ES2638521T5 - Composiciones y métodos para anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas - Google Patents

Composiciones y métodos para anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere generalmente al campo de anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas para la terapia del cáncer.
INFORMACIÓN ANTECEDENTE
El sistema inmune proporciona al cuerpo humano medios para reconocer y defenderse frente a microorganismos y sustancias reconocidas como extrañas o potencialmente dañinas. Mientras que la inmunoterapia pasiva del cáncer con anticuerpos monoclonales y la transferencia pasiva de células T para atacar células tumorales han demostrado una eficacia clínica, el objetivo de la vacunación terapéutica activa para inducir estos efectores inmunes y establecer memoria inmunológica frente a células tumorales ha seguido siendo un reto. Se han identificado varios antígenos específicos de tumores y asociados a tumores, aunque estos antígenos son generalmente débilmente inmunogénicos, y los tumores emplean diversos mecanismos para crear un entorno tolerogénico que les permitan evadir el ataque inmunológico. Las estrategias para superar tal tolerancia inmune y activar niveles robustos de respuestas de anticuerpos y/o de células T contienen la clave para la inmunoterapia eficaz contra el cáncer.
El documento US2005/0054832 describe variantes de Fc optimizadas, y anticuerpos y fusiones de Fc que comprenden variantes de Fc.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el descubrimiento trascendental de que los anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas pueden contrarrestar o invertir la tolerancia inmune de células cancerosas. Las células cancerosas son capaces de escapar a la eliminación mediante agentes quimioterapéuticos o anticuerpos dirigidos contra tumores vía mecanismos inmunosupresores específicos en el microentorno tumoral, y tal capacidad de las células cancerosas se reconoce como tolerancia inmune. Tales mecanismos inmunosupresores incluyen citocinas inmunosupresoras (por ejemplo, factor beta de crecimiento transformante (TGF-P)) y células T reguladoras y/o células dendríticas mieloides inmunosupresoras (DCs). Contrarrestando la tolerancia inmune inducida por el tumor, la presente invención proporciona composiciones eficaces y su uso en métodos para el tratamiento del cáncer, opcional en combinación con otro tratamiento existente del cáncer. La presente invención proporciona estrategias para contrarrestar la tolerancia inmune inducida por el tumor y aumentar la eficacia antitumoral de la quimioterapia activando y aprovechando la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por células T frente a células cancerosas resistentes o diseminadas. Específicamente, la presente invención proporciona una molécula de fusión bifuncional dirigida contra dianas, en la que dicha molécula comprende un resto seleccionador de dianas y un resto inmunomodulador, en la que:
(a) el resto seleccionador de dianas comprende un polipéptido que se une específicamente a una molécula coinhibidora de células T y es un antagonista que inhibe la función de la molécula a la que se dirige; y (b) el resto inmunomodulador comprende una secuencia del dominio de unión al ligando extracelular de un receptor seleccionado del grupo que consiste en:
receptor del factor beta de crecimiento transformante TpRII, TpRIIb, TpRIII;
muerte programada 1 (PD-1); receptor activador del factor nuclear kB (RANK); y
receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1, VEGFR2).
Preferiblemente, el resto seleccionador de dianas comprende un dominio de unión a antígeno de una inmunoglobulina, anticuerpo, anticuerpo biespecífico o multiespecífico, fragmento de anticuerpo, fragmento variable de cadena sencilla (scFv), scFv bivalente o multivalente.
Preferiblemente, el resto inmunomodulador se fusiona al término C o término N de dicho resto seleccionador de dianas.
Preferiblemente, el mencionado resto seleccionador de dianas y el dominio de unión al ligando extracelular de un receptor se fusionan entre sí vía un enlazador.
Preferiblemente, el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, CD152), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), muerte programada 1 (PD-1; CD279), ligando 1 de PD-1 (PD-L1; B7-H1), ligando 2 de PD-1 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4, atenuador de linfocitos B y T (BTLA; CD272), y HVEM.
Preferiblemente, el resto seleccionador de dianas es una inmunoglobulina IgG de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Preferiblemente, el resto el resto inmunomodulador comprende una o más de SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 96.
Preferiblemente, el resto seleccionador de dianas comprende un anticuerpo que se une a CTLA-4.
Preferiblemente, la molécula comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 31.
Preferiblemente, la molécula comprende un anticuerpo que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que corresponde a SEQ Id . NO: 74;
(ii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 19, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que corresponde a SEQ ID. NO: 74;
(iii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 31 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que corresponde a SEQ Id . NO: 74.
Preferiblemente, la molécula comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una cualquiera de SEQ ID NOS: 5, 11, 12, 19 y 31.
La presente invención también proporciona un método de producción de la molécula de la invención mediante técnicas de ADN recombinante, que comprende la optimización de codones de secuencias de aminoácidos de dichas moléculas, la síntesis y clonación de ADNc en plásmidos, y la expresión de moléculas mediante transfección de células hospedantes.
La presente invención también proporciona un ácido nucleico que codifica la molécula de la invención.
La presente invención también proporciona la molécula de la invención para uso en medicina para prevenir o tratar un trastorno neoplásico o cáncer.
Preferiblemente, la molécula para uso se administra en combinación con una terapia contra el cáncer que comprende una molécula quimioterapéutica o inmunoterapéutica, un anticuerpo, un inhibidor de cinasa de pequeña molécula, un agente hormonal o una vacuna.
La presente divulgación describe una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador. El resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula diana, y el resto inmunomodulador se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) factor beta de crecimiento transformante (TGFp); (ii) ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2); (iii) ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL); (iv) receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR); (v) muerte programada 1 (PD-1); y (vi) receptor activador del factor nuclear k B (RANK).
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, o polipéptido que contiene Fc que se une específicamente a un componente de una célula tumoral, antígeno tumoral, vasculatura tumoral, microentorno tumoral, o célula inmune infiltrante de un tumor. El resto seleccionador de dianas se puede unir específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR1, Erb-B1), HER2/neu (Erb-B2), CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1R), receptor de TRAIL, molécula de adhesión de células epiteliales, antígeno carcinoembrionario, antígeno de membrana específico de la próstata, mucina-1, CD30, CD33, o CD40.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une específicamente a un componente de una célula T reguladora, célula supresora mieloide, o célula dendrítica. En el presente documento se desvela el resto seleccionador de dianas que se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) CD4; (ii) CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR); (iii) interleucina 10 (IL-10); (iv) receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR); (v) factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); (vi) receptor activador del factor nuclear k B (RANK); o (vii) ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL). De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas se puede unir de manera específica al antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; CD152); muerte programada 1 (PD-1); o ligando de muerte programada 1 (PD-L1 o PD-L2). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador se puede unir específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); (ii) ligando de muerte programada 1 (PD-L1 o PD-L2); o (iii) ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL).
De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir una molécula que se une a TGF-p. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular del receptor del factor beta de crecimiento transformante TGF-pRII, TGF-pRIIb, o TGF-pRIII. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede inhibir la actividad o función de TGF-p.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4. De acuerdo con la invención, un resto seleccionador de dianas puede incluir un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido que se une específicamente al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. Las moléculas desveladas en el presente documento pueden incluir una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 o 10. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 5.
En un aspecto, el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a muerte programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1), o ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En otro aspecto, el resto seleccionador de dianas incluye un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio de muerte programada 1 (PD-1). En un aspecto adicional, el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. En otro aspecto, la molécula incluye el ectodominio de PD-1, la región Fc de inmunoglobulina, y el ectodominio de TGFpRII. En otro aspecto, la molécula incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 11 o 12.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al receptor activador del factor nuclear k B (RANK) o al ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL). En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. En el presente documento se desvela una molécula que incluye el ectodominio de RANK, la región Fc de inmunoglobulina, y el ectodominio de TGFpRII. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 13 o 14.
De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir una molécula que se une específicamente al ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o al ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En otro aspecto, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio de muerte programada 1 (PD-1). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede inhibir la actividad o función del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1).
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas puede incluir un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un olipéptido que se une específicamente al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio de muerte programada 1 (PD-1). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, o 24. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO:19.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al receptor activador del factor nuclear k B (RANK) o al ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL). En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de muerte programada 1 (PD-1). Una molécula de la invención puede incluir el ectodominio de RANK, la región Fc de inmunoglobulina, y el ectodominio de PD-1. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 25 o 26.
De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir una molécula que se une específicamente al ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede inhibir la actividad o función del ligando del receptor activador del factor nuclear kB (RANKL).
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas puede incluir un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido que e une específicamente al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear kB (RANK). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, o 36. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la SEQ ID NO: 31.
En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). El resto inmunomodulador puede incrementar la función de PD-1.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo que se une a TNF -a, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de PD1 (PD-L1 o B7-H1). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 37. En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un dominio de unión al ligando extracelular del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de PD1 (PD-L1 o B7-H1). En el presente documento se desvela una molécula que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, la región Fc de inmunoglobulina, y una secuencia de PD-L1. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 38 o 39.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20, CD25, o CD4, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 40, 41, 42, 43, 44, o 45.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye el dominio extracelular de CTLA-4 y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 46 o 47.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye el factor p de crecimiento transformante (TGF-P) y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 48 o 49.
En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P). El resto inmunomodulador puede activar la función de señalización del receptor del factor p de crecimiento transformante (TGF-P).
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P). En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo que se une a TNF-a, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia de TGF-p. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 50. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, la región Fc de inmunoglobulina, y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 51 o 52.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20, CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 53, 54, 55, 56, 57 o 58.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un dominio extracelular de CTLA-4 y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 59 o 60.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo que se une a TNF-a, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia de un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio de RANK. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 61. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, la región Fc de inmunoglobulina, y una secuencia de un dominio de unión a RANK extracelular o ectodominio de RANK. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 62 o 63.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un dominio extracelular de CTLA-4 y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 64 o 65.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P) y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 66 o 67.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 68 o 69.
En diversos aspectos, la molécula se fusiona o se enlaza directamente a uno o más antígenos, determinante antigénico, o epítopo.
La presente descripción describe una composición que incluye la molécula de la descripción y una célula, en la que la célula es una célula tumoral, célula inmune, o célula dendrítica.
La presente descripción describe un método para contrarrestar o superar la tolerancia inmune. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una o más moléculas de la invención.
La presente invención proporciona una molécula de la invención para uso en un método para prevenir o tratar un trastorno neoplásico o cáncer. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una composición de la invención. En diversos aspectos, al sujeto se le administra la molécula de la invención en combinación con otra terapia contra el cáncer. En un aspecto, la terapia contra el cáncer incluye una molécula quimioterapéutica, anticuerpo, inhibidor de cinasa de pequeña molécula, agente hormonal o agente citotóxico. Otras terapias contra el cáncer incluyen radiación ionizante, radiación ultravioleta, crioablación, ablación térmica, o ablación por radiofrecuencias.
La presente descripción describe un método para prevenir o tratar una enfermedad neoplásica. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo que se dirige contra y agota células T reguladoras CD4+ (Tregs) en combinación con otra terapia contra el cáncer citotóxica. El anticuerpo que se dirige contra y agota Tregs puede ser un anticuerpo anti-CD4. La terapia contra el cáncer citotóxica puede incluir una molécula quimioterapéutica, un anticuerpo dirigido contra el tumor, un inhibidor de cinasa de pequeña molécula, un agente hormonal o un agente citotóxico dirigido contra el tumor. La terapia contra el cáncer citotóxica puede incluir radiación ionizante, radiación ultravioleta, crioablación, ablación térmica, o ablación por radiofrecuencias.
En otra realización de la descripción, al sujeto se le administra una o más moléculas de la invención en combinación con cualquier vacuna. En otro aspecto, la vacuna incluye un antígeno tumoral, un antígeno asociado a un tumor, un epítopo tumoral, una proteína de fusión que contiene un antígeno tumoral, una célula tumoral, o una célula dendrítica. En otro aspecto, la vacuna incluye un antígeno patogénico, un antígeno asociado a un patógeno, un epítopo patogénico, o una proteína de fusión que contiene un antígeno patogénico.
La presente descripción describe un método para tratar células inmunes, en el que las células se ponen en contacto ex vivo o in vitro con una molécula de la invención. La presente descripción describe un método de tratamiento de una enfermedad neoplásica. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una composición de células inmunes puesta en contacto con una molécula de la descripción.
La presente descripción describe un método para inducir o promover la tolerancia inmune. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una o más moléculas de la descripción.
La presente descripción describe un método para prevenir o tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria, que incluye administrar a un sujeto que lo necesite una o más moléculas de la descripción. Al sujeto se le puede administrar una o más moléculas de la descripción en combinación con otra terapia antiinflamatoria o inmunosupresora. La presente descripción describe un método de tratamiento de células inmunes, en el que las células se ponen en contacto ex vivo o in vitro con una molécula de la descripción. La presente descripción describe un método para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria, o prevenir el rechazo de células o tejido injertados. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una composición de células inmunes puesta en contacto con una molécula de la descripción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 muestra secuencias de aminoácidos ejemplares del receptor tipo II del factor beta de crecimiento transformante (TGF-p-RII) o TGF-p-RIIB o un fragmento del mismo, incluyendo (i) receptor tipo II del factor beta de crecimiento transformante (TGF-p-RII) (SEQ ID NO: 79); y (ii) receptor tipo IIB del factor beta de crecimiento transformante (TGF-p-RIIB) (SEQ ID NO: 80).
También se muestran en la Figura 1 mutantes truncados ejemplares del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGF-p-RII) o TGF-p RIIB, incluyendo la región del dominio extracelular (ECD) que se une a TGF-p, incluyendo (i) TGF-p-R-II (término AC): TGFp RII que carece de los últimos 38 aminoácidos desde el término C (SEQ ID NO: 81) y TGF-p R-IIB (término AC): TGFp RIIB que carece de los últimos 38 aa a partir del término C (SEQ ID NO: 82); (ii) TGF-pR-II (Acyt): TGFpRII que carece del dominio de cinasa y región de yuxtamembrana (SEQ ID NO: 83), y TGF-pR-IIB (Acyt): TGFpRIIB que carece del dominio de cinasa y región de yuxtamembrana (SEQ ID NO: 84); (iii) TGF-p R-II que contiene la región del término N que incluye el dominio extracelular (SEQ ID NO: 85) y TGF-p R-IIB que contiene la región del término N que incluye el dominio extracelular (SEQ ID NO: 86); (iv) TGF-p R-II que contiene el dominio extracelular que se une a TGF-p (SEQ ID NO: 87) y TGF-p R-IIB que contiene el dominio extracelular que se une a TGF-p (SEQ ID NO: 88); y (v) TGF-p R-II que contiene la región del dominio extracelular que se une a TGF-p (SEQ ID NO: 89).
Además, la Figura 1 también muestra mutantes ejemplares deficientes en cinasa, mutantes de supresión, o mutantes de punto del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) o de TGFp-RIIB o de un fragmento del mismo que se une a TGF-p, incluyendo (i) receptor II del factor beta de crecimiento transformante que contiene mutaciones de punto - la secuencia de aminoácidos de TGF-p R-II (K277R) contiene una mutación de punto en su sitio de unión a ATP y es inactiva como una cinasa (SEQ ID NO: 90); y (ii) el receptor II del factor beta de crecimiento transformante que contiene supresiones en la secuencia de aminoácidos (mutantes de supresión) - receptor II del factor beta de crecimiento transformante (Ai) - TGF-p R-II (Ai2) contiene una supresión de los aminoácidos 498 a 508 y es inactivo como una cinasa (SEQ ID NO: 91).
La Figura 2 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-HER2/neu y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-HER2/neu ECD de TGFp-RII (SEQ ID NO: 1) , y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 70).
La Figura 3 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-EGFR1 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-EGFR1 ECD de TGFp-RII (SEQ ID NO: 2) , y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 71).
La Figura 4 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD20 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-CD20 ECD de TGFp-RII (SEQ ID NO: 3), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-CD20 (SEQ ID NO: 72).
La Figura 5 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-VEGF y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada ECD de TGFp-RII (SEQ ID NO: 4), y la secuencia de cadena ligera anti-VEGF (SEQ ID NO: 73).
La Figura 6 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CTLA-4 humana y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-CTLA-4 TGFp-RII (SEQ ID NO: 5), y la cadena ligera anti-CTLA-4 (SEQ ID NO: 74).
La Figura 7 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen IL-2, Fc, y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo IL-2 Fc dominio extracelular de TGFp-RII (SEQ ID NO: 6) y dominio extracelular de TGFp-RII Fc IL-2 (SEQ ID NO: 7). El enlazador GGGGSGGGGSGGGGS (SeQ ID NO: 104) es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK (SeQ ID NO: 105) u otra secuencia enlazadora bien conocida en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos se pueden sustituir en Fc, incluyendo E subrayado por D, y M subrayado por L.
La Figura 8 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD25 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo la cadena pesada anti-CD25 (Daclizumab) y el dominio extracelular de TGFp-RII (SEQ ID NO: 8), y la cadena ligera anti-CD25 (Daclizumab) (SEQ ID NO: 75) (Figura 8A); y la cadena pesada anti-CD25 (Basiliximab) y el dominio extracelular de TGFp-RII (SEQ ID NO: 9), y la cadena ligera anti-CD25 (Basiliximab) (SEQ ID NO: 76).
La Figura 9 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD4 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo la cadena pesada anti-CD4 y el dominio extracelular TGFp-RII (SEQ ID NO: 10), y la cadena ligera anti-CD4 (SEQ ID NO: 77).
La Figura 10 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el ectodominio de la muerte programada 1 (PD-1), Fc, y el dominio extracelular (ectodominio) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo el ectodominio de PD-1 Fc ectodominio de TGFpRII (SEQ ID NO: 11) y el ectodominio de TGFpRII Fc ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 12). La secuencia enlazadora EPKSCDK (SEQ ID NO: 105) es opcional y se puede suprimir o sustituir por otro enlazador.
La Figura 11 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el ectodominio del receptor activador del factor nuclear kB (RANK), Fc, y el dominio extracelular (ectodominio) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), incluyendo el ectodominio de RANK Fc ectodominio de TGFpRII (SEQ ID NO:13) y el ectodominio de TGFpRII Fc ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 14). La secuencia enlazadora EPKSCDK (SEQ ID NO: 105) es opcional y se puede suprimir o sustituir por otro enlazador.
La Figura 12 muestra un resto inmunomodulador ejemplar que se une al ligando 1 de la muerte programada 1 (PD-L1 o B7-H1) o al ligando 2 de la muerte programada 1 (PD-L2 o B7-DC), incluyendo PD-1 de longitud completa o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 92), el dominio extracelular (ectodominio) de PD-1 o fragmento del mismo (SEQ ID NO: 93), y la región de unión al ligando del dominio extracelular (ectodominio) de PD-1 (SEQ ID NO: 94).
La Figura 13 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-HER2/neu y el ectodominio de PD-1, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-HER2/neu ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO:15), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 70).
La Figura 14 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-EGFR1 y el ectodominio de PD-1, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-EGFR ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 16), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-EGFR (SEQ ID NO: 71).
La Figura 15 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD20 y el ectodominio de PD-1, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-CD20 ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 17), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-CD20 (SEQ ID NO: 72).
La Figura 16 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-VEGF y el ectodominio de PD-1, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-VEGF ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 18), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-VEGF (SEQ ID NO: 73).
La Figura 17 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CTLA-4 humana y el ectodominio de PD-1, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-CTLA-4 ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 19), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-CTLA-4 (SEQ ID NO: 74).
La Figura 18 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD25 y el ectodominio de PD-1, incluyendo la cadena pesada anti-CD25 (Daclizumab) y el ectodominio de PD-1 (s Eq ID NO: 20), y la cadena ligera anti-CD25 (Daclizumab) (SEQ ID NO: 75) (Figura 18A), y la cadena pesada anti-CD25 (Basiliximab) y el ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 21), y la cadena ligera anti-CD25 (Basiliximab) (SEQ ID NO: 76) (Figura 18B).
La Figura 19 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen IL-2, Fc, y el ectodominio de PD-1, incluyendo IL-2 Fc ectodominio de PD-1 (SeQ ID NO: 22), y el ectodominio de PD-1 Fc IL-2 (SEQ ID NO: 23). El enlazador GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 104 es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK SEQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora bien conocida en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos se pueden sustituir en Fc, incluyendo E subrayado por D, y M subrayado por L.
La Figura 20 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD4 y el ectodominio de PD-1, incluyendo la cadena pesada anti-CD4 y el ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 24), y la cadena ligera anti-CD4 (SEQ ID NO: 77).
La Figura 21 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK), Fc, y el ectodominio de PD-1, incluyendo el ectodominio de RANK Fc ectodominio de PD-1 (SEQ ID NO: 25), y el ectodominio de PD-1 Fc ectodominio RANK (SEQ ID NO: 26). La secuencia enlazadora EPKSCDK (SEQ ID NO: 105) es opcional, y se puede suprimir o sustituir por otro enlazador.
La Figura 22 muestra un resto inmunomodulador ejemplar que se une al ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL), incluyendo RANK de longitud completa o fragmento del mismo (SEQ ID NO: 95), el dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 96), las secuencias de unión a RANKL o restos de RANK (SEQ ID NO: 93), o secuencias de unión a RANKL de osteoprotegerina (OPG) (SEQ ID NO: 98).
La Figura 23 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-HER2/neu y el ectodominio RANK, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-HER2/neu ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 27), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 70).
La Figura 24 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-EGFR1 y el ectodominio RANK, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-EGFR ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 28), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-EGFR (SEQ ID NO: 71). La Figura 25 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD20 y el ectodominio RANK, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-CD20 el ectodominio RANK (SEQ ID NO: 29), y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-CD20 (SEQ ID NO: 72). La Figura 26 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-VEGF y el ectodominio RANK, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-VEGF ectodominio RANK (SEQ ID NO: 30), y la secuencia de cadena ligera anti-VEGF (SEQ ID NO: 73).
La Figura 27 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CTLA-4 humana y el ectodominio RANK, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la fusión de la cadena pesada anti-CTLA-4 ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 31) y la cadena ligera anti-CTLA-4 (SEQ ID NO: 74).
La Figura 28 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD25 y el ectodominio de RANK, incluyendo la cadena pesada anti-CD25 (Daclizumab) y el ectodominio de RANK (SeQ ID NO: 32), y la cadena ligera anti-CD25 (Daclizumab) (SEQ ID NO: 75) (Figura 28A), y la cadena pesada anti-CD25 (Basiliximab) y el ectodominio de RANK (s EQ ID NO: 33), y la cadena ligera anti-CD25 (Basiliximab) (SEQ ID NO: 76) (Figura 28B).
La Figura 29 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen IL-2, Fc, y el ectodominio de RANK, incluyendo IL-2 Fc ectodominio de RANK (SEQ ID nO: 34), y ectodominio de RANK Fc IL-2 (SEQ ID NO: 35). El enlazador GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID nO: 104 es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK SEQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora bien conocida en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos se pueden sustituir en Fc, incluyendo E subrayado por D, y M subrayado por L.
La Figura 30 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD4 y el ectodominio de RANK, incluyendo la cadena pesada anti-CD4 y el ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 36), y la cadena ligera anti-CD4 (SEQ ID NO: 77).
La Figura 31 muestra un resto inmunomodulador ejemplar que se une a muerte programada 1 (PD-1), que incluye un ligando 1 de PD1 (PD-L1 o B7-H1) o un ligando 2 de PD-1 (PD-L2 o B7-DC), o un fragmento del mismo (por ejemplo, SEQ ID NO: 101), la proteína del ligando 1 de PD1 humana de longitud completa (B7-H1; PDCD1L1; Pd-L1; o CD274) o un fragmento de la misma (SEQ ID NO: 99), y el dominio de unión extracelular (ectodominio) de PD-L1 o un fragmento del mismo (SEQ ID NO: 100).
La Figura 32 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral (TNFa) y el ligando de PD-1, incluyendo la cadena pesada anti-TNFa PD-1L (SEQ ID NO: 37), y la cadena ligera anti-TNFa (SEQ ID NO: 78). La secuencia KKAE (SEQ ID NO: 107) se puede sustituir por KRVE (SEQ ID NO: 108) o KKVE (SEQ ID NO: 109).
La Figura 33 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, Fc, y el ligando de PD-1, incluyendo ECD de TNFR2 IgG Cy1 PD-L1 (SEQ ID NO: 38) y PD-L1 IgG Cy1 ECD de TNFR2 (SEQ ID NO: 39).
La Figura 34 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD20 y el ligando 1 de PD1 (PD-L1), incluyendo la secuencia de la cadena pesada anti-CD20 Pd-L1 (SEQ ID NO: 40), y la secuencia de la cadena ligera anti-CD20 (SEQ ID NO: 72).
La Figura 35 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD25 y el ligando 1 de PD1 (PD-L1), incluyendo la cadena pesada anti-CD25 (Daclizumab) y PD-L1 (SEQ ID NO: 41), y la cadena ligera anti-CD25 (Daclizumab) (SEQ ID NO: 75) (Figura 35A), y la cadena pesada anti-CD25 (Basiliximab) y el ectodominio de PD-1 (SEQ iD NO: 42), y la cadena ligera anti-CD25 (Basiliximab) (SEQ ID NO: 76) (Figura 35B).
La Figura 36 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen IL-2, Fc, y el ligando 1 de PD1 (PD-L1), incluyendo la proteína de fusión del ligando 1 de h-PD1 Fc IL-2 (SEQ ID NO: 43), y la proteína de fusión de IL-2 Fc ligando 1 de PD1 (SEQ ID NO: 44). El enlazador GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 104 es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK SEQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora bien conocida en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos se pueden sustituir en Fc, incluyendo E subrayado por D, y M subrayado por L.
La Figura 37 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD4 y el ligando 1 de PD1 (PD-L1), incluyendo la cadena pesada anti-CD4 y el ligando 1 de PD1 (Pd-L1) (SEQ ID NO: 45), y la cadena ligera anti-CD4 (SEQ ID NO: 77).
La Figura 38 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el dominio extracelular de CTLA-4, Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y una secuencia del ligando de PD-1 (PD-L1), incluyendo el péptido señal de Oncostatina M ECD de CTLA-4 IgG Cy1 PD-L1 (SEQ ID NO: 46), y PD-1L1 IgG Cyl ECD de CTLA-4 (SEQ ID NO: 47). La secuencia de IgG mostrada puede tener una conversión opcional de C a S (subrayada en negrita). El enlazador QEPKSCDK SEQ ID NO: 110 es opcional, y se puede sustituir por EPkSc DK SEQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora.
La Figura 39 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y una secuencia del ligando de PD-1 (PD-L1), incluyendo TGFp-1 Fc PD-L1 (SEQ ID NO: 48), y PD-1L1 Fc TGFp-1 (SEQ ID NO: 49). El enlazador GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 104 es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK SeQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora bien conocida en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos se pueden sustituir en Fc, incluyendo E subrayado por D, y M subrayado por L.
La Figura 40 muestra un resto inmunomodulador ejemplar que se une al receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR), incluyendo el factor beta de crecimiento transformante (TGF-p1, TGF-p2, o TGF-p3^, o un fragmento del mismo: secuencia completa de TGF-p1 (SEQ ID NO: 102), y la secuencia de TGF-p1 madura (activa) (Ala 279 - Ser 390; 112 aminoácidos) (SEQ ID NO: 103).
La Figura 41 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen un anticuerpo que se une a TNF-a, y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), incluyendo cadena pesada anti-TNFa TGF-p1 (SEQ ID NO: 50) y cadena ligera anti-TNFa (SEQ ID NO: 78). La secuencia KKAE (SEQ ID NO: 107) se puede sustituir por KRVE (SEQ ID NO: 108) o KKVE (SEQ ID NO: 109).
La Figura 42 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2 (ECD de TNFR2), Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), incluyendo ECD de TNFR2 IgG Cyl TGF-P1 (SEQ ID NO: 51), y TGF-P1 IgG Cyl ECD de TNFR2 (SEQ ID NO: 52).
La Figura 43 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD20 y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), incluyendo la secuencia de la cadena pesada anti-CD20 TGFp1 madura (SEQ ID NO: 53), y la secuencia de cadena ligera anti-CD20 (SEQ ID NO: 72).
La Figura 44 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD25 y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), incluyendo la cadena pesada anti-CD25 (Daclizumab) y TGF-P1 (SEQ ID NO: 54), y la cadena ligera anti-CD25 (Daclizumab) (SEQ ID NO: 75) (Figura 44A), y la cadena pesada anti-CD25 (Basiliximab) y TGF-P1 (SEQ ID NO: 55), y la cadena ligera anti-CD25 (Basiliximab) (SEQ ID NO: 76) (Figura 44B).
La Figura 45 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen IL-2, Fc, y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), incluyendo TGF-P1 Fc IL-2 (SEQ ID NO: 56) y IL-2 Fc TGF-P1 (SEQ ID NO: 57). El enlazador GGg Gs Gg GGSGg Gg S SEQ ID nO: 104 es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK SEQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora bien conocida en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos se pueden sustituir en Fc, incluyendo E subrayado por D, y M subrayado por L.
La Figura 46 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-CD4 y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), incluyendo la cadena pesada anti-CD4 y TGF-p (SEQ ID NO: 58), y la cadena ligera anti-CD4 (SEQ ID NO: 77).
La Figura 47 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el dominio extracelular de CTLA-4, Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), incluyendo el péptido señal de Oncostatina M ECD de CTLA-4 IgG Cy1 TGF-p1 (SEQ ID NO: 59), y TGF-p1 IgG Cyl ECD de CTLA-4 (SEQ ID NO: 60). La secuencia de IgG mostrada puede tener una conversión opcional de C en S (subrayada en negrita). El enlazador QEPKSCDK SEQ ID NO: 110 es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK SEQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora.
La Figura 48 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen un anticuerpo que se une a TNF-a, y una secuencia del ectodominio de RANK, incluyendo la cadena pesada anti-TNFa ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 61) y la cadena ligera anti-TNFa (SEQ ID NO: 78). La secuencia KKAE (SEQ ID NO: 107) se puede sustituir por KRVE (SEQ ID NO: 108) o KKVE (SEQ ID NO: 109).
La Figura 49 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2 (ECD de TNFR2), Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y una secuencia del ectodominio de RANK, incluyendo ECD de TNFR2 IgG Cyl ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 62), y ectodominio de RANK IgG Cyl ECD de TNFR2 (SEQ ID NO: 63).
La Figura 50 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen el dominio extracelular de CTLA-4, Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del ectodominio de RANK, incluyendo el péptido señal de Oncostatina M ECD de CTLA-4 IgG CyI ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 64), y ectodominio de RANK IgG CyI ECD de CTLA-4 (SEQ ID NO: 65). La secuencia de IgG mostrada puede tener una conversión opcional de C en S (subrayada en negrita). El enlazador QEPKSCDK SEQ ID NO: 110 es opcional, y se puede sustituir por EPKSCDK SEQ ID NO: 105 u otra secuencia enlazadora.
La Figura 51 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p), Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y una secuencia del ectodominio de RANK, incluyendo TGF-p IgG Cyl ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 66), y ectodominio de RANK IgG Cyl TGF-p (SEQ ID NO: 67).
La Figura 52 muestra proteínas de fusión ejemplares que incluyen una secuencia del ligando de PD-1 (PD-L1), Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y una secuencia de ectodominio de RANK, incluyendo PD-L1 IgG Cyl ectodominio de RANK (SEQ ID NO: 68), y ectodominio de RANK IgG Cyl PD-L1 (SEQ ID NO: 69).
La Figura 53 muestra que las células T reguladoras (Treg) se acumulan en el microentorno tumoral y contrarrestan la capacidad de la quimioterapia para activar la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+. (a) Exposición superficial de calreticulina (CRT) en respuesta al tratamiento de células cancerosas humanas (SW780) y murinas (MB49) con doxorrubicina (10 |iM) durante 4 h. La exposición superficial de CRT se determinó mediante citometría de inmunofluorescencia de células del control sin tratar o células tratadas con doxorrubicina teñidas con anticuerpo anti-CRT marcado con Dylight o un anticuerpo de control de isotipo (IgG1). (b) Cebado de respuestas inmunes reactivas a un tumor por células tumorales MB49 tratadas con doxorrubicina ex vivo o in vivo. 5x106 células MB49 que se pretrataron ex vivo con doxorrubicina (10 |iM) durante 4 h se inyectaron en un flanco de ratones C57BL/6 inmunocompetentes singénicos. Como alternativa, se inyectaron a ratones C57BL/6 con 5x105 células tumorales MB49 vivas, y entonces se administró doxorrubicina intratumoral (10 |ig) en el 10d tras la inoculación del tumor. Las respuestas inmunes reactivas a un tumor se determinaron midiendo la producción de IFN-y drenando células de ganglios linfáticos (DLN) en respuesta a la reexposición in vitro con lisados de células MB49, un péptido irrelevante (hemaglutinina-HA), o medio solo. (c) La vacunación con células tumorales tratadas con doxorrubicina induce inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+ que previene la formación de tumores tras la reexposición con células tumorales vivas. Se inyectaron subcutáneamente células MB49 ( 5x106), que se pretrataron in vitro con doxorrubicina (10 |iM) durante 4 h, en un flanco de ratones C57BL/6 inmunocompetentes singénicos. Ratones sin tratamiento previo o vacunados se expusieron a células tumorales MB49 vivas sin tratar inyectadas en el flanco opuesto con o sin pretratamiento con un anticuerpo anti-CD8 (clon GK2.43) (5 |ig x 2 dosis, iv) para agotar las células T CD8+. (d) La administración retrasada de quimioterapia en ratones con tumores preestablecidos disminuye su inmunogenicidad y eficacia antitumoral. Se inyectaron a ratones C57BL/6 con 5x105 células tumorales MB49 singénicas vivas, y entonces se administró doxorrubicina intratumoral (10 |ig) en d3, d7, o d10 tras la inoculación del tumor. (e) Los tumores fomentan la acumulación de células CD4+CD25+FoxP3+ (Tregs) en su microentorno. Análisis citométricos de flujo del porcentaje de células CD4+CD25+FoxP3+ (Tregs) entre linfocitos T CD4+ aislados del bazo, ganglios linfáticos que drenan (DLN), y tumores de ratones C57BL/6 inmunocompetentes en d0 y d14 tras la inoculación subcutánea de 5x105 células tumorales MB49 vivas. (f) Las Tregs que se infiltran en el microentorno tumoral suprimen el cebado de las respuestas inmunes reactivas a un tumor por células tumorales tratadas con doxorrubicina. Ratones C57BL/6 sin tratamiento previo se vacunaron con 5x106 células MB49 exterminadas con doxorrubicina con o sin transferencia adoptiva intravenosa de 5x106 células CD4+ CD25+ aisladas de tumores y de DLN de ratones que portan tumores, vía separación inmunomagnética. Las respuestas inmunes reactivas a un tumor se determinaron midiendo la producción de IFNy por células de ganglios linfáticos que drenan (DLN) en respuesta a la reexposición in vitro con lisados de células MB49, un péptido irrelevante (hemaglutinina-HA), o medio solo. (g) Las Tregs que se infiltran en el microentorno tumoral suprimen la activación de la inmunidad antitumoral adaptativa en respuesta a la muerte de células tumorales inducida por quimioterapia. Ratones C57BL/6 sin tratamiento previo se vacunaron con 5x106 células MB49 exterminadas con doxorrubicina (flanco izquierdo) con o sin pretratamiento con un anticuerpo anti-CD8 (Clon GK2.43) (5 |ig x 2 dosis, iv) para agotar las células T CD8+, o transferencia adoptiva de 5x106 células CD4+ CD25+ aisladas de tumores y DLN de ratones que portan tumores. La inmunidad antitumoral protectora en ratones vacunados se determinó mediante la evaluación del crecimiento tumoral con la exposición con células tumorales MB49 vivas sin tratar inyectadas en el flanco opuesto.
La Figura 54 muestra que la inhibición de TGF-p en el microentorno tumoral reduce las células T reguladoras FoxP3+ “adaptativas”, y potencia la quimioterapia con eficacia antitumoral. (a) El crecimiento tumoral da como resultado un incremento progresivo en el nivel de TGF-p sérico. Los niveles de TGF-p en suero de ratones a d0, d14, y d28, tras la inoculación de 5x105 células tumorales MB49 vivas, se evaluaron utilizando ELISA. (b) La expresión autónoma de células tumorales de TGF-p es la fuente dominante de TGF-P elevado en ratones que portan tumores. Células tumorales o células de ganglios linfáticos que drenan, aisladas de ratones que portan tumores o de sus homólogos libres de tumores, se cultivaron ex vivo en medio libre de suero durante 24 h, y la cantidad de TGF-p/106 células en sobrenadantes se midió mediante ELISA. (c) TGFpRII:Fc secuestra TGF-p en sobrenadantes de células tumorales MB49 de una manera dependiente de la concentración. Células tumorales MB49 se cultivaron en presencia de concentraciones graduadas de TGFpRII:Fc (0-400 ng/ml) durante 24 h, seguido de la medida de TGF-p (pg/ml/106 células) en sobrenadantes, vía ELISA. (d) TGF-p induce células T reguladoras FoxP3+ “adaptativas” en el microentorno tumoral. En el d5 tras la inoculación de células tumorales MB49, los ratones se dejaron sin tratar (control) o se trataron con TGFpRII:Fc (1 |ig intratumoral; dos veces a la semana) durante 3 semanas, seguido de los análisis citométricos de flujo de la expresión de FoxP3 intracelular en células T CD4+CD25+ que se infiltran en los tumores. (e, f) El secuestro de TGF-p intratumoral con TGFpRII:Fc reduce las Tregs CD4+CD25+FoxP3+ en tejido tumoral, y mejora la eficacia antitumoral de doxorrubicina. Se administró doxorrubicina (5 mg/kg, i.p., semanalmente x 3) a ratones que portan el tumor MB49, con o sin el tratamiento dos veces a la semana con TGFpRII:Fc (1 |ig intratumoral). El porcentaje de células CD4+CD25+FoxP3+ (Tregs) entre células tumorales se evaluó mediante citometría de flujo (e), y el volumen tumoral se monitorizó para determinar el efecto de contrarrestar la tolerancia inmune mediada por TGF-p inducida por un tumor sobre la eficacia antitumoral in vivo de doxorrubicina (f).
La Figura 55 muestra que el agotamiento, mediado por el anticuerpo anti-CD4, de células T reguladoras CD4+ facilita la activación inducida por quimioterapia de células T CD8+ reactivas a un tumor, y potencia la eficacia antitumoral de la quimioterapia. (a) Agotamiento in vivo de células T CD4+CD25+FoxP3+ que se infiltran en el tumor mediante tratamiento de ratones que portan un tumor con anticuerpo anti-CD4. Ratones C57BL/6 inyectados con 5x105 células tumorales MB49 s.c. se dejaron sin tratar (control) o se les administró un anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) i.p. a 5d y 9d tras la exposición al tumor. Se detectaron mediante citometría de flujo células T CD4+CD25+FoxP3+ que se infiltran en los tumores aislados de ratones en el d16 tras la exposición a un tumor. (b) Agotamiento específico de la diana de células T CD4+, células T CD4+CD25+FoxP3+, o células T CD8+ mediante tratamiento de ratones que portan un tumor con anticuerpo anti-CD4 o anticuerpo anti-CD8. Ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5x105 células tumorales MB49 se dejaron sin tratar o se trataron con doxorrubicina (5 mg/kg, i.p., semanalmente x 3), comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin la administración de anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) o anticuerpo anti-CD8 (Clon GK2.43) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. Los análisis citométricos de flujo de células mononucleares de sangre periférica aisladas de ratones en el d16 tras la exposición al tumor determinaron el porcentaje de células T c D4+ o células T CD8+ entre las células mononucleares totales, y el porcentaje de células T CD4+CD25+FoxP3+ entre células T CD4+ totales. (c) El agotamiento de células T reguladoras CD4+ facilita la activación inducida por quimioterapia de células T CD8+ reactivas a un tumor. Ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5x105 células tumorales MB49 se dejaron sin tratar o se trataron con doxorrubicina (5 mg/kg, i.p., semanalmente x 3), comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin la administración de anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. Las respuestas inmunes reactivas a un tumor se determinaron mediante análisis citométricos de flujo de la expresión de IFN-y en células T CD8+ del tumor y ganglios linfáticos que drenan en respuesta a la estimulación in vitro con lisados de células MB49. (d) El agotamiento de células T reguladoras c D4+ aumenta la eficacia antitumoral in vivo de la quimioterapia vía activación de células T CD8+ reactivas a un tumor. Ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5x105 células tumorales MB49 se dejaron sin tratar o se trataron con doxorrubicina (5 mg/kg, i.p., semanalmente x 3), comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin la administración de anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) o anticuerpo anti-CD8 (Clon GK2.43) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. El volumen tumoral se monitorizó para determinar el efecto del agotamiento de células T CD4+ o células T CD8+ sobre la eficacia antitumoral in vivo de doxorrubicina.
La Figura 56 muestra que el agotamiento mediado por el anticuerpo anti-CD4 de células T reguladoras CD4+ aumenta y sostiene el efecto antitumoral de la quimioterapia al permitir la activación de la inmunidad antitumoral adaptativa. (a) Exposición superficial de calreticulina (CRT) en respuesta al tratamiento de células cancerosas MB49 con cisplatino o la combinación de cisplatino y gemcitabina durante 4 h. La exposición superficial de CRT se determinó mediante citometría inmunofluorescente de células del control no tratadas o de células tratadas con quimioterapia teñidas con el anticuerpo anti-CRT marcado con Dylight o un anticuerpo de control de isotipo (IgG1). (b, c) El agotamiento de células T reguladoras CD4+ permite la activación inducida por cisplatino de células T IFN-y+CD8+ reactivas a un tumor y de células T de memoria efectora (CD8+CD62L'). Ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5x105 células tumorales MB49 se dejaron sin tratar o se trataron con cisplatino (0,5 mg/kg, i.p., semanalmente x 4) comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin administración del anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. Las respuestas inmunes reactivas a un tumor se determinaron mediante análisis citométricos de la expresión de IFN-y en células T CD8+ procedentes del tumor y de ganglios linfáticos que drenan (DLN) en respuesta a la estimulación in vitro con lisados de células MB49 (b). El porcentaje de células de memoria efectora Tem se determinó mediante análisis citométricos de flujo de células CD8+CD62L' (c). (d, e, f) El agotamiento de células T reguladoras CD4+ aumenta la eficacia antitumoral in vivo de la quimioterapia vía activación de células T CD8+ reactivas a un tumor. Ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x105 células tumorales MB49 se dejaron sin tratar o se trataron con cisplatino (0,5 mg/kg) o la combinación de cisplatino y gemcitabina (i.p., semanalmente x 4) comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin la administración de anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) o anticuerpo anti-CD8 (Clon GK2.43) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. El volumen tumoral se monitorizó para determinar el efecto del agotamiento de células T CD4+ o células T CD8+ sobre la eficacia antitumoral in vivo de la quimioterapia, y el porcentaje de ratones que muestran regresión tumoral completa hacia el d50 tras la inoculación del tumor. El establecimiento de inmunidad antitumoral adaptativa tras la regresión de los tumores primarios se determinó volviendo a exponer a los ratones a células tumorales MB49 vivas en el flanco opuesto.
La Figura 57 muestra que la expresión inducida por quimioterapia de ligandos de NKG2D en células tumorales coopera con el agotamiento de células T reguladoras CD4+ para estimular la regresión tumoral mediada por células T CD8+. (a) Los agentes quimioterapéuticos genotóxicos inducen expresión de ligandos de NKG2D de ratón (Rae-1) en células cancerosas. La cinética del aumento de los transcritos de Rae1 en células de cáncer de colon CT26 de ratón se determinó mediante PCR en tiempo real cuantitativa tras el tratamiento con irinotecán (25 |ig/ml) u oxaliplatino (10 |ig/ml). La RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo usando cebadores específicos de Rae-1 [sentido, 5'-CTAGTGCCACCTGGGAATTCA-3' (SEQ ID NO: 111); antisentido, 5'-CATCATTAGCTGATCTCCAGCTCA-3'(SEQ ID NO: 112)] y la sonda [5'-6-FAM-CATCAGTGACAGTTACTTCTTCACCTTCTACACAGAGA-Tamra-3' (SEQ ID NO: 113)]. (b) Los agentes quimioterapéuticos genotóxicos inducen la expresión en la superficie de las células independiente de P53 de ligandos NKG2D humano (moléculas A y B relacionadas con MHC-I - MICA/MICB) en células cancerosas. Células HCT116 isogénicas proficientes en p53 (p53+/+) o deficientes en p53 (p53'A) se trataron con irinotecán (25 |ig/ml) durante 16 h, o se dejaron sin tratar. El aumento inducido por irinotecán de la expresión MICA/B en la superficie celular se determinó mediante análisis citométrico de flujo de células tumorales marcadas con un MAb anti-MICA/B humana (R&D Systems). (c) y (d) La inducción de ligandos de NKG2D contribuye al efecto antitumoral de la quimioterapia in vivo. Ratones Balb/C inmunocompetentes inyectados s.c. con 2x105 células tumorales CT26 singénicas se trataron con irinotecán (50 mg/kg, i.p., semanalmente x 3) comenzando en el d5 tras la inoculación del tumor, con o sin pretratamiento con un anticuerpo bloqueante de NKG2D (CX5, eBIOscience) (200 |ig i.p.) a 16 h antes de cada dosis de quimioterapia. El volumen tumoral se monitorizó para determinar el efecto del bloqueo de NKG2D sobre la eficacia antitumoral in vivo de irinotecán. (e) Agotamiento in vivo de células T CD4+CD25+FoxP3+ mediante tratamiento de ratones que portan tumores con anticuerpo anti-CD4. Ratones Balb/C inyectados s.c. con 2x10(i) *5 células tumorales CT26 se dejaron sin tratar o se trataron con irinotecán (50 mg/kg, i.p., semanalmente x 3) comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin la administración de anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. Las células T CD4+CD25+FoxP3+ en el bazo y ganglios linfáticos que drenan aisladas de ratones en el d16 tras la exposición al tumor se detectaron mediante citometría de flujo. (f) El agotamiento de células T reguladoras CD4+ facilita la activación inducida por irinotecán de células T IFN-y+CD8+ reactivas a un tumor. Ratones Balb/C inyectados s.c. con 2x105 células tumorales CT26 se dejaron sin tratar o se trataron con irinotecán (50 mg/kg, i.p., semanalmente x 3) comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin la administración de anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. Las respuestas inmunes reactivas a un tumor se determinaron mediante análisis citométricos de flujo de la expresión de IFN-y en células T CD8+ procedentes del tumor y de ganglios linfáticos que drenan (DLN) en respuesta a la estimulación in vitro con lisados de células CT26, un péptido irrelevante (hemaglutinina-HA), o medio solo. (g) y (h) La expresión inducida por quimioterapia de ligandos de NKG2D en células tumorales coopera con el agotamiento de células T reguladoras CD4+ para estimular la regresión tumoral mediada por células T CD8+. Ratones Balb/C inyectados s.c. con 2x105 células tumorales CT26 se dejaron sin tratar o se trataron con irinotecán (50 mg/kg, i.p., semanalmente x 3) comenzando en el d7 tras la inoculación del tumor, con o sin la administración de anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) y/o anticuerpo anti-CD8 (Clone GK2.43) en el d5 y d9 tras la inoculación del tumor. El volumen tumoral se monitorizó para determinar el efecto del agotamiento de células T CD4+ y/o células T CD8+ sobre la eficacia antitumoral in vivo de irinotecán.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunoestimuladores dirigidos contra dianas para la prevención o tratamiento de cáncer: la quimioterapia es una pieza clave del tratamiento sistémico de pacientes con los tipos más comunes de cánceres avanzados. La inmensa mayoría de cánceres humanos albergan alteraciones genéticas y mecanismos de señalización que alteran las rutas de señalización de muerte directa producidas por agentes quimioterapéuticos. Aunque los agentes quimioterapéuticos emplean diversos mecanismos para exterminar directamente células tumorales, la presente invención proporciona que estos agentes tengan efectos inmunoadyuvantes que activan respuestas inmunes antitumorales innatas y adaptativas que son cruciales para su eficacia antitumoral in vivo. La presente invención también proporciona que las células T CD8+ antitumorales desempeñen un papel fundamental en la respuesta in vivo de tumores a diversos agentes quimioterapéuticos citotóxicos. Aunque los agentes quimioterapéuticos pueden inducir la muerte de células tumorales “inmunogénicas”, y pueden facilitar la presentación cruzada de antígenos por células dendríticas, los tumores crean un entorno tolerogénico que les permite suprimir la activación de respuestas inmunes innatas y adaptativas y evadir el ataque inmunológico por células efectoras inmunes. La presente invención proporciona que las estrategias para contrarrestar la tolerancia inmune inducida por un tumor en el microentorno tumoral pueden potenciar la eficacia antitumoral de la quimioterapia activando y haciendo uso de la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por células T contra células cancerosas diseminadas.
La presente invención se basa en el descubrimiento trascendental de que los anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas pueden contrarrestar o invertir la tolerancia inmune de células cancerosas. Las células cancerosas son capaces de escapar a la eliminación por los agentes quimioterapéuticos o anticuerpos dirigidos contra los tumores vía mecanismos inmunosupresores específicos en el microentorno tumoral, y tal capacidad de las células cancerosas es reconocida como tolerancia inmune. Contrarrestando la tolerancia inmune inducida por un tumor, la presente invención proporciona moléculas eficaces y su uso en métodos para el tratamiento del cáncer, opcional en combinación con otro tratamiento existente contra el cáncer.
La presente invención proporciona moléculas que contrarrestan la tolerancia inmune en el microentorno tumoral y promueven la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por células T para el mantenimiento de una protección a largo plazo duradera frente a cánceres recurrentes o diseminados. Estas moléculas inmunoestimuladoras dirigidas contra el tumor se diseñan para facilitar respuestas inmunes mediadas por células T a largo plazo y eficaces frente a células tumorales mediante al menos uno de los siguientes:
(i) promoviendo la muerte de células tumorales vía aumento de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC);
(ii) facilitando la presentación cruzada eficaz de antígeno o antígenos tumorales procedentes de células tumorales que están muriendo aumentando la maduración de células dendríticas (DCs); y
(iii) incrementando la activación y proliferación de células T CD8+ antitumorales al anular la supresión inmune mediada por células T reguladoras y células supresoras mieloides. Estas respuestas inmunes antitumorales se pueden activar en tándem con la sensibilización de células tumorales a la citotoxicidad mediada por efectores inmunes, estableciendo de ese modo un bucle de observaciones positivas que aumentan la citorreducción tumoral y refuerzan la inmunidad antitumoral adaptativa. Las moléculas de fusión bifuncional a las que se dirigen de la presente invención proporcionan la capacidad para generar y promover la inmunidad antitumoral frente a múltiples antígenos tumorales presentados de forma cruzada obtenidos de células tumorales endógenas durante el transcurso de la terapia (como en una vacuna tumoral in situ), a la vez que hacen uso simultáneamente de la respuesta inmune antitumoral para eliminar células cancerosas diseminadas.
Mientras que la inmunoterapia pasiva del cáncer con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el tumor ha demostrado eficacia clínica, la meta de la vacunación terapéutica activa para inducir inmunidad medada por células T y establecer memoria inmunológica frente a células tumorales ha seguido siendo un reto. Se han identificado varios antígenos específicos de tumores y asociados a tumores, aunque los tumores emplean diversos mecanismos para crear un entorno tolerogénico que les permite suprimir la activación de una respuesta inmune antitumoral mediada por células T. Las moléculas de fusión bifuncionales a las que se dirigen de la invención se diseñan para superar tal tolerancia inmune en el microentorno tumoral y activar niveles robustos de respuestas de células T para la inmunoterapia o quimioinmunoterapia eficaz contra el cáncer. En consecuencia, las moléculas de fusión bifuncionales a las que se dirigen de la invención tienen una relevancia clínica amplia para promover el tratamiento de muchos tipos de cánceres humanos.
Las moléculas de fusión bifuncionales a las que se dirigen usadas en la invención proporcionan la capacidad para generar y promover la inmunidad antitumoral frente a múltiples antígenos tumorales presentados de forma cruzada obtenidos de células tumorales endógenas durante el transcurso de la terapia (como en la vacuna tumoral in situ) a la vez que aprovechan simultáneamente la respuesta inmune antitumoral para eliminar células cancerosas diseminadas. Este enfoque de la presente invención se distingue de y es superior a vacunas convencionales a base de antígenos tumorales, a base de células tumorales alogénicas o a base de DC en al menos uno de los siguientes aspectos: (i) no hay ningún requisito a priori para definir, clonar y purificar antígenos tumorales individuales, puesto que el propio tumor del paciente es la fuente in vivo de antígeno; (ii) es menos probable que las respuestas inmunes antitumorales multivalentes que se confeccionan naturalmente a medida frente a antígenos del tumor del propio paciente permitan el escape inmune que un antígeno tumoral preseleccionado; (iii) la activación de respuestas inmunes antitumorales por los efectos inmunoadyuvantes de moléculas de fusión bifuncionales se produce en tándem con la sensibilización de células tumorales a la citotoxicidad mediada por efectores inmunes, estableciendo de ese modo un bucle de retroalimentación positiva que aumenta la citorreducción tumoral y refuerza la inmunidad antitumoral adaptativa; y (iv) las moléculas de la descripción tienen una relevancia clínica amplia para promover el tratamiento de muchos tipos de cánceres humanos.
Además, las moléculas de fusión bifuncionales usadas en la invención se distinguen de y son superiores a las moléculas terapéuticas existentes en al menos uno de los siguientes aspectos: (i) para contrarrestar la tolerancia inmune en el microentorno tumoral y promover la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por células T para el mantenimiento de la protección a largo plazo frente a cánceres recurrentes o diseminados (para prevención o tratamiento de diversos cánceres); (ii) para producir composiciones de células inmunes para la terapia celular adoptiva de diversos cánceres; y (iii) para servir como adyuvantes o vacunas inmunes para la profilaxis de diversos cánceres.
Las moléculas de fusión bifuncionales a las que se dirigen usadas en la invención proporcionan la capacidad para interrumpir redes inmunosupresoras en el microentorno tumoral. Los tumores emplean un amplio conjunto de mecanismos reguladores para evitar o suprimir la respuesta inmune. Las células cancerosas promueven de forma activa la tolerancia inmune en el microentorno tumoral vía la expresión de citocinas y moléculas que inhiben la diferenciación y maduración de células dendríticas presentadoras de antígenos. Las citocinas y ligandos inmunosupresores producidos por las células tumorales incluyen los siguientes: (i) factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); (ii) ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1; B7-H1); (iii) factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); y (iv) interleucina-10 (IL-10). Además de bloquear la maduración de células dendríticas (DC), estas moléculas promueven el desarrollo de subconjuntos especializados de células T CD4+ inmunosupresoras (células T reguladoras; células Treg) y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). Las Tregs son una subpoblación minoritaria de células T CD4+ que expresan constitutivamente CD25 [la cadena a del receptor de interleucina 2 (IL-2)] y el factor de transcripción de la “caja de la cabeza del tenedor” (forkhead box) P3 (FOXP3). Las Tregs (células CD4+CD25+FoxP3+) mantienen la tolerancia inmune al impedir la activación, proliferación, y funciones efectoras de un amplio intervalo de células inmunes, incluyendo células T CD4+ y CD8+, células asesinas naturales (NK) y NKT, células B y células presentadoras de antígenos (APCs) in vitro e in vivo. La acumulación de células Treg en el microentorno tumoral refuerza la tolerancia inmune tumoral, y facilita la progresión y metástasis tumorales. La mayor expresión de citocinas inmunosupresoras (TGF-P; PD-L1) y Tregs que se infiltran en el tumor está correlacionada con una reducción de la supervivencia de los pacientes con diversos tipos de cánceres. La presente invención proporciona que la tolerancia inmune inducida por el tumor mediada vía Tregs es un determinante crucial de la resistencia de los cánceres a agentes quimioterapéuticos citotóxicos y anticuerpos dirigidos contra el tumor. Las moléculas de fusión bifuncionales a las que se dirigen usadas en la invención inhiben moléculas inmunosupresoras clave expresadas por la célula tumoral seleccionada como diana o células Treg que se infiltran en el tumor y células supresoras de mieloides (DCs o MDSC). Como tales, proporcionan la capacidad buscada para inhibir el desarrollo o función de Tregs en el microentorno tumoral. En otro aspecto, proporcionan la capacidad de contrarrestar la supresión inmune inducida por Tregs en el microentorno tumoral.
Las moléculas de fusión bifuncionales a las que se dirigen usadas en la invención proporcionan la capacidad para inhibir el desarrollo o funciones de Tregs y células supresoras de mieloides (DCs o MDSC) en el microentorno tumoral. Las Tregs (células CD4+CD25+FoxP3+) expresan un conjunto de citocinas y moléculas inmunosupresoras que actúan conjuntamente para inducir la tolerancia inmune y promover la progresión y metástasis tumorales. Estas incluyen: (i) proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; CD 152), un receptor coinhibidor que se une a los ligandos CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2) en la célula presentadora de antígenos (APC) e inhibe la coestimulación de células T; (ii) ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1; B7-H1), un ligando que se acopla al receptor coinhibidor muerte programada 1 (PD-1) e inhibe la activación y proliferación de células T; (iii) factor beta de crecimiento transformante (TGF-P), una citocina que regula las respuestas inmunes al restringir la maduración y la función presentadora de antígenos de las células dendríticas, inhibiendo la proliferación y activación de células T sin tratamiento previo, suprimiendo la expresión de moléculas citotóxicas (Granzyme A/B, FasL, Apo2L/TRAIL, IFN-y) en células efectoras inmunes, y promoviendo el desarrollo y función de Tregs; (iv) ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL), un ligando que se acopla al receptor activador del factor nuclear k B (RANK) y promueve la diferenciación de osteoclastos, el desarrollo de Tregs, y las metástasis tumorales. Además, las Tregs expresan otras moléculas de superficie; (v) LAG-3, una molécula relacionada con CD4 que se une a MHC clase II; (vi) el gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; TNFRSF18); y (vii) IL-10. Los anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunoestimuladores dirigidos contra dianas desvelados en el presente documento proporcionan la capacidad para unirse a una molécula seleccionada como diana expresada por Tregs o células supresoras de mieloides, a la vez que secuestra e inhibe concurrentemente una o más moléculas inmunosupresoras que promueven su desarrollo, supervivencia o función. En un aspecto, los anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunoestimuladores dirigidos contra dianas agotan directamente el número de Tregs.
En una realización, la presente descripción describe una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador. El resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula diana en la célula tumoral o microentorno tumoral (estroma tumoral, vasculatura tumoral, o célula inmune infiltrante en el tumor), y el resto inmunomodulador se une específicamente a una molécula inmunosupresora expresada por la célula tumoral o células Treg que se infiltran en el tumor y células supresoras de mieloides (DC o MDSC) seleccionadas como diana.
En una realización, la presente descripción describe una molécula, que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador. El resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula diana expresada por células Treg, células supresoras de mieloides (MDSC), o células dendríticas (DC), y el resto inmunomodulador se une específicamente a una molécula inmunosupresora que promueve su desarrollo, supervivencia o función.
En una realización, la presente descripción describe una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador. El resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula diana, y el resto inmunomodulador se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); (ii) ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2); (iii) ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL); (iv) factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); (v) receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-PR); (vi) muerte programada 1 (PD-1); y (vii) receptor activador del factor nuclear k B (RANK).
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, o polipéptido que contiene Fc que se une específicamente a un componente de una célula tumoral, antígeno tumoral, vasculatura tumoral, microentorno tumoral, o célula inmune que se infiltra en el tumor. El resto seleccionador de dianas se puede unir específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR1, Erb-B1), HER2/neu (Erb-B2), CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1R), receptor de TRAIL, molécula de adhesión de células epiteliales, antígeno carcinoembrionario, antígeno de membrana específico de la próstata, Mucina-1, CD30, CD33, o CD40.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une específicamente a un componente de una célula T reguladora, célula supresora de mieloides, o célula dendrítica. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) CD4; (ii) CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR); CD152); (iii) interleucina-10 (IL-10); (iv) receptor de factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR); (v) receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); ; (vi) receptor activador del factor nuclear k B (RANK); (x) ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL); o (viii) gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; TNFRSF18). De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas se puede unir específicamente al antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; CD152); muerte programasa 1 (PD-1); ligando de muerte programada 1 (PD-L1 o PD-L2) o LAG-3.
De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador se puede unir específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); (ii) ligando de muerte programada 1 (PD-L1 o PD-L2); (iii) ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL); o (iv) factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir una molécula que se une a TGF-p. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular del receptor del factor beta de crecimiento transformante TGF-pRII, TGF-pRIIb, o TGF-pRIII. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. De acuerdo con la invención, la molécula puede incluir una secuencia de aminoácidos que se une a TGF-p correspondiente a SEQ ID NOs: 79-91. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede inhibir la actividad o función de TGF-p.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4. De acuerdo con la invención, un resto seleccionador de dianas puede incluir un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido que e une específicamente al antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. Las moléculas desveladas en el presente documento incluyen una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 o 10. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID NO: 5.
En un aspecto, el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a muerte programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1), o ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En otro aspecto, el resto seleccionador de dianas incluye un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio de muerte programada 1 (PD-1). En un aspecto adicional, el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. En otro aspecto, la molécula incluye el ectodominio de PD-1, la región Fc de inmunoglobulina, y el ectodominio de TGFpRII. En otro aspecto, la molécula incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 11 o 12.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al receptor activador del factor nuclear k B (RANK) o al ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL). En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de TGF-pRII. En el presente documento se desvela una molécula que incluye el ectodominio de RANK, la región Fc de inmunoglobulina, y el ectodominio de TGFpRII. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 13 o 14.
De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir una molécula que se une específicamente al ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o al ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En otro aspecto, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio de muerte programada 1 (PD-1). En otro aspecto, la molécula puede incluir una secuencia de aminoácidos que se une a PD-L1 que corresponde a SEQ ID NO: 92, 93, o 94. En un aspecto adicional, el resto inmunomodulador inhibe la actividad o función de ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1).
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas puede incluir un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido que se une específicamente al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio de muerte programada 1 (PD-1). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, o 24. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos que se corresponde con SEQ ID NO: 19.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al receptor activador del factor nuclear k B (RANK) o al ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL). En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular de muerte programada 1 (PD-1). Una molécula de la invención puede incluir el ectodominio de RANK, la región Fc de inmunoglobulina, y el ectodominio de PD-1. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 25 o 26.
De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir una molécula que se une específicamente al ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En otro aspecto, la molécula incluye una secuencia de aminoácidos que se une a RANKL correspondiente a SEQ ID NO: 95, 96, 97, o 98. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede inhibir la actividad o función del ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANKL).
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas puede incluir un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o un polipéptido que se une específicamente al antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador puede incluir un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, o 36. Una molécula de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos correspondiente con la SEQ ID NO: 31.
La presente descripción describe nuevos anticuerpos y proteínas de fusión inmunosupresores dirigidos contra dianas que inducen o promueven tolerancia inmune mediante al menos uno de lo siguiente:
(i) inhibiendo la activación de células dendríticas, células T, y/o células B; y
(ii) promoviendo el desarrollo y/o función supresora de células T reguladoras y DCs de mieloides inmunosupresoras. Estas moléculas inmunosupresoras dirigidas contra dianas de la descripción se diseñan para suprimir las respuestas inmune o inflamatoria indeseadas o excesivas a fin de tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias o prevenir el rechazo de una célula, tejido u órgano transplantado.
Anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunosupresores dirigidos contra dianas: la activación aberrante de células T autorreactivas y/o la ruptura de los mecanismos de tolerancia inmune promueven el desarrollo de autoinmunidad que da como resultado diversas enfermedades, incluyendo diabetes mellitus tipo I, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria del intestino, y artritis reumatoide. Los anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunosupresores dirigidos contra dianas de la divulgación se diseñan para suprimir respuestas inmunes o inflamatorias indeseadas o excesivas y restaurar o promover la tolerancia inmune. En consecuencia, las composiciones y su uso en métodos de la divulgación tienen importancia clínica amplia para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes o inflamatorias y prevenir el rechazo de una célula, tejido o injertos de órgano transplantados.
Los anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunosupresores dirigidos contra dianas de la descripción proporcionan la capacidad para inhibir la actividad de citocinas proinflamatorias o células inmunes seleccionadas como diana, a la vez que promueven simultáneamente la tolerancia inmune vía el suministro dirigido de moléculas inmunosupresoras que facilitan el desarrollo y/o función de células T reguladoras. Estas moléculas de la presente descripción se distinguen de y son superiores a moléculas terapéuticas existentes en al menos uno de los siguientes aspectos: (i) las moléculas de la descripción permiten el suministro dirigido de moléculas inmunosupresoras a células inmunes o moléculas proinflamatorias en el ambiente de la célula, tejido u órgano afectado; (ii) las moléculas de la descripción pueden acoplar la inhibición de la molécula proinflamatoria o célula inmune seleccionadas como diana con el suministro simultáneo de una molécula inmunosupresora que promueve la tolerancia inmune, mejorando de ese modo la supresión de células efectoras inmunes; y (iii) las moléculas de la descripción pueden proporcionar un mecanismo para acoplar simultáneamente dos mecanismos independientes o sinérgicos de tolerancia inmune o supresión inmune.
Adicionalmente, los anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunosupresores dirigidos contra dianas de la descripción se distinguen de y son superiores a moléculas terapéuticas existentes en al menos uno de los siguientes aspectos: (i) para suprimir respuestas inmunes o inflamatorias indeseadas o excesivas a fin de tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias; y (ii) para prevenir el rechazo de injertos de células, tejidos u órganos transplantados.
En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que se une a PD-1 correspondiente a SEQ ID NO: 99, 100, o 101. Un resto inmunomodulador desvelado en el presente documento puede incrementar la función de PD-1.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo que se une a TNF -a, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de PD1 (PD-L1 o B7-H1). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 37. En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un dominio de unión al ligando extracelular del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de PD1 (PD-L1 o B7-H1). En el presente documento se desvela una molécula que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, la región Fc de inmunoglobulina, y una secuencia de PD-L1. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 38 o 39.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20, CD25, o CD4, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 40, 41, 42, 43, 44, o 45.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye el dominio extracelular de CTLA-4 y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 46 o 47.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye el factor p de crecimiento transformante (TGF-P) y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o del ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 48 o 49.
En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 99, 100, o 101. Un resto inmunomodulador desvelado en el presente documento puede activar la función de señalización del receptor factor p de crecimiento transformante (TGF-p).
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P). En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo que se une a TNF-a, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia de TGF-p. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 50. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, la región Fc de inmunoglobulina, y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 51 o 52.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20, CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR), o CD4, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 53, 54, 55, 56, 57 o 58.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un dominio extracelular de CTLA-4 y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cyl), y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 59 o 60.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido que se une específicamente al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear kB (RANK) o de osteoprotegerina (OPG). En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo que se une a TNF-a, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia de un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio de RANK. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 61. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un dominio de unión al ligando extracelular del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2). En el presente documento se desvela una molécula que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, la región Fc de inmunoglobulina, y una secuencia de un dominio de unión a RANK extracelular o ectodominio de RANK. En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 62 o 63.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un dominio extracelular de CTLA-4 y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) o de osteoprotegerina (OPG). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 64 o 65.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P) y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 66 o 67.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) y la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a RANKL extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear k B (RANK). En el presente documento se desvela una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 68 o 69.
En diversos aspectos, la molécula se fusiona o se enlaza directamente a uno o más antígenos, determinantes antigénicos, o epítopos.
En otra realización, la presente descripción describe una composición que incluye la molécula de la descripción y una célula, en la que la célula es una célula tumoral, célula inmune, o célula dendrítica.
En otra realización, la presente descripción describe un método para contrarrestar o superar la tolerancia inmune. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una o más moléculas de la descripción.
En otra realización, la presente descripción describe un método para prevenir o tratar una enfermedad neoplásica. En un aspecto, la enfermedad neoplásica es una neoplasia no de células T que no expresa CD4 en la célula tumoral. En una realización, el método incluye administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo que se dirige contra y agota células T reguladoras CD4+ (Tregs), en combinación con una terapia anticancerosa citotóxica. En un aspecto, el anticuerpo que se dirige contra y agota Tregs es un anticuerpo anti-CD4. En diversos aspectos, la terapia anticancerosa citotóxica incluye una molécula quimioterapéutica, anticuerpo dirigido a un tumor, inhibidor de cinasa de pequeña molécula, agente hormonal, o agente citotóxico dirigido contra un tumor, agente antiangiogénico, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, la terapia anticancerosa citotóxica incluye radiación ionizante, radiación ultravioleta, crioablación, ablación térmica, o ablación por radiofrecuencias.
Un método desvelado en el presente documento incluye administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo o molécula que se dirige contra y agota células T reguladoras CD4+ (Tregs) en combinación con un anticuerpo inmunoestimulador, proteína de fusión, péptido o ligando inmunoestimulador que se dirige contra CTLA-4, PD1, PD-1L, RANKL, TGF- p, GITR, 4-1BB, OX-40, o receptores de tipo Toll (TLR 1-10). En un aspecto, el agonista de TLR comprende un activador de TLR-8 o TLR-9. En un aspecto, el agonista de TLR comprende una secuencia de ácido nucleico inmunoestimuladora que contiene nucleótidos CpG. En un aspecto, el anticuerpo que se dirige contra y que agota Tregs es un anticuerpo anti-CD4.
En otra realización, la presente invención proporciona una molécula de la invención para uso en un método para prevenir o tratar un trastorno neoplásico o un cáncer. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una molécula de la invención. En diversos aspectos, al sujeto se le administra la molécula de la invención en combinación con otra terapia anticancerosa. En un aspecto, la terapia anticancerosa incluye una molécula quimioterapéutica, anticuerpo, inhibidor de cinasa de pequeña molécula, agente hormonal, agente citotóxico, agente terapéutico dirigido contra dianas, o agente antiangiogénico. Otras terapias contra el cáncer incluyen radiación ionizante, radiación ultravioleta, crioablación, ablación térmica, o ablación por radiofrecuencias. En otro aspecto, al sujeto se le administra la molécula de la invención en combinación con un anticuerpo o molécula que inhibe la producción o función de células T reguladoras (Tregs), o agota el número de Tregs. En un aspecto, el anticuerpo que se dirige contra y agota Tregs es un anticuerpo anti-CD4. En otro aspecto, la molécula que contrarresta la función de Tregs es un anticuerpo, proteína de fusión, péptido o ligando que se dirige contra CTLA-4, PD1, PD-1L, RANKL, TGF-p, GITR. En otro aspecto, la molécula que contrarresta la función de Tregs es un anticuerpo o proteína de fusión o ligando que se dirige contra 4-1BB o OX-40. En otro aspecto, la molécula que contrarresta la función de Tregs es un agonista de receptores de tipo Toll (TLR 1-10). En un aspecto, el agonista de TLR comprende un activador de TLR-8 o TLR-9. En un aspecto, el agonista de TLR es una secuencia de ácido nucleico inmunoestimuladora que contiene nucleótidos CpG.
En un aspecto, el agente quimioterapéutico es un agente que interacciona con topoisomerasas, antraciclina, doxorrubicina, mitoxantrona, camptotecina, análogo de camptotecina, irinotecán, epipodofilotoxina, etopósido, agente alquilante, ciclofosfamida, cisplatino, análogo de cisplatino, oxaliplatino, antimetabolito, análogo de fluoropirimidina, 5-fluorouracilo, gemcitabina, azacitidina, agente antimicrotúbulos, taxano, paclitaxel, o docetaxel.
En otra realización de la descripción, al sujeto se le administra una o más moléculas de la descripción en combinación con cualquier vacuna. En otro aspecto de la descripción, la vacuna incluye un antígeno tumoral, un antígeno asociado a un tumor, epítopo tumoral, proteína de fusión que contiene un antígeno tumoral, célula tumoral, o célula dendrítica. En otro aspecto de la descripción, la vacuna incluye un antígeno patogénico, un antígeno asociado a un patógeno, epítopo patogénico, o proteína de fusión que contiene antígeno patogénico. En un aspecto de la descripción, la vacuna incluye un epítopo auxiliar de células T CD4+ sustituto procedente de la toxina del tétanos. En un aspecto de la descripción, la secuencia auxiliar de células T CD4+ contiene un dominio del fragmento C de la toxina del tétanos (pDOM1). En un aspecto de la descripción, la secuencia de pDOM se fusiona a un polipéptido catiónico que permeabiliza la célula (por ejemplo, Arginina-9). En otro aspecto de la descripción, la secuencia de Arg9-pDOM se fusiona a un antígeno específico que comprende la vacuna.
En otra realización, la presente descripción describe un método para tratar células inmunes, en el que las células se ponen en contacto ex vivo o in vitro con una molécula de la descripción. En otra realización, la presente descripción describe un método de tratamiento de una enfermedad neoplásica. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesita una composición de células inmunes puestas en contacto con una molécula de la descripción.
En otra realización, la presente descripción describe un método para inducir o promover tolerancia inmune. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una o más moléculas de la descripción.
En otra realización, la presente descripción describe un método para prevenir o tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria, que incluye administrar a un sujeto que lo necesite una o más moléculas de la descripción. En un aspecto, al sujeto se le administra una o más moléculas de la descripción en combinación con otra terapia antiinflamatoria o inmunosupresora. En otra realización, la presente descripción describe un método de tratamiento de células inmunes, en el que las células se ponen en contacto ex vivo o in vitro con una molécula de la descripción. En otra realización, la presente descripción describe un método para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria, o prevenir el rechazo de células o tejidos injertados. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una composición de células inmunes puestas en contacto con una molécula de la descripción.
Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones anejas, las formas singulares “un”, “una”, y “el/la” incluyen referencias plurales excepto que el contexto indique claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, las referencias a “el método” incluyen uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito aquí que serán manifiestos para los expertos en la técnica al leer esta descripción, etc.
Excepto que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado como el que se entiende normalmente por alguien de pericia normal en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la invención se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
Como se usa aquí, “células inmunes” o “células efectoras inmunes” incluyen linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales (NK), células NKT, monocitos, macrófagos, células dendríticas (DC), células presentadoras de antígeno (APC).
Como se usa aquí, “neoplasia” o “tumor”, incluyendo sus versiones gramaticales, significan crecimiento nuevo y anormal de tejido, que puede ser benigno o canceroso. En un aspecto relacionado, la neoplasia es indicativa de una enfermedad o trastorno neoplásico, incluyendo, pero sin limitarse a, diversos cánceres. Por ejemplo, tales cánceres pueden incluir cánceres de próstata, pancreático, biliar, de colon, rectal, hepático, renal, pulmonar, testicular, de mama, ovárico, pancreático, de cerebro, y de cabeza y cuello, melanoma, sarcoma, mieloma múltiple, leucemia, linfoma, y similares.
Como se usa aquí, “sujeto”, incluyendo sus versiones gramaticales, significa un ser humano o animal vertebrado, incluyendo un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, mono, rata, y ratón.
Como se usa aquí, “resto seleccionador de dianas” se refiere a una molécula que tiene la capacidad para localizar y unirse a una molécula o componente celular específico. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas comprende un polipéptido que se une específicamente a una molécula coinhibidora de células T y es un antagonista que inhibe la función de la molécula a la que se dirige. El resto seleccionador de dianas puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc, anticuerpo de fusión, polipéptido, péptido, o cualquier combinación de los mismos. Otros restos seleccionadores de diana desvelados en el presente documento pueden ser un aptámero, ligando o ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, un resto seleccionador de dianas se puede unir a una molécula presente en una célula o tejido. En un aspecto, el resto seleccionador de dianas se puede unir a una molécula en una célula o tejido enfermo, tal como una célula cancerosa o tumor. En otro aspecto, la molécula seleccionadora de dianas se puede unir a célula o tejido normal, tal como una célula inmune. En otro aspecto, el resto seleccionador de dianas se puede unir a una molécula celular o extracelular que modula la respuesta inmune. Los restos seleccionadores de diana desvelados en el presente documento se pueden unir al receptor del factor de crecimiento, a factor de crecimiento, al receptor de citocina, a citocina, o a una molécula de la superficie celular.
De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas comprende un polipéptido que se une específicamente a una molécula coinhibidora de células T y es un antagonista que inhibe la función de la molécula a la que se dirige. En una realización, el resto seleccionador de dianas es un resto dirigido contra un tumor. El resto seleccionador de dianas se puede unir a un componente de una célula tumoral, o se puede unir en la vecindad de una célula tumoral (por ejemplo, microentorno tumoral). En una realización, el resto seleccionador de dianas se une a un componente de una célula tumoral, microentorno tumoral, linfocito asociado a un tumor, molécula de superficie de célula tumoral, célula asociada al tumor, o célula inmunológica asociada al tumor. Los restos seleccionadores de dianas desvelados en el presente documento se pueden unir a un componente de la vasculatura tumoral, antígeno tumoral, antígeno asociado a un tumor, determinante antigénico tumoral, proteína de fusión que contiene un antígeno tumoral, o vacuna antitumoral.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que es específico de o se une a una molécula o componente, que incluye, pero no se limita a, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, EGFR1, ErbB-1, HER1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3/HER3, ErbB-4/HER4, familia de ligandos de EGFR; familia de receptores del factor de crecimiento similar a insulina (IGFR), proteínas que se unen a IGF (IGFBPs), familia de ligandos de IGFR (IGF-1R); familia de receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), familia de ligandos de PDGFR; familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), familia de ligandos de FGFR, familia de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), familia de VEGF; familia de receptores de HGF; familia de receptores de TRK; familia de receptores de efrina (EPH); familia de receptores de AXL; familia de receptores de tirosina cinasas leucocíticas (LTK); familia de receptores de TIE, angiopoyetina 1, 2; familia de receptores del receptor de orfano similar a tirosina cinasas receptoras (ROR); familia de receptores del dominio de discoidina (DDR); familia de receptores de RET; familia de receptores de KLG; familia de receptores de RYK; familia de receptores de MuSK; factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a), receptor de TGF-a; factor beta de crecimiento transformante (TGF-P), receptor de TGF-P; cadena alfa2 del receptor de interleucina 13 (1L13Ralfa2), interleucina-6 (IL-6), receptor de iL-6, interleucina-4, receptor de IL-4, receptores de citocinas, receptores de Clase I (familia de hematopoyetinas) y Clase II (familia de interferón/IL-10), familia del factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (TNTRSF), familia de receptores de muerte, receptor de TRAIL; antígenos de cáncer testicular (CT), antígenos específicos del linaje, antígenos de diferenciación, alfa-actinina-4, ARTC1, productos de fusión de la región de agrupamiento del punto de ruptura-Abelson (Bcr-abl), B-RAF, caspasa-5 (CASP-5), caspasa-8 (CASP-8), beta-catenina (CTNNB1), ciclo 27 de la división celular (CDC27), cinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4), CDKN2A, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD-2, factor de elongación 2 (ELF2), proteína de fusión del gen 6 variante de Ets/gen ETS de leucemia mieloide aguda 1 (ETC6-AML1), fibronectina (FN), GPNMB, proteína de fusión del receptor de lípidos de baja densidad/GDP-L fucosa: beta-Dgalactosa 2-alfa-Lfucosiltransferasa (LDLR/FUT), HLA-A2, intercambio de arginina en isoleucina en el resto 170 de la hélice alfa del dominio alfa2 en el gen de h La -A2 (HLA-A*201-R170I), MLA-A11, proteína 70-2 mutada de choque térmico (HSP70-2M), KIAA0205, MART2, melanoma ubicuo mutado 1,2, 3 (MUM-1, 2,3), fosfatasa ácida prostática (PAP), neo-PAP, miosina clase 1, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalfa, PRDX5, PTPRK, K-ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, triosefosfato isomerasa, BAGE, BAGE-1, BAGE-2,3,4,5, GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8, GnT-V (N-acetil glucosaminil transferasa V aberrante, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-1, LAGE, LAGE-1, antígeno reconocido por CTL en melanoma (CAMEL), MAGE-A1 (MAGE-1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-AS, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-3, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, mucina 1 (MUCl), MART-1/Melan-A (MLANA), gp100, gp100/Pme117 (S1LV), tirosinasa (TYR), TRP-1, HAGE, NA-88, NY-ESO-1, NY-ESO-1/LAGE-2, SAGE, Sp17, SSX-1,2,3,4, TRP2-1NT2, antígeno carcinoembrionario (CEA), kalicreína 4, mammaglobm-A, OA1, antígeno específico de la próstata (PSA), antígeno de membrana específico de la próstata, TRP-1/gp75, TRP-2, adipofilina, proteína inducible por interferón ausente en melanoma 2 (AIM-2), BING-4, CPSF, ciclina D1, molécula de adhesión de células epiteliales (Ep-CAM), EpbA3, factor 5 de crecimiento de fibroblastos (FGF-5), glicoproteína 250 (gp250), carboxil esterasa intestinal (iCE), proteína alfa-feto (AFP), M-CSF, mdm-2, MUCI, p53 (TP53), PBF, FRAME, PSMA, RAGE-1, RNF43, RU2AS, SOX10, STEAP1, survivina (BIRCS), transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), telomerasa, gene de tumor de Wilms (WT1), SYCP1, BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE-5, LIP1, CTAGE-1, CSAGE, MMA1, CAGE, BORIS, HOM-TES-85, AF15q14, HCA66I, LDHC, MORC, SGY-1, SPO11, TPX1, NY-SAR-35, FTHLI7, NXF2 TDRD1, TEX 15, FATE, TPTE, idiotipos inmunoglobulínicos, proteína de Bence-Jones, receptores de estrógeno (ER), receptores de andrógeno (AR), CD40, CD30, CD20, CD19, CD33, CD4, CD25, CD3, antígeno 72-4 del cáncer (CA 72-4), antígeno 15-3 del cáncer (CA 15-3), antígeno 27-29 del cáncer (CA 27-29), antígeno 125 del cáncer (CA 125), antígeno 19-9 del cáncer (CA 19-9), gonadotropina coriónica humana beta, 1-2 microglobulina, antígeno de carcinoma de células escamosas, enolasa específica de neuronas, proteína gp96 de choque térmico, GM2, sargramostim, CTLA-4, 707 alanina prolina (707-AP), antígeno de adenocarcinoma reconocido por células T 4 (ART-4), péptido 1 de antígeno carcinoembionario (CAP-1), canal 2 de cloruro activado por calcio (CLCA2), ciclofilina B (Cyp-B), tumor 2 de células en anillo de sello humano (HST-2), proteínas del virus del papiloma humano (HPV) (HPV-E6, HPV-E7, antígenos de la cápside mayor o menor, otros), proteínas del virus de Epstein-Barr (EBV) (proteínas latentes de la membrana del EBV - LMP1, LMP2; otras), proteínas del virus de la hepatitis B o C, y proteínas del VIH. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas se puede unir específicamente a CTLA-4. Una composición desvelada en el presente documento puede incluir además lo anterior como un péptido/polipéptido, y/o codificar a los mismos.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, o polipéptido que contiene Fc que se une específicamente a un componente de unacélula tumoral, antígeno tumoral, vasculatura tumoral, microentorno tumoral, o célula inmune que se infiltra en un tumor. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR1, Erb-B1), HER2/neu (Erb-B2), CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1R), receptor de TRAIL, molécula de adhesión de células epiteliales, antígeno carcinoembrionario, antígeno de membrana específico de la próstata, mucina-1, CD30, CD33, CD40, o una combinación de los mismos.
Los ejemplos de anticuerpos que se pueden incorporar en composiciones y métodos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos tales como trastuzumab (anticuerpo anti-HER2/neu); Pertuzumab (mAb anti-HER2); cetuximab (anticuerpo monoclonal quimérico contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR); panitumumab (anticuerpo anti-EGFR); nimotuzumab (anticuerpo anti-EGFR); Zalutumumab (mAb anti-EGFR); Necitumumab (mAb anti-EGFR); MDX-210 (anticuerpo biespecífico anti-HER-2 humanizado); MDX-210 (anticuerpo biespecífico anti-HER-2 humanizado); MDX-447 (anticuerpo biespecífico anti-receptor de EGF humanizado); Rituximab (mAb anti-CD20 quimérico murino/humano); Obinutuzumab (mAb anti-CD20); Ofatumumab (mAb anti-CD20); Tositumumab-I131 (mAb anti-CD20); Ibritumomab tiuxetan (mAb anti-CD20); Bevacizumab (mAb anti-VEGF); Ramucirumab (mAb anti-VEGFR2); Ranibizumab (mAb anti-VEGF); Aflibercept (dominios extracelulares de VEGFR1 y VEGFR2 fusionados a Fc de IgG1); AMG386 (péptido de unión a angiopoyetina-1 y -2 fusionado a Fc de IgG1); Dalotuzumab (mAb anti-IGF-1R); Gemtuzumab ozogamicina (mAb anti-CD33); Alemtuzumab (mAb anti-Campath-1/CD52); Brentuximab vedotina (mAb anti-CD30); Catumaxomab (mAb biespecífico que se dirige contra la molécula de adhesión de células epiteliales y CD3); Naptumomab (mAb anti-5T4); Girentuximab (anti-anhidrasa carbónica ix); o Farletuzumab (anti-receptor de folato). Otros ejemplos incluyen anticuerpos tales como Panorex™ (17-1A) (anticuerpo monoclonal murino); Panorex (@ (17-1A) (anticuerpo monoclonal murino quimérico); BEC2 (mAb anti-idiotípico, imita el epítopo de GD) (con BCG); Oncolym (anticuerpo monoclonal Lym-1); Ab SMART M195, humanizado 13' 1 LYM-1 (Oncolym), Ovarex (B43.13, mAb de ratón anti-idiotípico); mAb 3622W94 que se une a antígeno de pancarcinoma EGP40 (17-1A) en adenocarcinomas; Zenapax (SMART Anti-Tac (receptor de IL-2); Ab SMART M195, Ab humanizado, humanizado); NovoMAb-G2 (Ab específico de pancarcinoma); TNT (mAb quimérico contra antígenos de histona); TNT (mAb quimérico contra antígenos de histona); Gliomab-H (Abs monoclonales humanizados); mAb GNI-250; EMD-72000 (antagonista de EGF quimérico); LymphoCide (anticuerpo IL.L.2 humanizado); y MDX-260 bispecífico, contra Gd-2, Ab de ANA, Ab de SMArT IDIO, Ab de s Ma RT ABL 364 o ImmuRAIT-CEA. Los ejemplos de anticuerpos incluyen los descritos en los documentos US5736167, US7060808, y US5821337.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une específicamente a un componente de una célula T reguladora, una célula supresora de mieloides, o célula dendrítica. El resto seleccionador de dianas se puede unir específicamente a una de las siguientes moléculas: CD4; CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR); interleucina-10 (IL-10); receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR); factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); receptor activador del factor nuclear k B (RANK); ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL); gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; TNFRSF18); o receptor de interleucina-4 (IL-4R). En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que es un agonista que incrementa la función de la molécula seleccionada como diana. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas se puede unir específicamente al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; CD152); muerte celular programada 1 (PD-1); o ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1 o PD-L2) o LAG-3. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas es un antagonista que inhibe la función de la molécula seleccionada como diana.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une a una citocina específica, receptor de citocina, molécula coestimuladora, molécula coinhibidora, o receptor inmunomodulador que modula el sistema inmune. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une específicamente a una de las siguientes moléculas: superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF); factor a de necrosis tumoral (TNF-a); superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR); interleucina-12 (IL-12); receptor de IL-12; 4-1BB (CD137); ligando de 4-1BB (4-1BBL; CD137L); OX40 (CD134; TNR4); ligando de OX40 (OX40L; CD40; ligando de CD40 (CD40L); CTLA-4; muerte programada 1 (PD-1); ligando 1 de PD1 (PD-L1; B7-H1); o ligando 2 de PD-1 (PD-L2; B7-DC); familia de B7; B7-1 (CD80); B7-2 (CD86); B7-H3; B7-H4; GITR/AITR; GITRL/AITRL; BTLA; CD70; CD27; LIGHT; HVEM; receptor similar a Toll (TLR) (TLR 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10). En un aspecto, el resto seleccionador de dianas es un agonista que incrementa la función de la molécula seleccionada como diana. En otro aspecto, el resto seleccionador de dianas es un antagonista que inhibe la función de la molécula seleccionada como diana.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc, o péptido que se une específicamente a un componente de una célula T reguladora, célula supresora de mieloides, o célula dendrítica. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, o polipéptido que contiene Fc que se une específicamente a una citocina, receptor de citocina, molécula coestimuladora, o molécula coinhibidora que modula el sistema inmune. En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que se une específicamente a una de las siguientes moléculas: CD4; CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR); interleucina-10 (IL-10); receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR); factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); receptor activador del factor nuclear k B (RANK); ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANk L); gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; TNFRSF18); receptor de interleucina-4 (IL-4R); superfamilia de factor de necrosis tumoral (TNF); factor a de necrosis tumoral (TNF-a); superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR); interleucina-12 (IL-12); receptor de IL-12; 4-1BB (CD137); ligando de 4-1BB (4-1BBL; CD137L); OX40 (CD134; TNR4); ligando de OX40 (OX40L; CD40; ligando de CD40 (CD40L); CTLA-4; familia de B7; B7-1 (CD80); B7-2 (CD86); GITR/AITR; GITRL/AITRL; CD70; CD27; o LIGHTEn el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que es un agonista que incrementa la función de la molécula seleccionada como diana. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador e dianas se une específicamente a una de las siguientes moléculas: antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; CD152); muerte programada 1 (PD-1); ligando 1 de PD-1 (PD-L1; B7-H1); ligando 2 de PD-1 (PD-L2; B7-DC); LAG-3; B7-H3; B7-H4; BTLA; o HVEM. De acuerdo con la invención, el resto seleccionador de dianas es un antagonista que inhibe la función de la molécula seleccionada como diana.
Los ejemplos de anticuerpos que se pueden incorporar en composiciones y métodos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos tales como Zanulimumab (mAb anti-CD4), Keliximab (mAb anti-CD4); Ipilimumab (MDX-101; mAb anti-CTLA-4); Tremilimumab (mAb anti-CTLA-4); (Daclizumab (mAb anti-CD25/IL-2R); Basiliximab (mAb anti-CD25/IL-2R); MDX-1106 (mAb anti-PD1); anticuerpo contra GITR; GC1008 (anticuerpo anti-TGF-P); metelimumab/CAT-192 (anticuerpo anti-TGF-P); lerdelimumab/CAT-152 (anticuerpo anti-TGF-P); ID11 (anticuerpo anti-TGF-P); Denosumab (mAb anti-RANKL); BMS-663513 (mAb anti-4-1BB humanizado); SGN-40 (mAb anti-CD40 humanizado); CP870,893 (mAb anti-CD40 humano); Infliximab (mAb anti-TNF quimérico; Adalimumab (mAb anti-TNF humano); Certolizumab (Fab humanizado anti-TNF); Golimumab (anti-TNF); Etanercept (dominio extracelular de TNFR fusionado a IgG1 Fc); Belatacept (dominio extracelular de CTLA-4 fusionado a Fc); Abatacept (dominio extracelular de CTLA-4 fusionado a Fc); Belimumab (anti-estimulador de linfocitos B); Muromonab-CD3 (mAb anti-CD3); Otelixizumab (mAb anti-CD3); Teplizumab (mAb anti-CD3); Tocilizumab (mAb anti-IL6R); REGN88 (mAb anti-IL6R); Ustekinumab (mAb anti-IL-12/23); Briakinumab (mAb anti-IL-12/23); Natalizumab (anti-integrina a4); Vedolizumab (mAb anti-integrina a4 P7); T1h (mAb anti-CD6); Epratuzumab (mAb anti-CD22); Efalizumab (mAb anti-CD11a); y Atacicept (dominio extracelular de activador de transmembrana e interactor del ligando modulador de calcio fusionado con Fc).
En el presente documento se desvela una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un “resto inmunomodulador”. Como se usa aquí, “resto inmunomodulador” se refiere a un ligando, péptido, polipéptido, o polipéptido que contiene Fc que se une a un componente específico de una célula T reguladora, célula supresora de mieloides, o célula dendrítica, y modula el número o función de Tregs o células supresoras de mieloides. El “resto inmunomodulador” se puede unir específicamente a una citocina, receptor de citocina, molécula coestimuladora, o molécula coinhibidora que modula el sistema inmune. De acuerdo con la invención, el resto inmunomodulador comprende una secuencia del dominio de unión a ligando extracelular seleccionado del grupo que consiste en: receptor de factor beta de crecimiento transformante TpRN, TpRIIb, TpRIII; muerte programada 1 (PD-1); receptor activador del factor nuclear KB (RANK); y receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1, VEGFR2). El resto inmunomodulador puede unirse específicamente a una de las siguientes moléculas: factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); ligando 1 de PD1 (PD-L1; B7-H1); ligando 2 de PD-1 (PD-L2; B7-DC); o ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL); o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que se une específicamente a una de las siguientes moléculas: receptor de factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR); muerte programada 1 (PD-1); receptor activador de factor nuclear kB (RANK). En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que se une específicamente a una de las siguientes moléculas: gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; AITR; TNFRSF18); GITRL/AITRL; 4-1BB (CD137); ligando 4-1BB (4-1BBL; CD137L); OX40 (CD134; TNR4); ligando de OX40 (OX40L); B7-H3; B7-H4; BTLA; CD40; ligando de CD40 (CD40L); CD70; CD27; LIGHT; o HVEM. En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que se une específicamente a una de las siguientes moléculas: factor a de necrosis tumoral (TNF-a); interleucina-12 (IL-12); IL-12R; interleucina-10 (IL-10); IL-10R. En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que comprende un dominio extracelular de CTLA-4. En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que es un agonista que incrementa la función de la molécula unida. En otro aspecto, el resto inmunomodulador es un antagonista que inhibe la función de la molécula seleccionada como diana.
El resto inmunomodulador de la invención comprende una secuencia del dominio de unión a ligando extracelular de uno de los siguientes receptores: receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-PRII, TGF-PRIIb, o TGF-PRIII); muerte programada 1 (PD-1); receptor activador del factor nuclear k B (RANK); receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1 o VEGFR2). En el presente documento, se desvela el resto inmunomodulador que comprende un dominio extracelular o ligando que se une a la secuencia del IL-10R. En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que comprende un dominio extracelular o secuencia de unión al ligando de uno de los siguientes receptores: receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2); 4-1BB (CD137); OX40 (CD134; TNR4); CD40; IL-12R; o gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; AITR; TNFRSF18). El dominio extracelular del receptor específico se puede unir al ligando cognado e inhibe la interacción del ligando con su receptor nativo.
En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que comprende uno o más de los siguientes ligandos o fragmentos de ligandos activos: factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); ligando 1 de PD1 (PD-L1); ligando 2 de PD-1 (PD-L2); o IL-10. En el presente documento se desvela un resto inmunomodulador que comprende uno o más de los siguientes ligandos o fragmentos de ligandos activos: ligando de 4-1BB (4-1BBL; CD137L); ligando de OX40 (OX40L); IL-12; CD40L; o GITRL/AITRL.
En otro aspecto, el resto inmunomodulador se fusiona al término C del resto seleccionador de dianas. En otro aspecto, el resto inmunomodulador se fusiona al término N del resto seleccionador de dianas. En un aspecto, la molécula de fusión se representa mediante X-Fc-Y, en la que X es el resto seleccionador de dianas, Fc es una región Fc de inmunoglobulina, e Y es el resto inmunomodulador. En otro aspecto, la molécula de fusión se representa mediante Y-Fc-X, en la que X es el resto seleccionador de dianas, e Y es el resto inmunomodulador. En un aspecto, el resto seleccionador de dianas puede ser adicionalmente un resto inmunomodulador.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, o polipéptido que contiene Fc que se une específicamente a un componente de una célula tumoral, antígeno tumoral, vasculatura tumoral, microentorno tumoral, o célula inmune que se infiltra en un tumor, y el resto inmunomodulador comprende un dominio extracelular o secuencia de unión a ligando de uno de los siguientes receptores: receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pRII, TGF-pRIIb, o TGF-pRIII); muerte programada 1 (PD-1); receptor activador del factor nuclear k B (RANK); receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1 o VEGFR2); o IL-10R.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, o polipéptido que contiene Fc que se une específicamente a un componente de una célula tumoral, antígeno tumoral, vasculatura tumoral, microentorno tumoral, o célula inmune que se infiltra en un tumor, y el resto inmunomodulador comprende uno o más de los siguientes ligandos o fragmentos de ligandos activos: ligando de 4-1BB (4-1BBL; CD137L); ligando de OX40 (OX40L); IL-12; CD40L; o GITRL/AITRL.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc o ligando que se une a un componente específico de una célula T reguladora, célula supresora de mieloides, célula dendrítica, y el resto inmunomodulador comprende un dominio extracelular o secuencia de unión a ligando de uno de los siguientes receptores: receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pRII, TGF-pRIIb, o TGF-pRIII); muerte programada 1 (PD-1); receptor activador del factor nuclear k B (RANK); o IL-10R. El resto inmunomodulador puede comprender uno o más de los siguientes ligandos o fragmentos de ligandos activos: ligando de 4-1BB (4-1BBL; CD137L); ligando de OX40 (OX40L); IL-12; CD40L; o GITRL/AITRL. El componente seleccionado como diana específico de una célula T reguladora, célula supresora de mieloides, o célula dendrítica puede ser una de las siguientes moléculas: CD4; CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR); antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; CD152); interleucina-10 (IL-10); factor beta de crecimiento transformante (TGF-p); muerte programada 1 (PD-1); ligando de muerte programada 1 (PD-L1 o PD-L2); ligando del receptor activador del factor nuclear k B (RANK) (RANKL); LAG-3; gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; TNFRSF18); o receptor de interleucina-4 (IL-4R).
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc o ligando que se une a uno de los siguientes: CTLA-4; 4-1BB (CD137); OX40 (CD134; TNr4); CD40; IL-12R; o gen relacionado con la familia de receptores del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR; AITR; TNFRSF18); y el resto inmunomodulador comprende una molécula diferente seleccionada de lo siguiente: (i) un dominio extracelular o secuencia de unión al ligando de uno de los siguientes receptores: receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pRII, TGF-pRIIb, o TGF-pRIII); muerte programada 1 (PD-1); receptor activador del factor nuclear k B (RANK); o IL-10R; o (ii) polipéptido que contiene Fc o ligando que se une a uno de lo siguientes: CTLA-4; 4-1BB (CD137); OX40 (CD134; TNR4); CD40; IL-12R; o GITR (AITR; TNFRSF18).
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas y el resto inmunomodulador son dos moléculas diferentes seleccionadas de cualquiera de las siguientes: un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc o ligando que se une a TGF-p, CTLA-4, PD-1, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134; TNR4), CD40; IL-12R, o GITR/AITR (TNFRSF18), o receptor de tipo Toll (TLR); un dominio extracelular o secuencia de unión al ligando del receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pRII, TGF-pRIIb, o TGF-pRIII), muerte programada 1 (PD-1), receptor activador del factor nuclear k B (RANK), o IL-10R. La molécula de fusión se puede representar mediante X-Fc-Y, en la que X es un resto seleccionador de dianas inmunomodulador e Y es un resto inmunomodulador diferente.
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc que se une a una de las siguientes moléculas: CD4; CD25 (receptor de IL-2a; IL-2aR); o CD20; y el resto inmunomodulador comprende uno de los siguientes ligandos o fragmentos de ligandos activos: factor beta de crecimiento transformante (TGF-P); ligando 1 de PD1 (PD-L1); ligando 2 de PD-1 (PD-L2); o IL-10.
En el presente documento se desvela un resto seleccionador de dianas que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc que se une al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina-12 (IL-12), IL-6R, estimulador de linfocitos B, CD11a, CD6, o CD22; y el resto inmunomodulador comprende uno de los siguientes: (i) ligandos o fragmentos de ligandos activos de factor beta de crecimiento transformante (TGF-P), ligando 1 de PD1 (PD-L1), o IL-10; o (ii) un dominio extracelular o fragmento de unión al ligando de RANK, 4-1Bb (CD137), OX40 (CD134; TNR4), CD40, IL-12R o GITR/AITR (TNFRSF18).
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas comprende el dominio extracelular de CTLA-4 fusionado a Fc de inmunoglobulina, y el resto inmunomodulador comprende uno de los siguientes: (i) ligandos o fragmentos de ligandos activos de factor beta de crecimiento transformante (TGF-P), ligando 1 de PD1 (PD-L1), o IL-10; o (ii) fragmento de unión al ligando de TNFR2, RANK, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134; TNR4), CD40, IL-12R o GITR/AITR (TNFRSF18).
En el presente documento se desvela una molécula en la que el resto seleccionador de dianas y resto inmunomodulador son dos moléculas diferentes seleccionadas de cualquiera de las siguientes: un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, polipéptido que contiene Fc que se une al factor a de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina-12 (IL-12), IL-6R, estimulador de linfocitos B, CD11a, CD6, o CD22; un fragmento de unión al ligando de TNFR2, RANK, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134; TNR4), CD40, IL-12R o GITR/AITR (TNFRSF18); ligandos o fragmentos de ligandos activos del factor beta de crecimiento transformante (TGF-P), ligando 1 de PD1 (PD-L1), o IL-10; o CTLA-4-Fc. En un aspecto, la molécula de fusión se representa por X-Fc-Y, en la que X es el resto seleccionador de dianas inmunomodulador e Y es un resto inmunomodulador diferente.
Anticuerpos: En una realización, el resto seleccionador de dianas o proteína de fusión es una inmunoglobulina. Como se usa aquí, el término “inmunoglobulina” incluye anticuerpos mono- o polivalentes, naturales o artificiales, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la invención), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. El término “anticuerpo”, como se usa aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. El ion de inmunoglobulina puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Un anticuerpo, como se describe aquí, incluye un fragmento de anticuerpo, tal como, pero sin limitarse a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fvs enlazados mediante disulfuro (sdfv) y fragmentos que incluyen un dominio VL o VH. En una realización, el resto seleccionador de dianas es un anticuerpo o scFv.
Un fragmento de anticuerpo que se une a un antígeno, incluyendo un anticuerpo monocatenario, puede incluir la región o regiones variables, solas o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: la región bisagra, los dominios CH1, CH2, y CH3. Un fragmento de unión a antígeno también puede incluir cualquier combinación de región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. También se incluye un fragmento Fc, proteínas de fusión de antígeno-Fc, y resto seleccionador de dianas de Fc. El anticuerpo puede ser de cualquier origen animal, incluyendo pájaros y mamíferos. En un aspecto, el anticuerpo es, o deriva de, un ser humano, murino (por ejemplo, ratón y rata), burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo, o pollo. Además, tal anticuerpo puede ser una versión humanizada de un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoespecífico, biespecífico, triespecífico, o de mayor multiespecificidad.
El anticuerpo aquí incluye específicamente un anticuerpo “quimérico”, en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que muestren la actividad biológica deseada (patente U.S. n° 4.816.567; y Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6851-6855). Un anticuerpo quimérico de interés incluye aquí anticuerpos “primatizados”, que incluyen secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.), y secuencias de la región constante humana.
Se han empleado diversos métodos para producir anticuerpos. La tecnología de hibridoma, que se refiere a una estirpe celular clonada que produce un solo tipo de anticuerpo, usa las células de diversas especies, incluyendo ratones (murinas), hámsters, ratas, y seres humanos. Otro método para preparar un anticuerpo usa ingeniería genética que incluye técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos obtenidos a partir de estas técnicas incluyen, entre otros, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Un anticuerpo quimérico combina regiones codificantes de ADN procedentes de más de un tipo de especie. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede derivar la región variable de un ratón, y la región constante de un ser humano. Un anticuerpo humanizado procede predominantemente de un ser humano, incluso aunque contenga porciones no humanas. Como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado puede contener una región constante completamente humana. Pero a diferencia de un anticuerpo quimérico, la región variable puede derivar parcialmente de un ser humano. Las porciones no humanas, sintéticas de un anticuerpo humanizado proceden a menudo de las CDRs en anticuerpos murinos. En cualquier caso, estas regiones son cruciales para permitir al anticuerpo reconocer y unirse a un antígeno específico.
En una realización, un hibridoma puede producir una proteína de fusión dirigida contra dianas que comprende un resto seleccionador de dianas y un resto inmunomodulador. En una realización, un resto seleccionador de dianas que comprende un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido, se enlaza o se fusiona a un resto inmunomodulador que consiste en un polipéptido, con un enlazador o sin un enlazador. El enlazador puede ser un enlazador de aminoácido. En una realización, un enlazador es (GGGGS)n, en el que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8. Por ejemplo, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 104). En otra realización, un enlazador es EPKSCDK (SEQ ID NO: 105). En otra realización, un enlazador es IEGRDMD (SEQ. ID. NO: 106). En diversos aspectos, la longitud del enlazador se puede modificar para optimizar la unión del resto diana o la función del resto inmunomodulador. En diversos aspectos, el resto inmunomodulador es un polipéptido que se fusiona al término C de la región Fc de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionador de dianas o proteína de fusión que contiene Fc. En otro aspecto, el resto inmunomodulador es un polipéptido que se fusiona al término C de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionador de dianas. En otro aspecto, la proteína de fusión comprende una secuencia X-Fc-Y, en la que X es un polipéptido seleccionador de dianas e Y es un polipéptido inmunomodulador.
Por ejemplo, un hibridoma puede producir los polipéptidos que corresponden a SEQ. ID. NO: 1-69.
Un fragmento de anticuerpo puede incluir una porción de un anticuerpo intacto, por ejemplo que incluye su región de unión a antígeno o variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; fragmentos Fc o productos de fusión de Fc; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmento o fragmentos de anticuerpos.
Un anticuerpo intacto es aquel que incluye una región variable que se une a un antígeno, así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y los dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana), o una variante de una secuencia de aminoácidos de los mismos para cualquier otro Fc modificado (por ejemplo, glicosilación u otro Fc modificado mediante ingeniería).
El anticuerpo intacto puede tener una o más “funciones efectoras”, que se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa, o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos, o cualquier otra región Fc modificada) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de un anticuerpo incluyen la unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; reducción de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B (BCR); y presentación cruzada de antígenos por células presentadoras de antígenos o células dendríticas. En una realización, el anticuerpo seleccionador de dianas o proteína de fusión que contiene Fc facilita el suministro focalizado o preferente de un resto inmunomodulador a una célula diana. En otro aspecto, un anticuerpo seleccionador de dianas puede inducir muerte de la célula seleccionada como diana, o sensibilizarla frente a citotoxicidad mediada por células inmunes. En otro aspecto, la proteína de fusión de Fc o el anticuerpo puede facilitar el suministro del resto inmunomodulador o material apoptótico inmunogénico a partir de dianas tumorales unidas a anticuerpo, o ambos, a células presentadoras de antígeno (APC) vía interacciones entre su Fc y los receptores de Fc (en APC).
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes “clases”. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos se pueden dividir además en “subclases” (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgC3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan alfa (a), delta (8), épsilon (g), gamma (y), y mu (|i), respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Péptidos: En algunos aspectos de la invención, el resto seleccionador de dianas o resto inmunomodulador es un péptido o polipéptido. Un péptido incluye cualquier análogo, fragmento o derivado químico de un péptido cuya secuencia de restos de aminoácidos se muestra aquí. Por lo tanto, un péptido presente se puede someter a diversos cambios, sustituciones, inserciones, y supresiones, en el que tales cambios proporcionan ciertas ventajas en su uso. A este respecto, un péptido corresponde a, más bien es idéntico a, la secuencia de un péptido citado cuando se hacen uno o más cambios y retiene en uno o más de los ensayos la capacidad para funcionar como el péptido sin modificar.
El término “análogo” incluye cualquier péptido que tiene una secuencia de restos de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia mostrada específicamente aquí, en la que uno o más restos se han sustituido de forma conservativa por un resto funcionalmente similar y que presenta la actividad como se describe aquí. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto no polar (hidrófobo), tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un resto polar (hidrófilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un resto básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o la sustitución de un resto ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, por otro.
El término “fragmento” se refiere a cualquier polipéptido objeto que tiene una secuencia de restos de aminoácidos más corta que la de un polipéptido cuya secuencia de restos de aminoácidos se describe aquí.
Como se usa aquí, “un péptido dirigido contra un tumor” incluye polímeros que contienen poco menos de 100 aminoácidos, en el que el polímero se une específicamente a un componente celular de una célula tumoral, vasculatura tumoral, y/o un componente de un microentorno tumoral.
Un péptido de la presente descripción se puede sintetizar mediante cualquiera de las técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica de polipéptidos, incluyendo técnicas de ADN recombinante. Las técnicas de química sintética, tal como una síntesis de tipo Merrifield en fase sólida, son preferidas por razones de pureza, especificidad antigénica, libertad de productos secundarios indeseados, facilidad de producción, y similares. En Steward et al., “Solid Phase Peptide Synthesis”* W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky, et al., “Peptide Synthesis”, John Wiley & Sons, Segunda Edición, 1976; J. Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptides”. Vol. 2. p. 46, Academic Press (Nueva York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96, 1969; Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214, 1990; y la patente U.S. n° 4.244.946, para síntesis de péptidos en fase sólida, y Schroder et al., “The Peptides”, Vol. 1, Academic Press (Nueva York), 1965 para síntesis clásica en disolución, se puede encontrar un excelente sumario de las muchas técnicas disponibles. Los grupos protectores apropiados utilizados en tales síntesis se describen en los textos anteriores y en J. F. W. McOmie, “Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, Nueva York, 1973.
Aptámeros: En un aspecto de la descripción, el resto seleccionador de dianas es un aptámero. En diversas realizaciones, un aptámero es específico para una molécula en una célula tumoral, vasculatura tumoral, y/o un microentorno tumoral. El término “aptámero” incluye ADN, ARN o péptidos que se seleccionan en base a las propiedades de unión específica para una molécula particular. Por ejemplo, un aptámero o aptámeros se pueden seleccionar para la unión a un producto génico particular en una célula tumoral, vasculatura tumoral, microentorno tumoral, y/o una célula inmune, como se describe aquí, en el que la selección se realiza por métodos conocidos en la técnica y familiares para alguien de pericia en la técnica. Subsiguientemente, dicho aptámero o aptámeros se pueden administrar a un sujeto para modular o regular una respuesta inmune.
Se han descrito algunos aptámeros que tienen afinidad por una proteína, ADN, aminoácido y nucleótidos específicos (por ejemplo, K. Y. Wang, et al., Biochemistry 32:1899-1904 (1993); Pitner et al., patente U.S. n° 5.691.145: Gold, et al., Ann. Rev. Biochem. 64:763-797 (1995); Szostak et al., patente U.S. n° 5.631.146). Los aptámeros de afinidad elevada y que se unen con especificidad elevada se han obtenido de bibliotecas combinatorias (más arriba, Gold, et al.). Los aptámeros pueden tener afinidades elevadas, con constantes de disociación en el equilibrio que oscilan desde micromolar a subnanomolar, dependiendo de la selección usada; los aptámeros también pueden mostrar selectividad elevada, por ejemplo mostrando una discriminación de mil veces entre 7-metil G y G (Haller y Sarnow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8521-8526 (1997)) o entre D y L-triptófano (más arriba, Gold et al.). Un aptámero se puede seleccionar en base a la molécula particular seleccionada como diana (por ejemplo, aptámero que selecciona como diana EGFR u otros marcadores de cáncer). Se conocen procedimientos estándar para la selección in vitro, tales como experimentos SELEX, descritos en Science 249 (4968) 505-510 (1990), y Nature (Londres), 346 (6287) 818-822 (1990), que se pueden seguir, o con modificaciones y mejoras conocidas en la técnica.
La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” significa la cantidad del compuesto objeto que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que se está buscando por el investigador, veterinario, médico u otro especialista.
Por “farmacéuticamente aceptable” se quiere decir que el vehículo, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación, y no puede ser pernicioso para el receptor del mismo.
Las expresiones “administración de” y o “administrando” debería entenderse que significan proporcionar una composición en una cantidad terapéuticamente eficaz al individuo que necesita tratamiento. La administración puede ser administración intratumoral o sistémica (intravenosa). Además, junto con la vacunación del receptor con una vacuna del antígeno patogénico (por ejemplo, toxoide del tétanos). Además, junto con un agente para agotar o inactivar células T reguladoras (por ejemplo, ciclofosfamida) o células supresoras de mieloides (por ejemplo gemcitabina). En un ejemplo adicional, el tratamiento ex vivo de células inmunes y células tumorales para la generación de células inmunes reactivas a un tumor o reactivas a un antígeno patogénico para inmunoterapia celular adoptiva. La administración puede ser intradérmica o subcutánea.
Además, la administración puede ser en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales que agotan o inactivan las células T reguladoras (ciclofosfamida) o células supresoras de mieloides (por ejemplo gemcitabina). Las composiciones farmacéuticas identificadas aquí son útiles para la administración parenteral, tópica, oral, nasal (o de otro modo inhalada), rectal o local, tal como mediante aerosol o transdérmicamente, para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una o más patologías/indicaciones descritas aquí (por ejemplo, cáncer, agentes infecciosos patogénicos, afecciones asociadas con ellos). Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria, dependiendo del método de administración. Las formas de dosificación unitaria adecuadas incluyen, pero no se limitan a, polvos, comprimidos, pastillas, cápsulas, tabletas, supositorios, parches, pulverizaciones nasales, inyectables, formulaciones implantables de liberación sostenida, complejos lipídicos, etc.
Excepto que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado como lo entiende normalmente alguien de pericia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. En la práctica o ensayo de la invención se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, así como se entenderá que las modificaciones y variaciones están englobadas dentro del alcance de la actual descripción.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente las realizaciones de la presente invención, pero no están destinados a limitar el alcance de la invención.
Aunque son típicos de aquellos que se pueden usar, alternativamente se pueden usar otros procedimientos, metodologías, o técnicas conocidos por los expertos en la técnica.
EJEMPLO 1
Contrarrestar la tolerancia inmune tumoral vía el agotamiento de células T reguladoras CD4+ mediado por anticuerpos facilita la activación de células T CD8+ reactivas a un tumor, y potencia la eficacia antitumoral in vivo de agentes anticancerosos citotóxicos
La muerte inmunogénica de células tumorales por agentes quimioterapéuticos puede inducir inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+. En respuesta a agentes quimioterapéuticos específicos, las células tumorales muestran la translocación rápida de calreticulina intracelular (CRT) a la superficie celular, donde su agregación proporciona una señal para el reconocimiento y engullición de células tumorales que mueren por células dendríticas (DCs) presentadoras de antígenos. El tratamiento de células cancerosas MB49 de ratón o de cáncer de vejiga SW780 humano con doxorrubicina, un agente quimioterapéutico antraciclínico, indujo exposición superficial rápida de CRT, que se detectó mediante citometría inmunofluorescente de células teñidas con el anticuerpo anti-CRT marcadas con Dylight 488 (Fig. 1a). Para determinar si el tratamiento ex vivo con doxorrubicina indujo una muerte inmunogénica de células tumorales, se inyectaron células MB49 vivas sin tratar o un número equivalente de células MB49 que se pretrataron i vivo con doxorrubicina en un flanco de ratones C57BL/6 inmunocompetentes singénicos. A diferencia de los ratones a los que se les inyectaron células tumorales vivas, los ratones inyectados con células tumorales tratadas con doxorrubicina mostraron una mayor producción de IFN-y por células de ganglios linfáticos que drenan (DLN), en respuesta a la reexposición in vitro con lisados de células MB49 (Fig. 1b). La vacunación con células MB49 exterminadas con doxorrubicina generó una respuesta inmune específica del tumor, puesto que no se observó el incremento correspondiente en la secreción de IFN-y por células DLN tras la exposición in vitro a un péptido irrelevante (hemaglutinina-HA). La inyección de células tumorales MB49 tratadas con doxorrubicina protegió a los ratones frente al crecimiento tumoral al exponerlos a células tumorales MB49 vivas no tratadas inyectadas en el flanco opuesto (Fig. 1c). La protección frente al crecimiento tumoral mediante vacunación con células tumorales tratadas con doxorrubicina no se observó en ratones a los que se les agotó las células T CD8+ con un anticuerpo anti-CD8 antes de la exposición a células tumorales vivas (Fig. 1c). Estas observaciones indican que el tratamiento ex vivo con agentes quimioterapéuticos puede inducir una muerte inmunogénica de células tumorales que genera inmunidad antitumoral adaptativa mediada por células T CD8+.
La tolerancia inmune inducida por el tumor inhibe la activación de células T CD8+ en respuesta a la quimioterapia. Para examinar si el tratamiento in vivo con agentes quimioterapéuticos puede activar respuestas inmunes mediadas por células T CD8+ en ratones con tumores preestablecidos, se inyectaron a ratones C57BL/6 con células tumorales MB49 singénicas vivas, y entonces se les administró doxorrubicina intratumoral en diversos de tiempo tras la inoculación del tumor. En contraste con la vacunación de ratones sin tratamiento previo con células MB49 exterminadas con doxorrubicina, el tratamiento in vivo de ratones con tumores MB49 establecidos, en el d10 tras la inoculación del tumor, no indujo un incremento correspondiente en la secreción de IFN-y por células DLN en respuesta a la reexposición in vitro con lisados de células MB49 (Fig. 1b). Mientras que el tratamiento con doxorrubicina en el d3 tras la inoculación del tumor fue capaz de detener el crecimiento tumoral, la administración retrasada de la misma dosis de doxorrubicina en el d10 no inhibió el crecimiento progresivo de tumores MB49 establecidos (Fig. 1b). Estos resultados indican que la tolerancia inmune inducida por el tumor, en el microentorno de cánceres establecidos, contrarrestan la activación de inmunidad antitumoral adaptativa en respuesta a la muerte de células tumorales inducida por quimioterapia.
Las células T reguladoras (Treg) se acumulan en el microentorno tumoral y contrarrestan la capacidad de la quimioterapia para activar la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+. Para investigar si las Tregs FoxP3+ están implicadas en la imposición de la tolerancia inmune en el microentorno tumoral, examinamos el porcentaje de células CD4+CD25+FoxP3+ (Tregs) entre linfocitos T CD4+ en el bazo, ganglios linfáticos que drenan (DLN), y tumores de ratones C57BL/6 inmunocompetentes, en el d0 y d14 tras la inoculación del tumor. Mientras que los ratones que portan tumor mostraron solamente un pequeño incremento en el porcentaje de Tregs entre las células T CD4+ en el bazo y DLN en el d14 tras la inoculación del tumor, una mayoría de células T CD4+ que se infiltran en el tumor fueron en este momento células CD4+CD25+FoxP3+ (Fig. 1e). Para investigar si las Tregs que se infiltran en el microentorno tumoral pueden suprimir la activación de la inmunidad antitumoral adaptativa en respuesta a la muerte de células tumorales inducida por quimioterapia, se transfirieron de forma adoptiva células CD4+CD25+ aisladas de tumores y DLN de ratones que portan tumor a ratones sin tratamiento previo C57BL/6 singénicos antes de la vacunación con células MB49 exterminadas con doxorrubicina. La transferencia adoptiva de células CD4+CD25+ que se infiltran en el tumor en ratones sin tratamiento previo inhibió la capacidad de vacunación in vivo subsiguiente con células tumorales MB49 tratadas con doxorrubicina para incrementar la producción de IFN-y por células de los ganglios linfáticos que drenan (DLN) en respuesta a la reexposición in vitro con lisados de células MB49 (Fig. 1f). Consistente con la capacidad de las células CD4+CD25+ que se infiltran en el tumor para suprimir la respuesta inmune específica del tumor, la transferencia adoptiva de estas células contrarrestó la protección conferida por la vacunación con células MB49 tratadas con doxorrubicina frente al crecimiento tumoral al exponerlas a células tumorales MB49 vivas no tratadas (Fig. 1g). Estos resultados indican que el microentorno tumoral fomenta la acumulación de Tregs FoxP3+ que contrarrestan la activación de la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+ en respuesta a la muerte de células tumorales inducida por quimioterapia.
La inhibición de TGF-p en el microentorno tumoral reduce las células T reguladoras FoxP3+ que se infiltran en el tumor, y potencia la eficacia antitumoral de la quimioterapia. TGF-p induce la expresión de FoxP3 en células T CD4+CD25-FoxP3- periféricas sin tratamiento previo, y facilita su conversión en Tregs FoxP3+ “adaptativa” que comparten la capacidad inmunosupresora de las Tregs FoxP3+ naturales generadas en el timo. Puesto que los cánceres humanos frecuentemente se hacen refractarios al efecto inhibidor del crecimiento de TGF-p y adquieren una capacidad para incrementar la expresión y secreción de TGF-p, se investigó si este cambio permite a las células tumorales incrementar el número de Tregs adaptativas en el microentorno tumoral. El examen de los niveles séricos de TGF-p en ratones en el d0, d14, y d28 tras la inoculación de células tumorales MB49 vivas demostró que el crecimiento tumoral dio como resultado un incremento progresivo en el nivel de TGF-p sérico (Fig. 2a). Para evaluar la fuente precisa de TGF-p en ratones que portan tumor, se midió la cantidad total de TGF-p en sobrenadantes de células tumorales o de células de ganglios linfáticos que drenan aisladas de ratones que portan tumor, tras el cultivo ex vivo en medio libre de suero durante 24 h. La medida del nivel de TGF-p/106 células mostró que las células tumorales fueron la fuente dominante del mayor nivel de TGF-p en ratones que portan tumor (Fig. 2b). Además de la expresión autónoma de la expresión de TGF-p, autónoma de células tumorales, las células T procedentes de ratones que portan tumor también expresaron mayores niveles de TGF-p en comparación con sus homólogos de ratones libres de tumor (Fig. 2b). Para determinar si la elevación de TGF-p es responsable del aumento de Tregs en el microentorno tumoral, se trataron ratones que portan tumor con una proteína quimérica soluble que comprende el dominio extracelular de TGFpRII y la porción Fc de la cadena pesada de IgG1 murina (TGFpRII:Fc). Esta proteína de fusión interfiere con la unión de TGF-p a TGFpRII endógeno, y funciona como un antagonista de TGF-p estable. Los ensayos ELISA confirmaron la capacidad de TGFpRII:Fc para secuestrar TGF-p en sobrenadantes de células tumorales MB49 de una manera dependiente de la concentración (Fig. 2c). En el d5 tras la inoculación de células tumorales MB49, los ratones se dejaron sin tratar, o se trataron con TGFpRII:Fc (1 |ig intratumoral; dos veces semanalmente) durante 3 semanas, seguido de los análisis citométricos de flujo de la expresión de FoxP3 intracelular en células T CD4+CD25+ que se infiltran en los tumores. El tratamiento in vivo de tumores con TGFpRII:Fc dio como resultado una disminución significativa en la expresión de FoxP3 en células T CD4+ que se infiltran en el tumor (Fig. 2d), y una reducción drástica de Tregs CD4+CD25+FoxP3+ en tejido tumoral (Fig. 2e). Para determinar si la inhibición de TGF-p en el microentorno tumoral puede mejorar la eficacia antitumoral de la quimioterapia, se administró doxorrubicina (5 mg/kg, i.p., semanalmente x 3) a ratones que portan tumor MB49, con o sin un tratamiento dos veces a la semana con TGFpRII:Fc (1 |ig intratumoral). En contraste con el tratamiento con doxorrubicina o TGFpRII:Fc solo, el tratamiento combinado con ambos agentes fue capaz de detener el crecimiento de los tumores MB49. Estos resultados indican que la expresión de TGF-p, autónoma de las células tumorales, en el microentorno tumoral induce Tregs FoxP3+ “adaptativas”, y que contrarrestar la tolerancia inmune mediada por TGF-p inducido por el tumor potencia la eficacia antitumoral de la quimioterapia.
El agotamiento de células T reguladoras CD4+ mediado por el anticuerpo anti-CD4 facilita la activación, inducida por quimioterapia, de células T CD8+ reactivas al tumor, y potencia la eficacia antitumoral de la quimioterapia. Para determinar si el agotamiento de las células T reguladoras CD4+ puede mejorar la eficacia antitumoral de la quimioterapia potenciando la actividad de células T CD8+ en el microentorno tumoral, se administró a ratones inmunocompetentes que portan tumores singénicos un anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) para agotar las células T CD4+, o un anticuerpo anti-CD8 (Clon GK2.43) para agotar las células T CD8+, y entonces se trataron con agentes quimioterapéuticos específicos. El análisis citométrico de flujo de células mononucleares de sangre periférica procedentes de ratones que portan el tumor MB49, en el d7 tras la administración de anticuerpo anti-CD4 o de anticuerpo anti-CD8, confirmaron el agotamiento específico de la diana de células T CD4+ o de células T CD8+, respectivamente (Fig. 3a). Los ratones tratados con anticuerpo anti-CD4 mostraron pérdida de células T CD4+CD25+FoxP3+ en la sangre periférica, así como entre células que se infiltran en el tumor (Fig. 3a, b). Para determinar si el agotamiento mediado por el anticuerpo de células CD4+CD25+FoxP3+ facilita la activación inducida por quimioterapia de células T CD8+ reactivas al tumor en el microentorno tumoral, se evaluó la expresión de IFN-y en células T CD8+ extraídas del tumor y de ganglios linfáticos que drenan de ratones que portan el tumor MB49, que se dejaron sin tratar o se trataron con doxorrubicina (con o sin anticuerpo anti-CD4). Los análisis citométricos de flujo mostraron que las células T CD8+ de ratones sin tratar no expresaron IFN-y en respuesta a la reexposición in vitro con lisados de células MB49 (Fig. 3c). Mientras que las células T IFN-y+CD8+ fueron evidentes en ratones tratados con doxorrubicina sola, el agotamiento de células T CD4+ mediado por el anticuerpo potenció adicionalmente el porcentaje de células T CD8+ reactivas al tumor que expresaron IFN-y en animales tratados con doxorrubicina (Fig. 3c). Para evaluar directamente si la activación de células T CD8+ reactivas al tumor determina la eficacia antitumoral in vivo de la quimioterapia, se examinó el efecto del agotamiento mediado por el anticuerpo de células T CD8+ o células T CD4+ sobre la respuesta de ratones que portan el tumor MB49 al tratamiento sistémico con doxorrubicina (5 mg/kg). El tratamiento con doxorrubicina sola inhibió el crecimiento de tumores MB49, pero no detuvo la progresión tumoral. Mientras que el agotamiento de células T CD8+ alteró completamente la eficacia antitumoral in vivo de doxorrubicina, el agotamiento de células T CD4+ potenció la respuesta a doxorrubicina y dio como resultado la regresión del tumor (Fig. 3d).
El agotamiento de células T reguladoras CD4+ mediado por el anticuerpo anti-CD4 aumenta y sostiene el efecto antitumoral de la quimioterapia al permitir la activación de la inmunidad antitumoral adaptativa. Mientras que las células tumorales tratadas con antraciclinas, tal como doxorrubicina, son particularmente eficaces provocando una respuesta inmune antitumoral, otros agentes quimioterapéuticos son menos eficaces induciendo la muerte de células tumorales inmunogénica. La exposición superficial de calreticulina es un determinante clave de la inmunogenicidad de la muerte de células tumorales en respuesta a agentes quimioterapéuticos. Comparado con la translocación eficiente de CRT a la superficie de la célula en respuesta al tratamiento con doxorrubicina (Fig. 1a), el tratamiento de células tumorales MB49 con dosis equitóxicas de cisplatino o la combinación de cisplatino y gemcitabina fue menos eficaz incrementando la exposición de CRT (Fig. 4a). Mientras que las células T IFN-y+CD8+ reactivas al tumor fueron evidentes en tumores de ratones que portan el tumor MB49 tratados con doxorrubicina (Fig. 3c), el tratamiento con cisplatino fue incapaz de inducir una elevación correspondiente de la expresión de IFN-y en células T CD8+ en respuesta a la reexposición in vitro con lisados de células MB49 (Fig. 4b). Para examinar si la contrarresta de la tolerancia inmune mediada por Tregs permite la activación de la inmunidad antitumoral por cisplatino, se trataron ratones inmunocompetentes que portan un tumor con cisplatino, tras el agotamiento de Tregs con el anticuerpo anti-CD4. El agotamiento mediado por el anticuerpo de células T CD4+ aumentó el porcentaje de células T IFN-y+CD8+ reactivas al tumor, así como células T CD8+CD62L', en animales tratados con cisplatino (Fig. 4b, c). El tratamiento de ratones que portan el tumor MB49 con cisplatino inhibió parcialmente el crecimiento tumoral, pero no pudo detener la progresión tumoral. Mientras que el agotamiento de células T CD8+ anuló completamente el efecto antitumoral in vivo de cisplatino, el agotamiento de células T CD4+ potenció la respuesta al cisplatino y detuvo el crecimiento tumoral (Fig. 4d). Aunque el tratamiento de ratones que portan tumor con la combinación de cisplatino y gemcitabina también fue capaz de detener el crecimiento tumoral, el crecimiento tumoral se reinició rápidamente tras terminar la terapia, no estando ninguno de los animales (0/8) libres del tumor en el d50 tras la inoculación del tumor (Fig. 4e). Por el contrario, los ratones a los que se les agotó las células T CD4+ mostraron una respuesta más sostenida a la quimioterapia con un solo agente o a la quimioterapia de combinación, mostrando 7/16 ratones una regresión total del tumor. La regresión total de los tumores se acompañó con el establecimiento de inmunidad antitumoral adaptativa, puesto que ninguno de los ratones curados (7/7) desarrolló tumores cuando se reexpuso a células tumorales MB49 vivas en el flanco opuesto.
La expresión inducida por quimioterapia de ligandos de NKG2D en células tumorales coopera con el agotamiento de células T reguladoras CD4+ para estimular la regresión tumoral mediada por células T CD8+. NKG2D (NK grupo 2, miembro D) es un receptor estimulador transmembránico de tipo II similar a lectina usado por células NK, células T y8-TCR+ y células T ap-TCR+ para la vigilancia inmune de tumores. La expresión de ligandos de ratón y humanos para NKG2D está aumentada en estirpes de células epiteliales transformadas en respuesta a estrés genotóxico o replicación de ADN perdida, vía activación de una ruta de punto de control del daño del ADN iniciada por proteína cinasas ATM (ataxia telangiectasia, mutada) o ATR (relacionadas con ATM y Rad3). El tratamiento de células de cáncer de colon de ratón CT26 con agentes quimioterapéuticos genotóxicos dio como resultado el aumento de ligandos de NKG2D de ratón de la familia del gen inducible por ácido retinoico (Rae1) (Fig. 5a). La RT-PCR mostró que se indujo ARNm de Rae1 en células CT26 en 2-4 h, alcanzó una meseta tras 16-24 h, y comenzó a declinar después de 48 h de tratamiento con irinotecán u oxaliplatino (Fig. 5a). El análisis citométrico de flujo demostró que la expresión de ligandos de NKG2D humana (moléculas A y B relacionadas con MHC-I - MICA, MICB) en la superficie celular también estaba aumentada en células de cáncer colorrectal humano (HCT116) en respuesta al tratamiento con irinotecán (Fig. 1b). Las células HCT116 isogénicas que difieren solamente en su estado p53 demostraron que p53 no es necesario para el aumento de MICA/B inducido por irinotecán (Fig. 1b). Para examinar si la inducción de ligandos de NKG2D contribuye al efecto antitumoral de la quimioterapia in vivo, se trataron ratones Balb/C inmunocompetentes, inoculados con células tumorales CT26 singénicas, con irinotecán (50 mg/kg i.p) con o sin pretratamiento con un anticuerpo que bloquea NKG2D (200 |ig i.p.). Mientras que el tratamiento con irinotecán solo inhibió el crecimiento de tumores CT26, el efecto antitumoral de irinotecán se anuló mediante el pretratamiento con el anticuerpo que bloquea NKG2D (Fig. 1c). Puesto que el acoplamiento de NKG2D por su ligando proporciona una señal coestimuladora para la activación de células T CD8+, se investigó si la expresión de ligandos de NKG2D inducida por daño del ADN sobre células tumorales coopera con el agotamiento de células T reguladoras CD4+ para estimular la regresión tumoral mediada por células T CD8+. Se administró a ratones Balb/C que portan tumores CT26 un anticuerpo anti-CD4 (Clon GK1.5) para agotar las células T CD4+, y/o un anticuerpo anti-CD8 (Clon GK2.43) para agotar las células T CD8+, y entonces se trataron con irinotecán. Los análisis citométricos de flujo confirmaron la pérdida de células T CD4+CD25+FoxP3+ en el bazo y ganglios linfáticos que drenan de ratones tratados con anticuerpo anti-CD4 (Fig. 5d). El agotamiento de células T CD4+ mediado por el anticuerpo aumentó el porcentaje de células T IFN-y+CD8+ reactivas al tumor en animales tratados con irinotecán (Fig. 5e). Mientras que el tratamiento de ratones que portan el tumor CT26 con irinotecán solamente ralentizó el crecimiento tumoral, el agotamiento de células T CD4+ potenció la respuesta a irinotecán y detuvo el crecimiento tumoral (Fig. 5f). La capacidad del agotamiento de células T CD4+ para aumentar la eficacia antitumoral de irinotecán estuvo mediada por células T CD8+, puesto que el agotamiento de células T CD8+ mediado por el anticuerpo abolió completamente el efecto antitumoral in vivo de la quimioterapia en ratones a los que se les había agotado las células T CD4+ (Fig. 5f).
Estos datos proporcionan las siguientes ideas: (i) la activación de células T CD8+ reactivas al tumor en respuesta a muerte de células tumorales inmunogénica es un determinante crucial de la eficacia antitumoral de la quimioterapia in vivo; (ii) Tregs inducidas por el tumor alteran la eficacia antitumoral de la quimioterapia al inhibir la activación de células T CD8+ en el microentorno tumoral; y (iii) contrarrestar la tolerancia inmune inducida por el tumor vía el agotamiento de células T reguladoras CD4+ mediado por el anticuerpo facilita la activación inducida por quimioterapia de la inmunidad antitumoral con memoria, potenciando de ese modo la eficacia antitumoral de la quimioterapia; (iv) las estrategias para disminuir el número o función de células T reguladoras CD4+ en el microentorno tumoral pueden incrementar la activación de células T CD8+ y mejorar la respuesta de los tumores a agentes anticancerosos citotóxicos (quimioterapia, anticuerpos dirigidos contra el tumor, sustancias terapéuticas dirigidas contra dianas, inhibidores de cinasas) o a quimioinmunoterapia (combinación de agente quimioterapéutico con agentes inmunoterapéuticos).
EJEMPLO 2
Anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas ejemplares
Un resto seleccionador de dianas, incluyendo un anticuerpo, se puede acoplar a un resto inmunomodulador que incluye un polipéptido derivado del dominio extracelular de TGFBR2. Los reticuladores o agentes activantes para tal acoplamiento o conjugación son bien conocidos en la técnica. Como alternativa, las proteínas de fusión de la invención se pueden sintetizar usando tecnología de ADN recombinante bien conocida en la técnica, en la que las secuencias codificantes de diversas porciones de las proteínas de fusión se pueden enlazar juntas a nivel de los ácidos nucleicos. Subsiguientemente, las proteínas de fusión de la invención se pueden producir usando una célula hospedante bien conocida en la técnica. Los ejemplos de anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas se muestran en las Figuras 1-33, y se describen brevemente a continuación.
En una realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador, en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula coinhibidora de células T, y el resto inmunomodulador se une específicamente a factor beta de crecimiento transformante (TGF-P). La SEQ ID NO: 1 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-HER2/neu y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 2). La SEQ ID NO: 2 proporciona una proteína de fusión que incluye anticuerpo anti-EGFR1 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 3). La SEQ ID NO: 3 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD20 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 4). La SEQ ID NO: 4 proporciona una proteína de fusión que incluye anticuerpo anti-VEGF y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 5). La SEQ ID NO: 5 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CTLA-4 humano y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 6). La SEQ ID NO: 6 proporciona una proteína de fusión que incluye IL-2, Fc, y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 7). La SEQ ID NO: 7 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), Fc, e IL-2 (Figura 7). La SEQ ID NO: 8 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 8A). La SEQ ID NO: 9 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 8B). La SEQ ID NO: 10 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD4 y el dominio extracelular (ECD) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (Figura 9). La SEQ ID NO: 11 proporciona una proteína de fusión que incluye el ectodominio de PD-1, Fc, y el dominio extracelular (ectodominio) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (ectodominio de PD-1 Fc ectodominio de TGFpRII; Figura 10). La SEQ ID NO: 12 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio extracelular (ectodominio) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), Fc, y el ectodominio de PD-1 (ectodominio de TGFpRII Fc ectodominio de PD-1; Figura 10). La SEQ ID NO: 13 proporciona una proteína de fusión que incluye el ectodominio de RANK, Fc, y el dominio extracelular (ectodominio) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII) (ectodominio de RANK Fc ectodominio de TGFpRII; Figura 11). La SEQ ID NO: 14 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio extracelular (ectodominio) del receptor II del factor beta de crecimiento transformante (TGFp-RII), Fc, y el ectodominio de RANK (ectodominio de TGFpRII Fc ectodominio de RANK; Figura 11).
En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador, en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula coinhibidora de células Tdiana, y el resto inmunomodulador es una molécula que se une específicamente al ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1 o B7-H1) o ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2 o B7-DC). La SEQ ID NO: 15 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-HER2/neu y el ectodominio de PD-1 (Figura 13). La SEQ ID NO: 16 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-EGFR1 y el ectodominio de PD-1 (Figura 14). La SEQ ID NO: 17 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD20 y el ectodominio de PD-1 (Figura 15). La SEQ ID NO: 18 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-VEGF y el ectodominio de PD-1 (Figura 16). La SEQ iD NO: 19 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CTLA-4 humano y el ectodominio de PD-1 (Figura 17). La SEQ ID NO: 20 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el ectodominio de PD-1 (Figura 18A). La SEQ ID NO: 21 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el ectodominio de PD-1 (Figura 18B). La SeQ ID NO: 22 proporciona una proteína de fusión que incluye IL-2, Fc, y el ectodominio de PD-1 (IL-2 Fc ectodominio de PD-1; Figura 19). La SEQ ID NO: 23 proporciona una proteína de fusión que incluye el ectodominio de PD-1, Fc, e IL-2 (PD-1 ectodominio Fc IL-2; Figura 19). La SEQ ID NO: 24 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD4 y el ectodominio de PD-1 (Figura 20). La SEQ ID NO: 25 proporciona una proteína de fusión que incluye el ectodominio de RANK, Fc, y el ectodominio de PD-1 (ectodominio de RANK Fc ectodominio de PD-1; Figura 21). La SEQ ID NO: 26 proporciona una proteína de fusión que incluye ectodominio de PD-1, Fc, y el ectodominio de RANK (ectodominio de PD-1 Fc ectodominio de RANK; Figura 21).
En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador, en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula coinhibidora de linfocitos T, y el resto inmunomodulador es una molécula que se une específicamente al ligando del receptor activador de NF-kB (RANKL). La SEQ ID NO: 27 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-HER2/neu y el ectodominio de RANK (Figura 23). La SEQ ID NO: 28 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-EGFR1 y el ectodominio de RANK (Figura 24). La SEQ ID NO: 29 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD20 y el ectodominio de RANK (Figura 25). La SEQ ID NO: 30 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-VEGF y el ectodominio de RANK (Figura 26). La SeQ ID NO: 31 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CTLA-4 humano y el ectodominio de RANK (Figura 27). La SEQ ID NO: 32 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el ectodominio de RANK (Figura 28A). La SEQ ID NO: 33 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el ectodominio de RANK (Figura 28B). La SEQ ID NO: 34 proporciona una proteína de fusión que incluye IL-2, Fc, y el ectodominio de RANK (IL-2 Fc ectodominio de RANK; Figura 29). La SEQ ID NO: 35 proporciona una proteína de fusión que incluye el ectodominio de RANK, Fc, e IL-2 (ectodominio de RANK Fc IL-2; Figura 29). La SEQ ID NO: 36 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD4 y el ectodominio de RANK (Figura 30).
En el presente documento se desvela una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador, en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula diana, y el resto inmunomodulador incluye una molécula que se une específicamente a muerte programada 1 (PD-1). La SEQ ID NO: 37 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral (TNFa) y el ligando 1 de PD1 (Figura 32). La SEQ ID NO: 38 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, Fc, y el ligando de PD-1: (ECD de TNFR2 IgG Cy1 PD-L1; Figura 33). La SEQ ID NO: 39 proporciona una proteína de fusión que incluye el ligando de PD-1, Fc, y el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2: (PD-L1 IgG Cy1 - ECD de TNFR2; Figura 33). La SEQ ID NO: 40 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD20 y el ligando 1 de PD1 (PD-L1) (Figura 34). La SEQ ID NO: 41 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el ligando 1 de PD1 (PD-L1) (Figura 35A). La SEQ ID NO: 42 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y el ligando 1 de Pd 1 (PD-L1) (Figura 35B). La SEQ ID NO: 43 proporciona una proteína de fusión que incluye el ligando 1 de PD1 (PD-L1), Fc, e IL-2 (PD-L1 - Fc - IL2; Figura 36). La SEQ ID NO: 44 proporciona una proteína de fusión que incluye IL-2, Fc, y el ligando 1 de PD1 (PD-L1) (IL-2 - Fc -PD-L1; Figura 36). La SEQ ID NO: 45 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD4 y el ligando 1 de PD1 (PD-L1) (Figura 37). La SEQ ID NO: 46 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio extracelular de CTLA-4, Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del ligando de PD-1 (PD-L1) (péptido señal de Oncostatina M ECD de CTLA-4 IgG Cy1 PD-L1; Figura 38). La SEQ ID NO: 47 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio extracelular del ligando de PD-1 (PD-L1), Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del dominio extracelular de CTLA-4: (PD-L1 IgG Cy1 ECD de CTLA-4; Figura 38). La SEQ ID NO: 48 proporciona una proteína de fusión que incluye el factor p de crecimiento transformante (TGF-P), Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del ligando 1 de PD1 (PD-L1) (TGFp-1 Fc PD-L1; Figura 39). La SEQ ID NO: 49 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del ligando 1 de PD1 (PD-L1), Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y factor beta de crecimiento transformante (TGF-P) (PD-L1 Fc TGFp-1; Figura 39).
En el presente documento se desvela una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador, en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula diana, y el resto inmunomodulador incluye una molécula que se une específicamente al receptor del factor beta de crecimiento transformante (TGF-pR). La SEQ ID NO: 50 proporciona una proteína de fusión que incluye un anticuerpo que se une a TNF-a, y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P) (Figura 41). La SEQ ID NO: 51 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, Fc, y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p) (ECD de TNFR2 IgG Cy1 TGF-P; Figura 42). La SEQ ID NO: 52 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p), Fc, y el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2: (TGF-p IgG Cy1 ECD de TNFR2; Figura 42). La SEQ ID NO: 53 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD20 y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-P) (Figura 43). La SEQ ID NO: 54 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p) (Figura 44A). La SEQ ID NO: 55 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD25 y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p) (Figura 44B). La SEQ ID NO: 56 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p), Fc, e IL-2 (TGF-p Fc IL-2; Figura 45). La SEQ ID NO: 57 proporciona una proteína de fusión que incluye IL-2, Fc, y factor p de crecimiento transformante (TGF-p) (IL-2 Fc TGF-p; Figura 45). La SEQ ID NO: 58 proporciona una proteína de fusión que incluye el anticuerpo anti-CD4 y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p) (Figura 46). La SEQ ID NO: 59 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio extracelular de CTLA-4, Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia de una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p) (péptido señal de Oncostatina M ECD de CTLA-4 IgG Cy1 TGF-p1; Figura 47). La SEQ ID NO: 60 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p), Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del dominio extracelular de CTLA-4: (TGF-p1 IgG Cy1 ECD de CTLA-4) (Figura 47).
En el presente document se desvela una composición que comprende una molécula que incluye un resto seleccionador de dianas fusionado con un resto inmunomodulador, en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una molécula diana, y el resto inmunomodulador es una molécula que se une específicamente al ligando del receptor activador de NF-kB (RANKL). La SEQ ID NO: 61 proporciona una proteína de fusión que incluye un anticuerpo que se une a TNF-a, y una secuencia de ectodominio de RANK (Figura 48). La SEQ ID NO: 62 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2, Fc, y una secuencia del ectodominio de RANK (ECD de TNFR2 IgG Cy1 ectodominio de RANK; Figura 49). La SEQ ID NO: 63 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del ectodominio de RANK, Fc, y el dominio de unión al ligando extracelular de TNFR2: (ectodominio de RANK IgG Cy1 ECD de TNFR2; Figura 49). La SEQ ID NO: 64 proporciona una proteína de fusión que incluye el dominio extracelular de CTLA-4, Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia procedente de una secuencia del ectodominio de RANK (péptido señal de Oncostatina M ECD de CTLA-4 IgG Cy1 ectodominio de RANK; Figura 50). La SEQ ID NO: 65 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del ectodominio de RANK, Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del dominio extracelular de CTLA-4: (ectodominio de RANK IgG Cy1 ECD de CTLA-4) (Figura 50). La SEQ ID NO: 66 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p), la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear kB (RANK) (TGF-p IgG Cy1 ectodominio de RANK; Figura 51). La SEQ ID NO: 67 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del ectodominio de RANK, Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p): (ectodominio de RANK IgG Cy1 TGF-p) (Figura 51). La SEQ ID NO: 68 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1), la región Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y un dominio de unión al ligando extracelular o ectodominio del receptor activador del factor nuclear kB (RANK) (PD-L1 IgG Cy1 ectodominio de RANK; Figura 52). La SEQ ID NO: 69 proporciona una proteína de fusión que incluye una secuencia del ectodominio de RANK, Fc de inmunoglobulina (IgG Cy1), y una secuencia del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1): (ectodominio de RANK IgG Cy1 PD-L1) (Figura 52).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de fusión bifuncional dirigida contra dianas, en la que dicha molécula comprende un resto seleccionador de dianas y un resto inmunomodulador, en la que:
(a) el resto seleccionador de dianas comprende un polipéptido que se une específicamente a una molécula coinhibidora de células T y es un antagonista que inhibe la función de la molécula seleccionada como diana; y (b) el resto inmunomodulador comprende una secuencia del dominio de unión al ligando extracelular de un receptor seleccionado del grupo que consiste en:
receptor del factor beta de crecimiento transformante TpRII, TpRIIb, TpRIII; muerte programada 1 (PD-1); receptor activador del factor nuclear kB (RANK); y receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1, VEGFR2).
2. La molécula de la reivindicación 1, en la que el resto seleccionador de dianas comprende un dominio de unión al antígeno de una inmunoglobulina, anticuerpo, anticuerpo biespecífico o multiespecífico, fragmento de anticuerpo, fragmento variable monocatenario (scFv), o scFv bivalente o multivalente.
3. La molécula de la reivindicación 1, en la que dicho resto inmunomodulador se fusiona al término C o término N de dicho resto seleccionador de dianas.
4. La molécula de la reivindicación 1, en la que dicho resto seleccionador de dianas y dicho dominio de unión al ligando extracelular de un receptor se fusionan entre sí vía un enlazador.
5. La molécula de la reivindicación 1, en la que el resto seleccionador de dianas se une específicamente a una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en:
Antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, CD152), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), muerte programada 1 (PD-1; CD279), ligando 1 de PD-1 (PD-L1; B7-H1), ligando 2 de PD-1 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4, atenuador de linfocitos B y T (BTLA; CD272), y HVEM.
6. La molécula de la reivindicación 5, en la que el resto seleccionador de dianas es una inmunoglobulina IgG de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
7. La molécula de la reivindicación 1, en la que el resto inmunomoduladorcomprende una de la SEQ ID NO: 87; la SEQ ID NO: 93 o la SEQ ID NO: 96.
8. La molécula de la reivindicación 1, en la que el resto seleccionador de dianas comprende un anticuerpo que se une a CTLA-4.
9. La molécula de la reivindicación 1, en la que la molécula comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 31.
10. La molécula de la reivindicación 1, en la que la molécula comprende un anticuerpo que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que corresponde a SEQ Id . NO: 74;
(ii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 19, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que corresponde a SEQ ID. NO: 74; o
(iii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que corresponde a SEQ ID NO: 31 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que corresponde a SEQ Id . NO: 74.
11. La molécula de la reivindicación 1, en la que la molécula comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una cualquiera de SEQ ID NOS: 5, 11, 12, 19 y 31.
12. Un método de producción de la molécula de la reivindicación 1-11 mediante técnicas de ADN recombinante, que comprende la optimización de codones de secuencias de aminoácidos de dichas moléculas, la síntesis y clonación de ADNc en plásmidos, y la expresión de moléculas mediante transfección de células hospedantes.
13. El ácido nucleico que codifica la molécula de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
14. La molécula de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para uso en medicina para prevenir o tratar un trastorno neoplásico o cáncer.
15. La molécula para uso de la reivindicación 14, en la que la molécula se administra en combinación con una terapia anticancerosa que comprende una molécula quimioterapéutica o inmunoterapéutica, un anticuerpo, un Ċ
inhibidor de cinasa de pequeña molécula, un agente hormonal, o una vacuna.
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