EA031182B1 - Ang2-связывающие молекулы - Google Patents

Abstract

В изобретении описаны Ang2-связывающие молекулы, предпочтительно Ang2-связывающие иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены типа VH и доменных антител, содержащие их фармацевтические композиции и их применение для лечения заболеваний, ассоциированных с опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез. В изобретении описаны также нуклеиновые кислоты, кодирующие Ang2-связывающие молекулы, клетки-хозяева и способы их получения.

Description

Изобретение относится также к Ang2-связывающей молекуле, состоящей из указанного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.

Кроме того, изобретение относится к Ang2-связывающей молекуле, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 167, 166, 129 и 138.

Другим объектом изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая указанную Ang2связывающую молекулу, а также экспрессионный вектор, который содержит указанную нуклеиновую кислоту.

Изобретение относится также к клетке-хозяину, которая несет один или несколько экспрессионных

- 2 031182 векторов, содержащих указанные нуклеиновые кислоты.

Изобретение относится также к способу получения или создания Апд2-связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, заключающемуся в том, что осуществляют стадии, на которых:

(а) трансфектируют клетку-хозяина одним или несколькими указанными векторами, которые содержат указанную молекулу нуклеиновой кислоты, (б) культивируют указанную клетку-хозяина и (в) выделяют и очищают указанную Апд2-связывающую молекулу.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержат в качестве действующего вещества одну или несколько указанных Ang2связывающих молекул и по меньшей мере один физиологически приемлемый носитель.

Изобретение относится также к вариантам применения Ang2-связывающих молекул, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, указанных в настоящем описании, а также к способам предупреждения и/или лечения заболеваний, ассоциированных с опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез, предпочтительно рака, злокачественных заболеваний и глазных болезней.

Эти и другие объекты, варианты осуществления изобретения, преимущества и варианты применения изобретения должны стать более понятными после ознакомления с представленным ниже дополнительным описанием.

Определения

Если не указано или определено иное, то все применяемые понятия употребляются в их обычном значении, принятом в данной области, которое очевидно специалистам в данной области. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, такие как Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-ое изд., тома 1-3, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Lewin, Genes IV, изд-во Oxford University Press, New York, 1990, и Roitt и др., Immunology (2-ое изд.), изд-во Gower Medical Publishing, London, New York, 1989, а также документы, касающиеся общего уровня техники, процитированные в настоящем описании; кроме того, если не указано иное, все методы, стадии, процессы и манипуляции, которые не описаны конкретно в деталях, можно осуществлять (и их осуществляли) хорошо известными методами, что должно быть очевидно специалисту в данной области. И в этом случае также в качестве ссылки можно, например, указать на известные руководства, сведения, касающиеся общего уровня техники, указанные выше, и дополнительные процитированные в них ссылки.

Понятие ангиопоэтин-2 или Ang2, если конкретно не указано, что он происходит из видов кроме человека (например, мышиный Ang2 и т.д.), относится к человеческому Ang2 или его биологически активному фрагменту (например, фрагмент белка Ang2, который обладает способностью индуцировать ангиогенез in vitro или in vivo), т.е. к человеческому Ang2 (вариант 1) с регистрационным № NM 001147.2, к человеческому Ang2 (вариант 2), имеющему регистрационный № NM 001118887.1, или к человеческому Ang2 (вариант 3), имеющему регистрационный № NM 001118888.1, и/или их биологически активным фрагментам. Аминокислотные последовательности Ang2 видов кроме человека, например мышиного Ang2 и Ang2 обезьян циномолгус (cyno), доступны из базы данных белковых последовательностей под регистрационными №№ NM 007426.3 (SEQ ID NO: (SEQ ID 188) и AB 172643.1 (SEQ ID NO: 187) соответственно.

Понятие ангиопоэтин-1 или Ang1, если конкретно не указано, что он происходит из видов кроме человека (например, мышиный Ang1 и т.д.), относится к человеческому Ang1 или его биологически активному фрагменту (например, фрагменту белка Ang1, который обладает способностью индуцировать ангиогенез in vitro или in vivo), т.е. к человеческому Ang1 с регистрационным № NM 001146.3 или его биологически активному фрагменту.

Если не указано иное, то понятия иммуноглобулин и последовательность иммуноглобулина, если их используют в контексте настоящего описания касательно состоящего только из тяжелых цепей антитела или канонического состоящего из 4 цепей антитела, применяют в качестве общих понятий, которые включают полноразмерное антитело, его индивидуальные цепи, а также все его области, домены или фрагменты (включая (но, не ограничиваясь только ими) антигенсвязывающие домены или фрагменты, такие как VnH-домены или Vn/Vi.-домены соответственно). Кроме того, понятие последовательность в контексте настоящего описания (например, в понятиях типа последовательность иммуноглобулина, последовательность антитела последовательность (единичного) вариабельного домена, последовательность VHH или последовательность белка), как это обычно принято, относится как к соответствующим аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновых кислот или нуклеотидным последовательностям, которые их кодируют, если из контекста не следует более ограниченная интерпретация.

Понятие домен (область) (полипептида или белка) в контексте настоящего описания относится к складчатой белковой структуре, которая обладает способностью сохранять свою третичную структуру, независимо от остальной части белка. Как правило, домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков, и во многих случаях их можно добавлять, удалять или переносить в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена.

- 3 031182

Понятие иммуноглобулиновый домен в контексте настоящего описания относится к глобулярной области цепи антитела (такой, например, как цепь канонического состоящего из 4 цепей антитела или состоящего из тяжелых цепей антитела) или к полипептиду, который состоит практически из указанной глобулярной области. Иммуноглобулиновые домены отличаются тем, что они сохраняют присущую иммуноглобулину складчатую структуру молекул антитела, которая представляет собой 2-слойный сэндвич, состоящий примерно из 7 антипараллельных бета-цепей, упакованных в две бета-складки, необязательно стабилизированных с помощью консервативного дисульфидного мостика.

Понятие иммуноглобулиновый вариабельный домен в контексте настоящего описания относится к иммуноглобулиновому домену, состоящему практически из четырех каркасных участков, как они определены в данной области, и обозначены ниже как каркасный участок 1 или FR1; каркасный участок 2 или FR2; каркасный участок 3 или FR3 и каркасный участок 4 или FR4 соответственно; указанные каркасные участки перемежаются тремя гипервариабельными участками (участками, определяющими комплементарность) или CDR, как они определены в данной области, и обозначены ниже как гипервариабельный участок 1 или CDR1; гипервариабельный участок 2 или CDR2 и гипервариабельный участок 3 или CDR3 соответственно. Таким образом, общую структуру или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина можно обозначать как: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 FR3 - CDR3 - FR4. Именно вариабельный(ые) домен(ы) иммуноглобулина придает(ют) специфичность антителу в отношении антигена, поскольку он(они) несет(ут) антигенсвязывающий центр.

Понятие иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в контексте настоящего описания относится к иммуноглобулиновому вариабельному домену, который обладает способностью специфически связываться с эпитопом антигена без спаривания с дополнительным иммуноглобулиновым вариабельным доменом. Одним из примеров иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов согласно настоящему изобретению являются доменные антитела, такие как единичные иммуноглобулиновые вариабельные домены V_H и V_L (Ун-домены и Vi.-домены). Другим примером иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов являются У_нН-домены (или просто V_HH) из представителей верблюдовых, как указано ниже в настоящем описания.

В свете вышеуказанных определений антигенсвязывающий домен канонического состоящего их 4 цепей антитела (такого как молекула IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; известная в данной области) или Fabфрагмента, F(ab')₂-фрагмента, Fv-фрагмента, такого как связанный дисульфидным мостиком Fv или scFvфрагмент, или димерного антитела (диабоди) (которые все известны в данной области), выведенный из указанного канонического состоящего из 4 цепей антитела, не следует рассматривать как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, поскольку в этих случаях связывание с соответствующим эпитопом антигена в норме не может осуществляться с помощью одного (единичного) иммуноглобулинового домена, а должно происходить с помощью пары (ассоциации) иммуноглобулиновых доменов, таких как вариабельные области легкой и тяжелой цепей, т.е. с помощью пары V_H-V_L иммуноглобулиновых доменов, которые совместно связываются с эпитопом соответствующего антигена.

ViiH-домены. которые обозначают также как V_HH, VnH-домены. фрагменты VHH-антитела и VHHантитела, впервые были описаны как антигенсвязывающие иммуноглобулиновые (вариабельные) домены состоящих (только) из тяжелых цепей антител (т.е. антител, в которых отсутствуют легкие цепи), Hamers-Casterman С., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers С., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. в Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Nature 363, 1993, сс. 446-448). Понятие VnH-домен было выбрано для того, что можно было отличать эти вариабельные домены от вариабельных областей тяжелых цепей, которые присутствуют в канонических, состоящих из 4 цепей антителах (они обозначены далее как ^-домены (области) или ^-домены (области)) и от вариабельных областей легких цепей, которые присутствуют в канонических состоящих из 4 цепей антителах (они обозначены далее как ^-домены (области) или ^-домены (области)). VnH-домены могут специфически связываться с эпитопом без дополнительного антигенсвязывающего домена (в отличие от V_H- или V_Lдоменов в каноническом состоящем из 4 цепей антителе, в котором для распознавания эпитопа требуется присутствие ^-домена в сочетании с Vu-доменом). VnH-домены представляют собой небольшие, сильные и эффективные распознающие антиген структуры (единицы), образованные единичным иммуноглобулиновым доменом.

В контексте настоящего изобретения понятия VnH-домен, V_HH, VnH-домен, фрагмент VHHантитела, V_HH-антитело, а также Nanobody® и домен Nanobody® (Nanobody является товарным знаком компании Ablynx N.V.; Гент, Бельгия) применяют взаимозаменяемо, и они относятся к иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменам (которые имеют следующее строение: FR1-CDR1-FR2CDR2-FR3-CDR3-FR4, и которые специфически связываются с эпитопом, не требуя присутствия второго иммуноглобулинового вариабельного домена), и они отличаются от Vu-доменов наличием так называемых отличительных остатков, остатков-маркеров, как они определены, например, в WO 2009/109635, фиг. 1.

Аминокислотные остатки иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, например, V_HH, нумеруют согласно общей номенклатуре Кэбота для Vu-доменов (Sequence of proteins of immunological interest, изд-во US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, публикация № 91), в том виде, в

- 4 031182 котором ее применяют для УнН-доменов верблюдовых, например, как продемонстрировано на фиг. 2 у Riechmann и Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 1999, сс. 25-38.

Согласно этой нумерации

FR1 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 1-30,

CDR1 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 31-35,

FR2 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 36-49,

CDR2 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 50-65,

FR3 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 66-94,

CDR3 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 95-102 и

FR4 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 103-113.

Однако следует отметить, что, как это хорошо известно в данной области для Vu-доменов и для V| iH-доменов. общее количество аминокислотных остатков в каждом CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанных в номенклатуре Кэбота (т.е. одно или несколько положений согласно номенклатуре Кэбота может быть незанятым в фактической последовательности, или фактическая последовательность может содержать большее количество аминокислотных остатков, чем количество остатков, которое должно присутствовать согласно номенклатуре Кэбота). Это означает, что, в целом, нумерация по Кэботу может как соответствовать, так и не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности.

В данной области известны альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков V_Hдоменов, указанные методы также можно применять аналогичным образом к У_НН-доменам. Однако в настоящем описании, формуле изобретения и на чертежах нумерация соответствует номенклатуре Кэбота, и ее применяют к описанным выше У_НН-доменам, если специально не указано иное.

Общее количество аминокислотных остатков в У_Н-домене, как правило, составляет от 110 до 29, часто от 112 до 115. Однако следует отметить, что для указанных в настоящем описании целей можно применять и более короткие, и более длинные последовательности.

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, например У_НН и доменные антитела, предлагаемые в предпочтительных вариантах осуществления изобретения, имеют целый ряд уникальных структурных характеристик и функциональных свойств, которые делают их наиболее предпочтительными для применения в терапии в качестве функциональных антигенсвязывающих молекул. В частности (но, не ограничиваясь только этим), У_НН-домены (которые созданы природой таким образом, что они могут функционально связываться с антигеном без спаривания с вариабельной областью легкой цепи) могут функционировать как единичные относительно мелкие функциональные антигенсвязывающие структурные единицы.

Благодаря своим уникальным свойствам иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, как они определены в настоящем описании, типа У_НН или У_Н (или V_L), либо индивидуально, либо в качестве части более крупного полипептида, например бипаратопной молекулы, обладают рядом важных преимуществ:

для связывания антигена с высокой аффинностью и высокой селективностью необходим только один домен, поэтому отсутствует как необходимость в наличии двух отдельных доменов, так и необходимость в требовании, чтобы эти два домена находились в правильной пространственной конформации и конфигурации (т.е. необходимость в применении специально созданных линкеров, как в случае scFv);

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены можно экспрессировать с одной молекулы нуклеиновой кислоты и при этом отсутствует необходимость в какой-либо пост-трансляционной модификации (типа гликозилирования);

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены легко можно конструировать в многовалентных и мультиспецифических форматах (что подробно обсуждено ниже в настоящем описании);

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены обладают высокой специфичностью и аффинностью к мишени, низкой присущей им токсичностью и их можно вводить путями, отличными от инфузии или инъекции;

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены обладают высокой устойчивостью к нагреванию, рН, протеазам и другим денатурирующим агентам или условиям и поэтому их можно получать, хранить или транспортировать без применения охлаждающего оборудования;

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены можно легко и относительно дешево получать как в лабораторном, так и в промышленном масштабе. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены можно получать путем ферментации с использованием микроорганизмов (что более подробно описано ниже) и для этой цели не требуется применения экспрессионных систем млекопитающих, что имеет место в случае канонических антител;

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены являются относительно небольшими (примерно 15 кДа или в 10 раз меньше, чем канонический IgG) по сравнению с каноническими, состоящими из 4 цепей антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, и поэтому для них характерна высокая (более высокая) способность проникать в ткани (включая (но, не ограничиваясь только ими) солидные опухоли и другие плотные ткани) и их можно вводить в более высоких дозах, чем дозы канонических

- 5 031182 состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов;

V_HH обладают специфической так называемой способностью связываться с сайтом, расположенным в расщелине (бороздке) (в том числе благодаря их удлиненной СОИЗ-петле, в отличие от V_Hдоменов, состоящих из 4 цепей антител), и поэтому для них являются доступными также мишени и эпитопы, которые не доступны для канонических состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов;

VHH обладают важным преимуществом, которое заключается в том, что они обладают высокой растворимостью и очень высокой стабильностью и не имеют тенденцию к агрегации (что имеет место в случае полученных из антител мышей антигенсвязывающих доменов, описанных у Ward и др., Nature 341, 1989, сс. 544-546).

Для иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов не требуется, чтобы они были получены из определенного биологического источника или с помощью определенного метода производства. Например, получение V_HH может включать следующие стадии:

(1) выделение VH-домена из встречающегося в естественных условиях, содержащего тяжелые цепи антитела; или скрининг библиотеки состоящих из тяжелых цепей антител или V_HH и выделение из них VHH;

(2) экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH-домен, имеющий встречающуюся в естественных условиях последовательность;

(3) гуманизация V_HH, необязательно после созревания аффинности, имеющего встречающуюся в естественных условиях последовательность, или экспрессия нуклеиновой кислоты, которая кодирует гуманизированный VHH;

(4) камелизация (согласно описанному ниже методу) иммуноглобулинового единичного вариабельного домена тяжелой цепи встречающегося в естественных условиях антитела, полученного из различных видов животных, в частности видов млекопитающих, таких как человек, или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный камелизированный домен;

(5) камелизация V_H или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный камелизированный V_H;

(6) применение методик для получения синтетических или полусинтетических белков, полипептидов или других аминокислотных последовательностей;

(7) получение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VnH-домен. с помощью методов синтеза нуклеиновых кислот с последующей экспрессией полученной таким образом нуклеиновой кислоты;

(8) подвергание состоящих из тяжелых цепей антител или V_HH процессу созревания аффинности, мутагенезу (например, неспецифическому мутагенезу или сайтнаправленному мутагенезу) и/или любой(ым) другой(им) обработке(ам) для повышения аффинности и/или специфичности V_HH; и/или (9) сочетание или выбор некоторых из вышеизложенных стадий.

Приемлемые методы и процессы осуществления указанных выше стадий известны в данной области и должны быть очевидны специалисту в данной области. Например, методы получения VH-доменов, которые связываются со специфическим антигеном или эпитопом, описаны в WO 2006/040153 и WO 2006/122786.

Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении или присутствующие в полипептидах, предлагаемых в изобретении, представляют собой ViiH-доменьт аминокислотная последовательность которых практически соответствует аминокислотной последовательности встречающегося в естественных условиях VHHдомена, но является гуманизированной или имеет оптимизированную последовательность (необязательно в результате созревания аффинности), т.е. имеет(ют) место замена(ы) одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанного встречающегося в естественных условиях VHH на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в вариабельном домене тяжелой цепи канонического состоящего из 4 цепей человеческого антитела. Для этой цели можно применять методы, известные в данной области, которые являются общепринятыми для специалиста в данной области.

Гуманизированный VH-домен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческих каркасных участков и в еще более конкретном варианте осуществления изобретения может содержать последовательности человеческих каркасных участков, выведенные из последовательностей человеческой зародышевой линии V_H3, таких как DP-29, DP-47, DP-51, или их части, или обладать высоким уровнем гомологии с ними, необязательно в сочетании с JH-последовательностями, такими как JH5. Так, протокол гуманизации может предусматривать замену любого из остатков V_HH на соответствующие остатки каркасного участка 1, 2 и 3 (FR1, FR2 и FR3) генов V_H зародышевой линии, таких как DP 47, DP 29 и DP 51, либо индивидуально, либо в комбинации. Приемлемые каркасные участки (FR) иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, можно выбирать из участков, описанных, например, в WO 2006/004678, и, в частности, они включают так называемые классы KERE и GLEW. Наиболее предпочтительными являются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые имеют аминокислотную последовательность G-L-E-W примерно в поло

- 6 031182 жениях 44-47, и их соответствующие гуманизированные копии. Гуманизированный VnH-домен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческого каркасного участка. Например, применяемая с целью гуманизации замена V_HH, принадлежащих к 103 P.R.S-группе и/или GLEW-группе (что описано ниже). представляет собой замену 108Q на 108L. Методы гуманизации иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов известны в данной области.

Связывающие иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены с улучшенными с позиций терапевтического применения свойствами. например. обладающие повышенной аффинностью или пониженной иммуногенностью. можно получать из индивидуальных связывающих молекул с помощью методик. известных в данной области. таких как созревание аффинности (например. используя в качестве исходных синтетические. произвольные или встречающиеся в естественных условиях последовательности иммуноглобулинов). CDR-трансплантация. гуманизация. объединение фрагментов. полученных из различных последовательностей иммуноглобулинов. ПЦР-сборка с использованием перекрывающихся праймеров и аналогичные методики. предназначенные для конструирования последовательностей иммуноглобулинов. которые хорошо известны специалисту в данной области; или любой приемлемой комбинации любых вышеизложенных методов. что обозначают также понятием оптимизация последовательности. употребляемым в настоящем описании. В качестве ссылки можно указать. например. стандартные руководства. а также можно использовать приведенное ниже описание и сведения. представленные в примерах.

При необходимости связывающую молекулу. которая обладает повышенной аффинностью. можно получать из другой связывающей молекулы путем созревания аффинности. последняя представляет собой родительскую связывающую молекулу относительно молекулы с созревшей аффинностью.

Ранее были описаны методы получения V_HH. которые связываются со специфическим антигеном или эпитопом. см.. например. WO 2006/040153 и WO 2006/122786. Как подробно описано в указанных документах. VHH-домены. выведенные из представителей верблюдовых. можно гуманизировать (в контексте настоящего описания этот процесс обозначен также как оптимизация последовательности. при этом оптимизация последовательности помимо гуманизации может включать дополнительную модификацию последовательности с помощью одной или нескольких мутаций. которые позволяют получать VHH с улучшенными свойствами. таких как удаление потенциальных сайтов пост-трансляционных модификаций) путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности исходной последовательности VHH на один или несколько аминокислотных остатков. которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в Vn-области канонического состоящего из 4 цепей человеческого антитела. Гуманизированный VnH-домен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческого каркасного участка и в более конкретном варианте осуществления изобретения может содержать последовательности человеческих каркасных участков. выведенные из DP-29. DP-47. DP-51. или их части. необязательно в сочетании с JH-последовательностями. такими как JH5.

Доменные антитела. которые обозначают также как Dab или dAb (понятия доменные антитела и dAb являются товарными знаками группы компаний GlaxoSmithKline). описаны. например. у Ward E.S. и др. в Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341. 1989. сс. 544-546; у Holt L.J. и др. в Domain antibodies: proteins for therapy. TRENDS in Biotechnology 21(11). 2003. сс. 484-490 и в WO 2003/002609.

Доменные антитела в основном соответствуют V_H- или ^-доменам антител из представителей млекопитающих. не относящихся к верблюдовым. в частности человеческих состоящих из 4 цепей антител. Для придания способности связываться с эпитопом в виде единичного антигенсвязывающего домена. т.е. без спаривания с V_L- или Vn-доменом соответственно. требуется осуществлять специфическую селекцию в отношении указанных антигенсвязывающих свойств. например. с использованием библиотек человеческих последовательностей единичных V_H- или Vi.-доменов.

Доменные антитела подобно V_HH имеют молекулярную массу. составляющую от примерно 13 до примерно 16 кДа. если их выводят из полностью человеческих последовательностей. и они не нуждаются в гуманизации. например. для терапевтического применения на людях. Также как и в случае V_HHдоменов. их можно с успехом экспрессировать также в прокариотических системах экспрессии. что приводит к существенному снижению общей стоимости производства.

Кроме того. что также должно быть очевидно специалисту в данной области. можно трансплантировать один или несколько указанных выше CDR в другие каркасы. включая (но. не ограничиваясь только ими) человеческие каркасы или неиммуноглобулиновые каркасы. Приемлемые каркасы и методики такой трансплантации CDR известны в данной области.

Понятия эпитоп и антигенная детерминанта. которые можно применять взаимозаменяемо. относятся к участку макромолекулы. такой как полипептид. который распознается антигенсвязывающими молекулами. такими как канонические антитела или полипептиды. предлагаемые в изобретении. и более конкретно антигенсвязывающими центрами указанных молекул. Эпитопы представляют собой минимальный сайт связывания для иммуноглобулина и поэтому представляют собой специфическую мишень для иммуноглобулина.

- 7 031182

Считается, что полипептид (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, или в целом антигенсвязывающая молекула или ее фрагмент), который может связываться с или специфически связываться с, который обладает аффинностью к и/или специфичностью к определенному эпитопу, антигену или белку (или по меньшей мере одному его участку, фрагменту или эпитопу), действует против или является направленным против указанного эпитопа, антигена или белка, или является связывающей молекулой в отношении указанного эпитопа, антигена или белка. В этом контексте Апд2-связывающую молекулу можно обозначать также как Апд2-нейтрализующая молекула.

Как правило, понятие специфичность относится к ряду антигенов или эпитопов различных типов, с которыми конкретная антигенсвязывающая молекула или молекула антигенсвязывающего белка (такая как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении) может связываться. Специфичность антигенсвязывающей молекулы можно определять на основе ее аффинности и/или авидности. Аффинность, характеризующаяся константной равновесия реакции диссоциации комплекса антиген: антигенсвязывающий белок (KD), является мерой силы связывания между эпитопом и антигенсвязывающим центром антигенсвязывающего белка: чем меньше величина KD, тем выше сила связывания между эпитопом и антигенсвязывающей молекулой (в альтернативном варианте аффинность можно выражать в виде константы аффиннности (KA), которая представляет собой 1/KD). Как должно быть очевидно специалисту в данной области (например, после ознакомления с представленным ниже дополнительным описанием), аффинность можно определять хорошо известным методом в зависимости от специфичности представляющего интерес антигена. Авидность представляет собой меру силы связывания между антигенсвязывающей молекулой (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, содержащий их) и соответствующего антигена. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и его антигенсвязывающем центром антигенсвязывающей молекулы, так и с количеством соответствующих сайтов связывания, которые присутствуют в антигенсвязывающей молекуле.

Часть антигенсвязывающей молекулы (такой как антитело или иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении), которая распознает эпитоп, называется паратопом.

Если не указано иное, то понятие Апд2-связывающая молекула включает антитела к Ang2, фрагменты антитела к Ang2, молекулы, напоминающие антитело к Ang2, как они определены в настоящем описании, и конъюгаты, включающие любую из указанных субстанций. Антитела представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные и химерные моноклональные антитела. Понятие антитело относится к полным иммуноглобулинам, например, моноклональным антителам, которые получают путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, а также к фрагментам Ang2-связывающего антитела или молекулам, напоминающим антитела, включая одноцепочечные антитела и линейные антитела, так называемые SMIP (Small Modular Immunopharmaceuticals, малые модульные иммунофармацевтические средства), например, описанные в WO 02/056910. Напоминающие антитела к Ang2 молекулы включают иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, представленные в настоящем описании. Другими примерами напоминающих антитела молекул являются антитела из суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF) или молекулы с трансплантированными CDR.

Понятие Ang2-связывающая молекула относится как к одновалентным Ang2-связывающим молекулам (т.е. к молекулам, которые связываются с одним эпитопом Ang2), так и к Ang2-связывающим молекулам, которые содержат более одного связывающегося с Ang2 иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, которые обозначают также как форматированные Ang2-связывающие молекулы. Форматированные Ang2-связывающие молекулы могут помимо Ang2-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов содержать также линкеры и/или фрагменты с эффекторными функциями, например, фрагменты, удлиняющие время полужизни, типа альбуминсвязывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, и/или партнера по слиянию типа сывороточного альбумина и/или присоединенного полимера типа ПЭГ.

Форматированная Ang2-связывающая молекула может, хотя этот вариант является менее предпочтительным, содержать также два идентичных Ang2-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена или содержать два различных иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, которые распознают один и тот же или перекрывающиеся эпитопы. В этом случае два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена могут связываться с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом в каждом из двух мономеров, которые образуют димер Ang2. Экспериментальные данные, включая анализ ELISA в условиях конкуренции, демонстрируют выраженное повышение активности форматированных димеров Ang2 по сравнению с индивидуальными структурными элементами одновалентных Ang2-связывающих молекул (данные не представлены).

Как правило, связывание Ang2-связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, характеризуется величиной константы диссоциации (K_D), составляющей от 10E-5 до 10E-14 молей/л (М) или менее, и предпочтительно от 10E-7 до 10E-14 молей/л (М) или менее, более предпочтительно от 10E-8 до 10E-14 молей/л и еще более предпочтительно от 10E-11 до 10E-13, по данным, полученным, например, с помощью Biacore- или Kinexa-анализа), и/или величиной константны ассоциации (K_D), составляющей по

- 8 031182 меньшей мере 10E7 М^-1, предпочтительно по меньшей мере 10E8 М^-1, более предпочтительно по меньшей мере 10E9 М^-1, например, по меньшей мере 10E11 М^-1. Как правило, считается, что любое значение величины KD, превышающее 10E-4 М, свидетельствует о неспецифическом связывании. Предпочтительно связывание полипептида, предлагаемого в изобретении, с требуемым антигеном, т.е. Ang2, должно характеризоваться величиной K_D, составляющей менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, например, менее 500 пМ. Специфическое связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или эпитопом можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, такого, например, как анализы, представленные в настоящем описании, анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции (анализы конкурентного связывания), такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА) и сэндвич-анализы в условиях конкуренции и их различные варианты, хорошо известные в данной области.

Аминокислотные остатки обозначают согласно стандартному трехбуквенному или однобуквенному коду аминокислот, что хорошо известно и является общепризнанным в данной области. При сравнении двух аминокислотных последовательностей понятие различие в аминокислотах относится к инсерциям, делециям или заменам указанного количества аминокислотных остатков в определенном положении референс-последовательности по сравнению со второй последовательностью. В случае замен(ы) указанные(ая) замены(а) предпочтительно должны(а) представлять собой консервативные(ую) аминокислотные(ную) замены(у), это означает, что аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток сходного химического строения, который оказывает незначительное влияние или практически не оказывает влияния на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Указанные консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области, например, они описаны в WO 98/49185, при этом консервативные аминокислотные замены предпочтительно представляют собой замены, при которых одну из аминокислот из следующих групп (I)-(V) заменяют на другой аминокислотный остаток, входящий в эту же группу: (I) небольшие алифатические неполярные или имеющие невысокую полярность остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (II) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (III) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (IV) крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (V) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Наиболее предпочтительными являются следующие аминокислотные замены: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ile или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp или на Phe; Val на Ile или на Leu.

Молекула полипептида или нуклеиновой кислоты рассматривается как практически выделенная (находится в практически выделенной форме), например, из ее нативного биологического источника и/или реакционный среды или среды для культивирования, из которой ее получают, когда она отделена по меньшей мере от одного другого компонента, с которым она обычно ассоциирована в указанном источнике или указанной среде, такой как другой белок/полипептид, другая нуклеиновая кислота, другой биологический компонент или макромолекула или по меньшей мере один загрязнитель, примесь или минорный компонент. В частности, молекула полипептида или нуклеиновой кислоты рассматривается как практически выделенная, когда степень ее чистоты повышена по меньшей мере в 2 раза, в частности по меньшей мере в 10 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз и вплоть до 1000 раз или более. Молекула полипептида или нуклеиновой кислоты, которая находится в практически выделенной форме, предпочтительно является практически гомогенной, что определяют с помощью приемлемого метода, такого как приемлемый хроматографический анализ, электрофорез в полиакриламидном геле.

Понятие N-конец (который обозначают также как аминоконец, NV-конец, N-концевой или аминоконцевой) относится к началу белка/полипептида (т.е. Апд2-связывающей молекулы), который заканчивается аминокислотой со свободной аминогруппой (-NH₂). При общепринятой записи пептидных последовательностей N-конец помещают слева и записывают последовательность в направлении от N- к Cконцу. Когда происходит трансляция белка с матричной РНК, то процесс создания белка происходит в направлении от N-конца к C-концу.

Идентичность последовательностей двух последовательностей Апд2-связывающих молекул означает процент аминокислот, идентичных в обеих последовательностях. Его можно рассчитывать или определять согласно методу, изложенному в разделе е) на с. 49 и с. 50 WO 2008/020079. Сходство последовательностей означает процент аминокислот, которые либо идентичны, либо представляют собой консервативные аминокислотные замены.

В данной области известны альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков V_Hдоменов, указанные методы аналогичным образом можно применять для нумерации VH-доменов. Однако в настоящем описании, формуле изобретения и на чертежах для нумерации VH-доменов, если не указано иное, используют номенклатуру Кэбота, которая описана выше.

Апд2-связывающая молекула с созревшей аффинностью, в частности, V_HH или доменное антитело, несет одно или несколько изменений в одном или нескольких CDR, что приводит к повышенной аф

- 9 031182 финности к Ang2 по сравнению с соответствующей родительской Апд2-связывающей молекулой. Ang2связывающие молекулы с созревшей аффинностью можно получать методами, описанными в данной области, например, описанными у Marks и др., Biotechnology 10, 1992, сс. 779-783 или у Barbas и др., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91, 1994, сс. 3809-3813.; Shier и др., Gene 169, 1995, сс. 147-155; Yelton и др., Immunol. 155, 1995, сс. 1994-2004; Jackson и др., J. Immunol. 154(7), 1995, сс. 3310-3319 и у Hawkins и др., J. Mol. Biol. 226(3), 1992, сс. 889-896; у K.S. Johnson и R.E. Hawkins в Affinity maturation of antibodies using phage display, изд-во Oxford University Press, 1996.

В контексте настоящего изобретения аминокислотные последовательности SEQ ID NO: x включают, если не указано иное, аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: x;

а) аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: х;

б) аминокислотные последовательности, которые имеют 3, 2 или 1 различие в аминокислотах относительно последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: x.

Понятие рак и злокачественный относится или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примерами рака, который можно лечить с помощью Ang2-связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, являются (но, не ограничиваясь только ими) карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз. Более конкретными примерами указанных видов рака являются плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарционома легкого, плоскоклеточная карцинома легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудочно-кишечной системы, рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, почечноклеточная карцинома, карцинома эндометрия или матки, карцинома слюнных желез, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени, рак желудка, меланома и различные виды рака головы и шеи. Нарушение регуляции ангиогенеза может приводить ко многим нарушениям, которые можно лечить с помощью композиций и способов, предлагаемых в изобретении. Эти нарушения включают как ненеопластические, так и неопластические состояния. Неопластические заболевания включают (но, не ограничиваясь только ими) описанные выше заболевания.

Не относящиеся к неопластическим нарушения включают (но, не ограничиваясь только ими) нежелательную или абберантную гипертрофию, артрит, ревматоидный артрит (RA), псориаз, псориатические бляшки, саркоидоз, атеросклероз, атеросклеротические бляшки, диабетические и другие пролиферативные ретинопатии, включая ретинопатию недоношенных, ретролентальную фиброплазию, неоваскулярную глаукому, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетический макулярный отек, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию трансплантата роговицы, отторжение трансплантата роговицы, ретинальную/хориоидальную неоваскуляризацию, неоваскуляризацию угла глаза (покраснение), глазное, связанное с неоваскуляризацией заболевание, васкулярный рестеноз, артериовенозные пороки развития (AVM), менингиому, гемангиому, ангиофиброму, гиперлазии щитовидной железы (включая болезнь Грейвса), трансплантацию роговицы и другой ткани, хроническое воспаление, воспаление легких, острое легочное повреждение/РДСВ (респираторный дистресс-синдром взрослых), сепсис, первичную легочную гипертензию, злокачественные пульмональные выпоты, отек головного мозга (например, ассоциированный с острым ударом/закрытым повреждением головы/травмой), синовиальное воспаление, формирование паннуса при RA, оссифицирующий миозит, гипертрофическое образование костной ткани, остеоартрит (ОА), рефрактерные асциты, поликистозное заболевание яичника, эндометриоз, болезни, связанные с накоплением жидкости в третьем пространстве организма (панкреатит, компартмент-синдром, ожоги, болезнь кишечника), фиброиды матки, преждевременные роды, хроническое воспаление, такое как IBD (болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), отторжение почечного аллотрансплантата, воспалительное заболевание кишечника, нефротический синдром, нежелательный или аберрантный рост тканевой массы (неракового происхождения), суставы при гемофилических артропатиях, гипертрофические рубцы, прекращение роста волос, синдром Ослера-Вебера, гнойную грануломатозную ретролентальную фиброплазию, склеродерму, трахому, васкулярные адгезии, синовиит, дерматит, преэклампсию, асциты, перикардиальный выпот (например, ассоциированный с перикардитом) и плевральный выпот.

Понятие глазные болезни относится к пролиферативным ретинопатиям, включая ретинопатию недоношенных, ретролентальную фиброплазию, неоваскулярную глаукому, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетический макулярный отек, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию трансплантата роговицы, отторжение трансплантата роговицы, ретинальную/хороидальную неоваскуляризацию.

Понятие хронические болезни почек относится к диабетической нефропатии, постренальной почечной недостаточности, преренальной азотемии и врожденной почечной недостаточности.

Подробное описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является Ang2-связывающая молекула, содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, где указанный иммуноглобулиновый единичный

- 10 031182 вариабельный домен содержит три гипервариабельных участка CDR1, CDR2 и CDR3, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 168-170, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 171-173, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 174-177. CDR1 имеет последовательность, выбранную из

SEQIDNO:168 DYAIG

SEQ ID NO: 169 DYALG

SEQ ID NO: 170 YYAIG.

CDR2 имеет последовательность, выбранную из

SEQ ID NO: 171 AIRSSGGSTYYADSVKG

SEQ ID NO: 172

CIRCSGGSTYYADSVKG

SEQ ID NO: 173 CISSSGGITYYADSVKG.

CDR3 имеет последовательность, выбранную из

SEQ ID NO: 174 VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA

SEQ ID NO: 175

SEQ ID NO: 176

VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA

SIVPRSKLEPYEYDA

SEQ ID NO: 177 DSGGYIDYDCSGLGYDY.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения Ang2-связывающая молекула содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, в котором:

(а) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 168, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 174, или в котором (б) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 168, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 175, или в котором (в) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 169, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 172, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 176, или в котором (г) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 170, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 173, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 177.

Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления изобретения Ang2-связывающая молекула содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, где указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH или доменное антитело.

Согласно еще более предпочтительным вариантам осуществления изобретения Ang2-связывающая молекула содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, где указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH.

Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения указанный VHH состоит из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, который имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 167, 166, 129 и 138.

В другом объекте настоящего изобретения Ang2-связывающая молекула состоит из указанного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.

Последовательность связывающих Ang2 агентов, предлагаемых в изобретении, может быть модифицирована на их N-концах (т.е. делеция или замена первой аминокислоты) без значимого снижения их связывающей активности. Указанная модификация повышает ко-/пост-транляционное отщепление Nконцевого метионина в процессе внутриклеточной /цитоплазматической экспрессии в бактериальных хозяевах (например (но, не ограничиваясь только указанным видом) в Escherichia coli).

Согласно одному из объектов изобретения указанный V_HH, состоящий из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, имеет модификацию или замену на N-конце, где указанная модификация представляет собой делецию первой аминокислоты и указанная замен представляет собой замещение первой аминокислоты другой аминокислотой.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения первая аминокислота на Nконце представляет собой валин (V) или аспарагиновую кислоту (D), которые заменены, например, на аланин (A).

Ang2-связывающие компоненты с улучшенными с позиций терапевтического применения свойствами, например, обладающие повышенной аффинностью или пониженной иммуногенностью, можно получать из индивидуальных Ang2-связывающих молекул с помощью методик, известных в данной области, таких как созревание аффинности (например, используя в качестве исходных синтетические, про

- 11 031182 извольные или встречающиеся в естественных условиях последовательности иммуноглобулинов), CDRтрансплантация, гуманизация, объединение фрагментов, полученных из различных последовательностей иммуноглобулинов, ПЦР-сборка с использованием перекрывающихся праймеров и аналогичные методики, предназначенные для конструирования последовательностей иммуноглобулинов, которые хорошо известны специалисту в данной области; или любой приемлемой комбинации любых вышеизложенных методов. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, а также можно использовать приведенное ниже описание и сведения, представленные в примерах.

Предпочтительно Апд2-связывающий компонент, предлагаемый в изобретении, обладающий повышенной аффинностью, получают путем созревания аффинности другого Апд2-связывающего компонента, при этом последний относительно молекулы с созревшей аффинностью представляет собой родительский Апд2-связывающий компонент.

Так, согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения Ang2связывающая молекула, предлагаемая в изобретении, представляет собой иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, полученный с помощью созревания аффинности из родительского иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, описанного выше.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, полученный с помощью созревания аффинности VhH.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который применяли для гуманизации V_HH с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, 17 и 80.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который применяли для гуманизации V_HH с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 127, 132 и 146.

Изобретение относится также к Ang2-связывающим молекулам, которые получали путем созревания аффинности и/или оптимизации последовательности указанного выше V_HH, например, к V_HH, который получали путем оптимизации последовательности V_HH, имеющего аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 167, 166, 129 и 138.

Другим более предпочтительным вариантом осуществления изобретения является иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который получали путем созревания аффинности V_HH с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 167.

Еще более предпочтительным вариантом осуществления изобретения является иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который получали путем созревания аффинности V_HH с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 166.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который получали путем созревания аффинности V_HH с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 129.

Следующим вариантом осуществления изобретения является иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который получали путем созревания аффинности V_HH с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 138.

Согласно другому варианту осуществления изобретения представители класса Ang2-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, или присутствующие в полипептидах, предлагаемых в изобретении, имеют аминокислотные последовательности, которые соответствуют встречающемуся в естественных условиях Уц-домену. который был «камелизирован», т. е. изменен путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, встречающейся в естественных условиях вариабельной области тяжелой цепи канонического состоящего из 4 цепей антитела на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в УцН-домене состоящего из тяжелой цепи антитела. Это можно осуществлять хорошо известным методом, который очевиден специалисту в данной области и дополнительную информацию о котором можно почерпнуть из WO 94/04678. Указанная «камелизация» может затрагивать главным образом аминокислотные положения, которые находятся в области контакта V_H-V_l, и так называемые остатки-маркеры верблюдовых (см., например, также WO 94/04678). Подробное описание указанных методов гуманизации и камелизации и предпочтительные последовательности каркасных участков, которые пригодны для осуществления этих методов, можно дополнительно почерпнуть из сведений, представленных на с. 46 и с. 98 WO 2006/040153 и с. 107 WO 2006/122786.

Апд2-связывающие компоненты, предлагаемые в изобретении, например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и/или содержащие их полипептиды, обладают специфичностью в отношении Ang2, поскольку они содержат один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, специфически связывающихся с одним или несколькими эпитопами молекулы Ang2.

Специфическое связывание Апд2-связывающего компонента молекулы с ее антигеном Ang2 можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, включая, например, представленные в настоящем описании методы, такие как анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях

- 12 031182 конкуренции, такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА и ELISA) и сэндвич-анализы в условиях конкуренции и их различные варианты, хорошо известные в данной области.

Касательно антигена Ang2, Ang2-связывающий компонент, например иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, не ограничен происхождением из какого-либо конкретного вида. Так, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, или содержащие их полипептиды предпочтительно связываются с человеческим Ang2, если они предназначены для лечения человека. Однако иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с Ang2 из других видов млекопитающих, или полипептиды, содержащие их, также подпадают под объем изобретения. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, который связывается с Ang2 из одного из видов, может давать перекрестную реакцию с Ang2 из одного или нескольких других видов. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, которые связываются с человеческим Ang2, могут обладать перекрестной реактивностью с Ang2 из одного или нескольких других видов приматов и/или Ang2 из одного или нескольких видов животных, которых применяют в качестве животных, на которых моделируют заболевание, например, обезьян (в частности обезьян циномолгус (яванский макак-крабоед) или макак резус), мышей, крыс, кроликов, свиней, собак), в частности из животных, на которых моделируют заболевания и нарушения, ассоциированные с опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез (например, в качестве видов и животных моделей, упомянутых в настоящем описании).

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, которые обладают указанной перекрестной реактивностью, являются важными для исследовательских целей и/или для разработки лекарственных средств, поскольку позволяют тестировать иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, на признанных моделях заболеваний, созданных на таких животных как обезьяны, в частности циномолгус или макак резус, или мыши и крысы.

Кроме того, Ang2-связывающие компоненты, предлагаемые в изобретении, не ограничены или не определены конкретным доменом или антигенной детерминантой Ang2, который/которая является их мишенью. Предпочтительно с позиций перекрестной реактивности с одной или несколькими молекулами Ang2 из видов кроме человека, которая(ые) предназначена(ы) для применения в качестве животных моделей при разработке терапевтического антагониста Ang2, Ang2-связывающий компонент распознает эпитоп в представляющей интерес области Ang2, которая обладает высокой степенью идентичности с человеческим Ang2. Например, при применении мышиной модели иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, распознает эпитоп, который полностью или частично локализован в FLD-домене, описанном у Kim H-Z, Jung K, Kim H.M., Cheng Y и Koh G.Y. A designed angiopoietin-2 variant, pentameric COMP-Ang2, strongly activates Tie2 receptor and stimulated angiogenesis, Biochim Biophys Acta 1793, 2009, сс. 772-780.

Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления изобретения является Ang2связывающий компонент, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или содержащий его полипептид, где указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен выбран из группы молекул, которые связываются с эпитопом, полностью или частично входящим в FLDдомен (SEQ ID NO: 188-190).

Предпочтительно связывание иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в изобретении, с Ang2 характеризуется величиной аффинности, составляющей менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, например, менее 500 пМ (что определяют с помощью анализа на основе резонанса поверхностного плазмона).

Предпочтительно для иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, характерны величины IC50, измеренные с помощью ELISA в условиях конкуренции, составляющие от 10^-6 до 10^-10 молей/л или менее, более предпочтительно от 10^-8 до 10^-10 моль/л или менее и еще более предпочтительно от 10^-9 до 10^-10 молей/л или менее.

Согласно не ограничивающему объем изобретения предпочтительному варианту осуществления изобретения связывание с Ang2 Ang2-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, или содержащих их полипептидов характеризуется величиной константы диссоциации (KD), составляющей от 10^-5 до 10^-12 молей/л (М) или менее и предпочтительно от 10^-7 до 10^-12 молей/л (М) или менее и более предпочтительно от 10^-8 до 10^-12 молей/л (М), и/или величиной константы ассоциации (KD), составляющей по меньшей мере 10⁷М^-1, предпочтительно по меньшей мере 10 М^-, более предпочтительно по меньшей мере 10 М^- , например, по меньшей мере 10 М^- ; и в частности, величиной KD, составляющей менее 500нМ, предпочтительно менее 200нМ, более предпочтительно менее 10нМ, например, менее 500пМ. Можно определять величины KD и K_A иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в изобретении, характеризующие связывание с Ang2.

Согласно другому варианту осуществления изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой доменные антитела, представленные в настоящем описании.

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, присутствующие в моноспецифических связывающих молекулах, предлагаемых в изобретении, имеют последовательности, которые соответст

- 13 031182 вуют встречающемуся в естественных условиях У_н-домену, который был камелизирован, т.е. изменен путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, встречающейся в естественных условиях вариабельной области тяжелой цепи канонического состоящего из 4 цепей антитела на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в У_нН-домене состоящего из тяжелой цепи антитела. Это можно осуществлять хорошо известным методом, который очевиден специалисту в данной области и дополнительную информацию о котором можно почерпнуть из WO 94/04678. Указанная камелизация может затрагивать главным образом аминокислотные положения, которые находятся в области контакта V_h-Vl, и так называемые остатки-маркеры верблюдовых (см., например, также WO 94/04678). Подробное описание указанных методов гуманизации и камелизации и предпочтительные последовательности каркасных участков, которые пригодны для осуществления этих методов, можно дополнительно почерпнуть из сведений, представленных на с. 46 и с. 98 WO 2006/040153 и с. 107 WO 2006/122786.

Связывающие компоненты обладают специфичностью в отношении Ang2, поскольку они содержат в предпочтительном варианте осуществления изобретения один из иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, специфически связывающихся с одним или несколькими эпитопами молекулы Ang2.

Специфическое связывание связывающего компонента с его антигеном Ang2 можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, включая, например, представленные в настоящем описании методы, такие как анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции, такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА и ELISA) и сэндвичанализы в условиях конкуренции и их различные варианты, хорошо известные в данной области.

Касательно антигена Ang2, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен не ограничен происхождением из какого-либо конкретного вида. Так, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены предпочтительно связываются с человеческим Ang2, если они предназначены для лечения человека. Однако иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с Ang2 из других видов млекопитающих, или полипептиды, содержащие их, также подпадают под объем изобретения. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с Ang2 из одного из видов, может давать перекрестную реакцию с соответствующим антигеном из одного или нескольких других видов. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с человеческим Ang2, могут обладать перекрестной реактивностью с соответствующим антигеном из одного или нескольких других видов приматов и/или с антигеном из одного или нескольких видов животных, которых применяют в качестве животных, на которых моделируют заболевание, например, обезьян (в частности обезьян циномолгус или макак резус), мышей, крыс, кроликов, свиней, собак), в частности из животных, на которых моделируют заболевания и нарушения, которые можно модулировать путем ингибирования Ang2 (таких как виды и животные модели, упомянутые в настоящем описании). Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, которые обладают указанной перекрестной реактивностью, являются важными для исследовательских целей и/или для разработки лекарственных средств, поскольку позволяют тестировать иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, на признанных моделях заболеваний, созданных на таких животных как обезьяны, в частности циномолгус или макак резус, или мыши и крысы.

Кроме того, связывающие компоненты не ограничены или не определены конкретным доменом или антигенной детерминантой антигена, который является их мишенью. Предпочтительно с позиций перекрестной реактивности с одной или несколькими молекулами антигенов из видов кроме человека, которая(ые) предназначена(ы) для применения в качестве животных моделей при разработке терапевтического антагониста Ang2, связывающий компонент распознает эпитоп в представляющей интерес области антигена, которая обладает высокой степенью идентичности с человеческим антигеном. Например, при применении мышиной модели анти-Ang2 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, входящий в моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, распознает эпитоп, который полностью или частично локализован в EGF-2-домене Ang2, для которого характерна высокая идентичность при сравнении человеческой и мышиной последовательности.

Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения моноспецифическая связывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержит Ang2-связывающую молекулу, которая представляет собой иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 167, 166, 129 и 138, который связывается с эпитопом, полностью или частично входящим в FLD-домен.

Настоящее изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, которая кодирует Ang2связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения Ang2-связывающая молекула, предлагаемая в изобретении, при экспрессии в Escherichia coli кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из:

- 14 031182

SEQ ID NO: 178

GAGGTACAGCTGGTCGAGTCAGGTGGCGGATTAGTGCAGCCTGGGGGTTCTC TGCGCTTATCTTGTGCCGCATCAGGCTTCACACTGGATGACTACGCCATCGG CTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGCGAAGGTGTTTCAGCAATCCG TTCAAGCGGTGGTTCAACATATTACGCCGACTCTGTTAAAGGACGCTTCACC ATTAGCTCCGACAATAGTAAAAATACAGTCTACTTACAAATGAACAGTTTAC GCCCAGAAGATACTGCGGTATACTATTGCGCTGCCGTGCCTGCTGGTCGCTT ACGCTTTGGCGAGCAATGGTATCCTCTGTACGAGTACGACGCCTGGGGACAG GGTACGCTGGTAACGGTTTCAAGC,

SEQ ID NO: 179 GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGACTGGTGCAACCGGGTGGTTCA CTGCGCCTGAGTTGCGCAGTTAGCGGTATTACCCTGGATGATTATGCAATTG GTTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCGCAATTC GTAGCAGCGGTGGTAGCACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTAC GATCAGCAGCGATAACAGTAAAAACACGGTTTATCTGCAAATGAACTCATTA CGTCCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGCGCAGCAGTTCCGGCAGGTCGTC TGCGTTATGGTGAACAGTGGTATCCGATTTATGAATATGATGCATGGGGTCA AGGTACACTGGTTACAGTGAGTAGC

SEQ ID NO: 180, GAAGTGCAGTTAGTCGAAAGTGGCGGAGGCCTGGTACAACCTGGTGGCAGT CTGCGCTTATCTTGTGCCGCTTCAGGTTTTACATTCGACGACTACGCCCTGGG GTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGTGAGGGCGTTTCATGCATTCGT TGTTCAGGTGGTTCAACCTATTATGCCGATAGTGTAAAAGGTCGGTTCACCA TTAGTAGCGACAATAGCAAGAATACAGTCTATCTGCAAATGAACTCTTTACG TCCTGAAGATACTGCGGTGTACTACTGCGCTGCATCAATCGTTCCTCGTTCAA AACTTGAACCTTACGAGTACGACGCCTGGGGTCAGGGTACGTTAGTAACGGT GTCAAGC и

SEQ ID NO: 181

GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGTTTAGTGCAACCGGGTGGTTCAC TGCGCCTGAGTTGCGCAGCCAGCGGTTTTGCACTGGATTATTATGCAATTGG TTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCTGTATTAGC AGCAGCGGTGGTATTACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGA TCTCTCGTGATAATAGTAAAAACACGGTTTACCTGCAGATGAACTCATTAAG ACCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGTGCAACCGATAGCGGTGGCTATATT GATTATGATTGTAGCGGTCTGGGCTACGATTATTGGGGACAAGGTACGCTGG TGACAGTTAGCAGC.

Изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении. Указанные молекулы нуклеиновых кислот в контексте настоящего описания обозначают также как нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, и они могут иметь также форму генетической конструкции, указанной в настоящем описании. Нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может представлять собой геномную ДНК, кДНК или синтетическую ДНК (такую как ДНК с наиболее часто встречающимися кодонами, которая специально адаптирована для экспрессии в выбранной клетке-хозяине или выбранном организме-хозяине). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, находится в практически выделенной форме, как указано выше в настоящем описании.

Следующим объектом изобретения является экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанную Ang2-связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может иметь также форму вектора, может присутствовать в векторе и/или представлять собой часть вектора, такого, например, как плазмида, космида или YAC.

Вектор может представлять собой прежде всего экспрессионный вектор, т.е. вектор, который может обеспечивать экспрессию моноспецифической связывающей молекулы in vitro и/или in vivo (т.е. в приемлемой/приемлемом клетке-хозяине, организме-хозяине и/или экспрессионной системе). Указанный экспрессионный вектор, как правило, содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которая функционально связана с одним или несколькими приемлемыми регулятор

- 15 031182 ными элементами, такими как промотор(ы), энхансер(ы), терминатор(ы) и т.п. Указанные элементы и их отбор с позиций экспрессии конкретной последовательности в конкретном хозяине находятся в компетенции обычного специалиста в данной области. Конкретные примеры регуляторных элементов и других элементов, пригодных или необходимых для экспрессии моноспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, таких как промоторы, энхансеры, терминаторы, факторы интеграции, маркеры для селекции, лидерные последовательности, репортерные гены и т. п., описаны, например, на сс. 131-133 WO 2006/040153.

Указанные векторы экспрессируют или обладают способностью экспрессировать одну или несколько моноспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении; и/или содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении.

Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, можно создавать или получать хорошо известным методом (например, путем автоматического синтеза ДНК и/или методом рекомбинантной ДНК) на основе информации об аминокислотных последовательностях полипептидов, предлагаемых в изобретении, которая представлена в настоящем описании, и/или их можно выделять из пригодного встречающегося в естественных условиях источника.

Следующим объектом изобретения является клетка-хозяин, которая несет один или несколько экспрессионных векторов, содержащих молекулу нуклеиновой кислота, которая кодирует Ang2связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении.

В одном из конкретных предпочтительных вариантов осуществления изобретения клетки-хозяева представляют собой бактериальные клетки; другими пригодными клетками являются клетки дрожжей, клетки грибов или клетки млекопитающих.

Приемлемыми бактериальными клетками являются клетки грамотрицательных штаммов бактерий, таких как штаммы Escherichia coli, Proteus и Pseudomonas, и грамположительных штаммов бактерий, таких как штаммы Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus и Lactococcus. Приемлемыми грибными клетками являются клетки видов Trichoderma, Neurospora и Aspergillus. Приемлемыми клетками дрожжей является клетки видов Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (например, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (например, Pichia pastoris и Pichia methanolica) и Hansenula.

Приемлемыми клетками млекопитающих являются, например, CHO-клетки, BHK-клетки, HeLaклетки, COS-клетки и т.п. Однако можно использовать также клетки амфибий, клетки насекомых, клетки растений и любые другие клетки, которые применяют в данной области для экспрессии гетерологичных белков.

Изобретение относится также к способам получения моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, как правило, заключающимся в том, что осуществляют стадии, на которых культивируют клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, обладающую способностью кодировать моноспецифическую связывающую молекулу в условиях, которые обеспечивают экспрессию моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении; и высвобождают или выделяют из культуры полипептид, экспрессируемый клетками-хозяевами; и необязательно дополнительно очищают и/или модифицируют, и/или включают в препаративную форму моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ получения Ang2связывающей молекулы, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 167, 166, 129 и 138, заключающийся в том, что осуществляют стадии, в которых:

(а) трансфектируют клетку-хозяина одним или несколькими указанными векторами, (б) культивируют указанную клетку-хозяина и (в) выделяют и очищают указанную Ang2-связывающую молекулу.

Для производства в промышленном масштабе предпочтительными организмами-хозяевами являются штаммы Е. coli, Pichia pastoris и S. cerevisiae, которые пригодны для крупномасштабной экспрессии, производства и ферментации, и прежде всего для крупномасштабной экспрессии, производства и ферментации фармацевтических продуктов.

Выбор конкретной экспрессионной системы зависит, в частности, от требований к определенным пост-трансляционным модификациям, более конкретно к гликозилированию. Для получения моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, для которой гликозилирование является желательным или необходимым, требуется применять для экспрессии клетки-хозяева млекопитающих, обладающие способностью гликозилировать экспрессируемый белок. В этом плане специалисту в данной области должно быть очевидно, что полученная схема гликозилирования (т.е. вид, количество и положение присоединенных остатков) должна зависеть от клетки или клеточной линии, применяемой для экспрессии.

Моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно получать либо в клетке, согласно описанному выше методу, внутриклеточно (например, в цитозоле, периплазме или в тельцах включения), а затем выделять из клеток-хозяев и необязательно дополнительно очищать; либо их можно получать внеклеточно (например, в среде, в которой культивируют клетки-хозяева), а затем выделять из культуральной среды и необязательно дополнительно очищать.

- 16 031182

Методы и реагенты, которые применяют для получения полипептидов с помощью рекомбинантной ДНК, такие как специфические приемлемые экспрессионные векторы, методы трансформации или трансфекции, маркеры для селекции, методы индукции экспрессии белков, условия культивирования и т.п., известны в данной области. Аналогично этому методики выделения и очистки белков, применяемые в методе производства полипептида, предлагаемого в изобретении, хорошо известны специалисту в данной области.

Эти пептиды соответствуют CDR3, выведенным из V_HH, предлагаемых в изобретении. Их, в частности молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют их, можно применять для трансплантации CDR для того, чтобы заменять CDR3 в цепи иммуноглобулина или для инсерции в неимуноглобулиновый каркас, например, ингибитор протеазы, ДНК-связывающий белок, цитохром b562, состоящий из пучка спиралей белок, связанный дисульфидным мостиком пептид, липокаин или антикалин, которые придают указанному каркасу способность связываться с мишенью. Метод трансплантации CDR хорошо известен в данной области и его широко применяли, например, для гуманизации антител (что, как правило, предусматривает трансплантацию CDR из антитела грызунов, в каркасные участки Fv человеческого антитела).

Для получения имммуноглобулинового или неиммуноглобулинового каркаса, содержащего CDR3, предлагаемый в изобретении, ДНК, которая кодирует указанную молекулу, можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии, например, с помощью синтеза генов, отжига олигонуклеотидов или на основе перекрывающихся ПЦР-фрагментов, которые описаны, например, у Daugherty и др., Nucleic Acids Research, т. 19, 9, 1991, сс. 2471-2476. Метод инсерции CDR3 V_HH в неиммуноглобулиновый каркас описан у Nicaise и др., Protein Science, 13, 2004, сс. 1882-1891.

Изобретение относится также к продукту или композиции, содержащему/содержащей по меньшей мере одну моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, и необязательно один или несколько хорошо известных дополнительных компонентов указанных композиций, т.е. которые зависят от предполагаемого применения композиции.

Следующим объектом изобретения является применение моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, в качестве лекарственного средства.

Еще одним объектом изобретения является применение моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, в способе лечения рака, злокачественных заболеваний или болезней глаз.

Для фармацевтического применения на основе моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, или полипептида, который ее содержит, можно приготавливать формы в виде фармацевтического препарата или композиции, содержащего/содержащей по меньшей мере одну моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и необязательно один или несколько дополнительных фармацетически активных полипептидов и/или соединений. Примерами таких препаративных форм являются (но, не ограничиваясь только ими) формы, пригодные для орального введения, для парентерального введения (например, с помощью внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции или внутривенной инфузии), для местного применения, для применения путем ингаляции, с помощью кожного пластыря, с помощью имплантата, суппозитория и т.д. Указанные приемлемые для введения формы, которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими в зависимости от пути введения, а также методы и носители для их применения в препаратах, должны быть очевидны специалисту в данной области и дополнительно представлены в настоящем описании.

Таким образом, следующим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит по меньшей мере одну моноспецифическую связывающую молекулу, в частности один иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, или полипептид, который его содержит, и по меньшей мере один приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. пригодный для фармацевтического применения) и необязательно одну или несколько дополнительных активных субстанций.

Моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно включать в препаративную форму и вводить с помощью любого пригодного хорошо известного метода: см. ссылки, прежде всего касающиеся иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, например, в WO 2004/041862, WO 2004/041863, WO 2-04/041865, WO 2004/041867 и WO 2008/020079, а также в стандартных справочниках, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Publishing Company, США, 1990, Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21-ое изд., изд-во Lippincott Williams и Wilkins, 2005; или Handbook of Therapeutic Antibodies, под ред. S. Dubel, изд-во Wiley, Weinheim, 2007 (см., например, сс. 252-255).

Например, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, можно включать в препаративную форму и вводить любым методом, широко применяемым для канонических антител и фрагментов антител (включая ScFv и димерные антитела) и других фармацевтически активных белков. Указанные препаративные формы и методы их получения должны быть очевидны специалисту в данной области и, например, включают препараты, пригодные для парентерального введения

- 17 031182 (например, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, внутрипросветного, внутриартериального или внутриоболочечного введения) или для местного (т.е. трансдермального или внутридермального) применения.

Препараты для парентерального введения могут представлять собой, например, стерильные растворы, суспензии, дисперсии или эмульсии, которые можно применять для инфузии или инъекции. Приемлемыми носителями или разбавителями для таких препаратов являются, например (но, не ограничиваясь только ими) стерильная вода и фармацевтически приемлемые водные буферы и растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса; водные растворы масел; глицерин; этанол; гликоли, такие как пропиленгликоль, или также минеральные масла, животные масла и растительные масла, например арахисовое масло, соевое масло, а также их приемлемые смеси. Как правило, предпочтительными являются водные растворы или суспензии.

Так, моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно вводить системно, например, орально, в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем, таким как инертный разбавитель или усвояемый съедобный носитель. Для орального терапевтического применения моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно объединять с одним или несколькими эксципиентами и применять в форме предназначенных для приема внутрь таблеток, трансбуккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Указанные композиции и препараты должны содержать Ang2-связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, в количестве, составляющем по меньшей мере 0,1%. Указанное процентное содержание в композициях и препаратах может, естественно, варьироваться и может, как правило, составлять от примерно 2 до примерно 60% в пересчете на массу указанной стандартной дозы лекарственного средства. Количество моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, в предназначенных для терапевтического применения композициях является таким, чтобы обеспечивать эффективный уровень доз.

Таблетки, пилюли, капсулы и т.п. могут содержать также связывающие агенты, эксципиенты, разрыхлители, замасливатели и подслащивающие вещества или корригенты, например, упомянутые на сс. 143-144 WO 2008/020079. Когда стандартная доза лекарственного средства представляет собой капсулу, то она может содержать помимо продуктов указанного выше типа жидкий носитель, такой как растительное масло или полиэтиленгликоль. Различные другие материалы могут присутствовать в виде покрытий или их можно применять для другой модификации физической формы твердой стандартной дозы лекарственного средства. Например, на таблетки, пилюли и капсулы можно наносить покрытие из желатина, воска, шеллака или сахара и т.п. Сироп или эликсир может включать моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, сахарозу или фруктозу в качестве подслащивающего вещества, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, такой как вишневая или апельсиновая отдушка. Естественно, любой продукт, применяемый для приготовления любой стандартной дозы лекарственного средства, должен быть фармацевтически приемлемым и практически нетоксичным в применяемых количествах. Кроме того, моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно включать в препараты или устройства с замедленным высвобождением.

Препараты и формы для орального введения могут иметь также энтеросолюбильное покрытие, которое позволяет конструкциям, предлагаемым в изобретении, сохраняться в среде желудка и проходить в кишечник. Более конкретно препараты и формы для орального введения можно приготавливать в виде, который позволяет осуществлять введение в требуемый отдел желудочно-кишечного тракта. Кроме того, для введения в желудочно-кишечный тракт можно применять суппозитории.

Моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно вводить также внутривенно или внутрибрюшинно с помощью инфузии или инъекции, что более подробно описано на сс. 144 и 145 WO 2008/020079.

В случае предназначенных для местного применения моноспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, их требуется наносить на кожу в виде композиций или форм в сочетании с приемлемым для дерматологического применения носителем, который может быть твердым или жидким, что более подробно описано на с. 145 WO 2008/020079.

Как правило, концентрация моноспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, в жидкой композиции, такой как лосьон, должна составлять примерно 0,1-25 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-10 мас.%. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, должна составлять примерно 0,1-5 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-2,5 мас.%.

Количество моноспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, которое требуется для лечения, должно варьироваться не только в зависимости от конкретной выбранной моноспецифической связывающей молекулы, но также от пути введения, природы состояния, подлежащего лечению, и возраста и состояния пациента, и, в конце концов, оно определяется предписанием лечащего врача или клинициста. Кроме того, доза моноспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, варьирует в зависимости от клетки-, опухоли-, ткани-, трансплантата- или органа-мишени. Требуемую дозу, как правило, можно применять в виде однократной дозы или в виде разделенных доз, которые предназначены для введения с соответствующими интервалами, например, в виде двух, трех, четырех или большего количества субдоз в день. Режим введения самих субдоз можно дополнительно

- 18 031182 разделять, например, на ряд введений, разделенных пустыми промежутками без обработки; например, на несколько ингаляций с использованием инсуффлятора, или путем внесения нескольких капель в глаз.

Схема введения может включать пролонгированную ежедневную обработку. Под пролонгированной подразумевают обработку в течение периода времени, составляющего по меньшей мере две недели и предпочтительно несколько недель, месяцев или лет. Необходимость изменений в этой схеме приема доз может определять обычный специалист в данной области с помощью общепринятых экспериментов, указанных в настоящем описании (см., Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Martin E.W., 4-ое изд., изд-во Mack Publishing Co., Easton, PA). Дозу может регулировать также каждый лечащий врач в случае любых осложнений.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является применение моноспецифических связывающих молекул, например, иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов или содержащих их полипептидов, для следующих терапевтических целей:

для предупреждения, лечения и/или облегчения нарушения, заболевания или состояния, прежде всего у человека, которое ассоциировано с опосредуемыми Ang2 и/или связанными с Ang2 воздействиями на ангиогенез, или которое можно предупреждать, лечить или облегчать посредством модуляции пути передачи сигналов Notch и/или передачи сигналов Tie2 с помощью моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, в способе лечения пациента, который нуждается в такой терапии, заключающемся в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, в фармацевтически активном количестве по меньшей мере одну моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, например иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, или содержащую их фармацевтическую композицию;

для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения, лечения или облегчения нарушений, заболеваний или состояний, ассоциированных с опосредуемыми Ang2 и/или связанными с Ang2 воздействиями на ангиогенез;

в качестве действующего вещества в фармацевтической композиции или лекарственном средстве, применяемой/применяемом для указанных выше целей.

Согласно конкретному объекту изобретения нарушение, заболевание или состояние представляет собой рак или злокачественное заболевание, указанное в настоящем описании.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения рака или злокачественных заболеваний, таких как рак молочной железы, почечноклеточная карцинома, рак яичника и рак поджелудочной железы.

Согласно другому объекту изобретения заболевание представляет собой глазную болезнь, ассоциированную с опосредуемыми Ang2 и/или связанными с Ang2 воздействиями на ангиогенез, или которую можно лечить или облегчать посредством модуляции пути передачи сигналов Notch и/или передачи сигналов Tie2 с помощью моноспецифической связывающей молекулы.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения глазных болезней, таких как возрастная дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения хронических болезней почек.

В зависимости от рака/злокачественных заболеваний, глазных болезней и/или хронических болезней почек, подлежащих лечению, моноспецифическую связывающую молекулу можно применять индивидуально или в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит в качестве действующего вещества одну или несколько указанных Ang-2связывающих молекул, дополнительно содержит одно или несколько дополнительных терапевтических средств, таких как химиотерапевтические агенты типа повреждающих ДНК агентов и/или обладающих антимитотическим действием в раковых клетках лекарственных средств (например, таксол), или терапевтических активных соединений, которые ингибируют ангиогенез (антиангиогенное лекарственное средство, такое как ингибитор VEGF/рецептора VEGF, например, авастин, нитеданиб и сунитиниб), или ингибиторы пути трансдукции сигнала, такие как ингибиторы mTOR (например, темсиролимус), или агенты для гормональной терапии (например, тамоксифен).

Дополнительное терапевтическое средство можно вводить одновременно, необязательно в виде компонента одного и того же фармацевтического препарата, или до, или после введения моноспецифической связывающей молекулы.

В конкретных вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство может представлять собой (но не ограничиваясь только ими) один или несколько ингибиторов, выбранных из группы ингибиторов EGFR, VEGF, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK и PI3киназые, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R или IR.

Другими примерами дополнительных терапевтических агентов являются ингибиторы CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, антагонисты hedgehog, ингибиторы JAK/STAT, Mek, mTor, NF-каппаВ, протеосом, Rho, ингибитор пути передачи сигналов wnt или ингибитор пути убикити

- 19 031182 низации или другой ингибитор пути передачи сигналов Notch.

Примерами ингибиторов киназы Aurora являются (но не ограничиваясь только ими) PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.

Примером ингибитора PLK является GSK-461364.

Примерами ингибиторов VEGF являются авастин (фирма Roche), афлиберцепт (фирма Regeneron).

Примерами ингибиторов raf являются BAY-73-4506 (который является также ингибитором VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (который является также ингибитором VEGFR), сорафениб (который является также ингибитором VEGFR) и XL281.

Примерами ингибиторов KSP являются испинесиб, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731 и SB-743921.

Примерами ингибиторов src и/или bcr-abl являются дасатиниб, AZD-0530, босутиниб, XL 228 (который является также ингибитором IGF-1R), нилотиниб (который является также ингибитором PDGFR и cKit), иматиниб (который является также ингибитором cKit) и NS-187.

Примером ингибитора PDK1 является ВХ-517.

Примером ингибитора Rho является BA-210.

Примерами ингибиторов PI3-киназы являются PX-866, BEZ-235 (который является также ингибитором mTor), XL 418 (который является также ингибитором Akt), XL-147 и XL 765 (который является также ингибитором mTor).

Примерами ингибиторов cMet или HGF являются XL-184 (который является также ингибитором VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (который является также ингибитором VEGFR), MGCD-265 (который является также ингибитором VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 и AV-299.

Примером ингибитора с-Мус является CX-3543.

Примерами ингибиторов Flt3 являются AC-220 (который является также ингибитором cKit and PDGFR), KW 2449, лестауртиниб (который является также ингибитором VEGFR, PDGFR, PKC), TG101348 (который является также ингибитором JAK2), XL-999 (который является также ингибитором cKit, FGFR, PDGFR и VEGFR), сунитиниб (который является также ингибитором PDGFR, VEGFR и cKit) и тандутиниб (который является также ингибитором PDGFR и cKit).

Примерами ингибиторов HSP90 являются танеспимицин, алвеспимицин IPI-504 и CNF 2024.

Примерами ингибиторов JAK/STAT являются CYT-997 (который взаимодействует также с тубулином), TG 101348 (который является также ингибитором Flt3) и XL-019.

Примерами ингибиторов Mek являются ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 и XL 518.

Примерами ингибиторов mTor являются темсиролимус, AP-23573 (который действует также как ингибитор VEGF), эверолимус (кроме того, является ингибитором VEGF), XL-765 (который является также ингибитором PI3-киназы) и BEZ-235 (который является также ингибитором PI3-киназы).

Примерами ингибиторов Akt являются перифосин, GSK-690693, RX-0201 и трицирибин.

Примерами ингибиторов cKit являются AB-1010, OSI-930 (который действует также в качестве ингибитора VEGFR), AC-220 (который является также ингибитором Flt3 и PDGFR), тандутиниб (который является также ингибитором Flt3 и PDGFR), акситиниб (который является также ингибитором VEGFR и PDGFR), XL-999 (который является также ингибитором Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), сунитиниб (который является также ингибитором Flt3, PDGFR, VEGFR) и XL-820 (который действует также как ингибитор VEGFR и PDGFR), имиаиниб (который является также ингибитором bcr-abl), нилотиниб (который является также ингибитором bcr-abl и PDGFR).

Примерами антагонистов hedgehog являются IPI-609 и CUR-61414.

Примерами ингибиторов CDK являются селициклиб, AT-7519, P-276, ZK-CDK (который является также ингибитором VEGFR2 и PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 и AG 024322.

Примерами ингибиторов протеосомы являются бортезомиб, карфилзомиб и NPI-0052 (который является также ингибитором NF-каппаВ).

Примером ингибитора NF-каппаВ-пути является NPI-0052.

Примером ингибитора пути убикитинизации является НВХ-41108.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой антиангиогенный агент.

Примерами антиангиогенных агентов являются ингибиторы FGFR, PDGFR и VEGFR или соответствующие лиганды (например, ингибиторы VEGF типа пэгаптаниба или антитело к VEGF бевацизумаб) и талидомиды, указанные агенты выбраны из группы, включающей (но не ограничиваясь только ими) бевацизумаб, мотесаниб, CDP-791, SU-14813, телатиниб, KRN-951, ZK-CDK (который является также ингибитором CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (иммуномодуляторные лекарственные средства), производное талидомида CC-4047, леналидомид, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, бриваниб, цедираниб, XL-999 (который является также ингибитором cKit и Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (который является также ингибитором Flt3), сунитиниб (который является также ингибитором cKit и Flt3), акситиниб (который является также ингибитором cKit), вемурафениб (который известен также как PLX4032, RG7204 или RO5185426, поступает в продажу под названием зелбораф), ин

- 20 031182 гибитор фермента B-Raf. кризотиниб. известный как ALK (киназа анапластической лимфомы) и ингибитор ROS1 (онкоген 1 c-ros. рецепторная тирозинкиназа). лестауртиниб (который является также ингибитором Flt3 и PKC). ваталаниб. тандутиниб (который является также ингибитором Flt3 и cKit). пазопаниб. GW 786034. PF-337210. IMC-1121B. AVE-0005. AG-13736. E-7080. CHIR 258. сорафениба тозилат (который является также ингибитором Raf). RAF-265 (который является также ингибитором Raf). вантетаниб. CP-547632. OSI-930. AEE-788 (который является также ингибитором EGFR и Her2). BAY-57-9352 (который является также ингибитором Raf). BAY-73-4506 (который является также ингибитором Raf). XL 880 (который является также ингибитором cMet). XL-647 (который является также ингибитором EGFR и EphB4). XL 820 (который является также ингибитором cKit) и нилотиниб (который является также ингибитором cKit и brc-abl).

Дополнительное терапевтическое средство можно выбирать также из ингибиторов EGFR. оно может представлять собой низкомолекулярный ингибитор EGFR или антитело к EGFR. Примерами антител к EGFR являются (но не ограничиваясь только ими) цетуксимаб. панитумумаб. матузумаб; примером низкомолекулярного ингибитора EGFR является гефитиниб. Другим примером модулятора EGFR является конъюгат EGF с токсином.

Из ингибиторов EGFR и Her2. которые можно применять в сочетании с моноспецифической связывающей молекулой. предлагаемой в изобретении. следует упомянуть лапатиниб. гефитиниб. эрлотиниб. цетуксимаб. трастузумаб. нимотузумаб. залутумумаб. вандетаниб (который является также ингибитором VEGFR). пертузумаб. XL-647. HKI-272. BMS-599626 ARRY-334543. AV 412. mAB-806. BMS-690514. JNJ-26483327. AEE-788 (который является также ингибитором VEGFR). ARRY-333786. IMC-11F8. Zemab.

Другими агентами. которые целесообразно применять для лечения в сочетании с моноспецифической связывающей молекулой. предлагаемой в изобретении. являются тоситумумаб и ибритумомаба тиуксетан (два меченных с помощью радиоактивных изотопов антитела к CD20). алемтузумаб (антитело к CD52). деносумаб (ингибитор лиганда фактора дифференцировки остеокластов). галиксимаб (антагонист CD80). офатумумаб (ингибитор CD20). занолимумаб (антагонист CD4). SGN40 (модулятор лиганда рецептора CD40). ритуксимаб (ингибитор CD20) или мапатумумаб (агонист рецептора TRAIL-1). или OMP-21M18 (ингибиторы D114).

Другими химиотерапевтическими лекарственными средствами. которые можно применять в сочетании с моноспецифическими связывающими молекулами. предлагаемыми в настоящем изобретении. являются (но не ограничиваясь только ими) гормоны. аналоги гормонов и антигормональные средства (например. тамоксифен. торемифен. ралоксифен. фулвестрант. мегестрола ацетат. флутамид. нилутамид. бикалутамид. ципротерона ацетат. финастерид. бусерелина ацетат. флудрокортизон. флуоксиместерон. медроксипрогестерон. остреотид. арзоксифен. пасиреотид. вапреотид). ингибиторы ароматазы (например. анастрозол. летрозол. лиарозол. эксеместан. атаместан. форместан). агонисты и антагонисты LHRH (например. госерелина ацетат. леупролид. абареликс. цетрореликс. деслорелин. гистрелин. трипторелин). антиметаболиты (например. антифолаты типа метотрексата. пеметрекседа. аналоги пиримидина типа 5фторурацила. капецитабина. децитабина. неларабина и гемцитабина. аналоги пурина и аденозина. такие как меркаптопурина тиогуанин. кладрибин и пентостатин. цитарабин. флударабин); противоопухолевые антибиотики (например. антрациклины. такие как доксорубицин. даунорубицин. эпирубицин и идарубицин. митомицин-C. блеомицин. дактиномицин. пликамицин. митоксантрон. пиксантрон. стрептозоцин); производные платины (например. цисплатин. оксалиплатин. карбоплатин. лобаплатин. сатраплатин); алкилирующие средства (например. эстрамустин. меклорэтамин. мелфалан. хлорамбуцил. бусульфан. дакарбазин. циклофосфамид. ифосфамид. гидроксимочевина. темозоломид. нитрозомочевины. такие как кармустин и ломустин. тиотепа); антимитотические средства (например. алкалоиды барвинка типа винбластина. виндесина. винорелбина. винфлунина и винкристина; и таксаны. такие как паклитаксел. доцетаксел и их препаративные формы. ларотаксел; симотаксел и эпотилоны типа иксабепилона. патупилона. ZK-EPO); ингибиторы топоизомеразы (например. эпиподофиллотоксины. такие как этопосид и этопофос. тенипосид. амсакрин. топотекан. иринотекан) и химиотерапевтические агенты смешанного типа. такие как амифостин. анагрелид. интерферон альфа. прокарбазин. митотан и порфимер. бексаротен. целекоксиб.

Наиболее предпочтительными входящими в комбинацию партнерами моноспецифических связывающих молекул. предлагаемых в настоящем изобретении. являются антагонисты VEGF. такие как бевацизумаб (Avastin®). нитеданиб. сорафениб и сунитиниб.

Другим вариантом осуществления изобретения является способ диагностирования заболевания. заключающийся в том. что:

а) приводят в контакт образец со связывающей молекулой. предлагаемой в изобретении. и

б) определяют связывание указанной связывающей молекулы с образцом и

в) сравнивают связывание. обнаруженное на стадии (б). со стандартом. при этом различие в связывании с указанным образцом является диагностическим в отношении заболевания или нарушения. ассоциированного с опосредуемыми VEGF- и/или Ang2 воздействиями на ангиогенез.

Для такого и других вариантов применения может оказаться целесообразным дополнительно моди- 21 031182 фицировать моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, например, путем интродукции функциональной группы, которая представляет собой один компонент специфической связывающейся пары, такой как связывающаяся пара биотин-(степт)авидин. Указанную функциональную группу можно применять для соединения связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, с другим белком, полипептидом или химическим соединением, который/которое связан/связано с другой половиной связывающейся пары, т. е. посредством формирования связывающейся пары. Например, моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно конъюгировать с биотином и связывать с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, который конъюгирован с авидином или стрептавидином. Например, указанную конъюгированную моноспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно применять в качестве репортера, например, в диагностической системе, в которой выявляемый агент, генерирующий сигнал, конъюгирован с авидином или стрептавидином.

Эффективность моноспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, или содержащих ее полипептидов или композиций можно оценивать с помощью приемлемого анализа in vitro, клеточного анализа, анализа in vivo и/или на хорошо известных животных моделях, или с помощью любой их комбинации в зависимости от специфического представляющего интерес заболевания или нарушения. Приемлемые анализы и животные модели очевидны специалисту в данной области, и они представляют собой, например, анализы, представленные в настоящем описании и применяемые ниже в примерах, например, анализ пролиферации.

Моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, подвергали экстенсивному процессу оптимизации последовательностей, который включал созревание аффинности, гуманизацию и удаление потенциальных сайтов пост-трансляционных модификаций, для гарантии низкого иммуногенного потенциала для человека и повышенной биофизической стабильности. При создании изобретения неожиданно было установлено, что моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, обладают свойствами, превышающими свойства известных из существующего уровня техники связывающих молекул. Из указанных свойств следует отметить повышенную избирательность в отношении нейтрализации Ang2 по сравнению с нейтрализацией Ang1, о чем свидетельствуют, например, данные, проиллюстрированные на фиг. 9-10, 13-14, 16-19; полное ингибирование взаимодействия Ang2-Tie2 с высокой активностью, о чем свидетельствуют, например, данные, полученные с помощью ELISA, проиллюстрированные на фиг. 6, 9, 13, 16, 18 и 20 и в табл. 12-3, 16-17, 20-22, а также величины IC₅₀ (нМ) для V_HH, полученные с помощью AlphaScreen-анализа, которые проиллюстрированы, например, в табл. 7 (пример 7); и данные о величине KD (нМ), характеризующие аффинность очищенных VHH, полученные с использованием рекомбинантного человеческого Ang2, cynoAng2, мышиного Ang2, которые представлены в табл. 8, 14, 18 и 23.

Эти результаты свидетельствуют о том, что моноспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, являются перспективными кандидатами, которые могут обладать терапевтической эффективностью в отношении заболеваний и нарушений, ассоциированных с опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез, такими как рак, злокачественные заболевания, глазные болезни и/или хронические болезни почек.

Краткое описание чертежей

Примечание: на чертежах 1-4, 6-7, 9-10, 12-14 и 16-20 на осях отложено:

на оси X - величины ОП₄₅₀ (нм), на оси Y - логарифм концентрации конкурента (М).

На чертежах показано:

на фиг. 1 (фиг. 1-1А-1-2В) - данные, демонстрирующие, что очищенные V_HH блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (ELISA);

на фиг. 2 (фиг. 2-1А-2-2В) - данные, демонстрирующие, что очищенные V_HH блокируют взаимодействие mAng2-mTie2 (ELISA);

на фиг. 3 (фиг. 3А-3Б)- данные, демонстрирующие, что очищенные V_HH блокируют взаимодействие cAng2-cTie2 (ELISA);

на фиг. 4 (фиг. 4А-4И) - данные, демонстрирующие, что очищенные V_HH блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 5 - сравнительный анализ последовательностей вариантов VHH 28D10 с созревшей аффинностью. Аминокислотную последовательность выравнивали относительно консенсусной последовательности человеческой зародышевой линии V_H3/JH. Нумерацию остатков осуществляли согласно Кэботу, CDR, определенные согласно AbM, выделены жирным шрифтом. Остатки, которые были замещены, подчеркнуты;

на фиг. 6 (фиг. 6А-6В) - данные, демонстрирующие, что очищенные варианты VHH 28D10 с созревшей аффинностью блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (ELISA);

на фиг. 7 (фиг. 7А-7В) - данные, демонстрирующие, что очищенные варианты V_HH 28D10 с созревшей аффинностью блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 8 (фиг. 8А-8Б) - сравнительный анализ последовательностей V_HH 1D01 и консенсусной последовательности hV_H3-JH (А) и последовательности оптимизированных вариантов V_HH 1D01 (Б). Ами

- 22 031182 нокислотную последовательность выравнивали относительно консенсусной последовательности человеческой зародышевой линии V_H3/JH. Нумерацию остатков осуществляли согласно Кэботу, CDR, определенные согласно системе определения AbM, выделены жирным шрифтом. Остатки, подлежащие мутации на их человеческие копии, подчеркнуты. Потенциальные сайты посттрансляционной модификации, подлежащие блокированию, выделены прямоугольником;

на фиг. 9 (фиг. 9-1А-9-3Б) - данные, демонстрирующие, что варианты V_HH 1D01 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (10-1), mAng2-mTie2 (10-2) и cAng2cTie2 (11-3) (ELISA);

на фиг. 10 - данные, демонстрирующие, что варианты V_HH 1D01 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 11 (фиг. 11А-11В) - сравнительный анализ последовательности V_HH 37F02 и консенсусной последовательности hV_H3-JH (А), для вариантов V_HH 37F02 с оптимизированной последовательностью, полученных с помощью цикла 1 (Б) и цикла 2 (В). Аминокислотную последовательность выравнивали относительно консенсусной последовательности человеческой зародышевой линии V_H3/JH. Нумерацию остатков осуществляли согласно Кэботу, CDR, определенные согласно системе определения AbM, выделены жирным шрифтом. Остатки, подлежащие мутации на их человеческие копии, подчеркнуты. Потенциальные сайты пост-трансляционной модификации, подлежащие блокированию, выделены прямоугольником;

на фиг. 12 (фиг. 12-1-12-3) - данные, демонстрирующие, что очищенные с помощью цикла 1 варианты V_HH 37F02 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (121), mAng2-mTie2 (12-2) и cAng2-cTie2 (12-3) (ELISA);

на фиг. 13 (фиг. 13-1-13-3) - данные, демонстрирующие, что очищенные с помощью цикла 2 варианты V_HH 37F02 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (131), mAng2-mTie2 (13-2) и cAng2-cTie2 (13-3) (ELISA);

на фиг. 14 - данные, демонстрирующие, что очищенные с помощью цикла 2 варианты V_HH 37F02 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 15 (фиг. 15А-15Г) - сравнительный анализ последовательности V_HH 28D10 и консенсусной последовательности hV_H3-JH (А), для вариантов V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью, полученных с помощью цикла 1 (Б), вариантов, полученных с помощью цикла 2 (В), и цикла 3 (Г). Аминокислотную последовательность выравнивали относительно консенсусной последовательности человеческой зародышевой линии V_H3/JH. Нумерацию остатков осуществляли согласно Кэботу, CDR, определенные согласно системе определения AbM, выделены жирным шрифтом. Остатки, подлежащие мутации на их человеческие копии, подчеркнуты. Потенциальные сайты посттрансляционной модификации, подлежащие блокированию, выделены прямоугольником;

фиг. 16 (фиг. 16-1А-16-3В) - данные, демонстрирующие, что очищенные с помощью цикла 1 варианты V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (16-1), mAng2-mTie2 (16-2) и cAng2-cTie2 (16-3) (ELISA);

фиг. 17 (фиг. 17А-17Б) - данные, демонстрирующие, что очищенные с помощью цикла 1 варианты V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 18 (фиг. 18-1А-18-3) - данные, демонстрирующие, что очищенные C5₀X-S5зX-варианты V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (18-1), mAng2-mTie2 (18-2) и cAng2-cTie2 (18-3) (ELISA);

на фиг. 19 - данные, демонстрирующие, что очищенные C5₀X-S5зX-варианты V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 20 (фиг. 20-1А-20-3В) - данные, демонстрирующие, что очищенные с помощью цикла 2 варианты V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (20-1), mAng2-mTie2 (20-2) и cAng2-cTie2 (20-3) (ELISA).

Примеры

Материалы и методы

а) Создание стабильных клеточных линий HEK293H, сверхэкспрессирующих человеческий или мышиный рецептор Tie2 кДНК, которые кодируют человеческий Tie2 (NM000459.3; SEQ ID NO: 182;), мышиный Tie2 (NM 013690.2; SEQ ID NO: 183) и cyno Tie2 (SEQ ID NO: 184); клонировали в экспрессионном векторе pcDNA3.1-neo (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США). Для создания клеток почки человеческого эмбриона (HEK), сверхэкспрессирующих человеческий Tie2 или мышиный Tie2, родительские HEK293H-клетки подвергали опосредуемой липидом Fugene (фирма Roche) трансфекции векторами pcDNA3.1-neo-hTie2 или pcDNA3.1-neo-mTie2 соответственно. Во всех вариантах отбор трансфектантов осуществляли через 2 дня после трансфекции, добавляя 1 мг/мл генетицина (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США). Отбирали конечные клоны человеческого, мышиного и cyno Tie2 с высоким уровнем экспрессии путем сортинга клонов единичных клеток, связывающихся с меченным РЕ (фикоэритрин) антителом к человеческому Tie2 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США), меченным PE антителом к мышиному Tie2 (фирма eBioscience, Сан-Диего, шт. Калифорния, США) и, осуществляя 2-стадийную обработку козьим антителом к человеческому Tie2 (фирма R&D Sys

- 23 031182 tems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США), а затем меченным PE ослиным антикозьим антителом (фирма Jackson ImmunoResearch, Вест-Гров, шт. Пенсильвания, США) соответственно, используя клеточный сортер FACSAria (фирма BD Biosciences, Сан-Хосе, шт. Калифорния, США).

б) Создание клеточных линий HEK293T, сверхэкспрессирующих Ang2 мышей или обезьян циномолгус, и получение кондиционированной среды, содержащей рекомбинантный Ang2 мышей и обезьян циномолгус кДНК, которые кодируют меченный на N-конце с помощью FLAG мышиный Ang2 (NM 007426.3; SEQ ID SEQ ID NO: 185) и Ang2 обезьян циномолгус (AB 172643.1; SEQ ID NO: 186), клонировали в экспрессионном векторе pSecTag2B (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США). Для создания клеток почки человеческого эмбриона (HEK), сверхэкспрессирующих мышиный Ang2 или Ang2 обезьян циномолгус, осуществляли опосредуемую липидом (Fugene; фирма Roche) трансфекцию родительской клеточной линии HEK293T векторами pSecTag2B-mAng2 или pSecTag2B-cAng2 соответственно. Для получения использовали 1,5-литровые контейнеры CF10 Bag и собирали 1,5 л кондиционированной среды (СМ) через 5 дней после трансфекции.

в) Получение химеры рекомбинантный Tie2 обезьян циномолгус/Fc в клетках HEK293-F кДНК, кодирующую внеклеточный домен Tie-2, субклонировали в экспрессионной плазмиде pSecTag2b, используя соответствующие сайты рестрикции для создания содержащего Fc слитого белка. Трансфекцию клеток HEK293-F (фирма Invitrogen) осуществляли согласно инструкции производителя, используя Megaprep (фирма Qiagen) препараты плазмид, среду Optimem (фирма Invitrogen), 293-фектин (фирма Invitrogen) при начальной плотности клеток 1х10⁶ жизнеспособных клеток/мл с 1 мкг плазмидной ДНК/10⁶ клеток. Трансфектированные клетки культивировали во вращающихся колбах в течение 7 дней при 37°С. Кондиционированную среду (СМ) собирали путем центрифугирования при 4000g в течение 10 мин и фильтровали через стерильный фильтр (мембрана с размером пор 0,45 мкм).

Слитые с Fc белки очищали, используя аффинную хроматографию, путем внесения СМ со скоростью 5 мл/мин на 5-миллилитровую колонку с белком A MabSelect SuRe, уравновешенную с помощью D-ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко). После стадии отмывки с помощью D-ЗФР связанный Fc-белок элюировали с помощью 10 мМ натрий-цитратного буфера, рН 3,0 и затем нейтрализовали до достижения значения рН 7,0, добавляя 1М Трис/HCl, рН 8,0. Очищенный белок концентрировали и осуществляли замену буфера на D-ЗФР с помощью центрифужного концентратора типа Millipore Amicon Ultra (номинальная отсекаемая молекулярная масса 10 кДа). Присутствие белка подтверждали с помощью стандартных аналитических методов (электрофорез с использованием набора Experion Pro 260 фирмы BioRad; масс-спектрометрия). Белок дополнительно анализировали с использованием гель-фильтрации и определяли содержание эндотоксинов (набор Endosafe PTS, фирма Charles River).

г) Получение комплекса рекомбинантный человеческий, обезьяний (циномолгус), мышиный и крысиный Ang2-FLD в клетках HEK293-F

Молекулярное клонирование и культивирование клеток осуществляли согласно методу, описанному для слитого белка Tie2-Fc. Для очистки меченных с помощью His белков СМ вносили со скоростью 5 мл/мин на 2-миллилитровую колонку Fast Flow, заполненную образующей хелаты с Nr'-сефарозой (HisTrap, фирма GE Healthcare Life Sciences), уравновешенную с помощью D-ЗФР. После внесения в присутствии 4% буфера для элюции (D-ЗФР + 0,5% имидазола) для предупреждения неспецифического связывания колонку отмывали D-ЗФР. Белки Ang2-FLD элюировали из колонки с помощью D-ЗФР, содержащего 0,5% имидазола. Затем осуществляли стадию ультрафильтрации для концентрирования и замены буфера (номинальная отсекаемая молекулярная масса 10 кДа). Аликвоту белка сохраняли для аналитической характеризации согласно методу, описанному для Tie2-Fc.

Пример 1.

Иммунизация рекомбинантным человеческим Ang2 индуцирует гуморальный иммунный ответ у лам

1.1. Иммунизации

После одобрения Комитетом по этике факультета ветеринарной медицины (Университет Гента, Бельгия), 4 лам (обозначены №№ 406, 408, 454, 455) иммунизировали, осуществляя 4 внутримышечные инъекции (день 0: 50 мкг, день 14: 20 мкг, день 28: 17,5 мкг и день 42: 17,5 мкг на дозу) рекомбинантным человеческим Ang2 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США). Антиген приготавливали в полном адъюванте Фрейнда для первичной вакцинации в день 0 (фирма Difco, Детройт, шт. Мичиган, США) и в неполном адъюванте Фрейнда для бустер-инъекций (фирма Difco, Детройт, шт. Мичиган, США).

1.2. Оценка индуцированных иммунных ответов у лам

Для оценки с помощью ELISA индукции иммунных ответов у животных против человеческого Ang2 получали образцы сыворотки в день 0 (неиммунная сыворотка), в день 35 и день 46 (время сбора лимфоцитов периферической крови [PBL]). В целом, метод состоял в следующем: осуществляли иммобилизацию рекомбинантного человеческого Ang2 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США), 1 мкг/мл, в течение ночи при 4°С на 96-луночном планшете MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали с помощью раствора казеина (ЗФР+1%). После добавления серийных

- 24 031182 разведений сыворотки специфически связанные иммуноглобулины выявляли, используя конъюгированное с пероксидазой из хрена (HRP) козье антитело к иммуноглобулину лам (фирма Bethyl Laboratories Inc., Монтгомери, шт. Техас, США) и осуществляя последующую ферментативную реакцию в присутствии субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (фирма Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США), при этом обнаружена индукция выраженного антитело-зависимого иммунного ответа против человеческого Ang2. Гуморальный иммунный ответ заключался в образовании B-клеточных популяций, экспрессирующих как канонические, так и состоящие только из тяжелой цепи антитела, поскольку связанные иммуноглобулины можно было обнаружить с помощью антител, специфически распознающих канонические антитела лам в виде IgG1, или состоящие только из тяжелой цепи антител лам в виде IgG2 или IgG3. У всех лам, которым инъецировали человеческий Ang2, гуморальный иммунный ответ включал образование B-клеток, экспрессирующих канонические и состоящие только из тяжелой цепи антитела, которые обладали специфичностью в отношении человеческого Ang2. Ответы на Ang2 в виде титров в сыворотке для каждой ламы представлены в табл. 1.

Таблица 1. Антитело-обусловленный специфический сывороточный ответ против рекомбинантного человеческого Ang2

		IgG-ответ
Лама	Иммуноген	IgGl	IgG2	IgG3
406	рекомбинантный человеческий Ang2	+++	++	++
408	рекомбинантный человеческий Ang2	+++	++	++
454	рекомбинантный человеческий Ang2	+++	++	++
455	рекомбинантный человеческий Ang2	+++	++	+++

Примечание: (*) низкий (или +/-): 1000 > HSD_S/n>₂ < 1500, умеренный (или +): 1500 > HSD_s/n>₂ < 13500, хороший (или ++): 13500 > HSD_s/n>₂ < 365000, очень хороший (или +++): HSD_s/n>₂ > 365000. (*) HSD: наиболее высокое разведение сыворотки; S/N > 2: отношение сигнала-к-шуму > 2

Пример 2. Клонирование спектров фрагментов антител, содержащих только тяжелую цепь, и получение фага

После последней инъекции иммуногена получали образцы иммунных тканей иммунизированных лам в качестве источника B-клеток, которые продуцировали антитела только с тяжелой цепью. Как правило, собирали по два 150-миллилитровых образца крови через 4 и 10 дней после последней инъекции антигена и у каждого животного получали биопсию одного лимфатического узла через 4 дня после последней инъекции антигена. Из образцов крови получали мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), используя фиколл-пак согласно инструкциям производителя (фирма Amersham Biosciences, Пискатавей, шт. Нью-Джерси, США). Из PBMC и биопсии лимфатических узлов (не использовали образцы животного № 406) экстрагировали общую РНК, которую применяли в качестве исходного материла для ОТ-ПЦР для амплификации кодирующих V_HH ДНК-сегментов согласно методу, описанному в примере 3 (с. 46) WO 05/044858. Для каждой иммунизированной ламы конструировали библиотеку путем объединения общей РНК, выделенной из всех собранных образцов иммунных тканей каждого животного. В целом, метод состоял следующем: амплифицированный с помощью ПЦР спектр VHH клонировали с использованием специфических сайтов рестрикции в векторе, созданном для облегчения фагового дисплея библиотеки V_HH. Вектор выводили из pUC 119, и он содержал промотор LacZ, последовательность, кодирующую белок gIII фага М13, ген, обусловливающий устойчивость к ампициллину или карбенициллину, сайт множественного клонирования и гибридную лидерную последовательность gIIIpelB. В рамке считывания с кодирующей последовательностью V_HH вектор кодировал C-концевую cmyc-метку и His6-метку. Фаги получали согласно стандартным протоколам и хранили после стерилизации фильтрацией при 4°С для последующего применения.

Пример 3. Селекция Ang2-специфических V_HH с помощью фагового дисплея

Спектры V_HH, полученные из всех лам и клонированные в виде фаговой библиотеки, применяли для различных стратегий селекции, используя различные условия селекции. Варьировали следующие компоненты: I) формат белка Ang2 (биотинилированный меченный на C-конце с помощью His полноразмерный рекомбинантный человеческий Ang2 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) и меченный на C-конце с помощью His полноразмерный мышиный Ang2 (полученный на фирме GeneArt, в настоящее время Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США), II) метод презентации Ang2: планшеты непосредственно сенсибилизировали мышиным Ang2 или инкубировали в растворе с биотинилированным человеческим Ang2 с последующей иммобилизацией на сенсибилизированных нейтравидином планшетах, и III) концентрацию антигена. Все селекции осуществляли в 96-луночных планшетах Maxisorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия).

Включающие несколько циклов селекции осуществляли следующим образом: препараты Ang2 для селекции в форматах в твердой и жидкой фазах презентовали согласно описанному выше методу в раз

- 25 031182 личных концентрациях (биотинилированный человеческий Ang2: 50, 5, 0,5, 0,05 и 0,005нМ; мышиный Ang2: 10, 1, 0,1 и 0,01 мкг/мл). После инкубации в течение 2 ч с фаговыми библиотеками с последующей интенсивной отмывкой связанный фаг элюировали с использованием трипсина (1 мг/мл) в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Активность трипсина немедленно нейтрализовали, применяя 0,8мМ протеазный ингибитор ABSF. В качестве контроля параллельно осуществляли селекции без антигена. Сборы фага, обогащенные по сравнению с фоновым уровнем, применяли для заражения Е. coli. Зараженные клетки Е. coli применяли либо для получения фага для следующего цикла селекции (сохранение (спасение) фага), либо высевали на агаровые пластины (LB+amp+глюкоза (2%)) для анализа индивидуальных клонов V_HH. Для скрининга продукта селекции в отношении специфических связывающих и блокирующих агентов индивидуальные колонии изымали из агаровых пластин и выращивали в 1 мл 96луночных планшетов с глубокими лунками. Контролируемую LacZ экспрессию V_HH индуцировали, добавляя ИПТГ (0,1-1мМ конечная концентрация) в отсутствии глюкозы. Получали экстракты содержимого периплазматического пространства (периплазматические экстракты) (в объеме -80 мкл) согласно стандартным протоколам (описанным, например, в WO 2006/040153, процитированной в настоящем описании). В целом, метод состоял в следующем: культуры центрифугировали в течение 15 мин при 4500 об/мин. Дебрис замораживали в течение ночи или 1 ч при -20°С. Затем дебрис подвергали оттаиванию при комнатной температуре в течение 40 мин, ресуспендировали в 15 мл буфера для периплазматических экстрактов (50 мМ NaHPO₄, 300м NaCl) и встряхивали в течение 1 ч. Периплазматическую фракцию выделяли путем центрифугирования в течение 20 мин при 14000 об/мин.

Пример 4. Скрининг периплазматических экстрактов в отношении взаимодействия Ang2-Tie2 и Ang1-Tie2 с помощью ELISA и AlphaScreen в условиях конкуренции

Периплазматические экстракты подвергали скринингу в отношении взаимодействия человеческий Ang2-человеческий Tie с помощью AlphaScreen-анализа (гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминисценции) в условиях конкуренции для оценки их блокирующей способности. В целом, метод состоял в следующем: химеру человеческий Tie2/Fc (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) биотинилировали, используя сложный N-гидроксисульфосукцинимидный эфир биотина (фирма Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Меченный с помощью FLAG человеческий Ang2 (фирма Alexis Biochemicals, Сан-Диего, шт. Калифорния, США) захватывали с помощью акцепторных гранул (фирма Perkin Elmer, Уолтем, шт. Массачусетс, США), сенсибилизированных антителом к FLAG M2 (фирма Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США). Для оценки способности V_HH ингибировать связывание человеческого Ang2 с его рецептором, т.е. человеческим Tie2, разведения 1:25 периплазматических экстрактов, содержащих экспрессированные V_HH, инкубировали с 0,1 нМ меченным с помощью FLAG человеческим Ang2. К этой смеси добавляли акцепторные гранулы и 0,3 нМ химеры биотинилированный человеческий Tie2/Fc и инкубировали в течение еще 2 ч при комнатной температуре. И, наконец, добавляли конъюгированные со стрептавидином донорские гранулы (фирма Perkin Elmer, Уолтем, шт. Массачусетс, США) и смесь инкубировали в течение еще 2 ч при комнатной температуре. Буфер для анализа представлял собой ЗФР + 0,03% Твин-20 + 0,1% БСА. Флуоресценцию измеряли, считывая планшеты с использованием планшет-ридера типа Envision Multilabel (фирма Perkin Elmer, Уолтем, шт. Массачусетс, США), при длине волны возбуждения 680 нм и длине волны испускания 520 нм. Снижение сигнала флуоресценции свидетельствовало о том, что связывание человеческого Ang2 с человеческим Tie2 блокируется V_HH, экспрессированным в периплазматическом экстракте. V_HH, которые обладали способностью блокировать взаимодействие человеческого Ang2 с человеческим Tie2 по меньшей мере на 50%, подвергали скринингу с помощью подтверждающего анализа на основе ELISA в условиях конкуренции. Дополнительно оценивали также перекрестную реактивность в отношении связывания с мышиным Ang2 и избирательность относительно человеческого Ang1 с помощью ELISA в условиях конкуренции. В целом, метод состоял в следующем: химеру человеческий или мышиный Tie2/Fc (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) иммобилизовывали в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при 4°С в 96-луночном планшете MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали с помощью 1%-ного раствора казеина. Разведение 1:5 периплазматического экстракта, содержащего экспрессированные VHH, инкубировали согласно типу анализа со следующими видами Ang: 0,02нМ меченный с помощью FLAG человеческий Ang2, разведенный в соотношении 1:3000 кондиционированная среда HEK293, содержащая меченный с помощью FLAG мышиный Ang2 или 0,02нМ меченный с помощью FLAG человеческий Ang1 (среда Alexis Biochemicals, Сан-Диего, шт. Калифорния, США). Эту смесь добавляли в сенсибилизированные Tie2/Fc лунки и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Остаточное связывание Ang выявляли с помощью конъюгированного с HRP антитела к FLAG M2 (фирма Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США).

Во втором цикле скрининга периплазматические экстракты, содержащие экспрессированные VHH, полученные в результаты селекции, для которых характерно высокое разнообразие обладающих перекрестной реактивностью к мышиным Ang2 блокирующих V_HH, подвергали скринингу в разведении 1:300. Отбирали VHH, которые ингибировали связывание человеческого Ang2 с человеческим Tie2, мышиного Ang2 с мышиным Tie2 и которые не ингибировали связывание человеческого Ang1 с человеческим Tie2. Анализ последовательностей подтвердил наличие 86 уникальных V_HH, принадлежащих к 38

- 26 031182 различным B-клеточным линиям дифференцировки. Общее количество уникальных вариантов последовательностей для каждой B-клеточной линии дифференцировки, репрезентативные V_HH и применяемые условия селекции представлены в табл. 2. Обобщенные данные, полученные в результате скрининга, проведенного с использованием анализов на основе AlphaScreen и ELISA, представлены в табл. 3. Аминокислотные последовательности всех уникальных V_HH представлены в перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1-86) и в табл. 4.

Таблица 2. Параметры, применяемые для селекции, с целью идентификации экспрессирующих Ang2-специфические V_HH B-клеточных линий дифференцировки

В-клеточная линия, №	Репрезентативные VHH, ID	Кол-во уникальных вариантов	Библиотека	Формат селекции	Циклы селекции
1	2F04	3	408	biot-hAng2 biot-hAng2 > biot-hAng2 rmAng2 > rmAng2	1 или 2
2	1D01	2	406	biot-hAng2 biot-hAng2 > rmAng2	1 или 2
3	10Н02	7	408	biot-hAng2 > biot-hAng2 rmAng2 > rmAng2	1 или 2
4	ЗА07	3	454	biot-hAng2 biot-hAng2 > rmAng2	1 или 2
5	7G08	3	454	biot-hAng2 > biot-hAng2	1 или 2
6	2G01	1	408	biot-hAng2	1
7	8А11	1	455	biot-hAng2 > biot-hAng2	2
8	16А03	4	455	biot-hAng2 biot-hAng2 > rmAng2	1 или 2
9	14А09	2	408	biot-hAng2 biot-hAng2 > rmAng2	1 или 2
10	11В07	18	454	biot-hAng2 biot-hAng2 > biot-hAng2 biot-hAng2 > rmAng2 rmAng2 > rmAng2	1 или 2
И	1Е01	1	406	biot-hAng2	1
12	13А03	2	406	biot-hAng2 > rmAng2	2
13	15А06	1	454	biot-hAng2 > rmAng2	2

- 27 031182

14	11А03	2	454	rmAng2 > rmAng2	2
15	14Н02	3	408	biot-hAng2 > rmAng2 rmAng2 > rmAng2	2
16	14А08	1	408	biot-hAng2 > rmAng2	2
17	15Н04	1	454	biot-hAng2 > rmAng2	2
18	16G09	3	455	biot-hAng2 > rmAng2	2
19	13А02	1	406	biot-hAng2 > rmAng2	2
20	10С06	4	408	rmAng2 > rmAng2	2
21	12А08	1	455	rmAng2 > rmAng2	2
22	12В03	2	455	biot-hAng2 > rmAng2 rmAng2 > rmAng2	2
23	10А03	1	408	rmAng2 > rmAng2	2
24	16А02	2	455	biot-hAng2 > rmAng2 rmAng2 > rmAng2	2
25	10А09	3	408	biot-hAng2 > rmAng2 rmAng2 > rmAng2	2
26	22С07	1	408	rmAng2 > rmAng2	2
27	21G10	2	408	biot-hAng2 > rmAng2 rmAng2 > rmAng2	2
28	19А03	1	406	biot-hAng2 > rmAng2	2
29	23С10	1	454	biot-hAng2 > rmAng2	2
30	25В01	1	455	biot-hAng2 > rmAng2	2
31	25F01	1	455	biot-hAng2 > rmAng2	2
32	25D08	1	455	biot-hAng2 > rmAng2	2
33	24В05	1	454	rmAng2 > rmAng2	2
34	22G11	1	408	rmAng2 > rmAng2	2
35	25G04	1	455	biot-hAng2 > rmAng2	2

36	28D10	1	408	biot-hAng2 > rmAng2	2
37	32H10	1	408	rmAng2 > rmAng2	2
38	29B08	1	408	biot-hAng2 > rmAng2	2

- 28 031182

Таблица 3. Скрининг периплазматических экстрактов, содержащих экспрессированные анти-Ang2 V_HH

			AlphaScreen	ELISA
В-клеточная линия,№	Репрезентативный VHH, ID	Кол-во уникальных вариантов	hAng2 (% ингибир.)	hAng2 (% ингибир.)	mAng2 (% ингибир.)	hAngl (% ингибир.)
1	2F04	3	79-84	50-86	13-27	0-4
2	1D01	2	77-83	97-101	85-102	0
3	10Н02	7	54-94	65-101	42-98	0-3
4	ЗА07	3	53-80	0-75	1-27	0-4
5	7G08	3	96-96	101	101	0
6	2G01	1	55	39	2	0
7	8А11	1	57	67	13	0
8	16А03	4	54-96	0	0-4	0-2
9	14А09	2	0-69	6-13	0-2	0
10	11В07	18	46-92	26-107	9-93	0-2
И	1Е01	1	0	2	3	4
12	13А03	2	50-53	28-40	0	0-2
13	15А06	1	72	0	0	0
14	11А03	2	57-74	0-3	0	0
15	14Н02	3	54-63	54-56	36-48	0-7
16	14А08	1	52	5-5	4	0
17	15Н04	1	57	82	38	0
18	16G09	3	55-95	57-99	21-96	1-7
19	13А02	1	91	96	97	1
20	10С06	4	64-85	84-90	43-50	0-2
21	12А08	1	98	0	2	3
22	12В03	2	83-92	92-94	11-99	0-7
23	10А03	1	67	0	0	0
24	16А02	2	67-90	0	0-1	0-1
25	10А09	3	52-65	0-11	0-1	0-4
26	22С07	1	73	78	82	0
27	21G10	2	55-85	45-72	13-30	0
28	19А03	1	74	74	22	0
29	23С10	1	57	37	24	0
30	25В01	1	61	5	24	4
31	25F01	1	67	85	42	14
32	25D08	1	78	94	6	10
33	24В05	1	97	102	98	3
34	22G11	1	96	100	98	0
35	25G04	1	90	87	9	0
36	28D10	1	89	118	93	4
37	32Н10	1	55	112	58	17
38	29В08	1	60	112	63	0

^(з)если идентифицировано множество уникальных вариантов V_HH в B-клеточной линии дифференцировки, то представлен диапазон (min-max) процента ингибирования.

- 29 031182

Таблица 4. Аминокислотные последовательности уникальных анти-Ang2 У_НН, идентифицированных в процессе скрининга

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
001D01/1	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQA AGKERE GVS	CIRCSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCAA	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TQVT VSS
001E01/2	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC VHSGTISS	THAMG	WYRQA PGKQRE HVA	TFTNRG STYYAG SVKG	RFTISRDNAKN TMYLQMNSLK PEDTAVYYCNT	GPY	WGQG TQVT VSS
002AO 1/3	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGRTFS	SSVMG	WFRQAP GKEREF VA	AISGSGS STDSAQ G	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCAA	GRAFLARDT FYYDI	WGQG TQVT VSS
002F04/4	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFAFD	DHLIG	WFRQAP GKEREA VS	CISRSAG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK ADDTAVYYCAA	GPAWGRPAS PLPYEYDY	WGQG TQVT VSS
002G01/5	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGRTIS	SYAMA	WFRQAP GKEREF VA	AISLSGD STYYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAEYYCAA	TDWDFEDIP EYYCSGYGC DESLFDS	WGQG TQVT VSS
003A07/6	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTLD	YDAIG	WFRQAP GKEREG VS	CITSSDG ITYYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCAT	GNRRIYYSD YALACFPYE YDY	WGQG TQVT VSS
003D01/7	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	VIWSSG DTAYAD SVKG	RFTISRDSAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCAG	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
003E10/8	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC TTSGFTLD	YYAVG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	GNLRIYYSD YALACFPYE YDY	WGQG TQVT VSS
003F02/9	EVOLVES GGGLVQV GDSLRLA CAASGRT FS	TYLMVG	WFROAP GKEREF AA	GIWSSG DTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK TEDTAVYYCA G	SYDGNYYIP GFYKD	WGOG TQVT VSS
003F07/10	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	AMWSS GVPAYA DSVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYED	WGQG TQVT VSS
004B06/11	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGHTFS	RYAMG	WFRRVP GKEREF VT	HITWNR GSTYYA DSVKG	RFTISRDKASN TLYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	QIKYGAVTH PEEYSY	WGQG TQVT VSS
006F05/12	KVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFAF D	DHLIG	WFRQAP GKEREA VS	CISRSAG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK ADDTAVYYCA A	GPAWGRPAS PLPYEYDY	WGQG TQVT VSS

- 30 031182

006Н05/13	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STAYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCT A	VPATRRTPQ MVAANVCW LAEYEYDY	WGQG TQVT vss
007В09/14	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	GIWSSG GTAYAD SVKG	RFTVSRDNAK NTVYLQMNSL KAEDTAVYYC AG	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
007С01/15	EVQLVEF GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	GIWSSG GTAYAD SVKE	RFTVSRDNDK NTVYLQMNSL QAEDTAVYYC AG	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
007С07/16	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGHTFS	TYLMVG	WFRQTP GKEREF AA	VIWSSG DTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYED	WGQG TQVT VSS
007G08/17	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQVP GKEREG VS	CISSSDG ITYYVD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TQVT VSS
008А11/18	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGRTFS	SYAMG	WFRQAP GKELEF VT	AVSWSG GSTYYA DSVKG	RFTISRDSAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	QSTIVEVTTL EAYDY	WGQG TQVT VSS
010А03/19	EVQLVES GGGSVQA GGSLRLSC AASERTFS	PYAMG	WFRQAP GKEREF VA	HITWSA GSTYYA DSVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	KRRYGIVDR DYND	WGQG TQVT VSS
010А09/20	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLA CIASGRDI F	SVSATG	WYRQA PGKQRE FVA	GISNIGA TKFADS VKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCN V	LLWSGNL	WGQG TQVT VSS
010А10/21	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC IASGRDIF	SITAIG	WYRQA PGKQRE FVA	GISNIGA TKYTDS VKG	RFTISGDNAEN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCN V	LLWSANY	WGQG TQVT VSS
010B02/22	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFAF D	DHLIG	WFRQAP GKEREA VS	CISRSAG STYYAD SVKG	RFTISGDNAKN TVYLQMNSLK ADDTAVYYCA A	GPAWGRPAS PLPYEYDY	WGQG TQVT VSS
010B08/23	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STAYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCT A	VPATRRTPQ MVVANVCW LAEYEYDY	WGQG TQVT VSS
010C06/24	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC VASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISGDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	GITPCSDYTQ TYEYDV	WGQG TQVT VSS
010C07/25	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISRSDG STSYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLVMNSLK PEDTAVYYCT A	VPATRRTPQ MVVANMCW LAEYEYDY	WGQG TQVT VSS

- 31 031182

010D04/26	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	GITPCSDYTQ TYEYDV	WGQG TQVT vss
010Е02/27	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STAYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCT A	VPATRRTPQ MVVANVCW LAEYEYDY	WGQG TQVT VSS
01 OF 10/28	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	YISSSDG STYYAD SVKG	RFTSSSDNAK NTVYLQMNSL KPEDTAVYYC AA	RPTLRVRLD NDRHHLLYE YEYDY	WGQG TQVT VSS
010G02/29	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYTIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STSYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCT A	VPATRRTPQ MVVLNMCW LAEYEYDY	WGQG TQVT VSS
010GU/30	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC VASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	GITPCSDYTQ TYEYDV	WGQG TQVT VSS
010H02/31	EVQLVES GGGSVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STNYAD SVKG	RFTISSDTAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCT A	VPATRRTPQ MVDANMCW LAEYEYDY	WGQG TQVT VSS
011A02/32	EVQLVES GGGLAQA GGSLRLSC AASGRRF G	GHAMG	WFRQAP GEEREF VA	TIYWTS GMTRYA GSVKG	RFTISRDNAEN TVFLQMNSLK PEDTAVYYCA V	IKDFQLRVD VTSASAYDY	WGQG TQVT VSS
011A03/33	GVQLVES GGGLAQA GGSLRLSC AASGRRF G	GHAMG	WFRQAP GKDREF VA	TIYWTT GMTRYA DSVKG	RFTISRDNAEN TVFLQMNSLK PEDTAVYYCA L	IRDFNIRLDV TSASAYGY	WGQG TQVT VSS
011B07/34	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	GIWSSG DTAYAD SVRG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK TEDTAVYYCA G	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
011CO1/35	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLVVG	WFRQAP GKEREF AA	AIWSSG DTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYED	WGQG TQVT VSS
012A02/36	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGRTFS	RNAMA	WFRQVP GKVREF VA	GIRWNV GRLDYA DSVKG	RFTISRDNAEN TVYLQMNDLK TEDTAVYYCA A	YAGLVFSGIP DY	WGQG TQVT VSS
012A08/37	EVQLVES GRGLVQA GGSLRLSC AASGSIFS	INAML	WYRQA PGKQRE LVA	AITSGGS TNYADS VKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	DSDYSSDYY Y	WGQG TQVT VSS
012B03/38	EVQLVES GGGLVQS GGSLRLSC AASGFAL D	YYTIG	WFRQAP GKEREG VS	CISGGD TSTYYA DSVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	DSAGVPAGP AAVYGSTCS RLEYDY	WGQG AQVT VSS

- 32 031182

О13АО2/39	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGGTFS	SYSMG	WFRQAP GKEREFI A	AINWNG DSTYYE DSVKG	RFTVSRDNAK NTVYLQMNSL KPEDTAVYYC AA	TGWGRAYE QAYEYDV	WGQG TQVT VSS
013А03/40	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTV D	DYAMS	WVRQA PGKGLE WVS	TISWND EYTYYA ESMKG	RFTISRDNAKN TLYLQMNSLK SEDTAVYYCA К	GGSRLYDYH Y	WGQG TQVT VSS
014А08/41	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC ASSGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	RPPFHSCSEY ENDY	WGQG TQVT VSS
014А09/42	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGRTIS	SSVLG	WFRQAP GKEREF VA	AISGSGS STDSAK D	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	GRAFLTRDP FYYDI	WGQG TQVT VSS
014А11/43	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLTC IASGRDIF	SVTAMG	WYRQA PGKQRE FVA	GLSNIG ATKYAD SVKG	RFTVSGDAAK NTVYLQMNSL KPEDTAVYYC NV	LLWSGNY	WGQG TQVT VSS
014D03/44	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	YISKSD GTTYYA DSVKG	RFTSSSDNAK NTVYLQINSLK PEDTAVYYCA A	RPTLRVRLD NDRHHLLYE YEYDY	WGQG TQVT VSS
014Н02/45	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	EYAIG	WFRQAP GKEREG VS	YISSSDG STYYAD SVKG	RVTSSSDNAK NTVYLQMNSL KPEDTAVYYC AA	RPTLRVRLD NDRHHLLYE YEYDY	WGQG TQVT VSS
015А06/46	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGRTFS	SYAMG	WFRQAP GKEREF VA	RISWNG GSTYHA DSVKG	RFTISRDNPKN TVYLQMDSLK PEDAAIYYCA A	SIALVGGVT PHSYDY	WGQG TQVT VSS
015С05/47	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	VIWSSG DTDYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
015D05/48	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	GIWSSG GTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
015Н04/49	EVQLVES GGGLVQA GGSLGLSC AASERTLP	SYVMG	WFRQAP GKELEF VA	GISWSS GRTYYT DSVKG	RFTISRDAAEN TWYLQMNSLK PEDTAVYYCA S	NSVSEPTLH TWQYEASY DY	WGQG TQVT VSS
016А01/50	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGHTFS	RYAMG	WFRRVP GEEREF VT	HITWNR GSTYYA DSVKG	RFTISRDKASN TLYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	QIKYGEITHP EEYSY	WGQG TQVT VSS
016А02/51	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGRTFS	RNAMG	WFRQVP GKAREF VA	AIRWNV GRLDYA DSVKG	RFAISRDNAEN TVYLQMNDLK TEDTAVYYCA A	YAGLVYSGI PDY	WGQG TQVT VSS

- 33 031182

016А03/52	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGHTFS	RYAMG	WFRRVP GKEREF VT	HITWNR GSTYYA DSVKG	RFTISRDKASN TLYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	QIKYGEITHP EEYSY	WGQG TQVT VSS
016А05/53	EVQLVES GGGLVQA GDSLRLSC AASGHTFS	RYAMG	WFRRVP GKEREF VT	HITWNR GSTYYA DSVKG	RFTISRDKASN TLYLQMNSLK SEDTAVYYCA A .	QTKYGEITR PEEYSY	WGQG TQVT VSS
016G09/54	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLV CSASGIDF S	INAMA	WYRQA PGKQRE WVA	FMINDS STDYTD SVKG	RFTISRDSTKN ILYLQMNNLN VEDTAVYYCN T	AYEQHTY	WGQG TQVT VSS
019А03/55	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIA	WFRQAP GKEREG IS	CITPSDR TYYADS VKG	RFIISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTADYYCA A	VPRLRGLGY WPYPEYEYD Y	WGQG TQVT VSS
019G07/56	KVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQA AGKERE GVS	CIRCSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TQVT VSS
019G08/57	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AVSGFTV D	DYAMS	WVRQA PGKGLE WVS	TISWND EYTYYA ESMKG	RFTISRDNAKN TLYLQMNSLK SEDTAVYYCA К	GGSRLYDYH Y	WGQG TQVT VSS
021G10/58	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STTYAD SVKG	RFTVSSDNAK NTVYLQMNSL KPEDTAVYYC AA	GLRGRYYRG TYSLVCAPY EYDF	WGQG TQVT VSS
022B09/59	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISADNAKN TVYLQMHSLK PEDTAVYYCA A	GLRGRYYSG SNYLVCAPY EYDY	WGQG TQVT VSS
022C07/60	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	DFIISSKRLC LDLFGS	RGQG TQVT VSS
022G03/61	EVQLVES GGGSVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PGDTAVYYCA A	GITPCSDYTQ TYEYDV	WGQG TQVT VSS
022G05/62	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRRAP GKEREG VS	CITSSDG STSYAD SVKG	RFTISSDSAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCS V	VPATRRNPQ MVVAKKCW LAEYEYDY	WGQG TQVT VSS
022G11/63	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISRSDG SPYYAD SVKG	RFTISSDNAKG TVYLQMSSLK PEDTAVYYCA A	SWSGAYYSG TYYCDRLYE YDA	WGQG TQVT VSS

- 34 031182

023А04/64	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASERTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	TMWSSG DTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYED	WGQG TQVT VSS
023С10/65	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	DSLGYGSSC RMAPYEYD Y	WGQG TQVT VSS
023D01/66	EVQLVEG GGLVQVG DSLRLSCA ASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	VIWSSG GTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
023Е02/67	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTSD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG ITYYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	GNRRIYYSD YALACFPYE YDY	WGQG TQVT VSS
023Е08/68	EVQLVES GRRLVQV GDSLRLA CAASGRT FS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	GIWSSG DTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK TEDTAVYYCA G	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
023F10/69	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASERTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	TMWVS GDTAYA DSVKG	RFTISRDNPKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
023F11/70	EVQLVES GGGLVQI GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	AIWSSG DTAVAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYED	WGQG TQVT VSS
024В05/71	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	YYAIG	WFRQAP GKEWE GVS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	DSIVCGSYY GMDY	WGKG TQVT VSS
024G05/72	EVQLVES GGASVQP GGSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	GIWSSG GTAYAD SVKE	RFTVSRDNDK NTVYLQMNSL QAEDTAVYYC AG	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS
025В01/73	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	AWGASRLPI GTMPPYEYD Y	WGQG TQVT VSS
025С06/74	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLV CSASGIDF S	INVMG	WYRQA PGKQRE WVA	FIGSGGS TDYIDY TDSVKG	RFTISRDSTKN ILYLRMNNLN VEDTAVYYCN T	AYEQHTY	WGQG TQVT VSS
025D08/75	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTFD	DYAIG	WFRQAP GKDLEG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VNGLGPFSV PVPVYDF	WGQG TQVT VSS

- 35 031182

025F01/76	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGLPFD	DYVIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAAYYCA A	GGPRINIAT MTCSHDEYE YDY	WGQG TQVT VSS
025F07/77	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CIESSDG STYYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	DSAGVPAGP AAVYGSSCS RLEYDY	WGQG TQVT VSS
025G04/78	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFG	SYDMS	WVRQA PGKGPE WVS	AINSRG GSTYYA DSVKG	RFTISRDNAKN TLYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	DPYSLSYYG YPLYDY	WGQG TQVT VSS
025G10/79	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLV CSASGIDF S	INVMG	WYRQA PGKQRE WVA	FIGSGSS TGYTDS VKG	RFSISRDSTKNI LYLQMNNLNV EDTAVYYCNT	AYEQHTY	WGQG TQVT VSS
028D10/80	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CIRDSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TQVT VSS
029В08/81	EVQLVES GGGVVQA GDSVRLS CAASGPTF R	SYTMA	WFRQTP GKERDI VA	AISSSLG RTYYAD SVKG	RFQILRDNAKE TVWLQMNSLK PEDTAVYICA A	SRSLNLAYT TKPYDY	WGQG TQVT VSS
032Н10/82	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFDFE	DYDMG	WFRQAP GKEREG VS	YISSSDG STYYTD SVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLIP EDTAVYYCAA	RPWTRRVY GSSWLARSL DEYEYDY	WGQG TQVT VSS
036Н10/83	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGHTFS	TYLMVG	WFRQTP GKEREF AA	VIWSSG DTAYAD SAKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYGGNYYIP GFYED	WGQG TQVT VSS
037А09/84	EVQLMES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQVP GKEREG VS	CISSSDG ITYYVD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PGDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TQVT VSS
037F02/85	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG ITYYVD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TQVT VSS
043Е10/86	EVQLVES GGGLVQV GDSLRLSC AASGRTFS	TYLMVG	WFRQAP GKEREF AA	VIWSSG DTAYAD SVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLK AEDTAVYYCA G	SYDGNYYIP GFYKD	WGQG TQVT VSS

Пример 5. Характеризация очищенных анти-Ang2 V_HH

Подгруппу обладающих ингибирующей активностью анти-Ang2 V_HH. отобранных с помощью скрининга. описанного в примере 4. дополнительно очищали и характеризовали. Отобранные V_HH экспрессировали в Е. coli TG1 в виде меченных с помощью c-myc. His6 белков. Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ ИПТГ и давали ей осуществляться в течение 4 ч при 37°С. После центрифугирования клеточных культур получали периплазматические экстракты путем замораживания-оттаивания дебриса. Эти экстракты применяли в качестве исходного продукта и V_HH очищали с помощью ИМАХ и гельфильтрации (ГФ) с получением продукта. чистота которого составляла > 95% по данным ДСН-ПААГ.

5.1. Оценка с помощью ELISA способности V_HH блокировать hAng2

Блокирующую активность V_HH в отношении взаимодействия человеческий Ang2-человеческий Tie2 оценивали с помощью ELISA. предназначенного для анализа блокирования. В целом. метод состоял в следующем: 2 мкг/мл химеры Tie2/Fc (фирма R&D Systems. Миннеаполис. шт. Миннесота. США) применяли для сенсибилизации 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc. Висбаден. Германия). Меченный с помощью FLAG человеческий Ang2 (фирма Alexis Biochemicals. Сан-Диего. шт. Калифорния. США) в фиксированной концентрации 0.02нМ добавляли к серийным разведениям очищенного V_HH (разведение в ЗФР+0.1% казеина+0.05% Твин-20) и инкубировали с применяемым для сенсибилизации человеческим рецептором Tie2 в течение 2 ч. Остаточное связывание человеческого Ang2 определяли. используя конъюгированное с пероксидазой из хрена (HRP) антитела к FLAG M2 (фирма Sigma. СентЛуис. шт. Миссури. США) (фиг. 1). В качестве референс-молекулы применяли Fab-фрагмент Ab536 (US 2009/0191212) (фиг. 1-1) или пептидный остаток пептибоди (пептид + антитело) AMG386 (SEQ ID NO: 25 в WO 2004/092215) (фиг. 1-2). В качестве отрицательного контроля применяли несоответствующий V_HH. Величины IC₅₀. характеризующие способность V_HH блокировать взаимодействие человеческий Ang2-человеческий Tie2. представлены в табл. 5-1 и табл. 5-2 соответственно.

- 36 031182

Таблица 5-1. Величины IC₅₀ (нМ), характеризующие способность очищенных V_HH блокировать взаимодействие hAng2/hTie2 (ELISA в условиях конкуренции; V_HH: n=2-3; Fab Ab536: n=6)

VHH ID	IC5O (нМ)
1D01	3,4
2F04	2,8
3A07	21,0
3F02	9,1
6H05	5,3
7G08	0,07
8A11	30,2
10C06	7,7
10H02	3,0
11B07	5,4
12B03	4,6
13A02	4,1
14H02	64,4
15H04	18,6
16G09	11,3
21G10	6,2
22C07	11,0
24B05	1,0
25F01	6,5
Fab Ab536	39,3

Таблица 5-2. Величины IC₅₀ (нМ), характеризующие способность очищенных V_HH блокировать взаимодействие hAng2/hTie2 (ELISA в условиях конкуренции: V_HH: n=1-3; пептид AMG386: n=3)

VHH ID	IC50 (нМ)
1D01	6,2
7G08	0,04
10H02	8,7
11B07	14,0
13A02	23,0
24B05	1,1
28D10	1,3
32H10	4,0
37A09	0,1
37F02	0,08
пептид AMG386	3,4

5.2. Оценка перекрестной реактивности в отношении мышиного Ang2 и Ang2 обезьян циномолгус с помощью ELISA, предназначенного для анализа блокирования

Для решения вопроса о том, может ли V_HH ингибировать связывание мышиного Ang2 с мышиным Tie2 и cyno Ang2 с cyno Tie2, проводили ELISA в условиях конкуренции. В целом, метод состоял в следующем: рекомбинантный мышиный Tie2-Fc или cyno Tie2-Fc в концентрации 2 мкг/мл применяли для сенсибилизации в течение ночи при 4°С 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Сенсибилизированные лунки блокировали с помощью 1%-ного раствора казеина. Меченный с помощью FLAG мышиный Ang2 (разведение 1:3000 кондиционированной средой, полученной после кратковременной трансфекции HEK) или меченный с помощью FLAG cyno Ang2 (разведение 1:800 кондиционированной среды, полученной после кратковременной трансфекции HEK) и серийные разведения очищенного V_HH (разведение в ЗФР+0,1% казеина+0,05% Твин-20) инкубировали с применяемым для сенсибилизации рецептором Tie2 в течение 2 ч при комнатной температуре до достижения равновесия связывания. Остаточное связывание FLAG-mAng2 или FLAG-cAng2 определяли, используя конъюгированное с HRP антитело к FLAG M2 (фирма Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США). В качестве референс-молекулы применяли Fab-фрагмент Ab536 (мыши: фиг. 2-1) или пептидный остаток пептибоди AMG386 (мыши: фиг. 2-2; cyno: фиг. 3). В качестве отрицательного контроля применяли несоответствующий V_HH. Величины IC₅₀, характеризующие способность V_HH блокировать взаимодействие мышиный Ang2-мышиный Tie2, представлены в табл. 6-1. Величины IC₅₀, характеризующие способность VHH блокировать связывание мышиного и cyno Ang2 с мышиным и cyno Tie2 соответственно представлены в табл. 6-2.

Таблица 6-1. Величины IC₅₀ (нМ), характеризующие способность очищенных V_HH блокировать взаимодействие mAng2 с mTie2 (ELISA в условиях конкуренции; V_HH: n=2-3; Fab Ab536: n=5)

	mAng2
VHH ID	IC50 (нМ)
1D01	6,3
2F04	57,4
3A07	99,3
3F02	32,7
6H05	7,7
7G08	0,09
8A11	442,1
10C06	45,2
10H02	5,2
11B07	21,0
12B03	6,7
13A02	6,1

- 37 031182

VHH ID	IC50 («Μ)
14Н02	143,2
15Н04	124,6
16G09	19,4
21G10	16,8
22С07	13,6
24B05	1,5
25F01	13,3
Fab Ab536	15,3

Таблица 6-2. Величины IC₅₀ (нМ), характеризующие способность очищенных V_HH блокировать взаимодействие mAng2 и cAng2 с mTie2 и cTie2 соответственно (ELISA в условиях конкуренции; V_HH: n=1-3; AMG386-пептид: n=3; n.d., не определяли)

	mAng2	cAng2
VHH ID	Ю50 (нМ)	IC50 (нМ)
1D01	10,0	16,4
7G08	0,07	0,14
10H02	21,4	23,7
11B07	39,7	24,8
13A02	26,6	33,1
24B05	1,1	2,1
28D10	6,1	2,0
32H10	13,0	n.d.
37A09	0,1	0,2
37F02	0,09	0,1
пептид AMG386	5,2	6,6

5.3. Оценка с помощью ELISA избирательности действия блокирующих V_HH в отношении человеческого Ang2 по сравнению с человеческим Ang1

Для решения вопроса о том, обладают ли блокирующие анти-Ang2 V_HH избирательным действием в отношении связывания человеческого Ang1 с человеческим Tie2, осуществляли ELISA в условиях конкуренции. В целом, метод состоял в следующем: рекомбинантный человеческий Tie2-Fc (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) в концентрации 2 мкг/мл применяли для сенсибилизации в течение ночи при 4°С 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Сенсибилизированные лунки блокировали с помощью 1%-ного раствора казеина. Меченный с помощью FLAG человеческий Ang1 в фиксированной концентрации (0,02 нМ) (фирма Alexis Biochemicals, Сан-Диего, шт. Калифорния, США) и серийные разведения очищенного V_HH (разведение в ЗФР+0,1% казеина+0,05% Твин-20) инкубировали с применяемым для сенсибилизации человеческим рецептором Tie2 в течение 2 ч при комнатной температуре до достижения равновесия связывания. Остаточное связывание FLAG- hAng1 определяли, используя конъюгированное с HRP МАт к FLAG M2 (фирма Sigma, СентЛуис, шт. Миссури, США). В качестве референс-молекулы применяли пептидный остаток пептибоди AMG386 (фиг. 4). В качестве отрицательного контроля применяли несоответствующий VHH. Величины IC₅₀, характеризующие способность V_HH блокировать взаимодействие человеческий Ang1 - человеческий Tie2, представлены в табл. 7.

Таблица 7. Величины IC50 (нМ), характеризующие способность очищенных VHH блокировать взаимодействие человеческого Ang1 с человеческим Tie2 (ELISA в условиях конкуренции; VHH: n=2-3; пептид AMG386: n=3)

VHH ID	IC50 (нМ)	Соотношение hAngI/hAng2
1D01	>67000	>10800
7G08	>84000	>2333333
10H02	2000	230
11B07	120000	8570
13A02	17000	739
24B05	120000	109090
28D10	>4000	> 3076
37A09	>10000	> 100000
37F02	>10000	> 100000
пептид AMG386	4000	1176

5.4. Определение аффинности взаимодействия: человеческий, мышиный, cyno Ang2 - VHH

Аффинность связывания VHH с человеческим, мышиным и cyno Ang2 определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) (устройство Biacore T100). В целом, метод состоял в следующем: V_HH и эталонные соединения иммобилизовывали на СМ5-чипе посредством аминного сочетания. Применяли многоцикличный кинетический подход: инъецировали человеческий, мышиный и cyno Ang2FLD в различных концентрациях (0,4; 1; 2,6 6,4; 16; 40; 100нМ). Для Ang2-FLD из различных видов давали пройти ассоциации в течение 2 мин и диссоциации в течение 20 мин при скорости потока 45 мкл/мин. Между инъекциями поверхности регенерировали, осуществляя впрыскивание в течение 10 с 25мМ NaOH с последующим периодом стабилизации в течение 60 с. Результаты ассоциации/диссоциации оценивали путем аппроксимации кривых связывания с использованием модели взаимодействия 1:1 (связывание по Лэнгмюру). Константу аффиности K_D рассчитывали на основе констант скорости ассоциации и диссоциации (ka) и (kd), результаты представлены в табл. 8.

- 38 031182

Таблица 8. Величины аффинности K_D (нМ) очищенных V_HH к человеческому, мышиному и cyno Ang2

VHH ID	Человеческий Ang2-FLD	мышиный Ang2-FLD	cyno Ang2-FLD
	ka (1/Mc)	kd (1/c)	kd (M)	ka (1/Mc)	kd (1/c)	kd (M)	ka (1/Mc)	kd (1/c)	kd (M)
1D01	7,7E+06	l,5E-02	2,0E-09	3,3E+06	l,5E-02	4,6E-09	9,9E+06	l,4E-02	l,4E-09
7G08	l,0E+06	l,0E-04	9,7E-11	8,lE+05	l,4E-04	l,8E-10	l,5E+06	1,1E-O4	7,2E-11
10Н02	5,7E+06	2,1E-O2	3,6E-09	2,5E+06	2,6E-02	1,1E-O8	6,9E+06	2,3E-02	3,4E-09
11В07	9,2E+06	6,2E-02	6,7E-09	4,8E+06	l,4E-01	2,9E-08	1.2E+07	7,3E-02	6,1E-O9
13А02	9,2E+06	9,lE-02	9,9E-09	l,9E+06	3,4E-02	l,8E-08	1,1E+O7	9,4E-02	8,7E-09
24В05	2,6E+06	2,5E-03	9,6E-10	l,7E+06	2,9E-03	l,7E-09	4ДЕ+06	2,4E-03	5,9E-10
28D10	4,9E+06	6,2E-03	l,3E-09	l,9E+06	Ι,ΙΕ-02	5,6E-09	l,8E+07	2,5E-02	l,4E-09
mAb 3.19.3	5,0E+07	5,5E-02	Ι,ΙΕ-09	1,1E+O7	6,1E-O2	5,5E-09	n.d.	n.d.	n.d.
Fab Ab536	3,1E+O6	3,7E-02	l,2E-08	1.6E+06	l,7E-02	1,1E-O8	4,1E+O6	4,5E-02	1,1E-O8

Пример 6. Созревание аффинности отобранных V_HH

Вариант V_HH 28D10 (00027, несущий замену C50S/S53N и Qi₀₈L - пример 7.3) подвергали процедуре созревания аффинности.

В первом цикле интродуцировали случайные аминокислотные замены как в каркасные (FW), так и в гипервариабельные участки (CDR) с применением ПЦР пониженной точности. Мутагенез осуществляли, применяя состоящий из двух циклов подход на основе ПЦР (набор для неспецифического мутагенеза Genemorph II, полученный от фирмы Stratagene, Ла-Джолла, шт. Калифорния, США), используя по 1 нг кДНК-матрицы V_HH 00027, с последующим осуществлением второй ПЦР пониженной точности с использованием 0,1 нг продукта, полученного в цикле 1. После стадии окончательной очистки ПЦРпродукты встраивали с использованием уникальных сайтов рестрикции в вектор, созданный для облегчения фагового дисплея VH [-библиотеки. Последующие циклы селекции в растворе осуществляли с использованием понижающихся концентраций биотинилированного рекомбинантного человеческого Ang2 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, MN, США) и элюции трипсином. Получали периплазматические экстракты (объем ~80 мкл) согласно стандартным методам и осуществляли скрининг в отношении связывания с рекомбинантным человеческим Ang2-FLD с использованием набора ProteOn (фирма BioRad, Геркулес, шт. Калифорния), предназначенного для анализа скорости диссоциации В целом, метод состоял в следующем: сенсорный чип GLC ProteOn сенсибилизировали рекомбинантным человеческим Ang2-FLD в лигандных каналах L3, L4, L5 и L6 (L1/L2 применяли в качестве референсканала). Периплазматический экстракт клонов с созревшей аффинностью разводили в соотношении 1/10 и инъецировали в каналы для анализируемого вещества A1-A6. Рассчитывали средние величины скорости диссоциации для референс-клона V_HH 00027, который получали и тестировали аналогично V_HH с созревшей аффинностью, и он служил в качестве эталона для определения улучшения скорости диссоциации. 25 наиболее эффективных вариантов с созревшей аффинностью представлены в табл. 9. V_HH секвенировали (табл. 10-А) для идентификации аминокислотных мутаций, благоприятных для улучшения скорости диссоциации (табл. 10-Б).

Таблица 9. Скорость реакции диссоциации и кратность ее увеличения для вариантов V_HH 00027 с

созревшей ас	эфинностью
VHH ID	kd (1/c)	Кратность увеличения
64G03	7,4E-05	15,7
64F03	Ι,ΙΕ-04	10,8
64D11	1,1E-O4	10,3
64G11	l,2E-04	9,6
55D06	l,2E-04	9,4
64F07	1.2E-04	9,4
64G02	l,2E-04	9,4
55A06	l,3E-04	9,2
64C03	l,3E-04	9,2
64G12	l,3E-04	8,9
65F03	l,4E-04	8,9
55F02	l,4E-04	8,7
64E12	l,3E-04	8,7
60C09	l,6E-04	8,5
64B02	l,4E-04	8,5
64A03	l,4E-04	8,3
64C07	1.4E-04	8,3
60A06	l,6E-04	8,3
64B01	l,4E-04	8,2
64G01	l,4E-04	8,2
56A07	l,5E-04	8,1
58D10	l,3E-04	8,1
65F01	l,6E-04	8,1
53A06	l,6E-04	8,0
55G03	l,5E-04	8,0

- 39 031182

Сначала конструировали 12 вариантов V_HH, содержащих мутации в положениях 27, 29, 100b и 100i (нумерация по Кэботу) (табл. 11; фиг. 5). Различные комбинации этих 4 мутаций трансплантировали в каркас с оптимизированной последовательностью V_HH 00042 (фиг. 17-Б), содержащий дополнительную замену D54G (пример 6.3). Аминокислотную последовательность выравнивали с консенсусной последовательностью человеческой зародышей линии V_H3/JH. Остатки нумеровали согласно Кэботу, CDR, определенные согласно AbM (программа моделирования антител Oxford Molecular's AbM), выделены серым цветом. Конструкции клонировали в экспрессионном векторе pAX100 в рамке считывания с C-концевой c-myc-меткой и (Л^)6-меткой. Варианты V_HH получали в Е. coli и очищали с помощью ИМАХ и ГФ. Последовательности представлены в табл. 11. Все эти V_HH анализировали в отношении взаимодействия hAng2/hTie2 (пример 5.1; результаты представлены на фиг. 6 и в табл. 12) и hAng1/hTie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.3; результаты представлены на фиг. 7 и в табл. 12). Кроме того, определяли температуру плавления (Т_пл) для каждого варианта при pH 7 с помощью анализа температурного сдвига (TSA), который основан на оценке изменения сигнала флуоресценции при включении реагента Sypro Orange (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США) (Ericsson и др., Anal. Biochem. 357, 2006, сс. 289-298) (табл. 12).

Таблица 10-А. Аминокислотная последовательность анти-Ang2 V_HH с созревшей аффинностью

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
64G03/ 87	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RSTISSDNDKN TVYLQMDSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT vss
64F03/ 88	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGITLD	DYAV G	WFRQAP GKEREG VS	TIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PKDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64D11/ 89	EVQLVES GGGQAQA GGSLRLSC AVSGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYT DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64G11/ 90	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGITLD	DYAI G	WFRQAP GKERVG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
55D06/ 91	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64F07/ 92	QVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDQN TVYLQMNSLK SEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64G02/ 93	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AISGFTLV	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFIISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
55А06/ 94	EVQLMES GGGLVQA GGSLRLSC AASGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVNLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64С03/ 95	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64G12/ 96	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIREND GSTYYA DSVQG	RFTISSDNDKN TVYLRMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
65F03/ 97	EVQMVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNGLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
55F02/ 98	EVQLVES GGGLVQS GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64Е12/ 99	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RSTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A ’	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
60С09/ 100	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKW	RFTISSDNDKN TVYLQMNSM KPEDTAVYYC AA	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG ILVTV SS

- 40 031182

64В02/ 101	EVQLVES GGGLVQA GGFLRLTC AVSGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNVKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64А03/ 102	EVQLLESG GGLVQAG GSLRLSCA ASGFTLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRIG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
64С07/ 103	EVHLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GVEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
60А06/ 104	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKDREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TVVT VSS
64В01/ 105	EVQLVES GGGLVQA GGTLRLSC AVSGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG ILVTV SS
64G01/ 106	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFIISSDNDKN TVYLQMNNLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
56А07/ 107	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RSTISSDNARN TVFLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
58D10/ 108	EELLVESG GGSVQAG GSLKLSCA ASGLTLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
65F01/ 109	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSRYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
53А06/ НО	EVQLVES GGSLVQA GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
55G03/ 111	EVQLVES GGSLVQA GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS

Таблица 10-Б. Единичные мутации или их комбинация, обеспечивающие улучшение скорости реакции диссоциации

Мутация(и)	Кратность увеличения скорости диссоциации
A24V	2
F27I	1,92.2
F27L ; LlOOil	9,4
L29I ; LlOOil	5,6 - 6,0
FlOObY ; LlOOil	5,1 -9,2
LlOOil	3,1 -7,0

- 41 031182

Таблица 11. Аминокислотные последовательности aHTu-Ang2 V_HH с созревшей аффинностью

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
00903/ 112	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00904/ 113	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00905/ 114	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTID	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00906/ 115	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTID	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00907/ 116	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00908/ 117	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00909/ 118	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGITID	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00910/ 119	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGITID	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00911/ 120	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00912/ 121	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGLTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00913/ 122	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGLTID	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00914/ 123	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGLTID	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS

Таблица 12. Обобщение данных о Т_пл, IC₅₀ (пМ), установленных для человеческого, мышиного и cyno Ang2 с помощью ELISA в условиях конкуренции, и соотношения величин IC₅₀ для hAng1/hAng2 вариантов V_HH 00027 с созревшей аффинностью

	TSA	IC50 в Ang2/Tie2-ELISA
VHH ID	Тпл при pH 7,0 (°C)	hAng2 (nM)	mAng2 (nM)	cAng2 (nM)	Соотношение IC50 hAngl/hAng2
00027	61,1	672	1975	728	> 14,878
00042	61,9	646	1910	753	> 15,476
00903	64,0	89	n.d.	n.d.	> 112,202
00904	64,4	62	n.d.	n.d.	> 162,181
00905	64,0	79	n.d.	n.d.	> 125,893
00906	64,4	45	n.d.	n.d.	> 223,872
00907	67,3	62	n.d.	n.d.	> 162,181
00908	67,3	45	85	79	> 192,014
00909	66,1	53	n.d.	n.d.	> 190,546
00910	66,1	42	n.d.	n.d.	> 239,883
00911	66,1	59	n.d.	n.d.	> 169,824
00912	66,1	62	n.d.	n.d.	> 162,181
00913	64,0	42	n.d.	n.d.	> 239,883
00914	64,4	37	n.d.	n.d.	> 269,153

На основе данных об эффективности, Т_пл и последовательности перспективный V_HH 00908 отобран для включения во второй цикл, объединяющий осуществление созревания аффинности и оптимизации последовательности (пример 7.3).

Пример 7. Оптимизация последовательностей отобранных V_HH 1D01, 28D10 и 37F02

7.1 V_HH 1D01

Выравнивали аминокислотную последовательность aнти-Ang2 V_HH 1D01 (см. фиг. 8-А) с консенсусной последовательностью человеческой зародышевой линии V_H3/JH. Остатки нумеровали согласно Кэботу, CDR, определенные согласно AbM (программа моделирования антител Oxford Molecular's AbM), выделены серым цветом. Остатки, подлежащие мутации путем замены на их человеческие копии, подчеркнуты. Потенциальные сайты пост-трансляционных модификаций, подлежащие блокированию, обозначены прямоугольником. Сравнительный анализ структуры последовательностей продемонстрировал,

- 42 031182 что клон 1D01 содержит 6 мутаций в каркасных участках относительно зародышевой референспоследовательности. Нечеловеческие остатки в положениях 14, 41, 71, 74, 83 и 108 отбирали для замены на их копии из человеческой зародышевой линии. Конструировали и получали набор из семи вариантов 1D01, несущих различные комбинации человеческих остатков в этих положениях (фиг. 8-Б) (пример 5). Параллельно в трех из семи указанных вариантов удаляли потенциальный сайт Asp-изомеризации в положении D54G55 путем интродукции замены D54G, а в одном из указанных семи вариантов удаляли потенциальный сайт формирования пиро-Glu в положении E₁ путем замены EiD (АК-последовательности представлены в табл. 15).

Указанные варианты в виде очищенных белков характеризовали в отношении ингибирования взаимодействия человеческого (фиг. 9-1), мышиного (фиг. 9-2) и cyno (фиг. 9-3) Ang2 с Tie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.1; пример 5.2), а также ингибирования взаимодействия hAng1/hTie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.3; фиг. 10). Кроме того, определяли температуру плавления (Т_пл) каждого варианта с помощью анализа температурного сдвига (пример 6). Обобщенные данные представлены в табл. 13. Кроме того, рассчитывали % идентичности FR с человеческой зародышевой линией согласно AbM (программа моделирования антител Oxford Molecular's AbM). Данные о аффинности V_HH 00921 к человеческому, cyno, мышиному и крысиному Ang2 представлены в табл. 14 (пример 5.4).

Таблица 13. Обобщение данных о Т_пл, IC₅₀ (нМ), установленных для человеческого, мышиного и cyno Ang2 с помощью ELISA в условиях конкуренции, и соотношения величин IC50 для hAng1/hAng2 вариантов V_HH 1D01 с оптимизированной последовательностью

	TSA	IC50 в Ang2-Tie2ELISA		% идентичности FR
VHH ID	ТПЛ (°C) при pH 7	hAng2 (нМ)	mAng2 (нМ)	cAng2 (нМ)	Соотношение IC50 для hAngl/hAng2	AbM
1D01	65,0	6,6	12,4	9,1	> 1,511	85,4
00039	61,5	11,9	28,1	6,4	n.d	91,0
00040	64,0	6,4	29,0	5,8	n.d	92,1
00049	66,1	6,9	20,3	4,5	n.d	89,9
00050	67,7	6,0	18,6	4,8	n.d	91,0
00051	64,8	16,1	37,9	15	n.d	89,9
00921	67,3	30,4	27,0	37	> 329	91,0
00925	66,5	22,1	28,4	33	>453	89,9

n.d., не определяли

Таблица 14. Величины аффинности K_D очищенного V_HH 00921 к рекомбинантному человеческому, cyno, мышиному и крысиному Ang2

	Человеческий Ang2-FLD	cyno Ang2-FLD
	ka (1/Mc)	kd (1/c)	Kd (M)	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)
00921	4,0E+06	2,7E-02	6,6E-09	1,1E+O6	2,5E-02	2,3E-09

	Мышиный Ang2-FLD	KpbiCHHbifiAng2-FLD
	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)
00921	3,3E+06	2,5E-02	7,5E-09	l,2E+06	4,9E-02	4,2E-08

Таблица 15. Аминокислотная последовательность вариантов анти-Ang2 V_HH 1D01 с оптимизированной последовательностью

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
00039/124	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQA AGKERE GVS	CIRCSD GSTYYA DSVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TLVT VSS
00040/125	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQAP GKEREG VS	CIRCSD GSTYYA DSVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TLVT VSS
00049/126	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQA AGKERE GVS	CIRCSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TLVT VSS

- 43 031182

00050/ 127	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQAP GKEREG VS	CIRCSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TLVT VSS
00051/128	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQA AGKERE GVS	CIRCSG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TLVT VSS
00921/129	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQAP GKEREG VS	CIRCSG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TLVT VSS
00925/130	DVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTFD	DYALG	WFRQAP GKEREG VS	CIRCSG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	SIVPRSKLEP YEYDA	WGQG TLVT VSS

7.2 V_HH 37F02

Выравнивали аминокислотную последовательность aHTu-Ang2 V_HH 37F02 (см. фиг. 12-А) с консенсусной последовательностью человеческой зародышевой линии V_H3/JH. Остатки нумеровали согласно Кэботу, CDR, определенные согласно AbM (программа моделирования антител Oxford Molecular's AbM), выделены серым цветом. Остатки, подлежащие мутации путем замены на их человеческие копии, подчеркнуты. Потенциальные сайты пост-трансляционных модификаций, подлежащие блокированию, выделены прямоугольником. Сравнительный анализ структуры последовательностей продемонстрировал, что клон 37F02 содержит 4 мутации в каркасных участках относительно зародышевой референспоследовательности. Нечеловеческие остатки в положениях 60, 74, 83 и 108 отбирали для замены на их копии из человеческой зародышевой линии. Параллельно удаляли потенциальный сайт изомеризации Asp в положении D54G55 путем интродукции замены D54G. Конструировали и получали набор из трех, полученных в процессе осуществления цикла 1 вариантов 37F02, которые несли различные комбинации человеческих остатков в указанных положениях (фиг. 12-Б) (пример 5; АК-последовательности представлены в табл. 21-1).

Указанные варианты в виде очищенных белков характеризовали в отношении ингибирования взаимодействия человеческого (фиг. 12-1), мышиного (фиг. 12-2) и cyno (фиг. 12-3) Ang2 с Tie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.1; пример 5.2). Кроме того, определяли температуру плавления (Т_пл) каждого варианта с помощью анализа температурного сдвига (пример 6). Обобщенные данные представлены в табл. 16. Кроме того, рассчитывали % идентичности FR с человеческой зародышевой линией согласно AbM (программа моделирования антител Oxford Molecular's AbM).

Таблица 16. Обобщение данных о Т_пл, IC₅₀ (пМ), установленных для человеческого, мышиного и cyno Ang2 с помощью ELISA в условиях конкуренции, и соотношения величин IC₅₀ для hAng1/hAng2 вариантов V_HH 37F02 с оптимизированной последовательностью, полученных в цикле 1

	TSA	1С50 в Ang2-Tie2-ELISA		% идентичности FR
VHH ID	ТПл (°C) при pH7	hAng2 (пМ)	mAng2 (пМ)	cAng2 (пМ)	Соотношение IC50 для hAngl/hAng2	AbM
37F02	66 л	77	ПО	150	> 130,317	87,6
00044	66,9	69	91	130	n.d.	91,0
00045	71,1	120	110	160	n.d.	92,1
00046	69,8	95	83	160	n.d.	91,0

Подход, основанный на применении NNK-библиотеки, применяли для удаления двух потенциальных сайтов пост-трансляционных модификаций в CDR3: I), чувствительный к окислению Met в положении 100e и II) сайт изомеризации Asp в положении D₉₅S₉₆. Поскольку D₅₄G является приемлемым (V_HH 00046 и 00920; табл. 16 и табл. 17), то не применяли подход, основанный на применении NNK, для выключения указанного потенциального сайта изомеризации Asp.

Для указанной цели три NNK-библиотеки, содержащие клоны V_HH, которые несут замены в положениях D₉₅, S₉₆ и M_100e на любые другие аминокислоты, подвергали скринингу с помощью AlphaScreenанализа в условиях конкуренции в отношении взаимодействия hAng2/hTie2 (пример 2). В целом, метод состоял в следующем: периплазматические экстракты, содержащие экспрессированные VHH, подвергали скринингу в трех различных разведениях (примерно соответствующих величинам EC20, EC50 и EC80 родительского VHH 37F02) и изменение % ингибирования при использовании трех различных разведений сравнивали с родительским 37F02. На основе результатов скрининга и данных, представленных в табл. 17, в цикле 2 конструировали 8 дополнительных вариантов V_HH (используя в качестве каркаса V_HH 00920), которые несли различные выключенные комбинации D₉₅S₉₆ и M_100e (фиг. 11-В; АКпоследовательности представлены в табл. 19-2).

Указанные варианты в виде очищенных белков характеризовали в отношении ингибирования взаимодействия человеческого (фиг. 13-1), мышиного (фиг. 13-2) и cyno (фиг. 13-3) Ang2 с Tie2 с помощью конкурентного ELISA (пример 5.1; пример 5.2), а также ингибирования взаимодействия hAng1/hTie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.3; фиг. 14). Кроме того, определяли температуру плавления (Тпл) каждого варианта с помощью анализа температурного сдвига (пример 6). Обобщенные данные представлены в табл. 17. Кроме того, рассчитывали % идентичности FR с человеческой зароды

- 44 031182 шевой линией. Данные о аффинности V_HH 00928 к человеческому, мышиному, cyno и крысиному Ang2 представлены в табл. 18.

Таблица 17. Обобщение данных о Т_пл, IC₅₀ (пМ), установленных для человеческого, мышиного и cyno Ang2 с помощью конкурентного ELISA, и соотношения величин IC₅₀ для hAng1/hAng2 вариантов V_HH 37F02 с оптимизированной последовательностью, полученных в цикле 2

	TSA	1С50 в Ang2-Tie2-ELISA		% идентичности FR
VHH ID	ТПл (°C) при рН7	hAng2 (пМ)	mAng2 (пМ)	cAng2 (пМ)	Соотношение IC50 для hAngl/hAng2	AbM
37F02	66,1	77	110	150	> 130,317	87,6
00920	73,6	130	150	230	>79,159	92,1
00924	73,1	но	n.d.	n.d.	n.d.	91,0
00926	71,5	250	200	290	> 39,446	92,1
00927	73,6	220	190	330	> 44,668	92,1
00928	72,7	220	200	390	> 45,604	92,1
00929	69,0	150	150	250	>65,013	92,1
00930	69,8	190	170	310	> 53,580	92,1
00931	69,4	170	150	290	> 57,677	92,1

n.d., не определяли

Таблица 18. Величины аффинности KD очищенного V_HH 00928 к рекомбинантному человеческому, cyno, мышиному и крысиному Ang2

	Человеческий Ang2-FLD	cyno Ang	2-FLD
	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)
00928	6,2+05	4,0E-05	6,4E-11	9,7E+05	4,9E-05	5,0E-ll

	Мышиный Ang2-FLD	Крысиный Ang2-FLD
	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)	ka (1/Mc)	kd (1/c)	kd (M)
00928	4,2E+05	7,3E-05	l,7E-10	l,8E+05	5,4E-05	2,9E-10

Таблица 19-1

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
00044/131	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG ITYYVD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TLVT VSS
00045/132	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSDG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TLVT VSS
00046/ 133	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYVD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TLVT VSS

Таблица 19-2

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
00920/134	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TLVT VSS
00924/135	DVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CMGLGYDY	WGQG TLVT VSS
00926/136	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CQGLGYDY	WGQG TLVT VSS
00927/ 137	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CRGLGYDY	WGQG TLVT VSS
00928/138	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	DSGGYIDYD CSGLGYDY	WGQG TLVT VSS

- 45 031182

00929/ 139	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	C1SSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	ESGGYIDYD CQGLGYDY	WGQG TLVT vss
00930/140	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	ESGGYIDYD CRGLGYDY	WGQG TLVT VSS
00931/141	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFAL D	YYAIG	WFRQAP GKEREG VS	CISSSGG ITYYAD SVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA T	ESGGYIDYD CSGLGYDY	WGQG TLVT VSS

7.3 V_HH 28D10

Выравнивали аминокислотную последовательность анти-Ang2 V_HH 28D10 (см. фиг. 15-А) с консенсусной последовательностью человеческой зародыше'вой линии V_H3/JH. Остатки нумеровали согласно Кэботу, CDR, опре'де'ле'нные' согласно AbM (программа моделирования антител Oxford Molecular's AbM), выде'ле'ны серым цветом. Остатки, подлежащие мутации путем замены на их человеческие копии, подчеркнуты. Потенциальные сайты пост-трансляционных модификаций, подлежащие блокированию, выде'ле'ны прямоугольником. Сравнительный анализ структуры последовательностей продемонстрировал, что клон 28D10 содержит 5 мутаций в каркасных участках относительно зародыше'вой референс-последовательности. Нечеловеческие остатки в положениях 14, 71, 74, 83 и 108 отбирали для замены на их копии из человеческой зародышевой линии. Параллельно удаляли потенциальный сайт изомеризации Asp в положении D₅₄G₅₅ путем интродукции замены D54G. Свободный цистеин в положении 50 удаляли путем замены на Ala, Thr или Ser. В результате конструировали и получали набор, состоящий из одиннадцати получе'нных в цикле 1 вариантов клона 28D10, которые несли различные' комбинации человеческих остатков в указанных положениях (см. фиг. 15-Б; АКпоследовательности представлены в табл. 24-1).

Указанные варианты в виде очищенных белков характеризовали в отношении ингибирования взаимодействия человеческого (фиг. 16-1), мышиного (фиг. 16-2) и cyno (фиг. 16-3) Ang2 с Tie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.1; пример 5.2), а также ингибирования взаимодействия hAng1/hTie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.3; фиг. 17). Кроме того, определяли температуру плавления (Т_т) каждого варианта с помощью анализа температурного сдвига (пример 6). Обобщенные данные представлены в табл. 20. Кроме того, рассчитывали % идентичности FR с человеческой зародышевой линией.

Таблица 20. Обобщение данных о Т_т, IC₅₀ (нМ), установленных для человеческого, мышиного и cyno Ang2 с помощью ELISA в условиях конкуренции, и соотношения величин IC₅₀ для hAng1/hAng2 вариантов V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью, полученных в цикле 1

	TSA	IC50 в Ang2-Tie2-ELISA		% идентичности FR
VHH ID	ТПЛ (°C) при pH7	hAng2 (нМ)	mAng2 (нМ)	cAng2 (нМ)	Соотношение IC50 для hAngl/hAng2	AbM
28D10	66 J	1,8	5,7	2,1	> 5,675	86,5
00025	63,2	2,1	4,9	1,7	n.d.	87,6
00026	68,2	1,0	2,6	1,1	n.d.	87,6
00027	61,1	0,7	2,0	0,7	> 14,878	87,6
00041	62,3	0,6	1,7	0,9	n.d.	89,9
00042	61,9	0,7	1,9	0,8	> 15,476	91,0
00043	65,7	9,5	29,2	12,6	n.d.	91,0
00048	63,2	0,6	2,1	1,0	n.d.	87,6
00052	61,1	1,0	2,1	0,8	n.d.	89,9
00053	64,8	10,7	36,7	13,8	n.d.	91,0
00054	65,7	9,5	22,9	11,7	n.d.	92,1
00055	63,6	1,8	4,6	2,0	n.d.	87,6

n.d., не определяли

Создавали дополнительный набор вариантов (цикл 2) для исследования предназначенной для созревания аффинности замены в положении A₂₄V и для дополнительного исследования C₅₀X-S₅₃Xвариантов (табл. 21; фиг. 15-В; АК-последовательности представлены в табл. 23-4-2). Указанные варианты в виде очищенных белков характеризовали в отношении ингибирования взаимодействия человеческого (фиг. 18-1), мышиного (фиг. 18-2) и cyno (фиг. 18-3) Ang2 с Tie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.1; пример 5.2), а также ингибирования взаимодействия hAng1/hTie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.3; фиг. 19). Кроме того, определяли температуру плавления (Т_пл) каждого варианта с помощью анализа температурного сдвига (пример 6).

- 46 031182

Таблица 21. Обобщение данных о Т_пл, IC₅₀ (нМ), установленных для человеческого, мышиного и cyno Ang2 с помощью ELISA в условиях конкуренции, и соотношения величин IC₅₀ для hAng1/hAng2 вариантов V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью, полученных в цикле 2

	TSA	IC50 в Ang2-Tie2-ELISA		% идентичности FR
VHH ID	ТПл (°C) при рН7	hAng2 (нМ)	mAng2 (нМ)	cAng2 (нМ)	Соотношение IC50 для hAngl/hAng2	AbM
28D10	66,1	1,8	5.7	2.1	> 5,675	86,5
00898	66,1	1,2	n.d.	n.d.	> 8,279	87,6
00899	61,9	0,9	n.d.	n.d.	> 11,749	87,6
00900	64,3	0,2	n.d.	n.d.	> 42,855	86,5
00901	Гб7,3	1,2	n.d.	n.d.	> 8,054	87,6
00902	66,1	1,3	n.d.	n.d.	> 7,907	87,6
00919	67,3	0,9	1,8	0.7	> 11,212	91,0
00923	67,7	0,7	n.d.	n.d.	n.d.	89,9

n.d., не определяли

Параллельно применяли подход, основанный на применении NNK-библиотеки, для выключения двух сайтов пост-трансляционных модификаций в CDR2: два последовательно расположенных сайта изомеризации Asp в положении D_52aS₅₃ и D₅₄G₅₅. Поскольку D₅₄G является приемлемым (пример 6: табл. 20), то не применяли подход, основанный на применении NNK, для выключения указанного потенциального сайта изомеризации Asp. Для указанной цели две NNK-библиотеки, содержащие клоны V_HH, которые несут замены в положениях D_52a и S₅₃ на любые другие аминокислоты, подвергали скринингу с помощью AlphaScreen-анализа в условиях конкуренции в отношении взаимодействия hAng2/hTie2 (пример 2). В целом, метод состоял в следующем: периплазматические экстракты, содержащие экспрессированные VHH, подвергали скринингу в трех различных разведениях (примерно соответствующих величинам EC₂₀, EC₅₀ и EC₈₀ родительского клона 00902) и изменение % ингибирования при использовании различных разведений сравнивали с референс-клоном 00902. На основе результатов скрининга и данных, представленных в табл. 21, в цикле 3 конструировали 7 дополнительных вариантов (используя в качестве каркаса клон 00908) (см. фиг. 15-Г). Конечной целью было конструирование вариантов V_HH, которые сохраняли активность или обладали повышенной активностью, повышенной термостабильностью и имели приемлемые выключенные сайты посттрансляционных модификаций (РТМ) по сравнению с V_HH 28D10. (АК-последовательности представлены в табл. 24-3). Указанные варианты в виде очищенных белков характеризовали в отношении ингибирования взаимодействия человеческого (фиг. 20-1), мышиного (фиг. 20-2) и cyno (фиг. 20-3) Ang2 с Tie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.1; пример 5.2), а также ингибирования взаимодействия hAng1/hTie2 с помощью ELISA в условиях конкуренции (пример 5.3). Кроме того, определяли температуру плавления (Тпл) каждого варианта с помощью анализа температурного сдвига (пример 6). Обобщенные данные представлены в табл. 22. Кроме того, рассчитывали % идентичности FR с человеческой зародышевой линией. И, наконец, наиболее оптимальные изменения последовательности вносили в вариант VHH 00956, не подвергавшийся процедуре созревания аффинности (фиг. 15-Г). Данные о аффинности VHH 00919, 00938 и 00956 к человеческому, мышиному, cyno и крысиному Ang2 представлены в табл. 23.

Таблица 22. Обобщение данных о Тпл, IC50 (пМ), установленных для человеческого, мышиного и cyno Ang2 с помощью ELISA в условиях конкуренции, и соотношения величин IC₅₀ для hAng1/hAng2 вариантов V_HH 28D10 с оптимизированной последовательностью, полученных в цикле 3

	TSA	IC50 в Ang2-Tie2ELISA		Выживание клеток HUVEC	% идентичности FR
VHH ID	Тпл (°C) при pH 7	hAng2 (nM)	mAng2 (nM)	cAng2 (nM)	Соотношение IC50 Для hAngl/hAng2	IC50 (нМ)	AbM
00027	61,1	672	1,975	728	> 14,878	n.d.	87,6
00908	67,3	45	85	79	> 192,014	n.d.	91,0
00932	70,5	49	38	54	> 205,747	n.d.	89,9
00933	70,5	56	62	71	> 179,887	n.d.	91,0
00934	67,1	64	74	71	> 156,675	n.d.	91,0
00935	68,6	68	78	69	> 146,218	n.d.	91,0
00936	73,9	45	42	60	> 223,872	n.d.	89,9
00937	72,0	54	52	85	> 186,209	n.d.	89,9
00938	73,9	50	55	91	>201,064	4,3	89,9
00956	68,0	1,300	2,200	830	> 7,727	6,8	91,0

n.d. не определяли

- 47 031182

Таблица 23. Величины аффинности (KD) очищенных V_HH 00919, 00938 и 00956 к рекомбинантному человеческому, cyno, мышиному и крысиному Ang2

	человеческий Ang2-FLD	cyno Ang2-FLD
	ka (1/Мс)	kd (1/с)	KD (М)	ka (1/Мс)	kd (1/с)	Ко (М)
00919	9,5Е+05	1,5Е-03	1,6Е-09	2,ЗЕ+06	1.2Е-03	5,4Е-10
00938	1,6Е+06	2,8Е-05	1,7Е-11	2,6Е+06	2,2Е-05	8,7Е-12
00956	1,ЗЕ+06	1,5Е-03	1,2Е-09	1,7Е+06	1, ЗЕ-ОЗ	7,2Е-10

	мышиный Ang2-FLD	Крысиный Ang2-FLD
	ka (1/Мс)	kd (1/с)	Ко (М)	ka (1/Мс)	kd (1/с)	Ко (М)
00919	1,ЗЕ+06	3,9Е-03	3,0Е-09	5,0Е+05	5,ОЕ-О3	1,0Е-О8
00938	Ι,ΙΕ+06	5,6Е-05	5,0Е-11	5,1Е+05	7,2Е-05	1,4Е-10
00956	9,8Е+05	3,9Е-03	4,0Е-09	4,2Е+05	5,2Е-03	1,ЗЕ-08

Таблица 24-1

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
00025/142	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	TIRDSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00026/143	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	AIRDSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00027/144	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00041/145	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNAKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00042/146	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00043/147	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISRDNAKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00048/148	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDSDG STYYAD SVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00052/149	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00053/ 150	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISRDNDKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00054/ 151	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISRDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00055/152	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS

- 48 031182

Таблица 24-2

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
00898/153	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	AIRDND G STYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00899/154	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDIDG STYYAD SVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00900/ 155	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AVSGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	SIRDND GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00901/ 156	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	AIRDSD GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00902/ 157	EVQLVES GGGLVQA GGSLRLSC AASGFTL D	DYAIG	WFRQAP GKEREG VS	AIRDSG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNDKN TVYLQMNSLK PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS

Таблица 24-3

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
00919/ 158	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00923/ 159	DVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS
00932/ 160	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AVSGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	SIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00933/ 161	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00934/ 162	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRESG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00935/ 163	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRSSGG STYYAD SVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00936/ 164	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AVSGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRDNG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00937/ 165	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AVSGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRESG GSTYYA DSVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00938/ 166	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AVSGITLD	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRSSGG STYYAD SVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRYG EQWYPIYEY DA	WGQG TLVT VSS
00956/ 167	EVQLVES GGGLVQP GGSLRLSC AASGFTL D	DYAI G	WFRQAP GKEREG VS	AIRSSGG STYYAD SVKG	RFTISSDNSKN TVYLQMNSLR PEDTAVYYCA A	VPAGRLRFG EQWYPLYEY DA	WGQG TLVT VSS

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	Бёрингер Ингельхайм Интернациональ ГмбХ
<120>	Ang2-связывающие молекулы
<130>	12-0350-PCT
<160>	190
<170>	PatentIn, версия 3.3
<210> <211> <212>	1 124 PRT

- 49 031182 <213> Lama glama <400> 1

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Ala

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

2

<211>

111

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

2

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

His

Ser

Gly

Thr

Ile

Ser

Ser

Thr

His

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

His

Val

35

40

45

Ala

Thr

Phe

Thr

Asn

Arg

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Gly

Ser

Val

Lys

50

55

60

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Met

Tyr

Leu

65

70

75

80

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Asn

85

90

95

Thr

Gly

Pro

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

100

105

110

- 50 031182 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Lama glama <400> 3

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Val

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala

Ala

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

Asp

Ser

Ala

Gln

Gly

Arg

50

55

60

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

Leu

Gln

Met

65

70

75

80

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ala

Gly

85

90

95

Arg

Ala

Phe

Leu

Ala

Arg

Asp

Thr

Phe

Tyr

Tyr

Asp

Ile

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

4

<211>

126

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

4

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Phe

Asp

Asp

His

20

25

30

Leu

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Ala

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Arg

Ser

Ala

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

- 51 031182

Ala Ala

Gly

Pro

Ala

Trp

Gly

Arg

Pro

Ala

Ser

Pro

Leu

Pro

Tyr

Glu

100

105

110

Tyr Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

5

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

5

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Ile

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Ala Met

Ala

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala Ala

Ile

Ser

Leu

Ser

Gly

Asp

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Ala

Thr

Asp

Trp

Asp

Phe

Glu

Asp

Ile

Pro

Glu

Tyr

Tyr

Cys

Ser

100

105

110

Gly Tyr

Gly

Cys

Asp

Glu

Ser

Leu

Phe

Asp

Ser

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>

6

<211>

130

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

6

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Tyr

Asp

20

25

30

Ala Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

- 52 031182

Ser

Cys 50

Ile

Thr

Ser

Ser Asp 55

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr Ala 60

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gly

Asn

Arg

Arg

Ile

Tyr

Tyr

Ser

Asp

Tyr

Ala

Leu

Ala

Cys

100

105

110

Phe

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

115

120

125

Ser Ser

130 <210>7 <211>123 <212> PRT <213> Lama glama <400>7

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Val

Gly 15

Asp

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Ser

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
	115	120
<210>	8
<211>	130
<212>	PRT
<213>	Lama	glama
<400>	8

- 53 031182

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Thr

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gly

Asn

Leu

Arg

Ile

Tyr

Tyr

Ser

Asp

Tyr

Ala

Leu

Ala

Cys

100

105

110

Phe

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

115

120

125

Ser

Ser

130

<210>

9

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

9

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Gly

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

- 54 031182

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

120 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama <400> 10

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Val

Gly 15

Asp

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Ala

Met

Trp

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Glu

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

11

<211>

124

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

11

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

His

Thr

Phe

Ser

Arg

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Arg

Val

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Thr

His

Ile

Thr

Trp

Asn

Arg

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Lys

Ala

Ser

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

- 55 031182

Leu

Gln

Met Asn

Ser 85

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp Thr 90

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Ala

Gln

Ile

Lys

Tyr

Gly

Ala

Val

Thr

His

Pro

Glu

Glu

Tyr

Ser

100

105

110

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

12

<211>

126

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

12

Lys

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Phe

Asp

Asp

His

20

25

30

Leu

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Ala

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Arg

Ser

Ala

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Pro

Ala

Trp

Gly

Arg

Pro

Ala

Ser

Pro

Leu

Pro

Tyr

Glu

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

13

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

13

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

- 56 031182

Ser

Cys 50

Ile

Ser

Ser

Ser Asp 55

Gly

Ser Thr Ala

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Ala

Val

Pro

Ala

Thr

Arg

Arg

Thr

Pro

Gln

Met

Val

Ala

Ala

Asn

100

105

110

Val

Cys

Trp

Leu

Ala

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>

14

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

14

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Gly

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Val

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama

- 57 031182 <400> 15

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Phe Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Val

Gly 15

Asp

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Gly

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Val

Ser

Arg

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

16

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

16

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

His

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Thr

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Glu

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

- 58 031182

115

120 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 17

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Val

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

18

<211>

124

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

18

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Leu

Glu

Phe

Val

35

40

45

Thr

Ala

Val

Ser

Trp

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Ser

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

- 59 031182

Ala

Ala

Gln

Ser 100

Thr

Ile

Val

Glu Val 105

Thr

Thr

Leu

Glu

Ala 110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

19

<211>

122

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

19

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Ser

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Phe

Ser

Pro

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala

His

Ile

Thr

Trp

Ser

Ala

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Lys

Arg

Arg

Tyr

Gly

Ile

Val

Asp

Arg

Asp

Tyr

Asn

Asp

Trp

100

105

110

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

20

<211>

116

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

20

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Ile

Ala

Ser

Gly

Arg

Asp

Ile

Phe

Ser

Val

20

25

30

Ser

Ala

Thr

Gly

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Val

Ala

Gly

Ile

Ser

Asn

Ile

Gly

Ala

Thr

Lys

Phe

Ala

Asp

Ser

Val

- 60 031182

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Asn Val

Leu

Leu

Trp

Ser

Gly

Asn

Leu

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

100

105

110

Thr Val

Ser

Ser

115

<210>

21

<211>

116

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

21

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ile

Ala

Ser

Gly

Arg

Asp

Ile

Phe

Ser

Ile

20

25

30

Thr Ala

Ile

Gly

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Val Ala

Gly

Ile

Ser

Asn

Ile

Gly

Ala

Thr

Lys

Tyr

Thr

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Gly

Asp

Asn

Ala

Glu

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Asn Val

Leu

Leu

Trp

Ser

Ala

Asn

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

100

105

110

Thr Val

Ser

Ser

115

<210>

22

<211>

126

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

22

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Phe

Asp

Asp

His

- 61 031182

Leu

Ile Gly Trp 35

Phe

Arg

Gln Ala 40

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg Glu 45

Ala

Val

Ser

Cys

Ile

Ser

Arg

Ser

Ala

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Gly

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Pro

Ala

Trp

Gly

Arg

Pro

Ala

Ser

Pro

Leu

Pro

Tyr

Glu

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

23

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

23

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Ala

Val

Pro

Ala

Thr

Arg

Arg

Thr

Pro

Gln

Met

Val

Val

Ala

Asn

100

105

110

Val

Cys

Trp

Leu

Ala

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln Val Thr Val Ser Ser

130

- 62 031182 <210>24 <211>125 <212> PRT <213> Lama glama <400>24

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Gly

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Ile

Thr

Pro

Cys

Ser

Asp

Tyr

Thr

Gln

Thr

Tyr

Glu

Tyr

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

25

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

25

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Arg

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Ser

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Val

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

- 63 031182

Thr

Ala

Val

Pro 100

Ala

Thr Arg Arg Thr 105

Pro

Gln Met Val

Val 110

Ala

Asn

Met

Cys

Trp

Leu

Ala

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>

26

<211>

125

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

26

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Ile

Thr

Pro

Cys

Ser

Asp

Tyr

Thr

Gln

Thr

Tyr

Glu

Tyr

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

27

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

27

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

- 64 031182

Ser

Cys 50

Ile

Ser

Ser

Ser Asp 55

Gly

Ser Thr Ala

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Ala

Val

Pro

Ala

Thr

Arg

Arg

Thr

Pro

Gln

Met

Val

Val

Ala

Asn

100

105

110

Val

Cys

Trp

Leu

Ala

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>

28

<211>

132

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

28

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ser

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Arg

Pro

Thr

Leu

Arg

Val

Arg

Leu

Asp

Asn

Asp

Arg

His

His

100

105

110

Leu

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

115

120

125

Thr Val Ser Ser

130

<210>	29
<211>	134
<212>	PRT

- 65 031182 <213> Lama glama <400> 29

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Thr

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Ser

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Ala

Val

Pro

Ala

Thr

Arg

Arg

Thr

Pro

Gln

Met

Val

Val

Leu

Asn

100

105

110

Met

Cys

Trp

Leu

Ala

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>

30

<211>

125

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

30

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

- 66 031182

Ala Ala Gly

Ile Thr 100

Pro

Cys

Ser

Asp Tyr Thr Gln Thr Tyr

Glu

Tyr

105

110

Asp Val

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

31

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

31

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Ser

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Thr

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr Ala

Val

Pro

Ala

Thr

Arg

Arg

Thr

Pro

Gln

Met

Val

Asp

Ala

Asn

100

105

110

Met Cys

Trp

Leu

Ala

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>

32

<211>

127

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

32

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Ala

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Arg

Phe

Gly

Gly

His

20

25

30

Ala Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Glu

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

- 67 031182

Ala Thr

Ile

Tyr

Trp

Thr

Ser

Gly

Met

Thr

Arg

Tyr

Ala

Gly

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Glu

Asn

Thr

Val

Phe

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Val

Ile

Lys

Asp

Phe

Gln

Leu

Arg

Val

Asp

Val

Thr

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Ala Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

33

<211>

127

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

33

Gly Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Ala

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Arg

Phe

Gly

Gly

His

20

25

30

Ala Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Asp

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala Thr

Ile

Tyr

Trp

Thr

Thr

Gly

Met

Thr

Arg

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Glu

Asn

Thr

Val

Phe

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Leu

Ile

Arg

Asp

Phe

Asn

Ile

Arg

Leu

Asp

Val

Thr

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Ala Tyr

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

34

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

34

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

- 68 031182

Ser

Leu Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala Ala

Ser 25

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser 30

Thr

Tyr

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Gly

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Arg

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

35

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

35

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Val

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Ala

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Glu

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 36 <211> 121

- 69 031182 <212> PRT <213> Lama glama <400> 36

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Arg

Asn

20

25

30

Ala

Met

Ala

Trp

Phe

Arg

Gln

Val

Pro

Gly

Lys

Val

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala

Gly

Ile

Arg

Trp

Asn

Val

Gly

Arg

Leu

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Glu

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Asp

Leu

Lys

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Tyr

Ala

Gly

Leu

Val

Phe

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

37

<211>

118

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

37

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Arg

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ser

Ile

Phe

Ser

Ile

Asn

20

25

30

Ala

Met

Leu

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

Leu

Val

35

40

45

Ala

Ala

Ile

Thr

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

50

55

60

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

Leu

65

70

75

80

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Ala

Asp

Ser

Asp

Tyr

Ser

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

100

105

110

- 70 031182

Gln Val Thr Val Ser Ser

115 <210>38 <211>133 <212> PRT <213> Lama glama <400>38

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ser

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Thr

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Gly

Gly

Asp

Thr

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Ala

Gly

Val

Pro

Ala

Gly

Pro

Ala

Ala

Val

Tyr

Gly

100

105

110

Ser

Thr

Cys

Ser

Arg

Leu

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Ala

Gln

115

120

125

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>39 <211>124 <212> PRT <213> Lama glama <400>39

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Gly

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Ser

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Ile

35

40

45

Ala

Ala

Ile

Asn

Trp

Asn

Gly

Asp

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Ser

Val

50

55

60

- 71 031182

Lys 65

Gly Arg

Phe

Thr Val 70

Ser

Arg

Asp Asn

Ala 75

Lys Asn

Thr

Val

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gly

Arg

Ala

Tyr

Glu

Gln

Ala

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Val

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

40

<211>

119

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

40

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Val

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Thr

Ile

Ser

Trp

Asn

Asp

Glu

Tyr

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Glu

Ser

Met

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

Gly

Gly

Ser

Arg

Leu

Tyr

Asp

Tyr

His

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

41

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

41

Glu Val

Gln

Leu Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu Ser

Cys

Ala

Ser

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

25 30

- 72 031182

Ala

Ile Gly Trp 35

Phe

Arg

Gln Ala 40

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg Glu 45

Gly

Val

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Arg

Pro

Pro

Phe

His

Ser

Cys

Ser

Glu

Tyr

Glu

Asn

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

42

<211>

120

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

42

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Ile

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Val

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala

Ala

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

Asp

Ser

Ala

Lys

Asp

Arg

50

55

60

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

Leu

Gln

Met

65

70

75

80

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ala

Gly

85

90

95

Arg

Ala

Phe

Leu

Thr

Arg

Asp

Pro

Phe

Tyr

Tyr

Asp

Ile

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 43 <211> 116 <212> PRT <213> Lama glama

- 73 031182 <400> 43

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Thr

Cys

Ile

Ala

Ser

Gly

Arg

Asp

Ile

Phe

Ser

Val

20

25

30

Thr

Ala

Met

Gly

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Val

Ala

Gly

Leu

Ser

Asn

Ile

Gly

Ala

Thr

Lys

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Val

Ser

Gly

Asp

Ala

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Asn

Val

Leu

Leu

Trp

Ser

Gly

Asn

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

100

105

110

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

44

<211>

132

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

44

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Ser

Lys

Ser

Asp

Gly

Thr

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ser

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Ile

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Arg

Pro

Thr

Leu

Arg

Val

Arg

Leu

Asp

Asn

Asp

Arg

His

His

100

105

110

Leu

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

- 74 031182

115

120

125

Thr Val Ser Ser

130 <210>45 <211>132 <212> PRT <213> Lama glama <400>45

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Glu

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Ser

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Arg

Pro

Thr

Leu

Arg

Val

Arg

Leu

Asp

Asn

Asp

Arg

His

His

100

105

110

Leu

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

115

120

125

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>46 <211>124 <212> PRT <213> Lama glama <400>46

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala

Arg

Ile

Ser

Trp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

His

Ala

Asp

Ser

Val

- 75 031182

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Pro

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asp

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Ala

Ala

Ile

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Ala

Ser

Ile

Ala

Leu

Val

Gly

Gly

Val

Thr

Pro

His

Ser

Tyr

Asp

100

105

110

Tyr Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

47

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

47

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

48

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

48

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

- 76 031182

Leu

Met

Val 35

Gly Trp

Phe

Arg Gln 40

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu 45

Arg

Glu

Phe

Ala

Ala

Gly

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

49

<211>

128

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

49

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Leu

Pro

Ser

Tyr

20

25

30

Val

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Leu

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala

Gly

Ile

Ser

Trp

Ser

Ser

Gly

Arg

Thr

Tyr

Tyr

Thr

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Ala

Ala

Glu

Asn

Thr

Trp

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ser

Asn

Ser

Val

Ser

Glu

Pro

Thr

Leu

His

Thr

Trp

Gln

Tyr

Glu

100

105

110

Ala

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210> 50 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama

- 77 031182 <400> 50

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

His

Thr

Phe

Ser

Arg

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Arg

Val

Pro

Gly

Glu

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Thr

His

Ile

Thr

Trp

Asn

Arg

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Lys

Ala

Ser

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gln

Ile

Lys

Tyr

Gly

Glu

Ile

Thr

His

Pro

Glu

Glu

Tyr

Ser

100

105

110

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

51

<211>

121

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

51

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Arg

Asn

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Val

Pro

Gly

Lys

Ala

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Ala

Ala

Ile

Arg

Trp

Asn

Val

Gly

Arg

Leu

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Glu

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Asp

Leu

Lys

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Tyr

Ala

Gly

Leu

Val

Tyr

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

- 78 031182

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>52 <211>124 <212> PRT <213> Lama glama <400>52

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

His

Thr

Phe

Ser

Arg

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Arg

Val

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Thr

His

Ile

Thr

Trp

Asn

Arg

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Lys

Ala

Ser

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gln

Ile

Lys

Tyr

Gly

Glu

Ile

Thr

His

Pro

Glu

Glu

Tyr

Ser

100

105

110

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

53

<211>

124

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

53

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

His

Thr

Phe

Ser

Arg

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Arg

Val

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

Val

35

40

45

Thr

His

Ile

Thr

Trp

Asn

Arg

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Lys

Ala

Ser

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

- 79 031182

Leu Gln

Met

Asn

Ser 85

Leu

Lys

Ser Glu Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Ala

Gln

Thr

Lys

Tyr

Gly

Glu

Ile

Thr

Arg

Pro

Glu

Glu

Tyr

Ser

100

105

110

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

54

<211>

115

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

54

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Val

Cys

Ser

Ala

Ser

Gly

Ile

Asp

Phe

Ser

Ile

Asn

20

25

30

Ala

Met

Ala

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

Met

Ile

Asn

Asp

Ser

Ser

Thr

Asp

Tyr

Thr

Asp

Ser

Val

Lys

50

55

60

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Ser

Thr

Lys

Asn

Ile

Leu

Tyr

Leu

65

70

75

80

Gln

Met

Asn

Asn

Leu

Asn

Val

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Asn

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Glu

Gln

His

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ser

115

<210> 55 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <400> 55

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Ala

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Ile

35

40

45

- 80 031182

Ser

Cys 50

Ile

Thr

Pro

Ser

Asp 55

Asp

Arg

Thr Tyr

Tyr Ala 60

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Ile

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Arg

Leu

Arg

Gly

Leu

Gly

Tyr

Trp

Pro

Tyr

Pro

Glu

100

105

110

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

56

<211>

124

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

56

Lys

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Ala

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

57

<211>

119

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

57

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

- 81 031182

Ser

Leu Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Val

Ser 25

Gly

Phe Thr

Val

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Thr

Ile

Ser

Trp

Asn

Asp

Glu

Tyr

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Glu

Ser

Met

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

Gly

Gly

Ser

Arg

Leu

Tyr

Asp

Tyr

His

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

58

<211>

131

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

58

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Val

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Leu

Arg

Gly

Arg

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Thr

Tyr

Ser

Leu

Val

100

105

110

Cys

Ala

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Phe

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

115

120

125

Val Ser Ser

130

- 82 031182 <210>59 <211>131 <212> PRT <213> Lama glama <400>59

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

His

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Leu

Arg

Gly

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Ser

Asn

Tyr

Leu

Val

100

105

110

Cys

Ala

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

115

120

125

Val

Ser

Ser

130

<210> 60 <211>125 <212> PRT <213> Lama glama <400>60

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

- 83 031182

Leu

Gln

Met Asn

Ser 85

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp Thr 90

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Ala

Asp

Phe

Ile

Ile

Ser

Ser

Lys

Arg

Leu

Cys

Leu

Asp

Leu

Phe

100

105

110

Gly

Ser

Arg

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

61

<211>

125

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

61

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Ser

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Gly

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Ile

Thr

Pro

Cys

Ser

Asp

Tyr

Thr

Gln

Thr

Tyr

Glu

Tyr

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

62

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

62

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Arg

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

- 84 031182

Ser

Cys 50

Ile Thr

Ser

Ser

Asp Gly 55

Ser

Thr

Ser

Tyr 60

Ala Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Ser

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ser

Val

Val

Pro

Ala

Thr

Arg

Arg

Asn

Pro

Gln

Met

Val

Val

Ala

Lys

100

105

110

Lys

Cys

Trp

Leu

Ala

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

115

120

125

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>

63

<211>

130

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

63

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Arg

Ser

Asp

Gly

Ser

Pro

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Gly

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Ser

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Asp

100

105

110

Arg

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

115

120

125

Ser Ser

130 <210> 64 <211> 123

- 85 031182

<212> <213>	PRT Lama glama
<400>	64

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Val

Gly 15

Asp

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Thr

Met

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Glu

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

65

<211>

127

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

65

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Leu

Gly

Tyr

Gly

Ser

Ser

Cys

Arg

Met

Ala

Pro

Tyr

100

105

110

- 86 031182

Glu Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

66

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

66

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

67

<211>

130

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

67

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Ser

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

70 75 80

- 87 031182

Leu

Gln

Met

Asn

Ser 85

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp Thr 90

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Thr

Gly

Asn

Arg

Arg

Ile

Tyr

Tyr

Ser

Asp

Tyr

Ala

Leu

Ala

Cys

100

105

110

Phe

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

115

120

125

Ser

Ser

130

<210>

68

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

68

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Arg

Arg

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Gly

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

69

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

69

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

25 30

- 88 031182

Leu

Met

Val 35

Gly Trp

Phe

Arg Gln 40

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu 45

Arg

Glu

Phe

Ala

Ala

Thr

Met

Trp

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Pro

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

70

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

70

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ile

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Ala

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Val

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Glu

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 71 <211> 122 <212> PRT <213> Lama glama

- 89 031182 <400> 71

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Trp

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Ile

Val

Cys

Gly

Ser

Tyr

Tyr

Gly

Met

Asp

Tyr

Trp

100

105

110

Gly

Lys

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

72

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

72

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Gly

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Val

Ser

Arg

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

- 90 031182

115

120 <210> 73 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <400> 73

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ala

Trp

Gly

Ala

Ser

Arg

Leu

Pro

Ile

Gly

Thr

Met

Pro

Pro

100

105

110

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

74

<211>

118

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

74

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Val

Cys

Ser

Ala

Ser

Gly

Ile

Asp

Phe

Ser

Ile

Asn

20

25

30

Val

Met

Gly

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

Ile

Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Asp

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Thr

Asp

50

55

60

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Ser

Thr

Lys

Asn

Ile

65

70

75

80

Leu

Tyr

Leu

Arg

Met

Asn

Asn

Leu

Asn

Val

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

- 91 031182

Tyr

Cys Asn

Thr Ala 100

Tyr

Glu

Gln His 105

Thr

Tyr Trp

Gly

Gln 110

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

75

<211>

125

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

75

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Asp

Leu

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Asn

Gly

Leu

Gly

Pro

Phe

Ser

Val

Pro

Val

Pro

Val

Tyr

100

105

110

Asp

Phe

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

76

<211>

130

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

76

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Pro

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Val

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

- 92 031182

Lys 65

Gly Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Ser Asp

Asn

Ala 75

Lys Asn

Thr

Val

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Ala

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Gly

Gly

Pro

Arg

Ile

Asn

Ile

Ala

Thr

Met

Thr

Cys

Ser

His

100

105

110

Asp

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

115

120

125

Ser

Ser

130

<210>

77

<211>

133

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

77

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Glu

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Ala

Gly

Val

Pro

Ala

Gly

Pro

Ala

Ala

Val

Tyr

Gly

100

105

110

Ser

Ser

Cys

Ser

Arg

Leu

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

115

120

125

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>	78
<211>	124
<212>	PRT
<213>	Lama glama

- 93 031182 <400> 78

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Gly

Ser

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Pro

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Asn

Ser

Arg

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Pro

Tyr

Ser

Leu

Ser

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Pro

Leu

Tyr

Asp

100

105

110

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

79

<211>

115

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

79

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Val

Cys

Ser

Ala

Ser

Gly

Ile

Asp

Phe

Ser

Ile

Asn

20

25

30

Val

Met

Gly

Trp

Tyr

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Arg

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

Ile

Gly

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Asp

Ser

Val

Lys

50

55

60

Gly

Arg

Phe

Ser

Ile

Ser

Arg

Asp

Ser

Thr

Lys

Asn

Ile

Leu

Tyr

Leu

65

70

75

80

Gln

Met

Asn

Asn

Leu

Asn

Val

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Asn

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Glu

Gln

His

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

100

105

110

- 94 031182

Val Ser Ser

115 <210> 80 <211>129 <212> PRT <213> Lama glama <400>80

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 81 <211>124 <212> PRT <213> Lama glama <400>81

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Val

Val

Gln

Ala

Gly 15

Asp

Ser

Val

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Pro

Thr

Phe

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ala

Trp

Phe

Arg

Gln

Thr

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Asp

Ile

Val

35

40

45

Ala

Ala

Ile

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Arg

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

- 95 031182

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Gln

Ile 70

Leu

Arg Asp Asn

Ala 75

Lys

Glu

Thr

Val

Trp 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Ile

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

Leu

Asn

Leu

Ala

Tyr

Thr

Thr

Lys

Pro

Tyr

Asp

100

105

110

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

82

<211>

133

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

82

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Asp

Phe

Glu

Asp

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Thr

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Ile

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Arg

Pro

Trp

Thr

Arg

Arg

Val

Tyr

Gly

Ser

Ser

Trp

Leu

Ala

100

105

110

Arg

Ser

Leu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

115

120

125

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

<210>	83
<211>	123
<212>	PRT
<213>	Lama	glama
<400>	83
Glu Val	Gln	Leu Val	Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val	Gln Val Gly Asp
1		5	10	15

- 96 031182

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys Ala

Ala

Ser 25

Gly

His

Thr

Phe

Ser 30

Thr

Tyr

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Thr

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Ala

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Glu

Asp

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

84

<211>

126

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

84

Glu

Val

Gln

Leu

Met

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Val

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Gly

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>	85
<211>	126
<212>	PRT

- 97 031182 <213> Lama glama <400> 85

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Gln

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

86

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Lama

glama

<400>

86

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Arg

Thr

Phe

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Met

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Phe

35

40

45

Ala

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Gly

Ser

Tyr

Asp

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

- 98 031182

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>87 <211>129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 87

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Ser

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asp

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 88 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 88

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Val

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

- 99 031182

35

40

45

Ser

Thr

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	89
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	89

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Gln Ala Gln Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Thr

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

- 100 031182 <210> 90 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400>90

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Val

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210>91 <211>129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 91

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

- 101 031182

Ser

Ser 50

Ile

Arg Asp Asn

Asp Gly 55

Ser Thr Tyr

Tyr Ala 60

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	92
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	92

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Gln

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

- 102 031182 <210> 93 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400>93

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ile

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Val

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ile

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210>94 <211>129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 94

Glu Val 1

Gln

Leu

Met 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

- 103 031182

55 60

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Ser Asp

Asn

Asp 75

Lys

Asn Thr Val

Asn 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	95
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	95

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 96

- 104 031182

<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	96

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Glu

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Arg

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 97 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 97

Glu Val 1

Gln Met

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

- 105 031182

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Ser Asp

Asn

Asp 75

Lys

Asn Thr Val

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Asn

Gly

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	98
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	98

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ser

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 99 <211> 129 <212> PRT

- 106 031182 <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 99

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Ser

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	100
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	100

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Trp

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

- 107 031182

70 75 80

Leu

Gln Met

Asn

Ser 85

Met

Lys

Pro

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Ile

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	101
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	101

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Phe

Leu

Arg

Leu

Thr

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Val

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	102
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная

- 108 031182 <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 102

Glu 1

Val

Gln

Leu

Leu Glu 5

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Ile

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	103
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	103

Glu 1

Val

His

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Val

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

- 109 031182

Leu

Gln

Met Asn

Ser 85

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp Thr Ala 90

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	104
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	104

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Asp

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Val

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 105 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <223> Мутантная последовательность Lama <220>

- 110 031182 <400> 105

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Thr

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Ile

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	106
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	106

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ile

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Asn

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

- 111 031182

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	107
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	107

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Ser

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Arg

Asn

Thr

Val

Phe

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	108
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	108

- 112 031182

Glu 1

Glu

Leu

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Ser

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	109
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	109

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly

Gly 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Arg

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

- 113 031182

Ala

Ala

Val

Pro Ala 100

Gly

Arg

Leu

Arg 105

Phe

Gly

Glu

Gln Trp Tyr 110

Pro

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	110
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	110

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Ser 10

Leu Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	111
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность	Lama
<400>	111
Glu Val	Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly	Ser Leu Val Gln Ala Gly Gly

- 114 031182

Ser

Leu Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala Ala

Ser Gly 25

Leu Thr

Leu

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	112
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	112

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

- 115 031182

100	105	110
Ile Tyr Glu Tyr Asp Ala	Trp Gly Gln Gly Thr	Leu Val Thr Val Ser
115	120	125

Ser

<210>	113
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	113

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	114
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность	Lama
<400>	114
Glu Val	Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly	Gly Leu Val	Gln Pro Gly Gly
1	5	10	15

- 116 031182

Ser

Leu Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala Ala

Ser Gly 25

Phe Thr

Ile

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	115
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	115

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Ile

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

- 117 031182

Ile Tyr Glu Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120125

Ser

Ser

<210>	116
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	116

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210>117 <211>129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama

<400>

117

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

- 118 031182

Ala

Ile Gly 35

Trp

Phe Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg Glu 45

Gly

Val

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	118
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	118

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Ile

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

- 119 031182

115

Ser

120

125

<210>	119
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	119

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Ile

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 120 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama

<400>

120

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

- 120 031182

Ala

Ile Gly 35

Trp

Phe Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg Glu 45

Gly

Val

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	121
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	121

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

- 121 031182

Ser

<210>	122
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	122

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Ile

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 123 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 123

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Thr

Ile

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

- 122 031182

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	124
<211>	124
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	124

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Ala

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 125

- 123 031182

<211>	124
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	125

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 126 <211> 124 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 126

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Ala

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

- 124 031182

Leu Gln

Met Asn

Ser 85

Leu

Arg

Pro

Glu Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

127

<211>

124

<212>

PRT

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Мутантная последовательность

Lama

<400>

127

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 128 <211> 124 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama

<400>

128

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

- 125 031182

Ala

Leu Gly Trp 35

Phe

Arg

Gln Ala 40

Ala

Gly

Lys

Glu Arg 45

Glu

Gly

Val

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>

129

<211>

124

<212>

PRT

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Мутантная последовательность

Lama

<400>

129

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120 <210> 130

- 126 031182

<211>	124
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	130

Asp 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Arg

Cys

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Ser

Ile

Val

Pro

Arg

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 131 <211> 126 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 131

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

- 127 031182

Leu

Gln Met

Asn

Ser 85

Leu Arg

Pro

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>	132
<211>	126
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	132

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Asp

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210> 133 <211> 126 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama

<400>

133

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

- 128 031182

Ala

Ile

Gly Trp 35

Phe

Arg

Gln Ala 40

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg 45

Glu

Gly

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Val

Asp

Ser

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

65

70

75

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

134

<211>

126

<212>

PRT

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Мутантная последовательность

Lama

<400>

134

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

65

70

75

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

Val

Val

Cys

Gly

Gly

Tyr

Val

Val

Cys

Gly

Tyr

Tyr <210> 135

- 129 031182 <211> 126 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 135

Asp 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Met

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 125 <210> 136 <211> 126 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223>

Мутантная последовательность

Lama

<400>

136

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

- 130 031182

Leu

Gln Met

Asn

Ser 85

Leu Arg

Pro

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Gln

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>	137
<211>	126
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	137

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Arg

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210> 138 <211> 126 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama

<400>

138

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

- 131 031182

20

25

30

Ala Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Thr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Ser

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

139

<211>

126

<212>

PRT

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Мутантная последовательность

Lama

<400>

139

Glu Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Thr

Glu

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Gln

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>

140

- 132 031182

<211>	126
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	140

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Glu

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Arg

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 125 <210> 141 <211> 126 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223>

Мутантная последовательность

Lama

<400>

141

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Gly

Ile

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

- 133 031182

Leu Gln Met Asn

Ser 85

Leu Arg

Pro

Glu

Asp Thr 90

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Thr

Glu

Ser

Gly

Gly

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Asp

Cys

Ser

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 125 <210> 142 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 142

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Thr

Ile

Arg

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	143
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность	Lama
<400>	143
Glu Val	Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly	Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

- 134 031182

Ser

Leu Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala Ala

Ser Gly 25

Phe Thr

Leu

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	144
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	144

Glu 1

Val

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

- 135 031182

100	105	110
Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala	Trp Gly Gln Gly Thr	Leu Val Thr Val Ser
115	120	125

Ser

<210>	145
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	145

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	146
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность	Lama
<400>	146
Glu Val	Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly	Gly Leu Val	Gln Pro Gly Gly
1	5	10	15

- 136 031182

Ser

Leu Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala Ala

Ser Gly 25

Phe Thr

Leu

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	147
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	147

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

- 137 031182

Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120125

Ser

Ser

<210>	148
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	148

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210>149 <211>129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama

<400>

149

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

- 138 031182

Ala

Ile Gly 35

Trp

Phe Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg Glu 45

Gly

Val

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	150
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	150

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

- 139 031182

115

Ser

120

125

<210>	151
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	151

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 152 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama

<400>

152

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

- 140 031182

Ala

Ile Gly 35

Trp

Phe Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg Glu 45

Gly

Val

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	153
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	153

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

- 141 031182

Ser

<210>	154
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	154

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Ile

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 155 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 155

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

- 142 031182

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	156
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	156

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

- 143 031182 <210> 157 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400>157

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Ala

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Asp

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210>158 <211>129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 158

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

- 144 031182

Ser Ala

Ile

Arg Asp Asn

Gly Gly 55

Ser Thr Tyr

Tyr 60

Ala Asp

Ser

Val

50

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	159
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	159

Asp 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

- 145 031182 <210> 160 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 160

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 161 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 161

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

- 146 031182

55 60

Lys 65

Gly Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Ser

Asp Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	162
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	162

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Glu

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 163

- 147 031182

<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	163

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 164 <211> 129 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 164

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Asp

Asn

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

- 148 031182

Lys 65

Gly Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Ser

Asp Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	165
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	165

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Glu

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser <210> 166 <211> 129 <212> PRT

- 149 031182 <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 166

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Tyr

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210>	167
<211>	129
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	167

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Gly

Trp

Phe

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Gly

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Arg

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

- 150 031182

70 75 80

Leu

Gln Met

Asn

Ser 85

Leu Arg

Pro

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Glu

Gln

Trp

Tyr

Pro

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Asp

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

<210> <211> <212> <213>

168 5 PRT Искусственная

<220> <223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	168

Asp Tyr Ala Ile Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	169 5 PRT Искусственная

<220> <223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	169

Asp Tyr Ala Leu Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	170 5 PRT Искусственная

<220> <223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	170

Tyr Tyr Ala Ile Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	171 17 PRT Искусственная

<220> <223>	Мутантная последовательность Lama
<400>	171

- 151 031182

Ala Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 10 15

Gly

<210>	172
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность	Lama
<400>	172
Cys Ile Arg Cys Ser Gly Gly Ser Thr	Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210>	173
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность	Lama
<400>	173
Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ile Thr	Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210>	174
<211>	20
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность	Lama
<400>	174
Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Phe Gly	Glu Gln Trp Tyr	Pro Leu Tyr
1	5	10	15

Glu Tyr Asp Ala

<210>	175
<211>	20
<212>	PRT
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Мутантная последовательность Lama

- 152 031182 <400>175

Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Tyr Gly Glu Gln Trp Tyr Pro Ile Tyr

5 1015

Glu Tyr Asp Ala <210>176 <211>15 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400>176

Ser Ile Val Pro Arg Ser Lys Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp Ala

5 1015 <210>177 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400>177

Asp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asp Cys Ser Gly Leu Gly Tyr Asp

5 1015

Tyr <210>178 <211>387 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 178

gaggtacagc	tggtcgagtc	aggtggcgga	ttagtgcagc	ctgggggttc	tctgcgctta	60
tcttgtgccg	catcaggctt	cacactggat	gactacgcca	tcggctggtt	ccggcaagcg	120
cctggaaaag	aacgcgaagg	tgtttcagca	atccgttcaa	gcggtggttc	aacatattac	180
gccgactctg	ttaaaggacg	cttcaccatt	agctccgaca	atagtaaaaa	tacagtctac	240
ttacaaatga	acagtttacg	cccagaagat	actgcggtat	actattgcgc	tgccgtgcct	300
gctggtcgct	tacgctttgg	cgagcaatgg	tatcctctgt	acgagtacga	cgcctgggga	360
cagggtacgc	tggtaacggt	ttcaagc				387

<210>	179
<211>	387
<212>	ДНК

- 153 031182 <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 179

gaagtgcaac	tggttgagtc	aggtggcgga	ctggtgcaac	cgggtggttc	actgcgcctg	60
agttgcgcag	ttagcggtat	taccctggat	gattatgcaa	ttggttggtt	tcgccaagcc	120
ccaggcaaag	agcgtgaagg	cgttagcgca	attcgtagca	gcggtggtag	cacctattat	180
gccgattcag	ttaaaggccg	ttttacgatc	agcagcgata	acagtaaaaa	cacggtttat	240
ctgcaaatga	actcattacg	tccagaggac	actgcagttt	actattgcgc	agcagttccg	300
gcaggtcgtc	tgcgttatgg	tgaacagtgg	tatccgattt	atgaatatga	tgcatggggt	360
caaggtacac	tggttacagt	gagtagc				387

<210> 180 <211> 372 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 180

gaagtgcagt	tagtcgaaag	tggcggaggc	ctggtacaac	ctggtggcag	tctgcgctta	60
tcttgtgccg	cttcaggttt	tacattcgac	gactacgccc	tggggtggtt	ccggcaagcg	120
cctggaaaag	aacgtgaggg	cgtttcatgc	attcgttgtt	caggtggttc	aacctattat	180
gccgatagtg	taaaaggtcg	gttcaccatt	agtagcgaca	atagcaagaa	tacagtctat	240
ctgcaaatga	actctttacg	tcctgaagat	actgcggtgt	actactgcgc	tgcatcaatc	300
gttcctcgtt	caaaacttga	accttacgag	tacgacgcct	ggggtcaggg	tacgttagta	360
acggtgtcaa	gc					372

<210> 181 <211> 378 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Lama <400> 181

gaagtgcaac	tggttgagtc	aggtggcggt	ttagtgcaac	cgggtggttc	actgcgcctg	60
agttgcgcag	ccagcggttt	tgcactggat	tattatgcaa	ttggttggtt	tcgccaagcc	120
ccaggcaaag	agcgtgaagg	cgttagctgt	attagcagca	gcggtggtat	tacctattat	180
gccgattcag	ttaaaggccg	ttttacgatc	tctcgtgata	atagtaaaaa	cacggtttac	240
ctgcagatga	actcattaag	accagaggac	actgcagttt	actattgtgc	aaccgatagc	300
ggtggctata	ttgattatga	ttgtagcggt	ctgggctacg	attattgggg	acaaggtacg	360
ctggtgacag	ttagcagc					378

<210> 182

- 154 031182 <211> 3375 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 182

atggactctt	tagccagctt	agttctctgt	ggagtcagct	tgctcctttc	tggaactgtg	60
gaaggtgcca	tggacttgat	cttgatcaat	tccctacctc	ttgtatctga	tgctgaaaca	120
tctctcacct	gcattgcctc	tgggtggcgc	ccccatgagc	ccatcaccat	aggaagggac	180
tttgaagcct	taatgaacca	gcaccaggat	ccgctggaag	ttactcaaga	tgtgaccaga	240
gaatgggcta	aaaaagttgt	ttggaagaga	gaaaaggcta	gtaagatcaa	tggtgcttat	300
ttctgtgaag	ggcgagttcg	aggagaggca	atcaggatac	gaaccatgaa	gatgcgtcaa	360
caagcttcct	tcctaccagc	tactttaact	atgactgtgg	acaagggaga	taacgtgaac	420
atatctttca	aaaaggtatt	gattaaagaa	gaagatgcag	tgatttacaa	aaatggttcc	480
ttcatccatt	cagtgccccg	gcatgaagta	cctgatattc	tagaagtaca	cctgcctcat	540
gctcagcccc	aggatgctgg	agtgtactcg	gccaggtata	taggaggaaa	cctcttcacc	600
tcggccttca	ccaggctgat	agtccggaga	tgtgaagccc	agaagtgggg	acctgaatgc	660
aaccatctct	gtactgcttg	tatgaacaat	ggtgtctgcc	atgaagatac	tggagaatgc	720
atttgccctc	ctgggtttat	gggaaggacg	tgtgagaagg	cttgtgaact	gcacacgttt	780
ggcagaactt	gtaaagaaag	gtgcagtgga	caagagggat	gcaagtctta	tgtgttctgt	840
ctccctgacc	cctatgggtg	ttcctgtgcc	acaggctgga	agggtctgca	gtgcaatgaa	900
gcatgccacc	ctggttttta	cgggccagat	tgtaagctta	ggtgcagctg	caacaatggg	960
gagatgtgtg	atcgcttcca	aggatgtctc	tgctctccag	gatggcaggg	gctccagtgt	1020
gagagagaag	gcataccgag	gatgacccca	aagatagtgg	atttgccaga	tcatatagaa	1080
gtaaacagtg	gtaaatttaa	tcccatttgc	aaagcttctg	gctggccgct	acctactaat	1140
gaagaaatga	ccctggtgaa	gccggatggg	acagtgctcc	atccaaaaga	ctttaaccat	1200
acggatcatt	tctcagtagc	catattcacc	atccaccgga	tcctcccccc	tgactcagga	1260
gtttgggtct	gcagtgtgaa	cacagtggct	gggatggtgg	aaaagccctt	caacatttct	1320
gttaaagttc	ttccaaagcc	cctgaatgcc	ccaaacgtga	ttgacactgg	acataacttt	1380
gctgtcatca	acatcagctc	tgagccttac	tttggggatg	gaccaatcaa	atccaagaag	1440
cttctataca	aacccgttaa	tcactatgag	gcttggcaac	atattcaagt	gacaaatgag	1500
attgttacac	tcaactattt	ggaacctcgg	acagaatatg	aactctgtgt	gcaactggtc	1560
cgtcgtggag	agggtgggga	agggcatcct	ggacctgtga	gacgcttcac	aacagcttct	1620
atcggactcc	ctcctccaag	aggtctaaat	ctcctgccta	aaagtcagac	cactctaaat	1680
ttgacctggc	aaccaatatt	tccaagctcg	gaagatgact	tttatgttga	agtggagaga	1740
aggtctgtgc	aaaaaagtga	tcagcagaat	attaaagttc	caggcaactt	gacttcggtg	1800
ctacttaaca	acttacatcc	cagggagcag	tacgtggtcc	gagctagagt	caacaccaag	1860
gcccaggggg	aatggagtga	agatctcact	gcttggaccc	ttagtgacat	tcttcctcct	1920
caaccagaaa	acatcaagat	ttccaacatt	acacactcct	cggctgtgat	ttcttggaca	1980

- 155 031182

atattggatg	gctattctat	ttcttctatt	actatccgtt	acaaggttca	aggcaagaat	2040
gaagaccagc	acgttgatgt	gaagataaag	aatgccacca	tcattcagta	tcagctcaag	2100
ggcctagagc	ctgaaacagc	ataccaggtg	gacatttttg	cagagaacaa	catagggtca	2160
agcaacccag	ccttttctca	tgaactggtg	accctcccag	aatctcaagc	accagcggac	2220
ctcggagggg	ggaagatgct	gcttatagcc	atccttggct	ctgctggaat	gacctgcctg	2280
actgtgctgt	tggcctttct	gatcatattg	caattgaaga	gggcaaatgt	gcaaaggaga	2340
atggcccaag	ccttccaaaa	cgtgagggaa	gaaccagctg	tgcagttcaa	ctcagggact	2400
ctggccctaa	acaggaaggt	caaaaacaac	ccagatccta	caatttatcc	agtgcttgac	2460
tggaatgaca	tcaaatttca	agatgtgatt	ggggagggca	attttggcca	agttcttaag	2520
gcgcgcatca	agaaggatgg	gttacggatg	gatgctgcca	tcaaaagaat	gaaagaatat	2580
gcctccaaag	atgatcacag	ggactttgca	ggagaactgg	aagttctttg	taaacttgga	2640
caccatccaa	acatcatcaa	tctcttagga	gcatgtgaac	atcgaggcta	cttgtacctg	2700
gccattgagt	acgcgcccca	tggaaacctt	ctggacttcc	ttcgcaagag	ccgtgtgctg	2760
gagacggacc	cagcatttgc	cattgccaat	agcaccgcgt	ccacactgtc	ctcccagcag	2820
ctccttcact	tcgctgccga	cgtggcccgg	ggcatggact	acttgagcca	aaaacagttt	2880
atccacaggg	atctggctgc	cagaaacatt	ttagttggtg	aaaactatgt	ggcaaaaata	2940
gcagattttg	gattgtcccg	aggtcaagag	gtgtacgtga	aaaagacaat	gggaaggctc	3000
ccagtgcgct	ggatggccat	cgagtcactg	aattacagtg	tgtacacaac	caacagtgat	3060
gtatggtcct	atggtgtgtt	actatgggag	attgttagct	taggaggcac	accctactgc	3120
gggatgactt	gtgcagaact	ctacgagaag	ctgccccagg	gctacagact	ggagaagccc	3180
ctgaactgtg	atgatgaggt	gtatgatcta	atgagacaat	gctggcggga	gaagccttat	3240
gagaggccat	catttgccca	gatattggtg	tccttaaaca	gaatgttaga	ggagcgaaag	3300
acctacgtga	ataccacgct	ttatgagaag	tttacttatg	caggaattga	ctgttctgct	3360
gaagaagcgg	cctag					3375

<210> 183 <211> 4654 <212> ДНК <213> Мышь <400> 183

gagcaggagc	cggagcagga	gcagaagata	agccttggat	gaagggcaag	atggataggg	60
ctcgctctgc	cccaagccct	gctgatacca	agtgccttta	agatacagcc	tttcccatcc	120
taatctgcaa	aggaaacagg	aaaaaggaac	ttaaccctcc	ctgtgctcag	acagaaatga	180
gactgttacc	gcctgcttct	gtggtgtttc	tccttgccgc	caacttgtaa	acaagagcga	240
gtggaccatg	cgagcgggaa	gtcgcaaagt	tgtgagttgt	tgaaagcttc	ccagggactc	300
atgctcatct	gtggacgctg	gatggggaga	tctggggaag	tatggactct	ttagccggct	360
tagttctctg	tggagtcagc	ttgctccttt	atggagtagt	agaaggcgcc	atggacctga	420

- 156 031182

tcttgatcaa	ttccctacct	cttgtgtctg	atgccgaaac	atccctcacc	tgcattgcct	480
ctgggtggca	cccccatgag	cccatcacca	taggaaggga	ctttgaagcc	ttaatgaacc	540
agcaccaaga	tccactggag	gttactcaag	atgtgaccag	agaatgggcg	aaaaaagttg	600
tttggaagag	agaaaaggcc	agtaagatta	atggtgctta	tttctgtgaa	ggtcgagttc	660
gaggacaggc	tataaggata	cggaccatga	agatgcgtca	acaagcatcc	ttcctacctg	720
ctactttaac	tatgaccgtg	gacaggggag	ataatgtgaa	catatctttc	aaaaaggtgt	780
taattaaaga	agaagatgca	gtgatttaca	aaaatggctc	cttcatccac	tcagtgcccc	840
ggcatgaagt	acctgatatt	ttagaagttc	acttgccgca	tgctcagccc	caggatgctg	900
gtgtgtactc	ggccaggtac	ataggaggaa	acctgttcac	ctcagccttc	accaggctga	960
ttgttcggag	atgtgaagct	cagaagtggg	ggcccgactg	tagccgtcct	tgtactactt	1020
gcaagaacaa	tggagtctgc	catgaagata	ccggggaatg	catttgccct	cctgggttta	1080
tggggagaac	atgtgagaaa	gcttgtgagc	cgcacacatt	tggcaggacc	tgtaaagaaa	1140
ggtgtagtgg	accagaagga	tgcaagtctt	atgtgttctg	tctcccagac	ccttacgggt	1200
gttcctgtgc	cacaggctgg	agggggttgc	agtgcaatga	agcatgccca	tctggttact	1260
acggaccaga	ctgtaagctc	aggtgccact	gtaccaatga	agagatatgt	gatcggttcc	1320
aaggatgcct	ctgctctcaa	ggatggcaag	ggctgcagtg	tgagaaagaa	ggcaggccaa	1380
ggatgactcc	acagatagag	gatttgccag	atcacattga	agtaaacagt	ggaaaattta	1440
accccatctg	caaagcctct	gggtggccac	tacctactag	tgaagaaatg	accctagtga	1500
agccagatgg	gacagtgctc	caaccaaatg	acttcaacta	tacagatcgt	ttctcagtgg	1560
ccatattcac	tgtcaaccga	gtcttacctc	ctgactcagg	agtctgggtc	tgcagtgtga	1620
acacagtggc	tgggatggtg	gaaaagcctt	tcaacatttc	cgtcaaagtt	cttccagagc	1680
ccctgcacgc	cccaaatgtg	attgacactg	gacataactt	tgctatcatc	aatatcagct	1740
ctgagcctta	ctttggggat	ggacccatca	aatccaagaa	gcttttctat	aaacctgtca	1800
atcaggcctg	gaaatacatt	gaagtgacga	atgagatttt	cactctcaac	tacttggagc	1860
cgcggactga	ctacgagctg	tgtgtgcagc	tggcccgtcc	tggagagggt	ggagaagggc	1920
atcctgggcc	tgtgagacga	tttacaacag	cgtctatcgg	actccctcct	ccaagaggtc	1980
tcagtctcct	gccaaaaagc	cagacagctc	taaatttgac	ttggcaaccg	atatttacaa	2040
actcagaaga	tgaattttat	gtggaagtcg	agaggcgatc	cctgcaaaca	acaagtgatc	2100
agcagaacat	caaagtgcct	gggaacctga	cctcggtgct	actgagcaac	ttagtcccca	2160
gggagcagta	cacagtccga	gctagagtca	acaccaaggc	gcagggggag	tggagtgaag	2220
aactcagggc	ctggaccctt	agtgacattc	tccctcctca	accagaaaac	atcaagatct	2280
ccaacatcac	tgactccaca	gctatggttt	cttggacaat	agtggatggc	tattcgattt	2340
cttccatcat	catccggtat	aaggttcagg	gcaaaaatga	agaccagcac	attgatgtga	2400
agatcaagaa	tgctaccgtt	actcagtacc	agctcaaggg	cctagagcca	gagactacat	2460
accatgtgga	tatttttgct	gagaacaaca	taggatcaag	caacccagcc	ttttctcatg	2520

- 157 031182

aactgaggac	gcttccacat	tccccagcct	ctgcagacct	cggaggggga	aagatgctac	2580
tcatagccat	ccttgggtcg	gctggaatga	cttgcatcac	cgtgctgttg	gcgtttctga	2640
ttatgttgca	actgaagaga	gcaaatgtcc	aaaggagaat	ggctcaggca	ttccagaacg	2700
tgagagaaga	accagctgtg	cagtttaact	caggaactct	ggcccttaac	aggaaggcca	2760
aaaacaatcc	ggatcccaca	atttatcctg	tgcttgactg	gaatgacatc	aagtttcaag	2820
acgtgatcgg	agagggcaac	tttggccagg	ttctgaaggc	acgcatcaag	aaggatgggt	2880
tacggatgga	tgccgccatc	aagaggatga	aagagtatgc	ctccaaagat	gatcacaggg	2940
acttcgcagg	agaactggag	gttctttgta	aacttggaca	ccatccaaac	atcattaatc	3000
tcttgggagc	atgtgaacac	cgaggctatt	tgtacctagc	tattgagtat	gccccgcatg	3060
gaaacctcct	ggacttcctg	cgtaagagca	gagtgctaga	gacagaccct	gcttttgcca	3120
tcgccaacag	tacagcttcc	acactgtcct	cccaacagct	tcttcatttt	gctgcagatg	3180
tggcccgggg	gatggactac	ttgagccaga	aacagtttat	ccacagggac	ctggctgcca	3240
gaaacatttt	agttggtgaa	aactacatag	ccaaaatagc	agattttgga	ttgtcacgag	3300
gtcaagaagt	gtatgtgaaa	aagacaatgg	gaaggctccc	agtgcgttgg	atggcaatcg	3360
aatcactgaa	ctatagtgtc	tatacaacca	acagtgatgt	ctggtcctat	ggtgtattgc	3420
tctgggagat	tgttagctta	ggaggcaccc	cctactgcgg	catgacgtgc	gcggagctct	3480
atgagaagct	accccagggc	tacaggctgg	agaagcccct	gaactgtgat	gatgaggtgt	3540
atgatctaat	gagacagtgc	tggagggaga	agccttatga	gagaccatca	tttgcccaga	3600
tattggtgtc	cttaaacagg	atgctggaag	aacggaagac	atacgtgaac	accacactgt	3660
atgagaagtt	tacctatgca	ggaattgact	gctctgcgga	agaagcagcc	tagagcagaa	3720
ctcttcatgt	acaacggcca	tttctcctca	ctggcgcgag	agcgccttga	cacctgtacc	3780
aagcaagcca	cccactgcca	agagatgtga	tatataagtg	tatatattgt	gctgtgtttg	3840
ggaccctcct	catacagctc	gtgcggatct	gcagtgtgtt	ctgactctaa	tgtgactgta	3900
tatactgctc	ggagtaagaa	tgtgctaaga	tcagaatgcc	tgttcgtggt	ttcatataat	3960
atatttttct	aaaagcatag	attgcacagg	aaggtatgag	tacaaatact	gtaatgcata	4020
acttgttatt	gtcctagatg	tgtttgatat	ttttccttta	caactgaatg	ctataaaagt	4080
gttttgctgt	gtacacataa	gatactgttc	gttaaaataa	gcattccctt	gacagcacag	4140
gaagaaaagc	gagggaaatg	tatggattat	attaaatgtg	ggttactaca	caagaggccg	4200
aacattccaa	gtagcagaag	agagggtctc	tcaactctgc	tcctcacctg	cagaagccag	4260
tttgtttggc	catgtgacaa	ttgtcctgtg	tttttatagc	acccaaatca	ttctaaaata	4320
tgaacatcta	aaaactttgc	taggagacta	agaacctttg	gagagataga	tataagtacg	4380
gtcaaaaaac	aaaactgtgg	gacttacatt	tattttctat	agtaatctgt	tgtacatttt	4440
aagaagtaaa	actaggaatt	taggagtgat	gtgtgacatt	tctgacatgg	agttaccatc	4500
cccacatgta	tcacatactg	tcatattccc	acatgtatca	cacatgtatt	gtaaaatttt	4560
gtagttttga	tcacttgtga	atttactgtt	gatgtggtag	ccacctgctg	caatggttcc	4620

- 158 031182 tcttgtaggt gaataaatgt cttgtctacc caca <210> 184 <211> 3378 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Мутантная последовательность Cyno (циномолгус) <400> 184

4654

atggacagcc	tggccagcct	ggtgctgtgc	ggagtgtccc	tgctgctgag	cggcacagtg
gaaggcgcca	tggacctgat	cctgatcaac	tccctgcccc	tggtgtccga	cgccgagaca
agcctgacct	gtatcgctag	cggctggcac	ccccacgagc	ctatcaccat	cggccgggac
ttcgaggccc	tgatgaacca	gcaccaggac	cccctggaag	tgacccagga	cgtgacccgc
gagtgggcca	agaaagtcgt	gtggaagaga	gagaaggcca	gcaagatcaa	cggcgcctac
ttctgcgagg	gcagagtgcg	gggcgaggcc	atcagaatcc	ggacaatgaa	gatgcggcag
caggccagct	tcctgcccgc	caccctgacc	atgaccgtgg	acaagggcga	caacgtgaac
atcagcttca	agaaggtgct	gatcaaagaa	gaggacgccg	tcatctacaa	gaacggcagc
ttcatccaca	gcgtgccccg	gcacgaggtg	cccgacatcc	tggaagtgca	tctgccccac
gcccagcctc	aggatgccgg	cgtgtacagc	gcccggtaca	tcggcggcaa	cctgttcacc
agcgccttca	cccggctgat	cgtgcggaga	tgcgaggccc	agaaatgggg	ccctgagtgt
aaccggctgt	gcaccgtgtg	cgtgaacaac	ggcgtgtgcc	acgaggacac	cggcgagtgc
atctgtcctc	ccggcttcat	gggccggacc	tgcgagaagg	cctgcgagag	acacaccttc
ggcagaacct	gcaaagagcg	gtgtagcggc	caggacggct	gcaagagcta	cgtgttctgc
ctgcccgacc	cctacggctg	cagctgtgcc	acaggctgga	agggcctgca	gtgcaacgag
gcctgccacc	acggcttcta	cggccccgac	tgcaagctgc	ggtgcagctg	cagcaacggc
gagacatgcg	accggttcca	gggatgcctg	tgcagccctg	gcagacaggg	actccagtgc
gagcgcgagg	gcatccccag	aatgaccccc	aagatcgtgg	acctgcccga	tcacatcgaa
gtgaacagcg	gcaagttcaa	ccccatctgc	aaggcctccg	gctggcccct	gcccaccaac
gaagagatga	ccctggtcaa	gcccgacggc	accgtgctgc	accccaagga	cttcaaccac
accgaccact	tcagcgtggc	catcttcacc	atccaccgga	tcctgccccc	cgactctggc
gtgtgggtct	gcagcgccaa	taccgtggcc	ggcatggtgg	aaaagccctt	caacatcagc
gtgaaggtgc	tgcccaagcc	cctgaacgcc	cccaacgtga	tcgacaccgg	ccacaacttc
gccgtgatca	acatctccag	cgagccctac	ttcggcgacg	gccccatcaa	gagcaagaag
ctgctgtaca	agcccgtgaa	ccactacgag	gcctggcggc	acatccaggt	cacaaacgag
atcgtgaccc	tgaaccacct	ggaaccccgg	accgagtacg	agctgtgcgt	gcagctcgtg
cggaggggcg	aaggcggcga	aggacatcct	ggccccgtgc	gcagattcac	caccgcctct
atcggcctgc	ccccacccag	aggcctgaac	ctgctgccta	agagccagac	caccctgaac
ctgacctggc	agcccatctt	ccccagcagc	gaggacgact	tctacgtgga	agtggaacgg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

- 159 031182

cggagcgtgc	agaagtccga	ccagcagaac	atcaaggtgc	ccggcaacct	gaccagcgtg	1800
ctgctgaaca	acctgcaccc	ccgcgagcag	tacgtcgtgc	gggccagagt	gaacaccaag	1860
gcccagggcg	agtggtccga	ggatctgacc	gcctggaccc	tgagcgacat	cctgcctccc	1920
cagcccgaga	atatcaaaat	cagcaacatc	acccacagca	gcgccgtgat	ctcttggacc	1980
atcctggacg	gctacagcat	cagctccatc	accatccggt	acaaggtgca	gggcaagaac	2040
gaggaccagc	acatcgacgt	gaagatcaag	aacgccacca	tcacccagta	ccagctgaag	2100
ggcctggaac	ccgagacagc	ctaccaggtg	gacatcttcg	ccgagaacaa	tatcggcagc	2160
agcaaccccg	ccttcagcca	cgagctggtc	accctgcccg	agtctgaggc	ccctgctgat	2220
ctgggcggag	gcaagatgct	gctgatcgcc	atcctgggca	gcgccggcat	gacctgtctg	2280
acagtgctgc	tggccttcct	gatcatcctg	cagctgaagc	gggccaacgt	gcagcggaga	2340
atggcccagg	ccttccagaa	cgtgcgcgag	gaacccgccg	tgcagttcaa	cagcggcacc	2400
ctggccctga	accggaaagt	gaagaacaac	cccgacccca	ccatctaccc	cgtgctggac	2460
tggaacgaca	tcaagttcca	ggatgtgatc	ggcgagggca	acttcggcca	ggtgctgaag	2520
gcccggatca	agaaagacgg	cctgcggatg	gacgccgcca	tcaagcggat	gaaggaatac	2580
gccagcaagg	acgaccacag	agacttcgcc	ggggagctgg	aagtgctgtg	caagctgggc	2640
caccacccca	acatcatcaa	cctgctgggc	gcctgcgagc	accggggcta	tctgtacctg	2700
gccatcgagt	acgcccccca	cggcaatctg	ctggatttcc	tgcggaagtc	ccgggtgctg	2760
gaaaccgacc	ctgccttcgc	cattgccaac	agcaccgcca	gcaccctgag	cagccagcag	2820
ctcctgcact	tcgccgccga	tgtggccaga	ggcatggact	acctgagcca	gaagcagttc	2880
atccaccggg	acctggccgc	cagaaacatc	ctcgtgggcg	agaactacgt	ggccaagatc	2940
gccgacttcg	gcctgagcag	aggccaggaa	gtgtacgtca	agaaaaccat	gggccggctg	3000
cccgtgcggt	ggatggccat	tgagagcctg	aactacagcg	tgtacaccac	caacagcgac	3060
gtgtggtcct	acggggtgct	gctgtgggag	atcgtgtctc	tgggcggcac	cccctactgc	3120
ggcatgacat	gcgccgagct	gtacgagaag	ctgccccagg	gctaccggct	ggaaaagcct	3180
ctgaactgcg	acgacgaggt	gttcgacctg	atgcggcagt	gctggcgcga	gaagccctac	3240
gagcggccta	gcttcgccca	gatcctggtg	tccctgaaca	gaatgctgga	agaacgcaag	3300
acctacgtga	acaccaccct	gtatgagaag	ttcacctacg	ccggcatcga	ctgcagcgcc	3360
gaagaggccg	cttgatga					3378

<210> 185 <211> 1491 <212> ДНК <213> Мышь <400> 185

atgtggcaga	tcattttcct	aacttttggc	tgggatcttg	tcttggcctc	agcctacagt	60
aactttagga	agagcgtgga	cagcacaggc	agaaggcagt	accaggtcca	gaacggaccc	120
tgcagctaca	cgttcctgct	gccggagacc	gacagctgcc	gatcttcctc	cagcccctac	180
atgtccaatg	ccgtgcagag	ggatgcaccc	ctcgactacg	acgactcagt	gcaaaggctg	240

- 160 031182

caggtgctgg	agaacattct	agagaacaac	acacagtggc	tgatgaagct	ggagaattac	300
attcaggaca	acatgaagaa	ggagatggtg	gagatccaac	agaatgtggt	gcagaaccag	360
acagctgtga	tgatagagat	tggaaccagc	ttgctgaacc	agacagcagc	acaaactcgg	420
aaactgactg	atgtggaagc	ccaagtacta	aaccagacga	caagactcga	gctgcagctt	480
ctccaacatt	ctatttctac	caacaaattg	gaaaagcaga	ttttggatca	gaccagtgaa	540
ataaacaagc	tacaaaataa	gaacagcttc	ctagaacaga	aagttctgga	catggagggc	600
aagcacagcg	agcagctaca	gtccatgaag	gagcagaagg	acgagctcca	ggtgctggtg	660
tccaagcaga	gctctgtcat	tgacgagctg	gagaagaagc	tggtgacagc	cacggtcaac	720
aactcgctcc	ttcagaagca	gcagcatgac	ctaatggaga	ccgtcaacag	cttgctgacc	780
atgatgtcat	cacccaactc	caagagctcg	gttgctatcc	gtaaagaaga	gcaaaccacc	840
ttcagagact	gtgcggaaat	cttcaagtca	ggactcacca	ccagtggcat	ctacacactg	900
accttcccca	actccacaga	ggagatcaag	gcctactgtg	acatggacgt	gggtggagga	960
gggtggacag	tcatccaaca	ccgagaagat	ggcagtgtgg	acttccagag	gacgtggaaa	1020
gaatacaaag	agggcttcgg	gagccctctg	ggagagtact	ggctgggcaa	tgagtttgtc	1080
tcccagctga	ccggtcagca	ccgctacgtg	cttaagatcc	agctgaagga	ctgggaaggc	1140
aacgaggcgc	attcgctgta	tgatcacttc	tacctcgctg	gtgaagagtc	caactacagg	1200
attcacctta	caggactcac	ggggaccgcg	ggcaaaataa	gtagcatcag	ccaaccagga	1260
agtgatttta	gcacaaagga	ttcggacaat	gacaaatgca	tctgcaagtg	ttcccagatg	1320
ctctcaggag	gctggtggtt	tgacgcatgt	ggtccttcca	acttgaatgg	acagtactac	1380
ccacaaaaac	agaatacaaa	taagtttaac	ggtatcaagt	ggtactactg	gaaggggtcc	1440
ggctactcgc	tcaaggccac	aaccatgatg	atccggccag	cagatttcta	a	1491

<210> 186 <211> 1488 <212> ДНК <213> Cyno <400> 186

atgtggcaga	ttgttttctt	taccctgagc	tgtgatcttg	tcttggccgc	agcctataac	60
aactttcgga	agagcatgga	cagcatagga	aagaagcagt	atcaggtcca	gcatgggtcc	120
tgcagctaca	ctttcctcct	gccagagatg	gacaactgcc	gctcttcctc	cagcccctac	180
gtgtccaatg	ctgtgcagag	ggacgcgccg	ctagaatatg	atgactcggt	gcagaggctg	240
caagtgctgg	agaacatcat	ggaaaacaac	actcagtggc	taatgaagct	tgagaattat	300
atccaggaca	acatgaaaaa	agaaatggta	gagatacagc	agaacgcagt	acagaaccag	360
acggctgtga	tgatagaagt	agtgacgaac	ctgttgaacc	aaacggcgga	gcaaacgcgg	420
aagttaactg	atgtggaagc	ccaagtatta	aaccagacca	caagacttga	acttcagctc	480
ttggaacact	ccctctcgac	aaacaaattg	gaaaaacaga	ttttggacca	gaccagtgaa	540
ataaacaaat	tgcaagataa	gaacagtttc	ctagaaaaga	aggtgctagc	tatggaagac	600

- 161 031182

aagcacatca	tccaactaca	gtcaatcaaa	gaagagaaag	atcagctgca	ggtgttagta	660
tccaagcaaa	attccatcat	tgaagaacta	gaaaaaaaaa	tagtgactgc	cacggtgaat	720
aattcagttc	ttcagaagca	gcaacatgat	ctcatggaga	cagttaataa	cttactgact	780
atgatgtcca	catcaaactc	taaggacccc	actgttgcta	aggaagaaca	aatcagcttc	840
agagactgtg	ctgaagtgtt	caaatcagga	cacaccacga	atggcgtcta	cacgttaaca	900
ctccccaact	ctacagaaga	ggtcaaggcc	tactgtgaca	tggaagctgg	tggaggcggg	960
tggacaatta	ttcagcgacg	tgaggacggc	agcgttgact	ttcagaggac	ttggaaagaa	1020
tataaagtgg	gatttggtaa	cccttcagga	gaatattggc	tgggaaatga	gtttgtttca	1080
caactgacta	atcagcaacg	ctatgtgctt	aaaatacacc	ttaaagactg	ggaagggaac	1140
gaggcttact	cattgtatga	acatttctat	ctctcaagtg	aagaactcaa	ttataggatt	1200
caccttaaag	gacttacagg	gacagccggc	aaaataagca	gcatcagtca	accaggaaat	1260
gattttagca	caaaggatgc	agacaacgac	aaatgtattt	gcaaatgttc	acaaatgcta	1320
acaggaggct	ggtggtttga	tgcatgtggt	ccttccaact	tgaacggaat	gtactatcca	1380
caaaggcaga	acacaaataa	gttcaacggc	attaagtggt	actactggaa	aggctcaggc	1440
tactcgctca	agggcacaac	catgatgatc	cgaccggcag	atttctaa		1488

<210>187 <211>495 <212> PRT <213> Cyno <400>187

Met 1

Trp

Gln

Ile

Val 5

Phe

Phe

Thr

Leu

Ser 10

Cys

Asp

Leu

Val

Leu 15

Ala

Ala

Ala

Tyr

Asn

Asn

Phe

Arg

Lys

Ser

Met

Asp

Ser

Ile

Gly

Lys

Lys

20

25

30

Gln

Tyr

Gln

Val

Gln

His

Gly

Ser

Cys

Ser

Tyr

Thr

Phe

Leu

Leu

Pro

35

40

45

Glu

Met

Asp

Asn

Cys

Arg

Ser

Ser

Ser

Ser

Pro

Tyr

Val

Ser

Asn

Ala

50

55

60

Val

Gln

Arg

Asp

Ala

Pro

Leu

Glu

Tyr

Asp

Asp

Ser

Val

Gln

Arg

Leu

65

70

75

80

Gln

Val

Leu

Glu

Asn

Ile

Met

Glu

Asn

Asn

Thr

Gln

Trp

Leu

Met

Lys

85

90

95

Leu

Glu

Asn

Tyr

Ile

Gln

Asp

Asn

Met

Lys

Lys

Glu

Met

Val

Glu

Ile

100

105

110

Gln

Gln

Asn

Ala

Val

Gln

Asn

Gln

Thr

Ala

Val

Met

Ile

Glu

Val

Val

115

120

125

- 162 031182

Thr

Asn 130

Leu

Leu

Asn

Gln

Thr 135

Ala

Glu

Gln

Thr

Arg 140

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

Glu

Ala

Gln

Val

Leu

Asn

Gln

Thr

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

Gln

Leu

145

150

155

160

Leu

Glu

His

Ser

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

Leu

Glu

Lys

Gln

Ile

Leu

Asp

165

170

175

Gln

Thr

Ser

Glu

Ile

Asn

Lys

Leu

Gln

Asp

Lys

Asn

Ser

Phe

Leu

Glu

180

185

190

Lys

Lys

Val

Leu

Ala

Met

Glu

Asp

Lys

His

Ile

Ile

Gln

Leu

Gln

Ser

195

200

205

Ile

Lys

Glu

Glu

Lys

Asp

Gln

Leu

Gln

Val

Leu

Val

Ser

Lys

Gln

Asn

210

215

220

Ser

Ile

Ile

Glu

Glu

Leu

Glu

Lys

Lys

Ile

Val

Thr

Ala

Thr

Val

Asn

225

230

235

240

Asn

Ser

Val

Leu

Gln

Lys

Gln

Gln

His

Asp

Leu

Met

Glu

Thr

Val

Asn

245

250

255

Asn

Leu

Leu

Thr

Met

Met

Ser

Thr

Ser

Asn

Ser

Lys

Asp

Pro

Thr

Val

260

265

270

Ala

Lys

Glu

Glu

Gln

Ile

Ser

Phe

Arg

Asp

Cys

Ala

Glu

Val

Phe

Lys

275

280

285

Ser

Gly

His

Thr

Thr

Asn

Gly

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

290

295

300

Thr

Glu

Glu

Val

Lys

Ala

Tyr

Cys

Asp

Met

Glu

Ala

Gly

Gly

Gly

Gly

305

310

315

320

Trp

Thr

Ile

Ile

Gln

Arg

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Asp

Phe

Gln

Arg

325

330

335

Thr

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lys

Val

Gly

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Gly

Glu

Tyr

340

345

350

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

Phe

Val

Ser

Gln

Leu

Thr

Asn

Gln

Gln

Arg

Tyr

355

360

365

Val

Leu

Lys

Ile

His

Leu

Lys

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Glu

Ala

Tyr

Ser

370

375

380

Leu

Tyr

Glu

His

Phe

Tyr

Leu

Ser

Ser

Glu

Glu

Leu

Asn

Tyr

Arg

Ile

385

390

395

400

His

Leu

Lys

Gly

Leu

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Ile

Ser

Ser

Ile

Ser

405 410 415

- 163 031182

Gln

Pro

Gly Asn Asp 420

Phe

Ser Thr

Lys Asp 425

Ala

Asp Asn

Asp 430

Lys

Cys

Ile

Cys

Lys

Cys

Ser

Gln

Met

Leu

Thr

Gly

Gly

Trp

Trp

Phe

Asp

Ala

435

440

445

Cys

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

Tyr

Tyr

Pro

Gln

Arg

Gln

Asn

450

455

460

Thr

Asn

Lys

Phe

Asn

Gly

Ile

Lys

Trp

Tyr

Tyr

Trp

Lys

Gly

Ser

Gly

465

470

475

480

Tyr

Ser

Leu

Lys

Gly

Thr

Thr

Met

Met

Ile

Arg

Pro

Ala

Asp

Phe

485 490 495 <210> 188 <211> 496 <212> PRT <213> Мышь

<400> 188

Met

Trp

Gln

Ile

Ile

Phe

Leu

Thr

Phe

Gly

Trp

Asp

Leu

Val

Leu

Ala

1

5

10

15

Ser

Ala

Tyr

Ser

Asn

Phe

Arg

Lys

Ser

Val

Asp

Ser

Thr

Gly

Arg

Arg

20

25

30

Gln

Tyr

Gln

Val

Gln

Asn

Gly

Pro

Cys

Ser

Tyr

Thr

Phe

Leu

Leu

Pro

35

40

45

Glu

Thr

Asp

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Ser

Ser

Pro

Tyr

Met

Ser

Asn

Ala

50

55

60

Val

Gln

Arg

Asp

Ala

Pro

Leu

Asp

Tyr

Asp

Asp

Ser

Val

Gln

Arg

Leu

65

70

75

80

Gln

Val

Leu

Glu

Asn

Ile

Leu

Glu

Asn

Asn

Thr

Gln

Trp

Leu

Met

Lys

85

90

95

Leu

Glu

Asn

Tyr

Ile

Gln

Asp

Asn

Met

Lys

Lys

Glu

Met

Val

Glu

Ile

100

105

110

Gln

Gln

Asn

Val

Val

Gln

Asn

Gln

Thr

Ala

Val

Met

Ile

Glu

Ile

Gly

115

120

125

Thr

Ser

Leu

Leu

Asn

Gln

Thr

Ala

Ala

Gln

Thr

Arg

Lys

Leu

Thr

Asp

130

135

140

Val

Glu

Ala

Gln

Val

Leu

Asn

Gln

Thr

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

Gln

Leu

145

150

155

160

Leu

Gln

His

Ser

Ile

Ser

Thr

Asn

Lys

Leu

Glu

Lys

Gln

Ile

Leu

Asp

- 164 031182

165

170

175

Gln

Thr

Ser Glu 180

Ile

Asn

Lys

Leu

Gln Asn 185

Lys

Asn

Ser

Phe 190

Leu

Glu

Gln

Lys

Val

Leu

Asp

Met

Glu

Gly

Lys

His

Ser

Glu

Gln

Leu

Gln

Ser

195

200

205

Met

Lys

Glu

Gln

Lys

Asp

Glu

Leu

Gln

Val

Leu

Val

Ser

Lys

Gln

Ser

210

215

220

Ser

Val

Ile

Asp

Glu

Leu

Glu

Lys

Lys

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Val

Asn

225

230

235

240

Asn

Ser

Leu

Leu

Gln

Lys

Gln

Gln

His

Asp

Leu

Met

Glu

Thr

Val

Asn

245

250

255

Ser

Leu

Leu

Thr

Met

Met

Ser

Ser

Pro

Asn

Ser

Lys

Ser

Ser

Val

Ala

260

265

270

Ile

Arg

Lys

Glu

Glu

Gln

Thr

Thr

Phe

Arg

Asp

Cys

Ala

Glu

Ile

Phe

275

280

285

Lys

Ser

Gly

Leu

Thr

Thr

Ser

Gly

Ile

Tyr

Thr

Leu

Thr

Phe

Pro

Asn

290

295

300

Ser

Thr

Glu

Glu

Ile

Lys

Ala

Tyr

Cys

Asp

Met

Asp

Val

Gly

Gly

Gly

305

310

315

320

Gly

Trp

Thr

Val

Ile

Gln

His

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Asp

Phe

Gln

325

330

335

Arg

Thr

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lys

Glu

Gly

Phe

Gly

Ser

Pro

Leu

Gly

Glu

340

345

350

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

Phe

Val

Ser

Gln

Leu

Thr

Gly

Gln

His

Arg

355

360

365

Tyr

Val

Leu

Lys

Ile

Gln

Leu

Lys

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Glu

Ala

His

370

375

380

Ser

Leu

Tyr

Asp

His

Phe

Tyr

Leu

Ala

Gly

Glu

Glu

Ser

Asn

Tyr

Arg

385

390

395

400

Ile

His

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Ile

Ser

Ser

Ile

405

410

415

Ser

Gln

Pro

Gly

Ser

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

420

425

430

Cys

Ile

Cys

Lys

Cys

Ser

Gln

Met

Leu

Ser

Gly

Gly

Trp

Trp

Phe

Asp

435

440

445

- 165 031182

Ala

Cys 450

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu 455

Asn

Gly

Gln Tyr

Tyr 460

Pro

Gln

Lys

Gln

Asn

Thr

Asn

Lys

Phe

Asn

Gly

Ile

Lys

Trp

Tyr

Tyr

Trp

Lys

Gly

Ser

465

470

475

480

Gly

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ala

Thr

Thr

Met

Met

Ile

Arg

Pro

Ala

Asp

Phe

485 490 495 <210> 189 <211> 253 <212> PRT <213> Мышь

<400> 189

Met

Glu

Thr

Asp

Thr

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Pro

1

5

10

15

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Asp

Tyr

Lys

Asp

Asp

Asp

Asp

Lys

Gly

Ile

Leu

20

25

30

Glu

Glu

Gln

Thr

Thr

Phe

Arg

Asp

Cys

Ala

Glu

Ile

Phe

Lys

Ser

Gly

35

40

45

Leu

Thr

Thr

Ser

Gly

Ile

Tyr

Thr

Leu

Thr

Phe

Pro

Asn

Ser

Thr

Glu

50

55

60

Glu

Ile

Lys

Ala

Tyr

Cys

Asp

Met

Asp

Val

Gly

Gly

Gly

Gly

Trp

Thr

65

70

75

80

Val

Ile

Gln

His

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Asp

Phe

Gln

Arg

Thr

Trp

85

90

95

Lys

Glu

Tyr

Lys

Glu

Gly

Phe

Gly

Ser

Pro

Leu

Gly

Glu

Tyr

Trp

Leu

100

105

110

Gly

Asn

Glu

Phe

Val

Ser

Gln

Leu

Thr

Gly

Gln

His

Arg

Tyr

Val

Leu

115

120

125

Lys

Ile

Gln

Leu

Lys

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Glu

Ala

His

Ser

Leu

Tyr

130

135

140

Asp

His

Phe

Tyr

Leu

Ala

Gly

Glu

Glu

Ser

Asn

Tyr

Arg

Ile

His

Leu

145

150

155

160

Thr

Gly

Leu

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Ile

Ser

Ser

Ile

Ser

Gln

Pro

165

170

175

Gly

Ser

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ser

Asp

Asn

Asp

Lys

Cys

Ile

Cys

180

185

190

Lys

Cys

Ser

Gln

Met

Leu

Ser

Gly

Gly

Trp

Trp

Phe

Asp

Ala

Cys

Gly

195

200

205

- 166 031182

Pro

Ser Asn 210

Leu Asn

Gly

Gln 215

Tyr Tyr

Pro

Gln

Lys 220

Gln

Asn

Thr

Asn

Lys

Phe

Asn

Gly

Ile

Lys

Trp

Tyr

Tyr

Trp

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

225

230

235

240

Leu

Lys

Ala

Thr

Thr

Met

Met

Ile

Arg

Pro

Ala

Asp

Phe

245

250

<210>

190

<211>

253

<212>

PRT

<213>

Cyno

<400>

190

Met

Glu

Thr

Asp

Thr

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Pro

1

5

10

15

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Asp

Tyr

Lys

Asp

Asp

Asp

Asp

Lys

Gly

Ile

Leu

20

25

30

Glu

Glu

Gln

Ile

Ser

Phe

Arg

Asp

Cys

Ala

Glu

Val

Phe

Lys

Ser

Gly

35

40

45

His

Thr

Thr

Asn

Gly

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

Thr

Glu

50

55

60

Glu

Val

Lys

Ala

Tyr

Cys

Asp

Met

Glu

Ala

Gly

Gly

Gly

Gly

Trp

Thr

65

70

75

80

Ile

Ile

Gln

Arg

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Asp

Phe

Gln

Arg

Thr

Trp

85

90

95

Lys

Glu

Tyr

Lys

Val

Gly

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Gly

Glu

Tyr

Trp

Leu

100

105

110

Gly

Asn

Glu

Phe

Val

Ser

Gln

Leu

Thr

Asn

Gln

Gln

Arg

Tyr

Val

Leu

115

120

125

Lys

Ile

His

Leu

Lys

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Glu

Ala

Tyr

Ser

Leu

Tyr

130

135

140

Glu

His

Phe

Tyr

Leu

Ser

Ser

Glu

Glu

Leu

Asn

Tyr

Arg

Ile

His

Leu

145

150

155

160

Lys

Gly

Leu

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Ile

Ser

Ser

Ile

Ser

Gln

Pro

165

170

175

Gly

Asn

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

Lys

Cys

Ile

Cys

180

185

190

Lys

Cys

Ser

Gln

Met

Leu

Thr

Gly

Gly

Trp

Trp

Phe

Asp

Ala

Cys

Gly

- 167 031182

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

Tyr

Tyr

Pro

Gln

Arg

Gln

Asn

Thr

Asn

210

215

220

Lys

Phe

Asn

Gly

Ile

Lys

Trp

Tyr

Tyr

Trp

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

225

230

235

240

Leu

Lys

Gly

Thr

Thr

Met

Met

Ile

Arg

Pro

Ala

Asp

Phe

245 250

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Ang2-связывающая молекула, содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, в которой указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит три гипервариабельных участка CDR1, CDR2 и CDR3, в которой CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 168-170, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 171-173, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 174-177.

   2. Ang2-связывающая молекула по п.1, в которой:

   (а) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 168, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 174, или в которой (б) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 168, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 175, или в которой (в) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 169, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 172, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 176, или в которой (г) CDR1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 170, CDR2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 173, и CDR3 SEQ ID NO: 177.

   3. Ang2-связывающая молекула по п.1 или 2, в которой указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH или доменное антитело.

   4. Ang2-связывающая молекула по одному из пп.1-3, в которой указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH.

   5. Ang2-связывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой указанный V_HH состоит из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID nO: 167, 166, 129 и 138.

   6. Ang2-связывающая молекула, состоящая из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена по одному из пп.1-5.

   7. Ang2-связывающая молекула по одному из пп.1-6, в которой указанный V_HH, состоящий из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, имеет модификацию на N-конце, где указанная модификация представляет собой делецию первой аминокислоты указанного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.

   8. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Ang2-связывающую молекулу по одному из пп.1-7.

   9. Экспрессионный вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты по п.8.

   10. Клетка-хозяин, предназначенная для экспрессии Ang2-связывающей молекулы по одному из пп.1-7, несущая один или несколько экспрессионных векторов по п.9.

   11. Способ получения Ang2-связывающей молекулы по одному из пп.1-7, включающий следующие стадии:

   (а) трансфекция клетки-хозяина одним или несколькими указанными векторами по п.9, (б) культивирование указанной клетки-хозяина и (в) выделение и очистка указанной Ang2-связывающей молекулы.

   12. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболевания, которое ассоциировано с опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез, и содержащая в качестве действующего вещества одну или несколько указанных Ang2-связывающих молекул по одному из пп.1-7 и по меньшей мере один физиологически приемлемый носитель.

   - 168 031182

   13. Фармацевтическая композиция по п.12, дополнительно содержащая один или несколько дополнительных терапевтических средств, выбранных из группы, содержащей химиотерапевтические средства, терапевтически активные соединения, которые ингибируют ангиогенез, ингибиторы пути трансдукции сигнала и агенты для гормональной терапии.

   14. Фармацевтическая композиция по п.12, предназначенная для лечения рака и злокачественных заболеваний, таких как рак молочной железы, почечноклеточная карцинома, рак яичника и рак поджелудочной железы.

   15. Фармацевтическая композиция по п.12, предназначенная для лечения глазных болезней, таких как возрастная дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия.

   16. Фармацевтическая композиция по п.12, предназначенная для лечения хронической болезни почек, такой как диабетическая нефропатия, постренальная почечная недостаточность, преренальная азо темия и врожденная почечная недостаточность.

   17. Способ лечения рака у пациента, который нуждается в этом, включающий введение указанному пациенту одной или нескольких указанных Ang2-связывающих молекул по одному из пп.1-7 или фармацевтической композиции по одному из пп.12-16.

   Фиг. 1-1Б ♦

   ▼ е

   □

   Т5

   1D01

   ЗА07

   3F02

   7G08

   11В07

   14Н02

   Fab АЬ536 «несоответствуи

   VHH log [М]

   Фиг. 1-1В

   16G09

   21G10

   22С07 ¹·5η

   0.0

   АЬ536 «несоответствующий»

   Фиг. 1-1Г

   - 169 031182

   Фиг. 1-2А ¹·²ί

   1.0Ο°·8α £ 0.6©

   0.40.2 29Β08 πττπ]—ιι ιιιιιΐ]—ττττπιη—ι ι ιιιιιΐ]—ι ι ιιιιιΐ|—γτττιιιι|—Γτττττη—ι ι ιιιιιΐ]

   -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 log [Μ]

   Фиг. 1-2Б

   Фиг. 1-2В

   Фиг. 2-1 А

   Фиг. 2-1 Б

   - 170 031182 log [Μ]

   Фиг. 2-1В

   Фиг. 2-1Г •1D01

   7G08 а 10Н02 ▼11В07 ♦13А02 ▼24В05 □ пептид AMG386 х «несоответствующий»

   VHH

   Фиг. 2-2А

   0.5η 29В08 а 32Н10

   О пептид AMG386 ^х «несоответствующий»

   VHH

   Фиг. 2-2Б

   Фиг. 2-2В

   - 171 031182

   Фиг. 3А

   7G08

   28D10

   37А09

   37F02 пептид AMG386 «несоответствующий» VHH

   Фиг. 3Б

   1D01 пептид AMG386 «несоответствующий» VHH

   1D01 log [М]

   Фиг. 4А

   7G08 пептид AMG386 «несоответствующий» VHH

   Фиг. 4Б

   7G08

   - 172 031182

   10Н02

   1.0η

   0.8- |||||||| .......η I ΙΙ·ΙΙΙΙ| I........ ..... I ιιιιιιΐ) ι I iiini| I iiiiui| I iiiiiii|

   -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 log [M] • 10Η02 □ пептид AMG386 ^χ «несоответствующий » VHH

   1.0-1

   0.80.6Фиг. 4В

   11B07 ui о s s

   0.4• 11B07 □ пептид AMG386 ^x «несоответствующий»

   VHH

   0.20.0-*—r |llllll| I I llllll) I 11ИЛ1| ......... I I llllll) I lllllll] 11111111) I 1111111) I 1111111)

   -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 log [M]

   Фиг. 4Г

   13A02

   1.0-]

   0.8°·⁶- ₀ • 13A02 □ пептид AMG386 ^x «несоответствующий »VHH (Λ s

   z

   0.40.20.0-*—г τττπη—Γττπτη—i rrwiq π ιιιιιη i 11ιιιπ|—ι i iniii|—ι i iiini|—ι 11iini|—r~ri iini|

   -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 log [M]

   Фиг. 4Д

   24B05 • 24B05 □ пептид AMG386 ^x «несоответствующий»

   VHH

   Фиг. 4Е

   - 173 031182

   28D10

   28D10

   VHH пептид AMG386

   Фиг. 4Ж

   37F02 пептид AMG386 «несоответст ву ющи й» VHH

   37А09 пептид AMG386

   Фиг. 4З «несоответствующий»

   Фиг. 4И

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10 00027

   00903

   00904

   00905

   00906

   00907

   00908

   00909

   00910

   00911

   00912

   00913

   00914

   .........I.........I.........I.........I.........I · .a.......I

   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSNGGSTYYA

   .............A..............LDY. . IG.F. . .............A..............LDD. .IG.F. . ............................LDD. .IG.F. . ............................LDD..IG.F.. ............................IDD..IG.F.. ............................IDD..IG.F.. ..........................I.LDD..IG.F.. ..........................I.LDD..IG.F.. ..........................I.IDD.-I6.F.. ..........................I.IDD.-IS-F.. ..........................L.LDD. .IG.F.. ..........................L.LDD. .IG.F.. ..........................L.IDD.-16.F.. ..........................L.IDD. .IG.F..

   ..ER.G..C.RDSD ..ER.G..S.RD.D ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. ..ER.G..S.RD.. . . ER.G. .S.RD ..

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   00027

   00903

   00904

   00905

   00906

   00907

   00908

   00909

   00910

   00911

   00912

   00913

   00914

   80 90 100 110

   .........I.........I . . abc.......I.........I abcdefghi j kl.........| . . . DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR--------------------WGQGTLVTVSS

   ..........S . . D. . . V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA.....Q..... ..........S . . D. . . V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPIYEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPIYEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPIYEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPIYEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPIYEYDA...........

   Фиг. 5

   174 031182 •00042

   00903 а 00904 ♦00905 ▼00906 е 00907 □ AMG386 х «несоответствующий»

   VHH log [М]

   Фиг. 6А

   00042

   00908

   00909

   00910

   00911

   00912

   AMG386 «несоответствующий»

   Фиг. 6Б

   00042

   00913

   00914

   AMG386 несоответствующий»

   00042

   00903

   00904

   00905

   00906

   00907 пептид AMG386 «несоответствующий» VHH

   Фиг. 6В

   Фиг. 7А

   - 175 031182

   Kabat# hVH3-JHcons 1D01

   Kabat# hVH3-JHcons 1D01

   00042

   00908

   00909

   00910 пептид AMG386

   00042

   00913

   00914 пептид AMG386

   Фиг. 7 В

   Фиг. 7Б

   Фиг. 8А

   00912 «несоответствующий» «несоответствующий»

   Kabat# hVH3-JHcons 1D01 00039

   00040

   00049

   00050

   00051

   00921

   00925

   Kabat# hVH3-JHcons 1D01

   00039

   00040

   00049

   00050

   00051

   00921

   00925

   1.5η

   20 30 40 50 60 .........I.........I.........I.........I.........I . .a.......I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSNGGSTYYA .............A.

   ..DD.. LG.F . . DD

   LG.F.. .DD..LG.F..

   LG.F..

   LG.F.. LG.F..

   . .DD. .LG.F. .

   ..DD..LG.F..

   . DD .DD DD

   A.. ER.G. .C.RCSD. A..ER.G..C.RCSD. ...ER.G..C.RCSD. A. .ER.G. .C.RCSD. ...ER.G..C.RCSD C.RCS.

   A..ER.G . . .ER.G..C.RCS

   ...ER.G..C.RCS . I

   100

   .. Iabcdefg

   110 . · I

   80

   .........I.........I . · abc DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR---------------WGQGTLVTVSS

   ..........S. .A. . .V.......KP.........ASIVPRSKLEPYEYDA.....Q.....

   V ........P.........ASIVPRSKLEPYEYDA...........

   V ........P.........ASIVPRSKLEPYEYDA...........

   V ........P.........ASIVPRSKLEPYEYDA...........

   V ........P.........ASIVPRSKLEPYEYDA...........

   V ........P.........ASIVPRSKLEPYEYDA...........

   V ........P.........ASIVPRSKLEPYEYDA...........

   V ........P.........ASIVPRSKLEPYEYDA...........

   s s s s s

   Фиг. 8Б •1D01

   00039 a 00040 ♦00049 ▼00050 e 00051 □ AMG386 x «несоответствующий»

   VHH log [M]

   Фиг. 9-1А

   - 176 031182

   1D01

   00921

   00925

   AMG386

   Фиг. 9-1Б

   1D01

   00039

   00040

   00049

   00050

   00051

   AMG386

   1D01

   00921

   00925

   AMG386

   1D01

   00039

   00040

   00049

   00050

   00051

   AMG386 irr VHH «несоответствующий» VHH «несоответствующий» VHH

   Фиг. 9-2А

   Фиг. 9-2Б

   Фиг. 9-3А «несоответствующий»

   - 177 031182

   1.5-1 • 1D01 00921 а 00925 □ AMG386 х irr VHH log [Μ]

   Фиг. 9-3Б пептид AMG386

   Фиг. 10 «несоответствующий» VHH

   1D01

   00921

   00925

   Rabat# hVH3-JHcons 37F02

   20 30 40 50 60

   .........I.........I.........I.........I.........I . .a.......I

   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGRGLEWVSAISSNGGSTYYA

   Q..........................ALDY. . IG.F......ER.G. .C. . . S|o7]l. . .V

   Rabat# hVH3-JHcons 37F02

   80 90 100 110

   .........I.........I . . abc.......I.........I abcdefghi.........| . . .

   DSVRGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR-----------------WGQGTLVTVSS

   .............A. . . V.......KP.........TpsjGGYIDYDC^GLGYDY.....Q.....

   Фиг. 11А

   Rabat# hVH3-JHcons 37F02

   00044

   00045

   00046

   20 30 40 50 60

   .........I.........I.........I.........I.........I . -a.......I

   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGRGLEWVSAISSNGGSTYYA

   .ALDY. .IG.F... ...ER.G. .C. . . . SD . I. . .V .ALDY. .IG.F... ...ER.G. .c.. , .SD. I. . . . V •ALDY. .IG.F... ...ER.G. .c.. . .SD. I. . .ALDY. .IG.F... ...ER.G. .c.. ,.S..1.. . .V

   Rabat# hVH3-JHcons 37F02

   00044

   00045

   00046

   80 90 100 110

   .........I.........I . . abc.......I.........I abcdefghi.........I . . . DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR-----------------WGQGTLVTVSS

   .............A. . . V.......KP.........TDSGGYIDYDCMGLGYDY.....Q..... .................V........P.........TDSGGYIDYDCMGLGYDY........... .................V........P.........TDSGGYIDYDCMGLGYDY........... .................V........P.........TDSGGYIDYDCMGLGYDY...........

   Фиг. 11 Б

   Rabat# hVH3-JHcons 37F02

   00920

   00924

   00926

   00927

   00928

   00929

   00930

   00931

   ALDY..IG.F.. ALDY..IG.F..

   IG.F..

   IG.F..

   IG.F.. IG.F.. IG.F..

   ALDY. .ALDY .ALDY

   ALDY .ALDY .ALDY..IG.F.. .ALDY..IG.F..

   .... ibK. и. ....ER.G. .c. . .C. . . . su . . S. . л . . . V . I. . . . . . ..ER.G. .C. . . .S. .1. . . . . . ..ER.G. .C. . . .s. .1. . . . . ...ER.G. .c.. . .s. .1.... . . ..ER.G. .c.. . .s. .1. . . . ....ER.G. .c.. . .s. .1.... . ...ER.G. .c.. . .s. .1. . .. . ...ER.G. • C. . . .s. .1. . . .

   Rabat# hVH3-JHcons 37F02

   00920

   00924

   00926

   00927

   00928

   00929

   00930

   00931

   100

   .. Iabcdefghi

   110 . . I

   80 90

   .........I.........I·, abc.......I DSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR-----------------WGQGTLVTVSS

   .............A. . . V.......KP.........TDSGGYIDYDCMGLGYDY.....Q..... .................V........P.........TDSGGYIDYDCMGLGYDY........... .................V. . ......P.........TDSGGYIDYDCMGLGYDY........... .................V........P.........TDSGGYIDYDCQGLGYDY........... .................V........P.........TDSGGYIDYDCRGLGYDY........... .................V........P.........TDSGGYIDYDCSGLGYDY........... .................V........P.........TESGGYIDYDCQGLGYDY........... .................V........P.........TESGGYIDYDCRGLGYDY........... .................V........P.........TESGGYIDYDCSGLGYDY...........

   Фиг. 11В

   178 031182

   37F02

   00044

   00045

   00046

   AMG386

   37F02

   00044

   00045

   00046

   AMG386

   Фиг. 12-2

   37F02

   00044

   00045

   00046

   AMG386

   00920

   00926

   00927

   00928

   00929

   00930

   00931

   AMG386 «несоответствующий» VHH «несоответствующий» VHH

   Фиг. 12-1

   Фиг. 12-3

   Фиг. 13-1А «несоответствующий»

   - 179 031182

   Фиг. 13-1Б

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   Фиг. 13-2

   00920

   00926

   00927

   00928

   00929

   00930

   00931

   I

   Фиг. 13-3 пептид AMG386

   Фиг. 14

   Фиг. 15А

   - 180 031182

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   00025

   00026

   00027

   00041

   00042

   00043

   00048

   00052

   00053

   00054

   00055

   20 30 40 50 60

   .........I.........I.........I.........I.........I . -a.......I EVQLVES GGGLVQPGGS LRLS CAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSNGGSTYYA .............A.

   .............A

   .............A.

   .............A

   Ά.

   ..LDY. .IG.F.... , . .ER.G. .C.RDSD...... . .LDY. .IG.F.... . ..ER.G. .T.RDSD...... ..LDY. .IG.F.... . ..ER.G. ...RDSD...... ..LDY. .IG.F.... . ..ER.G. .S.RD.D...... ..LDY. .IG.F.... . ..ER.G. .S.RD.D...... ..LDY. .IG.F.... . ..ER.G. .S.RD.D...... ..LDY. .IG.F.... ...ER.G. .S.RD.D...... ..LDY. .IG.F.... . ..ER.G. .S.RDSD...... ..LDY. .IG.F.... . ..ER.G. • S.RD.D...... ..LDY. .IG.F.... . . .ER.G. .S.RD.D...... ..LDY. .IG.F.... ...ER.G. .S.RD.D...... ..LDY. .IG.F.... ...ER.G. .S.RD........ 90 100 110

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   00025

   00026

   00027

   00041

   00042

   00043

   00048

   00052

   00053

   00054

   00055

   80

   .........I.........I . .abc.......I.........|abcdefghijkl.........| . . . DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR--------------------WGQGTLVTVSS

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA.....Q.....

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   ..........s. .D. . ..V.... ...KP......... ..........s. .D. . ..V.... ...KP......... ..........s. . D. . ..V.... ...KP......... ..........s. .A. , ..V.... . . ..P......... ..........s. ..V.... . . .. p......... .A. , ..V.... ..... p......... ..........s. • D. , ..V.... . ..KP......... ..........s. .D. , ..V.... . . . . .P......... . D. . ..V.... . . . . p......... ..V.... , . ... p......... ..........S. .D. , ..V.... . . . .KP.........

   Фиг. 15Б

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   00898

   00899

   00900

   00901

   00902

   00919

   00923

   LDY..IG.F.. LDY..IG.F.. LDY

   LDY

   LDY

   IG.F..

   IG.F.. IG.F..

   LDY..IG.F.. LDY..IG.F.. LDY..IG.F..

   ..ER.G.

   . .ER.G.

   ..ER.G.

   ..ER.G.

   ..ER.G

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   00898

   00899

   00900

   00901

   00902

   00919

   00923

   80 90 100 110

   .........I.........I . .abc.......I.........I abcdefghij kl | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR--------------------WGQGTLVTVSS

   ..........S..D...V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA.....Q..... ..........S . . D. . . V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA........... ..........S . . D . . . V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA........... ..........S . . D. . . V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA........... ..........S . . D. . . V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA........... ..........S . . D. . . V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA........... ..........S..D...V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA........... ..........S..D...V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   Фиг. 15В

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   00932

   00933

   00934

   00935

   00936

   00937

   00938

   00956

   Kabat# hVH3-JHcons 28D10

   00932

   00933

   00934

   00935

   00936

   00937

   00938

   00956

   IG.F.. IG.F.. IG.F.. IG.F.. IG.F..

   ..ER.G..C.RDSD . . ER.G. .S.RD . .

   .. ER.G....RD.. ..ER.G....RES.

   ..ER.G....R.S. .. ER.G.... RD..

   ..ER.G....RES. ..ER.G....R.S.

   ..ER.G....R.S.

   80 90 100 110

   .........I.........I . . abc.......I.........I abcdefghij kl.........| . . . DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR--------------------WGQGTLVTVSS

   ..........S..D...V.......KP.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA.....Q..... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPIYEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRYGEQWYPI YEYDA........... ..........S......V........P.........AVPAGRLRFGEQWYPLYEYDA...........

   Фиг. 15Г

   181

   28D10

   00025

   00026

   00027 «несоответствующий» VHH

   1.5η

   Фиг. 16-1А

   0.0 ^J—I—I [ IIниц I I НИЦ I ц ......... I Ц I ПИЩ .........

   О -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 •00027

   00041 а 00042 ♦00043 ▼00048 е 00052 □ AMG386 ^х «несоответствующий»

   VHH log [М]

   Фиг. 16-1Б

   Фиг. 16-1В

   Фиг. 16-2А

   Фиг. 16-2Б

   - 182 031182

   Фиг. 16-2В

   Фиг. 16-3 А •00027

   00041 а 00042 ♦00043 ▼00048 е 00052 □ AMG386 х «несоответствующий»

   VHH log [М]

   Фиг. 16-3Б

   Фиг. 16-3В

   Фиг. 17А • 00027 □ <пептид AMG386 х («несоответствующий»

   VHH

   - 183 031182 ¹·²ί

   1.0- • 00042 □ пептид AMG386 ^χ «несоответствующий»

   VHH πτη—I η Miii|—I ι 111ni|—ι ι inni| -8 -7 -6 -5 log [M] rnq

   Фиг. 17Б

   Фиг. 18-1А

   Фиг. 18-1Б

   00919

   00923

   AMG386

   Фиг. 18-2

   - 184 031182

   00919

   AMG386

   00027

   00898

   00899

   00900

   00901

   00902 пептид AMG386

   Фиг. 19

   00908

   00932

   00933

   00934

   00935

   00936

   AMG386 «несоответствующий» VHH «несоответствующий» VHH

   Фиг. 18-3 «несоответствующий» log [М]

   Фиг. 20-1А

   00908

   00937

   00938

   AMG386

   Фиг. 20-1Б «несоответствующий» VHH

   - 185 031182

   00956

   AMG386

   Фиг. 20-1 В

   00908

   00932

   00933

   00934

   00935

   00936

   AMG386

   00908

   00937

   00938

   AMG386 «несоответствующий» VHH «несоответствующий» VHH

   Фиг. 20-2А «несоответствующий» log [М]

   Фиг. 20-2Б

   Фиг. 20-2В

   - 186 031182

   Фиг. 20-3А • 00908 00937 а 00938 □ AMG386 ^х «несоответствующий»

   VHH

   Фиг. 20-3Б

   Фиг. 20-3В