JP2016528295A - Ｔｇｆ−ベータ受容体ｉｉ型変異体およびその使用 - Google Patents

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Abstract

ある特定の態様では、本開示は、ＴβＲＩＩリガンドを選択的にアンタゴナイズするために有用なＴβＲＩＩポリペプチドの細胞外ドメインのトランケートされたリガンド結合性部分を含むポリペプチドに関する。本開示は、ＴＧＦβ関連障害を処置または予防する際の使用のための組成物および方法をさらに提供する。一部には、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチド、およびＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に対する選択的アンタゴニストとしての、かかるＴβＲＩＩポリペプチドの使用を提供する。

Description

本出願は、２０１３年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／８６８，７１３号；２０１３年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／９０６，２７０号；および２０１３年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／９０６，８４９号の優先権を主張する。基礎出願の開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーは、増殖、分化、アポトーシス、運動性、細胞外マトリックス産生、組織リモデリング、血管新生、免疫応答、細胞接着などの重要な細胞機能に関与する多面的なサイトカインであり、慢性炎症性状態とがんほど異なる疾患状態の病態生理においても、重要な役割を果たす。ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーは、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、骨原性タンパク質（ＯＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、インヒビン／アクチビン、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）ならびにグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む主要なファミリーグルーピングに分類されてきた。
ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、特異的なＩ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体の形成を誘導することによって、原形質膜を横切ってそれらのシグナルを伝達し、これが次に、ＳＭＡＤタンパク質の特定のサブセット（一部は阻害性および一部は興奮性）を活性化する。これらのＳＭＡＤ分子化合物は、核中にシグナルを中継し、核において、それらは、他のタンパク質と呼応して、転写応答を指向する。
機能障害性ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達は、がん、線維症、骨疾患、糖尿病性腎症、ならびにアテローム動脈硬化症などの慢性血管疾患を含む、いくつかの臨床障害と関連付けられてきた。
したがって、本開示の目的は、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達をモジュレートするための組成物および方法を提供することである。
一部には、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチド、およびＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に対する選択的アンタゴニストとしての、かかるＴβＲＩＩポリペプチドの使用を提供する。本明細書に記載するように、さらなる変異ありまたはなしのＴβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の一部または全てを含むポリペプチドは、変動する親和性で、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３と結合するおよび／またはＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３を阻害する。したがって、ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連障害を選択的に阻害する際の使用のためのＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン中に変異および／またはトランケーションを含むポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列と異種アミノ酸配列とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドであって、この第１のアミノ酸配列が、ａ）配列番号５の２３位〜３５位のいずれかにおいて始まり配列番号５の１５３位〜１５９位のいずれかにおいて終わる配列、もしくはｂ）配列番号６の２３位〜６０位のいずれかにおいて始まり配列番号６の１７８位〜１８４位のいずれかにおいて終わる配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なもしくは同一なアミノ酸配列を含む、またはかかるアミノ酸配列からなるＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインの少なくとも一部分に融合した、ＴβＲＩＩの野生型または変更されたおよび／もしくはトランケートされた細胞外ドメインを含むポリペプチドを提供する。したがって、ある特定の態様では、本開示は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列と異種アミノ酸配列とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドであって、この第１のアミノ酸配列が、ａ）配列番号５の２３位〜３５位のいずれかにおいて始まり配列番号５の１５３位〜１５９位のいずれかにおいて終わる配列、もしくはｂ）配列番号６の２３位〜６０位のいずれかにおいて始まり配列番号６の１７８位〜１８４位のいずれかにおいて終わる配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なもしくは同一なアミノ酸配列を含む、またはかかるアミノ酸配列からなり、このポリペプチドが、ヒトＩｇＧ２の少なくとも定常ドメインを含み、任意選択で、配列番号１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るまたはかかるアミノ酸配列からなり得る第２のポリペプチド配列を含み、リンカーが、任意選択で、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間に位置付けられるＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。この一例は、配列番号５０として提供され、配列番号５１の核酸配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号５１の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むまたはかかる核酸配列からなる核酸配列によってコードされるポリペプチドを提供する。
一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号５の２３位において始まり配列番号５の１５９位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号５の２９位において始まり配列番号５の１５９位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号５の３５位において始まり配列番号５の１５９位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号５の２３位において始まり配列番号５の１５３位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号５の２９位において始まり配列番号５の１５３位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号５の３５位において始まり配列番号５の１５３位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。
一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号６の２３位において始まり配列番号６の１８４位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号６の２９位において始まり配列番号６の１８４位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号６の２３位において始まり配列番号６の１７８位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号６の２９位において始まり配列番号６の１７８位において終わる配列を含むまたはかかる配列からなる。
一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号４７の３６位に対応する位置におけるＤおよび／もしくは配列番号４７の７６位に対応する位置におけるＫを有する配列を含むまたはかかる配列からなる。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号７もしくは配列番号１３の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なまたは同一な第１のアミノ酸配列またはその活性断片と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドであって、この第１のアミノ酸配列が、配列番号４７の３６位に対応する位置におけるＤおよび／または配列番号４７の７６位に対応する位置におけるＫを有するＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。
一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸１〜１２に対応する１〜１２アミノ酸または配列番号１３のアミノ酸１〜３７に対応する１〜３７アミノ酸のＮ末端トランケーションを含む。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号７または配列番号１３のアミノ酸１〜６に対応する６アミノ酸のＮ末端トランケーションを含む。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸１〜１２に対応する１２アミノ酸または配列番号１３のアミノ酸１〜３７に対応する３７アミノ酸のＮ末端トランケーションを含む。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸１３７〜１３２または配列番号１３のアミノ酸１６２〜１５７に対応する１〜６アミノ酸のＣ末端トランケーションを含む。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸１３２〜１３７または配列番号１３のアミノ酸１５７〜１６２に対応する６アミノ酸のＣ末端トランケーションを含む。一部の実施形態では、この第１のアミノ酸配列は、配列番号４７の１１７位と１１８位に対応する残基の間に、配列番号１８に対応する挿入を含む。
一部の実施形態では、この異種部分は、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうちの１または複数を増強する１または複数のポリペプチド部分を含む。一部の実施形態では、この異種部分は、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンから選択されるポリペプチド部分を含む。さらなる実施形態では、この免疫グロブリンＦｃドメインは、リンカーによってこのＴβＲＩＩポリペプチドに接続されている。
一部の実施形態では、このポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１または複数の修飾されたアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドはグリコシル化されている。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、リーダー配列が除去された、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列もしくはその部分を含むまたはかかるアミノ酸配列もしくはその部分からなるポリペプチド、例えば、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、リーダー配列が除去された、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列もしくはその部分を含むまたはかかるアミノ酸配列もしくはその部分からなるポリペプチド、例えば、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、リーダー配列が除去された、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列もしくはその部分を含むまたはかかるアミノ酸配列もしくはその部分からなるポリペプチド、例えば、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、リーダー配列が除去された、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列もしくはその部分を含むまたはかかるアミノ酸配列もしくはその部分からなるポリペプチド、例えば、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、リーダー配列が除去された、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列もしくはその部分を含むまたはかかるアミノ酸配列もしくはその部分からなるポリペプチド、例えば、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、リーダー配列が除去された、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３から選択されるアミノ酸配列もしくはその部分を含むまたはかかるアミノ酸配列もしくはその部分からなるポリペプチド、例えば、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４から選択されるヌクレオチド配列の相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。
上述の各々において、全長ＴβＲＩＩ ＥＣＤを含まないＴβＲＩＩポリペプチドが、選択され得る。ＴβＲＩＩポリペプチドは、モノマータンパク質として、またはダイマー化形態で、使用され得る。ＴβＲＩＩポリペプチドはまた、改善された特性、例えば、増加した半減期、または産生もしくは精製のより高い容易さを提供するために、第２のポリペプチド部分に融合され得る。融合は、直接的であり得るか、またはリンカーが、ＴβＲＩＩポリペプチドと任意の他の部分との間に挿入され得る。リンカーは、構造化されていても構造化されていなくてもよく、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０またはそれ超のアミノ酸からなり得、任意選択で二次構造を比較的含まなくてもよい。
一部の実施形態では、本開示のＴβＲＩＩポリペプチドは、１×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＧＤＦ１５に結合する。
一部の実施形態では、本開示のＴβＲＩＩポリペプチドは、ＣＨＯ細胞におけるこのポリペプチドの発現に特徴的なグリコシル化パターンを有する。
一部の実施形態では、本開示は、本開示の２つのＴβＲＩＩポリペプチドを含むホモダイマーを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本開示のＴβＲＩＩポリペプチドのコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、この単離されたポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本開示の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。一部の実施形態では、この細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、この細胞は、ＣＨＯ細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、この細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞である。
ある特定の態様では、本開示は、本開示のＴβＲＩＩポリペプチドまたはホモダイマーと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬調製物を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに対する細胞の応答をモジュレートする方法であって、この細胞を本開示のＴβＲＩＩポリペプチドまたはホモダイマーに曝露するステップを含む方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者において、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと関連する疾患または状態を処置する方法であって、有効量の本開示のＴβＲＩＩポリペプチドまたはホモダイマーをこの患者に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、このＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３またはＧＤＦ１５である。
一部の実施形態では、この疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、このがんは、胃がん、腸管がん、皮膚がん、乳房がん、黒色腫、骨がんおよび甲状腺がんから選択される。
一部の実施形態では、この疾患または状態は、線維性または硬化性の疾患または障害である。一部の実施形態では、この線維性または硬化性の疾患または障害は、強皮症、アテローム動脈硬化症、肝臓線維症、びまん性全身性硬化症、糸球体腎炎、神経瘢痕、皮膚瘢痕、放射線誘発線維症、肝線維症および骨髄線維症から選択される。
一部の実施形態では、この疾患または状態は心臓疾患である。
一部の実施形態では、この疾患または状態は、遺伝性出血性末梢血管拡張症（ＨＨＴ）、マルファン症候群、ロイス・ディーツ症候群、家族性胸部大動脈瘤症候群、動脈蛇行症候群（ａｒｔｅｒｉａｌ ｔｏｒｔｕｏｓｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、子癇前症、アテローム動脈硬化症、再狭窄および肥大型心筋症／うっ血性心不全から選択される。
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１５と結合し、ＧＤＦ１５とＴβＲＩＩとの相互作用を遮断する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＴβＲＩＩに結合するその断片を提供し、このＧＤＦ１５ポリペプチドは、タンパク質夾雑物に関して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％純粋である。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５ポリペプチドまたは本開示のＴβＲＩＩポリペプチドと結合するその断片を提供し、このＧＤＦ１５ポリペプチドは、タンパク質夾雑物に関して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％純粋である。
一部の実施形態では、このＧＤＦ１５ポリペプチドは、１０−８Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＴβＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、このＧＤＦ１５ポリペプチドは、１０−８Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で本開示のＴβＲＩＩポリペプチドと結合する。
一部の実施形態では、このＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞における発現によって産生される。
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１５を含む試料を本開示のＴβＲＩＩポリペプチドと接触させるステップを含む、ＧＤＦ１５を濃縮または精製する方法を提供する。
図１は、ヒトＧＤＦ１５のネイティブ前駆体のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００４８５５．２）を示す図である。実線の下線は、配列決定によってＮ末端を決定した、成熟ＧＤＦ１５（残基１９７〜３０８）を示す。点線の下線は、リーダー（残基１〜２９）を示す。
図２は、ヒトＧＤＦ１５のネイティブ前駆体をコードするヌクレオチド配列を示す図である。実線の下線は、成熟ＧＤＦ１５をコードする配列（ヌクレオチド５８９〜９２４）を示し、点線の下線は、リーダーをコードする配列（ヌクレオチド１〜８７）を示す。ＮＭ＿００４８６４．２におけるＳｆｏＩ部位を破壊するために使用したサイレント変異（Ｇ４５６Ａ）には、二重下線を付す。
図３は、マウスＧＤＦ１５のネイティブ前駆体のアミノ酸配列（ＮＰ＿０３５９４９．２）を示す図である。実線の下線は、配列決定によってＮ末端を決定した、成熟ＧＤＦ１５（残基１９２〜３０３）を示す。点線の下線は、リーダー（残基１〜３０）を示す。
図４は、マウスＧＤＦ１５のネイティブ前駆体をコードするヌクレオチド配列（ＮＭ＿０１１８１９．２から誘導した）を示す図である。実線の下線は、成熟ＧＤＦ１５をコードする配列（ヌクレオチド５７４〜９０９）を示し、点線の下線は、リーダーをコードする配列（ヌクレオチド１〜９０）を示す。
図５は、ヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ型（ｈＴβＲＩＩ）のＢ（短）アイソフォームのネイティブ前駆体のアミノ酸配列（ＮＰ＿００３２３３．４）を示す図である。実線の下線は、成熟細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基２３〜１５９）を示し、二重下線は、Ａ（長）アイソフォームにおいて置き換えられるバリンを示す。点線の下線は、リーダー（残基１〜２２）を示す。
図６は、ヒトＴβＲＩＩのＡ（長）アイソフォームのネイティブ前駆体のアミノ酸配列（ＮＰ＿００１０２００１８．１）を示す図である。実線の下線は、成熟ＥＣＤ（残基２３〜１８４）を示し、二重下線は、スプライス生成されたイソロイシン置換を示す。点線の下線は、リーダー（残基１〜２２）を示す。
図７は、ｈＴβＲＩＩ短トランケーションおよびそれらのｈＴβＲＩＩ長対応物のＮ末端アラインメントを示す図である。ｈＴβＲＩＩ長トランケーション中に存在する２５アミノ酸の挿入に下線を付す。スプライシングプロセスによって、短アイソフォーム中の挿入部位に隣接するバリンが、長アイソフォームではイソロイシンによって置き換えられることに留意のこと。四角で囲んだ配列はリーダーを示す。 図７は、ｈＴβＲＩＩ短トランケーションおよびそれらのｈＴβＲＩＩ長対応物のＮ末端アラインメントを示す図である。ｈＴβＲＩＩ長トランケーション中に存在する２５アミノ酸の挿入に下線を付す。スプライシングプロセスによって、短アイソフォーム中の挿入部位に隣接するバリンが、長アイソフォームではイソロイシンによって置き換えられることに留意のこと。四角で囲んだ配列はリーダーを示す。
１．概説
本明細書に記載されるタンパク質は、特記しない限り、ヒト形態である。これらのタンパク質に対するＮＣＢＩ参照は、以下の通りである：ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＡ（ｈＴβＲＩＩ長）、ＮＰ＿００１０２００１８．１；ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＢ（ｈＴβＲＩＩ短）、ＮＰ＿００３２３３．４；ヒトＧＤＦ１５、ＮＰ＿００４８５５．２；マウスＧＤＦ１５、ＮＰ＿０３５９４９．２。ヒトおよびマウス由来のネイティブＴβＲＩＩおよびＧＤＦ１５タンパク質の配列は、図１〜６に示される。
ＴＧＦβスーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および非脊椎動物の両方において多種多様な細胞型に対して生物学的効果を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、パターン形成および組織特異化において胚発生の間に重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心発生、造血発生、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を与え得る。ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性を操作することによって、生物において顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能な場合が多い。例えば、ピエモンテ（Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ）およびベルギアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｂｌｕｅ）のウシ品種は、筋肉量における顕著な増加を引き起こす、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子における機能喪失型変異を保有する。Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７年、１７巻（１号）：７１〜４頁。同様に、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子は、増加した筋肉量、および報告によれば、例外的な強さと関連する。Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４年、３５０巻：２６８２〜８頁。
ＴＧＦβシグナルは、リガンド刺激の際に下流のＳＭＡＤタンパク質をリン酸化および活性化する、Ｉ型（例えば、ＴβＲＩ）およびＩＩ型（例えば、ＴβＲＩＩ）セリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介される（Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １巻：１６９〜１７８頁）。これらのＩ型およびＩＩ型の受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／スレオニン特異性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に重要である；ＩＩ型受容体は、リガンドに結合するためおよびＩ型受容体の発現のために必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型の受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化を生じる。ＴＧＦβは、各々ｉｎ ｖｉｖｏで個別の機能を有する３つの哺乳動物アイソフォーム、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を有する。ＴβＲＩＩへのＴＧＦβの結合は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性化を開始する際の重要なステップであり、ＳＭＡＤ２のリン酸化、および活性化されたＳＭＡＤ２／ＳＭＡＤ４複合体の核への転位置をもたらして、遺伝子発現をモジュレートする。
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、ＴＧＦβファミリーのメンバーである。特徴的なシステインノットモチーフを含むＴＧＦβスーパーファミリー中の他のリガンドと同様、成熟ＧＤＦ１５は、成熟ダイマーＧＤＦ１５を生成するために正準ＲＸＸＲ部位においてフューリン様プロテアーゼによる切断によって除去されるより大きいプロドメイン（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２９巻：１７４頁、２０１１年；Ｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４７４巻：３４３頁、２０１１年）を有して合成される。ＧＤＦ１５は、このタンパク質について暗示されている異なる機能を反映して、文献中で、マクロファージ阻害サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）、胎盤骨形態形成タンパク質（ＰＬＡＢ）、胎盤トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＰＴＧＦβ）、前立腺由来因子（ＰＤＦ）および非ステロイド性抗炎症活性化遺伝子−１（ＮＡＧ−１）として記載されている。ＧＤＦ１５は、いくつかの生理的および病理的状態と関連付けられてきた。例えば、ＧＤＦ１５は、胎盤において高度に発現され、妊娠の維持に必要である。ＧＤＦ１５濃度はまた、前立腺、結腸直腸または膵臓のがん、ならびにグリオーマを有する患者の血清において、著しく増加される。ＧＤＦ１５が、任意の受容体と直接的に結合または相互作用することは、生化学的に示されていない。本開示は、ＴＧＦβ ＩＩ型受容体ＴβＲＩＩが、高い親和性でＧＤＦ１５と結合し、ＧＤＦ１５に対する機能的受容体であるという発見に、一部関する。ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、およびＴβＲＩＩのリガンド結合性部分を含む他のポリペプチドは、ＧＤＦ１５誘導性の遺伝子活性化を阻害することが、本明細書で実証される。ＧＤＦ１５シグナル伝達の強力な阻害は、ＴβＲＩＩがＧＤＦ１５に対する機能的ＩＩ型受容体であるという証拠を提供し、このシグナル伝達経路における治療的介入のための新たな道を開く。したがって、一部には、本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチドに対する生理学的な高親和性受容体を同定する。
驚くべきことに、可溶性ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１５に対する高度に特異的な高親和性の結合を有することが、本明細書で示される。ＴβＲＩＩは、ＴＧＦβに対する公知のＩＩ型受容体であり、高い親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３と結合する。ヒトＴβＲＩＩは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における選択的スプライシングによって生成される、少なくとも２つのアイソフォーム−Ａ（長）およびＢ（短）−として天然に生じる（図６および５ならびに配列番号６および５）。この長アイソフォームは、２５アミノ酸の挿入を有し、スプライシングプロセスによって、短アイソフォーム中の挿入部位に隣接するバリンが、長アイソフォームではイソロイシンによって置き換えられる。可溶性受容体外部ドメインは、リガンド−受容体相互作用を阻害するために、スカベンジャーまたはリガンドトラップとして機能し得る。ネイティブＴβＲＩＩ細胞外ドメイン（外部ドメイン）を取り込んでいる可溶性ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質などのリガンドトラップは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３および本明細書に開示される知見に基づいてＧＤＦ１５を含むＴβＲＩＩリガンドに対する凡インヒビターとして機能する。一部の治療設定では、このより広いスペクトルのリガンド結合およびシグナル阻害が有利であり得るが、他の設定では、より選択的な分子が優れている可能性がある。ＴβＲＩＩ外部ドメインポリペプチドなどのリガンドトラップが選択的なリガンド結合プロファイルを示すことは、高度に望ましい。本開示は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメインのトランケートされた部分および／または細胞外ドメイン内の変異を含むポリペプチドが、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３による細胞シグナル伝達に対して示差的な阻害効果を有するという、驚くべき発見に関する。一部には、本開示は、ネイティブＴβＲＩＩ細胞外ドメインのものとは別個の変動するリガンド結合プロファイルを示す、ＴβＲＩＩの細胞外ドメインにおける一連の変異および／またはトランケーションによって生成されるリガンドトラップを提供する。本明細書に開示されるバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、ネイティブ全長細胞外ドメインと比較して有利な特性を提供し、ｉｎ ｖｉｖｏで異なるＴβＲＩＩリガンドによって媒介される経路を選択的に阻害するために使用され得る。
したがって、ある特定の態様では、本開示は、種々のＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３関連障害を処置する際の使用のための、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３のアンタゴニストとしての、ＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。任意の特定の作用機構に束縛されることは望まないが、かかるポリペプチドは、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３と結合し、これらのリガンドが三元シグナル伝達複合体を形成する能力を阻害することによって作用すると予測される。
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、かつ各用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるそれらの通常の意味を有する。特定の用語は、本発明の組成物および方法ならびにそれらを如何にして作製および使用するかを記載することにおいて、実務者にさらなるガイダンスを提供するために、本明細書の以下または他の箇所において議論される。用語の任意の使用の範囲または意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかである。
２．ＴβＲＩＩポリペプチド
天然に存在するＴβＲＩＩタンパク質は、細胞の外側に位置付けられるタンパク質の一部分（細胞外部分）および細胞の内側に位置付けられるタンパク質の一部分（細胞内部分）を有する膜貫通タンパク質である。本開示の態様は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン内の変異および／または細胞外ドメインのトランケートされた部分を含むバリアントＴβＲＩＩポリペプチドを包含する。上記のように、ヒトＴβＲＩＩは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における選択的スプライシングによって生成される、少なくとも２つのアイソフォーム−Ａ（長）およびＢ（短）−として天然に生じる（図６および５ならびに配列番号６および５）。配列番号５の残基２３〜１５９に対応する配列番号７は、ＴβＲＩＩの短アイソフォームのネイティブ全長細胞外ドメインを示す。配列番号６の残基２３〜１８４に対応する配列番号１３は、ＴβＲＩＩの長アイソフォームのネイティブ全長細胞外ドメインを示す。特記しない限り、ＴβＲＩＩの短および長アイソフォームに基づくバリアントに関するアミノ酸位置の番号付けは、それぞれ、ネイティブ前駆体配列番号５および配列番号６中の対応する位置を指す。
ある特定の実施形態では、本開示は、バリアントＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。本開示のＴβＲＩＩポリペプチドは、例えばＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３であるがこれらに限定されないＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと結合し得、その機能を阻害し得る。ＴβＲＩＩポリペプチドには、そのＣ末端が配列番号５のアミノ酸１５３〜１５９のいずれかにおいて存在する、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドのトランケートされたＥＣＤドメインに対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列、および任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列からなるまたはかかるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ得る。ＴβＲＩＩポリペプチドには、そのＣ末端が配列番号６のアミノ酸１７８〜１８４のいずれかにおいて存在する、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドのトランケートされたＥＣＤドメインに対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列、および任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列からなるまたはかかるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ得る。任意選択で、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１６０〜５６７からなる配列由来または配列番号６のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列由来の、５つよりも多く連続するアミノ酸、あるいは１０、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくは２００よりも多く、またはそれ超連続するアミノ酸を含まない。プロセシングされていないＴβＲＩＩポリペプチドは、任意のシグナル配列、ならびにシグナル配列に対してＮ末端の任意の配列を含むかまたは排除するかのいずれかであり得る。本明細書で詳述するように、成熟（プロセシングされた）ＴβＲＩＩポリペプチドのＮ末端は、配列番号５のアミノ酸２３〜３５または配列番号６のアミノ酸２３〜６０のいずれかにおいて存在し得る。成熟ＴβＲＩＩポリペプチドの例には、配列番号５のアミノ酸２３〜１５９（配列番号７に示される）、配列番号５のアミノ酸２９〜１５９（配列番号９に示される）、配列番号５のアミノ酸３５〜１５９（配列番号１０に示される）、配列番号５のアミノ酸２３〜１５３（配列番号１１に示される）、配列番号５のアミノ酸２９〜１５３（配列番号４８に示される）、配列番号５のアミノ酸３５〜１５３（配列番号４７に示される）、配列番号６のアミノ酸２３〜１８４（配列番号１３に示される）、配列番号６のアミノ酸２９〜１８４（配列番号１５に示される）、配列番号６のアミノ酸６０〜１８４（配列番号１０に示される）、配列番号６のアミノ酸２３〜１７８（配列番号１６に示される）、配列番号６のアミノ酸２９〜１７８（配列番号４９に示される）および配列番号６のアミノ酸６０〜１７８（配列番号４７に示される）が含まれるがこれらに限定されない。同様に、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号３０のヌクレオチド７３〜４６５、配列番号３４のヌクレオチド７３〜４４７、配列番号３８のヌクレオチド７３〜４６５、配列番号３８のヌクレオチド９１〜４６５もしくは配列番号３８のヌクレオチド１０９〜４６５またはそれらのサイレントバリアント、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（一般に、かかる条件は、当該分野で公知であるが、例えば、６５℃で一晩の、５０％ｖ／ｖホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ｗ／ｖブロッキング剤、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび０．３％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、ならびに例えば、約６５℃で５×ＳＳＣ中での洗浄を含み得る）下でそれらの相補体にハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドを含み得る。ＴβＲＩＩの長アイソフォームに基づく対応するバリアントが、２５アミノ酸の挿入に対してＣ末端の隣接する位置における保存的Ｖａｌ−Ｉｌｅ置換と共に、この挿入をコードするヌクレオチド配列を含むことが、当業者によって理解される。これらのＴβＲＩＩポリペプチドは、しかるべく、短および長アイソフォームの両方、それらのバリアント（例えば、配列番号５のアミノ酸２３〜１５９または配列番号６のアミノ酸２３〜１８４に対応する配列中に、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５以下のアミノ酸置換を含むバリアントを含む）、それらの断片、ならびに上述のいずれかを含む融合タンパク質を含む、ＴβＲＩＩポリペプチドの単離された細胞外部分を含み得るが、各場合において、好ましくは、上述のＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかは、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３のうちの少なくとも１つに対する実質的な親和性を保持する。一般に、ＴβＲＩＩポリペプチドは、生物学的に適切な温度、ｐＨレベルおよびモル浸透圧濃度において、水性溶液中で可溶性であるように設計される。
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、変更されたリガンド結合プロファイルを付与する、細胞外ドメイン中の１または複数の変異を含む。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの対応する部分と比較して、アミノ酸配列中に、１、２、５またはそれ超の変更を含み得る。一部の実施形態では、この変異は、配列番号５の７０位に対応する位置において、置換、挿入または欠失を生じる。一部の実施形態では、この変異は、配列番号５の１１０位に対応する位置において、置換、挿入または欠失を生じる。例には、配列番号５のそれぞれ７０位および１１０位に対応する位置におけるＮからＤへの置換またはＤからＫへの置換が含まれるがこれらに限定されない。かかるバリアントＴβＲＩＩポリペプチドの例には、配列番号８、配列番号１４、配列番号１２および配列番号１７に示される配列が含まれるがこれらに限定されない。ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２６のヌクレオチド７３〜４８３、配列番号４２のヌクレオチド７３〜４６５もしくはそれらのサイレントバリアントまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれらの相補体にハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドまたはその部分を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＣ（Ｋｏｎｒａｄら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８巻：３１８頁、２００７年）に天然に生じるような、ヒトＴβＲＩＩ ＥＣＤのＣ末端の近傍に位置するグルタミン酸残基の対（配列番号５の１５１位および１５２位、または配列番号６の１７６位および１７７位）の間に、３６アミノ酸の挿入（配列番号１８）をさらに含む。
本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドが、ＴβＲＩＩリガンドを選択的にアンタゴナイズするように修飾され得ることをさらに実証している。本明細書に提示されるデータは、ＴβＲＩＩポリペプチドのより短いＮ末端およびＣ末端がトランケートされたバリアントを含むＦｃ融合タンパク質が、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３によって媒介される細胞シグナル伝達に対して示差的な阻害効果を示すことを示している。具体的には、配列番号５のアミノ酸２９または３５において始まり、それぞれ細胞外ドメインの６アミノ酸または１２アミノ酸のＮ末端トランケーションを保有する、Ｎ末端がトランケートされたバリアントは、ＴβＲＩＩの短アイソフォームの全長細胞外ドメインと比較して、ＧＤＦ１５を最も強力に、ＴＧＦβ３を最も弱く、ＴＧＦβ１を中間の程度まで、阻害することが見出された。配列番号５のアミノ酸１５３において終わり、細胞外ドメインの６アミノ酸のＣ末端トランケーションを保有する、Ｃ末端がトランケートされたバリアントは、リガンド結合に対して実質的な影響を有さず、したがって、全長バージョンと相互交換可能に使用され得る。配列番号５の７０位に対応する位置におけるＮからＤへの置換は、ＴＧＦβ３を強力に阻害し、ＧＤＦ１５に対して中間の影響を有し、ＴＧＦβ１に対する無視できる影響を有することが見出された。Ｎ７０残基は、潜在的なグリコシル化部位を示す。さらに、配列番号５の１１０位に対応する位置におけるＤからＫへの置換を含むＦｃ融合タンパク質は、ＴβＲＩＩの短アイソフォームの全長細胞外ドメインと比較して、ＧＤＦ１５を最も強力に、ＴＧＦβ１を最も弱く、ＴＧＦβ３を中間の程度まで、阻害することが見出された。１１０位周囲の領域は、公知のＴβＲＩＩリガンドＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に対する選択性とは関連付けられてこなかった。したがって、予想外に、例えばＮ７０ＤおよびＤ１１０Ｋ（残基の番号付けは、配列番号５の番号付けと対応する）であるがこれらに限定されないＥＣＤ中の変異を含み、ならびに／またはアミノ酸２９と３５との間で始まりおよび／もしくはアミノ酸１５３とアミノ酸１５９との間で終結するＴβＲＩＩポリペプチドは、全て、活性であり、異なるリガンドに対して広く異なる阻害潜在力を示すと予測される。臨床または実験設定に依存して、これらのトランケートされたバリアント形態のいずれかを使用することが望まれ得る。
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１５と結合し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に対する実質的な結合を示さない。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１と結合し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１５またはＴＧＦβ３に対する実質的な結合を示さない。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３と結合し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１５またはＴＧＦβ１に対する実質的な結合を示さない。結合は、溶液中で、またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどの表面プラズモン共鳴システム中で、精製されたタンパク質を使用して評価され得る。
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１５細胞シグナル伝達を阻害し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に対して、中間のまたは限定的な阻害効果を有する。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１細胞シグナル伝達を阻害し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１５またはＴＧＦβ３に対して、中間のまたは限定的な阻害効果を有する。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３細胞シグナル伝達を阻害し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１５またはＴＧＦβ１に対して、中間のまたは限定的な阻害効果を有する。細胞シグナル伝達に対する阻害効果は、当該分野で公知の方法によってアッセイされ得る。
総合すると、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号５のアミノ酸配列２３〜１５３、２３〜１５４、２３〜１５５、２３〜１５６、２３〜１５７または２３〜１５８、ならびに配列番号５のアミノ酸２４〜３５のいずれかにおいて始まるこれらの配列のバリアントを含み得る。同様に、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号６のアミノ酸配列２３〜１７８、２３〜１７９、２３〜１８０、２３〜１８１、２３〜１８２または２３〜１８３、ならびに配列番号６のアミノ酸２４〜６０のいずれかにおいて始まるこれらの配列のバリアントを含み得る。例示的なＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列２９〜１５９、３５〜１５９、２３〜１５３、２９〜１５３および３５〜１５３、または配列番号６のアミノ酸配列２９〜１８４、６０〜１８４、２３〜１７８、２９〜１７８および６０〜１７８を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号５または配列番号６の対応する部分に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するバリアントもまた、企図される。配列番号５のアミノ酸１６０〜５６７または配列番号６のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列を含まないＴβＲＩＩポリペプチドが、選択され得る。
上記のように、本開示は、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドに対して、特定した程度の配列同一性または類似性を共有するＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較を目的として、アラインされる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方において導入され得、非相同配列が、比較を目的として無視され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸残基が比較される。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められる場合、これらの分子は、その位置において同一である（本明細書で使用する場合、アミノ酸「同一性」は、アミノ酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。
２つの配列間の配列の比較ならびにパーセント同一性および類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ １、Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）。
一実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用して決定される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）。具体的な実施形態では、以下のパラメーターが、ＧＡＰプログラムにおいて使用される：Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重み（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５または６の長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定される（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２巻（１号）：３８７頁（１９８４年））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）。例示的なパラメーターには、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用することが含まれる。特記しない限り、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス、１０のギャップ重みおよび３の長さ重みを使用するＧＡＰプログラムを使用して決定され、かかるアルゴリズムが所望のパーセント同一性を計算できない場合、本明細書に開示される適切な代替法を選択すべきである。
別の実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれたＥ． ＭｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁（１９８９年））のアルゴリズムを使用して決定される。
２つのアミノ酸配列間の最良の全体的アラインメントを決定するための別の実施形態は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ．、６巻：２３７〜２４５頁（１９９０年））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントでは、クエリー配列および対象配列は、共にアミノ酸配列である。前記網羅的配列アラインメントの結果は、パーセント同一性を単位として示される。一実施形態では、アミノ酸配列同一性は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ．、６巻：２３７〜２４５頁（１９９０年））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して実施される。具体的な実施形態では、アミノ酸アラインメントのパーセント同一性および類似性を計算するために使用されるパラメーターは、マトリックス＝ＰＡＭ １５０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５およびギャップサイズペナルティ＝０．０５を含む。
ＴβＲＩＩポリペプチドは、Ｎ末端において種々のリーダー配列のうちのいずれかをさらに含み得る。かかる配列は、ペプチドが、真核生物の系において発現され、分泌経路へと標的化されることを可能にする。例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２年）を参照のこと。あるいは、ネイティブＴβＲＩＩシグナル配列は、細胞からの突出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）をもたらすために使用され得る。可能なリーダー配列には、ネイティブリーダー、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）およびミツバチメリチン（それぞれ、配列番号２２〜２４）が含まれる。ＴＰＡリーダー配列を取り込んでいるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の例には、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３が含まれる。シグナルペプチドのプロセシングは、変数のなかでも、選択されたリーダー配列、使用される細胞型および培養条件に依存して変動し得、したがって、成熟ＴβＲＩＩポリペプチドについての実際のＮ末端開始部位は、Ｎ末端またはＣ末端方向のいずれかで、１、２、３、４または５アミノ酸シフトし得る。ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の例には、ＴβＲＩＩポリペプチド部分に下線を付した、本明細書に示される配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２が含まれる（実施例を参照のこと）。ＴβＲＩＩの長アイソフォームに基づく対応するバリアントが、２５アミノ酸の挿入に対してＣ末端の隣接する位置における保存的Ｖａｌ−Ｉｌｅ置換と共に、この挿入を含むことが、当業者によって理解される。
ある特定の実施形態では、本開示は、そのポリペプチドのグリコシル化を変更するような、ＴβＲＩＩポリペプチドの特異的変異を企図する。かかる変異は、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位などの１または複数のグリコシル化部位を導入または排除するように、選択され得る。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニン（またはアスパラギン−Ｘ−セリン）（式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。この変更は、野生型ＴβＲＩＩポリペプチドの配列に対する、１もしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加または１もしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によっても、行われ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。グリコシル化認識部位の第１もしくは第３のアミノ酸位置の一方もしくは両方における種々のアミノ酸の置換もしくは欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、修飾されたトリペプチド配列において非グリコシル化を生じる。ＴβＲＩＩポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ＴβＲＩＩポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基と結合し得る。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１年）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁中に記載されている。ＴβＲＩＩポリペプチド上に存在する１または複数の炭水化物部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化には、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＴβＲＩＩポリペプチドの曝露が関与し得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いた、ほとんどまたは全ての糖の切断を生じる。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７年）Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９巻：５２頁およびＥｄｇｅら（１９８１年）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１８巻：１３１頁によってさらに記載されている。ＴβＲＩＩポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８巻：３５０頁に記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るので、ＴβＲＩＩポリペプチドの配列は、必要に応じて、使用される発現系の型に依存して調整され得る。一般に、ヒトでの使用のためのＴβＲＩＩポリペプチドは、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株などの、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株において発現されるが、他の哺乳動物発現細胞株、操作されたグリコシル化酵素を有する酵母細胞株、および昆虫細胞も、同様に有用であると予測される。
本開示は、変異体、特に、ＴβＲＩＩポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセット、ならびにトランケーション変異体を生成する方法をさらに企図する；コンビナトリアル変異体のプールは、機能的バリアント配列を同定するために特に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る、またはあるいは、新規活性を全て一緒に有するＴβＲＩＩポリペプチドバリアントを生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイは、以下に提供され、かかるアッセイは、バリアントを評価するために使用され得る。例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドバリアントは、ＴβＲＩＩリガンドと結合する能力、ＴβＲＩＩポリペプチドへのＴβＲＩＩリガンドの結合を防止する能力、またはＴβＲＩＩリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を妨害する能力について、スクリーニングされ得る。ＴβＲＩＩポリペプチドまたはそのバリアントの活性は、細胞ベースのアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ、特に、実施例に開示されるアッセイのいずれかにおいても、試験され得る。
天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの細胞外ドメインを含むＴβＲＩＩポリペプチドと比較して、選択的なまたは一般に増加した潜在力を有する、コンビナトリアルに誘導されたバリアントが、生成され得る。同様に、変異誘発は、対応する野生型ＴβＲＩＩポリペプチドとは劇的に異なる血清半減期を有するバリアントを生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、ネイティブＴβＲＩＩポリペプチドの破壊、またはネイティブＴβＲＩＩポリペプチドの他の方法による排除もしくは不活化を生じる、タンパク質分解性の分解または他のプロセスに対して、より安定にされ得るかまたはより不安定にされ得るかのいずれかである。かかるバリアント、およびそれらをコードする遺伝子は、ＴβＲＩＩポリペプチドの半減期をモジュレートすることによって、ＴβＲＩＩポリペプチドレベルを変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過的な生物学的効果を生じ得、患者内の組換えＴβＲＩＩポリペプチドレベルのより厳密な制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異が、タンパク質の半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分中に作成され得る。
コンビナトリアルライブラリーは、潜在的ＴβＲＩＩポリペプチド配列の少なくとも一部分を各々が含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって産生され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、潜在的ＴβＲＩＩポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、またはあるいは、（例えば、ファージディスプレイのために）より大きい融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列へと酵素的にライゲーションされ得る。
潜在的ＴβＲＩＩポリペプチドバリアントのライブラリーが縮重オリゴヌクレオチド配列から生成され得る多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機において実施され得、次いで、合成遺伝子が、発現のために適切なベクター中にライゲーションされ得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ， ＳＡ（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐｒｏｃ． ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２７３〜２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４年）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら、（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１巻：４７７頁を参照のこと）。かかる技術は、他のタンパク質の指向性の進化において使用されてきた（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻：３８６〜３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９巻：２４２９〜２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻：４０４〜４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７巻：６３７８〜６３８２頁；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
あるいは、他の形態の変異誘発が、コンビナトリアルライブラリーを生成するために利用され得る。例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドバリアントは、例えば、アラニンスキャニング変異誘発などを使用するスクリーニングによって（Ｒｕｆら、（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３巻：１５６５〜１５７２頁；Ｗａｎｇら、（１９９４年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９巻：３０９５〜３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３年）Ｇｅｎｅ １３７巻：１０９〜１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１８巻：５９７〜６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８巻：２８８８〜２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０巻：１０８３２〜１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４巻：１０８１〜１０８５頁）、リンカースキャニング変異誘発によって（Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３巻：６５３〜６６０頁；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２巻：２６４４〜２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２巻：３１６頁）；飽和変異誘発によって（Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２巻：６１３頁）；ＰＣＲ変異誘発によって（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９年）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １巻：１１〜１９頁）；または化学的変異誘発などを含むランダム変異誘発によって（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２年）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４年）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７巻：３２〜３４頁）、ライブラリーから生成および単離され得る。特にコンビナトリアル設定におけるリンカースキャニング変異誘発は、ＴβＲＩＩポリペプチドのトランケートされた（生物活性）形態を同定するための代替的な方法である。
広い範囲の技術が、点変異およびトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、およびそれについて言えば、特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、当該分野で公知である。かかる技術は、ＴβＲＩＩポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに、一般に順応性がある。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングするステップ、ベクターの得られたライブラリーで適切な細胞を形質転換するステップ、および所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを含む。好ましいアッセイには、ＴβＲＩＩリガンド結合アッセイおよびリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示のＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴβＲＩＩポリペプチド中に天然に存在する任意の修飾に加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。かかる修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ペグ化（ポリエチレングリコール）およびアシル化が含まれるがこれらに限定されない。結果として、修飾されたＴβＲＩＩポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えば、ポリエチレングリコール、脂質、モノサッカライドまたはポリサッカライドおよびホスフェートを含み得る。ＴβＲＩＩポリペプチドの機能性に対するかかる非アミノ酸要素の影響は、他のＴβＲＩＩポリペプチドバリアントについて本明細書に記載したように試験され得る。ＴβＲＩＩポリペプチドが、ＴβＲＩＩポリペプチドの新生形態を切断することによって細胞中で産生される場合、翻訳後プロセシングは、タンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとっても重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ−２９３）は、かかる翻訳後活性のための特異的な細胞マシナリーおよび特徴的機構を有し、ＴβＲＩＩポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
ある特定の態様では、ＴβＲＩＩポリペプチドの機能的バリアントまたは修飾された形態には、ＴβＲＩＩポリペプチドの少なくとも一部分と１または複数の融合ドメインとを有する融合タンパク質が含まれる。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが含まれるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、一部の融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的として、アフィニティークロマトグラフィーのための適切なマトリックス、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲート樹脂が使用される。かかるマトリックスの多くは、（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用な、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」形態で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、ＴβＲＩＩポリペプチドの検出を促進するように選択され得る。かかる検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびにそれに対する特異的抗体が入手可能である通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。それに対する特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能である周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。一部の場合では、これらの融合ドメインは、適切なプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化するのを可能にし、それによって、そこから組換えタンパク質を遊離させる、第Ｘａ因子またはトロンビンなどについてのプロテアーゼ切断部位を有する。次いで、遊離されたタンパク質は、引き続くクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから単離され得る。ある特定の好ましい実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴβＲＩＩポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合される。「安定化する」とは、減少した破壊、腎臓による減少したクリアランス、または他の薬物動態学的効果に起因するか否かには関わらず、血清半減期を増加させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広い範囲のタンパク質に対して所望の薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を付与できる。選択され得る他の型の融合ドメインには、マルチマー化（例えば、ダイマー化、テトラマー化）ドメインおよび機能的ドメインが含まれる。
具体的な例として、本開示は、３つのＦｃドメイン配列（例えば、配列番号１９、２０および２１）のうちの１つに融合されたＴβＲＩＩポリペプチドのバリアントを含む融合タンパク質を提供する。任意選択で、このＦｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、Ｌｙｓ−３２２およびＡｓｎ−４３４（対応する全長ＩｇＧに従って番号付けした）などの残基において、１または複数の変異を有する。特定の場合には、これらの変異のうち１または複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃγ受容体と結合する能力を低減させた。他の場合には、これらの変異のうち１または複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）と結合する能力を増加させた。
融合タンパク質の異なるエレメントは、所望の機能性と一致する任意の様式でアレンジされ得ることが理解される。例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端に配置され得、またはあるいは、異種ドメインが、ＴβＲＩＩポリペプチドに対してＣ末端に配置され得る。ＴβＲＩＩポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端もしくはＮ末端に、またはドメイン間に、含まれ得る。
本明細書で使用する場合、用語「免疫グロブリンＦｃドメイン」または単に「Ｆｃ」は、免疫グロブリン鎖の定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部分の、カルボキシル末端部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２もしくはそれ超のドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域の組合せを含み得る。好ましい実施形態では、この免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、好ましくは、ＣＨ１ドメインを欠く。
一実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。他のクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）が、使用され得る。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号において、詳細に議論されている。特定の結果を達成するための、特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当該分野の技術水準の範囲内とみなされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部分、および好ましくは、ＦｃガンマのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれかにおける相同ドメインの少なくとも一部分を含む。
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は、本明細書に開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが企図される。一例は、Ｆｃ受容体に対する低減された親和性を有するＦｃバリアントを創出するために、上のＣＨ２領域中にアミノ酸置換を導入することである（Ｃｏｌｅら（１９９７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９巻：３６１３頁）。
ある特定の実施形態では、本開示は、他のタンパク質および／もしくは他のＴβＲＩＩポリペプチド種から単離された、または他のタンパク質および／もしくは他のＴβＲＩＩポリペプチド種を他の方法で実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％含まない）、ＴβＲＩＩポリペプチドの単離および／または精製された形態を利用可能にする。ＴβＲＩＩポリペプチドは、一般に、組換え核酸からの発現によって産生される。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩタンパク質の細胞外部分のコード配列を含む、可溶性ＴβＲＩＩポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本開示は、かかる核酸を含む宿主細胞にも関する。この宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であり得る。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において、発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。したがって、本開示の一部の実施形態は、ＴβＲＩＩポリペプチドを産生する方法にさらに関する。
３．ＴβＲＩＩポリペプチドをコードする核酸
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示される断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含むＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかをコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４は、ＩｇＧ２ ＦｃドメインまたはＮ末端がトランケートされたＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合されたＴβＲＩＩ細胞外ドメインのバリアントをコードする。対象核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。かかる核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドを作製するための方法において、または直接的治療剤として（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉまたは遺伝子治療アプローチにおいて）、使用され得る。
ある特定の態様では、ＴβＲＩＩポリペプチドをコードする対象核酸は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４のバリアントである核酸を含むことが、さらに理解される。バリアントヌクレオチド配列には、１または複数のヌクレオチド置換、付加または欠失によって異なる配列、例えば、対立遺伝子バリアントが含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、単離されたまたは組換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４に対して相補的な核酸配列、ならびに配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４のバリアントもまた、本開示の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離され得る、組換えであり得るおよび／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合され得る、またはＤＮＡライブラリー中にあり得る。
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４に示されるヌクレオチド配列、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４の相補体配列、またはそれらの断片に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた含む。上で議論したように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーの条件が変動され得ることを、容易に理解する。例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションと、その後の、５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄とを、実施することができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまでで、選択され得る。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃での低いストリンジェンシーの条件から、約６５℃での高いストリンジェンシーの条件まで増加され得る。温度および塩の両方が変動され得、または温度もしくは塩濃度は、他の変数が変化しても一定で維持され得る。一部の実施形態では、本開示は、室温での６×ＳＳＣとその後の室温での２×ＳＳＣにおける洗浄の低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４に示される核酸とは異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸は、１よりも多いトリプレットによって指定される。同じアミノ酸または同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンについて同義語である）を特定するコドンは、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」変異を生じ得る。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞の間に存在すると予測される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチドにおけるこれらのバリエーション（ヌクレオチドの最大約３〜５％）が、天然の対立遺伝子バリエーションに起因して、所与の種の個体の間に存在し得ることを理解する。あらゆるかかるヌクレオチドバリエーションおよび得られたアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
ＴβＲＩＩの長アイソフォームに基づく対応するバリアントが、２５アミノ酸の挿入に対してＣ末端の隣接する位置における保存的Ｖａｌ−Ｉｌｅ置換と共に、この挿入をコードするヌクレオチド配列を含むことが、当業者によって理解される。ＴβＲＩＩの長（Ａ）または短（Ｂ）アイソフォームのいずれかに基づく対応するバリアントが、天然に存在するＴβＲＩＩアイソフォームＣについて記載されたのと同じ位置で、３６アミノ酸の挿入（配列番号１８）をコードする１０８ヌクレオチドの挿入を含むバリアントヌクレオチド配列を含むこともまた、理解される（例証を参照のこと）。
ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において、１または複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適切である。多数の型の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が、種々の宿主細胞について、当該分野で公知である。典型的には、前記１または複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的または誘導性プロモーターが、本開示によって企図される。これらのプロモーターは、天然に存在するプロモーター、または１よりも多いプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのように、エピソーム上で細胞中に存在し得、または発現構築物は、染色体中に挿入され得る。好ましい実施形態では、この発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変動する。
本明細書に開示されるある特定の態様では、この対象核酸は、ＴβＲＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結した発現ベクター中で提供される。調節配列は、当該分野で認識されており、ＴβＲＩＩポリペプチドの発現を指向するために選択される。したがって、用語調節配列には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントが含まれる。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ； Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載されている。例えば、それに作動可能に連結した場合にＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＴβＲＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるために、これらのベクターにおいて使用され得る。かかる有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって指向されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにそれらの種々の組合せが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、および／または発現されることが望まれるタンパク質の型などの因子に依存し得ることを、理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびこのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現もまた、考慮すべきである。
本開示に含まれる組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物）のいずれか、またはそれら両方における発現に適切なベクター中にライゲーションさせることによって、産生され得る。組換えＴβＲＩＩポリペプチドの産生のための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、以下の型のプラスミドが含まれる：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの繁殖を促進するための原核生物配列、および真核細胞において発現される１または複数の真核生物転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのうちの一部は、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を促進するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体が、真核細胞中でのタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される種々の方法は、当該分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年）を参照のこと。一部の例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が含まれる。
ある特定の実施形態では、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などのベクターが、ＣＨＯ細胞における対象ＴβＲＩＩポリペプチドの産生のために設計される。好ましい実施形態では、ベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞における対象ＴβＲＩＩポリペプチドの産生のために設計される。明らかなように、これらの対象遺伝子構築物は、例えば、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含むタンパク質を、精製のために産生するために、培養物中で繁殖された細胞において、対象ＴβＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
本開示は、対象ＴβＲＩＩポリペプチドのうちの１または複数のコード配列（例えば、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４）を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。この宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において、発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
したがって、本開示は、対象ＴβＲＩＩポリペプチドを産生する方法にさらに関する。例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＴβＲＩＩポリペプチドの発現を生じさせるための適切な条件下で培養され得る。このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴβＲＩＩポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、このＴβＲＩＩポリペプチドは、細胞質にまたは膜画分中に保持され得、細胞が回収され得、溶解され得、タンパク質が単離され得る。細胞培養物は、宿主細胞および培地を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。これらの対象ＴβＲＩＩポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＴβＲＩＩポリペプチドの特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製、およびＴβＲＩＩポリペプチドに融合されたドメインと結合する薬剤を用いたアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムが、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合物を精製するために使用され得る）を含む、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞またはそれら両方から単離され得る。好ましい実施形態では、このＴβＲＩＩポリペプチドは、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質である。一例として、精製は、例えば、任意の順序で、以下のうちの３つまたはそれ超を含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了され得る。
別の実施形態では、組換えＴβＲＩＩポリペプチドの所望の部分のＮ末端においてポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。次いで、この精製リーダー配列は、精製されたＴβＲＩＩポリペプチドを提供するために、エンテロキナーゼによる処理によって引き続いて除去され得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８巻：８９７２頁を参照のこと）。
融合遺伝子を作製するための技術は、周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の接続は、ライゲーションのための平滑末端または粘着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の充填、望ましくない接続を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを使用する従来の技術に従って実施される。別の実施形態では、この融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅が、キメラ遺伝子配列を生成するために引き続いてアニーリングされ得る２つの連続する遺伝子断片間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実施され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと）。
ＴβＲＩＩ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３およびＧＤＦ１５のアンタゴニストである核酸化合物のカテゴリーの例には、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物および触媒的核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖化合物は、オーバーハングまたは非相補性の領域もまた含み得、ここで、これらの鎖の一方または他方は、一本鎖である。一本鎖化合物は、自己相補性の領域を含み得、これは、この化合物が、二重らせん構造の領域を有する、いわゆる「ヘアピン」または「ステムループ」構造を形成することを意味する。核酸化合物は、全長ＴβＲＩＩ核酸配列またはリガンド核酸配列の１０００以下、５００以下、２５０以下、１００以下または５０、３５、３０、２５、２２、２０もしくは１８以下のヌクレオチドからなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含み得る。相補性の領域は、好ましくは、少なくとも８ヌクレオチド、および任意選択で少なくとも１０または少なくとも１５ヌクレオチド、例えば、１５〜２５ヌクレオチドの間である。相補性の領域は、標的転写物のイントロン、コード配列または非コード配列、例えば、コード配列部分内に含まれ得る。一般に、核酸化合物は、約８〜約５００ヌクレオチドまたは塩基対長の長さ、例えば、約１４〜約５０ヌクレオチドの長さを有する。核酸は、ＤＮＡ（特に、アンチセンスとしての使用のため）、ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。任意の１つの鎖は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡのいずれとしても容易に分類できない修飾された形態を含み得る。同様に、二本鎖化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡであり得、任意の１つの鎖はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡのいずれとしても容易に分類できない修飾された形態を含み得る。核酸化合物は、骨格（ヌクレオチド間連結を含む、天然核酸中の糖−リン酸部分）または塩基部分（天然核酸のプリンまたはピリミジン部分）への１または複数の修飾を含む、種々の修飾のいずれかを含み得る。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、血清において、細胞において、または化合物が送達される可能性が高い場所、例えば経口送達された化合物の場合には胃において、吸入された化合物については肺において、安定性などの特徴を改善するための、１または複数の修飾を含むことが多い。ＲＮＡｉ構築物の場合、標的転写物に対して相補的な鎖は、一般に、ＲＮＡまたはその修飾物である。他方の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは任意の他のバリエーションであり得る。二本鎖または一本鎖「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の二重鎖部分は、好ましくは、Ｄｉｃｅｒ基質として機能する限り、１８〜４０ヌクレオチド長の長さ、および任意選択で約２１〜２３ヌクレオチド長の長さを有する。触媒的または酵素的核酸は、リボザイムまたはＤＮＡ酵素であり得、修飾された形態もまた含み得る。核酸化合物は、生理学的条件下およびナンセンスまたはセンス制御がほとんどまたは全く影響を有さない濃度において細胞と接触させた場合、約５０％、７５％、９０％またはそれ超、標的の発現を阻害し得る。核酸化合物の影響を試験するための好ましい濃度は、１、５および１０マイクロモルである。核酸化合物は、例えば、血管新生に対する影響についても試験され得る。
４．Ｆｃ−融合タンパク質における変更
本出願は、操作されたまたはバリアントＦｃ領域を有するＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質をさらに提供する。かかる抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、抗原依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能をモジュレートする際に、有用であり得る。さらに、これらの修飾は、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改善し得る。これらの抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製される。かかるバリアントは、例えば、本明細書に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列からの欠失、および／またはかかるアミノ酸配列中への挿入、および／またはかかるアミノ酸配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入および置換の任意の組合せが、最終構築物が所望の特徴を有することを条件として、最終構築物に到達するために作成される。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセスもまた変更し得る。
低減されたエフェクター機能を有する抗体およびＦｃ融合タンパク質は、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら（ＷＯ９４／２８０２７およびＷＯ９８／４７５３１を参照のこと；Ｘｕら２０００年Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００巻；１６〜２６頁もまた参照のこと）によって記載されたＡｌａ−Ａｌａ変異が含まれるがこれに限定されない変化をアミノ酸配列中に導入することによって産生され得る。したがって、ある特定の実施形態では、定常領域内にＡｌａ−Ａｌａ変異を含む変異を有する本開示の抗体およびＦｃ融合タンパク質が、エフェクター機能を低減または無効にするために、使用され得る。これらの実施形態によれば、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位におけるアラニンへの変異もしくは２３５位におけるアラニンへの変異、またはそれらの組合せを含み得る。一実施形態では、この抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、ここで、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位におけるフェニルアラニンからアラニンへの変異（複数可）および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異を記述する。別の実施形態では、この抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、ここで、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位におけるロイシンからアラニンへの変異（複数可）および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異を記述する。この抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＣＨ２ドメインにおける点変異Ｋ３２２Ａを含む他の変異を、代替的にまたはさらに保有し得る（Ｈｅｚａｒｅｈら２００１年Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７５巻：１２１６１〜８頁）。
特定の実施形態では、この抗体またはＦｃ融合タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するかまたは阻害するために修飾され得る。モジュレートされたＣＤＣ活性は、Ｆｃ領域中に１または複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を導入することによって達成され得る（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照のこと）。あるいは、またはさらに、システイン残基（複数可）が、Ｆｃ領域中に導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。こうして生成されたホモダイマー抗体は、改善もしくは低減された内在化能および／または増加もしくは減少された補体媒介性細胞死滅を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７６巻：１１９１〜１１９５頁（１９９２年）およびＳｈｏｐｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：２９１８〜２９２２頁（１９９２年）、ＷＯ９９／５１６４２、ＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２巻：７３８〜４０頁（１９８８年）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１を参照のこと。
５．ＧＤＦ１５−ＴβＲＩＩシグナル伝達
本開示は、ＴＧＦβ ＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）が高い親和性でＧＤＦ１５と結合するという発見に一部関する。これまで、ＧＤＦ１５が、受容体と直接的に結合または相互作用することは、生化学的に示されていない。不適当または不適切なリガンド精製が、市販のＧＤＦ１５の不活性の潜在的な理由であり得る。ＴβＲＩＩ結合活性を実証する例示的なＧＤＦ１５ポリペプチド、ならびにかかるポリペプチドを作製および精製する方法は、本明細書に開示されている。ヒトおよびマウス由来のネイティブ前駆体ＧＤＦ１５タンパク質およびヌクレオチドの配列は、図１〜４に示される。成熟ヒトＧＤＦ１５は、配列番号１の残基１９７から３０８に及ぶ。同様に、成熟マウスＧＤＦ１５は、配列番号３の残基１９２から３０３に及ぶ。ある特定の実施形態では、本開示は、他のタンパク質および／もしくは他のＧＤＦ１５ポリペプチド種から単離された、または他のタンパク質および／もしくは他のＧＤＦ１５ポリペプチド種を他の方法で実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％含まない）、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはその断片の単離および／または精製された形態を利用可能にする。本開示のＧＤＦ１５ポリペプチドは、高い親和性でＴβＲＩＩと結合する。結合は、溶液中で、またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどの表面プラズモン共鳴システム中で、精製されたタンパク質を使用して評価され得る。これらのＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＴβＲＩＩポリペプチドに対する、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９Ｍまたはそれ未満の親和性（解離定数）を有する。好ましくは、本開示のＧＤＦ１５ポリペプチドは、本明細書に記載される方法に従って単離および精製される。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、一般に、組換え核酸からの発現によって産生される。
ＧＤＦ１５ポリペプチドには、配列番号１もしくは配列番号３のＧＤＦ１５ポリペプチドに対して、少なくとも８０％同一なアミノ酸配列、および任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列もしくはその機能的断片からなるまたはかかるアミノ酸配列もしくはその機能的断片を含むポリペプチドが含まれ得る。ＧＤＦ１５ポリペプチドには、配列番号１の残基１９７〜３０８もしくは配列番号３の残基１９２〜３０３を含むＧＤＦ１５ポリペプチドに対して、少なくとも８０％同一なアミノ酸配列、および任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列もしくはその機能的断片からなるまたはかかるアミノ酸配列もしくはその機能的断片を含むポリペプチドが含まれ得る。プロセシングされていないＧＤＦ１５ポリペプチドは、任意のシグナル配列、ならびにシグナル配列に対してＮ末端の任意の配列を、含むまたは排除するかのいずれかであり得る。ＧＤＦ１５ポリペプチドには、配列番号１もしくは配列番号３のバリアント、またはそれぞれ、配列番号１の１９７〜３０８もしくは配列番号３の残基１９２〜３０３（例えば、配列番号１もしくは配列番号３の配列中に、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０もしくは３５以上のアミノ酸置換を含むバリアントを含む）に対応するそれらの部分、それらの断片、ならびに上述のいずれかを含む融合タンパク質が含まれ得るが、各場合において、好ましくは、上述のＧＤＦ１５ポリペプチドのいずれかが、ＴβＲＩＩポリペプチドに対する実質的な親和性を有する。
ある特定の実施形態では、本開示のＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチド中に天然に存在する任意の修飾に加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。かかる修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ペグ化（ポリエチレングリコール）およびアシル化が含まれるがこれらに限定されない。結果として、修飾されたＧＤＦ１５ポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えば、ポリエチレングリコール、脂質、モノサッカライドまたはポリサッカライドおよびホスフェートを含み得る。ＧＤＦ１５ポリペプチドの機能性に対するかかる非アミノ酸要素の影響は、他のＧＤＦ１５ポリペプチドについて本明細書に記載したように試験され得る。ＧＤＦ１５ポリペプチドが、ＧＤＦ１５ポリペプチドの新生形態を切断することによって細胞中で産生される場合、翻訳後プロセシングは、タンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとっても重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ−２９３）は、かかる翻訳後活性のための特異的な細胞マシナリーおよび特徴的機構を有し、ＧＤＦ１５ポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、前駆体および成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本開示は、かかる核酸を含む宿主細胞にも関する。この宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であり得る。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において、発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。したがって、本開示の一部の実施形態は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを産生する方法にさらに関する。
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示される断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含むＧＤＦ１５ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。対象核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。かかる核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドを作製するための方法において、または直接的治療剤として（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉまたは遺伝子治療アプローチにおいて）、使用され得る。
ある特定の態様では、ＧＤＦ１５ポリペプチドをコードする対象核酸は、配列番号１または配列番号３のバリアントである核酸を含むことが、さらに理解される。バリアントヌクレオチド配列には、１または複数のヌクレオチド置換、付加または欠失によって異なる配列、例えば、対立遺伝子バリアントが含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号１または配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、単離されたまたは組換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号１または配列番号３に対して相補的な核酸配列、および配列番号１または配列番号３のバリアントもまた、本開示の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離され得る、組換えであり得るおよび／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合され得る、またはＤＮＡライブラリー中にあり得る。
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１または配列番号３の相補体配列、またはそれらの断片に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた含む。上で議論したように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーの条件が変動され得ることを、容易に理解する。例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションと、その後の、５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄とを、実施することができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまでで、選択され得る。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃での低いストリンジェンシーの条件から、約６５℃での高いストリンジェンシーの条件まで増加され得る。温度および塩の両方が変動され得、または温度もしくは塩濃度は、他の変数が変化しても一定で維持され得る。一部の実施形態では、本開示は、室温での６×ＳＳＣとその後の室温での２×ＳＳＣにおける洗浄の低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号１または配列番号３に示される核酸とは異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸は、１よりも多いトリプレットによって指定される。同じアミノ酸または同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンについて同義語である）を特定するコドンは、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」変異を生じ得る。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞の間に存在すると予測される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチドにおけるこれらのバリエーション（ヌクレオチドの最大約３〜５％）が、天然の対立遺伝子バリエーションに起因して、所与の種の個体の間に存在し得ることを理解する。あらゆるかかるヌクレオチドバリエーションおよび得られたアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において、１または複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適切である。多数の型の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が、種々の宿主細胞について、当該分野で公知である。典型的には、前記１または複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的または誘導性プロモーターが、本開示によって企図される。これらのプロモーターは、天然に存在するプロモーター、または１よりも多いプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのように、エピソーム上で細胞中に存在し得、または発現構築物は、染色体中に挿入され得る。好ましい一実施形態では、この発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変動する。
本明細書に開示されるある特定の態様では、この対象核酸は、ＧＤＦ１５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結した発現ベクター中で提供される。調節配列は、当該分野で認識されており、ＧＤＦ１５ポリペプチドの発現を指向するために選択される。したがって、用語調節配列には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントが含まれる。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ； Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載されている。例えば、それに作動可能に連結した場合にＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＧＤＦ１５ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるために、これらのベクターにおいて使用され得る。かかる有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって指向されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにそれらの種々の組合せが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、および／または発現されることが望まれるタンパク質の型などの因子に依存し得ることを、理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびこのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現もまた、考慮すべきである。
本開示に含まれる組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物）のいずれか、またはそれら両方における発現に適切なベクター中にライゲーションさせることによって、産生され得る。組換えＧＤＦ１５ポリペプチドの産生のための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、以下の型のプラスミドが含まれる：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの繁殖を促進するための原核生物配列、および真核細胞において発現される１または複数の真核生物転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのうちの一部は、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を促進するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体が、真核細胞中でのタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される種々の方法は、当該分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年）を参照のこと。一部の例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が含まれる。
好ましい実施形態では、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）およびＵＣＯＥ（商標）由来ベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）などのベクターが、ＣＨＯ細胞における対象ＴβＲＩＩポリペプチドの産生のために設計される。明らかなように、これらの対象遺伝子構築物は、例えば、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含むタンパク質を、精製のために産生するために、培養物中で繁殖された細胞において、対象ＧＤＦ１５ポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
本開示は、対象ＧＤＦ１５ポリペプチドのうちの１または複数のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号３）を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。この宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に開示されるＧＤＦ１５ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において、発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。好ましい実施形態では、本明細書に開示されるＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において発現される。
したがって、本開示は、対象ＧＤＦ１５ポリペプチドを産生する方法にさらに関する。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＧＤＦ１５ポリペプチドの発現を生じさせるための適切な条件下で培養され得る。このＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、このＴβＲＩＩポリペプチドは、細胞質にまたは膜画分中に保持され得、細胞が回収され得、溶解され得、タンパク質が単離され得る。細胞培養物は、宿主細胞および培地を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。これらの対象ＧＤＦ１５ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＧＤＦ１５ポリペプチドの特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製、およびＧＤＦ１５ポリペプチドに融合されたドメインと結合する薬剤を用いたアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムが、ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合物を精製するために使用され得る）を含む、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞またはそれら両方から単離され得る。好ましい一実施形態では、このＧＤＦ１５ポリペプチドは、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質である。一例として、精製は、例えば、任意の順序で、以下のうちの３つまたはそれ超を含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了され得る。
好ましい実施形態では、これらの対象ＧＤＦ１５ポリペプチドは、一連のカチオン交換カラムクロマトグラフィーステップを使用して、培養培地から精製される。カチオン交換カラムに使用される材料の例は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）などの置換基を有する樹脂であり得る。カチオン交換カラムクロマトグラフィーに使用される材料の例には、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＤＥＡＥ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ−６５０（ＴＯＳＯＨ）、またはカルボキシメチルなどの弱いカチオン交換体が含まれる。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ ＦｌｏｗおよびＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗが好ましい。
精製を開始するために、ＧＤＦ１５ポリペプチドを安定に発現する宿主細胞由来の馴化培地のパラメーター、例えば、ｐＨ、イオン強度および温度は、必要に応じて調整され得る。一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、ポリペプチド含有上清との接触の前に、１または複数の溶液で洗い流され、平衡化される。かかる溶液は、例えば、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ヒスチジン、リン酸塩または酢酸ナトリウム、例えば、１〜５００ｍＭの間、２５〜１００ｍＭの間、１５〜３０ｍＭの間もしくは２０ｍＭ）、および／または塩（例えば、ＮａＣｌ、ＮａＰＯ４、酢酸ナトリウムもしくはＣａＣｌ２、例えば、０〜２Ｍの間、１〜２Ｍの間もしくは５００ｍＭ〜１Ｍの間）を含み得る。平衡化溶液のｐＨは、一般に、３．５〜１０の範囲である（例えば、ｐＨ３．５〜６の間、４．０〜５．５の間、４．５〜４．８の間または４．７）。カラムをポリペプチド含有流体と接触させた後、結合したカラムが洗浄され得る。洗浄溶液は、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ヒスチジン、リン酸塩もしくは酢酸ナトリウム、例えば、１〜５００ｍＭの間、２５〜１００ｍＭの間、１５〜３０ｍＭの間もしくは２０ｍＭ）および／または塩（例えば、ＮａＣｌ、ＮａＰＯ４、酢酸ナトリウムもしくはＣａＣｌ２、例えば、０〜２Ｍの間、１〜２Ｍの間、１００ｍＭ〜１Ｍの間もしくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの間）および／または添加物（例えば、グアニジン、尿素、スクロース、アルギニンもしくはアルギニン誘導体）および／または溶媒（例えば、エタノール、アセトニトリルもしくはポリエチレングリコール）を含み得る。洗浄溶液は、一般に、３．５〜１０の間のｐＨ（例えば、４．５〜８．０の間のｐＨ）を有する。ポリペプチドは、ｐＨの段階変化もしくは勾配変化、塩型、塩濃度、溶媒型、溶媒濃度、ディスプレーサ型、ディスプレーサ濃度、またはそれらの組合せを使用して、カラムから溶出され得る。一般に、カラムからポリペプチドを溶出させるために、媒体は、溶出緩衝液と接触させられる。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳもしくはＴｒｉｓ、例えば、１０〜１００ｍＭ、２５〜７５ｍＭもしくは５０ｍＭ）を含み、および／または塩（例えば、ＮａＣｌもしくはＣａＣｌ２、例えば、０〜２Ｍ、例えば、１０〜１００ｍＭ）を含む。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、グリシン、酢酸またはクエン酸（例えば、２０〜２５０ｍＭもしくは１５０ｍＭ）を含み得る。溶出緩衝液は、酢酸（例えば、２０ｍＭ〜約５０ｍＭ）、添加物（例えば、グアニジン、尿素もしくはスクロース、例えば、１〜１０Ｍ、２〜８Ｍもしくは６Ｍ）および／または溶媒（例えば、エタノール、アセトニトリル、ポリエチレングリコール、例えば、１〜１０％溶媒、例えば、５％溶媒）もまた含み得る。溶出緩衝液のｐＨは、約５．０〜約１０．０の範囲であり得る。一部の実施形態では、ｐＨは、勾配溶出を生じるために、（例えば、徐々に）変化され得る。一部の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。一部の実施形態では、一連のカラムクロマトグラフィーステップが実施される。
本明細書に提示されるデータは、ＴβＲＩＩポリペプチドが、ＧＤＦ１５シグナル伝達のアンタゴニストとして作用することを実証している。可溶性ＴβＲＩＩポリペプチド、および特にＴβＲＩＩ−Ｆｃは、好ましいアンタゴニストであるが、抗ＧＤＦ１５抗体、抗ＴβＲＩＩ抗体、アンチセンス、ＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩの産生を阻害するＲＮＡｉまたはリボザイム核酸、およびＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩの他のインヒビター、特に、ＧＤＦ１５−ＴβＲＩＩ結合を破壊するものを含む、他の型のＧＤＦ１５アンタゴニストが有用であると予測される。
ＧＤＦ１５ポリペプチドと特異的に反応性であり、ＴβＲＩＩポリペプチドへのその結合と競合する（競合的に結合する）ようにＧＤＦ１５ポリペプチドと結合するか、またはＧＤＦ１５媒介性のシグナル伝達を他の方法で阻害するかのいずれかである抗体は、ＧＤＦ１５ポリペプチド活性のアンタゴニストとして使用され得る。同様に、ＴβＲＩＩポリペプチドと特異的に反応性であり、ＧＤＦ１５結合を破壊する抗体は、アンタゴニストとして使用され得る。
ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＴβＲＩＩポリペプチドに由来する免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコールによって作製され得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅによって編集されたＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８年）を参照のこと）。哺乳動物、例えば、マウス、ハムスターまたはウサギは、免疫原性形態のＧＤＦ１５ポリペプチド、抗体応答を惹起することが可能な抗原性断片、または融合タンパク質によって、免疫化され得る。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技術には、担体へのコンジュゲート化または当該分野で周知の他の技術が含まれる。ＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫化の進行は、血漿または血清における抗体力価の検出によって、モニタリングされ得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイが、抗体のレベルを評価するために、抗原としての免疫原と共に使用され得る。
ＧＤＦ１５ポリペプチドの抗原性調製物による動物の免疫化後、抗血清が取得され得、所望の場合、ポリクローナル抗体が、血清から単離され得る。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）が、免疫化した動物から回収され得、ハイブリドーマ細胞を得るために、標準的な体細胞融合手順によって、骨髄腫細胞などの不死細胞と融合され得る。かかる技術は、当該分野で周知であり、これには、例えば、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁によって元々開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ７７〜９６頁）が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、かかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離された、ＧＤＦ１５ポリペプチドと特異的に反応性の抗体およびモノクローナル抗体の産生について、免疫化学的にスクリーニングされ得る。
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、これもまた対象ポリペプチドと特異的に反応性であるその断片を含むことが意図される。抗体は、従来の技術を使用して断片化され得、それらの断片は、抗体全体について上記したのと同じ様式で、有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。得られたＦ（ａｂ）２断片は、Ｆａｂ断片を産生するために、ジスルフィド架橋を還元するために処理され得る。本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されるＴβＲＩＩまたはＧＤＦ１５ポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性、単鎖、キメラ、ヒト化および完全にヒトの分子を含むことが、さらに意図される。抗体は、それと結合し、検出されることができる標識をさらに含み得る（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。
ある特定の実施形態では、この抗体は、組換え抗体であり、この用語は、ＣＤＲ移植抗体もしくはキメラ抗体、ライブラリー選択された抗体ドメインからアセンブルされたヒトもしくは他の抗体、単鎖抗体および単一ドメイン抗体（例えば、ヒトＶＨタンパク質またはラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）ＶＨＨタンパク質）を含め、分子生物学の技術によって一部生成された、任意の抗体を包含する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、ある特定の実施形態では、本発明は、新規抗体を生成するための利用可能な方法を作成する。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＴβＲＩＩポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、検出可能な免疫応答を刺激するために有効な抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物の量をマウスに投与するステップ、このマウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓由来の細胞）を取得し、この抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを取得するステップ、およびこの抗体産生ハイブリドーマを試験して、この抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するステップを含み得る。一旦取得されると、ハイブリドーマは、細胞培養物中で、任意選択で、ハイブリドーマ由来の細胞が、この抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件下で、繁殖され得る。このモノクローナル抗体は、細胞培養物から精製され得る。
形容詞「〜と特異的に反応性」とは、抗体に関して使用する場合、当該分野で一般に理解されるように、この抗体が、目的の抗原（例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチド）と目的ではない他の抗原との間で十分に選択的であり、この抗体が、最低でも、特定の型の生物学的試料において目的の抗原の存在を検出するために有用であることを意味することが意図される。抗体を使用する、治療適用などの特定の方法では、結合におけるより高い程度の特異性が望ましい場合がある。モノクローナル抗体は、一般に、所望の抗原と交差反応性ポリペプチドとを効率的に識別する（ポリクローナル抗体と比較して）より高い傾向を有する。抗体：抗原相互作用の特異性に影響する１つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性が、異なる親和性の範囲で達成され得るが、一般に好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９またはそれ未満の親和性（解離定数）を有する。ＧＤＦ１５とＴβＲＩＩとの高い親和性を考慮すると、中和性の抗ＧＤＦ１５または抗ＴβＲＩＩ抗体は、一般に、１０−９またはそれ未満の解離定数を有すると予測される。
さらに、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、取得された抗体の特性に影響し得る。例えば、抗体が、溶液中で抗原に結合するために使用されるものである場合、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。種々の異なる技術が、特に望ましい抗体を同定するために、抗体と抗原との相互作用を試験するために利用可能である。かかる技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学が含まれる。
ＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩアンタゴニストである核酸化合物のカテゴリーの例には、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物および触媒的核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖化合物は、オーバーハングまたは非相補性の領域もまた含み得、ここで、これらの鎖の一方または他方は、一本鎖である。一本鎖化合物は、自己相補性の領域を含み得、これは、この化合物が、二重らせん構造の領域を有する、いわゆる「ヘアピン」または「ステムループ」構造を形成することを意味する。核酸化合物は、全長ＧＤＦ１５核酸配列またはＴβＲＩＩ核酸配列の１０００以下、５００以下、２５０以下、１００以下または５０、３５、３０、２５、２２、２０もしくは１８以下のヌクレオチドからなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含み得る。相補性の領域は、好ましくは、少なくとも８ヌクレオチド、および任意選択で少なくとも１０または少なくとも１５ヌクレオチド、例えば、１５〜２５ヌクレオチドの間である。相補性の領域は、標的転写物のイントロン、コード配列または非コード配列、例えば、コード配列部分内に含まれ得る。一般に、核酸化合物は、約８〜約５００ヌクレオチドまたは塩基対長の長さ、例えば、約１４〜約５０ヌクレオチドの長さを有する。核酸は、ＤＮＡ（特に、アンチセンスとしての使用のため）、ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。任意の１つの鎖は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡのいずれとしても容易に分類できない修飾された形態を含み得る。同様に、二本鎖化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡであり得、任意の１つの鎖はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡのいずれとしても容易に分類できない修飾された形態を含み得る。核酸化合物は、骨格（ヌクレオチド間連結を含む、天然核酸中の糖−リン酸部分）または塩基部分（天然核酸のプリンまたはピリミジン部分）への１または複数の修飾を含む、種々の修飾のいずれかを含み得る。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、血清において、細胞において、または化合物が送達される可能性が高い場所、例えば経口送達された化合物の場合には胃において、吸入された化合物については肺において、安定性などの特徴を改善するための、１または複数の修飾を含むことが多い。ＲＮＡｉ構築物の場合、標的転写物に対して相補的な鎖は、一般に、ＲＮＡまたはその修飾物である。他方の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは任意の他のバリエーションであり得る。二本鎖または一本鎖「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の二重鎖部分は、好ましくは、Ｄｉｃｅｒ基質として機能する限り、１８〜４０ヌクレオチド長の長さ、および任意選択で約２１〜２３ヌクレオチド長の長さを有する。触媒的または酵素的核酸は、リボザイムまたはＤＮＡ酵素であり得、修飾された形態もまた含み得る。核酸化合物は、生理学的条件下およびナンセンスまたはセンス制御がほとんどまたは全く影響を有さない濃度において細胞と接触させた場合、約５０％、７５％、９０％またはそれ超、標的の発現を阻害し得る。核酸化合物の影響を試験するための好ましい濃度は、１、５および１０マイクロモルである。
６．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本発明は、ＧＤＦ１５−ＴβＲＩＩシグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（薬剤）を同定するための、ＴβＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性ＴβＲＩＩポリペプチド）およびＧＤＦ１５ポリペプチドの使用に関する。このスクリーニングによって同定された化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＤＦ１５シグナル伝達活性をモジュレートするそれらの能力を評価するために、試験され得る。任意選択で、これらの化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏで組織成長をモジュレートするそれらの能力を評価するために、動物モデルにおいてさらに試験され得る。
ＧＤＦ１５およびＴβＲＩＩポリペプチドを標的化することによって組織成長をモジュレートするための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットスクリーニングが、ＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩ媒介性の細胞シグナル伝達を乱す薬剤を同定するために、実施され得る。ある特定の実施形態では、このアッセイは、ＧＤＦ１５へのＴβＲＩＩポリペプチドの結合を特異的に阻害または低減させる化合物をスクリーニングおよび同定するために実施される。あるいは、このアッセイは、ＧＤＦ１５へのＴβＲＩＩポリペプチドの結合を増強する化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、これらの化合物は、ＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって同定され得る。
種々のアッセイ形式が、本開示に照らして十分であるが、それにもかかわらず、本明細書に明示的に記載されていないアッセイ形式が、当業者によって理解される。本明細書に記載されるように、本発明の試験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアルケミカル方法によって創出され得る。あるいは、これらの対象化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織成長のモジュレーターとして作用するそれらの能力について試験される化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物もしくは他の生物によって産生され得（例えば、天然産物）、化学的に産生され得（例えば、ペプチド模倣物を含む小分子）、または組換え産生され得る。本発明によって企図される試験化合物には、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が含まれる。具体的な実施形態では、この試験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機分子である。
本発明の試験化合物は、単一の個別の実体として提供され得るか、またはコンビナトリアルケミストリーなどによって作製された、より高い複雑度のライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含み得る。試験系への試験化合物の提示は、特に初期スクリーニングステップでは、単離された形態の化合物でまたは化合物の混合物としてのいずれかであり得る。任意選択で、これらの化合物は、他の化合物で任意選択で誘導体化され得、化合物の単離を促進する誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例には、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁性ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能なクロスリンカーまたはそれらの任意の組合せが含まれる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、ハイスループットアッセイが、所与の期間に調査される化合物の数を最大化するために、望ましい。精製または半精製のタンパク質を用いて誘導され得るものなどの無細胞系で実施されるアッセイは、迅速な開発と試験化合物によって媒介される分子標的における変更の比較的容易な検出とを可能にするように生み出され得るという点で、「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの影響は、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系では無視され得、その代わりに、このアッセイは、ＴβＲＩＩポリペプチドとＧＤＦ１５との結合親和性の変更として現れ得るような、分子標的に対する薬物の影響に主に焦点を当てる。
単に例示するために、本発明の例示的なスクリーニングアッセイでは、目的の化合物は、通常はＧＤＦ１５と結合することが可能な単離および精製されたＴβＲＩＩポリペプチドと接触させられる。次いで、化合物およびＴβＲＩＩポリペプチドの混合物に、ＴβＲＩＩリガンドを含む組成物が添加される。ＴβＲＩＩ／ＧＤＦ１５複合体の検出および定量化は、ＴβＲＩＩポリペプチドとＧＤＦ１５との複合体形成を阻害（または強化）する際の化合物の効力を決定するための手段を提供する。この化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を使用して取得されたデータから、用量反応曲線を生成することによって評価され得る。さらに、対照アッセイもまた、比較のためのベースラインを提供するために実施され得る。例えば、対照アッセイでは、単離および精製されたＧＤＦ１５が、ＴβＲＩＩポリペプチドを含む組成物に添加され、ＴβＲＩＩ／ＧＤＦ１５複合体の形成が、試験化合物の非存在下で定量化される。一般に、反応物が混合され得る順序は、変動され得、同時に混合され得ることが理解される。さらに、精製されたタンパク質の代わりに、細胞抽出物および溶解物が、適切な無細胞アッセイ系を提供するために使用され得る。
ＴβＲＩＩポリペプチドとＧＤＦ１５との複合体形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成のモジュレーションは、イムノアッセイまたはクロマトグラフィー検出により、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射能標識された（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈ）、蛍光標識された（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素的に標識されたＴβＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦ１５を使用して、定量化され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＴβＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との相互作用の程度を、直接的または間接的にのいずれかで測定する際の、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、他の様式の検出、例えば、光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサーおよび表面力センサーに基づくものが、本発明の多くの実施形態と適合性である。
さらに、本発明は、ＴβＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との相互作用を破壊または強化する薬剤を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７２巻：２２３〜２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４巻：９２０〜９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８巻：１６９３〜１６９６頁）を参照のこと。具体的な実施形態では、本発明は、ＴβＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との相互作用を解離させる化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するための逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する。例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７巻：９１９〜２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照のこと。
ある特定の実施形態では、これらの対象化合物は、本発明のＴβＲＩＩまたはＧＤＦ１５ポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって同定される。化合物とＴβＲＩＩまたはＧＤＦ１５ポリペプチドとの相互作用は、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、かかる相互作用は、光架橋、放射能標識されたリガンド結合およびアフィニティークロマトグラフィーを含むｉｎ ｖｉｔｒｏの生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで同定され得る（Ｊａｋｏｂｙ ＷＢら、１９７４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４６巻：１頁）。特定の場合には、これらの化合物は、機構ベースのアッセイ、例えば、ＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩポリペプチドと結合する化合物を検出するためのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相または液相結合事象を含み得る。あるいは、ＧＤＦ１５またはＴβＲＩＩポリペプチドをコードする遺伝子は、細胞中にレポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共にトランスフェクトされ得、好ましくはハイスループットスクリーニングによってライブラリーに対してスクリーニングされ得、またはライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ、例えば、自由エネルギーにおける変化を検出する結合アッセイが、使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定された、または固定化された抗体によって捕捉された、またはキャピラリー電気泳動によって分離された標的を用いて、実施され得る。結合した化合物は、通常は比色または蛍光または表面プラズモン共鳴を使用して、検出され得る。
ある特定の態様では、本発明は、ＧＤＦ１５媒介性の細胞シグナル伝達をモジュレート（刺激または阻害）するための方法および薬剤を提供する。したがって、同定された任意の化合物は、ＧＤＦ１５シグナル伝達をモジュレートするそれらの能力を確認するために、細胞または組織全体中で、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで試験され得る。当該分野で公知の種々の方法が、この目的のために利用され得る。
７．例示的な治療的使用
本明細書で使用する場合、障害または状態を「予防する」治療薬とは、統計学的試料において、未処置の対照試料と比較して、処置した試料において障害もしくは状態の発生を低減させ、あるいは未処置の対照試料と比較して、障害もしくは状態の１もしくは複数の症状の発症を遅延またはその重症度を低減させる化合物を指す。用語「処置する」は、本明細書で使用する場合、状態が一旦確立された後の、その状態の寛解または排除を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師によって提供される診断および治療剤の投与の意図した結果において、識別され得る。
本開示は、上述のＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質または核酸アンタゴニスト（例えば、アンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ）を含む、本明細書で以下、集合的に「治療剤」と称されるＴβＲＩＩポリペプチドの有効量を対象に投与することによって、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと関連する疾患または状態を処置または予防する方法を提供する。一部の実施形態では、この疾患または状態は、調節不全のＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３シグナル伝達と関連する。特定の心血管または血管障害を処置するための方法および組成物もまた提供される。さらに、本開示は、がんを処置または予防するための方法および組成物を提供する。さらに、本開示は、線維性障害および状態を処置または予防するための方法および組成物を提供する。
特に、本開示のポリペプチド治療剤は、慢性の血管または心血管疾患を処置または予防するために有用である。この種類の例示的な障害には、心臓疾患（心筋疾患、心筋梗塞、狭心症および心臓弁膜症を含む）；腎疾患（慢性糸球体炎症、糖尿病性腎不全およびループス関連腎炎症を含む）；アテローム動脈硬化症または他の型の動脈硬化症と関連する障害（脳卒中、脳出血、くも膜下出血、狭心症および腎動脈硬化症を含む）；血栓性障害（脳血栓症、血栓性腸管壊死を含む）；糖尿病の合併症（糖尿病関連網膜疾患、白内障、糖尿病関連腎疾患、糖尿病関連神経病理、糖尿病関連壊疽および糖尿病関連慢性感染を含む）；血管炎症障害（全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、関節動脈炎症、大細胞型動脈炎症、川崎病、高安動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群およびヘノッホ・シェーンライン紫斑病）；糖尿病性脈管障害；ならびに心障害、例えば、先天性心臓疾患、心筋症（例えば、拡張型、肥大型、拘束性心筋症）、およびうっ血性心不全が含まれるがこれらに限定されない。例示的な障害には、遺伝性出血性末梢血管拡張症（ＨＨＴ）、マルファン症候群、ロイス・ディーツ症候群、家族性胸部大動脈瘤症候群、動脈蛇行症候群、子癇前症および再狭窄がさらに含まれるがこれらに限定されない。
ＴβＲＩＩポリペプチドは、単独で、またはＴＧＦβ関連の心血管障害および／もしくは状態を処置するために有用な治療剤などの１もしくは複数の薬剤もしくは治療モダリティと組み合わせて、対象に投与され得る。ある特定の実施形態では、第２の薬剤または治療モダリティは、血管形成術、ベータブロッカー、血圧降下薬、強心薬、抗血栓薬、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、カルシウムチャネルブロッカー、ホスホジエステラーゼインヒビター、アンジオテンシン２型アンタゴニストおよび／またはサイトカインブロッカー／インヒビターのうちの１または複数から選択される。
特に、本開示のポリペプチド治療剤は、がん（腫瘍）を処置または予防するために有用である。用語「がん」および「がん性」とは、調節されない細胞の成長／増殖を典型的には特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すまたは記述する。がんまたは新生物障害の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が含まれるがこれらに限定されない。かかるがんのより特定の例には、扁平上皮がん、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸管がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳房がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、胃がん、腸管がん、皮膚がん、骨がん、胃のがん、黒色腫、および頭頸部扁平上皮がんを含む種々の型の頭頸部がんが含まれる。新生物障害および関連状態の他の例には、食道癌、莢膜細胞腫、男化腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、上咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、シュワン細胞腫、乏突起神経膠腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）と関連する異常な血管増殖、およびメグズ症候群が含まれる。本明細書に記載される治療剤による処置に特に適したがんは、以下のうちの１または複数を特徴とし得る：このがんは、腫瘍もしくは血清において検出可能な上昇したＴβＲＩＩレベル、増加したＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３の発現レベルもしくは生物学的活性を有し、転移性であるか、もしくは転移性になる危険性があり、またはそれらの任意の組合せである。
かかる方法のある特定の実施形態では、１または複数のポリペプチド治療剤は、一緒に（同時に）または異なる時点で（順次）、投与され得る。さらに、ポリペプチド治療剤は、がんを処置するためまたは血管新生を阻害するために、別の型の化合物と共に投与され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の対象方法は、単独で使用され得る。あるいは、これらの対象方法は、増殖性障害（例えば、腫瘍）の処置または予防に対して指向された他の従来の抗がん治療アプローチと組み合わせて使用され得る。例えば、かかる方法は、予防的がん予防、手術後のがんの再発および転移の予防において、ならびに他の従来のがん治療のアジュバントとして、使用され得る。本開示は、従来のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法および手術）の有効性が、対象ポリペプチド治療剤の使用を介して増強され得ることを認識している。
多様な従来の化合物が、抗新生物または抗がん活性を有することが示されている。これらの化合物は、固形腫瘍を収縮させるため、転移およびさらなる成長を予防するため、または白血病もしくは骨髄の悪性腫瘍における悪性細胞の数を減少させるための化学療法において、医薬剤として使用されてきた。化学療法は、種々の型の悪性腫瘍を処置する際に有効であるが、多くの抗新生物化合物は、望ましくない副作用を誘導する。２またはそれ超の異なる処置が組み合わされる場合、これらの処置は、相乗的に作用し得、処置の各々の投薬量の低減を可能にし、それによって、より高い投薬量において各化合物によってもたらされる有害な副作用を低減させることが示されている。他の例では、処置に対して抵抗性の悪性腫瘍は、２またはそれ超の異なる処置の組合せ治療に応答し得る。
本明細書に開示される治療剤が、併用してまたは順次のいずれかで、別の従来の抗新生物剤と組み合わせて投与される場合、かかる治療剤は、抗新生物剤の治療効果を増強し得る、またはかかる抗新生物剤に対する細胞の耐性を克服し得る。これは、抗新生物剤の投薬量の減少を可能にし、それによって、望ましくない副作用を低減させ、または耐性細胞における抗新生物剤の有効性を回復させる。
本開示によれば、本明細書に記載されるポリペプチド治療剤は、疾患の処置のために他の組成物および手順と組み合わせて使用され得る。例えば、腫瘍は、ＴβＲＩＩポリペプチドと組み合わせた手術、放射線療法または化学療法で従来通りに処置され得、次いで、ＴβＲＩＩポリペプチドが、微小転移の休眠を延長させ、任意の残留原発性腫瘍を安定化させるために、患者に引き続いて投与され得る。
本発明のある特定の態様では、ＴβＲＩＩポリペプチドとの組合せ腫瘍治療に有用な他の治療剤には、他のがん治療が含まれる：例えば、手術、細胞傷害剤、照射または放射性物質の投与が関与する放射線学的処置、化学療法剤、抗ホルモン剤、成長阻害剤、抗新生物組成物、ならびに本明細書に列挙され当該分野で公知の抗がん剤による処置、またはそれらの組合せ。
用語「細胞傷害剤」とは、本明細書で使用する場合、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす、物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレート剤、酵素およびそれらの断片、例えば、核酸分解酵素、抗生物質、ならびに毒素、例えば、小分子毒素、またはそれらの断片および／もしくはバリアントを含む、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、ならびに以下に開示する種々の抗腫瘍剤もしくは抗がん剤を含むことを意図する。他の細胞傷害剤は、以下に記載されている。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパおよびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（具体的には、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビセレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン酸化物塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマールおよびカリチアマイシンオメガール（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、３３巻：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照のこと）；ディネマイシンＡを含むディネマイシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連の色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）パクリタキセルのＣｒｅｍｏｐｈｏｒなしのアルブミン操作したナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体；ならびに上記の２もしくはそれ超の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの組合せ治療の略称ＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いる処置レジメンの略称ＦＯＬＦＯＸが含まれる。
がんの成長を促進し得るホルモンの影響を調節、低減、遮断または阻害するように作用し、全身性または全身処置の形態であることが多い抗ホルモン剤もまた、この定義に含まれる。これらは、ホルモン自体であり得る。例には、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹｌ １７０１８、オナプリストンおよびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンを含む、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン剤；エストロゲン受容体下方調節剤（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸リュープロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプトレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）；他の抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；ならびに副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳ ＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどが含まれる。さらに、化学療法剤のかかる定義には、ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）もしくはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣ ＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴ Ａ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネートまたはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン、ならびに遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；二トシル酸ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６としても公知のＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター）；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれる。
「成長阻害剤」とは、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで細胞の成長を阻害する化合物または組成物を指す。したがって、成長阻害剤は、Ｓ期にある細胞の百分率を顕著に低減させる薬剤であり得る。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の場所において）遮断する薬剤、例えば、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤が含まれる。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにトポイソメラーゼＩＩインヒビター、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンが含まれる。ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルおよびａｒａ−Ｃなどの、Ｇ１を停止させる薬剤はまた、Ｓ期停止まで波及する。さらなる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編、第１章、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５年）、特に１３頁において見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、共にイチイの木から誘導された抗がん薬物である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成アナログである。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリンダイマーからの微小管のアセンブリを促進し、脱重合を防止することによって微小管を安定化して、細胞における有糸分裂の阻害を生じる。
なお他の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、線維症の処置または予防において有用であり得る。本明細書で使用する場合、用語「線維症」とは、臓器または組織における細胞による過剰な線維性結合組織の異常な形成または発生を指す。線維症に関連するプロセスは、正常な組織形成または修復の一部として生じ得るが、これらのプロセスの調節不全は、組織または臓器の機能を進行性に損なう、変更された細胞組成および過剰な結合組織沈着をもたらし得る。線維性組織の形成は、修復または反応性プロセスから生じ得る。線維性障害または状態には、血管疾患、例えば、心疾患、大脳疾患および末梢血管疾患、ならびに心臓、皮膚、腎臓、腹膜、腸および肝臓を含む組織および臓器系と関連する線維増殖性障害（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷｙｎｎ、２００４年、Ｎａｔ Ｒｅｖ ４巻：５８３〜５９４頁に開示されている）が含まれるがこれらに限定されない。処置され得る例示的な障害には、傷害／線維症と関連する腎症、例えば、糖尿病と関連する慢性腎症（例えば、糖尿病性腎症）、ループス、強皮症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症およびＩｇＡ腎症を含む、腎線維症；腸線維症、例えば、強皮症および放射線誘発腸線維症；肝臓線維症、例えば、硬変、アルコール誘発性肝臓線維症、胆管傷害、原発性胆汁性肝硬変、感染またはウイルス誘導性肝臓線維症、先天性肝線維症および自己免疫性肝炎；ならびに他の線維性状態、例えば、嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、サルコイドーシス、強皮症、脊髄傷害／線維症、骨髄線維症、血管性再狭窄、アテローム動脈硬化症、注射線維症（これは、特に小児における筋内注射の合併症として生じ得る）、心内膜心筋線維症、後腹膜線維症および腎性全身性線維症が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用する場合、用語「線維性障害」、「線維性状態」および「線維性疾患」は、線維症を特徴とする障害、状態または疾患を指すために、相互交換可能に使用される。線維性障害の例には、硬化性障害（例えば、強皮症、アテローム動脈硬化症、びまん性全身性硬化症）、血管性線維症、膵臓線維症、肝臓線維症（例えば、硬変）、腎線維症、筋骨格線維症、心線維症（例えば、心内膜心筋線維症、特発性心筋症）、皮膚線維症（例えば、強皮症、外傷後、手術皮膚瘢痕、ケロイドおよび皮膚ケロイド形成）、眼線維症（例えば、緑内障、眼の硬化症、結膜および角膜瘢痕、ならびに翼状片）、骨髄線維症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、慢性移植片対宿主病、ペロニー病、膀胱鏡検査後尿道狭窄症、特発性および薬理学的に誘導された後腹膜線維症、縦隔線維症、増殖性線維症、新生物性線維症、デュピュイトラン病、狭窄、神経瘢痕、皮膚瘢痕および放射線誘発線維症が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用する場合、細胞の線維性応答の阻害には、肝臓（もしくは肝臓組織）内の１もしくは複数の細胞；腎臓（もしくは腎組織）内の１もしくは複数の細胞；筋肉組織内の１もしくは複数の細胞；心臓（もしくは心組織）内の１もしくは複数の細胞；膵臓内の１もしくは複数の細胞；皮膚内の１もしくは複数の細胞；骨内の１もしくは複数の細胞、脈管構造内の１もしくは複数の細胞、１もしくは複数の幹細胞、または眼内の１もしくは複数の細胞の線維性応答の阻害が含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、１または複数の他の治療モダリティと組み合わせたＴβＲＩＩポリペプチドの使用を企図する。したがって、ＴβＲＩＩポリペプチドの使用に加えて、線維性障害を処置するための１または複数の「標準的な」治療もまた、対象に投与することができる。例えば、これらのＴβＲＩＩポリペプチドは、細胞毒、免疫抑制剤、放射性毒薬剤および／または治療的抗体と組み合わせて（即ち、これらと一緒に）投与され得る。本発明によって企図される特定の共治療薬には、ステロイド（例えば、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾン）、免疫抑制剤および／または抗炎症剤（例えば、ガンマ−インターフェロン、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキセート、ペニシラミン、シクロスポリン、コルヒチン、抗胸腺細胞グロブリン、ミコフェノール酸モフェチルおよびヒドロキシクロロキン）、細胞傷害性薬物、カルシウムチャネルブロッカー（例えば、ニフェジピン）、アンジオテンシン変換酵素インヒビター（ＡＣＥ）インヒビター、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ジメチルスルホキシド、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）インヒビター、インターロイキン−５（ＩＬ−５）インヒビターおよび凡カスパーゼインヒビターが含まれるがこれらに限定されない。
ＴβＲＩＩポリペプチドと組み合わせて使用され得るさらなる抗線維性剤には、レクチン（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２６，２８３号に記載されている）、ならびにＷｙｎｎら（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７巻：５２４〜５２９頁）によって記載される抗線維性剤が含まれるがこれらに限定されない。例えば、さらなる抗線維性剤および治療には、種々の抗炎症性／免疫抑制／細胞傷害性薬物（コルヒチン、アザチオプリン、シクロホスファミド、プレドニゾン、サリドマイド、ペントキシフィリンおよびテオフィリンを含む）、ＴＧＦβシグナル伝達修飾剤（リラキシン、ＳＭＡＤ７、ＨＧＦおよびＢＭＰ７、ならびにＴＧＦβＩ、ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ、ＥＧＲ−ＩおよびＣＴＧＦインヒビターを含む）、サイトカインおよびサイトカイン受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−１３Ｒα１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、オンコスタチンＭ、ＷＩＳＰ−ＩおよびＰＤＧＦのインヒビター）、サイトカインおよびケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｃ）（ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α／β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１）、ケモカインアンタゴニスト（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ６、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８のインヒビター）、ケモカイン受容体アンタゴニスト（ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４のインヒビター）、ＴＬＲアンタゴニスト（ＴＬＲ３、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９のインヒビター）、血管新生アンタゴニスト（ＶＥＧＦ特異的抗体およびアデノシンデアミナーゼ補充療法）、血圧降下薬物（ベータブロッカーならびにＡＮＧ１１、ＡＣＥおよびアルドステロンのインヒビター）、血管作動性物質（ＥＴ−１受容体アンタゴニストおよびボセンタン（ｂｏｓｅｔａｎ））、コラーゲンを合成およびプロセシングする酵素のインヒビター（プロリルヒドロキシラーゼのインヒビター）、Ｂ細胞アンタゴニスト（リツキシマブ）、インテグリン／接着分子アンタゴニスト（α１β１およびαｖβ６インテグリンを遮断する分子、ならびにインテグリン関連キナーゼのインヒビター、ならびにＩＣＡＭ−ＩおよびＶＣＡＭ−Ｉに特異的な抗体）、筋線維芽細胞を標的化するアポトーシス促進性薬物、ＭＭＰインヒビター（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２のインヒビター）、ならびにＴＩＭＰインヒビター（ＴＩＭＰ−１に特異的な抗体）が含まれるがこれらに限定されない。
ＴβＲＩＩポリペプチドおよび共治療剤または共治療は、同じ製剤中で、または別々に、投与され得る。別々の投与の場合、このＴβＲＩＩポリペプチドは、共治療薬もしくは共治療の前に、その後に、またはそれと同時発生的に、投与され得る。一方の薬剤は、数分間から数週間までの範囲の間隔分、他方の薬剤の投与に先行または後続し得る。２またはそれ超の異なる種類の治療剤が対象に別々に適用される実施形態では、標的組織または細胞に対して有利に組み合わされた効果をこれらの異なる種類の薬剤がなおも発揮できるように、顕著な期間が各送達の時点の間で期限切れにならないことを一般に確実にする。
８．医薬組成物
本明細書に記載される治療剤（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）は、医薬組成物に製剤化され得る。本開示に従う使用のための医薬組成物は、１または複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化され得る。かかる製剤は、一般に、ほとんどの規制要件に応じて、実質的に発熱物質を含まない。
ある特定の実施形態では、本開示の治療方法は、全身的に、またはインプラントもしくはデバイスとして局所的に、組成物を投与するステップを含む。投与される場合、本開示における使用のための治療組成物は、発熱物質を含まない、生理学的に許容される形態である。これもまた上記のように組成物中に任意選択で含まれ得るＴβＲＩＩシグナル伝達アンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤が、本明細書に開示される方法において、対象化合物（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）と同時にまたは順次に投与され得る。
典型的には、本明細書に開示されるタンパク質治療剤は、非経口で、特に静脈内または皮下に投与される。非経口投与に適切な医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質または懸濁化剤もしくは増粘剤を含み得る、１または複数の薬学的に許容される無菌の等張水性もしくは非水性溶液、分散物、懸濁物またはエマルジョン、あるいは使用の直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散物へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて、１または複数のＴβＲＩＩポリペプチドを含み得る。本開示の医薬組成物において使用され得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
これらの組成物および製剤は、所望の場合、活性成分を含む１または複数の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイス中に提示され得る。このパックは、例えば、金属またはプラスチックのホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示書が付随し得る。
さらに、この組成物は、標的組織部位への送達のための形態で、カプセル化または注射され得る。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、標的組織部位に１または複数の治療化合物（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）を送達し、発生中の組織に構造を提供することが可能であり、最適には身体中に吸収されることが可能な、マトリックスを含み得る。例えば、このマトリックスは、ＴβＲＩＩポリペプチドの緩徐な放出を提供し得る。かかるマトリックスは、他の植え込まれた医学的適用のために現在使用されている材料から形成され得る。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、表面的外観および界面特性に基づく。対象組成物の特定の適用は、適切な製剤を規定する。組成物のための潜在的マトリックスは、生分解性かつ化学的に規定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であり得る。骨または皮膚コラーゲンなどの他の潜在的材料は、生分解性であり生物学的に十分規定されている。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス構成成分から構成される。他の潜在的マトリックスは、非生分解性かつ化学的に規定されており、例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネートまたは他のセラミックである。マトリックスは、上述の型の材料のいずれかの組合せ、例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムから構成され得る。バイオセラミックは、組成、例えば、カルシウム−アルミネート−ホスフェートにおいて変更され得、ポアサイズ、粒子サイズ、粒子形状および生分解性を変更するために加工され得る。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、経口でのために、例えば、各々が活性成分として所定の量の薬剤を含む、カプセル剤、サシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（風味付けした基礎、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用する）、粉末、顆粒の形態で、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物として、または水中油もしくは油中水液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを使用する）として、および／または口腔洗浄薬などとして、投与され得る。薬剤は、ボーラス、舐剤またはペースト剤としても投与され得る。
経口投与のための固体投薬形態（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）では、本発明の１または複数の治療化合物は、１または複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかと、混合され得る：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）バインダー、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルジネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなど；（３）保水剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収加速剤、例えば、第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、これらの医薬組成物は、緩衝剤もまた含み得る。同様の型の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用するソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル剤において、充填剤としても使用され得る。
経口投与のための液体投薬形態には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、この液体投薬形態は、当該分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤に加えて、これらの経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、調味料、着色剤、芳香剤、ならびに防腐剤もまた含み得る。
懸濁物は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天−寒天およびトラガント、ならびにそれらの混合物を含み得る。
本発明の組成物は、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤もまた含み得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって、確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることもまた、望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、もたらされ得る。
投薬レジメンは、本発明の対象化合物（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）の作用を修飾する種々の因子を考慮して、担当医によって決定されることが理解される。種々の因子には、患者の年齢、性別および食餌、重症度疾患、投与の時間、および他の臨床学的因子が含まれるがこれらに限定されない。任意選択で、投薬量は、再構成において使用されるマトリックスの型および組成物中の化合物の型によって変動し得る。最終組成物への他の公知の増殖因子の添加もまた、投薬量に影響し得る。進行は、骨の成長および／または修復の周期的評価、例えば、Ｘ線（ＤＥＸＡを含む）、組織形態計測的決定およびテトラサイクリン標識化によって、モニタリングされ得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＴβＲＩＩポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ産生のための遺伝子治療もまた提供する。かかる治療は、上に列挙した障害を有する細胞または組織中へのＴβＲＩＩポリヌクレオチド配列の導入によって、その治療効果を達成する。ＴβＲＩＩポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して、達成され得る。ＴβＲＩＩポリヌクレオチド配列の治療的送達には、標的化リポソームの使用が好ましい。
本明細書に教示される遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、このレトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかのさらなるレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を取り込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択可能なマーカーの遺伝子を移入させ得るまたは取り込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることによって、標的特異的にされ得る。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。当業者は、特異的ポリヌクレオチド配列が、ＴβＲＩＩポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするために、レトロウイルスゲノム中に挿入され得る、またはウイルスエンベロープと結合し得ることを認識する。好ましい実施形態では、このベクターは、骨または軟骨へと標的化される。
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドで直接トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
ＴβＲＩＩポリヌクレオチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル剤、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性内部内にカプセル化され得、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、６巻：７７頁、１９８１年を参照のこと）。リポソームビヒクルを使用した効率的な遺伝子移入のための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８年を参照のこと。リポソームの組成物は、通常、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
リポソーム産生において有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが含まれる。例示的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化もまた、例えば、臓器特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性に基づいて可能であり、当該分野で公知である。
本開示は、ｐＨを調整するための酸および塩基；ならびに狭い範囲内にｐＨを維持するための緩衝剤を含むように変動され得る製剤を提供する。
例証
本発明はここまで一般に記載されてきたが、本発明のある特定の実施形態の例示を単に目的として含まれ、本発明を限定することを意図しない、以下の実施例を参照して、より容易に理解される。
（実施例１）
生物活性ＧＤＦ１５の生成
ＧＤＦ１５（マクロファージ阻害サイトカイン−１としても公知）が、任意の受容体と直接的に結合または相互作用することは、生化学的に示されていない。出願人らは、哺乳動物ＣＨＯ細胞において産生された市販のヒトＧＤＦ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＧＤＦ１５への高親和性の結合を有するネイティブ受容体を同定することを最初に試みたが、成功しなかった。特徴的なシステインノットモチーフを含むＴＧＦβスーパーファミリー中の他のリガンドと同様、成熟ＧＤＦ１５は、成熟ダイマーＧＤＦ１５を生成するために正準ＲＸＸＲ部位においてフューリン様プロテアーゼによる切断によって除去されるより大きいプロドメイン（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２９巻：１７４頁、２０１１年；Ｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４７４巻：３４３頁、２０１１年）を有して合成される。不適当または不適切なリガンド精製は、市販のＧＤＦ１５の不活性の潜在的な理由であり得たので、出願人らは、ＧＤＦ１５に対して異なる精製手順を試験した。
ＣＨＯ細胞におけるＧＤＦ１５の安定な発現
出願人らは、さらなる研究のために、ヒトＧＤＦ１５（ｈＧＤＦ１５）およびマウスＧＤＦ１５（ｍＧＤＦ１５）を発現するためにＣＨＯ細胞を使用した。ｈＧＤＦ１５のネイティブ前駆体のアミノ酸配列は、図１に示され、対応するヌクレオチド配列（ネイティブ配列と比較して、サイレントの単一ヌクレオチド置換を有する）は、図２に示される。ｍＧＤＦ１５前駆体のネイティブアミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ図３および４に示される。ＣＨＯ細胞での発現のために、ヒトまたはマウスのＧＤＦ１５前駆体をコードするＵＣＯＥ（商標）ベースの構築物を、ＣＨＯ−ＰＡＣＥ細胞株中に安定にトランスフェクトした。クローンを、１０ｎＭ、２０ｎＭおよび５０ｎＭのメトトレキセートレベルにおいて選択し、次いで、コロニーを形成した任意のクローン（１つのメトトレキセート濃度につき１つまたは２つ）をプールした。発現の安定性を維持しつつＵＣＯＥ（商標）プールを増幅することは困難であるので、遺伝子増幅は実施しなかった。希釈クローニングの代わりに、高発現プールを同定し、ｈＧＤＦ１５およびｍＧＤＦ１５を生成するために使用した。
ヒトＧＤＦ１５の精製
精製を開始するために、ｈＧＤＦ１５を安定に発現するＣＨＯ細胞由来の馴化培地を、酢酸でｐＨ４．７に調整した。周囲温度で１０分間にわたる培地のインキュベーション後、沈殿物を遠心分離によって除去した。上清を、０．８μｍ使い捨てフィルターで濾過した。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７）および緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．７）で平衡化した。ローディングを１００ｃｍ／時間で実施した。カラムを、カラムからそれ以上タンパク質が溶出されなくなるまで、２０％のＢ（２００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、次いで、０％のＢに洗浄し戻して任意の残留塩を除去した。タンパク質を、カラムからそれ以上タンパク質が溶出されなくなるまで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、ｐＨ８．０で溶出させ（Ｔｒｉｓ＋尿素プール）、その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で溶出させた（Ｔｒｉｓ＋尿素＋塩プール）。各プールを、５０ｍＭの４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ、ｐＨ６．５）中で４℃で一晩透析した。
Ｔｒｉｓ＋尿素＋塩プール中で見出されたＧＤＦ１５は、ウエスタンブロット分析に基づいて分解されたので、このプールを廃棄した。Ｔｒｉｓ＋尿素プールを、緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５）および緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で予め平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。フロースルーを収集し、カラムを、１０％のＢ（１００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、その後、１２０ｃｍ／時間で５カラム体積にわたって１０〜５０％のＢ勾配（１００〜５００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。ウエスタンブロットによるフロースルーおよび洗浄画分の評価の後、タンパク質は、フロースルー中に主に見出された。このフロースルーを、緩衝液Ａ（水／０．１％ＴＦＡ）および緩衝液Ｂ（アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）を用いて、ＨＰＬＣに取り付けた逆相分取Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ）上に注入した。４．５ｍＬ／分で１時間にわたる２５〜４０％のＢ勾配は、最良の分解能を生じた。収集した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ）およびウエスタンブロットによって評価して、遠心分離蒸発器中での濃縮のためにそれらを選択した。
マウスＧＤＦ１５の精製
馴化培地のｐＨを、酢酸でｐＨ４．７に調整した。周囲温度で１０分間にわたる培地のインキュベーション後、沈殿物を遠心分離によって除去した。上清を、０．８μｍ使い捨てフィルターで濾過した。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７）および緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．７）で平衡化した。ローディングを、１００〜１５０ｃｍ／時間で実施し、カラムを、カラムからそれ以上タンパク質が溶出されなくなるまで、緩衝液Ａで洗浄した。洗浄を、３〜４カラム体積にわたって６０％のＢ（６００ｍＭ ＮａＣｌ）で実施し、その後、３〜４カラム体積にわたって１００％のＢ（１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。溶出を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、ｐＨ８．０を用いて継続して、樹脂になおも結合していた任意のタンパク質を除去した。
ＳＰカラム画分の非還元試料を、ウエスタンブロットによって分析した。ほとんどのタンパク質が、Ｔｒｉｓ溶出画分において見出されたが、以前の実験は、これらの画分中で見出されたｍＧＤＦ１５が本質的に不活性であることを示しているので、さらなる精製のためにこれを使用しなかった。その代り、精製を、１００％のＢ溶出（塩−溶出プール）において見出されたタンパク質を用いて継続した。このプールを、ＨＰＬＣに取り付けた逆相分取Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ）上に注入した。緩衝液Ａは、水／０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡであった。タンパク質を、４．５ｍＬ／分で１時間にわたる２５〜４０％のＢ勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ）およびウエスタンブロットによる逆相カラム画分の評価後に、純粋なｍＧＤＦ１５を含む画分をプールし、遠心分離蒸発器中で濃縮した。
ｈＧＤＦ１５およびｍＧＤＦ１５の正体を、各々Ｎ末端配列決定によって確認した。両方の型の精製されたＧＤＦ１５が、２つの異なる細胞株においてＳＭＡＤ２／３のリン酸化を刺激し、それによって、リガンド活性の確認を提供した。
（実施例２）
ＧＤＦ１５に対する高親和性の結合を有するＴＧＦβスーパーファミリー受容体の同定
活性ＧＤＦ１５タンパク質を取得したところで、ＴＧＦβスーパーファミリー受容体を含む受容体−Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に記載したように生成および精製したヒトまたはマウスのＧＤＦ１５への結合についてスクリーニングした。これらの融合タンパク質は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを取り込んでおり、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入したか、社内で生成したかのいずれかであった。５つのＩＩ型受容体（ＴＧＦβ受容体ＩＩ型、アクチビン受容体ＩＩＡ型、アクチビン受容体ＩＩＢ型、ＢＭＰ受容体ＩＩ型およびＭＩＳ受容体ＩＩ型）のなかで、ＴＧＦβ受容体ＩＩ型（ＴβＲＩＩ）のみが、捕捉された受容体−Ｆｃ融合タンパク質を用いた表面プラズモン共鳴によって決定した場合、ＧＤＦ１５に対する検出可能な結合を示した（ｋａ＝２．９２×１０５Ｍ−１ｓ−１；ｋｄ＝０．００１ｓ−１）。ｈＧＤＦ１５は、９．５６ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）で、３７℃で、捕捉されたｈＴβＲＩＩ−Ｆｃと結合した。７つのＩ型受容体（ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６およびＡＬＫ７）のなかには、ＧＤＦ１５（２０ｎＭまたは２００ｎＭにおけるｍＧＤＦ１５）に対する検出可能な結合を示したものはなかった。
ヒトＴβＲＩＩは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における選択的スプライシングによって生成される、少なくとも２つのアイソフォーム−Ａ（長）およびＢ（短）−として天然に生じる（図５、６）。上記スクリーニングに使用したｈＴβＲＩＩ−ｈＧ１Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、野生型ＴβＲＩＩ短アイソフォームを取り込む。追跡分析において、野生型ＴβＲＩＩ長アイソフォーム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を取り込む融合タンパク質に対するｍＧＤＦ１５結合の親和性は、表面プラズモン共鳴によって、ＴβＲＩＩ短アイソフォームを取り込む融合タンパク質ものと非常に類似していることが見出された（３７℃におけるＫＤは、それぞれ、２．７ｎＭおよび４．８ｎＭであった）。ＧＤＦ１５結合に関してこれらの短および長アイソフォームの一般的な等価性が観察されたので、出願人らは、次いで、ミニマルリンカーを介してそのＣ末端においてヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインと融合したｈＴβＲＩＩ短の野生型ＥＣＤ（配列番号７）からなる受容体−Ｆｃ融合タンパク質を生成した。特記しない限り、ＴβＲＩＩの短および長アイソフォームに基づくバリアントに関するアミノ酸位置の番号付けは、それぞれ、ネイティブ前駆体配列番号５および配列番号６における対応する位置を指す。
ＧＤＦ１５に対するＴβＲＩＩの高親和性の結合を考慮して、本発明者らは、ＴβＲＩＩがＧＤＦ１５のインヒビターとして使用できるかどうかを試験した。融合タンパク質ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃを、ＣＡＧＡ−１２プロモーター構築物を含むレポーター遺伝子でトランスフェクトしたＡ５４９細胞において試験したところ、これは、かかる細胞におけるｈＧＤＦ１５誘導性の遺伝子活性化を、０．１５〜０．５ｎＭのＩＣ５０で阻害することが見出された。ｈＴβＲＩＩ短ＥＣＤによるＧＤＦ１５シグナル伝達の強力な阻害は、ＴβＲＩＩがＧＤＦ１５に対する高親和性受容体であるというさらなる証拠を提供する。ＧＤＦ１５は、無細胞条件下でＡＬＫ５に対する検出可能な結合を示さなかったものの、ｓｉＲＮＡ方法論による内因性ＡＬＫ５ ｍＲＮＡの抑制は、対照処理と比較して、Ａ５４９細胞（ヒト肺上皮細胞株）におけるｍＧＤＦ１５媒介性のシグナル伝達を顕著に低減させた。対照的に、ｓｉＲＮＡ方法論による他のＩ型受容体（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４およびＡＬＫ７）の抑制は、Ａ５４９細胞においてＧＤＦ１５媒介性のシグナル伝達を変更できなかった。この結果は、ＧＤＦ１５三元シグナル伝達複合体が、そのＩ型受容体としてＡＬＫ５（ＴＧＦβ受容体Ｉ型）を含むことを示しており、したがって、ＧＤＦ１５に対する機能的ＩＩ型受容体としてのＴβＲＩＩについての裏付け証拠を提供する。
（実施例３）
受容体融合タンパク質バリアントの生成
ＴβＲＩＩ ＥＣＤバリアント
ＴβＲＩＩはまた、高い親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３と結合するので、ネイティブＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、これらのリガンドならびにＧＤＦ１５のシグナル伝達に影響を与える。一部の治療設定では、このより広いスペクトルのリガンド結合が有利であり得るが、他の設定では、より選択的な分子が優れている可能性がある。したがって、出願人らは、ヒトＴβＲＩＩ ＥＣＤのバリアントを含む融合タンパク質を生成することによって、ＧＤＦ１５に対する増強または低減された選択性を有するポリペプチドを探索した。以下に示す野生型ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９）配列（配列番号７）は、以下に列挙する５つの受容体ＥＣＤバリアント（配列番号８〜１２）についての基礎として機能した。野生型ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９）を、ＩｇＧ２のＦｃ部分に融合させて、新規の基礎Ｆｃ融合構築物を生成した。以下の配列番号５０、５１および５２を参照のこと。
Figure 2016528295
 （１）以下に示すｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）アミノ酸配列（配列番号８）、配列中、置換された残基に下線を付す。
Figure 2016528295
 （２）以下に示すＮ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）アミノ酸配列（配列番号９）。
Figure 2016528295
 （３）以下に示すＮ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）アミノ酸配列（配列番号１０）。
Figure 2016528295
 （４）以下に示すＣ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）アミノ酸配列（配列番号１１）。
Figure 2016528295
 （５）以下に示すＣ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）アミノ酸配列（配列番号１２）、配列中、置換された残基に下線を付す。
Figure 2016528295
出願人らは、以下に示す野生型ｈＴβＲＩＩ長（２３〜１８４）配列（配列番号１３）に基づく５つの対応するバリアント（配列番号１４〜１７）もまた想定し、配列中、２５アミノ酸の挿入に下線を付す。スプライシングは、この挿入に対してＣ末端の隣接する位置において保存的アミノ酸置換（Ｖａｌ→Ｉｌｅ）を生じることに留意のこと。いくつかのｈＴβＲＩＩ短バリアントおよびそれらのｈＴβＲＩＩ長対応物の間での配列の関係性を、図７に示す。
Figure 2016528295
 （１）以下に示すｈＴβＲＩＩ長（２３〜１８４／Ｄ１３５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号１４）、配列中、置換された残基に二重下線を付す。
Figure 2016528295
 （２）以下に示すＮ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ長（２９〜１８４）アミノ酸配列（配列番号１５）。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
 （３）以下に示すＮ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ長（６０〜１８４）アミノ酸配列（配列番号１０と同じ）。
Figure 2016528295
 （４）以下に示すＣ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ長（２３〜１７８）アミノ酸配列（配列番号１６）。
Figure 2016528295
 （５）以下に示すＣ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ長（２３〜１７８／Ｎ９５Ｄ）アミノ酸配列（配列番号１７）、配列中、置換された残基に二重下線を付す。
Figure 2016528295
さらなるＴβＲＩＩ ＥＣＤバリアントには、以下が含まれる：
（Ａ）以下に示す、Ｎ末端およびＣ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５３）またはｈＴβＲＩＩ長（６０〜１７８）アミノ酸配列（配列番号４７）。
Figure 2016528295
 （Ｂ）以下に示すＮ末端およびＣ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５３）アミノ酸配列（配列番号４８）。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
 （Ｃ）以下に示すＮ末端およびＣ末端がトランケートされたｈＴβＲＩＩ長（２９〜１７８）アミノ酸配列（配列番号４９）。
Figure 2016528295
上記バリアント（配列番号８〜１２、１４〜１７および４７〜４９）のいずれかは、ｈＴβＲＩＩアイソフォームＣ（Ｋｏｎｒａｄら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８巻：３１８頁、２００７年）に天然に生じるような、ｈＴβＲＩＩ ＥＣＤのＣ末端の近傍に位置するグルタミン酸残基の対（配列番号５の１５１位および１５２位、または配列番号６の１７６位および１７７位）の間の３６アミノ酸の挿入（配列番号１８）を取り込み得る。
Figure 2016528295
一例として、任意選択の挿入部位に隣接する対になったグルタミン酸残基が、ｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）バリアント（配列番号９）について以下に示される（下線）。
Figure 2016528295
 Ｆｃドメインバリアント
上記５つのｈＴβＲＩＩ短バリアントが各々、以下のアミノ酸配列（配列番号１９）を有するヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインに、それらのＣ末端において（ミニマルリンカーを介して）融合された、ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ融合タンパク質を生成した：
Figure 2016528295
出願人らは、全長ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ｈＧ１Ｆｃ）（配列番号２０、以下）およびＮ末端がトランケートされたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ｈＧ１Ｆｃ短）（配列番号２１、以下）を含む代替的Ｆｃドメインを含むｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ融合タンパク質を想定する。任意選択で、Ｆｃドメインと無関係のポリペプチドを、Ｆｃドメインの代わりに結合させることができる。
Figure 2016528295
 リーダー配列バリアント
以下の３つのリーダー配列を検討した：
Figure 2016528295
 ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ融合タンパク質の発現
選択されたｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃタンパク質バリアントは、ＴＰＡリーダーを取り込み、配列番号２５、２９、３３、３７および４１に示されるプロセシングされていないアミノ酸配列を有する（実施例５を参照のこと）。これらのバリアントの対応するヌクレオチド配列は、配列番号２６、３０、３４、３８および４２である。各々がＧ２Ｆｃドメイン（配列番号１９）を有する選択されたｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃバリアントを、ＨＥＫ−２９３細胞において発現させ、濾過およびプロテインＡクロマトグラフィーによって馴化培地から精製した。レポーター遺伝子アッセイのための試料の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって評価した。
出願人らは、配列番号２７、３１、３５、３９および４３に示されるプロセシングされていないアミノ酸配列を有するさらなるｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃタンパク質バリアント、ならびに配列番号２８、３２、３６、４０および４４に示される対応するヌクレオチド配列を想定する。
野生型短構築物ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号５０）が、以下に示される。
Figure 2016528295
このタンパク質を、以下に示すような、ＴＰＡリーダー配列を含む構築物（配列番号５２）から発現させた。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
配列番号５２をコードする核酸配列を以下に示す：
Figure 2016528295
Figure 2016528295
 （実施例４）
細胞ベースのアッセイにおける受容体融合タンパク質バリアントによる示差的リガンド阻害
Ａ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の活性を阻害するｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃバリアントの能力を決定した。このアッセイは、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ １７巻：３０９１〜３１００頁）ならびにトランスフェクション効率について制御するためのＲｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）でトランスフェクトしたヒト肺癌細胞株に基づく。ＣＡＧＡモチーフは、ＴＧＦβ応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在するので、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子のために一般に使用される。
アッセイの最初の日に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を、１ウェル当たり６．５×１０４細胞で４８ウェルプレート中に分配した。２日目に、１０μｇ ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、１００ｎｇ ｐＲＬＣＭＶ、３０μｌ Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）および９７０μｌ ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液を、３０分間事前インキュベートし、次いで、０．１％ＢＳＡを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））に添加し、これを、室温で一晩のインキュベーションにわたり、プレートした細胞に適用した（５００μｌ／ウェル）。３日目に、培地を除去し、細胞を、以下に記載するように調製したリガンドおよびインヒビターの混合物と共に、３７℃で一晩インキュベートした。
試験物品の連続希釈を、２００μｌ体積のアッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ）中で４８ウェルプレートにおいて行った。試験リガンドを含む等体積のアッセイ緩衝液を添加して、予め決定したＥＣ５０と等しい最終リガンド濃度を得た。ヒトＧＤＦ１５およびマウスＧＤＦ１５は、社内で生成したが（上記を参照のこと）、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから取得した。試験溶液を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、２５０μｌの混合物を、全てのウェルに添加した。各濃度の試験物品を、二連で決定した。試験溶液との一晩のインキュベーション後に、細胞を、リン酸緩衝食塩水でリンスし、次いで、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１９４１）で溶解させ、−７０℃で一晩貯蔵した。４日目の最終日に、プレートを、穏やかに振盪しながら室温まで温めた。細胞溶解物を、化学発光プレート（９６ウェル）に二連で移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１９８０）の試薬を用いてルミノメーターで分析して、正規化されたルシフェラーゼ活性を決定した。
このアッセイを使用して、ＴβＲＩＩリガンドによる細胞シグナル伝達に対する潜在的阻害効果について、受容体融合タンパク質バリアントをスクリーニングした。野生型ＴβＲＩＩ短−ＦｃおよびＴβＲＩＩ長−Ｆｃに関する以前の報告（ｄｅｌ Ｒｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９巻：２２７６５頁、２００４年）と一致して、試験したいずれのバリアントも、高い濃度であっても、ＴＧＦβ２を阻害できなかった。しかし、ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃバリアントは、ＧＤＦ１５、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３によって媒介される細胞シグナル伝達の示差的阻害を、予想外に示した。野生型ＴβＲＩＩ短（２３〜１５９）−Ｇ２Ｆｃと比較すると、ＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）−Ｇ２Ｆｃバリアントは、ＧＤＦ１５の強力な阻害を示したが、ＴＧＦβ１の阻害の喪失およびＴＧＦβ３の大きく低減された阻害（約５０倍）を示した（以下の表を参照のこと）。１１０位は、ＴβＲＩＩの「フック」領域中に位置するが（Ｒａｄａｅｖら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５巻：１４８０６頁、２０１０年）、認識されたＴβＲＩＩリガンドＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３のうちで選択性を付与することは示唆されてこなかった。したがって、このバリアントは、ＧＤＦ１５が最も強力に阻害され、ＴＧＦβ１が最も弱く阻害され、ＴＧＦβ３が中間の程度まで阻害される、示差的リガンド阻害のプロファイルを示す。
Figure 2016528295
第２の実験では、Ｎ末端がトランケートされたＴβＲＩＩ ＥＣＤを有するバリアントの潜在力を、全長野生型ＴβＲＩＩ ＥＣＤのものと比較した。以下の表に示すように、ＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）−Ｇ２ＦｃおよびＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）−Ｇ２Ｆｃは、ＴβＲＩＩ短（２３〜１５９）−Ｇ２Ｆｃ（野生型）と比較して、ＴＧＦβ３を阻害する大きく減退した能力を示したが、ＧＤＦ１５を阻害する減退されていない能力（Ｎ’Δ６）またはわずかにのみ減退した能力（Ｎ’Δ１２）を示した。野生型と比較した、ＴＧＦβ１の阻害に対するＮ末端トランケーションの影響は、大きさにおいて中間であった。したがって、これら２つのバリアントは、ＧＤＦ１５が最も強力に阻害され、ＴＧＦβ３が最も弱く阻害され、ＴＧＦβ１が中間の程度まで阻害される、示差的リガンド阻害のプロファイルを示す。
Figure 2016528295
第３の実験では、本発明者らは、Ｃ末端がトランケートされたＴβＲＩＩ ＥＣＤにおけるＮ７０Ｄ置換の潜在力に対する影響を決定した。このアスパラギン酸残基は、潜在的グリコシル化部位を示す。以下の表に示すように、ＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）−Ｇ２Ｆｃは、ＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−Ｇ２Ｆｃと比較して、ＴＧＦβ１を阻害する大きく減退された能力およびＴＧＦβ３を阻害する事実上減退されていない能力を示した。ＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−Ｇ２Ｆｃおよび野生型の両方と比較した、ＧＤＦ１５の阻害に対するＮ７０Ｄ置換の影響は、大きさにおいて中間であった。したがって、Ｎ７０Ｄ置換を有するＣ末端がトランケートされたバリアントは、ＴＧＦβ３が最も強力に阻害され、ＴＧＦβ１が最も弱く阻害され、ＧＤＦ１５が中間の程度まで阻害される、示差的リガンド阻害のプロファイルを示す。
Figure 2016528295
合わせると、これらの結果は、出願人らが、大きく異なるリガンド結合プロファイルを示すＴβＲＩＩ ＥＣＤのトランケーションおよび変異を生成したことを実証している。特に、この実証は、適切に発現および精製されたＧＤＦ１５が、ＴβＲＩＩと直接相互作用し、ＴβＲＩＩ ＥＣＤのバリアントを含む融合タンパク質によって示差的に阻害され得ることを明らかにしている。これらのバリアントの活性プロファイルは、以下の表にまとめられ得る。
Figure 2016528295
本発明者らは、これらのＴβＲＩＩ短ＥＣＤバリアントのＴβＲＩＩ長ＥＣＤ対応物が、類似のリガンド選択性を示すことを予測する。さらに、Ｃ’Δ６トランケートされたＥＣＤ（例えば、それぞれ、ＴβＲＩＩ短およびＴβＲＩＩ長アイソフォームについて配列番号１１および１６）が、変異およびＮ末端トランケーションを導入するＴβＲＩＩ短またはＴβＲＩＩ長についての塩基配列として使用され得る。
（実施例５）
例示的なｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ核酸およびタンパク質
この実施例は、細胞培養物から単離されたタンパク質を提供するために、本明細書に提供される方法に従って、ＨＥＫ−２９３またはＣＨＯ細胞においてＴβＲＩＩ構築物を発現させるために使用され得る核酸構築物をまとめる。各場合において、細胞培養物から単離された成熟タンパク質は、リーダー配列（以下の各配列中の点線の下線）が除去されている。
項目１は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）−ｈＧ２Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。二重下線はＤ１１０Ｋ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目２は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）−ｈＧ２Ｆｃをコードするヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す。二重下線はＤ１１０Ｋ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目３は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）−ｈＧ１Ｆｃ短のアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。二重下線はＤ１１０Ｋ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目４は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）−ｈＧ１Ｆｃ短をコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。二重下線はＤ１１０Ｋ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目５は、ｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目６は、ｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃをコードするヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目７は、ｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）−ｈＧ１Ｆｃ短のアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目８は、ｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）−ｈＧ１Ｆｃ短をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目９は、ｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目１０は、ｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃをコードするヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目１１は、ｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）−ｈＧ１Ｆｃ短のアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目１２は、ｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）−ｈＧ１Ｆｃ短をコードするヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目１３は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−ｈＧ２Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目１４は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−ｈＧ２Ｆｃをコードするヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目１５は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−ｈＧ１Ｆｃ短のアミノ酸配列（配列番号３９）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目１６は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−ｈＧ１Ｆｃ短をコードするヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目１７は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）−ｈＧ２Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。二重下線はＮ７０Ｄ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目１８は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）−ｈＧ２Ｆｃをコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。二重下線はＮ７０Ｄ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目１９は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）−ｈＧ１Ｆｃ短のアミノ酸配列（配列番号４３）を示す。二重下線はＮ７０Ｄ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目２０は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）−ｈＧ１Ｆｃ短をコードするヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す。二重下線はＮ７０Ｄ置換を示す。点線の下線はリーダーを示し、実線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目２１は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）−ｈＧ２Ｆｃの成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号５３）を示す。二重下線はＤ１１０Ｋ置換を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目２２は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）−ｈＧ１Ｆｃ短の成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号５４）を示す。二重下線はＤ１１０Ｋ置換を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目２３は、ｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃの成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号５５）を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目２４は、ｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）−ｈＧ１Ｆｃ短の成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号５６）を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目２５は、ｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）−ｈＧ２Ｆｃの成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号５７）を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目２６は、ｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）−ｈＧ１Ｆｃ短の成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号５８）を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目２７は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−ｈＧ２Ｆｃの成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号５９）を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目２８は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）−ｈＧ１Ｆｃ短の成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号６０）を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
Figure 2016528295
項目２９は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）−ｈＧ２Ｆｃの成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号６１）を示す。二重下線はＮ７０Ｄ置換を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
項目３０は、ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）−ｈＧ１Ｆｃ短の成熟アミノ酸配列（即ち、リーダー配列なし）（配列番号６２）を示す。二重下線はＮ７０Ｄ置換を示す。一本線の下線はリンカーを示す。
Figure 2016528295
 参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることがあたかも具体的かつ個々に示されるかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
主題の具体的な実施形態が議論されてきたが、上記明細書は、例示的であって限定的ではない。多くのバリエーションが、本明細書および以下の特許請求の範囲の再検討により、当業者に明らかとなる。本発明の全範囲は、等価物のそれらの全範囲と共に特許請求の範囲を参照し、かかるバリエーションと共に明細書を参照することによって、決定されるべきである。

Claims (69)

  1. ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列と異種アミノ酸配列とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドであって、前記第１のアミノ酸配列が、
    ａ）配列番号５の２３位〜３５位のいずれかにおいて始まり配列番号５の１５３位〜１５９位のいずれかにおいて終わる配列、または
    ｂ）配列番号６の２３位〜６０位のいずれかにおいて始まり配列番号６の１７８位〜１８４位のいずれかにおいて終わる配列
    に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列からなるＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  2. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号５の２３位において始まり配列番号５の１５９位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  3. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号５の２９位において始まり配列番号５の１５９位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  4. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号５の３５位において始まり配列番号５の１５９位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  5. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号５の２３位において始まり配列番号５の１５３位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  6. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号５の２９位において始まり配列番号５の１５３位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  7. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号５の３５位において始まり配列番号５の１５３位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  8. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号６の２３位において始まり配列番号６の１８４位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  9. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号６の２９位において始まり配列番号６の１８４位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  10. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号６の２３位において始まり配列番号６の１７８位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  11. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号６の２９位において始まり配列番号６の１７８位において終わる配列からなる、請求項１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  12. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号４７の３６位に対応する位置におけるＤおよび／または配列番号４７の７６位に対応する位置におけるＫを有する配列からなる、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  13. 配列番号７もしくは配列番号１３の配列に対して少なくとも８０％同一な第１のアミノ酸配列またはその活性断片と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチドであって、前記第１のアミノ酸配列が、配列番号４７の３６位に対応する位置におけるＤおよび／または配列番号４７の７６位に対応する位置におけるＫを有する、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  14. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸１〜１２に対応する１〜１２アミノ酸または配列番号１３のアミノ酸１〜３７に対応する１〜３７アミノ酸のＮ末端トランケーションを含む、請求項１３に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  15. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号７または配列番号１３のアミノ酸１〜６に対応する６アミノ酸のＮ末端トランケーションを含む、請求項１３または１４に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  16. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸１〜１２に対応する１２アミノ酸または配列番号１３のアミノ酸１〜３７に対応する３７アミノ酸のＮ末端トランケーションを含む、請求項１３または１４に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  17. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸１３７〜１３２または配列番号１３のアミノ酸１６２〜１５７に対応する１〜６アミノ酸のＣ末端トランケーションを含む、請求項１３から１６のいずれか一項に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  18. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸１３２〜１３７または配列番号１３のアミノ酸１５７〜１６２に対応する６アミノ酸のＣ末端トランケーションを含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  19. 前記第１のアミノ酸配列が、配列番号４７の１１７位と１１８位に対応する残基の間に、配列番号１８に対応する挿入を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  20. 前記異種部分が、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうちの１または複数を増強する１または複数のポリペプチド部分を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  21. 前記異種部分が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンから選択されるポリペプチド部分を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  22. 前記免疫グロブリンＦｃドメインが、リンカーによって前記ＴβＲＩＩポリペプチドに接続されている、請求項２１に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  23. 前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１または複数の修飾されたアミノ酸残基を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  24. 前記ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項２３に記載のＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  25. 配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  26. 配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  27. 配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  28. 配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  29. 配列番号７〜１７および４７〜４９から選択されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部分からなる第１のアミノ酸配列と第２の異種部分とを含むＴβＲＩＩ融合ポリペプチド。
  30. 配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  31. 配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  32. 配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  33. 配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  34. 配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  35. 配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４から選択されるヌクレオチド配列の相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩポリペプチド。
  36. １×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＧＤＦ１５に結合する、請求項１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. ＣＨＯ細胞における前記ポリペプチドの発現に特徴的なグリコシル化パターンを有する、請求項１から３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  38. 請求項１から３７のいずれかに記載の２つのポリペプチドを含むホモダイマー。
  39. 請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドのコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  40. 請求項３９に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  41. 請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項４０に記載の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
  42. 哺乳動物細胞である、請求項４１に記載の細胞。
  43. ＣＨＯ細胞またはヒト細胞である、請求項４２に記載の細胞。
  44. 請求項１から３７のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項３８に記載のホモダイマーと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬調製物。
  45. ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに対する細胞の応答をモジュレートする方法であって、前記細胞を請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項３８に記載のホモダイマーに曝露するステップを含む方法。
  46. それを必要とする患者において、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと関連する疾患または状態を処置する方法であって、有効量の請求項１から３７のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項３８に記載のホモダイマーを前記患者に投与するステップを含む方法。
  47. 前記ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３またはＧＤＦ１５である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記疾患または状態が、がんである、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記がんが、胃がん、腸管がん、皮膚がん、乳房がん、黒色腫、骨がんおよび甲状腺がんから選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記疾患または状態が、線維性または硬化性の疾患または障害である、請求項４６または４７に記載の方法。
  51. 前記線維性または硬化性の疾患または障害が、強皮症、アテローム動脈硬化症、肝臓線維症、びまん性全身性硬化症、糸球体腎炎、神経瘢痕、皮膚瘢痕、放射線誘発線維症、肝線維症および骨髄線維症から選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記疾患または状態が心臓疾患である、請求項４６または４７に記載の方法。
  53. 前記疾患または状態が、遺伝性出血性末梢血管拡張症（ＨＨＴ）、マルファン症候群、ロイス・ディーツ症候群、家族性胸部大動脈瘤症候群、動脈蛇行症候群、子癇前症、アテローム動脈硬化症、再狭窄および肥大型心筋症／うっ血性心不全から選択される、請求項４６または４７に記載の方法。
  54. ＧＤＦ１５と結合し、ＧＤＦ１５とＴβＲＩＩとの相互作用を遮断する抗体またはその抗原結合性断片。
  55. タンパク質夾雑物に関して少なくとも９５％純粋である、配列番号１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５ポリペプチド、またはＴβＲＩＩに結合するその断片。
  56. タンパク質夾雑物に関して少なくとも９５％純粋である、配列番号１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５ポリペプチド、または請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドと結合するその断片。
  57. １０−８Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＴβＲＩＩに結合する、請求項５５に記載のＧＤＦ１５ポリペプチド。
  58. １０−８Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドと結合する、請求項５６に記載のＧＤＦ１５ポリペプチド。
  59. ＣＨＯ細胞における発現によって産生される、請求項５５から５８のいずれかに記載のＧＤＦ１５ポリペプチド。
  60. ＧＤＦ１５を含む試料を請求項１から３７のいずれかに記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、ＧＤＦ１５を濃縮または精製する方法。
  61. 配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  62. 配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
  63. 配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
  64. 配列番号５０のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
  65. 配列番号５０のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列からなる、請求項６１に記載のポリペプチド。
  66. 請求項６１から６５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
  67. 配列番号５１の核酸配列を含む核酸。
  68. 請求項６７に記載の核酸を哺乳動物細胞において発現させることによって産生されるポリペプチド。
  69. 前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である、請求項６８に記載のポリペプチド。
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