JP2023506750A

JP2023506750A - Ｌｔｂｒ及びｅｄｂ結合ドメインを含む多重特異性結合分子並びにその使用

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Publication number: JP2023506750A
Application number: JP2022535429A
Authority: JP
Inventors: ローレンツィ，マシュー; ラクエル，シルヴィー; ブラック，シモン; クルプシュ，クリスティーナ; シャーデ，バベッテ; ベーリスヴィル，ヴァネッサ; メルッコ，ミケーラシラッチ; ベルトシンガー，ユリアン
Original assignee: Cilag GmbH International
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2023-02-20
Also published as: CA3164226A1; EP4073111A1; CN115087670A; IL293742A; AU2020401755A1; WO2021116337A1; US20210188990A1; KR20220130687A

Abstract

本明細書では、抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子、その抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子をコードする核酸、その核酸を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞、及びその抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子を含む医薬組成物が提供される。治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、方法もまた提供される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は２０１９年１２月１１日に出願された米国仮出願第６２／９４６，４５２号の利益を主張するものである。前述の出願の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本発明は、抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子、結合分子をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、並びに結合分子を含む組成物に関する。また、結合分子を作製する方法、及び癌細胞を死滅させるために結合分子を用いる方法が提供される。

癌の免疫療法には、腫瘍に対する免疫応答を促進することによって、癌患者の生存率を改善する可能性がある。特定の患者は、現在利用可能な抗癌免疫療法（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブ、ペンブロリズマブ又はニボルマブなどの抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体）に対する深く長い応答を経験しているが、患者の大部分はそのような治療薬の恩恵を受けない（Ｒｉｂａｓら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第３５９巻：第１３５０～１３５５頁（２０１８年））。例として、免疫細胞浸潤の欠如によって又は炎症性シグネチャの非存在によって特徴付けられるいわゆる「低温」すなわち非炎症性腫瘍を有する患者は、抗癌免疫療法による利益が低い（Ｃｈｅｎ及びＭｅｌｌｍａｎ、「Ｎａｔｕｒｅ」、第５４１巻：第３２１～３０頁（２０１７年））。したがって、改善された有効性を有する新規の抗癌免疫療法が必要とされている。

リンフォトキシンベータ受容体（lymphotoxin beta receptor：ＬＴＢＲ／ＴＮＦＲＳＦ３）である、ＴＮＦスーパーファミリーの受容体は、抗癌免疫療法のための可能な多くの標的のうちの１つである。ＬＴＢＲは、ＮＦ－κＢ経路を介していくつかのホメオスタシスのリンパ系サイトカイン（例えば、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３）及び接着分子（ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１、ＭＡｄＣＡＭ１）の発現を調節することによって、リンパ節及び二次リンパ器官の発達及びホメオスタシスにおける中心的な役割を果たす（Ｄｅｊａｒｄｉｎら、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、第１７巻：第５２５～５３５頁（２００２年）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．」、第２０２巻：第４９～６６頁（２００４年））。ＬＴＢＲは、２つの異なる三量体リガンドである、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）及びリンフォトキシンα１β２（ＬＴα１β２）によって活性化される。ＬＴα１β２はＬＴＢＲに特異的であるが、ＬＩＧＨＴはまた、免疫細胞上に発現される、免疫細胞の調節に関与する受容体であるＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）に結合し、これを活性化する（Ｐａｓｅｒｏら、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」、第１２巻：第４７８～８５頁（２０１２年））。

癌免疫療法の観点から特に興味深いものは、そのリガンドによるＬＴＢＲの活性化が三次リンパ構造（tertiary lymphoid structure：ＴＬＳ）の異所性形成をもたらすという知見である（Ｓｃｈｒａｍａら、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、第１４巻：第１１１～１２１頁（２００１年）；Ｔａｎｇら、「Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１４巻：第８０９～１８頁（２０１７年））。腫瘍微小環境におけるＴＬＳの存在は、典型的には免疫浸潤と相関し、また、より良好な予後とも関連しており、ＴＬＳが抗腫瘍免疫応答に関与することを示唆している（Ｄｉｅｕ－Ｎｏｓｊｅａｎら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．」、第２６巻：第４４１０～１７頁（２００８年；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ及びＳｔｏｒｋｕｓ、「Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」、第１２８巻：第１９７～２３３頁（２０１５年））。したがって、ＬＴＢＲの活性化は、腫瘍微小環境におけるＴＬＳ形成を促進し、抗腫瘍免疫応答を誘導し、現在の癌免疫療法を改善する可能性を有する。

保護抗腫瘍免疫応答を促進する目的でＬＴＢＲを標的化する治療のコンセプトは、いくつかの前臨床研究において確立されている。

いくつかの群は、その天然リガンドＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）を用いてＬＴＢＲを標的化している。ＬＩＧＨＴは、ＬＴＢＲ、及び第２の受容体であるＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）に結合し、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、及びＤＣなどの免疫細胞上に発現される（Ｐａｓｅｒｏら、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」、第１２巻：第４７８～８５頁（２０１２年））。したがって、ＬＩＧＨＴ媒介性免疫生物学的効果は、ＬＴＢＲ又はＨＶＥＭのいずれかに依存し得ることに留意されたい。

Ｙｕらは、マウス腫瘍細胞株におけるＬＩＧＨＴの膜結合形態の強制発現が、ケモカイン産生物及び接着分子のアップレギュレーションと相関するナイーブＴリンパ球の大規模な浸潤をもたらし、結果として局所及び遠位部位において確立された腫瘍の拒絶をもたらすことを実証した（Ｙｕら、「Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第５巻：第１４１～９頁（２００４年））。膜結合ＬＩＧＨＴの強制発現が、確立された腫瘍へのＬＩＧＨＴ遺伝子のアデノウイルス送達を通じて達成された際に、同様の発見がなされた（Ｙｕら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１７９巻：第１９６０～８頁（２００７年））。

これらの発見に基づき、臨床用途についてより好適なモダリティでこの作用様式を利用する試みにおいて、Ｔａｎｇらは、改善された安定性を有し、３ｘｈｍＬＩＧＨＴと称されるヒト及びマウス交差反応性を有するホモ三量体単鎖ＬＩＧＨＴバリアントを生成した（Ｔａｎｇら、「ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ」、第２９巻：第２８５～９６頁（２０１６年））。ＥＧＦＲ特異的腫瘍標的化抗体に融合した場合、３ｘｈｍＬＩＧＨＴは、リンパ球浸潤を増加させることによってマウス及びヒト腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫を誘導し、それによって、低リンパ球浸潤を伴うモデルで抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた場合に、チェックポイントブロック免疫療法に対する抵抗性を克服することができた。Ｔａｎｇらは腫瘍を有するマウスへの腫瘍内注射時の耐容性について報告した。体重又は血清サイトカインの有意な変化が見られなかったため、有意な副作用は観察されなかった。著者らは全身投与後の耐容性について報告しなかった。

Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ－Ｐｅｒｃｉｖａｌらは、血管標的化ペプチド（vascular targeting peptide：ＶＴＰ）のＣ末端に融合したマウスＬＩＧＨＴからなる融合構築物を開発した（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ－Ｐｅｒｃｉｖａｌら、「Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１８巻：第１２０７～１７頁（２０１７年））。マウス固形腫瘍モデルでは、ＶＴＰ－ＬＩＧＨＴ構築物は腫瘍血管にホーミングし、血管の正常化を促進し、ＴＬＳを誘導した。ＶＴＰ－ＬＩＧＨＴの添加は、抗ＣＴＬＡ４及び抗ＰＤ－１抗体の組合せの活性、並びにインビボでの抗腫瘍ワクチン接種の活性を強化した。ＶＴＰ－ＬＩＧＨＴの静脈内投与後、処置マウスにおいて体重減少が観察された。

Ｇｕｒｎｅｙらは、Ｂ７－Ｈ４特異的腫瘍標的化抗体に融合したヘテロ三量体単鎖ＬＴα１β２部分からなる二重特異性融合構築物を用いた、インビトロ及びインビボでの研究を報告した（国際公開第２０１８／１１９１１８号）。重要なことに、上述の様々なアプローチで使用されるＬＩＧＨＴとは異なり、ＬＴα１β２融合構築物は、ＬＴＢＲの特異的アゴニストであり、ＨＶＥＭを活性化しない。マウス腫瘍モデルにおけるＬＴα１β２融合構築物による治療後に、免疫細胞の浸潤、誘導サイトカイン発現、及びＴＬＳの形成が観察された。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＬＴα１β２抗体融合の抗腫瘍活性は、個々の化合物の各々よりも優れていた。Ｇｕｒｎｅｙらによって使用された有効性モデルは、Ｂ７－Ｈ４を過剰発現する操作された細胞株からなる人工モデルであった。ヒト腫瘍におけるＢ７－Ｈ４レベルについてより代表的な非操作Ｂ７－Ｈ４発現レベルを有するモデルにおける活性は、不明のままである。マウスにおける耐容性に対する観察は報告されなかった。

Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎらは、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２及びＬＴＢＲを標的化する二重特異性抗体を構築して、二重特異性抗体が、２つの抗体の混合物で処理することによって達成されるよりも強化された、相乗的である、又はより広い抗腫瘍応答を誘発し得る可能性を述べた（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎら、「ＭＡｂｓ」、第１巻：第１２８～４１頁（２００９年））。ＴＲＡＩＬ－Ｒ２は、結腸、肺、肝臓、及び脳を含む正常組織において広く発現される、ＴＮＦファミリー受容体（Ｓｐｉｅｒｉｎｇｓら、「Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．」、第５２巻：第８２１～３１頁（２００４年））であるが、ヒト上皮癌細胞株の表面上でＬＴＢＲと共発現したことも見出された。二重特異性構築物は、インビトロ及びマウス腫瘍異種移植モデルにおいて、親抗体に対して強化された活性を示した。マウスにおける耐容性に対する観察は報告されなかった。

これらの研究は、腫瘍免疫療法についてＬＴＢＲを標的化する可能性を示し、活性化ＬＴＢＲシグナル伝達が免疫細胞浸潤を強化し、腫瘍環境においてＴＬＳを誘導し、潜在的にチェックポイント阻害療法に対する抵抗性を克服するのに役立つことができることを示唆している。

免疫系は、組織損傷又は自己免疫を引き起こすことなく、病原体の免疫媒介性根絶を確実にするよう厳密に調節される。全身性免疫調節療法は、平衡から外れた微妙なバランスをもたらし、また間質性肺炎、大腸炎、肝炎、甲状腺機能障害、皮膚反応、及び眼炎症などの免疫関連有害事象を引き起こすことが一般的に観察されており、特に毒性が相加的又は相乗的であり得る併用療法の状況下においては、新規免疫療法の開発に対する課題となっている。

生物におけるＬＴＢＲの広範な発現に起因して、ＴＬＳを誘導し、活性化免疫環境を作り出すことができるアゴニストＬＴＢＲ標的化薬物には、全身性免疫関連有害事象を引き起こす実質的なリスクがある。興味深いことに、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ－Ｐｅｒｃｉｖａｌらは、ＬＴＢＲ活性化化合物である、ＶＴＰ－ＬＩＧＨＴの全身投与後のマウスにおける体重減少を報告した（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ－Ｐｅｒｃｉｖａｌら、「Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１８巻：第１２０７～１７頁（２０１７年））。したがって、先行技術において仮定されるように、腫瘍においてＬＴＢＲを特異的に活性化するが他の組織においては活性化しない治療モダリティが、毒性のリスクを低下させるために、また併用療法のために使用することができる耐容性が良好な薬物を生成するために、必要とされている（Ａｌｌｅｎら、「Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ」、第８巻：第９９２０７～８頁（２０１７年）；Ｔａｎｇら、「ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１４巻：第８０９～１８頁（２０１７年））。

いくつかのグループが、様々なＬＴＢＲ標的化部分を用いて治療標的としてＬＴＢＲを調査してきたが、これまでのところ、腫瘍において特異的にＬＴＢＲ活性化を可能にする治療モダリティは記載されていない。

本明細書では、腫瘍においてリンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）を特異的に活性化することができる多重特異性結合分子、例えば二重特異性抗体が提供される。多重特異性結合分子は、ＬＴＢＲの第１の特異性、及びフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（extra-domain B：ＥＤＢ）に対する第２の特異性を有する。ＥＤＢは細胞外マトリックスの腫瘍関連抗原（tumor-associated antigen：ＴＡＡ）である。多重特異性結合分子は、ＥＤＢを発現する腫瘍においてＬＴＢＲを活性化するが、そのリガンドＬＩＧＨＴ及びＬＴα１β２よりも十分に低い程度まで、ＥＤＢの非存在下においてＬＴＢＲを活性化しないか、又はわずかに活性化するだけであり、それによって、免疫関連の望ましくない事象のリスクを低減する。前述のＬＴＢＲ活性化分子とは異なり、ＥＤＢの存在下における効率的なＬＴＢＲ活性化は、本発明の多重特異性結合分子のＥＤＢ特異的部分を介したＥＤＢ結合、及び本発明の多重特異性結合分子のＬＴＢＲ特異的部分を介したＬＴＢＲ結合の際に達成される。ＥＤＢが存在しない場合、多重特異性結合分子は、正常組織においてＬＴＢＲの活性化をもたらさない。これは、ＴＡＡとは無関係にＬＴＢＲを活性化することができ、したがって、本明細書の実施例で示すように、本発明の分子と比較してＬＴＢＲの活性化に特異的な腫瘍がはるかに少ない、天然ＬＴＢＲリガンド、例えばＬＩＧＨＴ－抗体融合に基づく、従来技術に記載された分子を超える顕著な利点である。

本明細書では、多重特異性結合分子が提供される。多重特異性結合分子は、（ｉ）リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）に特異的に結合する第１の結合ドメイン、及び（ｉｉ）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインを含むことができ、多重特異性結合分子は、ＥＤＢの結合の際にＬＴＢＲを活性化する。より具体的には、多重特異性結合分子は、多重特異性結合分子がＬＴＢＲ及びＥＤＢに同時に結合する場合、これらの標的のそれぞれの特異的結合ドメインを介してＬＴＢＲを活性化する。好ましくは、これは、ＬＴＢＲを発現する細胞及びＥＤＢを発現する細胞が存在し、腫瘍組織におけるＬＴＢＲの特異的活性化をもたらす腫瘍環境で起こる。ある特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、腫瘍特異的様式でＬＴＢＲを活性化する。多重特異性結合分子は、例えば、二重特異性抗体であり得る。ある特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、２つの抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、３つの抗原結合ドメインを含む。３つの抗原結合ドメインは、例えば、ＬＴＢＲに特異的に結合する１つの結合ドメインを含み得る。３つの抗原結合ドメインは、例えば、ＥＤＢに特異的に結合する２つの結合ドメインを含み得る。

ある特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、３つの抗原結合ドメインを含み、例えば単鎖可変ドメインの形態である追加の結合ドメインが、例えば抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に融合されている抗体（例えば、ＩｇＧフォーマットで）から構成される。

ＬＴＢＲ及び細胞外マトリックス中に存在するＴＡＡに特異的に結合する本発明の多重特異性結合分子では、細胞外マトリックス中に存在するＴＡＡは、フィブロネクチンである。好ましくは、ＴＡＡに結合する結合ドメインは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異的に結合する。

ある特定の非限定的な実施形態では、ＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＢＨＡ１０抗体若しくはＣＢＥ１１抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、例として単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＶＨ及びＶＬは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）それぞれ、配列番号８３、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）配列番号２２；又は
（ｖｉｉ）配列番号２３；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５。

ある特定の非限定的な実施形態では、ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４５アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性結合分子は、以下を含む：
（１）ＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＢＨＡ１０抗体若しくはＣＢＥ１１抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、例として単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＶＨ及びＶＬは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）それぞれ、配列番号８３、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）配列番号２２；又は
（ｖｉｉ）配列番号２３；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５；並びに、
（２）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、それぞれ配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性結合分子は、以下を含む：
（１）ＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＢＨＡ１０抗体若しくはＣＢＥ１１抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、例として単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＶＨ及びＶＬは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）それぞれ、配列番号８３、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばここで、ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）配列番号２２；又は
（ｖｉｉ）配列番号２３；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５；並びに、
（２）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性分子は、以下を含む：
（１）配列番号２２を含むＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメイン；並びに、
（２）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性分子は、以下を含む：
（１）配列番号２３を含むＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメイン；並びに、
（２）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性分子は、以下を含み：並びに、
（１）配列番号２５を含むＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメイン；
（２）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性結合分子は、以下のいずれかを含む：
（ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＣＯＶＡ１４１２１と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＣＯＶＡ１４１２２と称される多重特異性結合分子）。

ある特定の更なる非限定的な実施形態では、多重特異性結合分子は、以下のいずれかを含む：
（ｃ）（ｉ）重鎖部分（配列番号８４）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４８０と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｄ）（ｉ）重鎖部分（配列番号８４）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４８１と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｅ）（ｉ）重鎖部分（配列番号８４）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３２のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４８２と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｆ）（ｉ）重鎖部分（配列番号８４）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４８３と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｇ）（ｉ）重鎖部分（配列番号８４）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４１０７と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｈ）（ｉ）重鎖部分（配列番号８４）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３５のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４１０８と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｊ）（ｉ）重鎖部分（配列番号３）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４１３３と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｋ）（ｉ）重鎖部分（配列番号３）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４１７４と称される多重特異性結合分子）；又は
（ｌ）（ｉ）重鎖部分（配列番号８４）が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号５６のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む（ＣＯＶＡ１４５６と称される多重特異性結合分子）。

いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖、を含む。

本明細書に開示される多重特異性結合分子をコードする、１つ以上の核酸分子もまた提供される。本明細書に開示される１つ以上の核酸分子を含む、１つ以上のベクターもまた提供される。本明細書に開示される１つ以上の単離ベクターを含む、単離された宿主細胞もまた提供される。

本明細書で開示される多重特異性結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物もまた提供される。

治療を必要とする対象において癌を治療する方法もまた提供される。本方法は、本明細書に開示される多重特異性結合分子、本明細書に開示される１つ以上の核酸分子、本明細書に開示される１つ以上のベクター、又は本明細書に開示される医薬組成物を、対象に投与することを含む。

腫瘍組織におけるＬＴＢＲを活性化するための、本明細書に開示される多重特異性結合分子、本明細書に開示される１つ以上の核酸分子、本明細書に開示される１つ以上のベクター、又は本明細書に開示される医薬組成物の使用もまた提供される。

本明細書に開示される多重特異性結合分子を産生する方法であって、本明細書に開示される１つ以上の核酸分子又は本明細書に開示される１つ以上のベクターを宿主細胞中で発現させることと、多重特異性結合分子を収集することと、を含む、方法もまた提供される。

本発明の多重特異性結合分子について、第１の抗原の結合ドメインは、腫瘍（例えば、腫瘍細胞、線維芽細胞、単球など）に存在する細胞上でＬＴＢＲに結合する。第２の抗原に対する結合ドメインはＥＤＢに結合し、これは、腫瘍に存在する細胞外マトリックスの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。

ある特定の実施形態では、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子は、ＥＤＢについて２つの結合ドメインを形成する、２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）を含む。

ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、１つのＨＣのカルボキシ（Ｃ）末端又はアミノ（Ｎ）末端に融合される。ある特定の実施形態では、ＨＣに融合されたｓｃＦｖは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３８、配列番号３９、又は配列番号５６から選択されるアミノ酸配列を含む。

本明細書で開示されるような、単離された抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体のＨＣ又はその抗原結合フラグメントに融合したｓｃＦｖをコードする、単離核酸もまた提供される。本明細書で開示されるような、抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体のＨＣ及びＬＣ又はその抗原結合フラグメントをコードする、単離核酸もまた提供される。

ある特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインなどの重鎖、軽鎖、及び／又はそれらの機能的フラグメントは、ヒトであるか、又はヒト化されている。

本明細書に開示されるような、多重特異性結合分子の重鎖、軽鎖、及び／又はその機能的フラグメントをコードする核酸もまた提供される。

本明細書に開示される核酸分子を含むベクターもまた提供される。

本明細書に開示される核酸分子又はベクターを含む宿主細胞もまた提供される。

好ましい実施形態では、本発明による多重特異性結合分子、二重特異性抗体、核酸、ベクター、又は宿主細胞は、それぞれ、単離された多重特異性結合分子、単離された二重特異性抗体、単離核酸、単離されたベクター、又は単離された宿主細胞である。

本明細書に開示されるような、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物もまた提供される。

治療を必要とする対象において癌を治療する方法もまた提供される。本方法は、（ａ）癌治療を必要とする対象を特定することと、（ｂ）本発明の多重特異性結合分子を、例えば医薬組成物の形態で、それを必要とする対象に投与することと、を含み、医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、対象において癌を治療する。

ＬＴＢＲ発現細胞を活性化する方法もまた提供される。本方法は、ＬＴＢＲ発現細胞を、多重特異性結合分子と、例えば本発明の医薬組成物の形態で接触させることを含み、ＬＴＢＲ発現細胞を多重特異性結合分子又は医薬組成物と接触させることは、ＥＤＢが存在しない環境においてＬＴＢＲを発現する細胞と比較して、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ－３ｂ、ＩＣＡＭ－１、Ｉ－ＴＡＣ、ＩＰ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－３ａ、及び／又はＳＤＦ－１ａ発現の増加をもたらす。

ＥＤＢを発現する腫瘍における癌細胞の成長又は増殖を阻害する方法もまた提供される。本方法は、腫瘍微小環境内の癌細胞及び／又は細胞を、多重特異性結合分子と、例えば本発明の医薬組成物の形態で接触させることを含み、腫瘍微小環境内の癌細胞及び／又は細胞を医薬組成物と接触させることにより、癌細胞の成長又は増殖を阻害する。

本明細書に開示される医薬組成物を製造する方法もまた提供される。本方法は、本発明の単離された多重特異性結合分子、例えば二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを、医薬的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を得ることを含む。

二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を作製する方法もまた提供される。本方法は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を産生し、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を回収するための条件下において、培養することを含む。

上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。サイレンシングＦｃ変異ＩｇＧ１σを有する対照モノクローナル抗体ＩｇＧ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。サイレンシングＦｃ変異ＩｇＧ１σを有する対照モノクローナル抗体ＩｇＧ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。サイレンシングＦｃ変異ＩｇＧ１σを有する対照モノクローナル抗体ＩｇＧ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。サイレンシングＦｃ変異ＩｇＧ１σを有する対照モノクローナル抗体ＩｇＧ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。標的化アーム（Ｂ２１Ｍ又はＥＤＢｍＡｂ１）及びＦｃに融合したヒトＬＩＧＨＴを含む、１：１ノブインホール（Knob-into-Hole：ＫｉＨ）ヘテロ二量体を示す。一連の変異をヒトＬＩＧＨＴに融合したＦｃに導入して、プロテインＡへの結合を抑制し、ヘテロ二量体の精製に有利にした。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。標的化アーム（Ｂ２１Ｍ又はＥＤＢｍＡｂ１）及びＦｃに融合したヒトＬＩＧＨＴを含む、１：１ノブインホール（Knob-into-Hole：ＫｉＨ）ヘテロ二量体を示す。一連の変異をヒトＬＩＧＨＴに融合したＦｃに導入して、プロテインＡへの結合を抑制し、ヘテロ二量体の精製に有利にした。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ヒトＬＴα１β２抗体融合を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ヒトＬＴα１β２抗体融合を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ヒトＬＴα１β２抗体融合を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ヒトＬＴα１β２抗体融合を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。１：１ＫｉＨヘテロ二量体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。１：１ＫｉＨヘテロ二量体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。１：１ＫｉＨヘテロ二量体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。１：１ＫｉＨヘテロ二量体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。１：１ＫｉＨヘテロ二量体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１のより低い親和性のバリアントに由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１のより低い親和性のバリアントに由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。Ｆｃ領域にプロテインＡ変異を含まない、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１又はＢ２１Ｍを示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。Ｆｃ領域にプロテインＡ変異を含まない、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１又はＢ２１Ｍを示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するジスルフィド安定化ｓｃＦｖに融合した、２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１、又はＢ２１Ｍを示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するジスルフィド安定化ｓｃＦｖに融合した、２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１、又はＢ２１Ｍを示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するジスルフィド安定化ｓｃＦｖに融合した、２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１、又はＢ２１Ｍを示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するジスルフィド安定化ｓｃＦｖに融合した、２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１、又はＢ２１Ｍを示す。抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＭＳＬＮｍＡｂ１を示す。抗ＲＳＶ抗体Ｂ２１Ｍの重鎖及び軽鎖を有する３ｘｈｍＬＩＧＨＴ－ＦｃからなるＣＯＶＡ１４１８のサイズ排除クロマトグラム（size exclusion chromatogram：ＳＥＣ）を示す。抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖及び軽鎖を有する３ｘｈｍＬＩＧＨＴ－ＦｃからなるＣＯＶＡ１４５４のサイズ排除クロマトグラム（size exclusion chromatogram：ＳＥＣ）を示す。抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖及び軽鎖とのＣ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向）融合を担持する、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖からなるＣＯＶＡ１４１３３のサイズ排除クロマトグラム（size exclusion chromatogram：ＳＥＣ）を示す。抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の軽鎖とのＣ末端ＬＴα１β２融合を担持する、ＥＤＢｍＡｂ１重鎖からなるＣＯＶＡ１４１１３のサイズ排除クロマトグラム（size exclusion chromatogram：ＳＥＣ）を示す。抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の軽鎖とのＣ末端ＬＴα１β２融合を担持する、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖からなるＣＯＶＡ１４１１４のサイズ排除クロマトグラム（size exclusion chromatogram：ＳＥＣ）を示す。抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖及び軽鎖とのＣ末端ＬＴα１β２融合を担持する、ＥＤＢｍＡｂ１重鎖からなるＣＯＶＡ１４１１６のサイズ排除クロマトグラム（size exclusion chromatogram：ＳＥＣ）を示す。抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖及び軽鎖とのＣ末端ＬＴα１β２融合を担持する、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖からなるＣＯＶＡ１４１１７のサイズ排除クロマトグラム（size exclusion chromatogram：ＳＥＣ）を示す。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４１８及び組換えヒトＬＩＧＨＴと比較した、ＣＯＶＡ１４５４によるＬＴＢＲの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）依存的活性化。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４１８及び組換えヒトＬＩＧＨＴと比較した、ＣＯＶＡ１４５４によるＬＴＢＲのＴＡＡ非依存的活性化。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。組換えヒトＬＩＧＨＴ及び組換えヒトＬＴα１β２と比較した、ＣＯＶＡ１４１１３及びＣＯＶＡ１４１１６によるＬＴＢＲのＴＡＡ依存的活性化。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。組換えヒトＬＩＧＨＴ及び組換えヒトＬＴα１β２と比較した、ＣＯＶＡ１４１１３及びＣＯＶＡ１４１１６によるＬＴＢＲのＴＡＡ非依存的活性化。ＥＤＢｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ１又はＬＴＢＲｍＡｂ２からなる１：１ヘテロ二量体を用いた、Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４１２０、ＣＯＶＡ１４１２４、ＣＯＶＡ１４１３、ＣＯＶＡ１４４０、及び組換えヒトＬＩＧＨＴと比較した、ＣＯＶＡ１４１２１によるＬＴＢＲの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）依存的活性化。ＥＤＢｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ１又はＬＴＢＲｍＡｂ２からなる１：１ヘテロ二量体を用いた、Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４１２０、ＣＯＶＡ１４１２４、ＣＯＶＡ１４１３、ＣＯＶＡ１４４０、及び組換えヒトＬＩＧＨＴと比較した、ＣＯＶＡ１４１２１によるＬＴＢＲのＴＡＡ非依存的活性化。ＥＤＢｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ１又はＬＴＢＲｍＡｂ２からなる１：１ヘテロ二量体を用いた、Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４１２３、ＣＯＶＡ１４１２４、ＣＯＶＡ１４０２、ＣＯＶＡ１４４０、及び組換えヒトＬＩＧＨＴと比較した、ＣＯＶＡ１４１２２によるＬＴＢＲのＴＡＡ依存的活性化。ＥＤＢｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ１又はＬＴＢＲｍＡｂ２からなる１：１ヘテロ二量体を用いた、Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４１２３、ＣＯＶＡ１４１２４、ＣＯＶＡ１４０２、ＣＯＶＡ１４４０、及び組換えヒトＬＩＧＨＴと比較した、ＣＯＶＡ１４１２２によるＬＴＢＲのＴＡＡ非依存的活性化。２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＥＤＢ含有フィブロネクチンの存在下における、ＣＯＶＡ１４５６（２：１ＥＤＢｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡＢ１）によるＬＴＢＲの効率的な活性化。アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４６２（２：１Ｂ２１Ｍ×ＬＴＢＲｍＡｂ１）で観察されたＬＴＢＲ活性化なし。２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４５６又はそのアイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４６２によるＥＤＢ含有フィブロネクチンの非存在下で測定された、ＬＴＢＲ活性化なし。２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４５６によるＴＡＡ依存性ＬＴＢＲ活性化と、ＣＯＶＡ１４８２、それらのそれぞれの対照分子ＣＯＶＡ１４６２及びＣＯＶＡ１４８６、並びに組換えヒトＬＩＧＨＴとの比較。２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４８２、並びにＬＴＢＲｍＡｂ１のより低い親和性のバリアントを含有する二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１０７及びＣＯＶＡ１４１０８、並びにＣＯＶＡ１４８６によるＴＡＡ依存性ＬＴＢＲ活性化の比較。２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイの結果を実証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４８２及びＣＯＶＡ１４１３３（プロテインＡ変異を含まない構築物）、並びにそれらのそれぞれの対照分子ＣＯＶＡ１４８６及びＣＯＶＡ１４１３６によるＴＡＡ依存性ＬＴＢＲ活性化の比較。ＥＤＢ含有フィブロネクチンの存在下におけるＣＯＶＡ１４１３３（２：１ＥＤＢｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡＢ１）及びＣＯＶＡ１４１１６（２：１ＥＤＢｍＡｂ１×ＬＴα１β２）による、ＬＴＢＲの効率的な活性化。アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４１３６（２：１Ｂ２１Ｍ×ＬＴＢＲｍＡｂ１）で観察されたＬＴＢＲ活性化なし。ＣＯＶＡ１４１１７（２：１Ｂ２１Ｍ×ＬＴα１β２）によるＬＴＢＲのＴＡＡ非依存的活性化。ＣＯＶＡ１４１３３又はそのアイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４１３６によるＥＤＢ含有フィブロネクチンの非存在下で測定された、ＬＴＢＲ活性化なし。ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７によるＬＴＢＲのＴＡＡ非依存性活性化。共培養実験後のＡ３７５細胞に対するＩＣＡＭ－１のフローサイトメトリー染色の結果を示す。ＣＯＶＡ１４８２及びその対照分子ＣＯＶＡ１４８６を組換えヒトＬＩＧＨＴと比較する。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＲＡＮＴＥＳの濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＩＬ－６の濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＩＬ－８の濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＭＩＰ－３ｂの濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。更に、２：１の抗体×ＬＴα１β２融合ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７、並びにＥＤＢｍＡｂ１ＣＯＶＡ１４５２を含む。ヒトＩＰ－１０の濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。更に、２：１の抗体×ＬＴα１β２融合ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７、並びにＥＤＢｍＡｂ１ＣＯＶＡ１４５２を含む。ヒトＳＤＦ－１ａの濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。更に、２：１の抗体×ＬＴα１β２融合ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７、並びにＥＤＢｍＡｂ１ＣＯＶＡ１４５２を含む。ヒトＩＬ－１２ｐ７０の濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。更に、２：１の抗体×ＬＴα１β２融合ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７、並びにＥＤＢｍＡｂ１ＣＯＶＡ１４５２を含む。ヒトＩ－ＴＡＣの濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。更に、２：１の抗体×ＬＴα１β２融合ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７、並びにＥＤＢｍＡｂ１ＣＯＶＡ１４５２を含む。ヒトＭＩＰ－３ａの濃度。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を実証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。更に、２：１の抗体×ＬＴα１β２融合ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７、並びにＥＤＢｍＡｂ１ＣＯＶＡ１４５２を含む。ヒトＴＮＦαの濃度。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーター／ＣＨＯＫ１ＭＳＬＮ又はＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーター／Ｈ２２６共培養細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ／ＬＴＢＲ二重特異性（二重特異体）によるＬＴＢＲ活性化を示す。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーター／Ｈ２２６共培養アッセイにおけるＬＴＢＲの活性化。ＣＯＶＡ１４１４６（２：１ＭＳＬＮｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡｂ１）を、ＬＩＧＨＴ及びアイソタイプ対照２：１構築物ＣＯＶＡ１４８６と比較する。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーター／ＣＨＯＫ１ＭＳＬＮ又はＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーター／Ｈ２２６共培養細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ／ＬＴＢＲ二重特異性（二重特異体）によるＬＴＢＲ活性化を示す。Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーター／Ｈ２２６共培養アッセイにおけるＬＴＢＲの活性化時に分泌されたＲＡＮＴＥＳの濃度。ＣＯＶＡ１４１４６（２：１ＭＳＬＮｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡｂ１）を、ＬＩＧＨＴ及びアイソタイプ対照２：１構築物ＣＯＶＡ１４８６と比較する。可能なＬＴＢＲ活性化機構の概略図を示す。細胞外マトリックス中のＥＤＢ（腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））の存在下において、二重特異性抗体は、ＥＤＢへの結合を介して細胞表面上でＬＴＢＲをクラスタリングすることができる。ＬＴＢＲの活性化は走化性因子サイトカイン及びケモカインの分泌をもたらす。可能なＬＴＢＲ活性化機構の概略図を示す。細胞外マトリックス中のＥＤＢの非存在下において、ＬＴＢＲのクラスタリングは起こらない。結果として、ＬＴＢＲの活性化は起こり得ない。ＬＴＢＲ活性化によって誘導されたサイトカインへのＰＢＭＣの遊走を示す。ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較した抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３、並びにＣＯＶＡ１４１１７と比較した抗ＥＤＢ／ＬＴα１β２融合ＣＯＶＡ１４１１６で処理した共培養物（図７に示す）の上清は、トランスウェル遊走アッセイにおいてＰＢＭＣの誘引物質として作用した。共培養上清に向かって遊走したＰＢＭＣの数を計数した。これをグラフに示す。ＰＢＭＣの遊走は、ＣＯＶＡ１４１３３、ＣＯＶＡ１４１１６で刺激した共培養物からの上清に対して用量依存的様式で、わずかに小さいＣＯＶＡ１４１１７まで誘導された。非標的化対照分子ＣＯＶＡ１４１３６とインキュベートした共培養からの上清は、ＰＢＭＣの遊走を誘導しなかった。その対照ＣＯＶＡ１４１３６と比較した、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で刺激されたＨＵＶＥＣ単層への単球の接着及び遊出を示す。ＥＤＢの存在下で成長させ、５０ｎＭのＣＯＶＡ１４１３３又はＣＯＶＡ１４１３６で刺激したＨＵＶＥＣ単層を横切る単球の連続流からなる画像処理に基づくアッセイにおいて、接着性単球の数を経時的に計数した。ＣＯＶＡ１４１３６に対するＣＯＶＡ１４１３３のスチューデントＴ検定分析を実施し、次のようにマークした：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００５。その対照ＣＯＶＡ１４１３６と比較した、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で刺激されたＨＵＶＥＣ単層への単球の接着及び遊出を示す。ＥＤＢの存在下で成長させ、５０ｎＭのＣＯＶＡ１４１３３又はＣＯＶＡ１４１３６で刺激したＨＵＶＥＣ単層を横切る単球の連続流からなる画像処理に基づくアッセイにおいて、遊出単球の数を経時的に計数した。ＣＯＶＡ１４１３６に対するＣＯＶＡ１４１３３のスチューデントＴ検定分析を実施し、次のようにマークした：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００５。

背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。

特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。

本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。

本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。

本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。

本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。

本明細書で使用するとき、「被験体／対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、「哺乳動物」という用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、好ましくはヒトが挙げられる。

好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。

「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ又は３つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体及びそれをコードするポリヌクレオチド、抗ＬＴＢＲ／抗ＥＤＢ二重特異性抗体及びそれをコードするポリヌクレオチド、ＬＴＢＲポリペプチド及びそれをコードするＬＴＢＲ／ポリヌクレオチド、ＥＤＢポリペプチド及びそれをコードするＥＤＢポリヌクレオチド）に関連して、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせした場合に同じであるか、又は特定のパーセントの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ又は３つ以上の配列又はサブ配列を指す。

配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

比較のための配列の最適な位置合わせは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性位置合わせアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｊｏｉｎｔｖｅｎｔｕｒｅｂｅｔｗｅｅｎＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。

配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９～３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと位置合わせしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。上記のＴは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積位置合わせスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。

ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に０より大きい値である）及びパラメータＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に０より小さい値である）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積位置合わせスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ以上の負のスコアリング残基の位置合わせの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、位置合わせの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するもの）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝３、期待値（Ｅ）＝１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。

配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似していると見なされる。

２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１核酸によりコード化されるポリペプチドが、第２核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ以上の改変された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由により改変された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「改変された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に改変された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。

本明細書で使用するとき、「ベクター」なる用語は、別の核酸セグメントを機能的に挿入することによってそのセグメントの複製又は発現を行うことができるレプリコンのことである。

本明細書で使用するとき、「宿主細胞」なる用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞のいずれのタイプの細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクトした細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、かかるトランスフェクトされた細胞の子孫又は潜在的な子孫である。ある細胞の子孫は、例えば、後続の世代で生じ得る変異若しくは環境の影響、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みによって、親細胞との同一性を有していない場合がある。

本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる、転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。発現される多重特異性結合分子、例えば二重特異性抗体は、宿主細胞の細胞質内、細胞培養の成長培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。好ましくは、多重特異性結合分子は、産生宿主細胞から培養培地に分泌される。

本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。本用語はまた、自然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。介入の例としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識構成成分とのコンジュゲートが挙げられる。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。

本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。

「多重特異性結合分子」とは、本明細書で使用するとき、少なくとも２つの異なる分子に特異的に結合する分子を意味する。好ましくは、分子は、例として抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含むタンパク質である。本発明の多重特異性結合分子又は抗体は、ＬＴＢＲに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びフィブロネクチンのＥＤＢに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを有し、ＬＴＢＲに対する結合特異性の存在を考慮して、本明細書では「抗ＬＴＢＲ」結合分子又は抗体と称されることがある。

「結合ドメイン」とは、本明細書で使用するとき、標的分子への結合分子の特異的結合を付与する、結合分子の、例えば抗体からの機能的部分を意味する。結合ドメインの例は、標的分子に特異的結合を付与する抗体の可変領域であり、抗体の２本以上の鎖によって、例えば軽鎖の可変ドメインと対になった重鎖の可変ドメインによって、又はｓｃＦｖ分子などの単鎖によって、又は例えばラマ由来のＶＨＨなどの単一ドメイン、例えばナノボディなどによって、形成されてもよい。本発明の標的分子は、ＬＴＢＲ又はフィブロネクチン、特にフィブロネクチンのＥＤＢである。

「特異的結合」という用語は、本明細書で使用するとき、抗体が所定の抗原と、他の抗原に対するよりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約１×１０^－７Ｍ以下、例えば約１×１０^－８Ｍ以下、約１×１０^－９Ｍ以下、約１×１０^－１０Ｍ以下、約１×１０^－１１Ｍ以下、約１×１０^－１２Ｍ以下、約１×１０^－１３Ｍ以下、又は約１×１０^－１４Ｍ以下Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で所定の抗原に結合し、非特異的抗原又はエピトープ（例えば、ＢＳＡカゼイン）との結合に関しては、典型的には、そのＫ_Ｄより少なくとも１０倍低いＫ_Ｄで結合する。解離定数は標準的手順を用いて測定することができる。しかしながら、所定の抗原と特異的に結合する抗体は、他の関連抗原、例えばヒト又はサル、例えばＭａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）などの他の種からの同じ所定の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する可能性がある。

「腫瘍関連抗原」又は「ＴＡＡ」という用語は、本明細書で使用するとき、腫瘍細胞上に存在する又は腫瘍の細胞外マトリックス中に存在する抗原を意味し、この抗原は、正常細胞上又は正常組織の細胞外マトリックス中に見られる抗原と質的に異なる形態ではないが、いくつかの点で量的に異なり、例えば、腫瘍細胞上若しくは腫瘍の細胞外マトリックス中に、有意に多い量で、高密度で、異なる発現部位で存在し、及び／又は免疫系などに示差的にアクセス可能である。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞外マトリックス中に、非腫瘍細胞上又は細胞外マトリックス上の少なくとも２倍多い量、より好ましくは少なくとも５倍多い量、例えば少なくとも１０倍多い量、更により好ましくは少なくとも１００倍多い量、例えば少なくとも１０００倍多い量、最も好ましくは少なくとも１０’０００倍多い量で存在する。ＥＤＢは腫瘍組織の細胞外マトリックス中のフィブロネクチン中に存在するが、一方で典型的には、正常組織中に存在するフィブロネクチン形態では検出できない（すなわち、正常条件下で同じ組織であり、腫瘍環境下にない）。

「細胞外マトリックス」という用語は、本明細書で使用するとき、周囲細胞の構造的及び生化学的支持を提供する、コラーゲン、酵素、及び糖タンパク質などの細胞外巨大分子の三次元ネットワークの形態にある、全ての組織及び器官内に存在する非細胞構成成分を意味する。その正確な組成は組織によって異なるが、概して、プロテオグリカン、水、ミネラル、及び繊維状タンパク質で構成されている。プロテオグリカンは、グリコサミノグリカンと呼ばれるデンプン様分子の長鎖によって囲まれたタンパク質コアで構成される。細胞外マトリックス分子の２つの主なクラスは、マトリックス：プロテオグリカン、及び繊維タンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニンを含む）を構成する。

抗体
本発明は、概して、抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子、多重特異性結合分子をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、並びに多重特異性結合分子を含む組成物に関する。好ましい実施形態では、抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子は、抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの抗ＬＴＢＲ多重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子は、結合ドメインが抗体又はその機能的フラグメントとは異なる形式であるＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメインを含むことができ、例えば、これらは、ＬＴＢＲに特異的に結合する候補についてスクリーニングされた、抗ＬＴＢＲＦｙｎｏｍｅｒ、抗ＬＴＢＲアフィマー、抗ＬＴＢＲｄａｒｒｐｉｎ、及び／又は他のタンパク質足場を含んでもよい。本発明の多重特異性結合分子では、ＬＴＢＲに対して特異的な結合ドメインは、ＬＩＧＨＴ又はＬＴα１β２（ＬＴＢＲの天然リガンド）によっても、又は３ｘｈｍＬＩＧＨＴなどのその機能的フラグメント若しくは誘導体によっても提供されない。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性結合分子においてＬＴＢＲに対して特異的な結合ドメインは、ＬＴＢＲに対する抗体、好ましくはＬＴＢＲに対するアゴニスト抗体、又はｓｃＦｖなどのその機能的フラグメント若しくはその誘導体を含む。ＬＴＢＲに対するアゴニスト抗体自体は説明されており、非限定的な例は、ＢＨＡ１０（例えば、国際公開第２００４００２４３１号）及びＣＢＥ１１（例えば、国際公開第０２３０９８６号）であるか、又はあるいは、マウスの免疫化、ファージディスプレイなどの抗体生成のための公知の方法に従って生成することができる。

ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド又は「Ｆｙｎｏｍｅｒ」は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら（２００７年）、「ＪＢＣ」、第２８２巻第３１９６～３２０４頁；国際公開第２００８／０２２７５９号；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら（２００７年）、「ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ」、第２０巻（第２号）：第５７～６８頁；並びに、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ（２００９年）、「ＣｕｒｒＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ」、第１３巻：第２４５～２５５頁に記載されている。「Ｆｙｎｏｍｅｒ」という用語と本明細書で互換的に使用される「ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド」という用語は、ヒトＦｙｎＳＨ３ドメインに由来する、非免疫グロブリン由来結合ポリペプチド（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ（２００９年）、「ＣｕｒｒＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ」、第１３巻：第２４５～２５５頁に記載されているような、いわゆる足場）を指す。Ｆｙｎｏｍｅｒは約７ｋＤａの小さな球状ポリペプチドである。ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメインは、異なる標的タンパク質（国際公開第２００８／０２２７５９号、同第２０１１／０２３６８５号、同第２０１３／１３５５８８号、同第２０１４／１７００６３号、ＧｒａｂｕｌｏｖｓｋｉＤ．ら（２００７年）、「ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ」、第２８２巻第３１９６～３２０４頁、ＢｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒＪ．ら（２００７年）、「ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ」、第２０巻第５７～６８頁、及びＳｃｈｌａｔｔｅｒら（２０１２年）「ｍＡｂｓ」、第４巻（第４号）第４９７～５０頁）に高い親和性及び特異性で結合する、タンパク質（Ｆｙｎｏｍｅｒと称されるＦｙｎＳＨ３由来結合タンパク質）を操作するための足場として成功裏に使用された。

アフィマー分子は、抗体と同様の特異性及び親和性で標的分子に結合する小さなタンパク質（１２～１４ｋＤａ）である。これらの操作された非抗体結合タンパク質は、異なる用途におけるモノクローナル抗体の分子認識特性を模倣するように設計されている（例えば、Ｔｉｅｄｅら、「ｅＬｉｆｅ２０１７」、ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２４９０３）。

ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質の場合）は、典型的には非常に特異的なタンパク質結合を提示し、天然アンキリンタンパク質に由来する、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎは少なくとも３つの反復モチーフからなり、典型的には、それらの分子量は、それぞれ、４回又は５回の反復ＤＡＲＰｉｎについて、約１４ｋＤａ又は１８ｋＤａである。ＤＡＲＰｉｎ設計は、例として、Ｂｉｎｚら、２００３年、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第３３２巻第４８９～５０３頁に記載されている。

タンパク質足場などの他の結合タンパク質フォーマットは当該技術分野において既知であり、また、本発明の多重特異性結合分子のある特定の実施形態の１つ以上の結合ドメインを提供するために使用することもできる。

本発明の好ましい実施形態では、ＬＴＢＲに結合する結合ドメインは、結合の際にＬＴＢＲを活性化し、抗体、好ましくは、ＬＴＢＲに特異的に結合するアゴニスト抗体に由来する。具体的なの実施形態では、ＬＴＢＲに結合する結合ドメインは、抗体の単鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）であり、ｓｃＦｖは、任意の利用可能なフォーマット、例えば、前述及び／又は本明細書に記載の方法によって安定化することができる。

本発明は、ある特定の実施形態では、抗ＬＴＢＲ／抗ＥＤＢ二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、この抗体をコードする核酸及び発現ベクター、このベクターを含有する組換え細胞、並びにこの二重特異性抗体を含む組成物に関する。多重特異性結合分子及び／又は抗体を作製する方法、並びに癌を含む疾患を治療するための多重特異性結合分子及び／又は抗体を用いる方法もまた提供される。本明細書に開示される多重特異性結合分子及び／又は抗体は、ＬＴＢＲ及びＥＤＢに対する特異的結合、ＬＴＢＲ及びＥＤＢに対する高い特異性、並びに／又は単独で若しくは他の抗癌療法と組み合わせて投与された場合に癌を治療又は予防する能力、のうち１つ以上を含むがこれらに限定されない、１つ以上の望ましい機能的特性を保有する。

本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、広義で使用され、免疫グロブリン、又はモノクローナル又はポリクローナルである、ヒト、ヒト化、複合、及びキメラ抗体、及び抗原結合ドメインを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。全般的には、抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、公知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。したがって、本発明の抗体は、５つの主要なクラス又は対応する下位クラスのいずれかのものであることができる。本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であることが好ましい。脊椎動物種の抗体軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちκ及びλのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ラット又はヒト抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重及び軽定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含有し、これらのそれぞれは３つのドメイン（すなわち相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、代替的にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と称される。

本明細書で使用するとき、「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＬＴＢＲに特異的に結合する単離二重特異性抗体は、ＬＴＢＲに結合しない抗体を実質的に含まず；ＬＴＢＲ及び／又はＥＤＢに特異的に結合する単離二重特異性抗体は、ＬＴＢＲ及び／又はＥＤＢに結合しない二重特異性抗体を実質的に含まない）。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。

本明細書で使用するとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る自然発生変異を除いて同一である。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、又は組み換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、抗体をコードする核酸配列を発現する組換え宿主細胞によって産生される。そのような組換え宿主細胞は、例として、親細胞、例えばＣＨＯ細胞への核酸配列のトランスフェクションによって得ることができる。組換え宿主細胞は、宿主細胞内の抗体の発現に寄与する条件下において培養することができ、抗体は、宿主細胞、培養培地、又はその両方から単離することができる。

ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、抗体、又はその１つ以上の抗原結合フラグメントを含む。本明細書で使用するとき、「抗原結合フラグメント」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ又は２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体又は親抗体フラグメントが結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のＦｄフラグメントを含む。他の特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントはＦａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントとしては、ヘテロ二量体形成させる相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、組換えＩｇＧ様二重標的化分子（この分子の２つの側面はそれぞれ、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部を含む）、ＩｇＧ融合分子（全長ＩｇＧ抗体が、余分のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合されている）、Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化されたダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合されている）、Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂフラグメントが一緒に融合されている）、ＳｃＦｖ及びダイアボディベース及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに融合されているか、又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。いくつかの実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子としては、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（ＴｒｉｏｎＰｈａｒｍａ／ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＢｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的に調整されたもの（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ストランドを交換し操作したドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、又はＤｕｏＢｏｄｙ（ＧｅｎｍａｂＡ／Ｓ、例えば、Ｌａｂｒｉｊｎら、２０１３年、ＰＮＡＳ１１０：５１４５～５１５０参照）が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、「ステープル処理された単鎖Ｆｖ」又は「ｓｐＦｖ」を含み、ＶＨとリンカーとの間又はＶＬとリンカーとの間に１つ以上のジスルフィド結合を含むｓｃＦｖを指す。典型的には、ｓｐＦｖは、ＶＨとリンカーとの間の１つのジスルフィド結合、ＶＬとリンカーとの間の１つのジスルフィド結合、又はＶＨとリンカーとの間及びＶＬとリンカーとの間の２つのジスルフィド結合を含み得る。ＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合を含むｓｃＦｖ分子は、「ｓｐＦｖ」から除外される。

本明細書で使用するとき、「単鎖抗体」という用語は、例えば約１５～約２０個のアミノ酸の短いペプチドによって接続される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野において従来既知の単鎖抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか、又は重鎖可変領域のみを含む、この分野において従来既知の単一ドメイン抗体を指す。

ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、プロテインＡへの結合を抑制するＦｃに１つ以上の変異を有する抗体を含む。そのような変異は、ヘテロ二量体の精製を促進し、例として、国際公開第２０１０１５１７９２号に記載されている。

本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において既知の任意の技術を用いて作製される、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、インタクトな若しくは完全長の抗体、その抗原結合フラグメント、並びに／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。

本明細書で使用するとき、用語「ヒト化抗体」とは、抗体の抗原結合特性が保持されるが、人体における抗原の抗原性が低下するように、改変によりヒト抗体への配列相同性を増加させた非ヒト抗体を意味する。

本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ又は３つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に対応する。

本明細書で使用するとき、用語「多重特異性抗体」は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しないか、又は実質的に重複しない。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、若しくは第５の免疫グロブリン可変ドメイン、又は更により多くの免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、又は四重特異性抗体分子である。

本明細書で使用するとき、「二重特異性抗体」という用語は、２つ以下のエピトープ、好ましくは２つ以下の抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープ（例えば、ＬＴＢＲ抗原上のエピトープ）に対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン、及び第２のエピトープ（例えば、ＥＤＢ上のエピトープ）に対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメインによって特徴付けられる。一実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する結合ドメインを形成する第１の重鎖可変ドメイン及び第１の軽鎖可変ドメインと、第２のエピトープに対する結合特異性を有する結合ドメインを形成する第２の重鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインと、を含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントとを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントとを含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。本発明の好ましい実施形態では、第１のエピトープはＬＴＢＲ上に位置し、第２のエピトープはフィブロネクチン上、特に、そのＥＤＢ上に位置する。

ある特定の実施形態では、本発明による多重特異性結合分子は、抗体、例えば抗体に融合されたｓｃＦｖを有するＩｇＧを含む。ｓｃＦｖは、ある特定の実施形態では、ＬＴＢＲに対する結合特異性を有してもよい。抗体の両方のアーム（可変領域を含む）は、ある特定の実施形態では、フィブロネクチンのＥＤＢに結合してもよい。ｓｃＦｖは、抗体の軽鎖又は抗体の重鎖に融合されてもよく、重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に融合されてもよい。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖のＮ末端に融合される。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖のＣ末端に融合される。例えば、ＬＴＢＲに特異的に結合する一方のアーム及びＥＤＢに特異的に結合する他方のアームを含む二重特異性抗体が、ＥＤＢに特異的に結合するｓｃＦｖを抗体の鎖の１つに融合することなどによって補充される、他の形態もまた可能であることは、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。

本明細書で使用するとき、「ＬＴＢＲ」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであるアポトーシス及びサイトカイン放出に関与するリンフォトキシンに対する細胞表面受容体であるポリペプチドを指す。ＬＴＢＲはまた、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー３（tumor necrosis factor receptor superfamily member 3、ＴＮＦＲＳＦ３）」と称され得る。ＬＴＢＲは、上皮及び骨髄系列の細胞を含む多くの細胞型の表面上に発現される。ＬＴＢＲは、リンフォトキシン膜形態（リンフォトキシン－アルファ及びリンフォトキシン－ベータの複合体）に特異的に結合することができる。ＬＴＢＲの活性化は、ＴＲＡＦ３及びＴＲＡＦ５を介してアポトーシスを誘発することができ、インターロイキン８の放出につながり得る。記載されない限り、好ましくは、ＬＴＢＲはヒトＬＴＢＲである。ヒトＬＴＢＲアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ３６９４１により提供される。

「ＥＤＢ」又は「エクストラドメインＢ」という用語は、フィブロネクチンプレｍＲＮＡのスプライシングパターンに基づいてフィブロネクチン分子に含まれ得るフィブロネクチンのドメインを指す。エクストラドメインＢは、９１個のアミノ酸残基を含む完全なフィブロネクチン（fibronectin、ＦＮ）ＩＩＩ型反復である。一般に、ＥＤＢは、正常な成人組織では検出不能であるが、細胞外マトリックス中の胎児組織及び腫瘍組織においてより大きな発現を示し、血管新生プロセス中に新血管系の周りに蓄積するため、ＥＤＢが可能性のあるマーカー及び血管新生の標的となる。記載されない限り、好ましくは、ＥＤＢはヒトＥＤＢである。フィブロネクチンアイソフォームアミノ酸配列を含有するヒトＥＤＢは、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０２７５１により提供される。

「フィブロネクチン」という用語は、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質であるポリペプチドを指す。フィブロネクチンは、インテグリンと称される膜貫通受容体タンパク質に結合し得る。フィブロネクチンはまた、コラーゲン、フィブリン、及びヘパラン硫酸プロテオグリカンなどの他の細胞外マトリックスタンパク質に結合し得る。フィブロネクチンは、一対のジスルフィド結合によって連結された２つのほぼ同一の単量体からなるタンパク質二量体として存在し得る。フィブロネクチンは単一の遺伝子から産生されるが、フィブロネクチンプレｍＲＮＡ分子の代替スプライシングにより、フィブロネクチンのいくつかのアイソフォームが創出され、そのうちの１つがＥＤＢフィブロネクチンである。フィブロネクチンは、細胞接着、成長、遊走、及び分化において役割を果たすことができ、創傷治癒及び胚発生などのプロセスにとって重要であり得る。ヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は、エクストラドメインＢを含有するＵｎｉＰｒｏｔ数Ｐ０２７５１、並びにＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２６３３３７（アイソフォームＢ）、ＮＰ＿００１２６３３３８（アイソフォームｃ）、ＮＰ＿００１２６３３３９（アイソフォームｄ）、ＮＰ＿００１２６３３４０（アイソフォームｅ）、及びＮＰ＿００１２６３３４１（アイソフォームｆ）、ＮＰ＿００１２９３０５８（アイソフォーム８）、ＮＰ＿００１２９３０５９（アイソフォーム９）、ＮＰ＿００１２９３０６０（アイソフォーム１０）、ＮＰ＿００１２９３０６１（アイソフォーム１１）、及びＮＰ＿００２０１７（アイソフォーム３）により提供される。

本明細書で使用するとき、「ＬＴＢＲに特異的に結合する」抗体又は結合分子は、ＬＴＢＲ、好ましくはヒトＬＴＢＲに、ＫＤが１×１０^－７Ｍ以下、好ましくは１×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、５×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１０Ｍ以下で結合する、その抗原結合ドメインを含む抗体又は分子を指す。「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムのバイオセンサシステムを使用することなどによって、又はＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤインターフェロメトリー技術を使用することによって、求めることができる。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性結合分子においてＬＴＢＲに対して特異的な結合ドメインは、ＬＴＢＲに対する抗体、好ましくはＬＴＢＲに対するアゴニスト抗体、又はｓｃＦｖなどのその機能的フラグメント若しくはその誘導体を含む。本明細書で使用するとき、「ＬＴＢＲに対するアゴニスト抗体」とは、ＬＴＢＲに結合し、直接又は高次クラスタリングの際のいずれかで、例えば固体支持体への固定、架橋抗体の使用などにより、下流のシグナル伝達を誘導することができる、抗体である。ＬＴＢＲに対するアゴニスト抗体自体は説明されており、非限定的な例は、ＢＨＡ１０（例えば、国際公開第２００４００２４３１号）、ＣＢＥ１１（例えば、国際公開第０２３０９８６号）、ＲＥＡ４１２（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃから市販）、３１Ｇ４Ｄ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販）、及び７１３１９／ＭＡＢ６２９（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから市販）であるか、又はあるいは、マウスの免疫化、ファージディスプレイなどの抗体生成の既知の方法に従って生成することができる。

本明細書で使用するとき、「ＥＤＢに特異的に結合する」抗原結合ドメイン又は抗原結合フラグメントは、ＫＤが１×１０^－７Ｍ以下、好ましくは１×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、５×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１０Ｍ以下で、ＥＤＢに結合する（例えば、ＥＤＢフィブロネクチンの形成における）抗原結合ドメイン又は抗原結合フラグメントを指す。

好ましい実施形態では、本発明の多重特異性結合分子においてＥＤＢに対して特異的な結合ドメインは、ＥＤＢに対する抗体、又はｓｃＦｖなどのその機能的フラグメント若しくはその誘導体を含む。ＥＤＢに対するアゴニスト抗体自体は説明されており、非限定的な例は、Ｌ１９（例えば、国際公開第９７４５５４４号）、及びＥＤ－Ｂ若しくは隣接ドメイン（例えば、Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」、第６８巻第３９７～４０５頁（１９９６年））に結合する他の抗体であるか、又はあるいは、マウスの免疫化、ファージディスプレイなどの抗体生成のための公知の方法に従って生成することができる。

抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高い。

本発明の特定の態様によれば、多重特異性結合分子が本明細書で提供される。多重特異性結合分子は、（ｉ）リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）に特異的に結合する第１の結合ドメイン、及び（ｉｉ）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインを含み、多重特異性結合分子は、ＥＤＢの結合の際にＬＴＢＲを活性化する。

ある特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、腫瘍特異的様式でＬＴＢＲを活性化する。腫瘍特異的様式でＬＴＢＲを活性化することは、本明細書で使用するとき、両方が細胞の表面上又は細胞外マトリックス中のいずれかで腫瘍微小環境中に存在するＬＴＢＲ及びＥＤＢへの多重特異性結合分子の同時結合の際に、ＬＴＢＲが活性化されて、標準的及び／又は非標準的ＮＦ－ｋＢ経路を介してシグナル伝達を引き起こすことを意味する。ＮＦ－ｋＢ経路の活性化は、炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインの分泌、並びに細胞の表面上の接着分子の発現を介した、炎症誘発性腫瘍微小環境の確立につながる可能性がある。多重特異性結合分子の同時結合は、腫瘍におけるＬＴＢＲの活性化をもたらす。ＥＤＢが、正常組織、すなわち正常細胞中に存在しないか、又は正常組織に隣接する細胞外マトリックス中に存在しない場合、多重特異性結合分子は正常組織上でＬＴＢＲにのみ結合することができ、ＬＴＢＲの活性化をもたらさない。これは、ＴＡＡとは無関係にＬＴＢＲを活性化することができ、したがって、本明細書の実施例で示すように、本発明の分子と比較してＬＴＢＲの活性化に特異的な腫瘍がはるかに少ない、天然ＬＴＢＲリガンド、例えばＬＩＧＨＴ抗体融合に基づく、従来技術に記載された分子を超える顕著な利点である。

ある特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、２つの結合ドメイン、例として２つの抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体を含み、一方はＬＴＢＲに結合し、他方はＥＤＢに結合する。好ましい実施形態では、多重特異性結合分子は、３つ以上の抗原結合ドメイン、例としてＬＴＢＲへの１つの結合及びＥＤＢへの２つの結合を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、３つの結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、３つの結合ドメインは全て異なり、３つの異なる抗原に結合する。ある特定の好ましい実施形態では、３つの抗原結合ドメインは、第１の抗原に結合する１つの結合ドメインと、第２の抗原に結合する２つの結合ドメインと、を含む。この実施形態では、３つの抗原結合ドメインは、２：１の化学量論で存在する。３つの抗原結合ドメインは、例えば、ＬＴＢＲ発現細胞上でＬＴＢＲに特異的に結合する１つの第１の結合ドメインを含み得る。３つの抗原結合ドメインは、例えば、ＥＤＢに特異的に結合する２つの第２の結合ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、２つの第２の結合ドメインは、ＥＤＢに対する同一の結合特異性を有し、例えば、２つの第２の結合ドメインは、同一であってもよい。ＥＤＢに対して特異的な２つ以上の結合ドメインを有する本発明の多重特異性結合分子は、ＥＤＢに特異的な１つの結合ドメインのみを有する本発明の多重特異性結合分子よりも更に有利な特性を有することが本明細書で示される。ある特定の実施形態では、ＬＴＢＲは、ＬＴＢＲ及びＥＤＢの結合の際に活性化される（ＥＤＢは腫瘍組織内の細胞外マトリックス中に存在するフィブロネクチンの一部である）。

特定の態様によれば、単離された抗リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが本明細書で提供される。ある特定の非限定的な実施形態では、ＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、アゴニスト抗ＬＴＢＲ抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、例として単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＶＨ及びＶＬは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）それぞれ、配列番号８３、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む：又は
（ｖｉ）配列番号２２；又は
（ｖｉｉ）配列番号２３；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５。

ある特定の非限定的な実施形態では、ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＥＤＢに結合する抗体又はそのような抗体のフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４５アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性結合分子は、以下を含む：
（１）ＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＢＨＡ１０抗体若しくはＣＢＥ１１抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、例として単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＶＨ及びＶＬは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）それぞれ、配列番号８３、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）配列番号２２；又は
（ｖｉｉ）配列番号２３；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５；並びに、
（２）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；例えば、ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、多重特異性分子は、以下を含む：
（１）配列番号２５を含むＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメイン；並びに、
（２）ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインは、例として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｌ１９抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体を含み、ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該抗体又はそのフラグメントは、以下のいずれかを含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、二重特異性）分子は、ＥＤＢの非存在下で（同一の条件下において）誘導されるＮＦ－κＢシグナル伝達よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍など、例えば少なくとも４倍大きい、ＥＤＢの存在下でのＮＦ－κＢシグナル伝達を誘導する。場合によっては、アッセイは、ＮＦ－κＢルシフェラーゼ・レポーター・アッセイである。ＮＦ－κＢルシフェラーゼ・レポーター・アッセイは、実施例２のプロトコルを用いて実施されてもよい。

いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、二重特異性）分子は、ＥＤＢの非存在下で（同一の条件下において）誘導されるＩＣＡＭ－１発現よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍など、例えば少なくとも４倍大きい、ＥＤＢの存在下での細胞表面のＩＣＡＭ－１発現を誘導する。場合によっては、アッセイは、Ａ３７５／ＷＩ３８Ａ亜系統２ＲＡ共培養細胞アッセイなどの、インビトロでのＬＴＢＲ活性化アッセイである。Ａ３７５／ＷＩ３８Ａ亜系統２ＲＡ共培養細胞アッセイは、実施例３のプロトコルを用いて実施されてもよい。

特定の態様によれば、重鎖及び軽鎖は、ヒト化されている。

いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明において記載されるものなどの、制御されたＦａｂアーム交換により得られるダイアボディ、クロスボディ、ｓｃＦｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ｓｐＦｖ、又は二重特異性抗体を含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体には、ヘテロ二量体形成を強制する相補性ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、組換えＩｇＧ様二重標的化分子（この分子の２つの側面はそれぞれ、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部を含む）、ＩｇＧ融合分子（全長ＩｇＧ抗体が、余分のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合されている）、Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化されたダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合されている）、Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂフラグメントが一緒に融合されている）、ＳｃＦｖ及びダイアボディベース及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに融合されているか、又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子としては、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（ＴｒｉｏｎＰｈａｒｍａ／ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＢｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的に調整されたもの（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ストランドを交換し操作したドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、又はＤｕｏＢｏｄｙ（ＧｅｎｍａｂＡ／Ｓ）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、組換えＩｇＧ様二重標的化分子としては、ＤｕａｌＴａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄＭａｂｓ（ＫａｒｍａｎｏｓＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、又はＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ融合分子としては、ＤｕａｌＶａｒｉａｂｌｅＤｏｍａｉｎ（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／ＥｌｉＬｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ）、又はＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合分子には、ＳｃＦｖ／ＦｃＦｕｓｉｏｎｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（ＥｍｅｒｇｅｎｔＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、ＤｕａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｔａｒｇｅｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、又はＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）_２－Ｆａｂ（ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｎｔｉｂｏｄｙＭｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体としては、Ｆ（ａｂ）_２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－ＡｃｔｉｏｎｏｒＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、ＢｉｖａｌｅｎｔＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、又はＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ－、ダイアボディベース及びドメイン抗体としては、ＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃＴＣｅｌｌＥｎｇａｇｅｒ（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＤｕａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｔａｒｇｅｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎＤｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ－ｌｉｋｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎＳｃＦｖＦｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、又はＣＯＭＢＯＤＹ（ＥｐｉｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈ）、二重標的化ナノボディ（dual targeting nanobody）（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的化重鎖単一ドメイン抗体（dual targeting heavy chain only domain antibody）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の完全長二重特異性抗体は、例えば、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を用い、インビトロにおいて、無細胞環境下又は共発現使用下のいずれかで、別個の特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に有利になるように各半分子において重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することにより生成することができる。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。単一特異性親抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は、低減される。親単一特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離－会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形成よりヘテロ二量体形成を有利にするように操作され得る。得られる生成物は、各々別個のエピトープ、すなわち、ＬＴＢＲにおけるエピトープ及びフィブロネクチンのＥＤＢにおけるエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。

本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体形成」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。

本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体形成」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。

「ノブインホール（knob-in-hole）」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に述べると、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するように、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、又はＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（Ｋａｂａｔナンバリングを用いる、第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。

他の戦略、例えば、１つのＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体形成の促進が、例として米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用され得る。他の戦略では、ヘテロ二量体形成は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５ＡＹ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６ＶＫ４０９ＦＹ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５ＡＹ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）により促進され得る。

上記の方法に加えて、本発明の二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法に従って、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、無細胞環境でインビトロにおいて生成することができる。この方法において、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおいてある特定の置換を有するように操作されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において共にインキュベーションされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びベータ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートが使用され得る。

本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体などの多重特異性結合分子の免疫エフェクター特性は、例えば当業者に既知の技術によりＦｃを修飾することによって、修飾、好ましくはサイレンシングさせることができる。例えば、Ｆｃエフェクター機能、例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等が、これらの活性を担うＦｃ中の残基を改変することにより提供され、かつ／又は制御され得る。例えば、次を参照されたい：Ｎｏｓｅら、「ＰＮＡＳ」（１９８３年）中のＮ２９７変異；Ｘｕら、「ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．」、第２００巻（第１号）：第１６～２６頁）（２０００年）中のＬＡＬＡ変異；及び、Ｗｉｌｓｏｎら、「ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ」、第１９巻（第１号）：第１０１～１１３頁（２０１１年）中のＤＡＮＡ変異；又は、例えば２６５位のアスパラギン酸（Ｄ）、２９７位のアスパラギン（Ｎ）、及び３２９位の及びプロリン（Ｐ）の変異。ここでナンバリングは、国際公開第２０１９／０６８６３２号で詳述されるように、いわゆるＤＡＮＡＰＡ変異体を得るように、例えば各々がアラニン（Ａ）に対して、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによって示される。

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現している非特異的細胞傷害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続けて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応を指す。

ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、キメラである二重特異性抗体を含む。

ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、ヒト又はヒト化された二重特異性抗体を含む。

別の全般的な態様では、本発明は、本発明の多重特異性結合分子、例えば二重特異性抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードする、１つ以上の単離核酸に関する。非限定的な例として、二重特異性抗体の重鎖は１つの核酸によってコードすることができ、軽鎖は第２の核酸によってコードすることができる。別の例では、二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖は、単一の核酸分子上にコードされてもよい。遺伝コードの縮重を考慮して、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができることが、当業者には理解されよう。したがって、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、本発明のモノクローナル抗体及び／又は二重特異性抗体をコードする核酸配列を変更できることが当業者には理解されるであろう。加えて、本発明の１つ以上の核酸は、単離核酸であり得る。したがって、本発明は、本発明の分子をコードする、任意の核酸分子又は核酸分子の組合せに関する。

別の全般的な態様では、本発明は、本発明の１つ以上の核酸を含む、１つ以上のベクターに関する。本開示を鑑みると、当業者に知られている任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えばプラスミドなどの組み換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び／又は複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において知られており、細胞内で抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するために、本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成法を使用して、本発明の実施形態に従った組み換え発現ベクターを生成することができる。このような技術は、本開示の観点から、当業者に周知である。

別の全般的な態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子をコードする１つ以上の核酸を含む、１つ以上のベクターを含む宿主細胞に関する。本開示を考慮すると、当業者に知られている任意の宿主細胞を、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子の組換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１若しくはＢＬ２１細胞（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ抗体の発現の場合）、ＣＨＯ－ＤＧ４４若しくはＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はＨＥＫ２９３細胞（例えば、完全長ＩｇＧ抗体の発現の場合）である。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、組換え核酸が効果的に発現するように宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれ得る、化学的トランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞に形質転換される。

別の全般的な態様では、本発明は、本明細書に開示される二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を産生する方法に関する。本方法は、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子をコードする核酸を含む細胞を、本明細書に開示される二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を産生する条件下で培養することと、細胞又は細胞培養物（例えば、上清）から二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を回収することと、を含む。発現した二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を細胞から収集し、当該技術分野において公知の従来の技術に従って、また本明細書に記載の通り精製することができる。

医薬組成物
別の全般的な態様では、本発明は、本発明の多重特異性結合分子（例えば、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント）と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。本明細書で使用するとき、「医薬組成物」という用語は、医薬的に許容される担体と一緒に本発明の多重特異性結合分子を含む生成物を意味する。本発明の多重特異性結合分子（例えば、二重特異性抗体）及びそれを含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための医薬の製造においても有用である。

本明細書で使用するとき、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野において周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するとき、用語「医薬的に許容される担体」は、本発明による組成物の効果にも本発明による組成物の生物活性にも干渉しない無毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、抗体の医薬組成物での使用に好適ないずれの薬学的に許容される担体も、本明細書で使用され得る。

医薬的に許容される担体を有する医薬的活性成分の製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ（例えば２１ｓｔｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）及びそれ以降の任意の改訂版）にあるように、当該技術分野において既知である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１つ以上の医薬上許容できる担体が、本発明の医薬組成物の製剤化において使用され得る。

本発明の一実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ゲルなどを含んでいてよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０重量％の水、又は少なくとも６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、又は少なくとも９５重量％の水を含む。

一実施形態では、医薬組成物は、例えば注射デバイス（例えば、注射器又は注入ポンプ）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射は、例えば、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、硝子体内に、又は静脈内に送達され得る。

別の一実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用することができるか、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／若しくは希釈剤を加える、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤及び／又はコーティング錠剤などの錠剤、並びにカプセル剤（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ、又は再構成用の粉末の形態であってもよい。

剤形は即時放出であってもよく、その場合、水溶性若しくは水分散性担体を含んでいてよく、又は剤形は遅延放出、持続放出、若しくは調節放出であってもよく、その場合、胃腸管若しくは皮下における剤形の溶解速度を制御する非水溶性ポリマーを含んでいてよい。

他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内に、口内に、又は舌下に送達され得る。

水性製剤のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のｐＨは約７．０～約９．５である。本発明の別の一実施形態では、製剤のｐＨは約３．０～約７．０である。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、又はトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、及びこれらの混合物が挙げられる。緩衝剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な緩衝剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、防腐剤を含む。防腐剤の非限定的な例としては、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４－ヒドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、エチル４－ヒドロキシベンゾエート、イミド尿素、メチル４－ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２－フェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、プロピル４－ヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な防腐剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。等張剤の非限定的な例としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、又はスレオニンなど）、アルジトール（グリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，３－プロパンジオール、又は１，３－ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ－ＨＰＣＤ、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、単糖類、二糖類、若しくは多糖類、又は水溶性グルカンを含み得る。等張剤の別の例は、糖アルコールであり、用語「糖アルコール」は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有するＣ（４～８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、又はアラビトールが挙げられる。等張剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な等張剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、キレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なキレート剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１種類以上の凝集阻害剤、１種類以上の酸化阻害剤、１種類以上の界面活性剤、及び／又は、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含み、当該安定剤は、カルボキシ－／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ、及びＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質（例えばモノチオグリセロール）、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な安定剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１種以上の界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分から構成される任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双性界面活性剤からなる群から選択され得る。界面活性剤は、個々に又は全体に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な界面活性剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個々に又は全体に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

別の全般的な態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を含む、医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントなどの多重特異性結合分子を医薬的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を得ることを含む、方法に関する。

使用方法
別の全般的な態様では、本発明は、腫瘍（例えば、腫瘍細胞、線維芽細胞、単球など）に存在する細胞上のＬＴＢＲを標的化する方法に関し、この方法は、腫瘍中に存在する細胞を、本発明の多重特異性結合分子又は医薬組成物に曝露することを含む。

ＬＴＢＲ及び／又はＥＤＢに結合する多重特異性結合分子（例えば、二重特異性抗体及びその抗原結合フラグメント）の機能的活性は、当該技術分野において既知の方法により、また本明細書に記載される通りに特性評価することができる。ＬＴＢＲ及び／又はＥＤＢに結合する多重特異性結合分子を特性評価するための方法としては、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、及び／又はＯｃｔｅｔＲｅｄ分析を含む親和性及び特異性アッセイ；ＦＡＣＳによる癌細胞及び他の細胞上でのＬＴＢＲへの多重特異性結合分子の結合を検出するための結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、ＬＴＢＲ及び／又はＥＤＢに結合する多重特異性結合分子を特性評価するための方法としては、以下に記載されるものが挙げられる。

別の全般的な態様では、本発明は、炎症誘発性腫瘍微小環境を確立する方法に関する。本方法は、腫瘍微小環境中のＬＴＢＲ発現細胞を本発明の多重特異性結合分子と接触させることを含み、ＬＴＢＲ発現細胞を多重特異性結合分子と接触させることは、炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインの分泌、並びに細胞表面上の接着分子の発現をもたらす。

別の全般的な態様では、本発明は、フィブロネクチンのＬＴＢＲ及びＥＤＢに特異的に結合する本発明の多重特異性結合分子（例えば、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント）、又は本明細書に開示される医薬組成物を、対象に投与することを含む、それを必要とする対象において癌を治療する方法に関する。癌は、好ましくは、ＥＤＢ発現癌である。癌は、例えば、ＬＴＢＲ発現癌であり得る。癌は、例えば、前立腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆管細胞癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphoma、ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、及び他の液体腫瘍からなる群から選択することができる。

本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、有効量の抗ＬＴＢＲ多重特異性結合分子（例えば、抗ＬＴＢＲ／抗ＥＤＢ二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント）を含む。本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、対象において所望の生物学的又は医薬的応答を惹起する活性成分又は構成成分の量を指す。

特定の実施形態によれば、有効量は、次の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療の量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態又はそれに関連する症状の重症度を軽減又は改善すること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進行又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性結合分子の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。

有効量又は薬用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療薬用量は、安全性及び有効性を最適化するために、任意選択的に漸増される。

特定の実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への想定される投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与、皮下投与、又は筋肉内投与に好適であるように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、局所、経口、又は非経口などの様々な経路によって対象に投与され得る。非経口送達の方法としては、動脈内（組織に直接）、髄内、髄腔内、脳室内、腹腔内、又は鼻腔内投与が挙げられる。

本明細書で使用するとき、用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は全て、癌に関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善又は回復を指し、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」はまた、疾患、障害、又は病態を退縮させる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、腫瘍若しくはより好ましくは癌などの疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ以上の症状の緩和、進行若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。

特定の実施形態によれば、癌の治療に使用される組成物が提供される。癌治療のために、組成物を、化学療法、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ３８抗体、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルス、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、他の免疫癌薬、抗血管新生剤、放射線療法、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、標的療法、又は他の抗癌剤が挙げられるがこれらに限定されない別の治療と併用することができる。

本明細書で使用するとき、対象への２種類以上の治療薬の投与との関連において用いられる用語「併用」とは、２種類以上の治療薬の使用を指す。用語「併用」の使用は、治療薬を対象に投与する順序について限定しない。例えば、第１治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。

実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。

実施形態１は、多重特異性結合分子であって、以下：
（ｉ）リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）に特異的に結合する第１の結合ドメインと、
（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異的に結合する第２の結合ドメインと、を含み、
多重特異性結合分子が、ＥＤＢの結合の際にＬＴＢＲを活性化する、多重特異性結合分子である。

実施形態２は、多重特異性結合分子が、腫瘍特異的様式でＬＴＢＲを活性化する、実施形態１に記載の多重特異性結合分子である。

実施形態３は、多重特異性結合分子が、二重特異性抗体である、実施形態１又は２に記載の多重特異性結合分子である。

実施形態４は、多重特異性結合分子が、２つの抗原結合ドメインを含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子である。

実施形態５は、多重特異性結合分子が、３つの抗原結合ドメインを含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子である。

実施形態６は、３つの抗原結合ドメインが、ＬＴＢＲに特異的に結合する１つの結合ドメインを含む、実施形態５に記載の多重特異性結合分子である。

実施形態７は、３つの抗原結合ドメインが、ＥＤＢに特異的に結合する２つの結合ドメインを含む、実施形態５又は６に記載の多重特異性結合分子である。

実施形態８は、ＬＴＢＲに特異的に結合する結合ドメインが、抗体の単鎖可変ドメインを含む、実施形態５～７のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子である。

実施形態９は、実施形態１～８のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子であって、ＬＴＢＲに特異的に結合する第１の結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＶＨ及びＶＬが、以下（（ｉ）～（ｖｉｉｉ））：
（ｉ）それぞれ、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）それぞれ、配列番号８３、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４３のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む：又は
（ｖｉ）配列番号２２；又は
（ｖｉｉ）配列番号２３；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５
のいずれか１つ以上を含む、多重特異性結合分子である。

実施形態１０は、実施形態１～９のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子であって、ＥＤＢに特異的に結合する第２の結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＶＨ及びＶＬが、以下（（ｉ）～（ｉｉ））：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えばＶＨは、配列番号４５アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

実施形態１１は、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子であって、［（ａ）～（ｌ）］：
（ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖のいずれか１つ以上を含む、多重特異性結合分子である。

実施形態１２は、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子であって、以下：
（ｃ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｄ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｅ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３２のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｆ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｇ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｈ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３５のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｊ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｋ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｌ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号５６のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖のいずれかを含む、多重特異性結合分子である。

実施形態１３は、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子であって、（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、多重特異性結合分子である。

実施形態１４は、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子をコードする、１つ以上の核酸分子である。

実施形態１５は、実施形態１４に記載の１つ以上の核酸分子を含む、１つ以上のベクターである。

実施形態１６は、実施形態１５に記載の１つ以上のベクターを含む、単離された宿主細胞である。

実施形態１７は、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。

実施形態１８は、治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子、実施形態１５に記載の１つ以上の核酸分子、実施形態１６に記載の１つ以上のベクター、又は実施形態１７に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、方法である。

実施形態１９は、腫瘍組織におけるＬＴＢＲを活性化するための、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子、実施形態１５に記載の１つ以上の核酸分子、実施形態１６に記載の１つ以上のベクター、又は実施形態１７に記載の医薬組成物の、使用である。

実施形態２０は、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子を産生する方法であって、実施形態１４に記載の１つ以上の核酸分子又は実施形態１５に記載の１つ以上のベクターを宿主細胞中で発現させることと、多重特異性結合分子を収集することと、を含む、方法である。

実施形態２１は、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性分子であって、ＥＤＢの非存在下で誘導されるＮＦ－κＢシグナル伝達よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍など、例えば少なくとも４倍大きい、ＥＤＢの存在下でのＮＦ－κＢシグナル伝達を誘導する、多重特異性分子である。

実施形態２２は、実施形態１～１０又は２１のいずれか一項に記載の多重特異性分子であって、ＥＤＢの非存在下で誘導されるＩＣＡＭ－１発現よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍など、例えば少なくとも４倍大きい、ＥＤＢの存在下での細胞表面のＩＣＡＭ－１発現を誘導する、多重特異性分子である。

実施例１：ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び対照分子の生成
二重特異性抗体及び対照分子は、表１に示す標的結合配列由来であり、無血清／動物成分不含培地で、ＣＨＯ懸濁培養液中で一過性に発現し、ＡｋｔａＰｕｒｅ機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）での分取サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）によって精製した。重鎖は、ヘテロ二量体形成を促進するノブインホール（ＫｉＨ）変異を含有していた（Ｒｉｄｇｗａｙら、「ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．」、第９巻（第７号）：６１７－２１（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第２７０巻（第１号）：第２６～３５頁（１９９７年）；Ｍｅｒｃｈａｎｔら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、第１６巻（第７号）：第６７７～８１頁（１９９８年））。抗体は、Ｆｃ受容体相互作用を低減する野生型ＩｇＧ１と比較した場合、７つのＦｃ変異－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのセットを含むＩｇＧ１シグマＦｃを含有していた（Ｔａｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（２０１７年））。

対称単一抗体及び二重特異性抗体は、ＩｇＧ１シグマ変異を伴い、ＫｉＨ変異を伴わず生成された。

^＊：本明細書で使用されるＥＤＢｍＡｂ１（国際公開第９７４５５４４号）は、診療所で試験された抗ＥＤ－Ｂ抗体であり、ＥＤ－Ｂ又は隣接ドメインに結合する他の抗体は、以前に記載されている（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」、第６８巻第３９７～４０５頁（１９９６年））

タンパク質濃度が、２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定され（ＯＤ２８０）、精製収率が決定された。分析ＳＥＣを、ＴｈｅｒｍｏＶａｎｑｕｉｓｈＨＰＬＣシステムにおけるＢｉｏＳＥＣ－５カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、５μｍの粒子サイズ、３００Å）を使用して行った。１０μｌの精製タンパク質をカラムに充填し、溶出をＯＤ２８０によって記録した。

表２は、本実施例に記載の二重特異性抗体及び対照分子の構造的特性の概要を示す。太字の分子は、本発明による分子であり、他のものは、異なる態様の対照である。

表３は、比較例４で論じられるように、ＬＴＢＲ及びメソテリン（細胞外マトリックス中に存在しない腫瘍関連抗原）を標的化する別の比較可能な二重特異性抗体の構造的特性を示す。

^＊：Ｆｃ部分における変異は、タンパク質Ａへの結合を抑制し、国際公開第２０１０／１５１７９２号に記載されるヘテロ二量体の精製を促進する。

異なる構築物がどのように生成されたかを以下に記載する。

１：１の化学量論を有する非対称抗体（全てがＩｇＧ１シグマであり；全てがノブインホール（ＫｉＨ）変異を伴う）：
ｉ．ＣＯＶＡ１４１２１は、アゴニストＬＴＢＲ抗体ＬＴＢＲｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号１）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号２）と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｌ）。
ｉｉ．ＣＯＶＡ１４１２０は、アゴニストＬＴＢＲ抗体ＬＴＢＲｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号１）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号２）と、抗ＲＳＶ抗体Ｂ２１Ｍの重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｋ）。
ｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４１２２は、アゴニストＬＴＢＲ抗体ＬＴＢＲｍＡｂ２の重鎖（ＨＣ；配列番号９）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号１０）と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｍ）。
ｉｖ．ＣＯＶＡ１４１２３は、アゴニストＬＴＢＲ抗体ＬＴＢＲｍＡｂ２の重鎖（ＨＣ；配列番号９）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号１０）と、抗ＲＳＶ抗体Ｂ２１Ｍの重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｎ）。
ｖ．ＣＯＶＡ１４１２４は、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）と、抗ＲＳＶ抗体Ｂ２１Ｍの重鎖（ＨＣ；配列番号６）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｏ）。
ｖｉ．ＣＯＶＡ１４５４は、３ｘｈｍＬＩＧＨＴ－Ｆｃ（配列番号１５）と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｆ）。３ｘｈｍＬＩＧＨＴ－Ｆｃは、ＩｇＧ１シグマＦｃのＮ末端に融合した、より良好な安定性並びにヒト及びマウスの交差反応性（Ｔａｎｇｒら、「ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ」、第２９巻：第２８５～９６頁（２０１６年））のために操作された単鎖三量体ＬＩＧＨＴである。
ｖｉｉ．ＣＯＶＡ１４１８は、３ｘｈｍＬＩＧＨＴ－Ｆｃ（配列番号１５）と、抗ＲＳＶ抗体Ｂ２１Ｍの重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｅ）。３ｘｈｍＬＩＧＨＴ－Ｆｃは、ＩｇＧ１シグマＦｃ（配列番号５８）のＮ末端に融合した、より良好な安定性並びにヒト及びマウスの交差反応性（Ｔａｎｇｒら、「ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ」、第２９巻：第２８５～９６頁（２０１６年））のために操作された単鎖三量体ＬＩＧＨＴである。

対称抗体（全てがＩｇＧ１シグマであり、ＫｉＨ変異を伴わない）：
ｖｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４１１４は、Ｃ末端ＬＴα１β２融合（配列番号１８）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖を、Ｂ２１Ｍ抗体の軽鎖（ＬＣ；配列番号８）とともに発現することによって生成した（図１Ｇ）。
ｉｘ．ＣＯＶＡ１４１１３は、Ｃ末端ＬＴα１β２融合（配列番号２０）を担持するＥＤＢｍＡｂ１重鎖を、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の軽鎖（ＬＣ；配列番号５）とともに発現することによって生成した（図１Ｈ）。
ｘ．ＣＯＶＡ１４１３は、アゴニストＬＴＢＲ抗体ＬＴＢＲｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号１１）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号２）の共発現によって生成した（図１Ｂ）。
ｘｉ．ＣＯＶＡ１４０２は、アゴニストＬＴＢＲ抗体ＬＴＢＲｍＡｂ２の重鎖（ＨＣ；配列番号１３）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号１０）の共発現によって生成した（図１Ａ）。
ｘｉｉ．ＣＯＶＡ１４４０は、抗ＲＳＶ抗体Ｂ２１Ｍの重鎖（ＨＣ；配列番号１４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）の共発現によって生成した（図１Ｃ）。
ｘｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４５２は、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号１２）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｄ）。

２：１の化学量論を有する非対称抗体（全てがＩｇＧ１シグマであり、全てがＫｉＨ変異を伴う）
ｘｉｖ．ＣＯＶＡ１４１１６は、Ｃ末端ＬＴα１β２融合（配列番号２１、配列番号８４を含む）を担持するＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｉ）。
ｘｖ．ＣＯＶＡ１４１１７は、Ｃ末端ＬＴα１β２融合（配列番号１９、配列番号８５を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｊ）。
ｘｖｉ．ＣＯＶＡ１４８４は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２２）融合（配列番号２６、配列番号８５を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｐ）。
ｘｖｉｉ．ＣＯＶＡ１４８５は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号２３）融合（配列番号２７、配列番号８５を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｑ）。
ｘｖｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４８６は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２２）融合（配列番号２８、配列番号８５を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｒ）。
ｘｉｘ．ＣＯＶＡ１４８７は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号２３）融合（配列番号２９、配列番号８５を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ｓ）。
ｘｘ．ＣＯＶＡ１４８０は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２２）融合（配列番号３０、配列番号８４を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｔ）。
ｘｘｉ．ＣＯＶＡ１４８１は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号２３）融合（配列番号３１、配列番号８４を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｕ）。
ｘｘｉｉ．ＣＯＶＡ１４８２は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２２）融合（配列番号３２、配列番号８４を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｖ）。
ｘｘｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４８３は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号２３）融合（配列番号３３、配列番号８４を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｗ）。
ｘｘｉｖ．ＣＯＶＡ１４１０７は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向、ＶＬ３Ｙ３６Ｆ＿Ｓ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ配列番号５３）融合（配列番号３４、配列番号８４を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｘ）。
ｘｘｖ．ＣＯＶＡ１４１０８は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向、ＶＨ＿ＣＤＲ１＿Ｙ３３Ａ配列番号５４）融合（配列番号３５、配列番号８４を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｙ）。
ｘｘｖｉ．ＣＯＶＡ１４１３３は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２２）融合（配列番号３８、配列番号３を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ｚ）。
ｘｘｖｉｉ．ＣＯＶＡ１４１３６は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２２）融合（配列番号４１、配列番号６を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ａ１）。
ｘｘｖｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４１７４は、Ｃ末端ジスルフィド安定化ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２５）融合（配列番号３９、配列番号３を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ａ２）。
ｘｘｉｘ．ＣＯＶＡ１４１７５は、Ｃ末端ジスルフィド安定化ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２５）融合（配列番号４０、配列番号６を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ａ３）。
ｘｘｘ．ＣＯＶＡ１４５６は、Ｃ末端ジスルフィド安定化ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２５）融合（配列番号５６、配列番号８４を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖と、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号４）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号５）との共発現によって生成した（図１Ａ４）。
ｘｘｘｉ．ＣＯＶＡ１４６２は、Ｃ末端ジスルフィド安定化ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２５）融合（配列番号５７、配列番号８５を含む）を担持する抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体重鎖と、抗ＲＳＶＢ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ；配列番号７）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８）との共発現によって生成した（図１Ａ５）。

メソテリン／ＬＴＢＲ二重特異性：非対称抗体、２：１の化学量論を有する（ＩｇＧ１シグマ、ＫｉＨ変異を伴う
ｘｘｘｉｉ．ＣＯＶＡ１４１４６は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号２２）融合（配列番号８０、配列番号８６を含む）を担持する抗メソテリン抗体ＭＳＬＮｍＡｂ１重鎖と、抗メソテリン抗体ＭＳＬＮｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ；配列番号８１）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号８２）との共発現によって生成した（図１Ａ６及び表３）。

結果
上記の全ての構築物を発現させ、精製することができたが、驚くべきことに、ＬＩＧＨＴ及びＬＴα１β２含有構築物（ＣＯＶＡ１４１８、ＣＯＶＡ１４５４、ＣＯＶＡ１４１１３、ＣＯＶＡ１４１１４、ＣＯＶＡ１４１１６、及びＣＯＶＡ１４１１７；表２）は、アゴニスト抗ＬＴＢＲ抗体に由来するステープル処理ｓｃＦｖを含有するＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体と比較して、１０倍まで減少した精製収率を示した（例えば、ＣＯＶＡ１４８２及びＣＯＶＡ１４１３３；表４参照）。更に、ＬＩＧＨＴ（例えば、ＣＯＶＡ１４５４）を含有する構築物は、図２及び表４に示したサイズ排除クロマトグラムから分かるように、単量体含有量が減少する傾向を示した。まとめると、これらの事実（精製収率は最大１０倍高く、単量体含有量がより高い）は、本発明の二重特異性構築物が、ＬＩＧＨＴ又はＬＴα１β２－Ｆｃ融合を含む構築物よりも良好な生物物理学的特性を有し得たことを示している。

実施例２：ＥＤＢ依存性インビトロＬＴＢＲ活性化－ＮＦ－κＢルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ
ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体がＥＤＢ依存的な方法でＬＴＢＲを活性化することができることを示すために、化合物の活性を、ＥＤＢ含有フィブロネクチン（ＥＤＢ＋フィブロネクチン）の存在下又は非存在下でのＡ５４９細胞ＮＦ－κＢルシフェラーゼ・レポーター・アッセイで試験した。ＮＦ－κＢシグナル伝達は、細胞発生及び免疫ホメオスタシスの調節において中心的役割を果たす。腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor：ＴＮＦＲ）又はＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー例えば、ＬＴＢＲ）を介したＮＦ－κＢの活性化は、それらのそれぞれのリガンドとの関与時に発生する。Ａ５４９肺上皮細胞株は、ＬＴＢＲを自然に発現し、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター構築物は、Ａ５４９肺上皮細胞株のゲノムに安定的に組み込まれる。刺激剤による活性化に続いて、内因性ＮＦ－κＢ転写因子は、ＤＮＡ応答要素に結合して、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。

ＬＴＢＲのＥＤＢ依存性活性化を実証するために、高結合９６ウェルμＣｌｅａｒ平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）を、１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えＥＤＢ＋フィブロネクチンドメイン７－Ｂ－８－９（ＥＤＢ、配列番号５１）又は１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えフィブロネクチンドメイン７－８－９（ＥＤＢ－、配列番号５２）で、一晩コーティングした。

一晩インキュベートした後、コーティングされたプレートをＰＢＳで洗浄し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ）で、３７℃で２時間ブロックした。試験される化合物の１：５希釈系列を、２倍濃度ストックとしてアッセイ培地で調製した（試験した最終濃度は、２００ｎＭ～２．６ｐＭの範囲であった）。ブロッキング溶液を吸引によって除去した後、５０μＬの希釈した化合物をプレブロックされたプレートに添加した。５０μＬのＡ５４９細胞懸濁液（細胞懸濁液の濃度＝０．４Ｍｉｏ細胞／ｍｌアッセイ培地）を、各ウェルに添加した（２０，０００細胞／ウェル）。Ａ５４９細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ／ＥＤＴＡを使用することによって細胞培養フラスコから予め分離され、次いでアッセイ培地に移された。細胞を化合物と共に３７℃／５％ＣＯ_２で１８～２０時間インキュベートした。

１８時間のインキュベートの後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光は、ＴｅｃａｎＭ１０００Ｐｒｏ機器を使用して、５００ミリ秒の積分時間で測定した。得られた相対光単位（relative light unit：ＲＬＵ）から、ＬＴＢＲシグナル伝達の誘導倍率を以下のように計算した：誘導倍率＝ＲＬＵ_刺激済み細胞／平均ＲＬＵ_非刺激細胞（非刺激細胞を試験される各プレートにおいて対照として含めた）。

標準偏差を含む用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用してプロットし、該当する場合は、非線形フィットを適用した（対数（アゴニスト）対応答（可変勾配－３パラメータ））。データを適合させるために、ｘ値（化合物の濃度）を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍのｘ＝Ｌｏｇ（ｘ）関数を使用して変換した。

結果
抗体－ＬＩＧＨＴ融合
二重特異性分子抗ＥＧＦＲ－ＬＩＧＨＴ融合が抗腫瘍活性を有すると記載されたＴａｎｇら（Ｔａｎｇら、「ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ」、第２９巻：第２８５～９６頁（２０１６年）によって公表された研究と同様に、ＣＯＶＡ１４５４、１つのＥＤＢ結合アーム、及び１つのＬＩＧＨＴ三量体－Ｆｃ融合物からなる二重特異性分子（図１Ｆ及び表２）を、ＥＤＢ含有フィブロネクチンの存在下又は非存在下において、Ａ５４９細胞ＮＦ－κＢルシフェラーゼ・レポーター・アッセイで設計し、発現させ、試験した。ＣＯＶＡ１４５４の活性を、可溶性組換えヒトＬＩＧＨＴ（カタログ番号６６４－ＬＩ－０２５／ＣＦ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、及び非標的化ＬＩＧＨＴ（ＣＯＶＡ１４１８；図１Ｅ及び表２）と比較した。図３Ａは、ＥＤＢ含有フィブロネクチンの存在下において、ＣＯＶＡ１４５４が、非標的化ＬＩＧＨＴ（ＣＯＶＡ１４１８）又は可溶性組換えヒトＬＩＧＨＴよりもＬＴＢＲをわずかに活性化するのみであることを示す。興味深いことに、図３Ｂは、ＥＤＢ含有フィブロネクチンの非存在下において、ＣＯＶＡ１４５４、ＣＯＶＡ１４１８、及び可溶性組換えＬＩＧＨＴが、ＥＤＢの存在下と同程度及び近い程度にＬＴＢＲを活性化することを示す（図３Ａ）。これらの発見は、正常組織におけるＬＴＢＲの広範な発現と一緒に（Ｌｕｋａｓｈｅｖら、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」、第６６巻（第１９号）：第９６１７～２４頁（２００６年））、抗体ＬＩＧＨＴ融合がＬＴＢＲの腫瘍特異的活性化を達成するのに適していないことを示す。実際に、正常組織におけるＬＴＢＲの活性化は、望まれないｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ毒性につながる可能性がある。

抗体－ＬＴα１β２融合
続いて、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１に融合した１つ又は２つのＬＴα１β２部分のいずれかを含むＬＴα１β２抗体融合（図１Ｇ～図１Ｊ及び表２）を生成し、レポーターアッセイで試験した。

これらの構築物は、Ｂ７－Ｈ４特異的腫瘍標的化抗体に融合したヘテロ三量体単鎖ＬＴα１β２部分からなる二重特異性融合構築物を用いた、インビトロ及びインビボでの研究を報告した、Ｇｕｒｎｅｙらによる研究と同様に設計した（国際公開第２０１８／１１９１１８号）。重要なことに、前の節で使用したＬＩＧＨＴとは異なり、ＬＴα１β２融合構築物は、ＬＴＢＲの特異的アゴニストであり、ＨＶＥＭを活性化しない。

図３Ｃ及び図３Ｄは、ＣＯＶＡ１４１１３、ＥＤＢｍＡｂ１抗体（図１Ｈ及び表２）への２つのＬＴα１β２の融合、ＣＯＶＡ１４１１６、ＣＯＶＡ１４１１４と比較したＥＤＢｍＡｂ１抗体（図１Ｉ及び表２）への１つのＬＴα１β２の融合、非標的化ＬＴα１β２対照、可溶性組換えヒトＬＩＧＨＴ、及び可溶性ＬＴα１β２（組換えヒトリンフォトキシンα１β２；カタログ番号８８８４－ＬＹ／ＣＦ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）として作用する、アイソタイプ対照抗体Ｂ２１Ｍ（図１Ｇ及び表２）への２つのＬＴα１β２の融合で得られた結果を示す。ＥＤＢの存在下（図３Ｃ）では、ＣＯＶＡ１４１１３及びＣＯＶＡ１４１１６の両方が、可溶性天然リガンドＬＩＧＨＴ及びＬＴα１β２よりも強力なＬＴＢＲの活性化を達成したが、非標的化ＬＴα１β２対照ＣＯＶＡ１４１１４は、ＣＯＶＡ１４１１３及びＣＯＶＡ１４１１６に匹敵する活性化レベルを示した。ＥＤＢの非存在下（図３Ｄ）では、ＣＯＶＡ１４１１３及びＣＯＶＡ１４１１４（２つのＬＴα１β２部分を担持する）の活性は変化しなかったが、一方でＣＯＶＡ１４１１６（１つのＬＴα１β２部分を担持する）の活性は、可溶性ＬＴα１β２によって達成される活性化をわずかに下回るレベルまで低下した。これらのデータは、ＬＴＢＲの腫瘍抗原依存性活性化が、そのような抗体－ＬＴα１β２構築物で達成するのが極めて困難であることを示した。実際に、ＥＤＢ含有フィブロネクチンの非存在下で達成された活性化レベル（図３Ｄ）は、正常組織におけるＬＴＢＲの広範な発現に起因して問題となり得た（Ｌｕｋａｓｈｅｖら、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」、第６６巻（第１９号）：第９６１７～２４頁（２００６年）。

アゴニスト抗ＬＴＢＲ抗体に基づく二重特異性抗体
ＬＴＢＲの腫瘍抗原依存性活性化を達成するために、本発明者らは、腫瘍抗原（細胞外マトリックス中に存在する腫瘍抗原である、フィブロネクチンのＥＤＢである腫瘍抗原）への結合時にのみＬＴＢＲを活性化することを目的として、抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１、並びに抗ＬＴＢＲアゴニスト抗体ＬＴＢＲｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ２（図１Ｋ～図１Ｍ）からなる、二重特異性抗体（１：１ヘテロ二量体；本発明者らは、正しい対合を促進するようにＦｃ領域にＫｉＨ変異を含めた）の生成に着手した。ＬＴＢＲｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ２と対になったアイソタイプ対照抗体Ｂ２１Ｍからなる、対応する対照抗体もまた生成された（図１Ｎ～図１Ｏ）。

図４Ａ及び図４Ｃは、ＣＯＶＡ１４１２１（１：１ヘテロ二量体ＥＤＢｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ１；図１Ｌ及び表２）、及びＣＯＶＡ１４１２２（１：１ヘテロ二量体ＥＤＢｍＡｂ１及びＬＴＢＲｍＡｂ２；図１Ｍ及び表２）が、ＥＤＢ依存的な方法でＬＴＢＲを活性化することができたことを示す。前述の分子とは対照的に、図４Ｂ及び図４Ｄに示されるような上記の実施例では、ＥＤＢの非存在下において、ＣＯＶＡ１４１２１及びＣＯＶＡ１４１２２は、最小のＬＴＢＲ活性化のみを実証した。この残存活性は、精製された材料中の残留不純物に起因する可能性があった。表５は、ヘテロ二量体ＣＯＶＡ１４１２１及びＣＯＶＡ１４１２２、又はＬＩＧＨＴ－（ＣＯＶＡ１４５４）若しくはＬＴα１β２－抗体融合（ＣＯＶＡ１４１１３及びＣＯＶＡ１４１１６）を用いて得られた、（ＥＤ－Ｂ含有フィブロネクチンの存在下又は非存在下における、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達の）最大誘導倍率の比較を示す。比較は、アゴニスト抗体を用いると、ＬＴＢＲ二重特異性分子がより特異的になることを明確に示す。実際に、ＥＤ－Ｂの存在下において達成される最大誘導倍率と、ＥＤ－Ｂの非存在下において達成される最大誘導倍率との比は、ＣＯＶＡ１４１２１及びＣＯＶＡ１４１２２では４．４～５．４の範囲であるのに対して、リガンド抗体融合では１．１～１．６の範囲であり、これらのリガンド抗体融合は、本発明の二重特異性抗体とは対照的に、特異的ＴＡＡ依存性ＬＴＢＲ活性化を達成しないことを実証している。

まとめると、これらの結果は、アゴニストＬＴＢＲ抗体に基づく二重特異性抗体を用いて、腫瘍抗原の非存在下で活性化を最小限にするか又は全く行わずに、腫瘍依存的にＬＴＢＲを活性化することが可能であることを示唆した。そのような二重特異性分子では、ＬＴＢＲ結合抗体は、腫瘍抗原、この場合、ＥＤＢ含有フィブロネクチンへの結合時にのみＬＴＢＲを活性化する。

腫瘍抗原依存性ＬＴＢＲ活性化を更に強化するために、ＥＤＢに対する２つの結合部位（抗原媒介性クラスタリングを増加させるため）又は２つの非特異的結合部位、及びＬＴＢＲへの１つの結合部位（図１Ｐ～図１Ｗ及び図１Ａ２～図１Ａ５参照）を有する、２：１二重特異性フォーマットを設計した。ＬＴＢＲ結合部位では、ｓｃＦｖフラグメントを使用した。ｓｃＦｖフラグメントは安定性に問題がある可能性があったため、それらを安定化するために２つの異なる方法を使用し、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するｓｃＦｖフラグメントを、ＶＨとＶＬとの間の更なるジスルフィド結合（Ｒｅｉｔｅｒら、「ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、第１４巻（第１０号）：第１２３９～４５頁（１９９６年））、又はステープル処理ｓｃＦｖプラットフォーム（ＶＨ－ＶＬ；ＶＬ－ＶＨ）を用いて安定化させ、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーを介して、ＥＤＢｍＡｂ１又はＢ２１Ｍ（アイソタイプ対照抗体）のいずれかに融合させた。

図５Ａは、２：１二重特異性ＥＤＢ／ＬＴＢＲ抗体であるＣＯＶＡ１４５６（図１Ａ４及び表２）がＬＴＢＲを強力に活性化し、一方で対照二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４６２（図１Ａ５及び表２）がＬＴＢＲを活性化できなかったことを実証した。これは、ＴＡＡ（この場合、固定化されたＥＤＢ含有フィブロネクチン）への結合を介したクラスタリングが、２：１二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４５６による強力なＬＴＢＲ活性化の前提条件であったことを示した。ＥＤＢ含有フィブロネクチンが存在しなかった場合（図５Ｂ）、ＣＯＶＡ１４５６はＬＴＢＲを活性化することができず、これは、ＥＤＢの存在がＬＴＢＲ活性化に必須であり、また細胞外マトリックス中のＬＴＢＲ及びＥＤＢを標的化する二重特異性抗体によってＬＴＢＲの腫瘍特異的活性化が達成されたという事実を裏付けた。

ＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化する能力が、ＣＯＶＡ１４５６の構築に使用したＬＴＢＲｍＡｂ１由来のジスルフィド安定化ｓｃＦｖの固有の特性ではなかったことを実証するために、ＣＯＶＡ１４５６を、同じＡ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイでＣＯＶＡ１４８２と比較した。ＣＯＶＡ１４８２は、ｓｃＦｖに使用される安定化方法においてのみ、ＣＯＶＡ１４５６と異なる。ＬＴＢＲｍＡｂ１にもまた由来するＣＯＶＡ１４８２中のｓｃＦｖを、ステープル処理されたプラットフォームを用いて安定化した。図５Ｃは、ＣＯＶＡ１４８２及びＣＯＶＡ１４５６の両方がＥＤＢ依存的な方法でＬＴＢＲを強力に活性化したことを示した。対応するアイソタイプ対照ＣＯＶＡ１４８６及びＣＯＶＡ１４６２は、ＬＴＢＲを活性化しなかった（図５Ｃ）。これらの結果は、ｓｃＦｖフラグメントを安定化するために使用される方法が、ＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化する二重特異性の能力に影響を及ぼさなかったことを示唆した。驚くべきことに、２：１二重特異性ＥＤＢ／ＬＴＢＲ抗体（ＣＯＶＡ１４８２又はＣＯＶＡ１４５６）は、このレポーターアッセイにおいてＮＦ－ｋＢシグナル伝達を誘導する際に効力の増加を示した。同じ実験設定でのいくつかのアッセイにわたってＣＯＶＡ１４８２について計算された平均ＥＣ_５０は、約３０ｐＭ±１０ｐＭであり、ＣＯＶＡ１４１２１（１：１ヘテロ二量体）は、図４Ａで示されたアッセイにおいて約３ｎＭのＥＣ_５０を示し、２：１二重特異性が１：１二重特異性よりも１００倍強力であり得ることを示す。これは、ＴＡＡへの２つの結合部位で達成されたＬＴＢＲ結合部位のクラスタリングの増加によって説明することができる。

ＬＴＢＲをＴＡＡ依存的に活性化するためのそのような二重特異体の能力へのＬＴＢＲに対する親和性の効果を研究するために、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するｓｃＦｖフラグメントのより低い親和性バリアント（配列番号５３、ＫＤ≒６０ｎＭ及び配列番号５４、ＫＤ≒６００ｎＭ）を生成し、２：１二重特異体（ＣＯＶＡ１４１０７、図１Ｘ及び表２；並びにＣＯＶＡ１４１０８、図１Ｙ及び表２）を構築するために使用した。た二重特異体を、Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイで試験して、ＬＴＢＲの活性化に対する親和性の効果を確認した。図５Ｄは、ＬＴＢＲに対するより低い親和性が、このアッセイにおいてＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化するための二重特異体の能力の低下に対応したことを示した。

実施例１で述べたように、プロテインＡ（抗体の精製に使用される）への結合を抑制する変異（国際公開第２０１０／１５１７９２号）を、所望のヘテロ二量体の精製を促進するために、いくつかの構築物のＦｃに導入した。ＣＯＶＡ１４１３３をこれらの変異なしで生成し、その活性は、ＣＯＶＡ１４８２と比較して、Ｆｃ領域の変異が二重特異体の活性に影響を与えなかったことを示した。ＣＯＶＡ１４１３３及びＣＯＶＡ１４８２並びにそれらのそれぞれのアイソタイプ対照ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４８６を、Ａ５４９ＮＦ－ｋＢレポーターアッセイにおいて比較した。図５Ｅは、ＣＯＶＡ１４１３３がＣＯＶＡ１４８２と同様の効率を有するＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化することを示し、Ｆｃにおける変異がＬＴＢＲを活性化する二重特異性の能力に影響を及ぼさなかったことを実証した。

ＥＤＢの存在下（図５Ｆ）で、ＣＯＶＡ１４１３３（２：１ＥＤＢｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡｂ１）及びＣＯＶＡ１４１１６（２：１ＥＤＢｍＡｂ１×ＬＴα１β２）の両方が、ＬＴＢＲの強力な活性化を達成した。非標的化アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４１３６（２：１Ｂ２１Ｍ×ＬＴＢＲｍＡｂ１）ではＬＴＢＲ活性化は観察されなかったが、非標的化ＬＴα１β２対照ＣＯＶＡ１４１１７（２：１Ｂ２１Ｍ×ＬＴα１β２）は、ＴＡＡ結合とは無関係に活性化を示した。ＥＤＢの非存在下（図５Ｇ）では、ＬＴＢＲ活性化は、ＣＯＶＡ１４１３３又はそのアイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４１３６によって検出することができなかった。対照的に、ＣＯＶＡ１４１１６及びＣＯＶＡ１４１１７によるＬＴＢＲのＴＡＡ非依存的活性化をＥＤＢの非存在下で測定したところ、このような抗体－ＬＴα１β２構築物でＬＴＢＲの腫瘍抗原依存的活性化を達成することは非常に困難であることが示された。

結論として、ＣＯＶＡ１４１３３はＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化する優れた能力を有することが示された。

実施例３：ＥＤＢ依存性インビトロＬＴＢＲ活性化－Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ共培養細胞アッセイ
ＥＤＢ＋フィブロネクチン（ＷＩ３８ＶＡ細胞による細胞外マトリックスにおいて産生及び堆積された（Ｚａｒｄｉ，Ｌ．ら、「ＥＭＢＯＪ」、第６巻第２３３７～４２頁（１９８７年））の存在下におけるＬＴＢＲの活性化が、サイトカイン及びケモカインの放出、並びにＡ３７５細胞上の接着分子ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションをもたらすかどうかを検証するために、Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ共培養アッセイを行った。ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ７５．１（商標））細胞を、５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で、成長培地（ＭＥＭｗ／ｏグルタミン＋１０％の熱不活性化ＦＢＳ＋０．１ｍＭのＮＥＡＡ＋２ｍＭのＬ－Ｇｌｎ＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム）で４８時間インキュベートした。試験される化合物の３通りの１：５希釈系列を、２倍濃度ストックとしてアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ）中で調製した（試験した最終濃度は４０ｎＭ～０．５ｐＭの範囲であった）。ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ細胞との共培養におけるインキュベートの前に、Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６１９（商標））を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット（ＣＴＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識した。標識するために、ＰＢＳ中５％のＦＢＳにおいて１０×１０^６細胞／ｍＬ及び２．５μＭＣＴＶの濃度を有する細胞懸濁液を、光から保護しながら、室温で５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．４×１０^６細胞／ｍＬの密度でアッセイ培地に再懸濁させた。４８時間のＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ培養を含有するプレートから培養培地を慎重に除去し、続いて、５０μＬのＡ３７５細胞懸濁液（２０，０００細胞／ウェル、ＣＴＶ＋又はＣＴＶ－）を各ウェルに添加した。５０μＬの連続希釈化合物（ウェル当たりの最終容量１００μＬ）を、細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。

２４時間又は７２時間インキュベートした後、上清を遠心分離によって除去し、ＭＳＤアッセイを用いてサイトカイン及びケモカインを測定するために、又はＰＢＭＣ遊走アッセイ（２４時間のインキュベート、実施例５）で使用するために、保存した。細胞を、フローサイトメトリーによってＩＣＡＭ－１測定のために更に処理した（２４時間のインキュベート）。

フローサイトメトリーによるＩＣＡＭ－１の検出
９６ウェルプレートに残っているいずれの培地も注意深く除去し、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで分離させ、ＤｅｅｐＷｅｌｌ９６ウェルプレートに移し（３通りに１つウェルでプールした）、洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ_３）に再懸濁し、丸底９６ウェルプレートに移した。抗体、すなわち、標識された抗ヒトＩＣＡＭ－１ＰＥ（クローン１Ｈ４、Ｔｈｅｒｍｏ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）又は標識されたアイソタイプ対照抗体ＰＥ（ＭＰＣ－１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能近ＩＲ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、単一染色又は組合せ染色を、表６に示すように希釈した。

細胞を４℃で４分間、４００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄し、５０μＬの抗体溶液を表６に記載するように調製した。細胞及び抗体を、暗所において４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、１２０μＬを各ウェルに添加し、次いで、細胞を４℃で４分間、４００×ｇで遠心分離した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離し、９０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。次いで、細胞を、ＰＢＳ中の３．７％のホルマリン溶液９０μｌを添加することによって固定し、暗所において氷上で１５分間インキュベートした。固定後、細胞を、４℃で４分間、４００ｘｇで遠心分離し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。細胞を、スクリーンモードにて高流量でＭＡＣＳＱｕａｎｔ機器を使用して測定し、４９μＬ／ウェルを取得した。データは、ＦｌｏｗｌｏｇｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅ（バージョン７００．２Ａ）を用いて分析し、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍでプロットした。

ＭＳＤプラットフォームを用いた処理細胞の上清中のサイトカイン測定
ＮＦ－κＢシグナル伝達の制御下にあることが知られているいくつかのサイトカインを、ＭＳＤプラットフォーム及びマルチプレックスＭＳＤプレートを使用して測定した。ここでは、測定されたサイトカインのいくつかの例を列挙している。
■ＲＡＮＴＥＳ：Ｒ－Ｐｌｅｘ抗体セットヒトＲＡＮＴＥＳ（ＭＳＤ）を使用、
■Ｉ－ＴＡＣ、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３ｂ：３－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用、
■ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３ｂ：３－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用、及び
■ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－３ａ、ＳＤＦ－１ａ：５－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用

処理された細胞の上清中のサイトカインの濃度を、製造業者の説明書に従ってＭＳＤプラットフォームを使用して測定した。簡単に説明すると、プロトコルは以下のステップを伴った：
（１）プレートの調製は、提供されたプレートをリンカー結合捕捉抗体でコーティングすることを伴った。プレートを２～８℃で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、プレートを、プレートワッシャ（Ｂｉｏｔｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した。
（２）較正物質標準及び検出抗体溶液を調製した。
（３）材料の利用可能性に応じて、上清を１：３又は１：５に希釈した。２４時間又は７２時間（Ｉ－ＴＡＣ、ＭＩＰ－３ａ、ＴＮＦα用）のインキュベート後の上清を測定した。

アッセイプロトコル：
○ステップ１：試料又は較正物質標準をプレートに添加し、プレート（palte）を振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
○ステップ２：プレートを洗浄し、検出抗体を添加した。プレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。
○ステップ３：プレートを洗浄し、２ｘリード緩衝液Ｔを添加した。プレートをＭＳＤ機器で分析した。
－データを、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅソフトウェア（ＭＳＤ探索作業ベンチプログラムｖ４．０．１２．１）を使用して分析した。３通りからの標準偏差を含む用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用してプロットし、該当する場合は、非線形フィットを適用した（対数（アゴニスト）対応答（可変勾配－４パラメータ））。データを適合させるために、ｘ値（化合物の濃度）を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍのｘ＝Ｌｏｇ（ｘ）関数を使用して変換した。

結果－フローサイトメトリーによるＩＣＡＭ－１の検出
ＮＦ－κＢシグナル伝達は細胞の表面上のＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションにつながる可能性があることが、以前に示されていた（ｄａＳｉｌｖａＡｎｔｕｎｅｓら、「ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ」、第９巻第５７６頁（２０１８年））。このことから、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性体との共培養インキュベーションの後のＡ３７５細胞の表面上のＩＣＡＭ－１発現のレベルを測定した。一例として、図６は、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性ＣＯＶＡ１４８２とのインキュベート後のＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションを示す。対照的に、アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４８６は、ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションを引き起こさなかった。これらの発見は、ＥＤＢへの結合を介してＬＴＢＲｓｃＦｖをクラスタリングする能力が、ＬＴＢＲ活性化のための前提条件であり、結果として、ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションとしての前提条件であることを示した。

結果－処理細胞の上清中のサイトカイン測定
ＬＴＢＲ活性化の結果として発現されるいくつかのサイトカイン及びケモカインを、上記のように、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体及び対照分子で処理した共培養の上清中で測定した。図７Ａ～図７Ｊは、ＣＯＶＡ１４１３３によるＬＴＢＲの活性化によってアップレギュレートされたサイトカイン読み出しの代表的な例（図７Ａ：ＲＡＮＴＥＳ、図７Ｂ：ＩＬ－６、図７Ｃ：ＩＬ－８、図７Ｄ：ＭＩＰ－３ｂ、図７Ｅ：ＩＰ－１０、図７Ｆ：ＳＤＦ－１ａ、図７Ｇ：ＩＬ－１２ｐ７０、図７Ｈ：Ｉ－ＴＡＣ、図７Ｉ：ＭＩＰ－３ａ、図７Ｊ：ＴＮＦα）を示す。ＣＯＶＡ１４１３６における標的化されていないＬＴＢＲｍＡｂ１由来ｓｃＦｖは、ＬＴＢＲを活性化せず、結果として、上清中のサイトカインの濃度は、バックグラウンドを超えて増加しなかった。バックグラウンドは、Ｂ２１Ｍ（ＣＯＶＡ１４４０）及びＥＤＢｍＡｂ１（ＣＯＶＡ１４５２）抗体で達成されたレベルで表された（プロット内の単一濃度として示された）。図７Ｅ～図７Ｊは、ＣＯＶＡ１４１３３（２：１ＥＤＢｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡｂ１）及びＣＯＶＡ１４１１６（２：１ＥＤＢｍＡｂ１×ＬＴα１β２）の両方が、サイトカイン放出の誘導によって測定された、ＬＴＢＲの強力な活性化を達成したことを示す。非標的化アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４１３６（２：１Ｂ２１Ｍ×ＬＴＢＲｍＡｂ１）ではＬＴＢＲ活性化は観察されなかったが、非標的化ＬＴα１β２対照ＣＯＶＡ１４１１７（２：１Ｂ２１Ｍ×ＬＴα１β２）は、ＴＡＡ結合とは無関係なサイトカインの誘導を示した。これらのデータは再び、ＬＴＢＲの腫瘍抗原依存性活性化が、そのような抗体－ＬＴα１β２構築物で達成するのが極めて困難であることを例示する。

まとめると、ＬＴＢＲ活性化時のＩＣＡＭ－１のアップレギュレーション及びサイトカイン分泌により、ＬＴＢＲ活性化が有し得る細胞に対する予想される効果が確認された。

この例では、本発明の分子は、ＬＴＢＲの効率的な腫瘍関連抗原（ＥＤＢ含有フィブロネクチン）依存性活性化を達成したことが実証された。正常組織におけるＬＴＢＲの広範な発現（Ｌｕｋａｓｈｅｖら、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」、第６６巻（第１９号）：第９６１７～２４頁（２００６年））に起因して、本発明の分子は、以前に記載されたＬＩＧＨＴ及びＬＴα１β２抗体融合よりも明らかな利点を有する。なぜならば、このような前述された融合は、腫瘍関連抗原の非存在下でもまたＬＴＢＲを効率的に活性化し、したがって、ＬＴＢＲ活性化に対する所望の腫瘍特異性を欠くことが本明細書において示されているからである。対照的に、本発明の多重特異性結合分子は、驚くべきことに、この所望の腫瘍特異性を有する。

比較例４：メソテリン依存性インビトロＬＴＢＲ活性化－Ａ５４９ＮＦ－κＢレポーター細胞及びＣＨＯＫ１－ｈｕＭＳＬＮ又はＨ２２６を用いた共培養細胞アッセイ
実施例２及び実施例３では、二重特異性抗体、標的化ＥＤＢ（細胞外マトリックス中の腫瘍関連抗原）、及びＬＴＢＲが、腫瘍抗原依存的な方法で非常に効率的にＬＴＢＲを活性化したことが実証された。その場所（細胞外マトリックス又は腫瘍細胞の細胞表面に堆積される）にもかかわらず、この発見が任意の腫瘍抗原に当てはまるかどうかを確認するために、二重特異性２：１抗体標的化メソテリン（ＭＳＬＮ）、異なるタイプの腫瘍で発現される腫瘍関連抗原（Ｈａｓｓａｎ及びＨｏ、「ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ」、第４４巻：第４６～５３頁（２００８年））及びＬＴＢＲを、実施例１に記載されるように設計及び産生した。ＣＯＶＡ１４１４６は、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するｓｃＦｖフラグメントに融合される、抗メソテリン抗体（ＭＳＬＮｍＡｂ１）からなる２：１ＭＳＬＮ／ＬＴＢＲ二重特異性抗体である。ＬＴＢＲ二重特異性抗体標的化ＬＴＢＲ及び腫瘍細胞の細胞表面に存在する腫瘍関連抗原（例えば、メソテリン）が腫瘍依存的な方法でＬＴＢＲを効率的に活性化することができるかどうかを示すために、共培養細胞アッセイを使用した。使用した共培養アッセイは、Ａ５４９細胞ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞アッセイ（実施例２に記載）及びＨ２２６細胞（中皮腫細胞株；ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８２６）（メソテリンを発現することが知られている（Ｆａｎら、「Ｍｏｌ．Ｃａｎｃ．Ｔｈｅｒ．」、第１巻第５９５～６００頁（２００２年））、及びＬＴＢＲであった。

Ｈ２２６細胞の調製
Ｈ２２６細胞（メソテリンの約２００，０００個のコピー及びＬＴＢＲの１０，０００個のコピーを発現する）懸濁液のウェル当たり１０，０００個の細胞（７５μＬのアッセイ培地、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）を９６ウェル組織培養プレートに播種し、それらの成長培地（ＭＥＭ＋２ｍＭのグルタミン＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ＋１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及びＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１ｍＭのＮａ－ピルビン酸塩のそれぞれ）において３７℃／５％ＣＯ_２で６時間インキュベートして、細胞がプレートに付着することを可能にした。

化合物の調製
化合物を１００ｎＭ～１．３ｐＭの濃度範囲で試験した。化合物の４倍１：５連続希釈を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）中で調製し、使用するまで４℃で保存した。

Ａ５４９レポーター細胞の調製及び添加
Ａ５４９レポーター細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ／ＥＤＴＡで細胞培養フラスコから分離し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）に移した。Ｈ２２６細胞を含むプレートにウェル当たり合計２０，０００個のＡ５４９レポーター細胞を添加した後、５０μＬの予備希釈した化合物を各ウェルに添加し、３７℃／５％ＣＯ_２で２０時間インキュベートした。

処理された共培養物における発光の測定
２０時間のインキュベートの後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者の説明書に従って使用して、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光は、ＴｅｃａｎＭ１０００Ｐｒｏ機器を用いて、５００ミリ秒の積分時間で測定した。得られた相対光単位（ＲＬＵ）から、ＬＴＢＲシグナル伝達の誘導倍率を以下のように計算した：誘導倍率＝ＲＬＵ_刺激済み細胞／平均ＲＬＵ_非刺激細胞（非刺激細胞を試験される各プレートにおいて対照として含めた）。

ＭＳＤプラットフォームを用いた処理細胞の上清中のサイトカイン測定
ＮＦ－κＢシグナル伝達の制御下であることが知られているいくつかのサイトカインは、ＭＳＤプラットフォーム及びマルチプレックスＭＳＤプレートを使用して測定され得る。一例として、Ｒ－Ｐｌｅｘ抗体セットヒトＲＡＮＴＥＳ（ＭＳＤ）を使用したＲＡＮＴＥＳの測定のための方法が本明細書に記載されている。

処理された細胞の上清中のＲＡＮＴＥＳの濃度を、製造業者の説明書に従ってＭＳＤプラットフォームを使用して測定した。簡単に説明すると、プロトコルは以下のステップを伴った：
（１）プレートの調製は、提供されたプレートをリンカー結合捕捉抗体でコーティングすることを伴った。プレートを２～８℃で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、プレートを、プレートワッシャ（Ｂｉｏｔｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した。
（２）較正物質標準及び検出抗体溶液を調製した。
（３）材料の利用可能性に応じて、上清を１：３又は１：５に希釈した。

アッセイプロトコル：
○ステップ１：試料又は較正物質標準をプレートに添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
○ステップ２：プレートを洗浄し、検出抗体を添加した。プレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。
○ステップ３：プレートを洗浄し、２ｘリード緩衝液Ｔを添加した。プレートをＭＳＤ機器で分析した。
－データを、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅソフトウェア（ＭＳＤ探索作業ベンチプログラムｖ４．０．１２．１）を使用して分析し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用してプロットした。

結果－Ａ５４９レポーター細胞／Ｈ２２６共培養アッセイにおけるＬＴＢＲのメソテリン依存性活性化
Ａ５４９レポーター細胞及びＨ２２６細胞を用いた共培養アッセイを行って、その広範な発現（Ｌｕｋａｓｈｅｖら、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」、第６６巻第１９号第９６１７～２４頁（２００６年）のために、ＬＴＢＲ及びメソテリン（腫瘍細胞の細胞表面上の他の腫瘍関連抗原、例えば、ＥＧＦＲ）が腫瘍細胞の細胞表面上で共発現されると予想される場合に、ＣＯＶＡ１４１４６がより生理的なシステムにおいてＬＴＢＲを活性化することができるかどうかを検証した。図８Ａでは、これらの条件下でＣＯＶＡ１４１４６がＬＴＢＲを効率的に活性化しなかったことが示された。処理された細胞の上清中に分泌されたＲＡＮＴＥＳの濃度を測定して、ＣＯＶＡ１４１４６がＬＴＢＲを効率的に活性化することができないことを確認した。予想通りに、図８Ｂは、ＲＡＮＴＥＳが、アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４８６で処理された細胞と同じ程度までＣＯＶＡ１４１４６で処理された細胞によって分泌されたことを示し、ＬＴＢＲは、これらの条件下で活性化できないことが確認された。

まとめると、実施例２～実施例４に提示されたデータは、ＥＤＢ含有フィブロネクチン（腫瘍の細胞外マトリックス中に堆積される腫瘍関連抗原；図９Ａ）が、腫瘍細胞（例えばメソテリン）の表面上でＬＴＢＲと共発現された抗原とは異なり、ＬＴＢＲの効率的なクラスタリングをもたらし、その効率的な活性化をもたらすことができたと示唆した。本発明の二重特異性抗体による、図９Ａに示される条件下でのＬＴＢＲの活性化は、走化性因子ケモカイン及びサイトカインの分泌、並びに処置された細胞上での接着分子（例えば、ＩＣＡＭ－１）の過剰発現をもたらした。ＥＤＢ含有フィブロネクチン（図９Ｂ）の非存在下では、本発明の二重特異性抗体はＬＴＢＲを活性化することができず、結果として、走化性因子ケモカイン及びサイトカインの発現、又は接着分子の過剰発現は観察されなかった。更に、腫瘍細胞上でＬＴＢＲと共発現する腫瘍関連抗原は、二重特異性抗体によって腫瘍依存的様式でＬＴＢＲを活性化するのには好適ではなかったことが示された。

手短に言えば、ＬＴＢＲ、並びにＬＴＢＲ及びそのような腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方に結合する二重特異性抗体により腫瘍細胞上でＬＴＢＲと共発現されるＴＡＡを標的化することは、腫瘍特異的様式でＬＴＢＲを活性化することができず（実施例４）、ＴＡＡ結合部分と天然ＬＴＢＲリガンドＬＩＧＨＴ又はＬＴα１β２の１つとを含む融合タンパク質を介してＬＴＢＲを標的化することは、ＬＴＢＲ活性化をもたらしたが、腫瘍特異的様式ではなかった（実施例２）ことが、本明細書で示された。しかしながら、際立って驚くべきことに、ＬＴＢＲに対する１つの結合ドメイン、及びフィブロネクチンのＥＤＢに対する別の結合ドメイン（細胞外マトリックス中に存在するＴＡＡ）と結合する二重特異性抗体は、腫瘍特異的様式でＬＴＢＲを活性化することができた（実施例２及び実施例３）。そのような二重特異性抗体が、３つの結合ドメイン、例えばＥＤＢを標的化する２つの結合ドメイン及びＬＴＢＲを標的化する１つの結合ドメインを含有する場合、特に良好な結果が観察された。これにより、本発明の二重特異性抗体は、その腫瘍特異性の観点から、癌免疫療法の興味深い候補となる。

当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

実施例５：Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ共培養細胞アッセイから馴化培地へのＰＢＭＣのトランスウェル遊走
実施例３では、二重特異性抗体、標的化ＥＤＢ（細胞外マトリックス中の腫瘍関連抗原）、及びＬＴＢＲが、腫瘍抗原依存的な方法で非常に効率的にＬＴＢＲを活性化し、炎症誘発性サイトカインの産生をもたらしたことが実証された。

このアッセイの目的は、共培養アッセイで産生されたサイトカイン及びケモカインが、ＰＢＭＣを引きつけ、それらの遊走をもたらし得るかどうかを研究することである。ヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ密度勾配遠心分離によってバフィーコートから単離し、Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ共培養物を調製し、実施例３に記載されるようにＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性及び対照分子で刺激した。

３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした後、刺激した共培養物の上清を９６ウェルＤｅｅｐＷｅｌｌプレートに移し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム）で１：１に希釈した。希釈後、上清を遠心分離し（５００ｘｇ／５分）、新鮮な９６ウェルＤｅｅｐＷｅｌｌプレートに移して、任意の細胞又は細胞残屑を除去した。

強力な走化性因子である組換えＳＤＦ－１ａを、ＰＢＭＣ遊走を刺激するための陽性対照として、アッセイ培地中４０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。２３５μＬ／ウェルの馴化培地、ＳＤＦ－１ａ対照、又はアッセイ培地を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム）中に３７℃／５％ＣＯ_２で少なくとも１時間事前に平衡化していた、５μｍ細孔ポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を有するＨＴＳＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）－９６ＰｅｒｍｅａｂｌｅＳｕｐｐｏｒｔｓのキャリアプレートに、遊走アッセイ（三通りに実施）のために移した。膜インサートをキャリアプレートに戻した後、４．６７×１０^６細胞／ｍＬを有する７５μＬ／ウェルのＰＢＭＣ懸濁液を、遊走アッセイプレートの全てのウェルに加え、３５０’０００細胞／ウェルを得た。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で２時間インキュベートして、馴化培地へのＰＢＭＣの遊走を可能にした。

２時間のインキュベート後、プレートインサートを除去し、キャリアプレートの遊走細胞を慎重に再懸濁し、新鮮なＵ底９６ウェルプレートに移した。遊走細胞を遠心分離し（４００ｘｇ／４分）、５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳ－ＨＩ、０．１％ナトリウムアジド、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ機器（高流量、高速モード）を用いて直接測定した。データは、ＦｌｏｗｌｏｇｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅ（バージョン７００．２Ａ）を用いて分析した。３通りからの標準偏差を含む用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いてプロットした。データを適合させるために、ｘ値（化合物の濃度）を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍのｘ＝Ｌｏｇ（ｘ）関数を使用して変換した。

結果－Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ共培養細胞アッセイから馴化培地へのＰＢＭＣのトランスウェル遊走
この実施例では、共培養アッセイ（実施例３を参照）においてＬＴＢＲの活性化の際に発現されるサイトカイン及びケモカインのカクテルが、サイトカイン及びケモカインの勾配に向かうＰＢＭＣの遊走を誘導することができたかどうかを試験した。異なる濃度のＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性抗体で刺激した共培養物の上清を下部チャンバに入れ、新たに単離したヒトＰＢＭＣをトランスウェルプレートの上部チャンバに加えた、トランスウェル遊走アッセイを確立した。２時間のインキュベート時間後、遊走した細胞を計数し、フローサイトメトリーによって表現型決定した。図１０は、遊走アッセイの代表的な結果を示す。ＰＢＭＣの遊走は、ＣＯＶＡ１４１３３（ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性）で刺激した共培養物からの上清に対して用量依存的様式で誘導されたが、一方で、非標的化対照分子ＣＯＶＡ１４１３６（アイソタイプ対照／ＬＴＢＲ）でインキュベートした共培養物からの上清はＰＢＭＣの遊走を誘導しなかった。－ＬＴα１β２抗体融合ＣＯＶＡ１４１１６（ＥＤＢｍＡｂ１－ＬＴα１β２；２：１）及びいくつらの程度でＣＯＶＡ１４１１７（Ｂ２１Ｍ－ＬＴα１β２；２：１）もまた、ＰＢＭＣの遊走を誘導した。異なる免疫細胞サブ集団の遊走は、遊走細胞を表現型決定するために免疫細胞マーカーで染色することによって確認された。単球、好酸球／好中球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、及びＴ細胞の遊走が確認された（データは示さず）。この実施例は、ＬＴＢＲのＥＤＢ依存的活性化がサイトカイン及びケモカインの分泌をもたらすことを確認し、これらが免疫細胞の走化性因子として作用し得ることを示す（図１０）。

更に、この実施例は、本発明の分子が、以前に記載されたＬＴα１β２抗体融合体よりも明らかな利点を有することを再び示している。なぜならば、このような前述された融合は、腫瘍関連抗原の非存在下でもＬＴＢＲを効率的に活性化し、ＰＢＭＣの遊走をもたらし、したがって、ＬＴＢＲ活性化に対する所望の腫瘍特異性を欠くことが本明細書において示されているからである。対照的に、本発明の多重特異性結合分子は、驚くべきことに、この所望の腫瘍特異性を有する。

実施例６：内皮単層を通る単球の輸送に対するＥＤＢ依存的ＬＴＢＲ媒介性内皮活性化の効果
実施例３及び実施例５において、ＬＴＢＲのＥＤＢ依存的活性化の際に産生されたサイトカインが、サイトカイン勾配に向かうＰＢＭＣの遊走をもたらすことができたことを実証した後、本明細書に記載のアッセイの目的は、ＥＤＢ依存的様式で内皮細胞上のＬＴＢＲの活性化が内皮層を通る単球の輸送を増加させるかどうかを検証することであった。

このアッセイで使用した単球を、それぞれの陰性選択キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて健常ドナーから採取したＥＤＴＡ血液から精製し、１．５×１０^６細胞／ｍＬで使用した。ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、Ｍ１９９補充培地（Ｍ１９９培地、２０％ＦＣＳ、ヒドロコルチゾン（０．１μＭ）、ヘパリン（１００μｇ／ｍＬ）、ＥＣＧＳ１５μｇ／ｍＬ、ビタミンＣ（１０μｇ／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％／１％））を用いて、組換えＥＤＢ＋フィブロネクチンドメイン７－Ｂ－８－９（ＥＤＢ＋；配列番号５１）でコーティングしたチャンバスライドで、４８時間培養した。次いで、ＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ（５００Ｕ／ｍＬ；陽性対照）、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性（ＣＯＶＡ１４１３３；５０ｎＭ）、又は非標的化ＬＴＢＲｍＡｂ１由来ｓｃＦｖ（ＣＯＶＡ１４１３６；５０ｎＭ）で刺激し、２日間インキュベートした。

フローアッセイの設定は、加熱した顕微鏡チャンバ（３７℃）及び較正されたポンプからなり、これは、洗浄緩衝液（Ｍ１９９培地、０．１％ＢＳＡ）±単球懸濁液を灌流することによって、ＨＵＶＥＣ単層上に流れを生成することができる。流量は細静脈／毛細血管（０．０５－Ｐａ）を代表する。次いで、洗浄緩衝液をＨＵＶＥＣ上に１０分間ポンピングして活性化培地を除去する。これは総ＨＵＶＥＣ曝露の２０分間に相当する。次いで、単球をＨＵＶＥＣ上で６分間灌流し（ステップ－２）、続いて５０分間洗浄緩衝液を灌流する（ステップ－３）。これは、全ての単球動員プロトコルの標準である、０．１Ｐａで行った。ステップ２～ステップ３を通して、捕捉された単球の画像を、位相差顕微鏡及びカメラを用いて作成した。個々の画像を１つの固定視野で３０秒ごとに記録し、短い動画のシーケンスにまとめ、広い領域にわたる個々の単球の分析を可能にした。ＨＵＶＥＣの表面に接着した単球は、白色相／灰色相の外観を有するが、一方で遊出した単球は、黒色相の外観を有する。

接着細胞及び遊出細胞を、動画シーケンスを再生することによって、実験の期間中、０．１９ｍｍ^２の画定された領域内の各画像上の固定グリッド内で計数した。各細胞数に対する時点は、実験全体を通して固定の時点で行われる。

接着細胞の総数は、各時点での捕捉細胞の合計を表す；遊出する百分率（灰色相＋黒色相）。遊出事象（黒色相）は、単位視野当たりの流れから捕捉された総単球（灰色相＋黒色相）の百分率である。単球は、典型的には、共培養の期間にわたる非常に少ない分離事象により接着したままである。

全ての実験は、３通りの視野を用いて実施し、＋標準誤差測定（＋ＳＥＭ）により平均値として示した。統計分析はパラメトリック分布を仮定し、スチューデントＴ検定を用いて行った。有意性スコアからのＰ値は次の通りに図に示す：^＊Ｐ＜．０５、^＊＊Ｐ＜．０１、^＊＊＊Ｐ＜．００５（ＢｒａｄｆｉｅｌｄＰＦら、「Ｂｌｏｏｄ．」、２００７Ｏｃｔ１；第１１０巻（第７号）：第２５４５～５５頁）。

結果－内皮単層を通る単球の輸送に対するＥＤＢ依存的ＬＴＢＲ媒介性内皮活性化の効果
この実施例は、内皮細胞がそれらの表面にＬＴＢＲを発現することが以前より示されてきたように、単球の接着及び遊走に対する内皮細胞単層上のＥＤＢ依存的ＬＴＢＲ活性化の影響を研究する（Ｌｕｋａｓｈｅｖら、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」、第６６巻（第１９号）：第９６１７～２４頁（２００６年））。

図１１Ａは、非標的化対照分子ＣＯＶＡ１４１３６（アイソタイプ対照／ＬＴＢＲ）で活性化された単層と比較して、ＣＯＶＡ１４１３３（ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性）で活性化されたＥＤＢ含有フィブロネクチンの存在下において成長させたＨＵＶＥＣ単層に、より多くの単球が接着できることを示す。

図１１Ｂは、接着だけでなく、ＣＯＶＡ１４１３３により活性化した後のＨＵＶＥＣ単層を通る単球の遊出もまた、非標的化対照ＣＯＶＡ１４１３６とインキュベートしたＨＵＶＥＣと比較して増加することを示す。

結論として、この実施例の結果は、本発明の分子が、先に記載されたＬＴα１β２抗体融合とは異なり、ＥＤＢ含有フィブロネクチンの存在下でのみＬＴＢＲを活性化することができ、ＬＴＢＲ活性化に所望の腫瘍特異性を与えるという明確な利点を有することを、更に確認する。

配列表
配列番号１（ＨＣＢＨＡ１０ＩｇＧ１ノブ）
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配列番号２（ＬＣＢＨＡ１０）
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配列番号３（ＨＣＬ１９ＩｇＧ１ノブ）
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配列番号４（ＨＣＬ１９ＩｇＧ１ホール）
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配列番号５（ＬＣＬ１９）
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配列番号６（ＨＣＢ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ノブ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７（ＨＣＢ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ホール）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８［ＬＣＢ２１Ｍ（ＲＳＶ）］
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号９ＨＣ（ＣＢＥ１１ＩｇＧ１ノブ）
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配列番号１０（ＬＣＣＢＥ１１）
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配列番号１１（ＨＣＢＨＡ１０ＩｇＧ１）
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配列番号１２（ＨＣＬ１９ＩｇＧ１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号１３（ＨＣＣＢＥ１１ＩｇＧ１）
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配列番号１４（ＨＣＢ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号１５（ＩｇＧ１、ノブ、及びｐＡ変異を伴うＦｃへの３ｘｈｍＬＩＧＨＴ融合）
ＲＲＳＨＥＶＮＰＡＡＨＬＴＧＡＮＳＳＬＴＧＳＧＧＰＬＬＷＥＴＱＬＧＬＡＦＬＲＧＬＳＹＨＤＧＡＬＶＶＴＫＴＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬＧＧＶＧＣＰＬＧＬＡＧＴＩＴＨＧＬＹＫＲＴＰＲＹＰＥＥＬＥＬＬＶＳＱＱＳＰＣＧＲＡＴＳＳＳＲＶＷＷＤＳＳＦＬＧＧＶＶＨＬＥＡＧＥＫＶＶＶＲＶＬＧＫＲＬＶＲＬＲＤＧＴＲＳＹＦＧＡＦＭＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＲＳＨＥＶＮＰＡＡＨＬＴＧＡＮＳＳＬＴＧＳＧＧＰＬＬＷＥＴＱＬＧＬＡＦＬＲＧＬＳＹＨＤＧＡＬＶＶＴＫＴＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬＧＧＶＧＣＰＬＧＬＡＧＴＩＴＨＧＬＹＫＲＴＰＲＹＰＥＥＬＥＬＬＶＳＱＱＳＰＣＧＲＡＴＳＳＳＲＶＷＷＤＳＳＦＬＧＧＶＶＨＬＥＡＧＥＫＶＶＶＲＶＬＧＫＲＬＶＲＬＲＤＧＴＲＳＹＦＧＡＦＭＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＲＳＨＥＶＮＰＡＡＨＬＴＧＡＮＳＳＬＴＧＳＧＧＰＬＬＷＥＴＱＬＧＬＡＦＬＲＧＬＳＹＨＤＧＡＬＶＶＴＫＴＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬＧＧＶＧＣＰＬＧＬＡＧＴＩＴＨＧＬＹＫＲＴＰＲＹＰＥＥＬＥＬＬＶＳＱＱＳＰＣＧＲＡＴＳＳＳＲＶＷＷＤＳＳＦＬＧＧＶＶＨＬＥＡＧＥＫＶＶＶＲＶＬＧＫＲＬＶＲＬＲＤＧＴＲＳＹＦＧＡＦＭＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号１６（融合に使用される３ｘｈｍＬＩＧＨＴ単鎖）
ＲＲＳＨＥＶＮＰＡＡＨＬＴＧＡＮＳＳＬＴＧＳＧＧＰＬＬＷＥＴＱＬＧＬＡＦＬＲＧＬＳＹＨＤＧＡＬＶＶＴＫＴＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬＧＧＶＧＣＰＬＧＬＡＧＴＩＴＨＧＬＹＫＲＴＰＲＹＰＥＥＬＥＬＬＶＳＱＱＳＰＣＧＲＡＴＳＳＳＲＶＷＷＤＳＳＦＬＧＧＶＶＨＬＥＡＧＥＫＶＶＶＲＶＬＧＫＲＬＶＲＬＲＤＧＴＲＳＹＦＧＡＦＭＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＲＳＨＥＶＮＰＡＡＨＬＴＧＡＮＳＳＬＴＧＳＧＧＰＬＬＷＥＴＱＬＧＬＡＦＬＲＧＬＳＹＨＤＧＡＬＶＶＴＫＴＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬＧＧＶＧＣＰＬＧＬＡＧＴＩＴＨＧＬＹＫＲＴＰＲＹＰＥＥＬＥＬＬＶＳＱＱＳＰＣＧＲＡＴＳＳＳＲＶＷＷＤＳＳＦＬＧＧＶＶＨＬＥＡＧＥＫＶＶＶＲＶＬＧＫＲＬＶＲＬＲＤＧＴＲＳＹＦＧＡＦＭＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＲＳＨＥＶＮＰＡＡＨＬＴＧＡＮＳＳＬＴＧＳＧＧＰＬＬＷＥＴＱＬＧＬＡＦＬＲＧＬＳＹＨＤＧＡＬＶＶＴＫＴＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬＧＧＶＧＣＰＬＧＬＡＧＴＩＴＨＧＬＹＫＲＴＰＲＹＰＥＥＬＥＬＬＶＳＱＱＳＰＣＧＲＡＴＳＳＳＲＶＷＷＤＳＳＦＬＧＧＶＶＨＬＥＡＧＥＫＶＶＶＲＶＬＧＫＲＬＶＲＬＲＤＧＴＲＳＹＦＧＡＦＭＶ

配列番号１７（融合に使用されるＬＴａ１ｂ２）
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配列番号１８（ＬＴａ１ｂ２ＩｇＧ１へのＨＣＢ２１Ｍ融合）
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配列番号１９（ＬＴａ１ｂ２へのＨＣＢ２１Ｍ融合、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号２０（ＬＴａ１ｂ２ＩｇＧ１へのＨＣＬ１９融合）
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配列番号２１（ＬＴａ１ｂ２へのＨＣＬ１９融合、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号２２［ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
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配列番号２３［ステープル処理ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）］
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配列番号２４［ステープル処理リンカー（ＶＨ－ＶＬ）］
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配列番号２５［ジスルフィド安定化ｓｃＦｖＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
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配列番号２６（ＨＣＢ２１ＭＮ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号２７（ＨＣＢ２１ＭＮ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号２８（ＨＣＢ２１ＭＣ末端ステープル処理ＢＨＡ（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号２９（ＨＣＢ２１ＭＣ末端ステープル処理ＢＨＡ（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号３０（ＨＣＬ１９Ｎ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３１（ＨＣＬ１９Ｎ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３２（ＨＣＬ１９Ｃ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３３（ＨＣＬ１９Ｃ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３４（ＨＣＬ１９Ｃ末端ステープル処理（ＶＬ３＿Ｙ３６ＦＳ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ）ＢＨＡ（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３５（ＨＣＬ１９Ｃ末端ステープル処理（ＶＨ＿ＣＤＲ１＿Ｙ３３Ａ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３６（ＨＣＢ２１ＭＣ末端ステープル処理（ＶＬ３＿Ｙ３６ＦＳ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ）ＢＨＡ（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３７（ＨＣＢ２１ＭＣ末端ステープル処理（ＶＨ＿ＣＤＲ１＿Ｙ３３Ａ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
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配列番号３８（ＨＣＬ１９Ｃ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異なし）
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配列番号３９（ＨＣＬ１９Ｃ末端ジスルフィド安定化、ＢＨＡ（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異なし）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号４０（ＨＣＢ２１ＭＣ末端ジスルフィド安定化、ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異なし）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号４１（ＨＣＢ２１ＭＣ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異なし）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号４２［（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ中のＦｖフラグメントを接続するために使用）］
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

配列番号４３（ＶＨＢＨＡ１０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号４４（ＶＬＢＨＡ１０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号４５（ＶＨＬ１９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

配列番号４６（ＶＬＬ１９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号４７（ＶＨＣＢＥ１１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＥＮＧＮＦＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号４８（ＶＬＣＢＥ１１）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＧＱＤＩＫＳＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＡＴＲＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ

配列番号４９（ＶＨＢ２１Ｍ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

配列番号５０（ＶＬＢ２１Ｍ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号５１（フィブロネクチンドメイン７Ｂ８９）
ＰＬＳＰＰＴＮＬＨＬＥＡＮＰＤＴＧＶＬＴＶＳＷＥＲＳＴＴＰＤＩＴＧＹＲＩＴＴＴＰＴＮＧＱＱＧＮＳＬＥＥＶＶＨＡＤＱＳＳＣＴＦＤＮＬＳＰＧＬＥＹＮＶＳＶＹＴＶＫＤＤＫＥＳＶＰＩＳＤＴＩＩＰＥＶＰＱＬＴＤＬＳＦＶＤＩＴＤＳＳＩＧＬＲＷＴＰＬＮＳＳＴＩＩＧＹＲＩＴＶＶＡＡＧＥＧＩＰＩＦＥＤＦＶＤＳＳＶＧＹＹＴＶＴＧＬＥＰＧＩＤＹＤＩＳＶＩＴＬＩＮＧＧＥＳＡＰＴＴＬＴＱＱＴＡＶＰＰＰＴＤＬＲＦＴＮＩＧＰＤＴＭＲＶＴＷＡＰＰＰＳＩＤＬＴＮＦＬＶＲＹＳＰＶＫＮＥＥＤＶＡＥＬＳＩＳＰＳＤＮＡＶＶＬＴＮＬＬＰＧＴＥＹＶＶＳＶＳＳＶＹＥＱＨＥＳＴＰＬＲＧＲＱＫＴＧＬＤＳＰＴＧＩＤＦＳＤＩＴＡＮＳＦＴＶＨＷＩＡＰＲＡＴＩＴＧＹＲＩＲＨＨＰＥＨＦＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＬＴＰＧＴＥＹＶＶＳＩＶＡＬＮＧＲＥＥＳＰＬＬＩＧＱＱＳＴＨＨＨＨＨＨ

配列番号５２（フィブロネクチンドメイン７８９）
ＰＬＳＰＰＴＮＬＨＬＥＡＮＰＤＴＧＶＬＴＶＳＷＥＲＳＴＴＰＤＩＴＧＹＲＩＴＴＴＰＴＮＧＱＱＧＮＳＬＥＥＶＶＨＡＤＱＳＳＣＴＦＤＮＬＳＰＧＬＥＹＮＶＳＶＹＴＶＫＤＤＫＥＳＶＰＩＳＤＴＩＩＰＡＶＰＰＰＴＤＬＲＦＴＮＩＧＰＤＴＭＲＶＴＷＡＰＰＰＳＩＤＬＴＮＦＬＶＲＹＳＰＶＫＮＥＥＤＶＡＥＬＳＩＳＰＳＤＮＡＶＶＬＴＮＬＬＰＧＴＥＹＶＶＳＶＳＳＶＹＥＱＨＥＳＴＰＬＲＧＲＱＫＴＧＬＤＳＰＴＧＩＤＦＳＤＩＴＡＮＳＦＴＶＨＷＩＡＰＲＡＴＩＴＧＹＲＩＲＨＨＰＥＨＦＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＬＴＰＧＴＥＹＶＶＳＩＶＡＬＮＧＲＥＥＳＰＬＬＩＧＱＱＳＴＨＨＨＨＨＨ

配列番号５３［ステープル処理ｓｃＦｖ（ＶＬ３＿Ｙ３６Ｆ＿Ｓ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号５４［ステープル処理ｓｃＦｖ（ＶＨ＿ＣＤＲ１＿Ｙ３３Ａ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号５５［ステープル処理リンカー（ＶＬ－ＶＨ）］
ＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧ

配列番号５６（ＨＣＬ１９Ｃ末端ジスルフィド安定化、ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号５７（ＨＣＢ２１ＭＣ末端ジスルフィド安定化、ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号５８（ＩｇＧ１シグマＦｃ）
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号５９［（ＧＧＧＧＳ）３リンカーｓｃＦｖ対Ｆｃ］
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

配列番号６０（ＶＨＢＨＡ１０のＨＣＤＲ１）
ＴＹＹＬＨ

配列番号６１（ＶＨＢＨＡ１０のＨＣＤＲ２）
ＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧ

配列番号６２（ＶＨＢＨＡ１０のＨＣＤＲ３）
ＳＷＥＧＦＰＹ

配列番号６３（ＶＬＢＨＡ１０のＬＣＤＲ１）
ＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡ

配列番号６４（ＶＬＢＨＡ１０のＬＣＤＲ２）
ＳＡＳＹＲＹＳ

配列番号６５（ＶＬＢＨＡ１０のＬＣＤＲ３）
ＱＱＹＤＴＹＰＦＴ

配列番号６６（ＶＨＣＢＥ１１のＨＣＤＲ１）
ＤＹＹＭＹ

配列番号６７（ＶＨＣＢＥ１１のＨＣＤＲ２）
ＴＩＳＤＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫ

配列番号６８（ＶＨＣＢＥ１１のＨＣＤＲ３）
ＥＥＮＧＮＦＹＹＦＤＹ

配列番号６９（ＶＬＣＢＥ１１のＬＣＤＲ１）
ＫＡＧＱＤＩＫＳＹＬＳ

配列番号７０（ＶＬＣＢＥ１１のＬＣＤＲ２）
ＹＡＴＲＬＡＤ

配列番号７１（ＶＬＣＢＥ１１のＬＣＤＲ３）
ＬＱＨＧＥＳＰＷＴ

配列番号７２（ＶＨＬ１９のＨＣＤＲ１）
ＳＦＳＭＳ

配列番号７３（ＶＨＬ１９のＨＣＤＲ２）
ＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ

配列番号７４（ＶＨＬ１９のＨＣＤＲ３）
ＰＦＰＹＦＤＹ

配列番号７５（ＶＬＬ１９のＬＣＤＲ１）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡ

配列番号７６（ＶＬＬ１９のＬＣＤＲ２）
ＹＡＳＳＲＡＴ

配列番号７７（ＶＬＬ１９のＬＣＤＲ３）
ＱＱＴＧＲＩＰＰＴ

配列番号７８（ＶＨＭＳＬＮｍＡｂ１）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳ

配列番号７９（ＶＬＭＳＬＮｍＡｂ１）
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号８０（ＭＳＬＮｍＡｂ１ＨＣＣ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号８１（ＨＣＭＳＬＮｍＡｂ１ＩｇＧ１ホール）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８２（ＬＣＭＬＳＮｍＡｂ１）
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号８３（ＢＨＡ１０ＨＣＤＲ１低親和性バリアント）
ＴＹＡＬＨ

配列番号８４（ＨＣＬ１９ＩｇＧ１ノブ、ｐＡ変異あり）
ＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８５（ＨＣＢ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８６（ＭＳＬＮｍＡｂ１ＨＣ、ＩｇＧ１、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Claims

多重特異性結合分子であって、以下：
（ｉ）リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）に特異的に結合する第１の結合ドメインと、
（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異的に結合する第２の結合ドメインと、を含み、
前記多重特異性結合分子が、前記ＥＤＢの結合の際にＬＴＢＲを活性化する、多重特異性結合分子。
前記多重特異性結合分子が、腫瘍特異的様式でＬＴＢＲを活性化する、請求項１に記載の多重特異性結合分子。
前記多重特異性結合分子が、二重特異性抗体である、請求項１又は２に記載の多重特異性結合分子。
前記多重特異性結合分子が、２つの抗原結合ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
前記多重特異性結合分子が、３つの抗原結合ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
前記３つの抗原結合ドメインが、ＬＴＢＲに特異的に結合する１つの結合ドメインを含む、請求項５に記載の多重特異性結合分子。
前記３つの抗原結合ドメインが、ＥＤＢに特異的に結合する２つの結合ドメインを含む、請求項５又は６に記載の多重特異性結合分子。
ＬＴＢＲに特異的に結合する前記結合ドメインが、抗体の単鎖可変ドメインを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
ＬＴＢＲに特異的に結合する前記第１の結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、以下：
（ｉ）それぞれ、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）それぞれ、配列番号８３、配列番号６１、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｖ）ＶＨが、配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）ＶＨが、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む：又は
（ｖｉ）配列番号２２；又は
（ｖｉｉ）配列番号２３；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５
のうちのいずれかを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
ＥＤＢに特異的に結合する前記第２の結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、以下：
（ｉ）それぞれ、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
のうちのいずれかを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
以下：
（ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、
のうちのいずれかを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
以下：
（ａ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｂ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｃ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３２のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｄ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｅ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｆ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３５のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｇ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｈ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖；又は
（ｉ）（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号５６のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖、
のうちのいずれかを含む、請求項１～３又は５～１０のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
（ｉ）重鎖部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号３８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ重鎖融合、及び（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と共に結合ドメインを形成する、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～３又は５～１０のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子をコードする、１つ以上の核酸分子。
請求項１４に記載の１つ以上の核酸分子を含む、１つ以上のベクター。
請求項１４に記載の１つ以上の核酸分子又は請求項１５に記載の１つ以上のベクターを含む、単離された宿主細胞。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子、請求項１４に記載の１つ以上の核酸分子、請求項１５に記載の１つ以上のベクター、又は請求項１７に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
腫瘍組織におけるＬＴＢＲを活性化するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子、請求項１４に記載の１つ以上の核酸分子、請求項１５に記載の１つ以上のベクター、又は請求項１７に記載の医薬組成物の、使用。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子を産生する方法であって、請求項１４に記載の１つ以上の核酸分子又は請求項１５に記載の１つ以上のベクターを宿主細胞中で発現させることと、前記多重特異性結合分子を収集することと、を含む、方法。