TW202128763A - 含有ＴＧＦ－β受體的融合蛋白及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本披露涉及含有TGF-β受體的融合蛋白及其醫藥用途。具體地，本披露涉及包含所述PD-1抗體靶向部分和TGF-βRII胞外區的雙功能融合蛋白，以及包含所述含有TGF-β受體融合蛋白的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。
Description
本申請要求2019年11月12日提交的中國專利申請的優先權(申請號201911098550.0)，其內容藉由引用併入本文。
本披露屬於生物技術領域，更具體地，本披露涉及抗PD-1抗體與TGF-β受體的融合蛋白及其應用。
這裡的陳述僅是提供與本披露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)屬於CD28超家族，表達於活化的T細胞，B細胞和髓系細胞。PD-1是約55kDa的I型膜蛋白，包括細胞外IgV結構域、跨膜域和含有免疫受體酪胺酸抑制基序的胞內域。目前，已發現PD-1有兩個配體，程序性死亡配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)和PD-L2。PD-1與配體結合後，可以負調控T細胞的活化，使腫瘤細胞獲得免疫逃逸。
PD-L1在多種癌症中有高表達，其表達水平也與患者預後相關。因此，抑制PD-1與PD-L1的相互作用可以阻斷負調控通路，增強T細胞在免疫應答中的反應，是腫瘤免疫治療領域很有潛力的治療方式。目前，多個PD-1和PD-L1抑制劑(如BMS的Nivolumab，Merck的Pembrolizumab，Roche的Atezolizumab)已經被證實臨床有效並批准上市。但是，PD-1和PD-L1抑制劑也存在著有效率不高的缺陷，主要原因可能是其他免疫檢查點的存在和腫瘤微壞境的複雜性所導致。
轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)屬於TGF-β超家族，TGF-β信號通路在調節細胞生長和分化中扮演著重要的角色。TGF-β表達釋放後，會與受體TGF-βRII結合，激活TGF-βRII，再與TGF-βRI形成複合體。隨後，該複合體會磷酸化下游的Smad2和Smad3。被磷酸化的Smad2和Smad3再與Smad4結合，形成磷酸化的Smad2/3/4複合體進入細胞核，調控下游基因表達。研究表明，TGF-β信號能促進腫瘤的上皮間質轉化過程，啟動腫瘤轉移。在目前的TGF-β靶向藥物的臨床研究中，雖然看到了抑制TGF-β信號通路對疾病進展的積極作用，但單用TGF-β靶向藥物的效果卻依然不夠理想。
因此，在中和腫瘤微環境的TGF-β基礎上抑制PD-1/PD-L1通路，可以使T細胞恢復活性，增強免疫應答，更有效地提高抑治腫瘤發生和發展的效果。
目前已有抗體/TGF-β受體融合蛋白公開，如WO2006074451A2、WO2009152610A1、WO2011109789A2、WO2013164694A1、WO2014164427A1、WO2015077540A2、WO9309228A1、WO9409815A1、WO2015077540A2、WO2015118175A2
和WO2018205985，但並沒有針對抗PD-1抗體和TGF-β受體的融合蛋白藥物獲批上市。
在實際生產和臨床應用上，仍需進一步開發具有更優性能的產品。
本披露提供一種融合蛋白，其包含靶向部分和TGF-β受體部分，其中，該TGF-β受體部分為TGF-βRII胞外區，該靶向部分為抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區為TGF-βRII胞外區的N端截短形式。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區的N端截短形式為在TGF-βRII胞外區的N端缺失0至26個的胺基酸；較佳N端缺失14-26個胺基酸；更佳缺失14-21個胺基酸；最佳缺失14、19或21個胺基酸。
在一些具體的實施方案中，前述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區的N端截短形式為在TGF-βRII胞外區的N端缺失1至26個連續的胺基酸；較佳N端缺失14-26個連續的胺基酸；更佳缺失14-21個連續的胺基酸；最佳缺失14、19或21個連續的胺基酸。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區的序列如SEQ ID NO：61所示。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區的的N端截短形式序列如SEQ ID NO：62、63或64所示。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中
a)該重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
該輕鏈可變區包含序列如SEQ ID NO：11、32、33、34、35、36或37所示的LCDR1和分別如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR2和LCDR3；或
b)該重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
該輕鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含如下該重鏈可變區和輕鏈可變區：
c)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：4序列所示的重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：5序列所示的輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
d)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：6序列所示的重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：7序列所示的輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段以小於4×10-8M、小於6×10-9M的KD值的親和力與人PD-1(或其表位)結合。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段能夠有效阻斷PD-1與配體(如PD-L1)的結合。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段以小於2×10-9M的KD值的親和力與人PD-1(或其表位)結合；和/或以小於3×10-9M的KD值的親和力與食蟹猴的PD-1(或其表位)結合。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段以小於1×10-9M的KD值的親和力與人PD-1(或其表位)結合；和/或以小於1×10-9M的KD值的親和力與食蟹猴的PD-1(或其表位)結合。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段能有效激活T細胞分泌IFN-γ。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段能有效抑制轉基因PD-1小鼠中移植瘤的生長(例如，但不限於結腸癌移植瘤，如MC38細胞移植瘤)。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段能有效抑制轉基因PD-1小鼠中移植瘤的生長(例如，但
不限於結腸癌移植瘤，如MC38細胞移植瘤)，當給藥量為1mpk時，其抑瘤率小於46%。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段能有效抑制轉基因PD-1小鼠中移植瘤的生長(例如，但不限於結腸癌移植瘤，如MC38細胞移植瘤)，當給藥量為3mpk時，其抑瘤率小於60%，或小於76%。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體為人源化抗體，該人源化抗體包含來源自人抗體的框架區或其框架區變體，該框架區變體為在人抗體的輕鏈框架區和/或重鏈框架區上分別具有至多6個胺基酸的回復突變；
較佳地，該回復突變選自如下：
e)輕鏈框架區中的胺基酸回復突變，如2G，和/或
重鏈框架區中的胺基酸回復突變，其選自：27Y、48I、67T、69L、82F和93T中的一個或更多個；或
f)輕鏈框架區中的胺基酸回復突變，選自：42G、44V和71Y中的一個或更多個，和/或
重鏈框架區中的胺基酸回復突變，其選自：1K和/或94S；上述回復突變位置符合Kabat編號規則。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區：
重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且在FR區包含選自27Y、48I、67T、69L、82F和93T中的一個或更多個胺基酸回復突變，和
輕鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且在FR區包含2G胺基酸回復突變。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區：
重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且在FR區包含1K和/或94S胺基酸回復突變，和
輕鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且在FR區包含選自42G、44V和71Y中的一個或更多個胺基酸回復突變；上述胺基酸回復突變的位置符合Kabat編號規則。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區：
重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且在FR區包含選自27Y、48I、67T、69L、82F和93T中的一個或更多個胺基酸回復突變，和
輕鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且在FR區包含2G胺基酸回復突變。
在一些實施方案中，前述融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區選自如下(g)至(k)中的任一項：
g)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：4所示或與其具有至少90%序列同一性和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：5所示或與其具有至少90%序列同一性；
h)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：6所示或與其具有至少90%序列同一性和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：7所示或與其具有至少90%的序列同一性；
j)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：20、23、24或25所示或分別與SEQ ID NO：20、23、24或25具有至少90%序列同一性，和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：21、22、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49所示或分別與SEQ ID NO：21、22、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49具有至少90%序列同一性；和
k)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：26、30或31所示或分別與SEQ ID NO：26、30或31具有至少90%序列同一性，和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：27、28或29所示或分別與SEQ ID NO：27、28或29具有至少90%序列同一性；
較佳地，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含：
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：20所示和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：40所示；或
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：30所示和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：28所示；或
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：31所示和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：28所示。
上述具有至少90%包含具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列一性，序列同一性可以藉由常規的序列比對軟體獲得。
在一些實施方式中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區或其變體，該變體為在SEQ ID NO：20中具有選自如G27Y、M48I、V67T、I69L、L82F和A93T中一個或更多個回復突變；和該抗PD-1抗體包含如SEQ ID NO：21所示的輕鏈可變區或其變體，其中該變體為在SEQ ID NO：21中具有I2G回復突變。
在一些實施方式中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含SEQ ID NO：26所示的重鏈可變區或其變體，該變體為在SEQ ID NO：26中具有R94S和/或E1K回復突變；和該抗PD-1抗體包含如SEQ ID NO：27所示的輕鏈可變區或其變體，其中該變體為在SEQ ID NO：27中具有選自K42G、P44V和F71Y中一個或更多個回復突變。
在一些實施方式中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區或其變體，該變體為在SEQ ID NO：20中具有選自如G27Y、M48I、V67T、I69L、L82F和A93T中一個或更多個回復突變；和該抗PD-1抗體包含如SEQ ID NO：40所示的輕鏈可變區或其變體，其中該變體為在SEQ ID NO：40中具有I2G回復突變。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：40所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：30所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：31所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段進一步包含抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區；該重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體，該輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其常規變體；較佳地，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO：50或51所示的重鏈恆定區和/或序列如SEQ ID NO：52所示的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含選自以下(1)-(n)中任一項的重鏈和輕鏈：
(1)重鏈序列如SEQ ID NO：53或54所示或與SEQ ID NO：53或54具有至少85%的序列同一性；和輕鏈序列如SEQ ID NO：55所示或與SEQ ID NO：55具有至少85%的序列同一性；
(m)重鏈序列如SEQ ID NO：56或57所示或與SEQ ID NO：56或57具有至少85%的序列同一性；和輕鏈序列如SEQ ID NO：58所示或與SEQ ID NO：58具有至少85%的序列同一性；和
(n)重鏈序列如SEQ ID NO：59或60所示或與SEQ ID NO：59或60具有至少85%的序列同一性；和輕鏈序列如SEQ ID NO：58所示或與SEQ ID NO：58具有至少85%的序列同一性；
上述具有至少85%包含具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列一性，序列同一性可以藉由常規的序列比對軟體獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含：SEQ ID NO：53的重鏈和SEQ ID NO：55的輕鏈。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含：SEQ ID NO：56的重鏈和SEQ ID NO：58的輕鏈。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含：SEQ ID NO：59的重鏈和SEQ ID NO：58的輕鏈。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)和二硫鍵穩定化的V區(dsFv)。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區可藉由接頭融合至該抗PD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈的羧基端(C-端)、重鏈的胺基端(N-端)、輕鏈的C-端或輕鏈的N端，較佳融合至重鏈的C-端。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其中該接頭可為本領域內的常用接頭，包括但不限於(ASTKGP)n、(ASTKGPSVFPLAP)n、(TVAAP)n、(TVAAPSVFIFPP)n或(G4S)nG，其中n為1、2、3、4、5或6，較佳為4或5。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白包含：
- 第一鏈，其包含融合至抗PD-1抗體重鏈的TGF-βRII胞外區；和
- 第二鏈，其包含抗PD-1抗體輕鏈，
其中：
o)該第一鏈的序列如SEQ ID NO：69或71所示或與SEQ ID NO：69或71所示的胺基酸序列具有至少85%的同一性，和第二鏈序列如SEQ ID NO：55所示或與SEQ ID NO：55所示胺基酸序列具有至少85%的同一性；或
p)該第一鏈的序列如SEQ ID NO：70、72、73或74所示或與SEQ ID NO：70、72、73或74所示的胺基酸序列具有至少85%的同一性，和第二鏈序列如SEQ ID NO：58所示或與SEQ ID NO：58所示胺基酸序列具有至少85%的同一性；
上述具有至少85%包含具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列一性，序列同一性可以藉由常規的序列比對軟體獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白包含兩條序列相同的第一鏈和第二鏈，其中：
- 第一鏈，其包含融合至抗PD-1抗體重鏈的TGF-βRII胞外區；和
- 第二鏈，其包含抗PD-1抗體輕鏈，
其中：
o)該第一鏈的序列如SEQ ID NO：69或71所示，和第二鏈序列如SEQ ID NO：55所示；或
p)該第一鏈的序列如SEQ ID NO：70、72、73或74所示，和第二鏈序列如SEQ ID NO：58所示。
在一些實施方式中，前述的融合蛋白包含兩條序列相同的第一鏈和第二鏈，其中：
該第一鏈的序列如SEQ ID NO：71所示，和第二鏈的序列如SEQ ID NO：55所示；或
該第一鏈的序列如SEQ ID NO：72所示，和第二鏈的序列如SEQ ID NO：58所示。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其與人PD-1(或其表位)的親和力的KD值小於1×10-8M，小於5×10-9M，小於3×10-9M或小於1×10-9M；其中該KD值可藉由Biacore檢測獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白，其與人TGF-β1的親和力的KD值小於1×10-11M，小於5×10-11M，小於7×10-12M或小於5×10-12M；其中該KD值可藉由Biacore檢測獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白結合細胞表面表達的PD-1；在一些實施方案中，其結合EC50小於10nM，小於8nM，小於5nM或小於2nM，其中結合EC50值可藉由測試例8的方法檢測獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白可以阻斷PD-1與其配體(如PD-L1)的結合；在一些實施方案中，其阻斷IC50值小於15nM，小於13nM，小於10nM或小於5nM；其中阻斷IC50值可藉由測試例9的方法檢測獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白可以抑制TGF-β1誘導Smad3活化；在一些實施方案中，其抑制IC50小於5nM，小於3nM，小
於1nM，小於0.5nM或小於0.2nM；其中阻斷IC50值可藉由測試例10的方法檢測獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白可以刺激T淋巴細胞分泌細胞因子，特別是IFN-γ的分泌；在一些實施方案中，刺激IFN-γ的分泌增加至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少11倍或至少12倍。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白可以阻斷PD-1與其配體的結合；在一些實施方案中，前述的融合蛋白阻斷PD-1與PD-L1結合的IC50值小於5nM，小於2.5nM或小於2nM、或小於1.7nM、或小於1.4nM，其中該IC50值可藉由測試例12的方案檢測獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白可以阻斷PD-1與其配體的結合；在一些實施方案中，前述的融合蛋白阻斷PD-1與PD-L2結合的IC50值小於10nM，小於8nM或小於5nM、或小於4.0nM、或小於3.5nM，其中該IC50值可藉由測試例12的方案檢測獲得。
在一些實施方案中，前述的融合蛋白可以抑小鼠移植瘤的生長。在一些實施方案中，給藥量為1mpk時，該融合蛋白對MC38的移植瘤的抑瘤率大於50%，大於70%，大於80%，或大於85%。
在一些具體的實施方案中，前述的融合蛋白是單體；例如當靶向部分呈現為單鏈結構時，TGF-βRII胞外區藉由接頭融合至單鏈抗體的羧基端或胺基端。
在另一些具體的實施方案中，前述的融合蛋白是二聚體，例如同二聚體或異二聚體；較佳同二聚體。
本披露還提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量的前述的融合蛋白，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施方案中，該治療有效量為單位劑量的組合物中含有0.1mg-3000mg的如前該融合蛋白。
在一些實施方案中，本披露還提供一種核酸分子，其編碼前述任一項該融合蛋白。
在一些實施方案中，本披露還提供一種宿主細胞，其包含前述的核酸分子；該宿主細胞選自細菌、酵母菌和哺乳動物細胞；較佳哺乳動物細胞。更佳地，該哺乳動物細胞為非人細胞。
在一些實施方案中，本披露還提供一種治療或預防腫瘤的方法，該方法包括給予所需患者治療有效量或預防有效量的前述的融合蛋白，或前述的醫藥組成物，或前述的核酸分子；較佳地，其中該腫瘤為PD-1相關的癌症。
在一些實施方案中，本披露還提供一種前述的融合蛋白，或前述的醫藥組成物，或前述的核酸分子在製備用於治療或預防腫瘤的藥物中的用途，較佳地，其中該腫瘤為PD-1相關的癌症。
在一些實施方案中，本披露還提供一種前述的融合蛋白，或前述的醫藥組成物，或前述的核酸分子用作藥物，較佳用作治療腫瘤的藥物，更較佳用作治療PD-1相關的癌症的藥物。
在一些實施方案中，前述的腫瘤選自：頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮
內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾九癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性和梅克爾細胞癌；較佳地，該淋巴瘤選自：何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤；該肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌；該白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病；最較佳的，該疾病選自：黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、腸癌、食管癌、肝癌和結腸癌。
圖1為TGF-β受體融合蛋白結構示意圖；
圖2顯示抗PD-1抗體阻斷PD-1與其配體的結合測試結果；
圖3顯示抗PD-1抗體對PBMC細胞分泌IFNγ的影響；
圖4顯示抗PD-1抗體對小鼠結腸癌MC38移植瘤的療效；
圖5顯示抗PD-1抗體對轉人PD-1基因小鼠結腸癌MC38移植瘤體積的影響；
圖6顯示融合蛋白與穩定轉染PD-1的CHO-S細胞的親和力檢測結果；
圖7顯示融合蛋白的體內藥效試驗。
為了更容易理解本披露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本領域的一般技術人員通常理解的含義。
術語“程序性死亡1”、“細胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PDCD1”和“hPD-1”可互換使用，且包括人PD-1的變體、同種型、物種同源物、以及與PD-1具有至少一個共同表位的類似物。完整的PD-1序列可以GenBank登錄號U64863找到。
術語“程序性死亡配體-1(PD-L1)”是PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體之一(另一種為PD-L2)，它在與PD-1結合時下調T細胞活化和細胞因子分泌。如本文中使用的術語“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的變體、同種型、和種間同源物，以及與hPD-L1具有至少一個共同表位的類似物。完整的hPD-L1序列可以用GenBank登錄號Q9NZQ7查到。
術語“細胞因子”是由一個細胞群體釋放的、作為細胞間介質作用於其它細胞的蛋白質的一般術語。這樣的細胞因子的例子包括淋巴因子、單核因子、趨化因子和傳統的多肽激素。示例性的細胞因子包括：IL-2、IFN-γ、IL-6、TNFα、IL-17和IL-5。
本披露所述的“免疫調節分子”可用於削弱癌細胞的免疫耐受性。本披露採用TGF-βRII胞外結構域(也稱TGF-βRII胞外區)，作為融合蛋白中免疫調節分子部分。本披露中所述的TGF-βRII胞外結構域包含全長形式和N端的截短形式。在一些實施方案中，本披露採用TGF-βRII胞外結構域的N端的截短形式作為融合蛋白中免疫調節分子部分。
“TGF-β受體II(TGF-βRII)”是指可結合配體(包括但不限於TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)細胞表面受體。TGF-βRII/TGF-β複合物招募TGF-βRI以形成信號轉導複合物(Won等，Cancer Res.1999；59：1273-7)。
全長TGF-βRII的胞外結構域是TGF-βRII細胞外自N端開始的一段長136個胺基酸殘基的肽段。其他長度約為136個胺基酸，並且來源於人的具有TGF-βRII的胞外區功能，能夠與TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3相結合的變體同樣屬於本披露的TGF-βRII的胞外結構域的範圍。本披露所述的“TGF-βRII胞外結構域N端截短形式”或“TGF-βRII胞外區的N端截短形式”為從TGF-βRII胞外結構域的N端開始截短，即從N端開始的連續的胺基酸缺失後獲得的TGF-βRII胞外結構域，較佳從TGF-βRII胞外結構域的N端開始連續的26個以下的胺基酸缺失，較佳14-26個胺基酸的缺失，更佳N端14-21個胺基酸的缺失，最佳N端19或21個連續胺基酸缺失。
本披露中的“TGF-βRII胞外結構域”與“TGF-βRII胞外區”可相互替換。
本披露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本披露所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同
的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本披露的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體，較佳人源化抗體。
術語“鼠源抗體”在本披露中為根據本領域知識和技能製備的針對人PD-1(或其表位)的單株抗體。製備時用PD-1抗原(或其表位)注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本披露一個較佳的實施方案中，該鼠源抗PD-1抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將第一物種抗體的可變區與第二物種抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕異源抗體誘發的免疫應答反應。例如，建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本披
露一個較佳的實施方案中，該抗PD-1嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該抗PD-1嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變，和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人物種的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本披露的人源化抗體也包括進一步由酵母菌展示對CDR進行親和力成熟突變後的人源化抗體。
本披露中所述人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區的“常規變體”是指現有技術已公開的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體，示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和胺基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區變體，具體替換如現有技術已知的YTE突變、L234A和/或L235A突變、S228P突變、和/或獲得knob-into-hole結構的突變(使得抗體重鏈具有knob-Fc和
hole-Fc組合)，這些突變已被證實使得抗體具有新的性能，但不改變抗體可變區的功能。
“人抗體”(HuMAb)、“人源抗體”、“全人抗體”、“完全人抗體”可以互換使用，可以是源於人的抗體或者是從一種轉基因生物體中獲得的抗體，該轉基因生物體經“改造”以響應於抗原刺激而產生特異性人抗體並且可以藉由本領域已知的任何方法產生。在某些技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元素元件引入到源於胚胎幹細胞系的生物體的細胞株中，這些細胞系中的內源性重鏈和輕鏈基因座被靶向破壞。轉基因生物可以合成對人抗原特異的人抗體，並且該生物可以用於產生人抗體-分泌融合瘤。人抗體還可以是一種抗體，其中重鏈和輕鏈是由源於一個或更多個人DNA來源的核苷酸序列編碼的。完全人抗體還可以藉由基因或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建，或者由體外活化的B細胞構建，所有的這些都是本領域已知的。
術語“全長抗體”、“完整抗體”、“完全抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與下文定義的抗原結合片段相區分。該術語特別指重鏈包含Fc區的抗體。
術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(或其表位)的能力的一個或更多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)Fd片段，通常由VH和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，通常由抗體的單臂VH和VL結構域組成；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH
結構域組成；(vi)單鏈Fv(scFv)。雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
本披露的抗原結合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)等。
Fab是藉由用酶處理IgG抗體分子所獲得的具有約50，000分子量的片段，並具有抗原結合活性，其中重鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
本披露的Fab可以藉由用酶處理本披露單株抗體來生產。此外，可以藉由將編碼該Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產該Fab。
F(ab')2是藉由用酶消化IgG鉸鏈區中二硫鍵的下游部分而獲得的片段，並具有抗原結合活性，並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區。
本披露的F(ab')2可以藉由用酶處理本披露的單株抗體來生產。此外，可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接Fab'來生產該F(ab')2。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2中鉸鏈區的二硫鍵而獲得的片段，並具有抗原結合活性。本披露的Fab'可以藉由用還原劑處理本披露的F(ab')2來生產。
此外，可以藉由將編碼Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFV”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成(例如Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本披露的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
本披露的scFv可以藉由以下步驟來生產，例如：獲得本披露的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。
雙抗體是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。
本披露的雙抗體可以藉由以下步驟來生產，例如：獲得本披露的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA以使接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA插入到原核生物表達
載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。
dsFv例如可以藉由以下方式獲得，例如：將VH和VL中的一個胺基酸殘基取代為半胱胺酸殘基，藉由半胱胺酸殘基之間形成二硫鍵而獲得的片段。可以按照已知方法(Protein Engineering，7，697(1994))來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
本披露的dsFv可以藉由以下步驟來生產，例如：獲得本披露的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。
術語“胺基酸差異”或“胺基酸突變”是指相較於原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變、突變、或修飾，包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生1個、2個、3個或更多個胺基酸的插入、缺失、替換、或修飾。
術語“抗體框架”或“FR區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
術語“互補決定區”、“CDR”或“高變區”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、
“Chothia”編號規則(參見Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(參見Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999))等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3)。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上被免疫球蛋白(或抗體)所特異性結合的部位(例如，PD-1分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10-8M，例如大約小於10-9M、10-10M、10-11M或更小的親和力(KD)結合。
術語“KD”或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本披露的抗體以小於大約10-7M，例如小於大約10-8M或10- 9M的解離平衡常數(KD)結合PD-1，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。
“Linker”或“接頭”或“連接子”或“連接片段”指用於連接蛋白質結構域的連接性多肽序列，通常具有一定的柔性，接頭的使用不會使蛋白質結構域原有的功能喪失。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，較佳是雙鏈DNA或單鏈mRNA或修飾的mRNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人PD-1或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或更多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據
庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本披露工程化的融合蛋白或抗體及其抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼第一鏈和第二鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的表達載體可以穩定地轉染細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由篩選獲得陽性純株，陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了融合蛋白的培養液可以用常規技術純化。比如，用A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、
“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本披露的任一種融合蛋白的組合物，該受試者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本披露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上
不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。示例性保守取代於下表“示例性胺基酸保守取代”中陳述。
表1. 示例性胺基酸保守取代
“有效量”或“有效劑量”指獲得任一種或多種有益的或所需的預防/治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，諸如減少各種本披露靶抗原相關病症的發病率或改善該病症的一個或更多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩患者的本披露靶抗原相關病症的進展。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或體外產生的物質。
“內源性”指根據情況在生物、細胞或體內產生的物質。
“同源性”或“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的(或同一的)。兩個序列之間的同源性(同源性)百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源或同一；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源或同一。通常，當比對兩個序列時進行比較以給出最大百分比同源性或同一性。例如，可以藉由BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。以下參考文獻涉及經常用於序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：
131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常規BLAST算法也為本領域技術人員所熟知。本披露中的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，較佳至少為95%。非限制性實施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮繼代數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示一種混合物，其含有一種或多種本文該該融合蛋白或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物、與其他化學組分；該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“藥學上可接受的載體”指適合用於製劑中用於遞送抗體或抗原結合片段的任何無活性物質。載體可以是抗黏附劑、黏合劑、包衣、崩解劑、充填劑或稀釋劑、防腐劑(如抗氧化劑、抗菌劑或抗真菌劑)、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適的藥學上可接受
的載體的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝液、緩衝的鹽水和等滲劑例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化鈉。
此外，本披露包括用於治療與目標抗原(例如PD-1)陽性細胞相關的疾病的藥劑，該藥劑包含本披露的融合蛋白作為活性成分。
本披露中與PD-1相關的癌症沒有限制，只要它是與PD-1相關的疾病即可，例如利用本披露的融合蛋白誘導的治療反應可藉由結合PD-1，然後阻遏PD-1與其配體的結合，或殺傷腫瘤細胞。因此，當處於適於治療應用的製備物和製劑中時，本披露的融合蛋白對這樣一些受試者是非常有用的，他們患有腫瘤或癌症，較佳黑色素瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、肝癌、食管癌等。
上述PD-1相關的癌症可以藉由用的抗PD-1抗體或其抗原結合片段檢測或測定表達PD-1的細胞來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本披露中，對用於檢測或測定目標抗原(例如PD-1)的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達目標抗原(例如PD-1)的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
實施例
以下結合實施例進一步描述本披露，但這些實施例並非限制著本披露的範圍。本披露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照
常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 抗人PD-1鼠源抗體獲得
抗原的製備
抗原構建和篩選：
設計併合成人PD-1-IgG1Fc融合蛋白，N端為人PD-1胞外區150個胺基酸，C端為人IgG1的Fc段(hIgG1Fc)。經Protein A的親和管柱純化，可獲得高純度的重組PD-1-Fc蛋白，用於檢測抗PD-1抗體與抗原的結合。
人PD-1-IgG1Fc(SEQ ID NO：1；信號肽+胞外區+hIgG1Fc)：
註釋：下劃線部分為信號肽，正體部分為人PD-1胞外區，斜體部分為hIgG1Fc。
人PD-1-his(SEQ ID NO：2)：
轉染細胞核酸編碼的PD-1抗原(SEQ ID NO：3)：
抗體的製備
抗人PD-1抗體可藉由免疫小鼠產生，也可藉由抗人PD-1噬菌體小鼠免疫文庫獲得。
藉由免疫小鼠製備抗人PD-1抗體的方法如下：
1.免疫：實驗用SJL白小鼠，雌性，6-8週齡和Balb/c白小鼠，雌性，6-8週齡。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按不同方案免疫，每組6-10隻。
免疫抗原可以是純化的重組蛋白PD-1-IgG1Fc(見SEQ ID NO：1)、PD-1-his(見SEQ ID NO：2)、或PD-1作為抗原(見SEQ ID NO：3)轉染的Jurkat/CHO-PD-1細胞，可以單獨一種試劑配合不同的免
疫佐劑或者不同類型免疫原交叉免疫。免疫部位可以是腹腔或者背部皮下，或者兩種位置交替免疫。
免疫佐劑TiterMax® Gold Adjuvant(以下簡稱Titermax，購自Sigma貨號T2684)與Imject Alum Adjuvant(以下簡稱Alum，購自Pierce貨號77161)交叉免疫。抗原與佐劑(Titermax)比例為1：1，抗原與佐劑(Alum)比例為3：1，25-50μg/隻(首次免疫)，50μg/隻(加強免疫)，或是1×107個Jurkat/CHO-PD-1細胞/隻。第0天腹膜內注射25-50μg/隻的乳化後抗原，首次免疫後每週一次或是每兩週一次，Titermax和Alum交替使用，共5-8次。
2.細胞融合：選擇血清中抗體滴度高的小鼠進行脾細胞融合，將衝刺免疫72小時後的小鼠眼球放血，拉頸處死，放入75%乙醇中消毒。採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(中國科學院)進行融合得到融合瘤細胞。
融合好的融合瘤細胞用HAT完全培養基(含20% FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培養基)重新懸浮，分裝於96孔細胞培養板中(1×105/150μl/孔)，37℃，5%CO2孵育，種板10-30塊左右。融合後的第5天加入HAT完全培養基，50μl/孔，37℃，5%CO2孵育。融合後第7天至8天，根據細胞生長密度，換液，200μl/孔，37℃，5%CO2孵育。
3.融合瘤細胞篩選：融合後第7-9天，根據細胞生長密度，進行抗體與PD-1結合的ELISA方法檢測，並將檢測的陽性孔細胞進行PD-1/PDL1結合的阻斷ELISA檢測，陽性孔換液，並根據細胞密度及時擴大至24孔板中。移入24孔板的細胞株經過複測後進行保種和第一次亞選殖。第一次亞選殖篩選為陽性的進行保種，並進行第二次或第三次亞選殖，
直至獲得單細胞純株。多次融合獲得有阻斷PD-1與PDL1結合效果的融合瘤細胞。
4.藉由抗人PD-1噬菌體小鼠免疫文庫獲得抗人PD-1抗體的方法如下：
構建抗人PD-1噬菌體小鼠免疫文庫：選擇血清中抗體滴度高的小鼠的脾臟，用Trizol(Invitrogen Cat No.15596-018)提取組織總RNA。使用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Takara Cat No.6210A)進行反轉錄獲得cDNA。根據IMGT數據庫設計並合成構建文庫的引子。藉由三輪PCR反應，獲得單鏈抗體片段。將單鏈抗體片段和經過改造的建庫載體pCantab5E(Amersham Biosciences/GE Cat No.27-9400-01)用Sfi1(NEB Cat No.#R0123L)進行酶切，電泳後用E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit(Omega Cat No.D2500-02)進行純化回收。然後用T4 DNA連接酶(NEB Cat No.#M0202L)16℃連接16-18小時，再用上述試劑盒進行純化回收，最後用去離子水沖提。取1μg連接產物與1支電轉化感受態TG1(Lucigen Cat No.60502-2)混合，電轉化儀(Bio Rad Micropulser)參數設至2.5kV，200Ω，25uF，進行電轉化。重複轉化10次，塗平板，37℃倒置培養16-18小時。將所有菌落刮洗下來混和在一起，加入終濃度為15%的甘油，-80℃保存備用。
5.抗人PD-1噬菌體小鼠免疫文庫的篩選：將包裝好的抗人PD-1噬菌體免疫文庫(1×1012-1×1013)與100μl鏈菌素微珠(Milenvi Biotec，Auburn，CA)加入1ml含2%脫脂牛奶-磷酸鹽緩衝液(縮寫MPBS)中於室溫下孵育1小時，放置在磁力架上，取上清。上清加入10μg/ml生物素化的人PD-1-ECD-his蛋白(購自Sino Biological)中於室溫下孵育1小時，再加入100μl鏈黴親和素包被的磁珠(1ml MPBS預孵育)於室溫
下孵育1小時。並使其負載於磁力架系統上用於分選，吸去上清。加入1ml PBST(含0.1% Tween-20的磷酸鹽緩衝液)，翻轉多次，吸盡後再加入新鮮洗液，重複11次，以去除未結合的抗體片段，加入0.5ml沖提液(50μl 10mg/ml胰蛋白酶存儲液加入450μl PBS中)。室溫下搖晃15min。放置在磁力架上，吸出上清至一新EP管中。TG1接入2YT培養基中擴增至培養細菌密度OD600=0.4時。每管加入1.75ml TG1(OD600=0.4)，並加入250μl沖提後phage(噬菌體)，37℃水浴中靜置孵育30min，梯度稀釋塗板，用於測試滴度。其餘TG1溶液離心，塗板，37℃過夜孵育。
噬菌體小鼠免疫文庫利用生物素化的人PD-1-ECD-his抗原，經過2-3輪MACS篩選(鏈黴素磁珠，Invitrogen)，最終獲得具有結合PD-1和阻斷PD-1與PD-L1結合的單株，測序驗證，得到抗體的可變區序列。
重組抗原蛋白/抗體的純化
1.融合瘤上清分離純化/ProteinG親和層析：
對於小鼠融合瘤上清純化首選ProteinG進行親和層析，將培養所得融合瘤離心取上清，根據上清體積加入10-15%體積的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)調節上清pH。ProteinG管柱利用6M鹽酸胍洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積；利用如1×PBS(pH7.4)緩衝體系作為平衡緩衝液對層析管柱平衡3-5倍管柱體積；細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間；利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線；利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0)緩衝液進行樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節pH至5-6。對於沖提產物可以利用本領域技術人員熟知的方法進行溶液置換(如，利用超濾管進行超濾濃縮及溶液
置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻替換成所需的緩衝體系，或者利用分子排阻管柱去除沖提產物中的聚體成分以提高樣品純度)。
2. Protein A親和層析純化蛋白或抗體：
首先將表達抗原蛋白或者抗體的細胞培養上清進行高速離心收取上清。ProteinA親和管柱利用6M鹽酸胍洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積。利用如1×PBS(pH7.4)緩衝體系作為平衡緩衝液對層析管柱平衡3-5倍管柱體積。細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間，結合完畢後利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線。利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0-3.5)緩衝液進行樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節pH至5-6。對於沖提產物可以利用本領域技術人員熟知的方法進行溶液置換(同上)。
將經前述方法獲得的抗人PD-1鼠源抗體進行抗原結合實驗，篩選得到2株活性良好的純株：M23和M33，將單細胞純株擴培養，提取RNA，利用小鼠-Ig的簡併引子進行反轉錄擴增(RT-PCR)，得到抗體的可變區序列。將該鼠抗體可變區序列與人抗體恆定區序列連接，選殖並重組表達出該鼠單株抗體的嵌合抗體，進行體外活性實驗，確認所得到的單株抗體可變區序列正確。
測得鼠源抗體M23和M33的可變區序列如下：
鼠源抗體M23的重鏈可變區(SEQ ID NO：4)：
鼠源抗體M23的輕鏈可變區(SEQ ID NO：5)：
鼠源抗體M33的重鏈可變區：(SEQ ID NO：6)
鼠源抗體M33的輕鏈可變區：(SEQ ID NO：7)
備註：上述抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區序列中，下劃線為Kabat編號系統確定的CDR序列，依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
表2. 鼠源抗體M23和M33重鏈及輕鏈CDR區序列
實施例2. 抗人PD-1單株抗體的人源化
藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟體，分別挑選與M23，M33的輕重鏈序列同一性高的重輕鏈可變區種系基因作為模板，將這2個鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源抗體模板中，分別構建其對應的人源化抗體。
1.鼠源抗體M23人源化
1.1 鼠源抗體M23人源化構架選擇
鼠源抗體M23的人源化輕鏈模板為IGKV2-40*01和IGKJ4*01，人源化重鏈模板為IGHV1-69*02和IGHJ6*01，人源化改造後可變區序列如下(下劃線為CDR序列)：
Hu23VH-CDR移植：(SEQ ID NO：20)
Hu23VL-CDR移植：(SEQ ID NO：21)
1.2 人源化抗體的回復突變設計
表3.人源化抗體回復突變設計
M23的人源化抗體輕/重鏈可變區序列如下：
>Hu23VL1(同Hu23VL-CDR移植)：(SEQ ID NO：21)
>Hu23VL2(SEQ ID NO：22)
>Hu23VH1(同Hu23VH-CDR移植)：(SEQ ID NO：20)
>Hu23VH2(SEQ ID NO：23)
>Hu23VH3(SEQ ID NO：24)
>Hu23VH4(SEQ ID NO：25)
1.3 鼠源抗體M23的人源化序列組合
鼠源抗體M23的人源化模板進行回復突變設計後，不同的可變區回復突變組合成不同的人源化抗體可變區，具體見下表。
表4. Hu23人源化抗體可變區組合
上表中所指代的抗體輕/重鏈可變區組合(例如Hu23-1)可以分別與抗體輕/重鏈恆定區連接形成全長抗體；在本披露中如無明確說明時，形成全長抗體時輕鏈可變區與SEQ ID NO：52所示的Kappa鏈恆定區連接形成抗體輕鏈，重鏈可變區與SEQ ID NO：50或51所示的IgG4-AA重鏈恆定區連接形成抗體重鏈。
2.鼠源抗體M33人源化
2.1 鼠源抗體M33人源化構架選擇
鼠源抗體M33的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和IGKJ4*01，人源化重鏈模板為IGHV3-7和IGHJ6*01，人源化可變區序列如下：
Hu33VH-CDR移植(SEQ ID NO：26)：
Hu33VL-CDR移植(SEQ ID NO：27)：
2.2 人源化抗體的回復突變設計
表5. 鼠源抗體M33人源化抗體輕/重鏈可變區序列
鼠源抗體M33的人源化抗體輕鏈可變區和重鏈可變區序列如下：
>Hu33VL1(同Hu33VL-CDR移植)：(SEQ ID NO：27)
>Hu33VL2(SEQ ID NO：28)
>Hu33VL3(SEQ ID NO：29)
>Hu33VH1(同Hu33VH-CDR移植)：(SEQ ID NO：26)
>Hu33VH2(SEQ ID NO：30)
>Hu33VH3(SEQ ID NO：31)
3.鼠源抗體M33的人源化序列組合
表6. 人源化抗體輕重鏈可變區組合
上表中所指代的抗體輕/重鏈可變區組合(例如Hu33-6)可以分別與抗體輕/重鏈恆定區連接形成全長抗體；在本披露中如無明確說明時，形成全長抗體時輕鏈可變區與SEQ ID NO：52所示的Kappa鏈恆定區連接形成抗體輕鏈，重鏈可變區與SEQ ID NO：50或51所示的IgG4-AA重鏈恆定區連接形成抗體重鏈。
4.人源化抗體的突變體
Hu23人源化抗體的突變抗體
藉由計算機模擬，對Hu23人源化抗體的輕鏈LCDR1(SEQ ID NO：11)的特定位點胺基酸進行定點突變，具體突變見表7：
表7. Hu23輕鏈LCDR1的突變序列：
LCDR1突變後的Hu23人源化抗體輕鏈可變區序列如下：
>Hu23VL1(N28Q)序列為：
>Hu23VL1(N28L)序列為：
>Hu23VL1(N28T)序列為：
>Hu23VL1(N28D)序列為：
>Hu23VL1(G29A)序列為：
>Hu23VL1(G29V)序列為：
>Hu23VL2(N28Q)序列為：
>Hu23VL2(N28L)序列為：
>Hu23VL2(N28T)序列為：
>Hu23VL2(N28D)序列為：
>Hu23VL2(G29A)序列為：
>Hu23VL2(G29V)序列為：
表8. Hu23人源化抗體輕/重鏈可變區組合
上表中所指代的抗體輕/重鏈可變區組合(例如Hu23-11)可以分別與抗體輕/重鏈恆定區連接形成全長抗體；在本披露中如無明確說明時，形成全長抗體時輕鏈可變區與SEQ ID NO：52所示的Kappa鏈恆定區連接形成抗體輕鏈，重鏈可變區與SEQ ID NO：50或51所示的IgG4-AA重鏈恆定區連接形成抗體重鏈。
對突變後得到的抗體進行親和力檢測，實驗結果顯示，Hu23LCDR1(N28Q)、Hu23LCDR1(N28L)、Hu23LCDR1(N28T)、Hu23LCDR1(N28D)、Hu23LCDR1(G29A)、Hu23LCDR1(G29V)位點突變後的人源化抗體均保持與PD-1的結合能力(表9)。
5.人源化抗體的篩選
藉由Biacore進行不同人源化抗體的親和力檢測(方法參見測試例3)，結果見表9，結果顯示不同的人源化抗體保持了對於PD-1的結合能力，部分人源化抗體的親和力甚至和其鼠源抗體基本接近。
表9. Hu23人源化抗體與人PD-1的親和力
實施例3. 構建和表達PD-1人源化抗體
設計引子PCR搭建各人源化抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr。IgG4-AA代表F234A(對應於序列SEQ ID NO：50的第114位)、L235A(對應於序列SEQ ID NO：50第115位)突變和S228P(對應於序列SEQ ID NO：50的第108位)，IgG4-AA可以藉由IgG4抗體形式簡單點突變獲得。此外，可選的，將IgG4恆定區的最後一位胺基酸K突變為A，該突變並不會影響抗體的活性。示例性的輕鏈恆定區為Kappa鏈的恆定區。
IgG4-AA重鏈恆定區變體序列如下(SEQ ID NO：50)：
IgG4-AA重鏈恆定區序列如下(SEQ ID NO：51)：
Kappa鏈恆定區序列如下(SEQ ID NO：52)：
構建的IgG4AA形式全長抗體序列示例性列舉如下：
Hu23-11(A)抗體重鏈(SEQ ID NO：53)：
Hu23-11抗體重鏈(SEQ ID NO：54)：
Hu23-11(A)/Hu23-11抗體輕鏈(SEQ ID NO：55)：
Hu33-5(A)抗體重鏈(SEQ ID NO：56)：
Hu33-5抗體重鏈(SEQ ID NO：57)：
Hu33-5(A)/Hu33-5抗體輕鏈(SEQ ID NO：58)：
Hu33-6(A)抗體重鏈(SEQ ID NO：59)：
Hu33-6抗體重鏈(SEQ ID NO：60)：
Hu33-6(A)/Hu33-6抗體輕鏈(SEQ ID NO：58)：
實施例4. 融合蛋白PD-1/TGF-β trap選殖和表達
採用TGF-βRII胞外結構域(也稱TGF-βRII胞外區)作為融合蛋白中免疫調節分子部分，將PD-1抗體作為融合蛋白的靶向部分，形成PD-1抗體/TGF-βRII胞外區的融合蛋白(PD-1/TGF-β trap)。研究發現，包含TGF-βRII胞外結構域截短形式的融合蛋白的結構和功能較為穩定，尤其是在TGF-βRII胞外結構域的N端作19個胺基酸的截短後，其融合蛋白具有更高的表達量和穩定的結構。本披露中的TGF-βRII胞外結構域及其截短形式的非限制性實施例序列如下：
TGF-βRII胞外結構域全長序列：ECD(1-136)
SEQ ID NO：61
TGF-βRII胞外結構域序列在N端有19個胺基酸的截短：ECD(20-136)
SEQ ID NO：62
TGF-βRII胞外結構域序列在N端有21個胺基酸的截短：ECD(22-136)
SEQ ID NO：63
TGF-βRII胞外結構域序列在N端有14個胺基酸的截短：ECD(15-136)
SEQ ID NO：64
利用同源重組技術將本披露抗PD-1抗體的重鏈C末端胺基酸藉由常規的接頭連接不同長度TGF-βRI1胞外區，與輕鏈一起，藉由293表達系統進行常規表達，得到PD-1/TGF-β trap融合蛋白，常見的接頭包括但不限於：
(ASTKGP)n SEQ ID NO：65；
(ASTKGPSVFPLAP)n SEQ ID NO：66；
(TVAAP)n SEQ ID NO：67；
(TVAAPSVFIFPP)n SEQ ID NO：68；或
(G4S)nG；
其中n為1-6的整數，較佳為4或5，非限制性的實施例如表10所示，本披露的融合蛋白結構如圖1所示。
表10：PD-1/TGF-β trap融合蛋白
本披露中的非限制性的融合蛋白的序列如下所示：
融合蛋白1的第一鏈(即抗Hu23-11(A)抗體重鏈-(G4S)4G-ECD(1-136))：
SEQ ID NO：69
融合蛋白1的第二鏈(同Hu23-11抗體輕鏈序列)：
SEQ ID NO：55
融合蛋白2的第一鏈(即抗Hu33-5(A)抗體重鏈-(G4S)4G-ECD(1-136))：
SEQ ID NO：70
融合蛋白2的第二鏈(同Hu33-5抗體輕鏈序列)：
SEQ ID NO：58
融合蛋白3的第一鏈(即抗Hu23-11(A)抗體重鏈-(G4S)4G-ECD(20-136))：
SEQ ID NO：71
融合蛋白3的第二鏈(同Hu23-11抗體輕鏈序列)：
SEQ ID NO：55
融合蛋白4的第一鏈(即抗Hu33-5(A)抗體重鏈-(G4S)4G-ECD(20-136))：
SEQ ID NO：72
融合蛋白4的第二鏈(同Hu33-5抗體輕鏈序列)：
SEQ ID NO：58
融合蛋白5的第一鏈(即抗Hu33-6(A)抗體重鏈-(G4S)4G-ECD(1-136))：
SEQ ID NO：73
融合蛋白5的第二鏈(同Hu33-6抗體輕鏈序列)：
SEQ ID NO：58
融合蛋白6的第一鏈(即抗Hu33-6(A)抗體重鏈-(G4S)4G-ECD(20-136))：
SEQ ID NO：74
融合蛋白6的第二鏈(同Hu33-6抗體輕鏈序列)：
SEQ ID NO：58
備註：上述融合蛋白的第一鏈序列中，劃線部分為PD-1抗體重鏈，斜體為接頭，點劃線部分為TGF-βRII胞外區。
編碼抗PD-1抗體的核苷酸序列、編碼TGF-βRII胞外區的核苷酸序列、接頭蛋白片段((G4S)4G)n的核苷酸序列藉由所屬領域常規技術手段獲得。利用同源重組技術將抗PD-1抗體的重鏈的C末端核苷酸藉由接頭蛋白連接不同長度TGF-βRII胞外區的N末端核苷酸，選殖到Phr-BsmbI載體上。重組的PD-1/TGF-β trap在293細胞等其他工程化的細胞中進行表達，藉由實施例5進行純化。純化的蛋白可用於下述各實施例實驗中。
實施例5：PD-1/TGF-β trap融合蛋白純化
細胞培養液高速離心後收集上清，利用親和層析進行第一步純化。層析介質為與Fc相互作用的Protein A或者衍生填料，如GE的MabSelect SuRe。平衡緩衝液為1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，pH7.4)，平衡5倍管柱體
積後，將細胞上清上樣結合，流速控制為樣品在管柱上保留時間≧1min。上樣結束後，用1×PBS(pH7.4)沖洗管柱，直至A280紫外吸收降至基線。然後用0.1M乙酸(pH3.5)的沖提緩衝液沖洗層析管柱，根據A280紫外吸收峰收集沖提峰，收集的沖提樣品用1M Tris(pH8.0)中和。
將上述中和後的沖提樣品超濾濃縮後進行體積排阻層析，緩衝液為1×PBS，層析管柱為XK26/60 Superdex200GE)，流速控制在4mL/min，上樣體積小於5mL，根據A280紫外吸收合併目的蛋白峰。收集的蛋白經SEC-HPLC鑒定純度大於95%，經LC-MS鑒定為正確後分裝備用，得到PD-1/TGF-β trap融合蛋白。
測試例
測試例1. 抗PD-1抗體在體外阻斷PD-1對其配體的結合的ELISA實驗
腫瘤細胞表面的PD-L1藉由和T細胞表面的PD-1的結合，從而對T細胞的增殖起到抑制的效果。抗PD-1的抗體能藉由和PD-1結合，阻斷PD-L1/PD-1的信號通路，進而刺激T細胞的增殖。阻斷PD-1/PD-L1的結合實驗用於檢測抗PD-1抗體對於信號通路的阻斷活性。
本實驗中，將胞外區與Fc融合的PD-1蛋白(PD-1-Fc，序列見SEQ ID NO：1)包被96孔板後，分別加入待測的抗PD-1抗體(包括抗體：Hu23-11、Hu33-6，陽性對照抗體：H005-1(參見WO2015085847中H005-1抗體)，進行孵育反應；稍後再加入生物素標記的PD-L1/PD-L2，孵育反應。洗板後，檢測生物素標記的PD-L1/PD-L2結合量，計算得到抗PD-1抗體對配體PD-L1/PD-L2結合阻斷的IC50值。
用pH 9.6 CB緩衝液(1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶於1L蒸餾水)將PD-1-Fc稀釋至1μg/mL，以100μL/孔的體積加於96孔板中，於4℃放置16h-20h。將96孔板中PBS緩衝液吸掉，用PBST(pH7.4PBS含0.05% tween20)緩衝液洗板1次後，加入120μL/孔PBST/1%脫脂乳，室溫孵育1h進行封閉。移去封閉液，用PBST緩衝液洗板1次後，加入90μl用樣品稀釋液(pH7.4 PBS含5%BSA，0.05% Tween20)稀釋至合適濃度的待測抗PD-1抗體，置4℃預孵育1h。以10μL/孔的體積加入10×濃度的生物素標記PD-L1/PD-L2(北京義翹神州生物技術有限公司)(10μg/ml)，在振盪器上振盪、混勻後，置37℃孵育1h。移去反應體系，用PBST洗板6次後，加入100μL/孔用PBST緩衝液1：400稀釋的鏈黴親和素-過氧化物酶聚合物，室溫振盪孵育50分鐘。用PBST洗板6次後，加入100μLl/孔TMB，於室溫孵育5-10min。加入100μL/孔1M H2SO4終止反應。用酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗PD-1抗體阻斷配體PD-L1/PD-L2的結合的IC50值。數據詳見下表。
表11. 抗PD-1抗體與PD-1結合及對PD-L1/PD-L2結合的阻斷
本披露示例性抗PD-1抗體Hu23-11和Hu33-6都能夠有效阻斷PD-1與PD-L1/PD-L2的結合，其阻斷活性與陽性對照抗體H005-1相似。
測試例2. 示例性抗體和配體的阻斷試驗
研究抗體對PD-1與PD-L1結合的阻斷作用。實驗過程簡單描述如下：消化CHOK1/PD-L1細胞(Promega)，按照100μL/孔加入到96孔板中，放置於37℃，5%CO2培養箱培養24小時。使用PBS稀釋對照品和樣品至所需濃度。計數Jurkat/PD-1細胞(穩定轉染有PD-1的Jurkat細胞)，按一定比例種CHOK1/PD-L1細胞的細胞培養板中(90μL/孔)同時加入10μL/孔加入稀釋後的抗體(抗體：Hu23-11和Hu33-6，陽性對照抗體：H005-1)，陰性對照IgG4蛋白，抗體梯度稀釋濃度為0.3mg/mL、3mg/mL、30mg/mL，置於37℃，5%CO2培養箱培養5小時。取出細胞
培養板，置於室溫放置5分鐘，然後每孔加入50μl Bio-GloTM Reagent，室溫孵育5分鐘，讀板。實驗結果見圖2。
結果表明，本披露中示例性的抗PD-1抗體Hu23-11和Hu33-6能夠有效阻斷PD-1與PD-L1的結合，其阻斷活性與陽性對照抗體H005-1相似。
測試例3. 示例性抗體的BIAcore抗體親和力實驗
用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲IgG，人PD-1抗原(Cat.# 10377H08H，Sino Biological)、Cyno PD-1抗原(購自Sino Biological)流過芯片表面，Biacore T200儀器實時檢測PD-1抗體和抗原PD-1反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用10mM甘胺酸-HCl pH1.5的緩衝液將生物傳感芯片洗淨再生。實驗緩衝體系為1×HBS-EP緩衝溶液(Cat# BR-1001-88，GE)。實驗結束後用GE Biacore T200 Evaluation 3.0版軟體以(1：1)Langmuir模型擬合數據，得出親和力數值，結果見表12。
表12. 抗PD-1抗體與人PD-1和食蟹猴PD-1的親和力
結果顯示，本披露示例性的抗PD-1抗體Hu23-11和Hu33-6A均能夠與人PD-1和猴PD-1結合。
測試例4. 在PBMC-T淋巴細胞激活實驗中，抗體對細胞分泌IFNγ的作用
為了研究抗PD-1抗體對人原代T淋巴細胞功能的影響，收集和純化人外週血單核細胞(PBMC)，採用結核菌素(TB)體外刺激5天後，檢測細胞因子IFNγ分泌水平。實驗過程簡單描述如下：
新鮮血液利用Ficoll-Hypaque(17-5442-02，GE)，密度梯度離心(Stem Cell Technologies)得到PBMC，於RPMI 1640(SH30809.01，GE)培養基中培養，該培養基中添加10%(v/v)FBS(10099-141，Gibco)，37℃，5% CO2條件下培養。
新鮮分離純化的PBMC以RPMI 1640培養基調整密度為2×106個/mL，20mL細胞懸液中加入40μL結核菌素(97-8800，Synbiotics)，37℃，5% CO2培養箱培養5天。第5天，收集上述培養的細胞離心，重新懸浮至新鮮的RPMI 1640培養基中，調整密度為1.1×106個/mL，接種至96孔細胞培養板，每孔90μL。同時加入梯度稀釋的抗體樣品(包括本披露的抗體：Hu23-11和Hu33-6，陽性對照抗體H005-1，和陰性對照IgG4蛋白，抗體梯度稀釋濃度為0.3mg/mL、3mg/mL、30mg/mL)，用PBS(B320，上海源培生物科技股份有限公司)稀釋，每孔10μL。細胞培養板置於37℃，5% CO2培養箱孵育3天。取出細胞培養板，離心(4000rpm，10min)收集細胞培養上清，採用ELISA的方法(人IFN-γ檢測試劑盒(EHC102g.96，欣博盛)，檢測IFN-γ的水平。具體操作參考試劑說明書。
試驗結果見圖3，結果表明本披露的抗PD-1抗體Hu23-11和Hu33-6均能有效激活IFN-γ的分泌，其激活IFN-γ分泌的能力與陽性H005-1對照相似。
測試例5. 抗PD-1抗體在轉基因PD-1小鼠結腸癌模型MC38中的作用
將MC38細胞5×105細胞/小鼠/100μL接種於90隻hPD-1 TG小鼠(百奧賽圖)右肋部皮下，10天後去除腫瘤體積過大過小的動物，按平均腫瘤體積約120mm3將小鼠隨機分為：空白對照(PBS)、陽性對照H005-1 3mpk、Hu23-11 1mpk、Hu23-11 3mpk、Hu33-6 3mpk共5組，每組8隻。Day0(第0天)起每週三次腹腔注射各組抗體，第一週給藥結束後發現腫瘤被明顯抑制，第二、三週調整給藥頻率為每週一次，共給藥5次。每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。當腫瘤體積超過2000mm3或多數腫瘤出現破潰或體重下降20%時，將荷瘤動物進行安樂死作為實驗終點。
腫瘤體積(TV)=1/2×L長×L短 2
腫瘤增殖率(T/C%)=(T-T0)/(C-C0)×100%
抑瘤率(TGI%)=1-T/C%
其中，T、T0分別表示抗體給藥組試驗結束和試驗開始時的腫瘤體積，C、C0分別表示空白對照組試驗結束和試驗開始時的腫瘤體積。
試驗結果見表13和圖4，試驗結果表明，與空白對照相比，本披露的抗體均能顯著抑制小鼠結腸癌MC38移植瘤的生長。當給藥頻率為一週給藥3次，在第七天檢測時，結果顯示本披露的抗體的抑瘤率均明顯優於陽性對照抗體H005-1；其後給藥頻率降為一週一次，給藥2次後(第21天)，本披露的抗體間藥效逐漸拉開差距，且表現出劑量依賴性。而且荷瘤小鼠對抗PD-1抗體均能很好耐受，在整個給藥過程中體重平穩上升，無明顯藥物致體重減輕等症狀發生。
表13. 抗PD-1抗體對小鼠結腸癌MC38的抑瘤率
測試例6. 抗PD-1抗體在轉基因PD-1小鼠結腸癌模型MC38中的作用
轉基因PD-1小鼠來源於購買的轉基因PD-1小鼠(ISIS INNOVATION LIMITED，University Offices，Wellington Square，Oxford OX1 2JD，England)在Cephrim Biosciences，Inc.培育的第五代小鼠。將MC38細胞以5×105個/100μl/隻接種到hPD-1轉基因小鼠(雌雄各半)右肋後部皮下，待小鼠平均腫瘤體積達到80-100mm3之間時，去除體重、腫瘤過大和過小的動物，按照腫瘤體積大小將荷瘤小鼠隨機分為5組(每組8隻)：陰性對照hIgG 30mpk、H005-1 10mpk、H005-1 30mpk、Hu33-6 10mpk、Hu33-6 30mpk。分組給藥日期設定為D0(第0天)。分組後腹腔給予各藥物，給藥週期22天，每兩天給藥一次，共11次。每週測2次瘤體積，稱體重，記錄數據。各組動物體重、腫瘤體積均用平均值±標準差(Mean±SEM)表示，並用Graphpad Prism 5和Excel軟體作圖，使用學生T檢驗統計分析。
腫瘤體積(TV)=0.5236×L長×L短 2
腫瘤增殖率T/C%=(T-T0)/(C-C0)×100%
抑瘤率%TGI=1-T/C%
其中，T、T0分別表示抗體給藥組試驗結束和試驗開始時的腫瘤體積，C、C0分別表示空白對照組試驗結束和試驗開始時的腫瘤體積。
試驗結果見表14和圖5所示，試驗結果表明，與對照組相比，本披露的抗體能顯著抑制小鼠結腸癌MC38移植瘤的生長，其中抑瘤率最高的是Hu33-6 30mpk組，第20天測量時抑瘤率為80.4%。在低劑量組(10mpk)，Hu33-6 10mpk的藥效好於陽性對照H005-1-10mpk。
表14. 抗PD-1抗體對小鼠結腸癌MC38腫瘤體積影響
測試例7：Biacore檢測PD-1/TGF-β trap融合蛋白的體外結合和動力學實驗
藉由Biacore T200(GE)測定待測分子與人TGF-β1或人PD-1蛋白的親和力，實驗過程描述如下：
用Protein A生物傳感芯片親和捕獲PD-1/TGF-β trap，然後於芯片表面流經高濃度的抗原1(人PD1(Sino Biological，Cat.#10377-H08H)或人TGF-β1(Acro，Cat.1G1-H4212 #))120s，將抗體上針對抗原1的位點飽和，再上樣抗原2(人TGF-β1或者人PD1)，用Biacore
T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用甘胺酸-鹽酸(pH 1.5，GE)將生物傳感芯片洗淨再生。實驗中用到的緩衝溶液為HBS-EP緩衝液(GE)。實驗得到的數據用BIAevaluation 4.1版軟體(GE)以(1：1)Langmuir模型進行擬合，得出如表15所示的親和力數值。
表15：融合蛋白與TGF-β1或人PD-1的體外親和力
結果表明，本披露的融合蛋白1，2，3和4均對人TGF-β1以及人PD-1具極高的親和力。
測試例8：PD-1/TGF-β trap的體外細胞結合實驗
待檢測融合蛋白或抗體：
(1)融合蛋白3或融合蛋白4。
(2)陰性對照C25：HIV抗體(參見專利US6114143製備)
C25抗體輕鏈的胺基酸序列：
SEQ ID NO：75；
C25抗體重鏈的胺基酸序列
SEQ ID NO：76；
實驗過程：
將穩定轉染有PD-1的CHO-S細胞以300g的轉速離心5分鐘，丟掉上清，沉澱用預冷封閉緩衝液1% BSA(Beyotime，ST023)重新懸浮，密度為1.0×106細胞/毫升。於4℃孵育30分鐘後，重新懸浮以每孔100μL加入到96孔板。96孔板在300g的轉速下離心5分鐘後，棄上清。
向每個孔加入100μL一抗(融合蛋白或陰性對照C25)，將細胞重新懸浮，室溫孵育30分鐘。離心棄上清，加入50μL1l：200稀釋的PE標記二抗(Life Technologies，H10104)。將細胞重新懸浮，室溫避光孵育30分鐘。用流式緩衝液1% BSA(Beyotime，ST023)洗兩次細胞，並用1%的多聚甲醛重新懸浮細胞進行固定，進行流式檢測，結果見表16和圖6。
表16：融合蛋白與穩定轉染有PD-1的CHO-S細胞的體外親和力
結果顯示，融合蛋白3，融合蛋白4能夠劑量依賴地結合穩定轉染有PD-1的CHO-S細胞(圖6)。
測試例9：體外檢測PD-1/PD-L1通路阻斷實驗
1、測試目的：
為了研究PD-1/TGF-β trap對PD-1/PD-L1信號通路的阻斷作用，採用來自Promega公司構建的分別帶有人源PD-1和PD-L1受體分子的細胞，進行基於細胞水平上的抗體阻斷實驗。
2、測試樣品：
①抗PD-1抗體：Hu23-11，Hu33-5；
②融合蛋白3，融合蛋白4；
③陰性對照C25；
3、測試過程
取CHO/PD-L1細胞(CS187108，Promega)，消化並用F-12 Nutrient Mixture(Gibco，22400-089)完全培養基重新懸浮細胞，根據細胞計數結果使用完全培養基調整細胞密度至4×105/mL，將細胞懸液轉移至加樣槽中，使用多道移液器以100μL/孔加入到96孔板中，放置於37℃，5%CO2培養箱培養20至24h；第二天製備Jurkat/PD-1(CS187102，Promega)細胞懸液，根據細胞計數結果使用分析培養基重新懸浮細胞，並調整細胞密度至1.25×106/mL；將加入CHO/PD-L1細胞的細胞培養板從培養箱中取出，使用多道移液器每孔取出95μL培養液，按照410μL/孔加入梯度稀釋的融合蛋白，以及PD-1抗體，然後將Jurkat/PD-1細胞懸液轉移至加樣槽中，以490μL/孔加入到細胞培養板中，置於37℃，5%CO2培養箱培養5至6h。在蛋白孵育期間，將Bio-GloTM試劑(Promega，G7940)取出使其溫度恢復至室溫。取出細胞培養板，置於室溫放置5至10min，然後每孔加入450μL Bio-GloTM試劑，置於安全櫃中孵育5至10min，使用多功能酶標儀讀取化學發光信號值。
4、結果
如表17所示，本披露的融合蛋白3，融合蛋白4均能夠有效地阻斷表達有PD-1分子的Jurkat細胞同CHO/PD-L1細胞結合。
表17：融合蛋白對PD-1/PD-L1通路的阻斷能力
測試例10：SMAD3報告基因抑制實驗
1、測試目的
該實驗藉由HepG2細胞表達帶螢光素酶報告基因的Smad3結合原件(SBE)來研究PD-1/TGF-β trap對TGF-β1誘導Smad3活化的抑制作用，根據IC50大小評價PD-1/TGF-β trap的體外活性。
2、測試樣品：融合蛋白3、融合蛋白4、陰性對照(C25)。
3、測試過程
HepG2細胞(ATCC，HB-8065TM)使用含有10% FBS的MEM完全培養基(GE，SH30243.01)培養，每3天繼代一次。實驗第一天以每孔25,000個細胞的密度接種於96孔板(Corning，3903)，在37℃，5% CO2條件下培養24小時。第二天，棄去細胞培養板中的培養基，每孔轉染100ng 3TP-Lux質粒(普如汀生物技術(北京)有限公司，貨號11767)。細胞在37℃，5% CO2條件下繼續培養24小時。加入待測樣品前6小時，棄去96孔板中完全培養基，每孔加入80μL不完全培養基(MEM+0.5%FBS)。
6小時後再加入10μL使用不完全培養基配製的人TGF-β1(R&D，240-B-010)溶液，終濃度為2ng/mL和10μL待測樣品，待測樣品的終濃度為500、50、5、0.5、0.05、0.005、0.0005、0.00005、0.000005和0nM，以人TGF-β1溶劑為對照，細胞在37℃，5% CO2條件下繼續培養18h。然後每孔加入100μL配製好的螢光素酶受質ONE-GloTM Luciferase Assay system(promega，E6110)，室溫避光放置10分鐘，然後使用Victor3多功能酶標儀(Perkin Elmer)讀取發光信號值。待測樣品的IC50值使用數據處理軟體Graphpad Prism5.0計算得到，實驗結果表18，將不加TGF-β1的孔作為抑制100%，計算獲得Emax值。
結果顯示融合蛋白3，融合蛋白4可明顯抑制TGF β誘導的pSMAD3報告物活性。
表18：融合蛋白對SMAD報告基因通路的抑制能力
測試例11：體外檢測結核桿菌素(TB)刺激PBMC釋放IFNγ實驗
1、測試目的
為了研究PD-1/TGF-β trap對T淋巴細胞的激活作用，收集和純化入外週血單核細胞(PBMC)，採用結核桿菌素(TB)體外刺激5天，檢測IFNγ細胞因子的分泌水平。
2、測試樣品：①C25；②PD-1抗體；③融合蛋白3；④融合蛋白4。
3、測試過程
新鮮分離純化的PBMC，15mL約3×107個，加入20μL結核菌素，37℃，5% CO2培養箱培養5天。第6天，收集上述培養的細胞離心，用PBS洗一次，重新懸浮至新鮮的培養基中，調整密度為1×106個每毫升，接種至96孔細胞培養板，每孔90μL。將不同濃度的抗體分別加入上述96孔細胞培養板的對應孔中，每孔10μL，對照組和空白組分別加入10μL PBS。細胞培養板置於37℃，5% CO2培養箱孵育3天。取出細胞培養板，離心(4000rpm，10min)每孔取上清，10倍稀釋後，採用ELISA的方法(人IFN-γ檢測試劑盒，欣博盛，EHC102g.96)檢測IFN-γ的水平。具體操作參考試劑說明書。結果如表19所示。
表19. PD-1/TGF-β trap對T淋巴細胞分泌IFN-γ的影響
4、結果
如表19所示，融合蛋白3，融合蛋白4能夠劑量依賴地增強激活的T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ，並且具有比抗PD-1抗體更強的激活作用。
測試例12：PD-1/PD-L1，PD-1/PD-L2阻斷實驗
將PD-1-IgG1Fc用PBS稀釋至0.5μg/mL，以100μL/孔加於96孔板中，於4℃孵育過夜。將96孔板中PBS棄去，用PBST(pH7.4PBS含0.05% tween20)洗板3次後，加入100μL/孔PBS/3%BSA，室溫孵育1h進行封閉。棄去封閉液，用PBST洗板3次後，加入100μL用PBS/3%BSA稀釋至合適濃度的融合蛋白或對照，4℃預孵育1h。以100μL/孔加入1μg/mL生物素標記PD-L1或PD-L2(北京義翹神州生物技術有限公司)，37℃孵育1h。用PBST洗板6次後，以100μL/孔加入用PBS/3%BSA 1：3000稀釋的鏈黴親和素-過氧化物酶聚合物(Jackson，016-030-084)，室溫孵育1h。用PBST洗板6次後，加入100μL/孔TMB顯色。加入100μL/孔IM H2SO4終止反應。用酶標儀在450nm處讀取吸收值。結果見下表。
表20：PD-L1/PD-L2阻斷實驗結果
測試例13：融合蛋白體內藥效試驗
人PD1轉基因C57BL/6J小鼠，購自百奧賽圖有限責任公司。於實驗室環境適應性飼養7天，給予12/12小時光/暗週期調節，溫度23±1℃，濕度40至50%，動物均給予標準滅菌鼠飼料，自由進食飲水。
人PD1轉基因C57BL/6J在右肋部皮下接種MC38細胞(1×105個/隻，購自南京銀河)，8天後分4組，10隻/組，每組平均腫瘤體積為59.08mm3。
腹腔注射等莫耳量的C25(2.48mpk)，Hu23-11(0.83mpk)和融合蛋白3(3mpk和1mpk)，共給藥4次，於腫瘤接種後7天，9天，11天和14天給藥。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。使用Excel 2003統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100%
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
本次實驗腹腔注射給藥四次，觀察至第26天，採用第19天數據進行統計，結果見下表和圖7。
表21：給藥抗體對荷瘤裸鼠MC38-H11移植瘤的療效
結果顯示，抗PD-1抗體Hu23-11和融合蛋白3均能有效抑制MC38移植瘤的增長，其中等莫耳給藥時，Hu23-11(0.83mpk)的抑瘤率為68.25%，融合蛋白3(1mpk)的抑瘤率達到86.78%；增大給藥劑量後，融合蛋白3(3mpk)的抑瘤率高達89.52%。給藥過程中各組動物包括對照組體重均無明顯下降，說明受試抗體和融合蛋白無明顯毒副作用。
雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本披露的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地併入。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD)
上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD)
<120> 含有TGF-β受體的融合蛋白及其醫藥用途
<130> 702104CPCT
<150> 201911098550.0
<151> 2019-11-12
<160> 76
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 肽
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<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<212> PRT
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<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
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<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> M33 HCDR1
<400> 14
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> M33 HCDR2
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> M33 HCDR3
<400> 16
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> M33 LCDR1
<400> 17
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> M33 LCDR2
<400> 18
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> M33 LCDR3
<400> 19
<210> 20
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VH-CDR移植(grafted)
<400> 20
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL-CDR移植(grafted)
<400> 21
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL2
<400> 22
<210> 23
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VH2
<400> 23
<210> 24
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VH3
<400> 24
<210> 25
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VH4
<400> 25
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu33VH-CDR移植(grafted)
<400> 26
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu33VL-CDR移植(grafted)
<400> 27
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu33VL2
<400> 28
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu33VL3
<400> 29
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu33VH2
<400> 30
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu33VH3
<400> 31
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23LCDR1(N28Q)
<400> 32
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23LCDR1(N28L)
<400> 33
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23LCDR1(N28T)
<400> 34
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23LCDR1(N28D)
<400> 35
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23LCDR1(G29A)
<400> 36
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23LCDR1(G29V)
<400> 37
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL1(N28Q)
<400> 38
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL1(N28L)
<400> 39
<210> 40
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL1(N28T)
<400> 40
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL1(N28D)
<400> 41
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL1(G29A)
<400> 42
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL1(G29V)
<400> 43
<210> 44
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL2(N28Q)
<400> 44
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL2(N28L)
<400> 45
<210> 46
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL2(N28T)
<400> 46
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL2(N28D)
<400> 47
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL2(G29A)
<400> 48
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hu23VL2(G29V)
<400> 49
<210> 50
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> IgG4-AA重鏈恆定區變體
<400> 50
<210> 51
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> IgG4-AA重鏈恆定區
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Kappa鏈恆定區序列
<400> 52
<210> 53
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu23-11(A)抗體重鏈
<400> 53
<210> 54
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu23-11抗體重鏈
<400> 54
<210> 55
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu23-11(A)/Hu23-11抗體輕鏈
<400> 55
<210> 56
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu33-5(A)抗體重鏈
<400> 56
<210> 57
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu33-5抗體重鏈
<400> 57
<210> 58
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu33-5(A)/Hu33-5抗體輕鏈
<400> 58
<210> 59
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu33-6(A)抗體重鏈
<400> 59
<210> 60
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> Hu33-6抗體重鏈
<400> 60
<210> 61
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> TGF-βRII胞外結構域序列
<400> 61
<210> 62
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> TGF-β RII ECD(20-136)
<400> 62
<210> 63
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> TGF-β RII ECD(22-136)
<400> 63
<210> 64
<211> 122
<212> 結構域
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> TGF-β RII ECD(15-136)
<400> 64
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 連接序列
<400> 65
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 連接序列
<400> 66
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 連接序列
<400> 67
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 連接序列
<400> 68
<210> 69
<211> 609
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 融合蛋白1的第一鏈
<400> 69
<210> 70
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 融合蛋白2的第一鏈
<400> 70
<210> 71
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 融合蛋白3的第一鏈
<400> 71
<210> 72
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 融合蛋白4的第一鏈
<400> 72
<210> 73
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 融合蛋白5的第一鏈
<400> 73
<210> 74
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 融合蛋白6的第一鏈
<400> 74
<210> 75
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> C25抗體輕鏈
<400> 75
<210> 76
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> C25抗體重鏈
<400> 76
Claims (22)
- 一種融合蛋白，其包含靶向部分和TGF-β受體部分，其中，該TGF-β受體部分為TGF-βRII胞外區，該靶向部分為抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項1所述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區為TGF-βRII胞外區的N端截短形式。
- 如請求項2所述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區的N端截短形式為在TGF-βRII胞外區的N端缺失1至26個連續的胺基酸，較佳N端缺失14至26個胺基酸，更佳缺失14至21個胺基酸，最佳缺失14、19或21個胺基酸。
- 如請求項1至3中任一項所述融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區的序列如SEQ ID NO：61所示。
- 如請求項2或3所述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區的N端截短形式的序列如SEQ ID NO：62、63或64所示。
- 如請求項1至5中任一項所述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中a)該重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含序列如SEQ ID NO：11、32、33、34、35、36或37所示的LCDR1，和序列分別如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR2和LCDR3；或b)該重鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含序列分別如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；較佳地，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1至5中任一項所述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區：c)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：4所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：5所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或d)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：6所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：7所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1至7中任一項中所述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項8所述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體為人源化抗體，該人源化抗體包含來源自人抗體的框架區或其框架區變體，該框架區變體為在人抗體的輕鏈框架區和/或重鏈框架區上分別具有至多6個胺基酸的回復突變；較佳地，該回復突變選自：e)輕鏈框架區中的2G胺基酸回復突變，和/或重鏈框架區中的胺基酸回復突變，其選自：27Y、48I、67T、69L、82F和93T中的一個或更多個；或f)輕鏈框架區中的胺基酸回復突變，選自：42G、44V和71Y中的一個或更多個，和/或重鏈框架區中的胺基酸回復突變，其選自：1K和/或94S。
- 如請求項8所述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含選自如下g)至k)中任一項所示的重鏈可變區和輕鏈可變區：g)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：4所示或與SEQ ID NO：4具有至少90%序列同一性；和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：5所示或與SEQ ID NO：5具有至少90%序列同一性；h)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：6所示或與SEQ ID NO：6具有至少90%序列同一性；和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：7所示或與SEQ ID NO：7具有至少90%的序列同一性；j)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：20、23、24或25所示或分別與SEQ ID NO：20、23、24或25具有至少90%序列同一性，和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：21、22、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49所示或分別與SEQ ID NO：21、22、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49具有至少90%序列同一性；和k)重鏈可變區序列如SEQ ID NO：26、30或31所示或分別與SEQ ID NO：26、30或31具有至少90%序列同一性，和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：27、28或29所示或分別與SEQ ID NO：27、28或29具有至少90%序列同一性；較佳地，所述的抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區序列如SEQ ID NO：20所示和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：40所示；或重鏈可變區序列如SEQ ID NO：30所示和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：28所示；或重鏈可變區序列如SEQ ID NO：31所示和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：28所示。
- 如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段進一步包含抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區；該重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體，該輕鏈恆定區選自人抗體κ或λ鏈恆定區及其常規變體；較佳地，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO：50或51所示的重鏈恆定區和/或序列如SEQ ID NO：52所示的輕鏈恆定區。
- 如請求項1至11中任一項所述的融合蛋白，其中該抗PD-1抗體包含選自以下1)-n)中任一項所示的重鏈和輕鏈：1)重鏈序列如SEQ ID NO：53或54所示或與SEQ ID NO：53或54具有至少85%的序列同一性；和輕鏈序列如SEQ ID NO：55所示或與SEQ ID NO：55具有至少85%的序列同一性；m)重鏈序列如SEQ ID NO：56或57所示或與SEQ ID NO：56或57具有至少85%的序列同一性；和輕鏈序列如SEQ ID NO：58所示或與SEQ ID NO：58具有至少85%的序列同一性；和n)重鏈序列如SEQ ID NO：59或60所示或與SEQ ID NO：59或60具有至少85%的序列同一性；和輕鏈序列如SEQ ID NO：58所示或與SEQ ID NO：58具有至少85%的序列同一性。
- 如請求項1至11中任一項所述的所述的融合蛋白，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙抗體和dsFv。
- 如請求項1至13中任一項所述的融合蛋白，其中該TGF-βRII胞外區藉由接頭融合至該抗PD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈的羧基端、重鏈的胺基端、輕鏈的羧基端或輕鏈的胺基端；較佳融合至重鏈的羧基端。
- 如請求項14所述的融合蛋白，其中該接頭為(ASTKGP)n、(ASTKGPSVFPLAP)n、(TVAAP)n、(TVAAPSVFIFPP)n或(G4S)nG，其中n為1-6的整數，較佳為4或5。
- 如請求項1至15中任一項所述的融合蛋白，其包含：- 第一鏈，其包含與抗PD-1抗體的重鏈融合的TGF-βRII胞外區；和- 第二鏈，其包含抗PD-1抗體的輕鏈；其中：o)該第一鏈的序列如SEQ ID NO：69或71所示或與SEQ ID NO：69或71所示的胺基酸序列具有至少85%的同一性，和第二鏈的序列如SEQ ID NO：55所示或與SEQ ID NO：55所示胺基酸序列具有至少85%的同一性；或p)該第一鏈的序列如SEQ ID NO：70、72、73或74所示或與SEQ ID NO：70、72、73或74所示的胺基酸序列具有至少85%的同一性，和第二鏈的序列如SEQ ID NO：58所示或與SEQ ID NO：58所示胺基酸序列具有至少85%的同一性。
- 一種醫藥組成物，其含有：- 預防有效量或治療有效量的如請求項1至16中任一項所述的融合蛋白，以及- 一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種核酸分子，其編碼如請求項1至16中任一項所述的融合蛋白。
- 一種表達載體，其含有如請求項18所述的核酸分子。
- 一種宿主細胞，其含有如請求項19所述的表達載體，其中該宿主細胞選自細菌、酵母菌和哺乳動物細胞；較佳哺乳動物細胞。
- 一種治療或預防腫瘤的方法，該方法包括：向所需患者施用預防有效量或治療有效量的如請求項1至16中任一項所述的融合蛋白，或如請求項17所述的醫藥組成物，或如請求項18所述的核酸分子；較佳地，該腫瘤為PD-1相關的癌症。
- 如請求項21所述的方法，其中該腫瘤選自：頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性和梅克爾細胞癌；較佳地，該淋巴瘤選自：何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴 瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤；該肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌；該白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病；最佳的，該腫瘤選自：黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、腸癌、食管癌、肝癌和結腸癌。
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