CN113646334A - 癌症靶向的、病毒编码的、可调节的t细胞（catvert）或nk细胞（catvern）接头 - Google Patents

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陈淳宇
布莱恩·胡特泽恩
马克·柯里尔
王品怡
道恩·钱德勒
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Abstract

提供了在转基因中包含工程化（人工）外显子‑内含子‑外显子基因结构的重组多核苷酸和载体，其在靶细胞中表达时经历剪接。

Description

癌症靶向的、病毒编码的、可调节的T细胞（CATVERT）或NK细胞 （CATVERN）接头
政府支持声明
本发明是在国防部授予的NF170075号政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2019年2月20日提交的美国临时申请第62/808264号的优先权，其内容通过引用整体并入本申请。
背景技术
基因转移作为一种疾病治疗方法（即基因治疗）现已成为现实。2017年，FDA批准了Luxturna（一种腺相关病毒（AAV），被设计来在视网膜细胞中稳定表达RPE65基因的正常拷贝）用于治疗先天性视网膜营养不良。2019年，FDA批准了Zolgensma，这是一种设计用于在运动神经元中表达SMN1以治疗脊髓性肌萎缩症的AAV。目前正在进行的使用AAV载体替代其他疾病基因功能的临床试验也取得了非常令人鼓舞的结果，包括用于杜氏（Duchenne）肌营养不良症的肌营养不良蛋白基因的迷你版本，以及分别用于血友病A和B的因子VIII和IX基因。
在上述所有示例中，目标是长期基因表达以替换缺失或缺陷的基因。然而，可能存在只短期表达转基因（该基因在基因治疗中被表达为治疗剂）的基因治疗应用，例如在有时间限制的疾病（例如感染或癌症）的治疗中。另一个说明性示例是表达细菌蛋白Cas9以诱导CRISPR/Cas9基因编辑，其中只有Cas9的瞬时表达是理想的，以最小化对Cas9的潜在免疫反应并最小化脱靶基因突变。另一个应用是基因治疗可能会引起不必要的副作用的情况，并希望使基因失活。在这些情况下，需要一种激活和/或抑制转基因表达的方法。
因此，需要一种能够激活转基因表达的新方法，以利用基因治疗平台进行短期基因表达（数周到数月）。理想的系统是将转基因表达置于药物的控制之下，因此药物的施用会激活基因表达，而药物的停用会恢复为使基因表达失活。在这种情况下，如果出现副作用或不再需要转基因表达，则不再需要给药。本发明满足了这一需要，并提供了相关的优点。
发明内容
本发明提供了一种表达疾病或病症的治疗基因的方法或载体，任选地在外部控制下表达。在一些情况下，所述疾病或病症是癌症。在某些情况下，所述载体表达多肽（本文称为“Dimert”），其用于将免疫执行细胞与癌细胞结合到一起从而触发对癌细胞的杀伤。
本发明提供一种重组多核苷酸或载体，其包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：（a）第一多核苷酸序列，其包含编码第一抗体或其抗原结合片段的开放阅读框的第一部分；（b）第二多核苷酸序列，其包含编码第一抗体或其抗原结合片段的开放阅读框的第二部分；（c）第三多核苷酸序列，其编码第二抗体或其抗原结合片段；和（d）位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的基因调控多核苷酸序列。在进一步的方面，基因调控多核苷酸序列包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：剪接供体位点、上游内含子、在其各自阅读框中包含一个以上终止密码子序列的外显子、下游内含子和剪接受体位点。在进一步的方面，所述基因调控多核苷酸序列包含用于反义寡核苷酸的结合序列中的一个或多个。在进一步的方面，反义寡核苷酸是吗啉基（morpholino）寡核苷酸。在另一方面，吗啉基寡核苷酸的结合序列包含与SEQ ID NO. 24(AATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTG)或SEQ ID NO. 25(GATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTA)至少95%相同的多核苷酸序列。在另一实施例中，终止密码子包含以下群组的寡核苷酸：TAA、TAG或TGA。在另一方面，所述终止密码子序列包含多核苷酸序列TAAxTAGxTGAxTAGxTAAxTGAx（SEQ ID NO.1），其中x为任意核苷酸，或者，该终止密码子序列包含多核苷酸序列TAATTAGTTGATTAGTTAATTGAT（SEQ ID NO.2）或其等效物。在另一实施例中，重组多核苷酸或载体编码双特异性或三特异性接合器（engager）。在另一实施例中，双特异性细胞接合器是双特异性接合器。在另一实施例中，双特异性细胞接合器是三特异性接合器。
在进一步的实施例中，第一抗体或其抗原结合片段特异性结合到免疫效应细胞上的活化抗原，并且第二抗体或其抗原结合片段结合到肿瘤抗原。在另一方面，第一抗体或其抗原结合片段特异性结合到肿瘤抗原，并且第二抗体或其抗原结合片段结合到免疫效应细胞上的活化抗原。在另一方面，重组多核苷酸或载体还包含编码第三抗体或其抗原结合片段的第四多核苷酸序列，其中第三抗体或其抗原结合片段结合到免疫效应细胞上的活化抗原或肿瘤抗原。一方面，免疫效应细胞包括树突状细胞、自然杀伤（“NK”）细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞或其组合。一方面，免疫效应细胞是T细胞。在另一方面，免疫效应细胞是NK细胞。在另一实施例中，第三抗体或其抗原结合片段结合NK细胞上的活化抗原，并诱导由NK细胞介导的免疫应答。
在一个实施例中，活化抗原为T细胞表面分子。在另一实施例中，活化抗原是NK细胞表面分子。免疫效应细胞上活化抗原的非限制性实例包括CD3、CD2、CD4、CD8、LFA1、CD45、NKG2D、NKp44、NKp46、NKp30、EphA2、DNAM、BT-H3、CD20、CD22或其组合。
一方面，所述dimert（例如，双特异性或三特异性细胞接合器）包含与SEQ IDNo.7-10中任何一个至少95%相同的多肽序列。在另一实施例中，该多肽序列编码用于CD3、CD2、CD4、CD8、LFA1、CD45、IL21R、NKG2D、NKp44、NKp46、NKp30或DNAM的抗原结合片段。在另一实施例中，该多肽序列编码用于CD3、CD19、GD2或NKG2D的抗原结合片段。在另一实施例中，该多肽编码第一抗原结合片段和第二抗原结合片段。在另一实施例中，第一抗原结合片段结合到CD3，第二抗原结合片段结合到CD19。在另一实施例中，第一抗原结合片段结合到CD3，第二抗原结合片段结合到GD2。在另一实施例中，第一抗原结合片段结合到NKG2D，第二抗原结合片段结合到GD2。
在一个实施例中，所述dimert（例如，三特异性接合器或抗体）包含第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和第三抗原结合片段。在另一实施例中，三特异性接合器或抗体包含分别与NKG2D、IL21R和GD2结合的三个抗原结合片段。在进一步的方面，三特异性接合器或抗体包含与SEQ ID NO.11至少95%相同的多肽序列。
在一个实施例中，与IL-21R结合的抗原结合片段为IL-21。IL-12的氨基酸和cDNA序列分别显示在SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4中。
SEQ ID NO. 3：IL-21的氨基酸序列
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
SEQ ID NO. 4：IL-21的cDNA序列
ATGAGAAGCAGCCCCGGCAACATGGAGAGAATCGTGATCTGCCTGATGGTGATCTTCCTGGGCACCCTGGTGCACAAGAGCAGCAGCCAGGGCCAGGACAGACACATGATCAGAATGAGACAGCTGATCGACATCGTGGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCCGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGAGCGCCTTCAGCTGCTTCCAGAAGGCCCAGCTGAAGAGCGCCAACACCGGCAACAACGAGAGAATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGAGAAAGCCCCCCAGCACCAACGCCGGCAGAAGACAGAAGCACAGACTGACCTGCCCCAGCTGCGACAGCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGATTCAAGAGCCTGCTGCAGAAGATGATCCACCAGCACCTGAGCAGCAGAACCCACGGCAGCGAGGACAGC。
在一个实施例中，结合NKG2D的抗原结合片段包含MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1γ、Rae-1δ、Rae-1ε、H60a、H60b、H60c、MULT1或其片段。在一个实施例中，与NKG2D结合的抗原结合片段为MICA或其片段。MICA的氨基酸和cDNA序列分别显示在SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6中。
SEQ ID NO. 5：MICA的氨基酸序列
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLAEVHLDGQPFLRYDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETEEWTVPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLESSVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNIILTWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICRGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPS
SEQ ID NO. 6：MICA的cDNA序列
gagccccaca gtcttcgtta taacctcacg gtgctgtcct gggatggatc tgtgcagtcagggtttcttg ctgaggtaca tctggatggt cagcccttcc tgcgctatga caggcagaaa tgcagggcaaagccccaggg acagtgggca gaagatgtcc tgggaaataa gacatgggac agagagacca gggacttgacagggaacgga aaggacctca ggatgaccct ggctcatatc aaggaccaga aagaaggctt gcattccctccaggagatta gggtctgtga gatccatgaa
gacaacagca ccaggagctc ccagcatttc tactacgatg gggagctctt cctctcccaaaacctggaga ctgaggaatg gacagtgccc cagtcctcca gagctcagac cttggccatg aacgtcaggaatttcttgaa ggaagatgcc atgaagacca agacacacta tcacgctatg catgcagact gcctgcaggaactacggcga tatctagaat ccagcgtagt cctgaggaga acagtgcccc ccatggtgaa tgtcacccgcagcgaggcct cagagggcaa catcaccgtg acatgcaggg cttccagctt ctatccccgg aatatcatactgacctggcg tcaggatggg gtatctttga gccacgacac ccagcagtgg ggggatgtcc tgcctgatgggaatggaacc taccagacct gggtggccac caggatttgc cgaggagagg agcagaggtt cacctgctacatggaacaca gcgggaatca cagcactcac cctgtgccct ct。
在一个实施例中，MICA序列包含野生型的突变体。在一个实施例中，MICA突变体是MUC-30的序列变体，其在野生型MICA序列的129位包含蛋氨酸突变而不是丙氨酸。MUC-30变体的氨基酸和cDNA序列分别显示在SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8中。
SEQ ID NO. 7：MUC-30的氨基酸序列
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLAEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETEEWTMPQSSRAQTLAMNIRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPS
SEQ ID NO. 8：MUC-30的cDNA序列
gagccccaca gtcttcgtta taacctcacg gtgctgtcct gggatggatc tgtgcagtca
gggtttctcg ctgaggtaca tctggatggt cagcccttcc tgcgctgtga caggcagaaa
tgcagggcaa agccccaggg acagtgggca gaagatgtcc tgggaaataa gacatgggac
agagagacca gggacttgac agggaacgga aaggacctca ggatgaccct ggctcatatc
aaggaccaga aagaaggctt gcattccctc caggagatta gggtctgtga gatccatgaa
gacaacagca ccaggagctc ccagcatttc tactacgatg gggagctctt cctctcccaa
aacctggaga ctgaggaatg gacaatgccc cagtcctcca gagctcagac cttggccatg
aacatcagga atttcttgaa ggaagatgcc atgaagacca agacacacta tcacgctatg
catgcagact gcctgcagga actacggcga tatctaaaat ccggcgtagt cctgaggaga
acagtgcccc ccatggtgaa tgtcacccgc agcgaggcct cagagggcaa cattaccgtg
acatgcaggg cttctggctt ctatccctgg aatatcacac tgagctggcg tcaggatggg
gtatctttga gccacgacac ccagcagtgg ggggatgtcc tgcctgatgg gaatggaacc
taccagacct gggtggccac caggatttgc caaggagagg agcagaggtt cacctgctac
atggaacaca gcgggaatca cagcactcac cctgtgccct ct。
在进一步的方面，表达前体mRNA（pre-mRNA），当所述前体mRNA与吗啉基寡核苷酸接触时，所述前体mRNA编码三特异性抗体。
一方面，抗原结合结构域是单链可变区片段或抗体。
在进一步的方面，重组多核苷酸或载体包含编码分泌肽的多核苷酸序列。在另一方面，重组多核苷酸或载体进一步包含编码二聚化结构域的多核苷酸序列。在另一方面，重组多核苷酸或载体包含5'反向末端重复序列（ITR）和3' ITR。在另一方面中，该载体包含序列SEQ ID No. 4、6、8、12、14、16-23、30-33或40-46。此类载体的非限制性示例包括：重组病毒载体，其包括选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、鼠白血病病毒（“MLV”）载体、爱泼斯坦-巴尔病毒（“EBV”）载体、腺病毒载体、疱疹病毒（“HSV”）载体、腺相关病毒（“AAV”）载体、AAV载体或任选的自互补AAV载体的骨干载体。
重组多核苷酸或载体可被包含在宿主细胞内，例如原核或真核细胞内。
重组多核苷酸、载体和细胞可被包含在包含载体和/或宿主细胞和载体（例如药学上可接受的载体）的组合物中。它们可针对各种给药方式配制，并包含有效量的多核苷酸、载体和/或宿主细胞，其对患者、疾病或病症、载体和给药方式有效。在一方面，给药方式是全身或静脉内。在另一方面，通过直接注射进行局部给药。在一方面，吗啉基寡核苷酸与多核苷酸或载体同时或在其之后接触，例如作为全身或局部注射。或者，在多核苷酸或载体之前接触。
重组多核苷酸或载体可用于治疗多种疾病或病症。在一方面，提供了一种用于递送转基因的方法。该方法包括向待治疗的细胞、组织或患者施用有效量的包含转基因的重组多核苷酸或载体。在一方面，向待治疗的细胞、组织或患者施用有效量的吗啉基寡核苷酸。提供根据该方法的目的提供和选择转基因的非限制性示例。细胞或组织可以是哺乳动物，例如人类。在一方面，吗啉基寡核苷酸与载体同时或在其之后接触。或者，在载体之前接触。在另一方面，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将载体引入细胞。
本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法。所述方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向受试者施用有效量的如本文所述的重组多核苷酸或载体或细胞。在进一步的方法中，该方法还包括向受试者施用有效量的吗啉基寡核苷酸。在一方面，向受试者施用有效量的抗癌剂。抗癌剂的非限制性实例包括抗癌肽、多肽、核酸分子、小分子、病毒颗粒或其组合。在另一方面，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将载体引入细胞。
在所公开的方法的一个方面中，病毒颗粒是溶瘤HSV颗粒。
本发明提供的另一种方法是在细胞中产生双特异性抗体或三特异性抗体的方法，所述方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：使包含如本文所述的多核苷酸或载体的细胞与有效量的吗啉基寡核苷酸接触。在一方面，吗啉基寡核苷酸与载体同时接触或在载体之后接触。或者，在多核苷酸或载体之前。在一方面，吗啉基寡核苷酸包含与SEQ ID NO.27或28至少95%相同的序列。双特异性抗体的非限制性示例包含与SEQID NO.13或15至少95%相同的多肽序列。在一个实施例中，双特异性抗体由与SEQ IDNO.14、16、22、23、30-33或40-46至少95%相同的多核苷酸序列编码。在另一方面，三特异性抗体包含与SEQ ID NO.11至少95%相同的多肽序列。在一个实施例中，三特异性抗体由与SEQ ID NO.12至少95%相同的多核苷酸序列编码。
在另一方面，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将多核苷酸或载体引入细胞。细胞的非限制性示例包括成纤维细胞、骨骼细胞、上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、内分泌细胞、黑素细胞、血细胞或其组合。
进一步提供包含如本文所述的多核苷酸、载体、细胞或组合物中的一种或多种的试剂盒，任选地具有说明材料。
附图说明
图1显示了使用3-外显子基因结构的剪接的一般概念的策略概述。外显子标记为1、2或3，内含子用直线表示。不同的剪接模式以小写字母（a、b、c）显示，所得的RNA的结构基于使用了其中的哪些来显示。可干扰剪接供体（1D、2D）或受体（2A、3A）位点的寡核苷酸显示为蓝色短线，不同的可能的RNA亚型的预期表达显示为“+”，取决于寡核苷酸阻断的位点。
图2显示了图1的策略概述，使用剪接类型1，其中外显子2通常包含在基因转录本中。包含所有3个外显子拼接在一起的转录本预计将占主导地位，但如果存在阻断外显子2剪接受体或供体位点的寡核苷酸，则外显子1与外显子3融合的转录本将占主导地位。
图3展示了在转基因中创建工程化内含子-外显子STOP（终止）-内含子的策略#1的概述。保留内含子的转录本将是无功能的，因为内含子将具有过早的终止密码子和/或将超出框架。由于外显子2中的终止密码子，“a+b”转录本将是无功能的。只有外显子2被跳过（利用剪接c）的转录本是有功能的，其将有较低的基线，并被阻断外显子2剪接位点的寡核苷酸激活。
图4显示了图1所示策略的转基因调控图。
图5展示了利用“剪接类型2”在转基因内创建工程化内含子-外显子STOP-内含子的第二种策略，其中外显子2通常不存在于癌细胞中，但存在于正常细胞中。在这种情况下，外显子跳跃寡核苷酸激活正常细胞中的转基因表达（外显子1+3），使其在细胞基因的某些脱靶跳跃中保持不变（或甚至更高），作为潜在的“额外”治疗效果。
图6展示了利用“剪接类型3”在转基因内创建工程化内含子-外显子STOP-内含子的第三种策略，其中外显子2通常存在于某些癌细胞中，但不存在于正常细胞中。在这种情况下，正常细胞中存在高水平的活性转基因（外显子1+3），并且外显子跳跃寡核苷酸激活肿瘤细胞中的表达。
图7展示了示例性的CD3xGD2-HDD AAV构建体。
图8展示了用于确定本文公开的Dimert的结构和功能的试验的卡通图。
图9展示了来自转染的293T细胞的全细胞裂解物的SDS-PAGE。图7的三种构建体#1101、#1040和#1124（其包含分泌肽），相对于构建体#1104和对照构建体pcDNA3 GFP，在转染的293T细胞中保留的CD3xGD2-HDD Dimert较少。
图10展示了结合并激活人类T细胞的AAV载体分泌的CD3xGD2-HDD Dimert。
图11展示了激活人类T细胞的分泌的CD3xGD2-HDD Dimert。
图12A展示了CD3xGD2-HDD与T细胞的结合是剂量依赖性的。
图12B展示了标准化为未染色对照的中值染色水平的条形图。
图13展示了CD3xGD2-HDD Dimert的抗GD2臂的结合试验的卡通图。该试验证实GD2和CD3结合均存在于单个分子上。
图14展示了结合到CD3和GD2的示例性CD3xGD2-HDD Dimert。
图15展示了确定CD3xGD2-HDD是否诱导T细胞的GD2+靶细胞杀伤的试验流程图。
图16展示了分泌的CD3xGD2-HDD诱导神经母细胞瘤细胞的T细胞杀伤。
图17展示了T细胞介导的CD3xGD2-HDD Dimert的细胞毒性，其与GD2表达相关。
图18A展示了用于测试CD19xCD3 Dimert表达的示例性AAV构建体的图。
图18B展示了示例性CD19 TransJoin基因组结构。AAV编码的转基因的元件在图中示出。
图18C展示了与癌细胞和T细胞相互作用的CD19 Dimert的卡通图。CD19 Dimert由包含CD19 TransJoin的细胞产生。如图所示，“Ca”代表癌细胞，“T”代表T细胞。
图19展示了来自转染有包含分泌序列的AAV CD19xCD3构建体的细胞的上清液结合并激活T细胞。
图20展示了来自转染有包含分泌肽的AAV载体的细胞的上清液激活人类T细胞。
图21展示了AAV分泌的CD19xCD3特异性结合CD19，但不结合CD45。
图22A展示了CD19xCD3与T细胞的结合呈剂量依赖性。
图22B展示了标准化为未染色对照的中值染色水平的条形图。
图23A展示了CD19xCD3与B细胞的结合呈剂量依赖性。
图23B展示了标准化为未染色对照的中值染色水平的条形图。
图24展示了CD3 Dimert比抗CD3抗体更好地通过抗CD28共刺激激活T细胞。
图25展示了293T细胞对AAV8载体产生最高的转导效率。
图26展示了AAV8感染细胞上清液中的Dimert浓度取决于AAV剂量和转导效率。
图27展示了单次静脉内注射CD19xCD3 TransJoin，其选择性地消除人源化小鼠中的B细胞。
图28展示了单次静脉内注射CD19xCD3 TransJoin，其导致人源化小鼠中B细胞的延长消耗。
图29展示了单次静脉内注射CD19xCD3 TransJoin消除人源化小鼠中的CD19+淋巴瘤。
图30展示了本文所述的OncoSkip和TransSkip的概述。
图31展示了KRAS Oncoskip反义吗啉基诱导肺癌细胞中内源性KRAS的外显子跳跃。
图32展示了CD3xGD2-HDD TransSkip的示例性AAV载体图谱，显示了插入CD3xGD2-HDD Dimert编码序列的外显子侧翼的反向工程化内含子。
图33展示了用于测试本文所述OncoSkip和TransSkip的活性的示例性策略。
图34展示了诱导CD3xGD2-HDD TransSkip转基因的外显子跳跃的反义吗啉基。
图35展示了KRAS OncoSkip在转染有CD3xGD2-HDD TransSkip AAV载体的细胞中诱导CD3xGD2-HDD Dimert的分泌表达。
图36展示了KRAS OncoSkip对CD3xGD2-HDD TransSkip的外显子跳跃是中靶效应。
图37展示了由T细胞结合确定的CD3xGD2-HDD Dimert表达的诱导是中靶效应。
图38展示了示例性TransSkip剪接变体的AAV基因组图谱，以减少基线TransSkip“泄漏”，但保持可诱导的外显子跳跃。
图39展示了CD3xGD2-HDD TransSkip剪接变体K3，其消除了基线，但保持了可诱导的外显子跳跃。
图40展示了CD3xGD2-HDD TransSkip变体K3，其未显示基线Dimert产生，但与其他测试的TransSkip变体相比更容易被KRAS OncoSkip诱导。
图41展示了来自CD3xGD2-HDD TransSkip变体K3和K5的OncoSkip介导的Dimert表达的诱导是中靶效应。
图42展示了来自AAV CD3xGD2-HDD TransSkip载体的OncSkip诱导的分泌的Dimert在介导神经母细胞瘤细胞的T细胞杀伤中起作用。
图43展示了感染有AV CD3xGD2-HDD TransSkip变体K3的细胞中的转基因外显子跳跃可被KRAS OncoSkip中靶诱导。
图44A展示了示例性CD19xCD3 TransSkip剪接变体的AAV基因组图谱。
图44B展示了示例性CD19 TransSkip基因组结构。AAV编码的转基因的元件在图中示出。
图44C展示了CD19 Dimert与癌细胞和T细胞相互作用的卡通图。CD19 Dimer由包含CD19 TransSkip的细胞产生。如图所示，“Ca”代表癌细胞，“T”代表T细胞。
图45展示了OncoSkip吗啉基KTS1和KTS2诱导CD19xCD3 TransSkip K1的中靶外显子跳跃。
图46展示了KRAS OncoSkip在转染有CD19xCD3 TransSkip K1 AAV载体的细胞中诱导CD19xCD3 Dimert的分泌表达。
图47展示了CD19xCD3 TransSkip剪接变体K3消除了基线，但保持了可诱导的外显子跳跃。
图48展示了由T细胞结合确定的CD19xCD3-K3 TransSkip的CD19xCD3 Dimert表达的诱导是中靶效应。
图49展示了从CD19xCD3-K3 TransSkip诱导CD19xCD3 Dimert表达是可重复的。
发明详述
下文将更全面地描述根据本发明的实施例。然而，本发明的各个方面可以以不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所述的实施例。相反，提供这些实施例是为了使本发明彻底和完整，并且将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。本文描述中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制。
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。将进一步理解，诸如在常用词典中定义的术语，应当被解释为具有与其在本申请和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且除非在此明确定义，否则不应当以理想化或过于正式的意义来解释。虽然下文未明确定义，但此类术语应根据其共同含义进行解释。
本文描述中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献全部通过引用整体并入。
除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术属于本领域技术。
除非上下文另有说明，否则本文描述的本发明的各种特征可用于任何组合。此外，本发明还设想在一些实施例中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书规定复合物包括组分A、B和C，则具体意图是A、B或C中的任何一个或其组合可以单独地或在任何组合中被省略和放弃。
除非另有明确指示，否则所有指定的实施例、特征和术语旨在包括所述实施例、特征或术语及其生物学等效物。
所有数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其变化（+）或（-）的增量为1.0或0.1，视情况而定，或者变化+/-15%，或者变化10%，或者变化5%，或者变化2%。应理解的是，尽管并非总是明确说明，但所有数字名称之前都有术语“约”。还应理解的是，尽管并非总是明确说明，但本文所述试剂仅为示例性试剂，且本领域已知此类试剂的等效物。
在本发明的整个过程中，各种出版物、专利和已公开的专利说明书均通过识别引用或阿拉伯数字引用。由阿拉伯数字标识的出版物的完整引用可在权利要求之前找到。在此通过整体引用将这些出版物、专利和已公开的专利说明书的公开内容并入本发明，以更全面地描述本发明所属领域的状态。
定义
除非另有说明，否则本技术的实施将采用本领域技术范围内的有机化学、药理学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。例如，见Sambrook,Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition(1989)；Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.,(1987))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: APractical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)),Harlow and Lane, eds. (1988)；Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal CellCulture (R.I. Freshney, ed. (1987))。
如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”也包括复数形式。
如本文所用，术语“包括”旨在表示组合物和方法包括所述元件，但不排除其他元件。如本文所使用的，基本上由……组成（和语法变体）的过渡短语将被解释为包含所述材料或步骤，以及那些不会实质性地影响所述实施例的基本和新颖特征的材料或步骤。因此，本文中使用的术语“基本上由……组成”不应解释为等同于“包括”。“由……组成”应意味着排除多于其他成分的微量元素以及用于施用本文所公开的组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的方面在本发明的范围内。
如本文所使用的术语“大约”，在提及可测量值（例如量或浓度等）时意指包含规定量的20%、10%、5%、1%、0.5%甚至0.1%的变化。
当用于描述本文所公开的任何成分、范围、剂型等的选择时，术语或“可接受的”、“有效的”或“充分的”意指所述成分、范围、剂型等适用于所公开的目的。
也如本文所使用的，“和/或”是指并包含一个或多个相关列出项目的任何和所有可能组合，以及在备选方案（“或”）中解释时缺少组合。
如本文所使用的，术语“腺相关病毒”或“AAV”是指与该名称相关并且属于依赖细小病毒属，细小病毒科的病毒类别的成员。已知该病毒的多种血清型适用于基因递送；所有已知的血清型都可以感染来自各种组织类型的细胞。本领域已知至少11个顺序编号的AAV血清型。可用于本文公开的方法的非限制性示例性血清型包括 11 种血清型中的任何一种，例如AAV2、AAV8、AAV9，或变体血清型，例如AAV-DJ和AAV PHP.B。AAV颗粒包含三种主要的病毒蛋白：VP1、VP2和VP3。在一个实施例中，AAV是指血清型 AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV PHP.B、AAV rh74 或 AAV-DJ（通过八种不同AAV野生型的混洗获得的嵌合体）。
在某些情况下，AAV血清型优先靶向组织型。在某些情况下，下图说明了针对每种组织类型的典型组织类型和AAV血清型。
组织 血清型
CNS AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9
心脏 AAV1, AAV8, AAV9
肾 AAV2
肝脏 AAV7, AAV8, AAV9
肺 AAV4, AAV5, AAV6, AAV9
胰腺 AAV8
感光细胞 AAV2, AAV5, AAV8
RPE (视网膜色素上皮) AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8
骨骼肌 AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9
本文中使用的术语“细胞”可指原核生物或真核生物细胞，任选地从受试者或市售来源获得。
“真核细胞”包括除无核界以外的所有生命界。它们可以通过膜结合的细胞核很容易区分。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或有机体，它们的细胞通过内膜和细胞骨架组织成复杂的结构。最典型的膜结合结构是细胞核。除非特别说明，否则术语“宿主”包括真核宿主，例如包括酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性示例包括猿猴、牛、猪、鼠、大鼠、禽、爬行动物和人，例如HEK293细胞和293T细胞。
“原核细胞”，通常缺乏细胞核或任何其他膜结合的细胞器，分为两个域，细菌和古细菌。除了染色体DNA外，这些细胞还可以在一个称为附加体的环中包含遗传信息。细菌细胞非常小，大致相当于动物线粒体的大小（直径约1-2 μm，长10 μm）。原核细胞有三种主要形状：杆状、球形和螺旋形。细菌细胞不像真核生物那样经历复杂的复制过程，而是通过二元分裂进行分裂。示例包括但不限于芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌。
应用于核酸序列的术语“编码”是指被叙述来“编码”多肽的多核苷酸，在其天然状态下或通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，编码序列可以从中推导出来。
术语“等效物”或“生物等效物”在提及特定分子、生物或细胞材料时可互换使用，并意指在保持所需结构或功能的同时具有最小同源性的材料。等效多肽的非限制性示例包括具有多肽序列至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少96%同一性、或至少97%的同一性、或至少98%的同一性、或至少99%同一性的多肽，或由多核苷酸或其互补序列编码的多肽，其在高度严格的条件下与编码该多肽序列的多核苷酸杂交，该多肽序列具有与参考多肽基本相同或相同的功能，并且在一个方面编码参考多肽。本文描述了高度严格的条件，并通过引用将其并入本文。或者，其等效物是由多核苷酸或其互补序列编码的多肽，具有与参考多核苷酸（例如野生型多核苷酸或参考多核苷酸）至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的同一性，或至少96%的同一性，或至少97%的序列同一性，或者任选地至少98%的同一性，或者任选地至少99%的同一性。
等效多核苷酸的非限制性示例包括与参考多核苷酸具有至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少96%同一性，或者至少97%序列同一性、或至少98%同一性、或至少99%的同一性的多核苷酸。等效物还包括在高度严格的条件下与参考多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列。
多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一序列具有一定百分比（例如，80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”意味着，当对齐时，该百分比的碱基（或氨基酸）在比较两个序列时是相同的。可使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocols inMolecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18,Table 7.7.1.中描述的软件程序，确定比对和同源性百分比或序列同一性。在某些实施例中，默认参数用于对齐。使用默认参数，可以使用BLAST执行非限制性示例性对齐程序。具体而言，示例性程序包括使用以下默认参数的BLASTN和BLASTP：遗传代码=标准；过滤器=无；股=两股；截止值=60；期望值=10；矩阵= BLOSUM62；描述=50个序列；排序方式=高分；数据库=非冗余，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein+ SPupdate + PIR。有关这些程序的详细信息，请访问以下网址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。序列同一性和百分比同一性可以通过将它们合并到clustalW中来确定（可在网址：genome.jp/tools/clustalw/上获得，最后一次访问日期为2017年1月13日）。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的一个位置来确定，该位置可能是为了比较而对齐的。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源度是序列共享的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源”序列是与本发明的其中一个序列具有小于40%的同一性，或者小于25%的同一性。
“同源性”或“同一性”或“相似性”也可以指在严格条件下杂交的两个核酸分子。
“杂交”指一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残基碱基之间的氢键来稳定。氢键可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或任何其他序列特异性方式发生。该复合物可包括形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，例如PCR反应的启动，或核酶对多核苷酸的酶切。
严格杂交条件的示例包括：约25℃至约37℃的培养温度；杂交缓冲液浓度约为6×柠檬酸钠缓冲液（SSC）至约10×SSC；甲酰胺浓度约为0%至25%；和约4×SSC到约8×SSC的洗涤溶液。中等严格杂交条件的示例包括：约40℃至约50℃的培养温度；缓冲液浓度约为9×SSC至2×SSC；甲酰胺浓度约为30%至50%；以及约5×SSC至约2×SSC的洗涤溶液。高度严格杂交是指寡核苷酸与靶序列的杂交不存在错配（或完全互补）。高严格条件的示例包括：约55℃至约68℃的培养温度；缓冲液浓度约为1×SSC至0.1×SSC；甲酰胺浓度约为55%至75%；以及约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。通常，杂交培养时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多洗涤步骤，洗涤培养时间约为1、2或15分钟。SSC为0.15 M NaCl和15 mM柠檬酸钠缓冲液。应当理解的是，可以使用使用其他缓冲系统的SSC等效物。
如本文所用，“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。
“基因”是指至少含有一个开放阅读框（ORF）的多核苷酸，在转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白质。“基因产物”或任选地“基因表达产物”是指当基因被转录和翻译时产生的氨基酸（例如，肽或多肽）。
“处于转录控制下”是本领域中熟知的术语，表示多核苷酸序列（通常为DNA序列）的转录取决于其与有助于启动或促进转录的元件的有效连接。“有效连接”意味着多核苷酸以允许它们在细胞中发挥功能的方式排列。在一方面，本发明提供与下游序列有效连接的启动子。
术语“外显子”是指包含蛋白质编码序列的核酸序列。该基因通常包含一个以上的外显子，外显子之间由内含子分隔。
本文使用的术语“内含子”是指核酸序列的两侧是5'端的剪接供体位点和3'端的剪接受体位点。在一些实施例中，内含子从存在该内含子的载体表达的RNA或mRNA序列中剪接或移除。
术语“剪接供体位点”是内含子5'端的核酸序列或结构域。在一个实施例中，剪接供体位点用紧接在前的编码序列（或外显子）标记内含子的开始和/或内含子的边界。
本文使用的术语“剪接受体位点”是指内含子3'端的核酸序列或结构域。在一个实施例中，剪接受体位点标记内含子的开始及其与随后的编码序列（外显子）的边界。在另一个实施例中，剪接受体位点包括内含子分支点，该点是在剪接过程中内含子的5'端连接到的点。在一些实施例中，剪接受体序列和内含子分支位点作为单个单元彼此相邻放置。在一些实施例中，可通过将分支位点进一步移动到剪接受体序列的5′端，进一步分离剪接受体序列和内含子分支位点。
本文使用的术语“剪接位点”是指存在于上文定义的内含子5′端或3′端的核酸序列或结构域。
本文使用的术语“外显子跳跃”是指通过使用一个或多个互补反义寡核苷酸靶向前体mRNA内的剪接供体和/或受体位点来修饰前体mRNA剪接。通过阻断剪接体对一个或多个剪接供体或受体位点的接近，一个或多个互补反义寡核苷酸可以阻止剪接反应，从而导致从完全处理的mRNA中删除一个或多个外显子。在一个实施例中，在前体mRNA的成熟过程中在细胞核中实现外显子跳跃。它包括通过使用与前体mRNA内剪接供体序列互补的反义寡核苷酸来掩盖参与靶向外显子剪接的关键序列。
本文使用的术语“基因调控序列”是指能够控制基因、开放阅读框或外显子或内含子的转录、剪接或修饰的核酸序列。本发明的基因调控序列可包括启动子、反义寡核苷酸的结合位点和/或增强子。因此，将基因置于启动子或调控元件的调控控制下意味着定位该基因，使该基因的表达受调控序列控制。因此，在启动子-基因组合的构建中，启动子优选位于基因的上游，并且与转录起始位点的距离接近于启动子与其在自然环境中控制的基因之间的距离。这种距离的变化是可以容忍的，而不会丧失启动子功能。类似地，调节元件（例如增强子）相对于置于其控制下的异源基因的优选定位反映了其相对于其自然调节的结构基因的自然位置。与启动子元件相比，增强子被认为是相对位置和方向独立的。在一些实施例中，基因调控序列包括反义寡核苷酸的结合序列、强力霉素的结合序列或编码核糖开关的多核苷酸序列中的一个或多个。在一些实施例中，反义寡核苷酸（ASO）包含一个或多个经修饰的核苷酸。在一个实施例中，反义寡核苷酸为吗啉基寡核苷酸。
在一些实施例中，本文所述的反义寡核苷酸（ASO）包含长度约8至约50个的核苷酸。在某些情况下，ASO包括长度约8至约30、约8至约25、约8至约20、约8至约18、约8至约15、约10至约50、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约10至约18、约10至约15、约12到约50、约12到约30、约12到约25、约12到约20、约12到约18、或约12到约15个的核苷酸。在一些实施例中，ASO包含长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个的核苷酸。
在某些情况下，ASO包含一个或多个经修饰的核苷酸。在某些情况下，ASO包含约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的经修饰的核苷酸。在其它情况下，ASO包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40或更多个经修饰的核苷酸。在某些情况下，修饰位于核糖部分的2'羟基上。在某些情况下，所述修饰包括H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R为烷基部分。示例性烷基部分包括但不限于卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺（伯、仲或叔）、酰胺、醚、酯、醇和氧。在某些情况下，烷基部分进一步包含修饰。在某些情况下，修饰包含偶氮基、酮基、醛基、羧基、硝基、亚硝基、腈基、杂环（例如咪唑、肼基或羟胺基）、异氰酸酯或氰酸酯基或含硫基（例如亚砜、砜、硫化物和二硫化物）。在某些情况下，烷基部分进一步包含杂取代。在某些情况下，杂环基团的碳被氮、氧或硫取代。在某些情况下，杂环取代包括但不限于吗啉基、咪唑和吡咯烷基。在某些情况下，2′羟基处的修饰是2′-O-甲基修饰或2′-O-甲氧基乙基（2′-O-MOE）修饰。在某些情况下，经修饰的核苷酸是锁或桥联核糖修饰（例如，锁核酸或LNA）、乙烯核酸（ENA）（例如，2′-4′-乙烯桥联核酸）、肽核酸或吗啉基。在某些情况下，经修饰的核苷酸进一步包含一个或多个经修饰的核苷酸间键。示例性的经修饰的核苷酸间键包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸盐、5′-亚烷基膦酸盐、5′-甲基膦酸盐、3′-亚烷基膦酸盐、硼氮杂氟酸盐、3′-5′键或2′-5′键的硼酸盐磷酸酯和硒酸盐、磷酸三酯、硫代烷基膦三酯、氢膦酸键、烷基膦酸盐、烷基硫代膦酸盐、芳基硫代膦酸盐、亚硒酸磷酯、亚硒酸磷酯、膦酸盐、磷酰胺盐、3′-烷基磷酰胺、氨基烷基磷酰胺、硫代磷酰胺、磷过酰肼、硫代磷酰苯胺、磷酰苯胺、酮、砜、磺酰胺、碳酸盐、氨基甲酸酯、亚甲基肼氮、亚甲基二甲肼氮、甲缩醛、硫代甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、硫代酰胺、与核糖乙酰基、氨基乙基甘氨酸、硅基或硅氧烷键的键，含或不含杂原子的烷基或环烷基键，例如，1至10个饱和或不饱和和/或被取代和/或含有杂原子的碳、与吗啉基结构的键、酰胺、其中碱直接或间接连接到主链的氮杂氮的聚酰胺，以及它们的组合。
本文中使用的术语“吗啉基”是指具有能够与多核苷酸形成氢键的碱基主链的聚合物分子。在一些实施例中，吗啉基上的聚合物缺少戊糖主链部分，更具体地，缺少通过磷酸二酯键连接的核糖主链，磷酸二酯键是核苷酸和核苷的典型特征。在一个实施例中，吗啉基寡核苷酸包含氮环。在另一个实施例中，吗啉基是立体纯寡核苷酸（例如，见wavelifesciences.com，最后一次访问日期为2019年1月25日）或其衍生物。在另一实施例中，吗啉基包含与立体纯多核苷酸至少95%相同的序列。
在另一实施例中，吗啉基包含约8至约50、约8至约30、约10至约50、约10至约30或约12至约30个核苷酸的结构，包括与所选预处理mRNA或前体mRNA的靶区互补的目标碱基序列，例如前体mRNA的内含子区域。在另一实施例中，吗啉基反义寡核苷酸促进剪接目标外显子，这导致了转录本缺少靶标外显子。
在某些情况下，反义寡核苷酸（ASO）在本文中称为OncoSkip。如本文所用，术语“OncoSkip”是指设计用于在目标转基因剪接期间诱导目标外显子的跳跃，从而诱导目标转基因表达的ASO。在某些情况下，目标转基因编码与目标细胞的表面多肽（例如，表面受体）结合的多肽。在某些情况下，靶细胞是肿瘤细胞或免疫细胞。在某些情况下，目标转基因是癌基因。在这种情况下，使用OncoSkip会在剪接过程中诱导目标外显子的跳跃，从而诱导癌基因的表达。
在一些实施例中，本文所述的OncoSkip包含长度约8至约50个的核苷酸。在一些实例中，OncoSkip包含长度约8至约30、约8至约25、约8至约20、约8至约18、约8至约15、约10至约50、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约10至约18、约10至约15、约12到约50、约12到约30、约12到约25、约12到约20、约12到约18、或约12到约15个的核苷酸。在一些实施例中，OncoSkip包含长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个的核苷酸。
在一些实施例中，OncoSkip包含一个或多个经修饰的核苷酸，例如，包含约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%经修饰的核苷酸。在某些情况下，OncoSkip包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40或更多个经修饰的核苷酸。在某些情况下，OncoSkip包含一个或多个吗啉基修饰的核苷酸。在某些情况下，OncoSkip包含约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%吗啉基修饰的核苷酸。在某些情况下，OncoSkip包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40或更多个吗啉基修饰的核苷酸。
在某些情况下，OncoSkip与TransSkip协同工作。如本文所使用，术语“TransSkip”指包含被内含子-外显子-内含子区域中断的转基因的重组载体（例如，重组病毒载体，如AAV载体），其中外显子包含阻止转基因编码多肽正常表达的终止密码子。在某些情况下，转基因进一步被包含编码dimert的多核苷酸的构建体涵盖。在某些情况下，与OncoSkip结合，OncoSkip在剪接过程中跳过来自内含子-外显子-内含子区域的外显子，以生成能够表达转基因编码多肽的mRNA。在没有OncoSkip的情况下，由于内含子-外显子-内含子区域中存在终止密码子，来自TransSkip的转基因表达被沉默。
如本文所用，术语“dimert”是指包含两个或多个单链可变片段（scFv）的工程化蛋白质分子，其中每个scFv识别细胞上表达的表面多肽（例如，表面受体），且两个细胞不同。在某些情况下，dimert靶向两种不同的细胞类型，例如癌细胞和免疫细胞，或两种不同的免疫细胞类型。典型的免疫细胞类型包括树突状细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、单核细胞或中性粒细胞。在某些情况下，免疫细胞是效应免疫细胞。在某些情况下，效应免疫细胞包括效应T（Teff）细胞（在本文中也称为肿瘤浸润性T细胞）。示例性的Teff细胞包括CD8+T细胞和非调节性CD4+辅助性T细胞。在某些情况下，dimert靶向癌细胞和效应免疫细胞。在某些情况下，dimert靶向癌细胞和Teff细胞。在某些情况下，dimert靶向两种不同的癌细胞，例如，来自同一癌症的两种不同癌细胞。
在某些情况下，dimert的两个或多个scFv通过接头链接。在某些情况下，接头是促进每个scFv与其各自的靶多肽结合的肽接头。在某些情况下，接头包含一系列聚-Ala、聚-Gly或其组合。在某些情况下，聚-Ala接头、聚-Gly接头或包含Ala和Gly组合的肽接头各自独立地长度为约2个残基至约50个残基。在某些情况下，聚-Ala接头、聚-Gly接头或包含Ala和Gly组合的肽接头各自独立地长度为约2个残基至约45个残基、约4个残基至约45个残基、约5个残基至约45个残基、约8个残基至约45个残基、约10个残基至约45个残基、约15个残基至约45个残基、约20个残基至约45个残基、约30个残基至约45个残基、约2个残基至约40个残基、约4个残基至约40个残基、约5个残基至约40个残基、约8个残基至约40个残基、约10个残基至约40个残基、约15个残基至约40个残基、约20个残基至约40个残基、约30个残基至约40个残基、约2个残基至约30个残基、约4个残基至约30个残基、约5个残基至约30个残基、约8个残基至约30个残基、约10个残基至约30个残基、约15个残基至约30个残基、约20个残基至约30个残基、约2个残基至约20个残基、约4个残基至约20个残基、约5个残基至约20个残基、约8个残基至约20个残基、约10个残基至约20个残基、或约15个残基至约20个残基。在某些情况下，聚-Ala接头、聚-Gly接头或包含Ala和Gly组合的肽接头各自独立地长度为约2、4、5、6、8、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50个残基。
在某些情况下，接头是(Gly4Ser)n接头，其中n是1到10的整数。在某些情况下，n是1到6、1到4或1到3的整数。在某些情况下，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些情况下，接头的长度是约10到约50个氨基酸残基，任选地，长度为约10至约30、约10至约25或约10至约20个氨基酸残基。在某些情况下，接头包含一个或多个非天然氨基酸。
在某些情况下，dimert进一步包含额外的多肽。在某些情况下，额外的多肽增强dimert对靶细胞的亲和力。在某些情况下，额外的多肽是人肝细胞核因子1α（HNF1α）的二聚结构域。在某些情况下，HNF1α包含多肽序列，该多肽序列包含与MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGE (SEQ ID NO: 47)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些实例中，HNF1α由与ATGGTGAGCAAGCTGAGCCAGCTGCAGACCGAGCTGCTGGCCGCCCTGCTGGAGAGCGGCCTGAGCAAGGAGGCCCTGATCCAGGCCCTGGGCGAG (SEQ ID NO: 48) 至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多核苷酸编码。在某些情况下，额外的多肽不会诱导任何额外的免疫原性或毒性。
在一些实施例中，额外的多肽通过接头连接到dimert的其余部分。在某些情况下，接头包括GSGGAP。如本文所用，GSGGAP肽在本文中也称为间隔基。在某些情况下，接头包括TPLGDTTHTSG。在某些情况下，肽TPLGDTTHTSG来自IgG3的铰链区。
如本文所用，术语“TransJoin”指包含编码本文所述dimert的多肽但不存在内含子-外显子-内含子区域（其中外显子包含终止密码子）的重组载体（例如，重组病毒载体，如AAV载体）。因此，TransJoin不同于TransSkip，因为TransJoin可以在不需要OncoSkip的情况下表达dimert。
在一些实施例中，本文所述的TransJoin被优化用于将dimert递送到目标细胞或目标组织。在某些情况下，所述TransJoin包含启动子和增强子对，或包含为递送和/或表达到靶细胞或靶组织而优化的启动子和调节元件对。在某些情况下，为了在一段时间内组成性表达dimert，对TransJoin进行了优化（例如，使用启动子和增强子对，或启动子和调节元件对）。在某些情况下，为了dimert在一段时间内的组成性和稳定表达，对TransJoin进行了优化（例如，使用启动子和增强子对，或启动子和调节元件对）。在某些情况下，TransJoin包含用于增强表达、组成性表达、稳定表达或其组合的启动子和调节元件，例如土拨鼠肝炎病毒（WHP）转录后调节元件（WPRE）。
在一些实施例中，本文所述的TransJoin包含启动子和增强子对，或针对dimert在靶细胞或靶组织的平衡表达进行了优化的启动子和调节元件对。在某些情况下，平衡表达是指高于该范围的表达会诱发毒性，而低于该范围的表达不会产生治疗效果的表达范围。在某些情况下，启动子和增强子、或启动子和调节元件（例如WPRE）协同作用以平衡dimert的表达，从而达到目标范围。在某些情况下，平衡表达包括广泛的范围，例如，为dimert提供广泛的治疗窗口。
在一些实施例中，本文所述的TransJoin还进一步包含下文所述的分泌共有（consensus）序列，该序列针对dimert在靶细胞或靶组织的平衡表达进行了优化。在某些情况下，平衡表达是指高于该范围的表达会诱发毒性，而低于该范围的表达不会产生治疗效果的表达范围。在某些情况下，分泌共有序列与启动子、增强子、调节元件（例如WPRE）或其组合协同作用以平衡dimert的表达，从而达到目标范围。在某些情况下，平衡表达包括广泛的范围，例如，为dimert提供广泛的治疗窗口。
如上所述，时间段包括一天、两天、三天、四天、五天、七天、二十一天、二十八天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、八个月、十个月、一年、两年或更长。
本文使用的术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子、生物制品或细胞材料。
如本文所用，术语“功能性/有功能的”可用于修饰任何分子、生物制品或细胞材料，以实现特定的具体效果。
如本文所用，术语“核酸序列”和“多核苷酸”互换使用以指任意长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰的、非天然或衍生核苷酸碱基的聚合物。
如本文所用，术语“启动子”是指调节编码序列（例如基因）的表达的任意序列。例如，启动子可以是组成型、诱导型、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是控制序列，它是多核苷酸序列的区域，该区域控制转录的起始和速率。它可能包含调节蛋白质和分子可以结合的遗传元件，如RNA聚合酶和其他转录因子。非限制性示例性启动子包括ROS肉瘤病毒（RSV）LTR启动子（任选地具有RSV增强子）、巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子、U6启动子或EF1 α短形式（EFS）启动子。
在一些实施例中，启动子是EF1 α短形式（EFS）启动子。在某些情况下，EF1 α短形式（EFS）启动子包括GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGAATTCGCTAGCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGG (SEQ ID NO: 49)，或其等效物。
下文提供了具有特定靶特异性的其他非限制性示例性启动子，包括但不限于巨细胞病毒（CMV）、人多肽链延伸因子（EF1a）、SV40、磷酸甘油酸激酶（PGK），例如PGK1（人或小鼠）、P5、Ubc、人β-肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角体蛋白、CaMKIIa、Gal1、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、泛素（Ubi）如泛素C（UbiC）、H1、U6、α-1-抗胰蛋白酶、脾病灶形成病毒（SFFV）和鸡β-肌动蛋白（CBA）。合成衍生的启动子可用于普遍存在的或组织特异性表达。此外，病毒衍生的启动子，其中一些如上所述，可用于本文公开的方法中，例如CMV、HIV、腺病毒和AAV启动子。
在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子。在某些情况下，组织特异性启动子是内源性启动子，或来自于仅在靶细胞类型中表达的基因的启动子。示例性组织特异性启动子包括但不限于肝脏特异性启动子，例如ApoE/hAAT、LP1、SV40/hAlb（InvivoGen）；光感受器特异性启动子，如人视紫红质激酶（GRK1）和视体抑制蛋白（CAR）；B细胞特异性启动子，如B29（InvivoGen）；造血细胞特异性启动子，如来自InvivoGen的CD45启动子和SV40/CD45；肌细胞特异性启动子，如结蛋白启动子（InvivoGen）；胰腺腺泡细胞特异性启动子，如弹性蛋白酶-1启动子（InvivoGen）；内皮细胞特异性启动子，如Flt-1启动子（InvivoGen）；和神经元特异性启动子，如SYN1启动子（InvivoGen）。
在一些实施例中，启动子与增强子偶联以提高转录效率。增强子的非限制性示例包括RSV增强子、CMV增强子和α-甲胎蛋白MERII增强子。
增强子是一种可增加靶序列表达的调节元件。“启动子/增强子”是包含能够同时提供启动子和增强子功能的序列的多核苷酸。例如，逆转录病毒的长末端重复序列包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可能是“内源性”或“外源性”或“异源性”的。“内源性”增强子/启动子是与基因组中给定基因自然连接的增强子/启动子。“外源性”或“异源性”增强子/启动子是通过遗传操作（即分子生物学技术）与基因并置的增强子/启动子，使得该基因的转录由连接的增强子/启动子控制。
在一些实施例中，本文中使用的载体（例如，病毒载体，如AAV载体）进一步包含一个或多个附加调节元件。示例性调节元件包括但不限于转录终止子、多聚腺苷酸化位点和反向末端重复序列（ITR），例如5' ITR和3' ITR。在某些情况下，调节元件包括土拨鼠肝炎病毒（WHP）转录后调节元件（WPRE）。在某些情况下，示例性WPRE包含SEQ ID NO:50的核酸序列或其等效物。SEQ ID NO:50的序列如下所述：
TCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO: 50)。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并在其最广泛的意义上，指由氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的两个或多个亚基组成的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面，亚基可通过其他键连接，例如酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且不限制可包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量。如本文所用，术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。
如本文所用，术语“载体（vector）”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当载体放置在细胞内时可被复制，例如通过转化过程。载体可以是病毒载体或非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒、经修饰的杆状病毒、巴氏病毒或其他经修饰的天然病毒。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；与阳离子脂质体复合的DNA，单独或与阳离子聚合物结合；阴离子和阳离子脂质体；DNA-蛋白质复合物和颗粒，包括与阳离子聚合物（如异构聚赖氨酸、限定长度寡肽和聚乙烯亚胺）缩合的DNA，在某些情况下包含在脂质体中；以及包含病毒和多聚赖氨酸DNA的三元复合物的用途。在另一实施例中，该载体是重组病毒载体，包含选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、鼠白血病病毒（“MLV”）载体、爱泼斯坦-巴尔病毒（“EBV”）载体、腺病毒载体、疱疹病毒（“HSV”）载体、或腺相关病毒（“AAV”）载体的骨架载体。在另一实施例中，该载体是AAV载体，或任选地是自身互补AAV载体。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，该病毒或病毒颗粒包含将在体内、离体或体外递送至宿主细胞的多核苷酸。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、AAV载体、慢病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体等。甲病毒载体，如基于Semliki Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，Schlesingerand Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 434-439 and Ying, et al.(1999) Nat. Med. 5(7): 823-827。在某些情况下，病毒载体是AAV载体，例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV PHP.B、AAV rh74或AAV-DJ。在某些情况下，病毒载体是AAV rh74。在某些情况下，AAV rh74包含GenBank号为LP899424.1（于2020年2月7日访问）的载体序列。
在一些实施例中，病毒载体（例如AAV载体）的承载能力有限。例如，AAV载体的承载能力限制为4.7 kb。因此，dimert与启动子、增强子和其他调控元件的组合需要在4.7 kb的容量范围内。在这种情况下，本文使用的启动子是基于其核酸长度选择的，以使dimert和其他调节元件能够包装到病毒载体（例如AAV载体）中。在某些情况下，这种用途的启动子是SFFV、EF1α、PGK、UbiC、CMV、CBA或EFS。在某些情况下，启动子是EFS。
在另一实施例中，启动子是诱导型启动子。在一个具体的实施例中，启动子为诱导型四环素启动子。如Gossen & Bujard (1992; Tet-Off)和Gossen et al. (1995; Tet-On)所描述，Tet-Off和Tet-On基因表达系统使研究人员能够随时访问受调控的高水平基因表达系统。在Tet-Off系统中，当从培养基中去除四环素（Tc）或强力霉素（Dox；Tc衍生物）时，基因表达就会开启。相反，在Tet-on系统中，表达是通过添加Dox打开的。这两种系统都允许基因表达受到不同浓度的Tc或Dox的严格调控。Tet系统中的最大表达水平非常高，与强组成型哺乳动物启动子（例如CMV）获得的最大表达水平相比，表现良好（Yin et al.,1996）。与其他诱导型哺乳动物表达系统不同，Tet系统中的基因调控具有高度特异性，因此结果解释不会因多效性效应或非特异性诱导变得复杂。在大肠杆菌中，Tet阻遏蛋白（TetR）对Tn10转座因子上的四环素抗性操纵子的基因进行负调控。在没有Tc的情况下，TetR通过结合到tet操作序列（tetO）来阻断这些基因的转录。TetR和tetO为在哺乳动物实验系统的调节和诱导提供了基础。在Tet-On系统中，调节蛋白基于“反向”Tet阻遏物（rTetR），该阻遏物是由TetR中的四种氨基酸变化产生的（Hillen & Berens, 1994; Gossen et al.,1995）。产生的蛋白质rtTA（反向tTA也被称为四环素激活蛋白）由pTet-On调节质粒编码。
在一相关实施例中，载体进一步包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：编码四环素激活蛋白的核酸；以及调节四环素激活蛋白表达的启动子。
其他可用于载体、分离细胞、病毒包装系统和本文所述方法的诱导型系统包括蜕皮激素、雌激素、孕酮、二聚化化学诱导剂和异丙基-β-D1-硫代半乳糖吡喃糖苷（EPTG）的调节。
如本文所用，术语“重组表达系统”或“重组载体”指用于表达通过重组形成的用于表达某些遗传物质的一种或多种遗传构建体。
“基因递送载体”被定义为任何能携带多核苷酸插入宿主细胞的分子。基因递送载体的实例包括脂质体、胶束、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；以及细菌或病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域常用的其他重组载体，其已被描述用于在各种真核和原核宿主中表达，并且可用于基因治疗以及简单蛋白质表达。
本文公开的多核苷酸可使用基因递送载体递送至细胞或组织。如本文所使用的“基因递送”、“基因转移”、“转导”等是指将外源性多核苷酸（有时称为“转基因”）引入宿主细胞的术语，与用于引入的方法无关。此类方法包括多种众所周知的技术，例如载体介导的基因转移（如通过病毒感染/转染或各种其他基于蛋白质或脂质的基因传递复合物）以及促进“裸”多核苷酸递送的技术（例如电穿孔，“基因枪” 递送和用于引入多核苷酸的各种其他技术）。所引入的多核苷酸可以稳定地或暂时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常要求引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点，或整合到宿主细胞的复制子中，例如染色体外复制子（如质粒）或核染色体或线粒体染色体。已知许多载体能够介导基因转移到哺乳动物细胞，如本领域所知和本文所述。
“质粒”是与染色体DNA中分离的染色体外DNA分子，能够独立于染色体DNA进行复制。在许多情况下，它是圆形和双链的。质粒为微生物群体内的水平基因转移提供了一种机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择性优势。质粒可能携带在竞争性环境生态位中对天然抗生素产生耐药性的基因，或者产生的蛋白质也可能在类似情况下充当毒素。
基因工程中使用的“质粒”被称为“质粒载体”。许多商业上的质粒可用于此类用途。将要复制的基因插入质粒的副本中，该副本包含使细胞对特定抗生素产生耐药性的基因和多克隆位点（MCS或polylinker），该多克隆位点是一个包含几个常用的限制性位点的短区域，允许在该位置轻松插入DNA片段。质粒的另一个主要用途是制造大量蛋白质。在这种情况下，研究人员培育出含有携带感兴趣的基因的质粒的细菌。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素耐药性一样，它也可以被诱导从插入的基因中产生大量蛋白质。
在基因转移由DNA病毒载体（例如腺病毒（Ad）或腺相关病毒（AAV））介导的方面中，载体构建体指包含病毒基因组或其部分的多核苷酸和转基因。腺病毒（Ad）是一组特征相对较好的同源病毒，包括50多种血清型。Ad不需要整合到宿主细胞基因组中。重组Ad衍生载体，特别是那些降低野生型病毒重组和产生可能性的载体，也已被构建。这些载体可从例如Takara Bio USA (Mountain View, CA), Vector Biolabs (Philadelphia, PA)和Creative Biogene (Shirley, NY)等来源获得。野生型AAV具有高度的传染性和特异性，可整合到宿主细胞基因组中。参见，Wold and Toth (2013) Curr. Gene. Ther. 13(6):421-433, Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470,以及Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 3988-3996。
包含启动子和可操作连接多核苷酸的克隆位点的载体是本领域公知常识。这种载体能够在体外或体内转录RNA，并且可以从例如Agilent Technologies (Santa Clara,Calif.)和Promega Biotech (Madison, Wis.)等来源获得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要移除、添加或改变克隆的5′和/或3′未翻译部分，以消除额外的、潜在的、不适当的替代翻译起始密码子或其他可能干扰或减少表达的序列，无论是在转录水平还是翻译水平。或者，可以将共有核糖体结合位点立即插入起始密码子的5'以增强表达。
如本文所用，术语“接合器”、“接合器分子”或“激活抗原”是指从能够激活免疫细胞的细胞分泌的分子。在具体实施例中，接合器根据接合器中存在的结构域激活特异性免疫效应细胞。分泌接合器的细胞的说明性示例包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞、CAR T细胞、间充质干细胞（MSC）、神经干细胞、造血干细胞或其混合物。在另一实施例中，免疫效应细胞包括树突状细胞、自然杀伤（“NK”）细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞或其组合。
术语“抗原识别域”或“抗原结合域”指接合器分子中识别抗原的一部分。在具体实施例中，抗原可以是任何性质的，包括但不限于蛋白质、碳水化合物和/或合成分子。
如本文所用，术语“激活抗原”或“激活域”指接合器分子的一部分，其与免疫细胞相互作用并诱导阳性或阴性免疫调节信号。阳性免疫调节信号的说明性示例包括诱导细胞增殖、细胞因子分泌或细胞溶解活性的信号。负性免疫调节信号的说明性示例包括抑制细胞增殖、抑制免疫抑制因子分泌或诱导细胞凋亡的信号。
如本文所用，术语“天然免疫细胞”指免疫系统中天然存在的免疫细胞。说明性示例包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞和树突状细胞。
如本文所用，术语“工程化免疫细胞”指经基因修饰的免疫细胞。
如本文所用，术语“T细胞”包括幼稚T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无能T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞和抗原特异性T细胞。
如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指保留免疫原结合能力的抗体分子片段。此类片段是本领域公知常识，并且在体外和体内都经常被使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，而且还指众所周知的活性片段F(ab')2和Fab。F(ab')2和缺乏完整抗体的Fc片段的Fab片段从循环中清除得更快，并且可能与完整抗体的非特异性组织结合较少(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983))。本发明的抗体包括全天然抗体、单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab'、单链V区片段（scFv）、单域抗体（例如，纳米抗体和单域骆驼抗体）、VNAR片段、双特异性T细胞接合器（BiTE）抗体、微型抗体、二硫键连接的FVs（sdFv）和抗独特型（抗Id）抗体、体内抗体、融合多肽、非传统抗体和上述任何一种的抗原结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类别（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2）或亚类。
在某些实施例中，抗体是包含至少两条重（H）链和两条轻（L）链的糖蛋白，通过二硫键相互连接。每个重链由重链可变区（在此缩写为VH）和重链恒定（CH）区组成。重链恒定区由三个结构域组成：CH1、CH2和CH3。每个轻链由轻链可变区（在此缩写为VL）和轻链恒定CL区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区域可进一步细分为高变异性区域，称为互补决定区（CDR），中间散布着更保守的区域，称为框架区（FR）。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区域可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞（例如效应细胞）和经典补体系统的第一组分（Clq）。如本文中可交换使用的，术语“抗原结合部分”、“抗原结合片段”或“抗原结合区域”是指抗体中结合抗原并赋予抗体抗原特异性的区域或部分；抗原结合蛋白的片段，例如，抗体包括保留特异性结合抗原的能力的一个或多个抗体片段（例如肽/HLA复合物）。已经证明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。包含抗体的术语“抗体片段”内的抗原结合部分的实例包括：Fab片段，由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；(Fab)2片段，包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；由VH和CHI结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward et al., Nature 341: 544-546(1989))，由VH结构域组成；和分离的互补决定区（CDR）。
抗体和抗体片段可以全部或部分来源于哺乳动物（例如，人类、非人灵长类动物、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠、兔子和绵羊）或非哺乳动物抗体产生动物（例如，鸡、鸭、鹅、蛇、有尾目两栖动物）。抗体和抗体片段可在动物体内或动物体外产生，例如从酵母或噬菌体中产生（例如，作为单个抗体或抗体片段或作为抗体库的一部分）。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但它们可以使用重组方法，通过合成接头连接，使它们成为单个蛋白质链，其中VL和VH区域配对形成单价分子。这些被称为单链Fv（scFv）；参见，例如Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); 以及Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883 (1988)。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段以供使用。
“分离的抗体”或“分离的抗原结合蛋白”是指已从其自然环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体。“合成抗体”或“重组抗体”通常使用本领域技术人员已知的重组技术或合成肽技术生成。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接以形成VH: VL异二聚体的免疫球蛋白（例如，小鼠或人类）的重链（VH）和轻链（VL）可变区域的融合蛋白。重链（VH）和轻链（VL）直接连接或通过肽编码接头（例如，约10、15、20、25个氨基酸）连接，其连接VH的N端与VL的C端，或VH的C端与VL的N端。接头通常富含甘氨酸以增加柔韧性，丝氨酸或苏氨酸以增加溶解度。该接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。
尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。如Huston, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988))所述，单链Fv多肽抗体可从包含VH和VL编码序列的核酸中表达。另见，美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；和专利公开号20050196754和20050196754。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv（参见，例如，Zhao et al., Hybridoma (Larchmt) 27(6): 455-51 (2008)；Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle (2012)；Shieh et al., J. Imunol 183(4): 2277-85 (2009)；Giomarelli et al., Thromb Haemost 97(6): 955-63 (2007)；Fife eta., J Clin Invst 116(8): 2252-61 (2006)；Brocks et al.,Immunotechnology 3(3): 173-84 (1997)；Moosmayer et al., Ther Immunol 2(10):31- 40 (1995)。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv（参见，例如Peter et al., JBiol Chem 25278(38): 36740-7 (2003)；Xie et al., Nat Biotech 15(8): 768-71(1997)；Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 17(5-6): 427-55 (1997)；Ho et al.,Bio Chim Biophys Acta 1638(3): 257-66 (2003)）。
如本文所用，“F(ab)”指结合抗原但为单价且不具有Fc部分的抗体结构片段，例如，经木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个F(ab)片段和一个Fc片段（例如，重（H）链恒定区；不与抗原结合的Fc区域）。
如本文所用，“F(ab')2”是指通过胃蛋白酶消化完整的IgG抗体产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab')（二价）区域，其中每个(ab1)区域包含两条独立的氨基酸链，由S-S键连接的H链和轻（L）链的一部分，用于结合抗原，其中剩余的H链部分连接在一起。一个“F(ab')2”片段可以分裂成两个单独的Fab'片段。
如本文所用，“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，该序列是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 4th U.S. Department of Health and Human Services,National Institutes of Health (1987)。通常，抗体在可变区包含三个重链和三个轻链CDR或CDR区域。CDR为抗体与抗原或表位的结合提供了大部分接触残基。在某些实施例中，使用Kabat系统描绘CDR区域(Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242(1991))。
如本文所用，术语“亲和力”是指结合强度的度量。在不受理论约束的情况下，亲和性取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间立体化学配合的紧密程度、它们之间接触面积的大小以及带电和疏水基团的分布。亲和力还包括术语“亲合力”，它是指形成可逆复合物（例如，单价或多价）后抗原-抗体键的强度。本领域已知用于计算抗体对抗原的亲和力的方法，包括使用结合实验来计算亲和力。功能分析（如流式细胞术分析）中的抗体活性也反映了抗体亲和力。抗体和亲和力可通过功能分析（如流式细胞术分析）进行表型表征和比较。可用于本发明主题中的核酸分子包括编码多肽或其片段的任何核酸分子。在某些实施例中，可用于本发明主题中的核酸分子包括编码抗体或其抗原结合部分的核酸分子。这种核酸分子不需要与内源性核酸序列100%相同，但通常会表现出实质性的一致性。与内源性序列具有“实质同源性”或“实质同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。所谓“杂交”是指在各种严格条件下配对以在互补多核苷酸序列（例如，本文所述的基因）或其部分之间形成双链分子（参见，例如，Wahl, G. M. and S. L. Berger, Methods Enzymol.152: 399 (1987); Kimmel, A. R. Methods Enzymol. 152: 507 (1987)）。
术语“基本上同源”或“基本上相同”是指与参考氨基酸序列（例如，本文所述的任何一个氨基酸序列）或核酸序列（例如，本文所述的任何一种核酸序列）显示至少50%或更大的同源性或同一性的多肽或核酸分子。例如，该序列至少约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%在氨基酸水平或核酸上与用于比较的序列（例如野生型或天然序列）同源或相同。在一些实施例中，相对于用于比较的序列，基本同源或基本相同的多肽包含一个或多个氨基酸取代、插入或删除。在一些实施例中，基本同源或基本相同的多肽包含一个或多个非天然氨基酸或氨基酸类似物，包括D-氨基酸和反转录氨基酸，以取代同源序列。
通常使用序列分析软件来分析序列同源性或序列同一性（例如，SequenceAnalysis Software Package of the Genetics Computer Group, University ofWisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705,BLAST, BESTFIT, GAP, or PILEUP/PRETTYBOX programs）。这种软件通过为各种取代、删除和/或其他修饰指定同源度来匹配相同或相似的序列。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率分数表示密切相关的序列。
如本文所用，术语“类似物”指具有参考多肽或核酸分子功能的结构相关的多肽或核酸分子。
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变包含氨基酸序列的目前公开的工程受体（例如，工程受体的细胞外抗原结合域）的结合特性的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸取代、添加和删除。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点突变和PCR介导的突变，将修饰引入目前公开的工程化受体的人类单链抗体中。氨基酸可以根据其物理化学性质，如电荷和极性，进行分类。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基替换为同一基团内的氨基酸。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，带中性电荷的氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。此外，氨基酸可按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸（碱性极性）、天冬酰胺、天冬氨酸（酸性极性）、谷氨酸（酸性极性）、谷氨酰胺、组氨酸（碱性极性）、赖氨酸（碱性极性）、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，CDR区域内的一个或多个氨基酸残基可以被来自同一组的其他氨基酸残基取代，并且可以使用本文所述的功能分析测试改变的抗体的保留功能（即，上文（c）至（1）中所述的功能）。在某些实施例中，指定序列或CDR区域内的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。
如本文所用，术语“配体”指与受体结合的分子。具体而言，配体结合另一细胞上的受体，允许细胞间识别和/或相互作用。
如本文所用，术语“共刺激信号结构域”或“共刺激结构域”指包含共刺激分子的细胞内结构域的工程化受体部分。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子，它们在与抗原结合时提供T淋巴细胞有效激活和功能所需的第二信号。此类共刺激分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、CD30、CD40、PD-1、ICOS（CD278）、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKD2C、B7-H2和特异性结合CD83的配体。因此，虽然本发明提供了衍生自CD28和4-1BB的示例性共刺激结构域，但预期其他共刺激结构域可用于本文所述的工程化受体。包含一个或多个共刺激信号结构域可增强表达工程受体的T细胞的功效和扩增。细胞内信号和共刺激信号结构域可以以任何顺序串联到跨膜结构域的羧基末端。
如本文所用，术语“嵌合共刺激受体”或“CCR”指结合抗原并提供共刺激信号但不提供T细胞激活信号的嵌合受体。
术语“双特异性抗体”或“三特异性抗体”指具有两个不同抗原结合区（双特异性抗体）或三个不同抗原结合区（三特异性抗体）的抗体。在一些实施例中，双特异性抗体包含如Brinkmann et al., “The making of bispecific antibodies,” MABS9(2): 182-212(2017)的图二；或Labrijn, et al., “Bispecific antibodies: a mechanistic reviewof the pipeline,” Nature Reviews18: 585-608 (2019)的图二所公开的抗体形式（或抗体结构）。
在一些实施例中，双特异性抗体或三特异性抗体的抗原结合区中的至少一个结合到免疫效应细胞上的活化抗原。这可以理解为不同的靶向结合，但也包括与一个目标中不同表位的结合。活化抗原的非限制性实例包括但不限于CD3、CD2、CD4、CD8、CD19、LFA1、CD45、NKG2D、NKp44、NKp46、NKp30、DNAM、B7-H3（CD276）、CD20、CD22或其组合。双特异性抗体的非限制性示例包括但不限于CD3xCD19、CD3xGD2、CD3xEphA2和NKG2DxGD2抗体。
在一个实施例中，上述dimert包含双特异性抗体。在某些情况下，dimert包含双特异性T细胞接合器（“BiTE”）抗体、双特异性杀伤细胞接合器（“BiKE”）抗体或本文所述的其他双特异性抗体，例如与不同免疫细胞相关的抗体。在另一实施例中，dimert包含三特异性抗体。在某些情况下，dimert包含三特异性T细胞接合器（“TriTE”）抗体或三特异性杀伤细胞接合器（“TriKE”）抗体，或本文所述的其他三特异性抗体，例如与不同免疫细胞相关的抗体。
如本文所用，术语“双特异性T细胞接合器”或“BiTE”是指双特异性单克隆抗体，其包括结合到T细胞受体的第一抗原结合片段和通过肿瘤特异性分子结合到肿瘤细胞的第二抗原结合片段。如本文所用，术语“三特异性T细胞接合器”（“TiTE”或“TriTE”）指三特异性单克隆抗体，其包括结合到T细胞接合器的第一抗原结合片段、通过肿瘤特异性分子结合到肿瘤细胞的第二抗原结合片段、以及结合到T细胞接合器或细胞因子T细胞激活域的第三抗原结合片段。在一个实施例中，肿瘤特异性分子包含选自肾上腺素A型受体2（EphA2）、白介素（IL）-13r α2、EGFR VIII、PSMA、EpCAM、GD2或GD3、岩藻糖基GM1、PSCA、PLAC1、肉瘤断点、肾母细胞瘤1、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原（ETA）、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原（MAGE）、血液分化抗原、表面糖蛋白、神经节苷脂（GM2）、生长因子受体、基质抗原、血管抗原、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）、间皮素、CD38、CD123、人表皮生长因子受体2（HER2）、B细胞成熟抗原（BCMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）α或其组合。BiTE的示例包括但不限于Blinatumomab（MT103）和Solitomab（MT110）。
如本文所用，术语“双特异性杀伤细胞接合器”或“BiKE”是指双特异性单克隆抗体，其包括结合到自然杀伤（NK）细胞接合器结构域的第一抗原结合片段和通过肿瘤特异性分子结合到肿瘤细胞的第二抗原结合片段。本文使用的术语“三特异性NK细胞接合器”（“TiKE”或“TriKE”）指三特异性单克隆抗体，其包括结合到NK细胞接合器的第一抗原结合片段、通过肿瘤特异性分子结合到肿瘤细胞的第二抗原结合片段、和结合到NK细胞接合器或细胞因子NK细胞激活域的第三抗原结合片段。NKG2DxIL21RxGD2抗体是一种示例性的TriKE抗体。NK细胞接合器结构域的实例包括但不限于结合CD16、CD16+CD2、CD16+DNAM和CD16+NKp46的配体或分子。细胞因子NK激活结构域的实例包括但不限于IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其他NK细胞增强细胞因子、趋化因子和/或活化分子。NK结合域可包括结合和/或激活NK细胞的任何部分和/或阻止NK细胞抑制的任何部分。在一些实施例中，NK结合域可包括选择性结合到NK细胞表面成分的抗体。在其他实施例中，NK结合域可包括选择性结合到NK细胞表面组分的配体或小分子。
在一些实施例中，NK结合结构域可选择性地结合至少部分位于NK细胞表面的受体。在某些实施例中，NK结合结构域可起到结合NK细胞的作用，从而使NK与靶向结构域选择性结合的空间接近。然而，在某些实施例中，NK结合结构域可选择性地结合到激活NK细胞的受体，因此也具有激活功能。如上所述，CD16受体的激活可引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。因此，在某些实施例中，NK结合结构域可包括有效地选择性结合到CD16受体的抗CD16受体抗体的至少一部分。在其他实施例中，NK接合器细胞结构域可中断抑制NK细胞的机制。在此类实施例中，NK结合结构域可包括例如抗PDl/PDLl、抗NKG2A、抗TIGIT、抗杀伤性免疫球蛋白受体（KIR）和/或任何其他抑制阻断结构域。
在具体实施例中，用接合器分子对细胞进行遗传修饰（包括免疫细胞），所述分子至少包含抗原识别域和激活域和任选的细胞因子、共刺激域和/或抑制T细胞激活的负调节分子的域。接合器分子的抗原识别域与存在于靶细胞内和/或靶细胞上或由靶细胞分泌的一个或多个分子结合。在特定方面，靶细胞是癌细胞，至少包括实体肿瘤细胞。一旦接合器分子与目标分子结合，它们就可以激活表达激活域识别的分子的细胞。接合器分子可以激活用接合器分子进行基因修饰的细胞，也可以激活未经修饰的细胞。
根据所需的效果，激活可产生正信号或负信号。正信号的示例包括诱导细胞增殖、细胞因子分泌或细胞溶解活性的信号。负信号的示例包括抑制T细胞增殖、抑制免疫抑制因子分泌或诱导细胞死亡的信号。
在特定方面，分泌接合器分子的免疫细胞能够将常驻（特定个体的天然内源性）免疫细胞重定向到癌细胞。
本发明的实施例提供了将分泌接合器分子的经修饰的免疫细胞输送给需要接合器分子的个体（已知患有癌症或怀疑患有癌症，包括特定的癌症），而不是只将接合器分子传递给个体本身（在没有经修饰的免疫细胞产生的情况下）。在本发明中，个体接受允许产生接合器分子的经修饰的免疫细胞。在具体实施例中，所述细胞产生免疫刺激性细胞因子；以抗原特异性方式增殖；杀死适当的靶细胞；将旁观免疫细胞（至少包括T细胞或NK细胞）重定向至癌细胞；激活后分泌接合器分子；和/或在局部区域或全身方式下对癌症有效。图3展示了分泌接合器分子的经修饰的T细胞或NK细胞的实例。尽管特定的T细胞或NK细胞可能产生一个可针对相同的癌细胞特异性抗原的接合器，但T细胞或NK细胞的激活域必须不同，因为NK细胞不表达CD3。NK细胞的激活域的示例至少包括例如CD16、NKG2D或NKp30。
基因递送载体还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白DNA复合物。包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本文公开的方法。除了向细胞或细胞群递送多核苷酸外，可通过非限制性蛋白质转染技术将本文所述蛋白质直接导入细胞或细胞群，或者其他非限制性技术可以增强本文公开的蛋白质的表达和/或促进其活性的培养条件。
如本文所用，术语“信号肽”或“信号多肽”意指通常存在于新合成的分泌或膜多肽或蛋白质的N端的氨基酸序列。其作用是将多肽引导至特定的细胞位置，例如，穿过细胞膜、进入细胞膜或进入细胞核。在一些实施例中，在定位之后移除信号肽。信号肽的实例在本领域中是众所周知的。非限制性示例为美国专利号8,853,381、5,958,736和8,795,965中描述的示例。
如本文所用，术语“病毒衣壳”或“衣壳”指病毒颗粒的蛋白质外衣或外壳。衣壳的功能是包裹、保护、运输病毒基因组并将其释放到宿主细胞中。衣壳通常由蛋白质的寡聚结构亚基（“衣壳蛋白”）组成。如本文所用，术语“衣壳化”是指包裹在病毒衣壳内。
如本文所用，关于病毒或质粒的术语“辅助子”指用于提供复制和包装病毒颗粒或重组病毒颗粒所需的附加组分的病毒或质粒，例如本文所公开的经修饰AAV。辅助子病毒编码的成分可包括病毒粒子组装、衣壳化、基因组复制和/或包装所需的任何基因。例如，辅助病毒可能编码病毒基因组复制所需的酶。适用于AAV构建体的辅助子病毒和质粒的非限制性示例包括pHELP（质粒）、腺病毒（病毒）或疱疹病毒（病毒）。
如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种单链DNA细小病毒，仅生长在细胞中，其中某些功能由共同感染的辅助病毒提供。AAV的一般信息和评论可以在例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, andBerns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)中找到。完全可以预期，这些综述中所述的相同原则将适用于在综述发表日期后表征的其他AAV血清型，因为众所周知，各种血清型在结构和功能上都非常密切相关，甚至在遗传水平上也是如此。（参见，例如Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R.Pattison, ed.; and Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)）。例如，所有AAV血清型明显表现出非常相似的由同源rep基因介导的复制特性；它们都携带三种相关的衣壳蛋白，如AAV2中表达的衣壳蛋白。异源双链分析进一步表明了相关程度，该分析揭示了血清型之间沿基因组长度的广泛交叉杂交；并且在对应于“反向末端重复序列”（ITR）的末端存在类似的自退火片段。相似的感染模式也表明，每个血清型的复制功能都处于相似的调控之下。
本文使用的“AAV载体”是指包含一个或多个由AAV末端重复序列（ITR）侧接的感兴趣的多核苷酸（或转基因）的载体。这种AAV载体在已转染编码并表达rep和cap基因产物的载体宿主细胞中存在时，可被复制并包装成感染性病毒颗粒。
“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果该颗粒包含异源多核苷酸（即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送到哺乳动物细胞的转基因），则其通常被称为“AAV载体颗粒”，或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这样的载体包含在AAV载体颗粒内。
在一些实施例中，AAV是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度约为4.7 kb，包括两个145核苷酸反向末端重复序列（ITR）。AAV有多种血清型。AAV血清型基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank Accession No. NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank Accession No. NC_001401和Srivastava et al., J.Virol., 45: 555-564 (1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank Accession No. NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank Accession No. NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank Accession No. AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank AccessionNo. NC_00 1862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank Accession No.AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388(2004) 中提供；AAV-10基因组在Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)中提供；AAV-11基因组在Virology, 330(2): 375-383 (2004)中提供。美国专利9,434,928提供了AAV rh.74基因组的序列，该专利通过引用并入本文。美国专利号9,434,928也提供了衣壳蛋白序列和自我互补基因组。一方面，基因组是自我互补的基因组。指导病毒DNA复制（rep）、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAV ITR中。三个AAV启动子（由相对图谱位置命名为p5、pl9和p40）驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子（p5和pi 9）与单个AAV内含子（核苷酸2107和2227处）的差异剪接，导致产生四种rep蛋白（rep 78、rep 68、rep 52和rep 40）。Rep蛋白具有多种酶促性质，最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非一致翻译起始位点负责三种相关衣壳蛋白的产生。单一的共有多聚腺苷酸化位点位于AAV基因组图谱位置95。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka, Current Topics in Microbiologyand Immunology, 158: 97-129 (1992)中进行了综述。
AAV具有独特的特性，使其成为有吸引力的用于向细胞输送外源DNA的载体，例如在基因治疗中。培养细胞的AAV感染是非细胞病变的，人类和其他动物的自然感染是无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而有可能在体内靶向许多不同的组织。此外，AAV能转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并能作为转录活性核附加体（染色体外成分）在这些细胞的整个生命周期中持续存在。AAV前病毒基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得构建重组基因组成为可能。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此基因组内部约4.3 kb的部分或全部（编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap）可能被外源DNA取代。为了产生AAV载体，rep和cap蛋白可以反式提供。AAV的另一个显著特征是，它是一种非常稳定和强大的病毒。它很容易耐受用于灭活腺病毒的条件（56℃至65℃持续数小时），使AAV的冷藏保存不那么重要。AAV甚至可以被冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抵抗力。
多项研究已经证明了肌肉中的长期（> 1.5 年）重组AAV介导的蛋白质表达。参见Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat.Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996)；和Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108(1996)。另见Chao et al., Mol Ther, 2: 619-623 (2000)和Chao et al., Mol Ther,4: 217-222 (2001)。此外，由于肌肉高度血管化，重组AAV转导已导致肌肉注射后在体循环中出现转基因产物，如Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809(1997)和Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997)所述。此外，Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)证明了骨骼肌纤维具有正确抗体糖基化、折叠和分泌所需的细胞因子，表明肌肉能够稳定表达分泌蛋白疗法。rAAV基因组中的AAV DNA可来自任何可衍生重组病毒的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVPHP.B、AAV rh74和AAV-DJ。例如，WO 01/83692中公开了假型rAAV的产生。还考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如，Marsic et al., MolecularTherapy, 22(11): 1900-1909 (2014)。本领域已知各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列。
如本文所用，提及病毒衣壳蛋白的术语“外部”是指在组装的病毒衣壳中面向外部的衣壳蛋白的表面、结构域、区域或末端。提及病毒衣壳蛋白的术语“内部”是指在组装的病毒衣壳中面向内部的衣壳蛋白的表面、结构域、区域或末端（氨基末端或羧基末端）。当用于组装的病毒衣壳时，术语“内部”是指病毒衣壳内的衣壳化空间和暴露于封闭空间的衣壳的向内表面。内部空间由病毒衣壳蛋白包裹，并且可以包括核酸，例如病毒基因组、病毒蛋白、宿主或包装细胞的蛋白质，以及在复制、病毒粒子组装、衣壳化和/或包装期间包装或包埋的任何其他组分或因子。
如本文所用，术语“标记”是指与待检测的组合物直接或间接偶联的直接或间接可检测的化合物或组合物，例如多核苷酸或蛋白质，例如抗体，以生成“标记”组合物。该术语还包括与多核苷酸偶联的序列，其在插入序列表达时提供信号，例如绿色荧光蛋白（GFP）等。标记本身是可检测的（例如放射性同位素标记或荧光标记），或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。标记可适用于小规模检测或更适用于高通量筛选。因此，合适的标记包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。可简单地检测标记或对其进行量化。简单检测的响应通常包括仅证实其存在的响应，而量化的响应通常包括具有可量化（例如，数字可报告）值的响应，例如强度、偏振和/或其他特性。在发光或荧光分析中，可以使用直接产生可检测响应的与实际参与结合的测定组分相关的发光团或荧光团，或间接使用与另一（例如，报告子或指示剂）组分相关联的发光体或荧光团产生。
产生信号的发光标记示例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光响应通常包括发光信号的变化或出现。本领域已知用于发光标记分析组分的合适方法和发光体，例如在Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals (6th ed.)中所述。发光探针的示例包括但不限于水母发光蛋白和荧光素酶。
合适荧光标签的示例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、红色素、香豆素、甲基香豆素、芘、苹果绿、芪、路西法黄、Cascade蓝TM.和德克萨斯红。其他合适的光学染料如Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals (6th ed.)中所述。
在另一方面，荧光标记功能化以促进共价附着到细胞或组织表面中或组织表面上存在的细胞组分，例如细胞表面标记物。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤化物，所有这些都可用于将荧光标记附着到第二分子。荧光标记官能团的选择取决于接头、试剂、标记物或第二标记物的附着位置。
荧光标记的附着可以直接附着到细胞组分或化合物上，或者也可以通过接头附着。用于将荧光标记间接连接到中间体的合适的结合对包括但不限于抗原/抗体，例如罗丹明/抗罗丹明、生物素/亲和素和生物素/链亲和素。
短语“固体载体/支持物”指非水表面，例如“培养板”、“基因芯片”或“微阵列”。此类基因芯片或微阵列可通过本领域技术人员已知的许多技术用于诊断和治疗目的。在一种技术中，寡核苷酸连接并排列在基因芯片上，用于通过杂交方法确定DNA序列，如美国专利号6,025,136和6,018,041中概述的方法。本发明的多核苷酸可被修饰为探针，进而可用于检测遗传序列。例如，美国专利号5,968,740和5,858,659中描述的此类技术。还可以将探针附着或固定到电极表面，用于核酸序列的电化学检测，如Kayem et al. U.S. Patent No.,952,172和Kelley et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 4830-4837所述。
“组合物”是指活性多肽、多核苷酸或抗体与另一种惰性（例如，可检测的标签）或活性（例如，基因递送载体）化合物或组合物的组合。
“药物组合物”是指包括活性多肽、多核苷酸或抗体与载体（惰性或活性载体，例如固体载体）的组合，使该组合物适合于离体、体内或体外的诊断或治疗用途。
如本文所用，术语“医药上可接受的载体”包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液、以及各种类型的润湿剂。所述组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和辅药的例子，参见Martin (1975) Remington’sPharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)。
如本文所用，术语“癌症”包括实体瘤和血液系统恶性肿瘤。示例性实体瘤包括但不限于膀胱癌、骨癌、脑癌（例如胶质母细胞瘤）、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。示例性的血液系统恶性肿瘤包括但不限于急性髓系白血病（AML）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、华氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高级别B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤（PMBL）、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔（胸腺）大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿。在某些情况下，癌症是转移性癌症（例如，转移性实体瘤或转移性血液系统恶性肿瘤）。在某些情况下，癌症是复发或难治性癌症（例如，复发或难治性实体瘤或复发或难治性血液系统恶性肿瘤）。
在一些实施例中，肿瘤的特征是成纤维细胞激活蛋白（FAP）的上调表达（其中人类FAP的氨基酸序列在GenPept Accession Number I38593中公开，于2020年2月10日获得）。FAP，也称为FAPα和脯氨酰内肽酶FAP，是一种膜结合糖蛋白，是二肽基肽酶（DPP）家族的一部分。FAP同时具有脯氨酸外肽酶和明胶酶活性。在某些情况下，以FAP表达上调为特征的癌症（FAP阳性癌症）包括但不限于骨癌、脑癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌和肾癌。在某些情况下，FAP阳性癌症包含高水平的纤维化。在某些情况下，将该水平与FAP未上调的等效癌症进行比较。在其他情况下，将该水平与正常受试者的纤维化水平进行比较。
在某些情况下，本文所述的dimert与FAPα的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人FAPα（例如，结合到具有GenPept Accession Number I38593的FAPα的细胞外部分或其等效物）。在某些情况下，dimert结合FAPα和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合FAPα并任选地结合免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽），用于治疗FAP阳性癌症、任选的胰腺癌、进一步任选的以高纤维化水平为特征的FAP阳性癌症。
在一些实施例中，癌症的特征是B细胞成熟抗原（BCMA）（也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17、TNFRSF17和BCM）的表达和/或上调，BCMA是TNF受体超家族的细胞表面受体。在某些情况下，人类BCMA的氨基酸序列在GenPept Accession Number BAB60895.1中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，以BCMA表达和/或上调为特征的癌症是骨髓瘤（或多发性骨髓瘤）。
在某些情况下，本文所述的dimert与BCMA的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合与人BCMA结合（例如，结合到具有GenPept Accession Number BAB60895.1的BCMA的细胞外部分，或其等效物）。在某些情况下，dimert结合BCMA和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合BCMA并任选地结合免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗骨髓瘤。
在一些实施例中，癌症的特征是表皮生长因子受体（EGFR）突变体（例如EGFR变体III（EGFRvIII））的表达或上调。EGFRvIII是指包括EGFR基因外显子2-7缺失的EGFR突变。在某些情况下，以EGFRvIII表达或上调为特征的癌症（EGFRvIII阳性癌症）包括但不限于胶质母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、周围神经鞘瘤（PNST）、前列腺癌、肉瘤和甲状腺癌。
在某些情况下，本文所述的dimert与EGFRvIII的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert与人EGFRvIII的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合EGFRvIII和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert与EGFRvIII结合，并任选地与免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）结合，用于治疗EGFRvIII阳性癌症，任选地为胶质母细胞瘤。
在一些实施例中，癌症的特征是人表皮生长因子受体2（HER2）（也称为HER2/neu、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2、CD340和ERBB2）的上调。在某些情况下，人类HER2的氨基酸序列在GenPept Accession Number NP-004439.2中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，HER2阳性癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和子宫内膜癌。
在某些情况下，本文所述的dimert与HER2的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人HER2的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number NP-004439.2中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合HER2和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合HER2并任选地结合免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗HER2阳性癌症，任选地为乳腺癌。
在一些实施例中，癌症的特征是CD123（也称为白细胞介素-3R或IL-3RA）的上调。在某些情况下，人类CD123的氨基酸序列在GenPept Accession Number NP_002174.1中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，CD123阳性癌症包括但不限于急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤和毛细胞白血病。
在某些情况下，本文所述的dimert与CD123的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人CD123的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number NP_002174.1中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合CD123和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合CD123并任选地结合免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗CD123阳性癌症，任选地为AML。
在一些实施例中，癌症的特征是CD38（也称为ADP核糖基环化酶1或ADPRC 1）的上调。在某些情况下，人类CD38的氨基酸序列在GenPept Accession Number BAA18966.1中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，CD38阳性癌症包括但不限于多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、前列腺癌和肺癌。
在某些情况下，本文所述的dimert与CD38的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人CD38的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number BAA18966.1中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合CD38和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合CD38并任选地结合免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗CD38阳性癌症，任选地为AML。
在一些实施例中，癌症的特征是间皮素（也称为MSLN）的上调。在某些情况下，人类间皮素的氨基酸序列在GenPept Accession Number AAV87530.1中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，间皮素阳性癌症包括但不限于间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃癌、肺腺癌和儿童急性髓系白血病。
在某些情况下，本文所述的dimert与间皮素的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人间皮素的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number AAV87530.1中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合间皮素和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合间皮素并任选地结合免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗间皮素阳性癌症，任选地为间皮瘤。
在一些实施例中，癌症的特征是白细胞介素-13受体α（IL13Rα）的上调。在某些情况下，IL13Rα包含IL13Rα1（IL13Rα1）和IL13Rα2（IL13Rα2）。在某些情况下，人类IL13Rα1的氨基酸序列在GenPept Accession Number P78552.1中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，人类IL13Rα2的氨基酸序列在GenPept Accession Number Q14627.1中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，IL13Rα阳性癌症包括但不限于脑癌（如胶质母细胞瘤）和肾细胞癌（RCC）。
在某些情况下，本文所述的dimert 与IL13Rα的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人IL13Rα的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number P78552.1、Q14627.1中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合IL13Rα和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合到IL13Rα并任选地结合到免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗IL13Rα阳性癌症，任选地为脑癌。
在一些实施例中，癌症的特征是B7-H3（也称为CD276，一种免疫检查点成员）的上调。在某些情况下，人类B7-H3的氨基酸序列在GenPept Accession Number CAE47548.1中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，B7-H3阳性癌症包括但不限于肺癌（例如，非小细胞肺癌）、乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、脑癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤和甲状腺癌。
在某些情况下，本文所述的dimert与B7-H3的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人B7-H3的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number CAE47548.1中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合B7-H3和T细胞或NK细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合B7-H3并任选地结合T细胞或NK细胞靶点（例如，在T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗B7-H3阳性癌症，任选地为肺癌（例如，非小细胞肺癌）、乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、脑癌、胰腺癌，肾癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤或甲状腺癌。
在一些实施例中，癌症的特征是受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）（也称为神经营养酪氨酸激酶、受体相关1或NTRKR1）的上调。在某些情况下，人类ROR1的氨基酸序列在GenPept Accession Number NP_005003中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，ROR1阳性癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性淋巴细胞白血病（ALL）。
在某些情况下，本文所述的dimert与ROR1的细胞外部分结合。在某些情况下，dimert结合到人ROR1的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number NP_005003中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合ROR1和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合ROR1并任选地结合免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗ROR1阳性癌症，任选地为乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、CLL或ALL。
在一些实施例中，癌症的特征是肾上腺素A型受体2（EphA2）（也称为EphA2受体、酪氨酸蛋白激酶受体ECK、上皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶）的上调。在某些情况下，人类EphA2的氨基酸序列在GenPept Accession Number NP_004422.2中公开（于2020年2月10日获得）。在某些情况下，EphA2阳性癌症包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤、甲状腺癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌和肝癌。
在某些情况下，本文所述的dimert结合到EphA2的细胞外部分。在某些情况下，dimert结合到人EphA2的细胞外部分（例如，包含GenPept Accession Number NP_004422.2中列出的氨基酸序列或其等效物）。在某些情况下，dimert结合到EphA2和免疫细胞靶点，例如T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合到EphA2并任选地结合到免疫细胞靶点（例如，T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗EphA2阳性癌症，任选地为乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤、甲状腺癌，结直肠癌、胃癌、食管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌或肝癌。
在一些实施例中，癌症为B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。示例性的B细胞白血病包括B细胞慢性淋巴细胞白血病（或B细胞小淋巴细胞淋巴瘤）；急性淋巴细胞白血病，成熟B细胞型；B细胞幼淋巴细胞白血病；前体B淋巴细胞白血病；毛细胞白血病。在某些情况下，B细胞白血病、B细胞淋巴瘤或其组合以B细胞上CD20和/或CD22的高表达为特征。在某些情况下，本文所述的dimert结合到CD20或CD22。在某些情况下，dimert与B细胞上表达的CD20结合。在某些情况下，dimert与B细胞上表达的CD22结合。在某些情况下，dimert进一步结合到另一个细胞靶点，例如癌细胞上表达的细胞表面多肽或T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽。在某些情况下，dimert结合到CD20或CD22并任选地结合到另一个细胞靶点（例如，癌细胞上表达的细胞表面多肽或T细胞或NK细胞上表达的细胞表面多肽）以治疗B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
如本文所用，“一线治疗”包括对受试者的初级治疗，任选地是对患有癌症的受试者的初级治疗。在某些情况下，癌症是原发性癌症。在其他情况下，癌症是转移性或复发性癌症。在某些情况下，一线治疗包括化疗。在其他情况下，一线治疗包括放射治疗。技术人员很容易理解，不同的一线治疗可适用于不同类型的癌症。
如本文所用，二线治疗包括在主要治疗或一线治疗停止后使用的治疗。三线治疗、四线治疗或五线治疗包括后续治疗。如命名约定所示，第三线治疗包括一个治疗过程，在该过程中，主要治疗和第二线治疗已经停止。
诊断或治疗的“对象/受试者”是细胞或动物，如哺乳动物或人类。受试者不限于特定物种，包括受诊断或治疗的非人类动物，以及受感染或动物模型影响的动物，例如，猿猴、鼠类（如大鼠、小鼠、毛丝鼠）、犬科动物（例如狗）、兔类（如兔子）、家畜、运动动物和宠物。人类患者也包括在该术语中。
如本文所用，术语“组织”指活的或已死的生物体的组织，或源自或设计用于模拟活的或已死的生物体的任何组织。组织可能是健康的、患病的和/或具有基因突变的。生物组织可包括任何单个组织（例如，可相互连接的细胞集合）或组成有机体器官或身体部分或区域的组织。该组织可包括均质细胞材料或可以是复合结构，例如在包括胸部在内的身体区域中发现的复合结构，该复合结构例如可包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性组织包括但不限于来源于肝、肺、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾脏、大脑、胆道、十二指肠、腹主动脉、髂静脉、心脏和肠道的组织，包括其任意组合。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异性靶点”是指识别和结合感兴趣的生物分子（例如，多肽）但基本上不识别和结合样品（例如包含或表达肿瘤抗原的生物样品）中的其他分子的多肽或其片段。
如本文所用，“治疗”或“治疗”受试者的疾病是指（1）防止易感或尚未显示疾病症状的受试者出现症状或疾病；（2） 抑制疾病或阻止其发展；或（3）改善或导致疾病或疾病症状消退。如本领域所理解，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果的方法，包括临床结果。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括一种或多种但不限于：减轻或改善一种或多种症状；病症（包括疾病）程度的减轻；稳定（即，不恶化）病症（包括疾病）的状态；病症（包括疾病）的延迟或减缓；病症（包括疾病）的进展、改善或缓解；状态和缓解（无论是部分还是全部），无论是否可检测。一方面，“治疗”一词不包括预防。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现预期效果所需的量。在治疗或预防应用的情况下，有效量将取决于所讨论疾病的类型和严重程度以及个体受试者的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在基因治疗的背景下，在一些实施例中，有效量是足以导致受试者中缺乏的基因的部分或全部功能恢复的量。在其他实施例中，重组多核苷酸、载体或AAV病毒颗粒的有效量是足以导致受试者中基因表达的量。在一些实施例中，有效量是增加有需要的受试者的半乳糖代谢所需的量。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的量。
在一些实施例中，有效量将取决于所述应用的大小和性质。还取决于目标对象的性质和敏感性以及使用的方法。本领域技术人员将能够基于这些和其他考虑因素确定有效量。根据实施例，有效量可包括一次或多次施用组合物。
如本文所用，术语“给药”或“施用”是指向受试者（如动物或人类）递送物质。在整个治疗过程中，可以一次施用、连续或间歇施用。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的以及被治疗对象的年龄、健康或性别而变化。单次或多次施用可由治疗医生选择剂量水平和模式，对于宠物和动物，可由治疗兽医选择剂量水平和模式。适当剂量的制剂和给药方法是本领域已知的。可以确定给药途径，并且确定最有效给药途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的、被治疗对象的健康状况或疾病阶段以及靶细胞或组织而变化。给药途径的非限制性示例包括静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射、心内注射、鞘内注射、脑室下注射、硬膜外注射、脑内注射、脑室内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、关节内注射、眼内注射、腹腔内注射、宫内注射、皮内注射、皮下注射、透皮注射、粘膜下注射和吸入。
执行本发明的模式
癌症是全球第二大死亡原因，2018年估计有960万人因此死亡。临床开发和市场上有许多不同类型的癌症治疗，例如免疫治疗、激素治疗、靶向药物治疗、过继细胞治疗和化疗。尽管在许多治疗领域取得了进展，但与影响治疗效果的半衰期和毒性等因素有关的挑战仍然存在。例如，以溶瘤病毒为基础的疗法可将有效载荷靶向递送至感兴趣的肿瘤微环境。然而，这些溶瘤病毒在肿瘤细胞内表达其有效载荷并诱导细胞杀伤效应，从而将有效载荷的表达限制在最多几天内，通常限制在几个小时内。因此，为了获得持续和持久的治疗效果，需要多次给药，这会增加毒性，导致不良的免疫反应。过继性细胞治疗，如嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗，为癌症患者提供了个性化的治疗选择。然而，CAR T细胞治疗最常见的副作用包括细胞因子释放综合征；神经系统事件，如脑病、失语、癫痫和失去平衡；中性粒细胞减少和贫血。此外，CAR-T细胞的制备需要在给药前进行数周的培养和扩增，这一时间对于癌症晚期患者来说尤为重要。
在某些实施例中，本文公开了使用基因治疗载体递送治疗性转基因（例如，本文公开的dimert）的方法。在一些实施例中，基因治疗载体提供治疗性转基因（例如，dimert）的稳定持续表达。在其他实施例中，基因治疗载体提供组成性表达。在进一步的实施例中，基因治疗载体提供受调节的表达。在某些情况下，基因治疗载体在正常细胞（例如，在肝细胞或肌肉细胞等器官细胞中）中转导。在某些情况下，单次施用基因治疗载体足以诱导治疗性转基因（例如，dimert）的稳定持续表达。在其他情况下，基因治疗载体提供治疗性转基因（例如，dimert）的持续、长期表达，从而对癌细胞提供长期压力。
在某些实施例中，本文公开了一种使用TransJoin递送治疗性转基因（例如，本文公开的dimert）的方法。在某些情况下，TransJoin提供治疗性转基因（例如，dimert）的组成性表达。在某些情况下，TransJoin提供了治疗性转基因（如dimert）的持续、稳定、长期表达。在某些情况下，长期表达包括约1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月、1年或更长时间。在某些情况下，TransJoin在正常细胞中（例如，在肝细胞或肌肉细胞等器官细胞中）被转导。在某些情况下，单次施用TransJoin足以诱导治疗性转基因（例如，dimert）的稳定持续表达。在其他情况下，TransJoin提供治疗性转基因（例如，dimert）的持续、长期表达，从而对癌细胞提供长期压力。
在某些实施例中，本文公开了一种激活转基因表达（例如，本文公开的dimert）的新方法，该方法可用作调节表达，例如短期基因表达（例如，数周到数月，进一步任选地为1周、2周、3周、4周、1个月，2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月或更长）的基因治疗平台。在某些情况下，该方法使用TransSkip。一方面，将转基因表达置于药物或外部试剂（例如，OncoSkip）的控制下，使得药物或药剂的施用调节（激活或失活）基因表达。另一方面，当药物或药剂缺乏给药或停药时会恢复到给药前基因表达的原始状态。例如，当药物或药剂可激活基因表达时，如果存在副作用或如果不再需要转基因表达，则停药可使基因表达失活，从而最小化副作用（如果有）。在某些情况下，TransSkip在正常细胞（例如，在肝细胞或肌肉细胞等器官细胞中）中转导。在某些情况下，单次施用TransSkip足以诱导治疗性转基因（例如，dimert）的稳定持续表达。在其他情况下，TransSkip提供了治疗性转基因（例如，dimert）受调控但持续的表达，从而对癌细胞提供长期压力。
外显子跳跃是一种用于治疗某些基因短区域缺陷的遗传病的技术。DNA突变导致蛋白质受损，要么是因为蛋白质中出现了错误的氨基酸，要么是因为它们产生了导致截断蛋白质的终止突变，要么是因为它们改变了产生这两者的阅读框。由于哺乳动物基因通常在外显子中编码，这意味着它们被分成多个基因片段（外显子），这些片段在mRNA处理过程中拼接在一起，因此导致许多疾病的DNA突变（碱基对的变化或缺失）包含在单个外显子中。如果该外显子可以被跳过，并且不包含在最终剪接的mRNA中，那么突变区域将不包含在最终蛋白质中。虽然蛋白质会变短，可能会缺少某些部分，但它仍将处于“框架内”，并可能保留其某些功能。
例如，杜氏肌营养不良症（DMD）和贝克肌营养不良症（BMD）是最常见的儿童肌营养不良症，由编码肌营养不良蛋白的DMD基因的遗传缺陷引起，细胞骨架和细胞外基质相互作用所需的肌肉蛋白质在收缩过程中维持肌肉纤维的稳定性。肌营养不良蛋白基因的DMD突变的特征是框移插入或缺失或无义点突变，导致功能性肌营养不良蛋白缺失。BMD突变通常保持阅读框完整，允许合成部分功能性肌营养不良蛋白。基于外显子跳跃的治疗导致DMD患者的框外突变转化为编码部分功能性肌营养不良蛋白的框内突变。2016年，FDA批准了第一种外显子跳跃药物Eteplirsen™ (Sarepta疗法）用于肌营养不良基因第51外显子突变的杜氏肌营养不良症。当施用药物（这是一种经过修饰的DNA短片段，也称为寡核苷酸）时，外显子51被“跳过”，以恢复接近全长且功能更强的蛋白质。正在开发类似的技术来跳过其他肌营养不良蛋白外显子以及其他致病基因中的外显子。
与外显子跳跃相比，本发明在基因治疗应用中利用转基因激活。大多数（如果不是全部）基因治疗方法目前都使用互补的（cDNA）基因序列；也就是说，转基因的遗传序列只是编码序列（只有外显子），不包括任何中间（内含子）序列。因此，该基因不经历任何RNA剪接。
本发明和技术利用含有剪接供体和受体位点以及RNA剪接体结合位点的干预序列迫使转基因进行正常的外显子剪接。因此，提供了转基因中的“反向工程化”（人工）外显子-内含子-外显子基因结构，当其在靶细胞中表达时，该结构会经历剪接。然而，剪接是根据外显子跳跃的原理进行调节的。一方面，在基因的中间含个终止密码子的有意插入的外显子调节基因表达，即，只有当跳过外显子时，人工结构才会表达正常的功能性转基因。在一个实施例中，功能性转基因编码抗体。在另一实施例中，抗体为双特异性或三特异性抗体（例如，dimert）。在另一实施例中，抗体（例如，dimert）为双特异性T细胞接合器（BiTE）、双特异性NK细胞接合器（BiKE）、三特异性T细胞接合器（TriTE）或三特异性NK细胞接合器（TriKE）。
在另一方面，剪接的程度和类型根据细胞类型改变，因为许多基因通常经历选择性剪接，有时因细胞类型而异。此外，剪接有时在某些癌细胞中会发生改变（某些基因的某些外显子可能在正常细胞和癌细胞中被包含或排除）。这项技术可以利用这些特征来实现与正常细胞和癌细胞中不同的转基因控制。此外，由功能性转基因编码的抗体，例如双特异性或三特异性抗体，可用于治疗癌症。因此，一方面，本发明中的转基因剪接的调控提供了一种治疗癌症的方法。
构建体实施例
在某些实施例中，本文提供的是一种多核苷酸或载体，其包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：（a）第一多核苷酸序列，包含编码第一多肽的开放阅读框的第一部分；（b）第二多核苷酸序列，包含编码第一多肽的开放阅读框的第二部分；（c）编码第二多肽的第三多核苷酸序列；和（d）位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的基因调控多核苷酸序列。在某些情况下，第一多肽结合到第一靶细胞的表面多肽（例如，表面受体），第二多肽结合到第二靶细胞的表面多肽（例如，表面受体）。在某些情况下，第一靶细胞和第二靶细胞是不同的。例如，第一靶细胞可以是肿瘤细胞，第二靶细胞可以是免疫细胞。在第二例子中，第一靶细胞可以是免疫细胞，第二靶细胞可以是肿瘤细胞。在第三个例子中，第一靶细胞可以是第一免疫细胞，第二靶细胞可以是第二免疫细胞，并且第一免疫细胞是与第二免疫细胞不同的细胞类型。在第四个例子中，第一靶细胞是第一癌细胞，第二靶细胞是第二癌细胞，并且第一癌细胞和第二癌细胞来自相同类型的癌症，例如，与相同的遗传缺陷相关或任选地具有相同的组织类型。
在一些实施例中，第一多肽为第一抗体或其结合片段，第二多肽为第二抗体或其结合片段。在某些情况下，本文提供的是一种多核苷酸或载体，其包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：（a）第一多核苷酸序列，包含编码第一抗体或其抗原结合片段的开放阅读框的第一部分；（b）第二多核苷酸序列，包含编码第一抗体或其抗原结合片段的开放阅读框的第二部分；（c）第三多核苷酸序列，包含编码第二抗体或其抗原结合片段；和（d）位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的基因调控多核苷酸序列。还提供了多核苷酸的互补序列。一方面，可检测地标记多核苷酸、其互补序列和/或载体。在某些情况下，第一抗体结合到第一靶点，第二抗体结合到第二靶点。在某些情况下，第一靶点是第一细胞上的表面多肽（例如，表面受体），第二靶点是第二细胞上的表面多肽（例如，表面受体）。在某些情况下，第一靶细胞和第二靶细胞是不同的。例如，第一靶细胞可以是肿瘤细胞，第二靶细胞可以是免疫细胞。在第二个例子中，第一靶细胞可以是免疫细胞，第二靶细胞可以是肿瘤细胞。在第三个例子中，第一靶细胞可以是第一免疫细胞，第二靶细胞可以是第二免疫细胞，并且第一免疫细胞是与第二免疫细胞不同的细胞类型。在第四个例子中，第一靶细胞是第一癌细胞，第二靶细胞是第二癌细胞，并且第一癌细胞和第二癌细胞来自相同类型的癌症，例如，与相同的遗传缺陷相关或任选地具有相同的组织类型。在某些情况下，第一靶点是第一表位，第二靶点是第二表位，两个表位存在于同一抗原上。在某些情况下，第一抗体和第二抗体具有不同的氨基酸序列。一方面，所述多核苷酸包含在基因表达载体内，其非限制性的实例包括质粒、DNA病毒载体或基因递送载体。
在一些实施例中，本文还公开了一种用于基因治疗的载体，其包含：编码第一抗体或其抗原结合片段的第一多核苷酸序列；以及编码第二抗体或其抗原结合片段的第二多核苷酸序列。还提供了多核苷酸的互补序列。一方面，可检测地标记多核苷酸、其互补序列和/或载体。在某些情况下，第一抗体结合到第一靶点，第二抗体结合到第二靶点。在某些情况下，第一靶点是第一细胞上的表面多肽（例如，表面受体），第二靶点是第二细胞的表面多肽（例如，表面受体）。在某些情况下，第一靶细胞和第二靶细胞是不同的。例如，第一靶细胞可以是肿瘤细胞，第二靶细胞可以是免疫细胞。在第二个例子中，第一靶细胞可以是免疫细胞，第二靶细胞可以是肿瘤细胞。在第三个例子中，第一靶细胞可以是第一免疫细胞，第二靶细胞可以是第二免疫细胞，并且第一免疫细胞是与第二免疫细胞不同的细胞类型。在第四个例子中，第一靶细胞是第一癌细胞，第二靶细胞是第二癌细胞，并且第一癌细胞和第二癌细胞来自相同类型的癌症，例如，与相同的遗传缺陷相关或任选地具有相同的组织类型。在某些情况下，第一靶点是第一表位，第二靶点是第二表位，两个表位存在于同一抗原上。在某些情况下，第一抗体和第二抗体具有不同的氨基酸序列。
在另一方面，基因调控多核苷酸序列包括剪接供体位点、上游内含子、在所有三个阅读框中包含终止密码子序列的外显子、下游内含子和剪接受体位点。在另一方面，该基因调控多核苷酸序列包含一个或多个反义寡核苷酸的结合序列。在另一方面，反义寡核苷酸为吗啉基。在另一个方面，吗啉基寡核苷酸的结合序列包含与SEQ ID NO: 24(AATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTG)或SEQ ID NO. 25(GATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTA)至少95%相同的多核苷酸序列，或者与其具有至少96%、或者至少97%、或者98%、或者至少99%的同一性。在一个实施例中，吗啉基寡核苷酸包含与SEQ ID NO. 27 (CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATT)或SEQ ID NO. 28(TAAAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATC)至少95%相同的多核苷酸序列，或者与其中的每一个具有至少96%、或者至少97%、或者98%、或者至少99%的同一性。剪接供体位点和剪接受体位点在本领域中是众所周知的。本领域普通技术人员知道剪接供体位点和剪接受体位点的序列，例如共有序列。U2内含子的示例性剪接位点共有序列可包括5'剪接位点MAG-GTRAGT，其中M为A或C；R是A或G，带下划线的核苷酸表示“GT”是不变的；破折号“-”表示剪接位点。U2内含子的3'剪接位点可以是CAG-G，其中带下划线的核苷酸表示“AG”是不变的；破折号“-”表示剪接位点。共有剪接位点序列的其他示例包括但不限于以下：
p53外显子10 5'剪接位点（供体）：CAG-gtgagt，其中破折号“-”表示剪接位点；
Brd2外显子3 5'ss：AAG-gtgagt，其中破折号“-”表示剪接位点；
BRCA1外显子22 5'剪接位点：CAG-gtaagt，其中破折号“-”表示剪接位点；
SMN1外显子1 5'ss：CAG-gtgagg，其中破折号“-”表示剪接位点；
BRD2 3'剪接位点受体内含子1（小写）/外显子2（大写）：cccatctttacag-GCTCCC，其中破折号“-”表示剪接位点；
BCL-X 3'剪接受体内含子2（小写）/外显子3（大写）：tctctccctgcag-GATACT，其中破折号“-”表示剪接位点；
纤维连接蛋白3'剪接受体内含子28（小写）/外显子29（大写）：ctttttcatacag-GAGGAA，其中破折号“-”表示剪接位点；和
存活蛋白3'剪接受体内含子2（小写）/外显子3（大写）：tctttatttccagGCAAAG，其中破折号“-”表示剪接位点。
在一些实施例中，从//science.umd.edu/labs/mount/RNAinfo/matrices.html获得剪接位点共有序列。
在一些实施例中，终止密码子包含TAA、TAG或TGA的寡核苷酸。在另一个方面，该终止密码子序列包含TAAxTAGxTGAxTAGxTAAxTGAx (SEQ ID NO. 1) 的多核苷酸序列，其中x为任意核苷酸，或者，该终止密码子序列包含TAATTAGTTGATTAGTTAATTGAT (SEQ ID NO. 2)的多核苷酸序列。在进一步的方面中，基因调控多核苷酸包含与SEQ ID NO.2至少95%相同的多核苷酸序列，或者与SEQ ID NO.2至少96%、或至少97%、或98%、或至少99%相同的多核苷酸序列。
在进一步的实施例中，第一抗体或其抗原结合片段特异性结合免疫效应细胞上的活化抗原，第二抗体或其抗原结合片段结合肿瘤抗原。在另一方面，第一抗体或其抗原结合片段特异性结合到肿瘤抗原，而第二抗体或其抗原结合片段结合到免疫效应细胞上的活化抗原。在另一方面，载体还包含编码第三抗体或其抗原结合片段的第四多核苷酸序列，其中第三抗体或其抗原结合片段结合免疫效应细胞上的活化抗原或肿瘤抗原。一方面，免疫效应细胞包括树突状细胞、自然杀伤（“NK”）细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞或其组合。免疫效应细胞的非限制性示例包括T细胞或NK细胞。
免疫效应细胞上活化抗原的非限制性示例包括CD3、CD2、CD4、CD8、CD19、LFA1、CD45、NKG2D、NKp44、NKp46、NKp30、DNAM或其组合。
抗原呈递细胞上的靶抗原的非限制性示例包括但不限于B7-H3（CD276）。
B细胞上的靶抗原的非限制性示例包括但不限于CD20和CD22。
肿瘤抗原的非限制性示例包括以下中的一种或多种：肾上腺素A型受体2（EphA2）、白细胞介素（IL）-13r α2、EGFR VIII、PSMA、EpCAM、GD3、岩藻糖基GM1、PSCA、PLAC1、肉瘤断裂点、肾母细胞瘤1、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原（ETA）、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原（MAGE）、血液分化抗原、表面糖蛋白、神经节苷脂（GM2）、生长因子受体、基质抗原、血管抗原、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）、间皮素、CD38、CD123、人表皮生长因子受体2（HER2），B细胞成熟抗原（BCMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）α或其组合。在本领域中可找到其他示例，参见，例如通过引用并入本文。在另一方面，重组载体表达编码本文所述dimert的前体mRNA。在某些情况下，当前体mRNA与吗啉基寡核苷酸接触时，dimert为双特异性抗体或三特异性抗体。dimert的非限制性示例为：双特异性T细胞接合器（BiTE）或双特异性NK细胞接合器（BiKE）；三特异性抗体包括三特异性T细胞接合器（TriTE）或三特异性NK细胞接合器（TriKE）。一方面，三特异性抗体包括第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段。
一方面，dimert（例如，双特异性或三特异性细胞接合器）包含具有与SEQ ID NO:11至少95%序列同一性的多肽序列，任选地具有与SEQ ID NO:11至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多肽序列。在另一实施例中，多肽序列编码用于以下的抗原结合片段：CD3、CD2、CD4、CD8、CD19；淋巴细胞功能相关抗原1（LFA1）；CD45；白细胞介素21受体（IL21R）；自然杀伤2组，成员D（NKG2D）；天然细胞毒性受体（NCR），如NKp44、NKp46或NKp30；或DNAX辅助分子-1（DNAM或DNAM-1；也称为CD226，或血小板和T细胞活化抗原1（PTA1））。在另一实施例中，多肽序列编码用于CD3、CD19、GD2或NKG2D的抗原结合片段。在另一实施例中，该多肽编码第一抗原结合片段和第二抗原结合片段。在另一实施例中，第一抗原结合片段结合到CD3，第二抗原结合片段结合到CD19。在另一实施例中，第一抗原结合片段结合到CD3，第二抗原结合片段结合到GD2。在另一实施例中，第一抗原结合片段结合到NKG2D，第二抗原结合片段结合到GD2。
在一个实施例中，三特异性接合器或抗体包含第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和第三抗原结合片段。在另一实施例中，三特异性接合器或抗体包含分别结合到NKG2D、IL21R和GD2的三个抗原结合片段。另一方面，三特异性接合器或抗体具有与SEQ IDNO.11至少95%的序列同一性的多肽序列，或者具有与SEQ ID NO.11至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一个实施例中，与IL-21R结合的抗原结合片段为IL-21。IL-12的氨基酸和cDNA序列分别显示在SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4中。在一个实施例中，结合NKG2D的抗原结合片段包含MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1γ、Rae-1δ、Rae-1ε、H60a、H60b、H60c、MULT1或其片段。在一个实施例中，与NKG2D结合的抗原结合片段为MICA（SEQ ID NO. 5）或其片段或其等效物。
在一个实施例中，MICA序列包含野生型突变体。在一个实施例中，MICA突变体是野生型MICA的序列变体（例如，SEQ ID NO:5中所述的野生型MICA序列）。在另一实施例中，MICA突变体是MUC-30（SEQ ID NO.7）的序列变体，其在野生型MICA序列（MICA-129Met）的129位处包含蛋氨酸突变而不是丙氨酸。MICA突变体（MICA-129Met）的一个等效物在野生型MICA的129位保留了蛋氨酸突变。在另一实施例中，双特异性或三特异性接合器或抗体的抗原结合片段通过接头序列分隔。接头序列的一个实施例包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO. 9) 或其等效物。接头由多核苷酸序列GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC (SEQ ID NO. 10) 或其等效物编码。在一个实施例中，由接头序列分隔的两个抗原结合片段为IL21和MICA（例如，野生型MICA或MICA突变体，如MUC-30或MICA-129Met）或其各自的片段或等效物。在一个实施例中，由接头序列分隔的两个抗原结合片段为GD2和MICA（例如，野生型MICA或MICA突变体，如MUC-30或MICA-129Met）或其各自的片段或等效物。在一个实施例中，由接头序列分隔的两个抗原结合片段为IL21和GD2，或其各自的片段或等效物。在另一个实施例中，接头插入以下任何三特异性接合器的抗原结合片段之间：
IL21-MICA129-GD2
MICA129-IL21-GD2
GD2-IL21-MICA129
GD2-MICA129-IL21
IL21-MICA/V129M-GD2-HDD
MICA/V12M-IL21-GD2-HDD
GD2-IL21-MICA129-HDD
GD2-MICA129-IL21-HDD。
在另一实施例中，dimert（例如，双特异性或三特异性接合器）包含分泌共有序列（在本文中也称为sec0A）。在某些情况下，分泌共有序列（sec0A）包含与MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA（SEQ ID NO: 51）至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或由SEQ ID NO: 51组成。在某些情况下，sec0A由包含ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCC (SEQ ID NO: 52)或其等效物的多核苷酸编码。
在某些情况下，所述分泌共有序列进一步在序列的C末端包含一个、两个、三个、四个或更多残基。在某些情况下，一个、两个、三个、四个或更多残基是具有脂肪族侧链的残基（例如，Ala、Met、Ile、Val或Leu）。在某些情况下，一个、两个、三个、四个或更多残基为Ala残基、Gly残基、Val残基、Ile残基或其组合。在某些情况下，一个、两个、三个、四个或更多残基为Ala残基、Gly残基、Val残基或其组合。在某些情况下，一个、两个、三个、四个或更多残基为Ala残基、Gly残基或其组合。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个、三个、四个或更多的Ala残基。在某些情况下，分泌一致性序列在序列的C端进一步包含一个、两个、三个、四个或更多的Gly残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个、三个、四个或更多的Val残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个、三个、四个或更多的Ile残基。
在某些情况下，分泌共有序列进一步包含一个、两个或三个具有脂肪族侧链的残基（例如，Ala、Met、Ile、Val或Leu）。在某些情况下，一个、两个或三个残基是Ala残基、Gly残基、Val残基、Ile残基或其组合。在某些情况下，一个、两个或三个残基是Ala残基、Gly残基、Val残基或其组合。在某些情况下，一个、两个或三个残基是Ala残基、Gly残基或其组合。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个或三个Ala残基。在某些情况下，分泌一致性序列在序列的C末端进一步包含一个、两个或三个Gly残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个或三个Val残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个或三个Ile残基。
在某些情况下，分泌共有序列进一步包含一个或两个具有脂肪族侧链的残基（例如，Ala、Met、Ile、Val或Leu）。在某些情况下，一个或两个残基是Ala残基、Gly残基、Val残基、Ile残基或其组合。在某些情况下，一个或两个残基是Ala残基、Gly残基、Val残基或其组合。在某些情况下，一个或两个残基是Ala残基、Gly残基或其组合。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个或两个Ala残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个或两个Gly残基。在某些情况下，分泌一致性序列在序列的C末端进一步包含一个或两个Val残基。在某些情况下，分泌一致性序列在序列的C末端进一步包含一个或两个Ile残基。
在某些情况下，分泌共有序列进一步包含一个具有脂肪族侧链的残基（例如，Ala、Met、Ile、Val或Leu）。在某些情况下，残基是Ala残基、Gly残基、Val残基、Ile残基或其组合。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个Ala残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个Gly残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个Val残基。在某些情况下，分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个Ile残基。
在某些情况下，分泌共有序列在序列的C端进一步包含一个或两个Ala残基，并且此类序列被称为secrecon1A（或sec1A），其中一个Ala位于C端，而secrecon2A（或sec2A）具有两个Ala残基位于C端。在某些情况下，sec1A具有与MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAA (SEQ IDNO: 53)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在某些情况下，sec1A由包含ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCC (SEQ IDNO: 54)或其等效物的多核苷酸编码。在某些情况下，sec2A具有与MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAAA (SEQ ID NO: 55)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在某些情况下，sec2A由包含ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCCGCC (SEQ ID NO: 56)或其等效物的多核苷酸编码。
在一些实施例中，分泌共有序列调节dimert的表达和/或分泌。在某些情况下，分泌共有序列（例如，sec1A或sec2A）增强dimert的表达和/或分泌。在某些情况下，分泌共有序列（例如，sec1A或sec2A）调节（例如，增强）dimert的表达约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或更多。在某些情况下，分泌共有序列（例如，sec1A或sec2A）调节（例如，增强）dimert的分泌约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或更多。
在一些实施例中，本文所述的dimert（例如，三特异性接合器）包含分泌共有序列（例如，sec0A、sec1A或sec2A）、IL21序列（例如，SEQ ID NO:3）、MICA序列（例如，野生型序列、MUC-30或MICA-129Met）、抗GD2肽序列或其中一个或多个的等效物。在某些情况下，dimert（例如，三特异性接合器）包含secrecon1A序列、IL21序列、MICA129序列、抗D2肽序列或其一种或多种等效物。在一个实施例中，dimert（例如，三特异性接合器）包含secrecon1A-接头-IL21-接头-MICA129-接头-抗GD2肽或其中一个或多个的等效物。在一个实施例中，dimert（例如，三特异性接合器）包含SEQ ID NO:11的多肽序列。
SEQ ID NO. 11
MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAARSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSGGGGSGGGGSGGGGSEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLAEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETEEWTMPQSSRAQTLAMNIRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYKFTEYTMHWVKQSHGKCLEWIGGINPNNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDTTVPYAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASSVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPLTFGCGTKLEIKRASTKGP或其等效物。
在一个实施例中，dimert（例如，三特异性接合器）由SEQ ID NO. 12的序列编码。
SEQ ID NO. 12
ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCCAGAAGCAGCCCCGGCAACATGGAGAGAATCGTGATCTGCCTGATGGTGATCTTCCTGGGCACCCTGGTGCACAAGAGCAGCAGCCAGGGCCAGGACAGACACATGATCAGAATGAGACAGCTGATCGACATCGTGGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCCGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGAGCGCCTTCAGCTGCTTCCAGAAGGCCCAGCTGAAGAGCGCCAACACCGGCAACAACGAGAGAATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGAGAAAGCCCCCCAGCACCAACGCCGGCAGAAGACAGAAGCACAGACTGACCTGCCCCAGCTGCGACAGCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGATTCAAGAGCCTGCTGCAGAAGATGATCCACCAGCACCTGAGCAGCAGAACCCACGGCAGCGAGGACAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGCCCCACAGTCTTCGTTATAACCTCACGGTGCTGTCCTGGGATGGATCTGTGCAGTCAGGGTTTCTCGCTGAGGTACATCTGGATGGTCAGCCCTTCCTGCGCTGTGACAGGCAGAAATGCAGGGCAAAGCCCCAGGGACAGTGGGCAGAAGATGTCCTGGGAAATAAGACATGGGACAGAGAGACCAGGGACTTGACAGGGAACGGAAAGGACCTCAGGATGACCCTGGCTCATATCAAGGACCAGAAAGAAGGCTTGCATTCCCTCCAGGAGATTAGGGTCTGTGAGATCCATGAAGACAACAGCACCAGGAGCTCCCAGCATTTCTACTACGATGGGGAGCTCTTCCTCTCCCAAAACCTGGAGACTGAGGAATGGACAATGCCCCAGTCCTCCAGAGCTCAGACCTTGGCCATGAACATCAGGAATTTCTTGAAGGAAGATGCCATGAAGACCAAGACACACTATCACGCTATGCATGCAGACTGCCTGCAGGAACTACGGCGATATCTAAAATCCGGCGTAGTCCTGAGGAGAACAGTGCCCCCCATGGTGAATGTCACCCGCAGCGAGGCCTCAGAGGGCAACATTACCGTGACATGCAGGGCTTCTGGCTTCTATCCCTGGAATATCACACTGAGCTGGCGTCAGGATGGGGTATCTTTGAGCCACGACACCCAGCAGTGGGGGGATGTCCTGCCTGATGGGAATGGAACCTACCAGACCTGGGTGGCCACCAGGATTTGCCAAGGAGAGGAGCAGAGGTTCACCTGCTACATGGAACACAGCGGGAATCACAGCACTCACCCTGTGCCCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGACCAGCGGCTACAAGTTCACCGAGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGTGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGAAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACACCACCGTGCCCTACGCCTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCACCAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCAGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCACCAGAGAAGCAGCTACCCCCTGACCTTCGGCTGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAGCCAGCACCAAGGGCCCCTAG或其等效物。
在一个实施例中，dimert（例如，双特异性接合器）包含secrecon1A序列（sec1A）、CD3序列和抗GD2肽序列，或其中一个或多个的等效物。在一个实施例中，双特异性接合器包含序列ID NO.13的多肽序列，排列为sec1A-抗CD3-接头-抗GD2-HDD。sec1A部分带有下划线。抗CD3部分为粗体。抗GD2部分有下划线和斜体。灰色阴影区域表示HDD部分，其包含以粗体显示的HDD肽、小写字母的HDD肽上游铰链区和小写字母的HDD肽下游间隔区。
SEQ ID NO. 13
MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAAQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYKFTEYTMHWVKQSHGKCLEWIGGINPNNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDTTVPYAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASSVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPLTFGCGTKLEIKRASTKGPGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGGGVVQP GRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPED TGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYM NWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
Figure 710324DEST_PATH_IMAGE001
Figure 96305DEST_PATH_IMAGE002
或其等效物。
在另一实施例中，包含sec1A序列、抗CD3序列和抗GD2肽序列或或其中一个或多个的等效物。dimert（例如，双特异性接合器）在一方面由SEQ ID NO.14的序列编码。
SEQ ID NO. 14
ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGACCAGCGGCTACAAGTTCACCGAGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGTGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGAAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACACCACCGTGCCCTACGCCTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCACCAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCAGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCACCAGAGAAGCAGCTACCCCCTGACCTTCGGCTGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAGCCAGCACCAAGGGCCCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGATACACCATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAGATTCACCATCAGCAGAGACAACAGCAAGAACACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGAGACCCGAGGACACCGGCGTGTACTTCTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCAGAACCCCCCTGGGCGACACCACCCACACCAGCGGCATGGTGAGCAAGCTGAGCCAGCTGCAGACCGAGCTGCTGGCCGCCCTGCTGGAGAGCGGCCTGAGCAAGGAGGCCCTGATCCAGGCCCTGGGCGAGGGCAGCGGCGGCGCCCCCTAG或其等效物。
在另一个实施例中，dimert（例如，双特异性接合器）包含secrecon1A序列、抗CD19序列和抗CD3序列，排列为sec1A-抗CD19-接头-抗CD3。该双特异性接合器包含SEQ IDNO.15的多肽序列。sec1A部分带有下划线。
SEQ ID NO. 15
MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAADIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHHTPLGDTTHTSGMVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEGSGGAP或其等效物。
在另一个实施例中，dimert（例如，双特异性接合器）包含secrecon1A序列、抗CD19序列和抗CD3序列，排列为sec1A-抗CD19-接头-抗CD3，或其中一个或多个的等效物。一方面，它由SEQ ID NO. 16的多核苷酸序列编码。
SEQ ID NO. 16
ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGAGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAGACCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAAGAGAGACCACCACCGTGGGCAGATACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCAGACCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCAGATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGCACCACCACCACCACCACACCCCCCTGGGCGACACCACCCACACCAGCGGCATGGTGAGCAAGCTGAGCCAGCTGCAGACCGAGCTGCTGGCCGCCCTGCTGGAGAGCGGCCTGAGCAAGGAGGCCCTGATCCAGGCCCTGGGCGAGGGCAGCGGCGGCGCCCCCTA或其等效物。
在一些实施例中，dimert包含称为secreconAA（sec2A）的分泌信号。在某些情况下，dimert包含与来自Blinatumomab（靶向CD3和CD19）的氨基酸序列串联的secreconAA。在某些情况下，secreconAA-BlinatumAb（或sec2A-CD19xCD3）包含SEQ ID NO:29的多肽序列，其中secreconAA部分加下划线。
SEQ ID NO: 29
MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAAADIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH或其等效物。
在一些实施例中，包含sec2A-CD19xCD3的dimert由SEQ ID NO:30的多核苷酸序列编码。
SEQ ID NO: 30
ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCCGCCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGAGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAGACCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAAGAGAGACCACCACCGTGGGCAGATACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCAGACCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCAGATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGCACCACCACCACCACCACTAG或其等效物。
在一些实施例中，dimert包含排列在sec1A-CD19xCD3中的 secreconA（sec1A）序列、CD19和CD3，或其中一个或多个的等效物。一方面，它由SEQ ID NO:31的多核苷酸序列编码。
SEQ ID NO: 31
ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGAGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAGACCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAAGAGAGACCACCACCGTGGGCAGATACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCAGACCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCAGATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGCACCACCACCACCACCACTAG或其等效物。
在一些实施例中，dimert包含排列在sec0A-CD19xCD3中的secrecon（sec0A）序列、CD19和CD3，或其中一个或多个的等效物。一方面，它由SEQ ID NO:32的多核苷酸序列编码。
SEQ ID NO: 32
ATGTGGTGGAGACTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGAGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAGACCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAAGAGAGACCACCACCGTGGGCAGATACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCAGACCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCAGATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGCACCACCACCACCACCACTAG或其等效物。
在一些实施例中，dimert包含排列为CD19xCD3的不含有secrecon序列的CD19和CD3序列，或其中一个或两个的等效物。一方面，它由SEQ ID NO:33的多核苷酸序列编码。
SEQ ID NO: 33
ATGGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGAGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAGACCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAAGAGAGACCACCACCGTGGGCAGATACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCAGACCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCAGATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGCACCACCACCACCACCACTAG或其等效物。
一方面，所述双特异性T细胞接合器包含具有与SEQ ID No.12和13中任何一个至少95%相同的多肽序列，或者至少96%、或至少97%、或98%、或至少99%的同一性。在一个实施例中，三特异性抗体包括第一抗体或其抗原结合片段、第二抗体及其抗原结合片段和第三抗体或其抗原结合片段。另一方面，三特异性抗体具有与SEQ ID NO.11至少95%序列同一性的多肽序列、或至少96%、或至少97%、或98%、或至少99%的序列同一性。
在进一步的方面，重组多核苷酸表达前体mRNA，当所述前体mRNA与吗啉基寡核苷酸接触时，前体mRNA编码三特异性抗体。
一方面，抗原结合结构域是抗体的单链可变片段。
在进一步的方面，重组多核苷酸或载体进一步包含编码分泌肽的多核苷酸序列。在另一方面，载体进一步包含编码二聚化结构域的多核苷酸序列。在另一方面，所述载体包括5'反向末端重复序列（ITR）和3' ITR。在另一方面，载体具有与SEQ ID No. 4、6、8、12、15、16、30-33或其等效物的序列、或多核苷酸至少95%、或至少96%、或至少97%、或任98%、或至少99%的同一性。该载体的非限制性实例包括：重组病毒载体，其包含选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、小鼠白血病病毒（“MLV”）载体、爱泼斯坦-巴尔病毒（“EBV”）载体、腺病毒载体、疱疹病毒（“HSV”）载体、腺相关病毒（“AAV”）载体、AAV载体或任选地自互补AAV载体的骨架载体。这些被任选地可检测地标记。还提供被任选地可检测地标记的多核苷酸的互补序列。
重组多核苷酸载体可包含在宿主细胞内，例如原核细胞或真核细胞内。通过在允许多核苷酸复制和任选地表达多核苷酸的条件下培养含有多核苷酸的细胞，所述细胞可用于重组表达或复制多核苷酸。多核苷酸和/或表达产物任选地从细胞培养物中分离。
本发明还提供了一种病毒包装系统，包括：如上所述的载体，其中骨架来自质粒、病毒；包装质粒；和包膜质粒。包装质粒含有核苷、衣壳蛋白和基质蛋白。专利文献中也描述了包装质粒的实例，例如，美国专利号7,262,049、6,995,258、7,252,991和5,710,037。该系统还包含编码由包膜质粒提供的包膜蛋白的质粒。
本发明还提供了合适的包装细胞系。一方面，包装细胞系是HEK-293细胞系。本领域已知其他合适的细胞系，例如，在美国专利号7,070,994、6,995,919、6,475,786、6,372,502、6,365,150和5,591,624中描述的。
本发明还提供了一种制备AAV颗粒的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：在适合包装病毒载体的条件下，用如上所述的病毒系统转导包装细胞系。此类条件在本领域中是已知的，并在本文中简要描述。可以使用本领域技术人员已知的方法，例如离心，从细胞上清液中分离病毒颗粒。本发明进一步提供了这种分离的颗粒。
本发明进一步提供通过该方法产生的分离的AAV病毒颗粒。病毒颗粒包含如本文所述的多核苷酸，或基本上由如本文所述的多核苷酸组成，或由如本文所述的多核苷酸组成。
宿主细胞
进一步提供了一种分离的细胞或细胞群，其包含分离的多核苷酸、病毒颗粒、载体和包装系统，或基本上由其组成，或由其组成，如上文所述并通过引用并入本文。一方面，所述分离的细胞是包装细胞系。
还提供了一种分离的细胞或细胞群，其包含如本文所述的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。
本文所述的分离细胞可以是以下物种的任何细胞：小鼠、大鼠、兔子、猿猴、牛、绵羊、猪、犬科动物、猫科动物、农场动物、运动动物、宠物、马和灵长类动物，尤其是人类细胞。
载体和细胞可被包含在包含载体和/或宿主细胞和载体（例如医药上可接受的载体）的组合物中。它们可针对各种给药模式配制，并包含有效量的对患者、疾病或病症、载体和给药模式有效的载体和/或宿主细胞。一方面，给药方式是全身或静脉内注射。另一方面，通过直接注射进行局部给药。一方面，吗啉基寡核苷酸与载体同时接触或在载体之后接触。或者，在载体之前接触吗啉基寡核苷酸。
使用方法
多核苷酸和载体可用于治疗多种疾病或病症。一方面，提供了一种递送转基因的方法。该方法包括向待治疗的细胞、组织或患者施用有效量的包含转基因的多核苷酸或载体。一方面，将有效量的反义寡核苷酸（例如吗啉基寡核苷酸）施用至待治疗的细胞、组织或患者。提供了转基因的非限制性示例，并根据该方法的目的进行选择。细胞或组织可以是哺乳动物，例如人类。一方面，反义寡核苷酸（例如吗啉基寡核苷酸）与载体同时接触或在载体之后接触。或者，在载体之前接触。另一方面，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将载体引入细胞。
本文还提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法。该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向受试者施用有效量的如本文所述的重组病毒载体或细胞。在另一方面，该方法还包括向受试者施用有效量的反义寡核苷酸（例如吗啉基寡核苷酸）。一方面，向受试者施用有效量的抗癌剂。抗癌剂的非限制性实例包括抗癌肽、多肽、核酸分子、小分子、病毒颗粒或其组合。在另一方面，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将载体引入细胞。该疗法可以作为一线、二线、三线、四线或五线治疗来实施。该疗法可以是辅助疗法，也可以与其他癌症疗法相结合。
在所公开方法的一个方面中，病毒颗粒是溶瘤HSV颗粒。
施用
本发明的重组多核苷酸和/或载体（例如AAV）、病毒颗粒或组合物的施用可在整个治疗过程中以一剂、连续或间歇的方式进行。可通过任何合适的施用方式给药，包括但不限于：静脉内、动脉内、肌肉内、心内、鞘内、脑室下、硬膜外、脑内、脑室内、视网膜下、玻璃体内、关节内、眼内、腹腔内、宫内、皮内、皮下、经皮、跨粘膜和吸入。在某些情况下，施用方式包括肠胃外给药。在一个实施方案中，通过肌肉内注射或静脉内注射施用重组多核苷酸或载体或组合物。在另一实施例中，全身地施用重组多核苷酸或载体或组合物。在另一实施例中，通过注射、输注或植入将重组多核苷酸或载体或组合物经肠胃外施用。
确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的和被治疗的受试者而变化。可由治疗医师选择剂量水平和模式进行单次或多次施用。值得注意的是，剂量可能受施用途径的影响。本领域已知适当剂量的制剂和施用方法。这类合适剂量的非限制性示例可低至每次给药1E+9个载体基因组至高达1E+17个载体基因组。
在本文所述方法的一些实施例中，施用到受试者的病毒颗粒（例如AAV）的数量范围为约109至约1017。在具体实施例中，向受试者施用约1010至约1016、约1010至约1015、约1010至约1012、约1011至约1013，约1011至约1012、约1011至约1014、约1011至约1015、约1011至约1016、约5x1011至约5x1012、或约1012至约1013个病毒颗粒。在某些情况下，向受试者施用约1011至约1012个病毒颗粒。在某些情况下，向受试者施用约1013至约1015个病毒颗粒。在某些情况下，向受试者施用约109至约1012个病毒颗粒。在某些情况下，向受试者施用约109至约1011个病毒颗粒。在某些情况下，施用的病毒颗粒量基于受试者的体重。本领域技术人员将理解如何调节递送的病毒颗粒的量，以使得递送给受试者的总量范围为约109至约1017、任选地约1010至约1016、约1010至约1015、约1010至约1012、约1011至约1013、约1011至约1012、约1011至约1014，约1011至约1015、约1011至约1016、约5x1011至约5x1012、或约1012至约1013个病毒颗粒。在某些情况下，受试者是儿科受试者（例如，18岁以下的受试者）。在一些情况下，向儿科受试者施用约109至约1012、约1010至约1012、约1011至约1012、或约109至约1010个病毒颗粒。
在另一方面，本发明的病毒颗粒和组合物可与其他治疗结合施用，例如，适用于癌症及其相关疾病或病症的经批准的治疗。
当检测到以下一种或多种情况时，确定成功治疗和/或修复：缓解或改善受试者的一种或多种疾病、病症或状况；减轻受试者疾病、病症或状况的程度，疾病、病症或状况的稳定（即，不恶化）；延迟或减缓受试者疾病、病症或状况的进展；以及受试者疾病、病症或状况的改善或缓解。在一些实施例中，通过检测从受试者分离的一个或多个细胞、组织或器官中修复的靶多核苷酸的存在来确定治疗的成功。在一些实施例中，通过检测从受试者分离的一个或多个细胞、组织或器官中存在由修复的靶多核苷酸编码的多肽来确定治疗的成功。
试剂盒
在一些实施例中，本文所述的试剂、载体或组合物可组装成药物或诊断或研究试剂盒，以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。在一些实施例中，本发明的试剂盒包含以下中的一种或多种：如本文所述的经修饰的病毒衣壳蛋白、分离的多核苷酸、载体、宿主细胞、重组病毒颗粒、重组表达系统、经修饰的AAV、经修饰的细胞、分离组织、组合物或药物组合物。
在一些实施例中，试剂盒进一步包括使用说明。具体而言，此类试剂盒可包括本文所述的一种或多种试剂，以及描述这些试剂的预期应用和正确使用的说明书。例如，在一个实施例中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并应用于受试者的说明。在某些实施例中，试剂盒中的试剂为适合于特定应用和施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可能包含用于进行各种实验的适当浓度或数量的成分。
试剂盒的设计可以促进本文所述方法的使用，并可采用多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以液体形式（如溶液）或固体形式（如干粉）提供。在某些情况下，例如通过添加合适的溶剂或其他种类（例如，水或细胞培养基），一些组合物可以是可组合的或以其他方式可加工的（例如，成为活性形式），其可以与试剂盒一起提供，也可以不与试剂盒一起提供。在一些实施例中，所述组合物可在保存溶液（例如，低温保存溶液）中提供。保存溶液的非限制性示例包括DMSO、多聚甲醛和CryoStor®（Stem Cell Technologies，加拿大，温哥华）。在一些实施例中，保存溶液包含一定量的金属蛋白酶抑制剂。
如本文所用，“说明”可定义说明和/或宣传的组成部分，且通常涉及对所述方法、重组载体或组合物的包装或与之相关的书面说明。说明还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明，以使得用户将清楚地认识到说明将与试剂盒相关联，例如，视听（例如，录像带、DVD等）、互联网和/或基于网络的通信等。在一些实施例中，书面说明采用监管药品或生物产品制造、使用或销售的政府机构规定的格式，该说明也可反映经动物管理机构批准的制造、使用或销售。
在一些实施例中，试剂盒在一种或多种容器中包含本文所述的任何一种或多种组件。因此，在一些实施例中，试剂盒可包括容纳本文所述试剂的容器。这些试剂可以是液体、凝胶或固体（粉末）的形式。制剂可无菌制备、包装在注射器中并冷藏运输。或者，可以将其置于小瓶或其他容器中进行储存。第二种容器可装有经灭菌制备的其它试剂。或者，试剂盒可包括预混合的活性剂，并在注射器、小瓶、试管或其他容器中运输。试剂盒可具有向受试者施用药剂所需的一种或多种或所有组件，例如注射器、局部施用装置或IV针管和袋子。
本文所述的治疗可与适当的诊断技术相结合，以识别和选择用于该治疗的患者。
生产方法
在本发明提供的附加方法中，是一种在细胞中产生双特异性抗体或三特异性抗体的方法，包括将含有本文所述载体的细胞与有效量的吗啉基寡核苷酸接触。在一个实施例中，吗啉基寡核苷酸具有与SEQ ID NO. 27 (CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATT)或SEQ IDNO. 28 (TAAAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATC)或其等效物至少95%相同的多核苷酸序列。一方面，吗啉基寡核苷酸与载体同时接触或在载体之后接触。或者，在载体之前接触。所述双特异性抗体的非限制性实例具有与SEQ ID NO: 13和15中任意一个至少95%相同的多肽序列，或者具有与SEQ ID NO:13和15中任意一个至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%相同的序列。在另一方面，三特异性抗体具有与SEQ ID NO:11至少95%相同的多肽序列，或者具有与SEQ ID NO:11至少96%、或者至少97%、或者至少98%、或者至少99%相同的序列。
在另一方面，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将载体引入细胞。细胞的非限制性示例包括成纤维细胞、骨骼细胞、上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、内分泌细胞、黑素细胞、血细胞或其组合。
进一步提供包含一种或多种如本文所述的载体、细胞或组合物的试剂盒，任选地具有说明文件或材料。
具体实施方案
有几种方法通过外显子跳跃原理来调节基因表达。
一方面，至少需要三个外显子才能在该策略中跳过一个外显子。对于三个外显子结构，有两个剪接供体和两个剪接受体位点，如图1所示。第一供体位点剪接到第一受体位点（图1中的“a”），或者，剪接到第二受体位点（图1中的“c”）。第二供体位点只能剪接到第二受体位点（图1中的“b”）。因此，这种三外显子/两内含子结构可以产生5种可能的RNA结构，这取决于是否发生剪接、是否只发生一个剪接事件（a、b或c）或两个剪接事件（a+b）。
构建序列特异性寡核苷酸（“寡核苷酸”），其特异性地干扰每个剪接事件，通常在剪接供体或受体位点，或在剪接体组分的一个结合位点（有时在内含子的中间）。为了本实施例的目的并且如图1所示，每个寡核苷酸基于其是否干扰供体或受体被分类为1-供体（1D）、2-受体（1A）、2-供体（2D）或3-受体（3D）。
例如，由于选择性剪接或寡核苷酸的干扰，基因的外显子2在癌细胞中被跳过，但仍保留在正常细胞中。在该实施例中，包含被跳过的外显子的正常基因在癌细胞中不表达，但在正常细胞中表达蛋白质。该结构中外显子2两侧的内含子序列可用于重现转基因中相同的剪接模式。因此，在正常细胞和肿瘤细胞中剪接的典型内含子-外显子-内含子结构中包含转基因的构建体保持相对有效的剪接，并产生高水平的完全剪接转录本（外显子1+2+3，利用剪接a+b）。此外，当寡核苷酸阻断内含子a或内含子b（或两者）的剪接时，外显子2被跳过以生成融合外显子1到外显子3的转录本。因此，图1中所示的“理论上可能”转录本的相对预期丰度在图2中被修改以显示可能丰富的转录本。
在一个实施例中，基于上述剪接概念，使用寡核苷酸和“外显子跳跃”技术将转基因从包含外显子1、外显子2和外显子6的转录本转换为包含外显子1和外显子3的转录本。因此，构建体或载体产生由外显子1与外显子3融合的转录本编码的功能性多肽。在一个实施例中，终止密码子被设计成可操作地连接到外显子2，从而在没有寡核苷酸干扰以跳过外显子2的情况下，转录在外显子3翻译之前停止于终止密码子。过早的终止密码子导致包含外显子1、外显子2和外显子3的非功能性转录本。在一个实施例中，在所有三个阅读框中放置终止密码子以确保完全终止。在这种情况下，非功能转录本（外显子1+2+3）的基线切换为功能转录本（外显子1+2），如图3所示，因为核糖体在包括外显子3的终止密码子之后停止转录本的翻译。
这样的转基因的构建相当简单，但是选择了在正常情况下适当“剪接”的内含子-外显子STOP-内含子结构。内含子-外显子STOP-内含子可以使用位于正常剪接外显子两侧的序列进行工程化，并克隆到转基因中的特定位点，从而在两侧碱基中形成剪接供体和受体共有序列。因为从正常基因中提取序列的外显子也将被跳过，所以应该仔细选择外显子。例如，内含子-外显子-内含子可能来自剪接的DNA病毒基因，在这种情况下，正常细胞基因预计不会受到影响。或者，如果基因治疗应用是针对癌症，则可以考虑利用致癌基因内含子-外显子-内含子边界，这可能导致致癌基因的缺陷。这种策略将利用细胞基因的非靶向跳跃作为潜在的“额外”治疗效果。
与正常细胞相比，一些外显子在癌细胞中受到差异调节。例如，剪接类型2外显子在正常细胞中被“剪接入”，但在某些癌细胞中被排除在同一基因之外。在这种情况下，如果在构建中使用剪接类型2外显子的内含子-外显子-内含子边界（见图4），则转基因的基线和跳过的表达在正常细胞和癌细胞中会有所不同，如图5所示。因为工程化外显子STOP通常不存在于癌细胞中，转基因将在这些细胞中被激活，但不会在正常细胞中被激活（图5）。这种外显子可用于在癌细胞中选择性表达转基因，但即使在没有外显子跳跃的情况下也不能在正常细胞中表达。例如，对于毒素基因或药物前体酶来说，这种情况可能是可取的。使用寡核苷酸跳过外显子2将激活正常细胞中的转基因，如果这些细胞中的基线跳跃小于100%，则可能增加癌细胞中的表达。
相反，剪接类型3外显子在正常细胞中被排除，但在某些癌细胞中被“剪接入”。因此，利用这种外显子的调控剪接将产生与剪接类型2相反的结果，如图6所示。
综上所述，已公开了以下的策略，以实现在基因治疗背景下调控转基因表达的目的：
策略#1：转基因表达的激活依赖于外显子跳跃寡核苷酸的施用。在正常细胞和癌细胞中都可以看到这种效果。
策略#2：在没有任何药物或外部添加剂的情况下，转基因表达的激活在某些癌细胞中通常较高（仅在某些癌症中），而在正常细胞中较低。该应用可用于具有适当调节剪接的癌症进行癌症选择性表达。除了特定的癌细胞外，施用外显子跳跃寡核苷酸将激活正常细胞中的表达。
策略#3：转基因表达的激活在正常细胞中较高，但在某些癌细胞中较低。施用外显子跳跃寡核苷酸可以激活这些癌细胞的表达。
尽管可控基因表达的原理可以应用于任何基因治疗应用，但癌症治疗的基因治疗是一种特殊应用。在该实施例中，可在需要时通过施用适当的外显子跳跃寡核苷酸来激活在正常细胞中表达和分泌的治疗药物。
出于这些目的，申请人设计了来自KRAS基因外显子1的内含子-外显子STOP-内含子盒，作为策略#1构建体的示例，以插入到感兴趣的转基因中来实现可调控的基因表达。选择诱导外显子跳跃的寡核苷酸用于治疗应用。
一方面，申请人利用了KRAS基因的结构，该基因是癌症中最常见的突变基因之一。KRAS不是一种酶，在其表面没有明显的药物结合袋，因此不能作为药物靶点。因此，就申请人所知，这种跳跃技术是第一种靶向癌症中KRAS的方法。出于这些目的，申请人的构建体利用5'非翻译区中KRAS的第一外显子，蛋白质翻译的ATG起始密码子位于第二外显子内。（因此，第二个外显子通常被称为外显子1，第一个外显子称为外显子0）。诱导包含ATG的外显子的外显子跳跃的寡核苷酸将导致转录本不能正常翻译，因为缺少ATG起始密码子。
基于KRAS的内含子-外显子STOP-内含子
根据Genbank序列（NCBI参考序列：NG_007524.1，最后访问时间为2019年2月20日），KRAS的外显子位于：
4990..5170,10526..10647,28509..28687,30148..30307, 46010..51132，而cDNA加入于：10537..10647,28509..28687,30148..30307,46010..46126。
正常KRAS基因的第一个ATG位于10537位。
要跳过的外显子位于10526-10647（122 bp）之间。
该构建体包含每个阅读框中都有终止（STOP）密码子的假版本。
在一个实施例中，对于KRAS 1外显子，有阴影和下划线的核苷酸（包括KRAS的ATG）被终止密码子取代：
Figure 876043DEST_PATH_IMAGE003
示例性终止密码子为：TAA、TAG和TGA。一方面，所有三个阅读框均为：TAAxTAGxTGA，其中x为任意核苷酸。
为了连续两次设计所有3个终止密码子，可以插入终止密码子。此外，可以通过使用序列TAAxTAGxTGAxTAGxTAAxTGAx（24 bp）（SEQ ID No:1）避免11碱基对重复，其中x为任意核苷酸。具体实施例为：TAATTAGCTGAGTAGATAAGTGAT（SEQ ID No: 2）。因此，包含exonKras1STOP（终止密码子有下划线）的一个实施例是：
GCCTGCTGAAATAATTAGCTGAGTAGATAAGTGATGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAG (SEQ ID NO. 18)。
正常上游内含子为NCBI参考序列NG_007524.1的5171-10525（5355 bp）：“gtacg…ataag”，其中上游内含子的剩余部分显示为“…”。
正常下游内含子为NCBI参考序列NG_007524.1的10648-28508（17861 bp）：“gtaaa…ctcag”，其中下游内含子的剩余部分显示为“…”。
在一方面，包括两个内含子的上游和下游端上的大约75个碱基对（“bp”）。在一个实施例中，上游内含子序列如下：
GTACGGAGCGGACCACCCCTCCTGGGCCCCTGCCCGGGTCCCGACCCTCTTTGCCGGCGCCGGGCGGGGCCGGCGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAG (SEQ ID NO. 19)。
在一个实施例中，下游内含子序列如下：
GTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTGAGTTGTATATAACACCTTTTTTGAAGTAAAAGGTGCACTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAG (SEQ ID NO. 20)。
因此，在一个实施例中，以下序列为内含子-外显子Kras1STOP-内含子序列（无突出显示的序列为上游内含子，灰色序列为包含STOP序列的内含子，有下划线序列为下游内含子）：
Figure 740093DEST_PATH_IMAGE004
一方面，可以添加一系列跨越外显子-下游内含子边界的交界处的寡核苷酸，因为它们具有能够引起外显子跳跃的能力。外显子跳跃寡核苷酸通常是20-30个碱基对，与DNA反义。
在一个实施例中，吗啉基结合位点是Kras1衍生的内含子-外显子STOP-内含子吗啉基结合位点（SEQ ID NO. 26）。K1ExonStopIntron 3'连接序列的序列如下所示（外显子标记为灰色，内含子标记为有下划线）：
Figure 554466DEST_PATH_IMAGE005
申请人创建并测试了两个吗啉基结合位点，称为KTS1（SEQ ID NO. 24）和KTS2（SEQ ID NO. 25）。KTS1吗啉基序列包含SEQ ID NO. 27的序列。并且KTS2吗啉基序列包含SEQ ID NO. 28的序列。申请人使用KTS2吗啉基反向序列（SEQ ID NO. 29）作为阴性对照。
SEQ ID NO. 24—KTS1 (KRAS TransSkip 1)（外显子标记为灰色，内含子有下划线）
Figure 111349DEST_PATH_IMAGE006
SEQ ID NO. 27—KTS1吗啉基
CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATT
SEQ ID NO. 25—KTS2 (KRAS TransSkip 2)
Figure 378382DEST_PATH_IMAGE007
SEQ ID NO. 28—KTS2吗啉基
TAAAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATC
SEQ ID NO. 29—KTS2吗啉基反向序列
CTAGGTTGTTATCTCCATTTAGAACAAAAT。
在某些情况下，剪接供体位点包括A/C AG***GT A/G AGT（SEQ ID NO: 34），其中“***”表示外显子-内含子边界以及插入内含子-外显子STOP-内含子序列的位点。
在某些情况下，剪接受体包含（Py）XCAG***G/T（SEQ ID NO:35），其中“***”表示内含子-外显子边界。
在某些情况下，插入内含子-外显子STOP-内含子序列的示例性剪接供体位点包括AAG-GG（SEQ ID NO: 36）、CAG-GG（SEQ ID NO: 37）、AAG-GT（SEQ ID NO: 38）或CAG-GT（SEQID NO: 39），其中“-”表示插入位点。
CATAAVERT构建体
为了创建癌症靶向的AAV表达的调节的T（Cancer Targeted AAVexpressed,regulated T，CATAAVERT）接头（也称为“TransSkip”），将内含子-外显子Kras1Stop-内含子序列插入编码区的位点，该位点产生共有剪接供体和受体位点。在一个实施例中，包含调节的CATAAVERT 的载体表达CD3和GD2。
在另一个实施例中，载体包含编码secrecon-AA-CD3xGD2-HDD dimert的序列。对于该构建体，secrecon-AA-CD3xGD2-HDD dimert序列包含插入内含子-外显子Kras1 stop-内含子以产生共有剪接供体/受体（插入序列位于其中一个或多个5 bp中的第三个之后）的所有潜在位点（以灰色突出显示），提供如下：
Figure 29812DEST_PATH_IMAGE008
Figure 698691DEST_PATH_IMAGE009
Figure 160896DEST_PATH_IMAGE010
一方面，在最上游位点插入，以最小化在终止密码子之前翻译的CD3xGD2 dimert的长度（下划线序列是插入子剪接时保留在mRNA中的剪接点，双下划线序列是上游插入子序列开始处的剪接供体位点，灰色的序列是包含STOP序列的外显子，粗体的序列是下游内含子）。在某些例子中，该序列被称为CD3xGD2 K1 dimert：
Figure 915226DEST_PATH_IMAGE011
Figure 121079DEST_PATH_IMAGE012
Figure 362574DEST_PATH_IMAGE013
在某些情况下，上游剪接因子结合位点被修饰（修饰区域显示为斜体和粗体）。下划线序列是插入子剪接时保留在mRNA中的剪接点，双下划线序列是上游内含子序列开始处的剪接供体位点，灰色序列是包含STOP序列的外显子，粗体序列是下游内含子。在某些例子中，该序列被称为CD3xGD2 K2 dimert：
Figure 792418DEST_PATH_IMAGE014
Figure 502885DEST_PATH_IMAGE015
Figure 778008DEST_PATH_IMAGE016
在某些情况下，CD3xGD2 dimert构建体包含多核苷酸序列中的一个或多个额外的修饰。在某些情况下，CD3xGD2 dimert构建体为sec2A-CD3xGD2-HDD-K3，sec2A-CD3xGD2-HDD-K3的序列如SEQ ID NO:41所示。下划线的序列是内含子剪接时保留在mRNA中的剪接点，双下划线的序列是上游插入子序列开始处的剪接供体位点，灰色序列是包含STOP序列的外显子，粗体序列是下游内含子。
SEQ ID NO: 41
Figure 421479DEST_PATH_IMAGE017
Figure 225487DEST_PATH_IMAGE018
Figure 954409DEST_PATH_IMAGE019
Figure 502065DEST_PATH_IMAGE020
Figure 734463DEST_PATH_IMAGE021
在某些情况下，CD3xGD2 dimert构建体为sec2A-CD3xGD2-HDD-K4，sec2A-CD3xGD2-HDD-K4的序列如SEQ ID NO:42所示。下划线的序列是内含子剪接时保留在mRNA中的剪接点，双下划线序列是上游内含子序列开始处的剪接供体位点，灰色序列是包含STOP序列的外显子，粗体序列是下游内含子。
SEQ ID NO: 42
Figure 506110DEST_PATH_IMAGE022
Figure 920997DEST_PATH_IMAGE023
Figure 803503DEST_PATH_IMAGE024
在某些情况下，CD3xGD2 dimert构建体为sec2A-CD3xGD2-HDD-K5，sec2A-CD3xGD2-HDD-K5的序列如SEQ ID NO:43所示。下划线序列是内含子剪接时保留在mRNA中的剪接点，双下划线序列是上游内含子序列开始处的剪接供体位点，灰色序列是包含终止序列的外显子，粗体序列是下游内含子。
SEQ ID NO: 43
Figure 624828DEST_PATH_IMAGE025
Figure 567376DEST_PATH_IMAGE026
Figure 474152DEST_PATH_IMAGE027
在一些实施例中，本文所述的dimert包含CD3序列、CD19序列和任选的secrecon序列。在某些情况下，dimert包含如SEQ ID NO:44所述的CD3xCD19构建体，突出显示插入内含子-外显子-Kras1stop-内含子序列的所有潜在位点，以产生共有剪接供体/受体位点。每个潜在的插入位点都以灰色突出显示。
SEQ ID NO: 44
Figure 894769DEST_PATH_IMAGE028
Figure 85448DEST_PATH_IMAGE029
Figure 198898DEST_PATH_IMAGE030
在某些情况下，对最上游的位点进行插入。在某些情况下，dimert进一步包含secrecon序列。在某些情况下，CD3xCD19构建体是sec1A-CD3xCD19-K1，其序列如SEQ IDNO:45所示。如下所示，下划线序列是内含子剪接时保留在mRNA中的剪接点，斜体和粗体序列是上游内含子序列，灰色序列是包含STOP序列的外显子，粗体的序列是下游内含子。
SEQ ID NO: 45
Figure 858549DEST_PATH_IMAGE031
Figure 82857DEST_PATH_IMAGE032
Figure 347616DEST_PATH_IMAGE033
在某些情况下，CD3xCD19构建体是sec1A-CD3xCD19-K3，其序列如SEQ ID NO:46所示。如下所示，下划线序列是内含子剪接时保留在mRNA中的剪接点，斜体和粗体区域是上游内含子结合位点的修饰区域，灰色序列是包含STOP序列的外显子，粗体序列是下游内含子。
SEQ ID NO: 46
Figure 631967DEST_PATH_IMAGE034
Figure 513336DEST_PATH_IMAGE035
Figure 541334DEST_PATH_IMAGE036
实施例
提供这些示例仅用于说明目的，而不是限制此处提供的权利要求的范围。
实施例1 -利用示例性 CD3xGD2-HDD TransJoin生成 CD3xGD2-HDD Dimert
用于测试 CD3xGD2-HDD表达的示例性AAV构建体的图谱。
作为原理证明，表达了先前描述的双特异性分子，该分子靶向T细胞上的人类CD3和神经母细胞瘤和其他类型的癌细胞上的双唾液酸神经节苷脂GD2。该双特异性蛋白具有源自克隆OKT3的针对人CD3的重链和轻链可变区的氨基酸序列（使用单链可变片段的格式scFv），其通过短接头（L）融合至源自克隆5F11的针对 GD2的scFv 构建体，通过HNF1a二聚化结构域（HDD）作为二聚体连接，如Ahmed et al., OncoImmunology, 4:4, e989776,DOI: 10.4161/2162402X.2014.989776所报道的。使用vectorbuilder.com 密码子优化工具（//en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html）来逆向工程化 CD3xGD2-HDD的最佳人类DNA编码序列。合成了以ATG起始密码子开始的所得 DNA 序列，并将其克隆到鸡肌动蛋白 b 珠蛋白启动子（CAGp）下游的腺病毒相关病毒表达盒中，具有源自AAV2的反向末端重复序列。基于丙氨酸根据蛋白质增强分泌的发现（Güler-Gane et al., PLoS ONE11(5): e0155340. doi:10.1371/journal.pone.0155340），制备了其他三个版本，其包含的共有分泌信号结构域（“secrecon”，基于 Barash et al., Biochem Biophys Res Commun. 2002; 294: 835–842）位于ATG起始位点下游并以 0、1 或 2个丙氨酸结尾。源自这些构建体的蛋白质被称为异二聚体scFv或Dimert。图7说明了4个示例性CD3xGD2-HDDdimert构建体。
确定Dimert的结构和功能的测试。
用AAV表达载体（或对照）转导293T细胞并收集和储存上清液。在电泳（SDS-PAGE）上测试上清液是否存在正确大小的蛋白质，通过使用流式细胞术的结合竞争测定与CD3结合，通过流式细胞术激活 T 细胞，以及在与T细胞共孵育时杀死肿瘤细胞。见图8，其示出了用于确定本文公开的dimert的结构和功能的测定的卡通图。
含有分泌肽的三种构建体显示出较少的CD3xGD2-HDD Dimert保留在细胞中。
在转染后48小时收集用不同AAV CD3xGD2-HDD表达质粒转染的293T细胞的全细胞裂解物。使用每条泳道50ug的总蛋白质进行聚丙烯酰胺电泳（PAGE），并用丽春红S 对凝胶进行染色。结果显示，使用缺乏分泌序列的构建体#1104有更多蛋白质，而具有分泌序列的所有3种构建体都显示出较少的蛋白质。对照包括单独的细胞或用对照质粒 （pcDNA3-GFP）转染的细胞。KDa，千道尔顿；Sec，分泌结构域；GFP，绿色荧光蛋白；MW，分子量。见图9。
只有来自用包含分泌序列的AAV CD3xGD2-HDD构建体转染的细胞的上清液结合并激活T细胞。
检测上清液与人类T细胞的结合和激活。通过与预先结合到T（Jurkat）细胞的荧光标记的抗CD3抗体的竞争来确定结合。染色的细胞在对照组（DMEM、对照、GFP）中分别显示77.6%、79.24%和78.7%（Q2+Q3）CD3 阳性，而在缺乏分泌肽的AAV载体#1104中则为77.7%。相比之下，荧光标记的抗CD3抗体的结合被每个含有分泌肽的载体转染的细胞的上清液降低到 2.15%、3.67% 和 3.99%（Q2+Q3）。此外，细胞与作为T细胞活化标志物的抗CD69共染色。对照组和AAV载体#1104均显示低于13.4%的CD69阳性（Q1+Q2），而三种不同的含有分泌肽的AAV载体显示58.87-68.5%的CD69阳性。见图10。
方法细节：将400ul RPMI+10%FBS中的Jurkat 2e5个细胞/孔接种在24孔板中，然后向每个孔中加入100ul来自293T转染细胞的上清液（总培养物的20%）。孵育4小时后，将Jurkat细胞离心，用PBS洗涤 1 次，然后用PE-抗-hCD69（1:100）和PerCP-抗-hCD3e（1:300#OKT3）在冰上染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，将每个样品固定在1% PFA中并通过流式细胞术进行分析。DMEM是单独添加到Jurkat的培养基，对照是从未转染的293T细胞中添加的上清液，GFP是从用表达GFP的AAV质粒转染的293T细胞中添加的上清液。
只有来自用含有分泌肽的AAV载体转染的细胞的上清液激活人类T细胞。
人T（Jurkat）细胞与转染有各种AAV载体的293T细胞的上清液一起孵育，用PE标记的抗体染色CD69，并在荧光显微镜下检查。见图11，其中左侧小图是相衬，右侧小图是荧光。EGFP载体对照和缺乏分泌肽的载体#1104均未显示阳性染色，而其他三种载体则显示出高水平的染色（红色）。方法细节：将400ul RPMI+10%FBS中的Jurkat 2e5个细胞/孔接种到24孔板中，然后向每个孔中加入100 ul来自293T转染细胞的上清液（总培养物的20%）。孵育48小时后，将Jurkat细胞离心，用PBS洗涤 1 次，然后用藻红蛋白（PE）-抗 hCD69（1:100）在冰上染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，每个样品在1% PFA中固定 5 分钟。比例尺：100um。
CD3xGD2-HDD与T细胞的结合是剂量依赖性的。
来自用不同的含有分泌肽的AAV质粒转染的293T细胞的不同量的上清液被温育并测试与在Jurkat T细胞上的Peridinin叶绿素蛋白复合物（PerCP）-缀合的抗hCD3的竞争。见图12A，其中左侧小图显示FACS图，右侧小图显示中值染色水平数。左侧小图中的灰色阴影未染色，每个小图中的深灰色线表示未添加上清液的最大染色细胞。图12B显示了针对未染色对照标准化的中值染色水平的条形图。
方法细节：将在400ul RPMI+10%FBS中的Jurkat 2e5个细胞/孔接种到24孔板中，然后向每孔中加入10ul、25ul、50ul 或 100ul来自293T转染细胞的上清液（总培养物的2~20 %）。孵育24小时后，将Jurkat细胞离心，用PBS洗涤 1 次，然后在冰上用PerCP-抗-hCD3e（1:300 #OKT3）染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，每个样品在1% PFA中固定5分钟，然后通过流式细胞术进行分析。Sec = 分泌肽，A = 丙氨酸。
CD3xGD2-HDD Dimer的抗GD2臂的结合测定并确认GD2和CD3结合均存在于单个分子上。
通过首先将来自293T转染细胞的上清液与GD2阳性或GD2阴性细胞一起孵育，然后重复CD3 T细胞结合竞争试验，从而间接测量CD3xGD2-HDD与GD2的结合。结合GD2的蛋白质应该被GD2阳性细胞吸收，但不会被GD2阴性细胞吸收，导致T细胞结合的竞争丧失。该测定被设计成这样以确认GD2结合与CD3结合共联，换言之，单个分子是双特异性的。见图13 ，为结合测定的卡通图。
CD3xGD2-HDD结合CD3和GD2。
如图13所示，收集来自用#1101 CD3xGD2-HDD AAV载体转染的293T细胞的上清液，并与GD2阳性SK-N-Be(2)或GD2阴性Raji细胞预孵育。旋转和洗涤后，对CD3 T（Jurkat）细胞进行结合竞争试验。
图14说明结合CD3和GD2两者的示例性CD3xGD2-HDD Dimert。带有黑色轮廓的顶部小图中的灰色阴影是未染色的Jurkat T细胞，深灰色线是在没有添加上清液的情况下对CD3完全染色的Jurkat T细胞。样品Jurkat_cd3e显示使用上清液而没有预孵育的完全竞争的CD3结合，几乎与用GD2阴性Raji细胞预孵育的上清液重叠。相比之下，当上清液与GD2阳性SK-N-Be(2)神经母细胞瘤细胞预孵育时，样品Jurkat_cd3e sknbe2表现出竞争损失，证实同一分子结合CD3和GD2。
确定CD3xGD2-HDD是否诱导T细胞杀死GD2+靶细胞的测试。
图15说明了确定CD3xGD2-HDD是否诱导G2+靶细胞被T细胞杀死的测定流程图。如图15所示，将GD2+神经母细胞瘤（SK-N-Be(2)）细胞接种到孔中，然后是原代人类T细胞（购自StemExpress）和来自AAV载体转染的293T细胞的上清液。用来自Promega（Madison, WI）的CellTiter-Glo评估细胞活力。
分泌的CD3xGD2-HDD诱导神经母细胞瘤细胞的T细胞杀伤。
使用图15中所示的测定，在GD2+ SK-N-Be(2)神经母细胞瘤细胞上测试了人类T细胞加上上清液（来自用各种AAV载体质粒转染的293T细胞）的细胞毒性。使用10:1的T细胞与靶细胞比率。在共培养48小时后测定细胞的活力。与来自未转染细胞（“无Dimert”）的上清液相比，使用来自用表达不相关dimert（CD19xCD3）的构建体或缺乏分泌肽的载体（#1104）转染的细胞的上清液没有明显的细胞毒性（图16）。相反，用含有分泌肽的每种载体转染的细胞的上清液诱导统计学显著的细胞毒性（p<0.001），杀死25-30％的细胞（图16）。
T细胞介导的CD3xGD2-HDD Dimert的细胞毒性与GD2表达有关。
测试一组神经母细胞瘤细胞系对人T细胞杀伤的敏感性，结合来自AAV载体#1101的上清液（图17的上图）并通过流式细胞术测量它们的GD2表达（图17的下图，阴影曲线是同种型对照）。CHP-134细胞显示出最大的细胞毒性和最高的GD2表达。
实施例2 - 利用示例性CD19xCD3 TransJoin生成CD19xCD3 Dimert
用于测试CD19xCD3 Dimert表达的示例性AAV构建体的图谱。
FDA批准的蛋白质治疗剂被称为博纳吐单抗（blinatumomab），是一种所谓的双特异性T细胞接合器（BiTE），用于靶向B细胞/B细胞恶性肿瘤上的人类CD19和T细胞上的人类CD3。使用可公开获得的博纳吐单抗氨基酸序列（//www.drugbank.ca/drugs/DB09052）并进一步使用vectorbuilder.com密码子优化工具（//en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html）来逆向工程化CD19xCD3的最佳人类 DNA 编码序列。以ATG起始密码子开始的所得DNA序列被合成并克隆到鸡-肌动蛋白-b-珠蛋白启动子（CAGp）下游的腺病毒相关病毒表达盒中，具有源自AAV2的反向末端重复序列。基于丙氨酸根据蛋白质增强分泌的发现（Güler-Gane et al., PLoS ONE11(5): e0155340. doi:10.1371/journal.pone.0155340），制备了其他三个版本，其包含的共有分泌信号域（“secrecon”，基于Barash et al., Biochem Biophys Res Commun. 2002; 294: 835–842）位于ATG起始位点下游并以 0、1 或 2个丙氨酸结尾。源自这些构建体的蛋白质被称为异二聚体scFv或Dimert。图18A和图18B说明了5个示例性CD19xCD3构建体。
图18C说明了CD19 dimert与癌细胞和T细胞相互作用的卡通图。CD19 dimert由包含CD19 TransJoin的细胞产生。当例如静脉内给予受试者时，AAV TransJoin（例如，如该图所示的AAV CD19 TransJoin）进入正常细胞（例如肝脏或肌肉）并表达其编码的多肽。分泌信号肽在分泌过程中被切割，留下活性dimert，其在一端结合癌细胞（Ca），在另一端结合T免疫细胞。
只有用含有分泌序列的AAV CD19xCD2构建体转染的细胞的上清液结合并激活T细胞。
检测上清液与人类T细胞的结合和激活。通过与预先结合人T（Jurkat）细胞的荧光标记抗CD3抗体竞争来确定结合。染色的细胞在对照组（DMEM、对照、GFP）中分别显示77.6%、79.24%和78.7%（Q2+Q3）CD3阳性，而在缺乏分泌肽的载体#1323中为79.4%。相比之下，荧光标记的抗CD3抗体的结合被每个含有分泌肽的载体转染的细胞的上清液降低到23.88%、18.59%和30.76%（Q2+Q3）。此外，细胞与作为T细胞活化标志物的抗CD69共染色。对照组和#1323均显示低于13.38%的CD69阳性（Q1+Q2），而三种不同的含有分泌肽的载体显示63.9%、67.3% 和 66.6%的CD69阳性（图19）。
方法细节：将400ul RPMI+10%FBS中的Jurkat 2e5个细胞/孔接种在24孔板中，然后向每个孔中加入100ul来自293T转染细胞的上清液（总培养物的20%）。孵育48小时后，将Jurkat细胞离心，用PBS洗涤1次，然后用PE-抗-hCD69（1:100）和PerCP-抗-hCD3e（1:300 #OKT3）在冰上染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，将每个样品固定在1% PFA 中并通过流式细胞术进行分析。DMEM是单独添加到Jurkat的培养基，对照是从未转染的293T细胞中添加的上清液，GFP是从用表达GFP的AAV质粒转染的293T细胞中添加的上清液。
只有来自用含有分泌肽的AAV载体转染的细胞的上清液激活人类T细胞。
将人T（Jurkat）细胞与用各种AAV载体转染的293T细胞的上清液一起孵育，用PE标记的抗体染色 CD69，并在荧光显微镜下检查。见图20，左侧小图是相衬，右侧小图是荧光。EGFP 载体对照和缺乏分泌肽的AAV载体#1323均未显示阳性染色，而其他三种载体则显示出高水平的染色（红色）。
方法细节：将400ul RPMI+10%FBS中的Jurkat 2e5个细胞/孔接种在24孔板中，然后向每个孔中加入100ul来自293T转染细胞的上清液（总培养物的20%）。孵育 48 小时后，将Jurkat细胞离心，用PBS洗涤1次，然后用藻红蛋白（PE）-抗 hCD69（1:100）在冰上染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，每个样品在1% PFA中固定5分钟。比例尺：100um。
AAV分泌的CD19xCD3特异性结合CD19但不结合CD45。
使用结合竞争试验来确定来自AAV载体转染的293T细胞上清液的上清液是否会干扰两种不同抗体对爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）转化的人B细胞的染色，这两种抗体中一种染色B细胞标记物 CD19而另一种染色泛白细胞标记物CD45。
见图21，其中3个对照组（DMEM、对照、GFP）中的细胞分别显示出93%、93.1%和93.2%的CD19（Q1+Q2）阳性染色，而用缺乏分泌肽的AAV载体#1323转染的细胞上清液不竞争染色，显示93.2%的CD19阳性。相比之下，每个含有分泌肽的AAV载体都将CD19信号竞争出降低到33.33%、31.07%和35.88%。请注意，设置截止值使得未染色的细胞显示14.58%的CD19阳性，这表明来自用这三种AAV载体转染的细胞的上清液竞争降低到比背景高出2倍。相比之下，没有一个载体竞争CD45染色，在3个对照中分别为78.89%、79.14%和78.32%阳性（Q2+Q3），在缺乏分泌肽的载体中为82.9%，而使用来自用其他三种载体转染的细胞的上清液为80.5%、78.5% %和79.4%阳性。
方法细节：在400ul的 RPMI+10%FBS中以2e5个细胞/孔用被称为NB122R的EBV（Gene Ther. 2013 Jul;20(7):761-9. doi: 10.1038/gt.2012.93）转化B细胞，接种于24孔板，每孔加入100ul 293T转染细胞上清液（总培养物的2~20%）。孵育24小时后，将细胞离心，用PBS洗涤1次，然后用PEcy7-抗-hCD45（1:100）和APC-抗-hCD19（1:300）在冰上染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，每个样品在流式细胞术分析前在1% PFA中固定 5 分钟。DMEM是单独添加到Jurkat的培养基，对照是从未转染的293T细胞中添加的上清液，GFP是从用表达GFP的AAV质粒转染的293T细胞中添加的上清液。
CD19xCD3与T细胞的结合是剂量依赖性的，并且与其他测试载体相比，在分泌肽共有序列下游含有单个丙氨酸的载体更优。
来自用不同的含有分泌肽的AAV质粒转染的293T细胞的不同量的上清液被温育并测试与在Jurkat T细胞上的Peridinin叶绿素蛋白复合物（PerCP）-缀合的抗hCD3的竞争。见图22A，其中左侧小图显示FACS图，右侧小图显示中值染色水平数。每个左侧小图中的灰色阴影是未染色的细胞，每个左侧小图中的深灰色线是未添加上清液的最大染色细胞。图22B显示了标准化为未染色对照的中值染色水平的条形图。与其他测试载体相比，在分泌肽共有序列下游具有单个丙氨酸的载体#1325表现出最大的竞争，并被选择用于进一步的实验。
方法细节：将在 400ul RPMI+10%FBS中的Jurkat 2e5个细胞/孔接种到24孔板中，然后向每孔中加入10ul、25ul、50ul 或 100ul来自293T转染细胞的上清液（总培养物的2~20 %）。孵育24小时后，将Jurkat细胞离心，用PBS洗涤1次，然后在冰上用PerCP-抗-hCD3e（1:300 #OKT3）染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，每个样品在1% PFA中固定5分钟，然后通过流式细胞术进行分析。MFI = 平均荧光强度，Sec = 分泌肽，A = 丙氨酸。
CD19xCD3与B细胞的结合是剂量依赖性的，并且与其他测试载体相比，在分泌肽共有序列下游含有单个丙氨酸的载体更优。
来自用不同的含有分泌肽的AAV质粒转染的293T细胞的不同量的上清液被温育并测试与人B细胞上的别藻蓝蛋白（APC）-缀合的抗hCD19的竞争。见图23A，其中左侧小图显示FACS图，右侧小图显示中值染色水平数。每个左侧小图中的灰色阴影未染色，每个左侧面板中的深灰色线是未添加上清液的最大染色细胞。图23B显示了针对未染色对照标准化的中值染色水平的条形图。在分泌肽末端具有单个丙氨酸的载体#1325显示出最强的竞争性，与图22A和图22B中所示的T细胞结合结果一致，并被选择用于进一步的实验。
方法细节：将在400ul RPMI+10%FBS中的NB122R人B细胞以2e5个细胞/孔接种到24 孔板中，然后向每个孔中加入10ul、25ul、50ul或100ul来自293T转染细胞的上清液（总培养物的2~20%）。孵育24小时后，将细胞离心，用PBS洗涤1次，然后在冰上用 APC-抗-hCD19（1:300）染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，每个样品在1% PFA中固定5分钟，然后通过流式细胞术进行分析。MFI = 平均荧光强度，Sec = 分泌肽，A = 丙氨酸。
CD3 Dimert比抗CD3抗体更好地通过抗CD28共刺激激活T细胞。
人T（Jurkat）细胞与抗CD28抗体和源自AAV载体转染的293T细胞的上清液（图24的左图）或增加浓度的抗CD3抗体（图24的右图）共孵育。收获细胞mRNA并对IL-2（图24的上图）和IL-8（图24的下图）mRNA进行定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）并计算相对于管家mRNAGAPDH的表达。只有来自用含有分泌结构域的AAV载体构建体转染的细胞的上清液显示出高于对照（gfp，293t）和高于缺乏分泌结构域的载体构建体（对于CD3xGD2-HDD为#1104，对于CD19xCD3为#1323）中任一基因的刺激。
293T细胞对AAV8产生最高的转导效率。
通过含2%胎牛血清的培养基，以感染复数（MOI）=1e4或1e5个基因组拷贝（gc），用2种不同浓度的表达绿色荧光蛋白（GFP）的AAV8感染四种不同的细胞系。在病毒感染后48小时通过荧光显微镜评估GFP信号。见图25。AML-12：小鼠正常肝细胞；293T：SV40-T抗原转化的人胚肾细胞；H441-CRM：具有KRAS突变的人肺癌细胞；SK-N-Be(2)：NMYC 扩增的人类神经母细胞瘤细胞。
AAV8感染的细胞的上清液中的Dimert浓度取决于AAV剂量和转导效率。
对来自用TransJoin载体或AAV-GFP对照转染的293T和H441细胞的上清液进行T（Jurkat）结合测定。见图26，其中小图中的灰色阴影是未染色的对照细胞，每个小图中的深灰色线是用抗CD3抗体完全染色的T细胞。尽管CD19xCD3 Dimert在竞争结合方面似乎比CD3xGD2-HDD Dimert有效得多，但这种效应是剂量依赖性的（随着MOI升高，曲线向左移动），并且在AAV8转导效率较差的细胞系（H441细胞）中未观察到。MOI，感染复数。
单次静脉注射CD19xCD3 TransJoin选择性地消除人源化小鼠的B细胞。
购买了免疫缺陷小鼠（NSG-SGM3，Jackson Labs），这些小鼠已经被辐射并静脉内注射了人类CD34+造血干细胞。到12周时，小鼠通过外周血的流式细胞术显示植入了人血细胞，包括T和B淋巴细胞。单次注射 CD19xCD3 TransJoin（AAV8-Sec1A-CAG-193，包装到AAV8衣壳中的载体#1325）在小鼠中以不同剂量给药，并通过流式细胞术分析在不同时间点收集的人淋巴细胞的血液，如图27所示。虽然低剂量（每公斤（kg）体重5e9 和5e10个载体基因组（vg））没有影响，但较高剂量（5e11和5e12 vg/kg）足以消除循环B细胞而不影响CD4+或 CD8+ T细胞。
单次静脉内注射CD19xCD3 TransJoin导致人源化小鼠B细胞耗竭时间延长。
用单剂量的CD19xCD3 AAV8 TransJoin处理人源化小鼠，随后测量血液中的淋巴细胞亚群。如图28所示，对于单只小鼠，只要这些小鼠还活着，就在所有分析的小鼠中观察到延长的和选择性的B细胞耗竭。
单次静脉内注射 CD19xCD3 TransJoin消除人源化小鼠的CD19+淋巴瘤。
将人类CD19+ Raji细胞（来自患有伯基特淋巴瘤的患者）植入两只人源化小鼠的侧腹，并等待它们达到超过250 mm3的大小。然后用对照AAV病毒AAVGFP注射一只动物的尾静脉，并用CD19xCD3 AAV8 TransJoin注射第二只动物的尾静脉。对照小鼠的肿瘤最终迅速生长，需要对动物实施安乐死。TransJoin治疗小鼠的肿瘤生长缓慢，最终几乎完全缩小。见图29。动物因移植物抗宿主病的症状而需要被处死，这是人源化小鼠的已知结果，但该实验证明了单次TransJoin注射可以治疗癌症的原理证明。
实施例3 - 使用OncoSkip和TransSkip来同时靶向癌基因表达并激活治疗性转基因表达
本文描述的OncoSkip和TransSkip的概述。
OncoSkip是一种反义吗啉基，可诱导癌基因的外显子跳跃。在一些实施方案中，OncoSkip被设计为一种反义吗啉基，其诱导癌基因中（图30的左侧）关键外显子的外显子跳跃。为了原理验证，使用了KRAS（外显子 1、2、3，由图30左侧的黑-金-灰色表示）并且测试了设计来跳过KRAS外显子2的吗啉基（图30中显示为癌基因顶部的浅灰色小条），其包含ATG起始位点，因此癌基因的正常表达会降低。然后创建要跳过的相同外显子的衍生物，但经过突变以在每个阅读框中包含多个终止密码子以及侧翼内含子序列。然后将新的内含子-外显子（STOP）-内含子插入到转基因编码序列中重建供体和受体剪接位点的位点，从而将其剪接到转基因mRNA中并中断正常的编码序列。在反义吗啉基（癌基因顶部的浅灰色小条）存在的情况下，新插入的外显子被跳过，重新连接编码序列以生成功能性产物。含有被内含子-外显子-内含子序列中断的基因的AAV载体类别被称为 TransSkip 病毒，而设计用于下调癌基因的吗啉基被称为OncoSkip。
KRAS OncoSkip反义吗啉基诱导肺癌细胞中内源性KRAS的外显子跳跃。
肺癌细胞系A549和H441（未显示）与KTS1和KTS2 OncoSkip反义吗啉基以及KTS2的反向对照吗啉基一起孵育。KTS1和KTS2都结合在KRAS外显子2外显子-内含子连接点的3-引发（prime）末端，并且被设计来诱导外显子2的跳跃，因为它包含ATG起始位点。然后使用外显子1（正向）和外显子2（反向）中存在的引物通过PCR通过逆转录酶RT-PCR分析内源性KRASmRNA是否存在外显子2。外显子4中的引物用作总KRAS mRNA的对照。两种OncoSkip吗啉基均观察到含有外显子2（“外显子 1+2”）的转录本呈剂量依赖性减少。见图31。
CD3xGD2-HDD TransSkip的AAV载体图谱显示逆向工程化的内含子位于插入CD3xGD2-HDD Dimert编码序列的外显子侧翼。
合成了KRAS外显子2（KRAS外显子2的衍生物，在所有三个阅读框中包含突变为多个终止密码子（STOP））上游的人类内含子（Ki1）的3-引发序列，以及KRAS外显子 2下游的人类内含子（Ki）的5-引发序列，并将该盒克隆到编码GD2 Dimert的基因序列中，位于重复剪接供体和受体位点的特定序列。见图32。当新的STOP外显子剪接到转录本中时，不会产生功能性Dimert。当细胞暴露于结合3-引发外显子-内含子连接的反义吗啉基时，STOP外显子被跳过并表达全长Dimert mRNA。选择KRAS序列，从而设计用于导致外显子2跳跃的反义吗啉基同时改变TransSkip转基因的mRNA剪接，导致全长Dimert在转导细胞中的表达，并减少或消除癌细胞中的天然KRAS表达，因为外显子2包含KRAS ATG起始密码子。
用于测试 OncoSkip和TransSkip的活性的示例性策略。
如图33所示，从用AAV Dimert载体转导的293T细胞收集细胞沉淀和上清液。从细胞沉淀中分离出mRNA并进行逆转录酶 RT-PCR，以确定转基因中的人工外显子剪接到mRNA中的程度。通过T细胞结合和杀伤试验分析Dimert表达的上清液。
反义吗啉基诱导 CD3xGD2-HDD TransSkip转基因的外显子跳跃。
用CD3xGD2-HDD Dimert质粒#1042转染293T细胞。转染后48小时收获细胞用于总RNA分离。大约1ug RNA用于RT-PCR。见图34，其中泳道#9显示引物之间没有剪接的全长转基因RNA，使用DNA质粒作为模板。泳道7和8以及对照泳道没有反义吗啉基，并显示大多数转录物包括内部外显子（带条纹的矩形）。有一些转录本不包括外显子（最小条带），这表明该构建体存在一些激活转录本的“泄漏”。加入任一吗啉基（KTS1、KTS2）以剂量依赖性方式减少失活的、包含外显子的转录本（219 bp）的比例，并增加不包括外显子的激活转录本（97bp）。
KRAS OncoSkip在用CD3xGD2-HDD TransSkip AAV载体转染的细胞中诱导CD3xGD2-HDD Dimert的分泌表达。
从转染的293T细胞收集上清液并测试T细胞结合（荧光标记的抗CD3抗体的干扰）。如图35所示，顶部小图中的灰线是未染色的T（Jurkat）细胞，顶部小图中的深灰色线是用抗CD3抗体完全染色的T细胞。作为阳性对照，用组成型表达的CD3xGD2-HDD TransJoin #1011转染的细胞上清液几乎完全消除了抗CD3染色。来自用 CD3xGD2-HDD TransSkip #1042转染的细胞的上清液显示出中等竞争，与外显子跳过的 Dimert mRNA的一些“泄漏”一致，并被 OncoSkip吗啉基（KTS1、KTS2）进一步诱导。
KRAS OncoSkip对CD3xGD2-HDD TransSkip的外显子跳跃是中靶效应。
将由靶向的反义吗啉基KTS2诱导的外显子跳跃与含有相同碱基但序列相反的吗啉基进行比较（图36）。KTS2诱导外显子跳跃到几乎100%的转录本（97 bp），而反向对照吗啉基与仅内转运体（Endoporter）（吗啉基的载体）对照相比没有影响。
由T细胞结合确定的CD3xGD2-HDD Dimert表达的诱导是中靶效应。
收集来自用CD3xGD2-HDD TransJoin（阳性对照）和CD3xGD2-HDD TransSkip转染的不用或用不同的反义吗啉基孵育的293T细胞的上清液，通过流式细胞术（荧光标记的抗CD3抗体结合的竞争）进行人T（Jurkat）细胞结合测定。见图37，其中顶部小图中的灰线是未染色的T细胞，顶部小图中的深灰色线是完全染色的T细胞。指示#1101 CD3xGD2-HDDTransJoin的线几乎是来自组成型表达的GD3 TransJoin的完全竞争信号。和以前一样，CD3xGD2-HDD TransSkip转染细胞的上清液在基线时表现出轻微的竞争（#1042 CD3xGD2-HDD TransSkip，无吗啉基），其没有被对照吗啉基（CD3xGD2-HDD TransSkip + “KTS2-反向对照”）改变，但被中靶“OncoSkip”吗啉基KTS2（CD3xGD2-HDD TransSkip + KTS2）诱导竞争更多信号。
创建和测试示例性TransSkip剪接变体的AAV基因组图谱，以减少基线TransSkip“泄漏”但保持可诱导的外显子跳跃。
TransSkip的剪接变体被设计来减少使用CD3xGD2-HDD TransSkip观察到的基线外显子跳跃。编码序列下游的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件 (WPRE) 用于增加转基因表达。由于AAV包装大小的限制，需要使用较短的启动子来包含WPRE序列，因此创建了一系列新的载体，其启动子源自短形式的人类真核翻译延伸因子1 α1启动子（EFSp）。这些变体是通过改变位于第一个内含子（Ki1-5）的3-引发末端的聚嘧啶轨道中的U2辅助因子（U2AF）结合位点中的特定碱基对来创建的。见图38。
CD3xGD2-HDD TransSkip剪接变体K3消除了基线，但仍保持可诱导的外显子跳跃。
在没有和含有KTS2反义“OncoSkip”吗啉基的情况下用新的5种不同的CD3xGD2-HDD TransSkip构建体转染293T细胞，并将它们与具有吗啉基载体但没有吗啉基的“仅内转运体”对照进行比较。通过逆转录酶RT-PCR分析mRNA转录物并发现不同的表型。如图39所示，变体K4显示出与K1相似（或甚至略多）的基线外显子跳跃水平，并且可诱导跳跃甚至超过K1。变体K2、K3和K5实际上没有显示基线跳跃。在这3个中，变异K3最能被诱导跳过外显子。
CD3xGD2-HDD TransSkip变体K3显示没有基线Dimert产生，但最易被KRASOncoSkip诱导。
使用T（Jurkat）细胞结合测定法（最右侧），测试 CD3xGD2-HDD TransJoin剪接变体组在不使用或使用KRAS KTS2 OncoSkip反义吗啉基的情况下产生分泌的 CD3xGD2-HDDDimert表达。如图40所示，右侧小图中的灰色线是未染色的T细胞，深灰色是完全染色的T细胞，蓝色是组成型表达的CD3xGD2-HDD TransJoin，绿色是没有OncoSkip的相应 CD3xGD2-HDD TransSkip（“仅内转运体”）。该序列显示了多嘧啶U2AF结合位点，其中碱基对变体相对于野生型KRAS内含子序列（K1）以灰色（下划线和斜体）设计。RT-PCR凝胶中的顶部条带是包含外显子的转录本，底部条带是外显子被跳过的转录本。变体K1和K4通过RT-PCR显示出一些可检测的基线外显子跳跃和标记的基线Dimert表达（绿色，最右侧），而变体K2、K3和K5通过RT-PCR显示没有基线外显子跳跃，也没有通过结合竞争显示出Dimert表达（绿色，最右边）。所有这三种变体在KRAS反义吗啉基OncoSkip KTS2的存在下通过RT-PCR表达显示出少量可诱导外显子跳跃，在KRAS OncoSkip的存在下显示出不同程度的剂量依赖性Dimert表达（浅紫色和深紫色代表分别较低和较高的浓度）。K3变体似乎最易诱导，因此选择K3作为先导构建体以进行进一步研究。
OncoSkip介导的CD3xGD2-HDD TransSkip变体K3和K5的Dimert表达的诱导是中靶效应。
用CD3xGD2-HDD TransSkip变体K2、K3和K5重复RT-PCR和T（Jurkat）结合测定，并包括“反向KTS2”反义吗啉基作为对照。见图41，反向的KTS2含有与KTS2相同的核苷酸碱基，但顺序相反。反向的KTS2未能在K3和K5中诱导外显子跳跃（凝胶上的较低条带），而正确的KTS2序列在K3和K5中诱导外显子跳跃（在K2变体中均未诱导）。在Dimert表达的T细胞结合测定中（最右侧小图），灰色是未染色的T细胞，深灰色是完全染色的T细胞，蓝色是组成型表达的CD3xGD2-HDD TransJoin，紫色是 KRAS OncoSkip KTS2（浅色是较低剂量，深色是较高剂量），黄色是反向KTS2对照。Dimert蛋白检测与RT-PCR一致；没有一种吗啉基诱导来自K2变体的Dimert表达，只有 KTS2 OncoSkip而不是反向对照诱导K3和K5变体的Dimert表达。
来自AAV CD3xGD2-HDD TransSkip载体的由OncoSkip诱导的分泌的Dimert在介导T细胞杀伤神经母细胞瘤细胞方面起作用。
测试了人T细胞加上来自用各种AAV CD3xGD2-HDD TransSkip变体转染的293T细胞的上清液在没有或有KRAS OncoSkip KTS2的情况下对GDS2+ SK-N-Be(2)神经母细胞瘤细胞的细胞毒性（图42）。使用10:1的T细胞与靶细胞比率。在共培养48小时后测定细胞的活力。结果标准化为来自未转染细胞的上清液。CD3xGD2-HDD TransSkip变体K1和K4在没有KRAS OncoSkip KTS2的情况下显示出细胞毒性，与基线外显子跳跃一致，并可使用K4进一步诱导细胞毒性。CD3xGD2-HDD TransSkip变体K2没有表现出基线或可诱导的细胞毒性，与其已知的有效剪接和外显子包含一致。相比之下，CD3xGD2-HDD TransSkip变体K3和K5没有表现出基线，但确实表现出可诱导的细胞毒性，K3变体呈剂量依赖性。
感染有AAV CD3xGD2-HDD TransSkip变体K3的细胞中的转基因外显子跳跃可由KRAS OncoSkip中靶诱导。
在AAV病毒感染的情况下检查外显子跳跃以确定它是否反映了在其他研究中转染AAV质粒时所看到的情况。将CD3xGD2-HDD TransSkip变体K1和K3包装到AAV8中，并在AAV感染293T细胞后48小时通过RT-PCR分析外显子包含（“失活”）和排除（“激活”）。在没有（“仅内转运体”）或有反义吗啉基KRAS OncoSkip KTS2或反向对照（“InvtKTS2对照”）的情况下孵育细胞。如图43所示和通过载体质粒，AAV GD2 K1变体在基线显示外显子跳跃，其进一步由KRAS OncoSkip KTS2诱导，但不是由对照诱导。相比之下，使用K3变体未观察到基线外显子跳跃，但观察到被OncoSkip KTS2（单独或与载体“Vivo-KTS2”复合）诱导。相比之下，它不是由对照吗啉基诱导的。
CD19xCD3 TransSkip剪接变体的AAV基因组图谱。
基于CD3xGD2-HDD TransSkip研究的结果，其中变体K3与K1相比显示出较低的基线，但仍可诱导Dimert表达，创建了插入CD19xCD3 Dimert转基因的K1和K3内含子变体。与GD2系列一样，编码序列下游的WPRE用于增加转基因表达，需要使用较短的启动子EFSp。Ki，源自部分KRAS内含子的序列。STOP，来自KRAS的外显子 2，被突变来在所有三个阅读框中都包含终止密码子。见图44A和图44B，是CD19xCD3 TransSkip构建体的说明性实例。
图44C说明了CD19 dimert与癌细胞和T细胞相互作用的卡通图。CD19 dimert由包含 CD19 TransSkip的细胞产生。当对受试者给药（例如静脉内）时，AAV TransSkip（例如本图中所示的 AAV CD19 TransSkip）进入正常细胞，例如肝脏或肌肉，但由于将内含子和含有终止密码子的外显子插入转基因的正常编码序列，其不表达多肽。在诱导外显子跳跃的反义多核苷酸（例如，吗啉基反义寡核苷酸）存在的情况下，由反义寡核苷酸加工的mRNA转录物包含不受STOP外显子中断的完整转基因。在这种情况下，多肽被合成和分泌，分泌信号肽在分泌过程中被切割，留下在一端结合癌细胞（Ca）和在另一端结合T免疫细胞的活性dimert。
OncoSkip吗啉基KTS1和KTS2均诱导 CD19xCD3 TransSkip K1的中靶外显子跳跃。
如图45所示，用AAV载体转染293T细胞，这些载体包括 CD19xCD3 TransJoin（阳性对照，#1325）和CD19xCD3 TransSkip K1（#1098），不共孵育（泳道 #4）或与对照吗啉基（泳道#3）或两种不同的KRAS OncoSkip吗啉基（泳道1和2）共孵育。CD19xCD3 TransSkip K1显示出一些基线外显子跳跃（泳道3和4中存在较低的“激活”条带），这与我们在CD3xGD2-HDDTransSkip的平行构建体中的发现一致。这些结果表明，工程化的TransSkip设计与多种不同的转基因类似。
KRAS OncoSkip在用CD19xCD3 TransSkip K1 AAV载体转染的细胞中诱导CD19xCD3 Dimert的分泌表达。
从转染的293T细胞收集上清液并测试T细胞结合（荧光标记的抗CD3抗体的干扰）。如图46所示，顶部小图中的灰线是未染色的T（Jurkat）细胞，顶部小图中的深灰色线是用抗CD3抗体完全染色的T细胞。作为阳性对照，用组成型表达的CD19xCD3 TransJoin #1325转染的细胞上清液竞争抗CD3染色（#1325）。在吗啉基对照的存在下用CD19xCD3 TransSkip #1098转染的细胞的上清液显示出一些基线竞争（KTS2反向对照），与外显子跳过的DimertmRNA的“泄漏”一致，并进一步被OncoSkip吗啉基（KTS1；KTS2）诱导到使用组成型 CD19xCD3TransJoin达到的水平。
CD19xCD3 TransSkip剪接变体K3消除了基线，但仍保持可诱导的外显子跳跃。
如图47所示，在没有和有KTS2 反义“OncoSkip”吗啉基或对照吗啉基（“InvtKTS2对照”）的情况下，用K1和K3 CD19xCD3 TransSkip构建体转染293T 细胞，并将它们与具有吗啉基载体但没有吗啉基的“仅内转运体”对照进行比较。通过逆转录酶RT-PCR分析mRNA转录物。与平行的CD3xGD2-HDD TransJoin构建体一致，变体K1显示基线外显子跳跃。相比之下，变体K3没有显示基线跳跃（“仅内转运体”）或通过吗啉基对照跳跃。K3（#1168）变体使用KTS2 OncoSkip观察到跳跃，通过T细胞结合测定分析蛋白质表达证实了这一点。
由T细胞结合确定的CD19xCD3 TransSkip K3的CD19xCD3 Dimert表达的诱导是中靶效应。
从用 CD3xGD2-HDD TransJoin（阳性对照）和CD19xCD3 TransSkip转染的不与或与不同的反义吗啉基进行孵育的293T细胞收集上清液，并通过流式细胞术（荧光标记抗CD3 抗体结合的竞争）进行人T（Jurkat）细胞结合试验。如图48所示，每个顶部小图中的灰色是未染色的T细胞，深灰色是完全染色的T细胞，粉色是在存在来自未转染的293T细胞的上清液的情况下完全染色的T细胞，蓝色是来自用组成型表达的CD19xCD3 TransJoin #1073转染的细胞的上清液竞争的信号。CD19xCD3 TransSkip K1 #11166的上清液在基线和使用对照吗啉基均表现出相当于阳性对照CD19xCD3 TransJoin的高表达，表明该构建体不适合控制基因表达。与CD3xGD2-HDD TransSkip的经验相比，CD19xCD3 TransSkip变体K3 #1168没有表现出基线表达（绿色）或由对照吗啉基（浅橙色和深橙色，“IntCtl”）诱导的表达，但具有用KRAS OncoSkip吗啉基KTS2（浅紫色和深紫色）的剂量依赖性表达。
从CD19xCD3 TransSkip K3诱导CD19xCD3 Dimert表达是可重复的。
重复外显子跳跃测定和T细胞结合测定，以确认相对于K1 CD19xCD3 TransSkip，K3 CD19xCD3 TransSkip不存在渗漏和存在可诱导性（图49）。另请参见图48。
实施方案
实施方案1：一种用于基因治疗的载体，其包括：编码第一抗体或其抗原结合片段的第一多核苷酸序列；以及编码第二抗体或其抗原结合片段的第二多核苷酸序列。
实施方案2：根据实施方案1所述的载体，其中所述载体是重组载体。
实施方案3：根据实施方案1或2所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
实施方案4：根据实施方案1-3中任一项所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
实施方案5：根据实施方案1-4中任一项所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体、慢病毒载体、鼠白血病病毒（“MLV”）载体、爱泼斯坦-巴尔病毒（“EBV”）载体或疱疹病毒（“HSV”）载体。
实施方案6：根据实施方案1-5中任一项所述的载体，其中所述AAV载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV PHP.B、AAV rh74或AAV-DJ载体。
实施方案7：根据实施方案6所述的载体，其中所述AAV 载体是 AAV rh74（GenBank登录号 LP899424.1）。
实施方案8：根据实施方案1-7中任一项所述的载体，其中所述第一抗体或其抗原结合片段与免疫效应细胞上的活化抗原特异性结合，并且所述第二抗体或其抗原结合片段与肿瘤抗原结合。
实施方案9：根据实施方案1-7中任一项所述的载体，其中所述第一抗体或其抗原结合片段与肿瘤抗原特异性结合，并且所述第二抗体或其抗原结合片段与免疫效应细胞上的活化抗原结合。
实施方案10：根据实施方案1-9中任一项所述的载体，其进一步包含编码第三抗体或其抗原结合片段的第三多核苷酸序列，其中所述第三抗体或其抗原结合片段与免疫效应细胞上的活化抗原或肿瘤抗原结合。
实施方案11：根据实施方案8-10中任一项所述的载体，其中所述免疫效应细胞包括树突状细胞、自然杀伤（ “NK” ）细胞、巨噬细胞、T细胞或B细胞。
实施方案12：根据实施方案8-11中任一项所述的载体，其中所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。
实施方案13：根据实施方案8-12中任一项所述的载体，其中免疫效应细胞上的活化抗原包括CD3、CD2、CD4、CD8、CD19、LFA1、CD45、NKG2D、NKp44、NKp46、NKp30、DNAM、B7-H3、CD20、CD22或其组合。
实施方案14：根据实施方案8-13中任一项所述的载体，其中所述肿瘤抗原包含以下中的一种或多种：肝配蛋白A型受体2（EphA2）、白介素（IL）-13r α2、EGFR VIII、PSMA、EpCAM、GD3、岩藻糖基 GM1、PSCA、PLAC1、肉瘤断裂点、威尔姆氏肿瘤 1、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原（ETA）、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原（MAGE）、血液分化抗原、表面糖蛋白、神经节苷脂（GM2）、生长因子受体、基质抗原、血管抗原、受体酪氨酸激酶样孤儿受体 1（ROR1） 、间皮素、CD38、CD123、人表皮生长因子受体2（HER2）、B细胞成熟抗原（BCMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）α或其组合。
实施方案15：根据实施方案1-14中任一项所述的载体，其中第一抗体或其抗原结合片段与第二抗体或其抗原结合片段形成dimert。
实施方案16：根据实施方案15所述的载体，其中所述dimert是双特异性抗体。
实施方案17：根据实施方案15所述的载体，其中所述dimert是三特异性抗体。
实施方案18：根据实施方案15或16所述的载体，其中所述双特异性抗体包含与SEQID NO: 13 或 15中的任一个至少95％相同的多肽序列。
实施方案19：根据实施方案15或17所述的载体，其中所述三特异性抗体包含与SEQID NO: 11至少95%相同的多肽序列。
实施方案20：根据实施方案1-19中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含编码分泌肽的多核苷酸序列。
实施方案21：根据实施方案20所述的载体，其中所述分泌肽包含分泌共有序列。
实施方案22：根据实施方案20或21所述的载体，其中所述分泌共有序列包含与SEQ ID NO: 51至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
实施方案23：根据实施方案20或21所述的载体，其中所述分泌共有序列由SEQ IDNO: 51组成。
实施方案24：根据实施方案20-23中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列由包含SEQ ID NO: 52的多核苷酸或其等效物编码。
实施方案25：根据实施方案20-24中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个、三个、四个或更多个残基。
实施方案26：根据实施方案20-25中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个、三个、四个或更多个Ala残基。
实施方案27：根据实施方案20-26中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个、两个或三个Ala残基。
实施方案28：根据实施方案20-27中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列在序列的C末端进一步包含两个Ala残基。
实施方案29：根据实施方案28所述的载体，其中所述分泌共有序列包含与SEQ IDNO: 55至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或由SEQ ID NO: 55组成。
实施方案30：根据实施方案28或29所述的载体，其中所述分泌共有序列由包含SEQID NO: 56的多核苷酸或其等效物编码。
实施方案31：根据实施方案20-30中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列在序列的C末端进一步包含一个Ala残基。
实施方案32：根据实施方案31所述的载体，其中所述分泌共有序列包含与SEQ IDNO: 53至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或由SEQ ID NO: 53组成。
实施方案33：根据实施方案31或32所述的载体，其中所述分泌共有序列由包含SEQID NO: 54的多核苷酸或其等效物编码。
实施方案34：根据实施方案1-33中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列调节dimert的表达和/或分泌。
实施方案35：根据实施方案1-34中任一项所述的载体，其中所述分泌共有序列增强dimert的表达和/或分泌。
实施方案36：根据实施方案1-35中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含编码二聚化结构域的多核苷酸序列。
实施方案37：根据实施方案36所述的载体，其中所述二聚化结构域包括人肝细胞核因子1α（HNF1α）的二聚化结构域。
实施方案38：根据实施方案37所述的载体，其中HNF1α的二聚化结构域包含与SEQID NO: 47具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽序列。
实施方案39：根据实施方案1-38中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含启动子。
实施方案40：根据实施方案39所述的载体，其中所述启动子是组成型启动子。
实施方案41：根据实施方案39或40所述的载体，其中所述启动子是组织特异性启动子。
实施方案42：根据实施方案39-41中任一项所述的载体，其中所述启动子包含劳斯氏肉瘤病毒（RSV）LTR启动子、巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子、U6启动子、EF1 α短形式（EFS）启动子、磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子、泛素 C（UbiC）启动子、α-1-抗胰蛋白酶、脾病灶形成病毒（SFFV）启动子或鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子。
实施方案43：根据实施方案39-42中任一项所述的载体，其中所述启动子是EFS，任选地包含SEQ ID NO: 49或其等效物。
实施方案44：根据实施方案1-43中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含增强子。
实施方案45：根据实施方案44所述的载体，其中所述增强子是RSV增强子、CMV增强子和甲胎蛋白MERII增强子。
实施方案46：根据实施方案1-45中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含一个或多个额外的调控元件。
实施方案47：根据实施方案1-46中任一项所述的载体，其中所述载体包含调控元件，所述调控元件包含土拨鼠肝炎病毒（WHP）转录后调控元件（WPRE），任选地SEQ ID NO:50，或其等效物。
实施方案48：根据实施方案1-47中任一项所述的载体，其中所述载体包含5'反向末端重复序列（ITR）和3' ITR。
实施方案49：根据实施方案1-48中任一项所述的载体，其中所述载体包含SEQ IDNO: 4、6、8、12、14、16-23、30-33或40- 46中所述的序列。
实施方案50：一种组合物，其包含实施方案1-49中任一项所述的载体（vector）以及载体（carrier），所述载体任选地是药学上可接受的载体。
实施方案51：根据实施方案50所述的组合物，其中所述组合物被配制用于全身施用。
实施方案52：根据实施方案50所述的组合物，其中所述组合物被配制用于局部施用。
实施方案53：根据实施方案50-52中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于肠胃外施用。
实施方案54：一种在有需要的对象中治疗癌症的方法，包括向所述对象施用有效量的实施方案1-49中任一项所述的载体或实施方案50-53中任一项所述的药物组合物，其中所述载体表达治疗性抗癌抗体或其抗原结合片段。
实施方案55：根据实施方案54所述的方法，其进一步包括向所述对象施用抗癌剂。
实施方案56：根据实施方案55所述的方法，其中所述抗癌剂包括选自肽、多肽、核酸分子、小分子、病毒颗粒或其组合的药剂。
实施方案57：根据实施方案56所述的方法，其中所述病毒颗粒是溶瘤HSV颗粒。
实施方案58：根据实施方案54-57中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
实施方案59：根据实施方案54-58中任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
实施方案60：一种在细胞中产生双特异性抗体或三特异性抗体的方法，包括使细胞与实施方案1-49中任一项所述的载体接触。
实施方案61：根据实施方案60所述的方法，其中所述接触包括转染、感染、转化、电穿孔、注射、显微注射或其组合。
实施方案62：根据实施方案60或61所述的方法，其中所述细胞包括成纤维细胞、骨骼细胞、上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、内分泌细胞、黑素细胞、血细胞或其组合.
实施方案63：根据实施方案60-62中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体包含与SEQ ID NO: 13或15至少95%相同的多肽序列。
实施方案64：根据实施方案60-62中任一项所述的方法，其中所述三特异性抗体包含与SEQ ID NO: 11至少95%相同的多肽序列。
实施方案65：根据实施方案60-62中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体由与SEQ ID NO: 14、16、22、23、30-33或40-46至少95%相同的多核苷酸序列编码。
实施方案66：根据实施方案60-62中任一项所述的方法，其中所述三特异性抗体由与SEQ ID NO: 12至少95%相同的多核苷酸序列编码。
实施方案67：一种试剂盒，其包含实施方案1-49中任一项所述的载体或实施方案50-53中任一项所述的药物组合物。
实施方案68：根据实施方案67所述的试剂盒，其进一步包括说明材料。
等效物
应当理解，虽然已经结合上述实施例描述了本公开，但前述描述和示例旨在说明而不是限制本公开的范围。本公开范围内的其他方面、优点和修改对于本公开所属领域的技术人员将是显而易见的。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提供的所有核苷酸序列均以5′到3′方向呈现。
此处说明性描述的实施例可在不存在此处未具体公开的任何要素、限制或约束的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“含有”、“包含”等应被广泛地而非限制地解读。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物，但应当认识到在本公开的范围内可以进行各种修改。
因此，应当理解，虽然本公开已经通过特定实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可以求助于本文公开的实施例的修改、改进和变化，并且此类修改、改进和变化被认为在本公开的范围内。这里提供的材料、方法和示例是特定实施方案的代表，是示例性的，并不旨在限制本公开的范围。
本公开的范围已经在本文中广泛和一般地进行了描述。属于通用公开内容的每个更窄的种类和亚通用组也构成本公开内容的一部分。这包括具有从属中去除任何主题的附带条件或否定限制的通用描述，无论此处是否具体引用了所切除的材料。
此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开的实施例也可由此根据马库什组的任何个体成员或成员的子组来描述。

Claims (49)

1.一种多核苷酸或载体，包括：
（a）第一多核苷酸序列，其包含编码第一多肽的开放阅读框的第一部分；
（b）第二多核苷酸序列，其包含编码第一多肽的开放阅读框的第二部分；
（c）第三多核苷酸序列，其编码第二多肽；以及
（d）基因调控多核苷酸序列，其位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之间。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸或载体，其中所述基因调控多核苷酸序列包含剪接供体位点、上游内含子、在其各自的阅读框中包括多于一个的终止密码子序列的外显子、下游内含子、以及剪接受体位点。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸或载体，其中所述基因调控多核苷酸序列包含用于反义寡核苷酸的结合序列、用于多西环素的结合序列、或编码核糖开关的多核苷酸序列中的一个或多个。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述反义寡核苷酸是吗啉基寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸或载体，其中用于吗啉基寡核苷酸的结合序列包括与SEQ ID NO.24或25至少95％相同的多核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的多核苷酸或载体，其中所述吗啉基寡核苷酸包括与SEQ IDNO:27或28至少95％相同的多核苷酸序列。
7.根据权利要求2所述的多核苷酸或载体，其中所述终止密码子包括：
TAA、TAG或TGA的群组中的寡核苷酸；
TAAxTAGxTGAxTAGxTAAxTGAx（SEQ ID NO. 1）的多核苷酸序列，其中x为任意核苷酸；或者
TAATTAGTTGATTAGTTAATTGAT（SEQ ID NO. 2）的多核苷酸序列，或其等效物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述基因调控多核苷酸包含与SEQ ID NO. 21至少95%相同的多核苷酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述第一多肽是第一抗体或其抗原结合片段，并且所述第二多肽是第二抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述第一抗体或其抗原结合片段与免疫效应细胞上的活化抗原特异性结合，并且所述第二抗体或其抗原结合片段与肿瘤抗原结合。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述第一抗体或其抗原结合片段与肿瘤抗原特异性结合，并且所述第二抗体或其抗原结合片段与免疫效应细胞上的活化抗原结合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸或载体，其进一步包含编码第三抗体或其抗原结合片段的第四多核苷酸序列，其中所述第三抗体或其抗原结合片段与免疫效应细胞上的活化抗原或肿瘤抗原结合。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述免疫效应细胞包括树突状细胞、自然杀伤（“NK”）细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞或其组合。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。
15.根据权利要求10-12任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述免疫效应细胞上的活化抗原包括CD3、CD2、CD4、CD8、CD19、LFA1、CD45、NKG2D、NKp44、NKp46、NKp30、DNAM、B7-H3、CD20、CD22或其组合。
16.根据权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述肿瘤抗原包含以下中的一种或多种：肝配蛋白A型受体2（EphA2）、白介素（IL）-13r α2、EGFR VIII、PSMA、EpCAM、GD3、岩藻糖基 GM1、PSCA、PLAC1、肉瘤断裂点、威尔姆氏肿瘤 1、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原（ETA）、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原（MAGE）、血液分化抗原、表面糖蛋白、神经节苷脂（GM2）、生长因子受体、基质抗原、血管抗原、受体酪氨酸激酶样孤儿受体 1（ROR1）、间皮素、CD38、CD123、人表皮生长因子受体2（HER2）、B细胞成熟抗原（BCMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）α或其组合。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述载体是重组载体，任选地是病毒载体，并且能够表达前体mRNA，当所述前体mRNA与反义寡核苷酸（任选地吗啉基寡核苷酸）接触时，所述前体mRNA编码dimert。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸或载体，其中所述dimert是双特异性抗体。
19.根据权利要求17所述的多核苷酸或载体，其中所述dimert是三特异性抗体。
20.根据权利要求18或19所述的多核苷酸或载体，其中所述双特异性抗体或三特异性抗体包含所述第一抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求18所述的多核苷酸或载体，其中所述双特异性抗体包含与SEQ IDNO. 13 或 15中的任一个至少95％相同的多肽序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述载体表达前体mRNA，当所述前体mRNA与反义寡核苷酸（任选地吗啉基寡核苷酸）接触时，所述前体mRNA编码三特异性抗体。
23.根据权利要求22所述的多核苷酸或载体，其中所述三特异性抗体包含所述第一抗体或其抗原结合片段、所述第二抗体或其抗原结合片段和所述第三抗体或其抗原结合片段。
24.根据权利要求22所述的多核苷酸或载体，其中所述三特异性抗体包含与SEQ IDNO. 11至少95%相同的多肽序列。
25.根据权利要求1-24任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地是单链可变片段。
26.根据利要求1-25任一项的多核苷酸或载体，其进一步包含编码分泌肽的多核苷酸序列，所述分泌肽任选地是分泌共有序列。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸或载体，其进一步包含编码二聚化结构域的多核苷酸序列。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的多核苷酸或载体，其进一步包含5'反向末端重复序列（ITR）和3'ITR。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述载体包含SEQ IDNO:4、6、8、12、14、16-23、30-33或40- 46中所述的序列。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述载体是重组病毒载体，其包含选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、鼠白血病病毒（“MLV”）载体、爱泼斯坦-巴尔病毒（“EBV”）载体、腺病毒载体、疱疹病毒（“HSV”）载体、或腺相关病毒（“AAV”）载体的骨架载体。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的多核苷酸或载体，其中所述载体是AAV载体，任选地是自互补AAV载体，进一步任选地是AAV rh74载体。
32.一种组合物，其包含权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸或载体以及载体，所述载体任选地是药学上可接受的载体。
33.一种在有需要的对象中治疗癌症的方法，包括向所述对象施用有效量的权利要求1-31任一项所述的重组多核苷酸或载体或权利要求32所述的药物组合物，其中所述多核苷酸或载体表达治疗性抗癌抗体或其抗原结合片段。
34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括向所述对象施用有效量的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸任选地是吗啉基寡核苷酸。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其进一步包括向所述对象施用抗癌剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗癌剂包括选自肽、多肽、核酸分子、小分子、病毒颗粒或其组合的药剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述病毒颗粒是溶瘤HSV颗粒。
38.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
39.根据权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
40.一种在细胞中产生双特异性抗体或三特异性抗体的方法，包括使包含权利要求1-31中任一项所述的载体的细胞与有效量的反义寡核苷酸接触，所述反义寡核苷酸任选地是吗啉基寡核苷酸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述吗啉基寡核苷酸包含与立体纯多核苷酸至少95％相同的序列。
42.根据权利要求40所述的方法，其中通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、显微注射或其组合将所述载体引入所述细胞。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述细胞包括成纤维细胞、骨骼细胞、上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、内分泌细胞、黑素细胞、血细胞或其组合。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体包含与SEQ IDNO. 13 或 15至少95%相同的多肽序列。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述三特异性抗体包含与SEQ IDNO.11至少95%相同的多肽序列。
46.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体由与SEQ ID NO.14、16、22、23、30-33 或 40-46至少95%相同的多核苷酸序列编码。
47.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述三特异性抗体由与SEQ IDNO.12至少95%相同的多核苷酸序列编码。
48.一种试剂盒，其包含权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸或载体或权利要求32所述的药物组合物。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其进一步包括说明材料。
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