TW202041527A - 包含tnf家族配位三聚體之抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於新穎的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分及(b)藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽，其特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此藉由肽連接子連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域。

Description

包含TNF家族配位三聚體之抗原結合分子
本發明係關於新穎的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分及(b)藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽，其中該抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域。本發明亦係關於此等分子之製備方法及其使用方法。
與TNF (腫瘤壞死因子)受體超家族之分子相互作用之配位體在免疫系統之組織及功能中具有重要作用。儘管調節正常功能，諸如免疫反應、血細胞生成及形態發生，但TNF家族配位體(亦稱為細胞激素)在腫瘤發生、移植排斥、敗血性休克、病毒複製、骨骼再吸收、類風濕性關節炎及糖尿病中起一定作用(Aggarwal, 2003)。TNF配位體家族包含編碼19種II型(亦即細胞內N端及細胞外C端)跨膜蛋白質之18種基因，其特徵在於存在創造『TNF同源性結構域』(THD)之保存性C端結構域。此結構域負責受體結合且因此對於TNF配位體家族成員之生物活性而言為重要的。家族成員之間的序列一致性為約20-30% (Bodmer, 2002)。TNF配位體家族之成員以自組裝、非共價三聚體形式發揮其生物功能(Banner等人, Cell 1993, 73, 431-445)。因此，TNF家族配位體形成三聚體，其能夠結合於且活化TNFR超家族之相應受體。 已鑑別4-1BB (CD137)分子(其為TNF受體超家族之成員)之表現由T細胞活化誘導(Kwon及Weissman, 1989)。後續研究表明4-1BB於T-及B-淋巴球(Snell等人, 2011；Zhang等人, 2010)、NK細胞(Lin等人, 2008)、NKT細胞(Kim等人, 2008)、單核細胞(Kienzle及von Kempis, 2000；Schwarz等人, 1995)、嗜中性白血球(Heinisch等人, 2000)、肥大細胞(Nishimoto等人, 2005)及樹突狀細胞以及非造血來源細胞(諸如內皮及平滑肌細胞)中之表現(Broll等人, 2001；Olofsson等人, 2008)。4-1BB於不同細胞類型中之表現大部分可由多種刺激信號(諸如T細胞受體(TCR)或B細胞受體觸發)誘導及驅動，以及經由促炎性細胞激素之共刺激分子或受體誘導之信號傳導(Diehl等人, 2002；von Kempis等人, 1997；Zhang等人, 2010)。 4-1BB配位體(4-1BBL或CD137L)之表現受到較多限制且在專業抗原呈現細胞(APC)(諸如B細胞、樹突狀細胞(DC)及巨噬細胞)上觀測。4-1BBL之誘導性表現為T細胞(包括αβ及γδ T細胞子集)及內皮細胞之特徵(評述於Shao及Schwarz, 2011中)。 已知CD137信號傳導可刺激NK細胞之IFNγ分泌及增殖(Buechele等人, 2012；Lin等人, 2008；Melero等人, 1998)以及促進DC活化，如由其增加之存活率以及分泌細胞激素及上調共刺激分子之能力所指示(Choi等人, 2009；Futagawa等人, 2002；Wilcox等人, 2002)。然而，CD137最佳表徵為共刺激分子，其調節T細胞之CD4+及CD8+子集中TCR誘導之活化。與TCR觸發組合，促效性4-1BB特異性抗體增強T細胞之增殖、刺激淋巴激素分泌以及降低T-淋巴球對活化誘導之細胞死亡的敏感性(評述於Snell等人, 2011中)。 根據活體外4-1BB抗體對T細胞之此等共刺激作用，其對攜有腫瘤之小鼠之投藥在許多實驗腫瘤模型中引起強效抗腫瘤作用(Melero等人, 1997；Narazaki等人, 2010)。然而，4-1BB通常僅在與其他免疫調節化合物(Curran等人, 2011；Guo等人, 2013；Morales-Kastresana等人, 2013；Teng等人, 2009；Wei等人, 2013)、化學治療劑(Ju等人, 2008；Kim等人, 2009)、腫瘤特異性疫苗接種(Cuadros等人, 2005；Lee等人, 2011)或放射線療法(Shi及Siemann, 2006)組合投與時呈現其作為抗腫瘤劑之效能。活體內耗乏實驗表明CD8+ T細胞在4-1BB特異性抗體之抗腫瘤作用中起最重要作用。然而，視腫瘤模型或包括抗4-1BB之組合療法而定，已報導其他類型細胞(諸如DC、NK細胞或CD4+ T細胞)之貢獻(Melero等人, 1997；Murillo等人, 2009；Narazaki等人, 2010；Stagg等人, 2011)。 除對不同淋巴細胞子集之直接作用以外，4-1BB促效劑亦可經由4-1BB介導之腫瘤血管內皮上細胞間黏附分子1 (ICAM1)及血管細胞黏附分子1 (VCAM1)之上調來誘導腫瘤中經活化T細胞之浸潤及滯留(Palazon等人, 2011)。 4-1BB觸發亦可逆轉由暴露於可溶性抗原誘導之T細胞能力缺失之狀態，該可溶性抗原可促進腫瘤微環境中或慢性感染期間免疫耐受性之破壞(Wilcox等人, 2004)。 似乎活體內4-1BB促效抗體之免疫調節特性需要抗體分子上存在野生型Fc部分，藉此暗示Fc受體結合為此類試劑之藥理學活性所需之重要事件，如關於對TNFR超家族之其他誘導細胞凋亡或免疫調節成員具有特異性之促效抗體所描述(Li及Ravetch, 2011；Teng等人, 2009)。然而，具有功能活性Fc結構域之4-1BB特異性促效抗體之全身投藥亦誘導與肝毒性相關聯之CD8+ T細胞之擴展(Dubrot等人, 2010)，其在小鼠中在不存在功能性Fc受體之情況下減弱或顯著改善。在人類臨床試驗(ClinicalTrials.gov, NCT00309023)中，每三週一次投與Fc勝任型4-1BB促效抗體(BMS-663513)持續12週可引起黑素瘤、卵巢或腎細胞癌之患者中之疾病穩定。然而，另一試驗(NCT00612664)中提供之相同抗體引起4級肝炎，導致試驗終止(Simeone及Ascierto, 2012)。 總體而言，可獲得之臨床前及臨床資料明確表明存在對有效4-1BB促效劑之高度臨床需求。然而，新一代候選藥物應不僅有效接合造血及內皮細胞之表面上的4-1BB，且亦能夠經由除結合於Fc受體以外的機制實現，以避免不可控制的副作用。後者可經由優先結合於腫瘤特異性或腫瘤相關部分且在其上進行寡聚作用來實現。 已製得由4-1BB配位體之一個細胞外結構域及單鏈抗體片段組成之融合蛋白質(Mueller等人, 2008；Hornig等人, 2012)或與重鏈之C端融合之單一4-1BB配位體(Zhang等人, 2007)。WO 2010/010051揭示由三個彼此連接且與抗體部分融合之TNF配位體胞外域組成的融合蛋白質之產生。 然而，仍需要新的抗原結合分子，其組合能夠優先結合於腫瘤特異性或腫瘤相關目標之部分與能夠形成共刺激TNF配位三聚體之部分且具有醫藥學上適用的足夠穩定性。本發明之抗原結合分子包含其兩者且意外的是，其提供三聚體且因此提供生物活性TNF配位體，但三聚TNF配位體胞外域中之一者與分子之另外兩個TNF配位體胞外域相比位於另一多肽上。
在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域。 在一個特定態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，及 (c) 由能夠穩定結合之第一子單元及第二子單元組成的Fc結構域。 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於 (i) 分別地，第一多肽含有CH1或CL結構域且第二多肽含有CL或CH1結構域，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH1或CL結構域，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CL或CH1結構域，或 (ii) 分別地，第一多肽含有CH3結構域且第二多肽含有CH3結構域，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端，或 (iii) 分別地，第一多肽含有VH-CL或VL-CH1結構域且第二多肽含有VL-CH1結構域或VH-CL結構域，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至VH或VL，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之VL或VH。 在一個特定態樣中，TNF配位體家族成員為共刺激人類T細胞活化之成員。因此，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，其中TNF配位體家族成員共刺激人類T細胞活化。更特定言之，TNF配位體家族成員係選自4-1BBL及OX40L。 在一個態樣中，TNF配位體家族成員為4-1BBL。 在另一態樣中，TNF配位體家族成員之胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，尤其SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，TNF配位體家族成員或其片段之胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:96，尤其SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96之胺基酸序列。更特定言之，TNF配位體家族成員之胞外域包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:183之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:185之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 分別地，第一多肽含有CH1或CL結構域且第二多肽含有CL或CH1結構域，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH1或CL結構域，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，該胞外域藉由肽連接子連接至該多肽之CL或CH1結構域。 在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 含有CH1結構域之第一多肽及含有CL結構域之第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH1結構域，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CL結構域。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 含有CL結構域之第一多肽及含有CH1結構域之第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CL結構域，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接該多肽之CH1結構域。 在另一態樣中，本發明提供如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分係選自由以下組成之群：抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。 在一個態樣中，本發明提供如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為抗體片段。 特定言之，能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分係選自由以下組成之群：抗體片段、Fab分子、互換型(crossover) Fab分子、單鏈Fab分子、Fv分子、scFv分子、單域抗體、aVH及骨架抗原結合蛋白。 在一個態樣中，本發明提供如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為骨架抗原結合蛋白。 在一個特定態樣中，本發明係關於如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子。 本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。在一個特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。 在另一態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤相關軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、CD19、CD20及CD33。 在一個特定態樣中，目標細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白質(FAP)。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105之胺基酸序列。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。 在一個特定態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:100之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:101之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:103之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列。 在一個態樣中，提供如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之部分包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的可變輕鏈，或其中能夠特異性結合於FAP之部分包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的可變輕鏈。 在另一態樣中，提供根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中包含藉由第一肽連接子彼此連接之TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域的肽在其C端藉由第二肽連接子與重鏈之CH1或CL結構域融合，且其中該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域在其C端藉由第三肽連接子與輕鏈上之CL或CH1結構域融合。 在一個特定態樣中，本發明係關於如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中肽連接子為(G4S)2 ，亦即SEQ ID NO:13之肽連接子。在一個態樣中，第一肽連接子為(G4S)2 ，第二肽連接子為GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)且第三肽連接子為(G4S)2 。在另一態樣中，第一、第二及第三肽連接子為(G4S)2 。 本發明亦係關於如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含由能夠穩定結合之第一及第二子單元組成之Fc結構域。 特定言之，本發明之包含(c)由能夠穩定結合之第一及第二子單元組成之Fc結構域的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子進一步包含(a)能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子，其中Fab重鏈在C端與Fc結構域中之CH2結構域之N端融合。 在另一態樣中，Fc結構域為IgG，尤其IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域。更特定言之，Fc結構域為IgG1 Fc結構域。在一個特定態樣中，Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之結合的修飾。 在另一態樣中，本發明係關於如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (c)  Fc結構域，其由能夠穩定結合之第一及第二子單元組成，其中該Fc結構域包含一或多個胺基酸取代，該一或多個胺基酸取代降低與Fc受體，尤其Fcγ受體之結合。 特定言之，Fc結構域包含IgG重鏈之位置234及235 (EU編號)及/或329 (EU編號)處的胺基酸取代。更特定言之，提供根據本發明之含有三聚TNF家族配位體之抗原結合分子，其包含具有胺基酸取代L234A、L235A及P329G (EU編號)之IgG1 Fc結構域。 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子分別包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第一肽，其包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與第二重鏈或輕鏈融合， 及第二肽，其包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與第二輕鏈或重鏈融合。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與CH1結構域(其為重鏈之一部分)融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接， 及第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CL結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的CL結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接， 及第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CH1結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域。 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與VH結構域(其為重鏈之一部分)融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接， 及第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的VL結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域。 亦提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸已由精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸已經離胺酸(K)取代，且其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。 在另一態樣中，提供如上文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a) 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， (b) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a) Fab分子，其能夠特異性結合於FAP，及 (b) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個特定態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含能夠特異性結合於FAP之部分。在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:139及SEQ ID NO:148，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114及SEQ ID NO:115之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:173，及 (iii) 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:174。 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地，第一多肽含有CH3結構域及第二多肽含有CH3結構域，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。 特定言之，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合於FAP之部分。特定言之，提供如上文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (i) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列，或 (ii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列，或 (iii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列。 在另一特定態樣中，本發明提供如上文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原為CD19。 在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD19之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:252之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:253之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:254之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:249之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:250之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:251之胺基酸序列。 在另一態樣中。提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD19之部分包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的可變輕鏈，或其中能夠特異性結合於FAP之部分包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的可變輕鏈。 在一個特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:113，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:114之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:173，及 (iii) 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:174。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合於CD19之部分。特定言之，提供如技術方案1至14、29、30及32至34中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:209之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:210之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列，或 (ii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:213之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:214之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列，或 (iii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列，或 (iv) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列。 在另一特定態樣中，本發明提供如上文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原為CEA。 在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CEA之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CEA之部分包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的可變輕鏈。 在一個態樣中，提供如上文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:113，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:114之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:173，及 (iii) 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:174。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合於CEA之部分。特定言之，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:337之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:338之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列，或 (ii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:341之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:342之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供如上文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中TNF配位體家族成員為OX40L。在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中TNF配位體家族成員之胞外域包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，尤其SEQ ID NO:53之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供如技術方案1至5、10至24、29、30、32至34、38至40、44及45中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:371或SEQ ID:372之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白質(FAP)且能夠特異性結合於FAP之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105之胺基酸序列。 特定言之，提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由SEQ ID NO:355組成之群的胺基酸序列，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:356之胺基酸序列。 根據本發明之另一態樣，提供編碼如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的經分離之聚核苷酸。本發明亦提供載體，特定言之表現載體，其包含本發明之經分離之聚核苷酸，及宿主細胞，其包含本發明之經分離之聚核苷酸或載體。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞，特定言之，哺乳動物細胞。 在另一態樣中，提供用於製備本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的方法，其包含以下步驟：(i)在適用於表現抗原結合分子之條件下培養本發明之宿主細胞，及(ii)回收抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明之方法產生之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。 本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。 本發明亦涵蓋本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，其係用作藥劑。在一個態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，其用於治療有需要之個體中之疾病。在一個特定實施例中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，其用於治療癌症。 亦提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造用以治療有需要之個體中之疾病的藥劑，特定言之，用於製造用以治療癌症之藥劑，以及治療個體中之疾病的方法，其包含投與該個體治療有效量之包含呈醫藥學上可接受之形式的本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的組合物。在一個特定實施例中，疾病為癌症。在以上實施例中之任一者中，個體較佳為哺乳動物，尤其為人類。
定義 除非以其他方式定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域中通常所使用相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。 如本文所用，術語「抗原結合分子 」在其最廣泛的意義上係指特異性結合抗原決定子的分子。抗原結合分子之實例為抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。 如本文中所使用，術語「能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分 」係指特異性結合於抗原決定子之多肽分子。在一個態樣中，抗原結合部分能夠經由其目標細胞抗原活化信號傳導。在一個特定態樣中，抗原結合部分能夠將其所連接之實體(例如TNF家族配位三聚體)引導至目標位點，例如引導至特定類型之攜有抗原決定子之腫瘤細胞或腫瘤基質。能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分包括如本文中進一步定義之抗體及其片段。此外，能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分包括如本文中進一步定義之骨架抗原結合蛋白，例如結合結構域，其係基於經設計之重複蛋白質或經設計之重複結構域(參見例如WO 2002/020565)。 關於抗體或其片段，術語「能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分」係指分子之一部分，其包含特異性結合於一部分或所有抗原且與其互補之區域。可例如藉由一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供能夠進行特異性抗原結合之部分。特定言之，能夠進行特異性抗原結合之部分包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。 術語「抗體 」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現所需抗原結合活性即可。 如本文所用之術語「單株抗體 」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能變異抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異抗體，此類變異體通常以較小量存在)以外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。相比於典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。 如本文所使用之術語「單特異性 」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點中之每一者結合於相同抗原之相同抗原決定基。術語「雙特異性 」意謂抗原結合分子能夠特異性結合於至少兩個不同抗原決定子。典型地，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中之每一者對不同抗原決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之，表現於兩個不同細胞上之兩個抗原決定子。 如本申請案中所使用之術語「價 」表示抗原結合分子中存在指定數目之結合位點。同樣，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有與原生抗體結構實質上類似之結構的抗體。「原生抗體 」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG類抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈組成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域；繼之為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，繼之為輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈可歸為五種類型中之一種，該五種類型稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成次型，例如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。 「抗體片段 」係指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合由完整抗體結合的抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、交叉(cross) Fab片段；直鏈抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及單域抗體。關於某些抗體片段之評述，參見Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之評述，參見例如Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體之蛋白分解消化以及藉由重組型宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文中所描述。 完整抗體之番木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各含有重鏈及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。如本文中所使用。因此，術語「Fab 片段 」係指抗體片段，其包含有包含VL結構域及輕鏈之恆定域(CL)之輕鏈片段，及重鏈之VH結構域及第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1結構域的羧基端處添加幾個殘基。Fab'-SH為其中恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2片段，其具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。 術語「交叉 ( cross) Fab 片段 」或「xFab片段」或「互換型(crossover) Fab片段」係指其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區互換之Fab片段。可能存在交叉Fab分子之兩種不同鏈組成且包含於本發明之雙特異性抗體中。一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區互換，亦即交叉Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈，及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈。此交叉Fab分子亦稱為CrossFab(VLVH) 。另一方面，當Fab重鏈及輕鏈之恆定區互換時，交叉Fab分子包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈，及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈。此交叉Fab分子亦稱為CrossFab(CLCH1) 。 「單鏈Fab片段」或「scFab 」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該抗體結構域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a)VH-CH1-連接子-VL-CL，b)VL-CL-連接子-VH-CH1，c)VH-CL-連接子-VL-CH1或d)VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少30個胺基酸，較佳32與50個胺基酸之間的多肽。該單鏈Fab片段經由CL結構域與CH1結構域之間的天然雙硫鍵穩定化。此外，此等單鏈Fab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)而產生鏈間二硫鍵來進一步穩定化。 「交叉單鏈Fab片段」或「x-scFab 」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a)VH-CL-連接子-VL-CH1及b)VL-CH1-連接子-VH-CL；其中VH及VL共同形成抗原結合位點，其特異性結合於抗原且其中該連接子為至少30個胺基酸之多肽。此外，此等x-scFab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)而產生鏈間二硫鍵來進一步穩定化。 「單鏈可變片段 (scFv )」為抗體之重鏈(VH )及輕鏈(VL )之可變區之融合蛋白質，其與十至約25個胺基酸之短連接子肽連接。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可連接VH 之N端與VL 之C端，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保持原始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96中。此外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH結構域(亦即能夠與VL結構域一起組裝至功能性抗原結合位點)或VL結構域(亦即能夠與VH結構域一起組裝至功能性抗原結合位點)之特徵，且藉此提供全長抗體之抗原結合性質。 「骨架抗原結合蛋白 」為此項技術中已知，例如纖維結合蛋白及經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPins)已用作抗原結合域之替代性骨架，參見例如Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及Stumpp等人, Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，骨架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 ((艾維伯迪)Evibody)；脂質運載蛋白(抗運載蛋白)；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z結構域(親和抗體)；A結構域(高親和性多聚體/最大抗體)；血清運鐵蛋白(反式體)；經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPin)；抗體輕鏈或重鏈之可變域(單域抗體，sdAb)；抗體重鏈之可變域(奈米抗體，aVH)；VNAR 片段；纖維結合蛋白(阿耐克汀(AdNectin))；C型凝集素結構域(四連接素)；新型抗原受體β-內醯胺酶之可變域(VNAR 片段)；人類γ-晶狀體球蛋白或泛素(阿菲林(Affilin)分子)；人類蛋白酶抑制劑之kunitz型結構域，微體，諸如來自knottin家族之蛋白質、肽適體及纖維結合蛋白(阿耐克汀)。 CTLA-4 (細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為表現於大部分CD4+ T細胞上之CD28家族受體。其細胞外結構域具有可變域類Ig摺疊。對應於抗體之CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造以具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為艾維伯迪(例如US7166697B1)。艾維伯迪與抗體(例如結構域抗體)之經分離之可變區之尺寸大致相同。關於其他細節，參見Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。 脂質運載蛋白為細胞外蛋白質之家族，其傳遞小型疏水性分子，諸如類固醇、後色膽素、類視黃素及脂質。其具有剛性β-片狀第二結構，其在圓錐結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以結合於不同目標抗原。抗運載蛋白之尺寸在160-180個胺基酸之間，且來源於脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1及US20070224633。 親和抗體為來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白質A之骨架，其可經工程改造以結合於抗原。結構域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)及EP 1641818A1。 高親合性多聚體為來源於A-結構域骨架家族之多域蛋白質。約35個胺基酸之原生結構域採用既定二硫鍵鍵結之結構。藉由改組由A-結構域之家族呈現之天然變化來產生多樣性。關於其他細節，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。 運鐵蛋白為單體血清傳遞糖蛋白。運鐵蛋白可藉由在允許的表面環中插入肽序列而經工程改造以結合不同目標抗原。經工程改造之運鐵蛋白骨架之實例包括反式體。關於其他細節，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。 經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPins)來源於錨蛋白，錨蛋白為介導整合膜蛋白質與細胞骨架之連接的蛋白質之家族。單一錨蛋白重複為由兩個α螺旋及β迴旋(beta-turn)組成之33殘基主結構。其可藉由隨機化各重複之第一個α螺旋及β迴旋中之殘基而經工程改造以結合不同目標抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面(親和力成熟方法)。關於其他細節，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)以及US20040132028A1。 單域抗體為由單一單體可變抗體結構域組成之抗體片段。第一個單域來源於來自駱駝之抗體重鏈之可變域(奈米抗體或VH H片段)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(aVH)或來源於鯊魚之VNAR 片段。 纖維結合蛋白為可經工程改造以結合於抗原之骨架。纖連蛋白由III型人類纖維結合蛋白(FN3)之15個重複單元之第10個結構域之天然胺基酸序列之主鏈組成。β-夾層結構之一端處的三個環可經工程改造以使阿耐克汀能夠特異性識別相關治療目標。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、US20080139791、WO2005056764及US6818418B1。 肽適體為組合性識別分子，其由恆定骨架蛋白質(通常為硫氧還蛋白(TrxA))組成，該恆定骨架蛋白質含有在活性位點處插入之限制性可變肽環。關於其他細節，參見Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。 微體來源於天然存在之長度為25-50個胺基酸之微型蛋白質，其含有3-4個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)及打結素。微型蛋白質具有環，其可經工程改造以包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程改造之打結素結構域之其他細節，參見WO2008098796。 與參考分子「結合於相同抗原決定基之抗原結合分子 」係指一種抗原結合分子，其在競爭分析中阻斷參考分子與其抗原之結合達50%或50%以上，及相反地，參考分子在競爭分析中阻斷抗原結合分子與其抗原之結合達50%或50%以上。 術語「抗原結合域 」係指抗原結合分子之一部分，其包含特異性結合於一部分或全部抗原且與其互補之區域。當抗原較大時，抗原結合分子可僅結合於抗原之特定一部分，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由例如一或多個可變域(亦稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。 如本文所用，術語「抗原決定子 」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如胺基酸之相鄰延伸或由非相鄰胺基酸之不同區域組成的構形組態)。適用的抗原決定子可見於例如腫瘤細胞表面上、病毒感染之細胞之表面上、其他病變細胞之表面上、免疫細胞之表面上、游離於血清中及/或細胞外基質中(ECM)。除非另有指示，否則本文中適用作抗原之蛋白質可為來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之蛋白質的任何原生形式。在一個特定實施例中，抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」的未經處理之蛋白質，以及由細胞中之處理所產生的任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。 「特異性結合 」意謂結合對於抗原而言具有選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合分子結合於特異性抗原之能力可經由酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術(例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。在一個實施例中，抗原結合分子與無關蛋白質之結合程度小於抗原結合分子與抗原之結合的約10%，如藉由例如SPR所量測。在某些實施例中，結合於抗原之分子具有≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM (例如10-8 M或10-8 M以下，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。 「親和力 」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指明，否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示，解離常數為解離速率常數與結合速率常數(分別為koff及kon)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之方法)來量測親和力。用於量測親和力之特定方法為表面電漿子共振(SPR)。 如本文所用，「目標細胞抗原 」係指目標細胞(例如腫瘤中之細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質之細胞)表面上所呈現的抗原決定子。在某些實施例中，目標細胞抗原為腫瘤細胞之表面上的抗原。在一個實施例中，目標細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤相關軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、CD19、CD20及CD33。特定言之，目標細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白質(FAP)。 除非另有指示，否則術語「纖維母細胞活化蛋白質 (FAP) 」，亦稱為脯胺醯基內肽酶FAP或Seprase (EC 3.4.21)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生FAP。該術語涵蓋「全長」的未經處理之FAP以及由細胞中之處理產生的FAP之任何形式。該術語亦涵蓋FAP之天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，本發明之抗原結合分子能夠特異性結合於人類、小鼠及/或食蟹獼猴FAP。人類FAP之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q12884 (版本149，SEQ ID NO:20)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人類FAP之細胞外結構域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置760。His標記之人類FAP ECD之胺基酸及核苷酸序列分別展示於SEQ ID NO:15及16中。小鼠FAP之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P97321 (版本126，SEQ ID NO:23)或NCBI RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP之細胞外結構域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置761。SEQ ID NO:24及25分別展示His標記之小鼠FAP ECD之胺基酸及核苷酸序列。SEQ ID NO:26及27分別展示His標記之食蟹獼猴FAP ECD之胺基酸及核苷酸序列。本發明之抗FAP結合分子較佳結合於FAP之細胞外結構域。例示性抗FAP結合分子描述於國際專利申請案第WO 2012/020006 A2號中。 除非另有指示，否則術語「癌胚抗原 (CEA) 」，亦稱為癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CEA。人類CEA之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P06731 (版本151，SEQ ID NO:28)中。長期將CEA鑑別為腫瘤相關抗原(Gold及Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965；Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002)。最初歸類為僅表現於胎兒組織中之蛋白質，現今在若干正常成年人組織中發現CEA。此等組織之來源主要為上皮，包括胃腸道、呼吸道及尿道之細胞，及結腸、子宮頸、汗腺及前列腺之細胞(Nap等人, Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988；Nap等人, Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992)。上皮來源之腫瘤以及其癌轉移含有CEA作為腫瘤相關抗原。儘管存在CEA本身並不指示轉型成癌細胞，但表明CEA之分佈。在正常組織中，CEA通常表現於細胞之頂端表面上(Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999))，使其不可接近血流中之抗體。與正常組織相反，CEA傾向於在癌細胞之整個表面上表現(Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999))。此表現模式之變化使得CEA可實現癌細胞中之抗體結合。此外，CEA表現在癌細胞中增加。此外，增加之CEA表現促進增加之細胞間黏附，其可引起轉移(Marshall J., Semin Oncol., 30(增刊8):30-6, 2003)。多種腫瘤實體中之CEA表現之發生率通常極高。根據公開之資料，組織樣品中進行之自身分析證實其高發生率，在結腸直腸癌(CRC)中為約95%，在胰臟癌中為90%，在胃癌中為80%，在非小細胞肺癌(NSCLC，其中其與HER3共表現)中為60%且在乳癌中為40%；在小細胞肺癌及神經膠母細胞瘤中發現低表現。 CEA易於自細胞表面裂解且自腫瘤直接或經由淋巴管進入血流。由於此性質，已使用血清CEA之含量作為用於診斷癌症及篩檢癌症(特定言之結腸直腸癌)復發之臨床標記物(Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992；Chau I.等人, J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004；Flamini等人, Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006)。 除非另有指示，否則術語「黑素瘤相關軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖 (MCSP) 」，亦稱為軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖4 (CSPG4)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生MCSP。人類MCSP之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號Q6UVK1 (版本103，SEQ ID NO:29)中。除非另有指示，否則術語「表皮生長因子受體 (EGFR) 」，亦稱為原癌基因c-ErbB-1或受體酪胺酸-蛋白質激酶erbB-1，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生EGFR。人類EGFR之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P00533 (版本211，SEQ ID NO:30)中。 除非另有指示，否則術語「CD19 」係指B-淋巴細胞抗原CD19，亦稱為B-淋巴細胞表面抗原B4或T細胞表面抗原Leu-12且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD19。人類CD19之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P15391 (版本160，SEQ ID NO:31)中。該術語涵蓋「全長」未經處理之人類CD19以及由細胞中之處理產生的人類CD19之任何形式，只要如本文所報導之抗體與其結合即可。CD19為表現於人類B細胞(包括(但不限於)前B細胞、早期發育之B細胞(亦即不成熟B細胞)、經由末端分化至漿細胞中之成熟B細胞及惡性B細胞)之表面上的結構上不同的細胞表面受體。CD19由大部分前B急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)、B細胞慢性淋巴球性白血病(CLL)、前淋巴球性白血病、毛狀細胞白血病、普通急性淋巴球性白血病及一些Null急性淋巴母細胞性白血病。漿細胞上CD19之表現進一步表明其可在分化型B細胞腫瘤(諸如多發性骨髓瘤)上表現。因此，CD19抗原為非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病及/或急性淋巴母細胞白血病之治療中免疫療法之目標。 除非另有指示，否則「CD20 」係指B淋巴細胞抗原CD20，亦稱為跨膜4-結構域子族A成員1 (MS4A1)、B-淋巴細胞表面抗原B1或白細胞表面抗原Leu-16，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD20。人類CD20之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P11836 (版本149，SEQ ID NO:32)中。除非另有指示，否則「CD33 」係指骨髓細胞表面抗原CD33，亦稱為SIGLEC3或gp67，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD33。人類CD33之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P20138 (版本157，SEQ ID NO:33)中。 術語「可變區 」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗原結合分子與抗原之結合的結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之可變域通常具有類似結構，其中各結構域皆包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。 如本文所用，術語「高變區 」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構上定義之環(「高變環」)的各區域。通常，原生四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性及/或與抗原識別相關。例示性高變環出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。) 例示性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102處。(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。)高變區(HVR)亦稱為「互補決定區」(CDR)，且此等術語在本文中、在提及形成抗原結合區之可變區之一部分時可互換使用。此特定區域已由Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)描述，其中當針對彼此比較時，該等定義包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任何定義的應用意欲處於如本文中所定義及所用之術語的範疇內。涵蓋如上文所引用之參考文獻中之每一者所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表A中作為比較。涵蓋特定CDR的確切殘基數目將視CDR序列及尺寸而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定的情況下，熟習此項技術者可以常規方式確定哪些殘基包含特定CDR。 表A. CDR定義1
CDR Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1 表A中之所有CDR定義之編號皆依據Kabat等人所闡述之編號約定(參見下文)。2 如表A中所用之含有小寫字母「b」的「AbM」係指如藉由Oxford Molecular之「AbM」抗體模型化軟體所定義的CDR。 Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變區序列編號系統。一般熟習此項技術者可針對任何可變區序列明確地指定此「Kabat編號」系統，而不依賴於除序列本身以外的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)所闡述之編號系統。除非另外說明，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置的編號係依據Kabat編號系統。 除VH中之CDR1以外，CDR通常包含形成高變環的胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於簡稱為-CDR或a-CDR之CDR區域內。例示性a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3) 出現在L1之胺基酸殘基31-34、L2之胺基酸殘基50-55、L3之胺基酸殘基89-96、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-58及H3之胺基酸殘基95-102處。(參見Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)。)除非另有指示，否則在本文中根據Kabat等人(同上)對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。 如本文所使用，在抗原結合分子(例如抗體)之情形下，術語「親和力成熟 」係指來源於參考抗原結合分子(例如藉由突變)之抗原結合分子，其與參考抗體結合於相同抗原，較佳結合於相同抗原決定基；且與參考抗原結合分子相比對抗原具有較高親和力。親和力成熟通常涉及抗原結合分子之一或多個CDR中一或多個胺基酸殘基之修飾。通常，親和力成熟抗原結合分子與初始參考抗原結合分子結合於相同抗原決定基。 「構架 」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，在VH (或VL)中HVR及FR序列通常呈現以下序列：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 出於本文之目的，「接受體人類構架 」為包含來源於如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架在序列上一致。 術語「嵌合 」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，同時重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。 抗體之「類別 」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。 「人類化 」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有HVR (例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且所有或實質上所有FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式 」係指已經歷人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形成為其中恆定區已經額外修飾或自原始抗體發生變化以產生根據本發明之特性，尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面。 「人類 」抗體為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。 術語「Fc結構域」或「Fc 區 」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3結構域。人類IgG Fc區之「CH2結構域」通常自約位置231處之胺基酸殘基延伸至約位置340處之胺基酸殘基。在一個實施例中，碳水化合物鏈連接至CH2結構域。本文中，CH2結構域可為原生序列CH2結構域或變異型CH2結構域。「CH3結構域」包含Fc區中C端殘基延伸至CH2結構域(亦即自IgG之約位置341之胺基酸殘基至約位置447處之胺基酸殘基)。本文中，CH3區可為原生序列CH3結構域或變異型CH3結構域(例如在其一個鏈中具有引入之「隆凸」(「結」)且在其另一個鏈中具有相應的引入之「凹穴」(「孔」)之CH3結構域，參見美國專利第5,821,333號，其以引用之方式明確併入本文中)。此類變異型CH3結構域可用於促進如本文中所描述之兩個非一致抗體重鏈之雜二聚化。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。本文中，除非另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991中所描述。 「結進孔 」技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。通常，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「結」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「孔」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成及阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小型胺基酸側鏈來構築隆凸。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大型胺基酸側鏈而在第二多肽界面中產生大小與隆凸相同或類似的補償性凹穴。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸產生，例如藉由定點誘變或藉由肽合成。在一個特定實施例中，結修飾包含Fc結構域之兩個子單元中之一者中之胺基酸取代T366W，且孔修飾包含Fc結構域之兩個子單元中之另一者中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一特定實施例中，包含結修飾之Fc結構域之子單元額外包含胺基酸取代S354C，且包含孔修飾之Fc結構域之子單元額外包含胺基酸取代Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc區之兩個子單元之間形成二硫橋鍵，由此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。編號係根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991之EU索引。 「與免疫球蛋白之Fc區等效之區域」意欲包括免疫球蛋白之Fc區之天然存在之對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或缺失，但不實質上降低免疫球蛋白介導效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)之能力。舉例而言，免疫球蛋白之Fc區之N端或C端可缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。此類變異體可根據此項技術中已知的一般法則選擇以對活性具有最小影響(參見例如Bowie, J. U.等人, Science 247:1306-10 (1990))。 術語「效應功能 」係指可歸因於抗體之Fc區之生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞激素分泌、免疫複合物介導之抗原呈遞細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。 「活化 Fc 受體 」為一種Fc受體，其與抗體之Fc區接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體為人類FcγRIIIa (參見UniProt寄存編號P08637，版本141)。 術語「TNF 配位體家族成員 」或「TNF家族配位體」係指促炎性細胞激素。細胞激素通常(且特定言之TNF配位體家族之成員)在免疫系統之刺激及配位中起重要作用。當前，基於序列、功能性及結構類似性，已發現十九種細胞激素為TNF (腫瘤壞死因子)配位體超家族之成員。所有此等配位體皆為具有C端細胞外結構域(胞外域)、N端細胞胞內結構域及單一跨膜結構域之II型跨膜蛋白質。C端細胞外結構域(稱為TNF同源性結構域(THD))在超家族成員之間具有20-30%胺基酸一致性且負責結合於受體。TNF胞外域亦負責TNF配位體以形成三聚複合物，其由其特異性受體而被識別。 TNF配位體家族之成員係選自由以下組成之群：淋巴毒素α (亦稱為LTA或TNFSF1)、TNF (亦稱為TNFSF2)、LTβ (亦稱為TNFSF3)、OX40L (亦稱為TNFSF4)、CD40L (亦稱為CD154或TNFSF5)、FasL (亦稱為CD95L、CD178或TNFSF6)、CD27L (亦稱為CD70或TNFSF7)、CD30L (亦稱為CD153或TNFSF8)、4-1BBL (亦稱為TNFSF9)、TRAIL (亦稱為APO2L、CD253或TNFSF10)、RANKL (亦稱為CD254或TNFSF11)、TWEAK (亦稱為TNFSF12)、APRIL (亦稱為CD256或TNFSF13)、BAFF (亦稱為CD257或TNFSF13B)、LIGHT (亦稱為CD258或TNFSF14)、TL1A (亦稱為VEGI或TNFSF15)、GITRL (亦稱為TNFSF18)、EDA-A1 (亦稱為外異蛋白A1)及EDA-A2 (亦稱為外異蛋白A2)。除非另有指示，否則該術語係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生TNF家族配位體。在本發明之特定實施例中，TNF配位體家族成員係選自由以下組成之群：OX40L、FasL、CD27L、TRAIL、4-1BBL、CD40L及GITRL。在特定實施例中，TNF配位體家族成員係選自4-1BBL及OX40L。 TNF配位體家族成員之其他資訊(特定言之，序列)可自公開可用資料庫(諸如Uniprot (www.uniprot.org))獲得。舉例而言，人類TNF配位體具有以下胺基酸序列：人類淋巴毒素α (UniProt寄存編號P01374，SEQ ID NO:34)、人類TNF (UniProt寄存編號P01375，SEQ ID NO:35)、人類淋巴毒素β (UniProt寄存編號Q06643，SEQ ID NO:36)、人類OX40L (UniProt寄存編號P23510，SEQ ID NO:37)、人類CD40L (UniProt寄存編號P29965，SEQ ID NO:38)、人類FasL (UniProt寄存編號P48023，SEQ ID NO:39)、人類CD27L (UniProt寄存編號P32970，SEQ ID NO:40)、人類CD30L (UniProt寄存編號P32971，SEQ ID NO:41)、4-1BBL (UniProt寄存編號P41273，SEQ ID NO:42)、TRAIL (UniProt寄存編號P50591，SEQ ID NO:43)、RANKL (UniProt寄存編號O14788，SEQ ID NO:44)、TWEAK (UniProt寄存編號O43508，SEQ ID NO:45)、APRIL (UniProt寄存編號O75888，SEQ ID NO:46)、BAFF (UniProt寄存編號Q9Y275，SEQ ID NO:47)、LIGHT (UniProt寄存編號O43557，SEQ ID NO:48)、TL1A(UniProt寄存編號O95150，SEQ ID NO:49)、GITRL (UniProt寄存編號Q9UNG2，SEQ ID NO:50)及外異蛋白A(UniProt寄存編號Q92838，SEQ ID NO:51)。 「胞外域 」為膜蛋白質中延伸至細胞外空間(亦即目標細胞外之空間)的結構域。胞外域通常為蛋白質中起始與表面之接觸(其引起信號轉導)之部分。因此，如本文所定義之TNF配位體家族成員之胞外域係指TNF配位體蛋白質中延伸至細胞外空間(細胞外結構域)之部分，但亦包括負責三聚作用及結合於相應TNF受體之更短部分或其片段。因此，術語「TNF配位體家族成員或其片段之胞外域」係指TNF配位體家族成員之細胞外結構域，其形成仍能夠結合於受體(受體結合結構域)之細胞外結構域或其部分。 術語「共刺激性 TNF 配位體家族成員 」或「共刺激性TNF家族配位體」係指TNF配位體家族成員之子群，其能夠共刺激T細胞之增殖及細胞激素產生。此等TNF家族配位體可在與其相應TNF受體相互相用時共刺激TCR信號且與其受體之相互相用可引起TNFR相關因子(TRAF)之募集，其起始可引起T細胞活化之信號級聯。共刺激性TNF家族配位體係選自由以下組成之群：4-1BBL、OX40L、GITRL、CD70、CD30L及LIGHT，更特定言之，共刺激性TNF配位體家族成員係選自4-1BBL及OX40L。 如上文中所描述，4-1BBL為II型跨膜蛋白及TNF配位體家族中之一個成員。已描述具有SEQ ID NO:42之胺基酸序列的完全或全長4-1BBL可形成細胞表面上之三聚體。藉由4-1BBL之胞外域之特定動機實現三聚體之形成。該等動機在本文中稱為「三聚區域」。人類4-1BBL序列(SEQ ID NO:52)之胺基酸50-254形成4-1BBL之細胞外結構域，但即使其片段亦能夠形成三聚體。在本發明之特定實施例中，術語「4-1BBL或其片段之胞外域」係指具有選自SEQ ID NO:4 (人類4-1BBL之胺基酸52-254)、SEQ ID NO:1 (人類4-1BBL之胺基酸71-254)、SEQ ID NO:3 (人類4-1BBL之胺基酸80-254)及SEQ ID NO:2 (人類4-1BBL之胺基酸85-254)之胺基酸序列的多肽，或具有選自SEQ ID NO:96 (人類4-1BBL之胺基酸71-248)、SEQ ID NO:375 (人類4-1BBL之胺基酸52-248)、SEQ ID NO:374 (人類4-1BBL之胺基酸80-248)及SEQ ID NO:373 (人類4-1BBL之胺基酸85-248)之胺基酸序列的多肽，但本文中亦包括其他能夠進行三聚之胞外域之片段。 如上文中所描述，OX40L為另一種II型跨膜蛋白及TNF配位體家族中之另一成員。完全或全長人類OX40L具有SEQ ID NO:37之胺基酸序列。人類OX40L序列(SEQ ID NO:53)之胺基酸51-183形成OX40L之細胞外結構域，但即使其片段亦能夠形成三聚體。在本發明之特定實施例中，術語「OX40L或其片段之胞外域」係指具有選自SEQ ID NO:53 (人類OX40L之胺基酸51-183)或SEQ ID NO:54 (人類OX40L之胺基酸52-183)之胺基酸序列的多肽，但本文中亦包括其他能夠進行三聚之胞外域之片段。 術語「肽連接子 」係指包含一或多個胺基酸，通常約2至20個胺基酸之肽。肽連接子為此項技術中已知或描述於本文中。適合的非免疫原性連接肽為例如(G4 S)n 、(SG4 )n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中「n」通常為1與10之間的數值，通常在1與4之間，尤其為2，亦即選自由以下組成之群的肽：GGGGS (SEQ ID NO:128)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:13)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:55)及GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:56)，但亦包括序列GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:57)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:58)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:59)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:60)、GGSGSG (SEQ ID NO:61)、GGSG (SEQ ID NO:62)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:63)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:64)及GGNGSG (SEQ ID NO:65)。尤其受關注之肽連接子為(G4S)1 或GGGGS (SEQ ID NO:128)、(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:13)及GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:57)，更特定言之，(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:13)及GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:57)。 如本申請案內所用，術語「胺基酸 」表示天然存在之羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。 如本文所使用之「單鏈融合蛋白質 」係指由與抗原結合部分或Fc部分之一部分融合的該TNF配位體家族成員之一個或兩個胞外域組成的單鏈多肽。融合可藉由將抗原結合部分之N端或C端胺基酸經由肽連接子直接連接至該TNF配位體家族成員之胞外域之C端或N端胺基酸來進行。 「融合」或「連接」意謂組分(例如多肽及該TNF配位體家族成員之胞外域)由肽鍵連接(直接或經由一或多個肽連接子)。 相對於參考多肽序列(蛋白質)之「胺基酸序列一致性 百分比 (%) 」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可用之電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SWAI或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.創作，且原始碼已隨使用者文件一起提交於美國版權局(U.S.Copyright Office, Washington D.C., 20559)，其在美國版權局以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可公開購自Genentech, Inc., South San Francisco, California或可自原始碼編譯。ALIGN-2程序經編寫可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者其可表述為，既定胺基酸序列A具有或包含相對於、與或針對既定胺基酸序列B的一定胺基酸序列一致性%)如下計算： 100乘以分數X/Y 其中X為在A與B之比對程式中藉由序列比對程式ALIGN-2以一致匹配形式所得到之胺基酸殘基數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值係使用ALIGN-2電腦程式獲得，如前一段落中剛剛所述。 在某些實施例中，涵蓋本文中提供之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子的胺基酸序列變異體 。舉例而言，可能需要改良含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物特性。含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之胺基酸序列變異體可藉由將適合的修飾引入編碼核苷酸序列之分子或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。為了獲得最終構築體，缺失、插入與取代可任意組合，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。用於取代性誘變之相關位點包括HVR及構架(FRs)。保守性取代以標題「較佳取代」提供於表B中且在下文中參考胺基酸側鏈分類(1)至(6)進一步描述。可將胺基酸取代引入 相關分子且針對所需活性篩選產物，例如保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。 表B
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；己胺酸 Leu
Leu (L) 己胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；己胺酸 Leu
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。 非保守性取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一個類別。 術語「胺基酸序列變異體 」包括實質性變異體，其中在親本抗原結合分子(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基中存在胺基酸取代。通常，所選擇之用於進一步研究之所得變異體與親本抗原結合分子相比將具有某些生物特性之修飾(例如改良)(例如提高之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保持親本抗原結合分子之某些生物特性。一種例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)便利地產生。簡言之，一或多個HVR殘基突變且變異型抗原結合分子在噬菌體上呈現且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。在某些實施例中，一或多個HVR內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性變化(例如本文所提供之保守性取代)。可靶向誘變之用於鑑別抗體之殘基或區域之適用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham and Wells (1989)Science , 244:1081-1085所描述。在此方法中，鑑別殘基或目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)之群且由中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以測定抗體與抗原之相互相用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗原結合分子之晶體結構複合以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。 胺基酸序列插入包括在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽長度範圍內的胺基及/或羧基端融合體，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。分子之其他插入型變異體包括與多肽之N或C端融合，其增加含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之血清半衰期。 在某些實施例中，本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子經改變以增加或降低抗體之糖基化程度。可藉由改變胺基酸序列使得創造或移除之一或多個糖基化位點便利地獲得分子之糖基化變異體。當含有TNF配位三聚體之抗原結合分子包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈雙觸角寡糖，其通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可進行含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中寡糖之修飾以產生具有某些改良之特性的變異體。在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的變異體，其具有不含與Fc區連接(直接或間接)之海藻糖的碳水化合物結構。此類海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之其他變異體包括具有平分寡糖之變異體，例如其中連接至Fc區之雙觸角寡糖由GlcNAc平分。此類變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能，參見例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供寡糖中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之變異體。此類抗體變異體可具有改良之CDC功能且描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。 在某些實施例中，可能需要產生本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的經半胱胺酸工程改造之變異體 ，例如「thioMAbs」，其中分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於分子之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代此等殘基，藉此將反應性硫醇基安置於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所描述產生經半胱胺酸工程改造之結合分子。 在某些態樣中，本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可經進一步修飾以含有此項技術中已知且可容易地獲得之其他非蛋白質部分。適合於抗體衍生作用之部分包括(但不限於)水可溶聚合物。水可溶聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支的。連接至抗體之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。通常，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能、雙特異性抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等考慮因素來確定。在另一態樣中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam, N.W.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害一般細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分附近之細胞之溫度的波長。 在另一態樣中，可獲得本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的免疫結合物。「免疫結合物 」為結合於一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。 術語「聚核苷酸 」係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在的任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。 「分離 」之核酸分子或聚核苷酸意欲為自原生環境中移出的核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組型聚核苷酸視為經分離。經分離之聚核苷酸之其他實例包括異源宿主細胞中所維持的重組型聚核苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。經分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。經分離之RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之經分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此類分子。此外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。 一種核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少例如95%「一致」意指除了該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可每100個核苷酸中包括至多五個點突變以外，該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入佔參考序列核苷酸總數至多5%的多個核苷酸。參考序列之此等變化可發生於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或此等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地散佈於參考序列中之殘基中或參考序列內之一或多個相鄰基團中。實際來看，任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可習知地使用已知電腦程式確定，諸如上文關於多肽所論述的電腦程式(例如ALIGN-2)。 術語「表現卡匣 」係指以重組或合成方式產生的聚核苷酸，其具有允許目標細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄的核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。 術語「載體 」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且導引該基因表現的DNA分子，該DNA分子與該基因在目標細胞中可操作地連接。該術語包括呈自身複製核酸結構之載體以及併入至已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入目標細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。 術語「宿主細胞 」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及來源於其之子代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與親代細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變後代。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，但亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。 藥劑之「有效量 」係指使其所投與之細胞或組織中產生生理學變化所需的量。 藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量 」係指在必需的劑量及時段情況下，有效達成所需治療或預防結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之副作用。 「個體 (individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體為人類。 術語「醫藥組合物 」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。 「醫藥學上可接受之賦形劑 」係指醫藥組合物中之除活性成分以外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之賦形劑包含(但不限於)緩衝劑、穩定劑或防腐劑。 術語「藥品說明書 」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或警告之資訊。 如本文所用，「治療 (treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入且可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防癌轉移、降低疾病進程速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病之進程。 如本文所使用，術語「癌症 」係指增生性疾病，諸如淋巴瘤、癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、乳癌、三陰性乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或尿管之癌症、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、中樞神經系統(CNS)之贅瘤、脊柱軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)、黑素瘤、多發性骨髓瘤、B細胞癌(淋巴瘤)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病、慢性骨髓母細胞白血病，包括以上癌症中之任一者之頑抗性版本，或以上癌症中之一或多者之組合。 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子 本發明提供新穎的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其具有尤其有利特性，諸如可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向功效及降低之毒性。 在第一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域。 在一個特定態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，及 (c) 由能夠穩定結合之第一子單元及第二子單元組成的Fc結構域。 在一個特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，其中TNF配位體家族成員共刺激人類T細胞活化。 在另一特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，其中所有實例中之TNF配位體家族成員之胞外域一致。 在另一態樣中，提供如技術方案1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於 (i) 分別地，第一多肽含有CH1或CL結構域且第二多肽含有CL或CH1結構域，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH1或CL結構域，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CL或CH1結構域，或 (ii) 分別地，第一多肽含有CH3結構域且第二多肽含有CH3結構域，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端，或 (iii) 分別地，第一多肽含有VH-CL或VL-CH1結構域且第二多肽含有VL-CH1結構域或VH-CL結構域，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至VH或VL，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之VL或VH。 在一個特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含選自4-1BBL及OX40L之TNF配位體家族成員，其共刺激人類T細胞活化。更特定言之，TNF配位體家族成員為4-1BBL。 在另一態樣中，其中TNF配位體家族成員之胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，尤其SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96之胺基酸序列。在一個態樣中，TNF配位體家族成員或其片段之胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:96，尤其SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96之胺基酸序列。在一個特定態樣中，TNF配位體家族成員或其片段之胞外域包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。在一個特定態樣中，第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在一個態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:183之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:185之胺基酸序列。 在另一態樣中，TNF配位體家族成員為OX40L。在一個特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中TNF配位體家族成員之胞外域包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，尤其SEQ ID NO:53之胺基酸序列。 在一個態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地，第一多肽包含SEQ ID NO:371或SEQ ID:372之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列。 在一個態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 分別地，第一多肽含有CH1或CL結構域且第二多肽含有CL或CH1結構域，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH1或CL結構域，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，該胞外域藉由肽連接子連接至該多肽之CL或CH1結構域。 在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 含有CH1結構域之第一多肽及含有CL結構域之第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH1結構域，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CL結構域。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 含有CL結構域之第一多肽及含有CH1結構域之第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CL結構域，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接該多肽之CH1結構域。 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域。 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 超過一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域。 在一個特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地，第一多肽含有CH3結構域及第二多肽含有CH3結構域，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。特定言之，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域， 其中該兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分結合於兩個不同的目標細胞抗原。 在另一態樣中，本發明提供如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分係選自由以下組成之群：抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。 在一個態樣中，提供如上文所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分係選自由以下組成之群：抗體片段、Fab分子、互換型Fab分子、單鏈Fab分子、Fv分子、scFv分子、單域抗體、aVH及骨架抗原結合蛋白。在一個態樣中，能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為aVH或骨架抗原結合蛋白。在一個態樣中，能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於目標細胞抗原之骨架抗原結合蛋白。 特定言之，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含一個或兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。 在一個特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為Fab分子或能夠特異性結合於目標細胞抗原之互換型Fab分子。特定言之，能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab。 此外，提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、黑素瘤相關軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。 在另一態樣中，提供根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中包含TNF配位體家族成員或其片段之藉由第一肽連接子彼此連接之兩個胞外域的肽在其C端藉由第二肽連接子與重鏈之CH1結構域融合，且其中該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域在其C端藉由第三肽連接子與輕鏈上之CL結構域融合。 在另一態樣中，提供根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中包含TNF配位體家族成員或其片段之藉由第一肽連接子彼此連接之兩個胞外域的肽在其C端藉由第二肽連接子與重鏈之CL結構域融合，且其中該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域在其C端藉由第三肽連接子與輕鏈上之CH1結構域融合。 在另一態樣中，本發明涉及根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中包含TNF配位體家族成員或其片段之藉由第一肽連接子彼此連接之兩個胞外域的肽在其C端藉由第二肽連接子與輕鏈之CL結構域融合，且其中該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域在其C端藉由第三肽連接子與重鏈之CH1結構域融合。 在一個特定態樣中，本發明係關於如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中肽連接子為(G4S)2 。在一個態樣中，第一肽連接子為(G4S)2 (SEQ ID NO:13)，第二肽連接子為GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:57)且第三肽連接子為(G4S)2 (SEQ ID NO:13)。特定言之，本發明係關於如上文所定義之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽連接子為(G4S)2 (SEQ ID NO:13)，第二肽連接子為(G4S)2 (SEQ ID NO:13)且第三肽連接子為(G4S)2 (SEQ ID NO:13)。 在另一態樣中，如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含由能夠穩定結合之第一及第二子單元組成之Fc結構域。 特定言之，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子，其中Fab重鏈在C端與Fc結構域中之CH2結構域之N端融合，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二子單元組成。 在另一態樣中，Fc結構域為IgG，尤其IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域。更特定言之，Fc結構域為IgG1 Fc結構域。在一個特定態樣中，Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之結合的修飾。 降低Fc受體結合及/或效應功能之Fc結構域修飾 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域由包含免疫球蛋白分子之重鏈結構域的一對多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子中之Fc結構域為二聚體，其中各子單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc結構域之兩個子單元彼此間能夠穩定結合。 Fc結構域賦予本發明之抗原結合分子有利的藥物動力學特性，包括長血清半衰期，其促進目標組織中之良好聚集及有利的組織-血液分佈率。然而，其同時可引起本發明之雙特異性抗體不合需要地靶向表現Fc受體之細胞並非較佳的攜有抗原之細胞。因此，在特定態樣中，與原生IgG1 Fc結構域相比，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的Fc結構域呈現降低之針對Fc受體之結合親和力及/或降低之效應功能。在一個態樣中，Fc不實質上結合於Fc受體及/或不誘導效應功能。在一個特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一個特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，人類FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc結構域不誘導效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、降低之細胞激素分泌、降低之免疫複合物介導之抗原呈現細胞之抗原捕捉、降低之與NK細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核細胞之結合、降低之與多形核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞激活。 在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文中提供之含有TNF家族配位體三聚體之抗原結合分子之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。 在一個特定態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，及 (c) Fc結構域，其由能夠穩定結合之第一及第二子單元組成，其中該Fc結構域包含一或多個胺基酸取代，該一或多個胺基酸取代降低與Fc受體，尤其Fcγ受體之結合。 在一個態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的Fc結構域包含一或多個胺基酸突變，其降低Fc結構域對Fc受體及/或效應功能之結合親和力。典型地，Fc結構域之兩個子單元中之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。特定言之，Fc結構域在位置E233、L234、L235、N297、P331及P329 (EU編號)處包含胺基酸取代。特定言之，Fc結構域包含IgG重鏈之位置234及235 (EU編號)及/或329 (EU編號)處的胺基酸取代。更特定言之，提供根據本發明之含有三聚TNF家族配位體之抗原結合分子，其包含具有IgG重鏈中之胺基酸取代L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」，EU編號)之Fc結構域。胺基酸取代L234A及L235A係指所謂的LALA突變。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc結構域之Fcγ受體結合且描述於國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中，其亦描述製備此類突變型Fc結構域之方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。「EU編號」係指根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991之EU索引之編號。 具有降低之Fc受體結合及/或效應功能之Fc結構域亦包括具有Fc結構域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的結構域(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。 在另一態樣中，Fc結構域為IgG4 Fc結構域。與IgG1抗體相比，IgG4抗體呈現降低之對Fc受體之結合親和力及降低之效應功能。在一個更特定態樣中，Fc結構域為包含位置S228 (Kabat編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc結構域。在一個更特定態樣中，Fc結構域為IgG4 Fc結構域，其包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G (EU編號)。此類IgG4 Fc結構域突變體及其Fcγ受體結合特性亦描述於WO 2012/130831中。 突變型Fc結構域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法，藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳學方法可包括編碼DNA序列之定點誘變、PCR、基因合成及其類似方法。正確的核苷酸變化可藉由例如測序來檢驗。 與Fc受體之結合可容易地測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可藉由重組型表現來獲得諸如Fc受體。適合的此類結合分析描述於本文中。或者，Fc結構域或包含Fc結構域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株(諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)評估。 Fc結構域或包含Fc結構域之本發明之雙特異性抗體之效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC之分析描述於本文中。用於評估相關分子之ADCC活性的活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可使用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可評估相關分子之活體內ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型。 在一些實施例中，Fc結構域與補體組分(特定言之，C1q)的結合減少。因此，在其中Fc結構域經工程改造以具有降低之效應功能的一些實施例中，該降低之效應功能包括降低之CDC。可進行C1q結合分析以測定本發明之雙特異性抗體是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。 在一個特定態樣中，Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之結合的修飾。 促進雜二聚化之Fc結構域修飾 在一個態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分， (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之僅一個胞外域，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二子單元組成之Fc結構域，其中Fc結構域包含一或多個胺基酸取代，其降低與Fc受體，尤其Fcγ受體之結合。因此，其包含不同部分，與兩個不相同的多肽鏈(「重鏈」)中通常所包含之Fc結構域之兩個子單元中之一者或另一者融合。此等多肽之重組共表現及隨後二聚化產生兩種多肽之若干種可能的組合。為了改良重組生產中含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之產率及純度，因此宜在本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域中引入促進所需多肽之結合的修飾。 因此，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之結合的修飾。人類IgG Fc結構域中之兩個子單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc結構域之CH3結構域中。因此，該修飾尤其存在於Fc結構域之CH3結構域中。 在一個特定態樣中，該修飾為所謂的「結進孔」修飾，其包含Fc結構域之兩個子單元中之一者中的「結」修飾及Fc結構域之兩個子單元之另一者中的「孔」修飾。因此，在一個特定態樣中，本發明係關於如上文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含IgG分子，其中第一重鏈之Fc部分包含第一二聚模組且第二重鏈之Fc部分包含第二二聚模組，從而實現IgG分子之兩個重鏈之雜二聚化，且根據結進孔技術，第一二聚模組包含結且第二二聚模組包含孔。 結進孔技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。通常，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「結」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「孔」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成及阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小型胺基酸側鏈來構築隆凸。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大型胺基酸側鏈而在第二多肽界面中產生大小與隆凸相同或類似的補償性凹穴。 因此，在一個特定態樣中，在本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域之第一子單元之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在第一子單元之CH3結構域內產生可定位於第二子單元之CH3結構域內之凹穴中的隆凸，且在Fc結構域之第二子單元之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在第二子單元之CH3結構域內產生供第一子單元之CH3結構域內之隆凸可定位於其中的凹穴。 隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸產生，例如藉由定點誘變或藉由肽合成。 在一個特定態樣中，在Fc結構域之第一子單元之CH3結構域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基(T366W)置換，且在Fc結構域之第二子單元之CH3結構域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基(Y407V)置換。更特定言之，另外在Fc結構域之第二子單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基(T366S)置換且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基(L368A)置換。更特定言之，另外在Fc結構域之第一子單元中，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基(S354C)置換，且另外在Fc結構域之第二子單元中，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基(Y349C)置換。引入此等兩個半胱胺酸殘基可引起在Fc結構域之兩個子單元之間形成二硫橋鍵。二硫橋鍵進一步使二聚體穩定(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。 在一個替代性態樣中，促進Fc結構域之第一及第二子單元之結合的修飾包含調節靜電導引作用之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。通常，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc結構域子單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成變成在靜電上不利的，但雜二聚在靜電上為有利的。CH1/CL 結構域中之修飾 為了進一步改良正確配對，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可含有不同的帶電胺基酸取代(所謂的「帶電殘基」)。將此等修飾引入交叉或非交叉CH1及CL結構域中。在一個特定態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在一個CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸由精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在一個CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。 更特定言之，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸由精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。 特定的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子 在另一態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子分別包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第一肽，其包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與第二重鏈或輕鏈融合， 及第二肽，其包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與第二輕鏈或重鏈融合。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的CH1結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，且第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CL結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的CL結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接， 及第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CH1結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的VH結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接， 及第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的VL結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域。 在一個態樣中，本發明提供如技術方案21至23之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸由精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。此等修飾產生具有有利特性之所謂的帶電殘基，其避免不合需要的作用，例如錯配。 此外，提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、黑素瘤相關軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。含有 TNF 家族配位三聚體之抗原結合分子 ， 其中目標細胞抗原為 FAP 在一個特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白質(FAP)。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105之胺基酸序列。 在一個特定態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於FAP之Fab分子且包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於FAP之Fab分子且包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:100之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:101之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:103之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列。 在另一態樣中，能夠特異性結合於FAP之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在另一態樣中，能夠特異性結合於FAP之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:106之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:107之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一個態樣中，能夠特異性結合於FAP之部分包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的可變輕鏈，或包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的可變輕鏈。 在一個特定態樣中，能夠特異性結合於FAP之部分包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的輕鏈可變區。在另一特定態樣中，能夠特異性結合於FAP之部分包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個特定態樣中，能夠特異性結合於FAP之部分包含由SEQ ID NO:106之胺基酸序列組成的VH結構域及由SEQ ID NO:107之胺基酸序列組成的VL結構域。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個特定態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個特定態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第二重鏈，其在其C端藉由第二肽連接子與CH1結構域融合，該第二重鏈包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，及第二輕鏈，其在其C端藉由第三肽連接子與CL結構域融合，該第二輕鏈包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，且其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:113，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:114之胺基酸序列。 在另一特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，且其中抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第二重鏈，其在其C端藉由第二肽連接子與CL結構域融合，該第二重鏈包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，及第二輕鏈，其在其C端藉由第三肽連接子與CH1結構域融合，該第二輕鏈包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，且其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:173，及 (iii) 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:174。 更特定言之，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子，其中第一重鏈包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的VH結構域且第一輕鏈包含有包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的VL結構域，及 (b) 第二重鏈，其在其C端藉由第二肽連接子與CL結構域融合，該第二重鏈包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，及第二輕鏈，其在其C端藉由第三肽連接子與CH1結構域融合，該第二輕鏈包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，其中第二重鏈包含SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:173之胺基酸序列，且第二輕鏈包含SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:174之胺基酸序列。特定言之，第二重鏈包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列且第二輕鏈包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列。 此外，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地，第一多肽含有CH3結構域及第二多肽含有CH3結構域，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。 在一個特定態樣中，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。 更特定言之，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列，或 (ii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列，或 (iii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其選自由以下組成之群： a) 包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； b) 包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； c) 包含有包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:108之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:109之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； d) 包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； e) 包含有包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列的第二重鏈之分子； f) 包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:108之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:110之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； g) 包含有包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； h) 包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:149之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； i) 包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:111之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:112之胺基酸序列的第二輕鏈之分子；及 j) 包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:113之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:114之胺基酸序列的第二輕鏈之分子。 在另一態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其選自由以下組成之群： a) 包含有包含SEQ ID NO:164之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； b) 包含有包含SEQ ID NO:164之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； c) 包含有包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列的第二重鏈之分子； d) 包含有包含SEQ ID NO:164之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； e) 包含有包含SEQ ID NO:164之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:173之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:174之胺基酸序列的第二輕鏈之分子；及 f) 包含有包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列的第二重鏈之分子。 特定言之，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含有包含SEQ ID NO:164之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中TNF配位體家族成員為OX40L且其中目標細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白質(FAP)，且能夠特異性結合於FAP之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105之胺基酸序列。 在一個特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由SEQ ID NO:355組成之群的胺基酸序列，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:356之胺基酸序列。含有 TNF 家族配位三聚體之抗原結合分子 ， 其中目標細胞抗原為 CD19 在一個特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原為CD19。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD19之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:252之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:253之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:254之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，包含SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:249之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:250之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:251之胺基酸序列。 在一個特定態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於CD19之Fab分子且包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:195之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:196之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:197之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於CD19之Fab分子且包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:252之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:253之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:254之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:249之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:250之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:251之胺基酸序列。 在另一態樣中，能夠特異性結合於CD19之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:202之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在另一態樣中，能夠特異性結合於CD19之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:357之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:358之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一個態樣中，能夠特異性結合於CD19之部分包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的可變輕鏈，或其中能夠特異性結合於CD19之部分包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的可變輕鏈。 在一個特定態樣中，能夠特異性結合於CD19之部分包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的輕鏈可變區。在另一特定態樣中，能夠特異性結合於CD19之部分包含包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的輕鏈可變區。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個特定態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個特定態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第二重鏈，其在其C端藉由第二肽連接子與CH1結構域融合，該第二重鏈包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，及第二輕鏈，其在其C端藉由第三肽連接子與CL結構域融合，該第二輕鏈包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，且其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:113，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:114之胺基酸序列。 在另一特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，且其中抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第二重鏈，其在其C端藉由第二肽連接子與CL結構域融合，該第二重鏈包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，及第二輕鏈，其在其C端藉由第三肽連接子與CH1結構域融合，該第二輕鏈包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，且其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:173，及 (iii) 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:174。 此外，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地，第一多肽含有CH3結構域及第二多肽含有CH3結構域，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。 在一個特定態樣中，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。 更特定言之，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:209之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:210之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列，或 (ii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:213之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:214之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列，或 (iii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列，或 (iv) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其選自由以下組成之群 a) 包含有包含SEQ ID NO:205之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； b) 包含有包含SEQ ID NO:205之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； c) 包含有包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:209之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:210之胺基酸序列的第二重鏈之分子； d) 包含有包含SEQ ID NO:205之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； e) 包含有包含SEQ ID NO:205之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:173之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:174之胺基酸序列的第二輕鏈之分子；及 f) 包含有包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:213之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:214之胺基酸序列的第二重鏈之分子。 特定言之，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含有包含SEQ ID NO:205之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其選自由以下組成之群： a) 包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； b) 包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； c) 包含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:209之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:210之胺基酸序列的第二重鏈之分子； d) 包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； e) 包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:173之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:174之胺基酸序列的第二輕鏈之分子；及 f) 包含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:213之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:214之胺基酸序列的第二重鏈之分子。 特定言之，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈。含有 TNF 家族配位三聚體之抗原結合分子 ， 其中目標細胞抗原為 CEA 在一個特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中目標細胞抗原為CEA。 在一個態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD19之部分包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列。 在一個特定態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分為能夠特異性結合於CEA之Fab分子且包含VH結構域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列。 在另一態樣中，能夠特異性結合於CEA之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:327之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:328之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一個態樣中，能夠特異性結合於CEA之部分包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:328之胺基酸序列的可變輕鏈。 在另一態樣中，能夠特異性結合於CEA之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:329之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:330之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一個態樣中，能夠特異性結合於CEA之部分包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的可變輕鏈。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。 在一個特定態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，其包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第二重鏈，其在其C端藉由第二肽連接子與CH1結構域融合，該第二重鏈包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，及第二輕鏈，其在其C端藉由第三肽連接子與CL結構域融合，該第二輕鏈包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，且其中抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:113，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:114之胺基酸序列。 在另一特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，且其中抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第二重鏈，其在其C端藉由第二肽連接子與CL結構域融合，該第二重鏈包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，及第二輕鏈，其在其C端藉由第三肽連接子與CH1結構域融合，該第二輕鏈包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，且其中抗原結合分子包含 i) 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:173，及 (iii) 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:174。 此外，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地，第一多肽含有CH3結構域及第二多肽含有CH3結構域，且其中第一多肽包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域，該兩個胞外域彼此連接且藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，且其中第二多肽包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。 在一個特定態樣中，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分。 更特定言之，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:337之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:338之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列，或 (ii) 第一重鏈，其包含SEQ ID NO:341之胺基酸序列，第二重鏈，其包含SEQ ID NO:342之胺基酸序列，及兩個輕鏈，其包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其選自由以下組成之群 a) 包含有包含SEQ ID NO:333之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； b) 包含有包含SEQ ID NO:333之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； c) 包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:337之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:338之胺基酸序列的第二重鏈之分子； d) 包含有包含SEQ ID NO:333之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈之分子； e) 包含有包含SEQ ID NO:333之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:173之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:174之胺基酸序列的第二輕鏈之分子；及 f) 包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列的兩個輕鏈、包含SEQ ID NO:341之胺基酸序列的第一重鏈及包含SEQ ID NO:342之胺基酸序列的第二重鏈之分子。 特定言之，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含有包含SEQ ID NO:333之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈。 聚核苷酸 本發明亦提供編碼如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其片段的經分離之聚核苷酸。 本發明之編碼含有TNF配位三聚體之抗原結合分子的經分離之聚核苷酸可表現為編碼整個抗原結合分子之單一聚核苷酸或共表現之多個(例如兩個或兩個以上)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經由例如二硫鍵或其他手段結合，以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，免疫球蛋白之輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的單獨聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽結合以形成免疫球蛋白。 在一些態樣中，經分離之聚核苷酸編碼如本文中所描述之根據本發明之整個含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。特定言之，經分離之聚核苷酸編碼如本文中所描述之根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中所包含之多肽。 在一個態樣中，本發明係關於編碼含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的經分離之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分的序列，(b)編碼包含TNF配位體家族成員或其兩個片段之兩個胞外域之多肽的序列，該兩個胞外域或兩個片段藉由肽連接子彼此連接，及(c)編碼包含該TNF配位體家族成員或其片段之一個胞外域之多肽的序列。 在另一態樣中，提供編碼含有4-1BB配位三聚體之抗原結合分子的經分離之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分的序列，(b)編碼包含4-1BBL或其兩個片段之兩個胞外域之多肽的序列，該兩個胞外域或兩個片段藉由肽連接子彼此連接，及(c)編碼包含4-1BBL或其片段之一個胞外域之多肽的序列。 在另一態樣中，本發明係關於經分離之聚核苷酸，其包含編碼包含兩個4-1BBL片段之多肽的序列，該兩個4-1BBL片段包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:96中展示之胺基酸序列至少約90%、95%、98%或100%一致的胺基酸序列，及係關於聚核苷酸，該聚核苷酸包含編碼包含一個4-1BBL片段之多肽的序列，該4-1BBL片段包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:96中展示之胺基酸序列至少約90%、95%、98%或100%一致的胺基酸序列。 此外，提供編碼含有OX40配位三聚體之抗原結合分子的經分離之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分的序列，(b)編碼包含OX40L或其兩個片段之兩個胞外域之多肽的序列，該兩個胞外域藉由肽連接子彼此連接，及(c)編碼包含OX40L或其片段之一個胞外域之多肽的序列。 在另一態樣中，本發明係關於經分離之聚核苷酸，其包含編碼包含兩個4-1BBL片段之多肽的序列，該兩個4-1BBL片段包含與SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54中所展示之胺基酸序列至少約90%、95%、98%或100%一致的胺基酸序列，及係關於聚核苷酸，其包含編碼包含一個4-1BBL片段之多肽的序列，該4-1BBL片段包含與SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54中所展示之胺基酸序列至少約90%、95%、98%或100%一致的胺基酸序列。 在其他態樣中，本發明係關於包含與本文中所揭示之特定cDNA序列至少約90%、95%、98%或100%一致的序列之聚核苷酸。在一個特定態樣中，本發明係關於包含與本文中所揭示之特定cDNA序列中之一者一致的序列之聚核苷酸。 在其他態樣中，核酸分子包含編碼如SEQ ID NO:5、6、97、98、99、183、184或185中之任一者中所闡述之胺基酸序列的核苷酸序列或由其組成。在另一態樣中，核酸分子包含編碼如SEQ ID NO:14、15、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173或174中之任一者中所闡述之胺基酸序列的核苷酸序列或由其組成。 在其他態樣中，核酸分子包含選自由以下組成之群的核苷酸序列或由其組成：SEQ ID NO:66、67、68、69、129、130、131、132、133、134、137、138、141、142、143、144、146、147、150、151、152、153、162、163、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、203、204、207、208、211、212、215、216、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、307、308、311、312、315、316、331、332、335、336、339、340、343、344、347、348、353或354。 在某些態樣中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股。 重組方法 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可例如藉由固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組製備來獲得。關於重組製備，分離一或多個編碼含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸(例如上文所描述)且插入一或多個載體中以用於宿主細胞中之進一步選殖及/或表現。此類聚核苷酸可使用習知程序容易地分離及測序。在本發明之一個態樣中，提供包含本發明之聚核苷酸中之一或多者的載體，較佳表現載體。可使用熟習此項技術者熟知的方法構築表現載體，該等表現載體具有含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之編碼序列(片段)以及適合的轉錄/轉譯控制信號。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)中所描述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括其中編碼含有腫瘤壞死因子TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸(亦即編碼區)以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯對照元件可操作結合之方式克隆的表現卡匣。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'未轉譯區及其類似物)不為編碼區之一部分。兩個或兩個以上編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如單一載體上，或存在於各別聚核苷酸構築體中，例如各別(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或兩個以上編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白水解分裂而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。此外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源編碼區(與或未與編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段的聚核苷酸融合)，或其變異體或衍生物。異源編碼區包括包括(但不限於)專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能性結構域。可操作結合為基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列以使基因產物之表現受到調節序列之影響或控制的方式結合。若誘導啟動子功能可引起編碼所需基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其相關的啟動子)為「可操作結合」。因此，若啟動子能夠實現核酸轉錄，則啟動子區域與編碼多肽之核酸可操作地結合。啟動子可為僅引導預定細胞中之DNA之實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子以外的其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)與引導細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地結合。 本文中揭示適合的啟動子及其他轉錄控制區。熟習此項技術者已知多種轉錄控制區。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子A)、猿猴病毒40 (例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔α-血球蛋白)之區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclins))。類似地，多種轉譯控制元件已為一般熟習此項技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。 本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽的其他編碼區結合，從而引導由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。舉例而言，若需要分泌含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段，則可將編碼信號序列之DNA置放於編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之核酸的上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有自成熟蛋白質裂解(一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網輸出已起始)的信號肽或分泌性前導序列。一般熟習此項技術者認識到，脊椎動物細胞分泌的多肽通常具有與多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯之多肽裂解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或保持引導與其可操作結合之多肽之分泌之能力的該序列之功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。 編碼可用於促進較晚純化(例如組胺酸標籤)或幫助標記融合蛋白質之短蛋白質序列之DNA可包括於編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸內或位於其末端。 在本發明之另一態樣中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸的宿主細胞。在某些實施例中，提供包含本發明之一或多種載體的宿主細胞。聚核苷酸及載體可合併有本文分別關於聚核苷酸及載體所述之任一特徵(單個或組合)。在一個態樣中，宿主細胞包含載體(例如經該載體轉型或轉染)，該載體包含編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子(之一部分)的聚核苷酸。如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指任何類型之可經工程改造以產生本發明之融合蛋白質或其片段的細胞系統。適用於複製及支持抗原結合分子之表現的宿主細胞為此項技術中熟知。此類細胞可視需要經特定表現載體轉染或轉導，且可生長含有大量載體之細胞以用於接種大型醱酵槽，以獲得足量抗原結合分子以用於臨床應用。適合的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可在細菌中產生多肽，尤其在無需糖基化時。在表現之後，可自可溶性部分之細菌細胞糊狀物分離出多肽且可將該多肽進一步純化。除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而引起產生具有部分或完全人類糖基化模式之多肽的真菌及酵母株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及Li等人, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。 適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人, J Gen Virol 36, 59 (1977)中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells)(TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人, Annals N. Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所描述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質製備的某些哺乳動物宿主細胞株之評述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁 (2003)。宿主細胞包括經培養之細胞，例如(但不限於)哺乳動物培養之細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞，但亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或所培養之植物或動物組織內所包含之細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。此項技術中已知在此等系統中表現外源基因的標準技術。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽的細胞可經工程改造以亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈的免疫球蛋白。 在一個態樣中，提供製備本發明之含有腫瘤壞死因子TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段的方法，其中該方法包含在適用於表現本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之條件下培養包含聚核苷酸之宿主細胞，該等聚核苷酸編碼如本文中提供之本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段。 在本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中，該等組分(至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分、一個包含TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域的多肽及一個包含該TNF家族配位體家族成員或其片段之一個胞外域的多肽)不以遺傳學方式彼此融合。多肽經設計使得其組分(TNF配位體家族成員或其片段之兩個胞外域及其他組分，諸如CH或CL)直接或經由連接子序列彼此融合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法確定且可測試其功效。本發明之抗原結合分子之不同組分之間的連接子序列之實例見於本文中提供之序列中。亦可包括合併裂解位點的其他序列以在必要時將融合蛋白質中之個別組分分離，例如內肽酶識別序列。 在某些實施例中，形成抗原結合分子之一部分的能夠特異性結合於目標細胞抗原(例如Fab片段)之部分包含至少一個能夠結合於抗原之免疫球蛋白可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段之一部分且來源於天然或非天然存在之抗體及其片段。產生多株抗體及單株抗體之方法為此項技術中熟知(參見例如Harlow及Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成構築，可以重組方式產生(例如美國專利第4,186,567號中所描述)或可藉由例如篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。 本發明中可使用任何動物物種之免疫球蛋白。適用於本發明之非限制性免疫球蛋白可為鼠、靈長類動物或人類來源。若融合蛋白質意欲用於人類用途，則可使用其中免疫球蛋白之恆定區來自人類之免疫球蛋白之嵌合形式。亦可根據此項技術中熟知之方法製備免疫球蛋白之人類化或完全人類形式(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法達成，包括(但不限於) (a)將非人類(例如供體抗體)CDR移植至人類(例如受體抗體)構架區及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用的殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用的殘基)移植至人類構架區及恆定區上；或(c)移植整個非人類可變域，但藉由置換表面殘基而用人類類似區段對其進行「遮掩」。人類化抗體及其製造方法評述於例如Almagro及Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人, Nature 332, 323-329 (1988)；Queen等人, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人, Nature 321, 522-525 (1986)；Morrison等人, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison及Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)；Kashmiri等人, Methods 36, 25-34 (2005) (描述SDR (a-CDR)移植)；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (描述「表面重修」)；Dall'Acqua等人, Methods 36, 43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人, Methods 36, 61-68 (2005)及Klimka等人, Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (描述FR改組的「導向選擇」方法)中。根據本發明之特定免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。人類抗體及人類可變區可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)及Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)中。人類可變區可形成藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體的一部分且可來源於藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體(參見例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由如下製備：向經修飾之轉殖基因動物投與免疫原，從而回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體(參見例如Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005))。人類抗體及人類可變區亦可藉由分隔選自人類衍生之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變區序列來產生(參見例如Hoogenboom等人, Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及McCafferty等人, Nature 348, 552-554；Clackson等人, Nature 352, 624-628 (1991))。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。 在某些態樣中，本發明之抗原結合分子中所包含之能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分(例如Fab片段)根據例如PCT公開案WO 2012/020006 (參見與親和力成熟相關之實例)或美國專利申請公開案第2004/0132066號中所揭示之方法經工程改造以具有增強之結合親和力。本發明之抗原結合分子結合於特異性抗原決定子之能力可經由酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術(例如表面電漿子共振技術)(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。可使用競爭分析鑑別與參考抗體競爭結合於特定抗原之抗原結合分子。在某些實施例中，此類競爭抗原結合分子結合於與由參考抗原結合分子所結合相同的抗原決定基(例如直鏈或構形抗原決定基)。抗原結合分子所結合之抗原決定基之定位的詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。在例示性競爭分析中，在包含結合於抗原之第一標記抗原結合分子及測試與第一抗原結合分子競爭結合於抗原之能力的第二未標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原。第二抗原結合分子可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗原結合分子但不包含第二未標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原。在允許第一抗體結合於抗原之條件下培育後，移除過量的未結合抗體，且量測與固定抗原相關之標記之量。若與對照樣品相比，測試樣品中與固定抗原相關之標記之量實質上降低，則表明第二抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭結合於抗原。參見Harlow及Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 第14章 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。 如本文中所描述製備之本發明之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子可藉由此項技術中已知的技術純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排阻層析及其類似技術。用於純化特定蛋白質之實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。關於親和層析純化，可使用與含有TNF配位三聚體之抗原結合分子結合之抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，關於本發明之融合蛋白質之親和層析純化，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可使用序列蛋白質A或G親和層析及尺寸排阻層析來分離實質上如實例中所描述之抗原結合分子。可藉由多種熟知分析方法(包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似方法)中之任一種測定含有TNF配位三聚體之抗原結合分子或其片段的純度。舉例而言，證實如實例中所描述來表現之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子為完整的且經適當組裝，如由還原及非還原性SDS-PAGE證明。 分析 可藉由此項技術中已知之各種分析對本文中提供之抗原結合分子針對其物理/化學特性及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。 1. 親和力分析 可使用標準測試設備(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))及諸如可藉由重組表現獲得之受體或目標蛋白質，根據實例中所闡述之方法藉由表面電漿子共振(SPR)測定本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子對相應TNF受體之親和力。亦可使用標準測試設備(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))及諸如可藉由重組表現獲得之受體或目標蛋白質，藉由表面電漿子共振(SPR)測定含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子對目標細胞抗原之親和力。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於實例4中。根據一個態樣，在25℃下使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)藉由表面電漿子共振量測KD 。 2. 結合分析及其他分析 本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子與表現相應受體之細胞的結合可使用表現特定受體或目標抗原之細胞株藉由例如流動式細胞測量術(FACS)來評估。在一個態樣中，結合分析中使用表現TNF受體之新鮮的周邊血液單核細胞(PBMC)。此等細胞在分離後(原生PMBC)或在刺激後(經活化之PMBC)直接使用。在另一態樣中，使用經活化之小鼠脾細胞(表現TNF受體分子)證明本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子與表現相應TNF受體之細胞的結合。 在另一態樣中，使用表現目標細胞抗原(例如FAP)之癌細胞株說明抗原結合分子與目標細胞抗原之結合。 在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別分別與特異性抗體或抗原結合分子競爭結合於目標或TNF受體之抗原結合分子。在某些實施例中，此類競爭抗原結合分子結合於與由特異性抗目標抗體或特異性抗TNF受體抗體所結合相同之抗原決定基(例如直鏈或構形抗原決定基)。用於定位抗體所結合之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology 第66卷 (Humana Press, Totowa, NJ)中。 3. 活性分析 在一個態樣中，提供用於鑑別結合於具有生物活性之特異性目標細胞抗原及特異性TNF受體之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的分析。生物活性可包括例如經由細胞上表現目標細胞抗原之TNF受體進行之促效性信號傳導。亦提供由分析鑑別為具有此類活體外生物活性之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。 在某些態樣中，針對此類生物活性測試本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。用於偵測本發明之分子之生物活性的分析為實例6中所描述之分析。此外，用於偵測細胞溶解(例如藉由量測LDH釋放)、誘導之細胞凋亡動力學(例如藉由量測卡斯蛋白酶3/7活性)或細胞凋亡(例如使用TUNEL分析)之分析為此項技術中熟知的。此外，此類複合物之生物活性可藉由評估其對多種淋巴細胞子集(諸如NK細胞、NKT細胞或γδ T細胞)之存活、增殖及淋巴激素分泌之作用或評估其調節抗原呈現細胞(諸如樹突狀細胞、單核細胞/巨噬細胞或B細胞)之表現型及功能的能力來評估。 醫藥組合物、調配物及投藥途徑 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含任一種本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，例如以用於以下治療方法中之任一種。在一個實施例中，醫藥組合物包含任一種本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含任一種本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子及至少一種其他治療劑，例如下文所描述。 本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解或分散於醫藥學上可接受之賦形劑中的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般為無毒性的，亦即當適當時投與動物(諸如人類)時，不會產生有害的過敏反應或其他不良反應。根據本發明，具有含有至少一種TNF家族配位三聚體之抗原結合分子及視情況選用之其他活性成分的醫藥組合物之製備為熟習此項技術者已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 Mack Printing Company, 1990，其以引用之方式併入本文中。特定言之，組合物為凍乾調配物或水性溶液。如本文中所使用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、鹽、穩定劑及其組合，如一般熟習此項技術者已知。 非經腸組合物包括經設計以藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)來投藥的組合物。對於注射，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可在水性溶液中，較佳在生理學上相容之緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，融合蛋白質可呈粉末形式以用於在使用之前用適合的媒劑(例如無菌無熱原質水)復原。藉由將所需量之本發明之融合蛋白質併入視需要具有多種下文列舉之其他成分之適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可藉由例如經由無菌過濾膜過濾來容易地實現。通常，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其利用預先無菌過濾之液體介質產生活性成分加任何其他所需成分之粉末。必要時，液體介質宜經緩衝，且在用足量生理食鹽水或葡萄糖注射之前，首先使液體稀釋劑呈等張性。組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且針對微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用加以保存。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。適合的醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫氨酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合的穩定劑或增加化合物溶解度之試劑以允許製備高度濃縮之溶液。此外，活性化合物之懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質體。 活性成分可包覆於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包覆於膠態藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合的實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。 本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP(包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。 例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所描述之水性抗體調配物，WO2006/044908中所描述之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。 除先前描述之組合物以外，融合蛋白質亦可調配成儲存製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，融合蛋白質可用適合的聚合或疏水性材料(例如呈可接受之油中的乳液形式)或離子交換樹脂調配，或調配成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。 包含本發明之融合蛋白質之醫藥組合物可借助於習知混合、溶解、乳化、包裹、包覆或凍乾方法製造。醫藥組合物可使用一或多種有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習知方式調配。適當調配物視所選投藥途徑而定。 含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可調配成游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保持游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與游離羧基形成的鹽亦可來源於無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。與相應的游離鹼形式相比，醫藥鹽傾向於更溶於水性及其他質子溶劑中。 本文中之組合物亦可含有一種以上為治療特定適應症所需之活性成分，較佳為具有互補活性不會對彼此產生不利影響之活性成分。此類活性成分宜以有效達成預期目的之量組合存在。 用於活體內投藥之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由例如經由無菌過濾膜過濾而輕易地實現。 治療方法及組合物 任一種本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可用於治療方法中。 對於用於治療方法中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可以符合良好醫學實踐之方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞位點、投藥方法、投藥時程及開業醫生已知之其他因素。 在一個態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子用作藥劑。在其他態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子用於治療疾病，尤其用於治療癌症。在某些態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子用於治療方法。在一個態樣中，本發明提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子用於治療有需要個體之疾病。在某些態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子用於治療患有疾病之個體之方法中，該方法包含投與該個體治療有效量之該融合蛋白質。在某些態樣中，所治療之疾病為癌症。癌症之實例包括實體腫瘤、膀胱癌、腎細胞癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌、黑素瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤及急性淋巴母細胞白血病。因此，提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子用於治療癌症。需要治療之個體、患者或「個體」典型地為哺乳動物，更特別是人類。 在另一態樣中，提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療感染性疾病，尤其用於治療病毒感染。在另一態樣中，提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療自體免疫疾病，諸如狼瘡疾病。 在一個態樣中，提供根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、乳癌、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌(PAC)、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及間皮瘤，其中目標細胞抗原為FAP。 在另一態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造或製備用以治療有需要之個體中之疾病的藥劑。在一個態樣中，藥劑用於治療疾病之方法，其包含投與患有疾病之個體治療有效量之藥劑。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症，特定言之，癌症。因此，在一個態樣中，本發明係關於本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造或製備用以治療癌症之藥劑。癌症之實例包括實體腫瘤、膀胱癌、腎細胞癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌、黑素瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤及急性淋巴母細胞白血病。其他可使用本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子治療的細胞增殖病症包括(但不限於)位於以下部位之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭部及頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸區及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病變及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習此項技術者可認識到，在一些情況下，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可能不提供治癒，而僅可提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學變化亦視為治療上有利的。因此，在一些態樣中，提供生理學變化之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之量視為「有效量」或「治療有效量」。 在另一態樣中，本發明係關於如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造或製備用以治療感染性疾病，尤其用於治療病毒感染或用於治療自體免疫疾病(例如狼瘡疾病)之藥劑。 在另一態樣中，本發明提供用於治療個體中之疾病的方法，其包含投與該個體治療有效量之本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。在一個態樣中，投與該個體組合物，其包含醫藥學上可接受之形式的本發明之融合蛋白質。在某些態樣中，所治療之疾病為增生性病症。在一個特定態樣中，疾病為癌症。在另一態樣中，疾病為感染性疾病或自體免疫疾病。在某些態樣中，若所治療之疾病為癌症，該方法進一步包含投與個體治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。 對於預防或治療疾病，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之適合劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於所治療之疾病類型、投藥途徑、患者之體重、融合蛋白質之類型、疾病之嚴重度及病程、融合蛋白質是否投與用於預防性或治療性目的、先前或並行治療干預、患者臨床病史及對融合蛋白質之反應以及主治醫師之判斷。負責投藥之從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及適用於個別個體的劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。 含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子宜一次性或經一系列治療來投與患者。取決於疾病之類型及嚴重度，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可為投與患者之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次單獨投藥或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療通常將持續至疾病症狀之所需抑制發生為止。融合蛋白質之一種例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。在其他實例中，劑量亦可包含每次投藥約1 μg/kg體重、約5 μg/kg體重、約10 μg/kg體重、約50 μg/kg體重、約100 μg/kg體重、約200 μg/kg體重、約350 μg/kg體重、約500 μg/kg體重、約1 mg/kg體重、約5 mg/kg體重、約10 mg/kg體重、約50 mg/kg體重、約100 mg/kg體重、約200 mg/kg體重、約350 mg/kg體重、約500 mg/kg體重至約1000 mg/kg體重或1000 mg/kg體重以上，及其中可衍生之任何範圍。在來自本文中列舉之數值之可衍生範圍之實例中，基於上述數值，可投與約5 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約5 μg/kg體重至約500 mg/kg體重等之範圍。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接收約二至約二十或例如約六個劑量之融合蛋白質)。最初可投與較高起始劑量，隨後可投與一或多種較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析來監測。 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子通常以可有效實現所欲目的之量使用。對於用於治療或預防疾病病狀，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其醫藥組合物以治療有效量投與或施用。治療有效量之確定完全屬於熟習此項技術者之能力範圍內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。 對於全身投藥，可首先由活體外分析(諸如細胞培養分析)評估治療有效劑量。接著可在動物模型中調配劑量以實現循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中測定的IC50 。此類資訊可用於更精確地測定人類中之適用劑量。 亦可使用此項技術中熟知的技術由活體內資料(例如動物模型)評估初始劑量。一般熟習此項技術者可基於動物資料容易地最佳化人類投藥。 可個別地調節劑量及區間以提供足以維持治療作用之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的血漿含量。常見的患者注射投藥劑量在約0.1至50毫克/公斤/天，通常約0.5至1毫克/公斤/天範圍內。治療有效血漿含量可藉由每日投與多次劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC量測。 在局部投藥或選擇性捕捉之情況下，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之有效局部濃度可能與血漿濃度無關。熟習此項技術者能夠最佳化治療有效局部劑量而無需不當實驗。 本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之治療有效劑量通常將提供治療效益而不引起實質性毒性。可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥學程序測定融合蛋白質之毒性及治療功效。可使用細胞培養分析及動物研究來測定LD50 (50%群體致死劑量)及ED50 (50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數，其可表示為比率LD50 /ED50 。呈現較大治療指數之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子為較佳。在一個實施例中，根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子呈現高治療指數。自細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類的劑量範圍。劑量較佳在循環濃度範圍內，其包括毒性極小或無毒性的ED50 。該劑量可視各種因素而在此範圍內變化，例如所使用之劑型、所使用之投藥途徑、個體之病狀及其類似因素。可由個別醫師根據患者病狀選擇確切調配物、投藥途徑及劑量(參見例如Fingl等人, 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章, 第1頁, 其以全文引用之方式併入本文中)。 用本發明之融合蛋白質治療之患者之主治醫師將知曉如何及何時由於毒性、器官功能不全及其類似原因而終止、中斷或調節投藥。相反，主治醫師亦知曉若臨床反應不充足(排除毒性)，則將治療調節至較高水準。管理所關注病症時所投與劑量之量值將因所治療之病狀之嚴重度及投藥途徑及其類似因素而不同。病狀之嚴重度可例如部分地藉由標準預後評價方法來評估。另外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變。 其他藥劑及治療 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可與療法中之一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之融合蛋白質可與至少一種其他治療劑共同投與。術語「治療劑」涵蓋可投與用於治療需要此類治療之個體中之症狀或疾病的任何藥劑。此類其他治療劑可包含適用於治療特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的活性成分。在某些實施例中，其他治療劑為另一種抗癌劑。 此類其他藥劑宜以有效達成所欲目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所使用之融合蛋白質之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子通常以相同劑量及藉由如本文中所描述之投藥途徑使用，或本文中所描述之劑量之約1至99%，或以任何劑量及藉由憑經驗/臨床上測定合適的任何途徑。 上文指出的此類組合療法涵蓋組合投藥(其中在相同或各別組合物中包括兩種或兩種以上治療劑)及各別投藥，在此情況下，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之投藥可在其他治療劑及/或佐劑之投藥之前、同時及/或之後進行。 製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。製品包含容器及附於或系連於容器之標籤或藥品說明書。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子。 標記或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中組合物包含本發明之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中的製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。 或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 表C (序列)：
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 人類(hu) 4-1BBL (71-254) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
2 hu 4-1BBL (85-254) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
3 hu 4-1BBL (80-254) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
4 hu 4-1BBL (52-254) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
5 由(G4S)2 連接子連接之二聚hu 4-1BBL (71-254) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
6 單體hu 4-1BBL (71-254)加(G4S)2 連接子 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGS
7 FAP(28H1)  CDR-H1 SHAMS
8 FAP(28H1)  CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG
9 FAP(28H1)  CDR-H3 GWLGNFDY
10 FAP(28H1)  CDR-L1 RASQSVSRSYLA
11 FAP(28H1)  CDR-L2 GASTRAT
12 FAP(28H1)  CDR-L3 QQGQVIPPT
13 (G4S)2 GGGGSGGGGS
14 二聚hu 4-1BBL (71-254)-CH1 Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15 單體hu 4-1BBL (71-254)-CL REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
16 FAP(28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS
17 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
18 抗FAP(28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP(28H1)輕鏈 參見表2
20 人類(hu) FAP UniProt編號Q12884
21 hu FAP胞外域+聚lys-tag+his6 -tag RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
22 核苷酸序列hu FAP胞外域+聚lys-tag+his6 -tag CGCCCTTCAAGAGTTCATAACTCTGAAGAAAATACAATGAGAGCACTCACACTGAAGGATATTTTAAATG GAACATTTTCTTATAAAACATTTTTTCCAAACTGGATTTCAGGACAAGAATATCTTCATCAATCTGCAGATAACAATATAGTACTTTATAATATTGAAACAGGACAATCATATACCATTTTGAGTAATAGAACCATGAAAAGTGTGAATGCTTCAAATTACGGCTTATCACCTGATCGGCAATTTGTATATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTTTGGAGATACTCTTACACAGCAACATATTACATCTATGACCTTAGCAATGGAGAATTTGTAAGAGGAAATGAGCTTCCTCGTCCAATTCAGTATTTATGCTGGTCGCCTGTTGGGAGTAAATTAGCATATGTCTATCAAAACAATATCTATTTGAAACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAAATAACATTTAATGGAAGAGAAAATAAAATATTTAATGGAATCCCAGACTGGGTTTATGAAGAGGAAATGCTTGCTACAAAATATGCTCTCTGGTGGTCTCCTAATGGAAAATTTTTGGCATATGCGGAATTTAATGATACGGATATACCAGTTATTGCCTATTCCTATTATGGCGATGAACAATATCCTAGAACAATAAATATTCCATACCCAAAGGCTGGAGCTAAGAATCCCGTTGTTCGGATATTTATTATCGATACCACTTACCCTGCGTATGTAGGTCCCCAGGAAGTGCCTGTTCCAGCAATGATAGCCTCAAGTGATTATTATTTCAGTTGGCTCACGTGGGTTACTGATGAACGAGTATGTTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTCCAGAATGTTTCGGTCCTGTCTATATGTGACTTCAGGGAAGACTGGCAGACATGGGATTGTCCAAAGACCCAGGAGCATATAGAAGAAAGCAGAACTGGATGGGCTGGTGGATTCTTTGTTTCAACACCAGTTTTCAGCTATGATGCCATTTCGTACTACAAAATATTTAGTGACAAGGATGGCTACAAACATATTCACTATATCAAAGACACTGTGGAAAATGCTATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATAAATATATTCAGAGTAACACAGGATTCACTGTTTTATTCTAGCAATGAATTTGAAGAATACCCTGGAAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAAGCTATCCTCCAAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAGGTGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCGACTACGCCAAGTACTATGCACTTGTCTGCTACGGCCCAGGCATCCCCATTTCCACCCTTCATGATGGACGCACTGATCAAGAAATTAAAATCCTGGAAGAAAACAAGGAATTGGAAAATGCTTTGAAAAATATCCAGCTGCCTAAAGAGGAAATTAAGAAACTTGAAGTAGATGAAATTACTTTATGGTACAAGATGATTCTTCCTCCTCAATTTGACAGATCAAAGAAGTATCCCTTGCTAATTCAAGTGTATGGTGGTCCCTGCAGTCAGAGTGTAAGGTCTGTATTTGCTGTTAATTGGATATCTTATCTTGCAAGTAAGGAAGGGATGGTCATTGCCTTGGTGGATGGTCGAGGAACAGCTTTCCAAGGTGACAAACTCCTCTATGCAGTGTATCGAAAGCTGGGTGTTTATGAAGTTGAAGACCAGATTACAGCTGTCAGAAAATTCATAGAAATGGGTTTCATTGATGAAAAAAGAATAGCCATATGGGGCTGGTCCTATGGAGGATACGTTTCATCACTGGCCCTTGCATCTGGAACTGGTCTTTTCAAATGTGGTATAGCAGTGGCTCCAGTCTCCAGCTGGGAATATTACGCGTCTGTCTACACAGAGAGATTCATGGGTCTCCCAACAAAGGATGATAATCTTGAGCACTATAAGAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAATATTTCAGAAATGTAGACTATCTTCTCATCCACGGAACAGCAGATGATAATGTGCACTTTCAAAACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTCTGGTTAATGCACAAGTGGATTTCCAGGCAATGTGGTACTCTGACCAGAACCACGGCTTATCCGGCCTGTCCACGAACCACTTATACACCCACATGACCCACTTCCTAAAGCAGTGTTTCTCTTTGTCAGACGGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGGGCCACCACCATCACCATCAC
23 小鼠FAP UniProt編號P97321
24 鼠類FAP胞外域+聚lys-tag+his6 -tag RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPNWISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYFSWLTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWHAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISIGNSPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLHDGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAVYRKLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGILSGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
25 核苷酸序列 鼠類FAP胞外域+聚lys-tag+his6 -tag CGTCCCTCAAGAGTTTACAAACCTGAAGGAAACACAAAGAGAGCTCTTACCTTGAAGGATATTTTAAATG GAACATTCTCATATAAAACATATTTTCCCAACTGGATTTCAGAACAAGAATATCTTCATCAATCTGAGGATGATAACATAGTATTTTATAATATTGAAACAAGAGAATCATATATCATTTTGAGTAATAGCACCATGAAAAGTGTGAATGCTACAGATTATGGTTTGTCACCTGATCGGCAATTTGTGTATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTCTGGCGATATTCATACACAGCGACATACTACATCTACGACCTTCAGAATGGGGAATTTGTAAGAGG ATACGAGCTCCCTCGTCCAATTCAGTATCTATGCTGGTCGCCTGTTGGGAGTAAATTAGCATATGTATATCAAAACAATATTTATTTGAAACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAAATAACTTATACTGGAAGAGAAAATAGAATATTTAATGGAATACCAGACTGGGTTTATGAAGAGGAAATGCTTGCCACAAAATATGCTCTTTGGTGGTCTCCAGATGGAAAATTTTTGGCATATGTAGAATTTAATGATTCAGATATACCAATTATTGCCTATTCTTATTATGGTGATGGACAGTATCCTAGAACTATAAATATTCCATATCCAAAGGCTGGGGCTAAGAATCCGGTTGTTCGTGTTTTTATTGTTGACACCACCTACCCTCACCACGTGGGCCCAATGGAAGTGCCAGTTCCAGAAATGATAGCCTCAAGTGACTATTATTTCAGCTGGCTCACATGGGTGTCCAGTGAACGAGTATGCTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTGCAGAATGTCTCAGTCCTGTCTATATGTGATTTCAGGGAAGACTGGCATGCATGGGAATGTCCAAAGAACCAGGAGCATGTAGAAGAAAGCAGAACAGGATGGGCTGGTGGATTCTTTGTTTCGACACCAGCTTTTAGCCAGGATGCCACTTCTTACTACAAAATATTTAGCGACAAGGATGGTTACAAACATATTCACTACATCAAAGACACTGTGGAAAATGCTATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATATATATATTCCGCGTAACACAGGATTCACTGTTTTATTCTAGCAATGAATTTGAAGGTTACCCTGGAAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAAACTCTCCTCCGAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAGGTGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCTACAAAGCCAAGTACTATGCACTCGTCTGCTATGGCCCTGGCCTCCCCATTTCCACCCTCCATGATGGCCGCACAGACCAAGAAATACAAGTATTAGAAGAAAACAAAGAACTGGAAAATTCTCTGAGAAATATCCAGCTGCCTAAAGTGGAGATTAAGAAGCTCAAAGACGGGGGACTGACTTTCTGGTACAAGATGATTCTGCCTCCTCAGTTTGACAGATCAAAGAAGTACCCTTTGCTAATTCAAGTGTATGGTGGTCCTTGTAGCCAGAGTGTTAAGTCTGTGTTTGCTGTTAATTGGATAACTTATCTCGCAAGTAAGGAGGGGATAGTCATTGCCCTGGTAGATGGTCGGGGCACTGCTTTCCAAGGTGACAAATTCCTGCATGCCGTGTATCGAAAACTGGGTGTATATGAAGTTGAGGACCAGCTCACAGCTGTCAGAAAATTCATAGAAATGGGTTTCATTGATGAAGAAAGAATAGCCATATGGGGCTGGTCCTACGGAGGTTATGTTTCATCCCTGGCCCTTGCATCTGGAACTGGTCTTTTCAAATGTGGCATAGCAGTGGCTCCAGTCTCCAGCTGGGAATATTACGCATCTATCTACTCAGAGAGATTCATGGGCCTCCCAACAAAGGACGACAATCTCGAACACTATAAAAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAATATTTCAGAAATGTAGACTATCTTCTCATCCACGGAACAGCAGATGATAATGTGCACTTTCAGAACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTTTGGTTAATGCACAAGTGGATTTCCAGGCGATGTGGTACTCTGACCAGAACCATGGTATATTATCTGGGCGCTCCCAGAATCATTTATATACCCACATGACGCACTTCCTCAAGCAATGCTTTTCTTTATCAGACGGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGGGCCACCACCATCACCATCAC
26 食蟹獼猴FAP胞外域+聚lys-tag+his6 -tag RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPFVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
27 核苷酸序列 食蟹獼猴FAP胞外域+聚lys-tag+his6 -tag CGCCCTCCAAGAGTTCATAACTCTGAAGAAAATACAATGAGAGCACTCACACTGAAGGATATTTTAAATG GGACATTTTCTTATAAAACATTTTTTCCAAACTGGATTTCAGGACAAGAATATCTTCATCAATCTGCAGATAACAATATAGTACTTTATAATATTGAAACAGGACAATCATATACCATTTTGAGTAACAGAACCATGAAAAGTGTGAATGCTTCAAATTATGGCTTATCACCTGATCGGCAATTTGTATATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTTTGGAGATACTCTTACACAGCAACATATTACATCTATGACCTTAGCAATGGAGAATTTGTAAGAGGAAATGAGCTTCCTCGTCCAATTCAGTATTTATGCTGGTCGCCTGTTGGGAGTAAATTAGCATATGTCTATCAAAACAATATCTATTTGAAACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAAATAACATTTAATGGAAGAGAAAATAAAATATTTAATGGAATCCCAGACTGGGTTTATGAAGAGGAAATGCTTGCTACAAAATATGCTCTCTGGTGGTCTCCTAATGGAAAATTTTTGGCATATGCGGAATTTAATGATACAGATATACCAGTTATTGCCTATTCCTATTATGGCGATGAACAATATCCCAGAACAATAAATATTCCATACCCAAAGGCCGGAGCTAAGAATCCTTTTGTTCGGATATTTATTATCGATACCACTTACCCTGCGTATGTAGGTCCCCAGGAAGTGCCTGTTCCAGCAATGATAGCCTCAAGTGATTATTATTTCAGTTGGCTCACGTGGGTTACTGATGAACGAGTATGTTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTCCAGAATGTTTCGGTCTTGTCTATATGTGATTTCAGGGAAGACTGGCAGACATGGGATTGTCCAAAGACCCAGGAGCATATAGAAGAAAGCAGAACTGGATGGGCTGGTGGATTCTTTGTTTCAACACCAGTTTTCAGCTATGATGCCATTTCATACTACAAAATATTTAGTGACAAGGATGGCTACAAACATATTCACTATATCAAAGACACTGTGGAAAATGCTATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATAAATATATTCAGAGTAACACAGGATTCACTGTTTTATTCTAGCAATGAATTTGAAGATTACCCTGGAAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAAGCTATCCTCCAAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAGGTGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCGACTACGCCAAGTACTATGCACTTGTCTGCTATGGCCCAGGCATCCCCATTTCCACCCTTCATGACGGACGCACTGATCAAGAAATTAAAATCCTGGAAGAAAACAAGGAATTGGAAAATGCTTTGAAAAATATCCAGCTGCCTAAAGAGGAAATTAAGAAACTTGAAGTAGATGAAATTACTTTATGGTACAAGATGATTCTTCCTCCTCAATTTGACAGATCAAAGAAGTATCCCTTGCTAATTCAAGTGTATGGTGGTCCCTGCAGTCAGAGTGTAAGGTCTGTATTTGCTGTTAATTGGATATCTTATCTTGCAAGTAAGGAAGGGATGGTCATTGCCTTGGTGGATGGTCGGGGAACAGCTTTCCAAGGTGACAAACTCCTGTATGCAGTGTATCGAAAGCTGGGTGTTTATGAAGTTGAAGACCAGATTACAGCTGTCAGAAAATTCATAGAAATGGGTTTCATTGATGAAAAAAGAATAGCCATATGGGGCTGGTCCTATGGAGGATATGTTTCATCACTGGCCCTTGCATCTGGAACTGGTCTTTTCAAATGTGGGATAGCAGTGGCTCCAGTCTCCAGCTGGGAATATTACGCGTCTGTCTACACAGAGAGATTCATGGGTCTCCCAACAAAGGATGATAATCTTGAGCACTATAAGAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAATATTTCAGAAATGTAGACTATCTTCTCATCCACGGAACAGCAGATGATAATGTGCACTTTCAAAACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTCTGGTTAATGCACAAGTGGATTTCCAGGCAATGTGGTACTCTGACCAGAACCACGGCTTATCCGGCCTGTCCACGAACCACTTATACACCCACATGACCCACTTCCTAAAGCAGTGTTTCTCTTTGTCAGACGGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGGGCCACCACCATCACCATCAC
28 人類CEA UniProt編號P06731
29 人類MCSP UniProt編號Q6UVK1
30 人類EGFR UniProt編號P00533
31 人類CD19 UniProt編號P15391
32 人類CD20 Uniprot編號P11836
33 人類CD33 UniProt編號P20138
34 人類淋巴毒素α UniProt編號P01374
35 人類TNF UniProt編號P01375
36 人類淋巴毒素β UniProt編號Q06643
37 人類OX40L UniProt編號P23510
38 人類CD40L UniProt編號P29965
39 人類FasL UniProt編號P48023
40 人類CD27L UniProt編號P32970
41 人類CD30L UniProt編號P32971
42 人類4-1BBL UniProt編號P41273
43 人類TRAIL UniProt編號P50591
44 人類RANKL UniProt編號O14788
45 人類TWEAK UniProt編號O43508
46 人類APRIL UniProt編號O75888
47 人類BAFF UniProt編號Q9Y275
48 人類LIGHT UniProt編號O43557
49 人類TL1A UniProt編號O95150
50 人類GITRL UniProt編號Q9UNG2
51 人類外胚層間質A UniProt編號Q92838
52 hu 4-1BBL (50-254) ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
53 hu OX40L (51-183) QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
54 hu OX40L (52-183) VSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
55 肽連接子(SG4)2 SGGGGSGGGG
56 肽連接子G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
57 肽連接子 GSPGSSSSGS
58 肽連接子(G4S)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
59 肽連接子 GSGSGNGS
60 肽連接子 GGSGSGSG
61 肽連接子 GGSGSG
62 肽連接子 GGSG
63 肽連接子 GGSGNGSG
64 肽連接子 GGNGSGSG
65 肽連接子 GGNGSG
66 核苷酸序列 二聚hu 4-1BBL (71-254)-CH1 Fc結鏈 參見表2
67 核苷酸序列 單體hu 4-1BBL (71-254)-CL1 參見表2
68 核苷酸序列 抗FAP(28H1) Fc孔鏈 參見表2
69 核苷酸序列 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
70 鼠類(mu) 4-1BBL UniProt編號Q3U1Z9-1
71 核苷酸序列 二聚mu 4-1BBL (104-309, C137,160,246S)-CH1 Fc結鏈 參見表13
72 核苷酸序列 單體mu 4-1BBL (104-309, C137,160,246S)-CL 參見表13
73 核苷酸序列 抗FAP Fc KK鏈 參見表13
74 核苷酸序列 抗FAP輕鏈 參見表13
75 二聚mu 4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CL Fc DD鏈 參見表13
76 單體mu 4-1BBL (104-309, C137,160,246S)-CL1 參見表13
77 抗FAP Fc KK鏈 參見表13
78 抗FAP輕鏈 參見表13
79 核苷酸序列DP47 Fc-孔鏈 參見表18
80 核苷酸序列DP47輕鏈 參見表18
81 DP47 Fc-孔鏈 參見表18
82 DP47輕鏈 參見表18
83 人類4-1BB Fc(kih) 參見表31
84 食蟹獼猴4-1BB Fc(kih) 參見表31
85 鼠類4-1BB Fc(kih) 參見表31
86 核苷酸序列 Fc 孔鏈 參見表32
87 核苷酸序列 人類4-1BB Fc(kih) 參見表32
88 核苷酸序列 食蟹獼猴4-1BB Fc(kih) 參見表32
89 核苷酸序列 鼠類4-1BB Fc(kih) 參見表32
90 Fc 孔鏈 參見表32
91 人類4-1BB Fc(kih) 參見表32
92 食蟹獼猴4-1BB Fc(kih) 參見表32
93 鼠類4-1BB Fc(kih) 參見表32
94 核苷酸序列 人類4-1BB His 參見表33
95 人類4-1BB His 參見表33
96 人類(hu) 4-1BBL (71-248) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
97 由(G4S)2 連接子連接之二聚hu 4-1BBL (71-248) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
98 由(G4S)2 連接子連接之二聚hu 4-1BBL (80-254) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
99 由(G4S)2 連接子連接之二聚hu 4-1BBL (52-254) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
100 FAP(4B9)  CDR-H1 SYAMS
101 FAP(4B9)  CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG
102 FAP(4B9)  CDR-H3 GWFGGFNY
103 FAP(4B9)  CDR-L1 RASQSVTSSYLA
104 FAP(4B9)  CDR-L2 VGSRRAT
105 FAP(4B9)  CDR-L3 QQGIMLPPT
106 FAP(4B9)  VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
107 FAP(4B9)  VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
108 二聚hu 4-1BBL (71-254)-CH1* Fc結鏈 參見表4
109 單體hu 4-1BBL (71-254)-CL* 參見表4
110 單體hu 4-1BBL (71-254)-(G4S)1-CL* 參見表7
111 二聚hu 4-1BBL (52-254)-CH1* Fc結鏈 參見表10
112 單體hu 4-1BBL (52-254)-CL* 參見表10
113 二聚hu 4-1BBL (80-254)-CH1* Fc結鏈 參見表11
114 單體hu 4-1BBL (80-254)-CL* 參見表11
115 二聚hu 4-1BBL (71-254)-CL* Fc結鏈 參見表3
116 單體hu 4-1BBL (71-254)-CH1* 參見表3
117 二聚hu 4-1BBL (71-254)-CL Fc結鏈 參見表22
118 單體hu 4-1BBL (71-254)-CH1 參見表22
119 二聚hu 4-1BBL (71-248)-CL* Fc結鏈 參見表24
120 單體hu 4-1BBL (71-248)-CH1* 參見表24
121 與二聚4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表6
122 與單體4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (28H1) Fc結鏈 參見表6
123 與二聚4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表23
124 與單體4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (4B9) Fc結鏈 參見表23
125 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
126 與二聚4-1BBL (71-248)融合之抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表26
127 與單體4-1BBL (71-248)融合之抗FAP (4B9) Fc結鏈 參見表26
128 肽連接子 GGGGS
129 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
130 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) -CH1* 參見表3
131 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc結鏈 參見表4
132 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) -CL* 參見表4
133 核苷酸序列抗FAP (28H1) (VHCL) Fc 孔鏈 參見表4
134 核苷酸序列抗FAP (28H1) (VLCH1)輕鏈 參見表4
135 抗FAP (VHCL) (28H1) Fc 孔鏈 參見表4
136 抗FAP (VLCH1) (28H1)輕鏈 參見表4
137 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc結鏈 參見表5
138 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) -CL* 參見表5
139 單體hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表5
140 二聚hu 4-1BBL (71-254) -CL* 參見表5
141 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表6
142 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列抗FAP (28H1) Fc結鏈 參見表6
143 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) -(G4S)1 - CL* 參見表7
144 核苷酸序列[抗FAP (28H1)]2 Fc 孔鏈 參見表8
145 [抗FAP (28H1)]2   Fc 孔鏈 參見表8
146 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*) Fc結鏈 參見表9
147 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) -FAP (VLCH1*) 參見表9
148 二聚hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*) Fc結鏈 參見表9
149 單體hu 4-1BBL (71-254) -FAP (VLCH1*) 參見表9
150 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (52-254) - CH1* Fc結鏈 參見表10
151 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (52-254) -CL* 參見表10
152 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (80-254) - CH1* Fc結鏈 參見表11
153 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (80-254) -CL* 參見表11
154 核苷酸序列DP47 FC KK鏈 參見表14
155 核苷酸序列DP47輕鏈 參見表14
156 DP47 FC KK鏈 參見表14
157 DP47輕鏈 參見表14
158 核苷酸序列二聚mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD鏈 參見表15
159 核苷酸序列單體鼠類4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 參見表15
160 二聚mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD鏈 參見表15
161 單體鼠類4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 參見表15
162 核苷酸序列 抗FAP (4B9) Fc 孔鏈 參見表21
163 核苷酸序列 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
164 抗FAP (4B9) Fc 孔鏈 參見表21
165 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL Fc結鏈 參見表22
166 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1 參見表22
167 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表23
168 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列抗FAP (4B9) Fc結鏈 參見表23
169 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
170 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 參見表24
171 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
172 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 參見表25
173 二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
174 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 參見表25
175 與二聚hu 4-1BBL (71-248)融合之核苷酸序列抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表26
176 與單體hu 4-1BBL (71-248)融合之核苷酸序列抗FAP (4B9) Fc結鏈 參見表26
177 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列DP47 Fc孔鏈 參見表27
178 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列DP47 Fc結鏈 參見表27
179 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之DP47 Fc孔鏈 參見表27
180 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之DP47 Fc結鏈 參見表27
181 核苷酸序列DP47重鏈(hu IgG1 PGLALA) 參見表29
182 DP47重鏈(hu IgG1 PGLALA) 參見表29
183 單體hu 4-1BBL (71-254)加(G4S)1 連接子 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGS
184 單體hu 4-1BBL (71-248)加(G4S)2 連接子 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGS
185 單體hu 4-1BBL (71-248)加(G4S)1 連接子 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGS
186 核苷酸序列 人類CD19抗原Fc結鏈avi tag 參見表43
187 多肽序列人類CD19抗原Fc結鏈avi tag 參見表43
188 核苷酸序列 食蟹獼猴CD19抗原Fc結鏈avi tag 參見表43
189 多肽序列食蟹獼猴CD19抗原Fc結鏈avi tag 參見表43
190 人類化CD19 (8B8) HVR-L1 NSNGNT
191 人類化CD19 (8B8) HVR-H2 KFNG
192 人類化CD19 (8B8)變異體1至9 HVR-H2 TEKFQGRVTM
193 人類化CD19 (8B8)變異體5 HVR-L1 LENPNGNT
194 人類化CD19 (8B8)變異體9 HVR-L1 LENPSGNT
195 CD19 (8B8-018) CDR-H1 DYIMH
196 CD19 (8B8-018) CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG
197 CD19 (8B8-018) CDR-H3 GTYYYGSALFDY
198 CD19 (8B8-018) CDR-L1 KSSQSLENPNGNTYLN
199 CD19 (8B8-018) CDR-L2 RVSKRFS
200 CD19 (8B8-018) CDR-L3 LQLTHVPYT
201 CD19 (8B8-018) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS
202 CD19 (8B8-018) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK
203 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc 孔鏈 參見表47
204 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
205 抗CD19(8B8-018) Fc 孔鏈 參見表47
206 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
207 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體鏈 參見表49
208 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc結單體配位體 參見表49
209 抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體鏈 參見表49
210 抗CD19(8B8-018) Fc結單體配位體 參見表49
211 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 參見表52
212 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc結單體(71-248)配位體 參見表52
213 抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 參見表52
214 抗CD19(8B8-018) Fc結單體(71-248)配位體 參見表52
215 核苷酸序列CD19 (8B8) VH親本純系 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGGCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATATTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGACTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTTCTAAGTACACTGAGAAGTTCAACGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCTTCCATCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGACCTATTATTATGGTAGCGCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCG
216 核苷酸序列CD19 (8B8) VL親本純系 GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAACTCCTGATCTACAGGGTTTCCAAACGATTTTCTGGGGTCCTAGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTACAACTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
217 CD19 L1反向隨機子 參見表53
218 CD19 L2正向隨機子 參見表53
219 CD19 H1反向隨機子 參見表53
220 CD19 H2正向隨機子 參見表53
221 CD19 H3反向恆定子 參見表53
222 LMB3 參見表53
223 D19 L1正向恆定子 參見表54
224 CD19 L3反向隨機子 參見表54
225 CD19 L3正向恆定子 參見表54
226 CD19 H3反向隨機子 參見表54
227 核苷酸序列SNAP tag 人類 CD19 ECD- PDGFR GGCCGCCGCTAGCGGCATCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCGGCATCGATGCCATCATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACGAGATCAAGCTGCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACCAGCAGCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGTCTAGCTCTGGCGCCGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTGATATCCCCGAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAAGAGGGCGACAATGCCGTGCTGCAGTGCCTGAAGGGCACCTCCGATGGCCCTACCCAGCAGCTGACCTGGTCCAGAGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGCTGTCTCTGGGCCTGCCTGGCCTGGGCATCCATATGAGGCCTCTGGCCATCTGGCTGTTCATCTTCAACGTGTCCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGTCAGCCTGGCCCCCCATCTGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGCTGGACCGTGAACGTGGAAGGATCCGGCGAGCTGTTCCGGTGGAACGTGTCCGATCTGGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAAGAACAGATCTAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAACTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGACCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCTCCTTGCCTGCCCCCTAGAGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACAATGGCCCCTGGCAGCACACTGTGGCTGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTGTCTAGAGGCCCTCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCTAAGGGCCCTAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGAGATATGTGGGTCATGGAAACCGGCCTGCTGCTGCCTAGAGCCACAGCCCAGGATGCCGGCAAGTACTACTGCCACAGAGGCAACCTGACCATGAGCTTCCACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGTGCTGTGGCACTGGCTGCTGAGAACAGGCGGCTGGAAGGTCGACGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTGGTGGTGATCTCAGCCATCCTGGCCCTGGTGGTGCTCACCATCATCTCCCTTATCATCCTCATCATGCTTTGGCAGAAGAAGCCACGT
228 核苷酸序列SNAP tag 食蟹獼猴 CD19 ECD- PDGFR CCGGCCGCCGCTAGCGGCATCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCGGCATCGATGCCATCATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACGAGATCAAGCTGCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACCAGCAGCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGTCTAGCTCTGGCGCCGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTGATATCCCCCAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAAGAGGGCGACAATGCCGTGCTCCAGTGTCTCGAGGGCACCTCCGATGGCCCTACACAGCAGCTCGTGTGGTGCAGAGACAGCCCCTTCGAGCCCTTCCTGAACCTGTCTCTGGGCCTGCCTGGCATGGGCATCAGAATGGGCCCTCTGGGCATCTGGCTGCTGATCTTCAACGTGTCCAACCAGACCGGCGGCTTCTACCTGTGTCAGCCTGGCCTGCCAAGCGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGATGGACCGTGTCCGTGGAAGGATCTGGCGAGCTGTTCCGGTGGAACGTGTCCGATCTGGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAAGAACAGAAGCAGCGAGGGCCCTAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGAATAGCAGCCAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGACCCGAGATGTGGGAGGGCGAGCCTGTGTGTGGCCCCCCTAGAGATAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACAATGGCCCCTGGCAGCACACTGTGGCTGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTGTCCAGAGGCCCTCTGAGCTGGACACACGTGCGGCCTAAGGGCCCTAAGAGCAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACCGGCCCGACCGGGATATGTGGGTGGTGGATACAGGCCTGCTGCTGACCAGAGCCACAGCCCAGGATGCCGGCAAGTACTACTGCCACAGAGGCAACTGGACCAAGAGCTTTTACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGCCCTGTGGCACTGGCTGCTGAGAATCGGAGGCTGGAAGGTCGACGAGCAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGACCTGAACGCCGTGGGCCAGGATACCCAGGAAGTGATCGTGGTGCCCCACAGCCTGCCCTTCAAGGTGGTCGTGATCAGCGCCATTCTGGCCCTGGTGGTGCTGACCATCATCAGCCTGATCATCCTGATTATGCTGTGGCAGAAAAAGCCCCGC
229 多肽序列SNAP tag 人類 CD19 ECD- PDGFR PAAASGIDYKDDDDKAGIDAIMDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHEIKLLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYQQLAALAGNPAATAAVKTALSGNPVPILIPCHRVVSSSGAVGGYEGGLAVKEWLLAHEGHRLGKPGLGDIPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR
230 多肽序列SNAP tag 食蟹獼猴 CD19 ECD- PDGFR PAAASGIDYKDDDDKAGIDAIMDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHEIKLLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYQQLAALAGNPAATAAVKTALSGNPVPILIPCHRVVSSSGAVGGYEGGLAVKEWLLAHEGHRLGKPGLGDIPQEPLVVKVEEGDNAVLQCLEGTSDGPTQQLVWCRDSPFEPFLNLSLGLPGMGIRMGPLGIWLLIFNVSNQTGGFYLCQPGLPSEKAWQPGWTVSVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLNSSQLYVWAKDRPEMWEGEPVCGPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVRPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLTRATAQDAGKYYCHRGNWTKSFYLEITARPALWHWLLRIGGWKVDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR
231 CD19 (8B8-5H09) CDR-L1 參見表56
232 CD19 (8B8-5H09) CDR-L2 參見表56
233 CD19 (8B8-5H09) CDR-L3 參見表56
234 CD19 (8B8-5H09) CDR-H1 參見表57
235 CD19 (8B8-5H09) CDR-H2 參見表57
236 CD19 (8B8-5H09) CDR-H3 參見表57
237 CD19 (8B8-7H07) CDR-L1 參見表56
238 CD19 (8B8-7H07) CDR-L2 參見表56
239 CD19 (8B8-7H07) CDR-L3 參見表56
240 CD19 (8B8-7H07) CDR-H1 參見表57
241 CD19 (8B8-7H07) CDR-H2 參見表57
242 CD19 (8B8-7H07) CDR-H3 參見表57
243 CD19 (8B8-2B03) CDR-L1 參見表56
244 CD19 (8B8-2B03) CDR-L2 參見表56
245 CD19 (8B8-2B03) CDR-L3 參見表56
246 CD19 (8B8-2B03) CDR-H1 參見表57
247 CD19 (8B8-2B03) CDR-H2 參見表57
248 CD19 (8B8-2B03) CDR-H3 參見表57
249 CD19 (8B8-2B11) CDR-L1 參見表56
250 CD19 (8B8-2B11) CDR-L2 參見表56
251 CD19 (8B8-2B11) CDR-L3 參見表56
252 CD19 (8B8-2B11) CDR-H1 參見表57
253 CD19 (8B8-2B11) CDR-H2 參見表57
254 CD19 (8B8-2B11) CDR-H3 參見表57
255 CD19 (8B8-5A07) CDR-L1 參見表56
256 CD19 (8B8-5A07) CDR-L2 參見表56
257 CD19 (8B8-5A07) CDR-L3 參見表56
258 CD19 (8B8-5A07) CDR-H1 參見表57
259 CD19 (8B8-5A07) CDR-H2 參見表57
260 CD19 (8B8-5A07) CDR-H3 參見表57
261 CD19 (8B8-5B08) CDR-L1 參見表56
262 CD19 (8B8-5B08) CDR-L2 參見表56
263 CD19 (8B8-5B08) CDR-L3 參見表56
264 CD19 (8B8-5B08) CDR-H1 參見表57
265 CD19 (8B8-5B08) CDR-H2 參見表57
266 CD19 (8B8-5B08) CDR-H3 參見表57
267 CD19 (8B8-5D08) CDR-L1 參見表56
268 CD19 (8B8-5D08) CDR-L2 參見表56
269 CD19 (8B8-5D08) CDR-L3 參見表56
270 CD19 (8B8-5D08) CDR-H1 參見表57
271 CD19 (8B8-5D08) CDR-H2 參見表57
272 CD19 (8B8-5D08) CDR-H3 參見表57
273 核苷酸序列CD19 (8B8)親本輕鏈 參見表58
274 核苷酸序列CD19 (8B8)親本重鏈 參見表58
275 CD19 (8B8)親本輕鏈 參見表58
276 CD19 (8B8)親本重鏈 參見表58
277 核苷酸序列CD19 (8B8-2B11)輕鏈 參見表59
278 核苷酸序列CD19 (8B8-2B11)重鏈 參見表59
279 CD19 (8B8-2B11)輕鏈 參見表59
280 CD19 (8B8-2B11)重鏈 參見表59
281 核苷酸序列CD19 (8B8-7H07)輕鏈 參見表59
282 核苷酸序列CD19 (8B8-7H07)重鏈 參見表59
283 CD19 (8B8-7H07)輕鏈 參見表59
284 CD19 (8B8-7H07)重鏈 參見表59
285 核苷酸序列CD19 (8B8-2B03)輕鏈 參見表59
286 核苷酸序列CD19 (8B8-2B03)重鏈 參見表59
287 CD19 (8B8-2B03)輕鏈 參見表59
288 CD19 (8B8-2B03)重鏈 參見表59
289 核苷酸序列CD19 (8B8-5A07)輕鏈 參見表59
290 核苷酸序列CD19 (8B8-5A07)重鏈 參見表59
291 CD19 (8B8-5A07)輕鏈 參見表59
292 CD19 (8B8-5A07)重鏈 參見表59
293 核苷酸序列CD19 (8B8-5D08)輕鏈 參見表59
294 核苷酸序列CD19 (8B8-5D08)重鏈 參見表59
295 CD19 (8B8-5D08)輕鏈 參見表59
296 CD19 (8B8-5D08)重鏈 參見表59
297 核苷酸序列CD19 (8B8-5B08)輕鏈 參見表59
298 核苷酸序列CD19 (8B8-5B08)重鏈 參見表59
299 CD19 (8B8-5B08)輕鏈 參見表59
300 CD19 (8B8-5B08)重鏈 參見表59
301 核苷酸序列CD19 (8B8-5H09)輕鏈 參見表59
302 核苷酸序列CD19 (8B8-5H09)重鏈 參見表59
303 CD19 (8B8-5H09)輕鏈 參見表59
304 CD19 (8B8-5H09)重鏈 參見表59
305 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
306 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
307 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體鏈 參見表64
308 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體配位體 參見表64
309 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體鏈 參見表64
310 抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體配位體 參見表64
311 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 參見表67
312 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體(71-248)配位體 參見表67
313 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 參見表67
314 抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體(71-248)配位體 參見表67
315 核苷酸序列CD19(8B8-018)重鏈(huIgG1 PGLALA) 參見表72
316 CD19(8B8-018)重鏈(huIgG1 PGLALA) 參見表72
317 抗mu CEA T84.66 VH MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGAEL VEPGASVKLS CTASGFNIKD TYMHWVKQRP EQGLEWIGRI DPANGNSKYV PKFQGKATIT ADTSSNTAYL QLTSLTSEDT AVYYCAPFGY YVSDYAMAYW GQGTSVTVSS
318 抗mu CEA T84.66 VL metdtlllwv lllwvpgstg divltqspas lavslgqrat mscragesvd ifgvgflhwy qqkpgqppkl liyrasnles gipvrfsgtg srtdftliid pveaddvaty ycqqtnedpy tfgggtklei k
319 IGHV1-69*08 IMGT寄存編號Z14309 TAAGGGGCTT CCTAGTCCTA AGGCTGAGGA AGGGATCCTG GTTTAGTTAA AGAGGATTTT ATTCACCCCT GTGTCCTCTC CACAGGTGTC CAGTCCCAGG TCCAGCTGGT GCAATCTGGG GCTGAGGTGA AGAAGCCTGG GTCCTCGGTG AAGGTCTCCT GCAAGGCTTC TGGAGGCACC TTCAGCAGCT ATACTATCAG CTGGGTGCGA CAGGCCCCTG GACAAGGGCT TGAGTGGATG GGAAGGATCA TCCCTATCCT TGGTACAGCA AACTACGCAC AGAAGTTCCA GGGCAGAGTC ACGATTACCG CGGACAAATC CACGAGCACA GCCTACATGG AGCTGAGCAG CCTGAGATCT GAGGACACGG CCGTGTATTA CTGTGCGAGA GA
320 IGKV3-11*01 IMGT寄存編號 CTGCAGCTGG AAGCTCAGCT CCCACCCAGC TGCTTTGCAT GTCCCTCCCA GCTGCCCTAC CTTCCAGAGC CCATATCAAT GCCTGTGTCA GAGCCCTGGG GAGGAACTGC TCAGTTAGGA CCCAGAGGGA ACCATGGAAG CCCCAGCTCA GCTTCTCTTC CTCCTGCTAC TCTGGCTCCC AGGTGAGGGG AACATGAGGT GGTTTTGCAC ATTAGTGAAA ACTCTTGCCA CCTCTGCTCA GCAAGAAATA TAATTAAAAT TCAAAGTATA TCAACAATTT TGGCTCTACT CAAAGACAGT TGGTTTGATC TTGATTACAT GAGTGCATTT CTGTTTTATT TCCAATTTCA GATACCACCG GAGAAATTGT GTTGACACAG TCTCCAGCCA CCCTGTCTTT GTCTCCAGGG GAAAGAGCCA CCCTCTCCTG CAGGGCCAGT CAGAGTGTTA GCAGCTACTT AGCCTGGTAC CAACAGAAAC CTGGCCAGGC TCCCAGGCTC CTCATCTATG ATGCATCCAA CAGGGCCACT GGCATCCCAG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACTCT CACCATCAGC AGCCTAGAGC CTGAAGATTT TGCAGTTTAT TACTGTCAGC AGCGTAGCAA CTGGCCTCCC ACAGTGATTC CACATGAAAC AAAAACCCCA ACAAGACCAT CAGTGTTTAC TAGATTATTA TACCAGCTGC TTCCTTTACA GACAGCTAGT GGGGTGGCCA CTCAGTGTTA GCATCTCAGC TCTATTTGGC CATTTTGGAG TTCAAGT 
321 CEA CDR-H1 參見表81
322 CEA CDR-H2 參見表81
323 CEA CDR-H3 參見表81
324 CEA CDR-L1 參見表81
325 CEA CDR-L2 參見表81
326 CEA CDR-L3 參見表81
327 親本CEA結合子VH 參見表81
328 親本CEA結合子VL 參見表81
329 人類化CEA結合子VH 參見表81
330 人類化CEA結合子VL 參見表81
331 核苷酸序列抗 CEA(T84.66-LCHA) Fc 孔鏈 參見表82
332 核苷酸序列抗 CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
333 抗 CEA (T84.66-LCHA) Fc 孔鏈 參見表82
334 抗 CEA (T84.66-LCHA) 輕鏈 參見表82
335 核苷酸序列抗 CEA(T84.66-LCHA) Fc孔二聚配位體鏈 參見表84
336 核苷酸序列抗 CEA(T84.66-LCHA) Fc結單體配位體 參見表84
337 抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔二聚配位體鏈 參見表84
338 抗CEA(T84.66-LCHA) Fc結單體配位體 參見表84
339 核苷酸序列抗 CEA (T84.66-LCHA) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 參見表87
340 核苷酸序列抗CEA (T84.66-LCHA) Fc結單體(71-248)配位體 參見表87
341 抗CEA (T84.66-LCHA) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 參見表87
342 抗CEA (T84.66-LCHA) Fc結單體(71-248)配位體 參見表87
343 核苷酸序列抗 CEA(T84.66) Fc 孔鏈 參見表88
344 核苷酸序列抗 CEA(T84.66)輕鏈 參見表88
345 抗CEA (T84.66) Fc孔鏈 參見表88
346 抗CEA (T84.66)輕鏈 參見表88
347 核苷酸序列抗 CEA(T84.66) Fc孔二聚配位體鏈 參見表89
348 核苷酸序列抗CEA(T84.66) Fc結單體配位體 參見表89
349 抗CEA(T84.66) Fc孔二聚配位體鏈 參見表89
350 抗CEA(T84.66) Fc結單體配位體 參見表89
351 核苷酸序列hu NA3B3A2-avi His 參見表92
352 人類NA3B3A2-avi-His 參見表92
353 核苷酸序列二聚hu OX40L (51-183) - CL* Fc結鏈 參見表97
354 核苷酸序列單體hu OX40L (51-183) - CH1* 參見表97
355 二聚hu OX40L (51-183) - CL* Fc結鏈 參見表97
356 單體hu OX40L (51-183) - CH1* 參見表97
357 CD19 (8B8-2B11) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS
358 CD19 (8B8-2B11) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIK
359 CD19 (8B8-7H07) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSELFDYWGQGTTVTVSS
360 CD19 (8B8-7H07) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQATHIPYTFGQGTKLEIK
361 CD19 (8B8-2B03) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYITHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPDLFDYWGQGTTVTVSS
362 CD19 (8B8-2B03) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGXKLEIK
363 CD19 (8B8-5A07) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS
364 CD19 (8B8-5A07) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQPGHYPGTFGQGTKLEIK
365 CD19 (8B8-5D08) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSELFDYWGQGTTVTVSS
366 CD19 (8B8-5D08) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHEPYTFGQGTKLEIK
367 CD19 (8B8-5B08) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS
368 CD19 (8B8-5B08) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLDSYPNTFGQGTKLEIK
369 CD19 (8B8-5H09) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS
370 CD19 (8B8-5H09) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLESSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLIDYPVTFGQGTKLEIK
371 由(G4S)2連接子連接之二聚huOX40L (51-183) QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
372 由(G4S)2連接子連接之二聚huOX40L (52-183) VSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
373 hu 4-1BBL (85-248) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
374 hu 4-1BBL (80-248) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
375 hu 4-1BBL (52-248) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)中。根據如上文所定義之根據Kabat (Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))之EU編號系統編號及參考抗體鏈之胺基酸。 *** 實例 以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文所提供之一般說明，可實施各種其他實施例。 重組型DNA技術 使用標準方法以如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所描述操作DNA。根據製造商之說明使用分子生物試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat, E.A.等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH公開案第91-3242號中。 DNA測序 藉由雙股測序法測定DNA序列。 基因合成 所需基因區段係使用適當模板藉由PCR產生，或藉由自動化基因合成法，藉由Geneart AG (Regensburg, Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物合成。在無法獲得確切基因序列之情況下，基於來自最近同源物的序列來設計寡核苷酸引子且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖入標準選殖/測序載體中。自經轉型之細菌純化質體DNA且藉由UV光譜學來測定濃度。經次選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA測序來證實。基因區段經設計具有允許次選殖入各別表現載體中的適合限制位點。所有構築體經設計具有5'端DNA序列，該序列編碼靶向真核細胞中分泌之蛋白質的前導肽。細胞培養技術 如Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.中之現有方案中所描述使用標準細胞培養技術。蛋白質純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施用於蛋白質A瓊脂糖凝膠管柱(GE Healthcare)且用PBS洗滌。在pH 2.8下實現抗體之溶離，接著立即中和樣品。在PBS或20 mm組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0中藉由尺寸排阻層析(Superdex 200，GE Healthcare)自單體抗體分離聚集之蛋白質。收集單體抗體部分，(必要時)使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)離心濃縮器濃縮，冷凍且在-20℃或-80℃下儲存。提供部分樣品用於後續蛋白質分析及分析型特徵化，例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質譜分析。SDS-PAGE 根據製造商說明使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。特定言之，使用10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES (還原性凝膠，具有NuPAGE® Antioxidant操作緩衝液添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)操作緩衝液。分析型尺寸排阻層析 藉由HPLC層析進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之尺寸排阻層析(SEC)。簡言之，將蛋白質A純化抗體施用於Agilent HPLC 1100系統上300 mM NaCl、50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 ，pH 7.5中之Tosoh TSKgel G3000SW管柱或Dionex HPLC系統上2×PBS中之Superdex 200管柱(GE Healthcare)。藉由UV吸光度及峰值面積之積分來定量溶離之蛋白質。BioRad Gel過濾標準151-1901用作標準。質譜分析 此章節描述具有VH/VL交換(VH/VL CrossMab)之多特異性抗體之表徵，其中強調其正確組裝。藉由去糖基化完整CrossMabs及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或以其他方式去糖基化/受限LysC消化CrossMab之電噴霧電離質譜(ESI-MS)來分析預期主要結構。 在1 mg/ml之蛋白質濃度下，VH/VL CrossMab在磷酸鹽或Tris緩衝液中，在37℃下用N-糖苷酶F去糖基化17小時。纖維蛋白溶酶或受限LysC (Roche)消化用100 µg去糖基化VH/VL CrossMab分別在Tris緩衝液pH 8中，在室溫下進行120小時及在37℃下進行40分鐘。在質譜分析之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC將樣品去鹽。在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。使用表面電漿子共振 (SPR)(BIACORE) 測定多特異性抗體與各別抗原之結合及結合親和力 使用BIACORE儀器(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)藉由表面電漿子共振研究所產生之抗體與各別抗原之結合。簡言之，對於親和力量測，Goat-Anti-Human IgG、JIR 109-005-098抗體經由胺偶合固定在CM5晶片上以用於針對各別抗原之抗體之呈現。在HBS緩衝液(HBS-P)(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，ph 7.4)中，在25℃下(或在37℃下)量測結合。在溶液中以多種濃度添加抗原(R&D Systems或內部純化)。藉由80秒至3分鐘之抗原注射來量測結合；藉由用HBS緩衝液洗滌晶片表面3-10分鐘來量測解離且使用1:1朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)來評估KD值。自樣品曲線減去陰性對照資料(例如緩衝液曲線)以用於系統內源性基線偏移之校正及雜訊信號降低。使用各別Biacore Evaluation軟體進行感測圖譜之分析及親和力資料之計算。 實例1 1.1 製備經靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子 根據Uniprot資料庫之P41273序列(SEQ ID NO:42)合成編碼人類4-1BB配位體之胞外域之一部分(胺基酸71-254、52-254及80-254)的DNA序列之不同片段。 作為用於組裝含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之組分，如圖1A中所描繪(人類4-1BB配位體、(G4 S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4 S)2 連接子、人類CH1或CL)或如圖1C中所描繪(人類CH3、(G4 S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4 S)2 連接子、人類4-1BB配位體)選殖包含4-1BB配位體之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔且與人類IgG1-CH1或CL結構域融合)之多肽。 如圖1B中所描述(人類4-1BB配位體、(G4 S)2 連接子、人類CL或CH1)或如圖1D中所描繪(人類CH3、(G4 S)2 連接子、人類4-1BB配位體)選殖包含4-1BB配位體之一個胞外域且與人類IgG1-CL或CH1結構域融合之多肽。 在具有人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域(具有視情況存在之肽連接子)之框架中次選殖多肽，例如對於構築體1，使用SEQ ID NO:57之連接子(GSPGSSSSGS)在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架中次選殖多肽(Merchant, Zhu等人1998)，該編碼二聚4-1BB配位體之多肽與人類CH1結構域融合。 在具有孔之恆定重鏈(Carter, J. Immunol. Methods (2001), 248, 7-15)或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對纖維母細胞活化蛋白質(FAP)，亦即28H1具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區。FAP結合子之產生及製備描述於WO 2012/020006 A2中，其以引用之方式併入本文中。 表1概述所產生之構築體之特徵。構築體1至10在其幾何形狀、對FAP之價數、4-1BB配位體胞外域、CH1及CL結構域之交叉(CrossMab技術)、CH1及CL結構域中之突變及包含4-1BB配位體之一個胞外域之多肽中之不同肽連接子(單體4-1BBL鏈)方面不同。 表1：所產生之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體)之特徵
構築體 針對FAP 之效價 FAP 結合子 4-1BBL 胞外域 交聯CH1-CL 結構域 帶電殘基 針對輕鏈中4-1BBL 之連接子
1.1 單價 28H1 71-254 否 否 (G4S)2
1.2 單價 28H1 71-254 是(配位體) 是(配位體) (G4S)2
1.3 單價 28H1 71-254 是(FAP Fab) 是(配位體) (G4S)2
1.4 單價 28H1 71-254 否 是(配位體) (G4S)2
1.5 二價 28H1 71-254 否 否 (G4S)2
1.6 單價 28H1 71-254 否 是(配位體) (G4S)1
1.7 二價 28H1 71-254 是(配位體) 是(配位體) (G4S)2
1.8 二價 28H1 71-254 是(與配位體融合之FAP Fab) 是(配位體) (G4S)2
1.9 單價 28H1 52-254 否 是(配位體) (G4S)2
1.10 單價 28H1 80-254 否 是(配位體) (G4S)2
為了避免錯配，在大部分構築體中，一對CH1及CL結構域由彼此置換(結構域交叉)，如WO 2009/080253 A1中所描述。 為了進一步改良正確配對，在交叉或非交叉CH1及CL結構域中以構築體2至4及6至10中之帶電殘基形式引入不同帶電胺基酸取代。在人類CL結構域中，引入突變E123R及Q124K，而將突變K147E及K213E選殖入人類CH1結構域。 對於所有構築體，在結鏈之CH3結構域中之S354C/T366W突變及孔鏈之CH3結構域中之相應Y349C/T366S/L368A/Y407V突變情況下使用結進孔雜二聚化技術(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。 根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 舉例而言，在構築體1中，第一CH3結構域中含有S354C/T366W突變之配位體-Fc結鏈與第二CH3結構域中含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之經靶向之抗FAP-Fc孔鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括經組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖2，圖1.1)。 表2展示單價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體1.1)之cDNA及胺基酸序列。 表2：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.1之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
66 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1 Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGAAGCGGAGGGGGAGGAAGTGCTAGCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACAAGTGGAGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGTGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTCGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
67 單體hu 4-1BBL (71-254) -CL AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
68 抗FAP Fc孔鏈 GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
69 抗FAP輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGTCCCGGTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCATCGGCGCCTCTACCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGTCATCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
14 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1 Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15 單體hu 4-1BBL (71-254) -CL1 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18 抗FAP(28H1) Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
19 抗FAP (28H1)輕鏈 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表3展示具有CH1-CL交叉及帶電殘基之單價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體1.2)之酸序列之cDNA及胺基酸序列。 表3：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.2之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
129 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTTATCTTCCCACCCAGCGACCGGAAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
130 單體hu 4-1BBL (71-254) -CH1* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGGAAGATTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGC
68 抗AP Fc孔鏈 參見表2
69 抗FAP輕鏈 參見表2
115 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
116 單體hu 4-1BBL (71-254) -CH1* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC
18 抗FAP(28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
表4展示單價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體Fc (kih)融合分子構築體1.3 (在含有4-1BBL之鏈上之抗FAP Fab及帶電殘基中具有CH1-CL交叉之FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表4：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.3之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
131 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGAAGCGGAGGGGGAGGAAGTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCGAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
132 單體hu 4-1BBL (71-254) -CL* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
133 抗FAP (VHCL) (28H1) Fc孔鏈 GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGTGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTCGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
134 抗FAP (VLCH1) (28H1)輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCCGGAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCATCGGCGCCAGCACCCGGGCCACCGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGTGATCCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGCAGCGCTTCCACCAAAGGCCCTTCCGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCTCCAAGTCCACCTCTGGAGGCACCGCTGCTCTCGGATGCCTCGTGAAGGATTATTTTCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACCTCTGGAGTGCATACTTTCCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGACTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGT
108 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
109 單體hu 4-1BBL (71-254) -CL* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
135 抗FAP (VHCL) (28H1) Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
136 抗FAP (VLCH1) (28H1)輕鏈 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
表5展示單價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.4 (具有抗FAP Fab、與CH1結鏈融合之單體4-1BB配位體及含有4-1BBL之鏈上之帶電殘基的FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表5：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.4之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
137 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCGAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
138 二聚hu 4-1BBL (71-254) -CL* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
68 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
69 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
139 單體hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
140 二聚hu 4-1BBL (71-254) -CL* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
表6展示二價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.5 (具有2個抗FAP Fab、分別在每個重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表6：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.5之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
141 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (28H1) Fc孔鏈 GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
142 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (28H1) Fc結鏈 GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
69 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
121 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (28H1) Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
122 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (28H1) Fc結鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
表7展示單價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.6 (具有抗FAP Fab、經由(G4S)連接子與CL*融合之單體4-1BB配位體之FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表7：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.6之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
131 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc結鏈 參見表4
143 單體hu 4-1BBL (71-254) -(G4S)1 - CL* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
68 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
69 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
108 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc結鏈 參見表4
110 單體hu 4-1BBL (71-254) -(G4S)1 - CL* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
表8展示二價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體7 (具有Fc孔鏈之N端上之雙重抗FAP及與4-1BB配位體融合之交叉CH1及CL上之帶電殘基的FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表8：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.7之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
129 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
130 單體hu 4-1BBL (71-254) -CH1* 參見表3
144 [抗FAP (28H1)]2   Fc孔鏈 GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACAAAGGGACCTAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGCGGAGGGGGATCTGGCGGCGGAGGATCCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
69 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
115 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
116 單體hu 4-1BBL (71-254) -CH1* 參見表3
145 [抗FAP (28H1)]2   Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
表9展示二價FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.8 (具有與抗FAP CrossFab融合之4-1BB配位體及結鏈上之帶電殘基的FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表9：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.8之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
146 二聚hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*) Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCGTGGCTGCACCATCTGTCTTTATCTTCCCACCCAGCGACCGGAAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
147 單體hu 4-1BBL (71-254) -FAP (VLCH1*) AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCCGGAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCATCGGCGCCAGCACCCGGGCCACCGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGTGATCCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGTCCTCTGCTAGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGGAAGATTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGC
68 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
69 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
148 二聚hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*) Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
149 單體hu 4-1BBL (71-254) -FAP (VLCH1*) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC
18 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
表10展示單價FAP靶向之含有4-1BB配位(52-254)三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.9 (具有4-1BBL胞外域胺基酸52-254及配位體鏈上之帶電殘基的FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表10：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.9之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
150 二聚hu 4-1BBL (52-254) - CH1* Fc結鏈 CCTTGGGCTGTGTCTGGCGCTAGAGCCTCTCCTGGATCTGCCGCCAGCCCCAGACTGAGAGAGGGACCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCCGGACTGCTGGATCTGAGACAGGGCATGTTCGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAGGGATCTGGATCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGACTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGCCCAGCCCTAGATCTGAAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCCCCTTGGGCTGTGTCTGGCGCTAGAGCCTCTCCTGGATCTGCCGCCAGCCCCAGACTGAGAGAGGGACCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTCGCTCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGTCCTGGTACTCCGACCCTGGCCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCTCTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGGCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACCCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCCGCTGGCCTGCCTAGCCCAAGAAGTGAAGGGGGAGGCGGATCTGGCGGAGGGGGATCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCGAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
151 單體hu 4-1BBL (52-254) -CL* CCTTGGGCTGTGTCTGGCGCTAGAGCCTCTCCTGGATCTGCCGCCAGCCCCAGACTGAGAGAGGGACCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCCGGACTGCTGGATCTGAGACAGGGCATGTTCGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAGGGATCTGGATCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
68 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
69 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
111 二聚hu 4-1BBL (52-254) - CH1* Fc結鏈 PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
112 單體hu 4-1BBL (52-254) -CL* PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
表11展示單價FAP靶向之含有4-1BB配位(80-254)三聚體之Fc (kih)融合分子構築體1.10 (具有4-1BBL胞外域胺基酸80-254及配位體鏈上之帶電殘基的FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表11：FAP靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體10之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
152 二聚hu 4-1BBL (80-254) - CH1* Fc結鏈 GATCCTGCCGGCCTGCTGGATCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGAGCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGACTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGCCCAGCCCTAGATCTGAAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCCGACCCAGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTCGCTCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGTCCTGGTACTCCGACCCTGGCCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCTCTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGGCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACCCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCCGCTGGCCTGCCTAGCCCAAGAAGTGAAGGGGGAGGCGGATCTGGCGGAGGGGGATCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCGAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
153 單體hu 4-1BBL (80-254) -CL* GATCCTGCCGGCCTGCTGGATCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGAGCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
68 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
69 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
113 二聚hu 4-1BBL (80-254) - CH1* Fc結鏈 DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
114 單體hu 4-1BBL (80-254) -CL* DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18 抗FAP (28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表2
1.2 製備FAP(28H1)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合構築體 將經靶向之含有TNF配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子編碼序列選殖入質體載體，該質體載體驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於在CDS之3'端處的合成polyA序列。此外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 藉由使用聚伸乙基亞胺共轉染HEK293-EBNA細胞及哺乳動物表現載體來產生經靶向之含有TNF配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子。對於構築體1、2、3、4、6、7、8、9、10，細胞用相應表現載體以1:1:1:1比率(例如「載體二聚配位體-(CH1或CL)-結鏈」:「載體單體配位體融合物-(CL或CH1)」:「載體抗FAP Fab-孔重鏈」:「載體抗FAP輕鏈」)轉染。對於二價構築體5，使用1:1:1比率(「載體孔重鏈」:「載體結重鏈」:「載體抗FAP輕鏈」)。 關於在500 mL搖瓶中製備，在轉染之前24小時接種3億個HEK293 EBNA細胞。對於轉染，細胞在210×g下離心10分鐘，且用20 mL預溫熱CD CHO培養基置換上清液。在20 mL CD CHO培養基中混合表現載體(200 μg完全DNA)。在添加540 μL PEI之後，溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加補充有6 mM L-麩醯胺酸、5 g/L PEPSOY及1.2 mM丙戊酸之160 mL Excell培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加12% Feed7及葡萄糖(最終濃度3 g/L)。在培養7天之後，藉由在400×g下離心30-40分鐘來收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由使用蛋白質A進行親和層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化經靶向之含有TNF配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子。對於親和層析，上清液裝載於用20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 7.5)平衡之MabSelect Sure管柱(CV=5-15 mL，來自GE Healthcare之樹脂)上。藉由用至少6倍管柱體積之相同緩衝液洗滌來移除未結合之蛋白質。用20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸緩衝液(pH 3.0)，使用線性梯度(20 CV)或分步溶離(8 CV)來溶離結合之蛋白質。對於線性梯度，應用額外的4倍管柱體積分步溶離。 藉由添加1/10 (v/v) 0.5 M磷酸鈉，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。在裝載於用20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉、0.01% (v/v)Tween20溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質。 藉由量測280 nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來測定蛋白質濃度。藉由在存在及不存在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)之情況下進行SDS-PAGE且用考馬斯 SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA)染色或使用Caliper GXII (Perkin Elmer)進行CE-SDS來分析經靶向之含有TNF配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mML-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析樣品之聚集物含量。 表12概述FAP靶向之含有4-1BBL三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之產量及最終單體含量。 表12：FAP(28H1)靶向之含有4-1BBL三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之生物化學分析
構築體 產量[mg/l] 單體 [%] (SEC)
構築體1.1 12.7 95
構築體1.2 25.2 97
構築體1.3 22 92
構築體1.4 14.2 99
構築體1.5 14 99
構築體1.6 12 98
構築體1.7 3.4 99
構築體1.8 5.4 98
構築體1.9 11.2 98
構築體1.10 19.8 99
1.3 製備經靶向之含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子 與經靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子類似，製備鼠類FAP靶向之含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子。 根據Uniprot資料庫之Q3U1Z9-1序列(SEQ ID NO:70)合成編碼鼠類4-1BB配位體之胞外域之一部分(胺基酸104-309)的DNA序列。對於構築體M.1，位置137、160及246處之半胱胺酸藉由標準PCR方法突變成絲胺酸，而對於構築體M.2，位置160處之半胱胺酸突變成絲胺酸(C160S)。 如關於人類4-1BBL所描述及如圖3A及3B中所描繪組裝鼠類配位體。由(G4S)2 連接子分隔之二聚4-1BBL與鼠類IgG1-CL結構域融合(圖3A)且單體4-1BBL與鼠類IgG1-CH結構域融合(圖3B)。在具有鼠類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架中次選殖編碼與鼠類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體之多肽以建立構築體，如圖3C中所描繪。 對於鼠類構築體，將突變Lys392Asp及Lys409Asp (DD)引入含有鼠類4-1BBL之重鏈且將突變Glu356Lys及Asp399Lys (KK)引入含有抗FAP Fab之重鏈以獲得不對稱分子(Gunasekaran K.等人, J Biol. Chem., 2010, 6月18日;285(25):19637-46)。 在重鏈之恆定區中引入突變Asp265Ala及Pro329Gly (DAPG)以消除與Fcγ受體之結合。 表13分別展示FAP靶向之含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子構築體M.1之cDNA及胺基酸序列。 表13：FAP靶向之鼠類構築體M.1之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
71 二聚鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CL Fc DD鏈 AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGCCCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTGACCCCCGTGTCCCACATCGGCAGCCCCAATACCACACAGCAGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCAGGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCAGGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAGATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCCTGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCCACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGTCACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGACAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCAGCAGCATGGAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGCTGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGGCTTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGAGCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTCGTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGATCTAGAACAGAGCCTCGGCCTGCCCTGACAATTACCACATCCCCCAATCTGGGCACCCGGGAAAACAATGCAGATCAAGTGACACCTGTGTCTCATATTGGCTCCCCAAACACTACCCAGCAGGGCTCCCCCGTGTTTGCTAAACTGCTGGCTAAAAATCAGGCCTCCCTGTCTAACACAACACTGAACTGGCACTCCCAGGACGGCGCTGGCAGCTCTTACCTGAGTCAGGGACTGCGCTATGAGGAAGATAAGAAAGAACTGGTGGTGGATTCCCCCGGACTGTACTATGTGTTTCTGGAACTGAAACTGTCCCCTACCTTTACAAATACCGGGCACAAAGTGCAGGGATGGGTGTCCCTGGTGCTGCAGGCTAAGCCTCAGGTGGACGATTTTGATAATCTGGCTCTGACAGTGGAACTGTTTCCTAGCAGCATGGAAAACAAGCTGGTGGACAGAAGCTGGTCCCAGCTCCTGCTGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGAGCCTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGAGCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTCGTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGATCCAGAGCTGATGCTGCCCCTACCGTGTCCATCTTCCCACCCAGCAGCGAGCAGCTGACATCTGGGGGAGCTAGCGTCGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGCGGCAGAACGGCGTGCTGAATAGCTGGACCGACCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGCGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCAGCCCCATCGTGAAGTCCTTCAACCGGAACGAGTGCGTGCCCAGAGACTGCGGCTGCAAGCCTTGCATCTGCACCGTGCCTGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACACCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCAGTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACCGCTCAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGATCAACAGCACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTTGGCGCCCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACAATCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAATTTCTTCCCAGAGGATATCACCGTGGAATGGCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACTACGACAACACCCAGCCTATCATGGACACCGACGGCTCCTACTTCGTGTACAGCGACCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGTCCCACAGCCCTGGCAAG
72 單體鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CL AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGCCCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTGACCCCCGTGTCCCACATCGGCAGCCCCAATACCACACAGCAGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCAGGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCAGGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAGATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCCTGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCCACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGTCACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGACAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCAGCAGCATGGAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGCTGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGGCCTATCTGCATGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGAGCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTCGTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGCTCCGGAGGAGGCGGAAGCGCTAAGACCACCCCCCCCAGCGTGTACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGACTGC
73 抗FAP (28H1) Fc KK重鏈 GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAAGACCACCCCCCCTAGCGTGTACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCCGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGAGGTGCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACACAGCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGCACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACCATCCCCCCACCCAAAAAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCGAGGACATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCCGCCGAGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGAAGACCGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGAGCCACTCCCCCGGCAAG
74 抗FAP (28H1)輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGTCCCGGTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCATCGGCGCCTCTACCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGTCATCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTGCCGATGCTGCACCAACTGTATCGATTTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
75 二聚鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CL Fc DD鏈 RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGSPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPSSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGSPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPSSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
76 單體鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) -CL RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGSPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPSSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
77 抗FAP (28H1) Fc KK鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
78 抗FAP (28H1)輕鏈 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
表14分別展示未靶向之(DP47)含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子對照物M.1之cDNA及胺基酸序列。 表14：未靶向之鼠類對照物M.1之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
71 二聚鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CL Fc DD鏈 參見表13
72 單體鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CH1 參見表13
154 DP47 Fc KK鏈 GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAAGACCACCCCCCCTAGCGTGTACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCCGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGAGGTGCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACACAGCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGCACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACCATCCCCCCACCCAAAAAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCGAGGACATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCCGCCGAGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGAAGACCGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGAGCCACTCCCCCGGCAAG
155 DP47輕鏈 GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTGCCGATGCTGCACCAACTGTATCGATTTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
75 二聚鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CL Fc DD鏈 參見表13
76 單體鼠類4-1BBL (104-309, C137,160,246S) - CH1 參見表13
156 DP47 Fc KK鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
157 DP47輕鏈 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
表15展示FAP靶向之含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子構築體M.2之cDNA及胺基酸序列。 表15：FAP靶向之鼠類構築體M.2之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
158 二聚鼠類4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD鏈 AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGCCCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTGACCCCCGTGTCCCACATCGGCTGCCCCAATACCACACAGCAGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCAGGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCAGGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAGATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCCTGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCCACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGTCACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGACAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCTGCAGCATGGAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGCTGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGGCTTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGAGCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTCGTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGCTCCGGAGGAGGCGGATCTAGAACAGAGCCTCGGCCTGCCCTGACAATTACCACATCCCCCAATCTGGGCACCCGGGAAAACAATGCAGATCAAGTGACACCTGTGTCTCATATTGGGTGCCCCAACACTACCCAGCAGGGGTCCCCAGTGTTTGCTAAACTGCTGGCTAAAAATCAGGCCTCCCTGTCTAACACAACACTGAATTGGCATAGTCAGGACGGGGCTGGCAGCAGCTACCTGTCTCAGGGACTGCGCTATGAGGAAGATAAGAAAGAACTGGTGGTGGATTCCCCCGGACTGTACTATGTGTTTCTGGAACTGAAACTGTCCCCTACCTTTACAAATACCGGGCACAAAGTGCAGGGATGGGTGTCCCTGGTGCTGCAGGCTAAGCCTCAGGTGGACGATTTTGATAATCTGGCTCTGACAGTGGAACTGTTTCCTTGCTCTATGGAAAACAAACTGGTGGACCGCTCTTGGAGCCAGTTGCTGCTGCTGAAAGCTGGCCACCGGCTGTCTGTGGGACTGAGAGCATACCTGCATGGGGCACAGGATGCCTACCGGGATTGGGAACTGTCCTACCCTAACACTACTTCCTTCGGACTGTTCCTCGTGAAACCTGATAATCCCTGGGAGGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCCAGAGCTGATGCTGCCCCTACCGTGTCCATCTTCCCACCCAGCAGCGAGCAGCTGACATCTGGGGGAGCTAGCGTCGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGCGGCAGAACGGCGTGCTGAATAGCTGGACCGACCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGCGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCAGCCCCATCGTGAAGTCCTTCAACCGGAACGAGTGCGTGCCCAGAGACTGCGGCTGCAAGCCTTGCATCTGCACCGTGCCTGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACACCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCAGTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACCGCTCAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGATCAACAGCACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTTGGCGCCCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACAATCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAATTTCTTCCCAGAGGATATCACCGTGGAATGGCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACTACGACAACACCCAGCCTATCATGGACACCGACGGCTCCTACTTCGTGTACAGCGACCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGTCCCACAGCCCTGGCAAG
159 單體鼠類4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGCCCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTGACCCCCGTGTCCCACATCGGCTGCCCCAATACCACACAGCAGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCAGGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCAGGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAGATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCCTGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCCACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGTCACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGACAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCTGCAGCATGGAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGCTGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGGCTTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGAGCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTCGTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGCTCCGGAGGAGGCGGAAGCGCTAAGACCACCCCCCCCAGCGTGTACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGACTGC
73 抗FAP (28H1) Fc KK鏈 參見表13
74 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表13
160 二聚鼠類4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD鏈 RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
161 單體鼠類4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
77 抗FAP (28H1) Fc KK鏈 參見表13
78 抗FAP (28H1)輕鏈 參見表13
表16展示DP47未靶向之含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子構築體對照物M.2之cDNA及胺基酸序列。 表16：FAP靶向之鼠類對照物M.2之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
158 二聚mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD鏈 參見表15
159 單體mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 參見表15
154 DP47 Fc KK鏈 參見表14
155 DP47輕鏈 參見表14
160 二聚mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD鏈 參見表15
161 單體mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 參見表15
156 DP47 Fc KK鏈 參見表14
157 DP47輕鏈 參見表14
如上文關於人類4-1BBL構築體所描述產生及純化含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子。 表17概述FAP靶向及未靶向之含有鼠類4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子之產量及最終單體含量。 表17：FAP靶向及未靶向之含有鼠類4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子之製備之概述
構築體 產量[mg/l] 單體 [%] (SEC)
構築體M.1 2.6 95
對照物M.2 2.3 96
構築體M.2 8.5 98
對照物M.2 8.1 97
1.4 未靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(對照分子)之製備及純化 如上文關於FAP靶向之構築體1及2所描述製備對照分子，唯一不同之處在於用不結合於抗原之稱為DP47之生殖系對照物置換抗FAP結合子(VH-VL)。對照物為未靶向之單價分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)(對照物A，圖5A)，且對於對照物B，構築體亦含有CH-CL交叉物及帶電殘基(圖5B)。FAP結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區用生殖系對照物(DP47)之可變區置換且在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖。 如上文關於FAP靶向之構築體所描述製備未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子。細胞用相應的表現載體以1:1:1:1比率(「載體二聚配位體-CH1或CL*-結鏈」:「載體單體配位體融合物-CL或CH1*」:「載體DP47 Fab-孔鏈」:「載體DP47輕鏈」)轉染。 表18分別展示DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子對照物A之cDNA及胺基酸序列。 表18：DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體)對照物A之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
66 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1 Fc結鏈 參見表2
67 單體hu 4-1BBL (71-254) - CL 參見表2
79 DP47 Fc孔鏈 GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
80 DP47輕鏈 GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
14 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CH1 Fc結鏈 參見表2
15 單體hu 4-1BBL (71-254) -CL 參見表2
81 DP47 Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
82 DP47輕鏈 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表19展示在含有4-1BB配位體之臂中具有CH1-CL交叉及帶電殘基之DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(對照物B)之cDNA及胺基酸序列。 表19：DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體)對照物B之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
96 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
97 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
79 DP47 Fc孔鏈 參見表18
80 DP47輕鏈 參見表18
98 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
99 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
81 DP47 Fc孔鏈 參見表18
82 DP47輕鏈 參見表18
表20概述DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之產量及最終單體含量。 表20：DP47未靶向之含有4-1BBL三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(對照分子)之製備特徵
構築體 單體 [%] (SEC) 產量[mg/l] LC/MS ( 非紅色)
對照物A 97 3.7 理論值* ： 179069.7 Da 實驗值： 179116.2 Da * 無末端賴胺酸
對照物B 99 15.4
實例2 2.1 製備FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子 根據Uniprot資料庫之P41273序列(SEQ ID NO:42)合成編碼人類4-1BB配位體之胞外域之一部分(胺基酸71-254及71-248)的DNA序列之不同片段。 2.1.1 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.1) 如圖1A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域 (由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。 如圖1B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 使用連接子(GSPGSSSSGS)，在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架(Merchant, Zhu等人 1998)中次選殖編碼與人類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體之多肽。 為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，引入突變E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，將突變K147E及K213E選殖入人類CH1結構域。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，該可變區編碼對纖維母細胞活化蛋白質(FAP)純系4B9具有特異性之結合子。 FAP結合子之產生及製備描述於WO 2012/020006 A2中，其以引用之方式併入本文中。 根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 對於所有構築體，在結鏈中之S354C/T366W突變及相應的孔鏈中之Y349C/T366S/L368A/Y407V突變情況下使用結進孔雜二聚化技術。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP-Fc孔鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖4，構築體2.1)。 表21展示含有CH1-CL交叉及帶電殘基之單價FAP(4B9)-人類4-1BB配位體(71-254) Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.1)之cDNA及胺基酸序列。 表21：單價FAP (4B9)靶向之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合分子構築體2.1之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
129 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
130 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
162 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
163 抗FAP (4B9)輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGACCTCCTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCAACGTGGGCAGTCGGAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCATCATGCTGCCCCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
115 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
116 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
164 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
125 抗FAP (4B9)輕鏈 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2.1.2 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.2) 如圖1A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。 如圖1B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH1。 使用連接子(GSPGSSSSGS)，在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架(Merchant, Zhu等人 1998)中次選殖編碼與人類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體之多肽。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，該可變區編碼對纖維母細胞活化蛋白質(FAP)純系4B9具有特異性之結合子。 將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合(WO 2012/130831)。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP-Fc孔鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖4，構築體2.2)。 表22展示含有CH1-CL交叉(無帶電殘基)之單價FAP(4B9)-人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.2)之cDNA及胺基酸序列。 表22：單價FAP (4B9)靶向之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合分子構築體2.2之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
165 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTTATCTTTCCCCCATCCGATGAACAGCTGAAAAGCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGTCTGCTGAACAATTTTTACCCTAGGGAAGCTAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCACTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCTGTGACAGAACAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACACTGTCTAAGGCTGATTATGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
166 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACCAAAGGCCCTTCCGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCTCCAAGTCCACCTCTGGAGGCACCGCTGCTCTCGGATGCCTCGTGAAGGATTATTTTCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACCTCTGGAGTGCATACTTTCCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGACTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGT
162 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表21
163 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
117 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
118 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
164 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表21
125 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
2.1.3 製備具有在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之二價FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.3) 含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)之多肽與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合，如圖1C中所描繪：人類IgG1 Fc孔、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合之多肽，如圖1D中所描述：人類IgG1 Fc結、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。 使用(G4S)2 連接子在孔上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之C端處，在框架中次選殖編碼二聚4-1BB配位體之多肽(Merchant, Zhu等人 1998)。使用(G4S)2 連接子在結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之C端處，在框架中次選殖編碼單體4-1BB配位體之多肽(Merchant, Zhu等人 1998)。 在具有孔、結之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，該可變區編碼對纖維母細胞活化蛋白質(FAP)純系4B9具有特異性之結合子。 根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP huIgG1孔二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗FAP huIgG1結單體配位體鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個FAP結合Fab (圖4，構築體2.3)。 表23展示二價FAP(4B9)靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體2.3 (具有2個抗FAP Fab、分別在每個重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表23：二價FAP (4B9)靶向之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合分子構築體2.3之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
167 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (4B9) Fc孔鏈 GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
168 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (4B9) Fc結鏈 GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
163 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
123 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (4B9) Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
124 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之抗FAP (4B9) Fc結鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
125 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
2.1.4 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.4) 如圖1A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。如圖1B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 使用連接子(GSPGSSSSGS)，在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架(Merchant, Zhu等人 1998)中次選殖編碼與人類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體之多肽。為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，K147E及K213E。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，該可變區編碼對纖維母細胞活化蛋白質(FAP)純系4B9具有特異性之結合子。 根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP-Fc孔鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖 4 ，構築體2.4)。表 24 展示含有CH1-CL交叉及帶電殘基之單價FAP (4B9)-人類4-1BB配位體(71-248) Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.4)之cDNA及胺基酸序列。 表24：單價FAP (4B9)靶向之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合分子構築體2.4之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
169 二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCAGCAGGGGCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCCCAGCTTCTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCCGCTGGACTGGGCGGAGGCGGTTCCGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTTATCTTCCCACCCAGCGACCGGAAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
170 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGGAAGATTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGC
162 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表21
163 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
119 二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
120 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC
164 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表21
125 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
2.1.5 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.5) 如圖1A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。如圖1B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 使用連接子(GSPGSSSSGS)，在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架(Merchant, Zhu等人 1998)中次選殖編碼與人類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體之多肽。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，該可變區編碼對纖維母細胞活化蛋白質(FAP)純系4B9具有特異性之結合子。 根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP-Fc孔鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖4，構築體2.5)。 表25展示含有CH1-CL交叉(無帶電殘基)之單價FAP (4B9)-人類4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.5)之cDNA及胺基酸序列。 表25：單價FAP (4B9)靶向之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合分子構築體2.5之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
171 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCAGCAGGGGCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCCCAGCTTCTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCCGCTGGACTGGGCGGAGGCGGTTCCGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTTATCTTTCCCCCATCCGATGAACAGCTGAAAAGCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGTCTGCTGAACAATTTTTACCCTAGGGAAGCTAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCACTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCTGTGACAGAACAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACACTGTCTAAGGCTGATTATGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
172 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACCAAAGGCCCTTCCGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCTCCAAGTCCACCTCTGGAGGCACCGCTGCTCTCGGATGCCTCGTGAAGGATTATTTTCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACCTCTGGAGTGCATACTTTCCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGACTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGT
162 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表21
163 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
173 二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
174 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
164 抗FAP (4B9) Fc孔鏈 參見表21
125 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
2.1.6 製備具有在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之二價FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體2.6) 含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)之多肽與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合，如圖1C中所描繪：人類IgG1 Fc孔、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合之多肽，如圖1D中所描述：人類IgG1 Fc結、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。 使用(G4S)2 連接子在孔上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之C端處，在框架中次選殖編碼二聚4-1BB配位體之多肽(Merchant, Zhu等人 1998)。使用(G4S)2 連接子在結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之C端處，在框架中次選殖編碼單體4-1BB配位體之多肽(Merchant, Zhu等人 1998)。 在具有孔、結之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，該可變區編碼對纖維母細胞活化蛋白質(FAP)純系4B9具有特異性之結合子。 根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP huIgG1孔二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗FAP huIgG1結單體配位體鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個FAP結合Fab (圖4，構築體2.6)。 表26展示二價FAP (4B9)靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子構築體2.6 (具有2個抗FAP Fab、分別在每個重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之FAP分裂型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表26：二價FAP (4B9)靶向之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合分子構築體2.6之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
175 與二聚hu 4-1BBL (71-248)融合之抗FAP (4B9) Fc孔鏈之核苷酸序列 GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTG
176 與單體hu 4-1BBL (71-248)融合之核苷酸序列抗FAP (4B9) Fc結鏈 GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTG
163 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
126 與二聚hu 4-1BBL (71-248)融合之抗FAP (4B9) Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
127 與單體hu 4-1BBL (71-248)融合之抗FAP (4B9) Fc結鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
125 抗FAP (4B9)輕鏈 參見表21
2.2 製備未靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(對照分子) 如上文在實例1.4中關於對照物A及B所描述製備其他對照分子。與二價構築體2.3及2.6類似地製備二價變異體對照物C且與構築體2.5 (含有4-1BB配位體(71-248)三聚體)類似地製備單價變異體對照物E，唯一不同之處在於抗FAP結合子(VH-VL)由不結合於抗原之稱為DP47之生殖系對照物置換。 表27展示二價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合分子對照物C之cDNA及胺基酸序列。表28展示單價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合分子對照物E之cDNA及胺基酸序列。 表27：二價DP47未靶向之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合分子對照物C之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
177 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列DP47 Fc孔鏈 GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
178 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列DP47 Fc結鏈 GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
80 核苷酸序列DP47輕鏈 參見表18
179 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之DP47 Fc孔鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
180 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之DP47 Fc結鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
82 DP47輕鏈 參見表18
表28：單價未靶向之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合分子對照物E之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
171 二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
172 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 參見表25
79 DP47 Fc孔鏈 參見表18
80 DP47輕鏈 參見表18
173 二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
174 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 參見表25
81 DP47 Fc孔鏈 參見表18
82 DP47輕鏈 參見表18
2.3 製備作為對照物F之未靶向之人類IgG1 用於分析之另一對照分子為未靶向之DP47、生殖系對照物、人類IgG1，其含有Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合，根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中描述之方法。 表29展示未靶向之DP47 huIgG1 PGLALA (對照物F)之cDNA及胺基酸序列之cDNA及胺基酸序列。 表29：未靶向之DP47 huIgG1 (對照物F)之序列
SEQ ID NO: 說明 序列
181 核苷酸序列DP47重鏈(hu IgG1 PGLALA) GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
80 DP47輕鏈 參見表18
182 DP47重鏈(hu IgG1 PGLALA) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
82 DP47輕鏈 參見表18
2.4 製備單價及二價FAP (4B9)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合構築體及對照分子 將靶向及未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物編碼序列選殖入質體載體，該質體載體驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於在CDS之3'端處的合成polyA序列。此外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 藉由聚伸乙基亞胺共轉染HEK293-EBNA細胞及哺乳動物表現載體來產生分裂型三聚4-1BB配位體Fc(kih)融合物。用相應的表現載體轉染細胞。對於構築體2.1、2.2、2.4及2.5以及相應的對照分子，使用1:1:1:1比率(例如「載體二聚配位體-CL-結鏈」:「載體單體配位體融合物-CH1」:「載體抗FAP Fab-孔鏈」:「載體抗FAP輕鏈」)。對於構築體2.3及2.6以及其對照分子，使用1:1:1比率(「載體huIgG1 Fc孔二聚配位體鏈」:「載體huIgG1 Fc結單體配位體鏈」:「載體抗FAP輕鏈」)。對於雙特異性構築體，產生人類IgG (用作分析中之對照物)(對於轉染，僅一個載體用於輕鏈且一個載體用於重鏈)。 關於在500 mL搖瓶中製備，在轉染之前24小時接種3億個HEK293 EBNA細胞。對於轉染，細胞在210×g下離心10分鐘，且用20 mL預溫熱CD CHO培養基置換上清液。在20 mL CD CHO培養基中混合表現載體(200 μg完全DNA)。在添加540 μL PEI之後，溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加補充有6 mM L-麩醯胺酸、5 g/L PEPSOY及1.2 mM丙戊酸之160 mL Excell培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加12% Feed 7及葡萄糖(最終濃度3 g/L)。在培養7天之後，藉由在至少400×g下離心30-40分鐘來收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由使用蛋白質A進行親和層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化靶向及未靶向之含有TNF配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子及人類IgG1。對於親和層析，上清液裝載於用磷酸鈉(20 mM)、檸檬酸鈉(20 mM)緩衝液(pH 7.5)平衡之MabSelect Sure管柱(CV=5-15 mL，來自GE Healthcare之樹脂)上。藉由用至少6倍管柱體積之相同緩衝液洗滌來移除未結合之蛋白質。用20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸緩衝液(pH 3.0)，使用線性梯度(20 CV)或分步溶離(8 CV)來溶離結合之蛋白質。對於線性梯度，應用額外的4倍管柱體積分步溶離。 藉由添加1/10 (v/v) 0.5 M磷酸鈉，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。在裝載於用20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉、0.01% (v/v)Tween20溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質。 藉由量測280 nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來測定蛋白質濃度。藉由在存在及不存在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)之情況下進行SDS-PAGE且用Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA)染色或使用Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer)進行CE-SDS來分析經靶向之三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mML-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析樣品之聚集物含量。表 30 概述FAP(4B9)靶向及未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子及對照分子之產量及最終單體含量。 表30 FAP (4B9)靶向及未靶向之含有4-1BB配位三聚體Fc (kih)融合抗原結合分子及對照分子之生物化學分析
構築體 單體 [%]      (SEC) 產量 [mg/l]
構築體2.1 95 15.8
構築體2.3 97 11.5
構築體2.4 97 14.1
構築體2.5 100 16.5
對照物C (二價) 98 12.6
對照物E (單價) 93 4.1
對照物F (生殖系DP47人類IgG1 PGLALA) 100 50
實例34-1BB 之製備、純化及表徵 在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架中次選殖編碼人類、小鼠或食蟹獼猴4-1BB之胞外域(表31)的DNA序列(Merchant等人, 1998)。在抗原胞外域與人類IgG1之Fc之間引入AcTEV蛋白酶裂解位點。在抗原-Fc結之C端引入用於引導生物素化之Avi標籤。含有S354C/T366W突變之抗原-Fc結鏈與含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之Fc孔鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括含有4-1BB胞外域之鏈之單一複本，因此產生Fc連接之抗原之單體形式(圖5C)。表32展示抗原Fc-融合物構築體之cDNA及胺基酸序列。 表31：抗原胞外域(ECD)之胺基酸編號及其來源
SEQ ID NO: 構築體 來源 ECD
83 人類4-1BB ECD 根據Q07011合成 aa 24-186
84 食蟹獼猴4-1BB ECD 自食蟹獼猴血液分離 aa 24-186
85 鼠類4-1BB ECD 根據P20334合成 aa 24-187
表32：單體抗原Fc (kih)融合分子之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 抗原 序列
86 核苷酸序列 Fc孔鏈 GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
87 核苷酸序列 人類4-1BB抗原Fc結鏈 CTGCAGGACCCCTGCAGCAACTGCCCTGCCGGCACCTTCTGCGACAACAACCGGAACCAGATCTGCAGCCCCTGCCCCCCCAACAGCTTCAGCTCTGCCGGCGGACAGCGGACCTGCGACATCTGCAGACAGTGCAAGGGCGTGTTCAGAACCCGGAAAGAGTGCAGCAGCACCAGCAACGCCGAGTGCGACTGCACCCCCGGCTTCCATTGTCTGGGAGCCGGCTGCAGCATGTGCGAGCAGGACTGCAAGCAGGGCCAGGAACTGACCAAGAAGGGCTGCAAGGACTGCTGCTTCGGCACCTTCAACGACCAGAAGCGGGGCATCTGCCGGCCCTGGACCAACTGTAGCCTGGACGGCAAGAGCGTGCTGGTCAACGGCACCAAAGAACGGGACGTCGTGTGCGGCCCCAGCCCTGCTGATCTGTCTCCTGGGGCCAGCAGCGTGACCCCTCCTGCCCCTGCCAGAGAGCCTGGCCACTCTCCTCAGGTCGACGAACAGTTATATTTTCAGGGCGGCTCACCCAAATCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGAG
88 核苷酸序列 食蟹獼猴4-1BB抗原Fc結鏈 TTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTTCAGGGTATCACTGCCTGGGGGCAGAGTGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAAACGTGGCATCTGTCGCCCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAGCATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGGTCGACGAACAGTTATATTTTCAGGGCGGCTCACCCAAATCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGAG
89 鼠類4-1BB抗原Fc結鏈 GTGCAGAACAGCTGCGACAACTGCCAGCCCGGCACCTTCTGCCGGAAGTACAACCCCGTGTGCAAGAGCTGCCCCCCCAGCACCTTCAGCAGCATCGGCGGCCAGCCCAACTGCAACATCTGCAGAGTGTGCGCCGGCTACTTCCGGTTCAAGAAGTTCTGCAGCAGCACCCACAACGCCGAGTGCGAGTGCATCGAGGGCTTCCACTGCCTGGGCCCCCAGTGCACCAGATGCGAGAAGGACTGCAGACCCGGCCAGGAACTGACCAAGCAGGGCTGTAAGACCTGCAGCCTGGGCACCTTCAACGACCAGAACGGGACCGGCGTGTGCCGGCCTTGGACCAATTGCAGCCTGGACGGGAGAAGCGTGCTGAAAACCGGCACCACCGAGAAGGACGTCGTGTGCGGCCCTCCCGTGGTGTCCTTCAGCCCTAGCACCACCATCAGCGTGACCCCTGAAGGCGGCCCTGGCGGACACTCTCTGCAGGTCCTGGTCGACGAACAGTTATATTTTCAGGGCGGCTCACCCAAATCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGAG
90 Fc孔鏈 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
91 人類4-1BB抗原Fc結鏈 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE
92 食蟹獼猴4-1BB抗原Fc結鏈 LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE
93 鼠類4-1BB抗原Fc結鏈 VQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVLVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE
將所有4-1BB-Fc-融合物分子編碼序列選殖入質體載體，其驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於CDS之3'端處的合成polyA信號序列。此外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 關於生物素化單體抗原/Fc融合分子之製備，用三個編碼融合蛋白之兩個組分(結及孔鏈)的載體以及BirA (生物素化反應所需之酶)共轉染以指數方式生長之懸浮液HEK293 EBNA細胞。以2:1:0.05比率(「抗原ECD-AcTEV-Fc結」:「Fc孔」:「BirA」)使用相應載體。 關於在500 ml搖瓶中製造蛋白質，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞。關於轉染，使細胞在210 g下離心5分鐘，且用預溫熱之CD CHO培養基置換上清液。使表現載體再懸浮於20 mL含有200 μg載體DNA之CD CHO培養基中。在添加540 μL聚乙烯亞胺(PEI)之後，將溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加160 mL F17培養基且培養細胞24小時。製備培養基補充有5 μM基夫鹼(kifunensine)。在轉染之後一天，1 mM丙戊酸及7% Feed 1與補充劑一起添加至培養物中。培養7天之後，藉由使細胞在210 g下短暫離心15分鐘來收集細胞上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由使用蛋白質A進行親和層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質。對於親和層析，將上清液裝載於經40 mL 20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)平衡的HiTrap ProteinA HP管柱(CV = 5 mL，GE Healthcare)上。藉由用至少10倍管柱體積之含有20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、0.5 M氯化鈉之緩衝液(pH 7.5)洗滌來移除未結合之蛋白質。使用經20倍管柱體積之20 mM檸檬酸鈉、0.01% (v/v)Tween-20 (pH 3.0)產生之氯化鈉之線性pH梯度(0至500 mM)來溶離結合之蛋白質。接著用10倍管柱體積之20 mM檸檬酸鈉、500 mM氯化鈉、0.01% (v/v) Tween-20 (pH 3.0)洗滌管柱。 藉由添加1/40 (v/v) 2 M Tris，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。濃縮且過濾蛋白質，隨後裝載於用2 mM MOPS、150 mM氯化鈉、0.02% (w/v)疊氮化鈉溶液(pH 7.4)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。 對於針對人類受體之親和力測定，亦在具有avi (GLNDIFEAQKIEWHE)及六組胺酸標籤之框架中次選殖人類4-1BB之胞外域。 如上文關於Fc-融合蛋白質所描述進行蛋白質製備。藉由螯合層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化分泌之蛋白質。在於20 mM磷酸鈉、500 nM氯化鈉，pH 7.4中平衡之NiNTA Superflow濾筒(5 ml，Qiagen)上進行第一層析步驟。藉由經12倍管柱體積施用5%至45%溶離緩衝液(20 mM磷酸鈉、500 nM氯化鈉、500 mM咪唑，pH 7.4)之梯度來進行溶離。濃縮且過濾蛋白質，隨後裝載於用2 mM MOPS、150 mM氯化鈉、0.02% (w/v)疊氮化鈉溶液(pH 7.4)平衡之HiLoad Superdex 75管柱(GE Healthcare)上(表33)。 表33：單體人類4-1BB His分子之序列
SEQ ID NO: 抗原 序列
94 核苷酸序列 人類4-1BB His CTGCAGGACCCCTGCAGCAACTGCCCTGCCGGCACCTTCTGCGACAACAACCGGAACCAGATCTGCAGCCCCTGCCCCCCCAACAGCTTCAGCTCTGCCGGCGGACAGCGGACCTGCGACATCTGCAGACAGTGCAAGGGCGTGTTCAGAACCCGGAAAGAGTGCAGCAGCACCAGCAACGCCGAGTGCGACTGCACCCCCGGCTTCCATTGTCTGGGAGCCGGCTGCAGCATGTGCGAGCAGGACTGCAAGCAGGGCCAGGAACTGACCAAGAAGGGCTGCAAGGACTGCTGCTTCGGCACCTTCAACGACCAGAAGCGGGGCATCTGCCGGCCCTGGACCAACTGTAGCCTGGACGGCAAGAGCGTGCTGGTCAACGGCACCAAAGAACGGGACGTCGTGTGCGGCCCCAGCCCTGCTGATCTGTCTCCTGGGGCCAGCAGCGTGACCCCTCCTGCCCCTGCCAGAGAGCCTGGCCACTCTCCTCAGGTCGACGAACAGTTATATTTTCAGGGCGGCTCAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAGGCTCGAGCTCACCACCATCACCATCAC
95 人類4-1BB His LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQVDEQLYFQGGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHHHHHH
實例4藉由表面電漿子共振進行 FAP 靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之生物化學表徵 藉由表面電漿子共振(SPR)評估FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子與重組型4-1BB之結合。所有SPR實驗均在Biacore T100上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20, Biacore, Freiburg/Germany)來進行。 如下所述測定FAP靶向或未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子與重組型4-1BB (人類、食蟹獼猴及鼠類)之間的相互相用之親合力。資料表明經靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子以及未靶向之含有DP474-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子皆以類似活性結合於人類及食蟹獼猴4-1BB，但與小鼠同系物之結合可忽略。 使用標準偶合指令(Biacore，Freiburg/Germany)在SA晶片上直接偶合重組型生物素化人類、食蟹獼猴及鼠類4-1BB Fc (kih)融合分子。固定含量為約30 RU。FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子或DP47未靶向之對照物以0.39至200 nM範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流動速率經由流動細胞經120秒傳遞。監測解離180秒。藉由減去參考空流動細胞上所得之反應來校正整體折射率差異。 對於親和力量測，使用標準胺偶合套組(GE Healthcare)，在pH 5.0下在CM5晶片上進行約7200個共振單元(RU)之抗人類Fc特異性抗體之直接偶合。在流動細胞2上，在30微升/分鐘之流動速率下經60秒捕獲FAP靶向或未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(50 nM)。在流動細胞上以30微升/分鐘經180秒傳遞人類4-1BB-avi-His之連續稀釋物(1.95至1000 nM)以記錄結合階段。監測解離階段180秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10 mM甘胺酸-HCl pH 2.1之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動細胞1上所得之反應來校正整體折射率差異。對於含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子與hu4-1BB avi His之間的相互相用，藉由使用Biaeval軟體(GE Healthcare)針對1:1朗格繆爾結合曲線擬合，自比率常數獲得親和力常數。表 34 ：針對1:1朗格繆爾結合(Langmuir binding)及親和力常數擬合
配位體 分析物 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
FAP 分裂型4-1BBL 三聚體 ( 構築體1.1) hu4-1BB 4.8E+04 2.6E-02 5.5E-07
DP47 分裂型4-1BBL 三聚體( 對照物A) hu4-1BB 6.2E+04 3.3E-02 5.2E-07
實例5經靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之功能性表徵 5.1. FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之原生對比經活化之人類PMBC上之結合 自Zürich血液供給中心獲得白血球層。為了分離新鮮的周邊血液單核細胞(PBMC)，白血球層用相同體積之DPBS (Gibco，Life Technologies，目錄號14190 326)稀釋。提供50 mL聚丙烯離心管(TPP，目錄號91050)及15 mL Histopaque 1077 (SIGMA Life Science，目錄號10771，聚蔗糖及泛影酸鈉，調節至1.077 g/mL之密度)且經稀釋之白血球層溶液在Histopaque 1077上分層。試管在400×g下離心30分鐘。接著自界面收集PBMC，用DPBS洗滌三次且再懸浮於由供應有10%胎牛血清(FBS，Gibco，Life Technology，目錄號16000-044，批號941273，在56℃下γ輻射、無黴漿菌且熱不活化35分鐘)、1% (v/v) GlutaMAX-I (GIBCO，Life Technologies，目錄號35050 038)、1 mM丙酮酸鈉(SIGMA，目錄號S8636)、1% (v/v) MEM非必需胺基酸(SIGMA，目錄號M7145)及50 µM β-巰基乙醇(SIGMA，M3148)之RPMI 1640培養基(Gibco，Life Technology，目錄號42401-042)組成的T細胞培養基中。 PBMC在分離之後直接使用且經刺激以藉由在37℃及5%CO2 下，在6孔組織培養盤中在補充有200 U/mL普羅金(Proleukin)(Novartis Pharma Schweiz AG，CHCLB-P-476-700-10340)及2 μg/mL PHA-L (SIGMA，目錄號L2769)之T及NK細胞中培養4天且接著在塗有含10 μg/mL抗人類CD3 (純系OKT3，BioLegend，目錄號317315)及2 μg/mL抗人類CD28 (純系CD28.2，BioLegend，目錄號：302928)之T細胞培養基之6孔組織培養盤中培養1天來誘導4-1BB表現。 為了測定含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子與人類PBMC之結合，0.1×106 個原生或經活化之PBMC添加至圓底懸浮液細胞96孔培養盤(Greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)之各孔中。培養盤在400×g及4℃下離心4分鐘。丟棄上清液。隨後，細胞在含有經1:1000稀釋之LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain套組(用於UV激勵)(Life Technologies，Molecular Probes，L-23105)或Fixable Viability Dye eF660 (eBioscience 65-0864-18)或LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain套組(Life Technologies，Molecular Probes，L-23101)之100微升/孔DPBS中，在4℃下於黑暗中染色30分鐘。若使用DAPI作為Live/Death染料，則省略此染色步驟。細胞用200 μL冷FACS緩衝液(供應有2% (v/v)FBS、5 mM EDTA pH 8 (Amresco，目錄號E177)及7.5 mM疊氮化鈉(Sigma-Aldrich S2002))洗滌一次。 隨後，添加50微升/孔含有不同滴定濃度之含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子的4℃冷FACS緩衝液且細胞在4℃下培育120分鐘，用200微升/孔4℃FACS緩衝液洗滌四次且再懸浮。細胞用50微升/孔之含有以下之4℃冷FACS緩衝液進一步染色：0.67 μg/mL抗人類CD3-PerCP-Cy5.5 (純系UCHT1，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號300430)或0.16 μL抗人類CD3-PE/Cy7 (純系SP34-2，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目錄號557749，批號33324597)、0.67 μg/mL抗人類CD45-AF488 (純系HI30，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號304017)或0.12 μg/mL抗人類CD56-FITC (純系NCAM16.2，小鼠IgG2bκ，BD Pharmingen，目錄號345811)或1 μL抗人類CD56-APC (純系B159，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目錄號555518，批號3098894)、0.25 μg/mL抗人類CD4-BV421 (純系RPA-T4，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號300532)或0.23 μg/mL抗人類CD4-BV421 (純系OKT4，小鼠IgG2bκ，BioLegend，目錄號317434)、0.25 μL抗人類CD8a-APC (純系RPA-T8，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目錄號555369)或0.67 μL抗人類CD8a-APC/Cy7 (純系RPA-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號301016)或0.83 ng/mL抗人類CD8a-BV711 (純系RPA-T8，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目錄號301044)及5 µg/mL PE結合之AffiniPure抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊IgG F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109 116 098或109 116 170)。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次。若細胞用可固定活性染料染色，則其用每孔50 µL含有1%甲醛之DPBS (Sigma，HT501320-9.5L)固定。細胞再懸浮於FACS緩衝液中且在第二天或同一天使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)或3-雷射Miltenyi Quant Analyzer 10 (Mitenyi Biotec)及Flow Jo (FlowJo X 10.0.7)獲取。若使用DAPI染色偵測死細胞，則將細胞再懸浮與每孔80 µL含有0.2 μg/mL DAPI (Santa Cruz Biotec，目錄號Sc-3598)之FACS緩衝液中且在同一天使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)獲取。 如圖6中所示，FAP靶向或未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子皆不結合於休眠人類CD4+ T細胞且未展示與休眠CD8+ T細胞及NK細胞之可偵測之結合。相比之下，兩種構築體強結合於經活化之NK、CD8+或CD4+ T細胞，但後者與NK細胞相比，特異性螢光強度低約10倍且與CD8+ T細胞相比，特異性螢光強度降低20倍。 圖7A及7B分別展示表現4-1BB之經活化之人類CD3+ CD8+ T細胞及表現4-1BB之經活化之人類CD3+ CD4+ T細胞上如實例1中製備之構築體1.1至1.10之結合。表35展示如關於構築體1.1至1.10量測之EC50 值。 表35：經活化之人類CD3+ CD8+ T細胞及CD3+ CD4+ T細胞上之結合
構築體 EC50 [nM] 4-1BB+ CD8+ EC50 [nM] 4-1BB+ CD4+
對照物B 0.11 16.21
1.1 0.43 4.99
1.2 0.18 20.79
1.3 0.07 2.82
1.4 0.19 0.34
1.5 0.17 2.67
1.6 0.19 0.95
1.7 0.26 16.47
1.8 0.14 2.77
1.9 0.18 12.92
1.10 0.12 0.3
圖8A及8B分別展示來自新鮮人類血液之CD4+及CD8+上及經活化之表現4-1BB之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上如實例2中製備之構築體2.1、2.3、2.4、2.5及2.6之結合。在活CD45+ CD3+ CD4+或CD45+ CD3+ CD8+ T細胞上設置閘門且針對經靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合變異體之滴定濃度點漬PE結合之AffiniPure抗人類IgG IgG Fcγ-片段特異性山羊F(ab')2片段之MFI。表36展示構築體2.1、2.3、2.4、2.5及2.6之所量測之EC50 值。 表36：經活化之表現4-1BB之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之結合
構築體 EC50 [nM] 4-1BB+ CD8+ EC50 [nM] 4-1BB+ CD4+
對照物B 0.36 0.42
對照物C 0.39 0.41
對照物E 0.57 0.76
2.1 0.21 0.24
2.3 0.44 0.3
2.4 0.3 0.38
2.5 0.35 0.68
2.6 0.33 0.24
5.2 FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子與經活化之小鼠脾細胞之結合 在3 mL PBS中收集小鼠脾且使用平緩MACS試管(Miltenyi Biotec目錄號130-096-334)及gentleMACS Octo解離劑(Miltenyi Biotec)產生單一細胞懸浮液。隨後，脾細胞經由30 μm Pre-Separation過濾器(Miltenyi Biotec目錄號130-041-407)過濾且在350×g及4℃下離心7分鐘。抽出上清液且細胞再懸浮於供應有10% (v/v)FBS、1% (v/v)GlutaMAX-I、1 mM丙酮酸鈉、1% (v/v)MEM非必需胺基酸、50 μM β-巰基乙醇及10%青黴素-鏈黴素(SIGMA，目錄號P4333)之RPMI 1640培養基中。106 個細胞/毫升在塗有10 μg/mL抗小鼠CD3ε Armenian Hamster IgG (純系145-2C11，BioLegend，目錄號100331)及2 μg/mL抗小鼠CD28 Syrian Hamster IgG (純系37.51，BioLegend，目錄號102102)之6孔組織培養盤中培養2天。 收集經活化之小鼠脾細胞，在DPBS中洗滌，計數且將0.1×106 個細胞轉移至96孔U型底經非組織培養物處理之盤之各孔中。移除上清液且細胞在每孔含有100 μL經1:5000稀釋之Fixable Viability Dye eF660 (Bioscience，目錄號65-0864-18)之DPBS中，在4℃下染色30分鐘。細胞用PBS洗滌且在含有不同濃度之FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體)、未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體)或抗小鼠CD137人類IgG1 P329G LALA mAb (純系Lob.12.3，BioXcell目錄號：BE0169)之50 μL FACS緩衝液中染色。細胞在4℃下培育120分鐘。細胞用FACS緩衝液洗滌四次且在4℃下，在含有以下之50微升/孔FACS緩衝液中染色30分鐘：10 μg/mL經純化之抗小鼠CD16/CD32大鼠IgG-Fc-Block (BD Pharmingen，目錄號553142純系2.4G2)、5 μg/mL抗小鼠CD8b大鼠IgG2bκ-FITC (BioLegend，目錄號126606，純系YTS156.7.7)、0.67 μg/mL抗小鼠CD3大鼠IgG2bκ-APC-Cy7 (BioLegend，目錄號100222，純系17A2)、0.67 μg/mL抗小鼠CD4大鼠IgG2bκ-PE-Cy7 (BioLegend，目錄號100422，純系GK1.5)、2 μg/mL抗小鼠NK1.1 Mouse (C3H×BALB/c)IgG2aκ-PerCp-Cy5.5 (BioLegend，目錄號108728，純系PK136)及10 μg/mL PE結合之AffiniPure多株F(ab')2片段、山羊抗人類IgG(Fcγ片段特異性、針對牛小鼠及兔血清蛋白質(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-170)之最小交叉反應性)。細胞用200微升/孔冷FACS緩衝液洗滌兩次。細胞用含有1%甲醛之50微升/孔DPBS固定。細胞再懸浮於FACS緩衝液中且第二天使用5-雷射LSR-Fortessa(具有DIVA軟體之BD Bioscience)獲取。 如圖9中所示，FAP靶向之含有hu4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(FAP分裂型hu4-1BBL三聚體)及未靶向之含有hu4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(DP47分裂型hu4-1BBL三聚體)不結合於小鼠4-1BB。因此，無法在免疫勝任小鼠中測試活性。對於活體內作用模式研究，需要使用免疫勝任小鼠或含有小鼠4-1BBL三聚體中之人類化小鼠模型，如圖3中所示。 5.3 與表現FAP之腫瘤細胞之結合 對於表現FAP之細胞上之結合分析，使用人類黑素瘤細胞株MV-3 (參見Ruiter等人, Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91)、WM-266-4 (ATTC CRL-1676)或NIH/3T3-huFAP純系39細胞株。為了產生後一種細胞株，用人類FAP (NIH/3T3-huFAP純系39)轉染NIH/3T3細胞。藉由在CMV啟動子下用編碼人類FAP之表現pETR4921質體轉染小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)來產生細胞。在1.5 μg/mL嘌呤黴素(InvivoGen，目錄號：ant-pr-5)存在下維持細胞。將0.1×106 個表現FAP之腫瘤細胞添加至圓底懸浮細胞96孔培養盤(Greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)之各孔中。細胞用200 µL DPBS洗滌一次且使顆粒再懸浮。添加100微升/孔含有經1:5000稀釋之Fixable Viability Dye eFluor 450 (eBioscience，目錄號65-0863-18)或Fixable Viability Dye eFluor 660 (eBioscience，目錄號65-0864-18)之4℃冷DPBS緩衝液且培養盤在4℃下培育30分鐘。細胞用200 µL 4℃冷DPBS緩衝液洗滌一次且再懸浮於含有不同濃度之經滴定之含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子之50微升/孔4℃冷FACS緩衝液(供應有2% (v/v)FBS、5 mM EDTA pH 8 (Amresco，目錄號E177)及7.5 mM疊氮化鈉之DPBS (Sigma-Aldrich S2002)中，接著在4℃下培育1小時。在以200微升/孔洗滌四次之後，細胞用50微升/孔含有30 µg/mL FITC結合之AffiniPure抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-096-098)或5 µg/mL PE結合之AffiniPure抗人類IgG Fgγ片段特異性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098或109-116-170)之4℃冷FACS緩衝液在4℃下染色30分鐘。細胞用200 µL 4℃ FACS緩衝液洗滌兩次且接著再懸浮於50微升/孔含有1%甲醛之DPBS中。在第二天或同一天，細胞再懸浮於100 µL FACS緩衝液中且使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)或3-雷射Miltenyi Quant Analyzer 10 (Mitenyi Biotec)及Flow Jo (FlowJo X 10.0.7)獲取。 如圖10中所示，FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體)構築體1.1而非未靶向之含有DP47-Fab之構築體(DP47分裂型4-1BBL三聚體)對照物A可有效結合於表現人類纖維母細胞活化蛋白質(FAP)之黑素瘤(10A)MV-3細胞或(10B)WM-266-4細胞。 圖11A展示如實例1中製備之構築體1.1至1.10與表現人類FAP之人類黑素瘤MV-3細胞之結合且在圖11B中，呈現構築體1.1、1.2、1.3及1.5與經表現人類FAP之NIH/3T3-huFAP純系39轉染之小鼠胚胎纖維母細胞之結合。表37展示如關於構築體1.1至1.10量測之EC50 值。 表37：與表現人類FAP之腫瘤細胞之結合
構築體 EC50 [nM] FAP+ MV-3 EC50 [nM] NIH/3T3-hu FAP
1.1 4.14 12.2
1.2 5.36 9.35
1.3 - 14.97
1.4 5.13 -
1.5 0.53 10.06
1.6 8.16 -
1.7 4.09 -
1.8 2.79 -
1.9 4.22 -
1.10 4.31 -
圖12展示不同FAP (4B9)靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體與表現人類FAP之人類黑素瘤MV-3細胞(圖12A)及WM-266-4細胞(圖12B)之結合。如實例2中所描述製備構築體2.1、2.3、2.4、2.5及2.6且如上文中所描述製備對照物。在活腫瘤細胞上設置閘門且針對經靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合構築體之滴定濃度點漬PE結合之AffiniPure抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊F(ab')2片段之MFI。表38展示所量測之EC50 值。 表38：與表現人類FAP之腫瘤細胞之結合
構築體 EC50 [nM] FAP+ MV-3 EC50 [nM] FAP+ WM-266-4
2.1 1.66 0.99
2.3 0.53 0.42
2.4 0.83 0.59
2.5 1.66 1.2
5.4 鼠類經靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之功能性表徵 5.4.1 與經活化之小鼠脾細胞之結合 在3 mL PBS中收集小鼠脾且使用平緩MACS試管(Miltenyi Biotec目錄號130-096-334)及gentleMACS Octo解離劑(Miltenyi Biotec)產生單一細胞懸浮液。隨後，脾細胞經由30 μm Pre-Separation過濾器(Miltenyi Biotec目錄號130-041-407)過濾且在350×g及4℃下離心7分鐘。抽出上清液且細胞再懸浮於供應有10% (v/v)FBS、1% (v/v)GlutaMAX-I、1 mM丙酮酸鈉、1% (v/v)MEM非必需胺基酸、50 μM β-巰基乙醇之RPMI 1640培養基中。 對於新鮮小鼠脾細胞上之結合，直接使用細胞。為了誘導T細胞上之小鼠4-1BB表現，小鼠脾細胞經如下活化：106 個細胞/毫升在塗有10 μg/mL抗小鼠CD3ε Armenian Hamster IgG (純系145-2C11，BioLegend，目錄號100331)及2 μg/mL抗小鼠CD28 Syrian Hamster IgG (純系37.51，BioLegend，目錄號102102)之6孔組織培養盤中培養2天。 收集新鮮小鼠脾細胞或經活化之小鼠脾細胞，在DPBS (Gibco life technologies，目錄號14190-136)中洗滌，計數且將0.1×106 個細胞轉移至經非組織培養物處理之96孔U型底部盤(Greiner bio-one，cell star，目錄號650185)之各孔中。移除上清液且細胞在100微升/孔含有經1:1000稀釋之LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell染色套組(Life Technologies，L34957)之4℃冷DPBS中在4℃下染色30分鐘。細胞用冷DPBS洗滌且在50微升/孔含有不同濃度之含有小鼠4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子或小鼠IgG1κ同型對照(BioLegend，目錄號400153，純系MOPC-21)之冷FACS緩衝液(供應有2% (v/v)FBS、5 mM EDTA pH 8 (Amresco，目錄號E177)及7.5 mM疊氮化鈉(Sigma-Aldrich S2002)之DPBS)中染色。細胞在4℃下培育120分鐘，用冷DPBS洗滌四次且在50微升/孔含有30 μg/mL FITC結合之抗小鼠IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2之冷FACS緩衝液(Jackson Immunoresearch，目錄號115-096-071)中在4℃下染色30分鐘。隨後，細胞用冷DPBS洗滌兩次且用50微升/孔供應有以下之FACS緩衝液在4℃下染色30分鐘：10 μg/mL經純化之抗小鼠CD16/CD32大鼠IgG-Fc-Block (BD Pharmingen，目錄號553142純系2.4G2)、0.67 μg/mL抗小鼠CD8a-APC-Cy7 (BioLegend，目錄號100714，純系53-6.7)、0.67 μg/mL抗小鼠CD3ε-PerCP-Cy5.5 (BioLegend，目錄號100328，純系145-2C11)、0.67 μg/mL抗小鼠CD4大鼠IgG2bκ-PE-Cy7 (BioLegend，目錄號100422，純系GK1.5)。細胞用200微升/孔冷DPBS洗滌兩次，用50微升/孔含有1%甲醛之DPBS固定且再懸浮於FACS緩衝液中。使用3-雷射MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech)及Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC)獲取細胞。在CD3+ CD8+ 或CD3+ CD4+ T細胞上設置閘門且藉由減去空白對照物(不添加含有小鼠4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子)之MFI來分析及標準化FITC結合之抗小鼠IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2之中值螢光強度(MFI)。針對所使用之含有小鼠4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子之濃度點漬MFI以顯示與小鼠4-1BB細胞結合分子之結合。 如圖13中可見，鼠類4-1BBL構築體M.1及M.2以及相應的對照分子對照物M.1及對照物M.2以極類似的親和力結合於小鼠4-1BB。表39展示構築體M.1及M.2以極對照分子之所量測之EC50 值。 表39：經活化之表現4-1BB之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之結合
構築體 EC50 [nM] 4-1BB+ CD8+ EC50 [nM] 4-1BB+ CD4+
對照物M.1 0.95 0.74
M.1 0.87 0.52
對照物M.2 0.78 0.6
M.2 0.54 0.42
5.4.2 表現FAP之腫瘤細胞上之結合 關於表現FAP之細胞上之結合分析，使用人類黑素瘤細胞株MV-3 (參見Ruiter等人, Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91)及WM-266-4 (ATTC CRL-1676)(抗FAP特異性純系28H1具有小鼠/人類交叉反應性)。將0.1×106 個表現FAP之腫瘤細胞添加至圓底懸浮細胞96孔培養盤(Greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)之各孔中。細胞用200 µL冷DPBS洗滌一次且顆粒再懸浮於100微升/孔含有經1:1000稀釋之LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell染色套組(Life Technologies，L34957)之4℃冷DPBS緩衝液中且在4℃下培育30分鐘。細胞用200 µL冷DPBS緩衝液洗滌一次且以一系列濃度再懸浮於50微升/孔具有含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子之冷FACS緩衝液(供應有2% (v/v)FBS、5 mM EDTA pH 8 (Amresco，目錄號E177)及7.5 mM疊氮化鈉(Sigma-Aldrich S2002)之DPBS)中且在4℃下培育1小時。在用200微升DPBS/孔洗滌四次之後，細胞用50微升/孔含有30 μg/mL FITC結合之抗小鼠IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2(Jackson Immunoresearch，目錄號115-096-071)之4℃冷FACS緩衝液在4℃下染色30分鐘。細胞用200微升/孔冷DPBS洗滌兩次，用50微升/孔含有1%甲醛之DPBS固定且再懸浮於FACS緩衝液中。使用3-雷射MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech)及Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC)獲取細胞。在活細胞上設置閘門且藉由減去空白對照物(不添加含有小鼠4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子)之MFI來分析及標準化FITC結合之抗小鼠IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2之中值螢光強度(MFI)。針對所使用之含有鼠類4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子之濃度點漬MFI以顯示與鼠類4-1BB細胞結合分子之結合。如所預期，鼠類4-1BBL構築體M.1及M.2以極類似親和力結合於FAP，而對照分子不結合。 圖14展示FAP靶向或未靶向之分裂型三聚鼠類4-1BB配位體Fc (kih)構築體M.1及M.2與表現人類FAP之人類黑素瘤MV-3細胞(圖14A)及WM-266-4細胞(圖14B)之結合。表40展示所量測之EC50 值。 表40：與表現人類FAP之腫瘤細胞之結合
構築體 EC50 [nM] FAP+ MV-3 EC50 [nM] FAP+ WM-266-4
M.1 7.26 5.14
M.2 6.9 5.63
實例6經靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之生物活性 6.1. 表現人類4-1BB之HeLa細胞中之NF-κB活化產生表現人類 4-1BB 及 NF-κB- 螢光素酶 之 HeLa 細胞 子宮頸癌瘤細胞株HeLa (ATCC CCL-2)在CMV啟動子及嘌呤黴素抗性基因之控制下用基於表現載體pETR10829之質體轉導，該質體含有人類4-1BB (Uniprot寄存號Q07011)之序列。細胞在補充有10% (v/v)FBS、1% (v/v)GlutaMAX-I及3 μg/mL嘌呤黴素之DMEM培養基中培養。 藉由流動式細胞測量術測試經4-1BB轉導之HeLa細胞之4-1BB表現：0.2×106 個活細胞再懸浮於含有0.1 µg PerCP/Cy5.5結合之抗人類4-1BB小鼠IgG1κ純系4B4-1 (BioLegend目錄號309814)或其同型對照物(PerCP/Cy5.5結合之小鼠IgG1κ同型對照抗體純系MOPC-21，BioLegend目錄號400150)之100 μL FACS緩衝液中且之4℃下培育30分鐘。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，再懸浮於含有0.06 μg DAPI Santa Cruz Biotec，目錄號Sc-3598)之300 μL FACS緩衝液中且使用5-雷射LSR-Fortessa (BD Bioscience，DIVA軟體)獲取。如所描述進行有限稀釋以產生單一純系：經人類4-1BB轉導之HeLa細胞再懸浮於培養基中達到10、5及2.5個細胞/毫升之密度且將200 μl細胞懸浮液轉移至經組織培養物處理之圓底96孔培養盤(6個培養盤/細胞濃度，TPP目錄號92697)中。收集單一純系，擴展且如上文所描述測試4-1BB表現。選擇具有最高4-1BB 表現之純系(純系5)用於隨後用NF-κB-螢光素酶表現載體5495p Tranlucent HygB進行之轉染。載體賦予經轉染之細胞針對潮黴素B之抗性及在NF kB反應元素之控制下表現螢光素酶之能力(主鏈載體Panomics，目錄號LR0051，具有引入之HyB抗性)。培養人類4-1BB HeLa純系5細胞達到70%匯合。50 μg (40 μL)線性化(限制酶AseI及SalI) 5495p Tranlucent HygB表現載體添加至無菌0.4 cm Gene Pulser/MicroPulser光析管(Biorad，目錄號165-2081)中。添加含2.5×106 個人類4-1BB HeLa純系5細胞之400 μl不含DMEM培養基之補充劑且與質體溶液小心混合。使用Gene Pulser Xcell完全系統(Biorad，目錄號165-2660)在以下設置下進行細胞之轉染：指數脈衝，電容500 μF，電壓160 V，抗性
Figure 02_image001
。在脈衝之後立即將經轉染之細胞轉移至具有15 mL 37℃溫熱的供應有10% (v/v) FBS及1% (v/v) GlutaMAX-I之DMEM培養基的75 cm2 組織培養燒瓶(TPP，目錄號90075)中。第二天，添加含有3 μg/mL嘌呤黴素及200 μg/mL潮黴素B (Roche，目錄號10843555001)之培養基。擴展活細胞且如上文所描述進行有限稀釋以產生單一純系。 如上文所描述測試純系之4-1BB表現且如下測試NF-κB-螢光素酶活性：在選擇培養基中收集純系且使用Cell Counter Vi-細胞xr 2.03 (Beckman Coulter，目錄號731050)計數。細胞設定為0.33×106 個細胞/毫升之細胞密度且將150 μL此細胞懸浮液轉移至具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio-one，目錄號655083)之各孔中，且作為對照物轉移至正常96孔平底組織培養盤(TPP目錄號92096)中以在第二天測試存活率及細胞密度。細胞在37℃及5% CO2 下培育隔夜。第二天，50 μL含有不同濃度之重組型人類腫瘤壞死因子α (rhTNF-α，PeproTech，目錄號300-01A)之培養基添加至96孔盤之各孔中達到100、50、25、12.5、6.25及0奈克/孔之rhTNF-α之最終濃度。細胞在37℃及5% CO2 下培育6小時且接著用200微升/孔DPBS洗滌三次。報導子溶解緩衝液(Promega，目錄號：E3971)添加至各孔(40 μl)中且培養盤在-20℃下儲存隔夜。第二天，冷凍細胞培養盤及偵測緩衝液(Luciferase 1000分析系統，Promega，目錄號E4550)解凍至室溫。100 μL偵測緩衝液添加至各孔中且使用SpectraMax M5/M5e微板讀取器及SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)儘可能快地量測盤。所量測之釋放光超過對照物(未添加rhTNF-α)500毫秒/孔(URL)之單元視為螢光素酶活性。選擇呈現最高螢光素酶活性及大量4-1BB表現之NF-κB-luc-4-1BB-HeLa純系26用於進一步使用。與表現 FAP 之 腫瘤細胞共同培養之表現人類 4-1BB 之 HeLa 細胞 中之 NF-κB 活化 收集NF-κB-螢光素酶人類4-1BB HeLa細胞且再懸浮於供應有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I之DMEM培養基中達到0.2×106 個細胞/毫升之濃度。此細胞懸浮液之100 μl(2×104 個細胞)轉移至具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio-one，目錄號655083)之各孔中且盤在37℃及5% CO2 下培育隔夜。第二天，添加50 μL含有滴定濃度之FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體)或DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體)之培養基。表現FAP之腫瘤細胞(MV3、WM-266-4或NIH/3T3-huFAP純系39)再懸浮於供應有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I之DMEM培養基中達到2×106 個細胞/毫升之濃度。 表現FAP之腫瘤細胞(50 µl，最終比率1:5)之懸浮液或僅培養基添加至各孔中且培養盤在37℃及5% CO2 下培育6小時。細胞用200微升/孔DPBS洗滌兩次。40 µl新近製備之報導子溶解緩衝液(Promega，目錄號：E3971)添加至各孔中且盤在-20℃下儲存隔夜。第二天，冷凍細胞盤及偵測緩衝液(Luciferase 1000分析系統，Promega，目錄號E4550)在室溫下解凍。100 μL偵測緩衝液添加至各孔中且使用SpectraMax M5/M5e微板讀取器及以URL計數發光之SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)(釋放光之單元，0.5秒/孔)或Victor3 1420多標記計數盤讀取器(Perkin Elmer)及以計數/秒(CPS)來計數發光之Perkin Elmer 2030 Manager軟體儘可能快地量測螢光素酶活性，且針對所測試之構築體之濃度進行點漬。 FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體)在表現FAP之腫瘤細胞存在下觸發報導子細胞株中NFκB信號傳導路徑之活化。相比之下，未靶向之相同分子之變異體在任一測試濃度下皆未觸發此作用(圖16)。經靶向之4-1BBL之此活性嚴格取決於腫瘤細胞之細胞表面之FAP表現，因為即使在FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子存在下，在NF-kB報導子細胞株與FAP陰性腫瘤細胞一起培養時不可偵測到NF-kB活化。構築體1.1至1.10之所量測之活性展示於圖17中且構築體2.1、2.4及2.5之所量測之資料呈現於圖18中。 6.2. 表現食蟹獼猴4-1BB之HEK T293細胞中之NFκB活化產生表現食蟹獼猴 4-1BB 及 NFκB- 螢光素酶 之 HEK T293 細胞 關於製備病毒樣粒子(VLP)，根據製造商方案使用Lipofectamine® LTX試劑及PLUS™試劑(Life Technologies，目錄號15338100)(具有編碼NFκB-螢光素酶-IRIS-GFP報導基因卡匣(NFκB-luc-GFP)之載體pETR14372)轉染人胚腎(HEK)T293/17 (ATCC CRL-11268)。6小時之後，進行供應有10%FBS培養基之DMEM更換且在4天後收集VLP。新鮮HEK 293T細胞在70-80%匯合下用所產生之pETR14372-VLP及4 μg/mL凝聚胺轉導。培養細胞24小時且進行培養基更換。收集經轉導之HEK T293/17細胞且進行1個細胞/孔之有限稀釋以篩檢穩定的單一純系。單一純系在培養基中用25 ng/mL TNF-α (PeproTech Inc.，目錄號300-01A)刺激且使用Incuyte Zoom Fluorescence Microscope系統(Essen Bioscience)針對隨時間推移之陽性GFP信號進行篩選。在記錄GFP信號之後，根據製造商方案使用Nano Glo Luciferase套組(Promega，N1120)測試細胞之螢光素酶活性。使用Victor3 1420多標記計數盤讀取器(Perkin Elmer)及Perkin Elmer 2030 Manager軟體量測螢光素酶活性。以計數/秒(CPS)對發光進行計數(0.5秒/孔)。純系61在TNF-α活化之後展示GFP及螢光素酶之最高表現且進一步用於報導子細胞株產生。 如上文所描述，使用編碼食蟹獼猴4-1BB及嘌呤黴素抗性之載體pETR14879產生新VLP且用所產生之pETR14879-VLP及4 μg/mL凝聚胺在70-80%匯合下轉導HEK 293T NFκB-fluc-GFP純系61細胞株。培養細胞24小時且進行培養基更換。在轉導之後四天，細胞在含有1%FBS之DPBS中用PE結合之抗人類食蟹獼猴交叉反應性4-1BB抗體(小鼠IgG1κ，純系MOPC-21，BioLegend，目錄號309804)染色，藉由FACS (ARIA，BD)分類且在供應有含有1 μg/mL嘌呤黴素(InvivoGen，目錄號ant-pr)之10% FBS培養基之DMEM中以5個細胞/孔接種。在TNF-α刺激之後，如所描述測試生長純系之GFP及螢光素酶且藉由流動式細胞測量術測試高食蟹獼猴4-1BB表現。選擇雙重陽性純系且在單價FAP靶向之構築體2.1或對照物B及表現FAP之MV-3或WM-266-4細胞存在下測試Luficerase活性。選擇表現HEK T293/17-NF-κB-luc-GFP-cy4-1BB之純系61-13用於所有其他實驗。與表現 FAP 之 腫瘤細胞共同培養之表現食蟹獼猴 4-1BB 之 HEK T293/17 報導子細胞之 NFκB 活化 收集表現HEK T293/17-NFκB-luc-GFP-cy4-1BB之純系61-13細胞且再懸浮於供應有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I之DMEM培養基中達到0.2×106 個細胞/毫升之濃度。此細胞懸浮液之100 μl(2×104 個細胞)轉移至具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio-one，目錄號655083)之各孔中且盤在37℃及5% CO2 下培育隔夜。第二天，添加50 μL含有不同滴定濃度之FAP靶向或未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子之培養基。表現FAP之腫瘤細胞(MV3及WM-266-4)再懸浮於培養基中達到2×106 個細胞/毫升之濃度。表現FAP之腫瘤細胞(50 µl)之懸浮液添加至各孔中且培養盤在37℃及5% CO2 下培育6小時。分析之原理展示於圖19中。在培育之後，細胞用200微升/孔DPBS洗滌三次。40 µl新近製備之報導子溶解緩衝液(Promega，目錄號：E3971)添加至各孔中且盤在-20℃下儲存隔夜。第二天，冷凍細胞培養盤及偵測緩衝液(Luciferase 1000分析系統，Promega，目錄號E4550)解凍至室溫。100 μL偵測緩衝液添加至各孔中且使用SpectraMax M5/M5e (Molecular Devices)微板讀取器(500 ms積分時間，無過濾器收集所有波長)儘可能快地量測螢光素酶活性。在釋放光之單元(URL)中以0.5秒/孔計數發光且針對所測試之FAP靶向或未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子之濃度點漬。實例2之構築體之結果展示於圖 20 中。 6.3 基於抗原特異性CD8+ T細胞之分析抗原特異性 CD8 T 細胞 之分離及培養 自HLA-A2+ CMV感染之志願者獲得新鮮血液。如上文所描述分離PBMC。根據製造商建議使用陰性選擇人類CD8 T細胞分離套組(Miltenyi Biotec，目錄號130-094-156)自PBMC純化CD8 T細胞。一千萬個經分離之CD8 T細胞再懸浮於補充有1% (v/v)FBS之1 mL無菌DPBS及50 µL PE標記之含有CMV衍生之NLVPMVATV肽(ProImmune，目錄號F008-2B)的HLA-A2五聚體中且在室溫下培育10分鐘。細胞用供應有1% (v/v)FBS之3 mL無菌DPBS洗滌兩次。細胞再懸浮於供應有1% (v/v)FBS之含有1 µg/mL抗人類CD8-FITC(純系LT8，Abcam，目錄號Ab28010)之1 mL細胞DPBS中且在4℃下培育30分鐘。洗滌細胞兩次，再懸浮於供應有1% (v/v)FBS之DPBS中達到5×106 個細胞/毫升之濃度，且經由30 µm預分離尼龍網細胞過濾器(Miltenyi Biotec，目錄號130-041-407)過濾。使用ARIA細胞分類器(具有DIVA軟體之BD Bioscience)在以下設置下藉由FACS分類經分離之NLV-肽特異性CD8+ T細胞：100 µm噴嘴及純度分類罩。在含有供應有10% (v/v)FBS、1% (v/v)GlutaMAX-I及400 U/mL普羅金之5 ml RPMI 1640培養基之15 ml聚丙烯離心管(TPP，目錄號91015)中收集經分類之細胞。經分類之細胞在室溫下在350×g下離心7分鐘且再懸浮於相同培養基中達到0.53×106 個細胞/毫升之濃度。100微升/孔之此細胞懸浮液添加至先前製備之進料盤之各孔中。 如先前所描述(Levitsky等人, 1998)自PBMC製備經PHA-L活化之輻射同種異體飼養細胞且以2×105 個飼養細胞/孔分佈於96孔培養盤中。 在培養一天之後，自含有經分類之CD8+ T細胞之孔移除100 µL培養基/孔且用補充有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I及400 U/mL普羅金之新RPMI 1640培養基置換，在培養期間定期重複此步驟(每隔2-4天)。一旦細胞開始增殖，將其轉移至24孔平底組織培養盤(TPP，92024)中。細胞擴展/裂解且定期用新餵養細胞製劑再活化。抗原特異性 CD8+ T 細胞 之活化分析 收集MV3細胞且用DPBS洗滌且2×107 個細胞再懸浮於PKH-26 Red Fluorescence Cell連接子套組(Sigma，目錄號PKH26GL)之250 μL C稀釋劑中。1 μL PKH26-Red-染料溶液用250 μL C稀釋劑稀釋且添加至MV3細胞之懸浮液中，接著在黑暗中在室溫下培育5分鐘。接著添加0.5 mL FBS且培育細胞1分鐘，且用由補充有10% (v/v)FBS、1% (v/v)GlutaMAX-I、1 mM丙酮酸鈉、1% (v/v)MEM非必需胺基酸及50 µM β-巰基乙醇之RPMI 1640培養基組成的T細胞培養基洗滌一次。1×106 個MV3細胞/毫升再懸浮於T細胞培養基中且分至三個試管中。添加合成NLVPMVATV肽(自thinkpeptides獲得)達到1×10-9 M或1×10-8 之最終濃度且培育細胞90分鐘。MV3細胞用T細胞培養基洗滌一次且再懸浮達到0.5×106 個細胞/毫升之密度，分佈(100微升/孔)至96孔圓底細胞懸浮液盤(Greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)中且在37℃及5% CO2 下培育隔夜。分析之原理展示於圖21中。 第二天，添加50微升/孔含有不同滴定濃度之經靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子之T細胞培養基。收集NLV特異性CD8 T細胞，添加CFDA-SE (5(6)-羧基螢光素二乙酸酯-N-琥珀醯亞胺酯(SIGMA-Aldrich，目錄號21888-25MG-F)達到40 nM之最終濃度且細胞在旋轉下在37℃下培育15分鐘。藉由添加FBS停止標記，洗滌細胞且再懸浮於T細胞培養基中達到0.125×106 個細胞/毫升之最終濃度。將50 μL此經CFSE標記之CD8 T細胞懸浮液添加至各孔中(最終E:T比率=1:8)。培育細胞培養盤24小時，移除50微升/孔且50 μL含有2.64 μL/mL高爾基體終止子(含有巴西金葉樹甙(Monesin)之蛋白質傳遞抑制劑，BD Bioscience，目錄號554724)之T細胞培養基添加至各孔中(最終濃度0.66 μL/mL)。培育細胞4小時且接著培養盤用200微升/孔DPBS洗滌且用100微升/孔含有經1:5000稀釋之Fixable Viability Dye-eF450 (eBioscience，目錄號65-0864)之4℃DPBS在4℃下染色30分鐘。細胞培養盤用200微升/孔DPBS洗滌，接著用螢光染料結合之抗體染色：抗人類CD137-PerCP/Cy5.5 (純系4B4-1，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號309814)、抗人類CD8-BV605(純系RPA-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號301012)或0.67 μg/mL抗人類CD8a-APC/Cy7 (純系RPA-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號301016)及抗人類CD25 PE/Cy7 (純系BC96，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號302612)。在4℃下培育30分鐘之後，細胞用200微升/孔FACS緩衝液洗滌兩次，再懸浮於50微升/孔新近製備之FoxP3 Fix/Perm緩衝液(eBioscience目錄號00-5123及00-5223)中且在4℃下培育30分鐘。培養盤用200微升/孔Perm-Buffer (供應有2% (v/v)FBS、1% (w/v)皂素(Sigma Life Science，S7900)及1% (w/v)疊氮化鈉(Sigma-Aldrich，S2002)之DPBS)洗滌兩次，且用50微升/孔含有0.25 µg/mL抗人類IFNγ-APC(純系B27，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號506510)或0.33 µg/mL抗人類IFNγ-BV510 (純系4S.B3，小鼠IgG1κ，BioLegend，目錄號502543)之Perm-Buffer (eBioscience，目錄號00-8333-56)染色。培養盤在4℃下培育1小時且用200微升/孔Perm-Buffer洗滌兩次。關於固定，添加50微升/孔含有1%甲醛之DPBS。在同一天或第二天，細胞再懸浮於100微升/孔FACS緩衝液中且使用5-雷射Fortessa流式細胞儀(具有DIVA軟體之BD Bioscience)或3-雷射Miltenyi Quant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec)及Flow Jo (FlowJo X 10.0.7)獲取。 如圖22及23中關於構築體1.1至1.10及圖24及25中關於構築體2.1、2.3及2.4所示，抗原特異性CD8+ T細胞而非未受刺激之對照物在FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體)存在下呈現增加之表面4-1BB表現量。4-1BBL之此作用為劑量依賴性且需要FAP靶向，因為添加未靶向之對照分子不影響4-1BB表現量。此外，在較高肽濃度(1×10-8 M)下活化之T細胞在FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體)存在下展示持續INFγ分泌。總體而言，此等資料說明抗原靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子以靶向依賴性方式調節抗原特異性T細胞之表面表型及反應。 6.4 細胞靶向及未靶向之小鼠4-1BBL Fc融合抗原結合分子之比較 如實例1.3中所描述製備經靶向及未靶向之含有小鼠4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(FAP分裂型小鼠4-1BBL三聚體及DP47分裂型小鼠4-1BBL三聚體)。 為了比較細胞靶向及未靶向之含有小鼠4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子之生物活性，Proliferation Dye eFlour670標記(eBioscience，目錄號65-0840-90)或CellTrace Violet Cell Proliferation染料標記(Cell tracer，目錄號C34557)之新鮮小鼠脾細胞在96孔U型底組織培養盤(TTP，目錄號92097)中與供應有以下之含黏著性50 Gy輻射之NIH/3T3-huFAP純系39細胞(關於產生方法，參見5.3)之RPMI 1640培養基(Gibco，目錄號42401-042)一起在0.5 µg/mL抗小鼠CD3 Syrian hamster IgG (純系145-2C11，BD，目錄號553057)及以某些濃度範圍添加之所指示之候選藥物分子存在下共培養3-4天：10% (v/v)FBS、1% (v/v)GlutaMAX-I、1 mM丙酮酸鈉、1% (v/v)MEM非必需胺基酸及50 µM β-巰基乙醇(圖26)。在三天或四天之後，細胞用FACS緩衝液洗滌且在含有抗小鼠CD8 ratIgG2a-BV711 (BioLegend，目錄號100747，純系53-6.7)及抗小鼠CD4 ratIgG2a-BV421 (BioLegend，目錄號100544，純系RM4 -5)及0.67 μg/mL抗小鼠CD137 (4-1BB)Syrian hamster IgG-PE (BioLegend，目錄號106106，純系17B5)及抗小鼠CD25-PErCP-Cy5.5 ratIgG2b (BioLegend，目錄號1019112)之25 μL FACS緩衝液/孔中在4℃下染色30分鐘。洗滌細胞且在室溫下在所製備之Fix/Perm緩衝液(Foxp3/轉錄因子染色緩衝液集合，eBioscience，目錄號00-5523-00)中培育1小時。細胞用新近製備之Perm緩衝液洗滌兩次且與針對細胞毒性譜系轉錄因子Eomes，亦即抗小鼠Eomes ratIgG2a-AlexaFluor488 (eBioscience，目錄號534875，純系Dan11mag)及(若CD137未不染色)針對細胞毒性效應分子顆粒酶B，亦即抗小鼠ratIgG2a顆粒酶B-PE (eBioscience，目錄號128822，純系16G6)之含有螢光標記之抗體之25微升/孔Perm緩衝液一起在室溫下共同染色1小時。接著洗滌細胞兩次，再懸浮於FACS緩衝液中且使用雷射Fortessa流式細胞儀(具有DIVA軟體之BD Bioscience)或3-雷射MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotech)及Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC)獲取。在活CD8+ T細胞及CD4+ T細胞上設置閘門且測定增殖性細胞之出現頻率以及CD25、Eomes及顆粒酶B或CD137之表現量。針對所使用之含有小鼠4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合分子之濃度點漬增殖頻率及活化標記物之MFI以顯示功能活性。如圖27中可見，可觀測到構築體M.1及M.2之增殖性CD8+ T細胞之增加。 6.5 用抗鼠類4-1BB抗體Lob 12.3 (muIgG1 Wt)或構築體M.2處理之小鼠中之肝變化 攜有皮下MC38-muFAP (鼠類結腸直腸癌模型)之C57BL/6小鼠每週一次用靶向FAP之促效抗鼠類4-1BB抗體處理持續3週(功效研究020-GA1401：「展示4-1BB靶向之療法與a-PD-L1之組合在C57B6小鼠中之MC38-muFAP皮下模型中之功效的實驗」)。所使用之抗體為Lob 12.3 muIgG1 Wt (具有「野生型」Fc，來自BioXcell之純系Lob 12.3，目錄號：BE0169)或具有DAPG突變之構築體M.2 (非活性Fc)。每週一次投與兩種抗體持續三週。在最終一次處理之後第7天處死四隻動物/組且用顯微鏡檢驗肝臟。 僅在接收Lob 12.3 muIgG1 Wt之動物中觀測到肝變化，在病變中由肝細胞變性及F4/80陽性巨噬細胞聚集以及頻繁展示中心血管分佈之降低量之發炎性細胞(主要淋巴球)之混合群體組成。發現偶爾的肝細胞之單細胞壞死及門靜脈隙中之血管周圍單核細胞浸潤。在接收構築體M.2之動物之肝臟中未觀測到處理相關之結果(表41)。 表41：組織病理學結果之發病率(n=4隻/組)
處理 媒劑 Lob 12.3 muIgG1 Wt 構築體M.2
用巨噬細胞及發炎性細胞進行之肝細胞變性之病變 - 4 -
血管周圍發炎性細胞浸潤 - 4 -
單細胞壞死 - 4 -
已在用優瑞路單抗(Urelumab)BMS-663513 (Ascierto P.A.等人 2010)治療之患者及使用小鼠替代物之小鼠中觀測到歸因於肝中FcγRs之交聯的肝炎。用具有非活性Fc之抗體處理之動物中不存在肝結果支持此假設。 6.6 含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子之藥物動力學參數之測定 為了測試本發明之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子是否適用於醫藥學用途，測定小鼠中之藥物動力學參數(PK資料)，諸如清除率、分佈體積或清除半衰期(t1/2 )。因此，進行以下實驗：實驗 A ： 健康 NOG 小鼠中構築體 1.2 及對照物 B 之單次劑量 PK 在實驗開始時，平均年齡為8至10週之NOG雌性小鼠(購自Taconic，SOPF機構)根據提交指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持在特定無病原體條件下，每天12小時光照/12小時黑暗循環。評述實驗研究方案且由當地政府批准(P 2011128)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀測。在常規基礎上進行連續健康狀況監測。 進行單劑量藥物動力學研究(SDPK)以評估構築體1.2及對照物B之暴露。投與NOG小鼠2.5 mg/kg之靜脈內快速注射投藥且在所選時間點獲得血液樣品用於藥物動力學評估。藉由ELISA分析小鼠血清樣品。生物素化人類4-1BB、測試樣品、洋地黃毒苷(Digoxygenin)標記之抗huCH1抗體及抗洋地黃毒苷偵測抗體(POD)逐步添加至經抗生蛋白鏈菌素塗佈之96孔微量滴定盤中且在每一步驟之後在室溫下培育1小時。在各步驟之後洗滌培養盤三次以移除未結合之物質。最終，藉由添加ABTS受質溶液形成著色反應產物來使過氧化酶結合之複合物可視化。在405 nm (490 nm下之參考波長)以光度測定之反應產物強度與血清樣品中之分析物濃度成正比。構築體之標準曲線之校準範圍為0.156至10 ng/ml，其中3 ng/ml為定量下限(LLOQ)。圖28A展示在此實驗中觀測之隨時間推移之濃度降低。實驗 B ： 用幹細胞人類化之攜有腫瘤之 NOG 小鼠中構築體 2.1 、 2.3 、 對照物 B 及對照物 C 之單次劑量 PK 進行單劑量藥物動力學研究(SDPK)以評估構築體2.1、2.3、對照物B及對照物C之暴露。經人類幹細胞轉移之NSG雌性小鼠由Jackson Laboratories提供。根據提交指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，為保持在特定無病原體條件下，每天12小時光照/12小時黑暗循環。評述實驗研究方案且由當地政府批准(ZH193-2014)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀測。在常規基礎上進行連續健康狀況監測。 最初自ATCC獲得人類MKN45細胞(人類胃癌瘤)且在擴展之後，在Glycart內部細胞組中沈積。在含有10% FCS之DMEM中培養細胞。在37℃下在5% CO2 下於水飽和氛圍中培養細胞。在97%活力下，活體外通道9用於皮下注射。人類纖維母細胞NIH-3T3在Roche Nutley經工程改造以表現人類FAP。純系39在活體外通道編號12及98%活力下使用。與50微升基質膠混合之50微升細胞懸浮液(1×106 個MKN45細胞+1×106 個3T3-huFAP)在經麻醉之小鼠之側腹皮下注射。當腫瘤達到190 mm3 之平均尺寸時，投與人類化小鼠10 mg/kg之靜脈內快速注射投藥。在所選擇時間點採集血液樣本以用於藥物動力學評估。藉由ELISA分析小鼠血清樣品。生物素化人類4-1BB、測試樣品、洋地黃毒苷標記之抗huCH1抗體及抗洋地黃毒苷偵測抗體(POD)逐步添加至經抗生蛋白鏈菌素塗佈之96孔微量滴定盤中且在每一步驟之後在室溫下培育1小時。在各步驟之後洗滌培養盤三次以移除未結合之物質。最終，藉由添加ABTS受質溶液形成著色反應產物來使過氧化酶結合之複合物可視化。在405 nm (490 nm下之參考波長)以光度測定之反應產物強度與血清樣品中之分析物濃度成正比。構築體之標準曲線之校準範圍為0.156至10 ng/ml，其中3 ng/ml為定量下限(LLOQ)。圖28B展示在此實驗中觀測之隨時間推移之構築體之濃度降低。實驗 C ： 健康 NOG 小鼠中構築體 2.1 及 2.3 之單次劑量 PK 在實驗開始時，平均年齡為8-10週之NOG雌性小鼠(購自Taconic，SOPF機構)根據提交指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持在特定無病原體條件下，每天12小時光照/12小時黑暗循環。評述實驗研究方案且由當地政府批准(P 2011128)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀測。在常規基礎上進行連續健康狀況監測。 進行單劑量藥物動力學研究(SDPK)以評估構築體2.1及2.3之暴露。投與NOG小鼠2.5 mg/kg之靜脈內快速注射投藥且在所選時間點獲得血液樣品用於藥物動力學評估。藉由ELISA分析小鼠血清樣品。生物素化人類4-1BB、測試樣品、洋地黃毒苷標記之抗huCH1抗體及抗洋地黃毒苷偵測抗體(POD)逐步添加至經抗生蛋白鏈菌素塗佈之96孔微量滴定盤中且在每一步驟之後在室溫下培育1小時。在各步驟之後洗滌培養盤三次以移除未結合之物質。最終，藉由添加ABTS受質溶液形成著色反應產物來使過氧化酶結合之複合物可視化。在405 nm (490 nm下之參考波長)以光度測定之反應產物強度與血清樣品中之分析物濃度成正比。構築體之標準曲線之校準範圍為0.156至10 ng/ml，其中3 ng/ml為定量下限(LLOQ)。圖28C展示所觀測之隨時間推移之濃度降低。 所測試之構築體2.1及2.3在體內足夠穩定且具有適用於醫藥學研究之範圍內的PK參數。亦可由結果得出構築體2.1稍微更穩定之結論。 6.7 人類腫瘤中之FAP發病率 如WO 2014/161845中所描述評估人類腫瘤中FAP之發病率，以理解FAP靶向之構築體之可能的臨床用途。 來自Vitatex (MABS1001)之大鼠抗人類Seprase抗體(IgG2a，純系D8)用於免疫標記來自Ventana Benchmark XT上之多種腫瘤適應症之2.5 μm FFPET切片。切片經歷標準CC1處理，接著在37℃下在Dako抗體稀釋劑(S3022)中以5 μg/mL之濃度進行抗體培育60分鐘且使用Ultraview DAB偵測系統(Ventana #760-4456)偵測陽性染色。來自Abcam (ab18450)之匹配同型抗體用作陰性對照。不同適應症之人類腫瘤中存在FAP+基質浸潤，包括頭部及頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、乳癌、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌(PAC)、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及間皮瘤，潛在標記FAP靶向之構築體之所關注之臨床適應症(表42)。 表42 ：人類腫瘤中之FAP 發病率
腫瘤類型 具有中等至高度FAP+ 浸潤之病例% 研究樣品數目
HNSCC 90 10
乳癌 77 105
三陰性BC 80 7
CRC 77 90
PAC 74 19
胃癌 68 28
NSCLC 66 90
間皮瘤 60 10
實例7 7.1 製備CD19 (8B8-018)靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子 7.1.1 用於噬菌體呈現操作之CD19抗原Fc融合物之製備、純化及表徵 為了表現及純化單體狀態之人類及食蟹獼猴CD19胞外域(人類CD19，參見SEQ ID NO:31)，各別DNA片段與含有「結」突變之人類IgG1 Fc基因片段(人類：SEQ ID NO:186；食蟹獼猴：SEQ ID NO:188)融合且用「Fc-孔」(SEQ ID NO:86)對應物轉染(Merchant等人, 1998)。在抗原胞外域與Fc結鏈之間引入IgA裂解位點(PTPPTP)。在抗原-Fc結鏈之C端引入用於引導生物素化之Avi標籤且在Fc孔中引入突變H435R及Y436F用於純化目的(Jendeberg L.等人, J. Immunological methods, 1997)。含有S354C/T366W突變之抗原-Fc結鏈(人類：SEQ ID NO:187；食蟹獼猴：SEQ ID NO:189)與含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之Fc孔鏈(SEQ ID NO:90)之組合允許產生雜二聚Fc融合物片段，其包括CD19胞外域之單一複本(與圖5C中之4-1BB構築體類似)。表43列舉抗原Fc-融合物構築體之cDNA及胺基酸序列。 表43：單體人類及獼猴CD19抗原Fc (kih)融合分子之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 抗原 序列
86 核苷酸序列Fc孔鏈 參見表32
186 核苷酸序列人類CD19抗原Fc結鏈avi tag CCCGAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAAGAGGGCGACAATGCCGTGCTGCAGTGCCTGAAGGGCACCTCCGATGGCCCTACCCAGCAGCTGACCTGGTCCAGAGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGCTGTCTCTGGGCCTGCCTGGCCTGGGCATCCATATGAGGCCTCTGGCCATCTGGCTGTTCATCTTCAACGTGTCCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGTCAGCCTGGCCCCCCATCTGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGCTGGACCGTGAACGTGGAAGGATCCGGCGAGCTGTTCCGGTGGAACGTGTCCGATCTGGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAAGAACAGATCTAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAACTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGACCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCTCCTTGCCTGCCCCCTAGAGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACAATGGCCCCTGGCAGCACACTGTGGCTGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTGTCTAGAGGCCCTCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCTAAGGGCCCTAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGAGATATGTGGGTCATGGAAACCGGCCTGCTGCTGCCTAGAGCCACAGCCCAGGATGCCGGCAAGTACTACTGCCACAGAGGCAACCTGACCATGAGCTTCCACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGTGCTGTGGCACTGGCTGCTGAGAACAGGCGGCTGGAAGGTCGACGCTAGCGGTGGTAGTCCGACACCTCCGACACCCGGGGGTGGTTCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGAG
90 多肽序列Fc孔鏈 參見表32
187 多肽序列人類CD19抗原Fc結鏈avi tag PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVDASGGSPTPPTPGGGSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE
188 核苷酸序列食蟹獼猴CD19抗原Fc結鏈avi tag CCCCAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAAGAGGGCGACAATGCCGTGCTCCAGTGCCTGGAAGGCACCTCCGATGGCCCTACACAGCAGCTCGTGTGGTGCAGAGACAGCCCCTTCGAGCCCTTCCTGAACCTGTCTCTGGGCCTGCCTGGCATGGGCATCAGAATGGGCCCTCTGGGCATCTGGCTGCTGATCTTCAACGTGTCCAACCAGACCGGCGGCTTCTACCTGTGTCAGCCTGGCCTGCCAAGCGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGATGGACCGTGTCCGTGGAAGGATCTGGCGAGCTGTTCCGGTGGAACGTGTCCGATCTGGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAAGAACAGAAGCAGCGAGGGCCCTAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGAATAGCAGCCAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGACCCGAGATGTGGGAGGGCGAGCCTGTGTGTGGCCCCCCTAGAGATAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACAATGGCCCCTGGCAGCACACTGTGGCTGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTGTCCAGAGGCCCTCTGAGCTGGACACACGTGCGGCCAAAGGGCCCTAAGAGCAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACCGGCCCGACCGGGATATGTGGGTGGTGGATACAGGCCTGCTGCTGACCAGAGCCACAGCCCAGGATGCCGGCAAGTACTACTGCCACAGAGGCAACTGGACCAAGAGCTTTTACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGCCCTGTGGCACTGGCTGCTGAGAATCGGAGGCTGGAAGGTCGACGCTAGCGGTGGTAGTCCGACACCTCCGACACCCGGGGGTGGTTCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGAG
189 多肽序列食蟹獼猴CD19抗原Fc結鏈avi tag PQEPLVVKVEEGDNAVLQCLEGTSDGPTQQLVWCRDSPFEPFLNLSLGLPGMGIRMGPLGIWLLIFNVSNQTGGFYLCQPGLPSEKAWQPGWTVSVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLNSSQLYVWAKDRPEMWEGEPVCGPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVRPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLTRATAQDAGKYYCHRGNWTKSFYLEITARPALWHWLLRIGGWKVDASGGSPTPPTPGGGSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE
關於製備單體抗原/Fc融合分子，按指數律成比例生長之懸浮液CHO細胞與兩種編碼融合蛋白質之兩個組分(結及孔鏈)之質體使用標準方法共同轉染。 藉由使用蛋白質A之親和層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化分泌之蛋白質。關於親和層析，上清液裝載於用磷酸鈉(20 mM)、檸檬酸鈉(20 mM)、0.5 M氯化鈉緩衝液(pH 7.5)平衡之MabSelect Sure (管柱體積(CV)=5-15 mL，來自GE Healthcare之樹脂)上。藉由用至少6倍管柱體積之相同緩衝液洗滌來移除未結合之蛋白質。使用線性梯度溶離結合之蛋白質；步驟1，10 CV，0至60%溶離緩衝液(20 mM檸檬酸鈉、500 mM氯化鈉緩衝液(pH 2.5))；步驟2，2 CV，60至100%溶離緩衝液。關於線性梯度，用100%溶離緩衝液應用額外2倍管柱體積之分步溶離。 藉由添加1/40 (v/v) 2 M Tris，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。濃縮且過濾蛋白質，隨後裝載於用2 mM MOPS、150 mM氯化鈉、0.02% (w/v)疊氮化鈉溶液(pH 7.4)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。 表44概述單體人類及獼猴CD19抗原Fc (kih)融合蛋白質之產量及最終單體含量。 表44 - 單體人類及獼猴CD19抗原Fc (kih)融合蛋白質之生物化學分析
構築體 單體[%]      (SEC) 產量          [mg/l]
單體人類CD19 Fc (kih)融合蛋白質 91 0.2
單體食蟹獼猴CD19 Fc (kih)融合蛋白質 95 3.56
根據製造商說明，使用BirA生物素-蛋白質連接酶標準反應套組(Avidity，目錄號BirA500)將一部分經純化之抗原活體外生物素化。含有人類CD19之融合物之生物素化程度為94%，各別食蟹獼猴CD19構築體之生物素化程度為100%。接著生物素化蛋白質用於不含去醯胺化熱點N27d及N28之親和力成熟8B8衍生之純系之選擇、篩選及表徵。 7.1.2 產生抗CD19純系8B8-018 7.1.2.1 小鼠抗人類CD19抗體(融合瘤)之免疫接種及產生 使Balb/c小鼠免疫六次且用經CD19轉染之HEK293細胞(平均受體密度35,000/細胞)進行增強免疫。藉由用經人類CD19轉染之NIH-3T3細胞上之CD19-細胞-ELISA測試血清樣品來監測免疫反應。藉由與小鼠骨髓瘤細胞株P3X63 Ag8.653融合，來自小鼠之具有足夠的抗人類CD19抗體效價之脾細胞用於永生化。進行三次融合且經人類CD19轉染之NIH-3T3細胞上之細胞-ELISA篩選融合瘤上清液，且使用針對抗人類CD19特異性抗體之Daudi (CD19+)及CD19-細胞進行FACS結合分析(參見WO 2011/147834之實例1)。 7.1.2.2 抗CD19抗體之融合瘤篩選及細胞生物功能性評估用於篩選針對人類 CD19 之 抗體之細胞 -ELISA 細胞ELISA用於篩選融合瘤，及鑑別分泌針對人類-CD19之抗體的此等融合瘤。經人類-CD19轉染之NIH3T3細胞用作陽性細胞；未經轉染之NIH3T3細胞用作陰性對照細胞。關於陽性融合瘤之評估，定量經轉染與未經轉染之NIH3T3細胞之間的OD比率。 -  培養基：DMEM高葡萄糖(4.5 mg/ml)、10% FCS、丙酮酸鈉、NEAA、麩醯胺酸 -  抗體陽性對照：抗CD19單株抗體(IgG1)，Pharmingen目錄號555409 c=1 mg/ml -  偵測抗體：山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP結合物，Bio-Rad目錄號170-06516 -  稀釋物1：1×ELISA阻斷劑中2000倍 -  其他試劑：纖維結合蛋白，Roche目錄號838039，c=1 mg/ml -  戊二醛：25%儲備溶液//Grade Agar Scientific #R102，最終濃度：0.05%於PBS中 -  ELISA阻斷劑：10×儲備溶液//Roche目錄號1112589 -  TMB受質：Roche目錄號11432559 -  停止溶液：1 M H2SO4 -  BioRad目錄號170-6516稀釋物1：1×ELISA阻斷劑中2000倍第 1 天： -  纖維結合蛋白塗料：5 µg/cm²於PBS中；96孔盤=32 cm²；160微克/盤於6毫升中 -  PBS，50微升/孔 -  在室溫下培育45分鐘，抽出塗佈溶液 -  在96孔盤中在50 µl培養基中接種1.25×104 個細胞/孔 -  在37℃下培育40小時 -  添加至盤之上半部分：表現CD19之NIH3T3細胞 -  添加至盤之下半部分：未經轉染之NIH3T3細胞第 3 天： -  添加含陽性對照抗體或樣品(上清液或小鼠血清)之50 µl培養基 -  在4℃下培育2小時 -  移除培養基，用100 µl戊二醛(0.05%於PBS中)固定細胞 -  用200 µl PBS洗滌兩次 -  添加偵測抗體1:2000，50微升/孔 -  在室溫下培育2小時 -  用200 µl PBS洗滌三次 -  添加50 µl TMB，在室溫下培育30分鐘 -  藉由添加25 µl 1 M H2SO4停止；在450 nm/620 nm下讀取吸光度 -  計算結果：比率OD NIH3T3 CD19:未經轉染之OD NIH3T3 與未轉染之NIH3T3細胞(參見WO 2011/147834之實例2)相比，所選擇之抗體顯示與經CD19轉染之NIH3T3細胞之特異性結合。 7.1.2.3 抗CD19抗體之人類化 鼠類抗體之CD19結合特異性轉移至人類受體架構上以消除由人體識別為外來物序列延伸子引起之前在免疫原性問題。此係藉由將鼠類(供體)抗體之完全互補決定區(CDR)移植至人類(受體)抗體構架上來實現，且稱為CDR移植或抗體人類化。 將鼠類胺基酸序列與人類生殖系抗體V基因之集合比對，且根據序列一致性及同源性分類。在選擇一個特定接受體序列之前，必須測定供體抗體之所謂典型環結構(Morea, V.等人, Methods, 第20卷, 第3期 (2000) 267-279)。此等典型環結構藉由在所謂典型位置存在之殘基之類型來測定。此等位置位於(部分)CDR區之外部，且在最終構築體中應保持功能相等以保留親本(供體)抗體之CDR構形。選擇人類生殖系序列VBASE_VH1_1作為重鏈之受體且選擇序列VBASE_VK2_5用於輕鏈。 7.1.2.4 移除去醯胺熱點 已發現野生型人類化抗人類CD19抗體在HVR-L1中具有三個去醯胺熱點：N S N G N T (SEQ ID NO:190)。此外，已發現在HVR-H2中存在另一去醯胺熱點：KF N G (SEQ ID NO:191)。為了將HVR-H2中之去醯胺熱點定址，在位置64 (根據Kabat編號)處引入N (Asn)至Q (Gln)點突變。因此，如本文所報導之抗體具有包含胺基酸序列TEKFQGRVTM (SEQ ID NO:192)之HVR-H2。 為了將輕鏈中之去醯胺熱點定址及獲得具有改良之去醯胺穩定性的人類化抗人類CD19抗體，在Kabat位置27d、27e、28及29處引入個別突變且在位置27e及28 (根據Kabat編號)處引入雙突變。已產生野生型人類化抗體(變異體0)之全部9種變異體(變異體1至變異體9)(參見表45)。表 45 ： 人類化野生型 CD19 抗體之變異體 Kabat                 2222           Kabat          6 位置                   7789           位置            4 LC:                   de              HC: 變異體0：wt        QSLENSNGNTYLNW            TEKFNGKATM 變異體1：N27dH    QSLEH SNGNTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體2：N27dQ    QSLEQ SNGNTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體3：S27eA    QSLENA NGNTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體4：S27eV    QSLENV NGNTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體5：S27eP    QSLENP NGNTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體6：N28Q     QSLENSQ GNTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體7：G29A     QSLENSNA NTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體8：G29V     QSLENSNV NTYLNW            TEKFQ GRVTM 變異體9：S27eP/N28S QSLENPS GNTYLNW         TEKFQ GRVTM
變異體→ ↓參數 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
KD (BIAcore) [nM] 5 250 136 2 1 6 54 4 16 45
t1/2 [min] - 0.1 1.1 105.2 191.5 43.6 4.4 51.5 17.6 4
pH 7.4培育後之人類CD19結合 [%] 46 0 75 84 85 95 91 72 83 83
pH 6.0培育後之人類CD19結合 [%] 90 0 95 95 97 99 97 86 91 87
培育後之SEC主峰 [%] ＞ 95 ＞ 95 ＞ 95 ＞ 95 ＞ 95 ＞ 95 ＞ 95 ＞ 95 ＞ 95 -
已發現藉由根據Kabat之位置27e處之S (絲胺酸)至P (脯胺酸)之單一突變，可將HVR-L1中之所有去醯胺熱點定址。此並非易於去醯胺之N (天冬醯胺)殘基而是相鄰殘基之突變。 因此，如本文所報導之抗體具有包含胺基酸序列LENPNGNT (SEQ ID NO:193)之HVR-L1。在一個實施例中，人類化抗人類CD19抗體包含具有胺基酸序列LENPSGNT (SEQ ID NO:194)之HVR-L1。 此外，此等抗體維持針對食蟹獼猴CD19之交叉反應性，如以下表46 中所示。
EC50 [µg/ml] 變異體0 變異體5 變異體9
huCD19 ECD 0.087 0.084 0.089
cyCD19 ECD 0.313 0.255 0.435
野生型人類化抗人類抗體CD19 (變異體0)在純化之後展示約7.5%去醯胺。在pH 7.4下儲存兩週之後，去醯胺抗體之量增加至約18.5%。具有S27eP突變(變異體5)之變異型抗體在純化之後展示約2%去醯胺及2%丁二醯亞胺形成。在pH 7.4下儲存兩週期間，僅存在約7.5%去醯胺抗體。變異體5稱為純系8B8-018且選擇用於製備CD19靶向之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。 7.1.3 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.1) 如圖29A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。如圖29B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架中次選殖編碼與人類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體的多肽(Merchant, Zhu等人 1998)。為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，K147E及K213E。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系8B8-018 。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19-Fc孔鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CD19結合Fab (圖 30 ，構築體3.1)。表 47 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.1)之cDNA及胺基酸序列。 表47：含有CH-CL交叉及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(構築體3.1)之cDNA及胺基酸序列。*表示帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
129 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
130 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
203 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAACCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGATACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCATATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAAGAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTACATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTCTGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGAGCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
204 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 GACATCGTCATGACCCAGACACCCCTGTCCCTCTCTGTGACCCCTGGCCAGCCAGCCTCAATTAGCTGCAAGTCCTCTCAAAGTCTGGAGAACCCCAATGGGAACACTTACCTTAATTGGTATCTGCAGAAACCCGGACAATCCCCTCAACTCCTGATCTACAGGGTCTCTAAGAGATTCTCAGGCGTGCCAGATCGCTTTAGCGGTTCCGGGTCTGGCACAGACTTCACCTTGAAGATTAGTCGGGTTGAAGCTGAGGATGTGGGAGTCTATTACTGTCTGCAGCTCACTCATGTGCCCTACACCTTTGGTCAGGGCACAAAACTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC
115 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
116 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
205 抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
206 抗CD19(8B8-018)輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
7.1.4 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-018)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.2) 與如圖(29A)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1- CL結構域融合之多肽，但在CL結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。與如圖(29B)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽，但在CH1結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH1。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系8B8-018。 根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19-Fc孔鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CD19結合Fab (圖30，構築體3.2)。 表48展示含有交叉CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.2)之cDNA及胺基酸序列。 表48：含有CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(構築體3.2)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
165 核苷酸序列二聚配位體(71-254)- CL Fc結鏈 參見表22
166 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1 參見表22
203 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 參見表47
204 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
117 二聚配位體(71-254) - CL Fc結鏈 參見表22
118 單體配位體(71-254) -CH1 參見表22
205 抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 參見表47
206 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
7.1.5 製備二價CD19 (8B8-018)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合(構築體3.3) 含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)之多肽與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合，如圖29C中所描繪：人類IgG1 Fc孔、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合之多肽，如圖29D中所描述：人類IgG1 Fc結、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。 在具有孔、結之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系8B8-018。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19 huIgG1孔二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗CD19 huIgG1結單體配位體鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個CD19結合Fab (圖30，構築體3.3)。 表49展示二價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.3)之cDNA及胺基酸序列。 表49：二價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)PGLALA融合物(構築體3.3)之鹼基對序列
SEQ ID NO: 說明 序列
207 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體鏈 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAACCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGATACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCATATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAAGAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTACATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTCTGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGAGCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
208 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc結單體配位體 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAACCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGATACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCATATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAAGAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTACATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTCTGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGAGCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
204 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
209 抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
210 抗CD19(8B8-018) Fc結單體配位體 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
206 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
7.1.6 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.4) 如圖29A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。如圖29B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架中次選殖編碼與人類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體的多肽(Merchant, Zhu等人 1998)。為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，K147E及K213E。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系8B8-018。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19-Fc孔鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CD19結合Fab (圖 30 ，構築體3.4)。表 50 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.4)之cDNA及胺基酸序列。 表50：含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體3.4)之cDNA及胺基酸序列。*帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
169 核苷酸序列二聚配位體(71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
170 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 參見表24
203 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 參見表47
204 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
119 二聚配位體(71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
120 單體配位體(71-248)-CH1* 參見表24
205 抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 參見表47
206 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
7.1.7 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-018)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.5) 與如圖(29A)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽，但在CL結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。與如圖(29B)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽，但在CH1結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH1。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系8B8-018。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19-Fc孔鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CD19結合Fab (圖30，構築體3.5)。表 51 展示含有交叉CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.5)之cDNA及胺基酸序列。 表51：含有CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體3.5)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
171 核苷酸序列二聚配位體(71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
172 核苷酸序列單體配位體(71-248)-CH1 參見表25
203 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 參見表47
204 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
173 二聚配位體(71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
174 單體配位體(71-248)-CH1 參見表25
205 抗CD19(8B8-018) Fc孔鏈 參見表47
206 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
7.1.8 製備二價CD19 (8B8-018)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合(構築體3.6) 含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)之多肽與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合，如圖 29C 中所描繪：人類IgG1 Fc孔、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合之多肽，如圖 29D 中所描述：人類IgG1 Fc結、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。 在具有孔、結之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系8B8-018。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19 huIgG1孔二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗CD19 huIgG1結單體配位體鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個CD19結合Fab (圖30，構築體3.6)。 表52展示二價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.6)之cDNA及胺基酸序列。 表52：二價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體3.6)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
211 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAACCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGATACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCATATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAAGAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTACATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTCTGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGAGCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCAGGCCTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCCGACGATCCCGCTGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGCATGTTCGCTCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCAGCAGGGGCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCCCAGCTTCTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCAGCCGGGCTC
212 核苷酸序列抗CD19(8B8-018) Fc結單體(71-248)配位體 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAACCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGATACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCATATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAAGAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTACATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTCTGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGAGCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTGCCGGGCTC
204 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
213 抗CD19(8B8-018) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
214 抗CD19(8B8-018) Fc結單體(71-248)配位體 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
206 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
7.2 製備CD19 (8B8衍生之親和力成熟)靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子及相應對照分子 7.2.1 產生不含熱點之8B8衍生之親和力成熟抗CD19結合子 7.2.1.1 親和力成熟CD19特異性抗體之選擇 位置27d及28處之天冬醯胺殘基之去醯胺化(位於人類化純系8B8之輕鏈之CDR1處)引起生物活性之顯著降低。因此，產生2個噬菌體呈現文庫，其中a)消除位置27d及28處之兩個天冬醯胺殘基及b)重鏈及輕鏈之其他CDR隨機化以選擇具有改良之親和力的8B8變異體。 7.2.1.2 產生不含LCDR1熱點之8B8親和力成熟文庫 使用標準方案(Silacci等人, 2005)，藉由噬菌體呈現進行不含去醯胺化位點N27d及N28 (位於LCDR1)的親和力成熟8B8衍生之抗體之產生。在第一步驟中，將人類化親本純系8B8 (SEQ ID NO:215及SEQ ID NO:216)之VL及VH DNA序列選殖入吾人之噬菌粒，該噬菌粒接著用作隨機化之模板。在下一步驟中，產生兩個文庫用於藉由噬菌體呈現選擇有利純系。為了消除上述熱點位置，僅允許位置27d及28處之胺基酸S T Q E的LCDR1隨機化引子(SEQ ID NO:217)用於兩個文庫。在輕鏈及重鏈之CDR1及CDR 2中隨機化成熟文庫1，而在輕鏈之CDR1及CDR 3以及重鏈之CDR3中隨機化成熟文庫2。各別CDR區域中之隨機位置展示於圖 31A 中。關於成熟文庫1之產生(在輕鏈及重鏈之CDR1及CDR 2中隨機化)，藉由「重疊擴展編接」(SOE)PCR組裝三個片段且選殖入噬菌體載體(圖 31B )。以下引子組合用於產生文庫片段：片段1 (LMB3(SEQ ID NO:222)及CD19 L1反向隨機子(SEQ ID NO:217)、片段2 (CD19 L2正向隨機子(SEQ ID NO:218)及CD19 H1反向隨機子(SEQ ID NO:219)，及片段3 (CD19 H2正向隨機子(SEQ ID NO:220)及CD19 H3反向恆定子(SEQ ID NO:221)(表 53 )。在組裝足量的全長隨機片段之後，與經相同處理之受體噬菌粒載體一起用Nco I/Nhe I消化。用10 μg噬菌粒載體接合3倍莫耳過量之文庫插入物。純化之連接用於20次變換，產生2×109 個轉型體。解救呈現8B8親和力成熟文庫之噬菌粒粒子且藉由PEG/NaCl純化來純化以用於選擇。 類似地進行第二文庫之產生(在輕鏈之CDR1及CDR3以及重鏈之CDR3中隨機化)。以下引子組合用於產生文庫片段：片段1 (LMB3(SEQ ID NO:222)及CD19 L1反向隨機子(SEQ ID NO:217)、片段2 (CD19 L1正向恆定子(SEQ ID NO:223)及CD19 L3反向隨機子(SEQ ID NO:224)及片段3 (CD19 L3正向恆定子(SEQ ID NO:225)及CD19 H3反向隨機子(SEQ ID NO:226)(表 54 )。在組裝足量的全長隨機片段之後，與經相同處理之受體噬菌粒載體一起用Nco I/Kpn I消化。用20 μg噬菌粒載體接合3倍莫耳過量之文庫插入物。純化之連接用於40次變換，產生2×109 個轉型體。解救呈現8B8親和力成熟文庫之噬菌粒粒子且藉由PEG/NaCl純化來純化以用於選擇。 表53：8B8親和力成熟之引子及熱點移除文庫L1_L2/H1_H2
SEQ ID 名稱 序列
217 CD19 L1反向隨機子 CAG CTG CGG GCT CTG ACC CGG TTT CTG GAG ATA CCA GTT CAG 1 CGT 2 GCC 3 GGA 4 TTC CAG AGA TTG GCT GGA TTT GCA AGA AAT G    1：40% Y、6% A/S/T/G/P/D/N/E/Q/V，2：40% N、6% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V，3：25% S/T/Q/E，4：25% S/T/Q/E
218 CD19 L2正向隨機子 CTC CAG AAA CCG GGT CAG AGC CCG CAG CTG CTG ATC TAC 5 GTA TCT 6 CGC 7 8 GGC GTT 9 GAT CGT TTC AGC GGT TCT GGA TCC GGC ACC    5：30% R、20% E、5% A/S/T/Y/G/P/D/N/Q/V，6：30% K、20% S、5% A/N/T/Y/G/P/D/E/Q/V，7：40% F、5% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V/I/L，8：40% S、6.6% A/T/Y/G/P/D/E/Q/V，9：50% P、50% L
219 CD19 H1反向隨機子 CAT CCA CTC CAG ACC CTG GCC CGG GGC CTG ACG AAC CCA 10 CAT 11 12 13 14 GAA 15 GTA ACC AGA TGC TTT GCA GCT CAC TTT AAC GGA AGC    10：52% H、4% G/A/S/P/T/N/Y/D/E/Q/V/I，11：30% I、15% Y、5% G/A/S/T/P/N/H/D/E/Q/V，12：52% Y、4% G/A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I，13：30% D、15% G、5% A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I，14：52% T、4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I，15：52% T、4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I
220 CD19 H2正向隨機子 CAG GCC CCG GGC CAG GGT CTG GAG TGG ATG GGC 16 ATT 17 CCA 18 19 20 21 TCC 22 TAT ACC 23 AAA TTC CAG GGC CGC GTC ACG ATG ACC    16：45% Y、5% A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I，17：52% N、4% G/A/S/P/Y/T/H/D/E/Q/V/I，18：40% Y、5% G/A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I，19：30% N、15% S、5% G/A/T/P/Y/H/D/E/Q/V/I，20：30% D、15% G、5% A/S/T/P/Y/N/H/E/Q/V/I，21：52% G、4% N/A/S/P/Y/T/H/D/E/Q/V/I，22：30% K、15% N、4% G/A/S/P/Y/T/H/D/E/Q/V/I，23：30% E、15% Q、5% G/A/S/T/P/Y/N/H/D/V/I
221 CD19 H3反向恆定子 CGTCACCGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAG
222 LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC
表54：8B8親和力成熟之引子及熱點移除文庫L1_L3/H3
SEQ ID 名稱 序列
223 CD19 L1正向恆定子 TGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCCGCAG
217 CD19 L1 反向隨機子 參見表53
224 CD19 L3反向隨機子 TTT AAT TTC CAG TTT AGT TCC TTG ACC GAA GGT 24 25 26 27 28 29 CTG CAG ACA ATA GTA GAC GCC AAC GTC TTC AGC    24：52% Y、4% G/A/S/T/N/P/D/E/Q/V/L/I，25：52% P、4% G/A/S/T/Y/N/H/D/E/Q/V/I，26：42% V、10% L、4% G/A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/I，27：52% H、4%  G/A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/I，28：42% T、10% I、4% G/A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/L，29：45% L、11% G、4% A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/I
225 CD19 L3正向恆定子 ACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACG
226 CD19 H3反向隨機子 TT GGT GCT AGC AGA GCT TAC GGT CAC CGT GGT ACC TTG GCC CCA GTA ATC AAA 30 31 32 33 34 35 36 37 38 GCG TGC ACA ATA GTA AAC AGC GGT GTC 30：50% L、3.8% G/A/S/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I，31：50% A、4.2% G/S/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I，32：50% S、4.2% G/A/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I，33：50% G、4.2% S/A/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I，34：50% Y、4.2% G/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I，35：50% Y、4.2% G/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I，36：50% Y、4.2% G/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I，37：50% T、4.2% G/A/Y/P/H/S/N/D/E/Q/V/I，38：50% G、4.2% Y/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I
222 LMB3 參見表53
7.2.1.3 選擇不含LCDR1熱點N27d及N28之親和力成熟8B8衍生之純系 關於不含LCDR1熱點N27d及N28之親和力成熟純系之選擇，進行藉由噬菌體呈現之兩種選擇方法： 在第一種方法中，使用兩種噬菌體呈現文庫對人類CD19-Fc融合蛋白質執行選擇。根據以下模式在溶液中進行數輪淘選：1. 約1012 個噬菌粒粒子與30 nM生物素化CD19-Fc蛋白質以1 ml之總體積結合0.5小時，2. 藉由添加5.4×107 個經塗佈抗生蛋白鏈菌素之磁性珠粒歷時10分鐘捕捉生物素化CD19-Fc蛋白質及特異性結合之噬菌體粒子，3. 使用5×1 ml PBS/Tween20及5×1 ml PBS洗滌珠粒，4. 藉由添加1 ml 100 mM TEA歷時10分鐘使噬菌體粒子溶離輕藉由添加500 μl 1 M Tris/HCl pH 7.4來中和，5. 再感染按指數律成比例生長之大腸桿菌TG1細菌及6. 用輔助噬菌體VCSM13感染輕隨後進行噬菌粒粒子之PEG/NaCl沈澱以用於後續選擇輪次。使用遞減抗原濃度(30×10-9 M、10×10-9 M及3×10-9 M)經3個輪次進行選擇。在第2及3輪中，使用中性抗生物素蛋白培養盤代替抗生蛋白鏈菌素珠粒進行抗原:噬菌體複合物之捕捉。中性抗生物素蛋白培養盤用5× PBS/Tween20及5× PBS洗滌。在第3輪中，中性抗生物素蛋白培養盤在2公升PBS中培育隔夜以用於「解離速率」選擇，隨後自培養盤溶離噬菌體。此外，在第2輪中使用食蟹獼猴CD19-Fc蛋白質以富集交叉反應結合子。 在第二種選擇方法中，對在細胞表面上短暫表現人類或食蟹獼猴CD19 ECD之細胞執行噬菌體淘選。對於HEK細胞之短暫轉染，產生具有以下蛋白質區段之DNA序列(5'至3')的表現質體：A Flag標籤、SNAP標籤、人類或食蟹獼猴來源之CD19 ECD及血小板衍生之生長因子受體(PDGFR)之跨膜區域(SEQ ID NO:227及228)。使用用於偵測之抗Flag抗體藉由流動式細胞測量術確認細胞表面上各別蛋白質(SEQ ID NO:229及230)之表現。兩種文庫在第一選擇輪皆暴露於表現含有人類或食蟹獼猴CD19 ECD之蛋白質融合物的細胞。用於後續淘選輪，相應地交替CD19 ECD之物種。經不相關膜蛋白質短暫轉染之細胞用於預先清除。 根據以下模式進行淘選輪： 1. 根據先前描述之標準程序用表現CD19 ECD或不相關跨膜蛋白質之構築體轉染HEK細胞， 2. 細胞在培育箱中，在37℃及5% CO2 氛圍型培育共48小時，3. 藉由離心(250×g下3分鐘)分離細胞且分別製備1×10E7個CD19 ECD陽性細胞及1×10E7個陰性細胞於PBS/5% BSA中之懸浮液， 3. 藉由使用平緩旋轉試管旋轉器將噬菌體文庫與1×107個CD19陰性細胞一起在4℃下培育60分鐘來預先清除非特異性噬菌體， 4. 在250×g下離心細胞3分鐘且將上清液轉移入新試管，且添加1×10E7個CD19陽性細胞且藉由在試管旋轉器上平緩旋轉，在4℃下培育60分鐘， 5. 藉由在250×g下離心1分鐘來洗滌細胞，抽出上清液且再懸浮於1 ml PBS中(8次)， 6. 用1 ml 100 mM TEA進行噬菌體溶離，在室溫下培育5分鐘且用500 μl 1 M Tris-HCl，pH 7.6中和溶離液， 7. 再感染按指數律成比例生長之大腸桿菌TG1細菌，及 8. 用輔助噬菌體VCSM13進行感染且隨後進行噬菌粒粒子之PEG/NaCl沈澱以用於後續選擇輪次。經3個輪次進行選擇。 對於兩種選擇方法，如下藉由ELISA鑑別特異性結合子：將100 μl 30 nM生物素化CD19-Fc蛋白質/孔塗佈於中性抗生物素蛋白培養盤上。添加含Fab之細菌上清液且使用抗Flag/HRP二級抗體經由其Flag標籤偵測結合Fab。 使用用含有人類CD19 ECD之表現質體(SEQ ID NO:227)短暫轉染之細胞在基於細胞之ELISA中進一步測試重組型人類CD19上之ELISA陽性純系。如下進行此分析：在轉染之後48小時，收集HEK細胞且在250×g下離心5分鐘。接著細胞再懸浮於冰冷的PBS BSA 2%中達到4×106 個細胞/毫升且在冰上培育20分鐘以阻斷非特異性結合位點。4 ×105 個細胞(100 μl)分佈至96孔盤之各孔中且在250×g及4℃下離心3分鐘。抽出上清液且50 μl含有可溶性Fab片段之細菌上清液用50 μl冰冷的PBS/BSA 2%稀釋，添加至培養盤中，與細胞混合且在4℃下培育1小時。隨後，細胞用冰冷的PBS洗滌3次，接著添加100 μl PBS BSA 2%/孔(含有抗Fab-HRP抗體之1:2000稀釋物)。在培育1小時之後，細胞再用冰冷的PBS洗滌3次。對於研究，每孔添加100 μl「1步驟超級TMB-ELISA」受質。在10分鐘培育時間之後，上清液轉移至新的含有40 μl H2 SO4 1 M/孔之96孔盤中且在450 nM下量測吸光度。呈現顯著高於背景之信號的純系經歷使用ProteOn XPR36藉由SPR分析進行之動力學篩選實驗。 7.2.1.4 藉由SPR鑑別親和力成熟8B8衍生之變異體 為了進一步表徵ELISA陽性純系，藉由表面電漿子共振量測解離速率且與親本人類化純系8B8進行比較。 對於此實驗，7000 RU多株抗人類Fab抗體藉由胺偶合(NaAcetate pH 4.5，25微升/分鐘，240秒)(垂直定向)固定在GLM晶片之所有6個通道上。過濾各含有抗體之細菌上清液且用PBS稀釋2倍，且接著以25微升/分鐘經360秒注射以在垂直定向上實現100與400個反應單元(RU)之間的固定程度。單體CD19-Fc之注射：對於單發動力學量測，注射方向變成水平定向，經純化之單體CD19-Fc之一系列三倍稀釋物(不同濃度範圍在150與6 nM之間)以50微升/分鐘沿個別通道1-4同時注射，其中結合時間為180秒，且解離時間為300秒。在通道5中注射人類 Fc片段(150 nM)作為特異性結合於單體CD19-Fc之陰性對照。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供用於參考之「串聯」空白。在90微升/分鐘(水平定向)下，藉由歷時30秒之10 mM甘胺酸pH 1.5及50 mM NaOH之兩個脈衝進行再生。在ProteOn Manager v3.1軟體中，使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型藉由同時擬合感測圖譜來計算解離速率常數(koff )。鑑別具有最慢解離速率常數之表現Fab之純系(表 55 )。應注意，由於擬合不充分，無法測定純系5A07及5B08之解離速率常數。然而，由於所得結果表明極緩慢解離而選擇兩個純系。將相應噬菌粒之可變結構域測序。重要的是，LCDR1中之兩個天冬醯胺殘基(位置27d及28)由絲胺酸或蘇胺酸置換，表明移除兩個去醯胺化位點。比對展示於圖 32 中。最佳純系之CDR列舉於表 56 (輕鏈之可變區)及表 57 (重鏈之可變區)中(純系5H09：(SEQ ID NO:231-236)；純系7H07：(SEQ ID NO:237-242)；純系2B03：(SEQ ID NO:243-248)；純系2B11：(SEQ ID NO:249-254)；純系5A07：(SEQ ID NO:255-260)；純系5B08：(SEQ ID NO:261-266)；純系5D08：(SEQ ID NO:267-272))。 表55：在具有細菌上清液之篩選分析中獲得之所選擇之純系之解離常數
純系 解離常數 kd (1/s)
親本8B8 3.01E-4
5H09 2.58E-4
7H07 5.75E-5
2B03 3.24E-5
2B11 4.37E-6
5A07 n.d.
5B08 n.d.
5D08 1.95E-4
表56：所選擇之8B8輕鏈之CDR序列
純系 SEQ ID NO CDR-L1 SEQ ID NO CDR-L2 SEQ ID NO CDR-L3
5H09 231 KSSQSLESSTGNTYLN 232 RVSKRFS 233 LQLIDYPVT
7H07 237 KSSQSLETSTGNTYLN 238 RVSKRFS 239 LQATHIPYT
2B03 243 KSSQSLETSTGNTYLN 244 RVSKRFS 245 LQLTHVPYT
2B11 249 KSSQSLETSTGTTYLN 250 RVSKRFS 251 LQLLEDPYT
5A07 255 KSSQSLETSTGNTYLN 256 RVSKRFS 257 LQPGHYPGT
5B08 261 KSSQSLETSTGNTYLN 262 RVSKRFS 263 LQLDSYPNT
5D08 267 KSSQSLETSTGNTYLN 268 RVSKRFS 269 LQLTHEPYT
表57：所選擇之8B8重鏈之CDR序列
純系 SEQ ID NO CDR-H1 SEQ ID NO CDR-H2 SEQ ID NO CDR-H3
5H09 234 DYIMH 235 YINPYNDGSKYTEKFQG 236 GTYYYGSALFDY
7H07 240 DYIMH 241 YINPYNDGSKYTEKFQG 242 GTYYYGSELFDY
2B03 246 DYITH 247 YINPYNDGSKYTEKFQG 248 GTYYYGPDLFDY
2B11 252 DYIMH 253 YINPYNDGSKYTEKFQG 254 GTYYYGPQLFDY
5A07 258 DYIMH 259 YINPYNDGSKYTEKFQG 260 GTYYYGSALFDY
5B08 264 DYIMH 265 YINPYNDGSKYTEKFQG 266 GTYYYGPQLFDY
5D08 270 DYIMH 271 YINPYNDGSKYTEKFQG 272 GTYYYGSELFDY
7.2.2 親和力成熟8B8衍生之抗體之表徵 7.2.2.1 可變抗體結構域選殖入表現載體 在具有人類IgG1之恆定重鏈或恆定輕鏈之框架中次選殖所選擇之抗CD19結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區。在重鏈中，根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中描述之方法引入Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。表 58 及表 59 中分別展示抗CD19 IgG之cDNA及胺基酸序列。將所有抗體編碼序列選殖入表現載體，該表現載體驅動具有嵌合MPSV啟動子之插入物之轉錄且含有位於CDS之3'端處的合成polyA信號序列。此外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 表58：P329GLALA人類IgG1格式中抗CD19純系8B8之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 純系及鏈 序列
273 8B8親本輕鏈 GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAACTCCTGATCTACAGGGTTTCCAAACGATTTTCTGGGGTCCTAGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTACAACTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
274 8B8親本重鏈 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGGCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATATTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGACTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTTCTAAGTACACTGAGAAGTTCAACGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCTTCCATCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGACCTATTATTATGGTAGCGCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
275 8B8親本輕鏈 DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQLTHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
276 8B8親本重鏈 EVQLQQSGPELVKPGASVKMACKASGYTFTDYIMHWVKQKTGQGLEWIGYINPYNDGSKYTEKFNGKATLTSDKSSITAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表59：P329GLALA人類IgG1格式中親和力成熟抗CD19純系之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 純系及鏈 序列
277 2B11輕鏈 GATATTGTCATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTCAGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCACCGGCACCACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCCGCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGATCGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCCGTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGCTGCTGGAAGATCCATACACCTTCGGTCAAGGAACGAAACTGGAAATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
278 2B11重鏈 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
279 2B11輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
280 2B11重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
281 7H07輕鏈 GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTCAGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCACCGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCCGCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGATCGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCCGTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGGCAACCCATATCCCATACACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
282 7H07重鏈 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTTCTGAACTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
283 7H07輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQATHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
284 7H07重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSELFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
285 2B03輕鏈 GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTCAGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCACCGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCCGCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGATCGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCCGTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGTTGACCCACGTTCCGTACACCTTCGGTCAAGGAANNAAACTGGAAATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT  
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292 5A07重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  
293 5D08輕鏈 GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTCAGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCACCGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCCGCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGATCGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCCGTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGCTGACCCATGAACCATACACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT  
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298 5B08重鏈 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA  
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302 5H09重鏈 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTTCTGCACTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA  
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304 5H09重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  
7.2.2.2 藉由SPR進行所選擇之抗體之親和力測定 對於藉由SPR進行之親和力之精確測定，藉由使用聚伸乙基亞胺共同轉染HEK293-EBNA細胞與哺乳動物表現載體來產生所選擇之抗CD19抗體。根據標準程序以1:1比率(「載體重鏈」:「載體輕鏈」)用相應表現載體轉染細胞。轉染之後7天，量測上清液中之抗體效價且所有效價平衡至10 μg/ml。 使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)在25℃下藉由SPR量測親本抗體8B8以及其衍生物之親和力(KD )。7000 RU多株抗人類Fab抗體藉由胺偶合(NaAcetate pH 4.5，25微升/分鐘，240秒)(垂直定向)固定於GLM晶片之所有6個通道上。過濾各含有抗體之HEK上清液，用PBST (10 mM磷酸、150 mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)稀釋至10 μg/ml之濃度，且接著經360秒以25微升/分鐘注射以在垂直定向上實現500與800個反應單元(RU)之間的固定程度。單體CD19-Fc之注射：對於單發動力學量測，注射方向變成水平定向，經純化之單體CD19-Fc之一系列三倍稀釋物(不同濃度範圍在150與6 nM之間)以50微升/分鐘沿個別通道1-4同時注射，其中結合時間為180秒，且解離時間為300秒。在通道5中注射人類IgG Fc片段(150 nM)作為特異性結合於單體CD19-Fc之陰性對照。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供用於參考之「串聯」空白。各別感測圖譜之概述展示於圖 33 中。在90微升/分鐘(水平定向)下，藉由歷時30秒之10 mM甘胺酸pH 1.5及50 mM NaOH之兩個脈衝進行再生。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算結合速率常數(kon )及解離速率常數(koff )。平衡解離常數(KD )計算為比率koff /kon 。動力學及熱力學資料之概述展示於表 60 中。所有親和力成熟純系之解離常數與其親本純系8B8相比得到改良。 表60：抗CD19 huIgG1與人類CD19之間的相互相用之動力學及熱力學資料之概述
純系 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
親本8B8 5.66E+4 1.34E-4 2.36E-9
5H09 7.91E+4 1.50E-5 1.89E-10
7H07 7.45E+4 5.57E-5 7.47E-10
2B03 6.02E+4 5.00E-5 8.31E-10
2B11 6.34E+4 3.14E-5 4.95E-10
5A07 6.98E+4 3.07E-5 4.40E-10
5B08 6.81E+4 5.26E-5 7.72E-10
5D08 8.88E+4 8.44E-5 9.51E-10
7.2.2.3 抗CD19 IgG1 P329G LALA之製備及純化 藉由使用聚伸乙基亞胺共同轉染HEK293-EBNA細胞與哺乳動物表現載體來產生所選擇之抗CD19抗體。細胞用相應表現載體以1:1比率(「載體重鏈」:「載體輕鏈」)轉染。 關於在500 mL搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞。在轉染之前，使細胞在210×g下離心5分鐘，且用預溫熱之CD CHO培養基置換上清液。在20 mL CD CHO培養基中混合表現載體(200 μg完全DNA)。在添加540 μL PEI之後，溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加160 mL F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加1 mM丙戊酸及具有補充劑之7% Feed。在培養7天之後，藉由在210×g下離心15鐘來收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 使用用於抗原Fc融合物之純化的如上文所描述之蛋白質A，藉由親和層析進行抗體分子自細胞培養物上清液之純化。濃縮且過濾蛋白質，隨後裝載於用20 mM組胺酸、140 mM NaCl溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。 使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數，藉由在280 nm型量測OD來測定經純化之抗體之蛋白質濃度。使用LabChipGXII (Caliper)在存在及不存在還原劑(Invitrogen, USA)之情況下藉由CE-SDS分析抗體之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mML-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v)NaN3 、pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析抗體樣品之聚集物含量(表 61 )。 表61：抗CD19 P329G LALA IgG1純系之生物化學分析
純系 產量[mg/l] 單體[%] CE-SDS (非紅色)
親本8B8 25.3 100 99.1
2B11 35.4 100 98.4
7H07 89.8 100 99.4
2B03 182 100 100
5A07 90.2 100 99.4
5D08 90.2 100 99.3
5B08 24.1 99.6 100
5H09 29.9 100 98.1
關於製備雙特異性構築體，選擇純系2B11，因為其缺乏三個去醯胺熱點。 根據Uniprot資料庫之P41273序列合成人類4-1BB配位體之胞外域之DNA序列編碼部分(胺基酸71-254及71-248)。 7.2.3 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.1) 如關於構築體3.1 (圖 30) 所描述製備構築體4.1，但使用編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，純系8B8-2B11。表 62 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.1)之cDNA及胺基酸序列。 表62：含有CH-CL交叉及帶電殘基之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(構築體4.1)之cDNA及胺基酸序列。*表示帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
129 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
130 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
305 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
277 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11)輕鏈 參見表59
115 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
116 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
306 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
206 抗CD19(8B8-2b11)輕鏈 參見表59
7.2.4 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.2) 如關於構築體3.2 (圖 30 )所描述製備構築體4.2，但使用編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，純系8B8-2B11。表 63 展示含有交叉CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.2)之cDNA及胺基酸序列。 表63：含有CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(構築體4.2)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
165 核苷酸序列二聚配位體(71-254)- CL Fc結鏈 參見表22
166 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1 參見表22
305 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
277 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11)輕鏈 參見表59
117 二聚配位體(71-254) - CL Fc結鏈 參見表22
118 單體配位體(71-254) -CH1 參見表22
306 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
279 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表59
7.2.5 製備二價CD19 (8B8-2B11)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合(構築體4.3) 如關於構築體3.3 (圖 30 )所描述製備構築體4.3，但使用編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，純系8B8-2B11。表 64 展示二價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.3)之cDNA及胺基酸序列。 表64：二價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)PGLALA融合物(構築體4.3)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
307 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體鏈 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
308 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體配位體 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
277 核苷酸序列抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表59
309 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
310 抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體配位體 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
279 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表59
7.2.6 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.4) 如關於構築體3.4 (圖30)所描述製備構築體4.4，但使用編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，純系8B8-2B11。表 65 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.4)之cDNA及胺基酸序列。 表65：含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體4.4)之cDNA及胺基酸序列。*帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
169 核苷酸序列二聚配位體(71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
170 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 參見表24
305 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
277 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11)輕鏈 參見表59
119 二聚配位體(71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
120 單體配位體(71-248)-CH1* 參見表24
306 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
279 抗CD19(8B8-2B11)輕鏈 參見表59
7.2.7 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.5) 如關於構築體3.5 (圖30)所描述製備構築體4.5，但使用編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，純系8B8-2B11。表 66 展示含有交叉CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體4.5)之cDNA及胺基酸序列。 表66：含有CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體4.5)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
171 核苷酸序列二聚配位體(71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
172 核苷酸序列單體配位體(71-248)-CH1 參見表25
305 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
277 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11)輕鏈 參見表59
173 二聚配位體(71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
174 單體配位體(71-248)-CH1 參見表25
306 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔鏈 參見表62
279 抗CD19(8B8-2B11)輕鏈 參見表59
7.2.8 製備二價CD19 (8B8-2B11)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合(構築體4.6) 如關於構築體3.6 (圖30)所描述製備構築體4.6，但使用編碼對CD19具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，純系8B8-2B11。表 67 展示二價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體3.6)之cDNA及胺基酸序列。 表67：二價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體4.6)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
311 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCAGGCCTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCCGACGATCCCGCTGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGCATGTTCGCTCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCAGCAGGGGCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCCCAGCTTCTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCAGCCGGGCTC
312 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體(71-248)配位體 CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTGCCGGGCTC
277 核苷酸序列抗CD19(8B8-2B11)輕鏈 參見表59
313 抗CD19(8B8-2B11) Fc孔二聚配位體(71-248)鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
314 抗CD19(8B8-2B11) Fc結單體(71-248)配位體 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
279 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表59
7.3 製備未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合物及人類IgG作為對照分子 7.3.1 製備未靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(對照分子) 如上文關於CD19靶向之構築體3.1 (稱為對照物B)、3.3 (稱為對照物C)、3.4 (稱為對照物D)及3.5 (稱為對照物E)所描述製備此等對照分子，唯一不同之處在於抗CD19結合子(VH-VL)由不結合於抗原之稱為DP47之生殖系對照物置換(參見圖30)。表 68 分別展示含有交叉CH-CL及帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物、對照物B之cDNA及胺基酸序列。表 69 分別展示二價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物、對照物C之cDNA及胺基酸序列。表 70 分別展示含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物、對照物D之cDNA及胺基酸序列。表 71 分別展示在CH-CL交叉物中不含帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物、對照物E之cDNA及胺基酸序列。 表68：具有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(對照物B)之cDNA及胺基酸序列。*帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
96 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
97 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
79 核苷酸序列DP47 Fc孔鏈 參見表18
80 核苷酸序列DP47輕鏈 參見表18
98 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
99 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
81 DP47 Fc孔鏈 參見表18
82 DP47輕鏈 參見表18
表69：二價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(對照物C)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
177 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列DP47 Fc孔鏈 參見表27
178 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之核苷酸序列DP47 Fc結鏈 參見表27
80 核苷酸序列DP47輕鏈 參見表18
179 與二聚hu 4-1BBL (71-254)融合之DP47 Fc孔鏈 參見表27
180 與單體hu 4-1BBL (71-254)融合之DP47 Fc結鏈 參見表27
82 DP47輕鏈 參見表18
表70：具有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(對照物D)之cDNA及胺基酸序列。*帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
169 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
170 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 參見表24
79 核苷酸序列DP47 Fc孔鏈 參見表18
80 核苷酸序列DP47輕鏈 參見表18
119 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表24
120 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表24
81 DP47 Fc孔鏈 參見表18
82 DP47輕鏈 參見表18
表71：具有CH-CL交叉物且無帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(對照物E)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
171 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
172 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 參見表25
79 核苷酸序列DP47 Fc孔鏈 參見表18
80 核苷酸序列DP47輕鏈 參見表18
173 二聚hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
174 單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1 參見表25
81 DP47 Fc孔鏈 參見表18
82 DP47輕鏈 參見表18
7.3.2 作為對照分子之抗體 製備含有PGLALA之兩個對照人類IgG1。表 72 展示抗CD19 huIgG1 PGLALA (純系8B8-018)，亦即對照物G之cDNA及胺基酸序列。表 73 展示生殖系對照物DP47 huIgG1 PGLALA (對照物F)之cDNA及胺基酸序列。 表72：抗CD19 (8B8-018)huIgG1 PGLALA (對照物G)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
315 核苷酸序列CD19(8B8-018)重鏈(huIgG1 PGLALA) CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAACCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGATACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCATATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAAGAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTACATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTCTGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGAGCTCCGCAAGTACTAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCTGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGCAAA
204 核苷酸序列CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
316 CD19(8B8-018)重鏈(huIgG1 PGLALA) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
206 CD19(8B8-018)輕鏈 參見表47
表73：生殖系對照物DP47 huIgG1 PGLALA (對照物F)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
181 核苷酸序列DP47重鏈(hu IgG1 PGLALA) 參見表29
80 DP47輕鏈 參見表18
182 DP47重鏈(hu IgG1 PGLALA) 參見表29
82 DP47輕鏈 參見表18
7.4 製備CD19靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合抗原結合分子及其對照分子 將靶向及未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原結合分子編碼序列選殖入質體載體，該質體載體驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於在CDS之3'端處的合成polyA序列。此外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 藉由使用聚伸乙基亞胺共轉染HEK293-EBNA細胞及哺乳動物表現載體來產生分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原結合分子。用相應的表現載體轉染細胞。關於變異體1、2、4、5及其對照物B、D及E，以1:1:1:1比率(「載體二聚配位體-CL-結鏈」:「載體單體配位體融合物-CH1」:「載體抗CD19 Fab-孔鏈」:「載體抗CD19輕鏈」)。關於變異體3、6及其對照物C，以1:1:1比率(「載體huIgG1 Fc孔二聚配位體鏈」:「載體huIgG1 Fc結單體配位體鏈」:「載體抗CD19輕鏈」)。與雙特異性構築體相同地產生人類IgG，在分析中用作對照物(關於轉染，以1:1比率僅使用輕鏈之一個載體及重鏈之一個載體)。 關於在500 mL搖瓶中製備，在轉染之前24小時接種3億個HEK293 EBNA細胞。對於轉染，細胞在210×g下離心10分鐘，且用20 mL預溫熱CD CHO培養基置換上清液。在20 mL CD CHO培養基中混合表現載體(200 μg完全DNA)。在添加540 μL PEI之後，溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加補充有6 mM L-麩醯胺酸、5 g/L PEPSOY及1.2 mM丙戊酸之160 mL Excell培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加12% Feed (胺基酸及葡萄糖)。在培養7天之後，藉由在至少400×g下離心30-40分鐘來收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由使用蛋白質A進行之親和層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原結合分子以及IgG。對於親和層析，上清液裝載於用磷酸鈉(20 mM)、檸檬酸鈉(20 mM)緩衝液(pH 7.5)平衡之MabSelect Sure管柱(CV=5-15 mL，來自GE Healthcare之樹脂)上。藉由用至少6倍管柱體積之相同緩衝液洗滌來移除未結合之蛋白質。用20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸緩衝液(pH 3.0)，使用線性梯度(20 CV)或分步溶離(8 CV)來溶離結合之蛋白質。對於線性梯度，應用額外的4倍管柱體積分步溶離。 藉由添加1/10 (v/v) 0.5 M磷酸鈉，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。在裝載於用20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉、0.01% (v/v)Tween20溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質。 藉由量測280 nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來測定蛋白質濃度。藉由在存在及不存在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)之情況下進行SDS-PAGE且用Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA)染色來分析經靶向之三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析樣品之聚集物含量。表 74 概述CD19靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原分子之產量及最終單體含量。 表74：CD19靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原結合分子之生物化學分析
構築體 單體 [%]      (SEC) 產量          [mg/l]
含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc融合抗原 (構築體3.1) 98 8.6
二價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc融合物 (構築體3.3) 100 11.3
含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc融合物 (構築體3.4) 99 11.5
含有CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc融合物 (構築體3.5) 97 13.3
二價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc融合物 (構築體3.6) 96 19.9
含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價CD19 (8B8-2B11)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc融合物 (構築體4.4) 99.2 21.2
表 75 概述DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物(單價(對照物B、D及E)及二價(對照物C))之產量及最終單體含量。 表75：DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之生物化學分析
構築體 單體 [%]      (SEC) 產量          [mg/l]
單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物 (對照物B) 99 15.4
二價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物 (對照物C) 98 12.6
單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物 (對照物D) 99.5 25.9
單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物 (對照物E) 93.3 4.1
表 76 概述抗CD19 (8B8-018)及生殖系DP47人類IgG1 PGLALA (對照物F)之產量及最終單體含量。 表76：對照人類IgG1 PGLALA之生物化學分析
構築體 單體 [%]      (SEC) 產量          [mg/l]
抗CD19(8B8-018) huIgG1 PGLALA 100 36.6
生殖系DP47人類IgG1 PGLALA 100 50
實例8CD19 靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之功能性表徵 8.1. 表面電漿子共振(親和力) 藉由表面電漿子共振(SPR)評估CD19靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合抗原結合分子(構築體3.4及3.6)與重組型4-1BB Fc (kih)及CD19之結合。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20, Biacore, Freiburg/Germany)來進行。與人類及食蟹獼猴 4-1BB 之 相互相用 抗人類Fab抗體(Biacore, Freiburg/Germany)使用標準胺偶合套組(Biacore， Freiburg/Germany)在pH 5.0下在CM5晶片上直接偶合。固定程度為約8000 RU。在2及5 nM (亦注射對照物D)下經60秒捕獲CD19靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合物。重組型人類或食蟹獼猴4-1BB avi His以2.7至2000 nM (3倍稀釋)範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流動速率經由流動細胞經120秒傳遞。監測解離180秒。藉由減去參考流動細胞上所得之反應來校正整體折射率差異。此處，抗原在具有固定之抗人類Fab抗體但已注射HBS-EP而非抗體之表面上流動。與人類 CD19 之 相互相用 抗人類Fab抗體(Biacore, Freiburg/Germany)使用標準胺偶合套組(Biacore， Freiburg/Germany)在pH 5.0下在CM5晶片上直接偶合。固定程度為約8000 RU。在20 nM下經60秒捕獲CD19靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合物或對照抗體(抗CD19 (8B8-018)huIgG1 PGLALA)。重組型人類CD19-Fc (kih)以7.8至500 nM (2倍稀釋)範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流動速率，經由流動細胞經120秒傳遞。監測解離120/1800秒。藉由減去參考流動細胞上所得之反應來校正整體折射率差異。此處，抗原在具有固定之抗人類Fab抗體但已注射HBS-EP而非抗體之表面上流動。 使用Biacore T200評估軟體(vAA，Biacore AB, Uppsala/Sweden)獲得動力學常數，以藉由數值整合針對1:1朗格繆爾結合來擬合比率方程。 雙特異性構築體3.4、3.6及對照物D類似地結合於4-1BB。表77 展示來自兩個實驗(使用2 nM或5 nM之構築體捕捉溶液)之具有標準差(括弧中)之平均值。雙特異性構築體3.4及3.6以與IgG類似的親和力結合人類CD19。藉由針對1:1朗格繆爾結合擬合來測定相互相用之親和力常數。關於hu4-1BB及cy4-1BB之量測，展示平均值及標準差(括弧中)(用2或5 nM捕捉溶液進行之兩個實驗)。 表77：CD19靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合物與重組型人類(hu)4-1BB、食蟹獼猴(cy)4-1BB及人類(hu)CD19之結合。
   抗原 ka (1/Ms) kd  (1/s) KD (M)
含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物 (構築體3.4) hu 4-1BB 7.2E+04(5.9E+03) 2.5E-02(1.0E-05) 3.4E-07(2.8E-08)
cy 4-1BB 1.2E+05(8.6E+03) 1.3E-02(1.8E-04) 1.1E-07(9.9E-09)
hu CD19 2.77E+04 2.67E-04 9.64E-09
二價CD19 (8B8-018)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物 (構築體3.6) hu 4-1BB 6.9E+04(1.7E+03) 2.4E-02(1.5E-04) 3.5E-07(1.1E-08)
cy 4-1BB 1.1E+05(7.7E+03) 1.4E-02(3.1E-04) 1.3E-07(1.3E-08)
hu CD19 2.55E+04 2.69E-04 1.06E-08
具有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物 (對照物D) hu 4-1BB 7.3E+04(3.9E+03) 2.6E-02(6.3E-04) 3.5E-07(1.0E-08)
cy 4-1BB 1.2E+05(1.9E+03) 1.4E-02(1.0E-04) 1.2E-07(2.9E-09)
抗CD19(8B8-018) huIgG1 PGLALA hu CD19 2.12E+04 2.61E-04 1.23E-08
8.2. 表面電漿子共振(同時結合) 藉由表面電漿子共振(SPR)評估同時結合人類4-1BB Fc (kih)及人類CD19之能力。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20, Biacore, Freiburg/Germany)來進行。生物素化人類4-1BB Fc (kih)與抗生蛋白鏈菌素(SA)感測器晶片之流動細胞直接偶合。使用至多250個共振單元(RU)之固定程度。 CD19靶向之三聚分裂型4-1BBL構築體(構築體3.1、3.3、3.4、3.5、3.6、4.4)以200 nM之濃度範圍，以30微升/分鐘之流動速率，經由流動細胞經90秒傳遞，且解離設定成零秒。以500 nM之濃度，以30微升/分鐘之流動速率，經由流動細胞經90秒注射人類CD19作為第二分析物(圖 34A )。監測解離120秒。藉由減去在參考流動細胞(其中未固定蛋白質)中獲得之反應來校正整體折射率差異。 如在圖 35 之圖式中可見，所有雙特異性構築體可同時結合人類4-1BB及人類CD19。 實例9CD-19 靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之功能性表徵 9.1. CD19靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之經活化之人類PMBC上之結合 為了測定含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子與人類PBMC之結合，不同滴定濃度之CD19靶向之含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子用於如實例5.2中所描述之分析中。圖 36A 及36B 分別展示經活化之表現4-1BB之CD4+ T細胞及CD8 T細胞上如實例7中製備之構築體3.1、3.3、3.4、3.5及3.6之結合。在活CD45+ CD3+ CD4+或CD45+ CD3+ CD8+ T細胞上設置閘門且針對經靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合變異體之滴定濃度點漬PE結合之AffiniPure抗人類IgG IgG Fcγ-片段特異性山羊F(ab')2片段之MFI。表 78 展示構築體3.1、3.3、3.4、3.5及3.6以及對照分子之所量測之EC50 值。 表78：經活化之表現4-1BB之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之結合
構築體 EC50 [nM] 4-1BB+ CD8+ EC50 [nM] 4-1BB+ CD4+
對照物B 0.05 0.26
對照物C 0.02 0.30
對照物D 0.04 0.28
對照物E 0.13 1.22
3.1 0.03 0.28
3.3 0.01 0.29
3.4 0.15 2.04
3.5 0.04 1.03
3.6 0.05 0.21
9.2 與表現CD19之腫瘤細胞之結合 關於表現CD19之腫瘤細胞上之結合分析，使用以下表現人類CD19之淋巴瘤細胞株：彌漫性大型非霍奇金氏B細胞淋巴瘤(B-NHL)細胞株SU-DHL-8 (DSMZ ACC573)、急性B細胞前驅體淋巴白血病細胞株Nalm6 (DSMZ ACC-128)、彌漫性大型細胞淋巴母細胞淋巴瘤(ATCC CRL-2631)及彌漫性大型B細胞淋巴瘤細胞株OCI-Ly18(DSMZ ACC-699)。如關於實例5.3中之表現FAP之MV-3及WM-266-4腫瘤細胞株所描述進行分析。 在活腫瘤細胞上設置閘門且針對經靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合構築體之滴定濃度點漬PE結合之AffiniPure抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊F(ab')2片段之MFI。圖 37A 展示如實例7.1中製備之構築體3.1、3.3、3.4、3.5及3.6與彌漫性大型非霍奇金氏B細胞淋巴瘤(B-NHL)細胞株SU-DHL-8之結合，且圖 37B 呈現構築體3.1、3.3、3.4、3.5及3.6與急性B細胞前驅體淋巴白血病細胞株Nalm6之結合。圖 37C 展示構築體3.1、3.3、3.4、3.5及3.6與彌漫性大型細胞淋巴母細胞淋巴瘤細胞株Toledo之結合且圖 37D 展示構築體3.1、3.3、3.4、3.5及3.6與彌漫性大型B細胞淋巴瘤細胞株OCI-Ly18之結合。表 79 展示構築體3.1、3.3、3.4、3.5及3.6以及對照分子之所量測之EC50 值。 表79：與表現CD19之腫瘤細胞之結合
構築體 EC50 [nM] SU-DHL-8 EC50 [nM] Nalm6 EC50 [nM] Toledo EC50 [nM] OCI-Ly18
3.1 0.64 0.43 0.29 0.29
3.3 0.15 0.14 0.10 0.09
3.4 0.31 0.39 0.29 0.26
3.5 0.54 0.43 0.27 0.31
3.6 0.14 0.12 0.09 0.10
對照物G 0.09 0.10 0.06 0.07
實例10CD19 靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之生物活性 10.1. 表現人類4-1BB之HeLa細胞中之NF-κB活化 如實例6.1中所描述產生表現人類4-1BB及NF-κB-螢光素酶之HeLa細胞。與表現 CD19 之 腫瘤細胞共同培養之表現人類 4-1BB 之 HeLa 細胞 中之 NF-κB 活化 收集NF-κB-螢光素酶人類4-1BB HeLa細胞且再懸浮於供應有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I之DMEM培養基中達到0.2×106 個細胞/毫升之濃度。此細胞懸浮液之100 μl(2×104 個細胞)轉移至具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio-one，目錄號655083)之各孔中且盤在37℃及5% CO2 下培育隔夜。第二天，添加50 μL含有滴定濃度之CD19靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(CD19分裂型4-1BBL三聚體)或DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體)之培養基。表現CD19之B細胞淋巴瘤細胞株(彌漫性大型非霍奇金氏B細胞淋巴瘤(B-NHL)細胞株SU-DHL-8 (DSMZ ACC573)及人類非霍奇金氏B細胞淋巴瘤細胞株Pfeiffer (ATCC CRL-2632))再懸浮於供應有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I之DMEM培養基中達到2×106 個細胞/毫升之濃度。 將表現CD19之B細胞淋巴瘤細胞(50 µl，最終比率1:5)之懸浮液或僅培養基添加至各孔中且培養盤在37℃及5% CO2 下培育6小時。細胞用200微升/孔DPBS洗滌兩次。40 µl新近製備之報導子溶解緩衝液(Promega，目錄號：E3971)添加至各孔中且盤在-20℃下儲存隔夜。第二天，冷凍細胞盤及偵測緩衝液(Luciferase 1000分析系統，Promega，目錄號E4550)在室溫下解凍。100 μL偵測緩衝液添加至各孔中且使用SpectraMax M5/M5e微板讀取器及以URL計數發光之SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)(釋放光之單元，0.5秒/孔)或Victor3 1420多標記計數盤讀取器(Perkin Elmer)及以計數/秒(CPS)來計數發光之Perkin Elmer 2030 Manager軟體儘可能快地量測螢光素酶活性，且針對所測試之構築體之濃度進行點漬。 CD19靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子構築體3.1及3.3在表現CD19之B細胞淋巴瘤細胞存在下觸發報導子細胞株中NF-kB信號傳導路徑之活化。相比之下，未靶向之對照分子在任一測試濃度下皆未觸發此作用(圖38)。 實例11 11.1 製備CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子 11.1.1 抗CEA純系T84.66之人類化 藉由將CDR移植至人類生殖系構架受體序列上來研究鼠類抗體T84.66之新穎人類化變異體(Wagener等人, J Immunol 130, 2308 (1983)，Neumaier 等人, J Immunol 135, 3604 (1985))。 來自非人類來源之抗體之人類化基本上由將來自非人類抗體(供體)之CDR殘基移植至人類(受體)抗體之構架上組成。通常，藉由以下選擇受體構架序列：比對供體序列與可能的受體序列之集合且選擇與供體具有合理的同源性或在對結構及活性重要的一些位置展示類似胺基酸的序列。在本發明之情況下，藉由比對小鼠T84.66蛋白質(NCBI寄存編號：CAA36980 (重鏈(SEQ ID NO:317))及CAA36979 (輕鏈(SEQ ID NO:318))序列與人類生殖系序列之集合且挑選展示高序列一致性之人類序列來進行抗體受體架構之檢索。此處，選擇來自IMGT資料庫之序列IGHV1-69*08作為重鏈構架受體序列(IMGT寄存編號Z14309，SEQ ID NO:319)，且選擇IGKV3-11*01序列(IMGT寄存編號X01668，SEQ ID NO:320)作為輕鏈之構架受體。將小鼠重鏈及輕鏈可變結構域之三個互補決定區(CDR)移植至此等兩個受體構架上。因為構架4 (FR4)區域不為生殖系V基因之可變區之一部分，因此個別地進行該位置之比對。選擇JH4序列用於重鏈，且選擇JK2序列用於輕鏈。 11.1.2 T84.66 IgG之不同人類化變異體與細胞之結合 在表現CEA之人類胃腺癌細胞(MKN45，DSMZ ACC 409)上測試T84.66 IgG之不同人類化變異體之結合。 收集細胞，計數，檢驗活力且以2×106 個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(100 μl PBS 0.1% BSA)中。100 µl細胞懸浮液(含有0.2x106 個細胞)在圓底96孔盤中，在4℃下，在遞增濃度之CEA IgG (4 ng/ml至60 μg/ml)下培育30分鐘，用冷PBS 0.1% BSA洗滌兩次，在4℃型與PE結合之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab #109-116-170)一起再培育30分鐘，用冷PBS 0.1% BSA洗滌兩次且立即使用FACS CantoII (Software FACS Diva)藉由FACS進行分析。使用GraphPadPrism5獲得及計算結合曲線及EC50值。圖 39 展示所選擇之T84.66 IgG之人類化變異體與表現於MKN45細胞上之人類CEA之不同結合模式。基於所計算之EC50結合值(表 80 )，選擇人類化變異體1用於進一步評估。 表80：T84.66 IgG之不同人類化變異體與細胞之結合(EC50值，基於圖39中所展示之結合曲線，藉由Graph Pad Prism計算)。
EC50 (µg/ml)
親本嵌合T84.66 0.99
人類化變異體1 1.5
人類化變異體2 8.6
人類化變異體3 1.4
人類化變異體4 3.1
人類化變異體5 -
人類化變異體6 -
人類化變異體1在下文中稱為T84.66-LCHA。其CDR及VH及VL之胺基酸序列以及親本嵌合T84.66純系之VH及VL結構域之胺基酸序列展示於表81中。 表81：CEA純系T84.66-LCHA及其親本抗體T84.66之可變結構域之胺基酸序列
說明 序列 SEQ ID NO:
CEA CDR-H1 DTYMH 321
CEA CDR-H2 RIDPANGNSKYVPKFQG 322
CEA CDR-H3 FGYYVSDYAMAY 323
CEA CDR-L1 RAGESVDIFGVGFLH 324
CEA CDR-L2 RASNRAT 325
CEA CDR-L3 QQTNEDPYT 326
親本CEA結合子VH EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSS 327
親本CEA結合子VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIK 328
人類化CEA結合子CEA (T84.66-LCHA) VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS 329
人類化CEA結合子CEA (T84.66-LCHA) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK 330
11.2 製備CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子 根據Uniprot資料庫之P41273序列(SEQ ID NO:42)合成編碼人類4-1BB配位體之胞外域之一部分(胺基酸71-254及71-248)的DNA序列之不同片段。 11.2.1 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.1) 如圖 29A 中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。如圖29B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，K147E及K213E。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66-LCHA。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CEA-Fc孔鏈及抗CEA輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CEA結合Fab (圖 40 ，構築體5.1)。表 82 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.1)之cDNA及胺基酸序列。 表82：含有CH-CL交叉及帶電殘基之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(構築體5.1)之cDNA及胺基酸序列。*表示帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
129 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
130 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
331 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔鏈 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
332 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGTAGAGCCGGCGAGAGCGTGGACATCTTCGGCGTGGGATTTCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACAGAGCCAGCAACCGGGCCACAGGCATCCCCGCCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGACCAACGAGGACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
115 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
116 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
333 抗CEA (T84.66-LCHA) Fc孔鏈 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
334 抗CEA (T84.66-LCHA)輕鏈 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
11.2.2 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.2) 與如圖(29A)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽，但在CL結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。與如圖(29B)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽，但在CH1結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH1。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66-LCHA。 根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CEA-Fc孔鏈及抗CEA輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CEA結合Fab (圖40，構築體5.2)。表 83 展示含有交叉CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.2)之cDNA及胺基酸序列。 表83：含有CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(構築體5.2)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
165 核苷酸序列二聚配位體(71-254)- CL Fc結鏈 參見表22
166 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1 參見表22
331 核苷酸序列抗CEA (T84.66-LCHA) Fc孔鏈 參見表82
332 核苷酸序列抗CEA (T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
117 二聚配位體(71-254) - CL Fc結鏈 參見表22
118 單體配位體(71-254) -CH1 參見表22
333 抗CEA (T84.66-LCHA) Fc孔鏈 參見表82
334 抗CEA (T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
11.2.3 製備二價CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合(構築體5.3) 含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)之多肽與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合，如圖29C中所描繪：人類IgG1 Fc孔、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合之多肽，如圖29D中所描述：人類IgG1 Fc結、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。 在具有孔、結之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66-LCHA。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CEA huIgG1孔二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗CEA huIgG1結單體配位體鏈及抗CEA輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個CEA結合Fab (圖40，構築體5.3)。表 84 展示二價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.3)之cDNA及胺基酸序列。 表84：二價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)PGLALA融合物(構築體5.3)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
335 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔二聚4-1BBL (71-254)鏈 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
336 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA) Fc結單體41-BBL (71-254) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
332 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
337 抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔二聚41-BBL (71-254)鏈 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
338 抗CEA(T84.66-LCHA) Fc結單體4-1BBL (71-254)鏈 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
334 抗CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
11.2.4 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.4) 如圖29A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。與圖29B中所描述類似地選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 在具有結上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域之框架中次選殖編碼與人類CL結構域融合之二聚4-1BB配位體的多肽(Merchant, Zhu等人 1998)。為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，K147E及K213E。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66-LCHA。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19-Fc孔鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CEA結合Fab (圖 40 ，構築體5.4)。表 85 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.4)之cDNA及胺基酸序列。 表85：含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體5.4)之cDNA及胺基酸序列。*帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
169 核苷酸序列二聚配位體(71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
170 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 參見表24
331 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔鏈 參見表82
332 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
119 二聚配位體(71-248) - CL* Fc結鏈 參見表24
120 單體配位體(71-248)-CH1* 參見表24
333 抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔鏈 參見表62
334 抗CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 參見表59
11.2.5 製備具有交叉CH1-CL結構域(無帶電殘基)之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.5) 與如圖(29A)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽，但在CL結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。與如圖(29B)中所描繪類似地選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽，但在CH1結構域中不存在胺基酸突變：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH1。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66-LCHA。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CEA-Fc孔鏈及抗CEA輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CD19合Fab (圖40，構築體5.5)。表 86 展示含有交叉CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.5)之cDNA及胺基酸序列。 表86：含有CH-CL交叉物(無帶電殘基)之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體5.5)之cDNA及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 說明 序列
171 核苷酸序列二聚配位體(71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
172 核苷酸序列單體配位體(71-248)-CH1 參見表25
331 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔鏈 參見表82
332 核苷酸序列抗CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
173 二聚配位體(71-248) - CL Fc結鏈 參見表25
174 單體配位體(71-248)-CH1 參見表25
333 抗CEA(T84.66-LCHA) Fc孔鏈 參見表82
334 抗CEA(T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
11.2.6 製備二價CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合(構築體5.6) 含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)之多肽與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合，如圖 29C 中所描繪：人類IgG1 Fc孔、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合之多肽，如圖29D中所描述：人類IgG1 Fc結、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。 在具有孔、結之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66-LCHA。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CEA huIgG1孔二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗CEA huIgG1結單體配位體鏈及抗CEA輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個CEA結合Fab (圖40，構築體5.6)。表 87 展示二價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.6)之cDNA及胺基酸序列。 表87：二價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(構築體5.6)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
339 核苷酸序列抗CEA (T84.66-LCHA) Fc孔二聚4-1BBL (71-248)鏈 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCAGGCCTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCCGACGATCCCGCTGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGCATGTTCGCTCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCAGCAGGGGCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCCCAGCTTCTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCAGCCGGGCTC
340 核苷酸序列抗CEA (T84.66-LCHA) Fc結單體(71-248) 4-1BBL鏈 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTGCCGGGCTC
332 核苷酸序列抗CEA (T84.66-LCHA)輕鏈 參見表82
341 抗CEA (T84.66-LCHA) Fc孔二聚4-1BBL (71-248)鏈 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
342 抗CEA (T84.66-LCHA) Fc結單體 (71-248) 4-1BBL鏈 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
334 抗CD19(8B8-018)輕鏈 參見表82
11.2.7 製備具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價CEA (T84.66)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.7) 如圖29A中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。如圖29B中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，K147E及K213E。 在具有孔之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、經靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CD19-Fc孔鏈及抗CD19輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及CEA結合Fab。構築體5.7對應於構築體5.1，如圖 40 中所示。表 88 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CEA (T84.66)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.7)之cDNA及胺基酸序列。 表88：含有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CEA (T84.66)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(構築體5.7)之cDNA及胺基酸序列。*表示帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
129 核苷酸序列二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
130 核苷酸序列單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
343 核苷酸序列抗CEA(T84.66) Fc孔鏈 GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAACTGGTGGAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGTACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCAGCAGCAACACAGCCTACCTGCAGCTGACCAGCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
344 核苷酸序列抗CEA(T84.66)輕鏈 GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCTCTCTGGCCGTGTCTCTGGGACAGAGGGCCACCATGTCTTGCAGAGCCGGCGAGAGCGTGGACATCTTCGGCGTGGGATTTCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGAGCCAGCAACCTGGAAAGCGGCATCCCCGTGCGGTTTAGCGGCACCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGATCATCGACCCCGTGGAAGCCGACGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAACGAGGACCCCTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
115 二聚hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc結鏈 參見表3
116 單體hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 參見表3
345 抗CEA (T84.66) Fc孔鏈 EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
346 抗CEA (T84.66)輕鏈 DIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
11.2.8 製備二價CEA (T84.66)靶向之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.8) 含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)之多肽與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合，如圖29C中所描繪：人類IgG1 Fc孔、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合之多肽，如圖29D中所描述：人類IgG1 Fc結、(G4S)2 連接子、人類4-1BB配位體。 在具有孔、結之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對CEA具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，純系T84.66。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗CEA huIgG1孔二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗CEA huIgG1結單體配位體鏈及抗CEA輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個CEA結合Fab。構築體5.8對應於構築體5.3，如圖 40 中所示。表 89 展示二價CEA (T84.66)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體5.8)之cDNA及胺基酸序列。 表89：二價CEA (T84.66)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)PGLALA融合物(構築體5.8)之cDNA及胺基酸序列
SEQ ID NO: 說明 序列
347 核苷酸序列抗CEA(T84.66) Fc孔二聚4-1BBL (71-254)鏈 GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAACTGGTGGAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGTACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCAGCAGCAACACAGCCTACCTGCAGCTGACCAGCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
348 核苷酸序列抗CEA(T84.66) Fc結單體4-1BBL (72-254)鏈 GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAACTGGTGGAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGTACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCAGCAGCAACACAGCCTACCTGCAGCTGACCAGCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
344 核苷酸序列抗CEA(T84.66)輕鏈 參見表88
349 抗CEA(T84.66) Fc孔二聚4-1BBL(71-254)鏈 EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
350 抗CEA(T84.66) Fc結單體4-1BBL (71-254)鏈 EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
346 抗CEA(T84.66)輕鏈 參見表88
11.3 製備未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合物及人類IgG作為對照分子 11.3.1 製備未靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(對照分子) 如上文關於CEA靶向之構築體3.1 (稱為對照物B)、3.3 (稱為對照物C)、3.4 (稱為對照物D)及3.5 (稱為對照物E)所描述製備此等對照分子，唯一不同之處在於抗CD19結合子(VH-VL)由不結合於抗原之稱為DP47之生殖系對照物置換(參見圖40)。對照物B (含有交叉CH-CL及帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物)之cDNA及胺基酸序列展示於以上表 68 中(參見實例7.3.1)。表 69 展示二價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(對照物C)之cDNA及胺基酸序列。表 70 展示含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(對照物D)之cDNA及胺基酸序列。表 71 展示在CH-CL交叉物中不含帶電殘基之單價DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(對照物E)之cDNA及胺基酸序列。 11.3.2 作為對照分子之抗體 分析中使用之另一對照物(稱為對照物F)為未靶向之DP47、生殖系對照物、人類IgG1，其含有Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。對照物F之cDNA及胺基酸序列可見於以上表 73 中。 11.4 製備CEA靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合抗原結合分子及其對照分子 將靶向及未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原結合分子編碼序列選殖入質體載體，該質體載體驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於在CDS之3'端處的合成polyA序列。此外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 藉由聚伸乙基亞胺共轉染HEK293-EBNA細胞及哺乳動物表現載體來產生分裂型三聚4-1BB配位體Fc(kih)融合物。用相應的表現載體轉染細胞。關於變異體1、2、4、5及其對照物B、D及E，以1:1:1:1比率(「載體二聚配位體-CL-結鏈」:「載體單體配位體融合物-CH1」:「載體抗CEA Fab-孔鏈」:「載體抗CEA鏈」)。關於變異體3、6及其對照物C，以1:1:1比率(「載體huIgG1 Fc孔二聚配位體鏈」:「載體huIgG1 Fc結單體配位體鏈」:「載體抗CEA輕鏈」)。與雙特異性構築體相同地產生人類IgG，在分析中用作對照物(關於轉染，以1:1比率僅使用輕鏈之一個載體及重鏈之一個載體)。 關於在500 mL搖瓶中製備，在轉染之前24小時接種3億個HEK293 EBNA細胞。對於轉染，細胞在210×g下離心10分鐘，且用20 mL預溫熱CD CHO培養基置換上清液。在20 mL CD CHO培養基中混合表現載體(200 μg完全DNA)。在添加540 μL PEI之後，溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加補充有6 mM L-麩醯胺酸、5 g/L PEPSOY及1.2 mM丙戊酸之160 mL Excell培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加12% Feed (胺基酸及葡萄糖)。在培養7天之後，藉由在至少400×g下離心30-40分鐘來收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由使用蛋白質A進行之親和層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物以及IgG。對於親和層析，上清液裝載於用磷酸鈉(20 mM)、檸檬酸鈉(20 mM)緩衝液(pH 7.5)平衡之MabSelect Sure管柱(CV=5-15 mL，來自GE Healthcare之樹脂)上。藉由用至少6倍管柱體積之相同緩衝液洗滌來移除未結合之蛋白質。用20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸緩衝液(pH 3.0)，使用線性梯度(20 CV)或分步溶離(8 CV)來溶離結合之蛋白質。對於線性梯度，應用額外的4倍管柱體積分步溶離。 藉由添加1/10 (v/v) 0.5 M磷酸鈉，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。在裝載於用20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉、0.01% (v/v)Tween20溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質。 藉由量測280 nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來測定蛋白質濃度。藉由在存在及不存在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)之情況下進行SDS-PAGE且用Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA)染色或使用Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer)進行之CE-SDS來分析經靶向之三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原結合分子之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析樣品之聚集物含量。表 90 概述CEA靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合抗原結合分子之產量及最終單體含量。 表90：CEA靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之生物化學分析
構築體 單體 [%]      (SEC) 產量          [mg/l]
單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之含有CH-CL交叉物及帶電殘基之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc融合物(構築體5.4) 98 1.4
二價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-248)Fc融合物(構築體5.6) 98 0.4
單價CEA (T84.66)靶向之含有CH-CL交叉物及帶電殘基之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc融合物(構築體5.7) 97 15
二價CEA (T84.66)靶向之分裂型三聚4-1BB配位體(71-254)Fc融合物(構築體5.8) 96 2
表 91 概述DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合分子(單價(對照物B、D及E)及二價(對照物C))及生殖系DP47人類IgG1 PGLALA (對照物F)之產量及最終單體含量。 表91：DP47未靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之生物化學分析
構築體 單體 [%]      (SEC) 產量          [mg/l]
單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(對照物B) 99 15.4
二價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(對照物C) 98 12.6
單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(對照物D) 99.5 25.9
單價DP47未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物(對照物E) 93.3 4.1
生殖系DP47人類IgG1 PGLALA 100 50
實例12CEA 靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之功能性表徵 12.1 表面電漿子共振(同時結合)製備 hu NA3B3A2 作為 CEA 靶向之三聚分裂型 4-1BBL 構築體之抗原 與關於NABA所描述(Durbin H.等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 1994年5月10日;91(10):4313-7)類似，用於評估SPR與CEA之結合之抗原為由來自人類CEACAM5 (CEA)之A3及B3結構域以及來自人類CEACAM1 (BGP1)之N及A2結構域組成之雜交分子。此處該抗原稱為NA3B3A2且示意性說明可見於圖 41A 中。表 92 展示hu NA3B3A2-avi-His之核苷酸及胺基酸序列。 表92：hu NA3B3A2-avi-His之核苷酸及胺基酸序列
SEQ ID NO: 抗原 序列
351 核苷酸序列hu NA3B3A2-avi His CAGCTGACCACCGAGTCCATGCCCTTCAACGTGGCCGAGGGCAAAGAGGTGCTGCTGCTGGTCCACAACCTGCCCCAGCAGCTGTTCGGCTACAGCTGGTACAAGGGCGAGCGGGTGGACGGCAACCGGCAGATCGTGGGCTACGCCATCGGCACCCAGCAGGCCACACCCGGCCCTGCCAATAGCGGCAGAGAGACAATCTACCCCAACGCCAGCCTGCTGATCCAGAACGTGACCCAGAACGACACCGGCTTCTACACACTCCAAGTCATCAAGAGCGACCTGGTCAACGAGGAAGCCACCGGCCAGTTCCACGTGTACCCCGAGCTGCCCAAGCCCAGCATCAGCAGCAACAACAGCAAGCCCGTGGAAGATAAGGACGCCGTGGCCTTTACCTGCGAGCCCGAGGCCCAGAACACCACCTACCTGTGGTGGGTCAACGGCCAGAGCCTGCCCGTGTCCCCCAGACTCCAGCTGAGCAACGGCAACAGAACCCTGACCCTGTTCAACGTGACCCGGAATGACGCCAGAGCCTACGTGTGCGGCATCCAGAACAGCGTGTCCGCCAACCGCAGCGACCCCGTGACCCTGGATGTGCTGTACGGCCCCGACACCCCCATCATCAGCCCCCCTGACAGCAGCTACCTGAGCGGCGCCAACCTGAACCTGAGCTGCCACAGCGCCAGCAACCCCAGCCCTCAGTACAGCTGGCGGATCAACGGCATCCCCCAGCAGCACACCCAGGTGCTGTTTATCGCCAAGATCACCCCCAACAACAACGGCACCTACGCCTGCTTCGTGTCCAACCTGGCCACCGGCCGGAACAACAGCATCGTGAAGTCCATCACCGTGTCCGCCTCCCTGAGCCCCGTGGTGGCCAAGCCTCAGATCAAGGCCAGCAAGACCACCGTGACCGGCGACAAGGACAGCGTGAACCTGACCTGCTCCACCAACGATACCGGCATCAGCATCCGGTGGTTCTTCAAGAATCAGTCCCTGCCCAGCAGCGAGCGGATGAAGCTGAGCCAGGGCAACATCACCCTGTCCATCAACCCCGTGAAAAGAGAGGACGCCGGCACCTATTGGTGCGAGGTGTTCAACCCCATCAGCAAGAACCAGAGCGACCCCATCATGCTGAACGTGAACTACAACGCCCTGCCCCAAGAAAACCTGATCAATGTTGATCTGGAAGTGCTGTTCCAGGGCCCAGGCAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAAGCCCAGAAAATCGAGTGGCACGAGGCCAGAGCCCACCACCACCATCACCAC
352 人類NA3B3A2-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASLSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDLEVLFQGPGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHHHHHH
如上文關於Fc-融合蛋白質(實例7.1.1)所描述進行蛋白質製備。藉由螯合層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物上清液純化分泌之蛋白質。在於20 mM磷酸鈉、500 nM氯化鈉，pH 7.4中平衡之NiNTA Superflow濾筒(5 ml，Qiagen)上進行第一層析步驟。藉由經12倍管柱體積施用5%至45%溶離緩衝液(20 mM磷酸鈉、500 nM氯化鈉、500 mM咪唑，pH 7.4)之梯度來進行溶離。 將蛋白質進行濃縮且過濾，隨後加載至經20 mM組胺酸、140 mM NaCl、0.01% Tween-20 pH 6.0平衡的HiLoad Superdex 75管柱(GE Healthcare)上。表 93 概述人類NA3B3A2-avi-His之產量及最終單體含量。 表93：人類NA3B3A2-avi-His之生物化學分析
構築體 單體[%] (SEC) 產量 [mg/l]
人類NA3B3A2-avi-His 88 14.1
藉由表面電漿子共振(SPR)評估同時結合人類4-1BB Fc (kih)及人類NA3B3A2之能力。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20, Biacore, Freiburg/Germany)來進行。生物素化人類4-1BB Fc (kih)與抗生蛋白鏈菌素(SA)感測器晶片之流動細胞直接偶合。使用至多250個共振單元(RU)之固定程度。 CEA靶向之三聚分裂型4-1BBL構築體(構築體5.4、5.6、5.7及5.8)以200 nM之濃度範圍，以30微升/分鐘之流動速率，經由流動細胞經90秒傳遞且解離設定成零秒。以500 nM之濃度，以30微升/分鐘之流動速率，經由流動細胞經90秒注射人類NA3B3A2作為第二分析物(圖 41B )。監測解離120秒。藉由減去在參考流動細胞(其中未固定蛋白質)中獲得之反應來校正整體折射率差異。 如在圖 42 之圖式中可見，所有雙特異性構築體可同時結合人類4-1BB及人類NA3B3A2。 12.2. CEA靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子之經活化之人類PMBC上之結合 為了測定含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子與人類PBMC之結合，不同滴定濃度之CEA靶向之含有4-1BBL三聚體之Fc融合抗原結合分子用於如實例5.2中所描述之分析中。圖 43 分別展示經活化之表現4-1BB之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上如實例11中製備之構築體5.4、5.6、5.7及5.8之結合。在活CD45+ CD3+ CD4+或CD45+ CD3+ CD8+ T細胞上設置閘門且針對經靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合變異體之滴定濃度點漬PE結合之AffiniPure抗人類IgG IgG Fcγ-片段特異性山羊F(ab')2片段之MFI。表 94 展示構築體5.4、5.6、5.7及5.8以及對照分子之所量測之EC50 值。 表94：經活化之表現4-1BB之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之結合
構築體 EC50 [nM] 4-1BB+ CD8+ EC50 [nM] 4-1BB+ CD4+
對照物B 0.05 0.26
對照物C 0.02 0.30
對照物D 0.04 0.28
對照物E 0.13 1.22
5.4 0.13 0.35
5.6 0.06 0.34
5.7 0.0004 0.36
5.8 0.17 0.38
12.2 與表現CEA之腫瘤細胞之結合 關於表現CEA之腫瘤細胞上之結合分析，使用以下表現人類CEA之淋巴瘤細胞株：表現CEA之腫瘤細胞株人類胃癌細胞株MKN-45 (ATCC TCP-1008)及人類結腸直腸腺癌細胞株LS180 (ATCC-187)。如關於實例5.3中之表現FAP之MV-3及WM-266-4腫瘤細胞株所描述進行分析。 在活腫瘤細胞上設置閘門且針對經靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc融合構築體之滴定濃度點漬PE結合之AffiniPure抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊F(ab')2片段之MFI。圖 44 展示如實例11.2.7中製備之構築體5.7與表現人類CEA之人類胃細胞株MKN-45 (左側)及人類結腸直腸腺癌細胞株LS180 (右側)之結合。表 95 展示表現人類CEA之人類胃細胞株MKN-45之所量測之EC50 值。 表95：與表現CEA之腫瘤細胞之結合
構築體 EC50 [nM] MKN45-8 EC50 [nM] LS180
5.7 11.6 14.4
實例13CEA 靶向之含有 4-1BB 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之生物活性 13.1. 表現人類4-1BB之HeLa細胞中之NF-κB活化 如實例6.1中所描述產生表現人類4-1BB及NF-κB-螢光素酶之HeLa細胞。與表現 CEA 之 腫瘤細胞共同培養之表現人類 4-1BB 之 HeLa 細胞 中之 NF-κB 活化 收集NF-κB-螢光素酶人類4-1BB HeLa細胞且再懸浮於供應有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I之DMEM培養基中達到0.2×106 個細胞/毫升之濃度。此細胞懸浮液之100 μl(2×104 個細胞)轉移至具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio-one，目錄號655083)之各孔中且盤在37℃及5% CO2 下培育隔夜。第二天，添加50 μL含有滴定濃度之CEA靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(CEA分裂型4-1BBL三聚體)或DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體)之培養基。表現CEA之腫瘤細胞株人類胃癌細胞株MKN-45 (ATCC TCP-1008)再懸浮於供應有10% (v/v)FBS及1% (v/v)GlutaMAX-I之DMEM培養基中達到2×106 個細胞/毫升之濃度。 將表現CEA之B細胞淋巴瘤細胞(50 µl，最終比率1:5)之懸浮液或僅培養基添加至各孔中且培養盤在37℃及5% CO2 下培育6小時。細胞用200微升/孔DPBS洗滌兩次。40 µl新近製備之報導子溶解緩衝液(Promega，目錄號：E3971)添加至各孔中且盤在-20℃下儲存隔夜。第二天，冷凍細胞盤及偵測緩衝液(Luciferase 1000分析系統，Promega，目錄號E4550)在室溫下解凍。100 μL偵測緩衝液添加至各孔中且使用SpectraMax M5/M5e微板讀取器及以URL計數發光之SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)(釋放光之單元，0.5秒/孔)或Victor3 1420多標記計數盤讀取器(Perkin Elmer)及以計數/秒(CPS)來計數發光之Perkin Elmer 2030 Manager軟體儘可能快地量測螢光素酶活性，且針對所測試之構築體之濃度進行點漬。 CEA靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合抗原結合分子構築體5.7及5.8在人類胃癌細胞株MKN-45細胞存在下觸發報導子細胞株中NF-kB信號傳導路徑之活化。相比之下，未靶向之對照分子在任一測試濃度下皆未觸發此作用(圖45)。表96展示相應EC50值。 表96：與表現CEA之腫瘤細胞之結合
構築體 EC50 [nM] MKN-45 無腫瘤細胞 EC50 [nM] MKN45   
5.4 3.1 0.34
5.6 2.05 0.21
5.7 0.85 0.05
5.8 1.52 0.45
實例14 14.1 FAP靶向之含有OX40配位三聚體之Fc融合抗原結合分子之製備 根據Uniprot資料庫之P23510序列合成編碼人類OX40配位體之胞外域之一部分(胺基酸51-183)的DNA序列。為了降低由糖基化引起之人類Ox40配位體之異質性，位置90及114之天冬醯胺酸殘基藉由定點誘變突變成天冬胺酸(根據Compaan D.M., Hymowitz S.G., Structure (2006) 14(8), 1321-30)。 如圖 46A 中所描繪選殖含有OX40配位體之兩個胞外域(由(G4S)2 連接子分隔)且與人類IgG1-CL結構域融合之多肽：人類OX40配位體、(G4S)2 連接子、人類OX40配位體、(G4S)2 連接子、人類CL。 如圖 46B 中所描述選殖含有OX40配位體之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類OX40配位體、(G4S)2 連接子、人類CH。 為了改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，K147E及K213E。 FAP結合子之產生及製備描述於WO 2012/020006 A2中，其以引用之方式併入本文中。 在具有人類IgG1之孔之恆定重鏈或恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對FAP特異性之結合子之重鏈及輕鏈可變區之DNA序列，純系28H11。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入結及孔重鏈之恆定區中以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP-Fc孔鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚OX40配位體及FAP結合Fab (圖 46C ，構築體6.1)。表 97 展示具有交叉CH-CL及帶電殘基之單價CEA (T84.66-LCHA)靶向之分裂型三聚OX40配位體(51-183) Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體6.1)之cDNA及胺基酸序列。 表97：含有CH-CL交叉及帶電殘基之單價FAP (28H1)靶向之分裂型三聚OX40配位體Fc (kih)融合物(構築體6.1)之cDNA及胺基酸序列。*表示帶電殘基
SEQ ID NO: 說明 序列
353 核苷酸序列二聚hu OX40L (51-183) - CL* Fc結鏈 CAGGTGTCCCACAGATACCCCAGAATCCAGAGCATCAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTCATCCTGACCAGCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGGACAACAGCGTGATCATCAACTGCGACGGCTTCTACCTGATCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGGACATCAGCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAGCCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATTCACCAGAACCCCGGCGAGTTCTGCGTGCTGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGATCTCAGGTGTCACACCGCTACCCCCGGATTCAGTCCATTAAGGTGCAGTTTACAGAGTATAAGAAAGAAAAAGGCTTTATTCTGACTTCCCAGAAAGAAGATGAGATTATGAAGGTGCAGGATAATTCTGTGATCATCAATTGTGACGGCTTCTACCTGATCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGGACATCAGCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAGCCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGTTCTGCGTGCTGGGAGGCGGAGGCTCCGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTTATCTTCCCACCCAGCGACCGGAAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
354 核苷酸序列單體hu OX40L (51-183) - CH1* CAGGTGTCCCACAGATACCCCAGAATCCAGAGCATCAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTCATCCTGACCAGCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGGACAACAGCGTGATCATCAACTGCGACGGCTTCTACCTGATCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGGACATCAGCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAGCCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATTCACCAGAACCCCGGCGAGTTCTGCGTGCTGGGAGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGGAAGATTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGC
68 核苷酸序列抗FAP(28H1) Fc孔鏈 參見表2
69 核苷酸序列抗FAP(28H1)輕鏈 參見表2
355 二聚hu OX40L (51-183)  - CL* Fc結鏈 QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQDNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVDISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQDNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVDISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
356 單體hu OX40L (51-183) - CH1* QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQDNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVDISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC
18 抗FAP(28H1) Fc孔鏈 參見表2
19 抗FAP(28H1)輕鏈 參見表2
14.2 製備作為對照物F之未靶向之人類IgG1 根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中描述之方法，分析中使用之對照分子(稱為對照物F (圖 46D ))為未靶向之DP47、生殖系對照物、人類IgG1，其含有Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。其製備方法描述於實例2.3中，表 29 展示未靶向之DP47 huIgG1 PGLALA (對照物F)之cDNA及胺基酸序列之cDNA及胺基酸序列。 14.3 製備FAP靶向之分裂型三聚OX40配位體Fc融合抗原結合分子及其對照分子 將靶向及未靶向之分裂型三聚OX40配位體Fc (kih)融合物編碼序列選殖入質體載體，該質體載體驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於在CDS之3'端處的合成polyA序列。此外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 藉由聚伸乙基亞胺共轉染HEK293-EBNA細胞及哺乳動物表現載體來產生分裂型三聚Ox40配位體Fc(kih)融合物。用相應的表現載體轉染細胞。關於變異體1、2、4、5及其對照物B、D及E，以1:1:1:1比率(「載體二聚配位體-CL-結鏈」:「載體單體配位體融合物-CH1」:「載體抗FAP Fab-孔鏈」:「載體抗FAP鏈」)。關於變異體3、6及其對照物C，以1:1:1比率(「載體huIgG1 Fc孔二聚配位體鏈」:「載體huIgG1 Fc結單體配位體鏈」:「載體抗FAP輕鏈」)。與雙特異性構築體相同地產生人類IgG，在分析中用作對照物(關於轉染，以1:1比率僅使用輕鏈之一個載體及重鏈之一個載體)。 關於在500 mL搖瓶中製備，在轉染之前24小時接種3億個HEK293 EBNA細胞。對於轉染，細胞在210×g下離心10分鐘，且用20 mL預溫熱CD CHO培養基置換上清液。在20 mL CD CHO培養基中混合表現載體(200 μg完全DNA)。在添加540 μL PEI之後，溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加補充有6 mM L-麩醯胺酸、5 g/L PEPSOY及1.2 mM丙戊酸之160 mL Excell培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加12% Feed (胺基酸及葡萄糖)。在培養7天之後，藉由在至少400×g下離心30-40分鐘來收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由使用蛋白質A進行之親和層析，接著進行尺寸排阻層析自細胞培養物純化分裂型三聚OX40配位體Fc (kih)融合抗原結合分子以及IgG。對於親和層析，上清液裝載於用磷酸鈉(20 mM)、檸檬酸鈉(20 mM)緩衝液(pH 7.5)平衡之MabSelect Sure管柱(CV=5-15 mL，來自GE Healthcare之樹脂)上。藉由用至少6倍管柱體積之相同緩衝液洗滌來移除未結合之蛋白質。用20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸緩衝液(pH 3.0)，使用線性梯度(20 CV)或分步溶離(8 CV)來溶離結合之蛋白質。對於線性梯度，應用額外的4倍管柱體積分步溶離。 藉由添加1/10 (v/v) 0.5 M磷酸鈉，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。在裝載於用20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉、0.01% (v/v)Tween20溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質。 藉由量測280 nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來測定蛋白質濃度。藉由在存在及不存在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)之情況下進行SDS-PAGE且用Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA)染色或使用Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer)進行CE-SDS來分析經靶向之三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析樣品之聚集物含量。表 98 概述FAP靶向之分裂型三聚Ox40配位體Fc (kih)融合抗原結合分子及生殖系DP47人類IgG1 PGLALA (對照物F)之產量及最終單體含量。 表98：CEA靶向之分裂型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之生物化學分析
構築體 單體 [%]      (SEC) 產量 [mg/l]
單價FAP(28H1)靶向之含有CH-CL交叉物及帶電殘基之分裂型三聚Ox40配位體Fc融合物 (構築體6.1) 93.8 19.7
生殖系DP47人類IgG1 PGLALA 100 50
實例15經靶向之含有 OX40 配位三聚體之 Fc 融合抗原結合分子之功能性表徵 15.1 與表現人類FAP之腫瘤細胞之結合 使用WM-266-4細胞(ATCC CRL-1676)測試與細胞表面FAP之結合。將0.5×105 個WM-266-4細胞添加至圓底懸浮細胞96孔培養盤(greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)之各孔中。細胞在4℃下，在黑暗中用50微升/孔含有經滴定之抗Ox40抗體構築體之4℃冷FACS緩衝液(DPBS (Gibco，Life Technologies，目錄號14190 326)及BSA (0.1% v/w，Sigma-Aldrich，目錄號A9418))染色120分鐘。在用過量FACS緩衝液洗滌三次之後，細胞在4℃下，在黑暗中在25微升/孔含有異硫氰酸螢光素(FITC)結合之AffiniPure抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊IgG F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109 096 098)之4℃冷FACS緩衝液中染色45分鐘。 最終，培養盤再懸浮於90微升/孔含有0.2 μg/mL DAPI (Santa Cruz Biotec，目錄號Sc-3598)之FACS緩衝液中且在同一天使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)獲取。 如圖 47A 中所示，單價FAP (28H1)靶向之分裂型三聚Ox40配位體Fc (kih)融合抗原結合分子(FAP-OX40L)而非陰性對照物F可有效結合於表現人類FAP之目標細胞。與FAP陽性WM-266-4之結合之EC50值為[6.9 nM]。 15.2 與OX40及FAP陰性腫瘤細胞之結合 使用表現NucLight Red螢光蛋白質之A549 NucLight™ Red細胞(Essenbioscience，目錄號4491)測試與OX40陰性FAP陰性腫瘤細胞之結合之缺乏，該NucLight Red螢光蛋白質受限於細胞核以允許自未標記之人類FAP陽性WM266-4細胞分離。根據標準Essen方案，親本A549 (ATCC CCL-185)在8 µg/ml凝聚胺存在下，用Essen CellPlayer NucLight Red Lentivirus (Essenbioscience，目錄號4476；EF1α、嘌呤黴素)在MOI為3 (TU/細胞)之情況下轉導。 5×104 個未標記之WM266 -4細胞及未標記之A549 NucLight™ Red細胞於FACS緩衝液中之混合物添加至圓底懸浮液細胞96孔培養盤之各孔中且如章節15.1中所描述進行結合分析。 如圖 47B 中所示，FAP-OX40L不結合於OX40陰性FAP陰性人類腫瘤細胞。 15.3 與表現人類OX40之細胞之結合：原生及經活化之人類周邊單核血液白細胞(PBMC) 自Zürich血液供給中心獲得白血球層。為了分離新鮮的周邊血液單核細胞(PBMC)，白血球層用相同體積之DPBS (Gibco，Life Technologies，目錄號14190 326)稀釋。提供50 mL聚丙烯離心管(TPP，目錄號91050)及15 mL Histopaque 1077 (SIGMA Life Science，目錄號10771，聚蔗糖及泛影酸鈉，調節至1.077 g/mL之密度)且經稀釋之白血球層溶液在Histopaque 1077上分層。試管在400×g下，在室溫下且在低加速度及不破裂情況下離心30分鐘。隨後，自界面收集PBMC，用DPBS洗滌三次且再懸浮於由以下組成之T細胞培養基中：供應有10%胎牛血清(FBS，Gibco，Life Technology，目錄號16000-044，批號941273，γ輻射、無黴漿菌且在56℃下熱不活化35分鐘)、1% (v/v)GlutaMAX I (GIBCO，Life Technologies，目錄號35050 038)、1 mM丙酮酸鈉(SIGMA，目錄號S8636)、1% (v/v)MEM非必需胺基酸(SIGMA，目錄號M7145)及50 µM β-巰基乙醇(SIGMA，M3148)之RPMI 1640培養基(Gibco，Life Technology，目錄號42401-042)。 PBMC在分離之後直接使用(休眠人類PBMC上之結合)或其經刺激以接收T細胞之細胞表面上之強人類Ox40表現(經活化之人類PBMC上之結合)。因此，原生PBMC在6孔組織培養盤中，在供應有200 U/mL普羅金(Novartis)及2 μg/mL PHA-L (Sigma-Aldrich，L2769-10)之T細胞培養基中培養四天，且接著在37℃及5% CO2 下，在供應有200 U/mL普羅金之T細胞培養基中，在經預先塗佈之6孔組織培養盤[4 μg/mL]抗人類CD3 (純系OKT3，eBioscience，目錄號16-0037-85)及[2 μg/mL]抗人類CD28 (純系CD28.2，eBioscience，目錄號16-0289-85]上培養隔夜。 關於Ox40之偵測，混合原生人類PBMC與經活化之人類PBMC。為了能夠區分原生PBMC與經活化之人類PBMC，使用eFluor670細胞增殖染料(eBioscience，目錄號65-0840-85)之結合分析之前標記原生細胞。 關於標記，收集細胞，用預溫熱(37℃)之DPBS洗滌且在DPBS中調節至1×107 個細胞/毫升之細胞密度。eFluor670細胞增殖染料(eBioscience，目錄號65-0840-85)添加至原生人類PBMC於DPBS中之懸浮液(最終濃度為2.5 mM且最終細胞密度為0.5×107 個細胞/毫升)中。接著細胞在室溫下，在黑暗中培育10分鐘。為了停止標記反應，添加4 mL熱不活化之FBS且細胞用T細胞培養基洗滌三次。接著將1×105 個休眠eFluor670標記之人類PBMC與0.5×105 個未標記之經活化之人類PBMC之2:1混合物添加至圓底懸浮細胞96孔培養盤(greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)之各孔中。 細胞在4℃下，在黑暗中，在50微升/孔含有經滴定之抗Ox40抗體構築體之4℃冷FACS緩衝液中染色120分鐘。在用過量FACS緩衝液洗滌三次之後，細胞在4℃下，在黑暗中，在25微升/孔含有螢光標記之抗人類CD4 (純系RPA-T4，小鼠IgG1 k，BioLegend，目錄號300532)、抗人類CD8 (純系RPa-T8，小鼠IgG1k，BioLegend，目錄號3010441)及異硫氰酸螢光素(FITC)結合之AffiniPure抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊IgG F(ab')2 片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-096-098)之混合物的4℃冷FACS緩衝液中染色45分鐘。 最終，培養盤再懸浮於90微升/孔含有0.2 μg/mL DAPI (Santa Cruz Biotec，目錄號Sc-3598)之FACS緩衝液中且在同一天使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)獲取。 如圖 48A 及48B 中所示，FAP-OX40L不結合於休眠人類CD4+ T細胞或CD8+ T細胞，該等細胞對OX40為陰性。相比之下，FAP-OX40L結合於表現OX40之經活化之CD8+或CD4+ T細胞。與CD4+ T細胞之結合顯著強於與CD8+ T細胞之結合。經活化之人類CD8+ T細胞僅表現在經活化之CD4+ T細胞上偵測之OX40含量之一部分。OX40之表現量取決於刺激之動力學及強度且此處，針對CD4+ T細胞而非CD8+ T細胞上之OX40表現來最佳化條件。因此，在CD8 T細胞上僅誘導極少OX40表現。與OX40陽性CD4+或CD8+ T細胞之結合之EC50值為[0.15 nM]。 15.4 表現人類OX40及報導基因NFκB-螢光素酶之HeLa細胞中之NFκB活化 Ox40與其配位體之促效結合經由核因子κB (NFκB)之活化誘導下游信號傳導(A. D. Weinberg等人, J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972)。產生重組型報導子細胞株HeLa_hOx40_NFkB_Luc1以在其表面上表現人類Ox40。此外，其具有受NFκB敏感性強化子片段控制之含有螢光素酶基因之報導子質體。Ox40觸發可誘導在細胞核中易位之NFκB之劑量依賴性活化，其中NFκB在報導子質體之NFκB敏感性強化子上結合以增加螢光素酶蛋白質之表現。螢光素酶催化螢光素-氧化，產生可發光之氧化螢光素。此可由光度計定量。因此，以量測生物活性形式來分析多種抗Ox40分子誘導HeLa_hOx40_NFkB_Luc1報導子細胞中之NFκB活化的能力。 在37℃下，使用細胞解離緩衝液(Invitrogen，目錄號13151-014)經10分鐘收集黏著性HeLa_hOx40_NFkB_Luc1細胞。細胞用DPBS洗滌一次且在包含MEM (Invitrogen，目錄號22561-021)、10% (v/v)熱不活化FBS、1 mM丙酮酸鈉及1% (v/v)非必需胺基酸之分析培養基中調節至1.33×105 個之細胞密度。細胞以0.2×105 個細胞/孔之密度在具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio-one，目錄號655083)中接種，且在培育箱(Hera Cell 150)中保持在37℃及5% CO2 下隔夜。 第二天，藉由添加含有經滴定之FAP-Ox40L或陰性對照物F之分析培養基將HeLa_hOx40_NFkB_Luc1刺激5小時。關於測試抗Ox40抗體上之過交聯作用，以1:2比率(二級抗體比初級抗體多2倍)添加25微升/孔含有二級抗體抗人類IgG Fcγ片段特異性山羊IgG F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，109-006-098)之培養基。在培育之後，抽出上清液且培養盤用DPBS洗滌兩次。根據製造商說明，使用螢光素酶100分析系統及報導子溶解緩衝液(皆來自Promega，目錄號E4550及目錄號E3971)進行發光之定量。簡言之，細胞藉由添加30微升/孔1×溶解緩衝液在-20℃下溶解10分鐘。細胞在37℃下解凍20分鐘，隨後添加90微升/孔螢光素酶分析試劑。立即藉由SpectraMax M5/M5e微板讀取器(Molecular Devices, USA)使用500 ms積分時間定量發光，無任何過濾器收集所有波長。所發射之相關光單元(URL)藉由HeLa_hOx40_NFkB_Luc1細胞之基本螢光校正且使用Prism4 (GraphPad Software, USA)針對對數初級抗體濃度點漬。使用嵌入式S形劑量反應擬合曲線。 如圖 49 中所示，已藉由向報導子細胞株中添加FAP-Ox40L (左側)來誘導有限、劑量依賴性NFkB活化。藉由抗人類IgG特異性二次抗體之FAP-Ox40L之過交聯以濃度依賴性方式增加NFκB介導之螢光素酶活化之誘導(右側)。 因此，吾人用藉由FAP+腫瘤細胞株進行之構築體之過交聯來測試FAP-Ox40L之NFkB活化能力。 所測試之腫瘤細胞株為NIH/3T3-huFAP純系39。藉由在1.5 μg/mL下用表現載體pETR4921轉染小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞株(ATCC CRL-1658)以表現huFAP來產生NIH/3T3-huFAP純系39。嘌呤黴素選擇。根據製造商說明使用Quifikit (Dako目錄號K0078)定量FAP之表面表現。用於偵測細胞表面FAP表現之初級抗體為人類/小鼠交叉反應性純系F11-24 (小鼠IgG1，Calbiochem，目錄號OP188)。NIH/3T3-huFAP純系39上之表面表現為約90000 huFAP/細胞。 如上文中所描述，黏著性HeLa_hOx40_NFkB_Luc1細胞以0.2×105 個細胞/孔之細胞密度培養隔夜且用含有經滴定之FAP-Ox40L之分析培養基刺激5小時。為了測試藉由細胞表面FAP結合進行之過交聯之作用，25微升/孔含有FAP+腫瘤細胞NIH/3T3-huFAP純系39之培養基以3:1比率(每個孔中FAP+腫瘤細胞比報導子細胞多三倍)共同培養。藉由使用螢光素酶100分析系統及報導子溶解緩衝液(皆來自Promega，目錄號E4550及目錄號E3971)量測發光來定量經活化之NFκB。 如圖50A 中所示，當添加FAP-Ox40L時，存在表現FAP之腫瘤細胞可顯著提高NFκB介導之螢光素酶活化之誘導。定量各別點漬之劑量反應曲線之曲線下面積作為各構築體之促效能力之標記物。如圖 50A 中所示，存在呈現FAP之細胞表面可確保較高交聯且因此確保FAP-Ox40L之較好促效作用，由此添加Fc特異性二級抗體。 15.5 OX40介導之次最佳化TCR觸發之休眠人類PBMC及藉由細胞表面FAP進行之過交聯之共刺激 實例15.4中展示，添加FAP+腫瘤細胞可藉由提供OX40受體之強寡聚作用而顯著增加人類Ox40陽性報導子細胞株中由FAP靶向之OX40L誘導之NFkB活性。類似地，吾人測試FAP-OX40L構築體在NIH/3T3-huFAP純系39細胞存在下解救休眠人類PBMC細胞之次最佳化TCR刺激之能力。 人類PBMC製劑含有(1)休眠Ox40陰性CD4+及CD8+ T細胞及(2)在細胞表面上具有多種Fc-γ受體之分子之抗原呈現細胞，例如B細胞及單核細胞。人類IgG1同型之抗人類CD3抗體可藉由其Fc部分結合於本發明之Fc-γ受體分子且介導休眠Ox40陰性CD4+及CD8+ T細胞上之延長TCR活化。接著，此等細胞開始在若干小時內表現Ox40。針對Ox40之功能性促效化合物可經由經活化之CD8+及CD4+T細胞上呈現之Ox40受體進行信號傳導及支持TCR介導之刺激。 休眠的經CFSE標記之人類PBMC用次最佳濃度之抗CD3抗體在輻射FAP+NIH/3T3-huFAP純系39細胞及經滴定之FAP-Ox40L存在下刺激五天。藉由流動式細胞測量術，經由監測總細胞計數及活細胞中之CFSE稀釋來分析對T細胞存活及增殖之作用。 在37℃下，使用細胞解離緩衝液(Invitrogen，目錄號13151-014)經10分鐘收集小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3-huFAP純系39細胞(參見實例15.4)。細胞用DPBS洗滌一次。NIH/3T3-huFAP純系39細胞在培育箱(Hera Cell 150)中，在37℃及5% CO2 下，在無菌96孔圓底黏著組織培養盤(TPP，目錄號92097)中之T細胞培養基中以0.2×105 個細胞/孔之密度培養隔夜。第二天，其在xRay輻射器中使用4500 RAD之劑量輻射以防止稍後由腫瘤細胞株引起之人類PBMC之過度生長。 如實例15.3中所描述藉由菲科爾(ficoll)密度離心來分離人類PBMC。接著在37℃下，藉由CFDA-SE (Sigma-Aldrich，目錄號2188)用CFSE 以1x106 個/毫升之密度，以[50 nM]之最終濃度標記細胞10分鐘。隨後，細胞用含有FBS (10% v/v)之過量DPBS洗滌兩次。經標記之細胞在T細胞培養基中在37℃下休眠30分鐘。隨後，用DPBS藉由兩個額外洗滌步驟移除未經轉化之CFDA-SE。CFSE標記之休眠人類PBMC以0.5×105 個細胞之密度添加至各孔中。以指示濃度添加抗人類CD3抗體(純系V9，人類IgG1，描述於Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)及美國專利第6,054,297號中)(最終濃度為[20 nM])及FAP-OX40L。細胞在培育箱(Hera Cell 150)中在37℃及5% CO2 下活化五天。接著，細胞在4℃下用螢光染料結合之抗體抗人類CD4 (純系RPA-T4，BioLegend，目錄號300532)及CD8 (純系RPa-T8，BioLegend，目錄號3010441)表面染色20分鐘。在用FACS緩衝液進行洗滌步驟之後，細胞再懸浮於85微升/孔FACS緩衝液中且使用5-雷射Fortessa流式細胞儀(具有DIVA軟體之BD Bioscience)獲取。 如圖 51 中所示，藉由本發明之NIH/3T3-huFAP純系39細胞進行之FAP-OX40L構築體之過交聯顯著促進TCR刺激之人類CD4及CD8 T細胞中之增殖(參見上部「事件」圖式)及存活(參見下部「增殖」 圖式)。根據人類CD8+ T細胞上OX40之較低表現，FAP-OX40L對CD8+ T細胞之促效作用之強度低於對CD4+ T細胞之促效作用。 *** 引用文獻： Ascierto, P. A., E. Simeone, M. Sznol, Y. X. Fu, and I. Melero (2010), Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PD1 therapeutic antibodies. Semin Oncol 37:508-516. Aggarwal B.B. (2003), Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat. Rev. Immunol. 3(9),745-56. Banner D. et al (1993), Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell 73, 431-445. Bodmer J., Schneider P. and Tschopp, J. (2002), The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends in Biochemical Sciences 27(1), 19-26. Broll, K., Richter, G., Pauly, S., Hofstaedter, F., and Schwarz, H. (2001). CD137 expression in tumor vessel walls. High correlation with malignant tumors. Am J Clin Pathol 115, 543-549. Buechele, C., Baessler, T., Schmiedel, B.J., Schumacher, C.E., Grosse-Hovest, L., Rittig, K., and Salih, H.R. (2012). 4-1BB ligand modulates direct and Rituximab-induced NK-cell reactivity in chronic lymphocytic leukemia. 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圖 1 展示用於組裝分裂型三聚人類4-1BB配位體之組分。圖(1A)展示二聚配位體，其在C端與人類CH1或CL結構域或VL或VH結構域融合，且圖(1B)展示單體配位體，其與人類CL或CH1結構域或VL或VH結構域融合。圖(1C)展示二聚配位體，其在N端與人類CH3結構域融合，且圖(1D)展示單體配位體，其在N端與人類CH3結構域融合。圖 2 展示本發明之含有4-1BBL三聚體之抗原結合分子構築體1.1至1.10。此等構築體之製備及產生描述於實例1中。VH及VL結構域為抗FAP抗體28H1之結構域，深黑色點表示結進孔(knob-into-hole)修飾。*表示CH1及CL結構域中之胺基酸修飾(所謂的帶電殘基)。圖 3 展示用於組裝分裂型三聚鼠4-1BB配位體之組分。圖(3A)展示二聚配位體，其在C端與鼠CL結構域融合，且圖(3B)展示單體配位體，其在C端與鼠CH1結構域融合。用於組裝靶向分裂型三聚鼠4-1BB配位體之FAP的組分。圖(3C)展示如實例1.3中更詳細描述之所組裝之含有鼠4-1BBL三聚體之抗原結合分子。圖 4 展示本發明之含有4-1BBL三聚體之抗原結合分子構築體2.1至2.6。此等構築體之製備及產生描述於實例2中。VH及VL結構域為抗FAP抗體4B9之結構域，深黑色點表示結進孔修飾。*表示CH1及CL結構域中之胺基酸修飾(所謂的帶電殘基)。圖 5A 及圖 5B 展示構築體1.1及1.2之「未靶向之」變異體，其包含DP47 Fab分子代替抗FAP Fab分子。該等分子分別稱為對照物A及對照物B。製備方法描述於實例1.4中。圖 5C 為如實例3中製備之單體4-1BB Fc (kih)構築體之圖式。圖 6 係關於FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體，實心圓)或DP-47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體，空心圓)與休眠(未經處理)或經活化之人類PMBC之結合。特定言之，與休眠(未經處理)或經活化之人類CD8+ T細胞之結合展示於圖(6A)中，與休眠(未經處理)或經活化之人類CD4+ T細胞之結合展示於圖(6B)中，且與休眠(未經處理)或經活化之人類NK細胞之結合展示於圖(6C)中。將結合展示為紅色大型藻類藻紅素(R-PE)標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之螢光強度之中值(MFI)，該片段用作第二偵測抗體。藉由流動式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。 不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體與表現人類4-1BB之T細胞(來自PHA-L)及Proleukin預先活化及抗人類CD3/抗人類CD28再活化人類PBMC之結合展示於圖 7 中。用R-藻紅素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與實例1之測試構築體1.1至1.10之濃度的關係。為了更好地顯示，結合曲線分成四種不同墨點法，使用構築體1.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))及對照物B (具有CH-CL交叉(cross)及帶電殘基之單價未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))作為比較曲線。在CD3+ CD8+ T細胞(圖7A)及CD3+ CD4+ T細胞(圖7B)上監測結合。CD8 T細胞上之4-1BB表現量通常高於CD4 T細胞。所有版本皆以極類似的親和力結合於人類4-1BB。圖 8 展示不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體與來自新鮮PBMC之CD4+或CD8+ T細胞(圖8A)或與表現人類4-1BB之PHA-L及Proleukin預先活化及抗人類CD3/抗人類CD28再活化人類PBMC(圖8B)之結合。用R-藻紅素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與實例2之測試構築體2.1、2.3、2.4、2.5及2.6及對照分子對照物B、對照物C、對照物E及對照物F之濃度的關係。為了更好地顯示，結合曲線分成兩種不同墨點法，使用構築體2.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))及對照物B (具有CH-CL交叉及帶電殘基之單價未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))作為比較曲線。在CD45+ CD3+ CD8+ T細胞(底部之墨點法)及CD45+ CD3+ CD4+ T細胞(頂部之墨點法)上監測結合。CD8 T細胞上之4-1BB表現量通常高於CD4 T細胞。所有構築體皆以極類似的親和力結合於人類4-1BB，然而二價構築體2.3及其未靶向之對照物C展示較低MFI。此可歸因於4-1BB結合之空間位阻及/或由Fc結合之分裂型4-1BB配位體誘導之第2偵測抗體引起之較少偵測。 在圖 9 中，展示FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(FAP分裂型4-1BBL三聚體，實心圓)或DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(DP47分裂型4-1BBL三聚體；空心圓)與經活化之小鼠脾細胞之結合。特定言之，與經活化之小鼠CD4+ T細胞之結合展示於圖(9A)中且與經活化之小鼠CD8+ T細胞之結合展示於圖(9B)中。使用抗小鼠CD137特異性人類IgG1 P329G LALA抗體(純系Lob12.3)作為陽性對照(三角形)。藉由繪製用作第二偵測抗體之R-PE標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之MFI與所測試之分裂型4-1BBL三聚構築體之濃度(nM)的關係圖來表徵結合。藉由流動式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。圖 10 展示含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子( 實心圓：FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子構築體1.1，空心圓：DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子對照物A)與表現纖維母細胞活化蛋白質(FAP)之黑素瘤(A)MV-3細胞株及(B)WM-266-4細胞株之結合。藉由繪製用作第二偵測抗體之R-PE標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之MFI與所測試之分裂型4-1BBL三聚構築體之濃度(nM)的關係圖來表徵結合。藉由流動式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。 在圖 11 中，展示不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體與表現人類FAP之人類黑素瘤MV-3細胞(圖11A)及/或經NIH/3T3-huFAP純系39轉染之小鼠胚胎纖維母細胞(圖11B)之結合。用R-藻紅素-螢光染料或螢光素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。為了更好地顯示，結合曲線分成四種(圖11A)或兩種墨點法(圖11B)，而使用構築體1.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))作為比較曲線。除二價FAP靶向之構築體(構築體1.5、1.7及1.8)以外，所有構築體以極類似的親和力結合於人類FAP。其展示具有較低EC50值及較低中值螢光強度之趨勢。此可由其二價靶向解釋(較高親合力，由於佔有兩個抗原決定基引起降低MFI，因此可同時結合之分子較少)。結構差異亦可解釋構築體1.8 (完全二價靶向)與構築體1.5及1.7 (僅部分二價靶向)之間的差異。 在圖 12 中，展示不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體2.1、2.3、2.4、2.5及2.6與表現人類FAP之人類黑素瘤Mv-3細胞(圖12A)及WM-266-4細胞(圖12B)之結合。用R-藻紅素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。為了更好地顯示，結合曲線分成兩種墨點法，而使用構築體2.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))作為比較曲線。除二價FAP靶向之構築體2.3以外，所有構築體以類似親和力結合於人類FAP。其具有展示較低EC50值及較低中值螢光強度之趨勢。此可由其二價靶向或細胞表面上引起較低MFI之FAP分子解釋，二價靶向引起較高親合力，但較低佔有率。圖 13 展示不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚小鼠4-1BB配位體Fc (kih)構築體與來自新鮮脾細胞之CD4+或CD8+ T細胞(圖13A)或與經表現小鼠4-1BB之抗小鼠CD3/抗小鼠CD28單株促效抗體活化之小鼠脾細胞(圖13B)之結合。用FITC-螢光染料結合之抗小鼠IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。在CD3+ CD8+ T細胞(左側墨點)及CD3+ CD4+ T細胞(右側墨點)上監測結合。CD8 T細胞上之4-1BB表現量通常高於CD4 T細胞。所有構築體皆以極類似的親和力結合於小鼠4-1BB。圖 14 中說明不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚小鼠4-1BB配位體Fc (kih)構築體與表現人類FAP之腫瘤細胞之結合。用FITC-螢光染料結合之抗小鼠IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。在MV-3細胞(圖14A)及WM-266-4細胞(圖14B)上監測結合。FAP靶向之分裂型三聚小鼠4-1BB配位體Fc (kih)構築體M.1及M.2以極類似的親和力結合於FAP。圖 15 展示一個流程，其說明使用報導細胞株之實例6.1中所描述之NFkB活性分析之一般原理。展示用表現人類4-1BB之HeLa報導細胞株進行之活化分析。表現於報導細胞上之4-1BB之交聯誘導NFκB活化及NFκB介導之螢光素酶表現。在細胞溶解之後，螢光素酶可催化螢光素氧化成氧化螢光素。此化學反應與NFκB介導之螢光素酶表現之強度正相關且可藉由發光強度(所釋放之光之單元)量測。表現FAP之腫瘤細胞與報導細胞株HeLa-huCD137-NFkB-luc之比率為5:1。 在圖 16 中，展示藉由FAP靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(構築體1.1)進行之NFkB信號傳導路徑之活化嚴格取決於其與表現FAP之目標細胞的結合。表現人類CD137之NFkB報導子HeLa細胞與所指示之呈現不同細胞表面FAP表現量含量腫瘤細胞共同培養。在所指示之濃度下、在不存在或存在含有4-1BBL之分子之情況下培養細胞6小時之後，如實例6.1中所描述評估螢光素酶活性。實心圓係指構築體1.1。空心圓係指DP47未靶向之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合抗原結合分子(對照物A)。圖(A)中使用細胞株NIH/3T3-人類FAP純系39作為目標細胞，圖(B)展示作為目標細胞之MV3細胞株之活化，且圖(C)使用WM-266-4細胞株作為目標細胞。藉由進行在0.5秒期間量測之所釋放之光之單元(URL)與所測試之分裂型4-1BBL三聚構築體之濃度(nM)之墨點分析來表徵活性。由於螢光素酶介導之螢光素氧化成氧化螢光素而發出URL。圖 17 展示NFκB活化誘導之螢光素酶表現及如藉由實例6.1中所描述之分析量測之活性。以0.5秒/孔量測每秒所釋放之光之計數(CPS)且針對所使用之FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體之濃度來標繪。表現人類4-1BB之HeLa報導細胞在不存在(圖 17A )或存在交聯型表現人類FAP之人類黑素瘤細胞株MV-3 (圖 17B )或WM-266-4 (圖 17C )之情況下培育6小時。針對不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體之濃度量測CPS且進行墨點分析。細胞比率為一個表現人類4-1BB之HeLa報導細胞比五個腫瘤細胞。為了更好地顯示，活化曲線分成四種不同顯示墨點法，使用構築體1.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))及對照物B (具有CH-CL交叉及帶電殘基之單價未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))作為比較曲線。圖17A 展示不存在交聯型表現FAP之腫瘤細胞情況下之活化，圖17B 展示存在交聯型表現FAP之MV-3腫瘤細胞情況下之活化，且圖17C 展示存在交聯型表現FAP之WM-266-4腫瘤細胞情況下之活化。圖 18 展示NFκB活化誘導之螢光素酶表現及活性，如關於實例2之構築體所量測。以0.5秒/孔量測每秒所釋放之光之單元(URL)且針對所使用之FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體之濃度來標繪。表現人類4-1BB之HeLa報導細胞在不存在或存在交聯型表現人類FAP之人類黑素瘤細胞株MV-3或WM-266-4之情況下培育6小時。量測URL且針對不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體2.1、2.3、2.4、2.5及2.6以及對照物B、C、E及F之濃度進行墨點分析。細胞比率為一個表現4-1BB之HeLa報導細胞比五個腫瘤細胞。為了更好地顯示，活性曲線分成兩種不同顯示-用構築體2.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))進行墨點分析。 在圖 19 中，展示用表現食蟹獼猴(cynomolgus monkey)4-1BB之T293-HEK報導細胞株進行之活性分析。表現於報導細胞上之食蟹獼猴4-1BB之交聯誘導NFκB活化及NFκB介導之螢光素酶表現。在細胞溶解之後，螢光素酶可催化螢光素氧化成氧化螢光素。此化學反應與NFκB介導之螢光素酶表現之強度正相關且可藉由發光強度(所釋放之光之單元)量測。圖 20 展示NFκB活化誘導之螢光素酶表現及活性。以0.5秒/孔量測每秒所釋放之光之單元(URL)且針對所使用之FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體之濃度來標繪。表現食蟹獼猴4-1BB之T293-HEK報導細胞在不存在或存在交聯型表現人類FAP之人類黑素瘤細胞株MV-3或WM-266-4之情況下培育6小時。針對不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體之濃度量測URL且進行墨點分析。細胞比率為一個表現4-1BB之T293-HEK報導細胞比五個MV-3或兩個WM-266-4細胞。為了更好地顯示，活性曲線分成兩種不同墨點法，使用構築體2.1作為比較曲線。圖 21 ：此流程說明實例6.3中所描述之T細胞活化分析之原理。展示在存在不同滴定濃度之FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體之情況下，用HLA-A2-NLV特異性CD8 T細胞及NLV脈衝HLA-A2+ FAP+人類黑素瘤細胞株MV-3進行之示意性分析活化。細胞培育28小時，最終4小時在存在含有莫能菌素(monesin)之Golgi-Stop之情況下培育。NLV特異性CD8 T細胞與MV-3腫瘤細胞之比率為1:8。圖 22A-E 及23A-E 係關於在不同滴定濃度之如實例1中製備之不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體存在下，用HLA-A2-NLV特異性CD8 T細胞及NLV脈衝HLA-A2+ FAP+人類黑素瘤細胞株MV-3進行之活性分析。為了更好地顯示，表現曲線分成若干種不同顯示墨點法，使用構築體1.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))及對照物B (單價未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))作為比較曲線。在四個獨立類似實驗中獲得結果且展示延長之NLV特異性CD8+ T細胞之IFNγ分泌及CD137表現嚴格取決於經由識別NLV-HLA-A2複合物進行之T細胞活化(信號1)與藉由FAP靶向之人類分裂型4-1BBL進行之4-1BB觸發(信號2)之同時發生。4-1BB上調之作用展示於圖22之曲線中，而CD8+ T細胞之INFγ表現之作用呈現於圖23之曲線中。始終展示全部CD8+ T細胞群體中陽性細胞之百分比之出現頻率。在24小時刺激之後，所有FAP靶向之變異體誘導之NLV肽活化之CD8 T細胞之類似活性改良在圖22中展示為4-1BB上調(正反饋迴路)且在圖23中展示為IFNγ表現。曲線之差異屬於正常誤差範圍內且不顯著。圖 24A-B 及25A-B 係關於在滴定濃度之實例2之不同FAP靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體存在下，用HLA-A2-NLV特異性CD8 T細胞及NLV脈衝HLA-A2+ FAP+人類黑素瘤細胞株MV-3進行之活性分析。為了更好地顯示，表現曲線分成兩種不同顯示墨點法，使用構築體2.1 (單價FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih))及對照物B作為比較曲線。在24小時刺激之後，所有FAP靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體展示類似的HLA-A2-NLV-肽特異性CD8 T細胞之活性改良，在圖24中展示為4-1BB上調(正反饋迴路)且在圖25中展示為IFNγ表現。曲線之差異屬於正常誤差範圍內且不顯著。圖 26 ：此流程說明如實例6.4中所描述之實驗。圖 27 展示CD8+ T細胞增殖之誘導。展示增殖性CD8+ T細胞之出現頻率與測試構築體之濃度的關係。圖 28A 係關於健康NOG小鼠中構築體1.2及對照物B之單次給藥PK實驗。展示構築體濃度隨時間推移之降低。圖 28B 展示用幹細胞人類化之攜有腫瘤之NOG小鼠中構築體2.1、2.3、對照物B及對照物C之單次給藥PK實驗之結果。圖28C係關於健康NOG小鼠中比較構築體2.1及2.3之單次給藥PK實驗。 圖29展示用於組裝分裂型三聚人類4-1BB配位體之組分。圖(29A)展示二聚配位體，其在C端與具有突變E123R及Q124K (帶電殘基)之人類CL結構域融合，且圖(29B)展示單體4-1BB配位體，其與具有突變K147E及K213E (帶電殘基)之人類CH1結構域融合。用於組裝二價CD19靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體(71-254)抗原結合分子(構築體3.3)之組分。圖(29C)展示二聚配位體，其與人類IgG1 Fc孔鏈之C端融合。圖(29D)展示單體配位體，其與人類IgG1 Fc結鏈之C端融合。圖 30 展示本發明之CD19靶向之含有4-1BBL三聚體之抗原結合分子構築體3.1至3.6。此等構築體之製備及產生描述於實例3中。VH及VL結構域為抗CD19抗體8B8-018之結構域，深黑色點表示結進孔修飾。*表示CH1及CL結構域中之胺基酸修飾(所謂的帶電殘基)。 在圖 31A 中，說明親本純系8B8之CDR區之隨機化策略。展示根據Kabat編號之親本純系8B8及CDR區(加框)之可變域。(X)表示隨機位置。圖 31B 展示文庫產生策略之示意性說明。展示用於產生基於8B8之文庫的PCR擴展及選殖策略，該文庫具有A)輕鏈及重鏈中之隨機CDR1及CDR2區，或B)輕鏈中之隨機CDR1及CDR3區以及重鏈中之CDR3區。指示用於選殖至噬菌粒(phagemide)中之各別酶。圖 32 展示親本抗CD19純系8B8與所選擇之親和力成熟結合子之比對。展示純系8B8及所有所選擇之親和力成熟結合子之序列。重鏈及輕鏈之CDR皆加框。圖 33 係關於親本8B8純系及其親和力成熟變異體之SPR分析。展示純系8B8及其親和力成熟衍生物之感測圖譜，其不含LCDR1 N27d及N28熱點。圖 34 說明量測CD19靶向之三聚分裂型4-1BBL與hu4-1BB及huCD19之同時結合之分析的設定(實例8.2)。圖 35 中之曲線展示CD19靶向之三聚4-1BBL FC融合抗原結合分子構築體3.1、3.3、3.4、3.5、3.6及4.4 (分析物1)與固定人類4-1BB及人類CD19 (分析物2)之同時結合。圖 36 展示不同CD19靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體與PHA-L之表現4-1BB之CD4及CD8 T細胞及Proleukin預先活化及抗人類CD3/抗人類CD28 再活化人類PBMC之結合。用R-藻紅素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。為了更好地顯示，結合曲線分成三種不同墨點法，使用構築體3.4及對照物F (同型對照物huIgG1 P329G LALA)作為比較曲線。在CD45+ CD3+ CD8+ T細胞(圖36A)及CD45+ CD3+ CD4+ T細胞(圖36B)上監測結合。CD8 T細胞上之4-1BB表現量通常高於CD4 T細胞。所有構築體皆以極類似的親和力結合於人類4-1BB。圖 37 展示CD19靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)抗原結合分子與以下各者之結合：表現人類CD19之B細胞淋巴瘤細胞株：彌漫性大型非霍奇金氏(non-Hodgkin)B細胞淋巴瘤SU-DHL-8 (37A)、急性B細胞前驅體淋巴白血病Nalm6 (37B)、彌漫性大型細胞淋巴母細胞淋巴瘤Toledo (37C)及彌漫性大型B細胞淋巴瘤OCI-Ly18 (37D)。用R-藻紅素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。為了更好地顯示，結合曲線分成三種不同墨點法，使用構築體3.4及對照物F (同型對照物huIgG1 P329G LALA)作為比較曲線。所有構築體皆以極類似的親和力結合於人類CD19。圖 38 係關於NFκB活化誘導之螢光素酶表現及CD19靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)抗原結合分子之活性。以0.5秒/孔量測所釋放之光之單元(URL)且針對所使用之CD19靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體3.1及3.3以及對照分子B及C之濃度標繪。表現人類4-1BB之HeLa報導細胞在不存在或存在交聯型表現人類CD19之SU-DHL-8或Pfeiffer細胞之情況下培育7.5小時。針對不同CD19靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體之濃度量測URL且進行墨點分析。細胞比率為一個表現4-1BB之HeLa報導細胞比2.5或五個腫瘤細胞。圖 39 展示表現CEA之人類胃腺癌細胞上T84.66 IgG之不同人類化變異體之結合。基於資料，選擇人類化變異體1將其包括於CEA靶向之三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)抗原結合分子中。圖 40 展示本發明之CEA靶向之含有4-1BBL三聚體之抗原結合分子構築體5.1至5.6。此等構築體之製備及產生描述於實例11中。VH及VL結構域為抗CEA抗體T84.66-LCHA之結構域，深黑色點表示結進孔修飾。*表示CH1及CL結構域中之胺基酸修飾(所謂的帶電殘基)。圖 41A 展示人類NA3B3A2-avi His之示意性說明，其為用於評估CEA靶向之三聚分裂型4-1BBL Fc (kih)抗原結合分子之結合的抗原。圖 41B 說明量測CEA靶向之三聚分裂型4-1BBL與hu4-1BB及人類NA3B3A2之同時結合的分析之設定(實例12.1)。圖 42 中之曲線展示CEA靶向之三聚4-1BBL Fc融合抗原結合分子構築體5.4、5.6、5.7及5.8 (分析物1)與固定人類4-1BB及人類NA3B3A2(分析物2)之同時結合。圖 43 中展示不同CEA靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體與PHA-L之表現4-1BB之CD4及CD8 T細胞及Proleukin預先活化及抗人類CD3/抗人類CD28再活化人類PBMC之結合。用R-藻紅素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。為了更好地顯示，結合曲線分成兩種不同墨點法，使用構築體5.4及對照物F (同型對照物huIgG1 P329G LALA)作為比較曲線。在CD45+ CD3+ CD8+ T細胞(底部之墨點法)及CD45+ CD3+ CD4+ T細胞(頂部之墨點法)上監測結合。CD8 T細胞上之4-1BB表現量通常高於CD4 T細胞。所有構築體皆以極類似的親和力結合於人類4-1BB。圖 44 展示CEA靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體與表現人類CEA之人類胃細胞株MKN-45 (左側)及人類結腸直腸腺癌細胞株LS180 (右側)之結合。用R-藻紅素-螢光染料結合之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段偵測結合。展示螢光強度之中值(MFI)與測試構築體之濃度之關係。圖 45 係關於NFκB活化誘導之螢光素酶表現及CEA靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)抗原結合分子之活性。以0.5秒/孔量測所釋放之光之單元(URL)且針對所使用之CEA靶向或未靶向之分裂型三聚人類4-1BB配位體Fc (kih)構築體5.4、5.6、5.7及5.8以及對照分子之濃度進行墨點分析。表現人類4-1BB之HeLa報導細胞在不存在或存在交聯型表現人類CEA之人類胃癌細胞株MKN-45之情況下培育6小時。細胞比率為一個表現4-1BB之HeLa報導細胞比三個腫瘤細胞。 在圖 46A 及46B 中，展示用於組裝單價FAP靶向之分裂型三聚人類OX40配位體(構築體6.1)之組分。圖46A係關於二聚配位體，其與人類IgG1-CL結構域融合，圖46B係關於單體配位體，其與人類IgG1-CH1結構域融合。圖 46C 展示FAP靶向之含有OX40L三聚體之抗原結合分子構築體6.1。在圖 46D 中，展示DP47「未靶向之」人類IgG1 PGLALA(對照物F)。圖 47A 展示FAP靶向之分裂型三聚人類Ox40L與FAP陽性WM-266-4細胞之結合。WM-266-4細胞表現大量人類纖維母細胞活化蛋白質(huFAP)。僅FAP靶向之OX4O配位體Fc (kih)構築體(實心正方形)而非對照物5 (實心菱形)結合於WM-266-4細胞。以用作第二偵測抗體之異硫氰酸螢光素(FITC)標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之螢光強度之中值(MFI)形式展示結合。藉由流動式細胞測量術量測MFI。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 47B 展示FAP靶向之OX4O配位體Fc (kih)構築體與人類FAP人類Ox40陰性A549 NucLight Red細胞之結合。未展示FAP靶向之OX4O配位體Fc (kih)構築體與OX40陰性FAP陰性A549腫瘤細胞結合。以用作第二偵測抗體之FITC標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之螢光強度之中值(MFI)形式展示結合。藉由流動式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。 在圖 48A 中，展示FAP-Ox40L與休眠及經活化之人類CD4 T細胞之結合。Ox40未表現於休眠人類CD4 T細胞(左側)上。在不存在表現人類Ox40之細胞之情況下，未觀測到結合(左側曲線)。在人類PBMC之活化之後，CD4+ T細胞上之Ox40上調(右側)。FAP-Ox40L結合於經Ox40+活化之CD4 T細胞。以用作第二偵測抗體之FITC標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之螢光強度之中值(MFI)形式展示結合。藉由流動式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 48B 展示Ox40未表現於休眠人類CD8 T細胞上(左側)。在不存在表現人類Ox40之細胞之情況下，未觀測到結合(左側曲線)。在人類PBMC之活化之後，CD8+ T細胞上之Ox40上調(右側)。人類CD8+ T細胞上之Ox40表現低於CD4+T細胞且在供體及時間點之間變化。所描繪之CD8 T細胞上Ox40之表現較低。FAp-Ox40L結合於經Ox40+活化之CD8 T細胞。以用作第二偵測抗體之FITC標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之螢光強度之中值(MFI)形式展示結合。藉由流動式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。x軸展示抗體構築體之濃度。 在圖 49 中，說明HeLa_hOx40_NFkB_Luc1報導細胞中，藉由FAP靶向之分裂型三聚人類OX40L抗原結合分子(FAP-OX40L)進行之NFκB信號傳導路徑之活化。展示具有(右圖)或不具有(左圖)二級抗體之交聯的活化。報導細胞以1:2比率，在具有或不具有交聯第二聚-純系抗huIgG1 Fcγ特異性山羊IgG F(ab)2片段情況下，在指示濃度之FAP-OX40L存在下培養5小時。如實例6.1中所描述評估螢光素酶活性。藉由在0.5秒期間所量測之所釋放之光之單元(URL)與測試構築體之濃度(nM)之關係的墨點分析表徵活性。由於螢光素酶介導之螢光素氧化成氧化螢光素而發出URL。圖 50A 中展示在FAP陽性細胞存在下，HeLa_hOx40_NFkB_Luc1報導細胞中藉由FAP-OX40L進行之NFκB之活化。展示在表現少量FAP之NIH-3T3人類FAP細胞存在下(比率為3個FAP+腫瘤細胞比1個報導細胞)，藉由FAP-OX40L進行之報導細胞中NFκB信號傳導路徑之活化。藉由在0.5秒期間量測之所釋放之光之單元(URL)與測試化合物之濃度(nM)之關係的墨點分析來表徵NFκB介導之螢光素酶活性。由於螢光素酶介導之螢光素氧化成氧化螢光素而發出URL。值為藉由減去空白對照物之URL而校正之基線。為了更好地比較，各別點漬之劑量反應曲線之曲線下面積定量為各構築體之促效能力之標記。比較說明於圖 50B 中。使用GraphPad Prism計算面積。值為藉由減去空白對照物之值而校正之基線。圖 51 展示OX40介導之次最佳TCR觸發之休眠人類PBMC之共刺激(實例15.5)。藉由本發明之NIH/3T3-huFAP純系39細胞進行之FAP-Ox40L之過交聯強烈促進人類CD4及CD8 T細胞中之存活及增殖。展示活CD4+ (左側)及CD8+ (右側)T細胞之事件計數。減去僅含有抗人類CD3 (純系V9，huIgG1)、休眠人類PBMC及NIH/3T3-huFAP純系39之樣品的基線值。因此，此處展示OX40共刺激之增強作用，而非次最佳抗CD3刺激之作用本身。在下部圖中，展示具有細胞表面固定之FAP-Ox40L-Proliferation之休眠人類PBMC之次最佳TCR刺激之解救。
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Claims (32)

  1. 一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子，其中該目標細胞抗原為CD19； (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽含有第一重鏈恆定(CH1)結構域或輕鏈恆定(CL)結構域，且該第二多肽含有CL或CH1結構域，其中該第二多肽藉由該CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至該第一多肽，且其中該第一多肽包含選自4-1BBL或OX40L之TNF配位體家族成員之兩個胞外域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，該兩個胞外域彼此藉由肽連接子連接且經由肽連接子連接至該CH1或CL結構域，且其中該第二多肽包含選自4-1BBL或OX40L之該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該胞外域經由肽連接子連接至該CL或CH1結構域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列；且 (c) 由能夠穩定結合之第一子單元及第二子單元組成的Fc結構域。
  2. 如請求項1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員共刺激人類T細胞活化。
  3. 如請求項1或2之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員為包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的4-1BBL：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375。
  4. 如請求項1或2之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員之胞外域包含選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:96之胺基酸序列。
  5. 如請求項1或2之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員之胞外域包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列。
  6. 如請求項1或2之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，且該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。
  7. 如請求項1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該Fc結構域為IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域。
  8. 如請求項1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該Fc結構域為IgG1 Fc結構域，其包含在位置234及235 (EU編號)及/或329(EU編號)之胺基酸取代。
  9. 如請求項1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， 第一肽，其包含選自4-1BBL或OX40L之TNF配位體家族成員之兩個胞外域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與第二重鏈或輕鏈融合， 及第二肽，其包含選自4-1BBL或OX40L之該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，該第二肽在其C端藉由第三肽連接子分別與第二輕鏈或重鏈融合。
  10. 如請求項9之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該第一肽包含選自4-1BBL或OX40L之TNF配位體家族成員之兩個胞外域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與重鏈之一部分的CH1結構域融合， 及該第二肽包含選自4-1BBL或OX40L之該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與輕鏈之一部分的CL結構域融合。
  11. 如請求項9之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該第一肽包含選自4-1BBL或OX40L之TNF配位體家族成員之兩個胞外域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，該兩個胞外域藉由第一肽連接子彼此連接，該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與輕鏈之一部分的CL結構域融合， 及該第二肽包含選自4-1BBL或OX40L之該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該4-1BBL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374及SEQ ID NO:375，該OX40L包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列，該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與重鏈之一部分的CH1結構域融合。
  12. 如請求項10或11之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在與選自4-1BBL或OX40L之該TNF配位體家族成員相鄰之CL結構域中，位置123 (EU編號)之胺基酸由精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在與選自4-1BBL或OX40L之該TNF配位體家族成員相鄰之CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)之胺基酸經麩胺酸(E)取代。
  13. 7及8中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (a) 第一重鏈及第一輕鏈，皆包含能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子， (b) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。
  14. 如請求項1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該Fab分子包含VH結構域，其包含(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:252之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:253之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:254之胺基酸序列，及VL結構域，其包含(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:249之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:250之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:251之胺基酸序列。
  15. 如請求項1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該Fab分子含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的可變輕鏈，或其中該能夠特異性結合於FAP之Fab分子含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的可變輕鏈。
  16. 7及8中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其含有包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:113，及 (iii) 第二輕鏈，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:114之胺基酸序列。
  17. 7及8中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (i) 第一重鏈，其含有包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其含有包含SEQ ID NO:202之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其含有包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其含有包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列的VL結構域， (ii) 第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:173，及 (iii) 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:174。
  18. 2、7至11、14及15中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其含有包含SEQ ID NO:205之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:206之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈。
  19. 2、7至11、14及15中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其含有包含SEQ ID NO:306之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列的第二輕鏈。
  20. 如請求項1或2之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員為包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列之OX40L。
  21. 如請求項1或2之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員之胞外域包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列。
  22. 7及8中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a) 至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之Fab分子，及 (b) 藉由雙硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含SEQ ID NO:371或SEQ ID:372之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之胺基酸序列。
  23. 2、7至11、14及15中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用作藥劑。
  24. 2、7至11、14及15中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療癌症。
  25. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。
  26. 一種載體，其包含如請求項25之經分離之聚核苷酸。
  27. 一種宿主細胞，其包含如請求項25之經分離之聚核苷酸或如請求項26之載體。
  28. 一種製備如請求項1至22中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的方法，其包含以下步驟 (i) 將如請求項27之宿主細胞在適於表現該抗原結合分子之條件下培養，及 (ii) 回收該抗原結合分子。
  29. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  30. 如請求項29之醫藥組合物，其係用作藥劑。
  31. 如請求項29之醫藥組合物，其係用於治療癌症。
  32. 一種如請求項1至22中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造用以治療癌症之藥劑。
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