CN108367019A - 用于通过外显子跳读产生截短的Ig的反义寡核苷酸用于治疗与B细胞相关的疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗涉及B细胞、B淋巴细胞或浆细胞的疾病。具体地，本发明涉及能够在免疫球蛋白重链或轻链的RNA处诱导外显子跳读的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸的化合物，其用于治疗涉及B细胞的疾病。

Description

用于通过外显子跳读产生截短的Ig的反义寡核苷酸用于治疗 与B细胞相关的疾病的用途
技术领域
本发明涉及与B谱系、B细胞或浆细胞相关的疾病的治疗。具体地，本发明涉及能够在免疫球蛋白重链或轻链的可变区或恒定区内诱导外显子跳读的反义寡核苷酸(AON)用于治疗与B细胞相关的疾病的用途以及此类AON的混合物。最后，本发明涉及一种用于提高使用蛋白酶体抑制剂治疗多发性骨髓瘤的治疗意识的方法。
背景技术
多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤(MM)是一种不可治愈的癌症，其表征为在骨髓中存在浆细胞的肿瘤克隆。多发性骨髓瘤占癌症的约1％和恶性血液病的10％，使得此肿瘤B成为继淋巴瘤之后的第二造血来源的癌症(Kyle和Rajkumar，2009)。MM的发生率在每100,000人中0.4至6.3例的范围内出现极大的变化。患MM的风险随着年龄而增加，其中诊断中值年龄>65。MM的发生率在男性中比在女性中高。发现暴露于高水平辐射(电离辐射、核辐射)和杀虫剂的人也具有更高的患MM的风险。在大部分MM患者中，在发展到骨髓瘤之前，疾病以称为MGUS(意义未定的单克隆丙种球蛋白病)的无临床症状阶段开始(Landgren，2013)。
患有MM的患者中通常可见的临床表现形式为：血钙过多、肾衰竭、贫血以及骨损伤。频繁观察到其它症状，诸如骨痛、极大易疲劳性、反复感染以及体重减轻(Bird等人，2011；Rajkumar，2011)。这些临床表现形式通过浆细胞克隆异常产生单克隆Ig(历史上称为M蛋白)来引起。
尽管MM仍为不可治愈的疾病，但是在癌学的最新进展和新治疗剂的出现已提高了患者的总体存活率(Kumar等人，2014)。
MM的诊断是基于通过对患者的血清和/或尿液进行电泳和免疫固定来对单克隆组分(M蛋白)进行的检测和评估、对Ig(例如：IgM、IgG、IgA、Igκ或Igλ轻链、“无”轻链水平等)进行的表征和量化。进行骨髓活检以评估作为疾病进展和攻击性的标记物的浆细胞浸润。通过成像(X-射线、NMR、X线断层摄影术)评估骨损伤。其它生物因子(2-微球蛋白、白蛋白、C-反应蛋白、肌酸酐、血红蛋白、钙、乳酸脱氢酶)的血清浓度使得可以将疾病阶段分类并且预测其演变。染色体异常(易位、缺失、低二倍性/超二倍性)的调查也允许将疾病进展的风险分类。大部分这些标准在MM的国际分类系统中使用：《国际分阶段系统：ISS(International Staging System:ISS)》(Greipp等人，2005)和《骨髓瘤Mayo分层和风险适应性疗法：mSMART(The Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy:mSMART)》(Mikhael等人，2013)。
患有骨髓瘤的患者的治疗包括三个步骤：
-诱导阶段：旨在于自体干细胞移植之前减小肿瘤质量。此化学疗法通常包括免疫调节剂(诸如沙利度胺)、蛋白酶体抑制剂(诸如作为销售的硼替佐米)以及地塞米松。
-可能的自体干细胞移植在满足地响应于诱导阶段的符合条件的患者中进行。
-维持阶段：由化学疗法和免疫调节剂的组合组成，免疫调节剂可包括烷基化剂和来那度胺。维持此治疗直到患者复发。
然后可向复发的患者施用不同的治疗(Dispenzieri等人，2009)。
用于治疗MM的药剂被分成5个主要类别：烷基化剂、蒽环类、皮质类固醇、免疫调节剂以及蛋白酶体抑制剂。
体液免疫应答
体液免疫应答首先涉及免疫球蛋白(Ig)的膜形成并且然后依赖于可溶性Ig：抗体的分泌。Ig是由4条多肽链组成的异二聚体蛋白，多肽链包括通过可变数量的二硫桥键连接在一起的2条相同轻链和2条相同重链。Ig具有携带抗原特异性的可变区和对于重链而言决定所分泌抗体的效应功能的恒定区。根据恒定区的结构，存在两种类型的轻链(κ或λ)和五种主要类型的重链(μ、o、y、￡或α)，它们定义Ig的类别。如果它们证明是有功能的，则编码可变区(对于轻链为VJ；对于重链为DJ、然后V(D)J)的基因的连续重排形成了可在编码恒定区的基因上转录和剪接的可变外显子。在重链基因座水平下，此外显子首先与位于正下游的恒定基因Cμ一起表达。然后，称为“类别转换”或“同型转换”的第二种类型的重排可以介入。其引起Cμ基因缺失并允许具有相同重排的可变区的新恒定基因(例如Cγ)表达。Ig基因重组的这些多个步骤在B细胞成熟期间精细调节，范围为B淋巴祖细胞阶段到分泌抗体的浆细胞的阶段。
Ig基因的结构
编码不同免疫球蛋白链的基因占据位于单独染色体上的3个基因座。这些基因具有一般常见的结构并且在B细胞系中特异性表达。每个基因由编码抗原受体的可变部分的多个基因片段和编码恒定部分的一个或多个基因组成。在其胚排列中，Ig重链和轻链基因不直接发挥功能。为了完全发挥功能，这些基因必须经历内部修饰或基因内重排。这些重排发生在B个体发生早期阶段、编码重链和轻链的可变部分的片段之间，并且称为V(D)J重组。
-Ig重链的人类基因座(染色体14)：重链基因包含大数量的V(可变)片段和D片段(这些所谓“多样性”片段对重链基因座具有特异性)以及一组6J片段：也存在编码恒定区的9个基因。每个恒定区由编码对每条重链具有特异性的结构域的多个外显子组成。在V(D)J重组期间，将一个片段与6J片段之一随机缔合，并且此D-JH缔合的重排使用V片段进行。可变部分通过剪接信使RNA来与恒定区相缔合。膜形式转变成Ig分泌形式通过对同一主要重链转录物进行替代性剪接来进行。
-κ轻链基因座(染色体2)：κ轻链基因包含许多V片段和5个功能性J片段；然后存活单个Cκ恒定基因。在轻链基因的重排期间，V片段随机连接至5个J片段之一。
-λ轻链基因座(染色体22)：λ轻链基因具有相对不同于其它两个所谓分组的基因座的结构。存在许多V片段(29-33)和4-5个功能性J和C片段。
B细胞分化成浆细胞
浆细胞克隆的起源是后生发中心B细胞。B细胞的分化分两个阶段进行：骨髓中抗原的非依赖阶段和依赖于二级淋巴器官(脾、淋巴结等)中的抗原活化的阶段。在抗原的非依赖阶段期间，B前体经历其Ig基因的重排。这些重组通过有序地组装重链的V(可变)、D(多样性)和J(接合)片段和轻链基因座的V和J片段来发生。这些V(D)J接合是高度多样性的并且允许许多能够识别几乎无穷数量的抗原的Ig表达。合成单个Ig(通常不具有对自身抗原的反应性)的每个B细胞是阳性选择的。在不同增殖阶段之后，此B细胞允许产生表达相同Ig的克隆。
表面免疫球蛋白对抗原的识别然后引起活化B细胞进入生发中心，在生发中心中发生若干种遗传修饰过程。活性B细胞可在恒定重链基因的水平下显著经历重排。这些遗传重组受到许多细胞因子的影响并且允许除IgM之外的新类别免疫球蛋白表达。类别转换机制是基于位于恒定片段的5'侧上的转换区的连接和呈染色体外环状DNA形式的插入区域的消除。在生发中心，与大致上位于可变片段中的特异性核苷酸修饰或短插入或缺失相对应的体细胞突变使得B细胞受体对抗原的亲和力增加并且构成高亲和力记忆B细胞库。活化B细胞也可以分化成浆细胞，浆细胞在血清中合成并分泌非常大量的免疫球蛋白。浆细胞然后可以到达骨髓，在骨髓中它们接收存活信号，诸如由基质细胞产生的白介素-6。这些长寿的浆细胞可在体内坚持几个月或甚至几年。与其后生发中心状态一致，骨髓瘤细胞产生IgG和IgA，较少的IgD和IgE，并且在其免疫球蛋白基因中具有高体细胞超突变率(Anderson和Carrasco，2011)。
浆细胞进行的大量Ig合成需要精细调节以避免过度装载内质网(ER)，这对于浆细胞存活是有害的。
本发明人现在已获得突出强调截短Ig在浆细胞的生理分化期间的毒性的新颖结果(Srour等人，J Exp Med,2015，接受的出版物)。有趣的是，浆细胞产生截短的Ig诱导了这些浆细胞的细胞应激并引起细胞凋亡。
基于这些结果，本发明人已开发一种治疗方法，所述治疗方法涉及诱导截短的Ig的产生以使用反义寡核苷酸(AON)去除病理性浆细胞。这些AON可以在Ig重链或轻链的RNA处引起外显子跳读，从而引起截短的Ig表达。
发明内容
本发明涉及一种治疗与B细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向患者施用至少一种能够在免疫球蛋白的重链或轻链之一的可变区或恒定区之一中诱导外显子跳读的AON。
“B细胞”意指B细胞和浆细胞。
在一个第一实施例中，本发明涉及AON用于消除Ig轻链或重链的可变区的用途。
实验部分的结果说明此方法，特别是在实例3中。具体地，本发明人已显示，通过用能够与由此克隆表达的轻链外显子VJ的剪接共同位点序列特异性杂交的AON转染髓细胞样谱系，所述细胞产生通过细胞凋亡引起其死亡的截短的Ig。此结果构成本发明的概念验证。本发明人也已验证了用于研究在转染不存在下AON治疗的功效的方法学。本发明因此涉及靶向Ig轻链的VJ可变部分的AON消除B细胞系的克隆的用途。此方法在实例4.1中说明。
在一个优选的实施例中，本发明包括使用针对位于λ轻链上的可变外显子的剪接供体位点的AON。用于此用途的优选AON是具有序列SEQ ID NO.5的AON。
同样地，本发明可使用能够诱导外显子跳读以使得所产生的Ig不具有重链的VDJ可变部分的AON来实施。此策略在实例4.2.2中说明。
“能够诱导外显子跳读的AON”意指特异性结合至靶区域以使得在剪接之后获得的成熟mRNA不允许翻译需要有待移除的蛋白质结构域的任何AON。“有待移除的结构域”意指重链或轻链的可变区或者重链的恒定区的至少一部分。AON所靶向的序列可以含有位于内含子或外显子区域内的剪接供体位点、剪接受体位点或剪接调节序列(例如增强子)。另外，根据本发明的AON能够通过与包含以下各项的序列杂交来诱导外显子跳读：位于免疫球蛋白链的可变区或恒定区的内含子或外显子区域内的剪接供体位点、剪接受体位点或剪接调节序列。此AON可用于治疗与B细胞相关的疾病。
旨在引起B细胞产生不具有可变结构域的Ig的治疗方法可以在个人化医学框架内实施。一旦已鉴别负责所述疾病的B克隆，则对可变区域进行测序并且可以选择能够与该序列特异性杂交的AON并将其作为药物施用。
例如，在MM的情况下，肿瘤克隆产生的单克隆Ig(例如，IgG、IgA、Igκ或Igλ轻链)通过对患者血清进行电泳和免疫固定来寻求。然后骨髓活检允许评估浆细胞浸润，并且通过特异性扩增转录物来表征肿瘤克隆的V(D)J重排(Van Dagen JJM等人，Leukemia 2003，Bridoux等人.Am J Kidney Dis 2005)。在鉴别由肿瘤克隆进行的V(D)J重排之后，使用靶向重排的特异性AON产生不具有可变结构域的截短Ig。
通过扩增Ig转录物进行的类似初步方法适用于表征任何肿瘤B细胞的V(D)J重排。
因此，大体上，由病理性克隆产生的Ig的类型可由患者的血液样品或淋巴组织确定。然后需要确定所涉及的克隆的轻链或重链的类型。另外，作为治疗骨髓癌症的个人化医学方法的一部分，肿瘤克隆的特异性可变序列可从患者的脊髓活组织检查获得。在鉴别由肿瘤克隆的Ig重链和轻链基因所携带的V(D)J重排之后，通过旨在例如针对涉及重排的J片段的剪接供体位点的AON，进行可变外显子的消除。
因此，在个人化医学方法的背景下，根据本发明的AON的使用包括以下步骤：
a.鉴别来自患者样品的负责疾病的B细胞：鉴别此克隆产生的单克隆Ig的重链和轻链同种型；
b.表征由所述B细胞克隆表达的重链或轻链的可变区的特定重排；
c.提供至少一种能够在所述克隆的免疫球蛋白链之一的可变区之一中诱导外显子跳读的AON；
d.向患者施用所述AON或AON混合物。
允许消除可变结构域的个人化医学的这些治疗方法是基于肿瘤细胞的V(D)J重排的鉴别。这些策略因此考虑到在Ig亲和力成熟过程期间引入在可变外显子上的最终体细胞突变。
因此，包括施用能够在Ig轻链或重链的可变区内诱导外显子跳读的AON的治疗方法特备适用于治疗以下各项的背景下：多发性骨髓瘤、AL淀粉样变性、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、瓦尔登斯特伦氏病、以及涉及单克隆Ig的产生的任何其它类型的B细胞癌症。
此个人化方法提供允许特异性消除肿瘤克隆同时保护健康B细胞并因此保持患者免疫防御的优点。此靶向治疗方法因此表示一种主要的新颖方法，与目前用于B细胞癌症中的“重度”治疗相反。
在一个第二实施例中，本发明涉及AON用于从Ig重链的恒定区消除至少一个外显子以治疗与B细胞相关的疾病的用途。
本发明人已证明B细胞产生截短的Ig引起了ER中的应激，从而通过细胞凋亡引起所述细胞死亡。因此，解释这些截短的Ig的毒性的假设之一在于，所述细胞可能对错误折叠的蛋白质的产生敏感(由于不存在某些结构域)。在此背景下，可以预测，产生不具有其恒定结构域的至少一部分的Ig的B细胞将存在与表达不具有其可变结构域的Ig的细胞相同的表型。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及一种能够在重链的恒定区内诱导外显子跳读以消除CH1、CH2或CH3外显子中的至少一个的AON。产生不具有其恒定结构域的至少一部分的Ig的方法在实例4.2.3中说明。
基于肿瘤细胞的V(D)J重排的鉴别，允许从Ig重链消除恒定外显子的此治疗策略具有比用于消除可变结构域的先前描述的个人化医学更广泛的作用谱。实际上，消除恒定外显子允许特异性靶向表达IgM、IgG、IgA或IgE的B细胞。
为了将其与“个人化医学”方法区分，术语“通用医学(generic medicine)”将用于描述根据独立于可变区的重排的标准治疗病理学的方法。有待靶向的区域的选择然后将区域由病理B细胞产生的Ig重链或轻链的同种型。
此一般策略适用于治疗B细胞淋巴谱系的癌症(作为以上定义的个人化医学方法的替代方案)，但是也适用于治疗大量与非癌性B细胞相关的病理学。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及靶向Ig重链恒定基因的AON药物的用途；此治疗方法可应用于许多病理学，诸如：
-通过靶向产生IgE的B细胞产生的速发型变态反应，
-与IgA相关的免疫病理学，
-通过靶向产生IgA的B细胞产生的涉及IgA沉积物的某些免疫变态病理学(IgA肾病、类风湿紫癜等)或对IgA有特异性的免疫病理学特性(疱疹样皮炎、具有线性IgA沉积物的皮肤病等)，
-通过靶向产生一类具有已证明的直接病原性的自身抗体的细胞产生的涉及自身抗体和/或组织特异性抗体的自身免疫疾病(例如，自身免疫甲状腺炎、比尔默氏病(Biermer's disease)、自身免疫血细胞减少等)，
-涉及单克隆免疫球蛋白链的组织沉积物(肾、心脏、肝等)的病理学(淀粉酶、范科尼氏综合征(Fanconi syndrome)、兰德尔综合征(Randall syndrome)、冷球蛋白血症等)，
-移植(与IgG类别同种抗体相关的急性排斥)。
本发明的另一个主题是一种能够在免疫球蛋白重链或轻链中诱导外显子跳读的AON，以用于治疗与B细胞相关的疾病。因此，根据本发明的AON能够诱导产生在重链或轻链上不具有可变区或在重链上不具有其恒定区的至少一部分的免疫球蛋白，以用于治疗与B细胞相关的疾病。
本发明还涉及能够诱导产生在重链或轻链上不具有可变区或在重链上不具有其恒定区的至少一部分的免疫球蛋白的AON用于制备旨在治疗与B细胞相关的疾病的药物的用途。
鉴于以上内容，靶向Ig转录物的AON诱导外显子跳读和截短的Ig产生的治疗应用可以覆盖几乎所有影响B细胞的疾病。
在一般方法诸如以上所定义的方法的背景下，本发明可以通过提议将AON的混合物作为药物来实施。
因此，本发明的另一个主题是一种能够特异性诱导截短的Ig的产生的AON混合物。
可以提供AON混合物以加宽作用谱和/或增加这些治疗方法的毒性。所述组合是多种的，在下文中是表现出作为“可工业化”一般药物的极大治疗兴趣和/或高可能性的一些混合物的表现形式。
-靶向J片段的AON混合物涉及B克隆的重链和轻链的V(D)J重排。
此混合物在个人化医学方法背景下将是特别有意义的，以增加治疗毒性，因此增加其有效性。
-AON混合物靶向κ轻链的所有J片段。
此混合物将允许选择性破坏Igκ群体，其占B细胞的大约60％。此一般方法的优点在于，其允许消除肿瘤克隆同时保持表达Igλ的B细胞(总B群体的约40％)。其适用于治疗其中有害的Ig为Igκ的疾病。
-AON混合物靶向λ轻链的所有J片段。
此混合物将允许选择性破坏Igλ群体，其占B细胞的约40％。此一般方法的优点在于，其允许消除肿瘤克隆同时保持表达Igκ的B细胞(总B群体的约60％)。其适用于治疗其中有害的Ig为Igλ的疾病。
-AON共混物靶向重链的所有J片段。
此方法将允许破坏B细胞，即实现免疫抑制。
因此，应注意在本发明的背景下，术语“AON”可被“AON混合物”替代，而这不会影响用途和方法。
用于靶向先前所述的序列的AON的选择是处于本领域技术人员的范围内。此类AON可从专门按需要制备AON的商业公司获得。
本发明还涉及一种通过蛋白酶体抑制剂敏化MM治疗的方法，其包括施用能够在负责MM的B克隆内诱导产生在重链或轻链上不具有可变区或在重链上不具有其恒定区的至少一部分的免疫球蛋白的AON。
本发明还涉及一种能够诱导产生在重链或轻链上不具有可变区或在重链上不具有其恒定区的一部分的免疫球蛋白的AON，以用于与蛋白酶体路径的抑制剂组合来治疗多发性骨髓瘤。
MM的治疗选择目前是一种蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bz)。然而，此治疗具有显著副作用并且一些患者对其产生抗性或者逐渐对其产生抗性。
应注意，结合使用hsp90和硼替佐米(Bz)的抑制剂具有协同作用，分别引起错误折叠的蛋白质比率增加和蛋白酶体对其进行的降解减少(Richardson DG等人,Br JHaematol 2011)。因此，旨在增加细胞应激以使细胞对Bz治疗敏感的治疗方法因此似乎非常有前景，并且特别适用于对Bz有抗性的患者。这些组合疗法也可用于使用较低剂量的Bz或间隔开的治疗时间段治疗MM患者。“组合治疗”意指同时施用蛋白酶体抑制剂和根据本发明的AON或AON混合物，或依次施用这些药物。
在此上下文中，本发明人提出使用基于在患有MM的患者中使用如本发明所述的AON与Bz治疗的组合的治疗方法。
此组合方法可使用Bz进行，也可使用任何其它蛋白酶体抑制剂进行。
在可与根据本发明的AON或AON混合物组合使用的其它蛋白酶体抑制剂中，可以提及卡菲佐米(carfilzomib)(KyprolisTM)以及目前研发的其它分子诸如marizomib、ixazomib(MLN-978)、delanzomib(CEP-18770)以及ONX-912。
本发明的优点从这些实施例及其应用的描述出现。具体地说，所提出的治疗方法是无创的并且允许精确靶向有待破坏的B细胞群体。因此，应限制副作用。另外，可以通过施用AON混合物来调节功效。这些特征使得此方法与患者通常不能良好耐受且治疗上不能满意的当前治疗相比更具吸引力。
适用于本发明的背景的AON可以任何适合的盖伦制剂(galenic)形式施用。目前，使用AON的许多治疗方法经历临床前试验和/或临床试验(Moreno和Pego，2014)。
所附实例旨在说明本发明的某些实施例并且不应被视为限制本发明的范围。
附图说明
图1：小鼠B细胞中的外显子跳读的证明和截短的Ig的影响的分析。A)用于转染小鼠B细胞的构建体(S194，Sp2/0)。不同构建体允许表达功能性(F)或非功能性(V终止*，C终止*)Igκ轻链的转录物的表达。B)正常或不具有可变外显子的Igκ信使RNA的表达的RT-PCR分析(“ΔV-κLC：少V结构域κ轻链”)。C)在用蛋白酶体抑制剂(MG132：1μM，8h)处理或未处理的情况下对转染或未转染(NT)的SP2/0细胞进行正常Igκ轻链(κLC：～25KD)和截短(ΔV-κLC：～12KD)的蛋白质分析(蛋白质印迹小鼠抗-Igκ)。D)S194细胞表示在用MG132(1μM，5小时)处理之后阳性S194膜联蛋白V细胞(％)增加的细胞凋亡指数。E)CHOP的相对表示通过对用MG132(1μM，5小时)处理或未处理的S194细胞进行定量PCR来分析。“终止*：与开放阅读框在V和J片段的接合处的偏移相邻的提前结束密码子。”
图2：小鼠模型iTIE(“诱导型截短Ig表达”)的生成和分析允许截短的Ig的诱导型表达。A)允许产生截短的Ig的模型的代表性图(L：前导外显子；Cκ：Cκ恒定外显子)。将iTIE/+动物与表达Cre重组酶的小鼠杂交以消除NeoR基因并允许不具有可变外显子的L-Cκ短转录物表达。B)仅在表达Cre重组酶(Cre+)的小鼠中证实截短的Ig(“ΔV-κLC：少V结构域的κ轻链”)。通过蛋白质印迹(小鼠抗-Igκ)对正常Igκ轻链(κLC：～25KD)和截短(ΔV-κLC：～12KD)进行蛋白质分析(蛋白质印迹小鼠抗-Igκ)。在iTIE小鼠中腹膜内施用硼替佐米(Bz)，如“方法”部分所指示的。C)在通过羊红血细胞免疫之后7天对表达或不表达Cre重组酶的纯合动物iTIE/iTIE进行的B细胞群体(B220+)和浆细胞(B220-CD138+)的流式细胞术分析。D)对8周至12周大的小鼠的血清实现的Ig水平的分析，通过ELISA进行的，如“方法”部分中指示的。E)按图C所指示地分选浆细胞并且在针对GAPDH表达进行免疫之后通过定量PCR进行转录物分析。
图3：靶向Jλ2片段的剪接供体位点的AON的发展。表示在RPM18226谱系中鉴定的Igλ转录物的DNA序列的图(大写字体：Jλ2片段的序列；小写字体：位于Jλ2的3'中的内含子序列)。合成能够在Jλ2片段的剪接供体位点(加下划线序列)处与主要转录物杂交的AON(粗体)。(L：“前导序列”外显子；VJ：可变外显子；C：恒定外显子)。此AON的序列对应于SEQ IDNO.5。
图4：AON在RPM18226黑素瘤细胞中的施用。A)表示施用能够通过靶向Jλ2片段的剪接供体位点来与主要Igλ转录物杂交的AON的图。通过Gene Tools,LLC合成吗啉代类型的AON(对照和Jλ2特异性)。箭头象征PCR引物的位置。(L：“前导序列”外显子；VJ：可变外显子；C：恒定外显子)。B-D)在通过AON转染RPM18226细胞(3×106)之后48小时进行实验。RT-PCR(B)和蛋白质印迹蛋白质分析(C，抗-hIgλ)显示通过外显子跳读进行的外显子可变消除。D)针对GAPDH表达归一化的归一化CHOP和BiP转录物的定量PCR分析。E)在转染不存在下通过被动施用AON来消除可变外显子。将RPM18226细胞(1×106)用Gene Tools,LLC销售的“体内吗啉代”(对照和Jλ2特异性)AON(10μM)孵育4小时。在洗涤之后，将细胞培养48小时并且在培养24小时和48小时之后通过RT-PCR进行外显子跳读分析。通过如图B所指示的253bp带的外观查看可变外显子的消除。
图5：迫使外显子跳读以在浆细胞内产生毒性截短的Ig。
描绘靶向Jκ5片段的剪接供体位点的反义寡核苷酸(AON)的施用的图。AON在主要Igκ转录物上的杂交在剪接期间引起VJ可变外显子消除。短转录物允许在B淋巴细胞系中大量合成不具有毒性可变结构域的Ig链。
图6：μ重链的表达和膜形式转变成分泌形式。在B细胞和浆细胞中，Ig(在此为μ重链)分别以膜形式和分泌形式产生。膜Ig通过使用CH4内部剪接位点来产生，剪接位点剪接在第一膜外显子(M1)上，所使用的多腺苷酸化(polyA)位点位于第二膜外显子(M2)之后。浆细胞大致上产生呈分泌形式的Ig。在分泌的μ重链的情况下，不使用CH4内部剪接位点，转录物因此包含此外显子的3'部分(以黄色表示)并且使用直接位于下游的polyA位点(改编自Lefranc等人，1999)。
图7：迫使外显子跳读以产生不具有V结构域的截短的重链。表示靶向J片段剪接供体位点的反义寡核苷酸(AON)的施用的图。AON在主要转录物上的杂交在剪接期间引起VDJ可变外显子消除。短转录物允许大量合成不具有可变结构域的Ig链。
图8：迫使外显子跳读以在恒定结构域外显子处产生截短的重链。表示靶向恒定外显子(CH1)的剪接供体位点的反义寡核苷酸(AON)的施用的图。AON在主要Igκ转录物上的杂交在剪接期间引起恒定外显子(CH1)消除。短转录物允许大量合成不具有恒定结构域(CH1)之一的Ig链。
具体实施方式
材料和方法
获得和分析转基因iTIE小鼠
诱导型截短-Ig表达(iTIE)小鼠模型在Igκ轻链基因座处表现出遗传修饰，这通过如先前所述的同源重组来获得(Sirac等人，2006)。小鼠Jκ片段通过含有启动子(pVH)、前导序列外显子(L1-33)和由IoxP位点围绕的新霉素抗性基因(NeoR)的盒置换。在相反取向中NeoR基因的转录允许阻断前导序列外显子的转录和/或剪接(图2A)。
在所有实验中使用2-3月大的小鼠，实验根据利穆辛动物实验伦理委员会准则(Ethical Committee Guidelines for Limousin Animal Experimentation)(由国际委员会以编号C2EA-33登记)进行并且批准作为以编号CREEAL 6-07-2012登记的方法的一部分。将杂合突变小鼠(iTIE/+)与C57BL/6(B6)杂交至少3代，并且然后与表达Cre的小鼠杂交以诱导NeoR盒的缺失。B6CMV-Cre小鼠来自Mouse Clinic(Illkirch,巴黎)。
为了分析B细胞的晚期发育，在通过腹膜内注射(200μl/小鼠)羊红血细胞(GR,SA-France)进行免疫之后7天从iTIE小鼠脾分离细胞。在图2B中，小鼠在第5天和第6天皮下接受硼替佐米(Sillag)(0.5mg/kg)的额外注射。在用抗-GL7、抗-B220和抗-CD138抗体(BD Biosciences)标记之后，通过流式细胞术进行B细胞和浆细胞的分析。
AON的细胞转染和被动施用
将鼠科细胞系(A20、S194和Sp2/0)在补充以下各项的RPMI培养基中培养(106个细胞/mL)：10％牛胎儿血清(英杰(Invitrogen))、丙酮酸钠、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素(吉毕科(Gibco))。根据制造商(Amaxa)说明书通过电穿孔稳定转染细胞(2x106)。通过连接片段Vκ1-135和Jκ5来创建VκJκ5重排。在接合期间，整合核苷酸以创建模拟非功能性重排的阅读框的偏移。使用关于阅读框(F)的质粒构建体和非生产性VPTC和CPTC构建体单独地或以如先前所述的F和VPTC或CPTC的等摩尔混合物形式进行转染(Chemin等人，2010)。用蛋白酶体抑制剂MG132(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))(1μM)处理转染的细胞(1×106/mL)。
使用不同浓度的反义寡核苷酸(1、5或10μM AON-Jλ2：5'AGAAGAGACTCACGTAGGACGGTCA(SEQ ID NO.5)，Gene Tools,LLC)根据制造商说明书(Amaxa)通过电穿孔转染骨髓瘤细胞(3x106)(RPM18226谱系)。然后在转染之后24小时和48小时进行分析。
使用由Gene Tools,LLC销售的“体内吗啉代”(对照和Jλ2特异性)AON进行AON的被动施用。这些AON具有使得它们具有被动进入细胞的化学修饰。可适用于患者细胞的此方法学的发展表示实现临床前研究的主要进展。将RPM18226细胞(1×106)用AON(10μM，在PBS中)孵育4小时。在洗涤之后，将细胞在完全培养基中培养并且在培养24小时和48小时之后通过RT-PCR进行外显子跳读分析。
也对通过LPS体外刺激的小鼠原代B细胞进行“体内吗啉代”类型AON的被动施用实验。
蛋白质分析
对于蛋白质印迹分析，使用4％-20％聚丙烯酰胺凝胶(伯乐(Bio-Rad))。然后将每种样品在94℃下变性3分钟，之后装载。使用TurboTM装置将凝胶转移至聚偏二氟乙烯(伯乐)膜。在含有5％脱脂奶粉的PBST缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、1mMNa2HPO4、2mM KH2PO4、0.1％20、pH 7.4)中进行膜封闭。通过化学发光(ECL plus，通用电气医疗集团(GE Healthcare))测量信号。兔抗体针对小鼠HERP蛋白(Santa CruzBiotechnology)、CHOP、BiP、IRE1α(Cell Signaling Technology)、山羊抗-Igκ(BeckmanCoulter)以及小鼠抗-GAPDH(R&D Systems)。将GAPDH信号强度用于在样品之间归一化。
由血清或培养上清液使用如先前所指示的针对小鼠Ig(IgM、IgG1、IgG3、IgG2b、Igκ、Igλ以及总IgG)(Southern Biotechnology)的羊抗体进行用于测定Ig水平的ELISA测定(Pinaud等人，2001,Sirac等人，2006)。在添加对硝基苯基磷酸盐(西格玛奥德里奇)以允许酶促显色之后，在405nm波长下读取板。
PCR和RT-PCR
为了分析VJ重排，使用特定几对人类Igλ进行扩增(Sens Leader-共有：5'-ATGGCCTGGDYYVYDCTVYTYCT(SEQ ID NO.1)，其中D＝A或G或T，Y＝C或T，V＝A或C或G，并且Cλ-AS反义：5'-CTCCCGGGTAGAAGTCACT(SEQ ID NO.2))，或者对小鼠Igκ有特异性(L1-135-S：5'-TCGGTTACCATTGGACAAC(SEQ ID NO.3)和Cκ-AS：5'-GCACCTCCAGATGGTTAACTGC(SEQ IDNO.4))。在将扩增产物克隆到pCR2.1-TOPO载体(英杰)并测序之后，使用V-QUEST软件(Theinternational ImMunoGeneTics information)分析VJ接合。
在ABI PRISM 7000装置上使用生命技术(Life Technologies)销售的对每种基因具有特异性的Taqman引物和探针进行定量PCR。在GAPDH表达上标准化之后通过标准2-ΔΔCt方法测定不同转录物的相对数目。
统计学分析
表示平均值和平均值标准偏差。使用Student检验使用Prism GraphPad软件(SanDiego,CA)计算各值之间的差值的统计学分析。
结果
实例1：截短的Ig表达在正常浆细胞中的影响
1.1截短的Ig的体外产生
为了分析外显子跳读的条件，使用允许表达不同类型的Igκ轻链转录物的构建体转染小鼠B细胞谱系(S194和Sp2/0)(图1A)：
-在阶段中具有VJ重排的功能性Igκ转录物
-具有在VJ外显子的3'端处(V终止*构建体)或在C外显子(C终止*)中来源于在V和J片段接合期间阅读框的偏移的无义密码子的非功能性Igκ转录物。
在转录水平(图1B)和蛋白质水平(图1C)下的分析显示，主要当V外显子本身含有无义密码子(结构V终止*)时，在剪接期间在VJ外显子“跳读”之后V区域的缺失是有效的。
已知浆细胞的存活取决于其在于大量Ig合成相关的ER水平下承受应激反应的能力(Cenci等人，2011)。因此，本发明人已寻求确定截短的Ig(即具有异常结构和折叠)的产生可影响浆细胞存活。为了这个目的，它们分析了关于截短的Igκ链的丰度的细胞凋亡指数(“ΔV-κLC：少V-结构域κ轻链”)。它们因此显示表达VPTC构建体的细胞具有的细胞凋亡水平大于未转染(NT)细胞或表达C终止*构建体的细胞(图1D)。另外，参与ER诱导型应激细胞凋亡的转录因子CHOP mRNA(C/EBP同源蛋白)的量化揭示了此mRNA的表达相对于存在于未转染细胞中的量增加超过2倍。因此，ΔV-κLC的存在似乎引起ER应激的增加，这使得浆细胞对CHOP依赖性细胞凋亡敏感。
1.2截短的Ig在iTIE小鼠模型中的产生
为了研究截短的Ig产生对B细胞发育和体液应答的影响，使用在Igκ轻链基因座处具有遗传修饰的动物模型。其允许通过设计截短的Ig的合成来诱导。图2A中示出了用于构建此iTIE(诱导型截短的Ig表达)动物模型的策略。使用Cre重组酶活化修饰的Igκ基因座的转录允许表达不具有V区域的mRNA(图2A)以及相应截短的蛋白质(图2B)。此模型已显示截短的Ig(ΔV-κLC)的表达影响正常浆细胞的存活(图2C)和体液应答(2D)。也进行iTIE模型与DH-LMP2A小鼠的杂交，以便生成仅表达截短的Igκ链的B细胞和浆细胞(Casola S等人，Nat lmmunol 2004,Bonaud A等人，Blood 2015)。此新模型显示截短的Igκ的简单表达足以引起浆细胞中的应激并增加CHOP、BiP、IRE1α和HERP蛋白的表达(结果未示出)，因此揭示不具有V结构域的Igκ链的内在毒性。此毒性可与存在于ER中的应激标记(具体地为CHOP、BiP、HERP以及Xbp1s)的表达相关，如图2E所示。这些体内结果证实，截短的Ig的表达引起ER应激，从而导致浆细胞凋亡。
实例2：表达截短的Ig的浆细胞系对Bz处理的敏感性增加
Sirac博士的团队所进行的研究证明Bz对表达截短的Ig重链的浆细胞的高敏感性(Bonaud等人，Blood,2015)。
本发明人现在已表明，由不具有可变外显子的κ轻链的短转录物编码的不具有可变结构域的截短的Ig的存在增加了用蛋白酶体抑制剂MG132处理的浆细胞系的凋亡(图1C)。与这些结果一致，截短的Ig通过蛋白酶体主动降解并且在iTIE小鼠中Bz施用(腹膜内)之后其数目显著增加(图2B)。
实例3：通过外显子跳读进行策略可行性研究以增加肿瘤浆细胞中截短的Ig的合成。
为了验证施用1AON以诱导截短的Ig的产生的概念，使用细胞模型。此实验包括消除VJ可变外显子以及在骨髓瘤谱系(RPMI 8226)中迫使异常Ig合成。此骨髓瘤谱系表达Igλ。使用RT-PCR扩增Igλ转录物以鉴别VJ重排。在对扩增产物进行克隆和测序之后，分析IMGT位点上的VJ重排。RPM1-8226谱系表达VJλ2重排(IGLV2-14，IGLJ2)。将这些细胞用针对Jλ2片段的剪接供体位点的“吗啉代”类型AON转染(图4A)并且通过Gene Tools,LLC商业化。初级转录物上的AON杂交的详细表示呈现在表3中并且所使用的AON的序列对应于序列SEQ IDNO.5。有趣的是，AON有效破坏剪接并诱导缺乏VJ可变外显子的短转录物的极大增加(253个碱基对带，图4B)。在蛋白质方面，施用AON诱导不具有可变结构域的截短的Ig的产生(图4C)。AON转染的细胞显示高水平的促细胞凋亡因子CHOP和BiP伴侣蛋白，从而在产生异常Ig之后突出显示细胞应激(图4D)。
还进行研究，其中AON在转染不存在下被动施用。将RPM18226细胞用Gene Tools,LLC销售的“体内吗啉代”型AON孵育。这些“体内吗啉代”AON具有使得它们具有被动进入细胞的化学修饰。如结果显示(图4E)，在被动施用“体内吗啉代”型AON之后，外显子跳读是显著的。在向通过LPS体外刺激的原代小鼠B细胞被动施用“体内吗啉代”型AON之后也证实了外显子跳读的增加(结果未示出)。可适用于患者细胞的此方法学的验证构成实施临床前研究的主要进展。
实例4：用于获得治疗目的的截短Ig的策略
4.1供应能够诱导旨在产生不具有可变结构域的截短Igκ或Igλ轻链的外显子跳读的AON。
Ig轻链转录物由3个外显子组成：L(“前导序列”)、VJ(可变)和C(恒定)。
为了产生不具有可变结构域的截短轻链，可以使用靶向VJ外显子剪接供体位点的反义寡核苷酸(AON)，以在剪接期间消除VJ外显子。从机制观点出发，本发明人已表明表达这些遗传Ig的浆细胞通过细胞凋亡来死亡(Srour等人，J.Exp Med，接受的出版物)。此策略在图5中示出。
4.2供应能够诱导旨在产生截短的重链的外显子跳读的AON。
相同策略可应用于重链的靶向。在此情况下，AON可靶向VDJ可变外显子或恒定外显子(CH1、CH2或CH3)。
4.2.1使B细胞和浆细胞中μ重链的产生机制恢复。
在B细胞中表达膜形式的μ重链或在浆细胞中表达分泌形式的重链的过程是基于mRNA的替代性剪接，如图6所示。
4.2.2供应能够诱导旨在产生不具有可变结构域的截短重链的外显子跳读的AON。
截短的Ig的产生也可以通过迫使重链的可变结构域消除来诱导。
在鉴别由肿瘤克隆进行的VDJ重排之后，可变外显子的消除可以通过使用针对参与重排的J片段的剪接供体位点的AON来实现。因此，成熟mRNA不含有可变结构域。此策略在图7中示出。
4.2.3供应能够诱导旨在产生不具有恒定结构域之一的截短重链的外显子跳读的AON。
截短的Ig的产生也可以通过消除Ig重链的恒定结构域之一来实现，如图8所示。
序列表
<110> 利摩日大学
国家科学研究中心
<120> 用于通过外显子跳读产生截短的Ig的反义寡核苷酸用于治疗与B细胞相关的疾病的用途
<130> F2052/2-EMT/ll
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成(synthetic)
<400> 1
atggcctggd yyvydctvyt yct 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 2
ctcccgggta gaagtcact 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 3
tcggttacca ttggacaac 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 4
gcacctccag atggttaact gc 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 5
agaagagact cacgtaggac ggtca 25

Claims (8)

1.一种反义寡核苷酸或反义寡核苷酸混合物，其能够在免疫球蛋白重链或轻链的RNA水平下诱导外显子跳读，以用于治疗与B细胞相关的疾病方面的用途。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，用于根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其能够在所述轻链的VJ可变区或所述重链的VDJ中诱导外显子跳读。
3.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，用于根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其能够在所述重链的恒定区中诱导外显子跳读。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，用于根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，其能够通过与包含以下各项的序列杂交来诱导外显子跳读：位于所述免疫球蛋白链的所述可变区或恒定区的内含子或外显子区域内的剪接供体位点、剪接受体位点或剪接调节序列。
5.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，用于根据权利要求2所述的用途，其中所述与B细胞相关的疾病选自多发性骨髓瘤、AL淀粉样变性、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、瓦尔登斯特伦氏病、以及影响B细胞并涉及单克隆Ig的产生的任何其他类型的癌症。
6.根据权利要求3所述的反义寡核苷酸，用于根据权利要求3所述的用途，其中所述与B细胞相关的疾病选自(i)通过靶向产生IgE的B细胞的速发型变态反应、(ii)与IgA相关的免疫病理学、(iii)与自身抗体相关的自身免疫疾病、(iv)涉及单克隆免疫球蛋白链的组织沉积物的病理学，以及(v)移植。
7.一种能够在免疫球蛋白的重链或轻链的RNA中诱导外显子跳读的AON混合物。
8.一种能够在免疫球蛋白重链或轻链的RNA中诱导外显子跳读的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸混合物，用于与蛋白酶体途径的抑制剂组合来治疗多发性骨髓瘤的用途。
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