JP7043422B2 - C末端融合tnfファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子 - Google Patents
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Description
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができる一つのFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原への結合に対して一価である、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができる一つのFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドが、配列番号:9及び配列番号:10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドが、配列番号:1及び配列番号:5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドが配列番号:9のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドが配列番号:10のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドが配列番号:5のアミノ酸配列を含む。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができる一つのFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。従って、本発明は、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が標的細胞抗原への結合に対して一価である、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
(a)(i)配列番号:13のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:14のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び(iii)配列番号:15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン、又は
(b)(i)配列番号:19のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)(i)配列番号:29のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:30のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:31のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:32のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:33のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:34のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン、又は
(b)(i)配列番号:35のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:36のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:37のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:38のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:39のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:40のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメインを含み、該Fcドメインが、Fc受容体、特にFcγ受容体への結合を減少させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、上述のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのN末端にC末端で融合された、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのN末端にC末端で融合された、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのN末端にC末端で融合された、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのN末端にC末端で融合された、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチド、及び
(d)標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメイン
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
他の定義がなされない限り、ここで使用される技術及び科学用語は、この発明が属する分野において一般的に使用されているものと同じ意味を有する。この明細書を解釈する目的で、次の定義が適用され、適宜、単数形で使用された用語は複数形をまた含み、その逆もしかりである。
1 表Aにおける全てのCDRの定義の番号付けは、Kabat等(以下参照)によって規定された番号付けの規定に従う。
2 表Aで使用される小文字の「b」を含む「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されたCDRを指す。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2により、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて完全な一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは等しくないことは理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用される全てのアミノ酸配列同一性%値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載されたようにして得られる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明は、生産性、安定性、堅牢性、結合親和性、生物学的活性、ターゲティング効率、及び毒性低減などの特に有利な性質を有する新規なTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結された共刺激性TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記共刺激性TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、共刺激性TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。よって、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーがヒトT細胞活性化を共刺激する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドは、配列番号:9及び配列番号:10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドは、配列番号:1及び配列番号:5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドは配列番号:9のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドは配列番号:1のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドは配列番号:10のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドは配列番号:5のアミノ酸配列を含む。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができる一つのFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。従って、本発明は、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が、標的細胞抗原への結合に対して一価であるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
(a)(i)配列番号:13のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:14のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び(iii)配列番号:15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン又は
(b)(i)配列番号:19のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)(i)配列番号:29のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:30のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:31のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:32のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:33のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:34のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン、又は
(b)(i)配列番号:35のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:36のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:37のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:38のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:39のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:40のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメインを含み、該Fcドメインが、Fc受容体、特にFcγ受容体への結合を減少させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、上述のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは二量体であり、その各々のサブユニットはCH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、Fcドメインが、Fc受容体、特にFcγ受容体への結合を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、Fcドメインが、Fc受容体、特にFcγ受容体への結合を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。よって、それらは、典型的には二つの非同一ポリペプチド鎖(「重鎖」)に含まれるFcドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合された異なる部分を含む。これらのポリペプチドの組換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの幾つかの可能な組み合わせをもたらす。従って、組換え産生におけるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の収率及び純度を改善するためには、本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のFcドメイン内に所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチド、及び
(d)標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメイン
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
二つの異なるFabドメインを含む抗原結合分子における正確な対合を更に向上させるために、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換(いわゆる「荷電残基」)を含みうる。これら修飾は、交差又は非交差CH1及びCLドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、CLドメインの一つにおいて、123位(EU番号付け)のアミノ酸がアルギニン(R)によって置換され、124位(EU番号付け)のアミノ酸がリジン(K)で置換されており、CH1ドメインの一つにおいて、147位(EU番号付け)及び213位(EU番号付け)のアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチド、及び
(d)クロスオーバーFabである標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメイン
を含み、CLドメインにおいて、123位(EU番号付け)のアミノ酸がアルギニン(R)によって置換され、124位(EU番号付け)のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており、TNFリガンドファミリーメンバーに隣接するCH1ドメインにおいて、147位(EU番号付け)及び213位(EU番号付け)のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
一態様では、
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのN末端にC末端で融合される、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのN末端にC末端で融合される、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのN末端にC末端で融合される、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ホール変異を含むFcドメインの第一サブユニットのN末端にC末端で融合される、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)であるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号:25のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:26のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は配列番号:27のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:28のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、FAPに特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号:25のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:26のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は配列番号:27のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:28のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、FAPに特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドが配列番号:9及び配列番号:10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドが配列番号:1及び配列番号:5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号:27のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:28のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、FAPに特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含む第一ポリペプチドが配列番号:10のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第二ポリペプチドが配列番号:5のアミノ酸配列を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖、
(ii)Fcドメインの第一サブユニットと、ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドであって、Fcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドとを含む融合ポリペプチド、及び
(iii)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVHドメイン、Fcドメインの第二サブユニット、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドを含む重鎖を含み、FAPに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、Fcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:105のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:105のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:113のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:113のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:177のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:177のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:182のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:182のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖、
(ii)Fcドメインの第一サブユニットと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、及び
(iii)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVHドメイン、Fcドメインの第二サブユニット、及びペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドを含む重鎖であって、FAPに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、Fcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている重鎖を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:110のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:110のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:116のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:116のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:173のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:173のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:180のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:114のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:180のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む第一軽鎖、
(ii)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVHドメイン、Fcドメインの第一サブユニット、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドを含む第一重鎖であって、FAPに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖がFcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、第二ポリペプチドがFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている、第一重鎖、
(iii)標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメインのVHドメイン、Fcドメインの第二サブユニット、及びペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドを含む第二重鎖であって、標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメインの可変重鎖がFcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている第二重鎖、及び
(iv)標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメインのVLドメインを含む第二軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第一軽鎖、
(ii)配列番号:217のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:218のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、
(ii)配列番号:217のアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:218のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、
を含む。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:222のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:221のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、
(ii)配列番号:222のアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:221のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、
を含む。
(i)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む第一軽鎖、
(ii)FAPに特異的に結合することができるFabドメインのVHドメイン、Fcドメインの第一サブユニット、及びペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドを含む第一重鎖であって、FAPに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖がFcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、TNFリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドがFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている、第一重鎖
(iii)標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメインのVHドメイン、Fcドメインの第二サブユニット、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドを含む第二重鎖であって、標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメインの可変重鎖がFcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている第二重鎖、及び
(iv)標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメインのVLドメインを含む第二軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第一軽鎖、
(ii)配列番号:212のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:213のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、
(ii)配列番号:212のアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:213のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、
を含む。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:226のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:225のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、
(ii)配列番号:226のアミノ酸配列を含む第一重鎖、
(iii)配列番号:225のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び
(iv)配列番号:214のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、
を含む。
一態様では、標的細胞抗原がCD19であるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号:41のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:42のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は配列番号:43のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:44のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、CD19に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号:41のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:42のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は配列番号:43のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:44のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、CD19に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドが配列番号:9及び配列番号:10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドが配列番号:1及び配列番号:5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号:43のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:44のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、CD19に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含む第一ポリペプチドが配列番号:10のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第二ポリペプチドが配列番号:5のアミノ酸配列を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)CD19に特異的に結合することができるFabドメインの可変軽鎖を含む軽鎖、
(ii)Fcドメインの第一サブユニットと、ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドであって、Fcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドとを含む融合ポリペプチド、及び
(iii)CD19に特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖、Fcドメインの第二サブユニット、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドを含む重鎖を含み、CD19に特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、Fcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:119のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:119のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:125のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:125のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:186のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:186のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:190のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:190のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)CD19に特異的に結合することができるFabドメインの可変軽鎖を含む軽鎖、
(ii)Fcドメインの第一サブユニットと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、及び
(iii)CD19に特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖、Fcドメインの第二サブユニット、及びペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドを含む重鎖であって、CD19に特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、Fcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている重鎖を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:122のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:122のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:128のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:128のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:184のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:120のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:184のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:188のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:126のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:188のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一態様では、標的細胞抗原がCEAであるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号:51のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:52のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、CEAに特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号:51のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:52のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、CEAに特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドが配列番号:9及び配列番号:10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドが配列番号:1及び配列番号:5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号:51のアミノ酸配列を含むVHドメインと配列番号:52のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、CEAに特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含み、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含む第一ポリペプチドが配列番号:10のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第二ポリペプチドが配列番号:5のアミノ酸配列を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)CEAに特異的に結合することができるFabドメインの可変軽鎖を含む軽鎖、
(ii)Fcドメインの第一サブユニットと、ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドであって、Fcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドとを含む融合ポリペプチド、及び
(iii)CEAに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖、Fcドメインの第二サブユニット、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドを含む重鎖を含み、CEAに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、Fcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:155のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:155のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:194のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:194のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)CEAに特異的に結合することができるFabドメインの可変軽鎖を含む軽鎖、
(ii)Fcドメインの第一サブユニットと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、及び
(iii)CEAに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖、Fcドメインの第二サブユニット、及びペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドを含む重鎖であって、CEAに特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、Fcドメインの第二サブユニットのN末端にそのC末端で融合され、TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている重鎖を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:158のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:109のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:158のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:192のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号:156のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:192のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
本発明は更にここに記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えば、メリフィールド固相合成)又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生では、例えば上記のような、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、更なるクローニング及び/又は宿主細胞における発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され、配列決定されうる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルと共にTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術及びインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis等, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);及びAusubel等, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載された技術を参照のこと。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でありうるか、又は核酸断片でありうる。発現ベクターは、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド(すなわちコード領域)が、プロモーター及び/又は他の転写もしくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。ここで使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられるが、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’未翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一ベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別個の(異なる)ベクター上に存在しうる。更に、任意のベクターは単一のコード領域を含んでいてもよいし、二つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、最終タンパク質に翻訳後又は翻訳と同時に分離される一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子もしくはそのポリペプチド断片、又はその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合された又は非融合の異種コード領域をコードしうる。異種コード領域は、限定されないが、特殊化されたエレメント又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能な結合は、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、一又は複数の制御配列と結合されるときである。(ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような)二つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらし、かつ二つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNA鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合されうる。
ここに提供される抗原結合分子は、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定され、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴付けられる。
対応するTNF受容体に対するここに提供されるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の親和性は、実施例に記載の方法に従い、Biacore(登録商標)機器(GE Healthcare)のような標準的機器類と、組換え発現により得られうるもののような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により決定することができる。TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のその標的細胞抗原に対する親和性もまた、BIAcore機器(GE Healthcare)のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により決定することができる。結合親和性を測定するための特定の例証的で例示的な実施態様を、実施例3に記載する。一態様によれば、KDは、25℃においてBIACORE(登録商標)T100マシン(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により測定される。
ここで提供されるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、評価することができる。一態様では、TNF受容体を発現する新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)が結合アッセイに使用される(実施例6.1及び7.1)。これらの細胞は、単離後に直接(ナイーブPMBC)又は刺激後(活性化PMBC)に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞(TNF受容体分子を発現)を使用して、本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の対応するTNF受容体発現細胞への結合を実証した。
一態様では、特異的標的細胞抗原及び生物学的活性を有する特異的TNF受容体に結合するTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性には、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のTNF受容体を介したアゴニストシグナル伝達が含まれうる。インビトロでこのような生物学的活性を有するものとしてアッセイによって同定されたTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子もまた提供される。
更なる態様では、本発明は、例えば以下の治療法の何れかに使用される、ここで提供されるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れかを含有する薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、ここに提供されるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れかと少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する。他の実施態様では、薬学的組成物は、ここで提供されるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れかと、例えば以下に記載されるような少なくとも一種の追加の治療剤とを含有する。
ここに提供されるTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れも、治療方法に使用することができる。
本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、治療法において一又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されうる。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも一種の追加的治療剤と同時投与されうる。「治療剤」という用語は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加的治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含みうる。所定の実施態様では、追加的治療剤は別の抗がん剤又は免疫療法である。
本発明の別の態様では、上述の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のもしくは容器に付随したラベル又は添付文書とを含む。好適な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、単独で又は別の組成物と併用されて、症状の治療、予防、及び/又は診断に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる)。組成物中の少なくとも一種の活性剤は、本発明のTNFリガンド三量体含有抗原結合分子である。
1. TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドであって、Fcドメインのサブユニットの一つのC末端にそのN末端で融合された第一ポリペプチドと、Fcドメインの他のサブユニットのC末端にそのN末端で融合された第二ポリペプチドを含む、TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
2. TNFリガンドファミリーメンバーがヒトT細胞活性化を共刺激する、パラ1に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
3. TNFリガンドファミリーメンバーが、4-1BBL及びOX40Lから選択される、パラ1又は2に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
4. TNFリガンドファミリーメンバーが4-1BBLである、パラ1から3の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
5. TNFリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7及び配列番号:8からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号:1又は配列番号:5のアミノ酸配列を含む、パラ1から4の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
6. TNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドが配列番号:9及び配列番号:10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドが配列番号:1及び配列番号:5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、パラ1から5の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
7. TNFリガンドファミリーメンバーがOX40Lである、パラ1から3の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
8. TNFリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号:11及び配列番号:12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、パラ1から3又は7の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
9. TNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が標的細胞抗原への結合に対して一価である、パラ1から8の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
10. 標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、がん胎児抗原(CEA)、CD19、CD20及びCD33からなる群から選択される、パラ1から9の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
11. 標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)である、パラ1から10の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
12. FAPに特異的に結合することができるFabドメインが、
(a)(i)配列番号:13のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:14のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び(iii)配列番号:15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン、又は
(b)(i)配列番号:19のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
を含む、パラ1から11の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
13. FAPに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:26のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はFAPに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:27のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:28のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、パラ1から12の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
14. 標的細胞抗原がCD19である、パラ1から10の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
15. CD19に特異的に結合することができるFabドメインが、
(a)(i)配列番号:29のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:30のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:31のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:32のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:33のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:34のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン、又は
(b)(i)配列番号:35のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:36のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:37のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:38のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:39のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:40のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
を含む、パラ1から10又は14の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
16. CD19に特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:41のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:42のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はFAPに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:43のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:44のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、パラ1から10、14又は15の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
17. 標的細胞抗原がCEAである、パラ1から10の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
18. CEAに特異的に結合することができるFabドメインが、(i)配列番号:45のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:46のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:47のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:48のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:49のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:50のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む、パラ1から10又は17の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
19. CEAに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:51のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:52のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、パラ1から10、17又は18の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
20. FcドメインがIgG、特にIgG1 Fcドメイン又はIgG4 Fcドメインである、パラ1から19の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
21. Fcドメインが、234位及び235位(EU番号付け)及び/又は329位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含むIgG1 Fcドメインである、パラ1から20の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
22. Fcドメインの第一サブユニットがアミノ酸置換S354C及びT366W(KabatのEUインデックスによる番号付け)を含み、Fcドメインの第二サブユニットがアミノ酸置換Y349C、T366S、L368A及びY407V(KabatのEUインデックスによる番号付け)を含む、パラ1から21の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
23. ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合され、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドがFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている、パラ1から22の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
24. ペプチドリンカーによって互いに連結されたTNFリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第一ポリペプチドがFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合され、前記TNFリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第二ポリペプチドがFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合されている、パラ1から22の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
25. 標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインが、Fcドメインの第一サブユニットのN末端にC末端で融合されている、パラ1から24の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
26. (d)標的細胞抗原に特異的に結合することができないFabドメイン
を更に含む、パラ1から26の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
27. パラ1から16の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。
28 パラ27に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
29. パラ27に記載の単離されたポリヌクレオチド又はパラ28に記載のベクターを含む宿主細胞。
30. パラ1から26の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の産生方法であって、
(i)パラ29に記載の宿主細胞を、抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及び
(ii)抗原結合分子を回収する工程
を含む、方法。
31. パラ1から26の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する薬学的組成物。
32. 医薬として使用するための、パラ1から26の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又はパラ31に記載の薬学的組成物。
33. がんの治療における使用のための、パラ1から26の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又はパラ31に記載の薬学的組成物。
34. がんの治療のための医薬の製造のための、パラ1から26の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用。
35. 個体における疾患の治療方法において、薬学的に許容される形態でパラ1から26の何れか一に記載のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含有する組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
36. 前記疾患ががんである、パラ35に記載の方法。
Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用して、DNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A.等, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, NIH Publication No 91-3242に与えられている。
DNA配列は、二本鎖配列決定により決定した。
所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用してPCRによって作製されたか、自動遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物からGeneart AG(Regensburg, Germany)によって合成された。正確な遺伝子配列が利用できない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするRNAからRT-PCRによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング/シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞中での分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を含むように設計した。
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及びYamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体をプロテインAセファロースカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出は、pH2.8で達成し、続いて試料を直ちに中和させた。凝集したタンパク質をPBS又は20mMのヒスチジン、150mMのNaCl(pH6.0)中のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200,GE Healthcare)により単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)遠心濃縮器を使用して(必要に応じて)濃縮し、-20℃又は-80℃で凍結し保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴付けのために提供した。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を製造業者の指示に従って使用した。特に、10%又は4~12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)及びNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)酸化防止剤ランニング緩衝液添加剤を含む)又はMOPS(非還元ゲル)ランニング緩衝液を使用した。
抗体の凝集及びオリゴマー状態の測定のためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)をHPLCクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインA精製抗体を、Agilent HPLC 1100システム上の300mMのNaCl、50mMのKH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに又はDionex HPLCシステム上の2×PBS中のSuperdex200カラム(GE Healthcare)に適用した。溶出したタンパク質を、UV吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。BioRadゲル濾過スタンダード151-1901が標準となった。
この節では、その正しいアセンブリーに重点を置いて、VH/VL交換(VH/VL CrossMabs)を含む多重特異性抗体の特徴付けについて記載する。予想される一次構造は、脱グリコシル化されたインタクトなCrossMab、及び脱グリコシル化/プラスミン消化又は別の脱グリコシル化/限定LysC消化CrossMabのエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって分析した。
BIACORE機器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)を使用する表面プラズモン共鳴により、作製した抗体のそれぞれの抗原への結合を調べる。簡単に説明すると、親和性測定のために、ヤギ-抗ヒトIgG、JIR109-005-098抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のために、アミンカップリングによってCM5チップ上に固定する。結合は、HBS緩衝液(HBS-P(10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.005%のTween20,pH7.4)中、25℃(あるいは37℃)で測定する。抗原(R&D Systems又は社内で精製)を様々な溶液中濃度で加えた。結合を、80秒から3分の抗原注入によって測定し;解離を、チップ表面をHBS緩衝液で3~10分間洗浄して測定し、KD値を、1:1のラングミュア結合モデルを使用して推定した。陰性対照データ(例えば緩衝液曲線)を、系固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために試料曲線から減算する。それぞれのBiacore評価ソフトウェアを、センサーグラムの解析及び親和性データの計算に使用する。
一価標的ヒト4-1BBリガンド三量体含有Fc融合抗原結合分子の調製
1.1 4-1BBリガンドがC末端融合された一価FAP標的4-1BBリガンド三量体含有Fc(kih)融合抗原結合分子(コンストラクト1.11、2.11、1.12及び2.12)の調製(ノブ鎖上のFAP)
ヒト4-1BBリガンドのエクトドメインの一部をコードするDNA配列(アミノ酸71-248)をUniprotデータベースのP41273配列(配列番号:75)に従って合成した。
該分子は、抗FAPバインダーを抗CD19バインダーで置き換えたことを唯一の相違点として、一価FAP標的コンストラクトについて実施例1.1に記載されたようにして調製した。
1.3.1 抗CD19クローン8B8-018の生成
a)マウス抗ヒトCD19抗体(ハイブリドーマ)の免疫化及び生成
Balb/cマウスを6回免疫化し、CD19-トランスフェクトHEK293細胞(1細胞当たり平均受容体密度35000)で追加免疫した。免疫応答は、ヒトCD19-トランスフェクトNIH-3T3細胞においてCD19-細胞-ELISAを用いて血清試料を試験することによってモニターした。十分な力価の抗ヒトCD19抗体を有するマウスからの脾臓細胞を、マウスミエローマ細胞株P3X63 Ag8.653との融合による不死化に使用した。3回の融合を実施し、ハイブリドーマ上清を、ヒトCD19-トランスフェクトNIH-3T3細胞上の細胞-ELISA及び抗ヒトCD19特異的抗体用のDaudi(CD19+)及びCD19-細胞を使用するFACS結合アッセイによりスクリーニングした(国際公開第2011/147834号の実施例1を参照)。
ハイブリドーマをスクリーニングし、ヒトCD19に対する抗体を分泌するハイブリドーマを同定するために細胞ELISAを適用した。ヒトCD19によりトランスフェクトされたNIH3T3細胞を陽性細胞として使用した;トランスフェクトされていないNIH3T3細胞を陰性対照細胞として使用した。陽性ハイブリドーマの評価のために、トランスフェクトされたNIH3T3細胞とトランスフェクトされていないNIH3T3細胞との間のOD比を定量した。
- 培養培地:DMEM高グルコース(4.5mg/ml)、10%FCS、ピルビン酸Na、NEAA、グルタミン
- 陽性対照抗体:抗CD19モノクローナル抗体(IgG1)Pharmingenカタログ番号555409 c=1mg/ml
- 検出抗体:ヤギ抗マウスIgG(H+L)HRPコンジュゲートBio-Radカタログ番号170-06516
- 希釈 1×ELISAブロッキング試薬で1:2000
- 他の試薬:フィブロネクチン Rocheカタログ番号838039 c=1mg/ml
- グルタルジアルデヒド:25%原液//Grade Agar Scientific#R102 最終濃度:PBS中0.05%
- ELISAブロッキング試薬:10×原液//Rocheカタログ番号1112589
- TMB基質:Rocheカタログ番号11432559
- 停止液:1MのH2SO4
- BioRadカタログ番号170-6516 希釈 1×ELISAブロッキング試薬で1:2000
- フィブロネクチンコーティング:PBS中5μg/cm2;96ウェルプレート=32cm2;6ml中160μg/プレート
- PBS、50μl/ウェル
- 室温で45分間インキュベートし、コーティング溶液を吸引する
- 96ウェルプレート中の50μlの培養培地中に1.25×104細胞/ウェルで播種する
- 37℃において40時間インキュベートする
- プレートの上半分に加える:CD19を発現するNIH3T3細胞
- プレートの下半分に加える:トランスフェクトされていないNIH3T3細胞
- 50μlの培養培地中に陽性対照抗体又は試料(上清又はマウス血清)の添加
- 4℃において2時間インキュベートする
- 培地を除去し、100μlのグルタルジアルデヒド(PBS中0.05%)で細胞を固定する
- 200μlのPBSで2回洗浄する
- 検出抗体1:2000、50μl/ウェルの添加
- 室温で2時間インキュベートする
- 200μlのPBSで3回洗浄する
- 50μlのTMBを添加し、室温で30分間インキュベートする
- 25μlの1MのH2SO4を添加することにより停止する;450nm/620nmで吸光度を読み取る
- 結果の計算:OD NIH3T3 CD19:OD NIH3T3(トランスフェクトされていない)の比
マウス抗体のCD19結合特異性をヒトアクセプターフレームワークに移し、人体が異物と認識する配列伸長から生じる可能性のある免疫原性の問題を排除した。これは、マウス(ドナー)抗体の相補性決定領域(CDR)全体をヒト(アクセプター)抗体フレームワークに移植することによって行われ、CDR移植又は抗体ヒト化と呼ばれている。
単量体状態のヒト及びカニクイザルCD19エクトドメイン(ヒトCD19は配列番号:64参照)を発現させ精製するために、それぞれのDNA断片を「ノブ」変異を含むヒトIgG1 Fc遺伝子セグメントに融合させ(ヒト:配列番号:132;カニクイザル:配列番号:135)、「Fc-ホール」(配列番号:131)対応物でトランスフェクトした(Merchant等, 1998)。IgA切断部位(PTPPTP)を抗原エクトドメインとFcノブ鎖との間に導入した。定方向のビオチン化のためのAviタグを抗原-Fcノブ鎖のC末端に導入し、変異H435R及びY436Fを精製目的のためにFcホールに導入した(Jendeberg L.等, J. Immunological methods, 1997)。S354C/T366W変異(ヒト:配列番号:134;カニクイザル:配列番号:136)を含む抗原-Fcノブ鎖と、Y349C/T366S/L368A/Y407V変異(配列番号:133)を含むFcホール鎖との組み合わせは、CD19エクトドメインの単一コピーを含むヘテロ二量体Fc融合断片の生成を可能にする(図3Cの4-1BBコンストラクトと同様に)。表13は、抗原Fc融合コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を列挙する。
CDR-L1に位置する脱アミド部位N27d及びN28を持たない親和性成熟8B8由来抗体の作製は、標準的なプロトコール(Silacci等, 2005)を使用してファージディスプレイによって実施した。第一の工程では、ヒト化親クローン8B8のVL及びVH DNA配列(配列番号:137及び配列番号:138)をファージミドにクローニングし、ついで無作為化のための鋳型として使用した。次の工程では、ファージディスプレイによる好ましいクローンの選択のための2つのライブラリーを作製した。上記のホットスポット位置を除去するために、位置27d及び28のアミノ酸S T Q Eのみを許容したLCDR1無作為化プライマー(配列番号:139)を両方のライブラリーに使用した。成熟ライブラリー1は、軽鎖及び重鎖の両方のCDR1及び2において無作為化された一方、成熟ライブラリー2は、軽鎖のCDR1及び3並びに重鎖のCDR3において無作為化された。軽鎖及び重鎖の両方のCDR1及び2において無作為化された成熟ライブラリー1の作製のために、3つの断片を「重複伸長によるスプライシング」(SOE)PCRによって構築し、ファージベクターにクローニングした。次のプライマーの組み合わせを使用して、ライブラリー断片を作製した:断片1(LMB3(配列番号:144)及びCD19 L1リバースランダム(配列番号:139)、断片2(CD19 L2フォワードランダム(配列番号:140)及びCD19 H1リバースランダム(配列番号:141)、及び断片3(CD19 H2フォワードランダム(配列番号:142)及びCD19 H3リバースコンスタント(配列番号:143))(表13)。十分な量の全長無作為化断片のアセンブリー後、それを同様に処理したアクセプターファージミドベクターと一緒にNcoI/NheIで消化した。3倍モル過剰のライブラリーインサートを10μgのファージミドベクターとライゲートさせた。精製されたライゲーションを20回の形質転換に使用し、2×10exp9の形質転換体を得た。8B8親和性成熟ライブラリーを示すファージミド粒子を救出し、PEG/NaCl精製によって精製し、選択に使用した。
CDR-L1ホットスポットN27d及びN28を欠く親和性成熟クローンの選択のために、ファージディスプレイによる二つの選択アプローチを実施した:
1.上記の標準的な手順に従って、CD19 ECD又は無関係の膜貫通タンパク質の何れかを発現するコンストラクトによるHEK細胞のトランスフェクション、
2.5%CO2雰囲気を有するインキュベーター内で、37℃において合計48時間の細胞のインキュベーション、
3.遠心分離(250×gで3分間)による細胞の単離と、PBS/5%BSA中の1×10E7 CD19 ECD陽性細胞及び1×10E7陰性細胞のそれぞれの再懸濁、
4.穏やかに回転するチューブローテーターを使用してファージライブラリーを4℃において60分間、1×107のCD19陰性細胞と共にインキュベートすることによる非特異的ファージの前透明化、
5.250×gで3分間の細胞の遠心分離、新鮮なチューブへの上清の移入、1×10E7 CD19陽性細胞の添加、及びチューブローテーター上での穏やかな回転による4℃における60分間のインキュベーション、
6.250×gで1分間の遠心分離による細胞の洗浄、上清の吸引、及び1mlのPBS中に再懸濁(8回)、
7.1mlの100mMのTEAを用いたファージ溶出、室温で5分間のインキュベーション、及び500ulの1MのTris-HCl、pH7.6での溶出液の中和、
8.指数関数的に増殖する大腸菌TG1細菌の再感染、及び
9.ヘルパーファージVCSM13による感染とその後の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子の続くPEG/NaCl沈殿。選択は3ラウンドにわたって実施された。
ELISA陽性クローンを更に特徴付けるために、オフ速度を表面プラズモン共鳴によって測定し、親ヒト化クローン8B8と比較した。
該分子は、抗FAPバインダーを抗CEAバインダーで置き換えたことを唯一の相違点として、一価のFAP標的コンストラクトについて実施例1.1に記載されたようにして調製した。
1.5.1 抗CEAクローンT84.66のヒト化
ヒト生殖系列フレームワークアクセプター配列上へのCDRの移植によって、マウス抗体T84.66(Wagener等, J Immunol 130, 2308 (1983), Neumaier等, J Immunol 135, 3604 (1985))の新規なヒト化変異体を開発した。
T84.66 IgGの異なるヒト化変異体の結合を、CEA発現ヒト胃腺癌細胞(MKN45、DSMZ ACC409)で試験した。
該分子は、抗FAPバインダー(VH-VL)を抗原に結合しないDP47と呼ばれる生殖系列対照で置き換えたことを唯一の相違点として、一価のFAP標的コンストラクトについて実施例1.1に記載されたようにして調製した。
(G4S)2リンカーによって分離された4-1BBリガンドの二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図1a:ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンドに示されるように、ヒトIgG1 Fcホール又はノブ鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした(Merchant, Zhu 1998)。4-1BBリガンドの一つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図1B:ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンドに記載されているように、ヒトIgG1 Fcノブ又はホール鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした。
該分子は、抗FAPバインダーを抗CD19バインダーで置き換えたことを唯一の相違点として、一価のFAP標的4-1BBリガンド三量体含有Fc(kih)融合抗原結合分子について実施例1.7に記載されたようにして調製する。
該分子は、抗FAPバインダーを抗CEAバインダーで置き換えたことを唯一の相違点として、一価FAP標的コンストラクトについて実施例1.7に記載されたようにして調製する。
該分子は、抗FAPバインダー(VH-VL)を抗原に結合しないDP47と呼ばれる生殖系列対照で置き換えたことを唯一の相違点として、一価のFAP標的コンストラクトについて実施例1.7に記載されたようにして調製した。
図3Bに示されるN末端に融合した4-1BBL部分を有する分子である対照Dを、抗原に結合しないDP47と呼ばれる生殖系列対照と組み合わせて調製した。
一価標的ヒト4-1BBリガンド三量体含有Fc融合抗原結合分子の産生
標的及び非標的一価三量体4-1BBリガンドC末端Fc(kih)融合抗原結合分子をコードする配列を、MPSVプロモーターからの挿入断片の発現を駆動し、CDSの3’末端に位置する合成ポリA配列を含むプラスミドベクター中にクローニングした。加えて、ベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのEBV OriP配列を含む。
表面プラズモン共鳴による親和性決定
3.1 抗原の調製、精製及び特徴付け又は表面プラズモン共鳴
[ヒトCD19Fc融合タンパク質]
ヒトIgG1 Fcドメインに融合したヒトCD19エクトドメインの調製、精製及び特徴付けは、実施例1.3.2に記載されている。
ヒト4-1BBのエクトドメイン(Q07011、アミノ酸24-186)を、avi(GLNDIFEAQKIEWHE、配列番号:245)及びヘキサヒスチジンタグ(表40)とインフレームでサブクローニングした。
組換え4-1BB又はCD19への標的分断三量体C末端4-1BBリガンド抗原結合分子の結合を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全てのSPR実験は、ランニング緩衝液(0.01MのHEPES,pH7.4、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P20、Biacore、Freiburg/Germany)としてHBS-EPを用いて25℃においてBiacore T200で実施した。
抗ヒトFc抗体(Biacore,Freiburg/Germany)を、標準アミンカップリングキット(Biacore,Freiburg/Germany)を使用してpH5.0でCM5チップ上に直接カップリングさせた。固定化レベルはおよそ4000RUであった。標的分断三量体C末端4-1BBリガンドを4nMの濃度で90秒間捕捉した。組換えヒト4-1BB avi hisを2.7~2000nMの濃度範囲で30μL/分の流量で120秒にわたってフローセルに通した。解離を120秒間モニターした。バルク屈折率の差を、基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。ここで、抗原は、固定された抗ヒトFc抗体を伴うが抗体ではなくHBS-EPが注入された表面上を通過させた。
抗ヒトFab抗体(Biacore,Freiburg/Germany)を、標準アミンカップリングキット(Biacore,Freiburg/Germany)を使用してpH5.0でCM5チップ上に直接カップリングさせた。固定化レベルはおよそ7000RUであった。標的分断三量体C末端4-1BBリガンドを75~100nMの濃度で60秒間捕捉した。組換えヒトCD19 Fc(kih)を7.8~500nMの濃度範囲で30μL/分の流量で220秒にわたってフローセルに通した。解離を600/2500秒間モニターした。バルク屈折率の差を、基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。ここで、抗原は、固定された抗ヒトFc抗体を伴うが抗体ではなくHBS-EPが注入された表面上を通過させた。
ヒト4-1BB Fc(kih)とヒトFAP、又はヒトCD19の同時結合能を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全てのSPR実験は、ランニング緩衝液(0.01MのHEPES pH7.4、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P20、Biacore,Freiburg/Germany)としてHBS-EPを用いて25℃においてBiacore T200で実施した。
FAP標的/DP47ヒト4-1BBリガンド三量体含有Fc融合抗原結合分子の調製及び精製
4.1 4-1BBリガンドがC末端に融合した一価FAP(4B9)標的/DP47 4-1BBリガンド三量体含有Fc(kih)融合抗原結合分子(コンストラクト2.15及び2.16)の調製(ホール鎖上のFAP)
ヒト4-1BBリガンドのエクトドメインの一部をコードするDNA配列(アミノ酸71-254)を、UniprotデータベースのP41273配列に従って合成した。
ヒト4-1BBリガンドのエクトドメインの一部をコードするDNA配列(アミノ酸71-254)を、UniprotデータベースのP41273配列に従って合成した。
ヒト4-1BBリガンドのエクトドメインの一部をコードするDNA配列(アミノ酸71-248)を、UniprotデータベースのP41273配列に従って合成した。コンストラクト2.19及び2.20を、コンストラクト2.15及び2.16について実施例4.1に記載されているようにして調製した。
ヒト4-1BBリガンドのエクトドメインの一部をコードするDNA配列(アミノ酸71-248)を、UniprotデータベースのP41273配列に従って合成した。コンストラクト2.21及び2.22を、コンストラクト2.17及び2.18について実施例4.2に記載されているようにして調製した。
一価FAP標的ヒトDP47/4-1BBリガンド三量体含有Fc融合抗原結合分子の産生
一価FAP標的三量体4-1BBリガンドC末端Fc(kih)融合抗原結合分子を、MPSVプロモーターから挿入断片の発現を駆動し、CDSの3’末端に位置する合成ポリA配列を含むプラスミドベクター中にクローニングした。加えて、ベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためにEBV OriP配列を含む。
表面プラズモン共鳴によるDP47/FAP(4B9)標的C末端4-1BB分断三量体リガンドFc融合抗原結合分子の同時結合の測定
ヒト4-1BB Fc(kih)及びヒトFAPに同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全てのSPR実験は、ランニング緩衝液(0.01MのHEPES,pH7.4、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P20、Biacore、Freiburg/Germany)としてHBS-EPを用いて25℃においてBiacore T200で実施した。
一価FAP標的C末端4-1BB分断三量体リガンドFc融合抗原結合分子の機能的特徴付け
6.1 新鮮な活性化ヒトPBMCへの結合
バフィーコートをチューリッヒ献血センターから得た。新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)を単離するために、バフィーコートを同じ容量のDPBS(Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号14190326)で希釈した。50mLのポリプロピレン遠心管(TPP、カタログ番号91050)に15mLのHistopaque1077(SIGMA Life Science,カタログ番号10771、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、濃度1.077g/mLに調整)を供給し、希釈したバフィコート内容物をHistopaque1077上に層化させた。遠心管を450×gで30分間遠心分離した。ついで、PBMCを界面から回収し、DPBSで3回洗浄し、10%(v/v)のウシ胎仔血清(FBS,米国起源,PAN biotech,P30-2009,ロットP150307GI,ガンマ線照射マイコプラズマフリー,熱失活56℃35分)、1%(v/v)のGlutaMAX I(Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号35050038)、1mMのピルビン酸ナトリウム(SIGMA、カタログ番号S8636)、1%(v/v)のMEM非必須アミノ酸(SIGMA、カタログ番号M7145)及び50μMのβ-メルカプトエタノール(SIGMA、M3148)と共に供給されたPPMI1640培地(Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号42401-042)からなるT細胞培地に再懸濁した。
FAP発現細胞に対する結合アッセイのために、異なるFAP発現腫瘍細胞を使用した:ヒトメラノーマ細胞株MV-3(最初の出版:van Muijen GN, Jansen KF, Cornelissen IM, Smeets DF, Beck JL, Ruiter DJ. Establishment and characterization of a human melanoma cell line (MV3) which is highly metastatic in nude mice. Int J Cancer. 1991 Apr 22;48(1):85-91)及びヒトメラノーマ細胞株WM-266-4(ATCC CRL-1676)。
6.3.1 ヒト4-1BB及びNF-κB-ルシフェラーゼを発現するHeLaレポーター細胞の作製
ヒトパピローマウイルス-18誘導子宮頸癌細胞株HeLa(ATCC CCL-2)に、ヒト4-1BBの配列(Uniprot受託Q07011)を含む発現ベクターpETR10829に基づくプラスミドをCMV-プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下で形質導入した。細胞を、10%(v/v)のウシ胎仔血清(FBS,Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号16000-044,ロット番号941273,ガンマ線照射マイコプラズマフリー,熱失活56℃35分)、1%のGlutaMAX-I(Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号35050-038)、3μg/mLのピューロマイシン(InvivoGen,カタログ番号ant-pr)と共に供給されたDMEM培地(Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号42430-025)で培養した。4-1BB形質導入HeLa細胞をフローサイトメトリーによって4-1BB発現について試験した:0.2×106個の生存細胞を、0.1μgのPerCP/Cy5.5コンジュゲート抗ヒト4-1BBマウスIgG1κクローン4B4-1(BioLegendカタログ番号309814)又はそのアイソタイプ対照(PerCP/Cy5.5コンジュゲートマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体クローンMOPC21、BioLegendカタログ番号400150)を含む100μLのFACS緩衝液(2%のFBS、5mMのEDTA pH8(Amresco、カタログ番号E177)及び7.5mMのアジ化ナトリウム(Sigma-Aldrich、カタログ番号S2002)中に再懸濁させ、4℃において30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、0.06μgのDAPI(Santa Cruz Biotec、カタログ番号Sc-3598)を含む300μLのFACS緩衝液に再懸濁し、5レーザーLSR-Fortessa(BD Bioscience、DIVAソフトウェア)を使用して獲得した。限定された希釈を実施して次のような単一クローンを作製した:ヒト4-1BBを形質導入したHeLa細胞を培地に10、5及び2.5細胞/mLの濃度で再懸濁し、200μLの細胞懸濁液を丸底の組織培養処理96ウェルプレート(6プレート/細胞濃度、TPPカタログ番号92697)に移した。単一クローンを収集し、増殖させ、上記のように4-1BB発現について試験した。4-1BBが最も高発現のクローン(クローン5)を、その後のNFκB-ルシフェラーゼ発現ベクター5495p Tranlucent HygBによるトランスフェクションのために選択した。ベクターは、トランスフェクトされた細胞にハイグロマイシンBに対する耐性とNFκB応答エレメント(Panomics、カタログ番号LR0051)の制御下でルシフェラーゼを発現する能力との両方を付与する。ヒト4-1BB HeLaクローン5細胞を70%のコンフルエンスになるまで培養した。50μg(40μL)の線状化(制限酵素AseI及びSalI)した5495pの半透明HygB発現ベクターを、無菌の0.4cmのGene Pulser/MicroPulserキュベット(Biorad、カタログ番号165-2081)に添加した。400μlのサプリメント無添加のDMEM中の2.5×106個のヒト4-1BB HeLaクローン5細胞を添加し、プラスミド溶液と注意深く混合した。細胞のトランスフェクションは、Gene Pulser Xcell全システム(Biorad、カタログ番号1652660)を使用して、次の設定下で実施した:指数パルス、キャパシタンス500μF、電圧160V、抵抗∞。パルス直後に、トランスフェクトされた細胞を、10%のFBS及び1%のGlutaMAX I(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号3505038)と共に供給された15mLの37℃の温かいDMEM培地(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号42430-025)を含む組織培養フラスコ75cm2(TPP、カタログ番号90075)に移した。翌日、3μg/mLのピューロマイシン(InvivoGen、カタログ番号ant pr)と200μg/mLのハイグロマイシンB(Roche、カタログ番号10843555001)を含む培養培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を実施して単一クローンを作製した。クローンを上記の4-1BB発現とNFκB-ルシフェラーゼ活性について次のように試験した:クローンを選択培地中で収集し、細胞カウンターVi-cell xr 2.03(Beckman Coulter、カタログ番号731050)を使用して計数した。細胞を0.33×106細胞/mLの細胞密度に設定し、150μLのこの細胞懸濁液を蓋付きの無菌の白色96ウェル平底組織培養プレート(greiner bio one、カタログ番号655083)の各ウェルと、対照として通常の96ウェル平底組織培養プレート(TPPカタログ番号92096)に移し、翌日に生存及び細胞密度を試験した。細胞を37℃及び5%CO2で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ(rhTNFα、PeproTech、カタログ番号30001A)を含む50μLの培地を96ウェルプレートの各ウェルに加え、100、50、25、12.5、6.25及び0ng/ウェルの最終濃度のrhTNFαにした。細胞を37℃及び5%CO2で6時間インキュベートし、ついで200μL/ウェルのDPBSで3回洗浄した。レポーター溶解緩衝液(Promega、カタログ番号:E3971)を各ウェル(30μl)に加え、プレートを-20℃において一晩保存した。翌日、凍結した細胞プレート及び検出緩衝液(ルシフェラーゼ1000アッセイシステム、Promega、カタログ番号E4550)を室温まで解凍した。100μLの検出緩衝液を各ウェルに加え、プレートを、SpectraMax M5/M5eマイクロプレートリーダー及びSoftMax Pro Software(Molecular Devices)を使用して、できるだけ速く測定した。対照(rhTNFαが無添加)より上の測定されたURLをルシフェラーゼ活性とした。最も高いルシフェラーゼ活性とかなりのレベルの4-1BB発現を示すNFκB-luc-4-1BB-HeLaクローン26を更なる使用のために選択した。
NFκB-luc-4-1BB-HeLaクローン26細胞をDPBS(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号14190326)で洗浄し、0.05%のトリプシンEDTA(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号25300054)で5分間37℃において処理した。細胞を収集し、10%のウシ胎仔血清(FBS,米国起源,PAN biotech,P30-2009,ロットP150307GI,ガンマ線照射マイコプラズマフリー,熱失活56℃35分)及び1%のGlutaMAX-I(Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号35050038)と共に供給されたDMEM培地(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号42430025)に再懸濁させた。細胞カウンターVi-cell xr2.03(Beckman Coulter、カタログ番号731050)を使用して細胞を計数し、0.2×106細胞/mLの細胞密度に設定した。この細胞懸濁液100μL(2×104細胞)を、蓋付きの無菌の白色96ウェル平底組織培養プレート(greiner bio one、カタログ番号655083)の各ウェルに移し、プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。翌日、異なる滴定濃度のコンストラクト2.11を含む培地50μLを加えた。陽性対照としてコンストラクト2.4を、陰性対照として対照D及び対照F(実施例1.11に記載)を加えた。FAP結合媒介性架橋のために、FAP発現株MV-3(最初の刊行:van Muijen GN, Jansen KF, Cornelissen IM, Smeets DF, Beck JL, Ruiter DJ. Establishment and characterization of a human melanoma cell line (MV3) which is highly metastatic in nude mice. Int J Cancer. 1991 Apr 22;48(1):85-91)、ヒトメラノーマ細胞株WM-266-4(ATCC CRL-1676)又はヒトFAPでトランスフェクトされたFAP発現マウス線維芽細胞株NIH/3T3(NIH/3T3-huFAPクローン19)を使用した。
FAP結合媒介架橋のために、ヒトFAPでトランスフェクトしたFAP発現マウス線維芽細胞株NIH/3T3(NIH/3T3-huFAPクローン19)を使用した。CMVプロモーター下でヒトFAPをコードする発現pETR4921プラスミドを用いたマウス胚線維芽細胞NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)のトランスフェクションにより細胞を生成させた。細胞を、1.5μg/mLのピューロマイシン(InvivoGen、カタログ番号:ant-pr-5)の存在下、10%の仔ウシ血清(CS、人工栄養仔ウシから鉄分補充、Sigma-Aldrich、C8056-500mL)と共に供給されたDMEM(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号42430-025)に維持した。
6.5.1 NLV-抗原特異的CD8 T細胞の単離及び培養
新鮮な血液をHLA-A2+CMV感染ボランティアから得た。PBMCをフィコール(Ficoll)密度遠心分離によって単離し、製造者の推奨に従い陰性選択ヒトCD8 T細胞単離キット(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-094-156)を使用してPBMCからCD8+T細胞を精製した。1000万個の単離されたCD8 T細胞を、CMV由来のNLVPMVATVペプチドを含むPE標識HLA-A2-五量体(ProImmune、カタログ番号F008-2B)50μLと共に、1%(v/v)のFBSが補填された1mLの無菌DPBSに再懸濁させ、室温において10分間インキュベートした。細胞を、1%(v/v)のFBSと共に供給された3mLの無菌DPBSで2回洗浄した。細胞を、1μg/mLの抗ヒトCD8-FITC(クローンLT8、Abcam、カタログ番号Ab28010)を含む1%(v/v)のFBSと共に供給された1mLの細胞DPBSに再懸濁させ、4℃において30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、1%(v/v)のFBSと共に供給されたDPBS中で5×106細胞/mLの濃度まで再懸濁し、30μmの前分離ナイロンネット細胞ストレーナー(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-041-407)を通して濾過した。NLV-ペプチド特異的CD8+T細胞を、次の設定でARIAセルソーター(BD Bioscience,DIVAソフトウェア)を使用するFACSソーティングによって単離した:100μmノズル及び純度ソートマスク。選別された細胞を、10%(v/v)のFBS、1%(v/v)のGlutaMAX-1及び400U/mLのプロロイキンと共に供給された5mlのRPMI1640培地を含む15mlのポリプロピレン遠心管(TPP、カタログ番号91015)に収集した。選別した細胞を室温において350×gで7分間遠心分離し、0.53×106細胞/mLの濃度になるように同培地中に再懸濁させた。100μL/ウェルのこの細胞懸濁液を、予め調製したフィーダープレートの各ウェルに添加した。PHA-L活性化照射同種異系フィーダー細胞を、以前に記載されているように(Levitsky等, 1998)PBMCから調製し、1ウェル当たり2×105フィーダー細胞で96ウェル培養プレートに分配した。培養の1日後、選別したCD8+T細胞を含むウェルから100μLの培地/ウェルを除去し、10%(v/v)のFBS及び1%(v/v)のGlutaMAX-1及び400U/mLのプロロイキンが補填された新しいRPMI1640培地と置き換え、これを培養中に定期的に(2~4日ごとに)繰り返した。細胞が増殖し始めると直ぐに、それらを24ウェル平底組織培養プレート(TPP、92024)に移した。細胞を増殖/分裂させ、定期的に新しいフィーダー細胞調製物で再活性化した。
MV-3細胞(実施例6.2に既に記載)を収集し、10%(v/v)のFBS、1%(v/v)のGlutaMAX I、1mMのピルビン酸ナトリウム、1%(v/v)のMEM非必須アミノ酸及び50μMのβ-メルカプトエタノールが補充されたRPMI1640培地からなるT細胞培地中に1×106細胞/mLになるまで再懸濁させ、3本のチューブに分離した。合成NLVPMVATVペプチド(thinkpeptidesから得た)を最終濃度1×10-9M又は1×10-8Mになるように加え、細胞を90分間インキュベートした。NLVペプチドをパルスしたMV-3細胞をT細胞培地で1回洗浄し、0.5×106細胞/mLの密度に再懸濁させ、96ウェル丸底細胞懸濁プレート(Greiner bio-one、cellstar、カタログ番号650185)に分配して(100μL/ウェル)、37℃において5%CO2下で一晩インキュベートした。翌日、FAP標的4-1BBリガンド三量体含有Fc融合抗原結合分子(コンストラクト2.11及び対照としてコンストラクト2.4及び対照F及びD)を、(10~0.0004nMの)最終濃度の範囲で50μLのT細胞培地に添加した。NLV特異的CD8 T細胞を収集し、洗浄し、50μLの培地で各ウェルに加えた(最終腫瘍:CD8T細胞比0.125)。アッセイの原理は図14に示す。
一価CD19標的C末端4-1BB分断三量体リガンドFc融合抗原結合分子の機能的特徴付け
7.1 活性化されたヒトPBMCへの結合
4-1BB発現T細胞への4-1BBLの結合を調べるために、48時間、T細胞上の4-1BBのアップレギュレーションのために、TCR刺激によってヒトPBMCを予め活性化させた。PBMCをFicoll(GE Healthcare、カタログ番号17-1440-03)勾配遠心分離によりバフィコートから精製し、RPMI培地(Gibco、カタログ番号72400-054)+10%のFBS(Gibco、カタログ番号20012-068)及び1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070-063)及び50uMの2-メルカプトエタノール(Gibco、カタログ番号31350-010)に再懸濁して2.8×106/mlの濃度に希釈した。90ulの細胞を丸底96ウェルプレート(greiner bio-one、cellstar、カタログ番号650185)の各ウェルに加えた。ついで、8×105ビーズ/mlの更なる50ul抗CD3及び抗CD28マイクロビーズ(Life Technologies、カタログ番号11131D)をウェルに添加した。2日後、細胞を冷PBS(Gibco、20012-068)で1回洗浄し、90ulの冷PBSで再懸濁し、コンストラクト4.11、コンストラクト3.11、陽性対照コンストラクト4.1及び陰性対照の対照Dを含む10ulの溶液と共に4℃において1時間インキュベートした。十分に洗浄した後、細胞を、5μg/mLのPEコンジュゲートAffiniPure抗ヒトIgG F(ab’)2断片特異的ヤギF(ab’)2断片(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号109116098)を含む50μL/ウェルの冷FACS緩衝液、及び加えて抗ヒトCD3(Biolegend、カタログ番号300312)、CD4(Biolegend、カタログ番号317434)及びCD8(Biolegend、カタログ番号344710)Abで4℃において30分間、更に染色した。細胞を200μL/ウェルの4℃のFACS緩衝液で2回洗浄し、細胞を1%のホルムアルデヒド(Sigma、HT501320-9.5L)を含む50μL/ウェルのDPBSに固定した。細胞を100μL/ウェルのFACS緩衝液に再懸濁し、FACS LSR II(BD Biosciences)を使用して獲得した。FlowJo V10(FlowJo、LLC)及びGraphPad Prism6.04を使用してデータを解析した。
腫瘍抗原CD19への結合を調べるために、CD19+WSU-DLCL2細胞(DSMZ番号ACC575)を使用した。DPBS(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号14190326)に再懸濁した0.1×106個の腫瘍細胞を丸底懸濁細胞96ウェルプレート(greiner bio-one、cellstar、カタログ番号650185)の各ウェルに添加した。細胞をDPBS200μLで1回洗浄した。細胞を、1:5000希釈のFixable Viability Dye eFluor660(eBioscience,カタログ番号65-0864-18)を含む100μL/ウェルの4℃の冷DPBS緩衝液に再懸濁し、プレートを4℃において30分間インキュベートした。細胞を200μL/ウェルの4℃の冷DPBS緩衝液で1回洗浄し、コンストラクト4.11、コンストラクト3.11、陽性対照としてコンストラクト4.1、そして陰性対照として対照Dを一連の濃度で含む50μL/ウェルの4℃の冷FACS緩衝液(2%のFBS、5mMのEDTA pH8(Amresco、カタログ番号E177)及び7.5mMのアジ化ナトリウム(Sigma-Aldrich S2002)と共に供給されたDPBS)に再懸濁し、続いて4℃において1時間インキュベートした。十分に洗浄した後、細胞を、5μg/mLのPEコンジュゲートAffiniPure抗ヒトIgG F(ab’)2断片特異的ヤギF(ab’)2(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号109116098)を含む50μL/ウェルの4℃冷FACS緩衝液で4℃において30分間、更に染色した。細胞を200μL/ウェルの4℃のFACS緩衝液で2回洗浄し、細胞を、1%のホルムアルデヒド(Sigma、HT501320-9.5L)を含む50μL/ウェルのDPBSに固定した。細胞を100μL/ウェルのFACS緩衝液に再懸濁し、FACS LSR II(BD Biosciences)を使用して獲得した。FlowJo V10(FlowJo、LLC)及びGraphPad Prism6.04(GraphPad Software,Inc)を使用してデータを解析した。
7.3.1 ヒト4-1BB及びNF-κB-ルシフェラーゼを発現するHeLaレポーター細胞の作製
HeLa-ヒト-4-1BB-NFκN-lucレポーター細胞株を、実施例6.3.1に記載されているようにして作製した。
NFκB-luc-4-1BB-HeLaクローン26細胞をDPBS(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号14190326)で洗浄し、37℃において5分、0.05%のトリプシンEDTA(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号25300054)で処理した。細胞を収集し、10%のウシ胎仔血清(FBS,米国起源,PAN biotech,P30-2009,ロットP150307GI,ガンマ線照射マイコプラズマフリー,熱失活56℃35分)及び1%のGlutaMAX-I(Life TechnologiesによるGibco,カタログ番号35050038)と共に供給されたDMEM培地(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号42430025)に再懸濁させた。細胞カウンターVi-cell xr2.03(Beckman Coulter、カタログ番号731050)を使用して細胞を計数し、0.2×106細胞/mLの細胞密度に設定した。この細胞懸濁液100μL(2×104細胞)を、蓋付きの無菌の白色96ウェル平底組織培養プレート(greiner bio one、カタログ番号655083)の各ウェルに移し、プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。翌日、異なる滴定濃度のコンストラクト3.11及びコンストラクト4.11を含む培地50μLを加えた。陽性対照としてコンストラクト3.4及び4.1を、陰性対照として対照D及び対照F(実施例1.11に記載した)を加えた。CD19結合媒介性架橋のために、次のCD19発現細胞株を使用した:びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株OCI-Ly18(DMSZ ACC699)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)細胞株Nalm6(DSMZ ACC-128)及び非ホジキンB細胞リンパ腫(B-NHL)細胞株SU-DHL-8(DSMZ ACC-573)。従って、CD19を発現する懸濁細胞株OCI-Ly18、Nalm6及びSU-DHL-8を収集し、細胞カウンターVi-cellxr2.03を使用して計数し、10%のFBS及び1%のL-GlutaMAX-1と共に供給されたDEMに再懸濁させて2×106細胞/mLとし、ウェル当たり50μLを添加した。架橋CD19発現腫瘍細胞系を加えた後、プレートを37℃及び5%CO2で6時間インキュベートした。白色平底96ウェルプレートを200μL/ウェルのDPBSで3回洗浄した。40μlの新しく調製したレポーター溶解緩衝液(Promega、カタログ番号:E3971)を各ウェルに添加し、プレートを-20℃で一晩保存した。翌日、凍結プレート及び検出緩衝液(ルシフェラーゼ1000アッセイシステム、Promega、カタログ番号E4550)を室温に解凍した。100μLの検出緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを、次の設定でSpectraMax M5/M5eマイクロプレートリーダー及びSoftMax Pro Software(Molecular Devices)を使用してできるだけ速やかに測定した:ルシフェラーゼ(RLU)については500msの積分時間、フィルターなし、全ての波長とトップの読み取りを収集。アッセイのセットアップを図18に示し、コンストラクト3.4、4.1、3.11及び4.11並びに対照D及びFについて測定した活性を図19に示す。表60に、CD19発現腫瘍細胞株に対する結合曲線のEC50値を列挙する。
生理学的関連設定における生物学的活性を決定するために、我々は、活性化ヒトPBMCにおけるエフェクター機能分子IFNγの放出を、4-1BBLを介してT細胞及びNK細胞を共刺激することによって測定した。PBMCを、Ficoll(GE Healthcare、カタログ番号17-1440-03)勾配遠心分離によりバフィコートから精製し、ついで2.2×106/mlの濃度に希釈し、RPMI培地(Gibco、カタログ番号72400-054)+10%のFBS(Gibco、カタログ番号20012-068)及び1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070-063)及び50uMの2-メルカプトエタノール(Gibco、カタログ番号31350-010)に再懸濁した。90μlの細胞を丸底96ウェルプレート(greiner bio one、cellstar、カタログ番号650185)の各ウェルに添加した。ついで、コンストラクト4.11、コンストラクト3.11、陽性対照のコンストラクト4.1及び陰性対照の対照Dを含む溶液10μlを一連の濃度でウェルに添加し、更に50μlの抗CD3及び抗CD28マイクロビーズ(Life Technologies、カタログ番号11131D)を8×105ビーズ/mlで与えた。48時間のインキュベーション後、ELISA(DuoSet Human IFNg ELISAキット、R&D Systems、カタログ番号DY285)によるIFN-γの測定のために上清を収集した。
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Claims (27)
- 4-1BBリガンド(4-1BBL)三量体含有抗原結合分子であって、
(a)標的細胞抗原に特異的に結合することができる一つのFabドメイン、
(b)安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメイン、及び
(c)ペプチドリンカーによって互いに連結された配列番号:5のアミノ酸配列を含む4-1BBLの二つのエクトドメインを含む第一ポリペプチドと、配列番号:5のアミノ酸配列を含む前記4-1BBLの一つのエクトドメインを含む第二ポリペプチドと
を含み、
前記第一ポリペプチドが、ホールのアミノ酸置換Y349C、T366S、L368A及びY407V(KabatのEUインデックスによる番号付け)を含むFcドメインの第一サブユニットのC末端にそのN末端で融合され、前記第二ポリペプチドが、ノブのアミノ酸置換S354C及びT366W(KabatのEUインデックスによる番号付け)を含むFcドメインの第二サブユニットのC末端にそのN末端で融合され、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFabドメインのVH及びCH1ドメインが、ノブ変異を含むFcドメインの第二サブユニットのN末端にC末端で融合され、標的細胞抗原への結合に対して一価である、4-1BBL三量体含有抗原結合分子。 - 4-1BBLがヒトT細胞活性化を共刺激する、請求項1に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- 標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、がん胎児抗原(CEA)、CD19、CD20及びCD33からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- 標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)である、請求項1から3の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- FAPに特異的に結合することができるFabドメインが、
(a)(i)配列番号:13のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:14のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び(iii)配列番号:15のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:18のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン、又は
(b)(i)配列番号:19のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:22のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:23のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
とを含む、請求項1から4の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。 - FAPに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:26のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含むか、又はFAPに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:27のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:28のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、請求項1から5の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- (i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:105のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、請求項1から6の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。 - 標的細胞抗原がCD19である、請求項1から3の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- CD19に特異的に結合することができるFabドメインが、
(a)(i)配列番号:29のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:30のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:31のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:32のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:33のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:34のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン、又は
(b)(i)配列番号:35のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:36のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:37のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:38のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:39のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:40のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメイン
とを含む、請求項1から3又は8の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。 - CD19に特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:41のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:42のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含むか、又はFAPに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:43のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:44のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、請求項1から3、8又は9の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- (i)配列番号:120のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:104のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:119のアミノ酸配列を含む重鎖;
又は
(i)配列番号:126のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(ii)配列番号:174のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び
(iii)配列番号:125のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、請求項1から3又は8から10の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。 - 標的細胞抗原がCEAである、請求項1から3の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- CEAに特異的に結合することができるFabドメインが、(i)配列番号:45のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号:46のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号:47のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHドメインと、(iv)配列番号:48のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号:49のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号:50のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLドメインとを含む、請求項1から3又は12の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- CEAに特異的に結合することができるFabドメインが、配列番号:51のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号:52のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、請求項1から3、12又は13の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- 安定な会合が可能な第一及び第二サブユニットからなるFcドメインが、IgGドメイン、特にIgG1ドメインである、請求項1から14の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- Fcドメインが、Fc受容体、特にFcγ受容体への結合を減少させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項1から15の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- Fcドメインが、234位及び235位(KabatのEUインデックスによる番号付け)及び/又は329位(KabatのEUインデックスによる番号付け)にアミノ酸置換を含むIgG1 Fcドメインである、請求項1から16の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子。
- 請求項1から17の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
- 請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項19に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項20に記載の宿主細胞を、抗原結合分子の発現に適した条件下で培養し、抗原結合分子を回収することを含む、請求項1から17の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子の産生方法。
- 請求項1から17の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子と少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1から17の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子、又は請求項22に記載の薬学的組成物。
- がんの治療における使用のための、請求項1から17の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子、又は請求項22に記載の薬学的組成物。
- がんの治療のための医薬の製造のための、請求項1から17の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子の使用。
- 個体における疾患を治療するための医薬であって、薬学的に許容される形態で請求項1から17の何れか一項に記載の4-1BBL三量体含有抗原結合分子を含有する組成物の治療的有効量を含む、医薬。
- 前記疾患ががんである、請求項26に記載の医薬。
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