JP2014511679A - 抗体結合ドメインを有する組換えｔｎｆリガンドファミリーメンバーポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの分野に関する。より詳細には、本発明は、ポリペプチドであって、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）の配列またはその機能的誘導体を各々が含む少なくとも３つの成分Ａを含み、および＜１２アミノ酸の長さを有するリンカー配列Ｌで互いに直接連結されているＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域から成る少なくとも１つの成分Ｂを含むものであるポリペプチドに関する。さらに、本発明は、かかるポリペプチドをコードする核酸、およびそれらの医薬組成物にも関する。

Description

本発明は、一般に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの分野に関する。より詳細には、本発明は、ポリペプチドであって、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）の配列またはその機能的誘導体を各々が含む少なくとも３つの成分Ａを含み、および≦１２アミノ酸残基の長さを有するリンカー配列Ｌで互いに直接連結されているＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域から成る少なくとも１つの成分Ｂを含むものであるポリペプチドに関する。さらに、本発明は、かかるポリペプチドをコードする核酸にも関する。

前記ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、炎症誘発性サイトカインである。一般にはサイトカイン、および詳細にはＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、自然免疫系の刺激および協調、ならびに適応免疫応答（細胞性免疫と体液性免疫の両方を含む）、アポトーシスの誘導、骨構築、発毛、歯の成長、汗腺の発達、リンパ節発達など多数のことに重要な役割を果たす（Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００３），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，７４５−７５６）。しかし、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーの活性の調節不全は、多数の病理をもたらし得る。これには、例えば、敗血症性ショック、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、または神経変性疾患が挙げられる。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、この大きなサイトカインファミリーのうちの名称が付与されている、おそらく最も重要なメンバーである。

ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、ホモ三量体としてそれらの生物学的機能を発揮する（Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら（１９９３），Ｃｅｌｌ ７３，４３１−４４５）。自然界ではかかるタンパク質の三量体構造およびまたより高次の集合体（例えば、三量体のオリゴマーまたは多量体）にしばしば遭遇する。これについての例は、結合組織タンパク質である軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）（Ｂｅｃｋら（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６，９０９−９２３）、コラーゲンファミリー、例えばＣｌｑ、コラーゲンα１（Ｘ）、α２（ＶＩＩ）、冬眠タンパク質、ＡＣＲＰ３０、内耳構造タンパク質、セレブリンおよびマルチメリンが属するＣｌｑファミリー、のタンパク質（Ｋｉｓｈｏｒｅ ａｎｄ Ｒｅｉｄ（１９９９），Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２，１５−２１）、ならびにコレクチンファミリーのタンパク質、例えば、肺サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）およびマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９９６），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８巻，第１号，２９−３５）である。

三量体形成は、個々の単量体間の相互作用、例えば、疎水性相互作用、水素架橋、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、および／またはクーロン力に起因して発生するが、構造モチーフ、すなわち分子間超二次構造の形成につながる特異的アミノ酸配列、に基づいて発生もする。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーの場合、３つの単量体が非共有結合性疎水性結合によってホモ三量体構造で会合している。活性形態で、今度はそれらが、酵素活性を一切有さないＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーを活性化する。例えば、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーであるＴＮＦは、２つの膜受容体ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に結合し、不活性受容体のオリゴマー化および活性化を媒介する。受容体複合体形成の結果として、シグナルカスケードが開始され、これが、とりわけ細胞質アダプタータンパク質の会合を生じさせる（Ｗａｊａｎｔ，Ｈ．ら（２００３），Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，Ｄｉｆｆｅｒ，１０，４５−６５）。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２とそのリガンドの相互作用は、ＴＮＦホモ三量体の３つのＴＮＦ単量体のうちの２つの間の区域での該受容体の結合を特徴とする（Ｂａｎｎｅｒ（１９９３），上記文献）。これは、ＴＮＦはもちろんＴＮＦリガンドファミリーの他のメンバーも、ホモ三量体構造でしか生物活性でないことの例証となる。それらの機能のため、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーおよびそれぞれの膜受容体は、疾患、例えば、感染症、炎症性疾患、代謝性疾患、アポトーシスの調節不全に起因する疾患、神経変性疾患など多数の疾患の多くの種類の処置にそれぞれ使用することができる。それらは、癌性疾患の処置に特に重要である。なぜなら、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、一般に、抗腫瘍活性を呈示するからである。これは、特に、ＴＮＦ（Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ，Ｔ． Ｌ．（２００３），Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５，７９−８０）、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス使用リガンド（ＴＮＦ ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ））［Ａｐｏ ２Ｌとも呼ばれる（Ｗｅｌｅｙら（１９９５），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：６７３−６８２；Ｐｅｔｔｉら（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２６８７−１２６８９）］およびＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）に当てはまる。しかし、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験により、ＴＮＦ、およびＦａｓ受容体のアゴニストについての強い全身性有害反応が証明されており、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）実験は、一定のＴＲＡＩＬ化合物について同様の毒性効果を示す（Ｊｏら（２０００）Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：５６４−５６７、Ｉｃｈｉｋａｗａら（２００１）Ｎａｔ Ｍｅｄ ７：９５４―９６０；Ｏｇａｓａｗａｒａら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：８０６−８０９）。このため、全身適用でのＦａｓ活性化リガンド／アゴニストの臨床利用は、これまでは安全性の懸念から不可能と考えられてきた。しかし、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）および他のＴＮＦリガンドファミリーメンバーのこの分野での重要性のため、ならびに臨床全身投与の形態でのそれらの適用に随伴する有害反応のため、それらの有害反応を最小にするための幾つかの代替アプローチが探求された（Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｌ．（２００３），Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５，７９−８０）。

国際公開第０２／２２６８０号パンフレットには、例えば、サイトカインを抗原結合抗体と融合させることにより、標的化された、組織および／または細胞特異的なサイトカインの活性を可能にする、融合タンパク質が記載されている。この方法により、これらの融合タンパク質と接触しない組織または細胞に対してサイトカインは活性でないこと、ならびにこれらの組織および細胞に関する有害反応をそれぞれ低減させることが実現される。

ドイツ特許第１０２ ４７ ７５５号明細書には、標的化された、組織および細胞特異的なサイトカインの作用が同様に可能になる抗体非依存性の系が開示されている。この文献には、生物活性ドメインおよび細胞表面結合ドメインを有する融合タンパク質が開示されている。前記生物活性ドメインの生物活性は、前記細胞表面結合ドメインのそれぞれの細胞表面への結合によって媒介される。非標的組織に対する有害反応の低減をもたらすことに加えて、標的細胞上の細胞表面分子にもこの系を有利に使用することができ、該標的細胞に対する特異性がないまた低い特異性しかない抗体を利用することができる。

上述の有害反応の他に、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーの活性ホモ三量体が生理的に妥当な濃度においても解離することがさらに問題となる。この解離は可逆的である。しかし、前記タンパク質は、変性し続けるので、その生物活性を急速に失う。この変性は、中間の不安定な単量体に起因すると想定されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｂａｇｌｉｏｎｉ，Ｃ．（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，６９５１−６９５４；Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．ａｎｄ Ａｒａｋａｗａ，Ｔ．（１９８７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ １４７，７４０−７４６）。

初の試みで、この問題は、当該技術分野において、例えば国際公開第０１／２５２７７号パンフレットにおいて扱われている。国際公開第０１／２５２７７号パンフレットには、ＴＮＦα単量体の３つのコピーを有する一本鎖ＴＮＦαポリペプチドが開示されている。一本鎖の性質のため、解離は防止される。類似の概念が国際公開第２００５／１０３０７７号パンフレットに開示されている。

加えて、先行技術分野において、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのオリゴマー分子は活性増加を呈示するが、同じく毒性増加も呈示することが報告されている（Ｋｏｓｃｈｎｙ Ｒら，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２００７；８５：９２３−９３５；Ｇｅｒｓｐａｃｈ Ｊ，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２００９；４９：２４１−７３．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｗｙｚｇｏｌら，ＪＩ ２０１０）。

したがって、好ましくは安定しており、（より）少ない有害全身性反応を呈示するまたは有害全身性反応をまったく呈示しない上、同時に、生物学的特異性を維持する、新規の改善されたＴＮＦリガンドファミリー由来化合物が、当該技術分野においてなお必要とされている。

この目的は、本発明によって、詳細には、添付の特許請求の範囲に示す手段および以下に例証する手段によって解決される。

本発明の発明者らは、本発明のポリペプチドが、腫瘍に対する活性増加を呈示するが、同時に、驚くべきことに非腫瘍組織に対する毒性増加を呈示しないことを、驚くべきことに発見した。

本質的に、本発明のポリペプチドは融合タンパク質であり、該融合タンパク質は、一方で、少なくとも３つのＴＮＦリガンドファミリーメンバー単量体を含み、もう一方で、短いリンカーによって連結された抗体Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域の可変ドメインを標的化部分として含む。特異性を増加させるために、インビボの半減期を増加させるため、および薬力学的特性を変調させるために、本発明によるポリペプチドは、アルブミン結合ドメインおよび／または他のドメインおよび／または他の修飾をさらに含むことができる。

したがって、第一の態様において、本発明は、次のものを含むポリペプチドに関する：
ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）の配列またはその機能的誘導体をそれぞれが含む、少なくとも３つの成分Ａ、および
ｂ）≦１２アミノ酸残基の長さを有するリンカー配列Ｌで互いに直接連結されているＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域から成る、少なくとも１つの成分Ｂ。

本明細書において用いる場合の用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の配列から成るポリマーを指す。この用語をポリペプチド単位の長さを限定するものとみなしてはならない。しかし、好ましくは、ポリペプチドは、１０００アミノ酸未満、さらに好ましくは９００アミノ酸未満の長さを有する。前記ポリペプチド配列のポリマーの中のアミノ酸は、通常、ペプチド結合によって互いに連結されているが、前記ペプチド結合（単数もしくは複数）のまたは側鎖残基の修飾は、総合的活性が全体として失われないこと、例えば、結果として得られる化学的エンティティー（例えば、成分Ａ）が、依然として三量体化し、その標的を活性化することを条件に、許容され得る。

ＴＮＦ相同ドメインは、すべてのＴＮＦリガンドファミリーメンバーによって共有されている共通の構造的特徴である Ｂｏｄｍｅｒ ＪＬら（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２００２ Ｊａｎ；２７（１）：１９−２６）。それは、受容体結合部位を含み、それ故、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの生物活性にとって極めて重要である。本発明の成分Ａは、最小モチーフとしてＴＨＤ、例えば、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＨＤを有してもよいが、例えば、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのより長い配列ストレッチ、例えば（それぞれ、溢出または分泌された）可溶性形態の該ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの配列、をも含んでもよい。前記配列は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの全細胞外ドメインを含み得るが、好ましくは、これらのＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一部に天然に存在するプロテアーゼ切断部位を伴わない、例えば、前記３つの成分Ａを含む領域における融合タンパク質の切断を避けるためにＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７切断部位を伴わないものである。

前記ＴＨＤドメインは、例えば、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、ＬＴアルファ、ＬＴベータ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡ １、ＥＤＡ ２、ＶＥＧＩおよびＢＡＦＦから成るＴＮＦリガンドファミリーメンバー群より選択することができる。ヒトＴＮＦリガンドファミリーメンバー：ヒトＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）、ヒトＴＲＡＩＬ、ヒトＴＮＦ、ヒトＬＴアルファ、ヒトＬＴベータ、ヒトＣＤ３０Ｌ、ヒトＣＤ４０Ｌ、ヒトＯＸ４０Ｌ、ヒトＲＡＮＫＬ、ヒトＴＷＥＡＫ、ヒトＬＩＧＨＴ、ヒトＣＤ２７Ｌ、ヒト４−１ＢＢＬ、ヒトＧＩＴＲＬ、ヒトＡＰＲＩＬ、ヒトＥＤＡ １、ヒトＥＤＡ ２、ヒトＶＥＧＩおよびヒトＢＡＦＦが、特に好ましい。

さらなる情報、特に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの配列についてのさらなる情報は、公的にアクセス可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから得ることができる：ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６３９）、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３８１０）（Ａｐｏ２Ｌとも呼ばれる）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５９４）、ＬＴアルファ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５９５）、リンホトキシンベータ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２３４１）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３； ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２４４）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４； ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７４）、ＯＸ４０Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３２６）、ＲＡＮＫＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７０１）、ＴＷＥＡＫ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３８０９）、ＬＩＧＨＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３８０７）、ＣＤ２７Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２５２）、４−１ＢＢＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３８１１）、ＧＩＴＲＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０９２）、ＡＰＲＩＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７２０８９）、ＥＤＡ １／２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１３９９； ＮＭ＿００１００５６０９）、ＶＥＧＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５１１８）およびＢＡＦＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６５７３）。

本発明によるポリペプチドの少なくとも３つの成分Ａの配列は、それぞれ独立して選択することができる；例えば、前記３つの成分Ａは、同じＴＮＦリガンドファミリーメンバーのそれぞれの配列を有することもあり、または異なるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの配列を有することもあり、またはそれらのうちの２つは配列が（長さおよび／または配列の点で）同一である一方で他の１つは異なることもある。異なるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＨＤドメインは、特に、該ＴＨＤドメインがＬＴアルファまたはＬＴベータから選択される場合に可能である。でなければ、３つすべての成分Ａが同じＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＨＤを含む場合、特に好ましい。本発明によるポリペプチドが３つより多くの成分Ａを含む場合、同様の考察が間違いなく当てはまる。例えば、本発明のポリペプチドは、４、５、６以上の成分Ａを含むことがある。本発明によるポリペプチドが３つより多くの成分Ａを含む場合には、該ポリペプチドが３の倍数の成分Ａを含むことが特に好ましい。このようにして、２、３、４以上の連続的に配置された三量体を形成することができる。

好ましい実施形態において、所与の成分Ａは、下の表１に示すような配列番号１〜３８に記載のヒト配列、またはそれらの機能的断片もしくは機能的誘導体のうちの１つを含むか又はそれから成るものであり得、該機能的断片もしくは機能的誘導体は、それらの天然もしくは人工の変異、または他の種からのそれぞれのオルソログを含む。他の哺乳動物種、例えばチンパンジー、マウス、ブタ、ラットなど、からのオルソログが好ましい。

縦列「アミノ酸位置」は、完全長天然タンパク質中のアミノ酸残基を示す。すなわち、この配列縦列に与えられている配列は、完全長配列中のそれぞれのアミノ酸残基に対応する。例えば、配列番号１は、完全長ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸残基１２０−２８１に対応する。

配列番号１〜３８の天然変異および他の種からのそれぞれのオルソログについての情報は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのタンパク質またはそれぞれの核酸配列についての情報を含む公的にアクセス可能なデータベースから容易に得ることができる。かかるデータベースの例は、ＵｎｉＰｒｏｔ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）；Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ；日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ ｄａｔａ ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ）などである。他の種のオルソログは、詳細には、例えばそれぞれの配列番号１〜３８に基づくＢＬＡＳＴ検索により、同様に同定することができる。

この関連でヒトＴＲＡＩＬにおける好ましい置換は、ヒトＴＲＡＩＬの次のアミノ酸のうちの少なくとも１つに作用する：Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９。ヒトＴＲＡＩＬの好ましいアミノ酸置換は、次の置換のうちの少なくとも１つである：Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、またはＤ２６９Ｋ。二重または多重置換、例えば、Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ；Ｅ１９５Ｒ／Ｄ２６９Ｈ、Ｔ２１４Ｒ／Ｄ２６９Ｈ；Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１Ｒ／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄも可能である。ＴＲＡＩＬの機能的突然変異体は、例えば、Ｒ．Ｆ．Ｋｅｌｌｅｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２８０（２００５）２２０５−２２１２）Ｍ．ＭａｃＦａｒｌａｎｅら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（２００５）１１２６５−１１２７０）、Ａ．Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３（２００６）８６３４−８６３９）、Ｖ．Ｔｕｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２００８）２０５６０−２０５６８）、およびＧａｓｐａｒｉａｎら（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ １４（２００９）７７８−７８７）に記載されている。ＴＲＡＩＬの機能的突然変異体は、詳細には、ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）、ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−Ｙ１８９Ｎ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｌ／Ｄ２６７Ｑ、ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−Ｙ１８９Ａ／Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１Ｒ／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｎ、ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−Ｙ１８９Ｑ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｌ／Ｄ２６７Ｑ、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｄ２６９Ｈ、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｄ２１８Ｈ、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｄ２１８Ｙ、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｙ１８９Ａ／Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｙ１８９Ｎ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６ＬＤ２６７Ｑ、ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｙ１８９Ｎ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｌ／Ｄ２６７Ｑ／Ｄ２６９Ｈ、およびＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）−Ｙ１８９Ｎ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｌ／Ｄ２６９Ｈである。

上で述べたように、本明細書において用いる場合の成分Ａは、ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）の配列、またはその機能的誘導体、を含むポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドは３つの前記成分Ａを含むので、三量体形成およびしたがって活性立体配座の形成が可能である。さらに、本発明によるポリペプチドは、前記少なくとも３つの成分Ａの存在のため、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの結合パートナー、例えば、膜結合受容体に対する結合活性を呈示する。前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバー配列の機能的誘導体は、例えば特異性または選択性に関して、（わずかに）異なる活性および生物学的機能を呈示することがあるが、それらの総合的生物機能は維持される。特に、受容体結合活性は維持されるはずである。

先行技術分野において、タンパク質、ポリペプチドまたは他の分子の生物活性の評定をそれぞれ可能にする多数の方法が開示されている。例は、タンパク質分析方法、例えば、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）；細胞および組織分析方法、例えば、免疫細胞化学、免疫組織化学、蛍光顕微鏡法、ＦＡＣＳ；細胞機能アッセイ：例えば、サイトカイン放出アッセイ、増殖および細胞周期アッセイ（^３Ｈ−チミジン取り込み、ＣＦＳＥ染色）、細胞傷害性アッセイ、アポトーシスアッセイ、ＮＦｋＢバンドシフト（ＥＭＳＡ）およびレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）アッセイ、キナーゼアッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；第１版（１９８８年１２月１日）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９２）；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ 第３版、Ｊ Ｃｅｌｉｓら編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６におけるもの）である。このようにして、当業者は、可溶性ＴＮＦリガンドファミリーメンバー配列の機能性断片または機能性誘導体が、該可溶性ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの総合的特性（例えば、アポトーシス／細胞死の誘導、またはＮＦｋＢの活性化）を保持するかどうかを容易に評定できるだろう。

用語「誘導体」、例えば、ＴＨＤ配列についてのまたは配列番号１〜３８に記載の配列のうちの１つについての機能的誘導体は、それぞれの基準配列との機能的および構造的類似性を呈示する配列も指すことを意図したものである。詳細には、前記それぞれの誘導体は、好ましくは、それぞれの基準配列と少なくとも５０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９４％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を呈示することとなる。かかる配列同一性レベルが、好ましくは１００％未満であることは、当業者には理解されるであろう。前記誘導体配列と前記基準配列は、１つ以上の挿入、欠失および／または置換の点で互いに異なり得る。

本明細書において用いる場合、用語「％配列同一性」は、次のように解さなければならない：比較すべき２つの配列をアラインして、それらの配列間の最大相関を得る。これは、アラインメント度を向上させるために、一方または両方の配列への「ギャップ」の挿入を含み得る。その後、比較する各配列の全長にわたって％同一性を決定することができ（いわゆるグローバルアラインメント）、これは、同じもしくは類似の長さの配列に特に適しており、またはより短い被定義長にわたって％同一性を決定することができ（いわゆるローカルアラインメント）、これは、不等長の配列により適している。上述に関連して、クエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列の配列が、クエリーアミノ酸配列の１００アミノ酸ごとに５以下のアミノ酸変更を含み得ることを除き、該対象アミノ酸配列が該クエリー配列と同一であることを意味することを意図したものである。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性の配列を有するアミノ酸配列を得るために、対象配列中の５％（１００のうちの５）以下のアミノ酸残基に別のアミノ酸が挿入されていることがあり、または該５％以下のアミノ酸残基は、別のアミノ酸残基で置換されている、または欠失されていることがある。

２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該技術分野において周知である。２つの配列が同一である百分率は、例えば、数学的アルゴリズムを用いることにより決定することができる。用いることができる数学的アルゴリズムの好ましい、しかし限定的でない、例は、Ｋａｒｌｉｎら（１９９３），ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＮＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０またはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２も参照されたし）、ワールド・ワイド・ウェブ・サイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩのホームページ経由でアクセス可能） およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，６３−９８；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８５，２４４４−２４４８）に組み込まれている。他の配列とある程度同一である配列をこれらのプログラムによって同定することができる。さらに、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３８７−３９５）で利用できるプログラム、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して、２ポリペプチド配列間の％同一性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７，１９５−１９７）の「局所相同性」アルゴリズムを用いるものであり、２配列間で最も類似性の高い単一の領域を見つける。

成分Ａにおける機能的誘導体は、特に、選択的受容体結合特性を呈示することができ、または生物活性もしくは他の特性、例えば安定性、に関して該誘導体を最適化することができる。特に、かかる誘導体は、プロテアーゼ切断部位での配列変更を呈示することができる。

本明細書において用いる場合の誘導体は、特に、それぞれの基準配列保存的置換にかんがみて（例えば、所与の配列同一性レベルに関連して）提示するアミノ酸配列を含む。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の群であって、該群のメンバー間での置換がその分子の生物活性を保存することとなるように十分に類似した物理化学的特性を有するものであるアミノ酸の群の中で起こると、好ましくは考えられる（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．（１９７４），Ｓｃｉｅｎｃｅ １８５，８６２−８６４を参照されたし）。特に、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、アミノ酸が、同じアミノ酸クラス（例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、脂肪族鎖を有するアミノ酸、正または負の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸、側鎖に芳香族基を有するアミノ酸、水素架橋に入ることができる側鎖、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖、を有するアミノ酸など）に由来する置換である。保存的置換は、この場合、例えば、塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）での別の塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）の置換、脂肪族アミノ酸残基（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）での別の脂肪族アミノ酸残基の置換、芳香族アミノ酸残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）での別の芳香族アミノ酸残基の置換、トレオニンのセリンによるまたはロイシンのイソロイシンによる置換である。さらなる保存的アミノ酸交換は、当業者には公知であるだろう。

挿入、欠失および置換は、詳細には、それらが三次元構造の変化を誘導しないまたはそれらが結合領域に影響を及ぼさない場合に可能なかかる配列位置でのものである。挿入または欠失による三次元構造の変化は、例えば、ＣＤスペクトル分析（円偏光二色性）を用いて検証することができる（Ｕｒｒｙ １９８５，Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ ＯＲＤ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（編集）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ）。

基準配列にかんがみて置換を呈示する、本発明によるポリペプチド配列の誘導体またはそれらの成分の適する生産方法は、例えば、米国特許第４，７３７，４６２号、同第４，５８８，５８５号、同第４，９５９，３１４号、同第５，１１６，９４３号、同第４，８７９，１１１号および同第５，０１７，６９１号明細書に開示されている。本明細書において用いる場合の誘導体の生産は、一般に、Ｍａｎｉａｔｉｓら（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。このアプローチのために、個々のコドンを単純にスキップ、追加または交換することができる。本明細書において述べるポリペプチド配列の誘導体は、詳細には、それぞれの基準配列に対して安定化されている、および生理的分解を受けにくい、かかるポリペプチド配列であり得る。かかる修飾についての例は、例えばβ−アミノ酸を使用することによりアミド様結合を置換することによるタンパク質主鎖の安定化である。

本発明による配列の誘導体は、詳細には、それぞれのポリペプチド基準配列をコードする核酸配列に変化を導入することにより生産することができる。かかる変化は、１つ以上のヌクレオチドの、好ましくないフレームシフトの誘導を伴わない、挿入、欠失および／または置換であり得る。当該技術分野において、かかる変化を核酸配列に導入するための多数の方法が公知である。最も一般的な技術は、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発である（Ｃｏｍａｃｋ Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８．０１−８．５．９，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．ら，１９９１を参照されたし）。簡単に言うと、特異的突然変異配列を呈示するオリゴヌクレオチドを合成する。その後、このオリゴヌクレオチドをテンプレート（基準配列）とハイブリダイズする。好ましくは、この技術は、一本鎖テンプレートに用いられる。その修飾されたオリゴヌクレオチドとそのテンプレートをアニールした後、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを添加して、テンプレートＤＮＡ鎖に相補的であるそのオリゴヌクレオチドの第二の鎖を合成する。結果として、ヘテロ二重鎖分子が形成され、この分子はミスマッチを含み、これは、オリゴヌクレオチドにおける上述の突然変異に起因する。その後、そのオリゴヌクレオチド配列を適するプラスミドに導入し、そしてまたそのプラスミドを適する宿主細胞に導入する。その後、その宿主細胞においてそのオリゴヌクレオチドが複製される。このようにして、本発明による誘導体の生産に使用することができる、特異的変化（突然変異）を有する核酸配列を得る。

本発明の好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドのすべてのおよび／または少なくとも３つの成分Ａは、配列番号１および／または配列番号５の配列を有する。

好ましくは、本発明によるポリペプチドの少なくとも３つの成分Ａは、少なくとも２つの介在ペプチドリンカーＰによって互いに連結されている。言い換えると、本発明によるポリペプチド内の２つ所与の成分Ａは、好ましくは、ペプチドリンカー経由で互いに直接連結されている（例えば、Ａ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ａ）。ペプチドリンカーＰは、好ましくは可撓性アミノ酸ストレッチであり、および／または本発明によるポリペプチド内の成分Ａの固有三量体化特性に影響を及ぼさない。好ましくは、かかるペプチドリンカーＰは、５０未満、さらにいっそう好ましくは４５未満、さらにいっそう好ましくは４０未満、さらにいっそう好ましくは３５未満、さらにいっそう好ましくは３０未満、さらにいっそう好ましくは２５未満、さらにいっそう好ましくは２０未満、さらにいっそう好ましくは１５未満、さらにいっそう好ましくは１０未満のアミノ酸長である。あるいは、または加えて、前記ペプチドリンカーＰは、好ましくは、１アミノ酸以上、２アミノ酸以上、３アミノ酸以上、４アミノ酸以上、５アミノ酸以上、６アミノ酸以上、７アミノ酸以上、および／または８アミノ酸以上のアミノ酸長を有する。したがって、本発明のポリペプチドの２つの成分Ａを連結するペプチドリンカーは、例えば、２から５０アミノ酸、２から３０アミノ酸、３から２５アミノ酸、４から１６アミノ酸、４から１２アミノ酸の範囲のアミノ酸長、またはペプチドリンカーについて上に開示したアミノ酸長の任意の他の組み合わせを有し得る。１から８アミノ酸、例えば、４または８アミノ酸のペプチドリンカー長が特に好ましい。

アミノ酸配列の点では、本発明のポリペプチド内の成分Ａを連結するペプチドリンカーＰは、好ましくはグリシン（Ｇ）リッチペプチドリンカーである、すなわち、５０％より高い、例えば、少なくとも６０から８０％、例えば約７５％の、高グリシン含有率を有するアミノ酸配列である。前記ペプチドリンカー中に存在し得る他のアミノ酸は、例えば、セリン残基またはあまり好ましくはないがアラニン残基もしくはグルタミン残基である。前記ペプチドリンカーＰは、繰り返し単位から成ることがある。例えば、前記リンカーは、数単位のＧＧ（配列番号４０）；ＧＧＳ（配列番号５５）；ＧＳＧ（配列番号５４）、またはＳＧＧ（配列番号５３）およびこれらの組み合わせを含むことがある。前記ペプチドリンカーは、容易に修飾され得る、例えばグリコシル化され得るタイプのものであることもある。かかる配列についての例は、配列番号８３〜９１である。本発明の２つの成分Ａを連結するペプチドリンカーＰの特に好ましい例は、下の表２に示すような配列の群から選択される：

上述のリンカーペプチドを併用することもできること、および多数の他の可撓性リンカー配列を、それらが成分Ａの三量体組み立てに干渉しない限り、同様に利用できることは、当業者には理解されるであろう。配列番号４８、８８および９０は、本発明によるポリペプチドの２つの成分Ａを連結するペプチドリンカーＰとして特に好ましい。好ましくは、本発明のポリペプチド内の成分Ａを連結するペプチドリンカーＰは、該成分Ａの三量体形成に負の影響を及ぼし得る分子内ジスルフィド架橋の形成を回避するために、システイン残基を一切含まない。

本発明によるポリペプチドの少なくとも３つの成分Ａを連結する少なくとも２つのペプチドリンカーＰを、原則的に、互いに独立して選択することができる；例えば、前記少なくとも２つのペプチドリンカーＰは、（長さおよび／または配列の点で）同じ配列を有することもあり、または異なる配列を有することもある。しかし、前記少なくとも３つの成分Ａを連結するペプチドリンカーＰが同一であるならば、特に好ましい。本発明によるポリペプチドが３つより多くの成分Ａと該成分Ａを連結する２つより多くのリンカーＰとを含む場合、同様の考察が間違いなく当てはまる。前記ペプチドリンカーＰは、前記成分Ａに、第一の成分ＡのＣ末端への共有結合、およびその後の成分ＡのＮ末端への共有結合によって連結される。好ましくは、前記連結は、ペプチド結合である。

本発明によるポリペプチドの具体的な例は、成分Ａとして配列番号５ならびに好ましくはペプチドリンカーＰとして配列番号４８、８８および／または９０を含む。

上で述べたように、本発明によるポリペプチドは、少なくとも３つの成分Ａと並んで少なくとも１つの成分Ｂを含み、該成分Ｂは、≦１２アミノ酸の長さを有するリンカー配列Ｌで互いに直接連結されているＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域から成る。

用語「Ｖ_Ｌ」および「Ｖ_Ｈ」は、抗体のＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域、すなわち、それぞれ、免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端可変領域および免疫グロブリンの重鎖のＮ末端可変領域を指す。両方の用語が当該技術分野において十分に理解されており、構造的に十分に定義されている。個々のＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は、各々、３つの超可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；ＣＤＲ：相補性決定領域）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）から成る。所与の配列内のそれぞれのサブ領域の同定は、当該技術分野において常例的であり、例えば、ＮＣＢＩのＩｇＢｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）、ＭＲＣのｖ−ｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）、ＥＵ−ＧＥＮＥがホストであるｖ−ｂａｓｅ２（ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／）、Ａｎｄｒｅｗ Ｍａｒｔｉｎグループ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｓｅｒｖｅｒｓ／）および／またはＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）により提供されているオンラインプログラムによって遂行することができる。Ｋａｂａｔ命名法も有用である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｋａｂａｔｍａｎ．ｈｔｍｌ）（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５（１９９６），１３０−１３３）。重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が一緒に抗体の結合領域を形成する。免疫グロブリンにおいて、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は異なるポリペプチド鎖上にある。本発明のポリペプチドでは、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が同じ鎖上にある。Ｖ_ＬドメインとＶ_Ｈドメインの相互作用（分子内または分子間的に）が、本発明のポリペプチドのそれぞれの標的抗原への結合を可能にする。

好ましくは、本発明によるポリペプチドのＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は、細胞表面分子（細胞表面抗原）に、詳細には、サイトカイン受容体、成長因子受容体、インテグリン、細胞接着分子および／または細胞タイプ特異的もしくは組織特異的細胞表面抗原、細胞表面発現腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、炭水化物から成る群より選択される細胞表面分子に、（好ましくは）特異的に結合する抗体のＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域である。腫瘍関連抗原は、例えば、腫瘍細胞自体の上で、悪性細胞上で、間質細胞上で、腫瘍内皮および他の腫瘍局在細胞タイプの上で発現され得る。

好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドのＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は、以下のものから成る群より選択される標的抗原に結合する抗体のＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域である：ｅｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）、ＶＥＧＦＲ、ヘテロマー型（ｈｅｔｅｒｍｅｒｉｃ）インテグリンａ_ｘβ_ｘ受容体ファミリー、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ガレクチン、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＣＤ４４およびその腫瘍特異的変異体（ＣＤ４４ｖ）、ならびに他の腫瘍選択的細胞表面マーカー、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、葉酸受容体、Ｌｅ^ｙ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ｕＰＡＲ、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２など。特に好ましい標的は、チロシンキナーゼ受容体のｅｒｂＢファミリーのメンバー、および腫瘍間質選択的標的、例えばＦＡＰである。

概念実証として、添付の実施例ではＥＧＦＲを標的抗原として使用する。

それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を当業者は容易に得ることができる。多くの抗体についてのポリペプチドおよび核酸配列を当該技術分野において容易に入手することができる（例えば、Ｅｘｐａｓｙ配列データベース、ＰｕｂＭｅｄなどを参照されたし）。あるいは、当業者は、所望の特異性の利用可能な抗体の配列を決定することができ、または抗体生産に適している動物を抗原で免疫すること、抗原特異的Ｂ細胞クローンを単離すること、およびそれぞれのＶ_ＬおよびＶ_Ｈ遺伝子をシークエンシングすることによって、所望の標的抗原に対する新たな抗体を生産することさえできる。組換え抗体ライブラリー、例えば、免疫、ナイーブ、半合成または完全合成抗体ライブラリーから、抗体（およびその後、抗体配列）を得ることもできる。かかるライブラリーからの単離を種々の手段によって、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、ハイスループットスクリーニングなどによって達成することができる。その後、遺伝子操作により、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に前記配列を含めることができる。

本発明によるポリペプチド内のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域が人工のものであってもよいこと、すなわち、事実上の天然に存在する抗体に由来する必要がないことは、当業者には理解されるであろう。むしろ、この専門用語は、前記領域がＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域の一般構成を呈示することを表すためのものである。本発明によるポリペプチドのＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は、例えば、ヒト化配列であることがあり、例えば、ＣＤＲがマウス由来のものである一方で、フレームワーク領域はヒト由来のものである。前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は、例えば、脱免疫化されていてもよく、および／または完全ヒトであってもよい。

特に好ましいＶ_Ｌ領域は、標的抗原がＥＧＦＲである場合、配列番号９２である（例えば、配列番号１０２および１０７を参照されたし）。

特に好ましいＶ_Ｈ領域は、標的抗原がＥＧＦＲである場合、配列番号９３である（例えば、配列番号１０２および１０７を参照されたし）。

標的抗原がＦＡＰである場合に特に好ましいＶ_Ｌ領域は、配列番号１３０〜１３２に記載のアミノ酸配列である（例えば、配列番号１２７〜１２９を参照されたし）。

標的抗原がＦＡＰである場合に特に好ましいＶ_Ｈ領域は、配列番号１３３〜１３５に記載のアミノ酸配列である（例えば、配列番号１２７〜１２９を参照されたし）。

配列番号１２７〜１２９に記載のＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、選択的腫瘍間質マーカー線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を認識する腫瘍間質標的化ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の例である。したがって、ＴＲＡＩＬアポトーシス促進活性は、腫瘍環境に指向され、前記融合タンパク質内のＴＲＡＩＬモジュールの向近接性提示（ｊｕｘｔａｔｒｏｐｉｃ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）により、アポトーシスが腫瘍細胞にトランスでシグナル伝達される。全腫瘍量の１０から９０％を含む様々な間質含量でのＦＡＰ過発現は、乳房、結腸、膵臓および肺をはじめとする様々な上皮癌の顕著かつ一般的な特徴であるので、ＴＲＡＩＬモジュールの高特異性アポトーシス活性は、広範な癌腫に対する効率的な抗腫瘍治療作用を確実なものにする（Ｇａｒｉｎ Ｃｈｅｓａら，１９９０，ＰＮＡＳ ８７：７２３５−７２３９）。

配列番号１２７〜１２９に記載の融合タンパク質は、ＦＡＰ特異的であり、および典型的にナノモル範囲（例えば、１０〜３０ｎＭ）の高い結合親和性を呈示する。配列番号１２７〜１２９に記載の融合タンパク質の成分Ｂは、１）ヒト化変異体であって、ＣＤＲグラフティングによって生成され、およびマウスとヒト間で交差反応性の種であり（配列番号１３０、１３３、１３６および１２７）、したがってマウス腫瘍モデルでの前臨床試験を可能にするものであるヒト変異体；２）２つの完全ヒト成分Ｂであって、ナイーブヒトＩｇライブラリー（配列番号１３１、１３４、１３７および１２８、ならびに配列番号１３２、１３５、１３８および１２９）からガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって単離され、およびヒトＦＡＰの細胞外ドメインにおける異なるエピトープに結合し、ＦＡＰ結合について一方（配列番号１３１、１３４、１３７および１２８）がマウスｍａｂＦ１９との競合を特徴とし、もう一方（配列番号１３２、１３５、１３８および１２９）がＦ１９と競合しないことを特徴とするものである２つの完全長ヒト成分Ｂである。

前記Ｖ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域は、本発明によるポリペプチド内に任意の適する様式で配置され得る。好ましくは、前記Ｖ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域を含む領域は、前記３つの成分Ａを含む領域のＮ末端に配置される。

上で述べたように、本発明によるポリペプチドの成分ＢのＶ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域は、≦１２アミノ酸の長さを有するリンカー配列Ｌで互いに直接連結されている。リンカー配列Ｌは、好ましくは、可撓性アミノ酸ストレッチである。好ましくはかかるリンカー配列Ｌは、１１未満、さらにいっそう好ましくは１０未満、さらにいっそう好ましくは９未満、さらにいっそう好ましくは８未満、さらにいっそう好ましくは７未満、さらにいっそう好ましくは６未満のアミノ酸長である。加えて、前記リンカー配列Ｌは、好ましくは０アミノ酸以上、１アミノ酸以上、２アミノ酸以上、３アミノ酸以上、４アミノ酸以上、５アミノ酸以上、６アミノ酸以上、７アミノ酸以上、および／または８アミノ酸以上のアミノ酸長を有し得る。したがって、本発明のポリペプチドの成分ＢのＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域を連結するリンカー配列Ｌは、例えば、０から１２アミノ酸、１から１２アミノ酸、２から１０アミノ酸、３から１０アミノ酸、３から９アミノ酸、３から６アミノ酸、４から８アミノ酸、４から７アミノ酸、４から１２アミノ酸の範囲のアミノ酸長、またはリンカー配列Ｌについて上に開示したアミノ酸長の任意の他の組み合わせを有し得る。０から５アミノ酸、特に５アミノ酸のリンカー配列Ｌ長が、特に好ましい。

アミノ酸配列の点で、本発明のポリペプチドの成分ＢのＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域を連結するリンカー配列Ｌは、好ましくはグリシン（Ｇ）リッチペプチドリンカーである、すなわち、５０％より高い、例えば、少なくとも６０から９０％、例えば約８０％の、高グリシン含有率を有するアミノ酸配列を有する。リンカー配列Ｌ中に存在し得る他のアミノ酸は、例えば、セリン残基またはあまり好ましくはないがアラニン残基もしくはグルタミン残基である。前記リンカー配列Ｌは、繰り返し単位から成ることがある。例えば、前記リンカーは、２、３または４単位のＧＧ（配列番号４０）；ＧＧＳ（配列番号５５）；ＧＳＧ（配列番号５４）、またはＳＧＧ（配列番号５３）およびこれらの組み合わせを含むことがある。本発明のポリペプチドの成分ＢのＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域を連結するリンカー配列Ｌについての特に好ましい例は、（リンカー配列Ｌの前記長さ制限を超える配列を除き）上の表２に示したような配列群から選択される。したがって、リンカー配列Ｌが存在する場合、そのリンカー配列Ｌを、例えば、配列番号３９〜５１、および５３〜７８のリンカー配列から選択することができる。

配列番号５０は、本発明のポリペプチドの成分ＢのＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域を連結するリンカー配列Ｌとして特に好ましい。好ましくは、前記リンカー配列Ｌは、例えば本発明のポリペプチドのＶ_ＨまたはＶ_Ｌ二次構造の妥当な形成に負の影響を及ぼし得る分子内ジスルフィド結合の形成を回避するために、システイン残基を一切含まない。

間違いなく、リンカー配列Ｌを、本発明によるポリペプチド中に存在する成分Ｂごとに独立して選択することができ、および成分Ａを連結するために選択される任意のペプチドリンカーＰとは無関係に選択することができる。リンカー配列Ｌは、共有結合によってＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域を連結する。好ましくは、前記連結は、ペプチド結合である。成分Ｂは、（Ｎ末端からＣ末端へ）配列：
Ｖ_Ｌ領域−リンカー配列Ｌ−Ｖ_Ｈ領域
を有してもよく、または配列
Ｖ_Ｈ領域−リンカー配列Ｌ−Ｖ_Ｌ領域
を有してもよい。

Ｖ_Ｈ領域−リンカー配列Ｌ−Ｖ_Ｌ領域の配置が特に好ましい。

特に好ましい実施形態において、成分Ｂは、配列番号９３、５０および９２から成る配列番号９４の配列を有する（例えば、配列番号１０２および１０７におけるものを参照されたし）。

これに関連して、本発明は、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９２と配列番号９３、および／または配列番号９４の配列を含むポリペプチドにも関する。

さらに特に好ましい実施形態において、成分Ｂは、配列番号１３３、５０および１３０（例えば、配列番号１２７参照）、配列番号１３４、５０および１３１（例えば、配列番号１２８参照）、ならびに配列番号１３５、５０および１３２（例えば、配列番号１２９参照）からそれぞれ成る、配列番号１３６〜１３８うちのいずれかの配列を有する。

これに関連して、本発明は、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３０と配列番号１３３、および／または配列番号１３６に記載の配列を含むポリペプチドに、配列番号１３１、配列番号１３４、配列番号１３１と配列番号１３４、および／または配列番号１３７に記載の配列を含むポリペプチドに、ならびに配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３２と配列番号１３５、および／または配列番号１３８に記載の配列を含むポリペプチドにも関する。

本発明によるポリペプチドの成分Ｂが、任意の抗体定常領域、例えばＦａｂ断片におけるものを含まないことは、当業者には理解されるであろう。

本発明によるポリペプチドは、少なくとも３つの成分Ａおよび少なくとも１つの成分Ｂを含む。好ましくは、前記少なくとも３つの成分Ａを含む領域は、ペプチドリンカーＸ経由で成分Ｂに連結されている。ペプチドリンカーＸは、ＴＨＤ三量体の形成にもＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの会合にも干渉しない限り、原則的にいずれの配列であってもよい。詳細には、リンカーＸに関する絶対長制限はなく、および可撓性の要求はない。しかし、好ましくはＸは、５０未満、さらにいっそう好ましくは４５未満、さらにいっそう好ましくは４０未満、さらにいっそう好ましくは３５未満、さらにいっそう好ましくは３０未満、さらにいっそう好ましくは２５未満、さらにいっそう好ましくは２０未満、さらにいっそう好ましくは≦１５のアミノ酸長である。したがって、リンカーＸは、例えば、ペプチドリンカーＰまたは連結配列Ｌについて上で定義したとおりのリンカーであり得る。特に好ましい実施形態において、リンカーＸは、例えば、配列ＧＮＧＴＳＮＧＴＳ（配列番号８３）を含むことができ、それにより、本発明のポリペプチドのグリコシル化が可能になり、したがってポリペプチド全体の安定性が向上される。その場合、グリコシル化残基は、Ａｓｎ残基である。リンカーＸの配列についての具体的な例は、例えば、ＡＡＡＥＦＴＲＧ（配列番号９５）、ＡＡＡＧＮＧＴＳＮＧＴＳＥＦＴＲＧ（配列番号１０５）、およびＧＧＳＧＮＧＴＳＮＧＴＳＧ（配列番号１０６）であり得る。後ろの２つは、重ねて、本発明によるポリペプチドのグリコシル化を可能にする。

本発明によるポリペプチドの構造は、例えば、（Ｎ末端からＣ末端へ：Ｂ：成分Ｂ；Ｘ：ペプチドリンカーＸ；Ａ：成分Ａ；Ｐ：ペプチドリンカーＰ：
Ｂ − Ｘ − Ａ − Ｐ − Ａ − Ｐ − Ａ，
を含むものであり得、または
Ａ − Ｐ − Ａ − Ｐ − Ａ − Ｘ − Ｂ
であり得る。

本発明によるポリペプチドの具体的な例は、成分Ａとしての配列番号５および成分Ｂとしての配列番号９４を、好ましくはペプチドリンカーＰとしての配列番号４８、８８および／または９０と共に含む。配列番号１０２および配列番号１０７（配列番号１０７は、配列番号１０２のアミノ酸３４−８５０に対応し、すなわち、リーダー配列およびＦＬＡＧタグを含まない）は、本発明の好ましい例である。本発明によるポリペプチドのさらに好ましい例は、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む配列番号１２５および１２６に記載の配列、ならびにＦＡＰ特異的成分Ｂを含む配列番号１２７〜１２９に記載の配列である。

さらなる態様において、本発明は、配列番号９６の配列を含むポリペプチドに関する。

さらなる態様において、本発明は、次のものを含むポリペプチドに関する：
ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）の配列またはその機能的誘導体をそれぞれが含む、少なくとも３つの成分Ａ、および
ｂ）グリコシル化モチーフを含む配列。

グリコシル化モチーフは、例えば、アスパラギンまたはアルギニン側鎖中に窒素原子を含む。グリコシル化モチーフの例は、例えば上で配列番号８３〜９１に開示している。かかるポリペプチドの具体的な例は、配列番号９７または配列番号９８の配列を含むポリペプチドである。

加えて、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、いずれのエンドペプチダーゼ認識部位および／または切断部位も含まないはずであり、少なくとも構造Ｂ−Ｘ−Ａ−Ｐ−Ａ−Ｐ−ＡまたはＡ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ａ−Ｘ−Ｂ内に含まないはずである（それらのエンドペプチダーゼ切断部位ＮまたはＣ末端の存在は、本発明によるポリペプチドの総合的機能に影響を及ぼさないであろうし、したがって、それらの存在は、決定的ではない）。言い換えると、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、少なくとも３つの成分Ａと少なくとも１つの成分Ｂとそれらの間のリンカーとを含む領域内にいずれのエンドペプチダーゼ認識部位および／または切断部位も含まないはずである。エンドペプチダーゼ切断部の存在は、本発明によるポリペプチドの半減期を有意に低減させることとなり、および重要なドメインの相互作用を無効にするので本発明のポリペプチドの効力に深刻な影響を及ぼすことがある。例えば、本発明によるポリペプチドからのエンドペプチダーゼ切断による１つの成分Ａの分離は、三量体形成を妨げることとなる。同様に、成分Ｂが成分Ａから分離されると、いずれかの標的化効力が失われる。これは、それぞれのエンドペプチダーゼ認識部位を除去／変更することにより、エンドペプチダーゼ切断部位を除去することにより、およびまたは両方を行うことにより、防止することができる。この状況では、本発明によるポリペプチド中の成分ＡがＴＡＣＥ切断部位を含まない場合、特に好ましい。ＴＡＣＥ（ＴＮＦ−アルファ変換酵素、これはＡＤＡＭ１７とも呼ばれる）は、ＡＤＡＭプロテアーゼファミリーのメンバーであり、例えば初期膜結合ＴＮＦおよびその他を生理的にプロセッシングする酵素を表す。ＴＡＣＥは、その膜結合形態を切断し、それによってＴＮＦを放出（溢出）させる。したがって、ＴＮＦに基づく成分Ａは、好ましくは、ＴＮＦのＡｌａ７６−Ｖａｌ７７切断部位を欠く。切断部位を欠くことは、切断部位が欠失され得る、または例えば置換もしくは挿入によって変更されることを含意する。あるいは、または好ましくは加えて、ＴＮＦリガンドの柄領域内のプロテアーゼ結合部位、例えば、ＴＮＦ−（Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）のアミノ酸７７−８８を変更して（または好ましくは欠失させて）、ＴＡＣＥによる本発明のポリペプチドの認識を回避することができる。

本発明によるポリペプチドは、さらなるポリペプチド配列およびドメインを含むことがあるが、これらは完全に任意選択である。

本発明によるポリペプチド中に存在してもよく、またはしなくてもよい１つのかかる任意選択要素は、本発明によるポリペプチド内の１つ以上のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の存在である。本発明によるポリペプチドは、特に、本発明のポリペプチドの血漿半減期を延長し、それによって治療に有効な血漿濃度を維持することを目的として、かかるアルブミン結合ドメインをさらに含むことがある。血清アルブミンは、ヒトにおいて異例の長い血漿半減期を有する。ヒト血清アルブミンの血漿半減期は、１９日の範囲内である。ＩｇＧを除けば、このような長い半減期を呈示する他の可溶性血清タンパク質は知られていない。アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、アルブミンに対して親和性を有する任意の分子、例えば、一定のペプチド、抗体断片、代替足場、および小さな化学物質であり得る（総説については、参照により本明細書に援用されているＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２００９，２３：９３−１０９を参照されたし）。本発明によるポリペプチド中のアルブミン結合ドメインの特に好ましい例は、例えば、アルブミン結合抗体およびアルブミン結合抗体誘導体、例えばアルブミン結合Ｆａｂ断片、アルブミン結合ｓｃＦｖ抗体、ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８のプロテインＧから成る群より選択される。（例えば、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２１（２００８）５１５−５２７頁およびＨｏｐｐら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２３（２０１０）８２７−８３４頁（これらは両方とも参照により本明細書に援用されている）に記載されているような）配列ＱＨＤＥＡＶＤＡＮＳＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲＥ ＬＤＫＹＧＶＳＤＹＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥＩＬＡＡＬＰ（配列番号９９）を含む連鎖球菌株Ｇ１４８のプロテインＧおよびその非免疫学的変異体または誘導体のＡＢＤが、最も好ましい。あるいは、本発明によるポリペプチドは、単に、アルブミン部分自体との融合タンパク質、またはその断片もしくは誘導体であることもある。かかるポリペプチドの例は、配列番号１０３である。

特に好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドは、上で説明したようなアルブミン結合ドメイン、例えば、配列番号９９に記載のアルブミン結合ドメイン、またはアルブミンを結合することができるその誘導体、例えば、配列番号９９の全長にわたって配列番号９９と少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する配列、またはアルブミンンを結合することができる配列番号９９のもしくはその誘導体の断片、例えば、配列番号９９の完全長配列のもしくはその誘導体の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも８０％に相当するアミノ酸の連続ストレッチから成る断片を含む。

好ましくは、本発明によるポリペプチド内のＡＢＤの位置は、それが、本発明によるポリペプチドの生物活性、例えば、癌細胞などの標的細胞においてアポトーシスを誘導する生物活性に有意に干渉しないように選択される。任意選択のＡＢＤが本発明によるポリペプチドの成分Ａと成分Ｂの間に位置することが、特に好ましい。例えば、特に好ましい実施形態において、成分Ｂは、成分ＡのＮ末端に位置し、任意選択のＡＢＤは、成分Ａと成分Ｂの間に位置し、その結果、例えば、構造Ｎ−Ｋ−［成分Ｂ］−Ｘ−ＡＢＤ−Ｐ−［成分Ａ］−Ｘ−Ｃを形成し、この式中、Ｋは、任意選択のＶ_Ｈリーダー配列であり、ＸおよびＰは、グリコシル化部位を含んでもよくまたは含まなくてもよい本明細書に記載の任意選択のリンカーであり、ならびにＮおよびＣは、この融合タンパク質のＮ末端部およびＣ末端部をそれぞれ表す。本発明によるかかるポリペプチドについての例を配列番号１２５（図２５）に与える。

もう１つの特に好ましい実施形態において、前記任意選択のアルブミン結合ドメインは、本発明によるポリペプチドの成分Ａの下流に位置する。例えば、特に好ましい実施形態において、成分Ｂは、成分ＡのＮ末端に位置し、任意選択のＡＢＤは、成分ＡのＣ末端に位置する。したがって、特に好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドは、構造Ｎ−Ｋ−［成分Ｂ］−Ｘ−［成分Ａ］−Ｐ−ＡＢＤ−Ｘ−Ｃを呈示し、この式中、Ｋは、任意選択のＶ_Ｈリーダー配列であり、ＸおよびＰは、グリコシル化部位を含んでもよくまたは含まなくてもよい本明細書に記載の任意選択のリンカーであり、ならびにＮおよびＣは、この融合タンパク質のＮ末端部およびＣ末端部をそれぞれ表す。好ましくは、ＡＢＤは、本発明によるポリペプチドのＣ末端部に位置する。本発明によるかかるポリペプチドの例を配列番号１２６（図２６）に与える。

本発明によるポリペプチド中に存在してもよくまたはしなくてもよい、もう１つの任意選択要素は、例えば本発明によるポリペプチドの検出およびまたは精製を可能にする、タグである。かかるタグの例は、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１００）、ＨＡタグ、ＳＴＲＥＰタグ、ｍｙｃタグ、ＧＳＴである。好ましくは、かかるタグを、少なくとも３つの成分Ａと少なくとも１つの成分Ｂとを含む領域外に配置する。そのような場合、そのタグに隣接して、例えばそのタグのＣ末端に直接、プロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビン切断部位）を配置することが可能である。これにより、そのタグを例えば精製後に除去することが可能になる。

本発明によるポリペプチド中に存在してもよくまたはしなくてもよい、もう１つの任意選択の、しかし好ましい、要素は、リーダーまたはシグナルペプチド配列、例えば、Ｖ_Ｈリーダー配列ＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬＬＡＶＡＰＧＡＨＳ（配列番号１０１）またはＩｇκ（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ；配列番号１０８）である。かかる配列は、マッチする細胞系において生産されると、翻訳後の本発明によるポリペプチドのプロセッシングおよび標的化に作用することができる。例えば、Ｖ_Ｈリーダー配列は、（例えば、哺乳動物において使用されると）、本発明によるポリペプチドを分泌経路に指向させ、およびかくして培養上清からの分泌産物のより容易な精製を可能にする。上述の検出および精製タグと同様に、かかるリーダーまたはシグナルペプチド配列を本発明によるポリペプチドのまさしくＮ末端に配置し、かくしてＥＲへの共翻訳転位、およびＣＨＯ細胞などの適する哺乳動物発現系における生理的プロセッシングを可能にする。このことに関して、本明細書においてポリペプチドを本明細書におけるリーダー配列と共に与える場合には、該ポリペプチドが、例えば哺乳動物発現での発現後、もはや該リーダー配列を含まないであろうことは、当業者には理解されるであろう。リーダー配列を有さないいずれのかかるポリペプチドも、間違いなく、本発明の範囲内に入る。詳細には、配列番号１０１のリーダー配列を有さない配列番号９６、９７、９８、１０２ならびに／または１０３の配列を含むポリペプチドは、本発明の実施形態である。同様に、配列番号１０１のリーダー配列を有さない、かつ配列番号１００のＦＬＡＧタグ配列を有さない、配列番号９６、９７、９８、１０２および／または１０３の配列を含むポリペプチドは、本発明の実施形態である。

同様に、本発明によるポリペプチドは、場合により修飾を呈示することがある。例えば、本発明によるポリペプチドをその流体力学的体積に関して変更することができる。タンパク質の流体力学的体積は、高可撓性、親水性分子、例えばポリエチレングリコールおよび／または炭水化物、を付けることにより、増加させることができる。当該技術分野では、ＰＥＧ化、すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の化学的カップリングを用いることが多い。ＰＥＧは、線状のまたは分岐した立体配置で接続されている様々な長さのエチレンオキシド単位から成る。例えば、５から４０ｋＤａの１本または数本のＰＥＧ鎖を本発明によるポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。しかし、好ましくはＰＥＧ化をランダムに果たすべきではない。なぜなら、かかるアプローチは、本発明によるポリペプチドの三量体化または標的化に負の影響を及ぼすことがあるからである。好ましくは、ＰＥＧ化部位は、少なくとも３つの成分Ａと少なくとも１つの成分Ｂとを含む領域内にはない。ＰＥＧ化部位を、例えば、本発明によるポリペプチドにシステイン残基によって付けることができる。好ましくは、これらのシステイン残基を、少なくとも３つの成分Ａと少なくとも１つの成分Ｂとを含む領域外に配置する。幾つかの他の技術も当該技術分野において公知である。ＰＥＧミメティクスも本発明によるポリペプチドを修飾するために間違いなく用いることができる。

本発明によるポリペプチドのさらなる可能な修飾は、−既に上で示したように−グリコシル化である。グリコシル化は、本発明によるポリペプチドの半減期および安定性に正の影響を及ぼすことができる。Ｎ−ならびにＯ−グリコシル化を考えることができる。本発明の発明者らは、例えば、配列ＧＮＧＴＳＮＧＴＳ（配列番号８３）を有するリンカーＸを導入することによりグリコシル化が可能であることを証明した。本発明によるポリペプチドの他の配列位置でのグリコシル化部位も間違いなく可能である。好ましくは、かかるグリコシル化部位は、本発明によるポリペプチド内のＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＨＤの標的化およびそれぞれの機能活性に（有意な）影響を及ぼさない。かかるポリペプチドについての例は、配列番号９７、９８および１０３の配列を有するポリペプチドである。

本発明によるポリペプチドの他の可能な修飾としては、例えば、ＨＥＳ化（ヒドロキシエチルデンプンでの修飾）、およびポリシアル酸（ＰＳＡ）での修飾が挙げられる。

一般に、ポリペプチドの生産は当該技術分野において周知であり、当業者は、常例的方法によって本発明のペプチドに容易に達することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたし）。一般に、ポリペプチドおよびタンパク質の生産は、それぞれ、それらをコードするＤＮＡ配列を作ること、続いて、そのそれぞれのＤＮＡ配列で適する宿主を形質転換すること、そしてその修飾されたＤＮＡ配列を発現させることによって達成される。あるいは、本発明によるポリペプチドを化学合成することができる。

本発明は、本発明によるポリペプチドのポリペプチド複合体、例えば、本発明によるポリペプチドのホモ二量体および／またはホモ三量体の複合体にも関する。したがって、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、多量体、例えば二量体、三量体、四量体など、好ましくは二量体、を形成することができる。好ましくは、成分Ｂは、多量体、例えば二量体、三量体、四量体など、を形成することができる。したがって、特に好ましい実施形態において、成分Ｂは、本発明によるポリペプチドの多量体化、例えば二量体化、が可能であるように選択される。特に好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドは、多量体形態、例えば、二量体、三量体、四量体などの形態、最も好ましくは二量体形態を呈示する。したがって、好ましくは、本発明によるポリペプチドは、多量体、例えば、二量体、三量体または四量体、好ましくは二量体のものである。したがって、特に好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチド複合体は、二量体のものである。本発明による二量体ポリペプチドは、少なくとも６つの成分Ａを含む。

さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸にも関する。前記核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのハイブリッドであってよい。好ましくは、前記核酸は、適する発現系において本発明によるポリペプチドの発現を可能にする配列も含む。前記核酸は、それぞれの発現系のために最適化されたコドンであり得る。

さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸を含むベクターにも関する。好ましくは、前記ベクターは、適する宿主細胞における本発明によるポリペプチドの転写および発現に備えるものである。

さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるポリペプチドまたは本発明によるポリペプチド複合体を含む、（宿主）細胞にも関する。前記宿主細胞がヒト宿主細胞である場合、それは、人体外の単離された宿主細胞である。

さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリペプチド複合体または本発明による宿主細胞を含む、非ヒト生物に関する。

さらなる態様において、本発明は、外科手術または治療によるヒトまたは動物の体の処置方法およびヒトまたは動物の体に対して実施される診断方法における、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリペプチド複合体および／または本発明による宿主細胞に関する。好ましくは、前記処置方法は、癌、自己免疫疾患または変性疾患の処置に関する。

これに関連して、本発明は、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリペプチド複合体および／または本発明による宿主細胞と、場合により、医薬的に許容され得る担体、アジュバントおよび／またはビヒクルとを含む、医薬組成物にも関する。特に好ましい医薬組成物は、配列番号１０２、１０３、１０７、１２５、１２６、１２７、１２８および／または１２９の配列を含むポリペプチドを含む。

前記医薬組成物は、安全かつ有効な量の、上で定義したとおりの本発明による化合物（ポリペプチド、核酸、ベクター）を概して含む。ここで用いる場合、「安全かつ有効な量」は、処置すべき病態の、例えば癌および／または腫瘍の、正の修飾を有意に誘導するのに十分である、上で定義したとおりの化合物の量を意味する。しかし、同時に、「安全かつ有効な量」は、好ましくは、重篤な副作用を回避する、すなわち、利点とリスク間の賢明な関係を可能にするのに十分な少量である。これらの制限の決定は、賢明な医学的判断の範囲内に概して存する。上で定義したとおりの本発明による化合物の「安全かつ有効な量」は、付き添う医師の知識および範囲内で、処置すべき特定の病態、ならびにまた処置すべき患者の健康状態、その病態の重症度、処置の継続期間、付随する療法の性質、使用される医薬的に許容され得る特定の担体の性質、および類似の要因との関連で変わるであろう。本発明による医薬品を、医薬組成物として、ヒトに、およびまた獣医学的目的で、本発明に従って使用することができる。

本発明の医薬組成物は、典型的に、医薬的に許容され得る担体を含有する。本明細書において用いる場合の「医薬的に許容され得る担体」という表現は、本発明の医薬品の液体または非液体基剤を含む。本発明の医薬品を液体形態で提供する場合、担体は、典型的に、発熱性物質除去水；等張食塩水または緩衝（水）溶液、例えばリン酸塩、クエン酸塩などで緩衝された溶液であるだろう。特に、本発明の医薬品の注射には、ナトリウム塩を含有する緩衝液、好ましくは水性緩衝液を使用することができる。前記注射緩衝液は、特定の参照媒体を基準にして高張性、等張性または低張性であることがある。すなわち、前記緩衝液は、特定の参照媒体を基準にしてより高い、同一のまたはより低い塩含有量を有することがあり、好ましくは、浸透または他の濃度効果に起因する細胞の障害をもたらさないような濃度の上述の塩を使用することができる。参照媒体は、例えば、「インビボ」法を行う場合、液体、例えば血液、リンパ、サイトゾル液もしくは他の体液であり、または例えば、「インビトロ」法において参照媒体として使用することができる液体、例えば共通緩衝液または液である。かかる共通緩衝液または液は、当業者に公知である。リンガー・乳酸塩溶液は、液体基剤として特に好ましい。

しかし、人への投与に適している１つ以上の相溶性固体または液体フィラー、希釈剤または封入化合物を使用することもできる。ここで用いる場合の用語「相溶性」は、通常の使用条件下で本発明の医薬品の医薬有効性を実質的に低減させる相互作用が起こらないような様式で、本発明の医薬品の構成成分と上で定義したとおりの本発明の化合物とを混合することができることを意味する。医薬的に許容され得る担体は、もちろん、それらを処置すべき人への投与に適するものにするために十分に高い純度および十分に低い毒性を有さなければならない。医薬的に許容され得る担体またはそれらの構成成分として使用することができる化合物の一部の例は、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンまたは馬鈴薯デンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど；粉末トラガカントゴム；麦芽；ゼラチン；獣脂；固体潤滑剤、例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど；硫酸カルシウム；植物油、例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオからの油など；ポリオール、例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；アルギン酸である。

医薬的に許容され得る担体の選択は、原則的に、本発明の医薬品を投与する様式によって決定される。本発明の医薬品を、例えば全身投与することができる。投与経路としては、例えば、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｅ）、吸入、経口、非経口（皮下もしくは静脈内注射を含む）、局所および／または鼻腔内経路が挙げられる。投与すべき本発明の医薬品の適量は、動物モデルでの常例的実験によって決定することができる。かかるモデルとしては、いずれの制限も含意しないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌおよび非ヒト霊長類モデルが挙げられる。注射に好ましい単位用量形態としては、滅菌水溶液、滅菌生理食塩液溶液、またはこれらの混合物が挙げられる。かかる溶液のｐＨを約７．４に調整すべきである。注射に適する担体としては、ヒドロゲル、制御または遅延放出用デバイス、ポリ乳酸およびコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所投与に適する医薬的に許容され得る担体としては、ローション、クリーム、ゲルおよびこれらに類するものでの使用に適しているものが挙げられる。本発明の医薬品を経口投与すべき場合、錠剤、カプセルおよびこれらに類するものが好ましい単位用量形態である。経口投与に使用することができる単位用量形態の調製用の医薬的に許容され得る担体は、先行技術分野において周知である。それらの選択は、本発明の目的にとって決定的なものではない二次的考慮、例えば、味、費用および保管性に依存することとなり、当業者は難なくそれを行うことができる。

本明細書に引用するすべての参考文献は、それら全体が本明細書に援用されている。

以下に、添付の図面の簡単な説明を与えることとする。これらの図は、本発明をより詳細に例証するためのものである。しかし、それらは、本発明の主題をいかなる程度にも制限するためのものではない。

本発明による例示的ポリペプチドの略図：Ａ）Ｋ＝Ｖ_Ｈリーダー（例えば、配列番号１０１）；Ｆ＝タグ（すなわち、ＦＬＡＧタグ；例えば、配列番号１００を参照されたし）；Ｌ＝リンカー配列Ｌ、例えば、１５ａａ長（例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３；配列番号５２）；Ｘ＝ペプチドリンカーＸ（例えば、配列番号９５を参照されたし）；Ｐ＝ペプチドリンカーＰ（例えば、配列番号４８を参照されたし）；Ａ＝成分Ａ（例えば、ＴＲＡＩＬ ａａ残基９５−２８１、配列番号５）。かかるポリペプチドの例は、配列番号９６（図２０）である。 Ｂ）Ｋ＝Ｖ_Ｈリーダー（例えば、配列番号１０１）；Ｆ＝タグ（すなわち、ＦＬＡＧタグ；例えば、配列番号１００を参照されたし）；Ｌ＝リンカー配列Ｌ、例えば、≦１２ａａ長（例えば、（ＧＧＧＧＳ）；配列番号５０）；Ｘ＝ペプチドリンカーＸ（例えば、配列番号９５を参照されたし）；Ｐ＝ペプチドリンカーＰ（例えば、配列番号４８を参照されたし）；Ａ＝成分Ａ（例えば、ＴＲＡＩＬ ａａ残基９５−２８１；配列番号５）。かかるポリペプチドの例は、配列番号１０２（図２１）である。 Ｃ）Ｋ＝Ｖ_Ｈリーダー（例えば、配列番号１０１）；Ｆ＝タグ（すなわち、ＦＬＡＧタグ；例えば、配列番号１００を参照されたし）；Ｌ＝リンカー配列Ｌ、例えば、１５ａａ長（例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３；配列番号５２）；Ｘ＝グリコシル化部位を含むペプチドリンカーＸ（例えば、配列番号１０５を参照されたし）；Ｐ＝ペプチドリンカーＰ（例えば、配列番号４８を参照されたし）；Ａ＝成分Ａ（例えば、ＴＲＡＩＬ ａａ残基９５−２８１；配列番号５）。かかるポリペプチドの例は、配列番号９７（図２２）である。 Ｄ）Ｋ＝Ｖ_Ｈリーダー（例えば、配列番号１０１）；Ｆ＝タグ（すなわち、ＦＬＡＧタグ；例えば、配列番号１００を参照されたし）；Ｌ＝リンカー配列Ｌ、例えば、１５ａａ長（例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３；配列番号５２）；Ｘ＝グリコシル化部位を含むペプチドリンカーＸ（例えば、配列番号１０５を参照されたし）；Ｐ＝グリコシル化部位を含むペプチドリンカーＰ（例えば、Ｐ_１：（配列番号９０）；Ｐ_２：配列番号８８）；Ａ＝成分Ａ（例えば、ＴＲＡＩＬ ａａ残基９５−２８１；配列番号５）。かかるポリペプチドの例は、配列番号９８（図２３）である。 Ｅ）Ｋ＝Ｖ_Ｈリーダー（例えば、配列番号１０１）；ＡＢＤ＝アルブミン結合ドメイン（例えば、配列番号９９を参照されたし）；Ｑ＝リンカー配列（例えば、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ；配列番号７１）；Ｌ＝リンカー配列Ｌ、例えば、≦１２ａａ長（例えば、（ＧＧＧＧＳ）；配列番号５０）；Ｘ＝グリコシル化部位を含むペプチドリンカーＸ（例えば、配列番号１０６を参照されたし）；Ｐ＝グリコシル化部位を伴うペプチドリンカーＰ（例えば、配列番号８８）またはグリコシル化部位を伴わないペプチドリンカーＰ（例えば、配列番号４８：ＧＧＧＳＧＧＧＳ）；Ａ＝成分Ａ（例えば、ＴＲＡＩＬ ａａ残基９５−２８１、配列番号５）。かかるポリペプチドの例は、配列番号１０３（図２４）である。 Ｆ）Ｋ＝Ｖ_Ｈリーダー（例えば、配列番号１０１）；Ｆ＝タグ（すなわち、ＦＬＡＧタグ；例えば、配列番号１００を参照されたし）；Ｌ＝リンカー配列Ｌ、例えば、≦１２ａａ長（例えば、（ＧＧＧＧＳ）；配列番号５０）；Ｑ＝リンカー配列（例えば、ＧＧＳ；配列番号５５）；ＡＢＤ＝アルブミン結合ドメイン（例えば、配列番号９９を参照されたし）；Ｘ＝グリコシル化部位を含むペプチドリンカーＸ（例えば、配列番号１０５を参照されたし）；Ｐ＝ペプチドリンカーＰ（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４８）；Ａ＝成分Ａ（例えば、ＴＲＡＩＬ ａａ残基９５−２８１、配列番号５）。かかるポリペプチドの例は、配列番号１２５（図２５）である。 Ｇ）Ｋ＝Ｖ_Ｈリーダー（例えば、配列番号１０１）；Ｆ＝タグ（すなわち、ＦＬＡＧタグ；例えば、配列番号１００を参照されたし）；Ｌ＝リンカー配列Ｌ、例えば、≦１２ａａ長（例えば、（ＧＧＧＧＳ）；配列番号５０）；Ｘ＝グリコシル化部位を含むペプチドリンカーＸ（例えば、配列番号１０５を参照されたし）；Ｐ_１＝ペプチドリンカーＰ_１（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４８）；Ｐ_２＝ペプチドリンカーＰ_２（例えば、ＧＧＳＧＧ；配列番号６１）；Ａ＝成分Ａ（例えば、ＴＲＡＩＬ ａａ残基９５−２８１、配列番号５）；ＡＢＤ＝アルブミン結合ドメイン（例えば、配列番号９９を参照されたし）。かかるポリペプチドの例は、配列番号１２６（図２６）である。 配列番号１０４（レーン１）、配列番号９６（レーン２）、配列番号１０２（レーン３）およびグリコシル化された配列番号９７（レーン４）の精製ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）、続いて、銀染色（上方、左、１レーンあたり１μｇのタンパク質）、またはモノクローナル抗ＴＲＡＩＬもしくは抗ＦＬＡＧ抗体をアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体と併用するウエスタンブロッティング（下方、１レーンあたり２５０ｎｇのタンパク質）によって分析した。配列番号９７のグリコシル化ポリペプチドをＮ−グリコシダーゼで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した（上方、右）。配列番号１０４は、２つのグリシンリンカーによって連結されたＴＲＡＩＬ９５−２８１（配列番号５）の３つのコピーを有しかつＮ末端Ｆｌａｇタグを含む、一本鎖ＴＲＡＩＬポリペプチドである。しかし、このポリペプチドは、本明細書に明記するような領域Ｂを一切含まない。 配列番号１０４（上方左）、配列番号９６（下方左）、配列番号１０２（上方右）およびグリコシル化された配列番号９７（下方右）の精製ポリペプチドをＢｉｏＳｕｉｔｅ ２５０カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。分子量標準物質サイログロブリン（６６９ｋＤａ）、β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）および炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）の保持時間を点線によって示す。 Ｊｕｒｋａｔ、Ｈｕｈ−７およびＨｅｐＧ２細胞系におけるＥＧＦ受容体ならびにアポトーシス促進性ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５の発現のフローサイトメトリー分析。 フローサイトメトリー分析：（Ａ）セツキシマブの標的陰性細胞（ＨｅｐＧ２）および標的陽性細胞（Ｈｕｈ−７）への結合の過剰な配列番号１０２による遮断；（Ｂ）配列番号１０２および配列番号９６のＨｅｐＧ２およびＨｕｈ−７細胞への結合。「ｓｃＦｖ」は、競合に使用した抗ＥＧＦＲ特異的抗体断片を表す。 細胞死の標的非依存性誘導：（Ａ）ＥＧＦＲ低／陰性ＨｅｐＧ２細胞を５００ｎｇ／ｍＬのボルテゾミブで感作し、配列番号１０２（白四角）、ＫｉｌｌｅｒＴＲＡＩＬ（商標）（黒逆三角形）、配列番号９６（白丸）および配列番号１０４の系列希釈物で処理した。クリスタルバイオレット染色を用いて、細胞生存率を判定した。４回の独立した実験からの結果を示す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。（Ｂ）（Ａ）に記載したのと同様の実験にＪｕｒｋａｔ細胞（１×１０^５／ウェル）を使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を感作しなかった。３回の独立した実験からの結果を示す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。ＭＴＴアッセイを用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存率を判定した。 ２５０ｎｇ／ｍＬのボルテゾミブで感作し、二重反復で、配列番号１０２（白四角）、配列番号９６（白丸）、配列番号９７（白菱形）および対照としての配列番号１０４の系列希釈物で処理した（パネルの左側）、ＥＧＦＲ＋Ｈｕｈ−７肝細胞癌腫細胞における細胞死のＥＧＦＲ指向性誘導。標的化効果の定量のために、細胞を過剰なＥＧＦＲ特異的抗体セツキシマブ（７０ｎＭ）と共にさらにプレインキュベートした後、試験ポリペプチドを添加した（配列番号１０２（中央パネル）および配列番号９６（右パネル）のグラフ）。容易な比較のために、左パネルからのセツキシマブ不在下でのそれぞれの試薬の用量応答曲線をこれらの２つのパネルに再びプロットした。４回の独立した実験からの結果を示す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。 一定した濃度の試験タンパク質をプレインキュベーション（３０分）に用い、続いてボルテゾミブの系列希釈物を添加したことを除き、図７の場合と同様のＨｕｈ−７肝細胞癌腫細胞における細胞死のＥＧＦＲ指向性誘導。対照：ボルテゾミブのみ。３回の独立した実験からの結果を示す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。 ＥＧＦＲ特異的ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は肝毒性活性を欠く。３匹のＣＤ１マウスの複数の群を示されている融合タンパク質または対照試薬で腹腔内処置した：陰性対照：ＰＢＳ；陽性対照：凝集ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）融合タンパク質。（Ａ）血漿試料を４時間および２４時間後に調製し、酵素的アッセイ（Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、テキサス州オースティン）を用いてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性をアッセイした。破断線は、ＡＬＴの上位正常レベルを示す（成人における生理的範囲：３５〜５０Ｕ／Ｌ）。（Ｂ）陽性対照（凝集ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）融合タンパク質で処置したマウスは、２〜４時間後に重度の全身毒性の表現型徴候を示し、≒５時間後に死亡する。試料を４時間後に採取した）を除き２４時間後にマウスを屠殺し、特異的ＡＭＣ結合ペプチド基質（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ国ローラッハ）を使用するカスパーゼ−３活性の判定のために肝臓生検材料を採取した。 ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に関する一本鎖ＴＲＡＩＬ融合タンパク質による細胞死のＥＧＦＲ指向性誘導。ＮＣＩ−Ｈ４６０非小肺癌細胞(non-small lung cancer cells)（３×１０^４／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。その後、細胞を２．５μｇ／ｍＬシクロヘキシミドで感作し、示されている融合タンパク質の系列希釈物で、二重反復で、処理した。１６時間後、クリスタルバイオレット染色を用いて、細胞生存率を判定した。２回の独立した実験からの結果を示す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。配列番号９６についてはＥＣ_５０値が１．２±０．０８×１０^−１２Ｍであり、配列番号１０２については３．４±０．２８×１０^−１３Ｍであり、配列番号９８については５．８±１．５×１０^−１２Ｍであった。 本発明によるＮ−グリコシル化ポリペプチド（配列番号９８）の生化学的特性付け。（Ａ）配列番号９８をＮ−グリコシダーゼで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した。（Ｂ）配列番号９８および配列番号９６をＢｉｏＳｕｉｔｅ ４５０カラム（Ｗａｔｅｒｓ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。分子量標準物質アポフェリチン（４４３ｋＤａ）、β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）および炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）の保持時間を点線によって示した。 ＥＧＦＲ特異的ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の受容体相互作用。（Ａ）半最大結合濃度（ＥＣ_５０）を明らかにするための間接的免疫蛍光フローサイトメトリーによるＥＧＦＲ^＋ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞へのＴＲＡＩＬ融合タンパク質結合の用量応答関係（平均 ＳＥＭ、ｎ＝４）。（Ｂ）Ｃｏｌｏ２０５およびＨｕｈ−７細胞を一晩、血清飢餓させ、その後、２ｎＭの配列番号１０２、セツキシマブ、および対照のためのＰＢＳ、それぞれと共にインキュベートした。１０分後、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを添加し、細胞をさらに２０分間インキュベートし、その後、細胞溶解した。特異的マウスモノクローナル抗体を使用してＥＧＦ受容体を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、その後、ホスホチロシン抗体（抗ｐＴｙｒ）での免疫ブロッティングに付した。ＥＧＦＲ特異的ウサギポリクローナル抗体（抗ＥＧＦＲ）での膜の再プロービングにより、ＥＧＦＲの総量を決定した。 細胞死のカスパーゼ依存性および配列番号１０２の成分Ｂの影響。（Ａ）Ｃｏｌｏ２０５細胞（左）およびＨｕｈ−７細胞（右）を２５ｎｇ／ｍＬおよび２５０ｎｇ／ｍＬのボルテゾミブでそれぞれ感作し、汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤｆｍｋまたはカスパーゼ−３阻害剤ｚＤＥＶＤｆｍｋ（両方の阻害剤：Ｃｏｌｏ２０５については２０μＭおよびＨｕｈ−７については１０μＭ）が存在するまたはしない異なる濃度の配列番号１０２で処理した。１６時間後、ＭＴＴ染色（Ｃｏｌｏ２０５）またはクリスタルバイオレット染色（Ｈｕｈ−７）を用いて細胞生存率を判定し、ボルテゾミブ処理細胞を対照として使用してデータを正規化した（平均 ＳＥＭ、ｎ＝３）。（Ｂ）０．１％ＦＣＳを有する培地を使用して、９６ウェルプレートで、１ウェルあたり１×１０^４のＣｏｌｏ２０５細胞を成長させた。５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦで刺激し、１０ｎｇ／ｍＬのボルテゾミブで感作し次第、細胞を等モル濃度の配列番号１０２（白四角）、配列番号１０２＋抗ＴＲＡＩＬ ｍＡｂ ２Ｅ５（黒四角）またはセツキシマブ（丸）と共に４日間インキュベートし、正規化のための対照としてボルテゾミブ／ＥＧＦ処理細胞を使用してＭＴＴ法によって細胞数をアッセイした（平均 ＳＥＭ、ｎ＝２）。（Ｃ）１ウェルあたり１×１０^４のＨｕｈ−７細胞を９６ウェルプレートで成長させ、２０ｎｇ／ｍＬのボルテゾミブで、またはボルテゾミブと１０μＭ ｚＶＡＤｆｍｋの組み合わせで処理した。その後、細胞を等モル濃度の配列番号１０２（白四角）、配列番号１０２＋ｚＶＡＤｆｍｋ（黒四角）、セツキシマブ（白丸）またはセツキシマブ＋ｚＶＡＤｆｍｋ（黒丸）と共に３日間インキュベートし、正規化のための対照としてボルテゾミブ処理細胞およびボルテゾミブ／ｚＶＡＤｆｍｋ処理細胞をそれぞれ使用してＭＴＴ法により細胞生存率をアッセイした（平均 ＳＥＭ、ｎ＝３）。 一次組織へのＴＲＡＩＬ融合タンパク質のインビトロの寛容性。（Ａ）５００ｎｇ／ｍＬのボルテゾミブの存在下でまたはなしで１．１ｎＭの配列番号１０２と共にインキュベートした後の一次ヒト肝細胞（ＰＨＨ、平均 ＳＥＭ、ｎ＝５）またはＨｕｈ−７肝癌腫細胞（ＰＨＨ、平均 ＳＥＭ、ｎ＝７）における相対カスパーゼ活性（未処理と比較した増加倍数）。アスタリスクは、統計学的有意性を示す。（Ｂ）５００ｎｇ／ｍＬのボルテゾミブ、１．１ｎＭの配列番号１０２、または両方と共にインキュベートした後のＰＨＨ（左）およびＨｕｈ−７細胞（右）におけるカスパーゼ−３切断を免疫ブロッティングによって分析した。 Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍モデルにおけるＴＲＡＩＬ融合タンパク質の抗腫瘍活性。（Ａ）ＰＢＳ（白菱形）、ボルテゾミブ（黒三角）、配列番号１０４（成分Ｂ欠如）＋ボルテゾミブ（白三角）、配列番号９７（Ｌ＞１２アミノ酸）＋ボルテゾミブ（丸）、配列番号１０２（Ｌ＜１２アミノ酸）＋ボルテゾミブ（黒菱形）または配列番号１０２のみ（四角）の腹腔内適用後の時間の関数としての腫瘍体積。矢印、タンパク質適用；アスタリスク、ボルテゾミブ適用；記号、腫瘍体積の平均値 ９５％信頼区間（ＣＩ）、ｎ＝１２腫瘍／処置群。（Ｂ）第１４日における個々の腫瘍体積。バー、腫瘍体積の平均値 ９５％ＣＩ。 アフィニティー精製された配列番号１０２（レーン１）、配列番号１２５（レーン２）および配列番号１２６（レーン３）のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。５μｇのタンパク質を還元条件下で負荷した。 配列番号１２５および配列番号１２６のアルブミン結合。両方のタンパク質を１時間、室温で、等モル濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）と共にインキュベートし、その後、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。サイログロブリン（６６９ｋＤａ）、アポフェリチン（４４３ｋＤａ）、 −アミラーゼ（２００ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）およびＦＬＡＧペプチド（１ｋＤａ）を標準タンパク質／ペプチドとして使用した。 インビトロでの配列番号１２５および配列番号１２６の生物活性。Ｈｕｈ−７肝癌腫細胞をボルテゾミブ（２５０ｎｇ／ｍＬ）で感作し、配列番号１０２、配列番号１２５（左パネル）および配列番号１２６（右パネル）の系列希釈物で、三重反復で処理した。１６時間後、クリスタルバイオレット染色を用いて、細胞生存率を判定した。標的化効果の定量のために、細胞を過剰なセツキシマブ（７０ｎＭ）と共にプレインキュベートした後、配列番号１０２、配列番号１２５および配列番号１２６を添加した。配列番号１２５および配列番号１２６を１００μｇ／ｍＬのＨＳＡの存在下でさらにインキュベートした。比較のために配列番号１０２の値を両方のパネルにプロットした。 配列番号１０２（Ａ）および配列番号１２５（Ｂ）の薬物動態。２５μｇのタンパク質をＣＤ１マウスにｉ．ｖ．注射し、示されている時点で血清試料を採取し、その後、ＥＬＩＳＡによりｓｃＴＲＡＩＬ分子を検出した。 配列番号９６の配列。 配列番号１０２の配列。 配列番号９７の配列。 配列番号９８の配列。 配列番号１０３の配列。 配列番号１２５の配列。 配列番号１２６の配列。 配列番号１２７の配列。 配列番号１２８の配列。 配列番号１２９の配列。

実施例
以下に、本発明の様々な実施形態および態様を例証する一般実施例を提供する。しかし、本発明は、本明細書に記載する特定の実施例によって範囲を制限されないものとする。実際、当業者には、上述の説明、添付の図面および下の実施例から、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な修飾形態が容易に明らかになるだろう。すべてのかかる修飾形態が添付の請求項の範囲に入る。

実施例１： 生化学的分析
１． ポリペプチド生産
１．１ 原理
ａａ残基９５−２８１（ＴＲＡＩＬ）（配列番号５）を包含する３つのヒトＴＲＡＩＬドメインを（ＧＧＧＳ）_２ペプチドリンカーＰ（配列番号４８）と融合して、いわゆる一本鎖ＴＲＡＩＬ（ｓｃＴＲＡＩＬ）（配列番号１０４）を生じさせた。Ｖ_Ｈ（配列番号９３）およびＶ_Ｌ（配列番号９２）から成るＥＧＦＲ特異的抗体断片をｓｃＴＲＡＩＬ（配列番号１０４）のＮ末端に融合させた。本発明によるポリペプチド（配列番号９６および１０２）を得るために、Ｖ_Ｈ（配列番号９３）とＶ_Ｌ（配列番号９２）の間の（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号５２）またはＧＧＧＧＳ（配列番号５０）ペプチドリンカーを選択した。Ｖ_Ｈリーダー（Ｋ）（配列番号１０１）およびＦＬＡＧタグ（Ｆ）（配列番号１００）をその抗体領域の前に配置した。本発明によるグリコシル化ポリペプチドについては、２つのＮ−グリコシル化部位を有するリンカー（ＧＮＧＴＳＮＧＴＳ）（配列番号８３）をＶ_Ｌ（配列番号９２）とｓｃＴＲＡＩＬ（配列番号１０４）の間に配置した。

１．２ プラスミドおよび細胞系
以前に記載された構築物（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，２０１０，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１０）への、（ＧＧＧＳ）_２リンカーモチーフをコードする配列によって接続された３つのＴＲＡＩＬ成分（ａａ残基９５−２８１）をコードする合成配列のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩクローニングによって、ヒトｓｃＴＲＡＩＬ（配列番号１０４）についてのｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｓｃＴＲＡＩＬ発現構築物を得た。ＥＧＦＲ特異的Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ−ｓｃＴＲＡＩＬ発現構築物の生成のために、オリゴヌクレオチドＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧ（配列番号１０９）およびＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣ（配列番号１１０）を使用してヒト化Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列（ｈｕＣ２２５）の合成コーディング配列を増幅した。次に、このテンプレートをオリゴヌクレオチドＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧ（配列番号１１１）とアニールして、ＸｈｏＩ部位およびＦＬＡＧタグコーディング配列を挿入した。鎖伸長後、全配列をオリゴヌクレオチドＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＣ（配列番号１１２）およびＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣ（配列番号１１３）によって増幅した。次いでそのＰＣＲ産物を、Ｖ_Ｈリーダーを保有するｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩによってクローニングした。次いでこの構築物のｓｃＴＲＡＩＬコーディング配列をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位によって挿入した。配列番号１０２についてのＥＧＦＲ特異的構築物は、リンカーＬを（ＧＧＧＧＳ）_３からＧＧＧＧＳに短縮することによってｐＣＲ３−ＶＨ−ＶＬ−ｓｃＴＲＡＩＬから誘導した。したがって、オリゴヌクレオチド（１）ＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧ（配列番号１１４）および（２）ＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号１１５）ならびに（３）ＣＴＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡ ＣＣＣＡＧＴＣＣ（配列番号１１６）および（４）ＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣ（配列番号１１７）を使用して、２つのＰＣＲ産物を生成した。下線を引いた領域での前記産物のアニーリングおよび鎖伸長後、全配列をオリゴヌクレオチド（１）および（４）によって増幅し、その後、ｐＣＲ３−Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ−ｓｃＴＲＡＩＬへのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩクローニングを行った。配列番号９６のグリコシル化変異体は、オリゴヌクレオチド（１）ＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧ（配列番号１１８）およびＣＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＣＣＴＧＣＧ ＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧ（配列番号１１９）、それぞれ、（１）およびＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧ（配列番号１２０）を使用するｐＣＲ３−ＶＨ−ＶＬ−ｓｃＴＲＡＩＬにおけるｈｕＣ２２５ ＶＨ−ＶＬコーディング配列の２回のＰＣＲ増幅、その後のｐＣＲ３−ＶＨ−ＶＬ−ｓｃＴＲＡＩＬにおけるＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩクローニングによって生成した。配列番号９８の発現用の構築物は、オリゴヌクレオチドＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＧＡＡＧＡＧＡＣＴＡＴＣＴＣ（配列番号１２１）およびＣＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣ（配列番号１２２）、それぞれＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧ（配列番号１２３）およびＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＡＴＴＡＣ（配列番号１２４）を使用するＴＲＡＩＬコーディング配列の２回の逐次的増幅、その後の配列番号９７用の発現構築物へのＢａｍＨＩクローニングによって生成した。

ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｃｏｌｏ２０５およびＪｕｒｋａｔ細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナッサス）から入手した。５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）をそれぞれ補足し、ＨｅｐＧ２については１０％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ国カールスルーエ）で細胞を培養した。Ｈｕｈ−７Ｄ１２肝臓癌腫細胞をドイツ国ハノーファーのＨｅｉｋｅ Ｂａｎｔｅｌ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから入手し、１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ国カールスルーエ）で培養した。

１．３ 組換えタンパク質の生産および精製
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する対応する発現プラスミドでの安定したトランスフェクション、および安定して発現するクローンのプールの生成後、ＨＥＫ２９３細胞において配列番号９６、９７、９８、１０２、１２５および１２６のＴＲＡＩＬ融合タンパク質を生産した。タンパク質生産のために、安定したクローンをＲＰＭＩ１６４０、５％ＦＣＳ中で拡大させ、９０％集密度まで成長させ、その後、５０μＭのＺｎＣｌ_２を補足した無血清Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、培地を３日ごとに２回交換した。上清をプールし、組換えタンパク質を、先ず、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国ハイデン）を使用するＩＭＡＣによって精製した。１００ｍＭのイミダゾールでの溶離およびＰＢＳに対する透析の後、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ国シュタインハイム）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによってそれらのタンパク質をさらに精製した。結合タンパク質を１００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｓ＆ｅｌｅｐｈａｎｔｓ、ドイツ国ポツダム）で溶離し、ＰＢＳに対して透析した。ｓｃＴＲＡＩＬならびに配列番号９７および９８を単一のＭ２アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー段階で精製した。５０または１０ｋＤａ ＭＷＣＯでＶｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ、フランス国オーバーニュ）を使用する精製タンパク質の濃縮後、そのタンパク質濃度を分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、デラウェア州ウィルミントン）で測定し、アリコートを−８０℃で保管した。

１．４ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
配列番号９６、配列番号１０２、配列番号１０４、１２５、１２６およびグリコシル化された配列番号９７の精製ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）、続いて、銀染色（１レーンあたり１μｇのタンパク質）、クマシー染色、またはモノクローナル抗ＴＲＡＩＬ（ＭＡＢ６８７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ国ヴィースバーデン）もしくは抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と併用するウエスタンブロッティング（１レーンあたり２５０ｎｇのタンパク質）によって分析した。配列番号９７のグリコシル化ポリペプチドをＮ−グリコシダーゼで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した。脱グリコシル化のために、タンパク質（５μｇ）をＳＤＳおよびＤＴＴの存在下で変性させ、その後、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０および５００単位のＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ドイツ国フランクフルト・アム・マイン）を供給業者の指示書に従って添加した。３７℃での１時間のインキュベーション後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ウエスタンブロッティングのために、抗ＴＲＡＩＬ抗体ＭＡＢ６８７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ国ヴィースバーデン）および抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し、その後、検出のために抗マウスアルカリホスファターゼ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。

ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析の結果は、配列番号１０４に対して配列番号９６、９７および１０２の分子質量の増加を確証した。配列番号１０２に対する配列番号１２５および１２６の分子質量の増加をＳＤＳ ｐａｇｅおよびクマシー染色によって確証した。配列番号９７は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて、このタンパク質の有効なグリコシル化と合致する泳動低減を示した。これを、糖タンパク質の炭化水素側鎖を除去する融合タンパク質のＰＮＧａｓｅＦ処理、その結果として生ずる非グリコシル化形態の質量への特異的バンドシフトによって確認した。さらに、前記アッセイにより、４つすべてのポリペプチドにおけるＴＲＡＩＬおよびＦＬＡＧタグの存在が確認された。

１．５ サイズ排除クロマトグラフィーおよびアルブミン結合アッセイ
配列番号９６、配列番号１０２、配列番号１０４およびグリコシル化された配列番号９７の精製ポリペプチドを、ＰＢＳ中で平衡させたＢｉｏＳｕｉｔｅ ２５０ ＨＲ ＳＥＣ（３００×７．８）カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ミルフォード）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離し、０．５ｍＬ／分の流量で溶離した。

配列番号１２５および１２６のポリペプチドへのアルブミン結合を、該ポリペプチドとヒト血清アルブミンまたはマウス血清アルブミンとのインキュベーション、および上で説明したようなサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質−タンパク質相互作用の判定によって確証した。

１．６ 免疫沈降およびタンパク質分析
免疫沈降のために、氷上、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭフッ化ナトリウム、２０ｍＭグリセロリン酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．１％ＳＤＳ、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム）中、完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国マンハイム）で細胞を溶解し、溶解産物を遠心分離（１６０００ ｇ、１０分、４℃）によって清澄化した。１．５ｍｇの溶解産物タンパク質を穏やかに振盪しながら１．５μｇのマウス抗ＥＧＦＲ Ａｂ−１３ ｍＡｂ（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、米国カリフォルニア州フリーモント）と共に４℃で一晩インキュベートした。プロテインＧセファロース（ＫＰＬ、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）で免疫複合体を捕捉し、ＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、マウス抗ホスホチロシンＰ−Ｔｙｒ−１００ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州ダンヴァース）およびウサギ抗ＥＧＦＲ１００５抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）、続いてＨＲＰコンジュゲート二次抗体を使用するウエスタンブロッティングとによって、タンパク質を分析した。可視化のためにＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国イリノイ州ロックフォード）を使用した。

切断カスパーゼ−３に対するウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する免疫ブロッティングにより、カスパーゼを検出した。内部対照としてのＧＡＰＤＨをウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出した。可視化のためにＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）およびＥＣＬを使用した。

実施例２： フローサイトメトリー、細胞死アッセイ、ＡＬＴおよびカスパーゼ活性
２．１ フローサイトメトリー
５×１０^５の細胞をＰＢＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．０２５％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）に懸濁させ、示されているｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質（２μｇ／ｍＬ）と共に１時間４℃でインキュベートした。ＰＢＡ緩衝液で細胞を３回洗浄した後、結合融合タンパク質を抗ヒトＴＲＡＩＬ ｍＡｂ ＭＡＢ６８７（２．５μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびフルオレセインイソチオシアナート標識ウサギ抗マウスＩｇＧ Ａｂ（１：２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により検出し、その後、各々ＰＢＡでの３回の洗浄段階を行った。ＥＧＦＲへのｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質結合の遮断（図５Ｂを参照されたし）のために、ｈｕＣ２２５の二価変異体（ｈｕＣ２２５Ｃｙｓ、５０μｇ／ｍＬ、ドイツ国ユーリッヒのＣｅｌｏｎｉｃ ＧｍｂＨにより好意的に提供されたもの）を添加し、その３０分後に配列番号９６および配列番号１０２をそれぞれ添加した。ＴＲＡＩＬ受容体の発現を、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣと共に抗ＴＲＡＩＬ Ｒ１ ｍＡｂ ＭＡＢ３４７および抗ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ｍＡｂ ＭＡＢ６３１１（各々４μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。ＥＧＦＲ発現をフィコエリトリン標識抗ヒトＥＧＦＲｍＡｂ ｓｃ−１０１（４μｇ／ｍＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルーズ）によって検出した（図４を参照されたし）。結合阻害のために、精製された配列番号１０２（５０μｇ／ｍＬ）を添加し、その３０分後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ｍＡｂセツキシマブ（１μｇ／ｍＬ）を添加した（図５Ａを参照されたし）。

前記アッセイによりＨｕｈ−７およびＨｅｐ２Ｇ肝細胞癌腫細胞系ならびにＴ細胞白血病系ＪｕｒｋａｔにおけるＥＧＦ受容体ならびにアポトーシス促進性ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５の発現レベルを判定し、Ｈｕｈ７は、ＥＧＦＲ＋、ＤＲ４＋、ＤＲ５低と判明し；ＨｅｐＧ２は、ＥＧＦＲ低／陰性、ＤＲ４＋、ＤＲ５＋と判明し；ならびにＪｕｒｋａｔは、ＥＧＦＲ陰性、ＤＲ４陰性、ＤＲ５低と判明した（図４を参照されたし）。さらに、過剰なＥＧＦＲ受容体特異的ＴＲＡＩＬタンパク質（配列番号１０２）による抗ＥＧＦＲ ｍａｂセツキシマブのＥＧＦＲ＋細胞（Ｈｕｈ−７）への結合の遮断により配列番号１０２の融合タンパク質内のＥＧＦＲ特異的Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌドメインの機能的発現が明らかになった（図５Ａ、右パネル）；予想どおり、ＥＧＦＲ低／陰性ＨｅｐＧ２細胞のほんのわずかなセツキシマブ染色を過剰な配列番号１０２の融合タンパク質によってさらに低減させることはできなかった。前記染色は、前記試薬の非特異的バックグラウンド染色を表す可能性が高い。同様に、ＥＧＦＲ標的化融合タンパク質配列番号１０２および配列番号９６のＥＧＦＲ＋Ｈｕｈ−７細胞への結合は、過剰な抗ＥＧＦＲ特異的抗原断片によってある程度遮断可能であり、それにより、残存シグナルを、ＴＲＡＩＬドメインによる融合タンパク質のそれらのコグネイトＴＲＡＩＬ受容体への特異的結合によるものとすることができた。この実験設定では、融合タンパク質の結合がＤＲ４＋ＤＲ５＋ＨｅｐＧ２細胞についても明確に認められ、これらの細胞における検出レベル以下での低いＥＧＦＲ発現のため、抗ＥＧＦＲ特異的抗体断片の添加により前記シグナルは殆ど遮断されなかった。

２．２ 細胞死アッセイ
Ｈｕｈ−７（３×１０^４）、ＨｅｐＧ２（３×１０^４）、Ｃｏｌｏ２０５（１ウェルあたり５×１０^４）またはＪｕｒｋａｔ（１×１０^５）を９６ウェルプレートにおいて１００μＬ培養培地中で２４時間成長させ、その後、示されている濃度の配列番号９６、１０２、１２５、１２６および１０４または「ＫｉｌｌｅｒＴＲＡＩＬ」（Ａｘｘｏｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、ドイツ国ローラッハ）で、三重反復で処理した（図６〜８および１８を参照されたし）。陽性対照として、細胞を０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で死滅させた。Ｈｕｈ−７およびＨｅｐＧ２細胞での細胞死アッセイを、ボルテゾミブの不在下（図６、Ｊｕｒｋａｔ細胞）または存在下（図７、Ｈｕｈ−７：２５０ｎｇ／ｍＬ、図６、ＨｅｐＧ２：５００ｎｇ／ｍＬ、図１８、Ｈｕｈ−７：２５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、テキサス州ヒューストン）で行った。ボルテゾミブを添加し、その３０分後、細胞死を誘導するために細胞をアポトーシス促進性リガンドと共にインキュベートして感作した（図６、７）。あるいは、細胞を、示されている濃度のＴＲＡＩＬ融合タンパク質と共に３０分間プレインキュベートし、その後、ボルテゾミブの系列希釈物を添加した（図８）。ＴＲＡＩＬのみで処理した細胞を、適用したＴＲＡＩＬ濃度についての各パネルに示す（ボルテゾミブ ０ｎｇ／ｍＬ）（図８）。１６時間のインキュベーション後、クリスタルバイオレット染色（Ｈｕｈ−７、ＨｅｐＧ２）またはＭＴＴ法（Ｊｕｒｋａｔ）（Ｗｕｅｓｔら，２００２）のいずれかによって細胞生存率を判定した。後者の場合、ＤＭＦ／Ｈ_２Ｏ（１：１）、ｐＨ４．５（８０％酢酸含有）中の１５％ＳＤＳから成る溶解緩衝液を使用した。細胞死の標的抗原依存性誘導を実証するために、細胞を競合するセツキシマブｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ国ダルムシタット）（図１８）または代替的にＥＧＦＲ特異的ｈｕＣ２２５Ｃｙｓ（１０μｇ／ｍＬ）（図７）と共に３０分間プレインキュベートした。

２．３ アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびカスパーゼ活性
３つのＣＤ１マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、フランス国Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ）を、１ｎｍｏｌの配列番号１０２および配列番号９７に記載の融合タンパク質、０．１ｎｍｏｌのＦａｓＬ融合タンパク質（陽性対照）およびＰＢＳ（陰性対照）でそれぞれ腹腔内処置した。４時間および２４時間後に尾から血液試料を採取し、氷上でインキュベートした。凝固した血液を遠心分離し（１００００ ｇ、１０分、４℃）、血清試料を−８０℃で保管した。アラニンアミノトランスアミナーゼの活性を酵素的アッセイ（ＢＩＯＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国テキサス州オースティン）によって判定した。肝臓組織におけるカスパーゼ−３活性を判定するために、２４時間後（陽性対照は５時間後）にマウスを屠殺し、肝臓生検材料を採取した。溶解緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ＮＰ−４０、ｐＨ７．４）でホモジネートを調製した。１０μｇのタンパク質を蛍光原基質Ａｃ−ＤＭＱＤ−ＡＭＣ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の変換によって分析した。Ｓｅｉｄｅｌら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００５，４２：１１３−１２０）によって発表されたように、ＰＨＨおよびＨｕｈ−７細胞におけるカスパーゼ活性を判定した。

実施例３： 異種移植マウス腫瘍モデル
８週齢雌ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）の左および右背面に１００μＬのＰＢＳ中の３×１０^６のＣｏｌｏ２０５細胞を皮下注射した。腫瘍細胞接種の６日後、腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したときに処置を開始した。０．４５ｎｍｏｌの配列番号１０４、９７および１０２に記載のアフィニティー精製ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の腹腔内注射をそれぞれ毎日、８回、マウスに投与した。第１、３、５および７処置日には、タンパク質注射の３時間前に１００μＬのＰＢＳ中の５μｇのボルテゾミブを追加で腹腔内投与した。対照群には１００μＬのＰＢＳまたは５μｇのボルテゾミブを同じ時間間隔で投与した。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１０；１：ｅ６８）およびＫｉｍら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１；２２：１６３１−１６３７）に記載されているように腫瘍成長をモニターした。テューキー検定を統計に利用した。

実施例１、２および３において開示した結果の説明
示した実施例の主目的は、ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質のアポトーシス促進活性を、それらの腫瘍選択性、すなわち正常な非悪性組織に対する非活性、を保持しながら向上させることであった。原則的に、ＴＮＦファミリーの他のアポトーシス促進性メンバーはもちろん、可溶性リガンドとして不活性である、またはそれらの活性を関連組織もしくは細胞タイプに拘束するために膜標的化を要する、すべての他の非アポトーシス性組織および免疫調節ＴＮＦリガンドにも、同じ規則が適用される。前記実施例はまた、例示的に使用した特異的標的抗原（ＥＧＦＲ）に限定されず、腫瘍治療目的での線維芽細胞活性化タンパク質などの腫瘍間質マーカーを含めて、原則的にすべての他の組織および細胞選択的標的に適用される。

ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の構築および調製
機能的に向上したｓｃＦｖ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質を生成するために、先ず、ｓｃＴＲＡＩＬの遺伝子コードを哺乳動物発現系におけるより高いタンパク質収量に適応させた。３つのＴｒａｉｌ分子（成分Ａ）の接続に適している様々なリンカーモチーフの中で、（ＧＧＧＳ）１−４モチーフを試験し、短いリンカー（ＧＧＧＳ）_１（配列番号４７）および（ＧＧＧＳ）_２（配列番号４８）のほうが、長いリンカーより、タンパク質安定性、凝集する傾向および同一のまたはより良好なアポトーシス誘導活性を提示する傾向に関して優れていた。

本発明者らは、モデル系としてＥＧＦＲ標的化を使用した。受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーの他のメンバー同様、ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１）は、肺および肝臓癌をはじめとする幾つかの癌腫において過発現される、確立された腫瘍マーカーである（Ｏｌａｙｉｏｙｅら，２０００）。配列番号９６のＥＧＦＲ特異的融合タンパク質の生成のために、前記構築物のＮ末端に成分Ｂ、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂセツキシマブ（Ｃ２２５）に由来するヒト化されコドン最適化された抗体断片（Ｎａｒａｍｕｒａら，１９９３）（配列番号９４）、を融合させた。精製および検出を目的として、ＦＬＡＧタグ（Ｆ）で成分ＢのＮ末端を置換した（図１Ａ）。ＴＲＡＩＬ生物活性はそのオリゴマー状態に依存し、これは、特に、ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）に該当し、ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）は、可溶性三量体形態のＴＲＡＩＬによってあまり活性化されない（Ｗａｊａｎｔら，２００１）。配列番号１０２については、Ｖ_ＨとＶ_Ｌ間のリンカーＬを（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号５２）からＧＧＧＧＳ（配列番号５０）に短縮した。発現培養条件中のタンパク質分解性プロセッシングに対する基礎タンパク質安定性および保護を向上させるための独立したアプローチで、配列番号９６の次の２つの変異体を設計した：ｉ）成分Ａと成分Ｂを接続するリンカーＸが２つのＮ−グリコシル化部位を含み、その結果、単量体グリコシル化形態を生じさせる変異体（配列番号９７）；およびｉｉ）加えて、３つのＴＲＡＩＬ成分を接続する２つのグリシンリンカー（Ｐ）が、各々が２つのＮ−グリコシル化部位も含むリンカー（Ｐ１、Ｐ２）によって置換された（図１）変異体（配列番号９８）。

安定してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における発現後、配列番号９６および配列番号１０２の精製をＩＭＡＣ（ＴＲＡＩＬの固有ヒスチジン残基のため）とＭ２ ｍＡｂアフィニティークロマトグラフィーの両方によって遂行した。例えば、細胞培養物上清１リットルあたり＞３ｍｇの高純度タンパク質という収量を両方の融合タンパク質について達成することができた。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、ｓｃＴＲＡＩＬ（配列番号１０４）およびＥＧＦＲ特異的Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質配列番号９６および１０２それぞれについて、６８、９３および９４ｋＤａの一本鎖単量体の予想算出分子質量と合致する７０ｋＤａおよび１００ｋＤａの近似的分子質量を有する単一タンパク質バンドを明示した（図２）。導入されたリンカーの有効なグリコシル化に従って、配列番号９７の見かけの分子質量は配列番号９６と比較して増加された。配列番号９７のＮ−グリコシダーゼ処理は、その非グリコシル化誘導体のものと本質的に同一の分子質量を有するタンパク質を生じさせる結果となった。配列番号９６へのＮ−グリコシル化部位の導入は、生産プロセス中の分解に対するタンパク質安定性および保護を向上させ、これは、培養上清中に存在する分解産物の強力な低減（示されていない）から明白であった。これにより、２段階精製後の非グリコシル化融合タンパク質のものに匹敵する精製グレードおよびしたがって精製された生物活性タンパク質のより高い総収量が得られる、Ｍ２アガロースでの配列番号９７などのグリコシル化変異体の一段階精製が可能になる。

融合タンパク質（配列番号１０４）および配列番号９６（グリコシル化を伴うものおよび伴わないもの、両方）のゲル濾過分析は、タンパク質の大部分（＞９４％）が単量体として存在する（図３）が、分子サイズの増加に従って保持時間がｓｃＴＲＡＩＬ（配列番号１０４）から配列番号９７へと減少することを示した。ｓｃＴＲＡＩＬ（配列番号１０４）に関しては、ＳＥＣから導出される分子質量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）から算出したものと比較してわずかに低かった。これは、この分子の特徴であり、分解の暗示ではない（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，２０１０）。興味深いことに、配列番号１０２のＳＥＣは、２つのピークの存在を明示した。２００ｋＤａ付近の主ピークは、二量体に起因し得るが、副ピークは、融合タンパク質の三量体および／または四量体形態を表し得る。

成分Ａと成分Ｂの間（配列番号１２５）または融合タンパク質のＣ末端（配列番号１２６）のいずれかにアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、上で説明したように、ＨＥＫ２９３細胞から精製した。本質的にＡＢＤの導入の結果である、分子量の増加を、図１６に示したクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで見ることができる。

サイズ排除クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ）実験は、アルブミン結合ドメインを含むＴＲＡＩＬ融合タンパク質が、実際にヒトおよびマウス両方の血清アルブミンを結合できることを示した（図１７）。

ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質のＥＧＦＲ特異的結合
様々なｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質のＥＧＦＲ陽性細胞への特異的抗原結合を２つのＨＣＣ細胞系のフローサイトメトリーによって分析した。ＨｅｐＧ２細胞においてＥＧＦＲは滅多に検出できず、したがって、標的抗原低／陰性と考えられたのに対して、Ｈｕｈ−７細胞ではＥＧＦＲ発現がはっきりと明示された（図４）が、このＨＣＣ系でのＥＧＦＲレベルは、ＥＧＦＲ過発現Ａ４３１細胞と比較して中程度のようである（データを示さない）。これと一致して、ＥＧＦＲ陽性Ｈｕｈ−７細胞への標識セツキシマブの結合を０．５μＭの配列番号１０２とのプレインキュベーションにより遮断することができる（図５）。ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ−７細胞と配列番号９６または配列番号１０２のインキュベーションは、結果として両方の細胞系への該タンパク質の結合を生じさせたが、抗ＥＧＦＲｈｕＣ２２５（２μＭ）との細胞のプレインキュベーションによる融合タンパク質結合の競合は、Ｈｕｈ−７細胞でしか可能でなかった（図２Ｃ）。Ｈｕｈ−７細胞への融合タンパク質結合の競合時に観察された中間蛍光シグナルは、ＴＲＡＩＬ受容体へのＴＲＡＩＬドメイン（該融合タンパク質の成分Ａ）の結合を表す可能性が高い。これは、ＥＧＦＲ低／陰性ＨｅｐＧ２細胞に対する配列番号９６および配列番号１０２のより弱い、かつ切断不能の結合と一致する。ＥＧＦＲ陽性細胞への両方の融合タンパク質の結合の競合は、標的化ドメイン（成分Ｂ）の構造的完全性および機能性の指標である。

ＥＧＦＲ＋、ＤＲ４＋５＋ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞へのＴＲＡＩＬ融合タンパク質の定量的結合研究により、配列番号９７に記載のＴＲＡＩＬ融合タンパク質（３．６±０．３×１０^−１０Ｍ）および配列番号１０２に記載のＴＲＡＩＬ融合タンパク質（１．６±０．３×１０^−１０Ｍ）についての有意に異なる（Ｐ＝０．００３）ＥＣ５０値が判明した。これは、配列番号１０２に記載の二価ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の特異的分子組成の結合活性効果およびしたがって配列番号９７に記載のＴＲＡＩＬ融合タンパク質と比較して潜在的に優れた標的化を含意する（図１２Ａ）。さらに、配列番号１０２に記載のＴＲＡＩＬ融合タンパク質が、ＥＧＦ誘導ＥＧＦＲ自己リン酸化を遮断する機能活性を呈示するかどうかを調査した。この実験ではセツキシマブが陽性対照としての役割を果たした。配列番号１０２に記載の二価ＴＲＡＩＬ融合タンパク質によるＥＧＦ刺激受容体活性化の機能的遮断をＣｏｌｏ２０５（図１２Ｂ、左パネル）およびＨｕｈ７（図１２Ｂ、右パネル）細胞の両方について実証することができた。

ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質による細胞死の標的非依存性誘導
標的化ドメインの影響のないｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の基礎生物活性を調査するために、本発明者らは、先ず、標的陰性細胞系ＨｅｐＧ２（ヘパトーム）およびＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病）に対する細胞死誘導を分析し、それを非標的化ｓｃＴＲＡＩＬ分子と比較した。分析した全ての細胞系に対して、配列番号１０２は、配列番号９６またはそのグリコシル化形態（配列番号９７）と比較しておおよそ１０倍増した生物活性を発揮した。参照として、市販の高活性ＴＲＡＩＬ製剤、いわゆる「ＫｉｌｌｅｒＴＲＡＩＬ」（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、の生物活性は、配列番号９６の活性と匹敵することが判明した。ＨｅｐＧ２細胞の低いまたは不十分でさえある標的抗原発現のため、配列番号１０２および配列番号９６のアポトーシス誘導活性は、少なくとも７倍過剰（７０ｎＭ）のセツキシマブの存在による影響を受けなかった（示されていない）。標的陰性細胞に対する配列番号９６の生物活性は、配列番号１０４（ｓｃＴＲＡＩＬ）のものと異ならなかった。可溶性ＴＲＡＩＬによってではなくＴＲＡＩＬ複合体によって誘導されるアポトーシスに対して感受性であることが公知である、ＥＧＦＲ陰性、ＤＲ４⁻ＤＲ５^弱Ｊｕｒｋａｔ細胞に関しては、本発明者らは、配列番号１０２のＫｉｌｌｅｒＴＲＡＩＬと比較して高いアポトーシス誘導活性、ならびに配列番号９６および１０４に対する無反応性を見出した（図６）。

ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質による細胞死のＥＧＦＲ指向性増進
配列番号９６および配列番号１０２の受容体標的化能力のため達成可能な生物活性の強化を実証するために、ＥＧＦＲ陽性肝臓癌腫細胞系Ｈｕｈ−７を選択した。ｓｃＴＲＡＩＬ（配列番号１０４）と比較して、配列番号９６は、Ｈｕｈ−７細胞に対して１０倍良好なアポトーシス誘導活性を示した（図７）。過剰なセツキシマブ（７０ｎＭ）とのこの生物活性の競合は、同じ桁数での配列番号９６のＥＣ５０の右方向シフトを明示した。これは、ｓｃＴＲＡＩＬ生物活性の向上の原因となるＥＧＦＲ標的化の機能性の証拠となる。グリコシル化された配列番号９７は、その非グリコシル化変異体と比較して同一の生物活性を発揮した。これは、この部位でのグリコシル化が生物活性に影響を及ぼさないことを示す。配列番号１０２は、配列番号９６に対して１０倍強化された生物活性を示した。配列番号１０２と同モル過剰のセツキシマブの活性の競合も、用量応答曲線の匹敵するシフトを生じさる結果となった。これにより、標的化はこの融合タンパク質の既に増加した生物活性をさらに向上させることが確認された。さらに、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む二量体ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（配列番号１２５および配列番号１２６）は、ＡＢＤを欠く二量体ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（配列番号１０２）に匹敵する生物活性を呈示した。これは、配列番号１２５および１２６に記載のＴＲＡＩＬ融合タンパク質に対して行ったようなＡＢＤの導入が、細胞死のＥＧＦＲ指向性増進の生物活性に有意な影響を及ぼさないことを示す（図１８）。

もう１つの実験構成では、Ｈｕｈ−７細胞を固定用量の様々なＴＲＡＩＬ融合タンパク質で前処理し、その後、アポトーシス感作物質ボルテゾミブの力価測定を行った（図８）。１ｎＭおよびそれより上のタンパク質濃度では、試験した配列番号１０２、９６および１０４は、ボルテゾミブで感作したときのこれらの細胞における完全アポトーシスの誘導に関してほぼ同等に効果があった。対照的に、０．１ｎＭおよびそれより下のタンパク質濃度では、ボルテゾミブ感作と構築物のＥＧＦＲ標的化能力の強い相乗作用が見えるようになった。０．０５Ｍのタンパク質濃度では、配列番号９６および１０２だけがボルテゾミブと相乗作用を示すことができ、それによって配列番号１０２は、この濃度で配列番号９６と比較して高い生物活性を示した。配列番号１０２の優れた活性は、０．０１ｎＭの融合タンパク質で、よりいっそう明白であった（図８）。

汎カスパーゼ（ｚＶＡＤｆｍｋ）またはカスパーゼ−３選択的（ｚＤＥＶＤｆｍｋ）阻害剤のいずれかによる細胞死のほぼ完全な遮断（図１３Ａ）、およびネクロスタチン−１の細胞死の防止または低減の失敗（データを示していない）は、Ｈｕｈ−７およびＣｏｌｏ２０５の大部分がＴＲＡＩＬ融合タンパク質での処理によってアポトーシス細胞死を被ることを示していた。セツキシマブは、ＥＧＦ受容体のＥＧＦ誘導自己リン酸化を遮断した（図１２Ｂ）。さらに、セツキシマブそれ自体は、Ｃｏｌｏ２０５およびＨｕｈ７細胞においてＥＧＦＲのＥＧＦ誘導自己リン酸化を遮断すること（図１２Ｂ）により、４日培養でのこれらの２つの癌細胞系の成長に実質的に影響を及ぼさなかった（図１３Ｂ、Ｃ）。同様に、配列番号１０２誘導アポトーシスを、配列番号１０２で処理したＣｏｌｏ２０５細胞培養物において中和抗ＴＲＡＩＬ抗体の存在により（図１３Ｂ）または汎カスパーゼ阻害剤でのＨｕｈ−７細胞の処理により（図１３Ｃ）防止したとき、４日の観察期間中にほんのわずかな成長阻害しか認められなかった。ここで研究した細胞およびインビトロの条件について考え併せると、これらのデータは、ｉ）配列番号１０２誘導細胞死が、ＴＲＡＩＬシグナル伝達を必要とすること、およびｉｉ）配列番号１０２によるＥＧＦＲ機能の遮断が、迅速なアポトーシス誘導に寄与しないことを示す。

細胞に対する配列番号９６および配列番号１０２の結合親和性
配列番号１０２の特異的分子組成は、結合活性効果およびしたがって配列番号９６と比較して潜在的に優れた標的化機能を含意する。したがって、本発明者らは、平衡結合条件下、４℃で、抗ＴＲＡＩＬ抗体での間接的免疫蛍光フローサイトメトリーによって、ＥＧＦＲ陽性、ＤＲ４＋５＋ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に関する両方の融合タンパク質の解離定数を決定した。４℃でのｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質とＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の間の相互作用のＫ_Ｄをラインウィーバー・バーク反応速度分析（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ ａｎｄ Ｂｕｒｋ，１９３４；Ｂｅｎｅｄｉｃｔら，１９９７）によって決定し、配列番号１０２の融合タンパク質のほうが４倍低いことを見出した（それぞれ、配列番号９６について６．５±０．９×１０^−８Ｍ、および配列番号１０２について１．７±１．２×１０^−８Ｍ）。原則的に、測定Ｋ_Ｄ値は、融合タンパク質内の両方の機能性ドメイン、すなわちＥＧＦＲ標的化ドメイン（成分Ｂ）およびＴＲＡＩＬドメイン（成分Ａ）、とそれらのそれぞれの受容体との細胞表面相互作用を表す。しかし、ＪｕｒｋａｔなどのＴＲＡＩＬＲ＋、ＥＧＦＲ陰性細胞への配列番号１０２の結合が、結果として、このアッセイにおいて非常に弱いシグナルしか生じさせなかったため（データを示さない）、本発明者らは、ＮＣＩ−Ｈ４６０について示されたシグナルは、主として、融合タンパク質のそのＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌドメイン経由でのＥＧＦＲへの結合に起因すると推論した。実際、適用したアッセイ条件（４℃）下で、安定した受容体リガンド相互作用およびしたがって明白な親和性強化の原因となり得るＴＲＡＩＬＲの動的クラスタリングは防止される。したがって、本発明者らは、この親和性増加を、主として、この特定の融合タンパク質（配列番号１０２）の二価標的化ドメイン（成分Ｂ）の結合活性作用によるものとする。

配列番号１０２の全身毒性の欠如および薬物動態
配列番号１０２の強力に増加されたインビトロの生物活性がＴＲＡＩＬの有利な腫瘍選択性を減少させるかどうかを評定するために、本発明者らは、許容しがたいＴＲＡＩＬ副作用に関して最も感受性が高いと言われている器官、肝臓、に対するインビボ適用の全身寛容および効果を研究した。３匹のＣＤ１マウスの複数の群を示されている試薬（図９）で腹腔内処置した：陰性対照：ＰＢＳ；陽性対照：凝集ＦａｓＬ融合タンパク質；配列番号１０２および配列番号９６。（Ａ）血漿試料を４時間および２４時間後に調製し、酵素的アッセイを用いてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性をアッセイした。破断線は、ＡＬＴの上位正常レベルを示す（３５〜５０Ｕ／Ｌ）。（Ｂ）陽性対照（凝集ＦａｓＬ融合タンパク質で処置したマウスは、２〜４時間後に重度の全身毒性の表現型徴候を示し、≒５時間後に死亡する。試料を４時間後に採取した）を除き２４時間後にマウスを屠殺し、特異的ＡＭＣ結合ペプチド基質を使用するカスパーゼ−３活性の判定のために肝臓生検材料を採取した。データは、配列番号１０２が、標的陽性腫瘍細胞系に対する（標的化されていないｓｃＴＲＡＩＬおよび最も活性な市販のＴＲＡＩＬと比較して）その強力に増加されたインビトロのアポトーシス活性にもかかわらず、マウスモデルにおいて３ｍｇ／ｋｇまでの用量で十分に全身寛容を維持することを明確に示す。さらに、器官（肝臓）特異的病理の生化学的パラメータにより、適用の４時間後に正常上限値へのＡＬＴ値の一時的なほんのわずかな増加しか伴わない、このＴＲＡＩＬ融合タンパク質に対する表現型寛容性が確認される。生物活性融合タンパク質が血液中でまだ検出可能である、２４時間後のカスパーゼ活性およびベースラインＡＬＴの欠如（Ｔα_１／２＝２時間、Ｔβ_１／２３時間；ｔ＝２４時間での血漿濃度：１００μｇ／マウスの静脈内適用用量で１００ｎｇ／ｍＬ）は、配列番号１０２が腫瘍選択性を維持し、配列番号１０２を安全にインビボ適用できることを証明する。

さらに、ボルテゾミブの存在下での配列番号１０２によるカスパーゼ−３活性化についてのＨｕｈ−７ヘパトーム細胞と初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の比較は、腫瘍細胞における強力なボルテゾミブ依存性カスパーゼ−３活性化を示したが、正常肝臓細胞は、単独でのｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質による影響も、ボルテゾミブと併用でのｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質による影響も、受けなかった（図１４Ａ）。これらの結果を、Ｈｕｈ−７およびＰＨＨにおける切断カスパーゼ−３の免疫ブロット分析によって確認し、併用処理したＰＨＨにおいてカスパーゼ活性化は検出できなかったが、感受性Ｈｕｈ７癌腫細胞では頑強なカスパーゼプロセッシングが検出できた（図１４Ｂ）。

異種移植腫瘍モデルにおける配列番号１０２の抗腫瘍活性
配列番号９７に記載の一価ＴＲＡＩＬ融合タンパク質または配列番号１０４に記載のｓｃＴＲＡＩＬと特に低タンパク質濃度で比較して配列番号１０２に記載の二価ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の優れた生物活性を示すインビトロのデータにかんがみて、毎日の処方での８用量の０．４５ｎｍｏｌタンパク質を、一日おきのボルテゾミブ併用処置との組み合わせで腹腔内注射した。血管新生化した固形腫瘍の確立後に全身処置を開始し、腫瘍成長を２２日間モニターした。ボルテゾミブ処置は、単独では、進行性腫瘍成長に干渉せず、これに対して配列番号１０４に記載のｓｃＴＲＡＩＬおよび配列番号９７に記載の一価ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、両方とも、腫瘍成長を遅延させたが、適用した低い投薬量では腫瘍の退縮を誘導しなかった。対照的に、配列番号１０２に記載の二価ＴＲＡＩＬ融合タンパク質で処置すると、すべてのマウスにおいて腫瘍サイズの強力な低減および生存延長とともに、１１／１２（＋ボルテゾミブ）および９／１２（ボルテゾミブなし）ケースで肉眼検出不能腫瘍が記録された（図１５）。興味深いことに、適用した処置条件下ではボルテゾミブでの併用処置の統計学的に有意でないわずかな恩恵しかなかったが、処置終了時、この併用処置群には、より遅い腫瘍再成長が現れた（図１５Ａ）。

アルブミン結合ドメインの導入は、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質のインビボの半減期を増加させる
アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を欠く配列番号１０２に記載の二量体ＴＲＡＩＬ融合タンパク質、および該ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の成分Ａと成分Ｂの間にＡＢＤを含む二量体融合タンパク質（配列番号１２５）についての薬物動態、詳細にはインビボの半減期を比較した。このために、２５μｇの融合タンパク質をＣＤ１マウスに静脈内注射し、注射後一定の時点でＥＬＩＳＡアッセイによって血清試料を分析した（図１９）。インビボの血清半減期が、ＡＢＤのない構築物（配列番号１０２）についての約３時間から、ＡＢＤを含む構築物（配列番号１２５）についての約２０時間まで増加することが実証された（図１９）。上に示したように、ＡＢＤを含む構築物は、ＡＢＤを欠く構築物と比較して同様の生物活性を発揮し（図１８）、これは、ＡＢＤが生物活性に負の影響を及ぼさず、インビボの血清半減期などの薬物動態特性に関して有利な特性を発揮することを示している。したがって、ＡＢＤを含む上で説明したようなＴＲＡＩＬ融合タンパク質、好ましくは二量体ＴＲＡＩＬ融合タンパク質、例えば、配列番号１２５および１２６に記載の二量体ＴＲＡＩＬ融合タンパク質が、本発明によるポリペプチドの特に好ましい実施形態である。

かくして、本発明の発明者らは標的癌療法に関する改善された概念についての証拠を提供した。本発明によるポリペプチドはオリゴマーを形成することもあるが、配列番号９６などのポリペプチドは厳密に単量体のままである。そのような場合に本発明によるポリペプチドの潜在的オリゴマー構造が、結果として全身毒性増加を生じさせないことは、驚くべきことである。組換えＴＲＡＩＬ構築物（例えば、Ｈｉｓ−ＴＲＡＩＬ、架橋ＦＬＡＧ−ＴＲＡＩＬ）の調製における高次凝集体の存在は、一部の非悪性組織細胞に対する毒性増加の原因となると以前に報告されている（Ｋｏｓｃｈｎｙら，２００７によって総説されている）。したがって、本発明者らは、向上したインビボの安定性および薬物動態特性を有する新形式の高活性で腫瘍選択的なＴＲＡＩＬ分子を提供し、かくして腫瘍治療薬として前例のない可能性に達する。

Claims (20)

1. ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）の配列またはその機能的誘導体をそれぞれが含む、少なくとも３つの成分Ａ、および
   ｂ）≦１２アミノ酸の長さを有するリンカー配列Ｌで互いに直接連結されているＶ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域から成る、少なくとも１つの成分Ｂ
   を含むポリペプチド。
2. 成分Ａの前記ＴＨＤが、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）、ＴＮＦ、ＬＴアルファ、ＬＴベータ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡ、ＶＥＧＩおよびＢＡＦＦのＴＨＤドメインから選択され得る、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記少なくとも３つの成分Ａが同一のものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 少なくとも１つ、少なくとも２つまたは少なくとも３つの成分Ａが、配列番号１〜３８から成る群より選択される配列または配列番号１〜３８の機能的断片もしくは機能的誘導体、特に、配列番号１〜３８の配列のうちの１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する機能的誘導体を含むか、またはこれらから成るものである、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
5. 少なくとも３つの成分Ａのすべてが、配列番号１および／または配列番号５の配列を含むか、またはこれらから成るものである、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
6. 前記少なくとも３つの成分Ａが、少なくとも２つの介在ペプチドリンカー（ペプチドリンカーＰ）を介して互いに直接連結されており、好ましくは、ペプチドリンカーＰが配列番号３９〜９１から選択されるものである、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
7. 前記少なくとも２つのペプチドリンカーＰが、配列番号４８、８８および／または９０から選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
8. 前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が、サイトカイン受容体、成長因子受容体、インテグリン、細胞接着分子および／または細胞タイプ特異的もしくは組織特異的細胞表面抗原、細胞表面発現腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ならびに炭水化物から成る群より選択される細胞表面分子に結合する抗体のものであり、特に、前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が、ｅｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）、ＶＥＧＦＲ、ヘテロマー型インテグリンａ_ｘβ_ｘ受容体ファミリー、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ガレクチン、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＣＤ４４およびその腫瘍特異的変異体（ＣＤ４４ｖ）ならびに他の腫瘍選択的細胞表面マーカー、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、葉酸受容体、Ｌｅｙ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびｕＰＡＲから成る群より選択される標的抗原に結合する抗体のものである、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
9. 前記Ｖ_Ｌ領域が、配列番号９２および１３０〜１３２から成る群より選択され、且つ／または前記Ｖ_Ｈ領域が、配列番号９３および１３３〜１３５から成る群より選択され、好ましくは、前記Ｖ_Ｌ領域が配列番号９２であり、且つ／または前記Ｖ_Ｈ領域が配列番号９３である、請求項８に記載のポリペプチド。
10. 成分Ｂの前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が、配列番号３９〜５１および５３〜７８から選択されるリンカー配列Ｌで連結されており、特に、前記リンカー配列Ｌが配列番号５０である、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
11. 成分Ｂが、配列番号９４、１３６、１３７または１３８の、好ましくは配列番号９４の配列を有する、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
12. グリコシル化モチーフを含む、且つ／またはグリコシル化されている、且つ／またはアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
13. 前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、成分Ａと成分Ｂの間、または成分Ａの下流、好ましくは該ポリペプチドのＣ末端部に位置するアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むものである、ポリペプチド。
14. 配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１０２、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８および／または配列番号１２９の配列を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
15. 配列番号９６、９７または９８の配列を含むポリペプチド。
16. 請求項１から１５に記載の、特に、請求項１から１４のいずれかに記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸。
17. 請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチド複合体。
18. 二量体および／または三量体複合体、好ましくは、請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチドのホモ二量体および／またはホモ三量体複合体、好ましくは、請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチドのホモ二量体複合体である、請求項１７に記載のポリペプチド複合体。
19. 請求項１から１５のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチド、特に、請求項１から１４のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項１６に記載の少なくとも１つの核酸；および／または請求項１７もしくは１８に記載の複合体を含み、場合により、少なくとも１つの医薬的に許容され得る担体、アジュバントおよび／またはビヒクルをさらに含む、医薬組成物。
20. 外科手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の体の処置のための方法において使用するための、および／またはヒトもしくは動物の体に対して実施される診断方法において使用するための、特に、癌、自己免疫疾患もしくは変性疾患の処置のための、請求項１から１５のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１７もしくは１８に記載の複合体、または請求項１９に記載の医薬組成物。

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