CN113372434B - 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且所述第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。

Description

包含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
本申请是申请日为2015年11月13日、中国申请号为201580073211.0、发明名称为“包含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及新的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且所述第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。本发明进一步涉及产生这些分子的方法和使用它们的方法。
发明背景
与TNF(肿瘤坏死因子)受体超家族分子相互作用的配体在免疫系统的组织和功能中具有关键作用。在调节正常功能如免疫应答、造血和形态发生的同时，TNF家族配体(也称为细胞因子)在肿瘤发生、移植排斥、脓毒性休克、病毒复制、骨吸收、类风湿性关节炎和糖尿病中起作用(Aggarwal，2003)。TNF配体家族包括编码19个II型(即细胞内N末端和细胞外C末端)跨膜蛋白的18个基因，其特征在于构成“TNF同源结构域”(THD)的保守C末端结构域的存在。这个结构域负责受体结合，因此对TNF配体家族成员的生物活性至关重要。家族成员之间的序列同一性约为20％-30％(Bodmer，2002)。TNF配体家族的成员以自组装非共价三聚体的形式而发挥其生物学功能(Banner等人，Cell 1993,73,431-445)。因此，TNF家族配体形成能够结合并激活TNFR超家族的相应受体的三聚体。
TNF受体超家族成员4-1BB(CD137)首先被鉴定为其表达经由T细胞活化诱导的分子(Kwon和Weissman，1989)。随后的研究证实4-1BB在T和B淋巴细胞(Snell等人，2011；Zhang等人，2010)、NK细胞(Lin等人，2008)、NKT-细胞(Kim等人)、单核细胞(Kienzle和vonKempis，2000；Schwarz等人，1995)、嗜中性粒细胞(Heinisch等人，2000)、肥大细胞(Nishimoto等人，2005)和树突细胞以及非造血来源的细胞如内皮细胞和平滑肌细胞(Broll等人，2001；Olofsson等人，2008)中表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多可由各种刺激信号诱导和驱动，例如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发，以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号转导(Diehl等人，2002；von Kempis等人，1997；Zhang等人，2010)。
4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)的表达受到更多限制，在专职抗原呈递细胞(APC)如B细胞、树突细胞(DC)和巨噬细胞上观察到表达。4-1BBL的诱导表达对于包括αβ和γδT细胞亚群在内的T细胞以及内皮细胞是特征性的(Shao和Schwarz综述，2011)。
已知CD137信号转导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele等人，2012；Lin等人，2008；Melero等人，1998)以及促进DC活化(表现为其存活和分泌细胞因子的能力增加)，并上调共刺激分子(Choi等人，2009；Futagawa等人，2002；Wilcox等人，2002)。然而，CD137最好被表征为调节T细胞的CD4+和CD8+亚群的TCR诱导性活化的共刺激分子。与TCR触发联合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞的增殖，刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(Snell等人综述，2011)。
与4-1BB抗体对体外T细胞的这些共刺激效应一致，在许多实验性肿瘤模型中将其施用于荷瘤小鼠导致有效的抗肿瘤作用(Melero等人，1997；Narazaki等人，2010)。然而，4-1BB通常仅在与其他免疫调节化合物(Curran等人，2011；Guo等人，2013；Morales-Kastresana等人，2013；Teng等人，2009年；Wei等人，2013)、化疗药物(Ju等人，2008；Kim等人，2009)、肿瘤特异性疫苗接种(Cuadros等人，2005；Lee等人，2011)、或放射治疗(Shi和Siemann，2006)联合给予时才显示其作为抗肿瘤剂的效力。体内消耗实验证明，CD8+T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤作用中起最关键的作用。然而，取决于肿瘤模型或包括抗4-1BB的联合疗法，已经报道了其他类型的细胞如DC、NK细胞或CD4+T细胞的作用(Melero等人1997；Murillo等人；2009；Narazaki等人，2010；Stagg等人，2011)。
除了4-1BB激动剂对不同淋巴细胞亚群的直接作用之外，通过4-1BB介导的细胞间粘附分子1(ICAM1)和肿瘤血管内皮上的血管细胞粘附分子1(VCAM1)的上调，4-1BB激动剂还可以诱导肿瘤中活化T细胞的浸润和保留(Palazon等人，2011)。
4-1BB触发还可以逆转由暴露于可溶性抗原诱导的T细胞无反应性的状态，其可能有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫耐受性(Wilcox等人，2004)。
似乎4-1BB激动性抗体在体内的免疫调节特性需要在抗体分子上野生型Fc部分的存在，从而提示Fc-受体结合为此类试剂的药理学活性所需的重要事件，所述试剂被描述为对TNFR超家族的其他的细胞凋亡诱导或免疫调节成员特异的激动性抗体(Li和Ravetch，2011；Teng等人，2009)。然而，在小鼠中，具有功能活性Fc结构域的4-1BB特异性激动性抗体的全身给药也诱导了与肝毒性相关的CD8+T细胞扩增(Dubrot等人，2010)，在不存在功能性Fc受体的情况下，肝毒性减弱或显著减轻。在人类临床试验(ClinicalTrials.gov,NCT00309023)中，每三周施用一次的有Fc活性的4-1BB激动性抗体(BMS-663513)持续12周诱导了黑素瘤、卵巢癌或肾细胞癌患者的病情稳定。然而，在另一项试验(NCT00612664)中给予的相同抗体引起4级肝炎，导致试验终止(Simeone和Ascierto，2012)。
总的来说，可用的临床前和临床数据清楚地表明，有效的4-1BB激动剂的临床需求很高。然而，新一代候选药物不仅会有效地使4-1BB接合在造血细胞和内皮细胞的表面上，而且还能通过除了与Fc受体结合之外的机制来实现这种接合，以避免不可控制的副作用。后者可以通过对肿瘤特异性或肿瘤相关模块的优先结合和寡聚化来实现。
已经制造了由4-1BB配体的一个细胞外域和单链抗体片段(Mueller等人，2008；Hornig等人，2012)或与重链C末端(Zhang等，2007)融合的单个4-1BB配体组成的融合蛋白。WO 2010/010051公开了由彼此连接并与抗体模块融合的三个TNF配体胞外域组成的融合蛋白的产生。
然而，仍然需要新的抗原结合分子，其将能够优选地与肿瘤特异性或肿瘤相关靶标结合的模块与能够形成共刺激的TNF配体三聚体的模块组合，并且具有足够的药学上有用的稳定性。本发明的抗原结合分子包含这两者，并且它们令人惊奇地提供了三聚体的并因此具有生物活性的TNF配体，尽管三聚体化TNF配体胞外域中的一个相对于该分子的其他两个TNF配体胞外域位于另一个多肽上。
发明概述
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个另外的方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，
(i)第一多肽含有CH1或CL结构域，第二多肽对应地含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(ii)第一多肽含有CH3结构域，第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF 配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(iii)第一多肽含有VH-CL或VL-CH1结构域，第二多肽对应地含有VL-CH1结构域或VH-CL结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与VH或VL连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，TNF配体家族成员是共刺激人T细胞活化的成员。因此，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。更具体地说，TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
在一个方面，TNF配体家族成员是4-1BBL。
在一个另外的方面，TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374和SEQ IDNO:375的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:96的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。更具体地说，TNF配体家族成员的胞外域包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列。
在又一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:185的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1或CL结构域的第一多肽和对应地含有CL或CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，第二多肽仅包含通过肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1结构域的第一多肽和含有CL结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CL结构域的第一多肽和含有CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个另外的方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是抗体片段。
具体地说，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体片段、Fab分子、交换Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单结构域抗体、aVH和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是支架抗原结合蛋白。
在一个特定方面，本发明与如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子。
本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在另一个方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD20和CD33。
在一个特定方面，靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12或SEQID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ IDNO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ IDNO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够与FAP特异性结合的模块包含包括SEQID NO:106的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列的可变轻链。
在一个另外的方面，提供了根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与重链的CH1或CL结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CL或CH1结构域融合。
在一个特定方面，本发明涉及如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(G4S)2，即，具有SEQ ID NO:13的肽接头。在一个方面，第一肽接头为(G4S)2，第二肽接头为GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，第三肽接头为(G4S)2。在另一个方面，第一、第二和第三肽接头均为(G4S)2。
本发明进一步涉及如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
具体地说，本发明的包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进一步包含(a)能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，其中Fab重链在C末端与Fc结构域中的CH2结构域的N末端融合。
在一个另外的方面，Fc结构域为IgG，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。更具体地说，Fc结构域为IgG1 Fc结构域。在一个特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基联合的修饰。
在另一个方面，本发明涉及如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。
具体地说，Fc结构域包含在IgG重链的位置234和235(EU编号)和/或329(EU编号)处的氨基酸替代。更具体地说，提供了根据本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含具有氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号)的IgG1 Fc结构域。
在一个另外的方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第一肽在其C末端通过第二肽接头与第二重链或轻链融合，和第二肽，其包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域，所述第二肽通过第三肽接头在其C末端对应地与第二轻链或重链融合。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CH1结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CL结构域融合。
在又另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CL结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CH1结构域融合。
在一个另外的方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的VH结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的VL结构域融合。
进一步提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近TNF配体家族成员的CL结构域中，在位置123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，并且其中在邻近TNF配体家族成员的CH1结构域中，在位置147(EU编号)和在位置213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。
在一个另外的方面，提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
(b)第二重链和第二轻链，所述第二重链包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，所述第二轻链包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(a)能够与FAP特异性结合的Fab分子，和
(b)第二重链和第二轻链，所述第二重链包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，所述第二轻链包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含能够与FAP特异性结合的模块。在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ IDNO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:148的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQID NO:114和SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
在又另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与FAP特异性结合的模块。具体地说，提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链。
在另一个特定方面，本发明提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CD19。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:253的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:249的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:201的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ IDNO:202的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够与FAP特异性结合的模块包含包括SEQ IDNO:357的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:358的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与CD19特异性结合的模块。具体地说，提供了权利要求1至14、29、30和32至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链，或
(iv)包含SEQ ID NO:313的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链。
在另一个特定方面，本发明提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CEA。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CEA特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ IDNO:323的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CEA特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:329的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的可变轻链。
在一个方面，提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与CEA特异性结合的模块。具体地说，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:341的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，提供了如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中TNF配体家族成员是OX40L。在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中TNF配体家族成员的胞外域包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的氨基酸序列，尤其是SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在一个另外的方面，提供了权利要求1至5、10至24、29、30、32至34、38至40、44和45中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:371或SEQ ID:372的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)，并且其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10或SEQID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
具体地说，提供了如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:355的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的第二轻链。
根据本发明的另一个方面，提供了编码如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸。本发明进一步提供了包含本发明的分离的多核苷酸的载体，尤其是表达载体，和包含本发明的分离的多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。
在另一个方面，提供了产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法，该方法包括以下步骤：(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及(ii)回收抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
本发明进一步提供了包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明还涵盖用作药剂的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子、或本发明的药物组合物。在一个方面，提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子、或本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，提供了用于治疗癌症的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子、或本发明的药物组合物。
还提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂尤其是制造用于治疗癌症的药剂中的用途，以及治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的药学上可接受的形式的包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。在具体的实施方案中，该疾病是癌症。在任何上述实施方案中，个体优选为哺乳动物，尤其是人。
附图简述
图1显示了用于组装分拆三聚体的人4-1BB配体的组分。图(1A)显示了在C末端与人CH1或CL结构域或VL或VH结构域融合的二聚体配体，图(1B)显示了与人CL或CH1结构域或VL或VH结构域融合的单体配体。图(1C)显示了在N末端与人CH3结构域融合的二聚体配体，图(1D)显示了在N末端与人CH3结构域融合的单体配体。
图2显示了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体1.1至1.10。这些构建体的制备和产生描述于实施例1中。VH和VL结构域是抗FAP抗体28H1的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。*表示CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
图3显示了用于组装分拆三聚体的鼠4-1BB配体的组分。图(3A)显示了在C末端与鼠CL结构域融合的二聚体配体，图(3B)显示了在C末端与鼠CH1结构域融合的单体配体。用于组装FAP靶向的分拆三聚体的鼠4-1BB配体的组分。图(3C)显示了如实施例1.3中更详细描述的含有组装的鼠4-1BBL-三聚体的抗原结合分子。
图4显示了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体2.1至2.6。这些构建体的制备和产生描述于实施例2中。VH和VL结构域是抗FAP抗体4B9的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。*表示CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
图5：图5A和图5B显示了构建体1.1和1.2的“非靶向”变体，其包含DP47Fab分子而不是抗FAP Fab分子。分子分别命名为对照A和对照B。制备方法描述于实施例1.4中。图5C是实施例3中制备的单体4-1BB Fc(kih)构建体的图。
图6涉及FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP分拆的4-1BBL三聚体，实心圆)或DP-47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体，空心圆)与静息(幼稚)或活化的人PMBC的结合。具体地说，与静息(幼稚)或活化的人CD8+T细胞的结合显示在图(6A)中，与静息(幼稚)或活化的人CD4+T细胞的结合显示在图(6B)中，以及与静息(幼稚)或活化的人NK细胞的结合显示在图(6C)中。结合被显示为用作第二检测抗体的红色大型藻类藻红蛋白(R-PE)标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
将不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与来自PHA-L的表达人4-1BB的T细胞以及用普留净(Proleukin)预活化且用抗人CD3/抗人CD28再活化的人PBMC的结合显示在图7A和7B中。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于实施例1的测试构建体1.1至1.10的浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分成四个不同的印迹，其中构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B(具有CH-CL交叉和带电残基的单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。在CD3+CD8+T细胞(图7A)和CD3+CD4+T细胞(图7B)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有型式均以很相似的亲和力与人4-1BB结合。
图8A和8B显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与来自新鲜的PBMC的CD4+或CD8+T细胞(图8A)或与表达人4-1BB的PHA-L以及与用普留净(Proleukin)预活化且用抗人CD3/抗人CD28再活化的人PBMC(图8B)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fc特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于实施例2的测试构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6的以及对照分子对照B、对照C、对照E和对照F的浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分成两个不同的印迹，其中构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B(具有CH-CL交叉和带电残基的单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。在CD45+CD3+CD8+T细胞(底部的印迹)和CD45+CD3+CD4+T细胞(顶部的印迹)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与人4-1BB结合，而二价构建体2.3及其非靶向的对照C显示出较低的MFI。这可能是由于4-1BB结合的空间位阻和/或由Fc缀合的分拆4-1BB配体诱导的第二检测抗体导致的较少检测的缘故。
在图9中，显示了FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP分拆的4-1BBL三聚体，实心圆)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体，空心圆)与活化的小鼠脾细胞的结合。具体地说，与活化的小鼠CD4+T细胞的结合显示在图(9A)中，与活化的小鼠CD8+T细胞的结合显示在图(9B)中。使用抗小鼠CD137特异性人IgG1 P329G LALA抗体(克隆Lob12.3)作为阳性对照(三角形)。通过绘制用作第二检测抗体的R-PE标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的MFI来表征结合，所述MFI是相对于测试的分拆4-1BBL三聚体构建体的浓度nM而言的。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
图10显示了含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(实心圆：FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)的融合抗原结合分子构建体1.1，空心圆：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子对照A)与表达成纤维细胞激活蛋白(FAP)的人黑素瘤(10A)MV-3细胞系和(10B)WM-266-4细胞系的结合。通过绘制用作第二检测抗体的R-PE标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的MFI来表征结合，所述MFI是相对于测试的分拆4-1BBL三聚体构建体的浓度nM而言的。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
在图11A和11B中，显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞(图11A)和/或NIH/3T3-huFAP克隆39转染的小鼠胚胎成纤维细胞(图11B)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料或荧光素-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分布到四个(图11A)或两个印迹(图11B)，而构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。除了二价的FAP靶向的构建体(构建体1.5、1.7和1.8)之外，所有构建体均以相似的亲和力与人FAP结合。它们表现出具有较低的EC50值和较低的中值荧光强度倾向。这可以用它们的二价靶向来解释(较高的亲合力，由于两个表位的占用，较少的分子可以同时结合，导致较低的MFI)。结构差异也可以解释在构建体1.8(完全二价靶向)与构建体1.5和1.7(仅部分二价靶向)之间的差异。
在图12A和12B中，显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞(图12A)和WM-266-4细胞(图12B)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分布到两个印迹，而构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。除了二价的FAP靶向的构建体2.3之外，所有构建体均以相似的亲和力与人FAP结合。它具有显示出较低的EC50值和较低的中值荧光强度倾向。这可以用它的二价靶向来解释，其导致更高的亲合力，但在细胞表面上更少的占用或FAP分子，导致较低的MFI。
图13显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的小鼠4-1BB配体Fc(kih)构建体与来自新鲜脾细胞的CD4+或CD8+T细胞(图13A)或用表达小鼠4-1BB的抗小鼠CD3/抗小鼠CD28单克隆激动性抗体激活的小鼠脾细胞(图13B)的结合。用FITC-荧光染料缀合的抗小鼠IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。在CD3+CD8+T细胞(左侧印迹)和CD3+CD4+T细胞(右侧印迹)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与小鼠4-1BB结合。
将不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的小鼠4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人FAP的肿瘤细胞的结合展示在图14中。用FITC-荧光染料缀合的抗小鼠IgG Fc特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。在MV-3细胞(图14A)和WM-266-4细胞(图14B)上监测结合。FAP靶向的分拆三聚体的小鼠4-1BB配体Fc(kih)构建体M.1和M.2以很相似的亲和力与FAP结合。
图15显示了使用报告细胞系说明在实施例6.1中描述的NFkB活性测定的一般原理的方案。显示了用表达人4-1BB的HeLa报告细胞系建立的活化测定。在报告细胞上表达的4-1BB的交联诱导了NFκB活化和NFκB介导的萤光素酶表达。细胞裂解后，萤光素酶可以催化萤光素氧化为氧化萤光素。这一化学反应与NFκB介导的萤光素酶表达的强度呈正相关，并可以通过发光强度(释放光的单位数)来量度。表达FAP的肿瘤细胞与报告细胞系HeLa-huCD137-NFkB-luc的比率为5比1。
在图16中显示，通过FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体1.1)激活NFkB信号转导途径严格依赖于其与表达FAP的靶细胞的结合。将表达人CD137的NFkB报告HeLa细胞与展现不同水平的细胞表面FAP表达的指定肿瘤细胞共培养。在不存在或存在指定浓度的含有4-1BBL的分子的情况下培养细胞6小时后，如实施例6.1所述评估萤光素酶活性。实心圆是指构建体1.1。空心圆是指DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照A)。细胞系NIH/3T3-人FAP克隆39用作曲线图(16A)中的靶细胞，曲线图(16B)显示以MV3细胞系作为靶细胞的活化，曲线图(16C)以WM-266-4细胞系作为靶细胞。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试的分拆的4-1BBL三聚体构建体的nM浓度的印迹来表征活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。
图17A-17C显示了用实施例6.1中所述的测定法测量的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量每秒释放光的计数(CPS)，并针对使用的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度作图。将表达人4-1BB的HeLa报告细胞在不存在(图17A)或存在表达交联的人FAP的人黑素瘤细胞系MV-3(图17B)或WM-266-4(图17C)的情况下温育6小时。测量CPS并针对不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达人4-1BB的HeLa报告细胞比5个肿瘤细胞。为了更好地展示，将活化曲线分成四个不同的显示印迹，其中构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B(具有CH-CL交叉和带电残基的单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。图17A显示在没有表达交联FAP的肿瘤细胞的情况下的活化，图17B显示在存在表达交联FAP的MV-3肿瘤细胞的情况下的活化，图17C显示在存在表达交联FAP的WM-266-4肿瘤细胞的情况下的活化。
图18显示了对实施例2的构建体测量的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的计数(URL)，并针对使用的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度作图。将表达人4-1BB的HeLa报告细胞在不存在或存在表达交联的人FAP的人黑素瘤细胞系MV-3或WM-266-4的情况下温育6小时。测量URL并针对不同FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6以及对照B、C、E和F的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达4-1BB的HeLa报告细胞比5个肿瘤细胞。为了更好地展示，将活化曲线分为具有构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))的两个不同的显示印迹。
在图19中，显示了用表达食蟹猴4-1BB的T293-HEK报告细胞系建立的活化测定。在报告细胞上表达的食蟹猴4-1BB的交联诱导了NFκB活化和NFκB介导的萤光素酶表达。细胞裂解后，萤光素酶可以催化萤光素氧化为氧化萤光素。这一化学反应与NFκB介导的萤光素酶表达的强度呈正相关，并可以通过发光强度(释放光的单位数)来量度。
图20显示了NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的计数(URL)，并针对使用的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度作图。将表达食蟹猴4-1BB的T293-HEK报告细胞在不存在或存在表达交联的人FAP的人黑素瘤细胞系MV-3或WM-266-4的情况下温育6小时。测量URL并针对不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达4-1BB的T293-HEK报告细胞比5个MV-3或2个WM-266-4细胞。为了更好地显示，将活化曲线分为两个不同的印迹，其中构建体2.1用作比较曲线。
图21：这个方案图解了实施例6.3中描述的T细胞活化测定的原理。显示了在不同滴定浓度的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的存在下，用HLA-A2-NLV特异性CD8T细胞和NLV脉冲的HLA-A2+FAP+人黑素瘤细胞系MV-3建立的示意性活化测定。将细胞温育28小时，最后4小时在含有莫能菌素的Golgi-Stop的存在下温育。NLV特异性CD8 T细胞与MV-3肿瘤细胞的比率为1:8。
图22(22A-22E)和23(23A-23E)涉及在实施例1中制备的不同滴定浓度的不同FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的存在下，用HLA-A2-NLV特异性CD8 T细胞和NLV脉冲的HLA-A2+FAP+人黑素瘤细胞系MV-3进行的活化测定。为了更好地展示，将表达曲线分成几个不同的显示印迹，其中构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B(单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。在四个独立的相似实验中获得结果，并且表明NLV特异性CD8+T细胞的延长IFNγ分泌和CD137表达严格依赖于通过识别NLV-HLA-A2复合物(信号1)的T细胞同时活化和通过FAP靶向的分拆的人4-1BBL(信号2)的4-1BB触发。4-1BB上调的效应显示在图22的曲线图中，而CD8+T细胞的INFγ表达的效应呈现在图23的曲线图中。一直显示总CD8+T细胞群中阳性细胞百分比的频率。所有FAP靶向的变体诱导了NLV肽激活的CD8T细胞的相似活化改善，在图22中显示为4-1BB上调(正反馈环)，并且在图23中显示为刺激24小时后的IFNγ表达。曲线差异在正常误差偏差的范围内，并不显著。
图24和25指的是在实施例2的滴定浓度的不同FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的存在下，用HLA-A2-NLV特异性CD8 T细胞和NLV脉冲的HLA-A2+FAP+人黑素瘤细胞系MV-3进行的活化测定。为了更好地展示，将表达曲线分为两个不同的显示印迹，其中构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B用作比较曲线。所有FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体显示出HLA-A2-NLV肽特异性CD8T细胞的相似活化改善，在图24中显示为4-1BB上调(正反馈环)，并且在图25中显示为刺激24小时后的IFNγ表达。曲线差异在正常误差偏差的范围内，并不显著。
图26:这个方案展示了实施例6.4中所述的实验。
图27显示了CD8+T细胞增殖的诱导。显示的是增殖性CD8+T细胞相对于测试构建体浓度的频率。
图28A涉及在健康NOG小鼠中构建体1.2和对照B的单剂量PK实验。显示的是构建体浓度随着时间而下降。图28B显示了在用干细胞人源化的荷瘤NOG小鼠中的构建体2.1、2.3、对照B和对照C的单剂量PK实验的结果。图28C涉及在健康NOG小鼠中比较构建体2.1和2.3的单剂量PK实验。
图29显示了用于组装分拆三聚体的人4-1BB配体的组分。图(29A)显示了在C末端与具有突变E123R和Q124K(带电残基)的人CL结构域融合的二聚体配体，图(29B)显示了与具有突变K147E和K213E(带电残基)的人CH1结构域融合的单体4-1BB配体。用于组装二价CD19靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-254)抗原结合分子(构建体3.3)的组分。图(29C)显示了与人IgG1 Fc穴链的C末端融合的二聚体配体。图(29D)显示了与人IgG1 Fc节链的C末端融合的单体配体。
图30显示了本发明的含有CD19靶向的4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体3.1至3.6。这些构建体的制备和产生描述于实施例3中。VH和VL结构域是抗CD19抗体8B8-018的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。*表示CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
在图31A中展示了亲本克隆8B8的CDR区的随机化策略。显示了根据Kabat编号的亲本克隆8B8和CDR区(加框)的可变结构域。(X)代表随机化位置。图31B显示了文库生成策略的示意性描述。显示了用于生成具有A)轻链和重链中的随机化CDR1和CDR2区域或B)轻链中的随机化CDR1和CDR3区和重链中的CDR3区的基于8B8的文库的PCR扩增和克隆策略。指示了用于克隆到噬菌粒(phagemide)中的各种酶。
图32显示了亲本抗CD19克隆8B8与选择的亲和力成熟的结合剂的比对。显示了克隆8B8和所有选择的亲和力成熟的结合剂的序列。重链和轻链的CDR被加框。
图33涉及亲本8B8克隆及其亲和力成熟的变体的SPR分析。显示了克隆8B8及其亲和力成熟的衍生物的传感图，其中没有LCDR1 N27d和N28热点。
图34图解了测量CD19靶向的分拆三聚体的4-1BBL与hu4-1BB和huCD19(实施例8.2)同时结合的测定的设置。
图35中的曲线图显示了CD19靶向的三聚体4-1BBL FC融合抗原结合分子构建体3.1、3.3、3.4、3.5、3.6和4.4(分析物1)与固定的人4-1BB和人CD19(分析物2)的同时结合。
图36A和36B显示了不同的CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与PHB-L的表达4-1BB的CD4和CD8 T细胞和用普留净(Proleukin)预活化且用抗人CD3/人CD28再活化的人PBMC的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地显示，将结合曲线分为三个不同的印迹，其中构建体3.4和对照F(同种型对照huIgG1P329G LALA)用作比较曲线。在CD45+CD3+CD8+T细胞(图36A)和CD45+CD3+CD4+T细胞(图36B)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与人4-1BB结合。
图37A-37D显示了CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)抗原结合分子与表达人CD19的B细胞淋巴瘤细胞系：弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤SU-DHL-8(37A)、急性前体B细胞淋巴样白血病Nalm6(37B)、弥漫性大细胞淋巴母细胞淋巴瘤Toledo(37C)和弥漫性大B细胞淋巴瘤OCI-Ly18(37D)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地显示，将结合曲线分为三个不同的印迹，其中构建体3.4和对照F(同种型对照huIgG1 P329G LALA)用作比较曲线。所有构建体均以很相似的亲和力与人CD19结合。
图38涉及CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)抗原结合分子的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的单位数(URL)，并针对使用的CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体3.1和3.3以及对照分子B和C的浓度作图。将表达人4-1BB的HeLa报告细胞在不存在或存在表达交联的人CD19的SU-DHL-8或Pfeiffer细胞的情况下温育7.5小时。测量URL并针对不同的CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达4-1BB的HeLa报告细胞比2.5或5个肿瘤细胞。
图39显示了T84.66 IgG的不同人源化变体在表达CEA的人胃腺癌细胞上的结合。基于该数据，选择人源化变体1，将其包括在CEA靶向的三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)抗原结合分子中。
图40显示了本发明的含有CEA靶向的4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体5.1至5.6。这些构建体的制备和产生描述于实施例11中。VH和VL结构域是抗CEA抗体T84.66-LCHA的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。*表示CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
图41：图41A显示了人NA3B3A2-avi His的示意性描述，该抗原其用于评估CEA靶向的分拆三聚体的4-1BBL Fc(kih)抗原结合分子的结合。图41B图解了测量CEA靶向的分拆三聚体的4-1BBL与hu4-1BB和人NA3B3A2(实施例12.1)同时结合的测定的设置。
图42中的曲线图显示了CEA靶向的三聚体4-1BBL Fc融合抗原结合分子构建体5.4、5.6、5.7和5.8(分析物1)与固定的人4-1BB和人NA3B3A2(分析物2)的同时结合。
将不同的CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与PHA-L的表达4-1BB的CD4和CD8 T细胞以及用普留净(Proleukin)预活化且用抗人CD3/抗人CD28再活化的人PBMC的结合显示在图43中。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地显示，将结合曲线分为两个不同的印迹，其中构建体5.4和对照F(同种型对照huIgG1P329G LALA)用作比较曲线。在CD45+CD3+CD8+T细胞(底部的印迹)和CD45+CD3+CD4+T细胞(顶部的印迹)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与人4-1BB结合。
图44显示了CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人CEA的人胃细胞系MKN-45(左)和人结肠直肠腺癌细胞系LS180(右)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。
图45涉及CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)抗原结合分子的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的单位数(URL)，并针对使用的CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体5.4、5.6、5.7和5.8以及对照分子的浓度进行印迹。将表达人4-1BB的HeLa报告细胞在不存在或存在表达交联的人CEA的人胃癌细胞系MKN-45的情况下温育6小时。细胞比率为1个表达4-1BB的HeLa报告细胞比3个肿瘤细胞。
图46：在图46A和46B中，显示了用于组装单价的FAP靶向的分拆三聚体的人OX40配体(构建体6.1)的组分。图46A涉及与人IgG1-CL结构域融合的二聚体配体，图46B涉及与人IgG1-CH1结构域融合的单体配体。图46C显示了FAP靶向的含有OX40L三聚体的抗原结合分子构建体6.1。在图46D中，显示了DP47“非靶向的”人IgG1 PGLALA(对照F)。
图47A显示了FAP靶向的分拆三聚体的人Ox40L与FAP阳性的WM-266-4细胞的结合。WM-266-4细胞表达高水平的人成纤维细胞激活蛋白(huFAP)。只有FAP靶向的OX4O配体Fc(kih)构建体(实心正方形)而不是对照5(实心菱形)与WM-266-4细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测定MFI。x轴显示抗体构建体的浓度。图47B显示了FAP靶向的OX4O配体Fc(kih)构建体与人FAP人Ox40阴性A549 NucLight Red细胞的结合。FAP靶向的OX4O配体Fc(kih)构建体显示没有与OX40阴性FAP阴性A549肿瘤细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的FITC标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
图48：在图48A中，显示了FAP-Ox40L与静息和活化的人CD4 T细胞的结合。在静息的人CD4 T细胞(左侧)上不表达Ox40。在没有表达人Ox40的细胞的情况下，没有观察到结合(左图)。激活人PBMC后，Ox40在CD4+T细胞上被上调(右侧)。FAP-Ox40L与Ox40+的活化CD4 T细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的FITC标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。x轴显示抗体构建体的浓度。图48B显示在静息的人CD8 T细胞(左侧)上不表达Ox40。在没有表达人Ox40的细胞的情况下，没有观察到结合(左图)。激活人PBMC后，Ox40在CD8+T细胞上被上调(右侧)。Ox40在人CD8+T细胞上的表达低于在CD4+T细胞上的表达，并且在供体和时间点之间变化。Ox40在描绘的CD8 T细胞上的表达较低。FAp-Ox40L与Ox40+的活化CD8 T细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的FITC标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。x轴显示抗体构建体的浓度。
在图49中，证明了在HeLa_hOx40_NFkB_Luc1报告细胞中通过FAP靶向的分拆三聚体的人OX40L抗原结合分子(FAP-OX40L)的NFκB信号通路的激活。显示了在具有(右曲线图)或没有(左曲线图)通过第二抗体进行交联情况下的活化。以指定浓度将报告细胞在FAP-OX40L存在下在具有或没有1:2比例的交联的第二多克隆抗huIgG1 Fcγ特异性山羊IgGIgG F(ab)2片段的情况下培养5小时。如实施例6.1中所述评估萤光素酶活性。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试构建体的nM浓度的印迹来表征活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。
图50：在FAP阳性细胞存在下通过FAP-OX40L在HeLa_hOx40_NFkB_Luc1报告细胞中NFκB的激活显示在图50A中。显示了在表达低FAP的NIH-3T3人FAP细胞存在下通过FAP-OX40L在报告细胞中的NFκB信号通路的激活(比率为3个FAP+肿瘤细胞比1个报告细胞)。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试化合物的nM浓度的印迹来表征NFκB介导的萤光素酶活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。通过减去空白对照的URL将这些值进行基线校正。为了更好地比较，将各个印迹的剂量-反应曲线的曲线下面积定量，作为每个构建体的激动能力的标志。在图50B中展示该比较。使用GraphPad Prism计算该面积。通过减去空白对照的值将这些值进行基线校正。
图51显示了OX40介导的次最佳TCR触发的静息人PBMC的共刺激(实施例15.5)。通过本发明NIH/3T3-huFAP克隆39细胞的FAP-Ox40L的超交联强烈促进了人CD4和CD8T细胞的存活和增殖。显示有活力的CD4+(左)和CD8+(右)T细胞的事件计数。减去仅含有抗人CD3(克隆V9，huIgG1)、静息的人PBMC和NIH/3T3-huFAP克隆39的样品的基线值。因此，这里显示了OX40共刺激的增强作用，但不是次最佳抗CD3刺激本身的作用。在底部的图中，显示了具有细胞表面固定的FAP-Ox40L的静息的人PBMC的次最佳TCR刺激的复苏-增殖。
发明详述
定义
除非另外定义，本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中通常使用的相同的含义。出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指的是特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
如本文中使用的，术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合模块能够通过其靶细胞抗原激活信号转导。在一个特定方面，抗原结合模块能够将与其连接的实体(例如，TNF家族配体三聚体)引导至靶位点，例如引导至具有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的抗体及其片段。另外，能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如，基于设计的重复蛋白或设计的重复结构域的结合结构域(参见例如WO 2002/020565)。
关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”是指分子的包含与抗原的部分或全部特异性结合并与其互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供能够进行特异性抗原结合的模块。具体地说，能够进行特异性抗原结合的模块包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
在本文中以最广义的方式使用术语“抗体”，其涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即包含该群的单独的抗体是同一的和/或结合同一表位，除了可能的变体抗体之外，例如，含有天然存在的突变的或在单克隆抗体制剂的产生过程中产生的抗体，这样变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点各自与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性地与至少两个不同的抗原决定簇结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对于不同的抗原决定簇是特异性的。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，尤其是在两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。
在本申请中使用的术语“价”意味着在抗原结合分子中特定数目的结合位点的存在。正因为因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别意味着在抗原结合分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指的是具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。“天然抗体”指的是具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2、和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N末端至C末端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是轻链恒定结构域(CL)，也称为轻链恒定区。抗体重链可被指定为五种类型中的一种，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体轻链可被指定为两种类型之一，称为卡帕(κ)和兰布达(λ)。
“抗体片段”指的是除了完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的所述完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体、三抗体、四抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，引自The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利Nos.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的可以是二价或双特异性的抗体片段，参见，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。Hudson等人在Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三抗体和四抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术制造抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中所述。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个完全相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自含有重链和轻链可变区以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文中使用的，术语“Fab片段”是指包含包括轻链的VL结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段、和重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。Fab'片段因在重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab')2片段。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”是指其中重链和轻链的可变区或恒定区之间被交换的Fab片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的并且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链、以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。这种交换Fab分子也被称为CrossFab(VLVH)。另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链、以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。这种交换Fab分子也被称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是具有至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键而被稳定化。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号在可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些单链Fab分子可以进一步被稳定化。
“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述接头是具有至少30个氨基酸的多肽。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号在可变轻链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些x-scFab分子可以进一步被稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是用具有10个至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白。该接头通常富含有关柔性的甘氨酸，以及有关溶解性的丝氨酸或苏氨酸，并且可将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)。另外，抗体片段包含具有VH结构域特征或VL结构域特征的单链多肽，所述VH结构域特征即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点上，所述VL结构域特征即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点上，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的，例如，纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.CurrOpin Chem Biol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation ofprotein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面，支架抗原结合蛋白选自CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子，如蛋白A的Z结构域(Affibody)、A结构域(Avimer/Maxibody)、血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、VNAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(VNAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、诸如来自knottin家族的蛋白质的微体、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外域具有类似可变结构域的Ig折叠。可用异源序列取代对应于抗体的CDR的环，以赋予不同的结合特性。经过工程化而具有不同结合特异性的CTLA-4分子也被称为Evibodies(例如，US7166697B1)。Evibodies的大小与抗体(例如，结构域抗体)的分离可变区大约相同。进一步的详情参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂质运载蛋白为细胞外蛋白质家族，其转运小的疏水性分子，如类固醇、胆红素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端具有可被工程化以结合不同的靶抗原的多个环。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。
亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架，其可被工程化以结合抗原。该结构域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)和EP1641818A1。
Avimers是衍生自A结构域支架家族的多结构域蛋白。具有约35个氨基酸的天然结构域采用定义的二硫键结构。多样性是通过改变A结构域家族所显示的自然变异产生的。进一步的详情参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(June2007)。
转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括Trans-body。进一步的详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基的基序。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基，它们可以被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数量(亲和力成熟法)可以增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。
单结构域抗体是由单个单体的可变抗体结构域组成的抗体片段。第一个单结构域来源于来自骆驼科动物(camelids)抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包括自主的人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。
纤连蛋白是一种可以被工程化为与抗原结合的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个结构域的天然氨基酸序列的主链组成。可以将β-夹心一端的三个环工程化，使Adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子，所述骨架蛋白通常是含有在活性位点插入的约束可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详情参见ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataBI以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程化的半胱氨酸结肽结构域的更多详情参见WO2008098796。
就参考分子而言“结合相同表位的抗原结合分子”是指在竞争测定中阻断参考分子与其抗原的结合的50％或以上的抗原结合分子，相反地，参考分子在竞争测定中阻断抗原结合分子与其抗原的结合的50％或以上。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的部分或全部特异性地结合且互补的区域。在大抗原的情况下，抗原结合分子可能仅与该抗原的特定部分结合，该部分称作表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文中使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指在抗原结合模块与其结合而形成抗原结合模块-抗原复合物的多肽大分子上的位点(例如氨基酸的连续段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他病变的细胞表面上、免疫细胞表面上发现，在血清中和/或细胞外基质(ECM)中游离。用作本文中的抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况下，该术语包括“全长”未加工的蛋白质以及通过在细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”意指结合对于抗原而言是选择性的，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区别开。抗原结合分子与特异性抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如，表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原结合的约10％，正如通过例如SPR所测量的。在某些实施方案中，与抗原结合的分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文中使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以通过解离常数(Kd)来表示，亲和力是解离速率常数与结合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等同亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。可以通过本领域已知的常用方法测量亲和力，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
如本文中使用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质细胞。在某些实施方案中，靶细胞抗原是肿瘤细胞表面上的抗原。在一个实施方案中，靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD20和CD33。具体地说，靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
术语“成纤维细胞激活蛋白(FAP)”，也称为脯氨酰内肽酶FAP或分离酶(Seprase)(EC 3.4.21)，是指任何脊椎动物来源的任何天然FAP，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的FAP以及通过在细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合人、小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列显示在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149，SEQ ID NO:20)、或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的细胞外域(ECD)从氨基酸位置26延伸至760。带His标签的人FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO:15和16中。小鼠FAP的氨基酸序列显示在UniProt登录号P97321(版本126，SEQ ID NO:23)、或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP的细胞外域(ECD)从氨基酸位置26延伸至761。SEQ ID NO:24和25分别显示了带His标签的小鼠FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO:26和27分别显示了带His标签的食蟹猴FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。优选地，本发明的抗FAP结合分子与FAP的细胞外域结合。示例性抗FAP结合分子描述于国际专利申请No.WO 2012/020006 A2中。
术语“癌胚抗原(CEA)”，也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，是指任何脊椎动物来源的任何天然CEA，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CEA的氨基酸序列显示在UniProt登录号P06731(版本151，SEQ ID NO:28)中。CEA早已被鉴定为肿瘤相关抗原(Gold和Freedman,J Exp Med.,121:439-462,1965；Berinstein N.L.,J Clin Oncol.,20:2197-2207,2002)。最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在若干正常的成人组织中鉴定了CEA。这些组织主要是起源于上皮，包括胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的细胞，以及结肠、子宫颈、汗腺和前列腺的细胞(Nap等人，Tumour Biol.,9(2-3):145-53,1988；Nap等人，Cancer Res.,52(8):2329-23339,1992)。上皮起源的肿瘤及其转移瘤含有作为肿瘤相关抗原的CEA。虽然CEA本身的存在不表明转化为癌细胞，但CEA的分布是指示性的。在正常组织中，CEA通常在细胞的顶端表面上表达(S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))，使血流中的抗体难以接近。与正常组织相反，CEA倾向于在癌细胞的整个表面上表达(/>S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))。这种表达模式的改变使CEA在癌细胞中可与抗体结合。另外，CEA表达在癌细胞中增加。此外，增加的CEA表达促进细胞间粘附增加，这可能导致转移(Marshall J.,Semin Oncol.,30(a Suppl.8):30-6,2003)。CEA表达在各种肿瘤实体中的发生率通常很高。根据公开的数据，在组织样品中进行的自身分析证实其高发生率，大约在结肠直肠癌(CRC)中为95％，在胰腺癌中为90％，在胃癌中为80％，在非小细胞肺癌(NSCLC，其与HER3共表达)中为60％，在乳腺癌中为40％；发现在小细胞肺癌和胶质母细胞瘤中为低表达。
CEA容易从细胞表面裂解并直接或通过淋巴管从肿瘤脱落进入血流。由于这种特性，血清CEA水平已被用作癌症诊断和筛选癌症特别是结肠直肠癌复发的临床标志物(Goldenberg D M.,The International Journal of Biological Markers,7:183-188,1992；Chau I.等人，J Clin Oncol.,22:1420-1429,2004；Flamini等人，Clin Cancer Res；12(23):6985-6988,2006)。
术语“黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)”，也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)，是指任何脊椎动物来源的任何天然MCSP，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人MCSP的氨基酸序列显示在UniProt登录号Q6UVK1(版本103，SEQ ID NO:29)中。术语“表皮生长因子受体(EGFR)”，也称为原癌基因c-ErbB-1或受体酪氨酸蛋白激酶erbB-1，是指任何脊椎动物来源的任何天然EGFR，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人EGFR的氨基酸序列显示在UniProt登录号P00533(版本211，SEQ ID NO:30)中。
术语“CD19”是指B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD19，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD19的氨基酸序列显示在Uniprot登录号P15391(版本160，SEQ ID NO:31)中。该术语涵盖“全长”未加工的人CD19以及通过在细胞中加工产生的任何形式的人CD19，只要本文中报道的抗体与其结合即可。CD19是在人B细胞表面上表达的结构上不同的细胞表面受体，所述细胞包括但不限于前B细胞、早期发育中的B细胞(即未成熟B细胞)、通过终末分化成浆细胞的成熟B细胞和恶性B细胞。由大多数前B型急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病和一些无标志型急性淋巴细胞性白血病表达CD19。CD19在浆细胞上表达进一步表明它可以在分化的B细胞肿瘤如多发性骨髓瘤中表达。因此，CD19抗原是用于治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和/或急性淋巴细胞白血病的免疫治疗的靶标。
术语“CD20”是指B淋巴细胞抗原CD20，也称为跨膜4域亚家族A成员1(MS4A1)、B淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD20，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD20的氨基酸序列显示在Uniprot登录号P11836(版本149，SEQ ID NO:32)中。术语“CD33”是指髓样细胞表面抗原CD33，也称为SIGLEC3或gp67，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD33，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD33的氨基酸序列显示在Uniprot登录号P20138(版本157，SEQ ID NO:33)中。
术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt等人，KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman和Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变/或形成结构上定义的环(“高变环”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)中，三个在VL中(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性的高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3) 处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987).)示例性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)发生在L1的24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102氨基酸残基处。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991).)高变区(HVR)也被称为互补决定区(CDR)，并且在提到形成抗原结合区的可变区的部分时，这些术语在本文中可互换地使用。这个特定的区域已经由Kabat等人在U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"(1983)和Chothia等人在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)中描述，其中定义包括当针对彼此进行比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，提及抗体的CDR或其变体的任一定义的应用预期在本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如以上每一篇引用的参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基在以下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将取决于CDR的序列和大小而变化。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定的CDR。
表A：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM2
VHCDR1 31-35 26-32 26-35
VHCDR2 50-65 52-58 50-58
VHCDR3 95-102 95-102 95-102
VLCDR1 24-34 26-32 24-34
VLCDR2 50-56 50-52 50-56
VLCDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中所有CDR定义的编号遵循Kabat等人提出的编号规则(见下文)。
2具有如表A中使用的小写“b”的“AbM”是指Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件所定义的CDR。
Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以将这个“Kabat编号”系统明确地指定给任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人在U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)中提出的编号系统。除非另有说明，抗体可变区中特定氨基酸残基位置编号的提及是根据Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含作为接触抗原的残基的“特异性测定残基”或“SDR”。SDR被包含在称为缩略CDR(或a-CDR)的CDR区域中。示例性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)发生在L1的31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102氨基酸残基处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008).)除非另外指明，在本文中根据上文Kabat等人将可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)编号。
如本文中使用的，在抗原结合分子(例如，抗体)的背景下，术语“亲和力成熟”是指例如通过突变而衍生自参考抗原结合分子的抗原结合分子与参考抗体结合相同的抗原，优选结合相同的表位；并且对抗原具有相比于对参考抗原结合分子更高的亲和力。亲和力成熟通常涉及抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常，亲和力成熟的抗原结合分子与初始参考抗原结合分子结合相同的表位。
“框架”或“FR”是指除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由FR1、FR2、FR3和FR4四个FR结构域组成。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以下列顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文的目的，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下所定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含相同的氨基酸序列，或者其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“嵌合”抗体是指其中一部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种的抗体，同时重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种。
抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个(通常两个)可变结构域中的基本上所有的可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”是指经过人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经基于原始抗体的恒定区另外加以修饰或改变以产生根据本发明的特性特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些抗体。
“人”抗体是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体或衍生自利用人抗体库或其他的人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中使用的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约位置231的氨基酸残基延伸至约位置340的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链与CH2结构域附接。本文中的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含在Fc区中的C末端到CH2结构域的残基段(即从IgG的约位置341的氨基酸残基到约位置447的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如，具有在其一条链中引入的“突起”(“节”)和在其另一条链中相应的引入的“腔”(“穴”)的CH3结构域；参见美国专利5,821,333，将其明确地通过提述并入本文)。如本文中所述，这种变体CH3结构域可用于促进两个不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非在本文中另外说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统也称为EU索引进行的，如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda, MD,1991中描述。
“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”)，使得该突起可以定位在该腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变、或通过肽合成而产生突起和腔。在具体的实施方案中，节修饰包括Fc结构域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W，并且穴修饰包括Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的氨基酸替代T366S、L368A和Y407V。在一个另外的具体实施方案中，包含节修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸替代S354C，并且包含穴修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。编号是根据Kabat等人在Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中的EU索引进行的。
“等同于免疫球蛋白Fc区的区域”预期包括免疫球蛋白Fc区的天然存在的等位基因变体、以及具有产生取代、添加或缺失的改变但不实质性地降低免疫球蛋白介导效应器功能(如抗体依赖性细胞毒性)的能力的变体。例如，可以从免疫球蛋白Fc区的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸，而没有生物学功能的实质性丧失。可以根据本领域已知的一般规则来选择这些变体，以便对活性具有最小的影响(参见，例如Bowie,J.U.等人，Science247:1306-10(1990))。
术语“效应器功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调、和B细胞活化。
“激活性Fc受体”是被抗体Fc区接合之后引出信号转导事件的Fc受体，所述事件刺激带有该受体的细胞履行效应器功能。激活性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、和FcαRI(CD89)。特定的激活性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
术语“TNF配体家族成员”或“TNF家族配体”是指促炎细胞因子。细胞因子，特别是TNF配体家族的成员，通常在免疫系统的刺激和协调中起关键作用。目前，根据序列、功能和结构相似性，已将19种细胞因子鉴定为TNF(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是具有C末端细胞外域(胞外域)、N末端胞内结构域和单个跨膜结构域的II型跨膜蛋白。称为TNF同源结构域(THD)的C末端细胞外域在超家族成员之间具有20-30％的氨基酸同一性，并且负责与受体的结合。TNF胞外域还负责TNF配体形成被其特异性受体识别的三聚体复合物。
TNF配体家族的成员选自淋巴毒素α(也称为LTA或TNFSF1)、TNF(也称为TNFSF2)、LT(也称为TNFSF3)、OX40L(也称为TNFSF4)、CD40L(也称为CD154或TNFSF5)、FasL(也称为CD95L、CD178或TNFSF6)、CD27L(也称为CD70或TNFSF7)、CD30L(也称为CD153或TNFSF8)、4-1BBL(也称为TNFSF9)、TRAIL(也称为APO2L,CD253或TNFSF10)、RANKL(也称为CD254或TNFSF11)、TWEAK(也称为TNFSF12)、APRIL(也称为CD256或TNFSF13)、BAFF(也称为CD257或TNFSF13B)、LIGHT(也称为CD258或TNFSF14)、TL1A(也称为VEGI或TNFSF15)、GITRL(也称为TNFSF18)、EDA-A1(也称为外异蛋白A1)和EDA-A2(也称为外异蛋白A2)。该术语是指任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族配体，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在本发明的具体实施方案中，TNF配体家族成员选自OX40L、FasL、CD27L、TRAIL、4-1BBL、CD40L和GITRL。在特定实施方案中，TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
可以从例如Uniprot(www.uniprot.org)的可公开访问的数据库获得TNF配体家族成员的更多信息，特别是序列。例如，人TNF配体具有以下氨基酸序列：人淋巴毒素α(UniProt登录号P01374，SEQ ID NO:34)、人TNF(UniProt登录号P01375，SEQ ID NO:35)、人淋巴毒素β(UniProt登录号Q06643，SEQ ID NO:36)、人OX40L(UniProt登录号P23510，SEQID NO:37)、人CD40L(UniProt 登录号P29965，SEQ ID NO:38)、人FasL(UniProt登录号P48023，SEQ ID NO:39)、人CD27L(UniProt登录号P32970，SEQ ID NO:40)、人CD30L(UniProt登录号P32971，SEQ ID NO:41)、4-1BBL(UniProt登录号P41273，SEQ ID NO:42)、TRAIL(UniProt登录号P50591，SEQ ID NO:43)、RANKL(UniProt登录号O14788，SEQ ID NO:44)、TWEAK(UniProt登录号O43508，SEQ ID NO:45)、APRIL(UniProt登录号O75888，SEQ IDNO:46)、BAFF(UniProt登录号Q9Y275，SEQ ID NO:47)、LIGHT(UniProt登录号O43557，SEQID NO:48)、TL1A(UniProt登录号O95150，SEQ ID NO:49)、GITRL(UniProt登录号Q9UNG2，SEQ ID NO:50)和外异蛋白A(UniProt登录号Q92838，SEQ ID NO:51)。
“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的结构域。胞外域通常是蛋白质中引发与表面接触的部分，导致信号转导。因此，如本文中定义的TNF配体家族成员的胞外域是指TNF配体蛋白中延伸进入细胞外空间的部分(细胞外域)，还包括负责三聚化和与相应TNF受体结合的较短部分或其片段。因此，术语“TNF配体家族成员的胞外域或其片段”是指形成细胞外域的TNF配体家族成员的细胞外域或其仍然能够与受体结合的部分(受体结合结构域)。
术语“共刺激TNF配体家族成员”或“共刺激TNF家族配体”是指能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子产生的TNF配体家族成员亚型。这些TNF家族配体可以在与其相应的TNF受体相互作用时共刺激TCR信号，并且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集，其引发导致T细胞活化的信号级联。共刺激TNF家族配体选自4-1BBL、OX40L、GITRL、CD70、CD30L和LIGHT，更特具体地说，共刺激TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
如前文中所述，4-1BBL是II型跨膜蛋白，并且为TNF配体家族的一个成员。已经描述了在细胞表面上形成三聚体的具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的完整或全长4-1BBL。通过4-1BBL的胞外域的特定基序而启动三聚体形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区域”。人4-1BBL序列的氨基酸50-254(SEQ ID NO:52)形成4-1BBL的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“4-1BBL的胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254)、SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸71-254)、SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254)和SEQ ID NO:2(人4-1BBL 的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽或具有选自SEQ ID NO:96(人4-1BBL的氨基酸71-248)、SEQ ID NO:375(人4-1BBL的氨基酸52-248)、SEQ ID NO:374(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:373(人4-1BBL的氨基酸85-248)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
如前文中所述，OX40L是另一种II型跨膜蛋白，并且为TNF配体家族的另一个成员。完整或全长的人OX40L具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列。人OX40L序列的氨基酸51-183(SEQID NO:53)形成OX40L的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“OX40L的胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:53(人OX40L的氨基酸51-183)或SEQ ID NO:54(人OX40L的氨基酸52-183)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸通常约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或描述于本文中。适合的非免疫原性接头肽例如是，(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为1至10之间的数字，通常为1至4，特别是2，即，这些肽选自GGGGS(SEQ ID NO:128)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:55)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:56)，但也包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:58)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:59)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:60)、GGSGSG(SEQ IDNO:61)、GGSG(SEQ ID NO:62)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:63)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:64)和GGNGSG(SEQ ID NO:65)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)1或GGGGS(SEQ ID NO:128)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，更具体地为(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)。
在本申请中使用的术语“氨基酸”表示包含丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)的天然存在的羧基α- 氨基酸的组。
如本文中使用的“单链融合蛋白”是指由与抗原结合模块或Fc部分的一部分融合的所述TNF配体家族成员的一个或两个胞外域组成的单链多肽。通过经由肽接头将抗原结合模块的N末端或C末端氨基酸直接与所述TNF配体家族成员的胞外域的C末端或N末端氨基酸连接，可以进行融合。
“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和所述TNF配体家族成员的胞外域)通过肽键直接连接或经由一个或多个肽接头连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代)之后候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成了氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创作，并且源代码已在美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)与用户文件一起备案，在美国版权局以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech公司公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译为供在包括数字UNIX V4.0D在内的UNIX操作系统上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且没有变化。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X为通过序列比对程序ALIGN-2在A与B的程序比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对于B的氨基酸序列同一性％不会等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得在本文中使用的所有氨基酸序列同一性％值。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学性质。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码所述分子的核苷酸序列引入适当的修饰、或通过肽合成来制备。这些修饰包括，例如，抗体氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。取代型诱变的感兴趣部位包括HVR和框架(FR)。在表B中的标题“优选取代”下提供了保守取代，并且在下文中参照氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步加以描述。可以将氨基酸替代引入感兴趣的分子中，并筛选出具有期望活性的产物，所述活性例如保留/增强的抗原结合、降低的免疫原性、或增强的ADCC或CDC。
表B
可以根据常见的侧链性质将氨基酸分组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要将这些类之一的成员替换为另一类。
术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸替代的实质性变体。通常，经过选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗原结合分子在某些生物学特性(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)方面将具有改变(例如提高)和/或将具有基本上保留的亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟抗体，可以方便地例如使用例如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术来产生所述抗体。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定的生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个HVR内进行，只要这些改变基本上不降低抗原结合分子结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如本文中提供的保守取代)。用于鉴定可能被靶向诱变的抗体残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在针对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。替代地，或另外地，抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可以作为取代候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。分子的其他插入变体包括与多肽的N末端或C末端的融合，以增加含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的血清半衰期。
在某些实施方案中，改变本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子以增加或降低抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地获得分子的糖基化变体。当含有TNF配体三聚体的抗原结合分子包含Fc区时，附着于其上的碳水化合物可能被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角(biantennary)寡糖，其通常通过N键与Fc区的CH2结构域的Asn297连接。参见，例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与在双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc附接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进行寡糖修饰，以产生具有某些改良特性的变体。在一个方面，提供了具有缺乏与Fc区附接(直接或间接)的岩藻糖的碳水化合物结构的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的变体。这样的岩藻糖基化变体可具有增强的ADCC功能，参见，例如美国专利公开Nos.US2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的其他变体包括具有二等分寡糖的那些，例如，其中与Fc区附接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这些变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或增强的ADCC功能，参见例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)。还提供了与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。这样的抗体变体可以具有增强的CDC功能，并被描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施方案中，可能希望产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化的变体，例如“thioMAb”，其中该分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在分子的可接近位置。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此反应性硫醇基团被定位在抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其他模块(例如药物模块或接头-药物模块)缀合以产生免疫缀合物。在某些实施方案中，任何一个或多个以下残基可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以按照例如美国专利No.7,521,541中的描述产生半胱氨酸工程化的抗原结合分子。
在某些方面，本文中提供的含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子可进一步被修饰，以含有另外的本领域已知并且易于获得的非蛋白质模块。适用于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而具有在制造方面的优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体附接的聚合物的数量可以变化，并且如果附接一种以上的聚合物的话，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑事项来确定，包括但不限于，待改进的抗体的特定性质或功能，是否将双特异性抗体衍生物在限定的条件下用于治疗中，等等。在另一个方面，提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体与非蛋白质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质模块是碳纳米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞的波长，但所述波长将非蛋白质模块加热到杀死抗体-非蛋白质模块附近的细胞的温度。
在另一个方面，可以获得本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒性剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如，可见于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语“核酸分子”是指任何一个或多个核酸区段，例如，存在于多核苷酸中的DNA或RNA片段。
关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，意指已经从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外的例子包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液形式的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但多核苷酸分子在染色体外存在或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式以及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于具有至少例如与本发明的参考核苷酸序列95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指除了该多核苷酸序列可以包括至多该参考核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外，所述多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可以被缺失或被另一个核苷酸取代，或者，在参考序列中，总核苷酸的至多5％的多个核苷酸可被插入参考序列。参考序列的这些改变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，独立散布在参考序列的残基之间或在参考序列内的一个基团或多个连续的基团中。实际情况是，使用例如上面针对多肽所讨论的已知的计算机程序(例如ALIGN-2)，可以常规地确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的，并且是指用于将与其可操作地相关联的特定基因引入靶细胞中并且指导所述特定基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。本发明的表达载体包括表达盒。表达载体允许大量稳定的mRNA的转录。一旦表达载体进入靶细胞内，则通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。宿主细胞是可用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，例如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。
药剂的“有效量”是指导致其所施用的细胞或组织的生理变化所必需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在剂量和时间段方面有效实现期望的治疗或预防结果所需的量。例如，治疗有效量的药剂消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如母牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人灵长类动物如猴子)、兔、和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。具体地说，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指其为这样的形式的制剂，所述形式允许其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且所述制剂不含另外的对该制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。
“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的，“治疗”(“treatment”)(及其语法变化例如“治疗”(“treat”)或“治疗”(“treating”))是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，所述临床干预可用于预防或在临床病理过程中进行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状减轻、疾病的任何直接或间接病理结果的削减、预防转移、降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态、以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的分子用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文中使用的术语“癌症”是指增殖性疾病，例如淋巴瘤、癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺癌(NSCL)、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部肿瘤、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌、乳腺癌癌症、三阴性乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊索瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞癌(淋巴瘤)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病，包括任何上述癌症的难治性形式、或上述一种或多种癌症的组合。
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
本发明提供了具有特别有利的性质的含有新型TNF家族配体三聚体抗原结合分子，所述性质例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、靶向效率和降低的毒性。
在第一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。
在另一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中TNF配体家族成员的这些胞外域在所有情况下是相同的。
在一个另外的方面，提供了权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，
(i)第一多肽含有CH1或CL结构域，第二多肽对应地含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(ii)第一多肽含有CH3结构域，第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(iii)第一多肽含有VH-CL或VL-CH1结构域，第二多肽对应地含有VL-CH1结构域或VH-CL结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与VH或VL连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含共刺激人T细胞活化的TNF配体家族成员，其选自4-1BBL和OX40L。更具体地说，TNF配体家族成员是4-1BBL。
在另一个方面，其中TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374和SEQ IDNO:375的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一个方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:96的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一个特定方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一个特定方面，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列。
在又一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:185的氨基酸序列。
在另一个方面，TNF配体家族成员是OX40L。在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中TNF配体家族成员的胞外域包含SEQ ID NO:53或SEQ IDNO:54的氨基酸序列，尤其是SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:371或SEQ ID:372的氨基酸序列，第二多肽对应地包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1或CL结构域的第一多肽和对应地含有CL或CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1结构域的第一多肽和含有CL结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CL结构域的第一多肽和含有CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在又另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)一个以上的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域，第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中所述两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块与两种不同的靶细胞抗原结合。
在一个另外的方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，提供了如前文所述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体片段、Fab分子、交换Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单结构域抗体、aVH和支架抗原结合蛋白。在一个方面，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是aVH或支架抗原结合蛋白。在一个方面，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的支架抗原结合蛋白。
具体地说，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个或两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子或交换Fab分子。具体地说，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab。
此外，提供了如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。
在一个另外的方面，提供了根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与重链的CH1结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CL结构域融合。
在另一个方面，提供了根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与重链的CL结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CH1结构域融合。
在一个另外的方面，本发明与根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与轻链的CL结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与重链的CH1结构域融合。
在一个特定方面，本发明涉及如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(G4S)2。在一个方面，第一肽接头为(G4S)2(SEQ ID NO:13)，第二肽接头为GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，第三肽接头为(G4S)2(SEQ ID NO:13)。具体地说，本发明涉及如上所述的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子，其中第一肽接头为(G4S)2(SEQ ID NO:13)，第二肽接头为GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:13)，第三肽接头为(G4S)2(SEQ ID NO:13)。
在另一个方面，如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
具体地说，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，其中Fab重链在C末端与Fc结构域中的CH2结构域的N末端融合，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个另外的方面，Fc结构域为IgG，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。更具体地说，Fc结构域为IgG1 Fc结构域。在一个特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基联合的修饰。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc结构域修饰
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，其每个亚基包含IgG重链恒定结构域CH2和CH3。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定联合。
Fc结构域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面，该Fc基本上不与Fc受体结合和/或不诱导效应器功能。在一个特定方面，该Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，该Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面，该Fc受体是激活性人Fcγ受体，更具体地说是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地说是人FcγRIIIa。在一个方面，该Fc结构域不诱导效应器功能。降低的效应器功能可以包括但不限于以下一者或多者：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌减少、免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取减少、与NK细胞的结合减少、与巨噬细胞的结合减少、与单核细胞的结合减少、与多形核细胞的结合减少、直接信号转导诱导性细胞凋亡减少、降低的树突细胞成熟、或减少的T细胞引发。
在某些方面，可以在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置上含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，在Fc结构域的两个亚基的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸突变。具体地说，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、N297、P331和P329(EU编号)处的氨基酸替代。具体地说，Fc结构域包含在IgG重链的位置234和235(EU编号)和/或329(EU编号)处的氨基酸替代。更具体地说，提供了根据本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含具有在IgG重链中的氨基酸替代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸替代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸替代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，并被描述于国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中，该文献还描述了制备这种突变体Fc结构域的方法以及用于确定其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。“EU编号”是指根据Kabat等人在Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中的EU索引的编号。
具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc结构域还包含具有一个或多个Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329的取代的Fc结构域(美国专利No.6,737,056)。这样的Fc突变体包括具有在两个或多个氨基酸位置265、269、270、297和327处的取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被替代为丙氨酸(美国专利No.7,332,581)。
在另一个方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体展现出对Fc受体的降低的结合亲和力和降低的效应器功能。在更具体的方面，Fc结构域是包含在位置S228(Kabat编号)处的氨基酸替代具体地为氨基酸替代S228P的IgG4 Fc结构域。在更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。这样的IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性也描述于WO 2012/130831中。
可以使用本领域熟知的遗传学或化学方法通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变体Fc结构域。遗传学方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以通过例如测序来验证正确的核苷酸变化。
可以例如通过ELISA或通过使用诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的标准仪器的表面等离子体共振(SPR)容易地确定与Fc受体的结合，并且可以例如通过重组表达获得Fc受体。适合的此类结合测定描述于本文中。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化性双特异性抗原结合分子针对Fc受体的结合亲和力。
可以通过本领域已知的方法测量Fc结构域或包含Fc结构域的本发明的双特异性抗体的效应器功能。适合的用于测量ADCC的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其他实例描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等人，Proc.NatlAcad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者，可以采用非放射性测定方法(参见，例如ACTITMnon-radioactivecytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；CytoToxnon-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地，或另外地，可以在体内，例如，在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。
在一些实施方案中，Fc结构域与补体成分特别是C1q的结合减少。因此，在其中将Fc结构域工程化以具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定本发明的双特异性抗体是否能够与C1q结合并因此具有CDC活性。参见，例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
在一个特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基联合的修饰。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。因此，它们包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同模块，所述亚基通常包含在两个不相同的多肽链(“重链”)中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两个多肽的若干可能的组合。为了在重组生产中提高含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的产率和纯度，因此在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域中引入促进期望多肽的联合的修饰将是有利的。
因此，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基的联合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，所述修饰具体地在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述修饰是所谓的“节入穴”修饰，包括在Fc结构域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc结构域的两个亚基的另一个中的“穴”修饰。因此，在一个特定方面，本发明涉及如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包括IgG分子，其中第一重链的Fc部分包含第一个二聚化模块，并且第二重链的Fc部分包含允许IgG分子的两条重链异二聚化的第二个二聚化模块；根据节入穴技术，第一个二聚化模块包括节，第二个二聚化模块包括穴。
“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人Prot Eng9,617-621(1996)and Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”)，使得该突起可以定位在该腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。
因此，在特定方面，在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在第一亚基的CH3结构域内产生可定位于第二亚基的CH3结构域内的腔中的突起；并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸酸残基，由此在第二亚基的CH3结构域内产生可将第一亚基的CH3结构域内的突起定位在其中的腔。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变、或通过肽合成而产生突起和腔。
在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W)，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)。更具体地说，在Fc结构域的第二亚基中，另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(T366S)，将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)。更具体地说，在Fc结构域的第一亚基中，另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C)，而在Fc结构域的第二亚基中，第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步使该二聚体稳定(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个替代方面，促进Fc结构域的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰，例如，如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，这种方法包括通过将两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电氨基酸残基，使得在静电方面不利于同二聚体形成，但在静电方面有利于异二聚化。
CH1/CL结构域的修饰
为了进一步提高正确配对，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以包含不同的带电氨基酸替代(所谓的“带电残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉CH1和CL结构域中。在一个特定方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在CL结构域之一中在位置123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，其中在CH1结构域之一中在位置147(EU编号)和在位置213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。
更具体地说，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近TNF配体家族成员的CL结构域中，在位置123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，并且其中在邻近TNF配体家族成员的CH1结构域中，在位置147(EU编号)和在位置213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。
特定的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第一肽在其C末端通过第二肽接头与第二重链或轻链融合，和第二肽，其包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域，所述第二肽通过第三肽接头在其C末端对应地与第二轻链或重链融合。
在一个另外的方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CH1结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CL结构域融合。
在又另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CL结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CH1结构域融合。
在一个另外的方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的VH结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的VL结构域融合。
在一个方面，本发明提供了权利要求21至23的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近TNF配体家族成员的CL结构域中，在位置123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，并且其中在邻近TNF配体家族成员的CH1结构域中，在位置147(EU编号)和在位置213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。这些修饰产生了具备有利特性的所谓的带电残基，以避免不希望的结果，例如错配。
此外，提供了如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是FAP
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12或SEQID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合FAP的Fab分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合FAP的Fab分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，能够与FAP特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，能够与FAP特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:106的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链，或包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：由SEQ ID NO:106的氨基酸序列组成的VH结构域和由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成的VL结构域。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:106的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:106的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CH1结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CL结构域融合，并且其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在一个另外的特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，并且其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，并且其中所述分子包含：(i)包含包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
更具体地说，提供了包含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，其中所述第一重链包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域，并且所述第一轻链包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域，和
(b)第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，其中第二重链包含SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:173的氨基酸序列，第二轻链包含SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:174的氨基酸序列。具体地说，第二重链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列，第二轻链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。
此外，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
更具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的第二轻链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第二重链的分子；
f)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的第二轻链的分子；
g)包括包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
h)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的第二轻链的分子；
i)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
j)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的第二轻链的分子；
在另一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中TNF配体家族成员是OX40L并且其中靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)，并且其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7或SEQID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ IDNO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:355的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的第二轻链。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CD19
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CD19。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:253的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:249的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合CD19的Fab分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:196的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合CD19的Fab分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:249的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ IDNO:250的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，能够与CD19特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:201的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:202的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个另外的方面，能够与CD19特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:357的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:358的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:201的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:201的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:357的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:357的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CH1结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CL结构域融合，并且其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ IDNO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在一个另外的特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，并且其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，并且其中所述分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
此外，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
更具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链，或
(iv)包含SEQ ID NO:313的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CEA
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CEA。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合CEA的Fab分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:322的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，能够与CEA特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:327的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:328的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与CEA特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:327的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:328的氨基酸序列的可变轻链。
在一个另外的方面，能够与CEA特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:329的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:330的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与CEA特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:329的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的可变轻链。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:329的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:329的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CH1结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CL结构域融合，并且其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在另外的特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，并且其中所述分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
此外，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
更具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:341的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:341的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
多核苷酸类
本发明进一步提供了编码如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸或其片段。
编码本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表述为编码整个抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其他手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由与免疫球蛋白的重链部分分开的多核苷酸编码。重链多肽将在共表达时与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。
在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文中描述的根据本发明的完整的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。具体地说，分离的多核苷酸编码包含在如本文中描述的根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的多肽。
在一个方面，本发明涉及编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的多肽的序列。
在另一个方面，提供了编码含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的4-1BB的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含4-1BB的一个胞外域或其片段的多肽的序列。
在一个另外的方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含两个4-1BBL片段的多肽的序列，所述两个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:96所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列，并且涉及包含编码包含一个4-1BBL片段的多肽的序列，所述一个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:96所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列。
此外，提供了编码含有OX40配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的OX40L的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含OX40L的一个胞外域或其片段的多肽的序列。
在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含两个4-1BBL片段的多肽的序列，所述两个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列，并且涉及包含编码包含一个4-1BBL片段的多肽的序列，所述一个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明涉及包含与本文中公开的特异性cDNA序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的序列的多核苷酸。在一个特定方面，本发明涉及包含与本文中公开的特异性cDNA序列之一相同的序列的多核苷酸。
在其他方面，核酸分子包含或其组成为编码在SEQ ID NO:5、6、97、98、99、183、184或185任一者中提出的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个另外的方面，核酸分子包含或其组成为编码在SEQ ID NO:14、15、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173或174任一者中提出的氨基酸序列的核苷酸序列。
还在其他方面，核酸分子包含或其组成为核苷酸序列SEQ ID NO:66、67、68、69、129、130、131、132、133、134、137、138、141、142、143、144、146、147、150、151、152、153、162、163、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、203、204、207、208、211、212、215、216、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、307、308、311、312、315、316、331、332、335、336、339、340、343、344、347、348、353或354。
在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如呈信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。对于重组生产，分离一个或多个编码例如上文所述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸，并将其插入到一个或多个载体中用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离这样的多核苷酸并将其测序。在本发明的一个方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体，优选表达载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建包括含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如描述于Maniatis等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括将编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即，编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件以可操作地关联的方式克隆到其中的表达盒。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但如果存在的话，它可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。在单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如，在单独的(不同的)载体上可以存在两个或更多个编码区。此外，任何载体可以包含单个编码区，或者可以包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一个或多个多肽，其通过蛋白水解切割在翻译后或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作地关联是指这样一种方式：基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调节序列相关联以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则所述两个DNA片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，则启动子区与该核酸可操作地关联。启动子可以是仅在预定细胞中指导实质性DNA转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻抑物和转录终止信号，可与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。
本文中公开了适合的启动子和其他转录控制区。许多转录控制区是本领域中的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α珠蛋白的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括诸如复制起点的其他特征、和/或诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的染色体整合元件。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌肽或信号肽的编码区相关联，所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果希望分泌含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段，则编码信号序列的DNA可以位于编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链输出穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的N末端融合的信号肽，其被从翻译的多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用了天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽、或该序列的功能衍生物，所述衍生物保留了指导与其可操作地相关联的多肽分泌的能力。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以替代为人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列。
编码可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的一个另外的方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别掺入关于核苷酸和载体的单一或组合地在本文中描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的(一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。可以使用特定的表达载体适当地转染或转导这样的细胞，并且可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的抗原结合分子。适合的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，尤其是在不需要糖基化时，可以在细菌中产生多肽。表达后，可以从菌体糊分离出作为可溶性级分的多肽，并可将其进一步纯化。除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码多肽的载体的适合克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，和Li等人，Nat Biotech24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利Nos.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978、和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是经SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾细胞系(例如，在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977))中描述的293或293T细胞；仓鼠婴肾细胞(BHK)；小鼠sertoli细胞(如在Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞(如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中描述)；MRC 5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于适用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu, Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在这些系统中表达外源基因的标准技术在本领域中是已知的。可以将表达包含免疫球蛋白重链或轻链的多肽的细胞工程化，以便也表达另一个免疫球蛋白链，使得所表达的产物是具有重链和轻链两者的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养在本文中提供的包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段。
在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中，多个组分(能够与靶细胞抗原特异性结合的至少一个模块，一个多肽包含TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，一个多肽包含所述TNF家族配体家族成员的一个胞外域或其片段)在遗传上不彼此融合。多肽被设计成使得其组分(TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段和其他成分如CH或CL)直接地或通过接头序列彼此融合。可以根据本领域熟知的方法测定接头的组成和长度，并且可以测试其效果。本发明的抗原结合分子的不同组分之间的接头序列的实例见本文中提供的序列。如果需要的话，还可以包括另外的序列，例如内肽酶识别序列，以便组入切割位点来分离融合蛋白的各个组分。
在某些实施方案中，形成抗原结合分子的一部分的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块(例如Fab片段)至少包含能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并且自其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane,"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如美国专利No.4,186,567中所述)，或者可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库而获得(参见授予McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
任何动物物种的免疫球蛋白都可用于本发明。可用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类、或人来源的。如果预期融合蛋白用于人类使用，则可以使用免疫球蛋白的嵌合形式，其中免疫球蛋白的恒定区域来自人。还可以根据本领域熟知的方法制备免疫球蛋白的人源化或完全人形式(参见例如授予Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法来实现，包括但不限于(a)将非人(例如，供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)框架和具有或不具有关键框架残基(例如，对于保留良好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)保留的恒定区，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)移植到人框架和恒定区，或(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基用类似于人的区段将其“遮盖”。人源化抗体及其制备方法综述于，例如，Almagro和Fransson,Front Biosci13,1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；Jones等人，Nature321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”办法)。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并且可以从其衍生(参见，例如，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区还可以通过向转基因动物施用免疫原加以制备，所述转基因动物已经被修饰以产生响应抗原攻击的完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见，例如，Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列来产生人抗体和人可变区(参见，例如，Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人，Nature348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式展示抗体片段。
在某些方面，根据例如PCT公开WO 2012/020006(参见有关亲和力成熟的实例)或美国专利申请公开No.2004/0132066中公开的方法，将包含在本发明的抗原结合分子中的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块(例如Fab片段)工程化，以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子与特异性抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如，表面等离子体共振技术(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000)))和传统结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。可使用竞争测定法鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参考抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子所结合的表位作图的详细的示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。在示例性竞争测定中，将固定抗原在包含与抗原结合的第一经标记的抗原结合分子和第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育，测试第二未标记的抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原的能力。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定抗原在包含第一颈标记的抗原结合分子但不包含第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育之后，除去过量未结合的抗体，并测量与固定抗原结合的标记物的量。如果在测试样品中与固定抗原结合的标记物的量相对于对照样品显著降低，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等来纯化如本文中描述制备的本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用与含有TNF配体三聚体的抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，为了本发明的融合蛋白的亲和色谱法纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以基本上如实施例中描述依次使用蛋白A或G亲和色谱法和尺寸排阻色谱法分离抗原结合分子。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种加以测定，包括凝胶电泳、高压液相色谱法等。例如，正如通过还原和非还原性SDS-PAGE证实，如通过实施例中描述表达的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子被显示为是完整且正确组装的。
测定法
可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定、筛选或通过其物理/化学性质和/或生物活性来表征在本文中提供的抗原结合分子。
1.亲和力测定
根据实施例中提出的通过表面等离子体共振(SPR)的方法，使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)、以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，可以测定在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的TNF受体的亲和力。通过表面等离子体共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)、以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，也可以测定含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与靶细胞抗原的亲和力。在实施例4中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。根据一个方面，使用T100仪(GE Healthcare)通过表面等离子体共振在25℃测量KD。
2.结合测定和其他测定
例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，可以评价在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的受体表达细胞的结合。在一个方面，在结合测定中使用表达TNF受体的新鲜外周血单核细胞(PBMC)。在分离后(幼稚PMBC)或刺激后(活化的PMBC)直接使用这些细胞。在另一个方面，使用活化的小鼠脾细胞(表达TNF受体分子)来证明本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的TNF受体表达细胞的结合。
在一个另外的方面，使用表达靶细胞抗原(例如FAP)的癌细胞系来证明抗原结合分子与靶细胞抗原的结合。
在另一个方面，可以使用竞争测定来鉴定与特异性抗体或抗原结合分子分别竞争结合靶标或TNF受体的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与特异性抗靶标抗体或特异性抗TNF受体抗体结合的相同。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。
3.活性测定
在一个方面，提供了用于鉴定与特异性靶细胞抗原和具有生物活性的特异性TNF受体结合的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的测定法。生物活性可以包括例如通过表达靶细胞抗原的细胞上的TNF受体的激动性信号转导。还提供了通过测定法鉴定为具有这样的体外生物活性的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在某些方面，测试了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的这种生物活性。用于检测本发明分子的生物活性的测定法是实施例6中所述的那些。此外，用于检测细胞裂解的测定法(例如通过测量LDH释放)、诱导的凋亡动力学(例如通过测量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用TUNEL测定)是本领域熟知的。另外，可以通过评估复合物对各种淋巴细胞亚群如NK细胞、NKT细胞或γδT细胞的存活、增殖和淋巴因子分泌的影响，或评估其调节抗原呈递细胞如树突细胞、单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力来评估此类复合物的生物活性。
药物组合物、制剂和给药途径
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的药物组合物，以供例如在任何下列治疗方法中使用。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种另外的例如如下文所述的治疗剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。短语“药学的或药学上可接受的”是指在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物，即在适当施用于动物时例如人时不产生不利的、过敏的或其他不良的反应。根据本公开内容，包含至少一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，Mack PrintingCompany,1990所例示，通过提述将其并入本文。具体地说，组合物是冻干制剂或水溶液。如本文中使用的，正如本领域普通技术人员已知，“药学上可接受的赋形剂”包括溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂中任一种和全部及其组合。
肠胃外组合物包括通过注射给药而设计的那些，例如皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射。为了注射，可以将本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制在水溶液中，优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，融合蛋白在使用前可处于粉末形式以与适合的载体(例如无菌无热原水)组构。根据需要，通过将在适当溶剂中的本发明融合蛋白以所要求的量并入下文列举的多种其他成分中来制备无菌注射溶液。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和/或其他成分。在用于制备无菌注射溶液，悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，从而产生来自其先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何其他期望的成分的粉末。必要时应该适当缓冲该液体介质并且在注射之前首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。在制造和储存条件下该组合物必须是稳定的，并且保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解，内毒素污染应该最低限度地保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可含有增加该悬液粘度的化合物，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。另外，这些活性化合物的悬液可制备为适当的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如ethyl cleats或甘油三酯)、或脂质体。
可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品的形式，例如薄膜、或微胶囊。在特定实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，可延长注射组合物的吸收。
本文中的示例性药学上可接受的赋形剂还包括诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)的间质药物分散剂，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rHuPH20的某些示例性的sHASEGP和使用方法。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体配制剂描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一种配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
除前述组合物之外，融合蛋白还可配制为贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此，例如，融合蛋白可以用适合的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如微溶盐。
包含本发明融合蛋白的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干过程进行制造。可以使用有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。适当的配制剂取决于所选择的给药途径。
可以将含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如由蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如盐酸或磷酸形成的那些，或与诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。与相应的游离碱形式相比，药物盐在水性溶剂和其他质子溶剂中的溶解度更高。
在被治疗的特殊适应症需要时，本文中的组合物还可含有一种以上的活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。这样的活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。
用于体内给药的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。
治疗方法和组合物
本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子均可在治疗方法中使用。
为了在治疗方法中使用，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体紊乱、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、紊乱的原因、药剂的递送部位、给药方法、给药方案、以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，提供了用作药剂的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在另外的方面，提供了在治疗疾病中使用尤其是在癌症治疗中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面，提供了在治疗方法中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面，本发明提供了在治疗患有疾病的个体的方法中使用的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述方法包括向个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。癌症的实例包括实体瘤、膀胱癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肾癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。因此，提供了在癌症治疗中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更具体地说是人。
在另一个方面，提供了用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个另外的方面，提供了用于治疗自身免疫病例如狼疮病的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在一个方面，提供了根据本发明的用于治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳腺癌、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌(PAC)、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和间皮瘤的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原为FAP。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂中的用途。在一个方面，所述药剂用于在治疗疾病的方法中使用，所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药剂。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性紊乱，具体地是癌症。因此，在一个方面，本发明涉及本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症的药剂中的用途。癌症的实例包括实体瘤、膀胱癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肾癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。可以使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进行治疗的其他细胞增殖紊乱包括但不限于位于腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾脏、胸部、和泌尿生殖系统的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员可以认识到，在一些情况下，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可能不能提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些方面，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此，在一些方面，提供生理变化的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。
在一个另外的方面，本发明涉及如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染或治疗自身免疫病例如狼疮病的药剂中的用途。
在一个另外的方面，本发明提供了治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面，向所述个体施用呈药学上可接受的形式的包含本发明融合蛋白的组合物。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性紊乱。在一个特定方面，该疾病是癌症。在另一个方面，该疾病是感染性疾病或自身免疫病。在某些方面，该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如果待治疗的疾病是癌症，则为抗癌剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选人。
为了预防或治疗疾病，本发明的含有TNF家族配体三聚体抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、给药途径、患者的体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和病程、给予融合蛋白是用于预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床病史、和对融合蛋白的反应、和主治医师的决定。在任何情况下，负责给药的医师将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文中考虑到各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药、推注给药和脉冲输注。
一次性地或以一系列治疗的方式适当地向患者施用含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或多次分开给药，还是通过连续输注。取决于上面提到的因素，一个典型的日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于数天或更长时间的反复给药，根据病情，治疗通常将持续到出现期望的疾病症状的抑制时为止。融合蛋白的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他实例中，剂量还可以包含每次给药从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重、至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在本文中所列数字的可推导范围的实例中，可以基于上述数字以约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等范围进行施用。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周一次(例如使得患者接受约2个至约20个，或例如约6个剂量的融合蛋白)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测这种疗法的进展。
通常以有效实现预期目的的量使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。为了用于治疗或预防疾病状况，以治疗有效量施用或应用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在根据本文中提供的详细公开内容的情况下。
对于全身给药，可以根据体外测定法(例如细胞培养物测定法)初步估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC50在内的循环浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人的剂量。
也可以使用本领域熟知的技术根据体内数据(例如，动物模型)估计初始剂量。根据动物数据，本领域普通技术人员可以容易地优化对人的给药。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的血浆水平。通常注射给药的患者剂量通常为约0.1至50mg/kg/天，一般为约0.5至1mg/kg/天。可以通过每天施用多个剂量来实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部给药或选择性吸收的情况下，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。
本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定融合蛋白的毒性和治疗效果。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，它可以被表示为比率LD50/ED50。表现出较大治疗指数的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中，根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适合于在人类中使用的剂量范围中加以使用。剂量优选地处在循环浓度范围内，其包括具有很小或没有毒性的ED50。取决于多种因素，例如采用的剂型、所用给药途径、受试者的状况等，剂量可以在这个范围内变化。考虑到患者的状况，个体医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量(参见，例如Fingl等人，1975,in:The Pharmacological Basis ofTherapeutics,Ch.1,p.1，通过提述将其完整并入本文)。
用本发明的融合蛋白治疗患者的主治医师知道如何并且何时由于毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调整给药。相反，如果临床反应不足(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在感兴趣紊乱的管理中，施用剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、给药途径等而变化。可以例如部分地通过标准预后评价方法来评价病症的严重程度。此外，剂量和剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。
其他药剂和治疗
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其他药剂联合给药。例如，本发明融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。术语“治疗剂”涵盖可用于治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这种另外的治疗剂可包含任何适合于被治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。在某些实施方案中，另外的治疗剂是另一种抗癌剂。
此类其他药剂以对预期目的有效的量适当地组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量、紊乱或治疗的类型、以及以上讨论的其他因素。通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以在经验/临床上确定为适当的任何剂量并通过任何途径使用含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
上述此类联合疗法涵盖联合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在同一个或分开的组合物中)和分开给药，在分开给药的情况下，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的给药可以发生在给予另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后。
制品
在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述紊乱的物质的制品。制品包括容器和标签或在容器上或与容器相关联的包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器容纳组合物本身或连同另一种有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。
标签或包装说明书指示该组合物用于治疗选择的病症。而且，制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性治疗剂或其他治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装说明书。
替代地或另外，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括立足于商业和用户立场所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表C(序列)：
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关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗体链的氨基酸根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))根据EU编号系统如上文定义进行编号和参考。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，根据上面提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook等人在Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York,1989中所述。按照制造商的说明使用分子生物试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Ed.,NIH公开No91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
使用适当的模板通过PCR生成或由Geneart AG(Regensburg,Germany)从合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动基因合成来合成期望的基因区段。在没有可用的确切基因序列的情况下，基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从源自适当组织的RNA分离基因。将侧翼为单个限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化质粒DNA，并通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有适合的限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到对应的表达载体中。所有构建体均被设计为具有编码前导肽的5'端DNA序列，所述前导肽靶向在真核细胞中分泌的蛋白质。
细胞培养技术
使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(eds.),John Wiley&Sons,Inc.中所述的标准细胞培养技术。
蛋白质纯化
参考标准方案，从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体应用于蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8实现抗体的洗脱，然后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS或在20mM组氨酸、150mM NaCl(pH 6.0)中从单体抗体分离聚集的蛋白质。合并单体抗体级分，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩机进行浓缩(如果需要的话)，在-20℃或-80℃冷冻并储存。提供部分样品用于随后例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱法(SEC)或质谱法进行蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。具体地说，使用10％或4-12％的/>Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和/>MES(还原凝胶，具有/>抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
分析尺寸排阻色谱法
通过HPLC色谱法进行尺寸排阻色谱法(SEC)，用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之，将蛋白A纯化的抗体应用于在Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7.5)中的Tosoh TSKgel G3000SW柱上，或者在Dionex HPLC系统上的2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。通过UV吸光度和峰面积的积分将洗脱的蛋白质定量。以BioRad凝胶过滤标准151-1901作为标准。
质谱法
本节描述了具有VH/VL交换(VH/VL CrossMabs)的多特异性抗体的表征，重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整CrossMabs和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/限制性LysC消化的CrossMabs的电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析预期的一级结构。
在37℃、以1mg/ml的蛋白质浓度将VH/VL CrossMabs用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F进行去糖基化达17个小时。用Tris缓冲液(pH 8)中的100μg去糖基化的VH/VLCrossMabs，分别在室温下进行120小时和在37℃、进行40分钟的纤溶酶或限制性LysC(Roche)消化。在进行质谱分析之前，将样品通过HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在装备有TriVersa NanoMate来源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(BrukerDaltonik)上，通过ESI-MS测定总质量。
使用表面等离子体共振(SPR)(BIACORE)测定多特异性抗体与相应抗原的结合以及结合亲和力
使用BIACORE仪(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)，通过表面等离子体共振来研究所生成的抗体与相应抗原的结合。简言之，为了亲和力测量，将山羊抗人IgG，JIR 109-005-098抗体通过胺偶联固定在CM5芯片上，以显现针对相应抗原的抗体。在25℃(或者37℃)的HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％吐温20，pH 7.4))中测量结合。加入不同浓度的抗原(R&D Systems或内部纯化的)溶液。通过80秒至3分钟的抗原注射来测量结合；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量解离，并且使用1:1Langmuir结合模型估计KD值。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以便校正系统固有的基线漂移和校正噪声信号降低。使用相应的Biacore评估软件进行传感图的分析和亲和力数据的计算。
实施例1
1.1靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P41273序列(SEQ ID NO:42)，合成了编码人4-1BB配体的胞外域部分(氨基酸71-254、52-254和80-254)的DNA序列的不同片段。
关于组装含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的组分，克隆了包含被(G4S)2接头分开并与人IgG1-CH1或CL结构域融合的4-1BB配体的两个胞外域的多肽，如图1A中描绘的(人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1或CL)，或如图1C中描绘的(人CH3、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体)。
克隆了包含4-1BB配体的一个胞外域并与人IgG1-CL或CH1结构域融合的多肽，如图1B中描绘的(人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL或CH1)，或如图1D中描绘的(人CH3、(G4S)2接头、人4-1BB配体)。
将多肽与人IgG1重链CH2和CH3结构域以及任选的肽接头进行框内亚克隆，例如对于构建体1，使用接头SEQ ID NO:13的(G4S)2或SEQ ID NO:57的(GSPGSSSSGS)，将编码与人CH1结构域融合的二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)特异的结合剂(即28H1)的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链(Carter,J.Immunol.Methods(2001),248,7-15)或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
表1总结了所产生的构建体的特征。构建体1至10在以下方面不同：其几何形状、FAP的效价、4-1BB配体胞外域、CH1和CL结构域的交换(CrossMab技术)、在CH1和CL结构域中的突变以及包含4-1BB配体的一个胞外域的多肽(单体4-1BBL链)中的不同肽接头。
表1：产生的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子(FAP分拆的4-1BBL三聚体)的特征
为了避免错配，在大多数构建体中，一对CH1和CL结构域被彼此替换(结构域交换)，如WO 2009/080253 A1中所述。
为了进一步提高正确的配对，在交叉或非交叉的CH1和CL结构域中引入不同的带电氨基酸替代，作为构建体2至4和6至10中的带电残基。在人CL结构域中引入突变E123R和Q124K，而将突变K147E和K213E克隆到人CH1结构域中。
对于所有构建体，使用了节入穴异源二聚化技术，其中在节链的CH3结构域中具有S354C/T366W突变，并在穴链的CH3结构域中具有相应的Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
例如，在构建体1中，在第一CH3结构域中含有S354C/T366W突变的配体-Fc节链与在第二CH3结构域中含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP的Fab(图2，曲线图1.1)。
表2显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体1.1)的cDNA和氨基酸序列。
表2：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.1的序列
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表3显示了具有CH1-CL交换和带电残基的单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体1.2)的cDNA和氨基酸序列。
表3：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.2的序列
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表4显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.3(FAP分拆三聚体，其具有在抗FAP Fab中的CH1-CL交换和在含4-1BBL链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表4：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.3的序列
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表5显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.4(FAP分拆三聚体，其具有抗FAP、与CH1-节链融合的单体4-1BB配体和在含4-1BBL链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表5：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.4的序列
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表6显示了二价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.5(FAP分拆三聚体，其具有2个抗FAP、分别在每条重链的C末端融合的二聚体和单体的4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表6：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.5的序列
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表7显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.6(FAP分拆三聚体，其具有抗FAP、经由(G4S)接头与CL*融合的单体4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表7：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.6的序列
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表8显示了二价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体7(FAP分拆三聚体，其具有在Fc穴链的N末端上的抗FAP双抗、与4-1BBL配体融合的在交叉CH1和CL上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表8：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.7的序列
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表9显示了二价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.8(FAP分拆三聚体，其具有与抗FAP CrossFab融合的4-1BB配体，具有在节链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表9：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.8的序列
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表10显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体(52-254)三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.9(FAP分拆三聚体，其具有4-1BB胞外域氨基酸52-254和在配体链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表10：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.9的序列
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表11显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体(80-254)三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.10(FAP分拆三聚体，其具有4-1BB胞外域氨基酸80-254和在配体链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表11：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体10的序列
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1.2FAP(28H1)靶向的分拆三聚体4-1BB配体Fc融合构建体的产生
将靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。对于构建体1、2、3、4、6、7、8、9、10，用1:1:1:1比率的相应表达载体(例如“二聚体配体-(CH1或CL)-节链载体”:“单体配体融合(CL或CH1)载体”:“抗FAP Fab穴重链载体”:“抗FAP轻链载体”)转染细胞。对于二价构建体5，使用1:1:1的比率(“穴重链载体”:“节重链载体”:“抗FAP轻链载体”)。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，加入12％的补料7和葡萄糖(终浓度3g/L)。培养7天后，通过在400x g下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GEHealthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTMSafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表12总结了FAP靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表12：FAP(28H1)靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的生物化学分析
1.3靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
与靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子相似，制备了鼠FAP靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子。
根据Uniprot数据库的Q3U1Z9-1序列(SEQ ID NO:70)，合成了编码鼠4-1BB配体的胞外域部分(氨基酸104-309)的DNA序列。对于构建M.1，通过标准PCR方法将位置137、160和246的半胱氨酸突变为丝氨酸，而对于构建体M.2，将位置160的半胱氨酸突变为丝氨酸(C160S)。
按照人4-1BBL所述组装鼠配体，如图3A和3B描绘。将由(G4S)2接头分开的二聚体4-1BBL与鼠IgG1-CL结构域融合(图3A)，并将单体4-1BBL与鼠IgG1-CH结构域融合(图3B)。将与鼠CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与鼠IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆来构造构建体，如图3C描绘。
对于鼠构建体，将突变Lys392Asp和Lys409Asp(DD)引入到含有鼠4-1BBL的重链中，并且将突变Glu356Lys和Asp399Lys(KK)引入到含有抗FAP Fab的重链中，从而获得不对称分子(Gunasekaran K.等人，J Biol.Chem.,2010,Jun 18；285(25):19637-46)。
将突变Asp265Ala和Pro329Gly(DAPG)引入到重链的恒定区中以消除与Fcγ受体的结合。
表13分别显示了FAP靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体M.1的cDNA和氨基酸序列。
表13：FAP靶向的鼠构建体M.1的序列
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表14分别显示了非靶向的(DP47)含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子对照M.1的cDNA和氨基酸序列。
表14：非靶向的鼠对照M.1的序列
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表15显示了FAP靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体M.2的cDNA和氨基酸序列。
表15：FAP靶向的鼠构建体M.2的序列
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表16显示了DP47非靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体对照M.2的cDNA和氨基酸序列。
表16：FAP靶向的鼠对照M.2的序列
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如前文中对于人4-1BBL构建体的描述，产生和纯化含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子。
表17总结了FAP靶向的和非靶向的含有鼠4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表17：FAP靶向的和非靶向的含有鼠4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的产生的总结。
1.4非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备和纯化
如上对于FAP靶向的构建体1和2所述制备了对照分子，唯一的区别是抗FAP结合剂(VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照。对照是非靶向的单价的分拆三聚体人4-1BB配体Fc(kih)(对照A，图5A)，对于对照B，构建体还含有具有带电残基的CH-CL交换(图5B)。将FAP结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区用种系对照(DP47)的可变区替换，并与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
如上文对于FAP靶向的构建体的描述，产生非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。用1:1:1:1比率的相应表达载体(“二聚体配体-CH1或CL*-节链载体”:“单体配体融合-CL或CH1*载体”:“DP47 Fab穴链载体”:“DP47轻链载体”)转染细胞。
表18分别显示了DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子对照A的cDNA和氨基酸序列。
表18：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体)对照A的序列
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表19显示了DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列，所述抗原结合分子具有CH4-CL交换和在含有4-1BB配体的臂中的带电残基(对照B)。
表19：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体)对照B的序列
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表20总结了DP47非靶向的含有4-1BB三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表20：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照分子)的生产特征。
实施例2
2.1 FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P41273序列(SEQ ID NO:42)，合成了编码人4-1BB配体的胞外域部分(氨基酸71-254和71-248)的DNA序列的不同片段。
2.1.1具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.1)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。
将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
使用接头(G4S)2或备选(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，将突变K147E和K213E克隆到人CH1结构域中。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
对于所有构建体，使用了节入穴异源二聚化技术，其中在节链中具有S354C/T366W突变，并在穴链中具有相应的Y349C/T366S/L368A/Y407V突变。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP的Fab(图4，构建体2.1)。
表21显示了含有CH1-CL交换和带电残基的单价的FAP(4B9)-人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.1)的cDNA和氨基酸序列。
表21：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建体2.1的序列
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2.1.2具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.2)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。
将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
使用接头(G4S)2或备选地(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合(WO 2012/130831)。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP的Fab(图4，构建体2.2)。
表22显示了无带电残基的含有CH1-CL交换的单价的FAP(4B9)-人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.2)的cDNA和氨基酸序列。
表22：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建体2.2的序列
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2.1.3二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.3)的制备，所述抗原结合分子在每条重链的C末端具有二聚体和单体的4-1BB配体
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图1C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图1D描述：人IgG1Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
使用(G4S)2接头，在穴(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域的C末端将编码二聚体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。使用(G4S)2接头，在节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域的C末端将编码单体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节、或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗FAP huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗FAP huIgG1节单体配体链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合FAP的Fab(图4，构建体2.3)。
表23显示了二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体2.3(FAP分拆三聚体，其具有2个抗FAP、分别在每条重链的C末端融合的二聚体和单体的4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表23：二价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建体2.3的序列
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2.1.4具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.4)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
使用接头(G4S)2或备选地(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP的Fab(图4，构建体2.4)。
表24显示了具有带电残基的含有CH1-CL交换的单价的FAP(4B9)-人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.4)的cDNA和氨基酸序列。
表24：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建体2.4的序列
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2.1.5具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.5)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
使用接头(G4S)2或备选地(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP的Fab(图4，构建体2.5)。
表25显示了无带电残基的含有CH1-CL交换的单价的FAP(4B9)-人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.5)的cDNA和氨基酸序列。
表25：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建体2.5的序列
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2.1.6二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.6)的制备，所述抗原结合分子在每条重链的C末端具有二聚体和单体的4-1BB配体
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图1C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图1D描述：人IgG1Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
使用(G4S)2接头，在穴(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域的C末端将编码二聚体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。使用(G4S)2接头，在节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域的C末端将编码单体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节、或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗FAP huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗FAP huIgG1节单体配体链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合FAP的Fab(图4，构建体2.6)。
表26显示了二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体2.6(FAP分拆三聚体，其具有2个抗FAP、分别在每条重链的C末端融合的二聚体和单体的4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表26：二价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建体2.6的序列
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2.2非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备
如上述实施例1.4对于对照A和B所述制备另外的对照分子。类似于二价构建体2.3和2.6制备二价变体对照C，类似于构建体2.5(含有4-1BB配体(71-248)三聚体)制备单价变体对照物E，唯一不同之处在于，抗FAP结合剂(VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照。
表27显示了二价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合分子对照C的cDNA和氨基酸序列。表28显示了单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合分子对照E的cDNA和氨基酸序列。
表27：二价的DP47非靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子对照C的序列
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表28：单价的非靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子对照E的序列
2.3作为对照F的非靶向人IgG1的制备
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831中描述的方法，在测定法中使用的另外的对照分子为非靶向的DP47、种系对照、含有Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变的人IgG1，以消除与Fcγ受体的结合。
表29显示了非靶向的DP47 huIgG1 PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列。
表29：非靶向的DP47 huIgG1(对照F)的序列
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2.4单价和二价的FAP(28H1)靶向的分拆三聚体4-1BB配体Fc融合构建体和对照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物。用相应的表达载体转染细胞。对于构建体2.1、2.2、2.4和2.5以及相应的对照分子，使用1:1:1:1的比率(例如“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合CH1载体”:“抗FAP Fab穴链载体“:”抗FAP轻链载体“)。对于构建体2.3和2.6及其对照分子，采取1:1:1的比率(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗FAP轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，加入12％的补料7和葡萄糖(终浓度3g/L)。培养7天后，通过在至少400x g下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm 过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化靶向和非靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子和人IgG1，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTMSafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表30总结了FAP（4B9）靶向和非靶向的含有4-1BB配体三聚体的
Fc(kih)融合抗原结合分子和对照分子的产率和最终单体含量。
表30FAP(4B9)靶向和非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子和对照分子的生物化学分析
实施例3
4-1BB的制备、纯化和表征
将编码人、小鼠或食蟹猴4-1BB(表31)的胞外域的DNA序列与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant et al.,1998)。在抗原胞外域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。将用于定向生物素化的Avi标签引入抗原-Fc节的C末端。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链的组合允许产生异二聚体，其包括单拷贝的含有4-1BB胞外域的链，从而产生单体形式的Fc连接的抗原(图5C)。表32显示了抗原Fc融合构建体的cDNA和氨基酸序列。
表31：抗原胞外域(ECD)的氨基酸编号及其起源
SEQ ID NO: 构建体 起源 ECD
83 人4-1BB ECD 根据Q07011合成 aa 24-186
84 食蟹猴4-1BB ECD 从食蟹猴血中分离 aa 24-186
85 鼠4-1BB ECD 根据P20334合成 aa 24-187
表32：单体抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列
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将所有4-1BB-Fc-融合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA信号序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
为了制备生物素化的单体抗原/Fc融合分子，用编码融合蛋白的两种成分(节链和穴链)的三个载体以及生物素化反应所必需的酶BirA共转染指数生长的悬液HEK293 EBNA细胞。以2:1:0.05的比率使用相应的载体(“抗原ECD-AcTEV-Fc节”:“Fc穴”:“BirA”)。
为了在500ml摇瓶中生产蛋白质，在转染前24小时接种4亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，细胞在210g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。将表达载体重悬于含有200μg载体DNA的20mL的CD CHO培养基中。加入540μL聚乙稀亚胺(PEI)后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17培养基，将细胞培养24小时。该生产培养基补充有5μM几夫碱(kifunensine)。转染后1天，向培养物中加入1mM丙戊酸和7％的含有补充剂的补料1。培养7天后，通过将细胞在210g下离心15分钟收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用40mL的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.5)平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的含有20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠的缓冲液(pH7.5)洗涤除去未结合蛋白质。使用在20个柱体积的20mM柠檬酸钠、0.01％(v/v)吐温20(pH 3.0)上产生的氯化钠的线性pH梯度(0至500mM)洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20(pH 3.0)洗涤。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
为了测定人受体的亲和力，还将人4-1BB的胞外域与avi(GLNDIFEAQKIEWHE)和六组氨酸标签进行框内亚克隆。
如上对Fc融合蛋白所描述进行蛋白质生产。通过螯合色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。第一个色谱步骤在20mM磷酸钠、500nM氯化钠(pH7.4)中平衡的NiNTA Superflow Cartridge(5ml,Qiagen)上进行。通过施加超过12个柱体积的5％到45％梯度的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、500nM氯化钠、500mM咪唑，pH7.4)的洗脱缓冲液进行洗脱。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 75柱(GE Healthcare)上(表33)。
表33：单体人4-1BB His分子的序列
实施例4
通过表面等离子体共振对FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物化学表征
通过表面等离子体共振(SPR)评估FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与重组4-1BB的结合所有SPR实验均在25℃、在Biacore T100上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。
如下所述测定FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与重组4-1BB(人、食蟹猴和鼠)之间的相互作用的亲合力。数据表明，靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子以及DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子两者都与人和食蟹猴4-1BB具有相当的亲合力，但与鼠同源物的亲合力可忽略不计。
使用标准偶联指导(Biacore,Freiburg/Germany)将重组生物素化的人、食蟹猴和鼠4-1BB Fc(kih)融合分子直接偶联在SA芯片上。固定化水平为约30RU。使FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子或DP47非靶向的对照以0.39至200nM的浓度范围以30μL/分钟的流速经120秒通过流动池。监测解离180秒。通过减去在空的参考流动池上获得的响应来校正本体折射率的差异。
对于亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，在pH 5.0的CM5芯片上进行约7200个共振单位(RU)的抗人Fc特异性抗体的直接偶联。在流动池2上以30μl/min的流速捕获50nM的FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。使人4-1BB-avi-His的稀释系列(1.95至1000nM)以30μl/min在两个流动池上通过180秒来记录结合相。监测解离相180秒，并通过从样品溶液切换到HBS-EP进行触发。在每次循环后，使用10mM甘氨酸-盐酸(pH 2.1)双重注射60秒使芯片表面再生。通过减去在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率的差异。对于含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与hu4-1BB avi His之间的相互作用，通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合曲线，从速率常数推导出亲和常数。
表34：与1:1Langmuir结合的拟合和亲和常数
实施例5
靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
5.1.FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在幼稚的人PBMC与活化的人PBMC上的结合
从Zürich献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC)，用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies，目录号14190 326)稀释血沉棕黄层。向50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)中提供15mL Histopaque 1077(SIGMA LifeScience，目录号10771、聚蔗糖和泛影酸钠，调节至1.077g/mL密度)并且使该稀释的血沉棕黄层溶液在Histopaque 1077上分层。离心管在400x g下离心30分钟。然后从界面收集PBMC，用DPBS洗涤三次，重悬于由RPMI 1640培养基(Gibco by Life Technology，目录号42401-042)组成的T细胞培养基中，所述RPMI 1640培养基补充有10％胎牛血清(FBS,Gibcoby Life Technology,目录号16000-044，批号941273，γ照射的，无支原体且在56℃热灭活35分钟)、1％(v/v)GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies，目录号35050 038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA，目录号S8636)、1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA，目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇(SIGMA，M3148)。
PBMC在分离后直接加以使用或刺激，以便通过在6孔组织培养板中补充有200U/mL普留净(Proleukin)(Novartis Pharma Schweiz AG,CHCLB-P-476-700-10340)和2μg/mLPHA-L(SIGMA目录号L2769)的T细胞培养基中培养4天，然后在37℃和5％CO2下在包被有10ug/mL抗人CD3(克隆OKT3，BioLegend，目录号317315)和2μg/mL抗人CD28(克隆CD28.2，BioLegend，目录号302928)的6孔组织培养板中的T细胞培养基中培养1天而诱导4-1BB在T和NK细胞的细胞表面表达。
为了确定含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子与人PBMC的结合，将0.1x106个幼稚的或活化的PBMC加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔中。将培养板在400x g下在4℃离心4分钟。弃去上清液。然后，将细胞在含有1:1000稀释的用于UV激发的LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit(LifeTechnologies,Molecular Probes,L-23105)或Fixable Viability Dye eF660(eBioscience 65-0864-18)或LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit(LifeTechnologies,Molecular Probes,L-23101)的100μL/孔DPBS中在4℃、在黑暗中染色30分钟。如果使用DAPI作为Live/Death染料，可以跳过这个步骤。用200μL的冷FACS缓冲液(补充有2％(v/v)FBS、5mM EDTA pH8(Amresco，目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-AldrichS2002)的DPBS)将细胞洗涤一次。
然后，加入50μL/孔的含有不同滴定浓度的含4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的4℃冷FACS缓冲液，将细胞在4℃、温育120分钟，用200μL/孔的4℃的FACS缓冲液洗涤四次并重悬。将细胞用50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液进一步染色，所述FACS缓冲液含有0.67μg/mL抗人CD3-PerCP-Cy5.5(克隆UCHT1，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号300430)或0.16μL抗人CD3-PE/Cy7(克隆SP34-2，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号557749，批号33324597)、0.67μg/mL抗人CD45-AF488(克隆HI30，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号304017)或0.12μg/mL抗人CD56-FITC(克隆NCAM16.2，小鼠IgG2bκ，BD Pharmingen，目录号345811)或1μL抗人CD56-APC(克隆B159，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号555518，批号3098894)、0.25μg/mL抗人CD4-BV421(克隆RPA-T4，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号300532)或0.23μg/mL抗人CD4-BV421(克隆OKT4，小鼠IgG2bκ，BioLegend，目录-号317434)、0.25μL抗人CD8a-APC(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号555369)或0.67μL抗人CD8a-APC/Cy7(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号301016)或0.83ng/mL抗人CD8a-BV711(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号301044)和5μg/mLPE缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊IgG F(ab)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109 116 098或109 116170)。用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。如果细胞用可固定活力染料染色，则用含有1％甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)的50μL/孔的DPBS固定细胞。将细胞重悬于FACS缓冲液中，并在次日或当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)或3激光Miltenyi QuantAnalyzer 10(Mitenyi Biotec)和Flow Jo(FlowJo X 10.0.7)收获细胞。如果使用DAPI染色来检测死细胞，则将细胞重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的80μL/孔FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图6所示，FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子不与静息的人CD4+T细胞结合，并且显示没有可检测到的与静息的CD8+T细胞和NK细胞的结合。相比之下，两种构建体都与活化的NK、CD8+或CD4+T细胞强烈结合，不过相对于NK细胞后者表现出低约10倍的特异性荧光强度，相对于CD8+T细胞后者表现出20倍的特异性荧光强度降低。
图7A和7B分别显示了在实施例1中制备的构建体1.1至1.10在表达4-1BB的活化的人CD3+CD8+T细胞和表达4-1BB的活化的人CD3+CD4+T细胞上的结合。表35显示了对构建体1.1至1.10测量的EC50值。
表35：在活化的人CD3+CD8+T细胞和CD3+CD4+T细胞上的结合
图8A和8B分别显示在实施例2中制备的构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6 在来自新鲜人血的CD4+和CD8+T细胞上和在活化的表达4-1BB的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合。设门于活的CD45+CD3+CD4+或CD45+CD3+CD8+T细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgGFcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合变体的滴定浓度进行印迹。表36显示了对构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6测量的EC50值。
表36：在活化的表达4-1BB的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
5.2FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子与活化的小鼠脾细胞的结合
将小鼠脾脏收集在3mL PBS中，并使用gentleMACS管(Miltenyi Biotec目录号130-096-334)和gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)产生单细胞悬液。然后，将脾细胞通过30μm预分离过滤器(Miltenyi Biotec目录号130-041-407)过滤，并在350x g和4℃、离心7分钟。吸出上清液并将细胞重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇和10％青霉素-链霉素(SIGMA，目录号P4333)的RPMI 1640培养基中。以106个细胞/mL在6孔组织培养板上培养2天，所述组织培养板包被有10μg/mL的抗小鼠CD3ε亚美尼亚仓鼠IgG(克隆145-2C11，BioLegend，目录号100331)和2μg/mL的抗小鼠CD28叙利亚仓鼠IgG(克隆37.51，BioLegend，目录号102102)。
收集活化的小鼠脾细胞，在DPBS中洗涤，计数，将0.1x106个细胞转移到非组织培养物处理的U型底96孔板的每个孔中。除去上清液，将细胞在含有1:5000稀释的可固定活力染料eF660(Bioscience，目录号65-0864-18)的100μL/孔的DPBS中在4℃、染色30分钟。用PBS洗涤细胞，并在含有不同浓度的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)、非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)或抗小鼠CD137人IgG1 P329G LALA单抗(克隆Lob.12.3，BioXcell目录号BE0169)的50μL FACS缓冲液中染色。细胞在4℃下温育120分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤四次，并在50μL/孔的FACS缓冲液中在4℃、染色30分钟，所述缓冲液含有10μg/mL纯化的抗小鼠CD16/CD32大鼠IgG-Fc-Block(BD Pharmingen，目录号553142，克隆2.4G2)的、5μg/mL抗小鼠CD8b大鼠IgG2bκ-FITC(BioLegend，目录号126606，克隆YTS156.7.7)、0.67μg/mL抗小鼠CD3大鼠IgG2bκ-APC-Cy7(BioLegend，目录号100222，克隆17A2)、0.67μg/mL抗小鼠CD4大鼠IgG2bκ-PE-Cy7(BioLegend，目录号100422，克隆GK1.5)、2μg/mL抗小鼠NK1.1小鼠(C3H×BALB/c)IgG2aκ-PerCp-Cy5.5(BioLegend，目录号1082728，克隆PK136)和10μg/mLPE缀合的AffiniPure多克隆F(ab')2片段山羊抗人IgG(其为Fcγ片段特异性的，与牛、小鼠和兔血清蛋白(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-170)交叉反应最小)。细胞用200μL/孔的冷FACS缓冲液洗涤两次。细胞用含1％甲醛的50μL/孔的DPBS固定。将细胞重悬于FACS缓冲液中，并在次日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图9所示，FAP靶向的含有hu4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆hu4-1BBL三聚体)和非靶向的含有hu4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆hu4-1BBL三聚体)不与小鼠4-1BB结合。因此，不能在有免疫能力的小鼠中测试活性。对于体内作用模式研究，必须使用如图3所示的免疫无能小鼠中的人源化小鼠模型或含有小鼠4-1BBL三聚体的替代物。
5.3与表达FAP的肿瘤细胞结合
对于在表达FAP的细胞上的结合测定，采用了人黑素瘤细胞系MV-3(参见Ruiter等人，Int.J.Cancer 1991,48(1),85-91)、WM-266-4(ATTC CRL-1676)或NIH/3T3-huFAP克隆39细胞系。为了生成后一种细胞系，用人FAP(NIH/3T3-huFAP克隆39)转染NIH/3T3细胞。通过用在CMV启动子下的编码人FAP的pETR4921表达质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)而生成上述细胞。在1.5μg/mL的嘌呤霉素(InvivoGen，目录号ant-pr-5)的存在下维持细胞。将0.1x106个表达FAP的肿瘤细胞加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。细胞用200μL的DPBS洗涤一次，并将沉淀重悬。加入100μL/孔的含有1:5000稀释的可固定活力染料eFluor 450(eBioscience，目录-号65-0863-18)或可固定活力染料eFluor 660(eBioscience，目录-号65-0864-18)的4℃冷DPBS缓冲液，将板在4℃下温育30分钟。将细胞用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次，并重悬于含有不同滴定浓度的含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液(补充有2％(v/v)FBS、5mM EDTA pH 8(Amresco，目录-号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich S2002)的DPBS)，然后在4℃、温育1小时。用200μL/孔洗涤4次后，细胞用50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液在4℃、染色30分钟，所述FACS缓冲液含有30μg/mL FITC缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊F(ab`)2片段(JacksonImmunoResearch，目录-号109-096-098)或5μg/mL PE缀合的AffiniPure抗人IgG Fgγ片段特异性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098或109-116-170)。细胞用200μL 4℃的FACS缓冲液洗涤两次，然后重悬于含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS中。在当日或次日将细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并使用5激光LSR-Fortessa(BDBioscience，具有DIVA软件)或3激光Miltenyi Quant Analyzer 10(Mitenyi Biotec)和Flow Jo(FlowJo X 10.0.7)收获细胞。
如图10所示，FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)构建体1.1，而不是DP47非靶向的含有Fab的构建体(DP47分拆4-1BBL三聚体)对照A，与表达人成纤维细胞激活蛋白(FAP)的黑素瘤(10A)MV-3细胞或(10B)WM-266-4细胞有效结合。
图11A显示了实施例1中制备的构建体1.1至1.10与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞的结合，在图11B中显示了构建体1.1、1.2、1.3和1.5与表达人FAP的NIH/3T3-huFAP克隆39转染的小鼠胚胎成纤维细胞的结合。表37显示了对构建体1.1至1.10测量的EC50值。
表37：与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
图12A和12B显示了不同的FAP(4B9)靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞(图12A)和WM-266-4细胞(图12B)的结合。如实施例2所述制备构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6，并如前所述制备对照。设门于活的肿瘤细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合构建体的滴定浓度进行印迹。表38显示了如所测量的EC50值。
表38：与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
5.4鼠靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
5.4.1与活化的小鼠脾细胞结合
将小鼠脾脏收集在3mL PBS中，并使用gentleMACS管(Miltenyi Biotec目录号130-096-334)和gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)产生单细胞悬液。然后，将脾细胞通过30μm预分离过滤器(Miltenyi Biotec目录号130-041-407)过滤，并在350x g和4℃、离心7分钟。吸出上清液并将细胞重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。
对于在新鲜小鼠脾细胞上的结合，直接使用细胞。为了诱导小鼠4-1BB 在T细胞上的表达，如下激活小鼠脾细胞：以106个细胞/mL在6孔组织培养板上培养2天，所述组织培养板包被有10μg/mL的抗小鼠CD3ε亚美尼亚仓鼠IgG(克隆145-2C11，BioLegend，目录号100331)和2μg/mL的抗小鼠CD28叙利亚仓鼠IgG(克隆37.51，BioLegend，目录号102102)。
收集新鲜的小鼠脾细胞或活化的小鼠脾细胞，在DPBS(Gibco lifetechnologies，目录号14190-136)中洗涤，计数，将0.1x106个细胞转移到非组织培养物处理的U型底96孔板(Greiner bio-one,cell star，目录号650185)的每个孔中。去除上清液，细胞在含有1:1000稀释的LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(LifeTechnologies,L34957)的100μL/孔4℃的冷DPBS中在4℃、染色30分钟。将细胞用DPBS洗涤并且在50μL/孔的冷FACS缓冲液(补充有2％(v/v)FBS、5mM EDTA pH 8(Amresco，目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich S2002)的DPBS)中染色，所述缓冲液含有不同滴定浓度的含有小鼠4-1BBL配体三聚体的Fc(kih)融合分子或小鼠IgG1κ同种型对照(BioLegend，目录号400153，克隆MOPC-21)。将细胞在4℃、温育120分钟，用冷DPBS洗涤四次，并在含有30μg/mL FITC缀合的抗小鼠IgG Fc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2(JacksonImmunoresearch，目录号115-096-071)的50μL/的冷FACS缓冲液中在4℃、染色30分钟。然后细胞用冷DPBS洗涤两次，并且用50μL/孔的FACS缓冲液在4℃、染色30分钟，所述缓冲液补充有10μg/mL纯化的抗小鼠CD16/CD32大鼠IgG-Fc-Block(BD Pharmingen，目录号553142，克隆2.4G2)、0.67μg/mL抗小鼠CD8a-APC-Cy7(BioLegend，目录号100714，克隆53-6.7)、0.67μg/mL抗小鼠CD3ε-PerCP-Cy5.5(BioLegend，目录号100328，克隆145-2C11)、0.67μg/mL抗小鼠CD4大鼠IgG2bκ-PE-Cy7(BioLegend，目录号100422，克隆GK1.5)。细胞用200μL/孔的冷DPBS洗涤两次，用含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS固定并重悬于FACS缓冲液中。使用3激光MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotech)和Flow Jo v10.0.7(FlowJo LLC)收获细胞。设门于CD3+CD8+或CD3+CD4+T细胞上，分析FITC-缀合的抗小鼠IgG Fc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2的中值荧光强度(MFI)，并通过减去空白对照(没有添加含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子)的MFI加以标准化。将MFI针对使用的含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子的浓度进行印迹，以显示与小鼠4-1BB细胞结合的分子的结合。
如图13可见，鼠4-1BBL构建体M.1和M.2以及相应的对照分子对照M.1 和对照M.2以很相似的亲和力与小鼠4-1BB结合。表39显示了对构建体M.1和M.2以及对照分子测量的EC50值。
表39：在活化的表达4-1BB的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
5.4.2在表达FAP的肿瘤细胞上的结合
对于在表达FAP的细胞上的结合测定，采用了人黑素瘤细胞系MV-3(参见Ruiter等人，Int.J.Cancer 1991,48(1),85-91)和WM-266-4(ATTC CRL-1676)(抗FAP特异性克隆28H1是小鼠/人交叉反应性的)。将0.1x106个表达FAP的肿瘤细胞加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。细胞用200μL冷DPBS洗涤一次，将沉淀重悬于含有1:1000稀释的LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(Life Technologies,L34957)的100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液中，并在4℃、温育30分钟。将细胞用200μL的冷DPBS缓冲液洗涤一次，并重悬于含有一系列浓度的含有鼠4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合分子的50μL/孔的冷FACS缓冲液(补充有2％(v/v)FBS、5mM EDTA pH8(Amresco，目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich S2002)的DPBS)中，然后在4℃、温育1小时。用200μL的DPBS/孔洗涤四次后，用含有30μg/mL FITC缀合的抗小鼠IgG Fc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2(Jackson Immunoresearch，目录号115-096-071)的50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液将细胞4℃、染色30分钟。细胞用200μL/孔的冷DPBS缓冲液洗涤两次，用含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS固定并重悬于FACS缓冲液中。使用3激光MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotech)和Flow Jo v10.0.7(FlowJo LLC)收获细胞。设门于活细胞上，分析FITC-缀合的抗小鼠IgG Fc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2的中值荧光强度(MFI)，并通过减去空白对照(没有添加含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子)的MFI加以标准化。将MFI针对使用的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子的浓度进行印迹，以显示与鼠4-1BB细胞结合的分子的结合。正如预期，鼠4-1BBL构建体M.1和M.2以很相似的亲和力与FAP结合，而对照分子不结合。
图14显示了FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的鼠4-1BB配体Fc(kih)构建体M.1和M.2与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞(图14A)和WM-266-4细胞(图14B)的结合。表40显示了如所测量的EC50值。
表40：与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
实施例6
靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性
6.1.在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NF-κB活化
表达人4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞的生成
用基于表达载体pETR10829的质粒转导宫颈癌细胞系HeLa(ATCC CCL-2)，所述表达载体包含在CMV启动子控制下的人4-1BB(Uniprot登录号Q07011)的序列和嘌呤霉素抗性基因。在补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I和3μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基中培养细胞。
通过流式细胞术检测4-1BB转导的HeLa细胞的4-1BB表达：将0.2x106个活细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，所述缓冲液含有0.1μg PerCP/Cy5.5缀合的抗人4-1BB小鼠IgG1κ克隆4B4-1(BioLegend目录-号309814)或其同种型对照(PerCP/Cy5.5缀合的小鼠IgG1κ同种型对照抗体克隆MOPC-21，BioLegend目录-号400150)，在4℃、温育30分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于含有0.06μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的300μLFACS缓冲液中，使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。进行有限稀释以产生如下所述的单个克隆：将人4-1BB转导的HeLa细胞重悬于培养基中达到10个、5个和2.5个细胞/ml的密度，将200μl细胞悬液转移到组织培养物处理的圆底96孔板(6个板/细胞浓度，TPP目录-号92697)中。如上所述收获单个克隆，扩增并检测4-1BB表达。选择具有最高4-1BB表达的克隆(克隆5)，以备随后用NF-κB萤光素酶表达载体5495p Tranlucent HygB进行转染。载体对转染细胞赋予潮霉素B抗性和在NF-kB应答元件(骨架载体Panomics，目录-号LL0051，引入HyB抗性)控制下表达萤光素酶的能力。培养人4-1BB HeLa克隆5细胞至70％汇合。将50μg(40μL)线性化(限制酶AseI和SalI)5495p Tranlucent HygB表达载体加入到无菌的0.4cm Gene Pulser/MicroPulser Cuvette(Biorad，目录号165-2081)中。加入400μl无补充剂的DMEM培养基中的2.5x106个人-4-1BB HeLa克隆5细胞，与质粒溶液仔细混合。使用Gene Pulser Xcell总系统(Biorad，目录-号165-2660)，在以下设置下进行细胞的转染：指数脉冲，电容500μF，电压160V，电阻∞。在脉冲转染细胞之后立即转移到具有15mL的37℃温热DMEM培养基的75cm2的组织培养瓶(TPP，目录-号90075)中，所述培养基补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I。次日，加入含有3μg/mL嘌呤霉素和200μg/mL潮霉素B(Roche，目录-号10843555001)的培养基。将存活的细胞扩增并且如上所述进行有限稀释以产生单个克隆。
如上所述检测克隆的4-1BB表达并且如下检测克隆的NF-κB-萤光素酶活性：在选择培养基中收获克隆，并使用Cell Counter Vi-cell xr 2.03(Beckman Coulter，目录-号731050)进行计数。将细胞设定为0.33x106个细胞/mL的细胞密度，并将150μL该细胞悬液转移到具有盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录-号655083)的每个孔中并且转移到常规的96-孔平底组织培养板(TPP目录-号92096)-作为对照-，次日检测存活和细胞密度。细胞在37℃和5％CO2下温育过夜。次日，将50μL含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α,PeproTech，目录号300-01A)的培养基加入到96孔板的每个孔中，得到rhTNF-α的终浓度为100、50、25、12.5、6.25和0ng/孔。将细胞在37℃和5％CO2下温育6小时，然后用200μL/孔的DPBS洗涤3次。向每个孔(40μl)中加入报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase1000Assay System，Promega，目录-号E4550)解冻至室温。将100μL检测缓冲液加入到每个孔中，并使用SpectraMax M5/M5e酶标仪和SoftMax Pro Software(Molecular Devices)尽可能快地检测平板。采取所测得的高于对照(不添加rhTNF-α)的500毫秒/小时的释放光单位数(URL)作为萤光素酶活性。NF-κB-luc-4-1BB-HeLa克隆26表现出最高的萤光素酶活性和相当程度的4-1BB表达，并被选择以备进一步使用。
与表达FAP的肿瘤细胞共培养的表达人4-1BB的Hela细胞中的NF-κB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/ml。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有滴定浓度的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)的培养基。将表达FAP的肿瘤细胞(MV3、WM-266-4或NIH/3T3-huFAP克隆39)重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的DMEM培养基中，浓度为2x106个细胞/ml。
向每个孔中加入表达FAP的肿瘤细胞悬液(50μl，最终比率1:5)或仅加入培养基，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。细胞用200μL/孔的DPBS洗涤两次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)在室温下解冻。将100μL的检测缓冲液加入每个孔中，使用SpectraMax M5/M5e酶标仪和以URL计数光发射(0.5s/孔的释放光单位数)的SoftMax Pro Software(Molecular Devices)或Victor3 1420多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和将光发射计数为每秒计数(CPS)的Perkin Elmer 2030Manager Software，尽可能快地测量萤光素酶活性，并针对测试构建体的浓度进行印迹。
FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)在存在表达FAP的肿瘤细胞的情况下触发了报告细胞系中的NFκB信号通路的激活。相比之下，相同分子的非靶向变体在任何测试浓度下都不能触发这种效应(图16)。靶向的4-1BBL的这种活性严格依赖于肿瘤细胞在细胞表面上FAP的表达，因为在培养NF-kB报告细胞系和FAP阴性肿瘤细胞时，即使在存在FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的情况下也不能检测到NF-kB活化。对构建体1.1至1.10测量的活性如图17A-17C所示，对构建体2.1、2.4和2.5测量的数据如图18所示。
6.2.在表达食蟹猴4-1BB的HEK T293细胞中的NF-κB活化
表达食蟹猴4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HEK T293细胞的生成
为了产生病毒样颗粒(VLP)，根据制造商的方案，使用具有PLUSTM试剂(LifeTechnologies，目录号15338100)的Lipofectamine LTX试剂，用编码NFκB-萤光素酶-IRIS-GFP报告基因盒(NFκB-luc-GFP)的载体pETR14372转染人胚胎肾(HEK)T293/17(ATCC CRL-11268)。6小时后进行DMEM培养基更换，所述培养基添加有10％FBS，4天后收获VLP。利用产生的pETR14372-VLP和4μg/mL聚凝胺在新鲜的HEK 293T细胞出现70-80％汇合时进行转导。培养细胞24小时，并进行培养基更换。收获转导的HEK T293/17细胞，并进行1个细胞/孔的有限稀释以筛选稳定的单克隆。用在培养基中的25ng/mL TNF-α(PeproTech Inc.目录号300-01A)刺激单个克隆，并使用Incuyte Zoom Fluorescence Microscope System(EssenBioscience)筛选单个克隆随着时间过去的阳性GFP信号。根据制造商的方案，在记录GFP信号之后，使用Nano Glo Luciferase Kit(Promega,N1120)检测细胞的萤光素酶活性。使用Victor3 1420多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和Perkin Elmer 2030ManagerSoftware测量萤光素酶活性。以每秒计数(CPS)计数0.5秒/孔的光发射。克隆61显示出在TNF-α激活后最高的GFP和萤光素酶表达，并进一步用于生成报告细胞系。
如上所述，使用编码食蟹猴4-1BB和嘌呤霉素抗性的载体pETR14879产生新的VLP，用产生的pETR14879-VLP和4μg/mL聚凝胺在HEK 293T NFκB-fluc-GFP克隆61细胞系出现70-80％汇合时进行转导。培养细胞24小时，并进行培养基更换。转导后4天，用PE缀合的抗人食蟹猴交叉反应性4-1BB抗体(小鼠IgG1κ，克隆MOPC-21，BioLegend，目录号309804)在含有1％FBS的DPBS中将细胞染色，通过FACS(ARIA，BD)分选所述细胞，并且以5个细胞/孔接种于DMEM培养基中，所述培养基补充有10％FBS，含有1μg/mL Puromycine(InvivoGen，目录号ant-pr)。在TNF-α刺激后，如所述通过流式细胞术检测生长克隆的GFP和萤光素酶活性，并检测到食蟹猴4-1BB高表达。在单价FAP靶向的构建体2.1或对照B和表达FAP的MV-3或WM-266-4细胞的存在下，选择双阳性克隆并检测萤光素酶活性。选择表达NF-κB-luc-GFP-cy4-1BB的HEK T293/17克隆61-13用于所有进一步的实验。
与表达FAP的肿瘤细胞共培养的表达食蟹猴4-1BB的HEK T293/17报告细胞的NF-κ B活化
收获表达NFκB-luc-GFP-cy4-1BB的HEK T293/17克隆61-13细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/mL。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有不同滴定浓度的FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的培养基。将表达FAP的肿瘤细胞(MV3和WM-266-4)重悬于培养基中，浓度为2x106个细胞/ml。向每个孔中加入表达FAP的肿瘤细胞悬液(50μl)，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。测定原理显示在图19中。温育后，细胞用200μL/孔的DPBS洗涤三次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)解冻至室温。将100μL检测缓冲液加入到每个孔中，并使用SpectraMax M5/M5e(Molecular Devices)酶标仪尽可能快地测定萤光素酶活性(500ms积分时间，未过滤收集所有波长)。以释放光的单位数(URL)计数0.5秒/孔的光照射，并且针对测试的FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的浓度进行印迹。实施例2的构建体的结果如图20所示。
6.3基于抗原特异性CD8+T细胞的测定
抗原特异性CD8 T细胞的分离和培养
从HLA-A2+的CMV感染志愿者获得新鲜血。如上所述分离PBMC。根据制造商的建议，使用阴性选择人CD8 T细胞分离试剂盒从PBMC中纯化CD8 T细胞(Miltenyi Biotec，目录号130-094-156)。将1000万个分离的CD8T细胞重悬于补充有1％(v/v)FBS的1mL无菌DPBS中，其中DPBS还补充有50μL的含有CMV衍生的NLVPMVATV肽(ProImmune，目录号F008-2B)的PE标记的HLA-A2-五聚体，并在室温下温育10分钟。用补充有1％(v/v)FBS的3mL无菌DPBS将细胞洗涤两次。将细胞重悬于含有1μg/mL抗人CD8-FITC(克隆LT8，Abcam，目录号Ab28010)的补充有1％(v/v)FBS的1mL DPBS中，并在4℃、温育30分钟。将细胞洗涤两次，以5x106个细胞/mL的浓度重悬于补充有1％(v/v)FBS的DPBS中，并通过30μm预分离尼龙网细胞过滤器(Miltenyi Biotec，目录号130-041-407)过滤。通过使用ARIA细胞分选仪(BD Bioscience，DIVA软件)通过FACS分选分离NLV肽特异性CD8+T细胞，所述细胞分选仪具有以下设置：100μm喷嘴和纯度分选掩模。将分选的细胞收集在含有具备10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I和400U/mL普留净的RPMI 1640培养基的15ml聚丙烯离心管(TPP，目录号91015)中。将分选的细胞在室温下以350x g离心7分钟，重悬于相同培养基中，浓度为0.53x106个细胞/mL。将该细胞悬液以100μL/孔加入预先准备的饲养板的每个孔中。
如前所述(Levitsky et al.,1998)从PBMC制备PHA-L激活的照射的异基因饲养细胞，并以每孔2x105个饲养细胞分配到96孔培养板中。
培养1天后，从含有分选的CD8+T细胞的孔中移除100μL培养基/孔，更换为补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I和400U/mL普留净的新的RPMI 1640培养基，在培养期间定期重复此操作(每2-4天一次)。一旦细胞开始增殖，就将其转移到24孔平底组织培养板(TPP,92024)上。使细胞扩增/分裂，定期地用新的饲养细胞制剂再活化。
抗原特异性CD8+T细胞的活化测定
收获MV3细胞并用DPBS洗涤，并将2x107个细胞重悬于250μL的PKH-26RedFluorescence Cell linker Kit(Sigma，目录号PKH26GL)的C稀释剂中。将1μL PKH26-Red染色溶液用250μL C稀释剂稀释，并加入到MV3细胞悬液中，然后在黑暗中在室温下温育5分钟。然后加入0.5mL FBS，将细胞温育1分钟，并用由RPMI 1640培养基组成的T细胞培养基洗涤一次，所述RPMI 1640培养基补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸和50μM的β巯基乙醇。将1x106个MV3细胞/mL重悬于T细胞培养基中并分到三个管中。加入合成的NLVPMVATV肽(从Thinkpeptides获得)至终浓度为1x10-9 M或1x10-8 M，将细胞温育90分钟。将MV3细胞用T细胞培养基洗涤一次，并以0.5x106个细胞/mL的密度重悬，分配(100μL/孔)到96孔圆底细胞悬浮板(Greiner bio-one，cellstar，目录-号650185)中，在37℃和5％CO2下温育过夜。测定原理显示在图21中。
次日，加入50μL/孔含有不同滴定浓度的靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的T细胞培养基。收获NLV特异性CD8 T细胞，加入CFDA-SE(5(6)-羧基荧光素二乙酸酯-N-琥珀酰亚胺酯，SIGMA-Aldrich，目录号21888-25MG-F)至终浓度为40nM，在37℃在旋转下温育细胞15分钟。通过加入FBS来终止标记，将细胞洗涤并重悬于T细胞培养基中至终浓度为0.125x106个细胞/mL。将50μL该CFSE标记的CD8 T细胞悬液加入各孔(最终E:T比＝1:8)中。将细胞板温育24小时，取出50μL/孔，并向每孔加入50μL含有2.64μL/mL的Golgi终止液(含莫能菌素的蛋白转运抑制剂，BD Bioscience，目录号554724)的T细胞培养基(终浓度0.66μL/mL)。将细胞温育4小时，然后用200μL/孔的DPBS洗涤平板，用含有1:5000稀释的可固定活力染料eF450(eBioscience，目录-号65-0864)的100μL/孔的4℃的DPBS在4℃染色30分钟。用200μL/孔的DPBS洗涤细胞板，然后用荧光染料缀合的抗体染色，所述抗体如下：抗人CD137-PerCP/Cy5.5(克隆4B4-1，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号309814)、抗人CD8-BV605(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号301012)或0.67μg/mL抗人CD8a-APC/Cy7(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号301016)和抗人CD25 PE/Cy7(克隆BC96，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号302612)。在4℃、温育30分钟后，用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于50μL/孔新鲜制备的FoxP3 Fix/Perm缓冲液(eBioscience目录号00-5123和00-5223)中，在4℃下温育30分钟。用200μL/孔的Perm-Buffer(补充有2％(v/v)FBS、1％(w/v)皂苷(Sigma Life Science，S7900)和1％(w/v)叠氮化钠(Sigma-Aldrich，S2002)的DPBS洗板，并用50μL/孔的Perm-Buffer(eBioscience，目录号00-8333-56)染色，所述Perm-Buffer含有0.25μg/mL的抗人IFNγ-APC(克隆B27，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号506510)或0.33μg/mL的抗人IFNγ-BV510(克隆4S.B3，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号502543)。将板在4℃、温育1小时，用200μL/孔的Perm-Buffer洗涤两次。为了固定，加入含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS。在当日或次日将细胞重悬于100μL/孔的FACS缓冲液中，并使用5激光Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience，具有DIVA软件)或3激光Miltenyi QuantAnalyzer 10(Mitenyi Biotec)和Flow Jo(FlowJo X 10.0.7)收获细胞。
如图22和23所示的构建体1.1至1.10以及图24和25所示的构建体2.1、2.3和2.4，抗原特异性CD8+T细胞，而不是未刺激的对照，在存在FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)的情况下表现出增加的表面4-1BB表达水平。4-1BBL的这种作用是剂量依赖性的并且需要FAP靶向，因为添加非靶向的对照分子不影响4-1BB表达水平。此外，在FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)存在下，以较高肽浓度(1x10-8M)激活的T细胞显示出持续的INF分泌。总的来说，这些数据表明抗原靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子以靶向依赖的方式调节抗原特异性T细胞的表面表型和反应性。
6.4细胞靶向和非靶向的小鼠4-1BBL Fc融合抗原结合分子的比较
如实施例1.3所述制备靶向和非靶向的含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆小鼠4-1BBL三聚体和DP47分拆小鼠4-1BBL三聚体)。
为了比较细胞靶向和非靶向的含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性，在0.5μg/mL抗小鼠CD3叙利亚仓鼠IgG(克隆145-2C11，BD，目录号553057)以及以一系列浓度添加的指示药物候选分子的存在下，将增殖染料eFlour670标记的(eBioscience，目录号65-0840-90)或CellTrace Violet细胞增殖染料标记的(Celltracer，目录号C34557)新鲜小鼠脾细胞在U型底96孔组织培养板(TTP，目录号90997)中与粘附的50Gy辐照的在RPMI1640培养基(Gibco，目录号440401-042)中的NIH/3T3-huFAP克隆39细胞(生成见5.3)共培养3-4天，所述培养基补充有(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸和50μMβ-巯基乙醇(图26)。三天或四天后，用FACS缓冲液洗涤细胞，在含有抗小鼠CD8大鼠IgG2a-BV711(BioLegend，目录号100747，克隆53-6.7)、抗小鼠CD4大鼠IgG2a-BV421(BioLegend，目录号100544，克隆RM4-5)、0.67μg/mL抗小鼠CD137(4-1BB)叙利亚仓鼠IgG-PE(BioLegend，目录号1010106，克隆17B5)和抗小鼠CD25-PErCP-Cy5.5大鼠IgG2b(BioLegend，目录号1019112)的25μL FACS缓冲液/孔中在4℃、染色30分钟。洗涤细胞并在制备的Fix/Perm Buffer(Foxp3/Transcription Factor StainingBuffer Set,eBioscience，目录-Ni.00-5523-00)中在室温下温育1小时。用新鲜制备的Perm缓冲液洗涤细胞两次，并用含有荧光标记抗体的25μL/孔Perm缓冲液在室温下共染色1小时，所述抗体针对细胞毒性谱系转录因子Eomes，即为抗小鼠Eomes大鼠IgG2a-AlexaFluor488抗体(eBioscience，目录号534875，克隆Dan11mag)，并且-如果CD137未被染色，则所述抗体针对细胞毒性效应器分子颗粒酶B，即为抗小鼠大鼠IgG2颗粒酶B-PE抗体(eBioscience，目录号128822，克隆16G6)。然后将细胞洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中，使用激光Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience，具有DIVA软件)或3激光MACSQuant Analyzer10(Miltenyi Biotech)和Flow Jo v10.0.7(FlowJo LLC)收获细胞。设门于活的CD8+T细胞和CD4+T细胞上，测定增殖细胞的频率以及CD25、Eomes和颗粒酶B或CD137的表达水平。将增殖频率以及活化标志物的频率和MFI针对使用的含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子的浓度进行印迹，以显示功能活性。从图27可以看出，对于构建体M.1和M.2可以观察到增殖性CD8+T细胞增加。
6.5用抗鼠4-1BB抗体Lob 12.3(muIgG1 Wt)或用构建体M.2处理的小鼠中的肝脏变化
用靶向FAP的激动性抗鼠4-1BB抗体每周一次治疗皮下荷载MC38-muFAP(鼠结肠直肠癌模型)的C57BL/6小鼠持续3周(Efficacy Study020-GA1401:“Experiment to showefficacy of 4-1BB targeted therapy in combination with a-PD-L1 in MC38-muFAPs.c.model in C57B6 mice.”)。使用的抗体为Lob 12.3muIgG1 Wt(具有“野生型”Fc，来自BioXcell目录号BE0169的克隆Lob 12.3)或具有DAPG突变的构建体M.2(无活性的Fc).给予两种抗体每周一次连续三周。最后一次治疗7天后处死4只动物/组，用显微镜检查肝脏。
仅在接受Lob 12.3muIgG1 Wt的动物中观察到肝脏变化，其组成为肝细胞变性病灶，具有F4/80阳性巨噬细胞和经常显示血管中心性分布的较少量的炎性细胞(主要是淋巴细胞)混合群的积聚。偶尔见到肝细胞的单细胞坏死、和门管区中的血管周围单核细胞浸润。在接受构建体M.2的动物的肝脏中未观察到治疗相关发现(表41)。
表41：组织病理学的发生率(n＝4/组)
在用Urelumab BMS-663513(Ascierto P.A.等人，2010)治疗的患者和使用小鼠替代物的小鼠中观察到肝炎，其归因于肝脏中FcγRs的交联。在用具有无活性Fc的抗体治疗的动物中肝脏发现的缺乏支持该假设。
6.6含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的药代动力学参数的确定
为了测试本发明的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子是否适合于药物用途，确定了在小鼠中的诸如清除率、分布容积或消除半衰期(t1/2)的药代动力学参数(PK数据)。因此，进行了以下实验：
实验A：构建体1.2和对照B在健康NOG小鼠中的单剂量PK
根据确定的指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，在实验开始将平均年龄为8至10周的NOG雌性小鼠(购自Taconic，SOPF设施)保持在无特定病原的条件下，日周期为12小时光照/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府(P2011128)审查批准。动物在到达之后被维护一周以便适应新的环境和便于观察。定期进行连续健康监测。
进行单剂量药代动力学研究(SDPK)以评价构建体1.2和对照B的暴露。向NOG小鼠以2.5mg/kg给予静脉推注给药，并在选定的时间点取血样用于药代动力学评价。通过ELISA分析小鼠血清样品。将生物素化人4-1BB、测试样品、地高辛标记的抗huCH1抗体和抗地高辛检测抗体(POD)分步加入到链霉亲和素包被的96孔微量滴定板中，每个步骤之后在室温下温育1小时。每个步骤之后将板洗涤三次以除去未结合的物质。最后，通过加入ABTS底物溶液以形成有色反应产物将结合过氧化物酶的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)下通过光度法测定的反应产物强度与血清样品中的分析物浓度成比例。构建体的标准曲线的校准范围为0.156到10ng/ml，其中3ng/ml为定量下限(LLOQ)。图28A显示了在该实验中观察到的浓度随时间的降低。
实验B：构建体2.1、2.3、对照B和对照C在用干细胞人源化的荷瘤NOG小鼠中的单剂 量PK。
进行单剂量药物动力学研究(SDPK)以评价构建体2.1、2.3、对照B和对照C的暴露。由Jackson Laboratories输送用人干细胞移植的NSG雌性小鼠。根据确定的指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将小鼠维持在无特定病原的条件下，日周期为12小时光照/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府(ZH193-2014)审查批准。动物在到达之后被维护一周以便适应新的环境和便于观察。定期进行连续健康监测。
人MKN45细胞(人胃癌)最初从ATCC获得，扩增后保藏在Glycart内部细胞库中。在含有10％FCS的DMEM中培养细胞。在37℃在5％CO2的水饱和气氛中培养细胞。对于皮下注射，使用9次体外传代，活力为97％。在Roche Nutley将人成纤维细胞NIH-3T3工程化以表达人FAP。使用克隆39时的体外传代数为12次，活力为98％。将与50微升Matrigel混合的50微升细胞悬液(1x106个MKN45细胞+1x106个3T3-huFAP)皮下注射到麻醉小鼠的侧腹。当肿瘤的平均尺寸达到190mm3时，向人源化小鼠以10mg/kg给予静脉推注给药。在选定的时间点取血样进行药代动力学评价。通过ELISA分析小鼠血清样品。将生物素化人4-1BB、测试样品、地高辛标记的抗huCH1抗体和抗地高辛检测抗体(POD)分步加入到链霉亲和素包被的96孔微量滴定板中，每个步骤之后在室温下温育1小时。每个步骤之后将板洗涤三次以除去未结合的物质。最后，通过加入ABTS底物溶液以形成有色反应产物将结合过氧化物酶的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)下通过光度法测定的反应产物强度与血清样品中的分析物浓度成比例。构建体的标准曲线的校准范围为0.156到10ng/ml，其中3ng/ml为定量下限(LLOQ)。图28B显示了在该实验中观察到的构建体浓度随时间的降低。
实验C：构建体2.1和2.3在健康NOG小鼠中的单剂量PK
根据确定的指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，在实验开始将平均年龄为8至-10周的NOG雌性小鼠(购自Taconic，SOPF设施)保持在无特定病原的条件下，日周期为12小时光照/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府(P2011128)审查批准。动物在到达之后被维护一周以便适应新的环境和便于观察。定期进行连续健康监测。
进行单剂量药代动力学研究(SDPK)以评价构建体2.1和2.3的暴露。向NOG小鼠以2.5mg/kg给予静脉推注给药，并在选定的时间点取血样用于药代动力学评价。通过ELISA分析小鼠血清样品。将生物素化人4-1BB、测试样品、地高辛标记的抗huCH1抗体和抗地高辛检测抗体(POD)分步加入到链霉亲和素包被的96孔微量滴定板中，每个步骤之后在室温下温育1小时。每个步骤之后将板洗涤三次以除去未结合的物质。最后，通过加入ABTS底物溶液以形成有色反应产物将结合过氧化物酶的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)下通过光度法测定的反应产物强度与血清样品中的分析物浓度成比例。构建体的标准曲线的校准范围为0.156到10ng/ml，其中3ng/ml为定量下限(LLOQ)。图28A显示了观察到的浓度随时间的降低。
经测试的构建体2.1和2.3在体内足够稳定，并且具有适用于药物开发范围的PK参数。从结果还可以得出结论，构建体2.1略微更稳定。
6.7FAP在人类肿瘤中的发生率
如WO 2014/161845中所述评价FAP在人类肿瘤中的发生率，以了解FAP靶向构建体的可能临床应用。
使用来自Vitatex(MABS1001)的大鼠抗人Seprase抗体(IgG2a，克隆D8)，将来自各种肿瘤指征的2.5μm FFPET切片在Ventana Benchmark XT上进行免疫染色。将切片进行标准CC1处理，然后在Dako抗体稀释液(S3022)中在37℃、以5μg/mL的浓度温育抗体60秒，使用Ultraview DAB检测系统(Ventana#760-4456)检测阳性染色。使用来自Abcam(ab18450)的匹配的同种型抗体作为阴性对照。FAP+间质浸润存在于不同指征的人类肿瘤中，包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、乳腺癌、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌(PAC)、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和间皮瘤，标志着FAP靶向构建体潜在有用的临床指征(表42)。
表42：FAP在人类肿瘤中的发生率
实施例7
7.1CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
7.1.1用于噬菌体展示活动的CD19抗原Fc融合物的制备、纯化和表征
为了以单体状态(人CD19参见SEQ ID NO:31)表达和纯化人和食蟹猴CD19胞外域，将各个DNA片段与包含“节”突变的人IgG1 Fc基因区段(人：SEQ ID NO:SEQ ID NO:186；食蟹猴：SEQ ID NO:188)融合，并用“Fc穴”(SEQ ID NO:86)对应物进行转染(Merchant等人，1998)。在抗原胞外域和Fc节链之间引入IgA切割位点(PTPPTP)。在抗原Fc节链的C末端引入用于定向生物素化的Avi标签，并将突变H435R和Y436F引入Fc穴中用于纯化目的(Jendeberg L.等人，J.Immunological methods,1997)。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链(人：SEQ ID NO:187；食蟹猴：SEQ ID NO:189)与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链(SEQ ID NO:90)的组合允许产生包括CD19胞外域的单拷贝的异二聚体Fc融合片段(类似于图5C中的4-1BB构建体)。表43列出了抗原Fc融合构建体的cDNA和氨基酸序列。
表43：单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列
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为了产生单体抗原/Fc融合分子，使用标准方法，用编码融合蛋白的两种成分(节链和穴链)的两个质粒共转染指数生长的悬液CHO细胞。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)、0.5M氯化钠缓冲液缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用线性梯度洗脱结合的蛋白质；步骤1，10个CV的0％至60％的洗脱缓冲液(20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠缓冲液(pH 2.5))；步骤2，2个CV的60％至100％的洗脱缓冲液。对于线性梯度，应用另外2个柱体积的100％的洗脱缓冲液进行分步洗脱。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
表44总结了单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合蛋白的产率和最终单体含量。
表44-单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合蛋白的生物化学分析
根据制造商的说明书，使用BirA生物素-蛋白质连接酶标准反应试剂盒(Avidity，目录号BirA500)将部分纯化抗原体外生物素化。相对于相应的食蟹猴CD19构建体的生物素化程度100％，含有人CD19的融合物的生物素化程度为94％。然后将生物素化的蛋白质用于选择、筛选和表征缺乏脱酰胺化热点N27d和N28的亲和力成熟的8B8衍生克隆。
7.1.2抗CD19克隆8B8-018的生成
7.1.2.1小鼠抗人CD19抗体(杂交瘤)的免疫和生成
将Balb/c小鼠免疫6次，并用CD19转染的HEK293细胞(平均受体密度为每细胞35,000)加强。利用人CD19转染的NIH-3T3细胞上的CD19细胞ELISA，通过检测血清样品来监测免疫应答。使用具有足够的抗人CD19抗体滴度的小鼠的脾细胞通过与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63 Ag8.653融合进行永生化。进行三次融合，通过对人CD19转染的NIH-3T3细胞进行细胞ELISA并且使用Daudi(CD19+)和CD19-细胞进行FACS结合测定来筛选杂交瘤上清液的抗人CD19特异性抗体(参见WO 2011/147834的实施例1)。
7.1.2.2杂交瘤筛选和抗CD19抗体的细胞生物学功能评价
用于筛选抗人CD19抗体的细胞ELISA
应用细胞ELISA筛选杂交瘤，并鉴定分泌抗人CD19抗体的杂交瘤。使用人CD19转染的NIH3T3细胞作为阳性细胞；使用未转染的NIH3T3细胞作为阴性对照细胞。为了评估阳性杂交瘤，将转染和未转染的NIH3T3细胞之间的OD比值进行定量。
-培养基：DMEM高糖型(4.5mg/ml)、10％FCS、丙酮酸钠、NEAA、谷氨酰胺
-抗体阳性对照：抗CD19单克隆抗体(IgG1)Pharmingen目录号555409c＝1mg/ml
-检测抗体：山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP缀合物Bio-Rad目录号170-06516
-稀释度1：在1x ELISA阻断剂中2000倍
-其他试剂：纤连蛋白Roche目录号838039c＝1mg/ml
-戊二醛：25％原液//Grade Agar Scientific#R102终浓度：PBS中0.05％
-ELISA阻断剂：10x原液//Roche目录号1112589
-TMB底物：Roche目录号11432559
-终止液：1M H2SO4
-BioRad目录号170-6516稀释度1：在1x ELISA阻断剂中2000倍
第1天：
-纤连蛋白包被：PBS中5μg/cm2；96孔板＝32cm2；160μg/板6ml
-PBS，50μl/孔
-在室温下温育45分钟，吸出包被溶液
-以1.25x104个细胞/孔接种于96孔板中的50μl培养液中
-在37℃、温育40小时
-向板的上半部加入：表达CD19的NIH3T3细胞
-向板的下半部加入：未转染的NIH3T3细胞
第3天：
-在50μl培养基中加入阳性对照抗体或样品(上清液或小鼠血清)
-在4℃、温育2小时
-除去培养基，用100μl戊二醛(在PBS中，0.05％)固定细胞
-用200μl PBS洗涤两次
-加入检测抗体1:2000，50μl/孔
-在室温下温育2小时
-用200μl PBS洗涤三次
-加入50μl TMB，在室温下温育30分钟，
-通过加入25μl 1M H2SO4进行终止；读取在450nm/620nm处的消光
-结果计算：NIH3T3 CD19的OD:未转染NIH3T3的OD
与未转染的NIH3T3细胞相比，选择的抗体显示出与CD19转染的NIH3T3细胞特异性结合(参见WO 2011/147834的实施例2)。
7.1.2.3抗CD19抗体的人源化
将鼠抗体的CD19结合特异性转移到人受体框架上以消除由于被人体识别为外来物的序列段引起的潜在免疫原性问题。这是通过将鼠(供体)抗体的整个互补决定区(CDR)移植到人(受体)抗体框架上完成的，称为CDR移植或抗体人源化。
将鼠氨基酸序列与人种系抗体V基因的集合进行比对，并根据序列同一性和同源性进行分选。在选择一个特定的受体序列之前，必须确定供体抗体的所谓规范环结构(Morea,V.等人，Methods,Vol 20,Issue 3(2000)267-279)。通过存在于所谓的规范位置处的残基的类型来确定这些规范环结构。这些位置位于(部分地)CDR区之外，并且必须在最终构建体中保持功能等效性，以便保留亲本(供体)抗体的CDR构象。选择人种系序列VBASE_VH1_1作为重链的受体，并且选择序列VBASE_VK2_5作为轻链的受体。
7.1.2.4去除脱酰胺热点
已经发现野生型人源化抗人CD19抗体具有三个脱酰胺热点在HVR-L1:NSNGNT(SEQID NO:190)中。另外发现HVR-H2中的另一个脱酰胺热点存在于：KFNG(SEQ ID NO:191)。为了处理HVR-H2中的脱酰胺热点，在位置64(根据Kabat编号)处引入了N(Asn)到Q(Gln)点突变。因此，本文中报道的抗体具有包含氨基酸序列TEKFQGRVTM(SEQ ID NO:192)的HVR-H2。
为了处理轻链中的脱酰胺热点并获得具有改进的脱酰胺稳定性的人源化抗人CD19抗体，在Kabat位置27d、27e、28和29处引入了单独突变并且在位置27e和28(根据Kabat编号)处引入了双突变。已经产生野生型人源化抗体(变体0)的总共9个变体(变体1至变体9)(参见表45)。
表45：人源化野生型CD19抗体的变体
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已经发现，在根据Kabat的位置27e处进行从S(丝氨酸)到P(脯氨酸)的单个突变可以处理HVR-L1中的所有脱酰胺热点。这是脱酰胺化不倾向于N(天冬酰胺)残基而是倾向于相邻残基的突变。
因此，本文中报道的抗体具有包含氨基酸序列LENPNGNT(SEQ ID NO:193)的HVR-L1。在一个实施方案中，人源化抗人CD19抗体包含具有氨基酸序列LENPSGNT(SEQ ID NO:194)的HVR-L1。
另外，这些抗体保持对食蟹猴CD19的交叉反应性，如下表46所示。
EC50[μg/ml] 变体0 变体5 变体9
huCD19 ECD 0.087 0.084 0.089
cyCD19 ECD 0.313 0.255 0.435
野生型人源化抗人CD19抗体(变体0)在纯化后显示出大约7.5％脱酰胺。在pH 7.4保存两周后，脱酰胺抗体的量增加到大约18.5％。具有S27eP突变的变体抗体(变体5)纯化后显示出2％脱酰胺和2％琥珀酰亚胺形成。在pH 7.4保存两周期间，仅存在大约7.5％脱酰胺抗体。变体5被命名为克隆8B8-018，并被选择用于制备CD19靶向的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
7.1.3具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.1)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图29B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu etal.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的Fab(图30，构建体3.1)。
表47显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.1)的cDNA和氨基酸序列。
表47：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体3.1)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
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7.1.4具有不含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.2)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的Fab(图30，构建体3.2)。
表48显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.2)的cDNA和氨基酸序列。
表48：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体3.2)的cDNA和氨基酸序列。
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7.1.5二价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.3)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CD19 huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CD19 huIgG1节单体配体链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CD19的Fab(图30，构建体3.3)。
表49显示了二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.3)的cDNA和氨基酸序列。
表49：二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)PGLALA融合物(构建体3.3)的碱基对序列
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7.1.6具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.4)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的Fab(图30，构建体3.4)。
表50显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.4)的cDNA和氨基酸序列。
表50：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体3.4)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
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7.1.7具有不含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.5)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的Fab(图30，构建体3.5)。
表51显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.5)的cDNA和氨基酸序列。
表51：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体3.5)的cDNA和氨基酸序列。
7.1.8二价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.6)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CD19 huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CD19 huIgG1节单体配体链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CD19的Fab(图30，构建体3.6)。
表52显示了二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.6)的cDNA和氨基酸序列。
表52：二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体3.6)的cDNA和氨基酸序列。
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7.2CD19(8B8衍生的亲和力成熟的)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子以及相应对照分子的制备
7.2.1缺乏热点的8B8衍生的亲和力成熟的抗CD19结合剂的生成
7.2.1.1亲和力成熟的CD19特异性抗体的选择
位于人源化克隆8B8的轻链CDR1中的位置27d和28处的天冬酰胺残基的脱酰胺化导致生物活性的显著降低。因此，生成了2个噬菌体展示文库，其中a)在位置27d和28处的两个天冬酰胺残基都被消除，并且b)重链和轻链的其他CDR被随机化，以便选择具有亲和力提高的8B8变体。
7.2.1.2缺乏LCDR1热点的8B8亲和力成熟文库的生成
使用标准方案，通过噬菌体展示进行亲和力成熟的8B8衍生的抗体的生成，所述抗体没有位于LCDR1中的脱酰胺化位点N27d和N28(Silacci等人，2005)。在第一步，将人源化亲本克隆8B8的VL和VH DNA序列(SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:216)克隆到我们的噬菌粒中，然后将其用作随机化的模板。在下一步，生成了两个文库，用于通过噬菌体展示选择有利的克隆。为了消除上述热点位置，对于两个文库，使用仅允许位置27d和28处的氨基酸S TQ E的LCDR1随机化引物(SEQ ID NO:217)。成熟文库1在轻链和重链两者的CDR1和CDR2中都被随机化，而成熟文库2在轻链的CDR1和CDR3以及重链的CDR3中被随机化。在对应CDR区域中的随机化位置如图31A所示。为了生成成熟文库1，在轻链和重链的CDR1和CDR2中都加以随机化，通过“重叠延伸剪接”(SOE)PCR组装三个片段并克隆到噬菌体载体中(图31B)。使用以下引物组合生成文库片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO:222)和CD19 L1反向随机(SEQ IDNO:217)、片段2(CD19 L2正向随机(SEQ ID NO:218)和CD19 H1反向随机(SEQ ID NO:219)、和片段3(CD19 H2正向随机(SEQ ID NO:220)和CD19 H3反向恒定(SEQ ID NO:221)(表53)。在装配足够量的全长随机片段后，与相同处理的受体噬菌粒载体一起用NcoI/NheI进行消化。将3倍摩尔过量的文库插入物与10μg噬菌粒载体连接。纯化的连接物用于20次转化，得到2×10个exp9转化体。通过PEG/NaCl纯化挽救并纯化展示8B8亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，以备用于选择。
在轻链的CDR1和CDR3以及重链的CDR3中随机类似地进行第二个文库的生成。使用以下引物组合生成文库片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO:222)和CD19 L1反向随机(SEQ IDNO:217)、片段2(CD19 L1正向恒定(SEQ ID NO:223)和CD19 L3反向随机(SEQ ID NO:224)、和片段3(CD19 L3正向恒定(SEQ ID NO:225)和CD19 H3反向随机(SEQ ID NO:226)(表54)。在装配足够量的全长随机片段后，与相同处理的受体噬菌粒载体一起用NcoI/KpnI进行消化。将3倍摩尔过量的文库插入物与20μg噬菌粒载体连接。纯化的连接物用于40次转化，得到2×10个exp9转化体。通过PEG/NaCl纯化挽救并纯化展示8B8亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，以备用于选择。
表53：用于8B8亲和力成熟和热点去除文库L1_L2/H1_H2的引物
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表54：用于8B8亲和力成熟和热点去除文库L1_L3/H3的引物
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7.2.1.3缺乏LCDR1热点N27d和N28的亲和力成熟的8B8衍生克隆的选择
为了选择缺乏LCDR1热点N27d和N28的亲和力成熟的克隆，通过噬菌体展示进行了两种选择方法：
在第一种方法中，使用两种噬菌体展示文库对人CD19-Fc融合蛋白实施选择。根据以下模式在溶液中进行各轮淘选：1.约1012个噬菌粒颗粒与30nM生物素化的CD19-Fc蛋白质以总体积1ml结合0.5小时；2.通过加入5.4×107个链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素化的CD19-Fc蛋白和特异性结合的噬菌体颗粒10分钟；3.使用5x 1ml PBS/吐温20和5x 1ml PBS洗涤珠子；4.通过加入1ml 100mM TEA洗脱噬菌体颗粒10分钟，并通过加入500μl 1M Tris/HCl pH7.4进行中和；5.指数生长的大肠杆菌TG1细菌的再感染；以及6.用辅助噬菌体VCSM13感染以及随后的噬菌粒颗粒的PEG/NaCl沉淀，所述噬菌粒颗粒用于随后的选择轮中。使用递减的抗原浓度(30x10-9M、10x10-9M、和3x10-9M)进行3轮以上的选择。在第2和第3轮中，使用中性亲和素板代替链霉亲和素珠进行抗原:噬菌体复合物的捕获。用5x PBS/吐温20和5x PBS洗涤中性亲和素板。在第3轮中，将中性亲和素板在2升PBS中温育过夜进行“解离速率”选择，然后从板上洗脱噬菌体。此外，在第2轮中使用食蟹猴CD19-Fc蛋白来富集交叉反应性结合剂。
在第二种选择方法中，对在细胞表面上瞬时表达人或食蟹猴CD19 ECD的细胞实施噬菌体淘选。为了HEK细胞的瞬时转染，生成包含以下蛋白质区段的DNA序列(5'至3')的表达质粒：Flag标签、SNAP标签、人或食蟹猴来源的CD19 ECD、以及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的跨膜区(SEQ ID NO:227和228)。使用用于检测的抗Flag抗体，通过流式细胞术证实细胞表面上对应蛋白质(SEQ ID NO:229和230)的表达。在第一选择轮中，两个文库都暴露于表达含有人或食蟹猴CD19 ECD的融合蛋白的细胞。对于后续的淘选轮，适当地交替使用CD19 ECD的种类。用无关膜蛋白瞬时转染的细胞用于预清除。
根据以下模式进行各轮淘选：
1.根据前述标准程序，用表达CD19 ECD或无关跨膜蛋白的构建体转染HEK细胞；
2.在5％CO2气氛的培养箱中在37℃、温育细胞总共48h；3.通过离心分离细胞(在250×g下3分钟)，分别将1×10E7 CD19 ECD阳性细胞和1×10E7阴性细胞重悬于PBS/5％BSA中；
3.通过使用轻轻旋转的管旋转器在4℃、用1×107CD19阴性细胞温育噬菌体文库60分钟，预先清除非特异性噬菌体；
4.将细胞在250×g下离心3分钟，将上清液转移到新鲜管中，加入1×10E7 CD19阳性细胞，并通过轻轻旋转管旋转器在4℃、温育60分钟；
5.通过在250×g下离心1分钟洗涤细胞，吸出上清液，重悬于1ml PBS(8倍)中；
6.用1ml 100mM TEA进行噬菌体洗脱，在室温下温育5分钟，用500μl 1M Tris-HCl(pH7.6)中和洗脱液；
7.指数生长的大肠杆菌TG1细菌的再感染；和
8.用辅助噬菌体VCSM13感染以及随后的噬菌粒颗粒的PEG/NaCl沉淀，所述噬菌粒颗粒用于随后的选择轮中。进行3轮以上的选择。
对于两种选择方法，通过ELISA如下鉴定特异性结合剂：将100μl 30nM生物素化CD19-Fc蛋白/孔包被在中性亲和素板上。加入含Fab的细菌上清液，使用抗Flag/HRP二抗通过其Flag标签检测结合性Fab。
使用经过用含有人CD19 ECD的表达质粒(SEQ ID NO:227)瞬时转染的细胞，在基于细胞的ELISA中进一步测试在重组人CD19方面为ELISA阳性的克隆。该分析如下进行：转染后48h，收获HEK细胞，在250x g下离心5分钟。然后将细胞重悬于冰冷的PBS BSA 2％中至4x106个细胞/ml，在冰上温育20分钟以阻断非特异性结合位点。将100μl中的4×105个细胞分配到96孔板的每个孔中，并在250x g和4℃、离心3分钟。吸出上清液，将含有可溶性Fab片段的50μl细菌上清液用50μl冰冷的PBS/BSA 2％稀释，加入板中，与细胞混合，在4℃下温育1小时。然后，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，然后每孔加入100μl 含有1:2000稀释的抗Fab-HRP抗体的PBS BSA 2％。温育1小时后，用冰冷的PBS反复洗涤细胞3次。为了显色，每孔加入100μl“1步超TMB-ELISA”底物。在温育10分钟之后，将上清液转移到每孔含有40μl H2SO4的新的96孔板中，测量在450nm下的吸光度。使用ProteOn XPR36，借助于SPR分析，对显示超过背景的显著信号的克隆进行动力学筛选实验。
7.2.1.4通过SPR鉴定亲和力成熟的8B8衍生变体
为了进一步表征ELISA阳性克隆，通过表面等离子体共振测定解离速率，并与亲本人源化克隆8B8进行比较。
对于该实验，通过胺偶联(NaAcetate pH4.5，25 l/min，240s)(垂直取向)将7000RU的多克隆抗人Fab抗体固定在GLM芯片的所有6个通道上。将每种含抗体的细菌上清液过滤并用PBS稀释2倍，然后以25μl/分钟注入360s，以实现垂直取向为100-400响应单位(RU)的固定水平。单体CD19-Fc的注入：对于一步法动力学测量，将注入方向改变为水平取向，同时以50μl/min沿分开的通道1-4注入纯化的单体CD19-Fc的三倍稀释系列(在150和6nM之间的不同浓度范围)，其中结合时间为180秒，解离时间为300秒。在通道5中注入人IgGFc片段(150nM)，作为与单体CD19-Fc缓冲液(PBST)特异性结合的阴性对照，所述缓冲液沿着第六通道注入以提供用于参考的“并列”空白。通过以90μl/min(水平取向)进行30秒的10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH的两次脉冲进行再生。使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合传感图来计算解离速率常数(koff)。鉴定出具有最慢解离速率常数的表达Fab的克隆(表55)。值得注意的是，克隆5A07和5B08的解离速率常数由于拟合不充分而不能确定。然而，两个克隆都被选定，因为获得的结果表明解离非常缓慢。对相应噬菌体的可变结构域进行测序。重要的是，LCDR1中的两个天冬酰胺残基(位置27d和28)都被丝氨酸或苏氨酸替换，表明两个脱酰胺位点都被去除。比对显示在图32中。最佳克隆的CDR列于表56(轻链的可变区)和表57(重链的可变区)中(克隆5H09:(SEQ IDNO:231-236)；克隆7H07:(SEQ ID NO:237-242)；克隆2B03:(SEQ ID NO:243-248)；克隆2B11:(SEQ ID NO:249-254)；克隆5A07:(SEQ ID NO:255-260)；克隆5B08:(SEQ ID NO:261-266)；克隆5D08:(SEQ ID NO:267-272)。
表55：在用细菌上清液的筛选分析中获得的选定克隆的解离常数
克隆 解离常数kd(1/s)
亲本8B8 3.01E-4
5H09 2.58E-4
7H07 5.75E-5
2B03 3.24E-5
2B11 4.37E-6
5A07 未检出
5B08 未检出
5D08 1.95E-4
表56：选定8B8轻链的CDR序列
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表57：选定8B8重链的CDR序列
7.2.2亲和力成熟的8B8衍生抗体的表征
7.2.2.1可变抗体结构域克隆到表达载体中
将选择的抗CD19结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与人IgG1的恒定重链或恒定轻链进行框内亚克隆。根据国际专利申请公开No.WO2012/130831A1中描述的方法，在重链中已引入了Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变，以消除与Fcγ受体的结合。
抗CD19 IgG的cDNA和氨基酸序列分别显示在表58和表59中。将抗体编码序列克隆到表达载体中，所述表达载体驱动具有嵌合MPSV启动子的插入片段的转录，并含有位于CDS3'端的合成polyA信号序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
表58：P329GLALA人IgG1形式的抗CD19克隆8B8的cDNA和氨基酸序列
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表59：P329GLALA人IgG1形式的亲和力成熟的抗CD19克隆的cDNA和氨基酸序列
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7.2.2.2通过SPR进行的所选抗体的亲和力测定
为了通过SPR准确测定亲和力，使用聚乙烯亚胺，通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞而产生选择的抗CD19抗体。根据标准程序，用1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”)的相应表达载体转染细胞。转染后7天，测定上清液中的抗体效价，并将所有效价平衡至10μg/ml。
使用ProteOn XPR36仪(Biorad)，通过SPR在25℃、测定亲本抗体8B8及其衍生物的亲和力(KD)。通过胺偶联(NaAcetate pH4.5，25μl/min，240s)(垂直取向)将7000RU的多克隆抗人Fab抗体固定在GLM芯片的所有6个通道上。过滤每种含抗体的HEK上清液，用PBST(10mM磷酸盐、150M氯化钠pH7.4、0.005％吐温20)稀释至10μg/ml的浓度，然后以25μl/分钟注入360s以达到在垂直取向上在500和800响应单位(RU)之间的固定水平。单体CD19-Fc的注入：对于一步法动力学测量，将注入方向改变为水平取向，同时以50μl/min沿分开的通道1-4注入纯化的单体CD19-Fc的三倍稀释系列(在150和6nM之间的不同浓度范围)，其中结合时间为180秒，解离时间为300秒。将人IgG Fc片段(150nM)注入通道5中，作为与单体CD19-Fc特异性结合的阴性对照。沿着第六通道注入缓冲液(PBST)以提供用于参考的“并列”空白。对应的传感图的概述如图33所示。通过以90μl/min(垂直取向)进行30秒的10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH的两次脉冲进行再生。使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。动力学和热力学数据的总结如表60所示。与其亲本克隆8B8相比，所有亲和力成熟克隆的解离常数均提高。
表60：在抗CD19 huIgG1与人CD19之间相互作用的动力学和热力学数据总结
克隆 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
亲本8B8 5.66E+4 1.34E-4 2.36E-9
5H09 7.91E+4 1.50E-5 1.89E-10
7H07 7.45E+4 5.57E-5 7.47E-10
2B03 6.02E+4 5.00E-5 8.31E-10
2B11 6.34E+4 3.14E-5 4.95E-10
5A07 6.98E+4 3.07E-5 4.40E-10
5B08 6.81E+4 5.26E-5 7.72E-10
5D08 8.88E+4 8.44E-5 9.51E-10
7.2.2.3抗CD19 IgG1 P329G LALA的制备和纯化
使用聚乙烯亚胺，通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞而产生选择的抗CD19抗体。用1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”)的相应表达载体转染细胞。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA 细胞。在转染之前，细胞在210x g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。在20mL CD CHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％的含有补充剂的补料。培养7天后，通过在210x g下离心15分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过如上所述的用于纯化抗原Fc融合物的使用蛋白A的亲和色谱法来进行来自细胞培养上清液的抗体分子的纯化。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用20mM组氨酸、140mMNaCl溶液(pH 6.0)平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的OD来确定纯化抗体的蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(Invitrogen,USA)的情况下，使用LabChipGXII(Caliper)，通过CE-SDS分析抗体的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mML-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SWXL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析抗体样品的聚集物含量(表61)。
表61：抗CD19 P329G LALA IgG1克隆的生物化学分析
为了制备双特异性构建体，选择克隆2B11是因为它缺乏三个脱酰胺热点。
根据Uniprot数据库的P41273序列，合成了编码人4-1BB配体的胞外域部分(氨基酸71-254和71-248)的DNA序列。
7.2.3具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.1)的制备
如构建体3.1(图30)所述制备构建体4.1，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表62显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.1)的cDNA和氨基酸序列。
表62：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体4.1)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
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7.2.4具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.2)的制备
如构建体3.2(图30)所述制备构建体4.2，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表63显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.2)的cDNA和氨基酸序列。
表63：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体4.2)的cDNA和氨基酸序列。
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7.2.5二价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.3)的制备
如构建体3.3(图30)所述制备构建体4.3，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表64显示了二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.3)的cDNA和氨基酸序列。
表64：二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)PGLALA融合物(构建体4.3)的cDNA和氨基酸序列。
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7.2.6具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.4)的制备
如构建体3.4(图30)所述制备构建体4.4，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表65显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.4)的cDNA和氨基酸序列。
表65：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体4.4)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
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7.2.7具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.5)的制备
如构建体3.5(图30)所述制备构建体4.5，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表66显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.5)的cDNA和氨基酸序列。
表66：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体4.5)的cDNA和氨基酸序列。
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7.2.8二价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.6)的制备
如构建体3.6(图30)所述制备构建体4.6，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表67显示了二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.6)的cDNA和氨基酸序列。
表67：二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体4.6)的cDNA和氨基酸序列。
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7.3非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合物和作为对照分子的人IgG的制备
7.3.1非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备
如上对于CD19靶向的构建体3.1(称为对照B)、3.3(称为对照C)、3.4(称为对照D)和3.5(称为对照E)所述制备了对照分子，唯一的区别是抗CD19结合剂(VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照(参见图30)。
表68分别显示了包含具有带电残基的交叉CH-CL的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物对照B的cDNA和氨基酸序列。
表69分别显示了二价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物对照C的cDNA和氨基酸序列。
表70分别显示了包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物对照D的cDNA和氨基酸序列。
表71分别显示了在CH-CL交叉中无带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物对照E的cDNA和氨基酸序列。
表68：具有CH-CL交叉且具有带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(对照B)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
表69：二价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(对照C)的cDNA和氨基酸序列。
表70：具有CH-CL交叉且具有带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(对照D)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
表71：具有CH-CL交叉且无带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(对照E)的cDNA和氨基酸序列。
7.3.2作为对照分子的抗体
制备含有PGLALA的两种对照人IgG1。
表72显示了抗CD19 huIgG1 PGLALA(克隆8B8-018)即对照G的cDNA和氨基酸序列。
表73显示了种系对照DP47 huIgG1 PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列。
表72：抗CD19(8B8-018)huIgG1 PGLALA(对照G)的cDNA和氨基酸序列
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表73：种系对照DP47 huIgG1 PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列
7.4CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合抗原结合分子及其对照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子。用相应的表达载体转染细胞。对于变体1、2、4、5及其对照B、D和E，比率为1:1:1:1(“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合-CH1载体”:“抗CD19 Fab穴链载体“:”抗CD19轻链载体“)。对于变体3、6及其对照C，比率为1:1:1(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗CD19轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用1:1比率的轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后一天，加入12％补料(氨基酸和葡萄糖)。培养7天后，通过在至少400x g下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子以及IgG，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用Coomassie SimpleBlueTMSafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表74总结了CD19靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合抗原分子的产率和最终单体含量。
表74：CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的生物化学分析
表75总结了单价(对照B、D和E)和二价(对照C)的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合物的产率和最终单体含量。
表75：DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
表76总结了抗CD19(8B8-018)和种系DP47人IgG1 PGLALA(对照F)的产率和最终单体含量。
表76：人IgG1 PGLALA对照的生物化学分析
实施例8
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
8.1.表面等离子体共振(亲和力)
通过表面等离子体共振(SPR)评估CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合抗原结合分子(构建体3.4和3.6)与重组4-1BB Fc(kih)和CD19的结合。所有SPR实验均在25℃、在Biacore T200上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15MNaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。
与人和食蟹猴4-1BB的相互作用
使用标准胺偶联试剂盒(Biacore,Freiburg/Germany)，将抗人Fab抗体(Biacore,Freiburg/Germany)在pH 5.0下直接偶联在CM5芯片上。固定化水平大致为8000RU。以2nM和5nM捕获CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合物60秒(还注入对照D)。使2.7至2000nM浓度范围(3倍稀释)的重组人或食蟹猴4-1BB avi His以30μL/分的流速通过流动池120秒。监测解离180秒。通过减去在参考流动池上获得的响应来校正本体折射率的差异。在这里，使固定化的抗人Fab抗体在抗原的表面上流过，但在抗原表面上已经注入了除抗体之外的HBS-EP。
与CD19的相互作用
使用标准胺偶联试剂盒(Biacore,Freiburg/Germany)，将抗人Fab抗体(Biacore,Freiburg/Germany)在pH 5.0下直接偶联在CM5芯片上。固定化水平大致为8000RU。以20nM捕获CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合物或对照抗体(抗CD19(8B8-018)huIgG1PGLALA)60秒。使7.8至500nM浓度范围(2倍稀释)的重组人CD19-Fc(kih)以30μL/分的流速通过流动池120秒。监测解离120/1800秒。通过减去在参考流动池上获得的响应来校正本体折射率的差异。在这里，使固定化的抗人Fab抗体在抗原的表面上流过，但在抗原表面上已经注入了除抗体之外的HBS-EP。
使用Biacore T200 Evaluation Software(vAA,Biacore AB,Uppsala/Sweden)推导动力学常数，通过数值积分拟合1:1Langmuir结合的速率方程。
双特异性构建体3.4、3.6和对照D相似地与4-1BB结合。表77显示了来自两个实验(使用2nM或5nM的构建体捕获溶液)的标准偏差(括号中)的平均值。双特异性构建体3.4和3.6以与IgG相似的亲和力结合人CD19。通过拟合到1:1Langmuir结合来确定相互作用的亲和常数。对于hu4-1BB和cy4-1BB的测量，显示了平均值和标准偏差(括号中)(两个实验使用2nM或5nM捕获溶液)。
表77：CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合物与重组人(hu)4-1BB、食蟹猴(cy)4-1BB和人(hu)CD19的结合。
8.2.表面等离子体共振(同时结合)
通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人CD19的能力。所有SPR实验均在25℃、在Biacore T200上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPESpH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。将生物素化的人4-1BB Fc(kih)与链霉亲和素(SA)传感器芯片的流动池直接偶联。使用高达250个共振单位(RU)的固定化水平。
使200nM浓度范围的CD19靶向的三聚体的分拆的4-1BBL构建体(构建体3.1、3.3、3.4、3.5、3.6、4.4)以30μL/分的流速通过流动池90秒，并且将解离设置为零秒。以500nM的浓度将人CD19作为第二分析物以30μL/分的流速注入通过流动池90秒(图34)。监测解离120秒。通过减去在参考流动池中获得的响应来校正本体折射率的差异，其中参考流动池没有固定化的蛋白质。
从图35的曲线图可以看出，所有双特异性构建体可以同时结合人4-1BB和人CD19。
实施例9
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
9.1.CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在活化的人PBMC上的结合
为了确定含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子与人PBMC的结合，在如实施例5.2所述的测定中使用不同滴定浓度的CD19靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子。
图36A和36B分别显示在实施例7中制备的构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6在表达4-1BB的活化CD4+和CD8+T细胞上的结合。设门于活的CD45+CD3+CD4+或CD45+CD3+CD8+T细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合变体的滴定浓度进行印迹。表78显示了对构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6和对照分子测量的EC50值。
表78：在表达4-1BB的活化CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
9.2与表达CD19的肿瘤细胞结合
对于表达CD19的肿瘤细胞的结合测定，使用以下表达人CD19的淋巴瘤细胞系：弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞系SU-DHL-8(DSMZ ACC573)、急性前体B细胞淋巴样白血病细胞系Nalm6(DSMZ ACC-128)、弥漫性大细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞系Toledo(ATCC CRL-2631)和弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系OCI-Ly18(DSMZ ACC-699)。如实施例5.3中针对表达FAP的MV-3和WM-266-4肿瘤细胞系所述进行测定。
设门于活的肿瘤细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合构建体的滴定浓度进行印迹。
图37A显示了实施例7.1中制备的构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6与弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞系SU-DHL-8的结合，并且在图37B中显示了构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6与急性前体B细胞淋巴样白血病细胞系Nalm6的结合。图37C显示了构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6与弥漫性大细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞系Toledo的结合，并且图37D显示了构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6与弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系OCI-Ly18的结合。表79显示了对构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6和对照分子测量的EC50值。
表79：与表达CD19的肿瘤细胞结合
实施例10
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性
10.1.在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NF-κB活化
如实施例6.1所述生成表达人4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞。
与表达CD19的肿瘤细胞共培养的表达人4-1BB的Hela细胞中的NF-κB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/ml。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有滴定浓度的CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(CD19分拆4-1BBL三聚体)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)的培养基。将表达CD19的B细胞淋巴瘤细胞系(弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞系SU-DHL-8(DSMZACC573)和人B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系Pfeiffer(ATCC CRL-2632))重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的DMEM培养基中，浓度为2x106个细胞/ml。
向每个孔中加入表达CD19的B细胞淋巴瘤细胞悬液(50μl，最终比率1:5)或仅加入培养基，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。细胞用200μL/孔的DPBS洗涤两次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)在室温下解冻。将100μL的检测缓冲液加入每个孔中，使用SpectraMax M5/M5e酶标仪和以URL计数光发射(0.5s/孔的释放光单位数)的SoftMax Pro Software(MolecularDevices)或Victor3 1420多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和将光发射计数为每秒计数(CPS)的Perkin Elmer 2030Manager Software，尽可能快地测量萤光素酶活性，并针对测试构建体的浓度进行印迹。
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体3.1和3.3在存在表达CD19的B细胞淋巴瘤细胞的情况下触发了报告细胞系中的NF-kB信号通路的激活。相比之下，非靶向的对照分子在任何测试浓度下都不能触发这种效应(图38)。
实施例11
11.1CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
11.1.1抗CEA克隆T84.66的人源化
通过将CDR移植到人种系框架受体序列上，开发了鼠抗体T84.66的新型人源化变体(Wagener等人，J Immunol 130,2308(1983),Neumaier等人，J Immunol 135,3604(1985))。
来自非人源的抗体的人源化主要包括将来自非人抗体(供体)的CDR残基移植到人(受体)抗体的框架上。通常，通过如下方式选择受体框架：将供体的序列与潜在受体序列的集合比对并选择与供体具有合理同源性、或在某些位置显示出对结构和活性关键的相似氨基酸的受体框架。在当前的情况下，通过如下方式进行抗体受体框架的搜索：将小鼠T84.66蛋白(重链(SEQ ID NO:317)的NCBI登录号CAA36980，轻链(SEQ ID NO:318)的NCBI登录号CAA36979)序列与人类种系序列的集合进行比对，并挑选显示出高序列同一性的人序列。这里，从IMGT数据库选择序列IGHV1-69*08作为重链框架受体序列(IMGT登录号Z14309，SEQID NO:319)并且选择IGKV3-11*01序列(IMGT登录号X01668，SEQ ID NO:320)作为轻链的框架受体。在这两个受体框架上，移植了小鼠重链和轻链可变结构域的三个互补决定区(CDR)。由于框架4(FR4)区不是种系V基因的可变区的一部分，因此单独进行该位置的比对。对于重链选择JH4序列，并且对于轻链选择JK2序列。
11.1.2T84.66 IgG的不同人源化变体与细胞的结合
检测T84.66 IgG的不同人源化变体在表达CEA的人胃腺癌细胞(MKN45，DSMZ ACC409)上的结合。
收获细胞，计数，检查活力，并以2x106个细胞/ml重悬于FACS缓冲液(100 1PBS0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在圆底96孔板中在4℃、温育30分钟，逐渐增加CEA IgG的浓度(4ng/ml-60μg/ml)，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃、用PE缀合的AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性二抗(Jackson Immuno ResearchLab PE#109-116-170)进一步在再次温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，并使用FACSCantoII(Software FACS Diva)通过FACS立即进行分析。使用GraphPadPrism5获得并计算结合曲线和EC50值。
图39显示了选择的T84.66 IgG的人源化变体与在MKN45细胞上表达的人CEA的不同结合模式。基于计算的EC50结合值(表80)，选择人源化变体1用于进一步评价。
表80：T84.66 IgG的不同人源化变体与细胞的结合(EC50值，基于图39所示的结合曲线，通过Graph Pad Prism进行计算)。
EC50(μg/ml)
亲本嵌合的T84.66 0.99
人源化变体1 1.5
人源化变体2 8.6
人源化变体3 1.4
人源化变体4 3.1
人源化变体5 -
人源化变体6 -
人源化变体1在下文称为T84.66-LCHA。其CDR以及VH和VL的氨基酸序列连同亲本嵌合T84.66克隆的VH和VL结构域的氨基酸序列示于表81中。
表81：CEA克隆T84.66-LCHA及其亲本抗体T84.66的可变结构域的氨基酸序列
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11.2CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P41273序列(SEQ ID NO:42)，合成了编码人4-1BB配体的胞外域部分(氨基酸71-254和71-248)的DNA序列的不同片段。
11.2.1具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.1)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图29B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CEA-Fc穴链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA的Fab(图40，构建体5.1)。
表82显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.1)的cDNA和氨基酸序列。
表82：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体5.1)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
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11.2.2具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.2)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CEA-Fc穴链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA的Fab(图40，构建体5.2)。
表83显示了具有无带电残基的交叉CH-CL的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.2)的cDNA和氨基酸序列。
表83：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体5.2)的cDNA和氨基酸序列
11.2.3二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.3)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CEA huIgG1节单体配体链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CEA的Fab(图40，构建体5.3)。
表84显示了二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.3)的cDNA和氨基酸序列。
表84：二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)PGLALA融合物(构建体5.3)的cDNA和氨基酸序列
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11.2.4具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.4)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA的Fab(图40，构建体5.4)。
表85显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.4)的cDNA和氨基酸序列。
表85：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体5.4)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
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11.2.5具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.5)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CEA-Fc穴链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的Fab(图40，构建体5.5)。
表86显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.5)的cDNA和氨基酸序列。
表86：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体5.5)的cDNA和氨基酸序列
11.2.6二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.6)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CEA huIgG1节单体配体链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CEA的Fab(图40，构建体5.6)。
表87显示了二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.6)的cDNA和氨基酸序列。
表87：二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体5.6)的cDNA和氨基酸序列
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11.2.7具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CEA(T84.66)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.7)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图29B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CEA(克隆T84.66)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA的Fab。构建体5.7对应于构建体5.1，如图40所示。
表88显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.7)的cDNA和氨基酸序列。
表88：包含具有带电残基的交叉CH-CL的单价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体5.7)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
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11.2.8二价的CEA(T84.66)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.8)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CEA(克隆T84.66)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CEA huIgG1节单体配体链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CEA的Fab。构建体5.8对应于构建体5.3，如图40所示。
表89显示了二价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.8)的cDNA和氨基酸序列。
表89：二价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)PGLALA融合物(构建体5.8)的cDNA和氨基酸序列
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11.3非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合分子和作为对照分子的人IgG的制备
11.3.1非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备
如上对于CEA靶向的构建体3.1(称为对照B)、3.3(称为对照C)、3.4(称为对照D)和3.5(称为对照E)所述制备了对照分子，唯一的区别是抗CD19结合剂(VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照(参见图40)。包含具有带电残基的交叉CH-CL的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(对照B)的cDNA和氨基酸序列显示在表68中(参见实施例7.3.1)。表69显示了二价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(对照C)的cDNA和氨基酸序列。表70显示了包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(对照D)的cDNA和氨基酸序列。表71显示了在CH-CL交叉中无带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(对照E)的cDNA和氨基酸序列。
11.3.2作为对照分子的抗体
在测定中使用的另外的对照(称为对照F)是DP47非靶向的种系对照(人IgG1)，其含有Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除与Fcγ受体的结合。对照F的cDNA和氨基酸序列可以在上面的表73中找到。
11.4CEA靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合抗原结合分子及其对
照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物。用相应的表达载体转染细胞。对于变体1、2、4、5及其对照B、D和E，比率为1:1:1:1(“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合-CH1载体”:“抗CEA Fab穴链载体“:”抗CEA轻链载体“)。对于变体3、6及其对照C，比率为1:1:1(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗CEA轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用1:1比率的轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后一天，加入12％补料(氨基酸和葡萄糖)。培养7天后，通过在至少400x g下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物以及IgG，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GEHealthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTMSafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表90总结了CEA靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表90：CEA靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
表91总结了单价(对照B、D和E)和二价(对照C)的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合分子以及种系DP47人IgG1 PGLALA(对照F)的产率和最终单体含量。
表91：DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
实施例12
CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
12.1表面等离子体共振(同时结合)
作为CEA靶向的三聚体分拆4-1BBL构建体的抗原的hu NA3B3A2的产生
用于通过SPR评估与CEA结合的抗原是由来自人CEACAM5(CEA)的A3和B3结构域以及来自人CEACAM1(BGP1)的N和A2结构域组成的杂交分子，类似于针对NABA所述(Durbin H.等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1994May10；91(10):4313-7)。在这里的抗原称为NA3B3A2，其示意性描述可以在图41A中找到。
表92显示了hu NA3B3A2-avi-His的核苷酸和氨基酸序列。
表92：hu NA3B3A2-avi-His的核苷酸和氨基酸序列
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如上对Fc融合蛋白所描述(实施例7.1.1)进行蛋白质生产。通过螯合色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。第一个色谱步骤在20mM磷酸钠、500nM氯化钠(pH7.4)中平衡的NiNTA Superflow Cartridge(5ml,Qiagen)上进行。通过施加超过12个柱体积的5％到45％梯度的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、500nM氯化钠、500mM咪唑，pH7.4)的洗脱缓冲液进行洗脱。
将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用20mM组氨酸、140mM NaCl、0.01％吐温20pH6.0平衡的HiLoad Superdex 75柱(GE Healthcare)上。表93总结了人NA3B3A2-avi-His的产率和最终单体含量。
表93：人NA3B3A2-avi-His的生物化学分析
通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人NA3B3A2的能力。所有SPR实验均在25℃、在Biacore T200上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。将生物素化的人4-1BB Fc(kih)与链霉亲和素(SA)传感器芯片的流动池直接偶联。使用高达250个共振单位(RU)的固定化水平。
使200nM浓度范围的CEA靶向的三聚体的分拆的4-1BBL构建体(构建体5.4、5.6、5.7和5.8)以30μL/分的流速通过流动池90秒，并且将解离设置为零秒。以500nM的浓度将人NA3B3A2作为第二分析物以30μL/分的流速注入通过流动池90秒(图41B)。监测解离120秒。通过减去在参考流动池中获得的响应来校正本体折射率的差异，其中参考流动池没有固定化的蛋白质。
从图42的曲线图可以看出，所有双特异性构建体可以同时结合人4-1BB和人NA3B3A2。
12.2.CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在活化的人PBMC上的结合
为了确定含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子与人PBMC的结合，在如实施例5.2所述的测定中使用不同滴定浓度的CEA靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子。
图43显示了在实施例11中制备的构建体5.4、5.6、5.7和5.8分别在表达4-1BB的活化CD4+和CD8+T细胞上的结合。设门于活的CD45+CD3+CD4+或CD45+CD3+CD8+T细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合变体的滴定浓度进行印迹。表94显示了对构建体5.4、5.6、5.7和5.8以及对照分子测量的EC50值。
表94：在表达4-1BB的活化CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
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12.2与表达CEA的肿瘤细胞结合
对于表达CEA的肿瘤细胞的结合测定，使用以下表达人CEA的淋巴瘤细胞系：表达CEA的肿瘤细胞系人胃癌细胞系MKN-45(ATCC TCP-1008)和人结肠直肠腺癌细胞系LS180(ATCC CL-187)。如实施例5.3中针对表达FAP的MV-3和WM-266-4肿瘤细胞系所述进行测定。
设门于活的肿瘤细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合构建体的滴定浓度进行印迹。
图44显示了实施例11.2.7中制备的构建体5.7与表达人CEA的人胃细胞系MKN-45(左)和人结肠直肠腺癌细胞系LS180(右)的结合。表95显示了对表达人CEA的人胃细胞系MKN-45测量的EC50值。
表95：与表达CEA的肿瘤细胞结合
实施例13
CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性
13.1.在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NF-κB活化
如实施例6.1所述生成表达人4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞。
与表达人CEA的肿瘤细胞共培养的表达人4-1BB的Hela细胞中的NF-κB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS 和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/ml。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有滴定浓度的CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(CEA分拆4-1BBL三聚体)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)的培养基。将表达CEA的肿瘤细胞系人胃癌细胞系MKN-45(ATCC TCP-1008)重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的DMEM培养基中，浓度为2x 106个细胞/ml。
向每个孔中加入表达CEA的B细胞淋巴瘤细胞悬液(50μl，最终比率1:5)或仅加入培养基，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。细胞用200μL/孔的DPBS洗涤两次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)在室温下解冻。将100μL的检测缓冲液加入每个孔中，使用SpectraMax M5/M5e酶标仪和以URL计数光发射(0.5s/孔的释放光单位数)的SoftMax Pro Software(MolecularDevices)或Victor3 1420多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和将光发射计数为每秒计数(CPS)的Perkin Elmer 2030Manager Software，尽可能快地测量萤光素酶活性，并针对测试构建体的浓度进行印迹。
CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体5.7和5.8在存在人胃癌细胞系MKN-45细胞的情况下触发了报告细胞系中的NF-kB信号通路的激活。相比之下，非靶向的对照分子在任何测试浓度下都不能触发这种效应(图45)。表96显示了相应的EC50值。
表96：与表达CEA的肿瘤细胞结合
实施例14
14.1FAP靶向的含有OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P23510序列，合成了编码人OX40配体的胞外域部分(氨基酸51-183)的DNA序列。为了降低由于糖基化引起的人Ox40配体的异质性，通过定点诱变将位置90和114的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸(根据Compaan D.M.,Hymowitz S.G.,Structure(2006)14(8),1321-30)。
将含有被(G4S)2接头分开的OX40配体的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图46A描绘：人OX40配体、(G4S)2接头、人OX40配体、(G4S)2接头、人CL。
将含有OX40配体的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图46B描述：人OX40配体、(G4S)2接头、人CH。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
将编码对FAP(克隆28H11)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的OX40配体和结合FAP的Fab(图46C，构建体6.1)。
表97显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的OX40配体(51-183)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体6.1)的cDNA和氨基酸序列。
表97：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的FAP(28H1)靶向的分拆三聚体的OX40配体Fc(kih)融合物(构建体6.1)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
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14.2作为对照F的非靶向人IgG1的制备
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831中描述的方法，在测定法中使用的称为对照F(图46D)的对照分子为DP47非靶向的种系对照人IgG1，其含有Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变，以消除与Fcγ受体的结合。其制备描述于实施例2.3中，表29显示了非靶向的DP47 huIgG1PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列。
14.3FAP靶向的分拆三聚体的OX40配体Fc融合抗原结合分子及其对照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的OX40配体Fc(kih)融合物编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的OX40配体Fc(kih)融合物。用相应的表达载体转染细胞。对于变体1、2、4、5及其对照B、D和E，比率为1:1:1:1(“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合-CH1载体”:“抗FAP Fab穴链载体“:”抗FAP轻链载体“)。对于变体3、6及其对照C，比率为1:1:1(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗FAP轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用1:1比率的轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后一天，加入12％补料(氨基酸和葡萄糖)。培养7天后，通过在至少400x g下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化分拆三聚体的OX40配体Fc(kih)融合抗原结合分子以及IgG，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTMSafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表98总结了FAP靶向的分拆三聚体的Ox40配体Fc(kih)融合抗原结合分子以及种系DP47人IgG1 PGLALA(对照F)的产率和最终单体含量。
表98：CEA靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
实施例15
靶向的含有OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
15.1与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
使用WM-266-4细胞(ATCC CRL-1676)检测与细胞表面FAP的结合。将0.5x105个WM-266-4细胞加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。将细胞在含有逐步滴加的抗Ox40抗体构建体的50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液(Gibcoby Life Technologies，目录号14190 326)和BSA(0.1％v/w,Sigma-Aldrich，目录号A9418)中在4℃、在黑暗中染色120分钟。用过量的FACS缓冲液洗涤三次后，将细胞在25μL/孔4℃的含有荧光素异硫氰酸酯(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109 096 098)的4℃冷FACS缓冲液中在4℃染色45分钟。
最后将板重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的90μL/孔FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图47A所示，单价的FAP(28H1)靶向的分拆三聚体的Ox40配体Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP-OX40L)而不是阴性对照F有效结合于表达人FAP的靶细胞。结合FAP阳性WM-266-4的EC50值为[6.9nM]。
15.2与OX40和FAP阴性肿瘤细胞的结合
使用表达局限于细胞核的NucLight Red荧光蛋白的A549 NucLightTMRed细胞(Essenbioscience，目录号4491)，检测与OX40阴性FAP阴性肿瘤细胞结合的缺乏，以允许将其从未标记的人FAP阳性WM266-4细胞分离。遵循标准Essen方案，在8μg/ml聚凝胺的存在下，用Essen CellPlayer NucLight Red Lentivirus(Essenbioscience，目录号4476；EF1α，嘌呤霉素)以3(TU/池)的MOI转导亲本A549(ATCC CCL-185)。
将5×104个未标记的WM266-4细胞和未标记的A549 NucLightTMRed细胞在FACS缓冲液中的混合物加入到圆底悬浮细胞96孔板的每个孔中，如第15.1节所述进行结合测定。
如图47B所示，FAP-OX40L不与OX40阴性FAP阴性人肿瘤细胞结合。
15.3与表达人OX40的细胞：幼稚和活化的人外周血单核细胞白细胞(PBMC)的结合
从Zürich献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC)，用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies，目录号14190 326)稀释血沉棕黄层。向50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)中提供15mL Histopaque 1077(SIGMA LifeScience，目录号10771、聚蔗糖和泛影酸钠，调节至1.077g/mL密度)并且使该血沉棕黄层溶液在Histopaque 1077上分层。将管在400x g、室温以及低加速度和无中断的条件下离心30分钟。然后从界面收集PBMC，用DPBS洗涤三次，重悬于由RPMI 1640培养基(Gibco by LifeTechnology，目录号42401-042)组成的T细胞培养基中，所述RPMI 1640培养基补充有10％胎牛血清(FBS,Gibco by Life Technology,目录号16000-044，批号941273，γ照射的，无支原体且在56℃热灭活35分钟)、1％(v/v)GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies，目录号35050 038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA，目录号S8636)、1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA，目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇(SIGMA，M3148)。
在分离后直接使用PBMC(在静息的人PBMC上的结合)，或者刺激它们在T细胞的细胞表面上接受强的人Ox40表达(在活化的人PBMC上的结合)。因此，在6孔组织培养板中将幼稚PBMC在补充有200U/mL普留净(Novartis)和2μg/mL PHA-L(Sigma-Aldrich,L2769-10)的T细胞培养基中培养4天，然后在37℃和5％CO2下在预包被的6孔组织培养板[4μg/mL]抗人CD3(克隆OKT3,eBioscience，目录号16-0037-85)和[2μg/mL]抗人CD28(克隆CD28.2,eBioscience，目录号16-0289-85]上在补充有200U/mL普留净的T细胞培养基中培养过夜。
为了检测，将Ox40幼稚的人PBMC和活化的人PBMC混合。为了从活化的人PBMC中区分幼稚的人PBMC，使用eFluor670细胞增殖染料(eBioscience，目录号65-0840-85)在结合测定之前标记幼稚细胞。
为了标记细胞，收获细胞，用预热的(37℃)DPBS洗涤，并在DPBS中调节至1x107个细胞/mL的细胞密度。将eFluor670细胞增殖染料(eBioscience，目录号65-0840-85)加入到幼稚的人PBMC的悬液中，终浓度为在DPBS中的2.5mM，最终细胞密度为0.5x107个细胞/mL。然后将细胞在室温下在黑暗中温育10分钟。为了停止标记反应，加入4mL热灭活的FBS，用T细胞培养基洗涤细胞三次。然后将1x105个静息的eFluor670标记的人PBMC和0.5x105个未标记的活化的人PBMC的二比一混合物加入到圆底悬浮细胞96孔板(greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。
在含有逐步滴加的抗Ox40抗体构建体的50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，细胞在4℃在黑暗中染色120分钟。用过量的FACS缓冲液洗涤三次后，在25μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，在4℃在黑暗中将细胞染色45分钟，所述FACS缓冲液含有荧光标记的抗人CD4抗体(克隆RPA-T4，小鼠IgG1 k，BioLegend，目录号300532))、抗人CD8抗体(克隆RPa-T8，小鼠IgG1 k，BioLegend，目录号3010441)和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录-号109-096-098)的混合物。
最后将板重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的90μL/孔FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图48A和48B所示，FAP-OX40L不与OX40阴性的静息的人CD4+T细胞或CD8+T细胞结合。相比之下，FAP-OX40L与表达OX40的活化的CD8+或CD4+T细胞结合。与CD4+T细胞的结合比与CD8+T细胞的结合强得多。活化的人CD8+T细胞仅表达在活化的CD4+T细胞上检测到的OX40水平的一部分。OX40的表达水平取决于刺激的动力学和强度，在这里针对CD4+T细胞而不是针对CD8+T细胞上的OX40表达而将这些条件优化。因此，在CD8 T细胞上仅诱导很少的OX40表达。与OX40阳性CD4+或CD8+T细胞结合的EC50值为[0.15nM]。
15.4在表达人OX40和报告基因NFκB-萤光素酶的HeLa细胞中的NFκB激活
Ox40与其配体的激动性结合通过激活核因子κB(NFκB)而诱导下游信号转导(A.D.Weinberg等人，J.Leukoc.Biol.2004,75(6),962-972)。生成了重组报告细胞系HeLa_hOx40_NFkB_Luc1，以便在其表面上表达人Ox40。另外，它包含报告基因质粒，所述报告基因质粒含有在NFκB敏感性增强子区段控制下的萤光素酶基因。Ox40触发诱导在细胞核中易位的NFκB的剂量依赖性激活，后者在报告基因质粒的NFκB敏感增强子上结合以增加萤光素酶蛋白的表达。萤光素酶催化萤光素氧化，生成发光的氧化萤光素。这可以通过发光计进行定量。因此，分析了各种抗Ox40分子在HeLa_hOx40_NFkB_Luc1报告细胞中诱导NFκB激活的能力，作为生物活性的量度。
使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，目录号13151-014)在37℃收获粘附的HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞10分钟。细胞用DPBS洗涤一次，在其组成为MEM(Invitrogen，目录号22561-021)、10％(v/v)热灭活的FBS、1mM丙酮酸钠和1％(v/v)非必需氨基酸的测定培养基中调整至1.33x105的细胞密度。将细胞以0.2*105个细胞/孔的密度接种在具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)中，并在培养箱(Hera Cell150)中在37℃和5％CO2下保持过夜。
次日，通过加入含有逐步滴加的FAP-Ox40L或阴性对照F的测定培养基，将HeLa_hOx40_NFkB_Luc1刺激5小时。为了检测超交联对抗Ox40抗体的作用，以1:2的比例加入(二级抗体比一级抗体多2倍)25μL/孔的含有二级抗体抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,109-006-098)的培养基。温育后，吸出上清液，用DPBS将板洗涤两次。根据制造商的说明，使用萤光素酶100测定系统和报告子裂解缓冲液(均来自Promega，目录-号E4550和目录号E3971)进行光发射的定量。简言之，通过加入每孔30μL1x裂解缓冲液将细胞在-20℃下裂解10分钟。将细胞在37℃、解冻20分钟，然后加入每孔90μL的所提供的荧光素酶测定试剂。利用SpectraMax M5/M5e酶标仪(Molecular Devices,USA)，使用500ms积分时间立即将发光定量，没有收集所有波长的任何滤光片。通过HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞的基础发光校正发射的相对光单位(URL)，并使用Prism4(GraphPadSoftware,USA)针对一级抗体的对数浓度进行印迹。使用内置的S形剂量反应来拟合曲线。
如图49所示，通过向报告细胞系添加FAP-Ox40L(左侧)已经诱导了有限的剂量依赖性NFkB活化。借助于抗人IgG特异性二级抗体的FAP-Ox40L的超交联以浓度依赖性方式增加了NFκB介导的萤光素酶激活的诱导(右侧)。
因此，我们通过FAP+肿瘤细胞系检测了与构建体超交联的FAP-Ox40L的NFkB激活能力。
检测的肿瘤细胞系为NIH/3T3-huFAP克隆39。通过用表达载体pETR4921转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC CRL-1658)生成了NIH/3T3-huFAP克隆39，用于在1.5μg/mL嘌呤霉素选择下表达huFAP。根据制造商的说明，使用Quifikit(Dako目录号K0078)将FAP的表面表达定量。用于检测细胞表面FAP表达的一级抗体是人/小鼠交叉反应性克隆F11-24(小鼠IgG1,Calbiochem，目录号OP188)。NIH/3T3-huFAP克隆39的表面表达为每个细胞大约90000huFAP。
如前文中所述，将粘附的HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞以每孔0.2*105个细胞的细胞密度培养过夜，并用含有逐步滴加的FAP-Ox40L的测定培养基刺激5小时。为了检测经由细胞表面FAP结合的超交联效应，以25μL/孔的含有FAP+肿瘤细胞NIH/3T3-huFAP克隆39的培养基以3比1比率进行共培养(每孔FAP+肿瘤细胞为报告细胞的三倍)。通过使用萤光素酶100测定系统和报告子裂解缓冲液(均来自Promega，目录号E4550和目录-号E3971)测量光发射将激活的NFκB定量。
如图50A所示，当加入FAP-Ox40L时，表达FAP的肿瘤细胞的存在强烈增加了NFκB介导的萤光素酶活化的诱导。将各个印迹的剂量-反应曲线的曲线下面积定量，作为每个构建体的激动能力的标志。如图50A所示，呈现FAP的细胞表面的存在确保了更高的交联、以及因此比加入Fc特异性二级抗体更好的FAP-Ox40L的激动效应。
15.5 OX40介导的次最佳TCR触发的静息人PBMC的共刺激和借助于细胞表面FAP的超交联
在实施例15.4中显示，通过提供OX40受体的强寡聚化，加入FAP+肿瘤细胞可以强烈增加人Ox40阳性报告细胞系中由FAP靶向的OX40L诱导的NFkB活性。同样地，我们检测了FAP-OX40L构建体在NIH/3T3-huFAP克隆39细胞的存在下补救静息人PBMC细胞的次最佳TCR刺激的能力。
人PBMC制剂含有(1)静息Ox40阴性CD4+和CD8+T细胞和(2)在其细胞表面上具有各种Fcγ受体分子的抗原呈递细胞，例如B细胞和单核细胞。人IgG1同种型的抗人CD3抗体可以与其Fc部分结合至当前的Fcγ受体分子并且在静息Ox40阴性CD4+和CD8+T细胞上介导延长的TCR活化。然后，这些细胞在数小时内开始表达Ox40。针对Ox40的功能性激动化合物可以通过活化的CD8+和CD4+T细胞上存在的Ox40受体发信号并支持TCR介导的刺激。
在照射的FAP+NIH/3T3-huFAP克隆39细胞和逐步滴加的FAP-Ox40L存在的情况下，使用次最佳浓度的抗CD3抗体将静息的CFSE标记的人PBMC刺激5天。通过流式细胞术监测总细胞计数和活细胞中的CFSE稀释度，分析对T细胞存活和增殖的影响。
使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，目录号13151-014)在37℃收获小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3-huFAP克隆39细胞(参见实施例15.4)10分钟。细胞用DPBS洗涤一次。在无菌96孔圆底粘附组织培养板(TPP，目录号92097)中，在37℃、并且在5％CO2的培养箱(HeraCell 150)中以0.2*105个细胞/孔的密度在T细胞培养基中培养NIH/3T3-huFAP克隆39细胞过夜。次日，使用4500RAD剂量在x射线辐照仪中将其辐照，以防止随后由于肿瘤细胞系的人PBMC的过度生长。
如实施例15.3所述，通过蔗聚糖密度离心分离人PBMC。然后将细胞以1x106个细胞/mL的细胞密度用[50nm]终浓度的CFDA-SE(Sigma-Aldrich，目录号2188)在37℃、用CFSE标记10分钟。此后，将细胞用含有FBS(10％v/v)的过量DPBS洗涤两次。将标记的细胞在T细胞培养基中在37℃、静置30分钟。此后，用DPBS通过两个另外的洗涤步骤除去未转化的CFDA-SE。将CFSE标记的静息人PBMC以0.5*105个细胞/孔的密度加入到每个孔中。加入终浓度[20nM]的抗人CD3抗体(克隆V9，人IgG1，描述于Rodrigues等人，Int J Cancer Suppl 7,45-50(1992)和美国专利No.6,054,297中)和指定浓度的FAP-OX40L。在37℃和5％CO2的培养箱(Hera Cell 150)中将细胞激活5天。然后，将细胞用荧光染料缀合的抗体抗人CD4抗体(克隆RPA-T4，BioLegend，目录号300532)和抗CD8抗体(克隆RPa-T8，BioLegend，目录号3010441)在4℃进行表面染色20分钟。在用FACS缓冲液的洗涤步骤之后，将细胞重悬于85μL/孔的FACS缓冲液中，并使用5激光Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience，DIVA软件)收获。
如图51所示，FAP-OX40L构建体通过当前的NIH/3T3-huFAP克隆39细胞的超交联强烈促进了TCR刺激的人CD4和CD8 T细胞中的增殖(参见顶部的“事件”图)和存活(参见底部的“增殖”图)。与人CD8+T细胞上OX40的较低表达一致，FAP-OX40L对CD8+T细胞的激动作用不如对CD4+T细胞强。
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Claims (21)

1.一种含有4-1BB配体(4-1BBL)三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与CD19特异性结合的Fab分子，该能够与CD19特异性结合的Fab分子包含VH结构域和VL结构域，
(1)该VH结构域包含(i)如SEQ ID NO:195的氨基酸序列所示的CDR-H1，(ii)如SEQ IDNO:196的氨基酸序列所示的CDR-H2，和(iii)如SEQ ID NO:197的氨基酸序列所示的CDR-H3，该VL结构域包含(iv)如SEQ ID NO:198的氨基酸序列所示的CDR-L1，(v)如SEQ ID NO:199的氨基酸序列所示的CDR-L2，和(vi)如SEQ ID NO:200的氨基酸序列所示的CDR-L3；或者
(2)该VH结构域包含(i)如SEQ ID NO:252的氨基酸序列所示的CDR-H1，(ii)如SEQ IDNO:253的氨基酸序列所示的CDR-H2，和(iii)如SEQ ID NO:254的氨基酸序列所示的CDR-H3，该VL结构域包含(iv)如SEQ ID NO:249的氨基酸序列所示的CDR-L1，(v)如SEQ ID NO:250的氨基酸序列所示的CDR-L2，和(vi)如SEQ ID NO:251的氨基酸序列所示的CDR-L3，
(b)通过二硫键彼此连接的第一多肽和第二多肽，
该第一多肽含有第一重链恒定(CH1)或轻链恒定(CL)结构域，并且该第二多肽对应地含有CL或CH1结构域，其中该第二多肽通过该CH1和CL结构域之间的二硫键与该第一多肽连接，并且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL结构域连接并彼此连接的4-1BBL的两个胞外域，并且该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的该CL或CH1结构域连接的所述4-1BBL的一个胞外域，其中4-1BBL的胞外域由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96的氨基酸序列组成，和
(c)由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
2.权利要求1的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该4-1BBL共刺激人T细胞活化。
3.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中4-1BBL的胞外域由SEQ IDNO:96的氨基酸序列组成。
4.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中
该第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且该第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或者
该第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，并且该第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
5.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该Fc结构域是IgG Fc结构域。
6.权利要求5的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该Fc结构域是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
7.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该Fc结构域是包含在位置234和235和/或329处的氨基酸替代的IgG1 Fc结构域，依照EU编号方式。
8.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的4-1BBL的两个胞外域的第一多肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CH1结构域融合，并且包含所述4-1BBL的一个胞外域的第二多肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CL结构域融合。
9.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的4-1BBL的两个胞外域的第一多肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CL结构域融合，并且包含所述4-1BBL的一个胞外域的第二多肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CH1结构域融合。
10.权利要求8或9的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中在邻近该4-1BBL的该CL结构域中，在位置123处的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124处的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，并且其中在邻近该4-1BBL的该CH1结构域中，在位置147处和在位置213处的氨基酸已替代为谷氨酸(E)，依照EU编号方式。
11.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该能够与CD19特异性结合的Fab分子包含如SEQ ID NO:201的氨基酸序列所示的可变重链和如SEQ ID NO:202的氨基酸序列所示的可变轻链，或者其中该能够与CD19特异性结合的Fab分子包含如SEQ IDNO:357的氨基酸序列所示的可变重链和如SEQ ID NO:358的氨基酸序列所示的可变轻链。
12.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)包含如SEQ ID NO:201的氨基酸序列所示的VH结构域的第一重链和包含如SEQ IDNO:202的氨基酸序列所示的VL结构域的第一轻链，或者包含如SEQ ID NO:357的氨基酸序列所示的VH结构域的第一重链和包含如SEQ ID NO:358的氨基酸序列所示的VL结构域的第一轻链，
(ii)如SEQ ID NO:14的氨基酸序列所示的第二重链，和
(iii)如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的第二轻链。
13.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)包含如SEQ ID NO:201的氨基酸序列所示的VH结构域的第一重链和包含如SEQ IDNO:202的氨基酸序列所示的VL结构域的第一轻链，或者包含如SEQ ID NO:357的氨基酸序列所示的VH结构域的第一重链和包含如SEQ ID NO:358的氨基酸序列所示的VL结构域的第一轻链，和
(ii)如SEQ ID NO:115的氨基酸序列所示的第二重链和如SEQ ID NO:116的氨基酸序列所示的第二轻链，或者
如SEQ ID NO:117的氨基酸序列所示的第二重链和如SEQ ID NO:118的氨基酸序列所示的第二轻链，或者
如SEQ ID NO:119的氨基酸序列所示的第二重链和如SEQ ID NO:120的氨基酸序列所示的第二轻链，或者
如SEQ ID NO:173的氨基酸序列所示的第二重链和如SEQ ID NO:174的氨基酸序列所示的第二轻链。
14.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其特征在于包含如SEQ IDNO:205的氨基酸序列所示的第一重链、如SEQ ID NO:206的氨基酸序列所示的第一轻链、如SEQ ID NO:119的氨基酸序列所示的第二重链和如SEQ ID NO:120的氨基酸序列所示的第二轻链。
15.权利要求1或2的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其特征在于包含如SEQ IDNO:306的氨基酸序列所示的第一重链、如SEQ ID NO:279的氨基酸序列所示的第一轻链、如SEQ ID NO:119的氨基酸序列所示的第二重链和如SEQ ID NO:120的氨基酸序列所示的第二轻链。
16.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至15任一项的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。
17.一种载体，其包含权利要求16的分离的多核苷酸。
18.权利要求17的载体，其中该载体是表达载体。
19.一种宿主细胞，其包含权利要求16的分离的多核苷酸或权利要求17或18的载体。
20.一种生成权利要求1至15任一项的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：
(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养权利要求19的宿主细胞，并
(ii)回收该抗原结合分子。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1至15任一项的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
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