CN115087670A

CN115087670A - 包含ltbr和edb结合结构域的多特异性结合分子及其用途

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Publication number: CN115087670A
Application number: CN202080096332.8A
Authority: CN
Inventors: M·洛伦齐; S·拉奎尔; S·布雷克; K·克卢普施; B·夏德; V·贝里斯维尔; 梅尔科 M·西拉奇; J·伯特辛格
Original assignee: Cilag GmbH International
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2022-09-20
Also published as: EP4073111A1; CA3164226A1; JP2023506750A; WO2021116337A1; AU2020401755A1; US20210188990A1; IL293742A; KR20220130687A

Abstract

本文提供了抗LTBR多特异性结合分子、编码抗LTBR多特异性结合分子的核酸、包含核酸的载体、包含载体的宿主细胞以及包含抗LTBR多特异性结合分子的药物组合物。还提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括施用本文所公开的药物组合物。

Description

包含LTBR和EDB结合结构域的多特异性结合分子及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月11日提交的美国临时申请序列号62/946,452的权益。上述申请的全部内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及抗LTBR多特异性结合分子、编码结合分子的核酸和表达载体、含有载体的重组细胞以及包含结合分子的组合物。还提供了制备结合分子的方法，以及使用结合分子杀死癌细胞的方法。

背景技术

癌症的免疫疗法具有通过促进对肿瘤的免疫应答来改善癌症患者的存活率的潜力。虽然某些患者对当前可用的抗癌免疫疗法(例如抗CTLA4抗体伊匹单抗，抗PD-1/PD-L1抗体，诸如派姆单抗或纳武单抗)体验到深刻且持久的反应，但是大部分患者不从此类疗法获益(Ribas等人，Science 359:1350-1355(2018))。例如，患有特征在于缺乏免疫细胞浸润或不存在炎性特征的所谓的“冷”或非炎症性肿瘤的患者从抗癌免疫疗法获益较少(Chen和Mellman，Nature 541:321-30(2017))。因此，需要具有改善的功效的新型抗癌免疫疗法。

淋巴毒素β受体(LTBR/TNFRSF3)，一种TNF超家族的受体，是抗癌免疫疗法的许多可能靶之一。LTBR通过经由NF-κB通路来调节若干稳态淋巴细胞因子(例如CCL19、CCL21、CXCL13)和粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM1)的表达而在淋巴结和次级淋巴器官的发育和稳态中起到核心作用(Dejardin等人，Immunity 17:525-535(2002)，Schneider等人，Immunol.Rev.202:49-66(2004))。LTBR由两种不同的三聚体配体(LIGHT(TNFSF14)和淋巴毒素α1β2(LTα1β2))激活。然而LTα1β2对LTBR具有特异性，LIGHT还与HVEM(TNFRSF14)结合并激活HVEM(TNFRSF14)，该HVEM是在免疫细胞上表达并参与免疫细胞的调节的受体(Pasero等人，Curr.Opin.Pharmacol.12:478-85(2012))。

从癌症免疫疗法的角度来看，特别感兴趣的是发现LTBR通过其配体的激活导致三级淋巴结构(TLS)的异位形成(Schrama等人，Immunity 14:111-121(2001)；Tang等人，Cell.Mol.Immunol.14:809-18(2017))。在肿瘤微环境中存在TLS通常与免疫浸润相关，并且也与更好的预后相关，这表明TLS参与抗肿瘤免疫应答(Dieu-Nosjean等人，J.Clin.Oncol.26:4410-17(2008)；Weinstein和Storkus，Adv.Cancer Res.128:197-233(2015))。因此，LTBR的激活具有促进肿瘤微环境中的TLS形成并诱导抗肿瘤免疫应答以及改善当前癌症免疫疗法的潜力。

若干临床前研究中已经建立了靶向LTBR的治疗概念，其目的在于促进保护性抗肿瘤免疫应答。

若干小组已经使用其天然配体LIGHT(TNFSF14)靶向LTBR。LIGHT与LTBR以及第二受体HVEM(TNFRSF14)结合，该第二受体在免疫细胞(诸如B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞和DC)上表达(Pasero等人，Curr.Opin.Pharmacol.12:478-85(2012))。因此，应注意，LIGHT介导的免疫生物效应可能取决于LTBR或HVEM。

Yu等人展示出，小鼠肿瘤细胞系中膜结合形式的LIGHT的强制表达导致原始T淋巴细胞的大量浸润，这与趋化因子产生和粘附分子的上调相关，从而导致在局部位点和远侧位点处对已建立肿瘤的排斥(Yu等人，Nat.Immunol.5:141-9(2004))。在通过将LIGHT基因腺病毒递送到已建立肿瘤中来实现膜结合的LIGHT的强制表达时的场景中，得到了类似的发现(Yu等人，J.Immunol.179:1960-8(2007))。

在这些发现的基础上，并且在尝试以更适用于临床应用的形式利用这种作用模式时，Tang和同事们生成了一种具有改善的稳定性以及人和小鼠交叉反应性的同源三聚体单链LIGHT变体，其被称为3xhmLIGHT(Tang等人，Cancer Cell 29:285-96(2016))。当与EGFR特异性肿瘤靶向抗体融合时，3xhmLIGHT通过增加淋巴细胞浸润来在小鼠和人肿瘤模型中诱导抗肿瘤免疫，并由此可在与低淋巴细胞浸润的模型中的抗PD-L1抗体组合时，克服对检查点阻断免疫疗法的抗性。Tang等人报告了对荷瘤小鼠进行瘤内注射后的耐受性。没有观察到显著的副作用，因为没有观察到体重或血清细胞因子的显著变化。作者没有报告全身给药后的耐受性。

Johansson-Percival等人开发了一种融合构建体，其由与血管靶向肽(VTP)的C端融合的小鼠LIGHT构成(Johansson-Percival等人，Nat.Immunol.18:1207-17(2017))。在小鼠实体瘤模型中，VTP-LIGHT构建体归巢于肿瘤血管，促进血管正常化并诱导TLS。添加VTP-LIGHT增强了抗CTLA4和抗PD-1抗体的组合以及体内抗肿瘤疫苗的活性。在静脉内施用VTP-LIGHT后，在经处理的小鼠中观察到体重减轻。

Gurney等人报告了双特异性融合构建体的体外和体内研究，该构建体由与B7-H4特异性肿瘤靶向抗体融合的异源三聚体单链LTα1β2部分组成(WO2018/119118)。重要的是，与上述各种方法中使用的LIGHT不同，LTα1β2融合构建体是LTBR的特异性激动剂，并且不激活HVEM。在小鼠肿瘤模型中用LTα1β2融合构建体处理后，观察到免疫细胞的浸润、诱导的细胞因子表达和TLS的形成。LTα1β2抗体融合体与抗PD-L1抗体的组合的抗肿瘤活性优于单独地每一种化合物。Gurney等人使用的功效模型是由过表达B7-H4的工程化细胞系组成的人工模型。具有对人肿瘤中B7-H4水平更具代表性的非工程化B7-H4表达水平的模型的活性仍不清楚。未报告对小鼠耐受性的观察结果。

Michaelson等人陈述了构建靶向TRAIL-R2和LTBR的双特异性抗体，以探索与通过利用两种抗体的混合物进行处理所实现的抗肿瘤应答相比，双特异性抗体可触发增强、协同或更广泛的抗肿瘤应答的可能性(Michaelson等人，MAbs 1:128-41(2009))。TRAIL-R2是在正常组织(包括结肠、肺、肝和脑)中广泛表达的TNF家族受体(Spierings等人，J.Histochem.Cytochem.52:821-31(2004))，但也发现其在人上皮癌细胞系的表面上与LTBR共表达。在体外和小鼠肿瘤异种移植模型中，双特异性构建体示出相对于亲本抗体的增强的活性。未报告对小鼠耐受性的观察结果。

这些研究指示靶向LTBR对于肿瘤免疫疗法的潜力，并且提出激活LTBR信号传导可增强免疫细胞浸润、诱导肿瘤环境中的TLS，并且潜在地有助于克服对检查点抑制疗法的抗性。

免疫系统受到严格调节，以确保免疫介导的病原体根除但不引起组织损伤或自身免疫。通常观察到，全身免疫调节疗法使这种精细平衡失去平衡，并导致免疫相关的不良事件，诸如肺炎、结肠炎、肝炎、甲状腺功能障碍、皮肤反应、眼部炎症等，从而代表了对开发新型免疫疗法的挑战，具体地讲在其中毒性可以是累加或协同的组合疗法的情况下。

由于LTBR在生物体中的广泛表达，能够诱导TLS并产生激活免疫环境的激动性LTBR靶向药物带有导致全身免疫相关的不良事件的显著风险。有趣的是，Johansson-Percival等人报告了在全身施用LTBR激活化合物VTP-LIGHT后，小鼠体重减轻(Johansson-Percival等人，Nat.Immunol.18:1207-17(2017))。因此，如现有技术中假设的，需要在肿瘤中而不是在其他组织中特异性激活LTBR的治疗形式，以降低毒性风险并生成可用于组合疗法的良好耐受药物(Allen等人，Oncotarget 8:99207-8(2017)；Tang等人，CellMol.Immunol.14:809-18(2017))。

虽然若干小组已使用各种LTBR靶向部分研究了LTBR作为治疗靶，但迄今为止尚未描述能够在肿瘤中特异性激活LTBR的治疗形式。

发明内容

本文提供了多特异性结合分子，诸如双特异性抗体，其能够特异性激活肿瘤中的淋巴毒素β受体(LTBR)。多特异性结合分子具有对LTBR的第一特异性和对纤连蛋白的额外结构域B(EDB)的第二特异性。EDB是细胞外基质的肿瘤相关抗原(TAA)。多特异性结合分子在表达EDB的肿瘤中激活LTBR，但在不存在EDB的情况下，不激活或仅适度激活LTBR，其程度远低于其配体LIGHT和LTα1β2，从而降低了免疫相关不良事件的风险。与先前描述的LTBR激活分子不同，在存在EDB的情况下，在经由本发明的多特异性结合分子的EDB特异性部分进行EDB结合和经由本发明的多特异性结合分子的LTBR特异性部分进行LTBR结合时实现有效的LTBR激活。如果不存在EDB，则多特异性结合分子将不导致正常组织中LTBR的激活。这是优于现有技术中描述的基于天然LTBR配体的分子的显著优势，该分子例如为LIGHT抗体融合体，其可不依赖于TAA激活LTBR，并且因此与本发明的分子相比，其对LTBR的激活具有低得多的肿瘤特异性，如本文实施例中所示。

本文提供了多特异性结合分子。多特异性结合分子可包含(i)第一结合结构域，该第一结合结构域与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合，和(ii)第二结合结构域，该第二结合结构域与EDB特异性结合，其中多特异性结合分子在结合EDB时激活LTBR。更具体地，当多特异性结合分子同时结合LTBR和EDB时，该多特异性结合分子经由其对这些靶的相应特异性结合结构域激活LTBR。优选地，这在其中存在表达LTBR的细胞和表达EDB的细胞的肿瘤环境中发生，从而导致肿瘤组织中的LTBR的特异性激活。在某些实施方案中，多特异性结合分子以肿瘤特异性方式激活LTBR。多特异性结合分子可以例如是双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性结合分子包含两个抗原结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合分子包含三个抗原结合结构域。三个抗原结合结构域可例如包括一个与LTBR特异性结合的结合结构域。三个抗原结合结构域可例如包括两个特异性结合EDB的结合结构域。

在某些实施方案中，多特异性结合分子包含三个抗原结合结构域并且由抗体(例如，以IgG形式)构成，附加结合结构域(例如呈单链可变结构域形式)已与该抗体融合，例如，与抗体的重链或轻链的N端或C端融合。

对于特异性结合存在于细胞外基质中的LTBR和TAA的本发明的多特异性结合分子而言，存在于细胞外基质中的TAA是纤连蛋白。优选地，与TAA结合的结合结构域与纤连蛋白的额外结构域B(EDB)特异性结合。

在某些非限制性实施方案中，与LTBR特异性结合的结合结构域包含BHA10抗体或CBE11抗体或者其片段或衍生物，例如单链抗体片段(scFv)，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述VH和所述VL包含以下中的任一者：

(i)分别包含SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者

(ii)分别包含SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者

(iii)分别包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别包含SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者

(iv)VH包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，诸如其中VH包含与SEQID NO:43的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQID NO:44的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少97％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；或者

(v)VH包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，诸如其中VH包含与SEQID NO:47的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQID NO:48的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少97％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；或者

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25。

在某些非限制性实施方案中，与EDB特异性结合的第二结合结构域包含L19抗体或者其片段或衍生物，例如包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其片段包含以下中的任一者：

(i)分别包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者

(ii)VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，诸如其中VH包含与SEQID NO:45的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少97％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

在某些非限制性实施方案中，多特异性结合分子包含：

(1)与LTBR特异性结合的结合结构域，其包含BHA10抗体或CBE11抗体或者其片段或衍生物，例如单链抗体片段(scFv)，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述VH和所述VL包含以下中的任一者：

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25；以及

(2)与EDB特异性结合的第二结合结构域，其包含L19抗体或者其片段或衍生物，例如包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的氨基酸序列；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77的氨基酸序列。

在某些非限制性实施方案中，多特异性结合分子包含：

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25；以及

(2)与EDB特异性结合的第二结合结构域，其包含L19抗体或者其片段或衍生物，例如包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其片段包含VH，其包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；以及VL，其包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ IDNO:45的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少97％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ IDNO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

在某些非限制性实施方案中，多特异性分子包含：

(1)与包含SEQ ID NO:22的LTBR特异性结合的结合结构域；以及

(2)与EDB特异性结合的第二结合结构域，其包含L19抗体或者其片段或衍生物，例如包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其片段包含以下中的任一者：

(ii)VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在某些非限制性实施方案中，多特异性分子包含：

(1)与包含SEQ ID NO:23的LTBR特异性结合的结合结构域；以及

(ii)VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

在某些非限制性实施方案中，多特异性分子包含：(1)和(2)

(1)与包含SEQ ID NO:25的LTBR特异性结合的结合结构域；

在某些非限制性实施方案中，多特异性结合分子包含以下中的任一者：

(a)(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一重链，该第一重链与包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的第一轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二重链，该第二重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第二轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA14121]；或者

(b)(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一重链，该第一重链与包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的第一轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二重链，该第二重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第二轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA14122]。

在某些另外的非限制性实施方案中，多特异性结合分子包含以下中的任一者：

(c)(i)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:84)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA1480]；或者

(d)(i)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:84)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA1481]；或者

(e)(i)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:84)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA1482]；或者

(f)(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:84)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA1483]；或者

(g)(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:84)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA14107]；或者

(h)(i)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:84)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA14108]；或者

(j)(i)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:3)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA14133]；或者

(k)(i)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:3)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA14174]；或者

(l)(i)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分(包含SEQ ID NO:84)与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域[多特异性结合分子被称为COVA1456]。

在一些实施方案中，多特异性分子包含(i)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的scFv重链融合体，该scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，该重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域。

还提供了一种或多种核酸分子，该一种或多种核酸分子编码如本文所公开的多特异性结合分子。还提供了一种或多种载体，该一种或多种载体包含如本文所公开的一种或多种核酸分子。还提供了分离的宿主细胞，该分离的宿主细胞包含如本文所公开的一种或多种载体。

还提供了药物组合物，该药物组合物包含如本文所公开的多特异性结合分子以及药学上可接受的载剂。

还提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。该方法包括向受试者施用如本文所公开的多特异性结合分子、如本文所公开的一种或多种核酸分子、如本文所公开的一种或多种载体或如本文所公开的药物组合物。

还提供了如本文所公开的多特异性结合分子、如本文所公开的一种或多种核酸分子、如本文所公开的一种或多种载体或如本文所公开的药物组合物用于激活肿瘤组织中的LTBR的用途。

还提供了制备如本文所公开的多特异性结合分子的方法，该方法包括在宿主细胞中表达如本文所公开的一种或多种核酸分子或如本文所公开的一种或多种载体，以及收获多特异性结合分子。

对于本发明的多特异性结合分子，第一抗原的结合结构域与存在于肿瘤中的细胞(例如，肿瘤细胞、成纤维细胞、单核细胞等)上的LTBR结合。第二抗原的结合结构域与EDB结合，该EDB是存在于肿瘤中的细胞外基质的肿瘤相关抗原(TAA)。

在某些实施方案中，多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)包含两条重链(HC)和两条轻链(LC)以形成对EDB的两个结合结构域。

在某些实施方案中，scFv与一个HC的羧基(C)端或氨基(N)端融合。在某些实施方案中，与HC融合的scFv包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQID NO:56。

还提供了分离的核酸，该分离的核酸编码与如本文所公开的分离的抗LTBR双特异性抗体或其抗原结合片段的HC融合的scFv。还提供了分离的核酸，该分离的核酸编码如本文所公开的抗LTBR双特异性抗体或其抗原结合片段的HC和LC。

在某些实施方案中，重链、轻链和/或其功能片段诸如抗原特异性结合结构域是人或人源化的。

还提供了核酸，该核酸编码如本文所公开的多特异性结合分子的重链、轻链和/或其功能片段。

还提供了载体，该载体包含如本文所公开的核酸。

还提供了宿主细胞，该宿主细胞包含如本文所公开的核酸或载体。

在优选的实施方案中，根据本发明的多特异性结合分子、双特异性抗体、核酸、载体或宿主细胞分别是分离的多特异性结合分子、分离的双特异性抗体、分离的核酸、分离的载体或分离的宿主细胞。

还提供了药物组合物，该药物组合物包含如本文所公开的多特异性结合分子，诸如双特异性抗体，或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。

还提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。该方法包括(a)鉴定需要癌症治疗的受试者；以及(b)向有需要的受试者施用本发明的多特异性结合分子(例如呈药物组合物的形式)，其中向需要的受试者施用药物组合物治疗受试者的癌症。

还提供了激活表达LTBR的细胞的方法。该方法包括使表达LTBR的细胞与本发明的多特异性结合分子(例如呈药物组合物的形式)接触，其中与在不存在EDB的环境中表达LTBR的细胞相比，使表达LTBR的细胞与多特异性结合分子或药物组合物接触导致RANTES、IL-6、IL-8、MIP-3b、ICAM-1、I-TAC、IP-10、IL-12p70、TNF-a、MIP-3a和/或SDF-1a表达增加。

还提供了抑制肿瘤中表达EDB的癌细胞的生长或增殖的方法。该方法包括使肿瘤微环境中的癌细胞和/或细胞与本发明的多特异性结合分子(例如呈药物组合物的形式)接触，其中使肿瘤微环境中的癌细胞和/或细胞与药物组合物接触抑制癌细胞的生长或增殖。

还提供了制备如本文所公开的药物组合物的方法。该方法包括将本发明的分离的多特异性结合分子(例如双特异性抗体或其抗原结合片段)与药学上可接受的载剂组合以获得药物组合物。

还提供了制备多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)的方法。该方法包括在制备多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)的条件下培养如本文所公开的包含核酸的宿主细胞，以及回收多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)。

附图说明

结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。

图1A至图1A6示出了抗LTBR双特异性抗体和对照分子的示意图。图1A至图1D示出了具有沉默Fc突变IgG1的对照单克隆抗体。图1E至图1F示出了包含靶向臂(B21M或EDBmAb1)和与Fc融合的人LIGHT的1:1杵臼结构(KiH)异源二聚体。在与人LIGHT融合的Fc中引入一组突变，以消除与蛋白质A的结合并有利于异源二聚体的纯化。图1G至图1J示出了人LTα1β2抗体融合体。图1K至图1O示出了1:1KiH异源二聚体。图1P至图1S示出了2:1异源二聚体，同种型对照抗体与来源于LTBRmAb1的装订的scFv融合。图1T至图1W示出了2:1异源二聚体，EDBmAb1与来源于LTBRmAb1的装订的scFv融合。图1X至图1Y示出了2:1异源二聚体，EDBmAb1与来源于LTBRmAb1的较低亲和力变体的装订的scFv融合。图1Z至图1A1示出了2:1异源二聚体，EDBmAb1或B21M与来源于LTBRmAb1的装订的scFv融合，但在Fc区中没有蛋白质A突变。图1A2至图1A5示出了2:1异源二聚体，EDBmAb1或B21M与来源于LTBRmAb1的二硫键稳定的scFv融合。图1A6示出了2:1异源二聚体，MSLNmAb1与来源于LTBRmAb1的装订的scFv融合。

图2A至图2G示出了以下物质的尺寸排阻色谱图(SEC)：图2A：COVA1418，其由3xhmLIGHT-Fc与抗RSV抗体B21M的重链和轻链组成；图2B：COVA1454，其由3xhmLIGHT-Fc与抗EDB抗体EDBmAb1的重链和轻链组成；图2C：COVA14133，其由携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链与抗EDB抗体EDBmAb1的重链和轻链组成；图2D：COVA14113，其由携带C端LTα1β2融合体的EDBmAb1重链与抗EDB抗体EDBmAb1的轻链组成；图2E：COVA14114，其由携带C端LTα1β2融合体的抗RSV B21M抗体重链与抗RSV B21M抗体的轻链组成；图2F：COVA14116，其由携带C端LTα1β2融合体的EDBmAb1重链与抗EDB抗体EDBmAb1的重链和轻链组成；图2G：COVA14117，其由携带C端LTα1β2融合体的抗RSV B21M抗体重链与抗RSV B21M抗体的重链和轻链组成。

图3A至图3D示出了展示出A549 NF-kB报告基因测定的结果的图。图3A：与COVA1418和重组人LIGHT相比，通过COVA1454对LTBR的肿瘤相关抗原(TAA)依赖性激活；图3B：与COVA1418和重组人LIGHT相比，通过COVA1454对LTBR的TAA非依赖性激活；图3C：与重组人LIGHT和重组人LTα1β2相比，通过COVA14113和COVA14116对LTBR的TAA依赖性激活；图3D：与重组人LIGHT和重组人LTα1β2相比，通过COVA14113和COVA14116对LTBR的TAA非依赖性激活。

图4A至图4D示出了展示出使用由EDBmAb1和LTBRmAb1或LTBRmAb2组成的1:1异源二聚体的A549 NF-kB报告基因测定的结果的图。图4A：与COVA14120、COVA14124、COVA1413、COVA1440和重组人LIGHT相比，通过COVA14121对LTBR的肿瘤相关抗原(TAA)依赖性激活；图4B：与COVA14120、COVA14124、COVA1413、COVA1440和重组人LIGHT相比，通过COVA14121对LTBR的TAA非依赖性激活；图4C：与COVA14123、COVA14124、COVA1402、COVA1440和重组人LIGHT相比，通过COVA14122对LTBR的TAA依赖性激活；图4D：与COVA14123、COVA14124、COVA1402、COVA1440和重组人LIGHT相比，通过COVA14122对LTBR的TAA非依赖性激活。

图5A至图5E示出了展示出使用2:1双特异性抗体的A549 NF-kB报告基因测定的结果的图。图5A：在存在含EDB的纤连蛋白的情况下，通过COVA1456(2:1EDBmAb1×LTBR mAB1)对LTBR进行有效激活。在同种型对照分子COVA1462(2:1B21M×LTBR mAb1)的情况下，未观察到LTBR激活；图5B：在不存在含EDB的纤连蛋白的情况下，未测量到通过COVA1456或其同种型对照分子COVA1462的LTBR激活；图5C：通过COVA1456与COVA1482、其相应对照分子COVA1462和COVA1486、以及重组人LIGHT进行的TAA依赖性LTBR激活的比较结果；图5D：通过COVA1482、含有LTBRmAb1的较低亲和力变体的双特异性抗体COVA14107和COVA14108、以及COVA1486进行的TAA依赖性LTBR激活的比较结果；图5E：通过COVA1482和COVA14133(不具有蛋白质A突变的构建体)及其相应对照分子COVA1486和COVA14136进行的TAA依赖性LTBR激活的比较结果；图5F：在存在含EDB的纤连蛋白的情况下，通过COVA14133(2:1EDBmAb1×LTBR mAB1)和COVA14116(2:1EDBmAb1×LTα1β2)对LTBR进行有效激活。在同种型对照分子COVA14136(2:1B21M×LTBR mAb1)的情况下，未观察到LTBR激活。通过COVA14117(2:1B21M×LTα1β2)对LTBR进行TAA非依赖性激活；图5G：在不存在含EDB的纤连蛋白的情况下，未测量到通过COVA14133或其同种型对照分子COVA14136的LTBR激活。通过COVA14116和COVA14117对LTBR进行TAA非依赖性激活。

图6示出了在共培养实验后A375细胞上ICAM-1的流式细胞术染色的结果。将COVA1482及其对照分子COVA1486与重组人LIGHT进行比较。

图7A至图7J示出了展示出与COVA14136和COVA1440相比，用抗EDB/抗LTBR双特异性抗体COVA14133处理的共培养物的上清液中的细胞因子测量结果的图。使用MSD平台进行测定。图7A：人RANTES的浓度；图7B：人IL-6的浓度；图7C：人IL-8的浓度；图7D：人MIP-3b的浓度。图7E至图7J中示出的图还包括2:1抗体x LTα1β2融合体COVA14116和COVA14117以及EDBmAb1 COVA1452。图7E：人IP-10的浓度；图7F：人SDF-1a的浓度；图7G：人IL-12p70的浓度；图7H：人I-TAC的浓度；图7I：人MIP-3a的浓度；图7J：人TNFα的浓度。

图8A至图8B示出了在A549 NF-kB报告基因/CHOK1MSLN或A549NF-kB报告基因/H226共培养细胞测定中，通过MSLN/LTBR双特异性抗体进行的LTBR激活。图8A：在A549 NF-kB报告基因/H226共培养测定中的LTBR激活。将COVA14146(2:1MSLNmAb1×LTBRmAb1)与LIGHT和同种型对照2:1构建体COVA1486进行比较；图8B：在A549NF-kB报告基因/H226共培养测定中激活LTBR时，分泌的RANTES的浓度。将COVA14146(2:1MSLNmAb1×LTBRmAb1)与LIGHT和同种型对照2:1构建体COVA1486进行比较。

图9A至图9B示出了可能的LTBR激活机制的示意图。图9A：在细胞外基质中存在EDB(肿瘤相关抗原(TAA))的情况下，双特异性抗体可经由与EDB结合将LTBR聚类到细胞表面上。LTBR的激活导致化学引诱剂细胞因子和趋化因子的分泌。图9B：在细胞外基质中不存在EDB的情况下，不发生LTBR的聚类。结果，可不发生LTBR的激活。

图10示出了PBMC朝向由LTBR激活所诱导的细胞因子的迁移。将用抗EDB/抗LTBR双特异性抗体COVA14133(与COVA14136和COVA1440相比)以及抗EDB/LTα1β2融合体COVA14116(与COVA14117相比)处理的共培养物的上清液(如图7所示)用作transwell迁移测定中PBMC的引诱剂。对朝向共培养物上清液迁移的PBMC的数量进行计数并示于图中。以剂量依赖性方式诱导PBMC朝向来自用COVA14133、COVA14116和COVA14117(迁移程度稍小)刺激的共培养物的上清液的迁移。来自与非靶向对照分子COVA14136一起温育的共培养物的上清液不诱导PBMC的迁移。

图11A至图11B示出了单核细胞对用抗EDB/抗LTBR双特异性抗体COVA14133刺激的HUVEC单层的粘附和迁移(与其对照COVA14136相比)。在基于成像的测定(该测定由单核细胞在HUVEC单层上的连续流动组成，该HUVEC单层在存在EDB的情况下生长并用50nMCOVA14133或COVA14136刺激)中，对粘附的(“A”)和迁移的(B)单核细胞随着时间的推移的数量进行计数。进行了COVA14133针对COVA14136的学生T检验分析，并且标记如下：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。

应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B两者为真(或存在)。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴、人等，优选地人。

还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。

在两条或更多条核酸或多肽序列(例如，抗LTBR双特异性抗体和编码它们的多核苷酸、抗LTBR/抗EDB双特异性抗体和编码它们的多核苷酸、LTBR多肽和编码它们的LTBR多核苷酸、EDB多肽和编码它们的EDB多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指当进行比较和比对以获得最大对应时，相同的或者具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量的。

对于序列比对，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算对于测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith&Waterman的局部同源性算法进行，《高等应用数学》第2卷：第482页(1981年)(Adv.Appl.Math.2:482(1981))，通过使用Needleman&Wunsch的同源比对算法进行，《分子生物学杂志》，第48卷：第443页(1970年)(JMol.Biol.48：443(1970))，通过搜索Pearson&Lipman的相似性方法进行，《美国国家科学院院刊》，第85卷：第2444页(1988年)(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988))，通过这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，在威斯康星州遗传学软件包，遗传学计算小组，威斯康辛州，麦迪逊，科学街区575号(575Science Dr.,Madison,WI)计算机化实施，或通过目测(大体参见，《分子生物学实验室指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等人编辑，《实验室指南》，格林尼出版协会和约翰威利父子公司的合资企业(1995年增补版)(Ausubel))。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中有所描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字词来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字词比对时，该短字词匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻近字词分数阈值(Altschul等人，出处同上)。这些初始邻近字词命中充当用于发起搜索以找到包含它们的较长HSP的种子。然后将字词命中沿每个序列在两个方向上延伸，只要可增加累积的比对分数。

对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和N(错配残基的处罚分数；始终<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)3、期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。

两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽免疫地交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅通过保守置换而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交。

如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类经转染细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。

如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的多特异性结合分子，例如双特异性抗体可处于宿主细胞的细胞质内，处于细胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。优选地，多特异性结合分子从生产宿主细胞分泌到培养基中。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可指由氨基酸组成的分子，并且可被本领域的技术人员识别为蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还涵盖已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；天然修饰或干预修饰为例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

本文所述的肽序列根据通常的惯例书写，其中肽的N端区在左侧，并且C端区在右侧。虽然氨基酸的同分异构形式是已知的，但除非另外明确指明，它是所表示的氨基酸的L形式。

如本文所用，“多特异性结合分子”意指与至少两个不同分子特异性结合的分子。优选地，分子是蛋白质，例如包含抗体或者其片段或衍生物。本发明的多特异性结合分子或抗体具有与LTBR特异性结合的至少一个结合结构域，以及与纤连蛋白的EDB特异性结合的至少一个结合结构域，并且鉴于针对LTBR的结合特异性的存在，在本文中有时被称为“抗LTBR”结合分子或抗体。

如本文所用，“结合结构域”意指结合分子的功能部分，例如来自抗体，其赋予结合分子对靶分子的特异性结合。结合结构域的示例是赋予对靶分子的特异性结合的抗体的可变区，并且可以由抗体的多于一个链形成，例如使重链的可变结构域与轻链的可变结构域配对，或由单链形成(诸如在scFv分子中)，或由例如单个结构域(诸如来自美洲驼的VHH，例如纳米抗体)形成等。本发明的靶分子是LTBR或纤连蛋白，具体地讲纤连蛋白的EDB。

如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体以比其他抗原更大的亲和力与预定抗原结合。通常，抗体以如下解离常数(K_D)与预定抗原结合：约1×10^-7M或更小，例如约1×10^-8M或更小，约1×10^-9M或更小，约1×10^-10M或更小，约1×10^-11M或更小，约1×10^-12M或更小，约1×10^-13M或更小，或者约1×10^-14M或更小，通常K_D比其与非特异性抗原或表位(例如BSA，酪蛋白)结合的K_D小至少十倍。可使用标准程序来测量解离常数。然而，与预定抗原特异性结合的抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，与来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)(食蟹猴(cynomolgus，cyno))或黑猩猩(Pantroglodytes)(黑猩猩(chimpanzee，chimp)))的相同预定抗原具有交叉反应性。

如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”意指存在于肿瘤细胞上或存在于肿瘤的细胞外基质中的抗原，该抗原不与在正常细胞上或正常组织的细胞外基质中发现的抗原定性地不同，但其在一些方面定量地不同，例如，它们以显著更大的量、更高的密度、在不同的表达位点处存在于肿瘤细胞上或存在于肿瘤的细胞外基质中，和/或可不同地访问免疫系统等。在某些实施方案中，与在非肿瘤细胞或细胞外基质上相比，肿瘤相关抗原以高至少两倍的量，更优选地高至少五倍的量，诸如例如高至少10倍的量，甚至更优选地高至少100倍的量，诸如例如高至少1000倍的量，并且最优选地高至少10,000倍的量存在于肿瘤细胞上或存在于肿瘤细胞外基质中。EDB存在于肿瘤组织的细胞外基质中的纤连蛋白中，然而其通常不可以正常组织(即，正常条件下的相同组织并且不处于肿瘤环境中)中存在的纤连蛋白形式检测。

如本文所用，术语“细胞外基质”意指存在于所有组织和器官内的呈细胞外大分子的三维网络形式的非细胞组分，诸如胶原、酶和糖蛋白，其提供周围细胞的结构和生物化学支撑。其确切的组成针对不同组织而变化，但其通常由蛋白聚糖、水、矿物质和纤维蛋白质构成。蛋白聚糖由被称为糖胺聚糖的淀粉样分子的长链包围的蛋白质核构成。两种主要类型的细胞外基质分子构成基质：蛋白聚糖和纤维蛋白质，包括例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。

抗体

本发明一般涉及抗LTBR多特异性结合分子、编码多特异性结合分子的核酸和表达载体、含有载体的重组细胞以及包含多特异性结合分子的组合物。在优选的实施方案中，抗LTBR多特异性结合分子是抗LTBR多特异性抗体，诸如抗LTBR双特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗LTBR多特异性结合分子可包含与LTBR特异性结合的结合结构域，该结合结构域呈与抗体或其功能片段不同的形式，例如其可包含抗LTBR Fynomer、抗LTBRaffimer、抗LTBR darpin和/或被筛选用于与LTBR特异性结合的候选物的其他蛋白质支架。在本发明的多特异性结合分子中，对LTBR具有特异性的结合结构域不由LIGHT或LTα1β2(LTBR的天然配体)提供，也不由其功能片段或衍生物，诸如3xhmLIGHT提供。在优选的实施方案中，本发明的多特异性结合分子中的对LTBR具有特异性的结合结构域包含针对LTBR的抗体，优选地针对LTBR的激动性抗体，或者其功能片段或衍生物，诸如scFv。已经描述了此类针对LTBR的激动性抗体，并且非限制性示例为BHA10(例如，WO2004002431)和CBE11(例如，WO0230986)，或者可另选地根据用于抗体生成的已知方法诸如小鼠免疫、噬菌体展示等来生成。

Fyn SH3来源的多肽或“Fynomer”在本领域中是众所周知的，并且已描述于例如Grabulovski等人，(2007)JBC，282，第3196-3204页；WO 2008/022759；Bertschinger等人，(2007)Protein Eng Des Sel 20(2):57-68；以及Gebauer和Skerra(2009)Curr Opinionin Chemical Biology 13:245-255中。术语“Fyn SH3来源的多肽”在本文中可与术语“Fynomer”互换使用，是指来源于人Fyn SH3结构域的非免疫球蛋白来源的结合多肽(例如，所谓的支架，如Gebauer和Skerra(2009)Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255中所述的)。Fynomer是约7kDa的小的球状多肽。人Fyn激酶的SH3结构域成功地用作支架以工程化蛋白质(被称为Fynomer的Fyn SH3来源的结合蛋白质)，其以高亲和力和特异性与不同靶蛋白质结合(WO 2008/022759、WO 2011/023685、WO 2013/135588、WO 2014/170063；Grabulovski D.等人，(2007)J Biol Chem 282，第3196-3204页；Bertschinger J.等人，(2007)Protein Eng Des Sel，20，第57-68页；以及Schlatter等人，(2012)mAbs，4(4)，第497-450页)。

Affimer分子是小蛋白质(12kDa至14kDa)，其以与抗体相似的特异性和亲和力与靶分子结合。这些工程化非抗体结合蛋白质被设计成模拟单克隆抗体在不同应用中的分子识别特性(参见例如Tiede等人，eLife 2017，DOI:10.7554/eLife.24903)。

DARPin(用于设计锚蛋白重复蛋白质)是基因工程化抗体模拟蛋白质，其通常表现出高特异性蛋白质结合，并且来源于天然锚蛋白蛋白质。它们由至少三个重复基序组成，并且对于四个或五个重复DARPin而言，其分子量通常分别为约14kDa或18kDa。DARPin设计例如在Binz等人，2003,J.Mol.Biol.332:489-503中有所描述。

其他结合蛋白质形式(诸如蛋白质支架)在本领域中是已知的，并且还可用于提供本发明的多特异性结合分子的某些实施方案的一个或多个结合结构域。

在本发明的优选实施方案中，与LTBR结合的结合结构域在结合时激活LTBR并且来源于与LTBR特异性结合的抗体，优选地激动性抗体。在具体实施方案中，与LTBR结合的结合结构域是抗体的单链可变结构域(scFv)，该scFv可以呈任何可用形式，例如通过先前和/或本文所述的方法稳定。

在某些实施方案中，本发明涉及抗LTBR/抗EDB双特异性抗体或其抗原结合片段、编码抗体的核酸和表达载体、含有载体的重组细胞以及包含双特异性抗体的组合物。还提供了制备多特异性结合分子和/或抗体的方法，以及使用多特异性结合分子和/或抗体治疗疾病(包括癌症)的方法。本文所公开的多特异性结合分子和/或抗体具有一种或多种期望的功能特性，包括但不限于以下中的一种或多种：与LTBR和EDB特异性结合，对LTBR和EDB的高特异性，和/或当单独施用或与其他抗癌疗法联合施用时治疗或预防癌症的能力。

如本文所用，术语“抗体”广义地使用，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆的抗原结合结构域。一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五大类(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ或λ轻链恒定域。根据具体实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除重链和轻链恒定结构域之外，抗体还包含由轻链可变区和重链可变区构成的抗原结合区，每个可变区包含三个结构域(即，互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域另选地被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且重链可变区结构域另选地被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与LTBR特异性结合的分离的双特异性抗体基本上不含不与LTBR结合的双特异性抗体；与LTBR和/或EDB特异性结合的分离的双特异性抗体基本上不含不与LTBR和/或EDB结合的双特异性抗体)。另外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一组基本上均质的抗体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该组的各个抗体是相同的。本发明单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以由包括获自转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠的B细胞的杂交瘤产生，转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。在某些实施方案中，单克隆抗体由表达编码抗体的核酸序列的重组宿主细胞产生。此类重组宿主细胞可例如通过将核酸序列转染到亲本细胞(例如CHO细胞)中来获得。可在有助于抗体在宿主细胞中表达的条件下培养重组宿主细胞，并且可从宿主细胞、培养基或两者中分离抗体。

在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括抗体或其一种或多种抗原结合片段。如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如像，双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。根据具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd区段。根据其他具体实施方案，抗原结合片段包含Fab和F(ab’)。在一些实施方案中，抗原结合片段包括具有互补CH3结构域以强制发生异源二聚化的IgG样分子；重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段的一部分或Fab片段；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白质或载剂分子融合。在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、杵臼结构(Knobs-in-Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对体(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)或DuoBody(Genmab A/S，参见例如，Labrijn等人，2013,PNAS 110:5145-5150)。在一些实施方案中，抗原结合片段包括“装订的单链Fv”或“spFv”，这是指包含VH与连接子之间或者VL与连接子之间的一个或多个二硫键的scFv。通常，spFv可包含VH与连接子之间的一个二硫键，VL与连接子之间的一个二硫键，或者VH与连接子之间以及VL与连接子之间的两个二硫键。包含VH与VL之间的二硫键的scFv分子从术语“scFv”中排除。

如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，其包含通过例如约15个至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，这种单域抗体包含重链可变区和重链恒定区或者仅包含重链可变区。

在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括在Fc中具有一个或多个突变的抗体，该一个或多个突变消除与蛋白质A的结合。此类突变有利于异源二聚体的纯化，并且例如已经描述于WO2010151792中。

如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其抗原结合片段和/或包含至少一种人重链多肽和/或轻链多肽的抗体。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指被修饰成提高与人抗体的序列同源性的非人抗体，使得抗体的抗原结合特性得以保留，但其在人体内的抗原性下降。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链两者的可变区经常对应于来源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望的特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区对应于来源于另一个哺乳动物物种(例如，人)的抗体中的序列，以便避免在那个物种中引出免疫应答。

如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在某些实施方案中，多特异性抗体包含第三免疫球蛋白可变结构域、第四免疫球蛋白可变结构域或第五免疫球蛋白可变结构域，或甚至更多免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位，优选地不超过两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位(例如，LTBR抗原上的表位)具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域和对第二表位(例如，EDB上的表位)具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，双特异性抗体包含形成对第一表位具有结合特异性的结合结构域的第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域以及形成对第二表位具有结合特异性的结合结构域的第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在本发明的优选实施方案中，第一表位位于LTBR上，并且第二表位位于纤连蛋白(具体地讲其EDB)上。

在某些实施方案中，根据本发明的多特异性结合分子包括抗体，例如IgG，其中scFv与抗体融合。在某些实施方案中，scFv可具有对LTBR的结合特异性。在某些实施方案中，抗体的两个臂(包括可变区)可与纤连蛋白的EDB结合。scFv可与抗体的轻链或抗体的重链融合，并且可与重链或轻链的N端或C端融合。在某些实施方案中，scFv与重链的N端融合。在其他实施方案中，scFv与重链的C端融合。技术人员基于本公开将清楚的是，其他形式也是可能的，例如其中包含与LTBR特异性结合的一个臂以及与EDB特异性结合的另一个臂的双特异性抗体通过将与EDB特异性结合的scFv与抗体的一条链融合等来补充。

如本文所用，术语“LTBR”是指作为淋巴毒素的细胞表面受体参与细胞凋亡和细胞因子释放的多肽，其是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。LTBR也可被称为“肿瘤坏死因子受体超家族成员3(TNFRSF3)”。LTBR在许多细胞类型(包括上皮细胞和髓系细胞)的表面上表达。LTBR可特异性结合淋巴毒素膜形式(淋巴毒素-α和淋巴毒素-β的复合物)。LTBR的激活可经由TRAF3和TRAF5触发细胞凋亡，并且可以导致白介素8的释放。除非另外指明，否则优选地，LTBR为人LTBR。人LTBR氨基酸序列由UniProt号P36941提供。

术语“EDB”或“额外结构域B”是指纤连蛋白的结构域，其基于纤连蛋白前mRNA的剪接模式可包括在纤连蛋白分子中。额外结构域B是包含91个氨基酸残基的完整纤连蛋白(FN)III型重复序列。一般来讲，EDB在正常成人组织中是不可检测的，但在胎儿和肿瘤组织中在细胞外基质中表现出更高的表达，并且在血管生成过程中在新血管系统周围积累，从而使得EDB成为血管生成的潜在标志物和靶。除非另外指明，否则优选地，EDB为人EDB。含有纤连蛋白同种型氨基酸序列的人EDB由UniProt号P02751提供。

术语“纤连蛋白”是指为细胞外基质的高分子量糖蛋白的多肽。纤连蛋白可与跨膜受体蛋白质结合，其被称为整联蛋白。纤连蛋白还可结合其他细胞外基质蛋白质，诸如胶原、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖。纤连蛋白可以以蛋白质二聚体形式存在，由两个几乎相同的单体组成，这两个单体通过一对二硫键连接。纤连蛋白由单个基因产生，但是纤连蛋白前mRNA分子的另选剪接导致形成纤连蛋白的若干同种型，其中一种同种型是EDB纤连蛋白。纤连蛋白可在细胞粘附、生长、迁移和分化中起作用，并且对于诸如伤口愈合和胚胎发育的过程可能是重要的。人纤连蛋白氨基酸序列由UniProt号P02751提供，其含有额外结构域B，以及NCBI登录号NP_001263337(同种型B)、NP_001263338(同种型c)、NP_001263339(同种型d)、NP_001263340(同种型e)、和NP_001263341(同种型f)、NP_001293058(同种型8)、NP_001293059(同种型9)、NP_001293060(同种型10)、NP_001293061(同种型11)、和NP_002017(同种型3)。

如本文所用，“与LTBR特异性结合”的抗体或结合分子是指以1×10^-7M或更小，优选地1×10^-8M或更小，更优选地5×10^-9M或更小、1×10^-9M或更小、5×10^-10M或更小、或者1×10^-10M或更小的KD与LTBR，优选地人LTBR结合的抗体或包含其抗原结合结构域的分子。术语“KD”是指从Kd对Ka的比(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)的解离常数。根据本公开，抗体的KD值可以使用本领域中的方法确定。例如，抗体的KD可通过使用表面等离振子共振，诸如通过使用生物传感器系统(例如

系统)，或者通过使用生物层干涉测量技术(诸如Octet RED96系统)来确定。在优选的实施方案中，本发明的多特异性结合分子中的对LTBR具有特异性的结合结构域包含针对LTBR的抗体，优选地针对LTBR的激动性抗体，或者其功能片段或衍生物，诸如scFv。如本文所用，“针对LTBR的激动性抗体”是与LTBR结合并且能够直接或在高阶聚类时，例如通过固定到固体支撑体、通过使用交联抗体等诱导下游信号传导的抗体。已经描述了此类针对LTBR的激动性抗体，并且非限制性示例为BHA10(例如，WO2004002431)、CBE11(例如，WO0230986)、REA412(可从Miltenyi Biotec商购获得)、31G4D8(可从BioLegend商购获得)以及71319/MAB629(可从Novus Biologicals商购获得)，或者可另选地根据用于抗体生成的已知方法诸如小鼠免疫、噬菌体展示等来生成。

如本文所用，“与EDB特异性结合”的抗原结合结构域或抗原结合片段是指以1×10^-7M或更小，优选地1×10^-8M或更小，更优选地5×10^-9M或更小、1×10^-9M或更小、5×10^-10M或更小、或者1×10^-10M或更小的KD结合EDB(优选地呈EDB纤连蛋白形式)的抗原结合结构域或抗原结合片段。

在优选的实施方案中，本发明的多特异性结合分子中的对EDB具有特异性的结合结构域包含针对EDB的抗体，或者其功能片段或衍生物，诸如scFv。已经描述了此类针对EDB的抗体，并且非限制性示例为L19(例如WO9745544)以及与ED-B或相邻结构域结合的其他抗体(例如，Carnemolla等人，Int.J.Cancer:68,397-405(1996))，或者可另选地根据用于抗体生成的已知方法诸如小鼠免疫、噬菌体展示等来生成。

抗体KD的值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。

根据本发明的具体方面，本文提供了多特异性结合分子。多特异性结合分子包含(i)第一结合结构域，该第一结合结构域与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合，和(ii)第二结合结构域，该第二结合结构域与EDB特异性结合，其中多特异性结合分子在结合EDB时激活LTBR。

在某些实施方案中，多特异性结合分子以肿瘤特异性方式激活LTBR。如本文所用，以肿瘤特异性方式激活LTBR意指在多特异性结合分子与LTBR和EDB(这两者都存在于肿瘤微环境中在细胞表面上或存在于细胞外基质中)同时结合时，LTBR被激活以经由经典和/或非经典NF-kB通路触发信号传导。NF-kB通路的激活可经由分泌促炎性趋化因子和细胞因子并在细胞表面上表达粘附分子导致促炎性肿瘤微环境的建立。多特异性结合分子的同时结合导致肿瘤中LTBR的激活。如果EDB不存在于正常组织，即正常细胞中，或者不存在于与正常组织相邻的细胞外基质中，则多特异性结合分子在正常组织上仅能结合LTBR，这将不导致正常组织中LTBR的激活。这是优于现有技术中描述的基于天然LTBR配体的分子的显著优势，该分子例如为LIGHT抗体融合体，其可不依赖于TAA激活LTBR，并且因此与本发明的分子相比，其对LTBR的激活具有低得多的肿瘤特异性，如本文实施例中所示。

在某些实施方案中，多特异性结合分子包含两个结合结构域，诸如例如双特异性抗体包含两个抗原结合结构域，一个与LTBR结合的抗原结合结构域以及另一个与EDB结合的抗原结合结构域。在优选的实施方案中，多特异性结合分子包含多于两个抗原结合结构域，例如一个与LTBR结合的抗原结合结构域以及两个与EDB结合的抗原结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合分子包含三个结合结构域。在某些实施方案中，三个结合结构域全部不同并且与三种不同的抗原结合。在某些优选的实施方案中，三个抗原结合结构域包括一个与第一抗原结合的结合结构域，以及两个与第二抗原结合的结合结构域。在该实施方案中，三个抗原结合结构域以2:1化学计量存在。三个抗原结合结构域可例如包括一个第一结合结构域，该第一结合结构域与表达LTBR的细胞上的LTBR特异性结合。三个抗原结合结构域可例如包括两个特异性结合EDB的第二结合结构域。在某些实施方案中，两个第二结合结构域对EDB具有相同的结合特异性，例如两个第二结合结构域可以是相同的。本文示出，具有多于一个特异于EDB的结合结构域的本发明多特异性结合分子具有优于仅具有一个特异于EDB的结合结构域的本发明多特异性结合分子的另外有利特性。在某些实施方案中，LTBR在LTBR与EDB结合时激活(该EDB是存在于肿瘤组织中的细胞外基质中的纤连蛋白的一部分)。

根据具体方面，本文提供了分离的抗淋巴毒素β受体(LTBR)双特异性抗体或其抗原结合片段。在某些非限制性实施方案中，与LTBR特异性结合的结合结构域包含激动性抗LTBR抗体或者其片段或衍生物，例如单链抗体片段(scFv)，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述VH和所述VL包含以下中的任一者：

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25。

在某些非限制性实施方案中，与EDB特异性结合的第二结合结构域包含与EDB结合的抗体或者此类抗体的片段或衍生物，例如包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其片段包含以下中的任一者：

在某些非限制性实施方案中，多特异性结合分子包含：

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25；以及

在某些非限制性实施方案中，多特异性结合分子包含：

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25；以及

(2)与EDB特异性结合的第二结合结构域，其包含L19抗体或者其片段或衍生物，例如包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其片段包含VH，其包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；以及VL，其包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；诸如其中VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少97％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列；VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

在某些非限制性实施方案中，多特异性分子包含：

(1)与包含SEQ ID NO:22的LTBR特异性结合的结合结构域；以及

在某些非限制性实施方案中，多特异性分子包含：

(1)与包含SEQ ID NO:23的LTBR特异性结合的结合结构域；以及

在某些非限制性实施方案中，多特异性分子包含：

(1)与包含SEQ ID NO:25的LTBR特异性结合的结合结构域；以及

在一些实施方案中，多特异性(例如双特异性)分子在存在EDB的情况下诱导NF-κB信号传导，该NF-κB信号传导是在不存在EDB的情况下(在相同条件下)诱导的NF-κB信号传导的至少2倍，诸如至少3倍，例如至少4倍。有时，测定是NF-κB荧光素酶报告基因测定。NF-κB荧光素酶报告基因测定可使用实施例2的方案进行。

在一些实施方案中，多特异性(例如双特异性)分子在存在EDB的情况下诱导细胞的表面的ICAM-1表达，该ICAM-1表达是在不存在EDB的情况下(在相同条件下)诱导的ICAM-1表达的至少2倍，诸如至少3倍，例如至少4倍。有时，测定是体外LTBR激活测定，诸如A375/WI38A亚系2RA共培养细胞测定。A375/WI38A亚系2RA共培养细胞测定可使用实施例3的方案进行。

根据具体方面，重链和轻链是人源化的。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包括经由受控Fab臂交换获得的双体抗体、交叉体、scFv、Duobody、spFv或双特异性抗体，如本发明所述的那些。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括具有互补CH3结构域以强制发生异源二聚化的IgG样分子；重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段的一部分或Fab片段；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白质或载剂分子融合。

在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、杵臼结构(Knobs-into-Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对体(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)或DuoBody(Genmab A/S)。

在一些实施方案中，重组IgG样双靶向分子包括双靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)或CovX体(CovX/Pfizer)。

在一些实施方案中，IgG融合分子包括双可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样双特异性抗体(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)或TvAb(Roche)。

在一些实施方案中，Fc融合分子可包括ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、双亲和性重靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)或双(ScFv)₂-Fab(National Research Center for AntibodyMedicine--China)。

在一些实施方案中，Fab融合双特异性抗体包括F(ab)₂(Medarex/AMGEN)、双功能或双-Fab(Dual-Action or Bis-Fab)(Genentech)、对接和锁定(Dock-and-Lock)(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性抗体(Biotecnol)或Fab-Fv(UCB-Celltech)。基于ScFv的抗体、基于双体抗体的抗体和结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞衔接器(BiTE)(Micromet)、串联双体抗体(Tandab)(Affimed)、双亲和性重靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双体抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT,ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack)或COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向纳米抗体(Ablynx)、仅双靶向重链结构域抗体。

本发明的全长双特异性抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式生成：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以对Fab臂的CH3结构域进行工程改造，以促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位，即LTBR上的表位和纤连蛋白的EDB上的表位。

如本文所用，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。

如本文所用，“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。

“杵臼结构”策略(参见例如，PCT公布WO2006/028936)可用于生成全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3结构域的交界的选定氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(臼)的氨基酸引入特异性结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(杵)的氨基酸引入特异性结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“臼”的重链与具有“杵”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成杵和臼的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置，使用Kabat编号)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S或T366W/T366S_L368A_Y407V。

还可使用其他策略，诸如通过在一个CH3表面处置换带正电荷的残基并在第二CH3表面处置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如例如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637；或美国专利公布US2011/0123532中所述的。在其他策略中，可通过以下置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，例如如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所述的。

除上述方法之外，本发明的双特异性抗体还可在体外无细胞环境中通过下列方式生成：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入非对称突变，并且在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而根据国际专利公布WO2011/131746中所述的方法允许二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换生成双特异性抗体。温育条件可以任选地恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选地为选自由2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦组成的组的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或在至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5至8的pH下，例如在7.0的pH下或在7.4的pH下，在至少20℃的温度下，温育至少90分钟。

在本文所述的一些实施方案中，本发明的多特异性结合分子诸如双特异性抗体的免疫效应子特性可例如通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到修饰，优选地沉默。例如，Fc效应子功能诸如Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制，参见例如N297突变(Nose等人，PNAS(1983))；LALA突变(Xu等人，Cell Immunol.200(1):16-26)(2000))；和DANA突变(Wilson等人，Cancer Cell 19(1):101-113(2011))；或例如在位置265处的天冬氨酸(D)、在位置297处的天冬酰胺(N)和在位置329处的脯氨酸(P)的突变，其中编号由如Kabat中的EU索引表示，例如，各自突变为丙氨酸(A)以获得所谓的DANAPA突变体，如WO2019/068632中所详细描述的。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，在该反应中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后致使靶细胞裂解。

在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括嵌合的双特异性抗体。

在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括人或人源化的双特异性抗体。

在另一个一般方面，本发明涉及编码本发明的多特异性结合分子(例如双特异性抗体或其抗原结合片段)的一种或多种核酸。作为非限制性示例，双特异性抗体的重链可由一种核酸编码，并且轻链可由第二核酸编码。在另一个示例中，双特异性抗体的重链和轻链可以在单个核酸分子上编码。本领域的技术人员将理解，根据遗传密码的简并性，可改变(例如置换、缺失、插入等)蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可变更编码本发明的单克隆抗体和/或双特异性抗体的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。另外，本发明的一种或多种核酸还可以为分离的核酸。因此，本发明涉及编码本发明的分子的任何核酸分子或核酸分子的组合。

在另一个一般方面，本发明涉及一种或多种载体，该一种或多种载体包含本发明的一种或多种核酸。根据本公开，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标志物和/或复制起点。启动子可为组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够向细胞递送核酸的多种表达载体在本领域中是已知的，并且在本文可用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可用于根据本发明的实施方案生成重组表达载体。根据本公开，此类技术是本领域技术人员所熟知的。

在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，该宿主细胞包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含编码本发明的多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)的一种或多种核酸。根据本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体实施方案，通过常规方法诸如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其中可将该重组表达载体稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸有效表达。

在另一个一般方面，本发明涉及一种制备本文所公开的多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)的方法。该方法包括在制备本文所公开的多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)的条件下培养包含编码多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)的核酸的细胞，以及从该细胞或细胞培养物(例如，从上清液)回收多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)。表达的多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)可从细胞收获并且根据本领域已知以及如本文所述的常规技术进行纯化。

药物组合物

在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的多特异性结合分子(例如双特异性抗体或其抗原结合片段)以及药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药物组合物”意指包含本发明的多特异性结合分子连同药学上可接受的载剂的产品。本发明的多特异性结合分子(例如双特异性抗体)和包含它们的组合物也可用于制造本文提及的治疗应用的药物。

如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其他材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。鉴于本公开，根据具体实施方案，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载剂均可用于本文。

药物活性成分与药学上可接受的载剂的制剂为本领域中已知的，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如第21版(2005)以及任何后续版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载剂可用于配制本发明的药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物为液体制剂。液体制剂的一个优选示例为水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％w/w、70％w/w、75％w/w、80％w/w、85％w/w、90％w/w或至少95％w/w的水。

在一个实施方案中，药物组合物可被配制为可例如经由注射装置(例如，注射器或输液泵)注射的注射剂。注射可以例如皮下、肌内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送。

在另一个实施方案中，药物组合物为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可按原样使用，或在使用前由医师或患者添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，诸如压片和/或包衣片，以及胶囊剂(例如硬明胶胶囊或软明胶胶囊)。药物组合物也可为例如用于重构的小药囊、糖衣丸、粉末、颗粒剂、锭剂或粉末的形式。

剂型可以是速释型，在这种情况下它们可包含水溶性或水分散性载剂，或者它们可被延迟释放、缓释或改变释放，在这种情况下它们可包含在胃肠道中或在皮下调节剂型的溶解速率的水不溶性聚合物。

在其他实施方案中，药物组合物可以鼻内、颊内或舌下递送。

水性制剂中的pH可介于pH 3和pH 10之间。在本发明的一个实施方案中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约3.0至约7.0。

在某些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性示例包括：精氨酸、天冬氨酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸盐、酒石酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸或三(羟甲基)-氨基甲烷、以及它们的混合物。缓冲剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。

在某些实施方案中，药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性示例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苄醇、溴代硝基丙二醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己啶、氯苯甘油醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞以及它们的混合物。防腐剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。

在某些实施方案中，药物组合物包含等渗剂。等渗剂的非限制性示例包括盐(诸如氯化钠)、氨基酸(诸如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸或苏氨酸)、糖醛(诸如甘油、1,2-丙二醇(propanediol/propyleneglycol)、1,3-丙二醇或1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)以及它们的混合物。等渗剂的另一个示例包括糖。糖的非限制性示例可包括单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉或羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个示例是糖醇，其中术语“糖醇”被定义为具有至少一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性示例包括甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇或阿拉伯糖醇。等渗剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。

在某些实施方案中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性示例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的盐、以及它们的混合物。螯合剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。

在某些实施方案中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性示例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。

在某些实施方案中，药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂为羧基/羟基纤维素及其衍生物(诸如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲硫基乙醇、聚乙二醇(诸如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐(诸如氯化钠)、含硫的物质(诸如单硫代甘油)或巯基乙酸。稳定剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。

在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂。术语“表面活性剂”是指任何由水溶性部分(亲水性)和脂溶性和部分(亲脂性)组成的分子或离子。例如，表面活性剂可选自由阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂组成的组。表面活性剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。

在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，诸如例如EDTA和/或苯甲脒盐酸盐(HCl)。蛋白酶抑制剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。

在另一个一般方面，本发明涉及一种制备包含本发明的多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)的药物组合物的方法，该方法包括将多特异性结合分子(诸如双特异性抗体或其抗原结合片段)与药学上可接受的载剂组合，以获得药物组合物。

使用方法

在另一个一般方面，本发明涉及一种靶向存在于肿瘤中的细胞(例如，肿瘤细胞、成纤维细胞、单核细胞等)上的LTBR的方法，该方法包括将存在于肿瘤中的细胞暴露于本发明的多特异性结合分子或药物组合物。

结合LTBR和/或EDB的多特异性结合分子(例如，双特异性抗体及其抗原结合片段)的功能活性可以通过本领域已知的和如本文所述的方法来表征。用于表征结合LTBR和/或EDB的多特异性结合分子的方法包括但不限于亲和力和特异性测定，包括Biacore、ELISA和/或OctetRed分析；结合测定，以通过FACS来检测多特异性结合分子与癌细胞和其他细胞类型上的LTBR的结合。根据具体实施方案，用于表征结合LTBR和/或EDB的多特异性结合分子的方法包括以下所述的那些。

在另一个一般方面，本发明涉及一种建立促炎性肿瘤微环境的方法。该方法包括使肿瘤微环境中的表达LTBR的细胞与本发明的多特异性结合分子接触，其中使表达LTBR的细胞与多特异性结合分子接触导致促炎性趋化因子和细胞因子的分泌以及粘附分子在细胞表面上的表达。

在另一个一般方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用特异性结合LTBR和纤连蛋白的EDB的本发明的多特异性结合分子(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)或本文所公开的药物组合物。癌症优选地是表达EDB的癌症。癌症可以是例如表达LTBR的癌症。癌症可以例如选自由前列腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤、以及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓细胞性白血病(AML)和其他液体肿瘤组成的组。

根据本发明的实施方案，药物组合物包含有效量的抗LTBR多特异性结合分子(例如，抗LTBR/抗EDB双特异性抗体或其抗原结合片段)。如本文所用，术语“有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。

根据具体实施方案，有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者或更多者的治疗量：(i)减小或改善所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状消退；(v)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

在一些实施方案中，本发明的多特异性结合分子的有效量可以以在约0.1mg/kg至约25mg/kg、约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.1mg/kg至约15mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约5mg/kg范围内的剂量施用。

有效量或剂量可根据各种因素，诸如所治疗疾病、障碍或病症、施用方式、目标位点、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受试者是人还是动物、施用的其他药物，并且不论治疗是预防性的还是治疗性的。任选地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物可通过多种途径施用于受试者，诸如局部、口服或肠胃外。肠胃外递送的方法包括动脉内(直接到组织)、髓内、鞘内、心室内、腹膜内或鼻内施用。

如本文所用，术语“处理”和“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)均旨在是指与癌症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选地癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。

根据具体实施方案，提供了用于治疗癌症的组合物。对于癌症治疗，组合物可与另一种治疗联合使用，包括但不限于化学疗法、抗CD20mAb、抗TIM-3mAb、抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、PD-1/PD-L1疗法、吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO)、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD40抗体、抗CD38抗体、细胞因子、溶瘤病毒、TLR激动剂、STING激动剂、其他免疫肿瘤学药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体-药物缀合物(ADC)、靶向疗法或其他抗癌药物。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

实施方案

本发明提供了以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含：

(i)第一结合结构域，所述第一结合结构域与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合，和

(ii)第二结合结构域，所述第二结合结构域与纤连蛋白的额外结构域B(EDB)特异性结合，

其中所述多特异性结合分子在结合所述EDB时激活LTBR。

实施方案2是根据实施方案1所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子以肿瘤特异性方式激活LTBR。

实施方案3是根据实施方案1或2所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子是双特异性抗体。

实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子包含两个抗原结合结构域。

实施方案5是根据实施方案1至3中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子包含三个抗原结合结构域。

实施方案6是根据实施方案5所述的多特异性结合分子，其中所述三个抗原结合结构域包括一个与LTBR特异性结合的结合结构域。

实施方案7是根据实施方案5或6所述的多特异性结合分子，其中所述三个抗原结合结构域包括两个特异性结合EDB的结合结构域。

实施方案8是根据实施方案5至7中任一项所述的多特异性结合分子，其中与LTBR特异性结合的所述结合结构域包括抗体的单链可变结构域。

实施方案9是根据实施方案1至8中任一项所述的多特异性结合分子，其中与LTBR特异性结合的所述第一结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述VH和所述VL包含以下[(i)至(viii)]中的任一者或多者：

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25。

实施方案10是根据实施方案1至9中任一项所述的多特异性结合分子，其中与EDB特异性结合的所述第二结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述VH和所述VL包含以下[(i)至(ii)]中的任一者或多者：

实施方案11是根据实施方案1至10中任一项所述的多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含[(a)至(l)]中的任一者或多者：

(a)(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一重链，所述第一重链与包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的第一轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二重链，所述第二重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第二轻链形成结合结构域；或者

(b)(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一重链，所述第一重链与包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的第一轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二重链，所述第二重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第二轻链形成结合结构域。

实施方案12是根据实施方案1至10中任一项所述的多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含以下中的任一者：

(c)(i)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(d)(i)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(e)(i)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(f)(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(g)(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(h)(i)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(j)(i)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(k)(i)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(l)(i)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域。

实施方案13是根据实施方案1至10中任一项所述的多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含(i)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域。

实施方案14是一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子编码根据实施方案1至13中任一项所述的多特异性结合分子。

实施方案15是一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据实施方案14所述的一种或多种核酸分子。

实施方案16是一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据实施方案15所述的一种或多种载体。

实施方案17是一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至13中任一项所述的多特异性结合分子以及药学上可接受的载剂。

实施方案18是一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1至14中任一项所述的多特异性结合分子、根据实施方案15所述的一种或多种核酸分子、根据实施方案16所述的一种或多种载体或根据实施方案17所述的药物组合物。

实施方案19是根据实施方案1至14中任一项所述的多特异性结合分子、根据实施方案15所述的一种或多种核酸分子、根据实施方案16所述的一种或多种载体或根据实施方案17所述的药物组合物用于激活肿瘤组织中的LTBR的用途。

实施方案20是一种制备根据实施方案1至13中任一项所述的多特异性结合分子的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达根据实施方案14所述的一种或多种核酸分子或根据实施方案15所述的一种或多种载体，以及收获所述多特异性结合分子。

实施方案21是根据实施方案1-10中任一项所述的多特异性分子，所述多特异性分子在存在EDB的情况下诱导NF-κB信号传导，所述NF-κB信号传导是在不存在EDB的情况下诱导的NF-κB信号传导的至少2倍，诸如至少3倍，例如至少4倍。

实施方案22是根据实施方案1-10或21中任一项所述的多特异性分子，所述多特异性分子在存在EDB的情况下诱导细胞的表面的ICAM-1表达，所述ICAM-1表达是在不存在EDB的情况下诱导的ICAM-1表达的至少2倍，诸如至少3倍，例如至少4倍。

实施例

实施例1：EDB/LTBR双特异性抗体和对照分子的生成

来源于表1中所示的靶结合序列的双特异性抗体和对照分子在无血清/无动物组分培养基中的CHO悬浮培养物中瞬时表达，并且使用

Pure仪器(GE Healthcare)在Superdex 200 10/300GL柱(GE Healthcare)上通过蛋白质A亲和力色谱法，然后是制备型尺寸排阻色谱法(SEC)来纯化。重链含有杵臼结构(KiH)突变以促进异源二聚化(Ridgway等人，Protein Eng.9(7):617-21(1996)；Atwell等人，J.Mol.Biol.270(1):26-35(1997)；Merchant等人，Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998))。抗体含有IgG1σFc，其包含一组七个Fc突变(L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S和P331S)，当与野生型IgG1相比时，以减少Fc受体相互作用(Tam等人，Antibodies(2017))。

生成具有IgG1σ突变而不具有KiH突变的对称性单特异性和双特异性抗体。

表1：用于实施例1的构建体的靶结合序列。

*：在此使用的EDBmAb1(WO9745544)是已在临床中测试的抗ED-B抗体，先前已经描述了与ED-B或相邻结构域结合的其他抗体(Carnemolla等人，Int.J.Cancer:68,397-405(1996))

通过在280nm(OD280)下的吸光度测量来确定蛋白质浓度并确定纯化收率。使用Bio SEC-5柱(Agilent，5μm粒度，

)在Thermo Vanquish HPLC系统上进行分析性SEC。将10μl纯化的蛋白质装载到柱上，并且通过OD280记录洗脱。

表2示出了该实施例中描述的双特异性抗体和对照分子的结构特性的概述。粗体形式的分子是根据本发明的分子，而其他分子是不同方面的对照。

表3示出了另一种比较双特异性抗体的结构特性，其靶向LTBR和间皮素(不存在于细胞外基质中的肿瘤相关抗原)，如比较例4中所述的。

下文描述了不同构建体是如何生成的。

非对称性抗体，具有1:1化学计量(全部为IgG1σ；全部具有杵臼结构(KiH)突变)：

i.COVA14121通过下列的共表达生成：激动性LTBR抗体LTBRmAb1的重链(HC；SEQID NO:1)和轻链(LC；SEQ ID NO:2)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO.5)(图1L)。

ii.COVA14120通过下列的共表达生成：激动性LTBR抗体LTBRmAb1的重链(HC；SEQID NO:1)和轻链(LC；SEQ ID NO:2)与抗RSV抗体B21M的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO.8)(图1K)。

iii.COVA14122通过下列的共表达生成：激动性LTBR抗体LTBRmAb2的重链(HC；SEQID NO:9)和轻链(LC；SEQ ID NO:10)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO.5)(图1M)。

iv.COVA14123通过下列的共表达生成：激动性LTBR抗体LTBRmAb2的重链(HC；SEQID NO:9)和轻链(LC；SEQ ID NO:10)与抗RSV抗体B21M的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO.8)(图1N)。

v.COVA14124通过下列的共表达生成：抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO.5)与抗RSV抗体B21M的重链(HC；SEQ ID NO:6)和轻链(LC；SEQ IDNO.8)(图1O)。

vi.COVA1454通过下列的共表达生成：3xhmLIGHT-Fc(SEQ ID NO:15)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO.5)(图1F)。3xhmLIGHT-Fc是被工程化以获得更好稳定性以及人和小鼠交叉反应性的单链三聚体LIGHT(Tang等人，CancerCell 29:285-96(2016))，其与IgG1σFc的N端融合。

vii.COVA1418通过下列的共表达生成：3xhmLIGHT-Fc(SEQ ID NO:15)与抗RSV抗体B21M的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO.8)(图1E)。3xhmLIGHT-Fc是被工程化以获得更好稳定性以及人和小鼠交叉反应性的单链三聚体LIGHT(Tang等人，CancerCell 29:285-96(2016))，其与IgG1σFc(SEQ ID NO:58)的N端融合。

对称性抗体(全部为IgG1σ，无KiH突变)：

viii.COVA14114通过下列的表达生成：携带C端LTα1β2融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:18)与抗RSV B21M抗体的轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1G)。

ix.COVA14113通过下列的表达生成：携带C端LTα1β2融合体的EDBmAb1重链(SEQID NO:20)与抗EDB抗体EDBmAb1的轻链(LC；SEQ ID NO.5)(图1H)。

x.COVA1413通过下列的共表达生成：激动性LTBR抗体LTBRmAb1的重链(HC；SEQ IDNO:11)和轻链(LC；SEQ ID NO:2)(图1B)。

xi.COVA1402通过下列的共表达生成：激动性LTBR抗体LTBRmAb2的重链(HC；SEQID NO:13)和轻链(LC；SEQ ID NO:10)(图1A)。

xii.COVA1440通过下列的共表达生成：抗RSV抗体B21M的重链(HC；SEQ ID NO:14)和轻链(LC；SEQ ID NO.8)(图1C)。

xiii.COVA1452通过下列的共表达生成：抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ IDNO:12)和轻链(LC；SEQ ID NO.5)(图1D)。

非对称性抗体，具有2:1化学计量(全部为IgG1σ，全部具有KiH突变)

xiv.COVA14116通过下列的共表达生成：携带C端LTα1β2融合体的EDBmAb1重链(SEQ ID NO:21，包含SEQ ID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO.5)(图1I)。

xv.COVA14117通过下列的共表达生成：携带C端LTα1β2融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:19，包含SEQ ID NO:85)与抗RSV B21M抗体的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1J)。

xvi.COVA1484通过下列的共表达生成：携带N端装订的scFv BHA10(VH-VL取向SEQID NO:22)融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:26，包含SEQ ID NO:85)与抗RSVB21M抗体的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1P)。

xvii.COVA1485通过下列的共表达生成：携带N端装订的scFv BHA10(VL-VH取向SEQ ID NO:23)融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:27，包含SEQ ID NO:85)与抗RSVB21M抗体的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1Q)。

xviii.COVA1486通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:22)融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:28，包含SEQ ID NO:85)与抗RSVB21M抗体的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1R)。

xix.COVA1487通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VL-VH取向SEQID NO:23)融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:29，包含SEQ ID NO:85)与抗RSVB21M抗体的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1S)。

xx.COVA1480通过下列的共表达生成：携带N端装订的scFv BHA10(VH-VL取向SEQID NO:22)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:30，包含SEQ ID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1T)。

xxi.COVA1481通过下列的共表达生成：携带N端装订的scFv BHA10(VL-VH取向SEQID NO:23)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:31，包含SEQ ID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1U)。

xxii.COVA1482通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:22)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:32，包含SEQ ID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1V)。

xxiii.COVA1483通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VL-VH取向SEQ ID NO:23)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:33，包含SEQ ID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1W)。

xxiv.COVA14107通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向，VL3 Y36F_S49Y_F87Y SEQ ID NO:53)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:34，包含SEQ ID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1X)。

xxv.COVA14108通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向，VH_CDR1_Y33A SEQ ID NO:54)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:35，包含SEQID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1Y)。

xxvi.COVA14133通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:22)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:38，包含SEQ ID NO:3)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1Z)。

xxvii.COVA14136通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:22)融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:41，包含SEQ ID NO:6)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1A1)。

xxviii.COVA14174通过下列的共表达生成：携带C端二硫键稳定的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:25)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:39，包含SEQ IDNO:3)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1A2)。

xxix.COVA14175通过下列的共表达生成：携带C端二硫键稳定的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:25)融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:40，包含SEQ ID NO:6)与抗RSV B21M抗体的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1A3)。

xxx.COVA1456通过下列的共表达生成：携带C端二硫键稳定的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:25)融合体的抗EDB抗体EDBmAb1重链(SEQ ID NO:56，包含SEQ ID NO:84)与抗EDB抗体EDBmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:4)和轻链(LC；SEQ ID NO:5)(图1A4)。

xxxi.COVA1462通过下列的共表达生成：携带C端二硫键稳定的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:25)融合体的抗RSV B21M抗体重链(SEQ ID NO:57，包含SEQ ID NO:85)与抗RSV B21M抗体的重链(HC；SEQ ID NO:7)和轻链(LC；SEQ ID NO:8)(图1A5)。

间皮素/LTBR双特异性：非对称性抗体，具有2:1化学计量(IgG1σ，具有KiH突变)

xxxii.COVA14146通过下列的共表达生成：携带C端装订的scFv BHA10(VH-VL取向SEQ ID NO:22)融合体的抗间皮素抗体MSLNmAb1重链(SEQ ID NO:80，包含SEQ ID NO:86)与抗间皮素抗体MSLNmAb1的重链(HC；SEQ ID NO:81)和轻链(LC；SEQ ID NO:82)(图1A6和表3)。

结果

上文所述的所有构建体均可被表达和纯化，然而令人惊讶地是，含有LIGHT和LTα1β2的构建体(COVA1418、COVA1454、COVA14113、COVA14114、COVA14116和COVA14117；表2)示出与含有来源于激动性抗LTBR抗体的装订的scFv的EDB/LTBR双特异性抗体(例如COVA1482和COVA14133；参见表4)相比，纯化收率降低最多至10倍。此外，含有LIGHT的构建体(例如COVA1454)示出具有降低的单体含量的趋势，如可从图2和表4中所示的尺寸排阻色谱图中看到的。综上所述，这些事实(纯化收率高最多至10倍和更高的单体含量)指示本发明的双特异性构建体可能具有比包含LIGHT或LTα1β2-Fc融合体的构建体更好的生物物理特性。

表4：所选EBD/LTBR双特异性抗体的收率和纯度

实施例2：EDB依赖性体外LTBR激活–NF-κB荧光素酶报告基因测定

为了示出EDB/LTBR双特异性抗体能够以EDB依赖性方式激活LTBR，在存在或不存在含EDB的纤连蛋白(EDB+纤连蛋白)的情况下，在A549细胞NF-κB荧光素酶报告基因测定中测试化合物的活性。NF-κB信号传导在调节细胞发育和免疫稳态中起关键作用。通过肿瘤坏死因子受体(TNFR)或TNFR超家族成员(例如，LTBR)激活NF-κB在与它们各自的配体接合时发生。A549肺上皮细胞系天然表达LTBR，并且NF-κB荧光素酶报告基因构建体稳定地整合到A549肺上皮细胞系的基因组中。在通过兴奋剂激活之后，内源性NF-κB转录因子与DNA反应元件结合以诱导荧光素酶基因的转录。

为展示出LTBR的EDB依赖性激活，高结合性96孔μClear平底板(Greiner；Monroe，NC)用150ng/孔人重组EDB+纤连蛋白结构域7-B-8-9(EDB+；SEQ ID NO:51)或150ng/孔人重组纤连蛋白结构域7-8-9(EDB-；SEQ ID NO:52)涂覆过夜。

在温育过夜后，将涂覆的板用PBS洗涤，并在37℃下用测定培养基(DMEM+10％热灭活的FBS)封闭2小时。在测定培养基中制备待测试化合物的1:5稀释系列作为2倍浓度原液(测试的最终浓度范围为200nM至2.6pM)。在通过抽吸去除封闭溶液之后，将50μl稀释的化合物添加到预封闭板中。将50μl A549细胞悬浮液(细胞悬浮液浓度＝0.4Mio细胞/ml测定培养基)添加到每个孔(20,000个细胞/孔)中。A549细胞先前通过使用Accutase/EDTA从细胞培养瓶中分离，并且然后转移到测定培养基中。在37℃/5％CO₂下，将细胞与化合物一起温育18-20小时。

在温育18小时之后，使用Bio-Glo^TM荧光素酶测定系统(Promega；Madison,WI)检测荧光素酶活性。使用Tecan M1000 Pro仪器测量发光，其中整合时间为500毫秒。由所得的相对光单位(RLU)，如下计算LTBR信号传导的诱导倍数：诱导倍数＝RLU_{受刺激的细胞}/平均RLU_{未受刺激的细胞}(未受刺激的细胞作为每个测试板中的对照被包括)。

使用GraphPad Prism绘制剂量反应曲线，包括标准偏差，并且应用非线性拟合(log(激动剂)对反应(可变斜率-三个参数))，如果适用的话。为了拟合数据，使用GraphPadPrism的X＝Log(x)函数转换x值(化合物的浓度)。

结果

抗体-LIGHT融合体

类似于Tang等人公布的工作(Tang等人，Cancer Cell 29:285-96(2016)，其中描述了双特异性分子抗EGFR-LIGHT融合体具有抗肿瘤活性)，在存在或不存在含EDB的纤连蛋白的情况下，在A549细胞NF-κB荧光素酶报告基因测定中设计、表达和测试COVA1454，由一个EDB结合臂和一个LIGHT三聚体-Fc融合体组成的双特异性分子(图1F和表2)。将COVA1454的活性与可溶性重组人LIGHT(目录号664-LI-025/CF；R&D Systems；Minneapolis,MN)和非靶向LIGHT(COVA1418；图1E和表2)进行比较。图3A示出，在存在含EDB的纤连蛋白的情况下，COVA1454仅比非靶向LIGHT(COVA1418)或可溶性重组人LIGHT略微更多地激活LTBR。有趣的是，图3B示出，在不存在含EDB的纤连蛋白的情况下，COVA1454、COVA1418和可溶性重组LIGHT激活LTBR与在存在EDB(图3A)的情况下具有相同的程度和相似的程度。这些发现连同正常组织中LTBR的广泛表达一起(Lukashev等人，Cancer Res.,66(19):9617-24(2006))，指示抗体LIGHT融合体不适用于实现LTBR的肿瘤特异性激活。实际上，正常组织中LTBR的激活可能导致不可取的肿瘤外毒性。

抗体-LTα1β2融合体

随后，生成LTα1β2抗体融合体(图1G至图1J和表2)，其包含与抗EDB抗体EDBmAb1融合的1个或2个LTα1β2部分，并在报告基因测定中进行测试。

这些构建体以类似于Gurney等人的工作进行设计，Gurney等人报告了双特异性融合构建体的体外和体内研究，该构建体由与B7-H4特异性肿瘤靶向抗体融合的异源三聚体单链LTα1β2部分组成(WO2018/119118)。重要的是，与先前部分中使用的LIGHT不同，LTα1β2融合构建体是LTBR的特异性激动剂，并且不激活HVEM。

图3C和图3D示出了用以下获得的结果：COVA14113，其是2个LTα1β2与EDBmAb1抗体的融合体(图1H和表2)；COVA14116，其是1个LTα1β2与EDBmAb1抗体的融合体(图1I和表2)，将其与下列进行比较：用作非靶向LTα1β2对照的COVA14114，其是2个LTα1β2与同种型对照抗体B21M的融合体(图1G和表2)；可溶性重组人LIGHT；以及可溶性LTα1β2(重组人淋巴毒素α1β2；目录号8884-LY/CF；R&D Systems)。在存在EDB的情况下(图3C)，COVA14113和COVA14116两者实现了比可溶性天然配体LIGHT和LTα1β2更有效的对LTBR的激活，然而，非靶向LTα1β2对照COVA14114示出与COVA14113和COVA14116相当的激活水平。在不存在EDB的情况下(图3D)，COVA14113和COVA14114(携带两个LTα1β2部分)的活性不变，然而COVA14116(携带一个LTα1β2部分)的活性降低至略低于由可溶性LTα1β2实现的激活的水平。这些数据示出，LTBR的肿瘤抗原依赖性激活非常难以用此类抗体-LTα1β2构建体实现。实际上，由于LTBR在正常组织中的广泛表达，因此在不存在含EDB的纤连蛋白的情况下(图3D)实现的激活水平可能是有问题的(Lukashev等人，Cancer Res.,66(19):9617-24(2006)。

基于激动性抗LTBR抗体的双特异性抗体

为了实现LTBR的肿瘤抗原依赖性激活，我们着手生成双特异性抗体(1:1异源二聚体；Fc区中包括KiH突变以促进正确配对)，其由抗EDB抗体EDBmAb1和抗LTBR激动性抗体LTBRmAb1和LTBRmAb2组成(图1K至图1M)，目的在于仅在与肿瘤抗原结合时激活LTBR(肿瘤抗原是纤连蛋白的EDB，其是存在于细胞外基质中的肿瘤抗原)。还生成了对应对照抗体，其由与LTBRmAb1和LTBRmAb2配对的同种型对照抗体B21M组成(图1N至图1O)。

图4A和图4C示出了COVA14121(1:1异源二聚体EDBmAb1和LTBRmAb1；图1L和表2)和COVA14122(1:1异源二聚体EDBmAb1和LTBRmAb2；图1M和表2)能够以EDB依赖性方式激活LTBR。与先前描述的分子相反，并且在上述实施例中，如图4B和图4D所示，在不存在EDB的情况下，COVA14121和COVA14122仅展示出最小的LTBR激活。这种残余活性可能是由于纯化材料中的残余杂质。表5示出了用异源二聚体COVA14121和COVA14122或用LIGHT抗体融合体(COVA1454)或LTα1β2抗体融合体(COVA14113和COVA14116)获得的(在存在或不存在含ED-B的纤连蛋白的情况下NF-kB信号传导的)最大诱导倍数的比较结果。该比较结果清楚地示出，使用激动性抗体使LTBR双特异性分子更具特异性。实际上，对于COVA14121和COVA14122而言，在存在ED-B的情况下实现的最大诱导倍数与在不存在ED-B的情况下实现的最大诱导倍数之间的比率在介于4.4与5.4之间的范围内，然而对于配体-抗体融合体而言，其在介于1.1与1.6之间的范围内，从而展示出与本发明的双特异性抗体相比，这些配体-抗体融合体不实现特异性TAA依赖性LTBR激活。

表5：在存在或不存在ED-B的情况下NF-kB信号传导的最大诱导倍数

综上所述，这些结果表明，使用基于激动性LTBR抗体的双特异性抗体，有可能以肿瘤依赖性方式激活LTBR，其中在不存在肿瘤抗原的情况下具有最小激活至无激活。在此类双特异性分子中，LTBR结合抗体仅在与肿瘤抗原(在这种情况下为含EDB的纤连蛋白)结合时激活LTBR。

为进一步增强肿瘤抗原依赖性LTBR激活，设计了具有针对EDB的2个结合位点(以增加抗原介导的聚类)或2个非特异性结合位点，以及对LTBR的1个结合位点的2:1双特异性形式(参见图1P至图1W和图1A2至图1A5)。对于LTBR结合位点，使用scFv片段。由于scFv片段可能具有稳定性问题，因此使用2种不同的方法来稳定它们，来源于LTBRmAb1的scFv片段使用介于VH与VL之间的附加二硫键(Reiter等人，Nat Biotechnol.14(10):1239-45(1996))，或使用装订的scFv平台(VH-VL；VL-VH)来稳定，并且经由(G₄S)₃连接子与EDBmAb1或B21M(同种型对照抗体)融合。

图5A展示出COVA1456(图1A4和表2)，2:1双特异性EDB/LTBR抗体有效激活LTBR，然而对照双特异性抗体COVA1462(图1A5和表2)不能激活LTBR。这指示经由与TAA(在这种情况下，固定的含EDB的纤连蛋白)结合进行聚类是由2:1双特异性抗体COVA1456进行有效LTBR激活的先决条件。如果不存在含EDB的纤连蛋白，则COVA1456不能激活LTBR(图5B)，这支持了以下事实：EDB存在对于LTBR激活是必不可少的，并且LTBR的肿瘤特异性激活由靶向细胞外基质中的LTBR和EDB的双特异性抗体来实现。

为了展示出以TAA依赖性方式激活LTBR的能力不是用于构建COVA1456的来源于LTBRmAb1的二硫键稳定的scFv的固有性质，将COVA1456与COVA1482在相同的A549 NF-kB报告基因测定中进行比较。COVA1482与COVA1456的不同之处仅在用于scFv的稳定方法方面。使用装订的平台稳定COVA1482中的scFv，其也来源于LTBRmAb1。图5C示出了COVA1482和COVA1456两者以EDB依赖性方式有效激活LTBR。对应的同种型对照COVA1486和COVA1462不激活LTBR(图5C)。这些结果表明，用于稳定scFv片段的方法不影响双特异性抗体以TAA依赖性方式激活LTBR的能力。令人惊讶的是，2:1双特异性EDB/LTBR抗体(COVA1482或COVA1456)在这种报告基因测定中示出诱导NF-kB信号传导的效力增加。在具有相同实验设置的若干测定中计算的COVA1482的平均EC₅₀为约30pM±10pM，然而在图4A中示出的测定中，COVA14121(1:1异源二聚体)示出EC₅₀为约3nM，从而指示2:1双特异性抗体可比1:1双特异性抗体更有效100倍。这可通过利用对TAA的2个结合位点实现的LTBR结合位点的聚类增加来解释。

为了研究对LTBR的亲和力对此类双特异性抗体TAA依赖性激活LTBR的能力的影响，生成来源于LTBRmAb1的scFv片段的较低亲和力变体(SEQ ID NO:53,KD≈60nM和SEQ IDNO:54,KD≈600nM)，并用于构建2:1双特异性抗体(COVA14107，图1X和表2；以及COVA14108，图1Y和表2)。在A549 NF-kB报告基因测定中测试双特异性抗体，以观察亲和力对LTBR激活的影响。图5D示出了在该测定中，对LTBR的较低亲和力对应于双特异性抗体以TAA依赖性方式激活LTBR的较低能力。

如实施例1中所述，在一些构建体的Fc中引入突变(WO2010151792)以消除与蛋白质A的结合(用于抗体的纯化)，以便促进期望的异源二聚体的纯化。在没有这些突变的情况下生成COVA14133，并将其活性与COVA1482进行比较，以示出Fc区中的突变不影响双特异性抗体的活性。在A549 NF-kB报告基因测定中比较了COVA14133和COVA1482及其相应同种型对照COVA14136和COVA1486。图5E示出了COVA14133以TAA依赖性方式以与COVA1482相似的效率激活LTBR，从而展示出Fc中的突变不影响双特异性抗体激活LTBR的能力。

在存在EDB的情况下(图5F)，COVA14133(2:1EDBmAb1×LTBR mAb1)和COVA14116(2:1EDBmAb1×LTα1β2)两者实现了LTBR的有效激活。在非靶向同种型对照分子COVA14136(2:1B21M×LTBR mAb1)的情况下，未观察到LTBR激活，然而，非靶向LTα1β2对照COVA14117(2:1B21M×Ltα1β2)示出不依赖于TAA结合的激活。在不存在EDB的情况下(图5G)，通过COVA14133或其同种型对照分子COVA14136不能检测到LTBR激活。相比之下，在不存在EDB的情况下测量通过COVA14116和COVA14117对LTBR的TAA非依赖性激活，从而示出LTBR的肿瘤抗原依赖性激活非常难以由此类抗体-LTα1β2构建体实现。

总之，示出COVA14133具有以TAA依赖性方式激活LTBR的优异能力。

实施例3：EDB依赖性体外LTBR激活-A375/WI38VA亚系2RA共培养细胞测定

进行A375/WI38VA亚系2RA共培养测定，以验证在EDB+纤连蛋白(由WI38VA细胞产生并沉积在细胞外基质中(Zardi,L.等人，EMBO J,6,2337-42(1987)))的存在下LTBR的激活是否导致细胞因子和趋化因子的释放以及A375细胞上粘附分子ICAM-1的上调。在96孔板中以5000个细胞/孔的密度接种WI38VA亚线2RA(

CCL75.1^TM)细胞，并且在37℃/5％CO₂下，在其生长培养基(MEM(不包含谷氨酰胺)+10％热灭活的FBS+0.1mM NEAA+2mM L-Gln+1mM丙酮酸钠)中温育48小时。在测定培养基(DMEM+10％热灭活的FBS)中制备待测试化合物的一式三份的1:5稀释系列，作为2倍浓度原液(测试的最终浓度在40nM至0.5pM的范围内)。在具有WI38VA亚系2RA细胞的共培养物的温育之前，用CellTrace violet(CTV,Invitrogen；Carlsbad,CA)标记A375细胞(

CRL-1619^TM)。为了标记，将浓度为10×10⁶个细胞/ml的细胞悬浮液和在5％FBS中的2.5μM CTV在PBS中的溶液在室温下温育5分钟，同时避光。然后洗涤细胞并将其以0.4×10⁶个细胞/ml的密度再悬浮于测定培养基中。小心地从含有48小时WI38VA亚系2RA培养物的板中去除培养基，之后在每个孔中添加50μlA375细胞悬浮液(20,000个细胞/孔；CTV+或CTV-)。将50μl的连续稀释化合物(每个孔的最终体积为100μl)添加到细胞中，并且在37℃/5％CO₂下温育24小时。

在温育24小时或72小时后，通过离心清除上清液并储存该上清液以使用MSD测定来测量细胞因子和趋化因子，或用于在PBMC迁移测定中使用(温育24小时，实施例5)。通过流式细胞术(温育24小时)进一步处理细胞以用于ICAM-1测量。

通过流式细胞术检测ICAM-1

小心地去除留在96孔板中的任何培养基，将细胞与Accutase分离，转移到深孔96孔板(一式三份，汇集于1个孔中)，洗涤，再悬浮于100μl FACS缓冲液(PBS+1％FBS+0.1％NaN₃)中并转移到圆底96孔板中。抗体，即标记的抗人ICAM-1PE(克隆体1H4，Thermo；Waltham，MA)或标记的同种型对照抗体PE(MPC-11，BioLegend；San Diego，CA)和LIVE/DEAD可固定近红外染色剂(Invitrogen)，单次染色或组合染色如表6中所示稀释。

表6：FACS缓冲液中单次染色或组合染色的稀释方案

将细胞在4℃下以400×g离心4分钟，丢弃上清液，并且如表6中所述制备50μl抗体溶液。将细胞和抗体在黑暗中在4℃下温育30分钟。在温育之后，在每个孔中添加120μl，并且然后将细胞在4℃下以400×g离心4分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞一次，离心并再悬浮于90μl FACS缓冲液中。然后通过在PBS中添加90μl的3.7％福尔马林溶液来固定细胞，并在黑暗中在冰上温育15分钟。在固定之后，将细胞在4℃下以400×g离心4分钟，并再悬浮于100μl FACS缓冲液中。使用MACS Quant仪器在筛选模式下以高流速测量细胞，获取49μl/孔。使用FlowLogics软件(版本700.2A)分析数据并用GraphPad Prism绘图。

使用MSD平台在经处理细胞的上清液中进行细胞因子测量

使用MSD平台和多路复用MSD板测量已知处于NF-κB信号传导的控制下的若干细胞因子。在此列出了测量的细胞因子的一些示例：

■RANTES：使用R-Plex抗体集人RANTES(MSD)；

■I-TAC、IP-10、MIP-3b：使用3-PLEX细胞因子释放测定(MSD)；

■IL-8、IP-10、MIP-3b：使用3-PLEX细胞因子释放测定(MSD)；以及

■IL-12p70、IL-6、TNF-a、MIP-3a、SDF-1a：使用5-PLEX细胞因子释放测定(MSD)

按照制造商的说明书使用MSD平台测量经处理细胞的上清液中的细胞因子的浓度。简而言之，方案涉及以下步骤：

(1)板的制备涉及用连接子偶联的捕获抗体涂覆提供的板。将板在2-8℃下振荡过夜温育。第二天，使用洗板机(Biotek；Winooski,VT)，用PBST(PBS加0.05％Tween-20)洗涤板；

(2)校准物标准品和检测抗体溶液的制备；

(3)根据材料的可用性将上清液以1:3或1:5稀释。测量在24小时或72小时(对于I-TAC、MIP-3a、TNFα)温育之后的上清液。

测定方案：

○第1步：将样品或校准物标准品添加到板中，并在振荡的同时，将板在室温下温育1小时；

○第2步：洗涤板，并且添加检测抗体。将板在室温下在振荡的情况下温育1小时。

○第3步：洗涤板，并且添加2×读缓冲液T。在MSD仪器上分析板。

-使用Mesoscale软件(MSD discovery work bench程序v 4.0.12.1)分析数据。使用GraphPad Prism绘制剂量反应曲线，包括来自三次重复的标准偏差，并且应用非线性拟合(log(激动剂)对反应(可变斜率-四个参数))，如果适用的话。为了拟合数据，使用GraphPad Prism的X＝Log(x)函数转换x值(化合物的浓度)。

结果-通过流式细胞术检测ICAM-1

先前示出，NF-κB信号传导可导致细胞的表面上ICAM-1的上调(da Silva Antunes等人，Front Immunol,9,576,(2018))。因此，测量在与EDB/LTBR双特异性抗体共培养温育之后，A375细胞的表面上ICAM-1表达的水平。例如，图6示出了在与EDB/LTBR双特异性抗体COVA1482一起温育之后，ICAM-1的上调。相比之下，同种型对照分子COVA1486不导致ICAM-1的上调。这些发现指示，经由与EDB结合来聚类LTBR scFv的能力是LTBR激活的先决条件，并且因此，是ICAM-1上调的先决条件。

结果-经处理细胞的上清液中的细胞因子测量

在用如上所述的EDB/LTBR双特异性抗体和对照分子处理的共培养物的上清液中测量作为LTBR激活结果表达的若干细胞因子和趋化因子。图7A至图7J示出了由于LTBR被COVA14133激活而上调的细胞因子读数的代表性示例(图7A：RANTES，图7B：IL-6，图7C：IL-8，图7D：MIP-3b，图7E：IP-10，图7F：SDF-1a，图7G：IL-12p70，图7H：I-TAC，图7I：MIP-3a，图7J：TNFα)。COVA14136中的未靶向LTBRmAb1来源的scFv不激活LTBR，并且因此，上清液中细胞因子的浓度不使上述背景增加。背景由用B21M(COVA1440)和EDBmAb1(COVA1452)抗体实现的水平表示，如在图中示为单一浓度。图7E至图7J示出了COVA14133(2:1EDBmAb1×LTBRmAb1)和COVA14116(2:1EDBmAb1×LTα1β2)两者实现了LTBR的有效激活，如通过诱导细胞因子释放所测量的。在非靶向同种型对照分子COVA14136(2:1B21M×LTBR mAb1)的情况下，未观察到LTBR激活，然而，非靶向LTα1β2对照COVA14117(2:1B21M×Ltα1β2)示出细胞因子诱导不依赖于TAA结合。同样，这些数据例示了LTBR的肿瘤抗原依赖性激活非常难以用此类抗体-LTα1β2构建体实现。

综上所述，LTBR激活时的ICAM-1上调和细胞因子分泌证实了LTBR激活可对细胞具有预期影响。

在该实施例中，展示出本发明的分子实现了LTBR的有效的肿瘤相关抗原(含EDB的纤连蛋白)依赖性激活。由于正常组织中LTBR的广泛表达(Lukashev等人，Cancer Res.,66(19):9617-24(2006))，本发明的分子相对于先前描述的LIGHT和LTα1β2抗体融合体具有明显的优势，因为此类先前描述的融合体在本文中示出在不存在肿瘤相关抗原的情况下也有效激活LTBR，并且因此缺乏对LTBR激活的期望肿瘤特异性。相比之下，本发明的多特异性结合分子令人惊讶地确实具有这种期望的肿瘤特异性。

比较例4：间皮素依赖性体外LTBR激活–用A549 NF-kB报告基因细胞和CHOK1- huMSLN或H226进行共培养细胞测定

在实施例2和3中，展示出双特异性抗体，靶向EDB(细胞外基质中的肿瘤相关抗原)和LTBR以肿瘤抗原依赖性方式非常有效地激活LTBR。为了验证该发现是否适用于任何肿瘤抗原，而不管其位置(沉积在细胞外基质中或沉积在肿瘤细胞的细胞表面上)，如实施例1中所述设计和制备靶向间皮素(MSLN)(在不同类型的肿瘤上表达的肿瘤相关抗原(Hassan和Ho，European Journal of Cancer,44:46-53(2008)))和LTBR的双特异性2:1抗体。COVA14146是2:1MSLN/LTBR双特异性抗体，其由与来源于LTBRmAb1的scFv片段融合的抗间皮素抗体(MSLNmAb1)组成。为了示出靶向LTBR和肿瘤细胞的细胞表面存在的肿瘤相关抗原(例如间皮素)的LTBR双特异性抗体是否能够以肿瘤依赖性方式有效地激活LTBR，使用共培养细胞测定。使用的共培养测定是A549细胞NF-κB荧光素酶报告基因细胞测定(在实施例2中描述)以及已知表达间皮素(Fan等人，Mol.Canc.Ther.第1卷，595–600(2002))和LTBR的H226细胞(间皮瘤细胞系；

CRL-5826)。

H226细胞的制备

将H226细胞(表达约200,000个拷贝的间皮素和10,000个拷贝的LTBR)悬浮液以每孔10,000个细胞(在75μl测定培养基：DMEM+10％FBS-HI中)接种在96孔组织培养板中，并在37℃/5％CO₂下于其生长培养基(分别为MEM+2mM谷氨酰胺+10％FBS-HI+10μg/ml嘌呤霉素和RPMI-1640+10％FBS+1mM丙酮酸钠)中温育6小时以允许细胞附接到板。

化合物的制备

在100nM至1.3pM的浓度范围内测试化合物。在测定培养基(DMEM+10％FBS-HI)中制备化合物的4比1的5次连续稀释溶液并储存在4℃下直至使用。

A549报告基因细胞的制备和添加

在细胞培养瓶中将A549报告基因细胞与Accutase/EDTA分离，并且转移到测定培养基(DMEM+10％FBS-HI)中。在向含有H226细胞的板中添加总共20,000个A549报告基因细胞/孔之后，将50μL预稀释的化合物添加到每个孔中，并在37℃/5％CO₂下温育20小时。

经处理共培养物中发光的测量

在温育20小时之后，根据制造商的说明书使用Bio-Glo^TM荧光素酶测定系统(Promega；Madison,WI)检测荧光素酶活性。使用Tecan M1000Pro仪器测量发光，其中整合时间为500毫秒。由所得的相对光单位(RLU)，如下计算LTBR信号传导的诱导倍数：诱导倍数＝RLU_{受刺激的细胞}/平均RLU_{未受刺激的细胞}(未受刺激的细胞作为每个测试板中的对照被包括)。

使用MSD平台在经处理细胞的上清液中进行细胞因子测量

可使用MSD平台和多路复用MSD板测量已知处于NF-κB信号传导的控制下的若干细胞因子。例如，本文描述了使用R-Plex抗体集人RANTES(MSD)测量RANTES的方法。

按照制造商的说明书使用MSD平台测量经处理细胞的上清液中的RANTES的浓度。简而言之，方案涉及以下步骤：

(2)校准物标准品和检测抗体溶液的制备；

(3)根据材料的可用性将上清液以1:3或1:5稀释。

测定方案：

-使用Mesoscale软件(MSD discovery work bench程序v 4.0.12.1)分析数据，并使用GraphPad Prism绘图。

结果-A549报告基因细胞/H226共培养测定中LTBR的间皮素依赖性激活

使用A549报告基因细胞和H226细胞进行共培养测定以验证COVA14146是否能够在更生理的系统中激活LTBR，其中由于其广泛的表达(Lukashev等人，Cancer Res.,66(19):9617-24(2006))，因此预期LTBR和间皮素(以及肿瘤细胞的细胞表面上的其他肿瘤相关抗原，例如EGFR)在肿瘤细胞的细胞表面上共表达。在图8A中，示出在这些条件下，COVA14146不有效激活LTBR。测量经处理细胞的上清液中分泌的RANTES的浓度以确认COVA14146不能有效激活LTBR。如所预期的，图8B示出了由用COVA14146处理的细胞分泌的RANTES与由用同种型对照分子COVA1486处理的细胞分泌的RANTES程度相同，从而确认在这些条件下不能激活LTBR。

综上所述，实施例2-4中呈现的数据表明，含EDB的纤连蛋白(沉积在肿瘤的细胞外基质中的肿瘤相关抗原；图9A)可以导致LTBR的有效聚类，从而导致其高效的激活，与肿瘤细胞的表面上与LTBR共表达的抗原(例如，间皮素)不同。在图9A中所示的条件下，通过本发明的双特异性抗体激活LTBR导致化学引诱剂趋化因子和细胞因子的分泌以及粘附分子(例如，ICAM-1)在经处理细胞上的过表达。在不存在含EDB的纤连蛋白的情况下(图9B)，本发明的双特异性抗体不能激活LTBR，并且因此未观察到化学引诱剂趋化因子和细胞因子的表达或粘附分子的过表达。此外，示出了与肿瘤细胞上的LTBR共表达的肿瘤相关抗原不适合由双特异性抗体以肿瘤依赖性方式激活LTBR。

简而言之，本文示出了利用与LTBR和与肿瘤细胞上的LTBR共表达的肿瘤相关抗原(TAA)两者结合的双特异性抗体靶向LTBR和此类TAA不能以肿瘤特异性方式激活LTBR(实施例4)，并且经由含有TAA-结合部分和天然LTBR配体LIGHT或LTα1β2中一者的融合蛋白质靶向LTBR确实导致LTBR激活，但不是以肿瘤特异性方式(实施例2)。然而，值得注意和令人惊讶的是，与LTBR的一个结合结构域结合且与纤连蛋白的EDB(存在于细胞外基质中的TAA)的另一结合结构域结合的双特异性抗体能够以肿瘤特异性方式激活LTBR(实施例2和3)。当此类双特异性抗体含有三个结合结构域，例如两个靶向EDB的结合结构域和一个靶向LTBR的结合结构域时，观察到特别良好的结果。鉴于其肿瘤特异性，这使得本发明的双特异性抗体成为感兴趣的癌症免疫疗法的候选物。

本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。

实施例5：PBMC朝向来自A375/WI38VA亚系2RA共培养细胞测定的条件培养基的 Transwell迁移

在实施例3中，展示出双特异性抗体，靶向EDB(细胞外基质中的肿瘤相关抗原)和LTBR以肿瘤抗原依赖性方式非常有效地激活LTBR，从而导致促炎性细胞因子的产生。

该测定的目的是研究共培养测定中产生的细胞因子和趋化因子是否可以吸引PBMC并导致其迁移。通过Ficoll Paque密度梯度离心从血沉棕黄层分离人PBMC，并且制备A375/WI38VA共培养物，并用EDB/LTBR双特异性抗体和对照分子刺激，如实施例3中所述。

在37℃/5％CO₂下温育24小时后，将受刺激的共培养物的上清液转移到96孔深孔板中，并且测定培养基(RPMI1640+10％FBS+1mM丙酮酸钠)1:1稀释。在稀释之后，将上清液离心(500xg/5min)并转移到新鲜的96孔深孔板中以消除任何细胞或细胞碎片。

将重组的SDF-1a(有效的化学引诱剂)以40ng/ml的浓度用于测定培养基中作为阳性对照以刺激PBMC迁移。将235μl/孔的条件培养基、SDF-1a对照或测定培养基转移以用于在HTS

-96可渗透支撑体的载剂板中进行迁移测定(一式三份进行)，该载剂板具有5μm孔聚碳酸酯膜(Corning)，其先前已在37℃/5％CO₂下在测定培养基(RPMI1640+10％FBS+1mM丙酮酸钠)中平衡至少1小时。在将膜插入件放置回载剂板中之后，将75μl/孔的PBMC悬浮液以4.67×10⁶个细胞/ml添加到迁移测定板的所有孔中，从而得到350,000个细胞/孔。将板在37℃/5％CO₂下温育2小时，以允许PBMC朝向条件培养基迁移。

在温育2小时后，移除板插入件，并将载剂板中的迁移细胞小心地再悬浮并且转移到新鲜的U形底部96孔板中。将迁移的细胞离心(400xg/4min)，再悬浮于50μl/孔FACS缓冲液(含有1％FBS-HI、0.1％叠氮化钠、1mM EDTA的PBS)中，并且使用MACS Quant仪器(高流速和快速模式)直接测量。数据使用FlowLogics软件(版本700.2A)分析。使用GraphPad Prism绘制剂量反应曲线，包括来自三次重复的标准偏差。为了拟合数据，使用GraphPad Prism的X＝Log(x)函数转换x值(化合物的浓度)。

结果–PBMC朝向来自A375/WI38VA亚系2RA共培养细胞测定的条件培养基的 Transwell迁移

在该实施例中，研究在共培养测定(参见实施例3)中在LTBR激活时表达的细胞因子和趋化因子的混合物可诱导PBMC朝向细胞因子和趋化因子梯度迁移。建立了transwell迁移测定，其中将用不同浓度的EDB/LTBR双特异性抗体刺激的共培养物的上清液置于在下部腔室中，然而将新分离的人PBMC添加到transwell板的上部腔室中。在2小时温育时间后，将迁移的细胞计数并且通过流式细胞术进行表型分型。图10示出了迁移测定的代表性结果。以剂量依赖性方式诱导PBMC从用COVA14133(EDB/LTBR双特异性抗体)刺激的共培养物朝向上清液迁移，然而来自与非靶向对照分子COVA14136(同种型对照/LTBR)一起温育的共培养物的上清液不诱导PBMC的迁移。-LTα1β2抗体融合体COVA14116(EDB mAb1-LTα1β2；2:1)并在一定程度上COVA14117(B21M-LTα1β2；2:1)确实还诱导PBMC的迁移。通过用免疫细胞标志物染色来确认不同免疫细胞亚群的迁移以对迁移的细胞进行表型分型。确认单核细胞、嗜酸性/中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞和T细胞的迁移(数据未示出)。该实施例证实了LTBR的EDB依赖性激活导致细胞因子和趋化因子的分泌，并且示出这些因子可充当免疫细胞的化学引诱剂(图10)。

此外，该实施例再次示出，本发明的分子相对于先前描述的LTα1β2抗体融合体具有明显的优势，因为此类先前描述的融合体在本文中示出在不存在肿瘤相关抗原的情况下也有效激活LTBR并导致PBMC的迁移，并且因此缺乏对LTBR激活的期望肿瘤特异性。相比之下，本发明的多特异性结合分子令人惊讶地确实具有这种期望的肿瘤特异性。

实施例6：EDB依赖性LTBR介导的内皮激活对单核细胞通过内皮单层运输的影响

在实施例3和5中展示之后，在EDB依赖性激活LTBR后产生的细胞因子可导致PBMC朝向细胞因子梯度迁移，在此描述的测定的目的是验证以EDB依赖性方式激活内皮细胞上的LTBR是否可导致单核细胞通过内皮层的运输增加。

使用相应的负选择试剂盒(Miltenyi Biotec)从健康供体中收集的EDTA血液中纯化该测定中使用的单核细胞，并以1.5×10⁶个细胞/ml使用。HUVEC(人脐带静脉内皮细胞)在涂覆有重组EDB+纤连蛋白结构域7-B-8-9(EDB+；SEQ ID NO:51)的室载玻片中培养48小时，其使用M199补充的培养基(M199培养基，20％FCS，氢化可的松(0.1μM)，肝素(100μg/ml)，ECGS 15μg/ml，维生素C(10μg/ml)，青霉素/链霉素(1％/1％))。然后用TNF(500U/ml；阳性对照)、EDB/LTBR双特异性抗体(COVA14133；50nM)或非靶向LTBRmAb1来源的scFv(COVA14136；50nM)刺激HUVEC并且温育2天。

流量测定设施由加热的显微镜室(37℃)和校准的泵组成，其中流量可通过灌注洗涤缓冲液(M199培养基，0.1％BSA)+/-单核细胞悬浮液在HUVEC单层上方生成。流速表示小静脉/毛细血管(0.05Pa)。然后将洗涤缓冲液在HUVEC上泵送10分钟以去除激活培养基，从而等于20分钟总HUVEC暴露。然后将单核细胞在HUVEC上灌注6分钟(步骤2)，随后灌注洗涤缓冲液50分钟(步骤3)。这在0.1Pa下进行，其是所有单核细胞募集方案的标准。在整个步骤2-3中，使用相差显微镜和相机制作捕获的单核细胞的图像。单独的图像每隔30秒在1个固定场中记录，并且将其编译成短电影序列，从而允许分析大面积范围内的各个单核细胞。与HUVEC的表面粘附的单核细胞具有相白色/灰色外观，而已迁移的那些具有相黑色外观。

通过播放电影序列，在实验的持续时间，在0.19mm²的限定面积中，在每个图像上的固定网格内对粘附和迁移的细胞进行计数。每个细胞计数的时间点在整个实验的固定时间点处进行。

粘附细胞的总数代表每个时间点处的捕获的细胞的总和；其中一定百分比将迁移(相灰色+黑色)。迁移事件(相黑色)是从每单位场流量中捕获的总单核细胞(相灰色+黑色)的百分比。单核细胞通常在共培养的持续时间内保持粘附，并具有极少的分离事件。

所有实验均使用一式三份的场进行并且以平均值+标准误差测量值(+SEM)表示。统计分析假设参数分布，并使用学生T检验进行。显著性分数的P值在图上如下所示：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005(Bradfield PF等人，Blood.2007年10月1日；110(7):2545-55)。

结果—EDB依赖性LTBR介导的内皮激活对单核细胞通过内皮单层运输的影响

该实施例研究了内皮细胞单层上的EDB依赖性LTBR激活对单核细胞的粘附和迁移的影响，因为内皮细胞先前已经示出在其表面上表达LTBR(Lukashev等人，Cancer Res.,66(19):9617-24(2006))。

图11A示出，与用非靶向对照分子COVA14136(同种型对照/LTBR)激活的单层相比，更多的单核细胞可粘附到HUVEC单层，该HUVEC单层在存在含EDB的纤连蛋白的情况下生长，用COVA14133(EDB/LTBR双特异性抗体)激活。

图11B示出了与和非靶向对照COVA14136一起温育的HUVEC相比，在用COVA14133激活之后，不仅单核细胞的粘附，而且单核细胞通过HUVEC单层的迁移增加。

总之，该实施例的结果进一步确认了本发明的分子具有明显的优点，其仅能够在存在含EDB的纤连蛋白的情况下激活LTBR，不同于先前所述的LTα1β2抗体融合体，从而提供对LTBR激活的期望肿瘤特异性。

序列表

SEQ ID NO:1(HC BHA 10 IgG1s杵)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:2(LC BHA10)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:3(HC L19 IgG1s杵)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:4(HC L19 IgG1s臼)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:5(LC L19)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:6(HC B21M(RSV)IgG1s杵)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:7(HC B21M(RSV)IgG1s臼)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:8[LC B21M(RSV)]

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:9 HC(CBE11 IgG1s杵)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMYWFRQAPGKGLEWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAREENGNFYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:10(LC CBE11)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQDIKSYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:11(HC BHA10 IgG1s)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:12(HC L19 IgG1s)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:13(HC CBE11 IgG1s)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMYWFRQAPGKGLEWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAREENGNFYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:14(HC B21M(RSV)IgG1s)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:15(与Fc融合的3xhmLIGHT，具有IgG1s、杵和pA突变)

RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:16(用于融合的3xhmLIGHT单链)

RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGTRSYFGAFMV

SEQ ID NO:17(用于融合的LTa1b2)

KPAAHLIGDPSKQNSLLWRANTDRAFLQDGFSLSNNSLLVPTSGIYFVYSQVVFSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSSQYPFHVPLLSSQKMVYPGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTVFFGAFALLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVG

SEQ ID NO:18(与LTa1b2融合的HC B21M，IgG1s)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAHSTLKPAAHLIGDPSKQNSLLWRANTDRAFLQDGFSLSNNSLLVPTSGIYFVYSQVVFSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSSQYPFHVPLLSSQKMVYPGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTVFFGAFALLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVG

SEQ ID NO:19(与LTa1b2融合的HC B21M，IgG1s，杵，具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKAHSTLKPAAHLIGDPSKQNSLLWRANTDRAFLQDGFSLSNNSLLVPTSGIYFVYSQVVFSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSSQYPFHVPLLSSQKMVYPGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTVFFGAFALLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVG

SEQ ID NO:20(与LTa1b2融合的HC L19，IgG1s)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAHSTLKPAAHLIGDPSKQNSLLWRANTDRAFLQDGFSLSNNSLLVPTSGIYFVYSQVVFSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSSQYPFHVPLLSSQKMVYPGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTVFFGAFALLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVG

SEQ ID NO:21(与LTa1b2融合的HC L19，IgG1s，杵，具有pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKAHSTLKPAAHLIGDPSKQNSLLWRANTDRAFLQDGFSLSNNSLLVPTSGIYFVYSQVVFSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSSQYPFHVPLLSSQKMVYPGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTVFFGAFALLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVG

SEQ ID NO:22[装订的scFv BHA10(VH-VL)]

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:23[装订的scFv BHA10(VL-VH)]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:24[装订的连接子(VH-VL)]

GGGSGGGSGCPPCGGGG

SEQ ID NO:25[二硫键稳定的scFv BHA10 (VH-VL)]

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQCLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:26(HC B21M N端装订的BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:27(HCB21MN端装订的BHA10(VL-VH)，IgG1s，杵，具有pA突变)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:28(HC B21M C端装订的BHA(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:29(HC B21M C端装订的BHA(VL-VH)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:30(HC L19 N端装订的BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:31(HC L19 N端装订的BHA10(VL-VH)，IgG1s，杵，具有pA突变)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:32(HC L19 C端装订的BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:33(HC L19 C端装订的BHA10(VL-VH)，IgG1s，杵，具有pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:34(HC L19 C端装订的(VL3_Y36F_S49Y_F87Y)BHA(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:35(HC L19 C端装订的(VH_CDR1_Y33A)BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYALHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:36(HC B21M C端装订的(VL3_Y36F_S49Y_F87Y)BHA(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:37(HC B21M C端装订的(VH_CDR1_Y33A)BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYALHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:38(HC L19 C端装订的BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，无pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:39(HC L19 C端二硫键稳定的，BHA(VH-VL)，IgG1s，杵，不具有pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQCLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:40(HC B21M C端二硫键稳定的，BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，不具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQCLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:41(HC B21M C端装订的BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，无pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:42[(GGGGS)4连接子(用于连接二硫键稳定的scFv中的Fv片段)]

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:43(VH BHA10)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:44(VL BHA10)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:45(VH L19)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:46(VL L19)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:47(VH CBE11)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMYWFRQAPGKGLEWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAREENGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:48(VL CBE11)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQDIKSYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO:49(VH B21M)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:50(VL B21M)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:51(纤连蛋白结构域7B89)

PLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNGQQGNSLEEVVHADQSSCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPEVPQLTDLSFVDITDSSIGLRWTPLNSSTIIGYRITVVAAGEGIPIFEDFVDSSVGYYTVTGLEPGIDYDISVITLINGGESAPTTLTQQTAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTHHHHHH

SEQ ID NO:52(纤连蛋白结构域789)

PLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNGQQGNSLEEVVHADQSSCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTHHHHHH

SEQ ID NO:53[装订的scFv(VL3_Y36F_S49Y_F87Y)BHA10(VH-VL)]

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:54[装订的scFv(VH_CDR1_Y33A)BHA10(VH-VL)]

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYALHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:55[装订的连接子(VL-VH)]

GGSGGSGGCPPCGSGG

SEQ ID NO:56(HC L19 C端二硫键稳定的，BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQCLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:57(HC B21M C端二硫键稳定的，BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQCLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:58(IgG1σFc)

DKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:59[(GGGGS)3连接子，scFv到Fc]

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:60(VH BHA10的HCDR1)

TYYLH

SEQ ID NO:61(VH BHA10的HCDR2)

WIYPGNVHAQYNEKFKG

SEQ ID NO:62(VH BHA10的HCDR3)

SWEGFPY

SEQ ID NO:63(VL BHA10的LCDR1)

KASQNVGINVA

SEQ ID NO:64(VL BHA10的LCDR2)

SASYRYS

SEQ ID NO:65(VL BHA10的LCDR3)

QQYDTYPFT

SEQ ID NO:66(VH CBE11的HCDR1)

DYYMY

SEQ ID NO:67(VH CBE11的HCDR2)

TISDGGSYTYYPDSVK

SEQ ID NO:68(VH CBE11的HCDR3)

EENGNFYYFDY

SEQ ID NO:69(VL CBE11的LCDR1)

KAGQDIKSYLS

SEQ ID NO:70(VL CBE11的LCDR2)

YATRLAD

SEQ ID NO:71(VL CBE11的LCDR3)

LQHGESPWT

SEQ ID NO:72(VH L19的HCDR1)

SFSMS

SEQ ID NO:73(VH L19的HCDR2)

SISGSSGTTYYADSVKG

SEQ ID NO:74(VH L19的HCDR3)

PFPYFDY

SEQ ID NO:75(VL L19的LCDR1)

RASQSVSSSFLA

SEQ ID NO:76(VL L19的LCDR2)

YASSRAT

SEQ ID NO:77(VL L19的LCDR3)

QQTGRIPPT

SEQ ID NO:78(VH MSLNmAb1)

QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSS

SEQ ID NO:79(VL MSLNmAb1)

DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIK

SEQ ID NO:80(MSLNmAb1 HC C端装订的BHA10(VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变)

QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK

SEQ ID NO:81(HC MSLNmAb1 IgG1s臼)

QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:82(LC MLSNmAb1)

DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:83(BHA10 HCDR1低亲和力变体)

TYALH

SEQ ID NO:84(HC L19 IgG1s杵，具有pA突变)

VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:85(HC B21M(RSV)IgG1s杵，具有pA突变)

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:86(MSLNmAb1 HC，IgG1s，杵，具有pA突变)

QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

<110> Cilag GmBH International

<120> 多特异性结合分子及其用途

<130> COV6002WOPCT1

<140>

<141>

<150> 62/946,452

<151> 2019-12-11

<160> 102

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC BHA 10 IgG1s杵

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC BHA10

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC L19 IgG1s knob

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC L19 IgG1s臼

<400> 4

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

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Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

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Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC B21M (RSV)

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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC CBE11 IgG1s

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Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

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385 390 395 400

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<212> PRT

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<223> 与LTa1b2融合的HC B21M，IgG1s

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<213> 人工序列

<220>

<223> 与LTa1b2融合的HC B21M，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 19

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Val Leu Asp Pro Ala Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr

705 710 715 720

Ser Val Gly Phe Gly Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val

725 730 735

Tyr Val Asn Ile Ser His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys

740 745 750

Thr Phe Phe Gly Ala Val Met Val Gly Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala

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Ala His Leu Ile Gly Ala Pro Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu

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Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp

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Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys

805 810 815

Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln

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Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala

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Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val

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Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp

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Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu

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Arg Val Tyr Val Asn Ile Ser His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg

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Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala Val Met Val Gly

915 920

<210> 20

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与LTa1b2融合的HC L19，IgG1s

<400> 20

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala His

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500 505 510

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Ser Ser Gln Tyr Pro Phe His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met

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Val Tyr Pro Gly Leu Gln Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly

545 550 555 560

Ala Ala Phe Gln Leu Thr Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp

565 570 575

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580 585 590

Phe Ala Leu Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala

595 600 605

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Arg Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro

675 680 685

Glu Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro

690 695 700

Ala Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe

705 710 715 720

Gly Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile

725 730 735

Ser His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly

740 745 750

Ala Val Met Val Gly Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile

755 760 765

Gly Ala Pro Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu

770 775 780

Gln Ala Phe Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu

785 790 795 800

Ala Leu Pro Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr

805 810 815

Arg Gly Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val

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Thr Leu Arg Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly

835 840 845

Thr Pro Glu Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu

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Asp Pro Ala Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val

865 870 875 880

Gly Phe Gly Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val

885 890 895

Asn Ile Ser His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe

900 905 910

Phe Gly Ala Val Met Val Gly

915

<210> 21

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与LTa1b2融合的HC L19，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala His

435 440 445

Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln

450 455 460

Asn Ser Leu Leu Trp Arg Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp

465 470 475 480

Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile

485 490 495

Tyr Phe Val Tyr Ser Gln Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro

500 505 510

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515 520 525

Ser Ser Gln Tyr Pro Phe His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met

530 535 540

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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625 630 635 640

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645 650 655

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Arg Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro

675 680 685

Glu Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro

690 695 700

Ala Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe

705 710 715 720

Gly Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile

725 730 735

Ser His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly

740 745 750

Ala Val Met Val Gly Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile

755 760 765

Gly Ala Pro Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu

770 775 780

Gln Ala Phe Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu

785 790 795 800

Ala Leu Pro Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr

805 810 815

Arg Gly Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val

820 825 830

Thr Leu Arg Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly

835 840 845

Thr Pro Glu Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu

850 855 860

Asp Pro Ala Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val

865 870 875 880

Gly Phe Gly Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val

885 890 895

Asn Ile Ser His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe

900 905 910

Phe Gly Ala Val Met Val Gly

915

<210> 22

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 装订的scFv BHA10 (VH-VL)

<400> 22

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<210> 23

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 装订的scFv BHA10 (VL-VH)

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn

20 25 30

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100 105 110

Ser Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val

115 120 125

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser

130 135 140

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro

165 170 175

Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr

180 185 190

Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser

195 200 205

Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu

210 215 220

Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Cys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 装订的连接子(VH-VL)

<400> 24

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 二硫键稳定的scFv BHA10 (VH-VL)

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys

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Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys

210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys

<210> 26

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC B21M N端装订的BHA10 (VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Cys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro

115 120 125

Cys Gly Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

145 150 155 160

Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

210 215 220

Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser

260 265 270

Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr

275 280 285

Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile

290 295 300

Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp

305 310 315 320

Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile

325 330 335

Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met

340 345 350

Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Phe

355 360 365

Thr Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

370 375 380

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

385 390 395 400

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

405 410 415

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

420 425 430

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

435 440 445

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

450 455 460

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

465 470 475 480

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

485 490 495

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro

500 505 510

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

515 520 525

Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

530 535 540

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

545 550 555 560

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

565 570 575

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

580 585 590

Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

595 600 605

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu

610 615 620

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

625 630 635 640

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

645 650 655

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

660 665 670

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

675 680 685

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe

690 695 700

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

705 710 715

<210> 27

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCB21M N端装订的BHA10 (VL-VH)，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Cys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val

115 120 125

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser

130 135 140

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro

165 170 175

Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr

180 185 190

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<210> 38

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC L19 C端装订的BHA10 (VH-VL)，IgG1s，杵，无pA突变

<400> 38

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser Val Phe

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245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val

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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

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Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Leu His

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530 535 540

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser

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565 570 575

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly

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Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

595 600 605

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<220>

<223> HC L19 C端二硫键稳定的BHA (VH-VL)，IgG1s，杵，不具有pA突变

<400> 39

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

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Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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<210> 40

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC B21M C端二硫键稳定的BHA10 (VH-VL)，IgG1s，杵，不具有pA突变

<400> 40

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

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Val Glu Ile Lys

705

<210> 41

<211> 705

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC B21M C端装订的BHA (VH-VL)，IgG1s，杵，无pA突变

<400> 41

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

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Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr

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Lys

705

<210> 42

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (GGGGS)4连接子

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

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Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL BHA10

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn

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<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

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Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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Thr Val Ser Ser

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<210> 46

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL L19

<400> 46

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

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Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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<210> 47

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CBE11

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

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Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 48

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CBE11

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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<210> 49

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH B21M

<400> 49

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

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Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

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Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

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Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL B21M

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn

20 25 30

Gly Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 51

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白结构域7B89

<400> 51

Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu Glu Ala Asn Pro Asp Thr

1 5 10 15

Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser Thr Thr Pro Asp Ile Thr

20 25 30

Gly Tyr Arg Ile Thr Thr Thr Pro Thr Asn Gly Gln Gln Gly Asn Ser

35 40 45

Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gln Ser Ser Cys Thr Phe Asp Asn

50 55 60

Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val Tyr Thr Val Lys Asp

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile Ile Pro Glu Val Pro

85 90 95

Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Ile Thr Asp Ser Ser Ile Gly

100 105 110

Leu Arg Trp Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ile Ile Gly Tyr Arg Ile

115 120 125

Thr Val Val Ala Ala Gly Glu Gly Ile Pro Ile Phe Glu Asp Phe Val

130 135 140

Asp Ser Ser Val Gly Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Leu Glu Pro Gly Ile

145 150 155 160

Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr Leu Ile Asn Gly Gly Glu Ser Ala

165 170 175

Pro Thr Thr Leu Thr Gln Gln Thr Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu

180 185 190

Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro

195 200 205

Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val

210 215 220

Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn

225 230 235 240

Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser

245 250 255

Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg

260 265 270

Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile

275 280 285

Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile

290 295 300

Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro

305 310 315 320

Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn

325 330 335

Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly

340 345 350

Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr His His His

355 360 365

His His His

370

<210> 52

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白结构域789

<400> 52

Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu Glu Ala Asn Pro Asp Thr

1 5 10 15

Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser Thr Thr Pro Asp Ile Thr

20 25 30

Gly Tyr Arg Ile Thr Thr Thr Pro Thr Asn Gly Gln Gln Gly Asn Ser

35 40 45

Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gln Ser Ser Cys Thr Phe Asp Asn

50 55 60

Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val Tyr Thr Val Lys Asp

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile Ile Pro Ala Val Pro

85 90 95

Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg

100 105 110

Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val

115 120 125

Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile

130 135 140

Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr

145 150 155 160

Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr

165 170 175

Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile

180 185 190

Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala

195 200 205

Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His

210 215 220

Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser

225 230 235 240

Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile

245 250 255

Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln

260 265 270

Ser Thr His His His His His His

275 280

<210> 53

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 装订的scFv (VL3_Y36F_S49Y_F87Y) BHA10 (VH-VL)

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Cys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro

115 120 125

Cys Gly Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

145 150 155 160

Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

210 215 220

Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 54

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 装订的scFv (VH_CDR1_Y33A) BHA10 (VH-VL)

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Cys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro

115 120 125

Cys Gly Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

145 150 155 160

Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

210 215 220

Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 55

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 装订的连接子(VL-VH)

<400> 55

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

<210> 56

<211> 704

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC L19 C端二硫键稳定的BHA10 (VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 56

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

450 455 460

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys

465 470 475 480

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Leu His

485 490 495

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile

500 505 510

Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg

515 520 525

Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

530 535 540

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser

545 550 555 560

Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

565 570 575

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

580 585 590

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

595 600 605

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

610 615 620

Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

625 630 635 640

Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

645 650 655

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

660 665 670

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

675 680 685

Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

690 695 700

<210> 57

<211> 708

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC B21M C端二硫键稳定的BHA10 (VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 57

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Phe Thr Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

465 470 475 480

Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr

485 490 495

Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp

500 505 510

Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys

515 520 525

Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala

530 535 540

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

545 550 555 560

Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

565 570 575

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

580 585 590

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

595 600 605

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

610 615 620

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

625 630 635 640

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr

645 650 655

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

660 665 670

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe

675 680 685

Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys

690 695 700

Val Glu Ile Lys

705

<210> 58

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1σ Fc

<400> 58

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 59

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (GGGGS)3连接子

<400> 59

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BHA10 HCDR1

<400> 60

Thr Tyr Tyr Leu His

1 5

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BHA10 HCDR2

<400> 61

Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BHA10 HCDR3

<400> 62

Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr

1 5

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BHA10 LCDR1

<400> 63

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala

1 5 10

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BHA10 LCDR2

<400> 64

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BHA10 LCDR3

<400> 65

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBE11 HCDR1

<400> 66

Asp Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 67

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBE11 HCDR2

<400> 67

Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBE11 HCDR3

<400> 68

Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBE11 LCDR1

<400> 69

Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 70

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBE11 LCDR2

<400> 70

Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBE11 LCDR3

<400> 71

Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L19 HCDR1

<400> 72

Ser Phe Ser Met Ser

1 5

<210> 73

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L19 HCDR2

<400> 73

Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 74

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L19 HCDR3

<400> 74

Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 75

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L19 LCDR1

<400> 75

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L19 LCDR2

<400> 76

Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L19 LCDR3

<400> 77

Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr

1 5

<210> 78

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH MSLN mAb1

<400> 78

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Ser Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 79

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL MSLN mAb1

<400> 79

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 80

<211> 704

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MSLN mAb1 HC C端装订的BHA10 (VH-VL)，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 80

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Ser Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

465 470 475 480

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

485 490 495

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Cys Gly Leu Glu Trp Met

500 505 510

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe

515 520 525

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

530 535 540

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

545 550 555 560

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

565 570 575

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro

580 585 590

Cys Gly Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

595 600 605

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

610 615 620

Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

625 630 635 640

Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

645 650 655

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

660 665 670

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

675 680 685

Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

690 695 700

<210> 81

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC MSLN mAb1 IgG1s臼

<400> 81

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Ser Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 82

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC MSLN mAb1

<400> 82

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 83

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BHA10 HCDR1低亲和力变体

<400> 83

Thr Tyr Ala Leu His

1 5

<210> 84

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC L19 IgG1s杵，具有pA变体

<400> 84

Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ser

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

35 40 45

Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 85

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC B21M (RSV) IgG1s杵，具有pA突变

<400> 85

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Phe Thr Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 86

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MSLNmAb1 HC，IgG1s，杵，具有pA突变

<400> 86

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Ser Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 87

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TnCA2 Ab 2B10的VH

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 88

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TnCA2 Ab 2B10的VL

<400> 88

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 89

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗EDA Ab F8的VH

<400> 89

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗EDA Ab F8的VL

<400> 90

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro

20 25 30

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 91

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hu纤连蛋白结构域11-A-12

<400> 91

Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met Gln Val Thr Asp Val Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ser Ile Ser Val Lys Trp Leu Pro Ser Ser Ser Pro Val Thr Gly Tyr

20 25 30

Arg Val Thr Thr Thr Pro Lys Asn Gly Pro Gly Pro Thr Lys Thr Lys

35 40 45

Thr Ala Gly Pro Asp Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu Gly Leu Gln Pro

50 55 60

Thr Val Glu Tyr Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn Pro Ser Gly Glu

65 70 75 80

Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile Asp Arg Pro Lys

85 90 95

Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp

100 105 110

Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser

115 120 125

Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Glu

130 135 140

Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val

145 150 155 160

Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly

165 170 175

Thr Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln

180 185 190

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Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro

210 215 220

Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser

225 230 235 240

Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu

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His His His His His His

275

<210> 92

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hu纤连蛋白结构域11-12

<400> 92

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Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly

165 170 175

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<223> 融合有BHA10装订的(VH-VL) scFv C端的2B10 HC，IgG1σ，杵突变

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<211> 703

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合有BHA10装订的(VH-VL) scFv C端的F8 HC，IgG1σ，杵突变

<400> 99

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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<211> 448

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 101

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180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 102

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B10 HC，IgG1σ，杵突变

<400> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Ala Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

Claims

1.一种多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含：

其中所述多特异性结合分子在结合所述EDB时激活LTBR。

2.根据权利要求1所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子以肿瘤特异性方式激活LTBR。

3.根据权利要求1或2所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子是双特异性抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子包含两个抗原结合结构域。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述多特异性结合分子包含三个抗原结合结构域。

6.根据权利要求5所述的多特异性结合分子，其中所述三个抗原结合结构域包括一个与LTBR特异性结合的结合结构域。

7.根据权利要求5或6所述的多特异性结合分子，其中所述三个抗原结合结构域包括两个特异性结合EDB的结合结构域。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的多特异性结合分子，其中与LTBR特异性结合的所述结合结构域包括抗体的单链可变结构域。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的多特异性结合分子，其中与LTBR特异性结合的所述第一结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述VH和所述VL包含以下中的任一者：

(iv)VH包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或者

(v)VH包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或者

(vi)SEQ ID NO:22；或者

(vii)SEQ ID NO:23；或者

(viii)SEQ ID NO:25。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性结合分子，其中与EDB特异性结合的所述第二结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述VH和所述VL包含以下中的任一者：

(ii)VH包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含以下中的任一者：

(a)(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一重链，所述第一重链与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第一轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二重链，所述第二重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第二轻链形成结合结构域；或者

(b)(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一重链，所述第一重链与包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第一轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二重链，所述第二重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第二轻链形成结合结构域。

12.根据权利要求1至3或5至10中任一项所述的多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含以下中的任一者：

(a)(i)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(b)(i)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(c)(i)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(d)(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(e)(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(f)(i)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(g)(i)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(h)(i)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域；或者

(i)(i)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域。

13.根据权利要求1至3或5至10中任一项所述的多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含(i)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的scFv重链融合体，所述scFv重链融合体的重链部分与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域，和(ii)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链，所述重链与包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链形成结合结构域。

14.一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子编码根据权利要求1至13中任一项所述的多特异性结合分子。

15.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据权利要求14所述的一种或多种核酸分子。

16.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据权利要求14所述的一种或多种核酸分子或根据权利要求15所述的一种或多种载体。

17.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至13中任一项所述的多特异性结合分子以及药学上可接受的载剂。

18.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至13中任一项所述的多特异性结合分子、根据权利要求14所述的一种或多种核酸分子、根据权利要求15所述的一种或多种载体或根据权利要求17所述的药物组合物。

19.根据权利要求1至13中任一项所述的多特异性结合分子、根据权利要求14所述的一种或多种核酸分子、根据权利要求15所述的一种或多种载体或根据权利要求17所述的药物组合物用于激活肿瘤组织中的LTBR的用途。

20.一种制备根据权利要求1至13中任一项所述的多特异性结合分子的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达根据权利要求14所述的一种或多种核酸分子或根据权利要求15所述的一种或多种载体，以及收获所述多特异性结合分子。