JP2022540571A - 変異したＴＧＦβ１－ＲＩＩ細胞外ドメインおよび免疫グロブリン足場で構成される抗腫瘍アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

本発明は、変異したＴＧＦ－β１－Ｒ１１細胞外ドメイン（変異したＥＣＤ）を含む第１のターゲティングドメインと、ならびにアミノ末端およびカルボキシ末端を有する免疫グロブリン足場を含む、抗腫瘍アンタゴニストに関し、ここで、一つまたは複数の変異は、当該抗腫瘍アンタゴニストのタンパク質加水分解による切断を減少させる。本明細書には、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストを使用して、増殖性障害、感染症、および免疫障害を治療する方法をさらに開示される。【選択図】 図２０

Description

本発明は、２０１９年７月１日に出願された米国仮出願６２／８６９１１１および２０１９年６月２８日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／３９９７９の優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

本発明は、概要的に癌治療に関し、特に腫瘍形成、腫瘍免疫および血管新生に関連する経路を調節することができる二重特異性阻害剤（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に関する。

宿主が癌細胞を排除できないのは、依然として主要な問題である。ますます多くの治療性モノクローナル抗体が様々な癌の治療に承認されるが、癌の増殖および転移に関与する異なる分子経路のために、これらの抗体に対する耐性が頻繁に観察される。免疫系は、癌予防の主要なメカニズムであるが、癌細胞は免疫監視（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に抵抗する。過剰なＴ細胞活性による二次的被害を回避するためにＴ細胞の活性化を制限する自然制御メカニズムが特定されている。腫瘍細胞は、このプロセスを使用して免疫応答を回避する。免疫エフェクター細胞（特にＴ細胞）が癌を認識して破壊する能力を回復することが、免疫治療の主要な目的である。

治療効果が増強された結合アンタゴニストまたは抗体、ならびに癌および慢性ウイルス感染症を治療するための当該タイプの試薬を使用する方法が必要である。

本発明の発明者らは、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ領域を有するアンタゴニストが時間の経過とともに許容されないレベルのタンパク質分解またはクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）を示すことを発見した。本発明の一態様は、ＴＧＦβ１に特異的に結合する第１のターゲティングドメインおよびＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２のターゲティングドメインを含む、抗腫瘍アンタゴニストに関し、ここで、当該第１のターゲティングドメインは、変異したＴＧＦ－β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（変異したＥＣＤ）を含み、当該変異ＥＣＤは、抗腫瘍アンタゴニストのタンパク質分解切断を大幅に減少させる。

本発明の別の一態様は、ＴＧＦβ経路阻害剤を含む第１のターゲティングドメインおよびＶＥＧＦに特異的に結合する第２のターゲティングドメインを含む、抗腫瘍アンタゴニストに関する。

本発明の別の態様は、個体の細胞増殖性障害（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を治療する方法に関する。前記方法は、当該治療を必要とする個体に有効量の本発明の抗腫瘍アンタゴニストを投与する段階を含む。

特定の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（抗ＰＤ－１ ｍａｂｓ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を示す。それに対応するフレームワーク領域（ＦＲ）配列シリーズは、図５３のＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１７６～２０５に示される。

抗ＰＤ－１抗体可変領域配列のいくつかの実施形態を示す。 抗ＰＤ－１抗体可変領域配列のいくつかの実施形態を示す。

特定の抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のＣＤＲ配列を示す。それに対応するＦＲ配列シリーズは、図５３のＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２０６～２２８に示される。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体可変領域配列のいくつかの実施形態を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１抗体可変領域配列のいくつかの実施形態を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１抗体可変領域配列のいくつかの実施形態を示す。

それぞれ（１）抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１可変領域、および（２）ＴＧＦ－β ＲＩＩ ＥＣＤ領域を含むＢｉ－ＰＢ－１、Ｂｉ－ＰＬＢ－１、Ｂｉ－ＰＢ－２およびＢｉ－ＰＬＢ－２の四つの異なる二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの構造を示す。

図５の二重特異性抗体に対応する例示的な機能的領域配列を示す。

図５で選択された二重特異性抗体に対応する例示的な重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の配列を示す。

それぞれ、それぞれ変異したＩｇＧ１（Ｋ４４７Ａ）足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）がそれぞれカルボキシ末端のＴＧＦ－β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むＢｉ－ＡＢ－１、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１およびＢｉ－ＺＢ－１等の三つの異なる二重特異性アンタゴニストを示す。Ｂｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１のどちらも、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ／ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のアミノ末端からの抗ＶＥＧＦ可変領域（ＶＨ１、ＶＬ１）を含み、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１は、ＶＨ領域には２個のアミノ酸置換（Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ）が含まれる。Ｂｉ－ＺＢ－１は、ＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｋ４４７Ａ）領域の上流にアミノ末端のアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）領域を含む。

図８に示された二重特異性アンタゴニストの様々な機能的領域配列を示す。 図８に示された二重特異性アンタゴニストの様々な機能的領域配列を示す。

図８に示された二重特異性アンタゴニストに対応する重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を示す。

図８に示された二重特異性アンタゴニストの機能的領域の配置を要約したものである。

クマシーブリリアントブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルであり、それは、非還元型ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、ＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトされた場合のＥ６ＱおよびＬ１１Ｖ変異を含む二重特異性抗体アンタゴニストＢｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１の発現レベルの増加を決定することを示す。

（図１３Ａ）Ｂｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）グラフを示す。 （図１３Ｂ）二量体（それぞれ９８．６％、９８．７％である）と比較して、タンパク質Ａによって精製されたＢｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１は、低レベルの高分子量（それぞれ１％、１％である）および低分子量（それぞれ０．４％、０．４％である）の種を示す。

非還元（図１４Ａ）および還元（図１４Ｂ）条件下で一過性に発現したＢｉ－ＺＢ－１のＰＡＧＥゲルを示す。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）グラフを示し、それは、二量体（９６．１％）と比較して、タンパク質Ａによって精製されたＢｉ－ＺＢ－１が、より低い低レベルの高分子量（ＨＭＷ、３．４％）および低分子量（ＬＭＷ、０．５％）の種を有することを示す。

細胞ベース試験（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）の結果を示し、ここで、段階希釈した二つの抗ＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１および抗体Ａ）が存在する状況下で、ｈｕＶＥＧＦ１６５を使用してＮＦＡＴ応答性要素の制御下でｈｕＶＥＧＦＲ２および蛍ルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現する組換えＨＥＫ－２９３細胞を刺激する。ルシフェラーゼを媒介した媒介蛍光量の減少を測定することによって生物学的活性を決定する。

Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１がＴＧＦ－β１およびＶＥＧＦ１６５に同時に結合するＥＬＩＳＡ分析を示し、ここで、ｈｕＴＧＦ－β１によってコーティングされた９６ウェルプレートを、段階希釈したサンプルＢｉ－Ａ１Ｂ－１、続いてビオチン化されたｈｕＶＥＧＦ１６５とともに培養することにより、ＴＭＢ基質を使用してストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）によって結合分子を検出する。

細胞ベース試験の結果を示し、ここで、ＳＭＡＤ応答性要素の制御下でヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ受容体および蛍ルシフェラーゼを発現する組換えＨＥＫ－２９３細胞を、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１、Ｂｉ－ＺＢ－１、および対照群の段階希釈の存在下でｈｕＴＧＦ－β１を使用して刺激し、当該Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１、Ｂｉ－ＺＢ－１、および対照群は、それぞれＴＧＦ－β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合を含む。ルシフェラーゼを媒介した蛍光量の減少によって生物学的活性を決定する。

薬物動態グラフであり、６～１０週齢の雌ＣＤ１マウスに尾静脈内注射した後の二重特異性アンタゴニストＢｉ－Ａ１Ｂ－１のインビボ半減期（Ｔ_１／２）を示す。注射後のいくつかの時点で血清中のＢｉ－Ａ１Ｂ－１アンタゴニストを採集し、ＥＬＩＳＡによって分析される。

二つの二重特異性抗腫瘍アンタゴニストＢｉ－ＰＢ－１．２（図２０Ａ）およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２（図２０Ｂ）を示し、そのそれぞれは、それぞれＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の可変領域領域からの抗体主鎖（ＩｇＧ４ Ｋ４４７ＡまたはＩｇＧ１ Ｋ４４７Ａ）をそれぞれ含み、さらに、各重鎖ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合したＴＧＦ－β－ＲＩＩ ＥＣＤを含む。

図２０Ａおよび２０Ｂに存在する二重特異性抗体の機能的領域配列を示す。

図２０Ａおよび２０Ｂに示された二重特異性アンタゴニストの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を示す。

図２０Ａおよび２０Ｂに示された二重特異性アンタゴニスト中の機能的領域の配置を要約する。

（図２４Ａ）ネイティブポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示し、それは、１μｇの親の対照抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、２Ｐ１７）と比較して、一過性発現システムにおけるＢｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２の発現を示す。 （図２４Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）グラフを示し、それは、タンパク質Ａによって精製されたＢｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２および抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子を示す。（図２４Ｃ）Ｂｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２および抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子が、二量体と比較して低レベルの高分子量（ＨＭＷ）および低分子量（ＬＭＷ）種を有することを示す。

Ｂｉ－ＰＢ－１．２（図２５Ａ）およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２（図２５Ｂ）の二量体、ＨＭＷおよびＬＭＷの形態が４℃下で少なくとも４週間良好な安定性を示したことを示す。

ＰＤ－１およびＴＧＦ－β１のＢｉ－ＰＢ－１．２への結合（それぞれ２６Ａ、２６Ｂである）、ならびにそれに対応する抗ＰＤ－１および抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子への結合（それぞれ２６Ｃ、２６Ｄである）の結果、ならびにそれらによって生成された結合親の定数を示す（２６Ｅ）。

ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－β１Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２への結合（それぞれ２７Ａ、２７Ｂである）、ならびにそれに対応する抗ＰＤＬ１および抗ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子への結合（２７Ｃ、２７Ｄ）の結果、およびそれらによって生成された結合親の定数（２７Ｅ）を示す。

（図２８）Ｂｉ－ＰＢ－１．２がＴＧＦ－β１およびＰＤ－１に同時に結合するＥＬＩＳＡ分析を示し、ここで、ＴＧＦ－β１によってコーティングされた９６ウェルプレートを、段階希釈したサンプルＢｉ－ＰＢ－１．２、続いてビオチン化されたｈｕＰＤ－１とともに培養することにより、ＴＭＢ基質を使用してストレプトアビジン－ＨＲＰによって結合分子を検出する。 （図２８Ｂ）Ｂｉ－ＰＢ－１．２がＴＧＦ－β１およびＰＤ－Ｌ１に同時に結合するＥＬＩＳＡ分析を示し、ここで、ＴＧＦ－β１によってコーティングされた９６ウェルプレートを、段階希釈したサンプルＢｉ－ＰＢ－１．２、続いてビオチン化されたｈｕＰＤ－１とともに培養することにより、ＴＭＢ基質を使用してストレプトアビジン－ＨＲＰによって結合分子を検出する。

（図２９Ａ）Ｂｉ－ＰＢ－１．２および抗ＰＤ－１ベンチマーク抗体が、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断する能力を示す。 （図２９Ｂ）細胞ベース試験の結果を示し、段階希釈したＢｉ－ＰＢ－１．２および抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子が、ＳＭＡＤ応答性要素制御下でＴＧＦ－β１活性化ルシフェラーゼ発現を遮断する能力を示す。ルシフェラーゼを媒介した蛍光量の減少によって生物学的活性を決定する。

抗ヒトＰＤ－１および抗蟹食猿ＰＤ－１の両方に対するＢｉ－ＰＢ－１．２とベンチマーク抗体の、ヒトＰＤ－１（図３０Ａ）および蟹食猿ＰＤ－１（図３０Ｂ）への結合、およびそれに対応するＥＣ_５０値を示し、当該ＥＣ_５０値は、ヒトＰＤ－１および蟹食猿ＰＤ－１に結合するために、それぞれベースラインおよび最大応答の間に半分の応答を生成する最大有効濃度（ＥＣ_５０）の半分を反映する。

（図３１Ａ）Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２および抗ＰＤ－Ｌ１ベンチマーク抗体がＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を遮断する能力を示す。 （図３１Ｂ）細胞ベース試験の結果を示し、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２および抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子の段階希釈が、ＳＭＡＤ応答性要素の制御下でＴＧＦ－β１活性化ルシフェラーゼ発現を遮断する能力を示す。ルシフェラーゼを媒介した蛍光量の減少によって生物学的活性を決定する。

抗ヒトＰＤ－Ｌ１および抗蟹食猿ＰＤ－Ｌ１の両方に対するＢｉ－ＰＬＢ－１．２とベンチマーク抗体のヒトＰＤ－Ｌ１（図３２Ａ）および蟹食猿ＰＤ－Ｌ１（図３２Ｂ）への結合、およびそれに対応するＥＣ_５０値を示し、当該ＥＣ_５０値は、ヒトＰＤ－Ｌ１および蟹食猿ＰＤ－Ｌ１に結合するために、それぞれベースラインおよび最大応答の間に版分の応答を生成する最大有効濃度（ＥＣ_５０）の半分を反映する。

（図３３Ａ～３３Ｂ）陰性対照群治療と比較して、Ｂｉ－ＰＢ－１．２を使用して、ヒトＰＢＭＣｓ（ドナー１、図３３Ａ、ドナー２、図３３Ｂ）のＩＦＮ－γ分泌を増加したことを示す。 （図３３Ｃ～３３Ｄ）陰性対照群治療と比較して、Ｂｉ－ＰＢ－１．２を使用して、ヒトＰＢＭＣｓ（ドナー１、図３３Ｃ、ドナー２、図３３Ｄ）のＩＬ－２分泌を増加したことを示す。

（図３４Ａ～３４Ｂ）親の抗ＰＤ－Ｌ１抗体および陰性対照群治療と比較して、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２を使用して、ヒトＰＢＭＣｓ（ドナー８、図３４Ａ、ドナー９、図３４Ｂ）のＩＦＮ－γ分泌を増加したことを示す。 （図３４Ｃ～３４Ｄ）親の抗ＰＤ－Ｌ１抗体および陰性対照群治療と比較して、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２を使用して、ヒトＰＢＭＣｓ（ドナー８、図３４Ｃ、ドナー９、図３４Ｄ）のＩＬ－２分泌を増加したことを示す。

６～１０週齢の雌ＣＤ１マウスに尾静脈内注射した後、Ｂｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２が、ベンチマーク抗体と比較して、改善された薬物動態グラフを示したことを示す。注射された後のいくつかの時点で血清中のＢｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２およびベンチマーク抗体アンタゴニストを採集し、ＥＬＩＳＡ（それぞれ図３５Ａ、３５Ｃ、３５Ｅである）およびウエスタンブロッティング法（それぞれ図３５Ｂ、３５Ｄ、３５Ｆである）によって分析する。

安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって生成されたＢｉ－ＰＢ－１．２を４℃で保存し、その低分子量（ＬＭＷ）種のパーセンテージは、時間とともに増加し、二量体種のパーセンテージは、時間とともに減少し、それは、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ）によって測定されたクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）の増加と一致する。

安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で発現した二重特異性アンタゴニスト（Ｂｉ－ＰＢ－１．２（ＰＤ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ）およびＰＬＢ－１ベンチマーク（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、ＢＭ）抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）グラフを示し、ＨＥＫ２９３一過性トランスフェクション細胞によって作られたＢｉ－ＰＢ－１．２を示し、当該メインピークの肩は、クリッピングの増加と一致する。

陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって得られたＢｉ－ＰＢ－１．２分画のＳＥＣグラフを示す。

質量分析によって決定されたフラグメントおよびクリッピングされたフラグメントを確認し、それは、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１およびＢｉ－ＰＢ－１．２が同様のクリッピング部位を有することを示す。

質量分析に基づいて、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１およびＢｉ－ＰＢ－１．２のそれぞれの重鎖アミノ酸配列のクリッピング部位を示す。

野生型ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤクリッピングの研究に使用される様々な変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を示す。 野生型ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤクリッピングの研究に使用される様々な変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を示す。 野生型ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤクリッピングの研究に使用される様々な変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を示す。

図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。 図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。 図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。 図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。 図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。 図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。 図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。 図４１Ａ～４１Ｃの変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図４６～５２に示されるようである。

図４１Ａおよび４１Ｃで選択された変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－ＰＬＢ－１．２重鎖配列を示す。これらの変異の分析は、以下の図５２に示されるようである。

以下の図４９、５０および５２で選択された変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－Ａ１Ｂ－１重鎖配列を示す。 以下の図４９、５０および５２で選択された変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－Ａ１Ｂ－１重鎖配列を示す。 以下の図４９、５０および５２で選択された変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－Ａ１Ｂ－１重鎖配列を示す。 以下の図４９、５０および５２で選択された変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列を含むＢｉ－Ａ１Ｂ－１重鎖配列を示す。

図４１Ａ～４１Ｃに示される変異ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列によってターゲティングされたアミノ酸を示す。

還元型ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示し、それは、安定したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）形質転換株からの分子のタンパク質Ａ－親の精製後、Ｂｉ－ＰＢ－１．２ ＴＧＦβ１ ＥＣＤ変異は、親の野生型Ｂｉ－ＰＢ－１．２と同様の発現レベルおよび収量を有することを示す。 還元型ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示し、それは、安定したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）形質転換株からの分子のタンパク質Ａ－親の精製後、Ｂｉ－ＰＢ－１．２ ＴＧＦβ１ ＥＣＤ変異は、親の野生型Ｂｉ－ＰＢ－１．２と同様の発現レベルおよび収量を有することを示す。 還元型ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示し、それは、安定したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）形質転換株からの分子のタンパク質Ａ－親の精製後、Ｂｉ－ＰＢ－１．２ ＴＧＦβ１ ＥＣＤ変異は、親の野生型Ｂｉ－ＰＢ－１．２と同様の発現レベルおよび収量を有することを示す。

Ｂｉ－ＰＢ－１．２および変異（Ｂｉ－ＰＢ－１．２－Δ７、Ｂｉ－ＰＢ－１．２Ｂ～Ｂｉ－ＰＢ－１．２Ｈ）に対応するＳＥＣグラフを示し、それは、Ｂｉ－ＰＢ－１．２と比較して、これらの変異のクリッピングが減少（肩なし）することを示す。 Ｂｉ－ＰＢ－１．２および変異（Ｂｉ－ＰＢ－１．２－Δ１５、およびＢｉ－ＰＢ－１．２－Δ２０）に対応するＳＥＣグラフを示し、それは、Ｂｉ－ＰＢ－１．２と比較して、これらの変異のクリッピングが減少（肩なし）することを示す。

図４７Ａ～４７ＢのＳＥＣグラフに反映された高分子量（ＨＭＷ）種、二量体、および低分子量（ＬＭＷ）種のパーセンテージを示す。

細胞ベース試験の結果を示し、それは、段階希釈されたＨＥＫ２９３の一過性トランスフェクションによって生成されたＢｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１の変異体および対照群（即ち、親のＢｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１およびＰＬＢ－ＢＭ（ベンチマーク）および陰性対照群抗体）がＳＭＡＤ応答性要素の制御下でＴＧＦ－β１活性化ルシフェラーゼ発現を遮断する能力を示す。ルシフェラーゼを媒介した蛍光量の減少によって生物学的活性を決定する。

Ｂｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１変異体と親の対照群とのＩＣ_５０を示し、それらが、ＳＭＡＤ応答性要素の制御下でＴＧＦ－β１活性化ルシフェラーゼ発現を遮断する能力を反映する。ルシフェラーゼを媒介した蛍光量の減少によって生物学的活性を決定する。

Ｂｉ－ＰＢ－１．２（図５１Ａ）、Ｂｉ－ＰＢ－１．２Ｃ（図５１Ｂ）およびＢｉ－ＰＢ－１．２Ｄ（図５１Ｃ）がペアのマウスで同様の薬物動態を示し、Ｔ_１／２が約５～８日であることを特徴とする。

還元型ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示し、それは、親の野生型Ｂｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１と比較して、Ｃ変異体由来のクリッピングされたフラグメントのレベルが減少することを示す。 還元型ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示し、それは、親の野生型Ｂｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１と比較して、Ｃ変異体由来のクリッピングされたフラグメントのレベルが減少することを示す。

図１および３の抗ＰＤ－１ ＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１７６～２０５）および抗ＰＤ－Ｌ１ ＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２０６～２２８）に対応するフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。

定義
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および化学的用語は、開示された方法および組成物の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。文脈上に明確にさらに指摘しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形態の「一（ａ、ａｎ）」および「当該（ｔｈｅ）」は、複数の形態を含むことに留意されたい。従って、例として、「ペプチド（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、「一つまたは複数の」ペプチドまたは「複数の」当該ペプチドを含む。本明細書の教示に関しては、本明細書に記載される任意の発行特許または特許出願公開は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。

本明細書で使用されるように、「ＰＤ－１」という用語は、ＰＤ－１およびその変異体の任意の形態を指し、ここで、当該変異体は、少なくとも一部のＰＤ－１活性を保持する。特に明記しない限り（例えば、ヒトＰＤ－１が指定される場合）、ＰＤ－１は、すべての哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマおよびウシ）の天然配列のＰＤ－１を含む。

本明細書で使用されるように、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ＰＤ－Ｌ１およびその変異体の任意の形態を指し、ここで、当該変異体は、少なくとも一部のＰＤ－Ｌ１活性を保持する。特に明記しない限り（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１のための特定の言及によって）、ＰＤ－Ｌ１は、すべての哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマおよびウシ）の天然配列のＰＤ－Ｌ１を含む。

「アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）」という用語は、他の分子の生物学的活性または効果を促進（即ち、誘導、誘発、向上、または増加）する物質を指す。アゴニストという用語は、受容体に結合する物質（例えば、抗体）、および受容体に結合しない状況下で受容体機能（例えば、関連タンパク質を活性化することによって）を促進する物質を含む。

「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、受容体またはリガンド等の他の分子の生物学的活性または効果を回避、遮断、阻害、中和、または減少する物質を指す。

本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、一つまたは複数の免疫グロブリン可変領域を介して抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体、抗原結合フラグメント、またはその一本鎖であることができる。「抗体」という用語は、生化学的に認識可能な多種多様なポリペプチド種を含む。当業者は、重鎖がα（ａｌｐｈａ）、δ（ｄｅｌｔａ）、ε（ｅｐｓｉｌｏｎ）、γ（ｇａｍｍａ）およびμ（ｍｕ）、ならびにそれらのいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４）に分類されることを理解している。この鎖の性質により、抗体の「クラス」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして決定される。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等の当該免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）は、十分に特徴付けられ、かつ特殊な機能を有することが知られている。本明細書を考慮して、これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾形態は、当業者には容易に認識可能であり、また本明細書の範囲内にある。免疫グロブリンのすべてのクラスは、本明細書の範囲内であり、以下の議論は、一般に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。

本発明の抗体または抗体アンタゴニストは、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、二重特異性、三重特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、ヒト、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）、キメラ、および一本鎖抗体を含むことができるが、これらに限定されない。本明細書で開示される抗体は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物源からのものであり得る。好ましくは、前記抗体は、ヒト、マウス、ラット、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であり得る。いくつかの実施形態において、前記可変領域は、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）のものであり得る。

「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨ領域を含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリー（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ）によって生成されたフラグメント、および抗特発性（ａｎｔｉ－Ｉｄ）抗体等の抗体の一部を指すために使用される。構造に関係なく、抗体フラグメントは、抗体全体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。「抗体フラグメント」という用語は、ＤＡＲＴｓおよびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。「抗体フラグメント」という用語は、任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質を含み、前記タンパク質は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより、抗体のように機能する免疫グロブリン可変領域を含む。「一本鎖フラグメント可変（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅまたはｓｃＦｖ）」とは、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質を指す。特定の態様において、前記可変領域は、１０～約２５個のアミノ酸の短い結合ペプチドに連結される。前記結合ペプチドは、柔軟性のためにグリシン、溶解性のためにセリンまたはスレオニンに富むことができ、また、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結することができ、または逆でも同じである。定常領域の除去および結合ペプチドの導入にもかかわらず、このタンパク質は、依然として元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）の二つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３０００～７００００ダルトンの二つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。当該四つのポリペプチド鎖は、通常、ジスルフィド結合によって「Ｙ」字型に結合され、ここで、軽鎖は、重鎖を囲み（ｂｒａｃｋｅｔ）、重鎖は、「Ｙ」の開口部から始まり、かつ可変領域まで延長する。

軽鎖および重鎖の両方は、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。「定常（ｃｏｎｓｔａｎｔ）」および「可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）」等の用語は、機能的に使用される。ここで、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の二つの部分が抗原の識別および特異性を決定することができる。逆に、軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ）、Ｆｃ受容体結合、補体結合等のような生物学的特性を付与する。慣例により、一般的な抗体において、定常領域ドメインが抗原結合部位または抗体のアミノ末端からさらに離れる場合、当該定常領域ドメインの番号が増加する。一般的な抗体において、Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は、定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬのドメインは、実際にそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。

上記のように、可変領域は、抗体が抗原エピトープを選択的に識別しかつ特異的に結合するようにする。つまり、抗体のＶＬ領域およびＶＨ領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが結合して、３次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体の構造は、Ｙの各アーム末端に存在する抗原結合部位を形成する。より特定的に、当該抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬのそれぞれの三つのＣＤＲ（即ち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）によって定義される。一部の例において、例えば、特定の免疫グロブリンは、ラクダ科の種に由来するか、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて設計される。または、免疫グロブリン分子は、軽鎖なしに重鎖のみからなるか、または重鎖なしに軽鎖のみからなる。

天然に存在する抗体において、各抗原結合領域に存在する六つのＣＤＲは短く、連続してないアミノ酸であり、抗体が水性環境でその３次元構造を示す場合、前記ＣＤＲは、特定の場所で抗原結合領域を形成する。「フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）」領域と呼ばれる抗原結合領域の残りのアミノ酸は、より少ない分子間変異性を表す。当該フレームワーク領域は、ほとんどにβ－シート（β－ｓｈｅｅｔ）構造を採用し、当該ＣＤＲは、当該β－シート構造を連結する環を形成し、また、当該環は、一部の状況下でβ－シート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有相互作用を通じてＣＤＲを正しい方法に位置付けるための足場として機能する。ＣＤＲ位置付けによって形成された抗原結合領域は、免疫応答性抗原エピトープに相補的な表面を定義する。この相補的な表面は、抗体の相同性のエピトープへの非共有結合を促進する。任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域についげは、それらが正確に定義されるため、当業者は、それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸を容易に同定することができる。

本明細書で使用されるように、「ＶＨ１」および「ＶＨ２」という用語は、二つの異なる結合特異性に対応する免疫グロブリン重鎖可変領域を指す。同様に、「ＶＬ１」および「ＶＬ２」は、二つの異なる結合特異性に対応する免疫グロブリン軽鎖可変領域を指す。一緒に使用される場合、ＶＨ１およびＶＬ１領域は、共通の結合特異性を定義し、ＶＨ２およびＶＬ２は、第２の結合特異性を定義することが理解される。

本明細書で使用される「フレームワーク領域（ＦＲ）」という用語は、ＣＤＲ残基以外の他の可変領域残基を指す。各可変領域は、通常、対応するＣＤＲｓに隣接する四つのＦＲｓを有する。例として、ＶＨ領域は、通常、三つのＨＣＤＲｓに隣接する四つのＨＦＲｓを有し、つまり、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４であり、その構成がＨＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＲ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＲ４である。類似的に、ＬＨ領域は、通常、三つのＬＣＤＲｓに隣接する四つのＬＦＲｓを有し、その構成がＬＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＲ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＲ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＲ４である。本明細書で説明されるアンタゴニストの例示的なＦＲｓは、図５３に要約される。

軽鎖は、Ｋ（ｋａｐｐａ）またはλ（ｌａｍｂｄａ）に分類される。様々な重鎖は、Ｋまたはλ軽鎖に結合されることができる。一般に、融合腫瘍細胞、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞が免疫グロブリンを生成する場合、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合し、二つの重鎖の「Ｆｃ」部分は、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに血尾久される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐端のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端に延長する。

本明細書で使用されるように、「軽鎖定常領域」または「ＣＬ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、かつ抗体の軽鎖から派生されるアミノ酸配列である。好ましくは、当該軽鎖定常領域は、少なくとも一つの定常Ｋ領域または定常λ領域を含む。

本明細書で使用されるように、「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖から派生されるアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、少なくともＣＨ１領域、ヒンジ領域（例えば、上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、またはその変異体またはフラグメントを含む。例として、本明細書で使用される抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１領域を含むポリペプチド鎖と、ＣＨ１領域、ヒンジ領域の少なくとも一部、およびＣＨ２領域を含むポリペプチド鎖と、ＣＨ１領域およびＣＨ３領域を含むポリペプチド鎖と、ＣＨ１領域、ヒンジ領域の少なくとも一部、およびＣＨ３領域を含むポリペプチド鎖と、またはＣＨ１領域、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むポリペプチド鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書のポリペプチドは、ＣＨ３領域を含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明に使用される抗体は、ＣＨ２領域の少なくとも一部（例えば、ＣＨ２領域の全部または一部）を欠くことができる。重鎖定常領域は、そのアミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子のものとは異なるように修飾されることができることが理解されるべきである。

例として、以下の本明細書に開示された内容に反映されるように、出願人は、ＣＨ３領域がＣＨ３領域のＦｃ環への大量の挿入（例えば、１００個のアミノ酸を超える）を許容または収容できることを発見した（例えば、図５ＢのＢｉ－ＰＢ－２、Ｂｉ－ＰＬＢ－２を参照する）。従って、本発明において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１５１～１５４に示される重鎖配列のＦｃ環へのＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ領域の挿入と同様の方法で、開示された任意の阻害剤領域をＦｃ環に挿入することができる。

本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、様々な免疫グロブリン分子から派生されることができる。例として、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子から派生されるＣＨ１領域およびＩｇＧ３分子から派生されるヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖定常領域は、一部がＩｇＧ１分子から派生され、一部がＩｇＧ３分子から派生されるヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖定常領域は、一部がＩｇＧ１分子から派生され、一部がＩｇＧ４分子から派生されるキメラヒンジ領域を含み得る。

「軽鎖－重鎖ペア（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ－ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｐａｉｒ）」とは、軽鎖のＣＬ領域および重鎖のＣＨ１領域との間のジスルフィド結合を介して二量体することができる軽鎖および重鎖のセットを指す。

様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および３次元配置は、知られている。本明細書で使用されるように、「ＶＨ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変領域を含み、「ＣＨ１領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。当該ＣＨ１領域は、ＶＨ領域に隣接し、かつ免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端である。

本明細書で使用されるように、「ＣＨ２領域」という用語は、重鎖分子の部分、例えば、従来の番号付けスキームを使用した抗体の約残基２４４から残基３６０まで延長する重鎖分子の部分（残基２４４～３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、残基２３１～３４０、ＥＵ番号付けシステム）を含む。ＣＨ２領域の特徴は、他の領域と密接にペアになっていないことである。完全な天然ＩｇＧ分子の二つのＣＨ２領域の間に二つのＮ－リンクされた分岐糖鎖を挿入する。ＣＨ３領域は、ＣＨ２領域からＩｇＧ分子のＣ末端まで延長し、約１０８個の残基を含む。

本明細書で使用されるように、「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、ＣＨ１領域およびＣＨ２領域に結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、かつ柔軟性を有するため、二つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することができる。ヒンジ領域は、上部ヒンジ領域、中間ヒンジ領域、および下部ヒンジ領域の三つの異なる領域に細分されることができる。

本明細書で使用されるように、「ジスルフィド結合」という用語は、二つの硫黄原子の間に形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、チオール基を含み、これは、ジスルフィド結合を形成するか、または２番目のチオール基に架橋することができる。天然に存在するほとんどのＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合によってリンクされ、二つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム２３９および２４２に対応する位置（ＥＵ番号付けシステムの２２６および２２９の位置）で二つのジスルフィド結合によってリンクされる。

本明細書で使用されるように、抗体、抗体フラグメントまたは抗体領域の「変異体」とは、（１）元の抗体、抗体フラグメントまたは抗体領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、および（２）元の抗体、抗体フラグメントまたは抗体領域に特異的に結合するのと同じ標的に特異的に結合する抗体、抗体フラグメントまたは抗体領域を指す。配列同一性の値が「少なくともｘ％同一する」または「少なくともｘ％の同一性」という句で表現される場合、当該実施形態は、当該下限値以上の任意のすべての整数パーセンテージを含むことを理解されたい。さらに、本明細書で現れたアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をさらに開示または含むと解釈されるべきであることを理解されたい。

本明細書で配列相同性範囲が現れる場合（例えば、「約８０％～約１００％」という句）、当該実施形態は、その範囲内の任意およびすべてのサブ範囲を含み、そのうちの下限値は、８０～１００の間の任意の整数であり得ることを理解されたい。

本明細書で使用されるように、「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という句は、非ヒト抗体、典型的にはマウスモノクローナル抗体から派生される抗体を指す。または、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体の抗原結合特性を保持するか、または実質的に保持するキメラ抗体から派生されることができるが、それがヒトに投与される場合、親の抗体と比較してより低い免疫原性を表す。

本明細書で使用されるように、「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という句は、免疫学的活性領域または部位が第１の種から得られるか、派生され、定常領域（本明細書に基づいて完全な、部分的なまたは修飾されたものであり得る）は、第２の種から得られる抗体を指す。特定の実施形態において、当該ターゲティングされた結合領域または部位は、ヒト以外の供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域は、ヒトに由来する。

本発明の多重特異性抗体の範囲は、非対称ＩｇＧ様抗体（例えば、ｔｒｉｏｍａｂ／ｑｕａｄｒｏｍａ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、クロス（Ｃｒｏｓｓ）ＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）、静電対抗体（ＡＭＧＥＮ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、鎖交換ドメイン（ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ、ＳＥＥＤ）抗体（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、Ｂｉｏｌｏｎｉｃ、Ｍｅｒｕｓ）、Ｆａｂ－交換抗体（Ｇｅｎｍａｂ）、対称ＩｇＧ様抗体（例えば、デュアルターゲティング（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、２－ｉｎ―１抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、架橋ＭＡｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－ｓｔａｒ）、Ｃｏｖ Ｘ－ｂｏｄｙ（Ｃｏｖ Ｘ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ダブルバリエーション領域（ＤＶＤ）－Ｉｇ融合体（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ様二重特異性抗体（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、ＢｓＡｂ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、ＴｖＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）、ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合体、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、デュアルアフィニティリターゲティング技術（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｃ－ＤＡＲＴ）、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、ビス（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂｓ（抗体薬物国家研究センター）、Ｆ（ａｂ）２融合体（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、デュアルアクションまたはＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ドックアンドロック（Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｆａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ｓｃＦｖ－およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）基質抗体（例えば、二重特異的Ｔ細胞エンゲージ抗体（ＢｉＴＥｓ、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ、Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＤＡＲＴｓ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、ＣＯＭＢＯＤＩＥＳ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、およびＩｇＧ／非ＩｇＧ融合体（例えば、免疫サイトカイン（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ、ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）を含む、様々な組成物および方法を含む。

「によって特異的に結合する」または「…に対して特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合領域を介してエピトープに結合することを表し、当該結合は、抗体結合領域とエピトープとの間にあるある程度の相補性が必要である。この定義に基づいて、抗体がランダムで無関係なエピトープよりも抗原結合領域を介してあるエピトープに容易に結合する場合、それは、当該エピトープに「特異的に結合する」と表現される。「特異性」という用語は、本明細書において、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対的な親和性を定義するために使用される。例として、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも特定のエピトープに対してより高い特異性を有すると見なされることができるか、または抗体「Ａ」が関連するエピトープ「Ｄ」へのより高い結合を有するエピトープ「Ｃ」への結合として説明されることができる。いくつかの実施形態において、抗体または抗体フラグメントが抗原と１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する複合体を形成する場合、抗体または抗体フラグメントは、「抗原に対して特異性を有する」。

「免疫チェックポイント調節剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）」という句は、免疫チェックポイントを介してシグナルを阻害または刺激する機能的なクラスの薬剤を指す。「免疫チェックポイント調節剤」は、細胞表面受容体およびそれに関連するリガンドを含み、一緒になって、Ｔ細胞活性化関連シグナル経路を阻害または刺激する手段を提供する。細胞表面受容体の免疫チェックポイント調節剤は、一般に、免疫応答を阻害するチェックポイントシグナル経路を誘導するＴＮＦ受容体またはＢ７スーパーファミリー（Ｂ７ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）メンバーであり、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＴＬＡ－４、およびそのそれぞれのリガンドを含むがこれらに限定されない負の共刺激分子（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に結合する薬剤を含む。

「免疫チェックポイント調節剤アンタゴニスト」、「免疫チェックポイント結合アンタゴニスト」および「免疫チェックポイントアンタゴニスト」という句は、本明細書で交換可能に使用され、かつ免疫チェックポイント調節剤の活性を妨害（または阻害）する薬剤のクラスを指すため、それがチェックポイント調節剤またはそのリガンドに結合する結果としては、チェックポイント調節剤受容体を介したシグナル伝達を遮断または阻害する。このシグナル伝達を阻害することにより、免疫抑制を逆転させて、抗腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫効果を再確立または増強することができる。例示的な免疫チェックポイントアンタゴニストは、ＰＤ－１およびそのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２、ＴＩＧＩＴおよびそのＣＤ１５５リガンド、ＰＶＲ、ならびに、肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）およびガレクチン－３、ＣＴＬＡ－４およびそのリガンド、Ｂ７－１およびＢ７－２、ＴＩＭ－３およびそのリガンド、ガレクチン－９、ＣＤ１２２およびそのＣＤ１２２Ｒリガンド、ＣＤ７０、Ｂ７Ｈ３、ＢおよびＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、およびＶＩＳＴＡを含むＬＡＧ－３およびそのリガンドを含むが、これらに限定されない。免疫チェックポイント調節剤アンタゴニストは、抗体フラグメント、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチドおよび小分子薬物が、単離された形態で、または融合タンパク質あるいはコンジュゲートの一部として含むことができる。

「免疫チェックポイント結合アゴニスト」および「免疫チェックポイントアゴニスト」は、本明細書で交換可能に使用され、かつ免疫チェックポイント調節剤を刺激する薬剤のクラスであるため、チェックポイント調節剤またはそのリガンドへの結合の結果としては、チェックポイント調節剤受容体を介したシグナルが刺激される。このシグナルを刺激することにより、抗腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫効果は、再確立または増強することができる。例示的な免疫チェックポイント調節剤アゴニストは、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、糖質コルチコイドＴＮＦＲファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびそのリガンド等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーを含むが、これらに限定されない。他のチェックポイント調節剤アゴニストは、ＣＤ２８およびＩＣＯＳを含むＢ７－ＣＤ２８スーパーファミリーに属している。免疫チェックポイント調節剤は、抗体フラグメント、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、小分子薬物を、単離されるか、または融合タンパク質または複合体の一部として含むことができる。

「アンタゴニスト抗体」という用語は、標的に結合し、かつ当該標的の生物学的効果を防止または減少する抗体を指す。特定の実施形態において、当該用語は、それが結合するターゲティング（例えば、ＰＤ－１）の生物学的機能を防止する抗体を指すことができる。

本明細書で使用されるように、「抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体」とは、ＰＤ－１生物学的活性および／またはＰＤ－１によって媒介される下流のイベントを阻害することができる抗体を指す。抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ－１結合および下流シグナル、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞活性化の阻害、ＩＦＮ分泌の阻害、ＩＬ－２分泌の阻害、ＴＮＦ分泌の阻害、ＩＬ－１０の誘導、ならびに抗腫瘍免疫応答の阻害等、ＰＤ－１によって媒介される下流イベントを含む、ＰＤ－１生物学的活性の遮断、拮抗、阻害または減少（任意のレベルまで、顕著にを含む）を含む。本発明の目的のために、「抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体」という用語は（用語「アンタゴニストＰＤ－１抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体」、または「ＰＤ－１アンタゴニスト抗体」と交換可能）は、前述で確認された用語、タイトル、および機能状態と特性、さらにＰＤ－１自体、ＰＤ－１生物学的活性、または当該生物学的活性を意味のある程度で実質的に排除、低減、または中和する任意の結果を含むことを明確に理解する必要がある。特定の実施形態において、抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ－１に結合し、かつ抗腫瘍免疫応答をアップレギュレートする。

本明細書で使用されるように、「抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体」とは、ＰＤ－１生物学的活性および／またはＰＤ－Ｌ１によって媒介される下流のイベントを阻害することができる抗体を指す。抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ－Ｌ１結合および下流シグナル、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞活性化の阻害、ＩＦＮ分泌の阻害、ＩＬ－２分泌の阻害、ＴＮＦ分泌の阻害、ＩＬ－１０の誘導、ならびに抗腫瘍免疫応答の阻害等、ＰＤ－Ｌ１によって媒介される下流イベントを含む、ＰＤ－Ｌ１生物学的活性の遮断、拮抗、阻害または減少（任意のレベルまで、顕著にを含む）を含む。本発明の目的のために、「抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体」という用語は（用語「アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、または「ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体」と交換可能）は、前述で確認された用語、タイトル、および機能状態と特性、さらにＰＤ－Ｌ１自体、ＰＤ－Ｌ１生物学的活性、または当該生物学的活性を意味のある程度で実質的に排除、低減、または中和する任意の結果を含むことを明確に理解する必要がある。当該抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体は、設計により、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ抗腫瘍免疫応答をアップレギュレートする。

「ドミナントネガティブタンパク質（ｄｏｍｉｎａｎｔ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ドミナントネガティブペプチド（ｄｏｍｉｎａｎｔ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）」という句は、一般に変異および／または欠失によって修飾された野生型タンパク質から派生されるタンパク質またはペプチドを指すため、当該修飾されたタンパク質またはペプチドは、それから派生される内因性野生型タンパク質の機能を妨害する。

「ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト」という句は、ＶＥＧＦ－Ａまたはその受容体、ＶＥＧＦＲ－２に結合する機能的なクラスの薬剤を指すため、結合の結果は、ＶＥＧＦ－ＡによるＶＥＧＦＲ－２活性化を遮断または阻害する。本明細書で使用されるように、「ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト」という用語は、抗体フラグメント、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチドおよび小分子薬物を、単離された形態で、または融合タンパク質あるいはコンジュゲートの一部として含む。

「Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニスト」という句は、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体またはそのリガンドの一つに結合する機能的なクラスの薬剤を指すため、結合した後、そのリガンドの一つまたは複数（即ち、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）によるＴｉｅ２チロシンキナーゼ受容体活性化を遮断または阻害する。本明細書で使用されるように、「Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニスト」という用語は、抗体フラグメント、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチドおよび小分子薬物を、単離された形態で、または融合タンパク質あるいは複合体の一部として含む。

「そのうちの一つまたは複数の変異が抗腫瘍アンタゴニストのタンパク質の切断を減少させる」という用語は、野生型ＥＣＤを含む他の同一のアンタゴニストとの関連で解釈されるべきである。

「小分子薬物」という句は、薬学的活性を有し、かつ分子量が約２ｋＤａ未満、約１ｋＤａ未満、約９００Ｄａ未満、約８００Ｄａ未満または約７００Ｄａ未満である、一般に有機または有機金属の非ポリマーの分子実体を指す。小ペプチドまたは核酸類似体は、小分子薬物と見なすことができるが、当該句は、タンパク質または核酸以外の「薬物」として知られているほとんどの医薬品化合物を含む。例としては、化学療法抗腫瘍薬物および酵素阻害剤を含む。小分子薬物は、合成的、半合成的（即ち、天然に存在する前駆体に由来する）または生物学的に得ることができる。

各領域間でハイフンで配置されたポリペプチド領域（例えば、ＣＨ２～ＣＨ３）を説明する場合、リストされた領域の順序は、アミノ末端からカルボキシ末端までであることを理解されたい。

「免疫コンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」という用語は、共有結合によって阻害性ペプチドまたは小分子薬物に融合する抗体を指す。当該ペプチドまたは小分子薬物は、定常重鎖のＣ末端または可変軽鎖および／または重鎖のＮ末端にリンクすることができる。

「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」は、ペプチドまたは小分子薬物（例えば、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ））を安定した共有の方式で抗腫瘍アンタゴニストにリンクするために使用されることができる。化合物または抗体が活性化されたままである条件下で、リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド結合性切断の影響を受けやすいか、または実質的に影響を受けない可能性がある。適切な結合ペプチドは、当技術分野で知られており、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基を含む。本明細書で説明され、かつ当技術分野で知られるように、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、荷電リンカー、およびその親の水形態を含む。当該免疫コンジュゲートは、抗腫瘍アンタゴニストとペプチドおよび／または小分子薬物との間に柔軟な３～１５アミノ酸ペプチド（またはスペーサー）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、結合ペプチドは、３、４、５、６、７または８個が重複されたＧＧＧＧＳを含む。いくつかの実施形態において、結合ペプチドは、３または４個が重複されたＧＧＧＧＳからなる。

本明細書で使用されるように、「足場」という用語は、アンタゴニスト機能を支持するために必要な特性を示す任意のアミノ酸ポリマーを指し、前記機能は、抗体の特異性の増加、抗体機能の増強または抗体の構造および安定性の支持を含む。足場は、ドナーポリペプチドの結合領域で移植されて、当該足場へのドナーポリペプチドの結合特異性を与えることができる。

本明細書で使用されるように、「多重特異性阻害剤」という句は、異なる結合特異性を有する少なくとも二つのターゲティングドメインを含む分子を指す。いくつかの実施形態において、当該多重特異性阻害剤は、足場および異なる抗原またはエピトープの免疫グロブリンの抗原結合領域をターゲティングする二つまたは複数のポリペプチドを含む。特定の実施形態において、当該多重特異性阻害剤は、二重特異性抗体またはアンタゴニストである。他の実施形態において、当該多重特異性阻害剤は、三重特異性抗体またはアンタゴニストである。

本明細書で使用されるように、「二重特異性」という句は、異なる結合特異性を有する少なくとも二つのターゲティングドメインを含む分子を指す。各ターゲティングドメインは、標的分子に特異的に結合し、標的分子に結合した後、当該標的分子の生物学的機能を阻害することができる。いくつかの実施形態において、当該二重特異性チェックポイント調節剤アンタゴニストは、二つまたは複数のペプチドを含む高分子分子である。いくつかの実施形態において、当該ターゲティングドメインは、抗体の抗原結合領域またはＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、当該二重特異性阻害剤は、二重特異性抗体である。

「二重特異性抗体」および「二重特異性アンタゴニスト」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、二つの異なる抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、当該二重特異性抗体は、以下についての完全長抗体：その二つの結合アームの一つ（一つのペアのＨＣ／ＬＣ）で抗原（またはエピトープ）に結合し、その２番目の結合アーム（異なるペアのＨＣ／ＬＣ）で異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。これらの実施形態において、当該二重特異性抗体は、二つの（特異性およびＣＤＲ配列の両方で）異なる抗原結合アームを有し、かつそれらがリンクされた各抗原に対して一価である。

他の実施形態において、当該二重特異性抗体は、それぞれの結合アーム（二つのペアのＨＣ／ＬＣ）で二つの異なる抗原（またはエピトープ）に結合する完全長抗体である。これらの実施形態において、当該二重特異性抗体は、二つの同一の抗原結合アーム（同じ特異性および同一のＣＤＲ配列）を有し、それらが、リンクされた各抗原は二価である。

例示的な二重特異性抗体は、非対称ＩｇＧ様抗体（例えば、ｔｒｉｏｍａｂ／ｑｕａｄｒｏｍａ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ノブイントゥホール抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、クロスＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）、静電対抗体（ＡＭＧＥＮ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、鎖交換ドメイン（ＳＥＥＤ）抗体（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、ｂｉｏｌｏｎｉｃ、Ｍｅｒｕｓ）、Ｆａｂ－交換抗体（Ｇｅｎｍａｂ）、対称ＩｇＧ様抗体（例えば、デュアルターゲティング（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、２－ｉｎ―１抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、架橋ＭＡｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－ｓｔａｒ）、Ｃｏｖ Ｘ－ｂｏｄｙ（Ｃｏｖ Ｘ／Ｐｆｉｚｅｒ）、二重可変領域（ＤＶＤ）－Ｉｇ融合体（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ様二重特異性抗体（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、ＢｓＡｂ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、ＴｖＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）、ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合体、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、デュアルアフィニティリターゲティング技術（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、ビス（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂｓ（抗体薬物国家研究センター）、Ｆ（ａｂ）２融合体（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、デュアルアクションまたはＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ドックアンドロック（ＤＮＬ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｆａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ｓｃＦｖ－およびダイアボディ－基質抗体（例えば、二重特異的Ｔ細胞エンゲージ抗体（ＢｉＴＥｓ、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ、Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＤＡＲＴｓ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖抗体、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、ＣＯＭＢＯＤＩＥＳ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ならびにＩｇＧ／非ＩｇＧ融合体（例えば、免疫サイトカイン（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ、ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）を含むことができる。

「治療（ｔｒｅａｔおよびｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、一つまたは複数の細胞増殖性障害関連症状を改善すること、一つまたは複数の細胞増殖性障害症状の発症を予防または遅延させること、および／または一つまたは複数の細胞増殖性障害症状の重症度または頻度を低下させることを指す。

「必要とする患者（ｔｏ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ）」、「治療を必要とする患者（ｔｏ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療を必要とする個体（ａ ｓｕｂｊｅｃｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という句は、細胞増殖性障害の治療のための本明細書の抗腫瘍アンタゴニストの投与から利益を得るである個体（例えば、哺乳類個体）を含む。

「治療有効量」、「薬理学的有効量」、および「生理学的有効量」という用語は、交換可能に使用され、血流またはターゲティング組織において閾値程度の活性アンタゴニストを提供するために必要な抗腫瘍アンタゴニストの含有量を表す。正確な含有量は、多くの要因（例えば、具体的な活性剤、組成物の成分および物理的特性、予期された患者集団、患者の注意事項等）に依存し、本明細書で提供される情報または関連文献で利用可能な他の情報に基づいて、当業者によって容易に当該正確な含有量を決定することができる。

本明細書で使用される「改善」、「増加」または「減少」という用語は、ベンチマークに対して測定された値またはパラメーターを指し、ベンチマーク値は、例えば、本明細書に記載の治療を開始する前に同じ個人で測定されるか、または本明細書に記載の治療がない場合に一つの対照の個体（または複数の対照個体）で測定される。

「対照の個体（ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」は、治療された個体と同じ細胞増殖性障害に苦しんでいる個体であり、治療された個体とほぼ同じ年齢である（治療を受けた個体と対照の個体の疾患の病期が同等であることを確認する）。当該治療された個体（「患者」または「被験者」とも呼ばれる）は、細胞増殖性障害を罹患する胎児、乳児、子供、青年または成人であり得る。

「細胞増殖性障害（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、細胞の異常な増殖を特徴とする障害症を指す。増殖性障害は、細胞増殖の速度に関連する制限を意味するのではなく、増殖と細胞分裂に影響を与える正常な制御の喪失を意味するだけである。従って、いくつかの実施形態において、増殖性障害の細胞は、正常な細胞の同じ細胞分裂速度を示す可能性があるが、当該増殖を制限するシグナルには反応しない。新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）、癌（ｃａｎｃｅｒ）または腫瘍（ｔｕｍｏｒ）は、「細胞増殖性障害」の範囲内にある。

「癌」または「腫瘍」という用語は、細胞増殖を特徴とする様々な悪性新生物のいずれかを指し、その特徴は、周囲の組織に侵入し、および／または新しいコロニー形成部位（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）に転移する能力を有し、白血病、リンパ腫、悪性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫、肉腫、胚細胞腫瘍および芽細胞腫を含む。本明細書の方法によって治療される例示的な癌は、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、頭頚部がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、中皮腫、卵巣がん、前立腺がん、胃がんおよび子宮がん、白血病、ならびに髄芽腫を含む。

「白血病」という用語は、造血器官の進行性悪性疾患を指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびその前駆体の異常な増殖および発達を特徴とする。例示的な白血病は、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、白血球性白血病、非白血病性白血病、好塩基性細胞白血病、幹細胞性白血病（ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ウシ白血病、慢性骨髄細胞性白血病、皮膚白血病、胚性白血病、好酸性細胞白血病、グロス白血病（Ｇｒｏｓｓ’ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、毛細胞性白血病、血球性白血病、血球細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ球性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ球性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ様白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、微小骨髄球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄球性白血病、骨髄様骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病（Ｎａｅｇｅｌｉ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞性白血病（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞性白血病（ｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病（Ｒｉｅｄｅｒｃｅｌ ｌｌｅｕｋｅｍｉａ）、シリング白血病（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ’ｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、亜白血病性白血病（ｓｕｂｌｅｕｋｅｍｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、および未分化細胞性白血病を含む。

「悪性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」という用語は、周囲の組織に浸潤して転移する傾向がある上皮細胞の悪性増殖を指す。例示的な悪性腫瘍は、例えば、腺嚢胞がん（ａｃｉｎａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢胞状がん（ａｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢性がん（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢性がん（ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質がん、肺胞がん、肺胞細胞がん、基底細胞がん（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、基底細胞様がん（ｂａｓａｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底扁平上皮がん、気管支肺胞がん（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、気管支がん、気管支原性がん、脳様がん（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝内胆管細胞がん（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛膜がん（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、コロイドがん（ｃｏｌｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、面皰がん（ｃｏｍｅｄｏ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、コーパスがん（ｃｏｒｐｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クリブリフォームがん（ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、鎧状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｎｃｕｉｒａｓｓｅ）、皮膚がん、円柱状細胞がん（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、円柱状細胞がん（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳管がん、硬膜がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｕｒｕｍ）、胚性がん（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、脳様がん（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、表皮がん（ｅｐｉｅｎｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮腺がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖性がん（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍性がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｘ ｕｌｃｅｒｅ）、線維がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、膠様がん（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ゼラチン状がん（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨大細胞がん、巨細胞がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺がん（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞腫（ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛母細胞がん（ｈａｉｒ－ｍａｔｒｉｘ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血行性がん（ｈｅｍａｔｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞がん、ハースレ細胞がん（Ｈｕｒｔｈｌｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硝子がん（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎下垂体がん（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳児肺がん（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ｉｎｓｉｔｕがん、表皮内がん（ｉｎｔｒａｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内がん（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒがん（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ細胞がん（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ－ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞がん（ｌａｒｇｅ－ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンチキュラーがん（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンチキュラーがん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性がん（ｌｉｐｏｍａｔｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ上皮がん（ｌｙｍｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、脳様がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、脳様がん（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液性腫瘍（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘膜細胞性がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘膜類表皮腫瘍（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性腫瘍（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫状がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽頭がん（ｎａｓｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、オート麦細胞がん（ｏａｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、骨化がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨化がん（ｏｓｔｅｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状がん（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、門脈周囲がん（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前浸潤がん（ｐｒｅｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、棘細胞がん（ｐｒｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、多発性がん（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓の腎細胞がん、予備細胞がん（ｒｅｓｅｒｖｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、癌肉腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓａｒｃｏｍａｔｏｄｅｓ）、シュナイダーがん（ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬性がん（ｓｃｉｒｒｈｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、陰嚢がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｃｒｏｔｉ）、シグネットリング細胞がん（ｓｉｇｎｅｔ－ｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、単純がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｉｍｐｌｅｘ）、小細胞がん、ソラノイドがん（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞がん、紡錘細胞がん、海綿状がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｍ）、扁平上皮がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮がん、ひもがん（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮がん（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結核がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、塊茎がん（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣贅性がん（ｖｅｒｒｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、および絨毛癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｌｌｏｓｕｍ）を含む。

「肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）」という用語は、胚性結合組織に類似した物質で構成される腫瘍を指し、一般に、繊維状または均質な材料に埋め込まれた緊密に覆いた細胞で構成される。例示的な肉腫は、例えば、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメチ肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、肺胞状軟組織肉腫（ａｌｖｅｏｌａｒ ｓｏｆｔ ｐａｒｔ ｓａｒｃｏｍａ）、アメロブラストイド肉腫、ブドウ肉腫、クロロマ肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛膜がん、胚性肉腫（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、ウィルンズ腫瘍肉腫（Ｗｉｌｎｓ’ ｔｕｍｏｒｓａｒｃｏｍａ）、子宮内膜肉腫（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、間質性肉腫（ｓｔｒｏｍａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、ユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、筋膜肉腫（ｆａｓｃｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、線維芽細胞性肉腫、巨細胞肉腫、肉芽腫性肉腫、ホジキン肉腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、特発性多色素性出血性肉腫（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、Ｂ細胞免疫芽球性肉腫（ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ）、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、Ｔ細胞免疫芽球性肉腫（ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌｓ）、ジェンセン肉腫（Ｊｅｎｓｅｎ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、カポジ肉腫（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、クプファー細胞肉腫（Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ ｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、白血病性肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性間葉腫肉腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏｍａ ｓａｒｃｏｍａ）、傍骨肉腫（ｐａｒｏｓｔｅａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、網状細胞性肉腫（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、Ｒｏｕｓ肉腫、血清嚢胞性肉腫（ｓｅｒｏｃｙｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫および毛細血管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）を含む。

「黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）」という用語は、皮膚または他の器官のメラノサイト系から生じる腫瘍を指す。黒色腫は、例えば、アクラ‐レンチジナス黒色腫（ａｃｒａｌ－ｌｅｎｔｉｇｉｎｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）、メラニン欠乏性黒色腫（ａｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ）、良性若年性黒色腫（ｂｅｎｉｇｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｅｌａｎｏｍａ）、クラウドマン黒色腫（Ｃｌｏｕｄｍａｎ’ｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｓ９１黒色腫、ハーディング‐パッシー黒色腫（Ｈａｒｄｉｎｇ－Ｐａｓｓｅｙ ｍｅｌａｎｏｍａ）、若年性黒色腫（ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｅｌａｎｏｍａ）、黒子悪性黒色腫（ｌｅｎｔｉｇｏ ｍａｌｉｇｎａ ｍｅｌａｎｏｍａ）、悪性黒色腫、結節性黒色腫（ｎｏｄｕｌａｒ ｍｅｌａｎｏｍａ）、爪下黒色腫（ｓｕｂｕｎｇａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ）および表在性拡大黒色腫（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ）を含む。

他の癌は、例えば、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、肺がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃がん、結腸がん、悪性膵臓インスリン腫、悪性カルシノイド、前がん状態の皮膚病変、精巣がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮頸がん、子宮内膜がんおよび副腎皮質がんを含む。
Ｉ．ＴＧＦ－β経路をターゲティングする二重特異性アンタゴニスト

ＴＧＦ－βは、Ｔ制御性細胞を誘導および維持し、かつ自然免疫細胞および獲得性免疫細胞（例えば、ＮＫ、ＤＣおよびＴ細胞）を直接阻害することにより、免疫抑制を媒介する主要なサイトカインと見なされる。ＴＧＦ－βは、血管新生および腫瘍血管の安定化にも作用し、細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）および浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を引き起こす上皮から間葉への形質転換によって腫瘍に直接影響を受ける。血管新生の有効な誘導剤として、ＴＧＦ－β１は、固形腫瘍に対して重要な支持システムを提供し、腫瘍細胞の播種に重要な役割を果たす。従って、ＴＧＦ－β状態は、様々な癌における抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１耐性および全生存率の有力な予測指標である。

多くの細胞は、ＴＧＦ－βを合成し、かつそのほぼすべての細胞は、これらのペプチドに対して特定の受容体を有する。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３は、すべて同じ受容体シグナルシステムを介して機能を発揮する。ＴＧＦ－βの活性形態は、二量体であり、付加されたヘテロ四量体を形成することによってシグナルを伝達し、当該ヘテロ四量体は、それぞれセリンスレオニン１型受容体および２型受容体（ＴＧＦ－β ＲＩおよびＴＧＦβ ＲＩＩ）で構成される。近年、ＴＧＦ－β経路の阻害剤は、例えば、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むドミナントネガティブ融合タンパク質フラグメント等、ＴＧＦ－β１またはＴＧＦ－β１ ＲＩＩに直接対する抗体または結合フラグメントの形態で開発される。

しかしながら、これらの結合試薬を開発する際に、本発明の発明者らは、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ領域を有するアンタゴニストが、時間の経過とともに許容できないレベルのタンパク質分解またはクリッピングを示すことを発見した。この問題を解決するために、この領域内のクリッピングを減少するＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ変異の変異体が開発される。本明細書でさらに説明されるように、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤｓを他のチェックポイント調節剤経路または血管新生経路をターゲティングする他の結合剤と合併して、時間の経過とともにタンパク質分解またはクリッピング程度が顕著に減少した二重特異性アンタゴニストを生成する。

一態様において、本発明は、ＴＧＦβ経路およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント調節剤経路を阻害する、二重特異性アンタゴニストを提供する。

別の態様において、本発明は、ＴＧＦβ経路、および血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）経路、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＦＧＲ）、または同時に両方を阻害する、二重特異性アンタゴニストを提供する。
Ａ．ＴＧＦ－βおよびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路をターゲティングする二重特異性アンタゴニスト

いくつかの実施形態において、当該二重特異性アンタゴニストは、ＴＧＦ－β経路を特異的に阻害する第１のターゲティングドメインおよびＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２のターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態において、当該第１のターゲティングドメインは、ＴＧＦ－β経路阻害剤を含む。
ＴＧＦ－β経路阻害剤

ＴＧＦ－β経路は、多くの細胞クラスにおける細胞の増殖および分化、移動および付着、細胞外マトリックスの修飾（腫瘍マトリックスおよび免疫抑制）、血管新生および結合組織の増殖、アポトーシス、ならびに他の機能を制御するペプチドの多機能グループを含む。ＴＧＦ－βは、Ｔ制御性細胞を誘導および維持し、自然免疫細胞および獲得性免疫細胞（例えば、ＮＫ、ＤＣおよびＴ細胞）を直接阻害することによって、免疫抑制を媒介する主要なサイトカインであると考えられる。ＴＧＦ－βは、血管新生および腫瘍血管の安定化、また細胞の移動および浸潤を引き起こす上皮間葉の形質転換を介して腫瘍に直接影響を及ぼす。血管新生の有効な誘導剤として、ＴＧＦ－β１は、固形腫瘍に対して重要な支持システムを提供し、腫瘍細胞の播種に重要な役割を果たす。

ＴＧＦ－β状態は、様々な癌における抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１耐性および全生存率の有力な予測指標である。例として、高いＴＧＦ－β１レベルは、転移性尿路上皮がん患者のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１阻害に対する反応不良と関連し（Ｎａｔｕｒｅ（２０１８）５５４（７６９３）：５４４－５４８）、高ＴＧＦβの特徴は、３３の異なる種類の癌の予後不良と関連する（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１８）４８：８１２－８３０）。ＴＧＦβを阻害する同時に抗ＰＤ／ＰＤ－Ｌ１がＣＤ８エフェクター細胞をさらに放出して、腫瘍細胞を殺し、他の細胞クラスを刺激して腫瘍殺傷能力を増加させることができる。

多くの細胞がＴＧＦ－βを合成し、ほぼすべての細胞がこれらのペプチドに対して特定の受容体を有する。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３は、すべて同じ受容体シグナルシステムを介して機能を発揮する。ＴＧＦ－βの活性形態は、付加されたヘテロ四量体を形成することによってシグナルを伝達する、二量体であり、当該ヘテロ四量体は、それぞれセリンスレオニン１型および第２型受容体（ＴＧＦ－β ＲＩおよびＴＧＦβ ＲＩＩ）で構成される。

本明細書で使用されるように、ＴＧＦ－β経路阻害剤は、例えば、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むドミナントネガティブ融合タンパク質フラグメント等、ＴＧＦ－β１またはＴＧＦ－β１ ＲＩＩに直接対した抗体または結合フラグメントの形態であり得る。
ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤおよび変異体

いくつかの実施形態において、前記ＴＧＦ－β経路阻害剤は、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む。例示的なヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ（野生型）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９に示されるようなアミノ酸配列を有する。本発明の発明者らは、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ領域を有するアンタゴニストが、保存時に、実施例９のように、時間の経過とともに許容できないレベルのタンパク質分解またはクリッピングを発見した。従って、いくつかの実施形態において、本発明のＴＧＦ－β経路阻害剤は、タンパク質の分解またはクリッピングを低減する一つまたは複数の修飾を含む、ヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤの変異体（以下、「ＴＧＦＢＲ変異体」と呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態において、当該修飾は、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、または前述の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の部位６、７、１３、１６、１７、２０、２２、および／または２３に一つまたは複数の置換変異を含む。いくつかの実施形態において、当該一つまたは複数の置換変異は、極性または疎水性アミノ酸残基を使用して、非極性アミノ酸残基を置換することである。

いくつかの実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、野生型ヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態において、当該一つまたは複数の欠失は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基１～２０を含む領域を指し、そのうちの任意の残基を含むことができる。さらに特定の実施形態において、当該一つまたは複数の欠失は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基１～７、１～１２、１～１３、１～１５、１～２０、７～１２、７～１３、７～１５、７～２０、８～２０、９～２０、１０～２０、１１～２０、１２～２０、１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０および／または１７～２０の欠失を含む。さらに特定の実施形態において、当該一つまたは複数の欠失は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基６、７、１２、１３、１５、１６、１７、または２０を含む。

いくつかの実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基１～２０領域における一つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基６、７、１３、１６、１７、２０、２２、および／または２３の一つまたは複数の置換を含む。いくつかの実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基１～７の欠失、ならびに（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基１３、１６、１７、２０、２２、および２３のアミノ酸置換、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基１６および１７の二つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、一つまたは複数の極性アミノ酸残基を使用して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基６、７、１３、１６、１７、２０、２２および／または２３のうちの一つまたは複数を置換する。いくつかの実施形態において、一つまたは複数の疎水性アミノ酸残基を使用して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸残基６、７、１３、１６、１７、２０、２２および／または２３のうちの一つまたは複数を置換する。

いくつかの実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１１４～１２３および２５１～２７０（図４１Ａ～４１Ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、免疫グロブリン重鎖を含み、当該免疫グロブリン重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２４～１３３、１４８、１５０、および２７１－２９０（図４２Ａ～４２Ｈ、４４Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

他の実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、免疫グロブリン重鎖を含み、当該免疫グロブリン重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３（図４３）のアミノ酸配列を含む。

他の実施形態において、当該ＴＧＦＢＲ変異体は、免疫グロブリン重鎖を含み、当該免疫グロブリン重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２９１－３０２（図４４Ａ～４４Ｄ）のアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載されるＴＧＦＢＲ変異体が免疫グロブリン重鎖を含むかどうか、かつ当該免疫グロブリン重鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２４～１３３、１４５、１４７、１４８、１５０および２７１～３０３（本明細書における「特定のアミノ酸配列」）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかどうかに関係なく、当該実施形態は、それから派生されるすべての重鎖配列と組み合わせた他の重鎖の実施形態を意味するとさらに解釈されるべきであることを理解されたく、ここで、一つまたは複数の既存の抗ＰＤ－１アミノ酸配列（図１に示されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む）、または一つまたは複数の既存の抗ＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列（図３に示されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む）置換は、「特定のアミノ酸配列」に存在する既存の抗ＰＤ１ ＣＤＲ配列または抗ＰＤ－Ｌ１ ＣＤＲ配列を置き換える。

類似的に、前述の段落に関しては、前述ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２４～１３３、１４５、１４７、１４８、１５０および２７１～３０３に示される重鎖と対になっていると記載される任意の免疫グロブリン軽鎖は、それから派生されるすべての軽鎖配列と組み合わせた他の軽鎖の実施形態を表すと解釈されるべきであり、ここで、一つまたは複数の既存の抗ＰＤ－１アミノ酸配列（図１に示されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む）、または一つまたは複数の既存の抗ＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列（図３に示されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む）置換は、「特定のアミノ酸配列」に存在する既存の抗ＰＤ１ ＣＤＲ配列または抗ＰＤ－Ｌ１ ＣＤＲ配列を置き換える。

同様に、本明細書に記載されるＴＧＦＢＲ変異体が免疫グロブリン重鎖を含むかどうか、かつ当該免疫グロブリン重鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２４～１３３、１４５、１４７、１４８、１５０および２７１～３０３（本明細書における「特定のアミノ酸配列」）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかどうかに関係なく、当該実施形態は、それから派生されるすべての軽鎖配列と組み合わせた他の重鎖の実施形態を意味するとさらに解釈されるべきであることを理解されたく、ここで、当該「特定のアミノ酸配列」において、既存の抗ＰＤ１重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列で異なる抗ＰＤ１ ＨＣＶＲを置き換え、当該抗ＰＤ１ ＨＣＶＲは、図２Ａ～２Ｂに示されるようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２９、３１、３３、３５、３７および３９からなる群から選択され、またはここで、当該「特定のアミノ酸配列」において、既存の抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＶＲアミノ酸配列で異なる抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＶＲを置き換え、当該抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＶＲは、図４Ａ～４Ｃに示されるようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および８６からなる群から選択される。

類似的に、前述の段落に関しては、「特定のアミノ酸配列」において前述の重鎖と対になっていると記載される任意の免疫グロブリン軽鎖は、それから派生されるすべての軽鎖配列と組み合わせた他の軽鎖の実施形態を表すと解釈されるべきであり、ここで、「特定のアミノ酸配列」において、既存の抗ＰＤ１軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列は、異なる抗ＰＤ１ ＬＣＶＲを置き換え、当該抗ＰＤ１ ＬＣＶＲは、図２Ａ～２Ｂに示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３０、３２、３４、３６、３８および４０からなる群から選択され、またはここで、「特定のアミノ酸配列」において、既存の抗ＰＤ－Ｌ１ ＬＣＶＲアミノ酸配列は、異なる抗ＰＤ－Ｌ１ ＬＣＶＲを置き換え、当該抗ＰＤ－Ｌ１ ＬＣＶＲは、図４Ａ～４Ｃに示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および８７からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ＴＧＦ－β経路阻害剤は、例えば、図５Ａ～５Ｂ、８Ａ～８Ｃおよび２０Ａ～２０Ｂに示されるように、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストにおけるＩｇＧのカルボキシ末端に融合させる。代替的に、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤは、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストにおけるＩｇＧのアミノ末端に融合させることができる。さらに別の実施形態において、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤを、例えば図５Ｂに示されるように、ＩｇＧのＩｇＧ Ｆｃ受容体（即ち、ＣＨ２またはＣＨ３領域）内に挿入する。

いくつかの実施形態において、抗ＴＧＦ－β１、抗ＴＧＦ－β１ ＲＩＩまたはその可変領域フラグメントは、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤの代わりに使用されることができる。例示的な抗ＴＧＦ－β１抗体は、米国特許第７０６７６３７号、７４９４６５１号、７５２７７９１号、および７６１９０６９号に記載されるようである。例示的な抗ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ抗体は、米国特許７５７９１８６号に記載されるようである。代替的に、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤは、一つまたは複数の抗ＴＧＦ－β１および／または抗ＴＧＦ－β１ ＲＩＩペプチド阻害剤を使用して置換することができる。例示的なＴＧＦ－β１ペプチド阻害剤は、ＫＲＩＷＦＩＰＲＳＳＷＹＥＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５）である。

抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－１抗体フラグメント
いくつかの実施形態において、二重特異性ＴＧＦβ経路アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－１阻害剤は、抗体、またはその抗原結合部分であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１、４、７、９、および１２からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖の相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １、ＣＤＲ１）配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２、５、１０、および１３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３、６、８、１１、および１４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１５、１８、２１－２３、および２６からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１６、１９、２４、および２７からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１７、２０、２５、および２８からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。

別の実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－１阻害剤（例えば、第２のターゲティングドメイン）は、抗体、またはその抗原結合部分であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１、４、７、９、および１２からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２、５、１０、および１３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３、６、 ８、１１、および１４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１５、１８、２１－２３、および２６からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１６、１９、２４、および２７からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１７、２０、２５、および２８からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。

別の実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２９、３１、３３、３５、３７、および３９からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３０、３２、３４、３６、３８、および４０からなる群から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または前述の両方を含む。

別の実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２９、３１、３３、３５、３７、および３９からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３０、３２、３４、３６、３８、および４０からなる群から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列、または前述の両方を含む。

一実施形態において、前記ＰＤ－１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のＨＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＨＣＶＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＬＣＶＲ、または前述の両方を含む。

別の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のＨＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＨＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＨＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＨＦＲ３、与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＨＦＲ４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を有し、また、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＬＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＬＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＬＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の同一性を有するＬＦＲ４を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を有する。

別の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－１阻害剤を含む。より特定の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－１阻害剤を含む。

別の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－１阻害剤を含む。より特定の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－１阻害剤を含む。別の実施形態において、ＰＤ－１／ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、図５Ｂに示されるように、ＣＨ３環内に挿入されたＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む。

一実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－１阻害剤を含む。より特定の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－１阻害剤を含む。

他のＰＤ－１ターゲティングされたアンタゴニストは、例えば、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＰＤＩＶＯ^商標）、ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）ｍＡｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＫ－３４７５、ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ^商標）、ヒト化された免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）ｍＡｂ（Ｍｅｒｃｋ）、ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＴ－０１１）（Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、およびＡＭＰ－２２４（Ｍｅｒｃｋ）等の抗ＰＤ－１抗体を含む。抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ^商標（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１－１４）およびＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販される。抗ＰＤ－１ターゲティング抗腫瘍アンタゴニストは、図１～２に示されるものを含む、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ－１抗体から派生される任意のＨＣＶＲｓ、ＬＣＶＲｓ、および／またはＣＤＲｓを含むことができる。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体フラグメント
いくつかの実施形態において、二重特異性ＴＧＦ－β１経路アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗体フラグメントをさらに含む。一実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４１、４４、５０、および５３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４２、４５、４７、４９、５１、および ５４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４３、４６、４８、５２、および５５からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５６、５９、６３、６６、および６９からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５７、６０、６４、６７、および７０からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５８、６１、６２、６５、６８、および７１からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、抗体、またはその抗原結合部分である。

別の実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、第２のターゲティングドメイン）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４１、４４、５０、および５３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４２、４５、４７、４９、５１、および ５４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４３、４６、４８、５２、および５５からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５６、５９、６３、６６、および６９からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５７、６０、６４、６７、および７０からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５８、６１、６２、６５、６８、および７１からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、抗体、またはその抗原結合部分である。

別の実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、および８６からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、および８７からなる群から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリンＬＣＶＲ、または前述の両方を含む。別の実施形態において、本発明に使用されるＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、および８６からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、および８７からなる群から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列、または前述の両方を含む。

一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のＨＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＨＣＶＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７のＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＬＣＶＲ、または前述の両方を含む。より特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲ、または前述の両方を含む。

別の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。より特定の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。

別の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、図５Ｂに示されるように、ＣＨ３環内に挿入されたＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む。

特定の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。より特定の実施形態において、ＴＧＦ－β１抗腫瘍アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方を含む、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。

他の抗ＰＤ－Ｌ１ターゲティングされたアンタゴニストは、例えば、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、完全ヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、完全ヒトＩｇＧ４ ｍＡｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）（ＭＥＤＩ４７３６、Ｉｍｆｉｎｚｉ）、ヒトＩｇＧ１抗体（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、およびアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（Ｍｅｒｃｋ、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）等の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。抗ＰＤ－Ｌ１ターゲティングされた抗腫瘍アンタゴニストは、図３～４に示されるものを含む、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ－Ｌ１抗体から派生される任意のＨＣＶＲｓ、ＬＣＶＲｓ、および／またはＣＤＲｓを含むことができる。

Ｂ．ＴＧＦ－β１および血管新生経路をターゲティングする二重特異性アンタゴニスト
別の態様において、本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ１ ＲＩＩに特異的に結合する第１のターゲティングドメイン、およびＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ｔｉｅ２Ｒ、または前述の組み合わせに特異的に結合する第２のターゲティングドメインを含む。これらの実施形態において、上記の任意のＴＧＦβ１－またはＴＧＦβ１ ＲＩＩ結合フラグメントは、当該第２のターゲティングドメインと合併して使用することができる。

血管新生経路
血管新生（既存の血管からの新しい血管の発達）は、腫瘍の増殖および移動に必要である。血管新生の阻害は、疾患（例えば、癌）の治療のための潜在的に価値のある策略であり、ここで、疾患の経過（例えば、転移）は、血管新生に依存する。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死を引き起こし、これは、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に供給することができる。血管新生経路阻害剤は、例えば、抗体、可変領域フラグメント、またはドミナントネガティブ融合タンパク質フラグメントの形態であり得る。

１．ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ経路
主要なＶＥＧＦ経路は、膜貫通型チロシンキナーゼＶＥＧＦ Ｒ２によって媒介される。ＶＥＧＦの様々なアイソフォーム（特にＶＥＧＦ－Ａ）はＶＥＧＦ－Ｒ２に結合して、様々な下流のチロシンキナーゼによるリン酸化作用によって二量体化および活性化することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のアンタゴニストは、ＶＥＧＦ－Ａまたはその受容体のＶＥＧＦＲ－２に結合するＶＥＧＦ経路アンタゴニストを含み、従って、結合した後、ＶＥＧＦ－ＡによるＶＥＧＦＲ－２活性化を遮断または阻害する。

一実施形態において、ＴＧＦβ経路アンタゴニストは、ヒトＶＥＧＦ受容体１または２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するドミナントネガティブＶＥＧＦＲアンタゴニストの形態のＶＥＧＦ経路アンタゴニストをさらに含む。特定の実施形態において、前記ＴＧＦβ経路アンタゴニストは、ＶＥＧＦ－Ａ結合領域の組換え融合タンパク質を含むアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）（Ｚａｌｔｒａｐとも呼ばれる）を含み、当該組換え融合タンパク質は、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分との融合体である。ＶＥＧＦＲ ＥＣＤｓ（例えば、アフリベルセプト）は、ＶＥＧＦ－Ａの可溶性受容体デコイとして機能する。

一実施形態において、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦβ経路阻害剤を含む第１のターゲティングドメイン、およびＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する第２のターゲティングドメインを含み、ここで、当該第２のターゲティングドメインは、アフリベルセプトを含む。アフリベルセプトの適切な供給源は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８に示されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、修飾された免疫グロブリン重鎖を含み、当該修飾された免疫グロブリン重鎖は、図８Ｃに示されるようなアミノ末端アフリベルセプト領域を含み、そのカルボキシ末端は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４ Ｆｃ受容体（Ｂｉ－ＺＢ－１）鎖を介してＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤまたはＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ変異体に結合する。一実施形態において、修飾された免疫グロブリン重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５のアミノ酸配列を有する。代替的に、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤまたはＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ変異体は、アミノ末端に位置付けられることができ、アフリベルセプト領域は、カルボキシ末端に位置付けられることができる。

別の実施形態において、ＴＧＦβ経路アンタゴニストは、ＶＥＧＦ経路アンタゴニストをさらに含み、当該ＶＥＧＦ経路アンタゴニストは、抗ＶＥＧＦＡまたは抗ＶＥＧＦＲ２可変領域配列、例えばベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）から派生されるモノを含む。ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ^商標）は、ヒトＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ－２への結合を遮断するヒトＩｇＧ１フレームワーク領域（ＦＲｓ）およびマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域を含む、ヒト化抗体である。約９３％のベバシズマブアミノ酸配列（ほとんどのフレームワーク領域を含む）は、ヒトＩｇＧ１から派生され、約７％の配列は、マウス抗体Ａ４．６．１から派生される。ベバシズマブは、約１４９０００ダルトンの分子量を有し、かつグリコシル化される。一実施形態において、本発明に使用されるベバシズマブＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に示されるようなアミノ酸配列を有し、ベバシズマブＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示されるようなアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、米国特許第７５７５８９３号に記載されるようなベバシズマブ／アバスチン抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸置換を含み得る。例示的なアミノ酸置換は、Ｅ１Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｑ１３Ｋ、Ｌ１８Ｖ、Ｒ１９Ｋ、Ａ２３Ｋ、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明に使用されるベバシズマブの変異ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６に示されるようなアミノ酸配列を有し、これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のＬＣＶＲとカップリングすることができる。

一実施形態において、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ（または抗ＴＧＦβ１または抗ＴＧＦβ１ ＲＩＩ可変領域を含む）等のＴＧＦβ１に特異的に結合する第１のターゲティングドメインと、およびベバシズマブまたは他の任意の抗ＶＥＧＦまたは抗ＶＥＧＦＲ２抗体、その可変領域フラグメント、またはその機能的活性変異フラグメント等のＶＥＧＦＡまたはＶＥＧＦＲ２に特異的に結合する第２のターゲティングドメインとを含む。

特定の実施形態において、二重特異性抗腫瘍ＴＧＦ－β／ＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲ２アンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方、例えば、野生型ベバシズマブ可変領域配列を含むＢｉ－ＡＢ－１（図８Ａ）を含む。

別の実施形態において、二重特異性抗腫瘍ＴＧＦ－βアンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、または前述の両方、例えば、変異したベバシズマブ可変領域配列を含むＢｉ－Ａ１Ｂ－１（図８Ｂ）を含む。

他の抗ＶＥＧＦまたは抗ＶＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントは、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、商標名はＬｕｃｅｎｔｉｓ^商標である）、ベバシズマブと同じ親のマウス抗体から派生されたモノクローナル抗体フラグメント、米国特許公開番号第２００６／０２８０７４７、２００７／０１４１０６５、および／または２００７／００２０２６７号に記載されたＧ６またはＢ２０シリーズ抗体（例えば、Ｇ６－２３、Ｇ６－３１、Ｂ２０－４．１）、米国特許第７２９７３３４、７０６０２６９、６８８４８７９、６５８２９５９、６７０３０２０、６０５４２９７号に記載された抗体、ならびに米国特許公開番号第２００７／０５９３１２、２００６／００９３６０、２００５／０１８６２０８、２００３／０２０６８９９、２００３／０１９０３１７および２００３／０２０３４０９号に記載された抗体に基づくことができる。

例示的な抗ＶＥＧＦＲ－２抗体アンタゴニストは、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）であり、これは、ＶＥＧＦＲ－２の細胞外ドメインに結合することにより、ＶＥＧＦ－Ａとの相互作用を遮断する。他の抗ＶＥＧＦＲ－２抗体は、米国特許第７４９８４１４、６４４８０７７、および６３６５１５７号に記載される。

いくつかの実施形態において、抗腫瘍アンタゴニストは、例えば、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、セディラニブ（ｃｅｄｉｒａｎｉｂ）、パゾンパニブ（ｐａｚｏｎｐａｎｉｂ）およびニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）を含むＶＥＧＦＲ－２のマルチキナーゼ阻害剤等の、一つまたは複数のＶＥＧＦ経路の小分子アンタゴニストをさらに含むことができる。
２．Ａｎｇ－Ｔｉｅ２Ｒ経路

いくつかの実施形態において、二重特異性アンタゴニストは、少なくとも一つのＴｉｅ２受容体結合アンタゴニストを含むターゲティングドメインを含む。Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニストは、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体またはそのリガンドの一つ（即ち、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）に結合し、従って、結合した後、一つまたは複数のリガンドを介したＴｉｅ２チロシンキナーゼ受容体の活性化を遮断または阻害する。ＶＥＧＦと同様に、アンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）は、腫瘍の血管新生において重要な役割を果たす。ＡＮＧ２およびＶＥＧＦは一緒に作用して、樹状細胞およびマクロファージによる抗原提示作用を防止し、Ｔ_ｒｅｇ凝集を増強し、Ｔ_ｅｆｆ凝集を阻害する。ＶＥＧＦおよびＡｎｇ２の阻害は、マウス乳がんモデルＴｇ ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴの生存率を改善することが以前に示されている。また、抗ＰＤ－１の添加により、反応をさらに改善することができる。

本発明に使用されるＴｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニストは、抗体フラグメント、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチドおよび小分子薬物が単離された形態で、または融合タンパク質またはコンジュゲートの一部として含むことができる。一実施形態において、Ｔｉｅ２受容体結合アンタゴニストは、トレバナニブ（ｔｒｅｂａｎａｎｉｂ）、ＴＢＮ－Ｐに由来する阻害性ペプチドである。特定の実施形態において、当該阻害性ペプチドは、ＡＱＱＥＥＣＥＷＤＰＷＴＣＥＨＭＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨＱＥＥＣＥＷＤＰＷＴＣＥＨＭＬＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、アンタゴニストに結合するＴｉｅ２受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８（ＴＢＮ－Ｐ－ＩｇＧ）を含む。

本発明に使用されるＴｉｅ２活性化を阻害する他のペプチド阻害剤（Ａｎｇ－２阻害剤を含む）は、アミノ酸配列：ＥＴＦＬＳＴＮＫＬＥＮＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７）、ＣＶＸ－０６０ペプチド：ＱＫ（Ａｃ）ＹＱＰＬＤＥＫ（Ａｃ）ＤＫ（０Ｐ）ＴＬＹＤＱＦＭＬＱＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＶＸ－０３７ペプチド：（ＤＦＢ）ＴＮＦＭＰＭＤＤＬＥＫ（０Ｐ）ＲＬＹＥＱＦＩＬＱＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９，Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＣＧＥＮ－２５０１７（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）を含むＡ－１１（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）を含む。Ｔｉｅ２活性化を阻害する他のペプチド阻害剤は、米国特許第７１３８３７０号に記載される。

本発明に使用されるＴｉｅ２活性化（および／またはアンジオポエチン－２）を阻害する抗体阻害剤は、ＡＭＧ－７８０（Ａｍｇｅｎ）、ＭＥＤＩ－３６１７（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＤＸ－２２４０（Ｄｙａｘ／Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＲＥＧＮ－９１０（Ｓａｎｏｆｉ／Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＲＧ７５９４（Ｒｏｃｈｅ）、ＬＣ０６（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＡｖｉ６（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＴ－００６（Ｒｏｃｈｅ／Ａｆｆｉｔｅｃｈ）を含む。他のＴｉｅ２受容体結合抗体アンタゴニストおよびその抗体結合配列は、米国特許第７５２１０５３、７６５８９２４および８０３００２５号、ならびに米国特許公開第２０１３／００７８２４８、２０１３／０２５９８５９および２０１５／０１９７５７８号に記載される。

本発明に使用されるＴｉｅ２結合アンタゴニストは、ＣＧＩ－１８４２（ＣＧＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＬＰ－５９０（Ｌｏｃｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＣＴＢ－１００３（Ａｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ ＡＧ）、 ＣＥＰ－１１９８１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ／Ｔｅｖａ）、ＭＧＣＤ２６５（Ｍｅｔｈｙｌｇｅｎｅ）、 Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ（Ｂａｙｅｒ）、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ／ＸＬ－１８４／ＢＭＳ－９０７３５１（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、Ｆｏｒｅｔｎｉｂ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＭＧＣＤ－２６５（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ Ｉｎｃ．）の小分子阻害剤をさらに含むことができる。

いくつかの特定の実施形態において、二重特異性チェックポイント調節剤アンタゴニストは、二つの結合アームの一つ（ＨＣ／ＬＣのペア）でヒトＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、２番目の結合アーム（異なるＨＣ／ＬＣのペア）で異なる抗原（またはエピトープ）に結合する完全長抗体である。これらの実施形態において、二重特異性抗体は、二つの異なる抗原結合アーム（両方とも特異性およびＣＤＲ配列を有する）を有し、かつそれがリンクされる各抗原はすべて一価である。

いくつかの実施形態において、当該二重特異性チェックポイント調節剤アンタゴニストは、二つの結合アーム（ＨＣ／ＬＣのペア）でそれぞれヒトＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に結合する完全長抗体である。これらの実施形態において、当該二重特異性チェックポイント調節剤アンタゴニストは、二つの同一の抗原結合アーム（同一の特異性および同一のＣＤＲ配列を有する）を有し、それがリンクされる各抗原はすべて二価である。

免疫グロブリンおよび非免疫グロブリン足場
本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、本明細書に説明されるような免疫グロブリン足場または非免疫グロブリン足場を使用して構築することができる。いくつかの実施形態において、本発明的二重特異性アンタゴニストは、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４足場の免疫グロブリン足場を使用して構築する。抗体依存性細胞を媒介できる細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）の抗原提示細胞に標的が存在する場合、癌の治療にはＩｇＧ１足場の使用が好ましい。単独の抗原結合で望ましい治療効果を生み出すのに十分な場合、ＩｇＧ４足場の使用は、抗原をターゲティングすることができる。ＩｇＧ４アンタゴニストは、ＦｃγＲ結合および補体活性化を含むＩｇＧ１抗体に関連する不良エフェクター機能を防止する。

好ましくは、第１および第２のターゲティングドメインは、ヒト化ＩｇＧ１またはＩｇＧ４足場に存在する。また、当該第２のターゲティングドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４足場のカルボキシ末端に融合させることができる。さらに、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４足場は、Ｎ２９７ＡまたはＫ４４７Ａのアミノ酸置換を有することができる。いくつかの実施形態において、当該第１のターゲティングドメインは、一つまたは複数のフレームワーク領域を含むことができ、当該フレームワーク領域は、Ｅ１Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｑ１３Ｋ、Ｌ１８Ｖ、Ｒ１９Ｋ、Ａ２３Ｋ、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される一つまたは複数アミノ酸置換を含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４足場の一つまたは複数のアミノ酸残基が脱グリコシル化または変異されて、非グリコシル化変異体が生成される。本明細書に記載の二重特異性分子の例示的な免疫グロブリン足場は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１５９～１６６および１７３～１７５からなる群から選択されることができる。

当該抗体またはアンタゴニストのいずれも、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、または多重特異性抗体の形態として構築される。さらに、本明細書に記載の抗体アンタゴニストのいずれも、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、アンジオポエチンおよび／またはＴｉｅ２Ｒをターゲティングする複数の結合特異性を含むことができる。また、抗体アンタゴニストのいずれは、特定の標的で複数のエピトープをターゲティングするように設計されることができる。および、いくつかの実施形態において、当該チェックポイントアンタゴニストおよび／または血管新生特異性は、例えば受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対応する、ドミナントネガティブ融合タンパク質の形態に含まれることができる。

本明細書に記載のＨＣＶＲｓおよびＬＣＶＲｓは、天然に存在するＦｃ領域、または非エフェクター（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ／Ｇ）またはほとんどの非エフェクターＦｃ（例えば、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４）等の非天然に存在するかまたは変異されたＦｃ領域に連結されるか、または代替的に、一つまたは複数の活性化Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩａ）へのＦｃ結合が増強されて、腫瘍環境においてＴ_ｒｅｇ消耗が向上される。従って、特定の実施形態において、一般に抗体の一つまたは複数の機能的特性（例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害作用）を変更するために、本明細書に記載の抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、および／または抗ＶＥＧＦのＨＣＶＲｓおよびＬＣＶＲｓは、一つまたは複数の修飾を含むＦｃに連結されることができる。また、本明細書に記載の抗体は、化学的に修飾することができるか（例えば、抗体を一つまたは複数の化学部分異連結することができる）、またはそのグリコシル化を変更して、抗体の一つまたは複数の機能的特性を変更するように修飾することができる。より特定的に、特定の実施形態において、本発明の抗体は、（ａ）抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の向上または減少、（ｂ）補体媒介性細胞毒性（ＣＤＣ）の向上または減少、（ｃ）Ｃ１ｑ親和性向上または減少、および／または（ｄ）親のＦｃと比較して、Ｆｃ親和性向上または減少等を有するＦｃ変異体生成するためのＦｃ領域の修飾を含むことができる。これらのＦｃ領域変異体は、一般にＦｃ領域に少なくとも一つのアミノ酸修飾を含む。組み合わせたアミノ酸修飾が特に望ましい。例として、変異体Ｆｃ領域は、例えば、本明細書で決定されるよう名特定のＦｃ領域部位での二つ、三つ、四つ、五つ等の置換を含むことができる。

エフェクター機能を完全に回避する必要がある用途、例えば、抗原結合だけで望ましい治療効果を生み出すのに十分であり、エフェクター機能は望ましくない副作用（またはそのリスクを向上させる）をもたらすだけであり、ＩｇＧ４抗体を使用するか、またはＦｃ領域を欠く抗体またはフラグメントまたはその実質的な部分を設計するか、またはＦｃを変異させてグリコシル化（例えば、Ｎ２９７Ａ）を完全に排除することができる。代替的に、エフェクター機能を欠き、ＦｃγＲｓ（例えばＩｇＧ２）および活性化補体（例えばＩｇＧ４）に結合する能力を欠く、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１領域およびヒンジ領域）ならびにヒトＩｇＧ４（ＣＨ２およびＣＨ３領域）の複合構築体を生成することができる。ＩｇＧ４定常領域が使用される場合、好ましくは、一般に、ＩｇＧ１のヒンジ配列を模倣するＳ２２８Ｐ置換を含むことにより、ＩｇＧ４分子を安定化し、治療された患者において治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間のＦａｂアーム交換を減少させる。

特定の実施形態において、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＶＥＧＦ、抗アンジオポエチン、および／または抗Ｔｉｅ２Ｒ抗体またはそのフラグメントは、その生物学的半減期を向上させるように修飾することができる。例えば、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることを含む、様々な異なる方法を使用することができる。一実施形態において、抗体のＣＨ１またはＣＬ領域は、米国特許第５８６９０４６および第６１２１０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２領域の二つの環から取られたサルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合エピトープを含むように変更される。Ｆｃ領域の残基は、ＥＵインデックスの番号付けとしてコード化される。本明細書に開示される配列変異体は、残基番号付けを参照して提供され、番号付けに続くのは、天然に存在するアミノ酸の代わりにアミノ酸であり、任意選択で、当該位置の前に天然に存在する残基を示す。複数のアミノ酸が特定の位置に存在することができる場合、例えば、配列が天然に存在するアイソタイプ間で異なる場合、または当該位置を複数の変異で置き換えることができる場合、スラッシュでそれを区切りする（例えば、「Ｘ／Ｙ／Ｚ」）。

ＦｃＲｎへの結合を増強する、および／または薬物動態学的特性を改善する例示的なＦｃ変異体は、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、および４３４Ｍを含む、位置２５９、３０８、および４３４での置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増強する他の変異体は、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６２１６、Ｈｉｎｔｏｎら、２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：３４６－３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓら、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（９）：６５９１－６６０４）、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９：５１７１－５１８０、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１：２３５１４－２３５２４、および米国特許第８３６７８０５号）を含む。

例えば、Ｎ４３４Ａ変異体（Ｙｅｕｎｇら、（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：７６６３）等のＩｇＧ Ｆｃ（１２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４）の特定の保存残基の修飾は、循環中の抗体半減期を増加させるためにＦｃＲｎ親和性を向上させる方法として（ＷＯ９８／０２３２８９）提案される。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組み合わせＦｃ変異体は、ＦｃＲｎ結合を向上させ、かつ血清半減期を最大５倍向上させることが示される（Ｚａｌｅｖｓｋｙら、（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１５７）。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組み合わせＦｃ変異体も、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する（Ｐｅｔｋｏｖａら、（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１７５９）。さらに、Ｍ２５２Ｙ－Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｍ、およびＭ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｓ変異を含む組み合わせＦｃ変異体も、半減期を延長することが示される（米国特許公開第２００６／１７３１７０号）。また、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組み合わせＦｃ変異体は、半減期をほぼ４倍改善することが報告されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４）。
ホモ二量体およびヘテロ二量体

二重特異性抗体の調製物を効率的に作成する際の課題の一つは、異なる結合特異性の鎖が共発現する場合の軽鎖および重鎖のミスマッチである。表１は、異なる結合特異性の重鎖ミスマッチを克服するためのいくつかのアミノ酸置換オプションを示し、これは、望ましい重鎖間の正しい結合を「執行（ｅｎｆｏｒｃｅ）」または優先的に促進する。本明細書による二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの製造において、重鎖間のミスマッチを予防または減少する任意の方法を使用することができる。

「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ、ＫｉＨ）」方法は、ほとんどの相互作用が起こる二つのＣＨ３領域のインターフェースでの修飾に依存する。一般に、厖大な残基を一つの抗体重鎖のＣＨ３領域に導入する鍵のように機能する。他の重鎖では「ホール」が形成され、当該ホールは、鍵と同様に、厖大な残基を収容することができる。得られたヘテロ二量体Ｆｃ部分は、人工ジスルフィド結合によってさらに安定化されることができる。

代替方法は、イオン交換作用または空間的相補性を有する荷電残基に基づく。これは、当該ＣＨ３インターフェースの電荷極性を変更することにより、静電で気に対になったＦｃ領域の共発現が疎水性コアを保持しながら有利な引力相互作用およびヘテロ二量体の形成を支持する同時に、不利な反発電荷相相互作用のホモ二量体化の阻害することを含む。表１を参照する。表１のアミノ酸コードは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従い、本明細書に記載の抗体の重鎖アミノ酸配列に適用されることができる。

別の方法において、本発明の二重特異性分子は、ロイシンジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ、ＬＺ）領域を含む非免疫グロブリンを使用して構築することができる。ロイシンジッパーは、タンパク質の一般的な３次元構造モチーフであり、通常、様々な転写因子のＤＮＡ結合領域の一部として使用される。単一のＬＺには、約７個の残基ごとに４～５個のロイシン残基が含まれ、片側に沿う疎水性領域を有する両親の媒性αヘリックスを形成する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体タンパク質足場は、ｃ－ｊｕｎ転写因子に由来するＬＺおよびｃ－ｆｏｓ転写因子に由来するＬＺを含む。ｃ－ｊｕｎがｊｕｎ－ｊｕｎホモ二量体を形成し、かつｃ－ｆｏｓがホモ二量体を形成できないが、ｊｕｎ－ｆｏｓヘテロ二量体の形成は、ｊｕｎ－ｊｕｎホモ二量体の形成よりもより有利する。

ロイシンジッパー領域は、タンパク質足場のＣＨ２－ＣＨ３配列を置換することができるか、または二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの２本の重鎖のカルボキシ末端に配置されることができる。後者の場合、ロイシンジッパーのＣＨ３カルボキシ末端とアミノ末端との間にｆｕｒｉｎ切断部位を導入することができる。適切な哺乳類細胞発現システムで二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの重鎖および軽鎖を共発現される場合、これは、ヘテロ二量体化段階に続くｆｕｒｉｎによって媒介されたロイシンジッパーの切断を促進することができる（Ｗｒａｎｉｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７（５）：４３３３１－４３３３９、２０１２を参照）。

表１のアミノ酸コードは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従い、本明細書に記載の抗体の重鎖アミノ酸配列に適用されることができる。表１に記載の変異は、任意の免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖および他の免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラス（またはアイソタイプ）の配列に適用されることができる（公開されるかどうかにかかわらず）。

二重特異性抗体の重鎖および軽鎖を共発現する場合、特定の結合特異性を有する軽鎖も、異なる結合特異性を有する重鎖とミスマッチすることができる。従って、特定の実施形態において、重鎖部分、軽鎖部分または二部分は、それが由来する「野生型」抗体鎖に対して修飾されて、重鎖定常領域間の相互のミスマッチ、および軽鎖定常領域のそれに対応する重鎖へのミスマッチを予防または減少することができる。

軽鎖ミスマッチの問題は、複数の方法で解決することができる。いくつかの実施形態において、空間的に相補的な変異および／またはジスルフィド結合を二つのＶＬ／ＶＨ接合部に導入することができる。他の実施形態において、イオンまたは静電的作用によって変異を導入することができる。いくつかの実施形態において、重鎖ＣＨ１領域のＳ１８３Ｅ変異および軽鎖ＣＬ領域のＳ１７６Ｋ変異を有する第１のアームを使用することによって、軽鎖ミスマッチを予防または減少することができる。第２のアームは、重鎖ＣＨ１領域のＳ１８３Ｋ変異および軽鎖ＣＬ領域のＳ１７６Ｅ変異を含むことができる。他の実施形態において、「クロスＭａｂ」方法が使用され、ここで、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト（例えば、Ｆａｂ）の一つのアームが変化しないままであるが、他の結合特異性を含む別のアームにおいて、重鎖：軽鎖の接合部に位置する軽鎖の一つまたは複数の領域が、重鎖の一つまたは複数の領域と交換される。

免疫グロブリン配列（特定の変異を含む）が上記で開示された重鎖および軽鎖ミスマッチを予防する方法は、米国特許公開第２０１４／０２４３５０５および２０１３／００２２６０１号に記載される。
コンジュゲート

特定の実施形態において、本発明の抗腫瘍アンタゴニストは、一つまたは複数のペプチドおよび／または小分子薬物に化学的にカップリングされる。前記ペプチドまたは小分子薬物は、同じでも異なってもよい。当該ペプチドまたは小分子薬物は、例えば、還元型ＳＨ基および／または炭水化物側鎖にリンクさせることができる。ペプチドまたは小分子薬物および抗体の共有または非共有のコンジュゲートを製造するための方法は、当技術分野で知られており、これらの既知の方法のいずれかを使用することができる。

いくつかの実施形態において、ペプチドまたは小分子薬物は、ジスルフィド結合の形成を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域にリンクされる。または、Ｎ－スクシニル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等のヘテロ二機能架橋剤を使用して、これらの薬剤にリンクされることができる。そのようなカップリングの一般的な技術は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、ペプチドまたは小分子薬物は、抗体Ｆｃ領域の炭水化物部分を介してカップリングされる。当該炭水化物基は、チオール基に結合した同じ試薬の負荷の増強に使用されることができるか、または炭水化物基は、異なる治療剤または診断剤の結合に使用されることができる。抗体の炭水化物部分を介してペプチド阻害剤または小分子薬物を抗体にカップリングされるための方法は、当業者に知られている。例として、一実施形態において、当該方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも一つの遊離アミン機能を有するベクターポリマーと反応させることを含む。この反応により、開始Ｓｃｈｉｆｆ塩基（イミン）結合を引き起こし、２級アミンに還元して最終的なコンジュゲートを形成することで安定化することができる。小分子薬物およびペプチドを抗体にカップリングさせるための例示的な方法は、米国特許公開第２０１４／０３５６３８５号に記載される。

好ましくは、本明細書の抗腫瘍アンタゴニストは、望ましいインビトロおよびインビボ安定性（例えば、長い半減期および貯蔵寿命の安定性）、望ましいターゲティング細胞への効率的な送達、結合物に対する親和性向上、望ましい抗体依存性細胞媒介性細胞傷害および補体依存性細胞傷害の向上、および腎臓のクリアランスまたは排除率の減少を含む、抗体の特定の所望の特性および薬物動態特性のいくつかを保持する。従って、抗腫瘍アンタゴニストの設計では、サイズに対する注意および特定の定常領域エフェクター機能の必要性を考慮することができる。

本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、５０ｋＤ～３００ｋＤ、５０ｋＤ～２５０ｋＤ、６０ｋＤ～２５０ｋＤ、８０ｋＤａ至２５０ｋＤ、１００ｋＤ～２５０ｋＤ、１２５ｋＤ～２５０ｋＤ、１５０ｋＤ～２５０ｋＤ、６０ｋＤ～２２５ｋＤ、７５ｋＤ～２２５ｋＤ、１００ｋＤ～２２５ｋＤ、１２５ｋＤ～２２５ｋＤ、１５０ｋＤ～２２５ｋＤ、６０ｋＤ～２００ｋＤ、７５ｋＤ～２００ｋＤ、１００ｋＤ～１２５ｋＤ～２００ｋＤ、１５０ｋＤ～２００ｋＤ、６０ｋＤ～１５０ｋＤ、７５ｋＤ～１５０ｋＤ、１００ｋＤ～１５０ｋＤ、６０ｋＤ～１２５ｋＤ、７５ｋＤ～１２５ｋＤ、７５ｋＤ～１００ｋＤ、または上記に記載された範囲にリストされた整数の任意の組み合わせを含む任意の範囲、または上記に記載された範囲の整数の任意の組み合わせで特に指定された任意の範囲等の範囲のサイズを有することができる
キット

本発明は、本発明のチェックポイント調節剤アンタゴニストまたは抗腫瘍アンタゴニストを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、当該キットは、一つまたは複数の二重特異性免疫チェックポイント調節剤を含み、当該二重特異性免疫チェックポイント調節剤は、少なくとも一つのＴＧＦβ経路阻害領域を含む。いくつかの実施形態において、当該キットは、検出に使用される二次抗体、および本明細書に記載の他のヒト抗体（例えば、同じ抗原の異なるエピトープに結合する補体活性を有するヒト抗体）を含む、他の試薬を含む。キットは、一般にキットの内容物の予期用途を示す説明が記載されたラベルを含む。いわゆるラベルは、キットに提供または付属している任意の文字または記録された材料を含む。

ＩＩ．抗腫瘍アンタゴニストの使用方法
本発明の抗腫瘍アンタゴニストは、例えば、免疫応答の増強および癌、感染症または自己免疫疾患の治療を含む、多くのインビトロおよびインビボの有用性を有する。

本発明の抗腫瘍アンタゴニストは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で培養中の細胞に、またはヒト個体、例えば、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で投与して、様々な疾患の免疫作用を増強することができる。従って、本明細書は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを個体に投与して、当該個体中の免疫応答を増強、刺激またはアップレギュレートする、個体の免疫応答を修飾する方法を提供する。好ましくは、当該個体は、免疫応答を増強させるヒト患者を含む。当該方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答）を増強させることによって治療できる疾患の患者を治療するのに特に適している。この方法は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での癌または慢性感染症の治療に特に適している。例として、抗体特異的免疫作用を増強するために、抗腫瘍アンタゴニストは、所望の抗原、または治療される個体（例えば、腫瘍またはウイルスのある個体）にすでに存在する抗原とともに投与されることができる。抗腫瘍アンタゴニストが他の薬剤とともに投与される場合、当該両方は、それぞれまたは同時に投与されることができる。

いくつかの実施形態において、上記の方法におけるチェックポイント調節剤アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ抗体、またはＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ、ａ ＶＥＧＦＲ ＥＣＤまたは前述の両方を有するその任意のフラグメントである。

本明細書に記載の任意の抗体の実施形態において、当該抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。

本発明の範囲は、サンプルおよび対照サンプルを本発明の抗体、抗体フラグメントまたは二重特異性アンタゴニストと接触させることを含む、サンプル中のターゲティング分子の存在を検出および／または測定する方法を包含し、当該抗体、抗体フラグメントまたは二重特異性アンタゴニストは、アンタゴニストとターゲティング分子との間で複合体を形成することができる条件下で、ターゲティング分子に特異的に結合する。その後、当該複合体の形成を検出し、ここで、サンプルとの複合体の形成と対照サンプルとの複合体の形成との間の違いは、当該サンプルにターゲティング分子が存在することを示す。

阻害性または共阻害性Ｔ細胞応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を遮断する本発明の抗腫瘍アンタゴニストの能力を考えると、本明細書は、本明細書に記載の抗体を使用して、抗原特異的Ｔ細胞応答（例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答）を刺激、増強またはアップレギュレートするインビトロおよびインビボの方法を提供する。特定の実施形態において、チェックポイント調節剤アンタゴニスト治療と同時に、前または後に刺激を提供することができる、ＣＤ３刺激（例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との共培養による）も提供する。例として、本明細書は、前記Ｔ細胞を本明細書に記載のチェックポイント調節剤アンタゴニストと（および必要に応じてＣＤ３と）接触することにより、抗原特異的Ｔ細胞応答（例えば、チェックポイント調節剤によって媒介される阻害応答を排除することによって）を増強させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強する方法を提供する。任意の適切な抗原特異的Ｔ細胞応答指示剤を使用して、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定することができる。そのような適切な指示剤の非限定的な例としては、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の向上および／または抗体の存在下でサイトカイン製造の向上を含む。好ましい実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞によって製造されたインターロイキン－２および／またはインターフェロン－γが増加される。

本発明は、個体における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を増強する方法を包含し、当該方法は、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを個体に投与して、免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を増強する。好ましい実施形態において、当該個体は、腫瘍を有する個体であり、腫瘍に対する免疫応答を増強する。腫瘍は、固形腫瘍または液性腫瘍（例えば、血液系の悪性腫瘍）であり得る。特定の実施形態において、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。特定の実施形態において、腫瘍は、非免疫原性腫瘍である。いくつかの実施形態において、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１陽性である。他の実施形態において、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１陰性である。当該個体も、本明細書に記載されるような二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの投与後にウイルスに対する免疫応答を増強する、ウイルスを有する個体であり得る。

一実施形態において、個体の腫瘍細胞増殖を阻害する方法は、当該個体に本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与して、個体の腫瘍増殖を阻害することを含む。当該個体に本明細書に記載されるような二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与して、個体の慢性ウイルス感染症を治療することを含む、個体の慢性ウイルス感染症を治療する方法も提供する。

本明細書には、個体に本明細書に記載の治療有効量の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することを含む、腫瘍（例えば、癌性腫瘍）を有する個体の腫瘍微小環境に由来するＴｒｅｇ細胞を消耗させる方法も含まれ、当該二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、腫瘍微小環境におけるＴ_ｒｅｇ細胞の消耗を消耗するＦｃを含む。Ｆｃは、例えば、エフェクター機能を有するか、またはエフェクター機能（例えば、結合至または具有増強結合至一つまたは複数の活性化Ｆｃ受容体）を増強するＦｃであり得る。

好ましい実施形態において、Ｔ_ｒｅｇ枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、腫瘍微小環境におけるＴ_ｅｆｆの顕著な枯渇または阻害なしに、かつ腫瘍微小環境外のＴ_ｅｆｆ細胞およびＴ_ｒｅｇ細胞の枯渇または阻害なしに発生する。特定の実施形態において、当該個体は、例えば、腫瘍微小環境においてＴ_ｅｆｆ細胞よりも高いＴｒｅｇ細胞チェックポイント調節剤レベルを有する。特定の実施形態において、二重特異性アンタゴニストは、腫瘍および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）のＴｒｅｇを消耗させることができる。例として、ＣＴ２６腫瘍モデルでは、例えば、マウスＩｇＧ２ａ（その表示エフェクター機能）規格等の抗マウスＴＩＧＩＴ抗体がＴ_ｒｅｇおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞を部分的に消耗させるが、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を消耗させないことが分かった。例えば、マウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ規格等の非エフェクター対応物の抗体またはアンタゴニストは、Ｔ細胞を消耗させない。

特定の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、補助療法として個体に投与される。本発明による二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを使用する癌患者の治療は、現在の標準治療と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、１０またはそれ以上の長期生存率、少なくとも１、２、３、４、５、１０またはそれ以上の無再発生存率等の、長期の持続的な応答をもたらす。特定の実施形態において、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを使用する癌患者の治療は、癌の再発を予防するか、または癌の再発を少なくとも１、２、３、４、５、１０またはそれ以上を遅延させる。従って、これらのアンタゴニストを使用する治療は、主要または二次治療として使用されることができる。

特定の好ましい実施形態において、個体は、細胞増殖性疾患または癌を有する。本明細書は、当該個体に本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与して、個体（例えば、癌性腫瘍の増殖を阻害または減少する、および／または腫瘍退縮を引き起こす）を治療することを含む、癌を有する当該個体を治療する方法を提供する。本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用されることができる。または、これらの任意の抗腫瘍アンタゴニストは、例えば、以下の他の抗腫瘍ターゲティング、免疫原性剤、標準的な癌治療、または他の抗体等の、他の薬剤とともに使用されることができる。

従って、本明細書は、個体に本明細書に記載の治療有効量の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することを含む、当該個体の癌を治療する（例えば、腫瘍細胞の増殖を阻害する）方法を提供する。好ましくは、当該抗体は、ヒトまたはヒト化された免疫グロブリン配列を含む。

本発明の抗体を使用してその増殖を阻害することができる癌は、免疫治療に応答する癌を含む。治療に使用される癌の非限定的な例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、腸および胃がん、腎臓がん（例えば、明細胞がん）、卵巣がん、肝臓がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ））、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺がん）、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵臓がん、神経膠芽細胞腫（多形性神経芽細胞腫）、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、および頭頚部がん（または癌）、胃がん、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔内の自然キラー、黒色腫（例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫等の転移性悪性黒色腫）、骨がん、皮膚がん、子宮がん、肛門がん、精巣がん、ファロピウス管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、食道がん、小腸がん、内分泌がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、尿道がん、腎骨盤がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、骨髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん（アスベストによって誘発されたものを含む）、ウイルス関連がん（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）および二つの主要な血球レパートリーのいずれかに由来する（即ち、肉芽腫細胞、赤血球、血液凝固細胞、マクロファージおよびマスト細胞を生成する骨髄細胞株、またはＢ、Ｔ、ＮＫおよびリンパ球を生成するリンパ球性細胞株）血液悪性疾患、例えば、例えば、急性、慢性、リンパ球性および／または骨髄性白血病（例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（Ｍ０）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２、細胞成熟）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３変異体［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球が増加されたＭ４変異体［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、孤立性顆粒膜肉腫および緑の腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、多形性（例えば、Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔ－リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ－リンパ芽球性、およびリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ組織増殖性疾患、真の組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ性スペクトルの造血器新生物、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織細胞リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂ－リンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉腫またはセザリー（Ｓｅｚａｒｙ）症候群としても知られている）すべてのクラスの白血病、リンパ腫および骨髄腫瘍、ならびにワルデンストレーム（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ）マクログロブリン血症を有するリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、例えば、ＩｇＧ骨髄腫瘍、軽鎖骨髄腫瘍、非分泌型骨髄腫瘍、くすぶり型骨髄腫瘍（無痛性骨髄腫瘍としても知られている）、孤立性形質細胞腫瘍および多発性骨髄腫瘍、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞リンパ腫等の骨髄腫瘍、骨髄性造血腫瘍、間質起源の腫瘍（線維肉腫および横紋筋肉腫を含む）、セミノーマ、奇形腫、中枢および末梢神経腫瘍（星状細胞腫を含む）、神経鞘腫、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間質起源の腫瘍、および黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞がんおよび奇形腫、例えば、小細胞および脳様細胞クラスを含むＴ－前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）等のＴ細胞傷害を含むがこれらに限定さない、Ｔ細胞およびＢ細胞腫瘍等のリンパ系造血腫瘍を含む他の腫瘍、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）、好ましくはＴ細胞クラス、およびＴ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫、末梢／レトロチミックＴ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性サブ型）、血管中心性（経鼻）Ｔ細胞リンパ腫、頭部または頚部がん、腎臓がん、直腸がん、甲状腺がん、急性骨髄リンパ腫および前記癌の任意の組み合わせを含む。本明細書に記載の方法は、転移性癌、難治性癌（例えば、依然は免疫療法を使用し、例えば、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１抗体を遮断する難治性癌）および再発性癌を治療するために使用される。

本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、単独で、他の抗腫瘍アンタゴニストと合併して、または他の抗腫瘍アンタゴニストと同時に投与されることができる。または、癌ワクチン策略において、当該二重特異性抗腫瘍アンタゴニストも、免疫原性剤（例えば、癌性細胞、腫瘍ワクチン、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および糖類分子を含む）、免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞（Ｈｅら、（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９－２８）、または腫瘍溶解性ウイルスと合併してまたは同時に投与されることができる。

多くの抗腫瘍ワクチンの実験的策略を考案した。これらの策略の一つにおいて、ワクチンは、自家または同種異系の腫瘍細胞を使用する。腫瘍細胞がＧＭ－ＣＳＦを発現するように形質導入される場合、これらの細胞ワクチンのいくつかは、最も効果的であることが示される。ＧＭ－ＣＳＦは、癌ワクチン接種に有用な抗原提示の潜在的な活性化剤であることが示される（Ｄｒａｎｏｆｆら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３９－４３）。癌ワクチンは、前臨床モデルにおいて、エフェクターＴ細胞の腫瘍への浸潤を増加させることが示される。癌ワクチンの主要な形態は、ペプチドワクチン、ベクター基質の抗原特異的ワクチン、前細胞ワクチン、および樹状細胞ワクチンを含む。ワクチンを基礎とするすべての療法は、単一または複数の抗原エピトープまたは完全細胞の抗原から患者に送達し、腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を誘導するように設計される。従って、ワクチンを基礎とする療法は、主要へのＴ細胞浸潤を誘導するための最も効率的な方法であり得る。

様々な腫瘍において、遺伝子発現および大規模な遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ Ａ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１～７）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、およびＴｒｐ－２等、腫瘍および腫瘍生産細胞で発現する分化抗原である。より重要なことに、これらの多くの抗原は、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的となる可能性がある。

チェックポイント調節剤経路、ＴＧＦ－β経路、および／または血管新生経路の阻害は、腫瘍で発現される組換えタンパク質および／またはペプチドのセットとともに使用して、これらのタンパク質に対して免疫応答を生成することができる。これらのタンパク質は、免疫系によって自己抗原と見なされるため、それに対して耐性がある。腫瘍抗原は、染色体テロメア合成に必要なテロメラーゼタンパク質を含み、８５％を超えるヒト癌において、限られた数の体細胞でのみ発現される（Ｋｉｍら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１～２０１３）。体細胞変異は、二つの無関係な配列（即ち、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体でのｂｃｒ－ａｂｌ）またはＢ細胞腫瘍に由来するイディオタイプ（ｉｄｉｏｔｙｐｅ）間でタンパク質配列を交換するか、または融合タンパク質を作成するため、腫瘍抗原が癌細胞で発現する「ネオ抗原（ｎｅｏ－ａｎｔｉｇｅｎ）」であり得る。

腫瘍ワクチンの非限定的な例としては、転移性前立腺がんに対するＦＤＡ承認の腫瘍ワクチンに使用されるｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ（ＰｒｏｖｅｎｇｅR）、全細胞ＧＭ－ＣＳＦ分泌型照射異種膵臓癌ワクチン（ＧＶＡＸ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ）等の、サイトカイン顆粒球マクロファージコロニー－刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞、乳がん抗原、ｎｅｕ、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、および抗ＰＤ－１抗体と合併して投与される場合、乳がんを患うマウスのワクチン誘導性無疾患の経過生存率が延長されることができる（Ｋａｒｙａｍｐｕｄｉ Ｌ．ら、（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４：２９７４－２９８５）、β－カテニンに由来する免疫原性ペプチドからなるポリペプチドワクチン、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴＩおよび／またはチロシン等の黒色腫抗原ペプチドを含む。他の腫瘍ワクチンは、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）（例えば、ＧａｒｄａｓｉｌR、Ｇａｒｄａｓｉｌ ９R、およびＣｅｒｖａｒｉｘR）等のヒトの癌に関連するウイルス由来のタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｅｎｇｅｒｉｘ－ＢおよびＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）を含む。ＴＩＧＩＴ阻害で使用できる腫瘍特異的抗体の他の形態は、腫瘍組織自体から単離された、生成された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質フラグメントを含み、かつこれらのＨＳＰは、抗原提示細胞への送達において腫瘍免疫作用を誘発するのに非常に効率的である。Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（Ｔ－ＶＥＣまたはＩｍｌｙｇｉｃR）は、転移性黒色腫の一部の患者に向けたＦＤＡが承認した腫瘍溶解性ウイルスであり、当該転移性黒色腫は、外科的に取り除くことができない。

樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を誘発するために使用できる有効な抗原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで製造され、様々なタンパク質、ペプチド、および腫瘍細胞抽出物をロードできる（Ｎｅｓｔｌｅら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：３２８－３３２）。ＤＣは、これらの腫瘍抗原を発現させるための遺伝的手段によっても形質導入することができる。免疫作用の目的のために、ＤＣは、腫瘍細胞に直接融合させることもできる（Ｋｕｇｌｅｒら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３３２－３３６）。ワクチン（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）を接種する方法として、ＤＣ免疫作用は、チェックポイント調節剤遮断に効果的に結合されて、より有効な抗腫瘍反応を活性化（釈放）することができる。

チェックポイント調節剤経路、ＴＧＦ－β経路、および／または血管新生経路の阻害は、標準的な癌治療（例えば、手術、放射線療法、および化学療法）と組み合わせることもできる。特に、チェックポイント調節剤阻害剤は、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。この場合、投与される化学療法の試薬の用量を減少させることが可能かもしれない（Ｍｏｋｙｒら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：５３０１－５３０４）。当該組み合わせの例としては、黒色腫の治療のためのデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）との抗腫瘍アンタゴニストを併用することである。別の組み合わせの例としては、黒色腫の治療のためのチェックポイント調節剤アンタゴニストまたは抗腫瘍アンタゴニストとインターロイキン－２（ＩＬ－２）との組み合わせである。例として、チェックポイント調節剤阻害、ＴＧＦ－β１／ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ阻害、および／または血管新生阻害を化学療法と組み合わせて使用する化学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用によって誘発される細胞死を促進することにより、抗原提示経路の腫瘍抗原レベルを向上させる。チェックポイント調節剤阻害、ＴＧＦ－β１／ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ阻害、および／または細胞死による血管新生の阻害と相乗効果を発揮できる他の併用治療は、放射線治療、手術、およびアンドロゲン遮断（ａｎｄｒｏｇｅｎ－ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）である。これらの方案は、それぞれ宿主に腫瘍抗原の供給源を作る。

本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストもＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞にターゲティングするように構築される（例えば、米国特許第５９２２８４５および５８３７２４３号を参照する）。例として、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位にターゲティングするために使用される。このタイプのターゲティングクラスは、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化するために、本発明の実施形態に適合させることができる。これらの応答のＴ細胞アームは、本明細書に記載のチェックポイント調節剤アンタゴニストの一つまたは複数を阻害することによって増強されることができる。または、二重特異性抗体を使用して、抗原をＤＣｓに直接送達することができ、当該二重特異性抗体は、腫瘍抗原および樹状細胞の特定の細胞表面マーカーに結合される。

腫瘍は、様々なメカニズムを介して宿主の免疫監視から逃れる。これらのメカニズムの多くは、腫瘍で発現して免疫抑制タンパク質を不活性化することで克服することができる。免疫抑制タンパク質には、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、およびＦａｓリガンドが含まれる。これらの実体のそれぞれに対する抗体は、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用して、免疫抑制剤の効果を打ち消し、かつ宿主の腫瘍免疫応答を増強することができる。

宿主免疫応答を活性化する他の抗体は、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。これには、樹状細胞の表面でのＤＣ機能および抗原提示を活性化する分子を含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、補助Ｔ細胞活性を効果的に置換することができ（Ｒｉｄｇｅら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４－４７８）、かつ本明細書に記載の二重特異性アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。例えば、ＯＸ－４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：２１６０－２１６９）、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６８２－６８５（１９９７）、およびＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６２－２６６）Ｔ細胞共刺激分子に対する抗体の活性化も、Ｔ細胞活性化レベルを向上させることができる。さらに、他の免疫チェックポイント調節剤の阻害剤も、以下にさらに説明されるように、本明細書に記載の他の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。

骨髄移植は、現在造血起源の様々な腫瘍治療に使用される。この治療は移植物対宿主疾患を引き起こすが、チェックポイント調節剤阻害は、移植物対腫瘍反応を低下させることに使用されることにより、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を向上させることができる。

特定の実施形態において、感染症性疾患（特に慢性感染症）を患う患者に本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストを投与することができる。この場合、癌への適用と同様に、抗体によって媒介されたチェックポイント調節剤の阻害は、単独で使用されるか、またはアジュバントとしてワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を増強することができる。この治療法に使用できる例示的な病原体は、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ型、およびＣ型）、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ジノべん毛虫、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、および緑膿菌を含むが、これらに限定されない。チェックポイント調節剤阻害、ＴＧＦ－β１／ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ阻害、および／または血管新生阻害は、病原体によって引き起こされる感染症（例えば、感染症の過程で存在する新しいまたは変更された抗原を有するＨＩＶ）に特に効果的である。二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの投与により、これらの抗原は、適切なＴ細胞応答を引き起こすために外来物であると見なすことができる。

本明細書に記載の方法によって治療されることができる感染症を引き起こす他の病原性ウイルスは、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ型、およびＣ型）、ヘルペスウイルス感染症（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ、およびＣＭＶ、ヒトヘルペスウイルスＩＶ型等）、ならびにアデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、サイウイルス、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ムンプスウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、ドイツのはしかウイルス、パルボウイルス、ｐｏｘウイルス、ＨＴＬＶウイルス，デングウイルス、乳頭腫ウイルス、軟体動物ウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス性脳炎ウイルス（ａｒｂｏｖｉｒａｌ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、またはその組み合わせによって引き起こされる感染症を含む。

本明細書に記載の方法によって治療されることができる例示的な病原性細菌または疾患は、クラミディア、リケッツィア、マイコバクテリウム、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、ニューモコッカス、メニンゴコッカスおよびナイセリアゴノレエ、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、レプトスピラ症、破傷風、ボッリヌス中毒、炭疽、ならびにペストおよびライム病を含む。

本明細書に記載の方法によって治療されることができる感染症の例示的な病原性真菌は、カンジダ（例えば、カンジダアルビカンス、カンジダクルジ、カンジダグラブラタ、カンジダトロピカリス等）、クリプトコッカスネオフォルマンス、アスペルギルス（例えば、アスペルギルスフミガーツス、アスペルギルスニガー等）、ムコール真菌（例えば、ムコール真菌、アプシディア、リゾプス）、スポロトリクスシェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス皮膚炎（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデスプラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデスイミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）およびヒストプラズマカプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）を含む。

本明細書に記載の方法によって治療されることができる例示的な病原性寄生虫は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ジアルジアザンビア（Ｇｉａｒｄｉａ Ｚａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ニューモシスチスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマクルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノヴァンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、およびブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む。

上記のすべての方法において、チェックポイント調節剤阻害、ＴＧＦ－β１／ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ阻害、および／または血管新生阻害は、他の形態の免疫療法（例えば、サイトカイン（例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２）治療）と組み合わせるか、または二つの異なる結合特異性を使用する二重特異性抗体療法と組み合わせて使用して、増強された腫瘍抗原の提示を提供することができる。

本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、任意の抗体および目的抗原（例えば、ワクチン）の一つまたは複数と同時投与することにより、抗原特異的免疫応答を増強することができる。従って、本明細書は、個体において抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供し、当該個体に（ｉ）抗原と、（ｉｉ）二重特異性抗腫瘍アンタゴニストとを投与することにより、個体において抗原に対する免疫応答を増強することを含む。当該抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または病原体に由来する抗原であり得る。そのような抗原の非限定的な例としては、例えば、上記で論議した腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）、またはウイルス、細菌または上記の他の病原体に由来する抗原等、上記のセクションに説明されたものを含む。

特定の実施形態において、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの結合エピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質は、抗腫瘍アンタゴニストを置換するか、または抗腫瘍アンタゴニスト以外のワクチンとして使用されることができる。

本明細書に記載の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性抗体、または免疫複合体）のインビボおよびインビトロ投与のための適切な経路は、当業者に周知であり、かつ当業者によって選択されることができる。例として、当該抗体組成物は、注射（静脈内または皮下）によって投与されることができる。使用される分子の適切な用量は、当該個体の年齢および体重、ならびに当該抗体組成物の濃度および／または製剤に依存する。

併用療法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）
別の態様において、本発明は、個体において抗原特異的Ｔ細胞応答を増強するための併用療法を提供する。一実施形態において、当該方法は、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストおよび二次抗体、抗体フラグメント、アンタゴニスト、または薬物と合併してＴ細胞に接触させて、抗原特異的Ｔ細胞応答またはアポトーシス経路を増強することを含む。例として、いくつかの実施形態において、第１の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１等の第１のチェックポイント調節剤に特異的に結合し、第２の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、異なるチェックポイント調節剤または異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、当該二次抗体または抗体フラグメントは、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に由来する異なるＨＣＶＲｓ、ＬＣＶＲ、またはＣＤＲ（ｓ）を含む。

関連される態様において、腫瘍を必要とする個体の制御性Ｔ細胞を減少または消耗させる方法は、有効量の抗体または抗体フラグメントを二次抗体、抗体フラグメント、アンタゴニストまたは薬物と合併して投与して、当該個体における制御性Ｔ細胞の数を減少させることを含む。

いくつかの実施形態において、当該個体は、本明細書に記載されるような細胞増殖性疾患または癌を有する。

他の実施形態において、当該個体は、本明細書に記載されるような慢性ウイルス感染症、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する。

Ｔ細胞に二つの異なるシグナルを提供することは、休止中のＴリンパ球（ｒｅｓｔｉｎｇ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）のリンパ球活性化について広く許容されるモデルである。このモデルは、自己および非自己の識別、および免疫寛容をさらに提供する。初期シグナルまたは抗原特異的シグナルは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のバックグラウンドの存在下で外来抗原ペプチドが認識された後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって伝達される。二次または共刺激シグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）で発現される共刺激分子によってＴ細胞に送達される。これにより、Ｔ細胞がクローン増殖（ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、サイトカイン分泌およびエフェクター機能を促進する。共刺激が乏しい場合、Ｔ細胞は、抗原刺激に抵抗性になり、外因性または内因性の抗原に対する耐性反応を引き起こす可能性がある。

当該２シグナルモデル（ｔｗｏ－ｓｉｇｎａｌ ｍｏｄｅｌ）において、Ｔ細胞は、正の共刺激シグナルおよび負の共抑制シグナルを受け取る。これらの正および負のシグナルの調節は、宿主の保護性免疫応答を最大化するために重要である同時に、免疫寛容を保持し、自己免疫を予防する。負のシグナルは、Ｔ細胞耐性を誘導するために必要であるように見え、正のシグナルは、Ｔ細胞の活性化を促進する。共刺激シグナルおよび共抑制シグナルの療法は、抗原に曝露されたＴ細胞に提供され、共刺激シグナルと共抑制シグナルとの間の相互作用は、免疫応答の幅を制御するために不可欠である。また、感染症または免疫チャレンジが解消、悪化または持続的に存在する場合、Ｔ細胞に提供されるシグナルが変化し、これらの変化は、応答するＴ細胞に強く影響し、かつ免疫応答を再生する。

共刺激シグナルの操作が細胞に基づく免疫応答を増強または終結させる手段を提供することを示すため、共刺激のメカニズムには治療上の意味がある。近年、Ｔ細胞の機能不全またはアネルギー（ａｎｅｒｇｙ）は、免疫チェックポイント調節剤（例えば、プログラム細胞死ポリペプチド（ＰＤ－１）およびそのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）を誘導および持続的な発現と同時に起こり得ることが見出された。ＰＤ－Ｌ１は、多くの癌で過剰に発現され、予後不良と常に関連されることがよくある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６、６６（７）：３３８１）。また、正常組織および末梢血Ｔリンパ球のＴリンパ球と比較して、ほとんどの腫瘍浸潤性Ｔリンパ球は、主にＰＤ－１を発現し、これは、腫瘍反応性Ｔ細胞でのＰＤ－１のアップレギュレーションが抗腫瘍免疫応答の障害（Ｂｌｏｏｄ ２００９ １１４（８）：１５３７）につながる可能性があることを示唆する。これは、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞とＰＤ－１を発現するＴ細胞との相互作用によって媒介されるＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の利用によるものであり、Ｔ細胞活性化の減弱および免疫監視の回避をもたらす。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用の阻害は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって媒介された癌細胞および腫瘍に対する殺傷作用を含む、Ｔ細胞免疫性を増強する手段を提供する。ＰＤ－１と結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）Ｂ７－１との結合を阻害することにより、類似なＴ細胞免疫の増強が観察される。従って、ＰＤ－１および他の免疫チェックポイント調節剤の治療ターゲティングは、注目している分野である。

ＴＧＦ－β１シグナル、チェックポイント調節剤シグナル、および／または血管新生シグナルと腫瘍細胞でダウンレギュレートされた他のシグナル経路との組み合わせ阻害は、治療効果を増強させる手段を提供することができる。近年、受容体およびそのリガンド形態の免疫チェックポイント調節剤の複数が確認されている。共刺激または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの重要なファミリーは、ＣＴＬＡ－４とそのリガンド、Ｂ７－１とＢ７－２、ＰＤ－１とそのリガンド、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）とＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳ－Ｌ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、およびＢ７－Ｈ６を含むＢ７ファミリーである。他の免疫チェックポイント調節剤アンタゴニストは、ＴＩＭ－３とそのリガンド、ガレクチン－９、肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）とガレクチン－３を含むＬＡＧ－３とそのリガンド、ＣＤ１２２とそのＣＤ１２２Ｒリガンド、ならびにＣＤ７０、Ｂ７Ｈ３、ＢとＴリンパ球減衰剤（ＢＴＬＡ）、およびＶＩＳＴＡ（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒら、（２０１５）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（６）、Ａｒｔｉｃｌｅ ４１８）を含むが、これらに限定されない。さらに、複数のチェックポイント調節剤アンタゴニストが決定され、かつ様々な臨床および前臨床モデルで試験されているか、および／またはＦＤＡによって承認されている（Ｋｙｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８８：３６８－３７６（２０１４））。免疫チェックポイント遮断としても知られている阻害性受容体遮断の概念が、例えば転移性黒色腫におけるＦＤＡによって承認されたＰＤ－１阻害剤、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）およびペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、および抗ＣＴＬＡ－４抗体、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）の有効性によって実証されている。

免疫チェックポイントアンタゴニストは、免疫チェックポイント調節剤の活性を調節または妨害することにより、チェックポイント調節剤またはそのリガンドに結合することによってチェックポイント調節剤受容体を介したシグナル伝達を遮断または阻害する。このシグナル伝達を阻害することによって免疫抑制を逆転させることができることにより、抗腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫を再構築または増強する。逆に、免疫チェックポイントアゴニスト（例えば、共刺激分子）は、免疫チェックポイント調節剤の活性を刺激することにより、チェックポイント調節剤またはそのリガンドに結合することによってチェックポイント調節剤受容体を介したシグナル伝達を刺激する。このようなシグナル伝達を刺激することにより、抗腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫を再構築または増強することができる。

従って、一実施形態において、個体の免疫応答を刺激する方法は、本明細書に記載されるような抗二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを上記の他の免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて当該個体に投与することにより、例えば、腫瘍増殖を阻害するか、または抗ウイルス反応を刺激する等の当該個体における免疫応答を刺激することを含む。特に、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、別個のアンタゴニストとして、または複数の生成物を含む結合の不均一性の多重特異性アンタゴニストとして投与されることができる。

いくつかの実施形態において、免疫応答を刺激するために、本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリータンパク質、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーのアンタゴニスト、またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦまたは他の免疫抑制性サイトカイン）のアンタゴニスト、および／または（ｉｉ）免疫応答を刺激するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーの刺激性受容体のアゴニスト、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストに結合することができる。他の実施形態において、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを抗ＣＴＬＡ－４抗体またはＣＴＬＡ－４アンタゴニストと合併して当該個体に投与される。本発明によって使用される例示的なＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレビリズマブ（ｔｒｅｖｉｌｉｚｕｍａｂ）およびトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）を含む。

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント調節剤リガンドを高度に発現する癌を患う個体に、異なるチェックポイント調節剤アンタゴニストをターゲティングする二重特異性アンタゴニストを投与することができる。例として、一実施形態において、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）および／またはＮｅｃｔｉｎ－２（ＣＤ１１２）の高発現および／またはＰＤ－１の低発現を示す癌個体を選択することができる。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＬＡＧ－３抗体またはそのフラグメントのみを使用して単剤療法を実行するか、またはＰＤ－１アンタゴニストまたは他の免疫チェックポイント調節剤アンタゴニストを使用して併用療法を実行する。本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、免疫応答および／またはアポトーシスを刺激する有効量で他の薬剤（例えば、抗体、アンタゴニストまたは薬物）と同時に投与して、個体の免疫応答および／またはアポトーシスをさらに増強、刺激またはアップレギュレートすることができる。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、異なる抗腫瘍アンタゴニストによる治療後に投与される。例として、いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、単一の特異性抗腫瘍アンタゴニストが失効した後、不完全な治療反応を引き起こした後、または腫瘍の再出現または再発（例えば、「ＰＤ－１失敗」）を引き起こした後にのみ投与されることができる。いくつかの実施形態において、例えば、ＰＶＲおよび／またはＮｅｃｔｉｎ－２でそのような失敗を示す癌をスクリーニングすることができ、これらの高レベルの発現者のみが本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストで治療される。

特定の実施形態において、当該抗腫瘍アンタゴニストは、免疫チェックポイント調節剤のドミナントネガティブタンパク質領域を含む。特定の実施形態において、当該ドミナントネガティブタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７Ｈ３、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７０、およびその組み合わせからなる群から派生される細胞外ドメインを含む。いくつかの特定の実施形態において、これらの細胞外ドメインは、本明細書に記載の抗体の免疫グロブリン定常領域またはＦｃ受容体に融合される。このような変異は、内因性受容体に結合して、シグナル伝達が足りない複合体を形成することができる。特定の実施形態において、当該細胞外ドメインは、免疫グロブリン定常領域またはＦｃ受容体、またはオリゴタンパク質複合体の単量体に融合される。

特定の実施形態において、ドミナントネガティブＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、またはＰＤ－１の細胞外ドメインを含む。別の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１に結合しなくなった変異を有するドミナントネガティブＰＤ－１アンタゴニストを使用する。例示的なドミナントネガティブタンパク質は、ＡＭＰ－２２４（Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ ＫｌｉｎｅおよびＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅによって共同開発された）、ＰＤ－Ｌ２とヒトＩｇＧとのＦｃ領域の細胞外ドメインを含む組換え融合タンパク質である。

例示的な免疫チェックポイント調節剤アゴニストは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲおよび４－１ＢＢ（ＣＤ１３７））およびそのリガンド、またはＢ７－ＣＤ２８スーパーファミリーメンバー（ＣＤ２８およびＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）を含む）を含むが、これらに限定されない。他のチェックポイント調節剤アゴニストは、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３リガンドを含む。免疫チェックポイントアゴニストは、一つまたは複数の共刺激領域を含む抗体または可溶性融合タンパク質アゴニストを含むことができる。アゴニスト抗体は、例えば、ＣＰ－８７０と８９３、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、およびダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）等の抗ＣＤ４０ ｍＡｂｓ、例えば、ＢＭＳ－６６３５１３ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）、およびＰＦ－０５０８２５６６等の抗ＣＤ１３７ ｍＡｂｓ、抗ＯＸ４０ ｍＡｂｓ、例えば、ＴＲＸ５１８等の抗ＧＩＴＲ ｍＡｂｓ、例えば、ＣＤＸ－１１２７等の抗ＣＤ２７ ｍＡｂｓ、ならびに抗ＩＣＯＳ ｍＡｂｓを含むが、これらに限定されない。

例示的なＧＩＴＲアゴニストは、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質、ならびに例えば、米国特許第６１１１０９０および８５８６０２３号、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号、国際特許出願の公開番号ＷＯ２０１０／００３１１８およびＷＯ２０１１／０９０７５４等に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質等の抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）を含む。抗ＧＩＴＥ抗体は、例えば、米国特許第７０２５９６２、７６１８６３２、７８１２１３５、８３８８９６７、および８５９１８８６号、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１および１８６６３３９号、国際特許出願の公開番号ＷＯ２０１１／０２８６８３、ＷＯ２０１３／０３９９５４、ＷＯ２００５／００７１９０、ＷＯ２００７／１３３８２２、ＷＯ２００５／０５５８０８、ＷＯ９９／４０１９６、ＷＯ２００１／０３７２０、ＷＯ９９／２０７５８、ＷＯ２００６／０８３２８９、ＷＯ２００５／１１５４５１、ＷＯ２０１１／０５１７２６に記載される。例示的な抗ＧＩＴＲ抗体は、ＴＲＸ５１８である。

共刺激または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの他のファミリーは、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２－Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦ γ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１（３２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲ（例えば、Ｔａｎｓｅｙ、Ｍ．Ｇ．ら、（２００９）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、１４（２３－２４）：１０８２－１０８８を参照する）を含む、同族のＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合されるＴＮＦファミリー分子である。

免疫チェックポイントアゴニストまたは共刺激分子は、Ｉ型ＭＨＣ分子、ＩＩ型ＭＨＣ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナルリンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体（Ｔｏｌｌ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒ β、ＩＬ２Ｒ γ、ＩＬ７Ｒ α、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない、効果的な免疫応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子を含む。

一態様において、Ｔ細胞応答は、本発明の抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂｓを介して、（ｉ）例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン－１、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ－１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ－１、ＣＤ９６およびＴＩＭ－４等のＴ細胞活性化を阻害するタンパク質のアンタゴニスト（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）、ならびに（ｉｉ）例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８Ｈ等のＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト等の、一つまたは複数との組み合わせによって刺激されることができる。

上記のタンパク質の一つを調節する例示的な薬剤は、癌を治療するために、本発明の抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用することができる。これらの例示的な薬剤は、例えば、ＹＥＲＶＯＹ^商標／イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）またはトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＴＬＡ－４の場合）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）（Ｂ７．１の場合）、ＯＰＤＩＶＯ^商標／ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）／ＢＭＳ－９３６５５８（ＰＤ－１の場合）、ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）／ＣＴ－０１１（ＰＤ－１の場合）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ^商標／ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）／ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１の場合）、ＡＭＰ２２４（Ｂ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２の場合）、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂ７－Ｈ１の場合）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｂ７－Ｈ１の場合）、ＭＥＤＩ－５７０（ＩＣＯＳの場合）、ＡＭＧ５５７（Ｂ７Ｈ２の場合）、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３の場合）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ－３の場合）、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）／ＢＭＳ－６６３５１３およびＰＦ－０５０８２５６６（ＣＤ１３７／４－１ＢＢの場合）、ＣＤＸ－１１２７（ＣＤ２７の場合）、ＭＥＤＩ－６３８３およびＭＥＤＩ－６４６９（ＯＸ４０の場合）、ＲＧ－７８８８（ＯＸ４０Ｌの場合）、Ａｔａｃｉｃｅｐｔ（ＴＡＣＩの場合）、ＣＰ－８７０８９３（ＣＤ４０の場合）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ４０の場合）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ４０の場合）、ならびにムロモナブ－ＣＤ３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３）（ＣＤ３に対して）を含む。

癌治療において本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと併用することができる分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニスト、またはＮＫ細胞上の活性化性受容体のアゴニストを含む。例として、アンタゴニスト抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＫＩＲ（例えば、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ））、ＣＳＦ－１Ｒアンタゴニスト（例えば、ＲＧ７１５５）アンタゴニストと併用することができる。

腫瘍は、様々なメカニズムを通じて宿主免疫のモニタリングを回避する。ここで、多くのメカニズムは、腫瘍発現免疫抑制タンパク質の不活性化によって克服されることができる。ここで、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０およびＦａｓリガンドを含む。これらの実体のそれぞれに対する抗体は、免疫抑制剤の効果を打ち消し、かつ宿主の腫瘍免疫応答を促進するために、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。

宿主免疫応答を活性化する他の抗体は、本明細書に記載の抗腫瘍阻害剤と組み合わせて使用されることができる。これは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞表面分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞補助活性を効果的に代替されることができ、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用されることができる。例えば、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢおよびＩＣＯＳ等のＴ細胞共刺激分子を活性化する抗体は、Ｔ細胞活性化レベルを向上させることができる。

特定の実施形態において、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、例えば、抗がん剤、放射性毒性剤、または免疫抑制剤等の一つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて使用することができる。このような組み合わせは、薬剤耐性、アンタゴニストを無効にする腫瘍抗原性の変化、および毒性（一つまたは複数の低用量の薬剤を投与することによって）によって引き起こされる問題を解決することができる。

本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、（免疫複合体として）当該薬剤にリンクされるか、または当該薬剤とは別投与されることができる。後者の場合（別に投与）、抗体は、当該薬剤の投与の前、後または同時に投与されることができるか、または抗腫瘍療法（例えば、放射線治療）等の他の既知の療法とともに投与される。本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、一つまたは複数の抗がん剤と同時に投与されて、異なるメカニズムを介して相乗的に作用してヒト癌細胞に細胞毒性効果をもたらす二つの抗がん剤を提供することができる。

本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、例えば、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗代謝物、解毒剤、インターフェロン、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ホルモン、有糸分裂阻害剤、ホスファチジルアルコール－３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、哺乳動物ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤、セントロソームデクラスタリング剤、マルチキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤、タキサンまたはタキサン誘導体、アロマターゼ阻害剤、アントラサイクリン、微小管標的薬、トポイソメラーゼ毒薬、分子ターゲティングまたは酵素阻害剤（例えば、キナーゼまたはタンパク質ジャケターゼ）、シチジン類似体またはその組み合わせ等の抗がん剤と組み合わせることができる。

例示的なアルキル化剤は、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ）、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）、カルムスチン（Ｇｌｉａｄｅｌ）、イホスファミド（Ｉｆｅｘ）、ジクロロエチルメチルアミン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）、チオプレックス（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）、ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ）、またはストレプトゾトシン（Ｚａｎｏｓａｒ）を含むが、これらに限定されない。

例示的なアントラサイクリンは、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシンリポソーム（Ｄｏｘｉｌ）、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、ダウノルビシンリポソーム（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ）、アクチノマイシン（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ）、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、イダルビシン（イダマイシン）、プルカマイシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）、セロマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）、ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ）、またはバルビシン（Ｖａｌｓｔａｒ）を含むが、これらに限定されない。

例示的な抗代謝物は、フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）、フルオロウラシルカペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ）、メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｏｌ）、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）、ネララビン（Ａｒｒａｎｏｎ）、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ Ｎｏｖａｐｌｕｓ）、クロファラビン（Ｃｌｏｌａｒ）、シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ）、デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ）、シタラビンリポソーム（ＤｅｐｏＣｙｔ）、ヒドロキシ尿素（Ｄｒｏｘｉａ）、プララトレキサート（Ｆｏｌｏｔｙｎ）、フルダラビン（ＦＵＤＲ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）、フルダラビン（Ｏｆｏｒｔａ）、メトトレキサート（ＭＴＸ、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）、メトトレキサート（Ｔｒｅｘａｌｌ）、チオグアニン（Ｔａｂｌｏｉｄ）、ＴＳ－１またはシタラビン（Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ）を含むが、これらに限定されない。

例示的な解毒剤は、アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ）またはメスナ（Ｍｅｓｎｅｘ）を含むが、これらに限定されない。

例示的なインターフェロンは、インターフェロンα－２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）またはインターフェロンα－２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ）を含むが、これらに限定されない。

例示的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ）、ベバシズマブ（アバスチン）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、トシツムマブ／ヨウ素１３１トシツムマブ（Ｂｅｘｘａｒ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、イブリツモマブ（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）（Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｉｎ－１１１、Ｙ－９０ Ｚｅｖａｌｉｎ）、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ）またはデノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）を含むが、これらに限定されない。

例示的なＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、ＰＫＩ－１６６、カヌチニブ（ＣＩ－１０３３）、マツズマブ（Ｅｍｄ７２００）またはＥＫＢ－５６９を含むが、これらに限定されない。

例示的なＨＥＲ２阻害剤は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）またはＡＣ－４８０を含むが、これらに限定されない。

例示的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ）、バルプロ酸、ロミデプシン、エンチノスタット、アベキシノスタット（ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、グビノスタット、およびモキセチノスタットを含むが、これらに限定されない。

例示的なホルモンは、タモキシフェン（Ｓｏｌｔａｍｏｘ、Ｎｏｌｖａｄｅｘ）、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ）、メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ）、リュープロレリン（Ｌｕｐｒｏｎ、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ、Ｅｌｉｇａｒｄ、Ｖｉａｄｕｒ）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ）、トリプトレリン（Ｔｒｅｌｓｔａｒ ＬＡ、Ｔｒｅｌｓｔａｒ Ｄｅｐｏｔ）、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ）、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ）、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、フルメチルテストステロン（Ａｎｄｒｏｘｙ、Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ）、メドロキシプロゲステロン（Ｐｒｏｖｅｒａ、Ｄｅｐｏ－Ｐｒｏｖｅｒａ）、エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、デガレリクス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ）、ニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ）、アブレリクス（Ｐｌｅｎａｘｉｓ）、またはテストステロン（Ｔｅｓｌａｃ）を含むが、これらに限定されない。

例示的な有糸分裂阻害剤は、タキソール（Ｔａｘｏｌ、Ｏｎｘｏｌ、Ａｂｒａｘａｎｅ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）、エトポシド（Ｔｏｐｏｓａｒ、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ、ＶｅＰｅｓｉｄ）、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ）、イキサベピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ）、ノコダゾール、エポチロン、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、カンプトテシン（ＣＰＴ）、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、アマクリジンまたはラメラリン（ｌａｍｅｌｌａｒｉｎ）Ｄ（ＬＡＭ－Ｄ）を含むが、これらに限定されない。

例示的なホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤は、不可逆的ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン、ワートマニン誘導体デメトキシピリジンＬＹ２９４００２、可逆的ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＢＫＭ１２０（Ｂｕｐａｒｌｉｓｉｂ）、イデラリシブ（Ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ）（ＰＩ３Ｋδ阻害剤の一種）、デュベリシブ（ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ）（ＩＰＩ－１４５、ＰＩ３Ｋ δおよびγ阻害剤）、アルペリシブ（ａｌｐｅｌｉｓｉｂ）（ＢＹＬ７１９）、α－特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤の一種、ＴＧＲ １２０２（以前にはＲＰ５２６４と呼ばれる）、経口ＰＩ３Ｋ δ阻害剤の一種、ならびにコパンリシブ（ｃｏｐａｎｌｉｓｉｂ）（ＢＡＹ ８０－６９４６）、主にＰＩ３Ｋα、δアイソタイプ阻害剤の一種を含むが、これらに限定されない。

例示的なＡｋｔ阻害剤は、ミチフォックス、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ－００６８、ＭＫ２２０６、ペリフォー、ＲＸ－０２０１、ＰＢＩ－０５２０４、ＧＳＫ２１４１７９５、およびＳＲ１３６６８を含むが、これらに限定されない。

例示的なＭＴＯＲ阻害剤は、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）またはテムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｕｎｅ）、ジフォスリムス（ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、ジフォスリムス（ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ－０２７（ＯＳＩ）、ＩＮＫ－１２８、ＢＥＺ２３５、ＰＩ－１０３、トリン（Ｔｏｒｉｎ）１、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｋｕ－００６３７９４、ＷＡＹ－６００、ＷＹＥ－６８７、ＷＹＥ－３５４、およびＣＣ－２２３を含むが、これらに限定されない。

例示的なプロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ（ＰＳ－３４１）、イキサゾミブ（ｉｘａｚｏｍｉｂ）（ＭＬＮ ２２３８）、ＭＬＮ ９７０８、デランゾミブ（ｄｅｌａｎｚｏｍｉｂ）（ＣＥＰ－１８７７０）、カルフィルゾミブ（ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ）（ＰＲ－１７１）、ＹＵ１０１、オポゾミブ（ｏｐｒｏｚｏｍｉｂ）（ＯＮＸ－０９１２）、マリゾミブ（ｍａｒｉｚｏｍｉｂ）（ＮＰＩ－００５２）、およびジスフィラム（ｄｉｓｕｆｉｒａｍ）を含むが、これらに限定されない。

例示的なＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、イパリブ、ベラパリブ（ｖｅｌａｐａｒｉｂ）、ＢＭＮ－６７３、ＢＳＩ－２０１、ＡＧ０１４６９９、ＡＢＴ－８８８、ＧＰＩ２１０１６、ＭＫ４８２７、ＩＮＯ－１００１、ＣＥＰ－９７２２、ＰＪ－３４、Ｔｉｑ－Ａ、Ｐｈｅｎ、ＰＦ－０１３６７３３８および前述の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

例示的なＲａｓ／ＭＡＰＫ阻害剤は、トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、セルメチニブ（ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ（ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ）、ＣＩ－１０４０、ＰＤ０３２５９０１、ＡＳ７０３０２６、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５０６８７６０、ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２、ＴＡＫ－７３３、Ｕ０１２６、ＭＥＫ１６２、およびＧＤＣ－０９７３を含むが、これらに限定されない。

例示的なセントロソームデクラスタリング剤は、グリセオフルビン、ノスカピン（ｎｏｓｃａｐｉｎｅ）、例えば、臭化ノスカピン（例えば、９－ブロモノスカピン（９－ｂｒｏｍｏｎｏｓｃａｐｉｎｅ））、還元臭化ノスカピン（ＲＢＮ）、Ｎ－（３－ブロモベンジル）ノスカピン、アミンノスカピンおよびその水溶性誘導体等のノスカピン誘導体、ＣＷ０６９、フェナントレンから派生されたポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ阻害剤、ＰＪ－３４、Ｎ２－（３－ピリジルメチル）－５－ニトロ－２－フラミド、Ｎ２－（２－チエニルメチル）－５－ニトロ－２－フラミド、ならびにＮ２－ベンジル－５－ニトロ－２－フラミドを含むが、これらに限定されない。

例示的なマルチキナーゼ阻害剤は、レゴラフェニブ、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ＢＩＢＷ２９９２、Ｅ７０８０、Ｚｄ６４７４、ＰＫＣ－４１２、モテサニブ、またはＡＰ２４５３４を含むが、これらに限定されない。

例示的なセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤は、ルボキシスタウリン（ｒｕｂｏｘｉｓｔａｕｒｉｎ）、エリル（ｅｒｉｌ）／塩酸イースジル、フラボノイド抗腫瘍薬、セリシクリブ（ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）（ＣＹＣ２０２、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｒｉｎｅ）、ＳＮＳ－０３２（ＢＭＳ－３８７０３２）、Ｐｋｃ４１２、ブリオスタチン、ＫＡＩ－９８０３、ＳＦ１１２６、ＶＸ－６８０、Ａｚｄ１１５２、Ａｒｒｙ－１４２８８６（ＡＺＤ－６２４４）、ＳＣＩＯ－４６９、ＧＷ６８１３２３、ＣＣ－４０１、ＣＥＰ－１７０７またはＰＤ３３２９９１を含むが、これらに限定されない。

例示的なチロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、トラスツズマブ（ヒーピング）、ベバシズマブ（アバスチン）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）、バタラニブ（ｖａｔａｌａｎｉｂ）（Ｐｔｋ７８７、ＺＫ２２２５８４）、ＣＥＰ－７０１、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＸＬ９９９、ＶＸ－３２２、Ａｚｄ０５３０、ＢＭＳ－３５４８２５、ＳＫＩ－６０６ ＣＰ－６９０、ＡＧ－４９０、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＷＨＩ－Ｐ１３１、ＡＣ－２２０、またはＡＭＧ８８８を含むが、これらに限定されない。

例示的なＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤は、ベバシズマブ（アバスチン）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ラニビズマブ、ペガプタニブ、またはバンデチニブ（ｖａｎｄｅｔｉｎｉｂ）を含むが、これらに限定されない。

例示的な微小管標的薬は、タキソール、ドセタキセル、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、ノコダゾール、エポチロンおよびノビボンを含むが、これらに限定されない。

例示的なトポイソメラーゼ毒薬は、テニポシド、エトポシド、ドキソルビシン、カンプトテシン、ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アマクリジン、エピルビシンおよびイダルビシンを含むが、これらに限定されない。

例示的なタキサンまたはタキサン誘導体は、タキソールおよびドセタキセルを含むが、これらに限定されない。

例示的な一般的な化学療法剤、抗がん剤、抗増殖剤は、ヘキサメチルメラミン（Ｈｅｘａｌｅｎ）、イソトレチノイン（Ａｃｃｕｔａｎｅ、Ａｍｎｅｓｔｅｅｍ、Ｃｌａｒａｖｉｓ、Ｓｏｔｒｅｔ）、レチノイン酸（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）、アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）、レバミソール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）、ミトタン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）、プロカルバゾール（Ｍａｔｕｌａｎｅ）、ペグアスパラガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ）、デニロイキン－毒素抱合体（Ｏｎｔａｋ）、フォトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）、アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、レサリドマイド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）、サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）、シロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、三酸化ヒ素（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）、ベルテポルフィン（Ｖｉｓｕｄｙｎｅ）、ミモシン（Ｌｅｕｃｅｎｏｌ）、（１Ｍテガフール－０．４ Ｍ ５－クロロ－２，４－ジヒドロキシピリミジン－１ Ｍカリウムオキサジン）またはロバスタチンを含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、サブ治療量の用量で投与され、他の抗免疫チェックポイント調節剤抗体またはアンタゴニストは、サブ治療量の用量で投与され、血管新生アンタゴニストは、サブ治療量の用量で投与され、またはそれと合併した任意のアンタゴニストは、それぞれサブ治療量の用量で投与される。

特定の実施形態において、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ ＲＩＩ、チェックポイント調節剤、および／または血管新生経路の阻害は、一般的な化学療法レジメンに従って、標準的な癌治療（例えば、手術、放射線治療、および化学療法）と組み合わせることができる。これらの場合、投与される化学療法試薬の用量を減少させることが可能かもしれない。このような組み合わせの例としては、黒色腫の治療における本発明のチェックポイント調節剤アンタゴニストとダカルバジンとを合併する。このような組み合わせの他の例としては、黒色腫の治療における本発明のチェックポイント調節剤アンタゴニストとインターロイキン－２（ＩＬ－２）とを合併する。チェックポイント調節剤阻害と化学療法との合併は、細胞毒性免疫作用のアポトーシスを増強し、腫瘍抗原提示を増加させる可能性があると考えられる。他の相乗的な組み合わせ治療は、放射線治療、手術またはアンドロゲン遮断と合併する場合の細胞死を介したチェックポイント調節剤阻害を含む。このような方案は、それぞれ宿主に腫瘍抗原の供給源を作る。

特定の実施形態において、本明細書に記載のチェックポイント調節剤アンタゴニストは、多重特異性アンタゴニストに使用されるか、またはＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を癌細胞にターゲティングする二重特異性抗体と合併して使用されることができる（例えば、米国特許第５９２２８４５および５８３７２４３号を参照する）。二重特異性抗体は、二つの独立した抗原をターゲティングすることができる。例として、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを癌細胞または腫瘍にターゲティングするために使用される。このターゲティングは、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化することができる。これらの応答のＴ細胞アームは、チェックポイント調節剤の阻害によって増強されることができる。または、二重特異性抗体を使用して、抗原をＤＣｓに直接送達することもでき、当該二重特異性抗体は、腫瘍抗原および樹状細胞の特定の細胞表面マーカーに結合される。

ＩＩＩ．抗腫瘍アンタゴニストを発現するための核酸および宿主細胞
別の態様において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む本発明の抗腫瘍アンタゴニストをコードする核酸、およびこれらの核酸を含む発現ベクターを提供する。特に、当該核酸は、本明細書に記載の任意の抗体、アンタゴニストまたはフラグメントに対する一つまたは複数のＨＣＤＲｓ、ＬＣＤＲｓ、ＨＣＶＲｓおよび／またはＬＣＶＲｓをコードする。

ここで、一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニスト、抗体またはその抗原結合部分のいずれかをコードする一つまたは複数の核酸を提供する。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニスト、抗体またはその抗原結合部分のいずれかをコードする一つまたは複数の核酸を含む、一つまたは複数の発現ベクターを提供する。

別の態様において、本発明は、発現ベクターがトランスフェクトされた一つまたは複数の当該宿主細胞の使用を提供し、当該発現ベクターは、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニスト、抗体またはその抗原結合部分のいずれかをコードする一つまたは複数の核酸を含む。

一般的な手順（例えば、モノクローナル抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用する）を使用してハイブリドーマ腫瘍細胞によって生成されたモノクローナル抗体から抗原結合部位のＤＮＡ（ｓ）を単離および配列決定することができる。または、直接タンパク質配列決定によって、注目される免疫グロブリンからのアミノ酸配列を決定することができ、ユニバーサルコドン表に従って、適切なコーディングヌクレオチド配列を設計することができる。他の場合、当技術分野で知られている公開された情報源から、抗原結合部位または他の免疫グロブリン配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（定常領域、ヒンジ領域等を含む）を獲得することができる。

一態様において、本発明の任意の結合アンタゴニストフラグメントはｍ例えば、抗体可変領域等に対応するコドン最適化の合成ＤＮＡフラグメントの使用を含み得る。例として、免疫グロブリンＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、ＬＣ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはフレームワーク領域をコードするｃＤＮＡ配列のコドンは、様々なヒト、霊長類または哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫまたはＣＨＯ細胞）での発現のために最適化されることができる。本発明は、一つまたは二つのヌクレオチド配列を含む核酸分子の特徴を有し、当該ヌクレオチド配列は、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体分子の重鎖および軽鎖可変領域、ＣＤＲｓ、超可変環（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐ）、フレームワーク領域をコードする。

特定の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする発現ベクターを使用して、インビトロで培養細胞において本明細書の抗腫瘍アンタゴニストを合成することができ，またはそれを患者に直接投与して、インビボまたはエクスビボで抗腫瘍アンタゴニストを発現させることができる。本明細書に使用されるように、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、本明細書の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストに対応する一つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、抗体調製目的または治療剤としての直接投与のための宿主ポリヌクレオチドの発現に適した形態で提示する、ウイルスまたは非ウイルスのベクターを指す。

核酸配列が別の核酸配列と機能的関係にある場合、前者は、後者に「操作可能にリンク（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」される。例として、プレシーケンスまたはシグナルペプチドのＤＮＡがポリペプチド分泌に関与するプレタンパク質として発現されると、当該プレシーケンスまたはシグナルペプチドのＤＮＡは、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能にリンクされ、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を与えると、当該プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に操作可能にリンクされ、または、リボソーム結合部位が翻訳の便宜のために位置付けられると、当該リボソーム結合部位は、コード配列に操作可能にリンクされる。一般に、「操作可能にリンク」とは、リンクされたＤＮＡ配列が連続的であり、シグナルペプチドの例において、連続的であり、かつ読み取り段階にあることを指す。しかし、エンハンサーは、連続的である必要はない。リンクは、便利な限制性部位でのリンクによって達成される。この部位が存在しないと、一般的な手順に従って合成されたオリゴヌクレオチドアダプターまたは結合ペプチドを使用することができる。

チェックポイント調節剤アンタゴニストを発現するために使用される核酸配列は、通常、成熟タンパク質から除去されたアミノ末端シグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチド配列が発現レベルに影響を与えることができるため、ポリヌクレオチドは、様々な異なるＮ末端シグナルペプチド配列のいずれかをコードすることができる。当業者は、発現ベクターの設計が、例えば、トランスフェクトされる宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等の要因に依存することができることを理解されたい。

上記「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、一つまたは複数の宿主生物において、操作可能にリンクされたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。調節配列は、多くのクラスのこれらの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を支持するか、または特定の宿主細胞（例えば、組織特異的調節配列）においてのみヌクレオチド配列発現を支持することを含む。発現ベクターは、通常、転写終結のための配列を含み、さらにｍＲＮＡ安定性にプラスの影響を与える一つまたは複数の要素を含み得る。

発現ベクターは、抗腫瘍アンタゴニストの発現を支持するための、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む一つまたは複数の転写調節要素を含む。プロモーターは、固定位置に対して転写開始部位から初期転写機能のＤＮＡ配列を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子が本質的な相互作用に必要なコアヨウ素を含み、他の上流要素および応答性要素と一緒に走査することができる。

本明細書に使用された「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、その最も広い意味で使用されるべきであり、ゲノム遺伝子またはそのキメラＴＲＥからの転写調節要素（ＴＲＥ）を含み、追加のＴＲＥ（即ち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサーおよびサイレンサー）の有無にかかわらず、正確な転写開始のためのＴＡＴＡボックスまたは開始サブヨウ素を含み、それは、発展および／または外部刺激に応答して、それが操作可能にリンクされることができる遺伝子の活性化または阻害、ならびにトランス作用性調節タンパク質または核酸を調節する。プロモーターは、ゲノムフラグメントを含み得るか、または一つまたは複数のＴＲＥが組み合わせたキメラを含み得る。

好ましいプロモーターは、標的細胞において高レベルの発現を支持することができるプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＨＣＭＶ、ＳＶ４、伸長因子－１α（ＥＦ－１α））またはこれらの特定の標的細胞クラスで最適な発現を示すプロモーターを含み得る。エンハンサーは、通常、転写開始部位から離れて機能するＤＮＡ配列を指し、転写ユニットに対して５’または３’であり得る。また、エンハンサーは、イントロンないおよびコード配列内にある可能性がある。通常、１０～３００ｂｐの間の長さで、シスで作用する。エンハンサーの機能は、近くのプロモーターの転写を増加および／または調節することである。好ましいエンハンサーは、抗体生成細胞において高レベルの発現を支持するエンハンサーである。細胞または組織特異的転写調節要素（ＴＲＥ）を発現ベクターに導入して、発現を目的の細胞クラスに制限することができる。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｈ１またはＵ６）は、ｓｉＲＮＡを発現するｓｈＲＮＡに特に適している。発現ベクターは、一つまたは複数の細胞クラスにおける抗腫瘍アンタゴニストの発現を促進するように設計することができる。

特定の実施形態において、一つまたは複数の発現ベクターは、抗腫瘍アンタゴニストと、Ｔｉｅ２経路、ＶＥＧＦ経路または免疫チェックポイント調節剤をターゲティングする一つまたは複数のｓｉＲＮＡを発現するように設計することができる。

ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するように設計することができる二本鎖ＲＮＡである。合成によって生成されたｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素によって細胞内で通常処理されるｓｉＲＮＡクラスを構造的に模倣する。発現ベクターから発現させる場合、発現ベクターは、細胞をターゲティングするｓｉＲＮＡにプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を転写するように設計される。よく知られているアルゴリズムを使用して合成ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを設計し、一般的なＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して合成することができる。

抗腫瘍アンタゴニストのそれぞれの鎖を共発現（ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓ）させるために、適切なスプライスドナーおよびスプライス受容体配列を導入して、二つの生成物を発現させることができる。または、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド配列を使用して、一つのプロモーターに由来する複数の生成物を発現させることができる。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの５’末端に結合することなくリボソームが結合できる構造を提供する。従って、リボソームに、ｍＲＮＡの２番目の開始コドンで翻訳を開始するように指示して、単一のｍＲＮＡから複数のポリペプチドを生成する。２Ａペプチドは、２Ａ部位の上流および下流のペプチドからの同時翻訳自己切断を仲介する短い配列を含み、これにより、一つの転写生成物で２等モル量の異なるタンパク質を生成することができる。ＣＨＹＳＥＬは、真核生物の翻訳リボソームにｍＲＮＡから解離することなく成長中のポリペプチド鎖を放出させる２Ａペプチドの非限定的な例である。リボソームは、連続的に翻訳されることにより、２番目のポリペプチドが生成される。

発現ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含むことができる。ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２等のレンチウイルスを含む）、Ｓｉｎｄｂｉｓおよび他のＲＮＡウイルス、αウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、ミルクポリベシクルウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス（ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）等に由来することができる。非ウイルスベクターは、ウイルスから派生された成分（例えば、キャプシドおよび／またはエンベロープ）がパッケージングされていない、単に「裸の」発現ベクターである。

特定の場合、ウイルスベクターに固有のターゲティング機能を使用するか、またはウイルスベクターに組み込まれることにより、特定の疾患または細胞集団をこれらのベクターにターゲティングするように設計されることができる。ポリヌクレオチドの送達および発現のために、特定の細胞を「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｅｄ）」することができる。従って、この場合、「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」という用語は、特定の細胞に送達されるキャプシド、エンベロープタンパク質、抗体の形態の内因性および異種結合剤、細胞の特定のサブセットに発現を制限する組織特異的調製成分、または前述の療法に基づくことができる。

いくつかの実施形態において、抗体鎖の発現は、例えば、組織特異的または遍在に存在するプロモーター等の調節成分に制御下にある。いくつかの実施形態において、遍在するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ－ニワトリβ－アクチンパイブリッド（ＣＡＧ）アクチベーター、組織特異的または腫瘍特異的プロモーター）は、それが由来する特定の抗体の重鎖、または軽鎖、または一本鎖誘導体の発現を制御する。

非ウイルス発現ベクターは、裸のＤＮＡを直接注入するか、またはリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、ウイルス様粒子または赤血球ゴースト（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｇｈｏｓｔ）に抗腫瘍アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドをパッケージングすることにより、非ウイルス遺伝子転移に使用されることができる。これらの組成物は、化学的複合体形成によってターゲティングドメインにさらにリンクされて、標的化された送達および／または目的の所望の細胞への核酸の侵入を容易にすることができる。さらに、プラスミドベクターは、高分子ＤＮＡ結合陽イオン（例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン）等の合成的遺伝子転移分子と一緒に培養し、細胞ターゲティングリガンド（例えば、非唾液ムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）にリンクさせることができる。

または、裸のＤＮＡを使用することもできる。圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）または生分解性ラテックスビーズを使用することで裸のＤＮＡの摂取効率を改善することができる。ビーズを処理して疎水性を増加させ、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を促進することによってこれらの送達をさらに改善することができる。

ＩＶ．二重特異性アンタゴニストを作成する方法
別の態様において、本発明は、核酸または発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供し、当該核酸または発現ベクターは、本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする。当該宿主細胞は、本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト（その免疫グロブリン重鎖または軽鎖を含む）を発現することができる任意の真核または原核細胞であり得る。

別の態様において、抗腫瘍アンタゴニストを作成する方法は、細胞での発現に適切なアンタゴニスト、抗体またはそのフラグメントの製造および精製を許容する条件下で、本発明の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする一つまたは複数の核酸または発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を培養する段階を含む。

別の態様において、本発明は、抗体中の一つまたは複数のポリペプチド鎖をコードする一つまたは複数の構造を一過性または安定して発現する細胞を培養する段階、および当該培養された細胞から抗体を精製する段階を含む、抗体を作成する方法を提供する。機能的な抗体を生成することができる任意の細胞を使用することができる。好ましい実施形態において、当該抗体発現細胞は、真核生物または哺乳類動物（好ましくはヒト細胞）である。様々な組織細胞形態の細胞を使用して抗体を発現させることができる。別の実施形態において、当該細胞は、酵母菌細胞、昆虫細胞または細菌細胞である。好ましくは、当該抗体作製細胞は、抗体発現ベクターで安定的にトランスフェクトされる。

例えば、裸のＤＮＡ技術、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、ポリマー媒介トランスフェクション、ペプチド媒介トランスフェクション、ウイルス媒介感染症、物理剤または化学剤または処理、エレクトロポレーション等の任意の一般的な方法によって、抗体の重鎖および軽鎖をコードする一つまたは複数の発現ベクターを細胞に導入することができる。さらに、一つまたは複数の発現ベクターおよび選択可能なマーカーを細胞にトランスフェクトして、抗体を発現する安定的にトランスフェクトされたクローンの選択を容易にすることができる。当技術分野で知られている技術に従って、例えば、遠心分離、クロマトグラフィー等を介して、細胞によって作製された抗体を精製および／または収集することができる。

哺乳動物細胞での使用に適した選択可能なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイコマイシンおよびピューロマイシンを含む。選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞にうまく転移される場合、選択圧力下に置かれると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は生き残ることができる。広く使用される選択可能な制度は二つの異なるクラスがある。第１のクラスは、細胞代謝に基づいており、かつ補充培地とは独立して増殖する能力を欠く変異細胞株を使用する。二つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ－細胞およびマウスＬＴＫ－細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチン等の栄養素を添加されない場合に増殖する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要とする特定の遺伝子を欠いているため、欠失されたヌクレオチドが補充された培地で提供されない限り、それらは生き残ることができない。補充培地の替代方案は、完全なＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を対ソウル遺伝子を欠く細胞に導入して、それらの装飾要件を変更することができる。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されていない個体の細胞は、非補充培地では生き残れることができない。

第２のクラスは、優勢な選択であり、これは、任意の細胞クラスで使用される選択方案を指し、変異細胞株の使用を必要としない。これらの方案は、通常、薬物を使用して宿主細胞の増殖を遮断する。新しい遺伝子を有するこれらの細胞は、耐性タンパク質を発現し、かつ選択で生き残ることができるタンパク質を発現する。この優性な選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸またはハイグロマイシンという薬物を使用することである。これらの三つの例は、真核細胞の制御下で、細菌遺伝子を使用して、それぞれ適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジエネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐性を発現する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピューロマイシンが含まれる。

抗体発現細胞の例としては、ヒトＪｕｒｋａｔ、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＷＥＨＩ線維肉腫細胞、およびリーシュマニア等の単細胞原生動物種を含む。また、ｃ－ｍｙｃまたは他の不死化剤を使用して一次細胞を不死化し、安定して形質転換された抗体を生成する細胞株を生成することができる。

一実施形態において、当該細胞株は、安定して形質転換されたリーシュマニア細胞株、例えば、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）を含む。リーシュマニアは、哺乳類形態のグリコシル化パターンを有する真核生物のタンパク質を高度に発現する、強力で急速に増殖する単細胞宿主であることが知られている。市販のリーシュマニア発現セット（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することができる。

いくつかの実施形態において、当該細胞株は、培地１Ｌあたり少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、または少なくとも５００ｍｇの抗体を発現する。

本発明の抗体は、任意の適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、およびＡＩＭ Ｖ^R）で培養および維持された後、抗体発現細胞から単離されることができる。タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを使用する免疫親の精製を含む一般的なタンパク質精製方法（例えば、親の精製、クロマトグラフィー等）を使用して抗体を精製することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、単離された培養上清に分泌されるように設計される。

Ｖ．医薬組成物および治療方法
本発明の別の態様は、医薬組成物および細胞増殖性障害（例えば、癌、慢性感染症、または免疫不全の疾患状態）を治療する方法に関する。一実施形態において、当該医薬組成物は、本発明の一つまたは複数の抗腫瘍アンタゴニストを含む。いくつかの実施形態において、当該抗腫瘍アンタゴニストは、一つまたは複数のＴＧＦ－β１阻害剤またはＴＧＦ－β１ ＲＩＩ阻害剤を、（１）ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤、または（２）ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ２阻害剤、アンジオポエチン－１／２阻害剤、およびＴｉｅ２Ｒ阻害剤等の一つまたは複数の血管新生阻害剤に結合することを含む。当該アンタゴニストは、医薬上許容される担体とともに調製される。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の一つまたは複数の異なる抗体、一つまたは複数の多重特異性抗体、一つまたは複数の免疫複合体、または前述の組み合わせを含み得る。

上記のように、本明細書に記載されるような医薬組成物を使用する方法は、必要とする個体に本明細書による有効量の医薬組成物を投与する段階を含む。

任意の適切な投与経路または投与方式を使用して、治療的または予防的有効量の抗体またはアンタゴニストを患者に提供することができる。例示的な投与経路または方式は、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内）、経口、局所（鼻腔内、経皮、皮内または眼内）、粘膜（例えば、鼻腔、舌下、口腔、直腸、膣）吸入、リンパ管内、脊髄内、頭蓋内、腹腔内、気管内、膀胱内、髄腔内、腸内、肺内、リンパ内、血管内、眼窩内、被膜内および軽尿道、ならびにカテーテルまたはステントによる局所送達を含む。

本明細書による抗体またはアンタゴニストを含む医薬組成物は、任意の薬学的に許容される担体または賦形剤で調製されることができる。本明細書に使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性のある任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含む。医薬組成物は、適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含み得る。例示的な担体または賦形剤は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコール等のポリマーを含むが、これらに限定されない。例示的な薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の一つまたは複数、および前述の組み合わせを含む。多くの場合、組成物には、好ましくは糖等の等張剤、例えば、マンニトール、ソルビトール等のポリオール、または塩化ナトリウムが含まれる。薬学的に許容される担体は、治療剤の貯蔵寿命または効力を増加させる、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤等の少量の補助物質をさらに含み得る。

非経口投与に適した医薬組成物にチェックポイント調節剤アンタゴニストを組み込ませることができる。適切な緩衝剤は、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムを含むが、これらに限定されない。塩化ナトリウムを使用して、溶液の毒性を０～３００ミリモル（ｍＭ）の濃度に変更することができる（液体剤形には１５０ミリモルの濃度が最適である）。凍結防止剤は、凍結乾燥用の剤形を含み得、主に０～１０％のスクロース（最も好ましくは０．５～１．０％である）である。他の適切な凍結防止剤は、トレハロースおよびラクトースを含む。凍結乾燥剤形は、主に１～１０％のマンニトール（最も好ましくは２～４％である）の充填剤を含み得る。液体および凍結乾燥剤形は、安定剤、主に１～５０ミリモルの濃度のＬ－メチオニン（最も好ましくは５～１０ミリモルの濃度である）を使用することができる。他の適切な充填剤は、グリシン、アルギニンを含み、これは、０～０．０５％のポリソルベート－８０（最も好ましくは０．００５～０．０１％である）の形態で含まれることができる。追加の表面活性剤は、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ表面活性剤を含むが、これらに限定されない。

治療性抗腫瘍アンタゴニスト製剤を、凍結乾燥し、かつ滅菌粉末として保存され、好ましくは真空下で保存され、次に注射前に静菌水（例えば、ベンジルアルコール防腐剤）または滅菌水で再構成することができる。医薬組成物は、注射、例えば、単回ボーラス注射または持続注入による非経口投与に処方することができる。

医薬組成物における治療剤は、「治療有効量」または「予防有効量」で調製されることができる。「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および時間で有効な量を指す。組換えベクターの治療有効量は、治療される病症、病症の重症度および経過、投与方式、抗体または薬剤がお坊的または治療的目的で投与されるかどうか、特定の試薬の生物学的利用能、個体における所望の応答を誘発する抗腫瘍アンタゴニストの能力、以前の療法、患者の年齢、体重および性別、患者の病歴および抗体に対する反応、使用される抗腫瘍アンタゴニストクラス、主治医の考慮事項等に基づくことができる。治療有効量は、そのうちの組換えベクターの毒性または有害な効果が治療的に有益な効果を上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および機関で有効な量を指す。

好ましくは、抗腫瘍アンタゴニストのポリペプチド領域は、投与された治療薬に対する炎症性反応を減少させるために投与されるのと同じ宿主に由来する。

抗腫瘍アンタゴニストは、一度または一連の治療にわたって患者に投与されるのに適しており、診断からいつでも患者に投与されることができる。抗腫瘍アンタゴニストは、単剤治療として、または前記疾患の治療に使用される他の薬物または療法と組み合わせて投与されることができる。

一般的な提案として、単回投与であろうと複数回投与であろうと、治療的有効量または予防的有効量の抗腫瘍アンタゴニストは、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与される。特定の実施形態において、各抗腫瘍アンタゴニストは、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日～約ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日～約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日～約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日～約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日～約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日～約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日～約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日～約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与される。

他の実施形態において、抗腫瘍アンタゴニストは、３日ごとに５００μｇ～２０ｇ、または３日ごとに２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。

他の実施形態において、各抗腫瘍アンタゴニストは、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１００ｎｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１μｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１０μｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１００μｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１ｍｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１０ｍｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１００ｍｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１０ｎｇ～約１００００ｍｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１μｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１０μｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１００μｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１ｍｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１０ｍｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１００ｍｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１００ｎｇ～約１００００ｍｇ、単回投与当たり約１μｇ～約１０μｇ、単回投与当たり約１μｇ～約１００μｇ、単回投与当たり約１μｇ～約１ｍｇ、単回投与当たり約１μｇ～約１０ｍｇ、単回投与当たり約１μｇ～約１００ｍｇ、単回投与当たり約１μｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１μｇ～約１００００ｍｇ、単回投与当たり約１０μｇ～約１００μｇ、単回投与当たり約１０μｇ～約１ｍｇ、単回投与当たり約１０μｇ～約１０ｍｇ、単回投与当たり約１０μｇ～約１００ｍｇ、単回投与当たり約１０μｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１０μｇ～約１００００ｍｇ、単回投与当たり約１００μｇ～約１ｍｇ、単回投与当たり約１００μｇ～約１０ｍｇ、単回投与当たり約１００μｇ～約１００ｍｇ、単回投与当たり約１００μｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１００μｇ～約１００００ｍｇ、単回投与当たり約１ｍｇ～約１０ｍｇ、単回投与当たり約１ｍｇ～約１００ｍｇ、単回投与当たり約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１ｍｇ～約１００００ｍｇ、単回投与当たり約１０ｍｇ～約１００ｍｇ、単回投与当たり約１０ｍｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１０ｍｇ～約１００００ｍｇ、単回投与当たり約１００ｍｇ～約１０００ｍｇ、単回投与当たり約１００ｍｇ～約１００００ｍｇおよび^{単回投与当たり}約１０００ｍｇ～約１００００ｍｇ等の範囲で投与される。抗腫瘍アンタゴニストは、毎日に、２、３、４、５、６または７日ごとに、または１、２、３または４週間ごとに投与されることができる。

他の特定の実施形態において、抗腫瘍アンタゴニストは、約０．０００６ｍｇ／日、０．００１ｍｇ／日、０．００３ｍｇ／日、０．００６ｍｇ／日、０．０１ｍｇ／日、０．０３ｍｇ／日、０．０６ｍｇ／日、０．１ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、１ｍｇ／日、３ｍｇ／日、６ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、５０００ｍｇ／日または１００００ｍｇ／日等の用量で投与されることができる。予想とおり、用量は、患者の病症、大きさ、年齢および状況に依存される。

特定の実施形態において、抗腫瘍アンタゴニストをコードする配列は、適切な発現ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）に導入されて、細胞増殖性障害を患う患者において有効量の抗腫瘍アンタゴニストを発現させる。例えば、一つまたは複数の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスの投与を含む特定の実施形態において、前記医薬組成物は、ｋｇあたり少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、または少なくとも１０^１４個のゲノムコピー（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｉｅｓ）（ＧＣ）または組換えウイルス粒子、またはその任意の範囲を含む量のｒＡＡＶを含み得る。特定の実施形態において、前記医薬組成物は、個体あたり少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、少なくとも１０^１４、少なくとも１０^１５個のゲノムコピーまたは組換えウイルス粒子ゲノムコピー、またはその任意の範囲を含む量の有効量の組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）を含む。

特定の細胞増殖性障害に適した複数の分野で許容される動物モデルで投与量を試験することができる。

送達方法は、死んだウイルスにリンクされたまたはリンクされていないポリ陽イオン性凝縮ＤＮＡ、リガンド結合ＤＮＡ、リポソーム、真核細胞送達ベクター細胞、光重合性ヒドロゲル材料の沈殿、携帯型遺伝子転移粒子ガンの使用、イオン化放射線、核電荷中和または細胞膜との融合、粒子媒介遺伝子転移等も含み得る。

以下の実施例によって本発明をさらに説明し、実施例は限定的であると解釈されるべきではない。本明細書の全体で引用されるすべての参照文献、特許および公開される特許出願の内容、および図と表は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例
実施例１：モノクローナル抗体の生成
当技術分野で知られている技術を使用して、本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を生成し、かつスクリーニングし、例えば：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）「抗体の実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照する。当技術分野で知られている技術を使用して、抗原特異的融合腫瘍のモノクローナル抗体をクローン化、シーケンシングおよび設計し、例えば：Ｌｏ．Ｂ．Ｋ．Ｃ、「分子生物学の方法^商標（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ^商標）」、Ｖｏｌ．２４８ ２００４、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを参照する。

実施例２：二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの設計
図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ二つの二重特異性抗腫瘍アンタゴニストであるＢｉ－ＰＢ－１（またはＢｉ－ＰＬＢ－１）およびＢｉ－ＰＢ－１（またはＢｉ－ＰＬＢ－２）を示す。これらのアンタゴニスト細胞は、（ｉ）二つの重鎖のそれぞれのＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合されるか（図５Ａ）、または（ｉｉ）Ｆｃ環のＣＨ３領域内に挿入される（図５Ｂ）、ＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＴＧＦ－β－ＲＩＩ ＥＣＤ）を有するチェックポイント調節剤抗体足場（抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１）を含む。

図５Ａおよび５Ｂに示される実施形態において、当該二重特異性抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４足場を有することができる。また、任意の一つまたは複数の抗体特異性は、任意の他のチェックポイント調節剤アンタゴニスト特異性および／または任意の腫瘍ターゲティング抗体特異性（例えば、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ等）を使用して置き換えられることができる。

図６は、図５Ａおよび５Ｂの二重特異性抗体に対応する例示的な機能的領域配列を示す。

図７Ａ～７Ｂは、図５Ａおよび５Ｂの二重特異性抗体に対応する例示的な重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を示す。

実施例３：他の二重特異性アンタゴニストの設計
図８Ａ～８Ｃは、それぞれＢｉ－ＡＢ－１、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１およびＢｉ－ＺＢ－１の三つの異なる二重特異性アンタゴニストの設計を示し、それぞれが変異ＩｇＧ１（Ｋ４４７Ａ）足場においてカルボキシ末端ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。Ｂｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１は、すべてアバスチン／ベバシズマブに由来するアミノ末端抗ＶＥＧＦ可変領域（ＶＨ１、ＶＬ１）を含み、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１は、ＶＨ領域において二つのアミノ酸置換（Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ）を含む。Ｂｉ－ＺＢ－１は、ＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｋ４４７Ａ）領域の上流のアミノ末端アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）領域を含む。他の実施形態において、変異ＩｇＧ１（Ｋ４４７Ａ）足場の代替として、二重特異性アンタゴニストは、野生型ＩｇＧ１足場、様々な変異ＩｇＧ１足場、ＩｇＧ２足場、変異ＩｇＧ２足場、ＩｇＧ４足場、または変異ＩｇＧ４足場を含む。

図９Ａおよび９Ｂは、図８Ａ～８Ｃに示される二重特異性アンタゴニストに存在する様々な機能的領域配列を示す。

図１０は、図８Ａ～８Ｃに示される二重特異性アンタゴニストに対応する重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を示す。

図１１は、図８Ａ～８Ｃ示される二重特異性アンタゴニストの機能的領域の配置を要約する。

実施例４：図１０～１１のアンタゴニストの発現および精製
図１２は、クマシーブリリアントブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルであり、それは、ＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトされた場合、非還元型ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、ｗｔ ＶＥＧＦ－Ａ、またはＥ６ＱおよびＬ１１Ｖ変異を含むアンタゴニスト（即ち、それぞれＢｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１である）の発現レベルの増加を決定することを示す。図１２に示される力価は、ＰＯＲＯＳ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した細胞上清液の定量化によって決定される。この分析結果は、Ｂｉ－ＡＢ－１と比較して、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１発現レベルが１６７％向上されたことを示す。

図１３Ａは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）グラフを示し、それは、タンパク質Ａによって精製されたＢｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１から獲得された高分子量（ＨＭＷ）、低分子量（ＬＭＷ）種、および二量体の相対的レベルを示す。図１３Ｂは、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを使用したＳＥ－ＵＰＬＣにより、精製された二量体のパーセンテージ（Ｂｉ－ＡＢ－１の場合は９８．６％であり、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１の場合は９８．７％である）がＨＭＷ（１％）およびＬＭＷ（０．４％）種よりもはるかに大きいと決定されたことを示す。これらの結果は、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＢｉ－ＡＢ－１およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１への融合が、有意な高分子量（ＨＭＷ）または低分子量（ＬＭＷ）種のレベルをもたらさなかったことを示す。

図１４Ａ～１４Ｂは、それぞれ非還元および還元条件下でのＢｉ－ＺＢ－１一過性にトランスフェクション後に獲得された上清液のクマシーブリリアントブルー染色ＰＡＧＥ分析を示す。この分析結果は、インビトロで８日間細胞を増殖した後、Ｂｉ－ＺＢ－１が良好な一過性発現レベル（２２０μｇ／ｍｌ）を有することを示す。

図１５は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）グラフを示し、それは、二量体（９６．１％）と比較して、タンパク質Ａによって精製されたＢｉ－ＺＢ－１が、低レベルの高分子量（ＨＭＷ、３．４％）および低分子量（ＬＭＷ、０．５％）種を有することを示す。

実施例５：図８Ａ～８Ｃの抗腫瘍アンタゴニストの機能的特性
抗－ＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１）がＶＥＧＦによって媒介されたＶＥＧＦＲ２（即ち、同族受容体）の活性化に拮抗する能力を評価するために、細胞ルシフェラーゼ試験（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）を実施する。この実験によると、段階希釈された抗ＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１）が存在する場合、ｈｕＶＥＧＦ１６５を使用して、ＮＦＡＴ応答性要素制御下でヒトＶＥＧＦＲ２と蛍ルシフェラーゼを発現する組換えＨＥＫ－２９３を刺激することを示す。この試験の結果は図１６に示される。予想とおり、濃度が向上された抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ２を活性化し、かつＮＦＡＴによって媒介されたルシフェラーゼ活性を誘導するＶＥＧＦ１６５の能力が徐々に中和される。

ＴＧＦ－β１およびＶＥＧＦ１６５に同時に結合する二重特異性アンタゴニスト（Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１）の能力を評価するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ試験を実施する。この実験において、ｈｕＴＧＦ－β１が９６ウェルプレートにコーティングされ、５％のＢＳＡで遮断し、続いてＢｉ－Ａ１Ｂ－１を加えてサンプルを段階希釈して培養し、続いてビオチン化されたｈｕ ＶＥＧＦ１６５を加える。ＴＭＢ基質を使用したストレプトアビジン－ＨＲＰによって結合分子を検出する。図１７の分析結果は、二重特異性アンタゴニスト（Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１）がＴＧＦ－β１およびＶＥＧＦ１６５に同時に結合することができることを示す。

ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤがＴＧＦ－β１によって媒介されたヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ（即ち、同族受容体）活性化を拮抗する能力を評価するために、細胞ルシフェラーゼ試験を実施する。この実験によると、段階希釈されたＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ（Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１、Ｂｉ－ＺＢ－１）に融合した抗体が存在する場合、ｈｕＴＧＦ－β１を使用して、ＳＭＡＤ応答性要素制御下でヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ受容体と蛍ルシフェラーゼを発現する組換えＨＥＫ－２９３細胞を刺激することを示す。この試験結果は図１８に示される。予想とおり、濃度が向上されたＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む抗体は、ヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩを活性化し、かつＳＭＡＤによって媒介されたルシフェラーゼの活性を誘導するＴＧＦ－β１の能力を徐々に中和する。この場合、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１およびＢｉ－ＺＢ－１は、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１のＩＣ５０が０．３２ｎＭであり、Ｂｉ－ＺＢ－１のＩＣ５０が０．３１ｎＭである等に反映されるように同様の拮抗能力を示す。これらのＩＣ５０は、対照ＴＧＦＢＲ２融合生成物（ＩＣ５０＝０．２０ｎＭ）に匹敵である。

インビボでのＢｉ－Ａ１Ｂ－１の薬物動態特性を評価するために、薬物動態曲線を説明する。簡単に説明すると、１０ｍｇ／ｋｇの各アンタゴニストを６～１０週齢の雌のＣＤ１マウスの尾静脈（各分子についてはｎ＝２のマウス）の尾静脈に静脈内注射する。注射後３分間、３時間、１日、３日、７日および１０日に血清を収集する。血清中の抗体を検出するために、５μｇ／ｋｇのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを使用して９６ウェルプレートでコーティングし、次に５％のミルク（ＰＢＳで調製）で遮断する。５％のミルクでのマウス血清の段階希釈、および標準品としての精製タンパク質分子の段階希釈を９６ウェルプレートに追加する。ペルオキシダーゼ共有結合マウス抗ヒトＩｇＧと培養し、かつさらに洗浄した後、二重特異性アンタゴニストＢｉ－Ａ１Ｂ－１（図１９）抗体をＴＭＢ－ＥＬＩＳＡマトリックスを使用して培養したから検出する。この分析結果は、二重特異性アンタゴニストＢｉ－Ａ１Ｂ－１の半減期（Ｔ_１／２）が７．４～１６日であることを示す。

実施例６：ＴＧＦ－β１ ＥＣＤｓを有する二重特異性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストの設計
図２０Ａ～２０Ｂは、Ｂｉ－ＰＢ－１．２（図２０Ａ）およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２（図２０Ｂ）の二つの二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを示し、それぞれは、抗体足場（（ＩｇＧ４ Ｋ４４７ＡまたはＩｇＧ１ Ｋ４４７Ａ）およびそれぞれ抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１に由来する可変領域を含み、さらに、各重鎖ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合したＴＧＦ－β－ＲＩＩ ＥＣＤを含む。

図２１は、図２０Ａおよび２０Ｂの二重特異性抗体に存在する機能的領域配列を示す。図２２は、図２０Ａおよび２０Ｂに示される二重特異性アンタゴニストに対応する重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を示す。図２３は、図２０Ａおよび２０Ｂに示される二重特異性アンタゴニストの機能的領域の配置を要約する。

実施例７：図２０Ａ～２０Ｂの二重特異性アンタゴニストの発現および精製
図２４Ａは、ネイティブポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示し、それは、１μｇの精製親の対照抗体（２Ｐ１７）と比較した、一過性発現システムにおけるＢｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２の発現レベルを示す。図２４Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）グラフを示し、図２４Ｃに示されるように、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質Ａによって精製されたＢｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２および抗ＰＤＬ１ ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ融合抗体（ベンチマーク）が二量体化分子（「二量体」）と比較して、低レベルの高分子量（ＨＭＷ）および低分子量（ＬＭＷ）種を有することを示す。図２５Ａ～２５Ｂは、Ｂｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２の二量体、ＨＭＷおよびＬＭＷ形態が４℃下で少なくとも４週間良好な安定性を示すことを示す。

実施例８：図２０Ａ～２０ＢにおけるＢｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２アンタゴニストの機能的特性
１．バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を使用してＢｉ－ＰＢ－１．２のＰＤ－１およびＴＧＦ－β１への結合の検出
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム）を使用して、生体光干渉法（Ｂｉｏ－ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を実行して、Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１タンパク質またはＨｉｓタグ付きのＴＧＦ－β１に対する抗体の結合動態特性を測定する。２０ｎＭの抗体を抗ヒトＩｇＧ捕捉バイオセンサーに組み込む。センサーを分析物の２倍または３倍段階希釈（最大濃度が７２ｎＭである）を含むウェルに５分間置いて、分析物（Ｈｉｓタグ付きヒトＰＤ－１またはＨｉｓタグ付きＴＧＦ－β１タンパク質）の結合を観察する。バイオセンサーのみを動的緩衝液に転移し、かつ干渉計のシグナルを１０分間モニタリングした後、解離度を測定する。少なくとも五つの試験濃度を含む１：１バインディンググローバルフィットモデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔ ｍｏｄｅｌ）を使用して、観察された開始速度および終了速度（ＫａおよびＫｄ）をフィッティングし、次に平衡結合定数ＫＤを計算する。

図２６Ａ～２６Ｅは、ＰＤ－１およびＴＧＦ－β１のＢｉ－ＰＢ－１．２（それぞれ図２６Ａ、２６Ｂである）および対応する抗ＰＤ－１抗体およびベンチマーク（Ｍｅｒｃｋ ＫＧＡから購入したＭ７８２４）（それぞれ図２６Ｃ、２６Ｄである）への結合の結果，およびそれらによって生成された結合親の定数（図２６Ｅ）を示す。当該結果は、Ｂｉ－ＰＢ－１．２が抗ＰＤ－１ベンチマーク（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）およびＭ７８２４ベンチマークよりもＰＤ－１およびＴＧＦ－β１に対して優れた結合親和性を有することを示す。

２．バイオレイヤー干渉法を使用したＢｉ－ＰＬＢ－１．２のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－β１への結合の検出
Ｂｉ－ＰＢ－１．２について前述したようにバイオレイヤー干渉法を使用して、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－β１への結合を検出する。図２７Ａ～２７Ｅは、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－β１のＢｉ－ＰＬＢ－１．２（それぞれ図２７Ａ、２７Ｂである）、および対応する抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＴＧＦ－β－ＲＩＩ ＥＣＤ融合抗体（ＴＧＦ－β１ベンチマーク）（それぞれ図２７Ｃ、２７Ｄである）への結合の結果，およびそれらによって生成された結合親の定数（図２７Ｅ）を示す。当該結果は、ＴＧＦ－β１に対するＢｉ－ＰＬＢ－１．２の結合親のほうがＴＧＦ－β１ ＥＣＤベンチマークの結合親のよりも優れており、ＰＤ－Ｌ１に対するＢｉ－ＰＬＢ－１．２の結合親が抗ＰＤ－Ｌ１ベンチマークと同等である。

３．Ｂｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２を使用したＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１への同時結合
図２８Ａは、ＴＧＦ－β１およびＰＤ－１の同時結合にＢｉ－ＰＢ－１．２を使用したＥＬＩＳＡ試験を示し、ここで、ｈｕＴＧＦ－β１でコーティングされた９６ウェルプレートをＢｉ－ＰＢ－１．２の段階希釈サンプル、続いてＨｉｓタグ付きｈｕＰＤ－１と培養することにより、ＴＭＢ基質を使用した抗Ｈｉｓタグ付きＨＲＰによって結合分子を検出する。図２８Ｂは、ＴＧＦ－β１およびＰＤ－Ｌ１の同時結合にＢｉ－ＰＬＢ－１．２を使用したＥＬＩＳＡ試験を示し、ここで、ｈｕＴＧＦ－β１でコーティングされた９６ウェルプレートをＢｉ－ＰＬＢ－１．２の段階希釈サンプル、続いてＨｉｓタグ付きｈｕＰＤ－Ｌ１と培養することにより、ＴＭＢ基質を使用した抗Ｈｉｓタグ付きＨＲＰによって結合分子を検出する。ＥＣ_５０値は、それぞれヒトＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１のベースラインおよび最大応答に結合する反応の途中で精製される、最大エフェクター濃度の半分を反映する。

４．ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－β１のその受容体への結合を効果的に遮断させるＢｉ－ＰＢ－１．２
図２９Ａにおいて、遮断試験を実行して、抗ＰＤ－１ベンチマーク抗体と比較して、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断するＢｉ－ＰＢ－１．２の能力に対応するＩＣ５０値を計算する。簡単に説明すると、Ｂｉ－ＰＢ－１．２またはベンチマーク抗ＰＤ－１抗体の２倍段階希釈液を調製する（最大Ａｂ濃度は、１２８ｎＭであり、各ｍＡｂは３回である）。ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）を使用してヒトＰＤ－１でトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞を洗浄し、１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。ＦＩＴＣ標識ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を当該ヒトＰＤ－１でトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞に最終濃度７μｇ／ｍｌで添加し、均等に混合する。培養がない場合、２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液における２０００個のＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＰＤ－Ｌ１タンパク質を含む）を９６ウェルの丸い皿にすぐに加え、抗体の２０μｌまたは２倍段階希釈液を細胞にすぐに加え、かつ４℃下で３０分間培養する。次に、３０μｌの７ＡＡＤ溶液で細胞を洗浄および再懸濁し、続いてｉＱｕｅ ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステムを使用して分析する前に、３５μｌの１０％中性緩衝ホルマリン溶液を添加し、１５分間培養する。予想とおり、図２９Ａの分析結果は、濃度が向上されたＢｉ－ＰＢ－１．２がＰＤ－Ｌ１のその受容体に結合する能力を徐々に遮断することを示す。さらに、ＰＤ－Ｌ１に対するＢｉ－ＰＢ－１．２のＩＣ５０は、ＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－１ベンチマークのＩＣ５０に匹敵すると計算されたことが分かった。

ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤがＴＧＦ－β１によって媒介されたヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ（即ち、同族受容体）の活性化を拮抗する能力を評価するために、細胞ルシフェラーゼ試験を実施する。この実験では、ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤによるＢｉ－ＰＢ－１．２の段階希釈が存在する場合、ｈｕＴＧＦ－β１を使用して、ＳＭＡＤ応答性要素制御下でヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩ受容体および蛍ルシフェラーゼを発現する組換えＨＥＫ－２９３細胞を刺激する。ルシフェラーゼによって媒介された蛍光量の減少を測定することによって生物学的活性を決定する。この試験の結果は図２９Ｂに示される。予想とおり、濃度が向上されたＢｉ－ＰＢ－１．２およびベンチマーク抗ＰＤ－Ｌ１ ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤは、ＴＧＦ－β１がヒトＴＧＦ－β１ ＲＩＩを活性化し、ＳＭＡＤによって媒介されたルシフェラーゼ活性を誘導する能力を徐々に中和する。さらに、ＴＧＦ－β１に対するＢｉ－ＰＢ－１．２のＩＣ５０は、ＴＧＦ－β１に対する抗ＰＤ－Ｌ１ ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマークのＩＣ５０に匹敵すると計算されたことが分かった。

５．同様の活性でヒトおよび蟹食猿ＰＤ－１に結合するＢｉ－ＰＢ－１．２
ヒトおよび蟹食猿（ｃｙｎｏ）ＰＤ－１に結合するＢｉ－ＰＢ－１．２の能力を評価するために、Ｂｉ－ＰＢ－１．２の段階希釈液を、ヒトまたはｃｙｎｏ ＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（２００００個の細胞／ウェル）に添加する。当該混合物を４℃下で２０分間培養し、３回洗浄し、二次抗体（ＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）２－ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈ１０１０４）を使用して４℃下で２０分間染色する。細胞を７ＡＡＤ溶液で洗浄し、７ＡＡＤ溶液に再懸濁し、ｉＱｕｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステムを使用して分析する前に、１０％の中性緩衝ホルマリン溶液で１５分間固定する。図３０Ａ～３０Ｂは、Ｂｉ－ＰＢ－１．２がヒトＰＤ－１（図３０Ａ）およびｃｙｎｏ ＰＤ－１（図３０Ｂ）の両方に結合することを示す。予想とおり、抗ヒトＰＤ－１ベンチマーク抗体がヒトＰＤ－１（図３０Ａ）に結合する能力は、蟹食猿ＰＤ－１（図３０Ｂ）に結合する能力と類似していることが分かった。応答の半分の最大エフェクター濃度（ＥＣ_５０）に対するＥＣ_５０値も決定され、それは、それぞれヒトＰＤ－１およびｃｙｎｏ ＰＤ－Ｌ１のベースラインおよび最大応答に結合する応答の途中で生成される。この場合、ＥＣ_５０は、Ｂｉ－ＰＢ－１．２のベンチマーク抗体と同様の結合特性を示す。

６．ＰＤ－１およびＴＧＦ－β１のその受容体への結合を効果的に遮断するＢｉ－ＰＬＢ－１．２
上記の実施例８のセクション４に説明したように、遮断試験を実施て、抗ＰＤ－Ｌ１ベンチマーク抗体と比較して、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２とＰＤ－Ｌ１との間の結合に対応するＩＣ５０値を計算する。図３１Ａは、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２または抗ＰＤ－Ｌ１ベンチマーク抗体の濃度を向上すると、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を徐々に遮断することを示す。得られたＩＣ５０に反映されるように、当該二重特異性抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１ベンチマークに匹敵する。

Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２とＴＧＦ－β１との間の結合に対するＩＣ５０値（それは抗ＴＧＦ－β１ベンチマーク抗体と比較される）を計算するために、実施例８のセクション４に説明されたような細胞ベース試験を実施する。図３１Ｂは、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２および抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマークの段階希釈が、ＳＭＡＤ応答性要素制御下でルシフェラーゼ発現を活性化するＴＧＦ－β１の能力を遮断することを示す。得られたＩＣ５０に反映されるように、当該二重特異性抗体は、抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマークと同様の結合特性を示す。

７．同様の活性でヒトおよび蟹食猿のＰＤ－１に結合するＢｉ－ＰＬＢ－１．２
Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２がヒトおよびｃｙｎｏ ＰＤ－１に結合する能力を評価するために、実施例９のセクション５に説明されるように、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２の段階希釈を、ヒトまたはｃｙｎｏ ＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（２００００個の細胞／ウェル）に添加する。図３２Ａ～３２Ｂは、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２がヒトＰＤ－Ｌ１（図３２Ａ）およびｃｙｎｏ ＰＤ－Ｌ１（図３２Ｂ）に結合することを示す。得られたＥＣ_５０値は、最大エフェクター濃度の半分（ＥＣ_５０）を反映し、それは、それぞれヒトＰＤ－１およびｃｙｎｏ ＰＤ－Ｌ１のベースラインおよび最大応答に結合する応答の途中で生成される。

８．Ｔ細胞活性化を増強するＢｉ－ＰＢ－１．２
Ｂｉ－ＰＢ－１．２抗体の有効性を示すためにヒトＴ細胞ベース試験を実施する。簡単に説明すると、ドナー１および２から収集された正常な健康なヒトＰＢＭＣは、それぞれＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃：ＢＴ２０２）を使用して活性化される。ＩＦＮ－γの生成を検出するために、９６ウェルプレートで０．５μｇ／ｍｌのＳＥＢを使用して、１０００００個の細胞を刺激する。２５０００個の腫瘍阻害およびＳＨＰ７７細胞を加えて、抑制性シグナルを提供する。６６ｎＭのＢｉ－ＰＢ－１．２ ｍＡｂｓまたはアイソタイプ対照Ａｂを添加する。５日後、ＥＬＩＳＡによって上清液におけるＩＦＮ－γおよびＩＬ－２をチェックする。図３３Ａ～３３Ｄは、陰性対照治療と比較して、Ｂｉ－ＰＢ－１．２によるＩＦＮ－γ（ドナー１、図３３Ａ、ドナー２、図３３Ｂ）およびＩＬ－２（ドナー１、図３３Ｃ、ドナー２、図３３Ｄ）の増加を示す。

９．Ｔ細胞の活性化増強し、かつ腫瘍細胞のＴ細胞阻害を克服する、親の抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも優れたＢｉ－ＰＬＢ－１．２
図３４Ａ～３４Ｂは、陰性対照治療および親の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２を用いたヒトＰＢＭＣｓによる増加したＩＦＮ－γ分泌を示す（ドナー８、図３４Ａ、ドナー９、図３４Ｂ）。図３４Ｃ～３４Ｄは、陰性対照治療および親の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２を用いたヒトＰＢＭＣｓによる増加したＩＬ－２分泌を示す（ドナー８、図３４Ｃ、ドナー９、図３４Ｄ）。これらの結果は、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２が親の抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも腫瘍細胞のＴ細胞阻害を克服するという考えと一致している。

１０．ベンチマーク抗体と比較して、マウスの薬物動態曲線を改善するＢｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２
Ｂｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２およびベンチマーク抗体のインビボ薬物動態特性を評価するために、薬物動態曲線を作成する。簡単に説明すると、１０ｍｇ／ｋｇの各アンタゴニストを６～１０週齢の雌ＣＤ１マウスの尾静脈に静脈内注射する（分子あたりｎ＝２マウス）。注射後３分間、３時間、１日、３日、７日および１０日目に血清を収集する。血清中の抗体を検出するために、５μｇ／ｋｇのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを使用して９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次に５％ミルク（ＰＢＳで調製）を使用して遮断する。５％ミルクでのマウス血清の段階希釈、および標準品としての精製タンパク質分子の段階希釈を皿に加える。

ペルオキシダーゼ共有結合マウス抗ヒトＩｇＧと培養し、かつさらに洗浄した後、ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質を加え、かつＢｉ－ＰＢ－１．２（図３５Ａ）、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２（図３５Ｃ）、および抗ＰＤＬ１－ＴＧＦ－β１ ＲＩＩ ＥＣＤ ベンチマーク（Ｍ８７２４）（図３５Ｅ）を検出する。マウス血清中の注射された抗体Ｂｉ－ＰＢ－１．２（図３５Ｂ）、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２（図３５Ｄ）およびベンチマーク（図３５Ｆ）の完全性およびクリッピングレベルも、抗ヒトＦｃウエスタンブロッティング法によって分析される。この分析結果は、ベンチマーク抗体と比較して、Ｂｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＰＬＢ－１．２の改善されたマウス薬物動態曲線を示す。

実施例９：ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ領域のタンパク質クリッピングの探索
本発明の発明者らは、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ領域を有するアンタゴニストが安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって生成される場合、許容できないレベルのタンパク質分解またはクリッピングが貯蔵後時間の経過とともに示すことを発見した。これは図３６に反映され、それは、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを使用して、ＳＥ－ＵＰＬＣによって、Ｂｉ－ＰＢ－１．２（ＰＤ１／ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ、図２０Ａを参照）が決定された低分子量（ＬＭＷ）種のパーセンテージが４℃下での保存時間とともに向上し、二量体種のパーセンテージが時間の経過とともに減少することを示す。

ＰＤ１／ＰＤＬ１－ＴＧＦＢ ＲＩＩ ＥＣＤ分子がＨＥＫ２９３細胞の一過性にトランスフェクションによって生成される場合、ＬＭＷが見られなかったため、ＳＥＣ分析を実行して、二つの異なるＣＨＯトランスフェクションプール（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｏｏｌ）に由来する安定したＣＨＯによって生成されたベンチマークおよびＢｉ－ＰＢ－１．２をＨＥＫ２９３細胞（図３７）によって生成されたＢｉ－ＰＢ－１．２と比較する。図３７に示されるように、当該ＳＥＣグラフは、メインピークに近い肩と、ＨＥＫ２９３細胞ではなくＣＨＯ細胞を使用して生成された分子のより小さい第２のピークを示し、それは、ＣＨＯで製造された分子のタンパク質切断（またはクリッピング）の向上と一致する。

切断の具体的性質をさらに調べるために、ＣＨＯ－Ｋ１細胞でＢｉ－ＰＢ－１．２アンタゴニストを発現し、かつそれに陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＣＥＸ）を実行して、さらに液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）による分画を生成することにより、クリッピングに関連する部分を決定する（図３８）。Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１に対して同じ分析を実行する（データは示されない）。ＬＣ－ＭＳ分析のために、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用してサンプルを酵素的に脱グリコシル化する。次に、ＴＳＫｇｅｌ Ｐｈｅｎｙｌ－５ＰＷを使用して、逆超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＰＬＣ）によって、還元された完全なタンパク質を分離させる。移動相Ａ（ＭＰＡ）および移動相Ｂ（ＭＰＢ）は、それぞれ０．０５％のギ酸水溶液、および０．０５％のギ酸アセトニトリル溶液である。カラムの流出液は、オンラインＵＶ検出器を直接通過し、次にＥＳＩ－ＴＯＦ（飛行時間）質量分析計のＥＳＩソースに送る。データは、Ｗａｔｅｒｓ Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェアを使用してデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）する。配列の正確さを確認するために、還元された脱グリコシル化分子の実験的質量を、一次アミノ酸配列によって計算された理論的質量と比較する。

ＬＣ－ＭＳからの結果（データは示されない）は、いくつかのタンパク質切断フラグメントを同定する（図３９）。より特異的に、これらの分析結果は、図４０Ａおよび４０Ｂにそれぞれさらに示されるように、Ｂｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－ＡＢ－１がそれぞれの重鎖に同様の切断部位を有することを示す。

実施例１０：ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ変異体のクリッピングの減少特性
クリッピングの減少を示すＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む変異体分子を開発するために、図４１Ａ～４１Ｃに示されるような様々なＥＣＤ変異を設計する。当該変異は、提案されたクリッピングサイトをターゲティングするように設計される。図４２Ａ～４２Ｈ、４３および４４Ａ～４４Ｄは、それそれＢｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１．２、およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１の重鎖配列の生成および発現を示し、それは、図４１Ａ～４１Ｃに示されるような様々なＥＣＤ変異を含む。図４５は、追加の置換がない場合の特定のアミノ酸欠失変異（変異体Δ７、Δ１２、Δ１３）、および追加の置換がない場合の特定のアミノ酸欠失変異（変異体Ｂ、Ｃ、Ｉ－Ｂ１）、ならびに長い分子における完全な置換変異（変異体Ｄ－Ｈ）等の提案されたクリッピングサイトのターゲティングを示す。

ＣＨＯ細胞で、得られた分子および親の精製タンパク質Ａを一過性に発現する。図４６Ａ～４６Ｃにおいて、図４２Ａ～４２Ｈの発現生成物の還元ＰＡＧＥ分析は、変異体分子のクリッピングが減少することを示す。当該結果と一致して、図４７Ａおよび４７Ｂに示される発現生成物のＳＥＣグラフは、Ｂｉ－ＰＢ－１．２に見られる、または図３７に観察されるような「肩」および第２のピークが伴わない。図４８において、ＳＥＣグラフのピークが定量化され、かつ変異体が親の分子と比較して高分子形態のパーセンテージが低いことを示す。

実施例１１：ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ変異の機能的活性
変異体で減少されたクリッピングが機能的活性を低下させなかったことを確認するために、ＥＣＤ変異体の機能的活性を評価するために細胞ベース試験を実施する（図４９）。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３で製造されたＢｉ－ＰＢ－１．２および様々なＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ変異体を段階希釈し、かつ試験して（陰性対照抗体と一緒に）、アンタゴニストが上記のＳＭＡＤ応答性要素によって制御される条件下でルシフェラーゼ発現を活性化するＴＧＦ－β１の能力を遮断できるかどうかを確認する。ルシフェラーゼによって媒介された蛍光量の減少を測定することによって生物学的活性を決定する。この分析のＩＣ５０結果は図５０に要約され、Ｂｉ－Ａ１Ｂ－１Ｗ、Ｂｉ－ＰＢ－１．２Δ１５およびＢｉ－ＰＢ－１．２Δ２０を除くすべての変異体が、親のＢｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１と同様の生物学的活性を保持することを示す。

実施例１２：Ｂｉ－ＰＢ－１ＣおよびＢｉ－ＰＢ－１Ｄの薬物動態
Ｂｉ－ＰＢ－１．２（ｗｔ）と比較したＢｉ－ＰＢ－１．２ＣおよびＢｉ－ＰＢ－１．２Ｄのインビボでの薬物動態特性を評価するために、薬物動態曲線を作成する。簡単に説明すると、１０ｍｇ／ｋｇの各アンタゴニストを６～１０週齢の雌ＣＤ１マウスの尾静脈に静脈内注射する（分子あたりｎ＝２マウス）。注射後３分間、３時間、１日、３日、７日および１０日目に血清を収集する。血清中の抗体を検出するために、５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｓｉｇｍａ、＃ＳＡＢ３７０１２７４）で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次に５％ミルク（ＰＢＳで調製）を使用して遮断する。５％ミルクでのマウス血清の段階希釈、および標準品としての精製タンパク質分子の段階希釈を皿に加えるペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅマウス抗ヒト（Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃２０９－０３５－０９８）と培養し、かつさらに洗浄した後、Ｂｉ－ＰＢ－１．２（図５１Ａ）、Ｂｉ－ＰＢ－１．２Ｃ（図５１Ｂ）、およびＢｉ－ＰＢ－１．２Ｄ（図５１Ｃ）アンタゴニストを、ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、＃３４０２９）と培養した後検出し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ多機能プレート検出器を使用して、ＯＤ６５０シグナルによって定量化される。この分析結果は、Ｂｉ－ＰＢ－１．２ＣおよびＢｉ－ＰＢ－１．２Ｄのマウス薬物動態曲線がＢｉ－ＰＢ－１．２に匹敵し、インビボで約５～８日の半減期（Ｔ_１／２）を示すことを示す。

実施例１３：安定したＣＨＯ細胞プールからの製造
ＣＨＯ－Ｋ１安定細胞プールから、親のＢｉ－ＰＢ－１．２、Ｂｉ－ＰＬＢ－１、およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１分子に対応するＣ変異体分子、およびＢｉ－ＰＢ－１．２およびＢｉ－Ａ１Ｂ－１分子のＵ変異体を生成し、そのクリッピングレベルを、その野生型の対応物および／またはＣ変異体を有する対応物と比較する。当該ＣＨＯ－Ｋ１安定細胞プールは、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）条件下で１４日間増殖させ、タンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製される。精製された変異および変異体タンパク質の還元ＰＡＧＥ分析によって、クリッピングレベルを決定する。この分析結果は、親の野生型分子と比較して、ＣおよびＵ変異体を有する分子のクリッピングが有意に減少することを示す（図５２Ａ～５２Ｂ）。

以上の説明は、当業者に本発明を実施する方法を教えることを意図し、それらの明白な修正および変更のすべてを詳細に説明することを意図せず、これらの修正および変更は、明細書を読むと当業者には明らかであろう。しかし、すべてのこれらの明白な修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれることを意図する。文脈上明確に別段の指示をしない限り、所望の目的を達成するために勇往な任意の順序で必要な構成要素および段階を網羅することを意図する。

Claims (31)

1. 抗腫瘍アンタゴニストであって、
   変異したＴＧＦ－β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（変異したＥＣＤ）を含む第１のターゲティングドメイン、ならびに
   アミノ末端およびカルボキシ末端を有する免疫グロブリン足場を含み、
   ここで、前記変異したＥＣＤは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の部位６、７、１３、１６、１７、２０、２２および／または２３上の一つまたは複数の置換変異、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の部位１～２０の領域における一つまたは複数の欠失変異を含み、また
   ここで、一つまたは複数の変異は、前記抗腫瘍アンタゴニストのタンパク質加水分解による切断を減少させることを特徴とする、前記抗腫瘍アンタゴニスト。
2. 前記一つまたは複数の変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の部位６、７、１６、１７、２０、２２および／または２３上の非極性アミノ酸残基の極性または疎水性アミノ酸による置換を含むことを特徴とする
   請求項１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
3. 前記一つまたは複数の変異は、アミノ酸残基１～７、１～１２、１～１３、１～１５、１～２０、７～１２、７～１３、７～１５、７～２０、８～２０、９～２０、１０～２０、１１～２０、１２～２０、１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０または１７～２０の欠失を含むことを特徴とする
   請求項１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
4. （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の部位６、７、１３、１６、１７、２０、２２および／または２３上の一つまたは複数の置換変異、および
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の部位１～２０の領域における一つまたは複数の欠失変異を含むことを特徴とする
   請求項１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
5. 前記変異したＥＣＤは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１１４～１２３および２５１～２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする
   請求項１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
6. 第２のターゲティングドメインをさらに含むことを特徴とする
   請求項１～５のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
7. 第２のターゲティングドメインをさらに含み、前記第２のターゲティングドメインは、免疫チェックポイント調節剤アンタゴニスト、ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト、ＰＤ１結合アンタゴニストまたはＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストを含むことを特徴とする
   請求項６に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
8. 前記第１のターゲティングドメインは、ペプチドリンカーによって前記免疫グロブリン足場にリンクされることを特徴とする
   請求項６に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
9. 前記ペプチドリンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする
   請求項８に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
10. 前記第２のターゲティングドメインは、ＰＤ－１に特異的に結合することを特徴とする
    請求項６～９のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
11. 前記第２のターゲティングドメインは、
    （１）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の三つの相補性決定領域（ＨＣＤＲｓ）を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、ならびに
    （２）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の三つの相補性決定領域（ＬＣＤＲｓ）を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含み、
    前記（１）において、
    ここで、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１、４、７、９および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    ここで、前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２、５、１０および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、および
    ここで、前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３、６、８、１１および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記（２）において、
    ここで、前記ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１５、１８、２１～２３および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    ここで、前記ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１６、１９、２４および２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、および
    ここで、前記ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１７、２０、２５および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする
    請求項１０に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
12. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２９、３１、３３、３５、３７および３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＨＣＶＲ、および／または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３０、３２、３４、３６、３８および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＬＣＶＲを含むことを特徴とする
    請求項１０または１１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
13. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２９、３１、３３、３５、３７および３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、および／または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３０、３２、３４、３６、３８および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含むことを特徴とする
    請求項１２に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
14. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、および／または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含むことを特徴とする
    請求項１０または１１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
15. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、および／または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含むことを特徴とする
    請求項１４に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
16. 前記第２のターゲティングドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することを特徴とする
    請求項６～９のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
17. 前記第２のターゲティングドメインは、
    （１）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３等の三つの相補性決定領域（ＨＣＤＲｓ）を含む免疫グロブリンＨＣＶＲと、ならびに
    （２）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の三つの相補性決定領域（ＬＣＤＲｓ）を含む免疫グロブリンＬＣＶＲとを含み、
    前記（１）において、
    ここで、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４１、４４、５０および５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    ここで、前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４２、４５、４７、４９、５１および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、および
    ここで、前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４３、４６、４８、５２および５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記（２）において、
    ここで、前記ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５６、５９、６３、６６および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    ここで、前記ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５７、６０、６４、６７および７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、および
    ここで、前記ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５８、６１、６２、６５、６８および７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする
    請求項１６に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
18. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、および／または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含むことを特徴とする
    請求項１７に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
19. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、および／または
    ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含むことを特徴とする
    請求項１７に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
20. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、および／または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含むことを特徴とする
    請求項１７に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
21. 前記第２のターゲティングドメインは、ＶＥＧＦに特異的に結合することを特徴とする
    請求項６～９のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
22. 前記第２のターゲティングドメインは、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：９０および９１、または（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：９６および９１等のアミノ酸配列を含むことを特徴とする
    請求項２１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
23. 前記免疫グロブリン足場は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４足場であることを特徴とする
    請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
24. 前記免疫グロブリン足場は、Ｎ２９７Ａ変異、Ｋ４４７Ａ変異、または両方を含むことを特徴とする
    請求項２３に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
25. 前記免疫グロブリン足場は、：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１００、１５９～１６６および１７３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする
    請求項２３または２４に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
26. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２４～１３３、１４５、１４７、１４８、１５０および２７１～３０３からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする
    請求項１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
27. （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３に示される軽鎖アミノ酸配列と対になるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３に示される重鎖アミノ酸配列と、
    （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５に示される軽鎖アミノ酸配列と対になるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３に示される重鎖アミノ酸配列と、または
    （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に示される軽鎖アミノ酸配列と対になるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９５に示される重鎖アミノ酸配列とを含むことを特徴とする
    請求項１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
28. 対象の細胞増殖性障害を治療する方法であって、
    必要とする対象に有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニストを投与することを特徴とする、前記対象の細胞増殖性障害を治療する方法。
29. 一つまたは複数のヌクレオチドであって、
    請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニストをコードすることを特徴とする、前記一つまたは複数のヌクレオチド。
30. 一つまたは複数のベクターであって、
    請求項２９に記載の一つまたは複数のヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記一つまたは複数のベクター。
31. 宿主細胞であって、
    請求項３０に記載の一つまたは複数のベクターによって形質転換されることを特徴とする、前記宿主細胞。

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