BR112019022074A2

BR112019022074A2 - Terapia de combinação anticâncer

Info

Publication number: BR112019022074A2
Application number: BR112019022074-7A
Authority: BR
Inventors: Hilberg Frank; Hans Hofmann Marco; Reschke Markus; Solca Flavio
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2020-05-12
Also published as: WO2018220169A1; PH12019502692A1; CA3061053A1; EP3630822A1; AU2018277227A1; CL2019003430A1; IL270905A; US20220340651A1; US11198726B2; KR20200013231A; MX2019014199A; CN110691790A; JP2020521797A; US20180346559A1

Abstract

a presente invenção refere-se ao uso combinado de certas moléculas biespecíficas de ligação a vegf e ang2 com antagonistas de pd1 para o tratamento de câncer. refere-se ainda a composições e kits farmacêuticos compreendendo essas moléculas de ligação e antagonistas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para TERAPIA DE COMBINAÇÃO ANTICÂNCER.

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma terapia combinada no tratamento de câncer e a compostos para uso em tal terapia combinada. Os compostos para combinação são uma molécula de ligação biespecífica, como um derivado de anticorpo e um antagonista de PD-1. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A angiogênese é o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos para fornecer um suprimento sanguíneo nutritivo e um prérequisito para o crescimento e a sobrevivência do tumor sólido. Foram feitas abordagens na terapia do câncer nas quais as principais moléculas envolvidas nas vias angiogênicas são direcionadas. Isso inclui modos de inibição da via de sinalização do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), pois o VEGF é considerado o fator de crescimento angiogênico mais potente.

[003] O câncer de pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer, com quase 1,6 milhão de mortes em todo o mundo em 2012 ou quase 20% da mortalidade por câncer como um todo (Molina et al., Mayo Clin Proc. 2008;83(5):584-594; Chan et al., Transi Lung Cancer Res. 2014;4(1 ):36-54). O tipo mais comum de câncer de pulmão é o câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), responsável por aproximadamente 85% de todos os cânceres de pulmão (Chen et al. Nat Rev Cancer 2014;14:535-546; Nawaz et al. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:229-230). Atualmente, o CPNPC é entendido como compreendendo um conjunto heterogêneo de doenças com características fisiopatológicas diversas, entre elas adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de células escamosas (CEC) e carcinoma de grandes células como os subtipos mais importantes.

[004] Nos últimos anos, diversas novas opções de tratamento

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2/57 para pacientes com doença localmente avançada ou metastática no momento do diagnóstico, além de quimioterapia e radioterapia, foram desenvolvidas para o câncer, especialmente para o CPNPC. Esses novos métodos de tratamento são terapias direcionadas que envolvem, por exemplo, inibidores de pequenas moléculas ou anticorpos monoclonais (mAb) do receptor e são baseadas em alterações das principais vias de sinalização e regulação de células - incluindo alterações nos receptores de tirosina quinases (TKs), como receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e alterações nas vias angiogênicas - frequentes no câncer de pulmão. Muito do trabalho recente tem se concentrado nas mutações do EGFR e na fusão anormal da quinase do linfoma anaplásico (ALK) sendo inibida pelos inibidores da tirosina quinase de EGFR e pelo crizotinibe. Foi demonstrado ainda que a combinação da administração do anticorpo monoclonal bevacizumabe, que tem como alvo o VEGF, com quimioterapia resultou em uma melhora significativa na sobrevida entre pacientes com câncer colorretal (Hurwitz et al. New Eng J Med 2004;350:2335-2342) ou CPNPC avançado não escamoso (Sandler et al. J Clin Oncol 2005 23(16s pt 1):2s). Além das terapias de componentes bloqueadores diretamente envolvidos na via de VEGF, por exemplo, Angiopoietina 2 (Ang2), um ligante do receptor de tirosina quinase Tie2 que controla o remodelamento vascular, permitindo a função de outros fatores angiogênicos, como VEGF, tem sido outro alvo atraente na terapia do câncer.

[005] O documento WO2010/040508 e Kienast et al. (Clin Cancer Res; 19(24), 2013) revelam o vanucizumabe, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-Ang-2 e seu uso no tratamento de câncer.

[006] Os documentos EP2694546 B1 e W02012/131078 A1 referem-se a uma molécula de ligação biespecífica compreendendo um domínio variável único de imunoglobulina de ligação a VEGF e um

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3/57 domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 e ainda um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica, que é usado no tratamento de câncer e outras doenças.

[007] O documento WO2016/170039 A1 refere-se a uma terapia de combinação de um anticorpo que se liga especificamente à angiopoietina 2 com um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de morte programada 1 (PD-1).

[008] O documento WO2016/170040 A1 refere-se a uma terapia de combinação de um anticorpo que se liga especificamente à angiopoietina 2 e um anticorpo que se liga especificamente a VEGF com um anticorpo que se liga especificamente ao ligante de morte programada 1 (PD-L1).

[009] Apesar de todas as abordagens, ainda é necessário melhorar as opções de tratamento para pacientes com câncer. É, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer composições e métodos farmacêuticos em terapia contra o câncer para melhorar a eficácia e aplicabilidade terapêutica.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção fornece um método para o tratamento de um paciente com um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-Ang-2 junto com um antagonista contra a Morte Programada 1 (PD-1) - uma proteína imunoinibidora que regula negativamente os sinais do receptor de células T. O tratamento leva a uma redução significativa do crescimento do tumor ou mesmo ao encolhimento do tumor (Figura 1). Portanto, a presente invenção fornece uma terapia de combinação compreendendo um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-Ang-2 e um antagonista de PD-1.

[0011] Em um aspecto detalhado, a presente invenção refere-se a um método de tratamento e/ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, em particular câncer ou uma doença tumoral,

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4/57 compreendendo a administração a um paciente em necessidade de

a) uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto

A, e

b) uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto

B, em que o O composto A é uma molécula de ligação biespecífica compreendendo o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF, o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica, e o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 em que o o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF possui as seguintes sequências de CDR:

o CDR1: SYSMG (SEQ ID NO: 1) o CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG (SEQ ID NO: 2) o CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY (SEQ ID NO: 3) o o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica possui as seguintes sequências de CDR:

o CDR1: SFGMS (SEQ ID NO: 4) o CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 5) o CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO: 6), o o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 possui as seguintes sequências de CDR:

o CDR1: DYAIG (SEQ ID NO: 7) o CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 8) o CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO: 9) e

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5/57 em que o O composto B é um antagonista de PD-1.

[0012] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece um Composto A e um Composto B, cada um para uso em um método de tratamento e/ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, o dito método compreendendo a administração do Composto A e Composto B a um paciente em necessidade do mesmo.

[0013] A presente invenção refere-se ainda ao uso do Composto A e do Composto B, cada um para preparar uma composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, em que o Composto A e o Composto B são destinados ou administrados para administração combinada do Composto A e Composto B.

[0014] Em outro aspecto, a presente invenção revela uma composição farmacêutica compreendendo

a) Composto A e

b) Composto B em que • O composto A é uma molécula de ligação biespecífica compreendendo o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF, o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica, e o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2, em que • o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF possui as seguintes sequências de CDR:

o CDR1: SYSMG (SEQ ID NO: 1)

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6/57 o CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG (SEQ ID NO: 2) o CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY (SEQ ID NO: 3) • o dito domínio variável único de imunoglobulina de liga- ção à albumina sérica possui as seguintes sequências de CDR:

o CDR1: SFGMS (SEQ ID NO: 4) o CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 5) o CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO: 6), • o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 possui as seguintes sequências de CDR:

o CDR1: DYAIG (SEQ ID NO: 7) o CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 8) o CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO: 9) e em que o O composto B é um antagonista de PD-1.

[0015] Em aspecto adicional, a presente invenção relaciona-se a um kit compreendendo

a) uma primeira composição farmacêutica compreendendo o Composto A e

b) uma segunda composição farmacêutica compreendendo o Composto B, em que o composto A e o composto B são definidos conforme acima.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] A Figura 1 mostra a inibição do crescimento do tumor após o tratamento de 9 indivíduos de teste (triângulos abertos, linhas inferiores) com a molécula de ligação biespecífica VEGFANGBII22 (composto A) (dose: 15 mg/kg; cronograma: a cada 3-4 dias) (A-B) e o anticorpo CrossMab anti-VEGF/anti-Ang-2 (vanucizumabe) (dose: 15 mg/kg; cronograma: a cada 3-4 dias), conforme definido no documento WQ2010/040508 ou Kienast et al. (2013, supra) (C-D), respectivamen

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7/57 te, em combinação com o anticorpo anti-PD-1 murino de rato lgG2a EX 101359 (clone RMP1-14) (dose: 10 mg/kg; cronograma: a cada 3-4 dias), em comparação com 9 indivíduos não tratados (círculos preenchidos, linhas superiores). Os indivíduos tratados foram posteriormente administrados com o inibidor de tirosina quinase de pequenas moléculas vatalanibe (EXBF003) (dose: 100 mg/kg; cronograma; uma vez por dia), para mimetizar a atividade anti-VEGF em modelos de camundongos. O tratamento foi iniciado no dia 5 depois da injeção de 5 x 10⁴LL/2 células de tumores subcutâneos por camundongo. São indicados o volume do tumor em mm³ (A, C) e o correspondente volume tumoral relativo randomizado (B, D), respectivamente, até o dia 35 do experimento.

[0017] A Figura 2 mostra a sobrevida média de camundongos tratados com controle/anticorpo Isotipo, anticorpo anti-PD1 (dose: 10 mg/kg; cronograma: a cada 3-4 dias), VEGFANGBII22 (dose: 15 mg/kg; cronograma: a cada 3-4 dias), vatalanibe (dose: 100 mg/kg; cronograma; uma vez por dia), vatalanibe mais anticorpo anti-PD1, vatalanibe mais anticorpo anti-PD1 mais VEGFANGBII22 ou anticorpo anti-PD1 mais VEGFANGBII22. Cada grupo de tratamento consistiu em 10 tumores individuais contendo camundongos randomizados. O tratamento foi iniciado no dia 3 depois da injeção de 5 x 10⁴ LL/2 células de tumores subcutâneos por camundongo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0018] A presente invenção refere-se a um método, compostos para uso, uso de compostos, composições farmacêuticas e kits, todos referentes à terapia combinada ou provisão combinada do composto A e do composto B, em que • O composto A é uma molécula de ligação biespecífica compreendendo o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação

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8/57 ao VEGF, o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica, e o um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 em que o o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF possui as seguintes sequências de CDR:

• CDR1: SYSMG (SEQ ID NO: 1) • CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG (SEQ ID NO: 2) • CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY (SEQ ID NO: 3) o o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica possui as seguintes sequências de CDR:

• CDR1: SFGMS (SEQ ID NO: 4) • CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 5) • CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO: 6), o o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 possui as seguintes sequências de CDR:

• CDR1: DYAIG (SEQ ID NO: 7) • CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 8) • CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO: 9) e em que • O composto B é um antagonista de PD-1.

[0019] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que uma combinação do Composto A e do Composto B resulta em uma redução significativa, ou mesmo encolhimento, do crescimento do tumor em comparação com uma terapia apenas com o Composto A ou apenas com o Composto B. Os compostos A e B trabalham em sinergia e podem levar a uma redução do câncer.

[0020] O composto A, de acordo com a presente invenção, é uma

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9/57 molécula de ligação biespecífica anti-VEGF/anti-Ang-2. As terapias antiangiogênese tornaram-se uma importante opção de tratamento para vários tipos de tumores. Estas terapias focaram-se em bloquear a via de VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004;3(5):391-400) neutralizando o VEGF ou seus receptores. Estudos recentes em camundongos mostraram que a angiopoietina2 (Ang2), um ligante do receptor Tie2, controla a remodelação vascular, permitindo as funções de outros fatores angiogênicos, como VEGF. Ang2 é expressa principalmente por células endoteliais, fortemente induzida por hipóxia e outros fatores angiogênicos, e tem demonstrado regular a plasticidade dos vasos tumorais, permitindo que os vasos respondam a VEGF e FGF2 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009; 10(3): 165-77). Consistente com este papel, a deleção ou inibição de Ang2 resulta em angiogênese reduzida (Gale et al., Dev Cell. 2002;3(3):302-4) (Falcon et al., Am J Pathol. 2009;175(5):2159-70). Foram notificadas concentrações séricas elevadas de Ang2 em pacientes com câncer colorretal, CPNPC e melanoma (Goede et al., Br J Cancer. 2010 Oct 26;103(9): 1407-14), (Park et al., Chest. 2007;132(1): 200-6),(Helfrich et al., Clin Cancer Res. 2009 15; 15(4): 1384-92). No câncer CR, os níveis séricos de Ang2 se correlacionam com a resposta terapêutica à terapia antiVEGF.

[0021] Ang2 é um ligante de 66 kDa secretado para a tirosina quinase do receptor Tie2 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009; 10(3):165-77). Ang2 consiste em um domínio enrolado em espiral Nterminal e um domínio similar a fibrinogênio C-terminal, o último é necessário para a interação com Tie2. Ang2 é expressa principalmente por células endoteliais e fortemente induzida por hipóxia e outros fatores angiogênicos, incluindo VEGF. Tie2 é encontrado em células endoteliais, células-tronco hematopoiéticas e células tumorais. Demonstrouse que Ang2-Tie2 regula a plasticidade dos vasos tumorais, permitindo

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10/57 que os vasos respondam ao VEGF e FGF2.

[0022] O sistema Ang-Tie consiste em 2 receptores (Tie1 e Tie2) e 3 ligantes (Ang1, Ang2 e Ang4) (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009; 10(3): 165-77). Tie2, Ang1 e Ang2 são os membros mais bem estudados dessa família, Tie1 é um receptor órfão e o papel do Ang4 no remodelamento vascular ainda precisa ser definido. Ang2 e Ang1 mediam funções opostas na ligação e ativação de Tie2. A ativação de Tie2 mediada por Ang2 resulta em ativação de células endoteliais, dissociação de pericitos, derrame de vasos e indução de brotação de vasos. Em contraste com Ang2, a sinalização de Ang1 mantém a integridade do vaso através do recrutamento de pericitos, mantendo assim a quiescência das células endoteliais.

[0023] As moléculas de ligação biespecíficas anti-VEGF/anti-Ang-2 que podem ser utilizadas de acordo com a invenção são, por exemplo, reveladas no documento W02012/131078, incorporado neste pedido por referência).

[0024] O composto B, de acordo com a presente invenção, é um antagonista contra um membro da família da proteína de Morte Programada 1 (PD-1), como a própria PD-1 ou um de seus ligantes, PDL1 ou PD-L2. PD-1 é conhecida como uma proteína imunoinibidora que regula negativamente os sinais de TCR (Ishida, Y. et al. (1992) EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. et al. (2006) Immunol. Immunother. 56(6):739-745). A interação entre PD-1 e PD-L1 pode atuar como um ponto de verificação imune, o que pode levar a, por exemplo, uma diminuição nos linfócitos infiltrantes de tumores, uma diminuição na proliferação mediada pelo receptor de células T e/ou imuno-evasão por células cancerígenas (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). A supressão imunológica pode ser revertida inibindo a interação local de PD-1 com PD-L1 ou PD-L2;

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11/57 o efeito é aditivo quando a interação de PD-1 com PD-L2 também é bloqueada (Iwai et al. (2002) Proc. Nat’l. Acad. Sci USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).

[0025] PD-1 é um membro inibidor da família CD2/CTLA-4 estendida de reguladores de células T. Outros membros da família CD28 incluem CD28, CTLA-4, ICOS e BTLA. Sugere-se que PD-1 exista como monômero, sem a característica do resíduo de cisteína não pareado de outros membros da família CD28. PD-1 é expressa em células B ativadas, células T e monócitos (Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14:391779-82; Bennett et al. (2003) J. Immunol. 170:711-8). Foram identificados dois ligantes para PD-1, PD-L1 (B7-H1) e PD-L2 (B7-DC), que demonstraram regular negativamente a ativação de células T após a ligação a PD-1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027-34; Carter et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:634-43). PD-L1 e PD-L2 são homólogos de B7 que se ligam a PD-1. PD-L1 é abundante em uma variedade de cânceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9).

[0026] O gene PD-1 codifica uma proteína transmembrana tipo I de 55 kDa que faz parte da superfamília do gene Ig (Agata et al. (1996) Int Immunol. 8:765-72). A sequência de PD-1 completa pode ser encontrada sob o n° de Acesso GenBank U64863. Embora estruturalmente similar ao CTLA-4, a PD-1 não possui o motivo MYPPY (SEQ ID NO: 10) que é importante para a ligação de B7-1 e B7-2.

[0027] Em vista do exposto acima, anticorpos monoclonais como antagonistas de PD-1 foram desenvolvidos nos últimos anos para uso em terapia, mais precisamente no tratamento de várias doenças, incluindo câncer e doenças infecciosas (por exemplo, W02006/121168; WO2015/112900). Qualquer um desses anticorpos pode ser utilizado de acordo com a presente invenção.

[0028] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente

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12/57 que o tratamento de indivíduos com uma combinação do Composto A e do Composto B, conforme definido acima/abaixo, leva a uma redução significativamente mais forte - ou mesmo encolhimento - no volume do tumor em comparação com o tratamento apenas com o Composto A ou apenas com o Composto B. Além disso, quando comparado a um tratamento de indivíduos com vanucizumabe e o mesmo antagonista de PD-1, o tratamento com uma composição compreendendo o Composto A e o Composto B, conforme definido acima/abaixo, resultou em encolhimento do tumor (Exemplo 1; Figura 1). Tanto o composto A como o composto B são agentes ativos de acordo com a presente invenção.

[0029] Um antagonista de PD-1 dentro do significado desta invenção é um composto que inibe a interação de PD-1 com seus receptores ou ligantes.

[0030] De preferência, o antagonista de PD-1 é um inibidor de PD1 ou um inibidor de PD-L1. O antagonista de PD-1 pode, preferencialmente, ser um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1, e, com mais preferência, um anticorpo anti -PD-1 humanizado ou inteiramente humano ou um anticorpo anti-PD-L1 humanizado ou inteiramente humano. Qualquer um desses anticorpos pode ser um anticorpo humano recombinante.

[0031] O termo anticorpo é utilizado neste pedido no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, entre outros, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único e anticorpos fragmentados (também referidos como fragmentos de anticorpos), como Fab, F(ab)2, F(ab’)2, Fab’, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) ou domínios de ligação ao antígeno de um anticorpo, desde que apresentem a atividade desejada de ligação ao antígeno.

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[0032] O anticorpo pode ter uma função efetora, como ADCC ou CDC, que geralmente é mediada pela parte Fc (região constante do anticorpo) do anticorpo, ou pode não ter função efetora, por exemplo, na falta de uma parte Fc ou com uma parte Fc bloqueada mascarada, em essência uma parte Fc que não é ou é insuficientemente reconhecida pelas células imunes ou pelos componentes do sistema imunológico, como o sistema complemento.

[0033] O anticorpo ou seu fragmento pode ser de qualquer tipo, por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. É preferencial a IgG.

[0034] Os termos anticorpo monoclonal ou composição de anticorpo monoclonal, conforme utilizados neste pedido, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma única composição de aminoácidos.

[0035] Um anticorpo recombinante é um anticorpo que foi produzido por uma célula hospedeira manipulada de forma recombinante. É opcionalmente isolado ou purificado.

[0036] Um anticorpo humano é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano.

[0037] O termo anticorpo humano recombinante, como utilizado neste pedido, destina-se a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como anticorpos isolados de uma célula hospedeira, como uma célula NS0 ou CHO ou de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana ou anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante

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14/57 transfectado para uma célula hospedeira. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes em uma forma reorganizada. Os anticorpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos a hipermutação somática in vivo. Dessa forma, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas às sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[0038] Um anticorpo humanizado refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de regiões hipervariáveis não humanas (HVRs) e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, regiões de determinação de complementaridade (CDRs)) correspondem às de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais inteiras (FRs) correspondem às de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma forma humanizada de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que passou por humanização.

[0039] Ligação de um polipeptídeo (como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variável único da imunoglobulina da invenção ou geralmente uma molécula de ligação ao antígeno ou um fragmento da mesma) significa ter afinidade para ou ter especificidade para um certo epítopo, antígeno ou proteína (ou por pelo menos uma parte, fragmento ou epítopo dos mesmos).

[0040] Geralmente, o termo especificidade refere-se ao número

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15/57 de diferentes tipos de antígenos ou epítopos aos quais uma molécula específica de ligação ao antígeno ou proteína de ligação ao antígeno (como um domínio variável único da imunoglobulina da invenção) pode se ligar. A especificidade da molécula de ligação ao antígeno pode ser determinada com base em sua afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação ao antígeno (KD), é uma medida da força de ligação entre um epítopo e um sítio de ligação ao antígeno na proteína de ligação ao antígeno: quanto menor a valor do KD, mais forte a força de ligação entre um epítopo e a molécula de ligação ao antígeno (como alternativa, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), que é 1/KD). Como ficará claro para o versado (por exemplo, com base na revelação adicional neste pedido), a afinidade pode ser determinada de uma maneira conhecida por si, dependendo do antígeno específico de interesse. Avidez é a medida da força da ligação entre uma molécula de ligação ao antígeno (como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variável único da imunoglobulina ou um polipeptídeo) que o contém e o antígeno pertinente. A avidez está relacionada à afinidade entre um epítopo e seu sítio de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno e ao número de sítios de ligação pertinentes presentes na molécula de ligação ao antígeno.

[0041] Anticorpos naturais, por exemplo, são monoespecíficos. O termo anticorpo monoespecífico, conforme utilizado neste pedido, denota um anticorpo que possui um ou mais sítios de ligação, cada um dos quais se liga ao mesmo epítopo do mesmo antígeno. Anticorpos multiespecíficos se ligam a dois ou mais epítopos diferentes (por exemplo, dois, três, quatro ou mais epítopos diferentes). Os epítopos podem estar no mesmo antígeno ou em antígenos diferentes. Um exemplo de anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico que

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16/57 se liga a dois epítopos diferentes. Quando um anticorpo possui mais de uma especificidade, os epítopos reconhecidos podem ser associados a um único antígeno ou a mais de um antígeno.

[0042] Um epítopo é uma região de um antígeno que está ligado por um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno. O termo epítopo inclui qualquer determinante polipeptídico capaz de ligação específica a um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, os determinantes de epítopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como aminoácidos, cadeias laterais de glicano, fosforila ou sulfonila e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de que a ligação ao primeiro, mas não ao último, é perdida na presença de solventes desnaturantes. Como utilizado neste pedido, os termos ligação e ligação específica se referem à ligação do anticorpo ou da porção de ligação ao antígeno a um epítopo do antígeno em um ensaio in vitro, de preferência em um ensaio de ressonância de plásmons (BIAcore®, GE Healthcare, Uppsala, Suécia) com antígeno purificado selvagem.

[0043] A afinidade da ligação das moléculas de ligação (por exemplo, anticorpos), de acordo com a presente invenção, incluindo os anticorpos dos mesmos do Composto A ou do Composto B, por um antígeno é definida pelos termos de k_a (constante da taxa de associação entre o anticorpo a partir da anticorpo/complexo de antígeno), Kd (constante de dissociação), e Kd (kD/ka). Em uma modalidade, a ligação ou que se liga especificamente a significa uma afinidade de ligação (Kd) de 10’⁸ mol/l ou menos, em uma modalidade, 10’⁸ M a 10’¹³mol/l. Dessa forma, um anticorpo multiespecífico, de acordo com a invenção, se liga especificamente a cada antígeno para o qual é específico com uma afinidade de ligação (Kd) de 10’⁸ mol/l ou menos, por

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17/57 exemplo, com uma afinidade de ligação (Kd) de 10’⁸ a 10^-13 mol/l. Em uma modalidade, com uma afinidade de ligação (Kd) é de 10^-9 a 10^-13mol/l.

[0044] As expressões domínios variáveis ou região variável ou Fv, conforme utilizadas neste pedido, denotam cada um dos pares de cadeias leves e pesadas que estão envolvidos diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. O domínio variável de uma cadeia leve é abreviado como VL e o domínio variável de uma cadeia pesada é abreviado como VH. Os domínios variáveis de cadeia leve e pesada têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões estruturais (FR) cujas sequências são amplamente conservadas, conectadas por três HVRs (ou CDRs). As regiões estruturais adotam uma conformação de folha beta e as CDRs podem formar alças conectando a estrutura de folha beta. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões estruturais e formam junto com as CDRs da outra cadeia o sítio de ligação ao antígeno. As regiões CDR3 da cadeia pesada e leve do anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e, portanto, fornecem um objeto adicional da invenção.

[0045] O termo domínios constantes ou região constante, conforme usado no presente pedido, denota a soma dos domínios de um anticorpo que não seja a região variável. A região constante não está diretamente envolvida na ligação de um antígeno, mas exibe várias funções efetoras.

[0046] Os domínios constantes, conforme utilizados nos anticorpos revelados neste pedido, são, de preferência, de origem humana, que é de uma região de cadeia pesada constante de um anticorpo humano da subclasse lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 e/ou uma região kappa ou lambda da cadeia leve constante. Tais domínios e regiões cons

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18/57 tantes são bem conhecidos no estado da técnica e, por exemplo, descritos por Kabat et al. (Sequence of proteins of immunological interest, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91).

[0047] A parte Fc de um anticorpo não está envolvida diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibe várias funções efetoras. Uma parte Fc de um anticorpo é um termo bem conhecido pelos versados na técnica e definido com base na divagem de anticorpos por papaína. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, lgA1 e lgA2. De acordo com as regiões constantes da cadeia pesada, as diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. A parte Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento) com base na ativação do complemento, ligação a C1q e ligação ao receptor Fc. A ativação do complemento (CDC) é iniciada pela ligação do fator C1q do complemento à parte Fc da maioria das subclasses de anticorpos IgG. Embora a influência de um anticorpo no sistema complemento seja dependente de certas condições, a ligação a C1q é causada por sítios de ligação definidos na parte Fc. Tais sítios de ligação são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, por Boackle, R.J., et al, Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J., et al, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al, J. Immunol.164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al, J. Virology 75 (2001) 12161

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12168; Morgan, A., et al, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434. Tais sítios de ligação são, por exemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat, E.A., ver abaixo). Os anticorpos das subclasses IgGI, lgG2 e lgG3 geralmente mostram ativação do complemento e ligação a Clq e C3, enquanto lgG4 não ativa o sistema complemento e não se liga a Clq e C3.

[0048] Em relação ao Composto A, o termo molécula de ligação biespecífica refere-se a uma molécula compreendendo pelo menos uma molécula de ligação à Ang2 (ou componente de ligação à Ang2) e pelo menos uma molécula de ligação a VEGF (ou componente de ligação a VEGF). Uma molécula de ligação biespecífica pode conter mais de uma molécula de ligação à Ang2 e/ou mais de uma molécula de ligação a VEGF, ou seja, no caso em que a molécula de ligação biespecífica contenha uma molécula de ligação biparatópica (como definida abaixo) e uma molécula biparatópica de ligação ao VEGF, em parte da molécula que se liga a Ang2 ou VEGF, ou seja, em seu componente de ligação à Ang2 (ou componente anti-Ang2) ou componente de ligação a VEGF (ou componente anti-VEGF), respectivamente. A palavra biespecífico neste contexto não deve, no entanto, ser interpretada de modo a excluir outros componentes de ligação com especificidade de ligação a moléculas que não sejam VEGF e Ang2 da molécula de ligação biespecífica. Exemplos não limitadores desses componentes de ligação adicionais são os componentes de ligação à albumina sérica.

[0049] Salvo indicação em contrário, o termo molécula de ligação a VEGF ou molécula de ligação à Ang2 inclui anticorpos anti-VEGF ou anti-Ang2, fragmentos de anticorpo anti-VEGF ou de anticorpo antiAng2, moléculas similares a anticorpos anti-VEGF ou moléculas do tipo anticorpo anti-Ang2, conforme definidos neste pedido, e conjuga

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20/57 dos com qualquer urn desses. Os anticorpos incluem, mas não estão limitados a anticorpos monoclonais e monoclonais quiméricos. O termo anticorpo abrange imunoglobulinas completas, como anticorpos monoclonais produzidos por expressão recombinante em células hospedeiras, bem como fragmentos de anticorpos ou moléculas similares a anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia única e anticorpos lineares, os chamados SMIPs (pequenos imunofarmacêuticos modulares), como, por exemplo, descritos em W02002/056910; moléculas similares a anticorpos incluem domínios variáveis únicos de imunoglobulina, como definidos neste pedido. Outros exemplos de moléculas do tipo anticorpo são os anticorpos da família super imunoglobulina (IgSF) ou moléculas enxertadas em CDR.

[0050] Molécula de ligação à Ang2 ou molécula de ligação a VEGF, respectivamente, referem-se a ambas as moléculas monovalentes de ligação ao alvo (ou seja, moléculas que se ligam a um epítopo do respectivo alvo), bem como a moléculas de ligação bi ou multivalentes (ou seja, moléculas de ligação que se ligam a mais de um epítopo, por exemplo, moléculas biparatópicas, conforme definido abaixo). As moléculas de ligação à Ang2 (ou VEGF) que contêm mais de um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 (ou VEGF) também são denominadas moléculas de ligação formatadas, elas podem, dentro do componente de ligação ao alvo, além dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina, compreender ligantes e/ou porções com funções efetoras, por exemplo, porções que prolongam a meia-vida como domínios variáveis únicos de imunoglobulina de ligação à albumina e/ou um parceiro de fusão como albumina sérica e/ou um polímero ligado como PEG.

[0051] O termo molécula de ligação biparatópica à Ang2 (ou VEGF) ou domínio variável único de imunoglobulina biparatópico, conforme utilizado neste pedido, significará uma molécula de ligação

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21/57 compreendendo um primeiro domínio variável único de imunoglobulina e um segundo domínio variável único de imunoglobulina, conforme definido neste pedido, em que as duas moléculas se ligam a dois epítopos não sobrepostos do respectivo antígeno. As moléculas de ligação biparatópicas são compostas por domínios variáveis únicos de imunoglobulina que têm especificidades diferentes em relação ao epítopo. [0052] Uma molécula de ligação formatada pode, embora menos preferencial, também compreender dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina idênticos ou dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina diferentes que reconhecem os mesmos epítopos sobrepostos ou seus respectivos antígenos. Neste caso, em relação ao VEGF, os dois domínios variáveis únicos da imunoglobulina podem se ligar ao mesmo ou a um epítopo sobreposto em cada um dos dois monômeros que formam o dímero de VEGF.

[0053] A eficácia da molécula de ligação biespecífica da invenção e de composições compreendendo a mesma pode ser testada usando qualquer ensaio in vitro adequado, ensaio baseado em células, ensaio in vivo e/ou modelo animal conhecido por si, ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo da doença ou distúrbio específico de interesse. Os ensaios e modelos animais adequados serão claros para o versado e, por exemplo, incluem os ensaios descritos na EP 2 694 546 B1.

[0054] Salvo indicação em contrário, os termos imunoglobulina e sequência de imunoglobulina - utilizados neste pedido para se referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo convencional de 4 cadeias - são utilizados como termos gerais para incluir o anticorpo em tamanho real, as cadeias individuais dos mesmos, bem como todas as partes, domínios ou fragmentos dos mesmos (incluindo, mas não se limitando a, domínios ou fragmentos de ligação ao antígeno, como domínios VHH ou domínios VH/VL, respectivamente). Além disso, o

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22/57 termo sequência, conforme utilizado neste pedido (por exemplo, em termos como sequência de imunoglobulinas, sequência de anticorpos, sequência (única) de domínio variável, sequência de VHH ou sequência de proteínas), deve geralmente ser entendido incluindo tanto a sequência de aminoácidos relevante quanto as sequências de ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeos que as codificam, a menos que o contexto exija uma interpretação mais limitada.

[0055] O termo domínio (de um polipeptídeo ou proteína), conforme utilizado neste pedido, refere-se a uma estrutura de proteína enovelada que tem a capacidade de reter sua estrutura terciária independentemente do restante da proteína. Geralmente, os domínios são responsáveis por propriedades funcionais discretas das proteínas e, em muitos casos, podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domínio.

[0056] O termo domínio de imunoglobulina, conforme utilizado neste pedido, refere-se a uma região globular de uma cadeia de anticorpos (como, por exemplo, uma cadeia de um anticorpo convencional de 4 cadeias ou de um anticorpo de cadeia pesada), ou a um polipeptídeo que consiste essencialmente de tal região globular. Os domínios de imunoglobulina são caracterizados por reterem a característica de enovelamento da imunoglobulina das moléculas de anticorpo, que consistem em um sanduíche de 2 camadas de cerca de 7 fitas beta antiparalelas dispostas em duas folhas beta, opcionalmente estabilizadas por uma ligação dissulfeto conservada. Um domínio de imunoglobulina compreende (a) domínio(s) variável(is), isto é, um ou mais domínios variáveis de imunoglobulina.

[0057] O termo domínio variável de imunoglobulina, conforme utilizado neste pedido, significa um domínio de imunoglobulina consistindo essencialmente em quatro regiões estruturais que são referidas

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23/57 na técnica e a seguir denominadas como região estrutural 1 ou FR1; como região estrutural 2 ou FR2; como região estrutural 3 ou FR3; e como região estrutural 4 ou FR4, respectivamente; quais regiões estruturais são interrompidas por três regiões de determinação de complementaridade ou CDRs, que são referidas na técnica e a seguir denominadas região de determinação de complementaridade 1 ou CDR1; como região de determinação de complementaridade 2 ou CDR2; e como região de determinação de complementaridade 3 ou CDR3, respectivamente. Dessa forma, a estrutura ou sequência geral de um domínio variável de imunoglobulina pode ser indicada da seguinte maneira: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 CDR3 - FR4. São os domínios variáveis da imunoglobulina que conferem especificidade a um anticorpo para o antígeno carregando o sítio de ligação ao antígeno. As moléculas da presente invenção incluem domínios variáveis únicos de imunoglobulina como VHHs.

[0058] O termo domínio variável único de imunoglobulina, conforme utilizado neste pedido, significa um domínio variável de imunoglobulina que é capaz de se ligar especificamente a um epítopo do antígeno sem pareamento com um domínio variável de imunoglobulina adicional. Um exemplo de domínios variáveis únicos de imunoglobulina no significado da presente invenção são anticorpos de domínio, como os domínios variáveis únicos de imunoglobulina VH e VL (domínios VH e domínios VL). Outro exemplo de domínios variáveis únicos de imunoglobulina são domínios VHH (ou simplesmente VHHs) de camelídeos, conforme descrito a seguir.

[0059] Tendo em vista a definição acima, o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo convencional de 4 cadeias (como uma molécula de IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE; conhecida na técnica) ou de um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv, como um Fv ligado por dissulfeto ou um fragmento scFv, ou um diacorpo (todos co

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24/57 nhecidos na técnica) derivados desse anticorpo convencional de 4 cadeias, normalmente não seria considerado um domínio variável único de imunoglobulina como, nesses casos, a ligação ao epítopo respectivo de um antígeno normalmente não ocorrería por um (único) domínio da imunoglobulina, mas por um par de domínios (associação) da imunoglobulina, como domínios variáveis da cadeia leve e pesada, ou seja, por um par VH-VL dos domínios da imunoglobulina, que se ligam conjuntamente a um epítopo do respectivo antígeno.

[0060] Domínios VHH, também conhecidos como VHHs, os domínios VhH, fragmentos de anticorpos VHH, e anticorpos VHH, foram originalmente descritos como o domínio (variável) da imunoglobulina de ligação ao antígeno de anticorpos da cadeia pesada (isto é, de anticorpos sem cadeias leves; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Nature 363, 446-448 (1993)). O termo domínio VHH foi escolhido de modo a distinguir estes domínios variáveis dos domínios variáveis da cadeia pesada que se encontram presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos neste pedido como domínios Vh ou domínios VH) e a partir dos domínios variáveis da cadeia leve que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos neste pedido como domínios Vl ou domínios VL). Os domínios VHH podem se ligar especificamente a um epítopo sem um domínio adicional de ligação ao antígeno (em oposição aos domínios VH ou VL em um anticorpo convencional de 4 cadeias, caso em que o epítopo é reconhecido por um domínio VL em conjunto com um domínio VH). Os domínios VHH são unidades de reconhecimento de antígeno pequenas, robustas e eficientes, formadas por um único domínio de imunoglobulina.

[0061] No contexto da presente invenção, os termos domínio VHH,

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VHH, domínio VhH, fragmento de anticorpo VHH, anticorpo VHH são utilizados indiferentemente e são representantes de domínios variáveis únicos da imunoglobulina (possuindo a estrutura FR1-CDR1-FR2CDR2-FR3 -CDR3-FR4 e se ligando especificamente a um epítopo sem exigir a presença de um segundo domínio variável da imunoglobulina) e que são diferenciados dos domínios VH pelos chamados resíduos de marca, conforme definido em, por exemplo, W02009/109635, Figura 1.

[0062] Os resíduos de aminoácidos de um domínio variável único da imunoglobulina, por exemplo, um VHH, são numerados de acordo com a numeração geral para domínios Vh dada por Kabat et al. (Sequence of proteins of immunological interest, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), como aplicado aos domínios VHH de camelídeos, como mostrado, por exemplo, na Figura 2 de Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999). De acordo com esta numeração

- FR1 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 30,

- CDR1 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 31 a 35,

- FR2 compreende os aminoácidos nas posições 36 a 49,

- CDR2 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 50 a 65,

- FR3 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 66 a 94,

- CDR3 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 95 a 102, e

- FR4 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 103 a 113.

[0063] No entanto, deve-se notar que - como é bem conhecido na

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26/57 técnica para domínios Vh e para domínios VHH - o número total de resíduos de aminoácidos em cada uma das CDRs pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos de aminoácidos indicado pela numeração de Kabat (ou seja, uma ou mais posições de acordo com a numeração de Kabat podem não ser ocupadas na sequência real ou a sequência real pode conter um ou mais resíduos de aminoácidos que o número permitido pela numeração Kabat). Isto significa que, geralmente, a numeração de acordo com Kabat pode ou não corresponder à numeração real dos resíduos de aminoácidos na sequência real.

[0064] Métodos alternativos para numerar os resíduos de aminoácidos dos domínios Vh, métodos que também podem ser aplicados de maneira análoga aos domínios VHH, são conhecidos na técnica. No entanto, na presente descrição, reivindicações e figuras, a numeração de acordo com Kabat e aplicada aos domínios VHH como descrito acima será seguida, a menos que indicado de outra forma.

[0065] O número total de resíduos de aminoácidos em um domínio VHH geralmente estará na faixa de 110 a 120, geralmente entre 112 e 115. No entanto, deve-se notar que sequências menores e mais longas também podem ser adequadas para os fins descritos neste pedido.

[0066] Os domínios variáveis únicos de imunoglobulina, por exemplo, VHHs e anticorpos de domínio, de acordo com as modalidades preferenciais da invenção, têm várias características estruturais e propriedades funcionais únicas, o que os torna altamente vantajosos para uso em terapia como moléculas funcionais de ligação a antígeno. Em particular, e sem se limitar a isso, os domínios VHH (que foram projetados por natureza para se ligarem funcionalmente a um antígeno sem pareamento com um domínio variável da cadeia leve) podem funcionar como unidades estruturais de ligação a antígeno funcionais úni

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27/57 cas, relativamente pequenas.

[0067] Detalhes e informações adicionais sobre as vantagens de domínios variáveis únicos de imunoglobulina e sobre a obtenção de VHHs são revelados em detalhes na EP 2 694 546 B1.

[0068] Os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção não estão limitados em relação a uma fonte biológica específica a partir da qual foram obtidos ou a um método específico de preparação. Métodos e técnicas adequados para a obtenção de domínios VHH que se ligam a um antígeno ou epítopo específico foram descritos nos documentos W02006/040153 e W02006/122786.

[0069] De acordo com modalidades específicas, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção são domínios VHH com uma sequência de aminoácidos que corresponde essencialmente à sequência de aminoácidos de um domínio VHH de ocorrência natural, mas que foi humanizado ou otimizado por sequência (opcionalmente após maturação por afinidade), ou seja, substituindo um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da dita sequência VHH de ocorrência natural por um ou mais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio pesado variável de um anticorpo convencional de 4 cadeias de um ser humano. Isso pode ser realizado usando métodos conhecidos na técnica, que podem ser usados rotineiramente pelo versado.

[0070] Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências da região estrutural totalmente humana e, em uma modalidade ainda mais específica, pode conter sequências da região estrutural humana derivadas das sequências Vh3 da linhagem germinativa humana DP-29, DP-47, DP-51 ou partes das mesmas, ou sejam altamente homólogas a elas, opcionalmente combinadas com sequências JH, como JH5. Dessa forma, um protocolo de humanização pode

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28/57 compreender a substituição de qualquer um dos resíduos VHH pelos resíduos estruturais 1, 2 e 3 correspondentes (FR1, FR2 e FR3) dos genes VH da linhagem germinativa, como DP 47, DP 29 e DP 51) isolados ou em combinação. As regiões estruturais adequadas (FR) dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção podem ser selecionados dentre os estabelecidos, por exemplo, no documento W02006/004678 e, especificamente, incluem as chamadas classes KERE e GLEW. Exemplos são domínios variáveis únicos de imunoglobulina com a sequência de aminoácidos GLEW aproximadamente nas posições 44 a 47 e seus respectivos homólogos humanizados. Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências da região da estrutura totalmente humana.

[0071] A título de exemplo, uma substituição humanizadora de VHHs pertencentes ao grupo 103 P, R, S e/ou ao grupo GLEW (como definido abaixo) é 108Q a 108L. Os métodos para humanizar domínios variáveis únicos de imunoglobulina são conhecidos na técnica.

[0072] Domínios variáveis únicos de imunoglobulina de ligação com propriedades aprimoradas em vista da aplicação terapêutica, por exemplo, afinidade aprimorada ou imunogenicidade reduzida, podem ser obtidos de moléculas de ligação individuais por técnicas conhecidas na técnica, como maturação por afinidade (por exemplo, a partir de sequências de imunoglobulina sintéticas, aleatórias ou de ocorrência natural), enxerto de CDR, humanização, combinação de fragmentos derivados de diferentes sequências de imunoglobulina, montagem de PCR usando iniciadores sobrepostos e técnicas semelhantes para engenharia de sequências de imunoglobulina bem conhecidas pelos versados; ou qualquer combinação adequada de qualquer um dos anteriores, também denominada otimização de sequência, como descrito neste pedido. É feita referência, por exemplo, a manuais padrão, bem como a descrição e exemplos adicionais.

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[0073] De acordo com o descrito acima, em uma modalidade preferencial, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina do Composto A são domínios VHH. Com mais preferência, o composto A é selecionado de compostos com as seguintes sequências de aminoácidos: DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKER EFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVY YCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQL VESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVS SISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT IGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGGSTYYADSV KGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQ WYPIYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11); EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKER EFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVY YCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQL VESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVS SISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT IGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGGSTYYADSV KGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQW YPIYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12); e VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKER EFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAV YYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEV QLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLE WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTA VYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQ

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PGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGG STYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVP AGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13).

[0074] As três sequências mostradas acima são quase idênticas, exceto a sequência N-terminal, que pode ser alterada ou modificada para se adaptar de maneira ideal à sequência ao sistema de expressão selecionado (vetor de expressão, célula hospedeira) ou devido a outras necessidades. Dessa forma, é claro para o versado que outros polipeptídeos que compreendem essencialmente a sequência acima, mas que são ligeiramente modificados, por exemplo, por trocas, deleções ou adições de aminoácidos que não alteram as afinidades de ligação dos polipeptídeos resultantes, também serão úteis como um Composto A de uma combinação farmacêutica de acordo com a invenção.

[0075] Em outra modalidade, os representantes da classe de domínios variáveis únicos da imunoglobulina de ligação a VEGF e/ou Ang2 da invenção têm sequências de aminoácidos que correspondem à sequência de aminoácidos de um domínio VH de ocorrência natural que foi camelizado, isto é, substituindo um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada variável de ocorrência natural de um anticorpo convencional de 4 cadeias por um ou mais resíduos de aminoácidos que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) no domínio VHH de um anticorpo da cadeia pesada. Isto pode ser realizado de uma maneira conhecida por si, que será clara para o versado, e é feita referência adicional a WO1994/04678. Essa camelização pode ocorrer preferencialmente em posições de aminoácidos que estão presentes na interface VH-VL e nos resíduos chamados Camelidae Hallmark (ver, por exemplo, também W01994/04678). Uma descrição detalhada dessas técnicas de

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31/57 humanização e camelização e sequências preferenciais da região estrutural consistentes com as mesmas podem ser obtidas adicionalmente, por exemplo, nas páginas 98 de W02006/040153 e 107 de W02006/122786.

[0076] Um antagonista de PD-1 dentro do significado desta invenção e todas de suas modalidades é um composto que inibe a interação de PD-1 com seus receptores ou ligantes. Os antagonistas de PD-1 são bem conhecidos na técnica, por exemplo, revisados por Li et al., Int. J. Mol. Sei. 2016, 17, 1151 (incorporado neste pedido por referência). Qualquer antagonista de PD-1, especialmente anticorpos, como os revelados por Li et al. bem como os anticorpos adicionais revelados neste pedido abaixo, podem ser utilizados de acordo com a invenção. De preferência, o antagonista de PD-1 desta invenção e todas as suas modalidades são selecionados do grupo que consiste nos seguintes anticorpos:

- pembrolizumabe (anticorpo anti-PD-1);

- nivolumabe (anticorpo anti-PD-1);

- pidilizumabe (anticorpo anti-PD-1);

- PDR-001 (anticorpo anti-PD-1);

- PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5, conforme revelado abaixo (anticorpos anti-PD-1)

- atezolizumabe (anticorpo anti-PD-L1);

- avelumabe (anticorpo anti-PD-L1);

- durvalumabe (anticorpo anti-PD-L1).

[0077] Pembrolizumabe (anteriormente também conhecido como lambrolizumabe; nome comercial Keytruda; também conhecido como MK-3475) revelado, por exemplo, em Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369(2):134-44, é um anticorpo monoclonal lgG4 humanizado que se liga à PD-1; contém uma mutação em C228P projetada para evitar citotoxicidade mediada por Fc. Pembrolizumabe

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32/57 é, por exemplo, revelado nos documentos US 8.354.509 e W02009/114335. É aprovado pelo FDA para o tratamento de pacientes que sofrem de melanoma irressecável ou metastático e pacientes com CPNPC metastático.

[0078] Nivolumabe (Número do Registro CAS: 946414-94-4; BMS936558 ou MDX1106b) é um anticorpo monoclonal lgG4 totalmente humano que bloqueia especificamente PD-1, sem toxicidade celular dependente de anticorpo detectável (ADCC). Nivolumabe é, por exemplo, revelado nos documentos US 8.008.449 e W02006/121168. Foi aprovado pelo FDA para o tratamento de pacientes que sofrem de melanoma irressecável ou metastático, CPNPC metastático e carcinoma avançado de células renais.

[0079] Pidilizumabe (CT-011; Cure Tech) é um anticorpo monoclonal lgG1k humanizado que se liga à PD-1. Pidilizumabe é, por exemplo, revelado no documento W02009/101611.

[0080] PDR-001 ou PDR001 é um anticorpo lgG4 anti-PD-1 humanizado, de alta afinidade e bloqueador de ligantes, que bloqueia a ligação de PD-L1 e PD-L2 a PD-1. PDR-001 é revelado nos documentos WO2015/112900 e WO2017/019896.

[0081] Os anticorpos PD1-1 a PD1-5 são moléculas de anticorpo definidas pelas sequências como mostrado na Tabela 1, em que HC denota a cadeia pesada (de comprimento total) e LC denota a cadeia leve (de comprimento total):

Tabela 1:

SEQID NO:	Nome da sequência	Sequência de aminoácidos
14	HC de PD1-1	EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSVWRQAPGKGLEW VAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP

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SEQID NO:	Nome da sequência	Sequência de aminoácidos
		REEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG
15	LC de PD1-1	EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNWYQQKPGQA PKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQS KEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
16	HC de PD1-2	EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSVWRQAPGKGLE VWAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCARHSNPNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
17	LC de PD1-2	EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNWYQQKPGQA PKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQS KEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18	HC de PD1-3	EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSVWRQAPGKGLE VWAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
19	LC de PD1-3	EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNWYQQKPGQA PKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQS KEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

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SEQ ID NO:	Nome da sequência	Sequência de aminoácidos
20	HC de PD1-4	EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSVWRQAPGKGLE VWAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
21	LC de PD1-4	EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNWYQQKPGQA PKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
22	HC de PD1-5	EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSVWRQAPGKGL EVWAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEF LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLG
23	LC de PD1-5	EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNWYQQKPGQAP KLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKEV PWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0082] Especificamente, a molécula de anticorpo anti-PD-1 descrita aqui acima tem:

(PD1-1:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; ou (PD1-2:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência

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35/57 de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; ou (PD1-3:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; ou (PD1-4:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; ou (PD1-5:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.

[0083] Otezolizumabe (Tecentriq, também conhecido como MPDL3280A) é um anticorpo monoclonal lgG1k humano derivado de fago que tem como alvo PD-L1 e é descrito, por exemplo, em Deng et al. mAbs 2016;8:593-603. Foi aprovado pelo FDA para o tratamento de pacientes que sofrem de carcinoma urotelial.

[0084] Avelumabe é um anticorpo monoclonal anti-PD-L1 lgG1 humano e descrito, por exemplo, em Boyerinas et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1148-1157.

[0085] Durvalumabe (MEDI4736) é um anticorpo monoclonal lgG1k humano com alta especificidade para PD-L1 e descrito em, por exemplo, Stewart et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1052-1062 ou em Ibrahim et al. Semin. Oncol. 2015;42:474-483.

[0086] Antagonistas de PD-1 adicionais divulgados por Li et al. (supra) ou conhecido por estar em ensaios clínicos, como AMP-224, MEDI0680 (AMP-514), REGN2810, BMS-936559, JS001-PD-1, SHR1210, BMS-936559, TSR-042, JNJ-63723283, MEDI4736, MPDL3280A e MSB0010718C, podem ser utilizados como alternativa ou em adição aos antagonistas acima mencionados.

[0087] As INNs, conforme utilizadas neste pedido, devem abranger

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36/57 também todos os anticorpos biossimilares que possuem as mesmas sequências de aminoácidos, ou substancialmente as mesmas, que o anticorpo originador, incluindo mas não se limitando aos anticorpos biossimilares autorizados sob a 42 USC §262 subseção (k) nos EUA e regulamentos equivalentes em outras jurisdições.

[0088] Os antagonistas de PD-1 listados acima são conhecidos na técnica com sua respectiva fabricação, uso terapêutico e propriedades.

[0089] Em uma modalidade, o antagonista de PD-1 é pembrolizumabe.

[0090] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é nivolumabe.

[0091] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é pidilizumabe.

[0092] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é atezolizumabe.

[0093] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é avelumabe.

[0094] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é durvalumabe.

[0095] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PDR-001.

[0096] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-1.

[0097] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-2.

[0098] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-3.

[0099] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-4.

[00100] Em outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-5.

[00101] Dentro desta invenção, deve ser entendido que as combi nações, composições, kits, métodos, usos ou compostos para uso de acordo com esta invenção podem prever a administração simultânea, concomitante, sequencial, sucessiva, alternativa ou separada dos agentes ou componentes ativos. Será apreciado que a molécula de ligação biespecífica e o antagonista de PD-1 podem ser administrados formulados de forma dependente ou independente, como por exemplo,

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37/57 a molécula de ligação biespecífica e o antagonista de PD-1 podem ser administrados como parte da mesma composição farmacêutica/forma de dosagem ou, de preferência, em composições farmacêuticas/formas de dosagem separadas.

[00102] Nesse contexto, combinação ou combinado, na acepção desta invenção, inclui, sem limitação, um produto que resulta da mistura ou combinação de mais de um agente ativo e inclui combinações fixas e não fixas (por exemplo, livres) (incluindo kits) e usos, como, por exemplo, o uso simultâneo, concomitante, sequencial, sucessivo, alternativo ou separado dos componentes ou agentes. O termo combinação fixa significa que os agentes ativos são administrados simultaneamente a um paciente na forma de uma única entidade ou dosagem. O termo combinação não fixa significa que os agentes ativos são administrados a um paciente como entidades separadas simultaneamente, concomitantemente ou sequencialmente, sem limites de tempo específicos, em que essa administração fornece níveis terapeuticamente eficazes dos dois compostos no corpo do paciente. Este último também se aplica à terapia de coquetel, por exemplo, a administração de três ou mais agentes ativos.

[00103] A administração da molécula de ligação biespecífica/Composto A e do antagonista de PD-1/Composto B pode ocorrer coadministrando os componentes ou agentes ativos, como, por exemplo, administrando-os simultaneamente ou concomitantemente em uma única ou em duas formulações ou formas de dosagem. Alternativamente, a administração da molécula de ligação biespecífica e do antagonista de PD-1 pode ocorrer administrando os componentes ou agentes ativos sequencialmente ou em alteração, como por exemplo, em duas formulações ou formas de dosagem separadas.

[00104] Por exemplo, a administração simultânea inclui administração substancialmente ao mesmo tempo. Essa forma de administração

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38/57 também pode ser chamada de administração concomitante. A administração simultânea inclui a administração dos agentes ativos no mesmo período de tempo geral, por exemplo, no(s) mesmo(s) dia(s), mas não necessariamente no mesmo horário. A administração alternativa inclui a administração de um agente durante um período de tempo, por exemplo, ao longo de alguns dias ou uma semana, seguida pela administração do outro agente durante um período subsequente, por exemplo, ao longo de alguns dias ou semana e, em seguida, repetindo o padrão por um ou mais ciclos. A administração sequencial ou sucessiva inclui a administração de um agente durante um primeiro período de tempo (por exemplo, durante alguns dias ou uma semana) usando uma ou mais doses, seguida pela administração do outro agente durante um segundo período de tempo (por exemplo, durante alguns dias ou uma semana) usando uma ou mais doses. Um cronograma de sobreposição também pode ser empregado, o que inclui a administração dos agentes ativos em dias diferentes durante o período de tratamento, não necessariamente de acordo com uma sequência regular. Variações nessas diretrizes gerais também podem ser empregadas, por exemplo, de acordo com os agentes utilizados e as condições do indivíduo.

[00105] Portanto, em uma modalidade preferencial, no método de acordo com a presente invenção, o Composto A, como descrito neste pedido, é administrado simultaneamente, concomitantemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto B, como descrito neste pedido. Em uma modalidade preferencial similar, o Composto A, como descrito neste pedido, para utilização em um método de acordo com a presente invenção, é administrado simultaneamente, concomitantemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto B, como descrito neste pedido. Em uma modalidade preferencial relacio

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39/57 nada, o Composto B, como descrito neste pedido, para utilização em um método de acordo com a presente invenção, é administrado simultaneamente, concomitantemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto A, como descrito neste pedido. Em uma outra modalidade preferencial, o uso do Composto A, como descrito neste pedido, é fornecido em que o Composto A deve ser administrado simultaneamente, concomitantemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto B. Em uma outra modalidade preferencial relacionada, o uso do Composto B como descrito neste pedido é fornecido em que o Composto B é para ser administrado simultaneamente, concomitantemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto A. Em outra modalidade, o kit de acordo com a presente invenção é fornecido em que a primeira composição farmacêutica deve ser administrada simultaneamente, concomitantemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com a segunda composição farmacêutica.

[00106] As vias de administração preferenciais para o Composto A, o Composto B, ou ambos, administrados separadamente ou simultaneamente, incluem, entre outras, administração oral, entérica, parenteral (por exemplo, injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, transdérmica ou subcutânea ou implante), nasal, vaginal, retal ou tópica. Em uma modalidade preferencial, a via de administração é a administração intravenosa, especialmente infusão ou injeção intravenosa. Os compostos da presente invenção podem ser formulados, isoladamente ou em conjunto, em formulações unitárias de dosagem adequadas contendo veículos, excipientes e/ou veículos convencionais não tóxicos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, apropriados para cada via de administração. Com mais preferência, as formulações incluem formas de dosagem sólidas, semissólidas ou líquidas, como lioPetição 870190106491, de 21/10/2019, pág. 66/114

40/57 filização, soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, lipossomas e supositórios. O modo preferencial depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. Modalidades especialmente preferenciais incluem formulações líquidas e liofilização. No caso de uma liofilização, o liofilizado pode ser reconstituído em um líquido, de preferência, água. [00107] Os compostos como descritos neste pedido podem ser administrados diariamente, 5 vezes por semana, 3 vezes por semana, 2 vezes por semana, uma vez por semana, uma vez em 2 semanas, uma vez em 3 semanas, uma vez em 4 semanas. Intervalos de administração preferenciais incluem uma vez por semana e uma vez a cada 2 semanas.

[00108] De preferência, os compostos A e B são administrados uma vez por semana por infusão iv.

[00109] Um regime de administração pode incluir tratamento de longo prazo. Por longo prazo entende-se pelo menos duas semanas e, de preferência, várias semanas, meses ou anos de duração. As modificações necessárias neste regime de dosagem podem ser determinadas por um versado na técnica usando apenas experimentação de rotina, dados os ensinamentos apresentados neste pedido. Ver Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico em caso de qualquer complicação. A administração pode ser diária, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, um dia por semana, dois dias por semana, um dia por duas semanas, um dia por três semanas, etc.

[00110] Os compostos como descritos neste pedido podem ser administrados em quantidades terapeuticamente eficazes em doses únicas ou divididas administradas em intervalos de tempo apropriados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade

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41/57 eficaz em dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico desejado e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou distúrbio. A quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos de acordo com a presente invenção pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do composto para obter uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do composto são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma dose terapeuticamente eficaz inibe preferencialmente um parâmetro mensurável, por exemplo, uma taxa de crescimento do tumor em pelo menos cerca de 20%, com mais preferência, em pelo menos cerca de 40%, ainda com mais preferência, em pelo menos cerca de 60% e, ainda com mais preferência, em pelo menos cerca de 80% em relação a indivíduos não tratados ou em relação a um período não tratado anterior do mesmo indivíduo a ser tratado.

[00111] Os compostos ativos podem ser administrados em doses que são terapeuticamente eficazes em monoterapia, ou em doses que são mais baixas ou mais altas que as doses utilizadas em monoterapia, mas quando combinadas resultam em uma quantidade terapeuticamente eficaz desejada (em conjunto). A quantidade das moléculas de ligação biespecífica da invenção necessária para uso no tratamento pode ser adaptada à molécula de ligação específica selecionada, à via de administração, à natureza da condição a ser tratada e à idade e condição do paciente e, em última análise, estará a critério do médico ou clínico assistente. Além disso, a dosagem das moléculas de ligação da invenção pode ser adaptada dependendo da célula, tumor, tecido, enxerto ou órgão alvo.

[00112] A dose desejada de Composto A ou Composto B pode ser

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42/57 administrada como uma quantidade fixa por administração ou em bolus, para atingir uma concentração sanguínea definida no paciente.

[00113] A administração do Composto B, o antagonista de PD-1, como descrito neste pedido pode, por exemplo, ser por injeção (por exemplo, por via subcutânea ou intravenosa) a uma dose de cerca de 0,1 a 30 mg/kg de peso corporal do paciente, por exemplo, cerca de 0,5 a 25 mg/kg de peso corporal do paciente, cerca de 1 a 20 mg/kg de peso corporal do paciente, cerca de 2 a 5 mg/kg de peso corporal do paciente ou cerca de 3 mg/kg de peso corporal do paciente.

[00114] As dosagens e regimes terapêuticos do antagonista de PD1 podem ser determinados por um versado na técnica. Os regimes de dosagem preferenciais para um antagonista de PD-1 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal do hospedeiro ou 3 mg/kg de peso corporal do hospedeiro por administração intravenosa, com o anticorpo sendo administrado usando um dos seguintes esquemas de dosagem:

(i) a cada quatro semanas por seis doses, depois a cada três meses;

(ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal do hospedeiro uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal do hospedeiro a cada três semanas. Em certas modalidades, o antagonista de PD-1 é administrado por injeção (por exemplo, por via subcutânea ou intravenosa) a uma dose de cerca de 1 a 40 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, por exemplo, 1 a 30 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, por exemplo, cerca de 5 a 25 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, cerca de 10 a 20 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, cerca de 1 a 5 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, 1 a 10 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, 5 a 15 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, 10 a 20 mg/kg de peso corporal do hospedeiro, 15 a 25 mg/kg de peso corporal do hospedeiro ou cerca de 3 mg/kg de peso corporal do hospedeiro. O esquema de dosagem pode variar, por exemplo, uma vez por semana a uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas. Em uma modalidade, o

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43/57 antagonista de PD-1 é administrado em uma dose de cerca de 10 a 20 mg/kg de peso corporal do hospedeiro a cada duas semanas. A molécula de anticorpo pode ser administrada por infusão intravenosa a uma taxa de mais de 20 mg/min, por exemplo, 20-40 mg/min, e tipicamente maior ou igual a 40 mg/min para atingir uma dose de cerca de 35 a 440 mg/m², tipicamente cerca de 70 a 310 mg/m², e mais tipicamente, cerca de 110 a 130 mg/m². Em modalidades, a taxa de infusão de cerca de 110 a 130 mg/m² atinge um nível de cerca de 3 mg/kg de peso corporal do hospedeiro. Em outras modalidades, a molécula de anticorpo pode ser administrada por infusão intravenosa a uma taxa de menos do que 10 mg/min, por exemplo, menor ou igual a 5 mg/min para atingir uma dose de cerca de 1 a 100 mg/m², por exemplo, cerca de 5 a 50 mg/m², cerca de 7 a 25 mg/m², ou de cerca de 10 mg/m². Em algumas modalidades, o anticorpo é infundido durante um período de cerca de 30 min. Deve-se notar que os valores de dosagem podem variar de acordo com o tipo e a severidade da condição a ser aliviada. Deve ser entendido ainda que, para qualquer indivíduo em particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de dosagem estabelecidos neste pedido são exemplares apenas e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.

[00115] O esquema de dosagem do Composto A e do Composto B, separadamente ou em conjunto, pode variar de, por exemplo, uma vez por semana a uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas. Em uma certa modalidade, a quantidade ou dosagem administrada do Composto A, Composto B, ou ambos, é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% menor). Em outras modalidades, a quantidade ou dosagem do Composto A, Composto B

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44/57 ou ambos, que resulta em um efeito desejado (por exemplo, tratamento de uma doença hiperproliferativa ou oncológica) é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% menor).

[00116] O método, compostos, compostos para uso, usos de compostos, composição farmacêutica e kit de acordo com a presente invenção compreende administração ao indivíduo de uma combinação de uma molécula de anticorpo biespecífica e uma molécula de anticorpo anti-PD-1, como descrito neste pedido.

[00117] Dependendo da doença cancerígena a ser tratada, a terapia combinada, conforme definida neste pedido, pode ser utilizada sozinha ou em combinação adicional com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, em particular selecionados de agentes quimioterapêuticos ou compostos terapeuticamente ativos que inibem a angiogênese, vias de transdução de sinal ou pontos de verificação mitóticos nas células cancerígenas.

[00118] O agente terapêutico adicional pode ser administrado simultaneamente, opcionalmente como um componente da mesma preparação farmacêutica, ou antes ou após a administração da molécula de ligação e/ou do antagonista de PD1.

[00119] O agente quimioterapêutico pode ser selecionado de hormônios, análogos hormonais e anti-hormonais (por exemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreotida, arzoxifeno, pasireotida, vapreotida), inibidores da aromatase (por exemplo, anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo, acetato de goserelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelina, histrelinol, triptorelina), antimetabólitos (por exemplo, antifolatos como

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45/57 metotrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina como 5-fluorouracil, capecitabina, decitabina, nelarabina e gencitabina, análogos de purina e adenosina como mercaptopurina, tioguanina, cladribina e pentostatina, citarabina, fludarabina); antibióticos antitumorais (por exemplo, antraciclinas como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina, mitomicina-C, bleomicina-dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados de platina (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, lobaplatina, satraplatina); agentes alquilantes (por exemplo, estramustina, mecloretamina, melfalano, clorambucil, bussulfano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiureia, temozolomida, nitrosoureias como carmustina e lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por exemplo, alcalóides de vinca como vinblastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina e vincristina; e taxanos como paclitaxel, docetaxel e suas formulações, larotaxel; simotaxel e epotilonas como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); inibidores da topoisomerase (por exemplo, epipodofilotoxinas como etoposídeo e etofofos, teniposídeo, ansacrina, topotecano, irinotecano) e quimioterápicos diversos como amifostina, anagrelida, interferona alfa, procarbazina, mitotano e porfímero, bexaroteno, celecoxibe.

[00120] Em uma modalidade preferencial, o tratamento envolvendo o Composto A e o Composto B inclui ainda uma terapia de dupleto de platina, isto é, terapia com (i) um composto de platina como cisplatina ou carboplatina, mais (ii) um agente quimioterápico de terceira geração, como docetaxel, paclitaxel, vinorelbina ou gencitabina.

[00121] Em outra modalidade preferencial, o tratamento envolvendo o Composto A e o Composto B é combinado com uma terapia de direcionamento de células cancerígenas.

[00122] Em certas modalidades, a doença oncológica ou hiperproliferativa, em particular câncer ou uma doença tumoral, tratada com a terapia combinada como revelada neste pedido, inclui, mas não está

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46/57 limitada a, um tumor sólido, um câncer hematológico (por exemplo, leucemia, linfoma, mieloma, por exemplo, mieloma múltiplo) e lesão metastática. Em uma modalidade, o câncer é um tumor sólido. Exemplos de tumores sólidos incluem neoplasias, por exemplo, sarcomas e carcinomas, por exemplo, adenocarcinomas de vários sistemas orgânicos, como os que afetam o pulmão, mama, ovário, linfoide, gastrointestinal (por exemplo, cólon), anal, órgãos genitais e trato geniturinário (por exemplo, renal, urotelial), células da bexiga, próstata), faringe, SNC (por exemplo, células cerebrais, neurais ou gliais), cabeça e pescoço, pele (por exemplo, melanoma) e pâncreas, além de adenocarcinomas que incluem doenças malignas, como câncer de cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de fígado, câncer de pulmão de não pequenas células, câncer de intestino delgado e câncer de esôfago. O câncer pode estar em estágio inicial, intermediário, tardio ou câncer metastático.

[00123] Como utilizado neste pedido, doença hiperproliferativa refere-se a condições em que o crescimento celular é aumentado acima dos níveis normais. Por exemplo, doenças ou distúrbios hiperproliferativos incluem doenças malignas (por exemplo, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer biliar) e doenças não malignas (por exemplo, aterosclerose, hiperplasia benigna, hipertrofia prostática benigna).

[00124] Em uma modalidade, o câncer é escolhido entre um câncer de pulmão (por exemplo, CPNPC (por exemplo, um CPNPC com histologia escamosa e/ou não escamosa ou um adenocarcinoma de CPNPC)), um melanoma (por exemplo, um melanoma avançado), um câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais), câncer de fígado, mieloma (por exemplo, mieloma múltiplo), câncer de próstata, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama que não expressa um, dois ou todos os receptores de estrogênio, receptor de progesterone ou Her2/neu, por exemplo, câncer de mama triplo negativo), cân

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47/57 cer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), câncer anal, câncer gastroesofágico, câncer de tireoide, câncer cervical, doença linfoproliferativa (por exemplo, doença linfoproliferativa póstransplante) ou câncer hematológico, linfoma de células T, linfoma de células B, linfoma não Hodgkin ou leucemia (por exemplo, leucemia mieloide ou leucemia linfoide).

[00125] Em outra modalidade, o câncer é escolhido entre um carcinoma (por exemplo, carcinoma avançado ou metastático), melanoma ou um carcinoma de pulmão, por exemplo, um CPNPC.

[00126] Em uma modalidade, o câncer é um câncer de pulmão, por exemplo, um CPNPC ou câncer de pulmão de pequenas células. Em uma modalidade preferencial, o câncer é CPNPC.

[00127] Em uma modalidade especialmente preferencial combinável com qualquer aspecto e modalidade da invenção, a terapia de combinação de acordo com a presente invenção é para tratar um paciente que sofre de CPNPC não escamoso localmente avançado ou metastático sem mutação de EGFR ou translocação de ALK. Nesse caso, opcionalmente, o paciente é selecionado de acordo com seu status de expressão de PD-L1, como status de expressão alto ou baixo de PD-L1. O tratamento pode ser um tratamento de primeira linha, ou seja, o primeiro tratamento administrado para a doença (CPNPC). Consequentemente, o paciente não pode ter sido submetido à quimioterapia ou terapia de radiação, em particular não para o tratamento de CPNPC quando tratado de acordo com a invenção. Ao determinar o status da expressão de PD-L1 antes de qualquer tratamento de câncer do paciente, resultados confiáveis podem ser alcançados.

[00128] O status da expressão de PD-L1 pode ser determinado como descrito por Han et al. (Journal of Pathology and Translational Medicine 2017; 51: 40-48) ou por Wang et al. (OncoTargets and The

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48/57 rapy 2016:9 5023-5039), como pelo uso de imuno-histoquímica. Uma amostra de biópsia do tumor do paciente a ser tratado pode ser usada para determinação do status de expressão de PD-L1. Uma biópsia única ou múltiplas biópsias do tumor de um paciente individual podem ser usadas, no caso de mais de uma biópsia usada, de preferência, a biópsia com a expressão mais alta de PD-L1 é usada para determinar o status da expressão de PD-L1 de acordo com a invenção. PD-L1 pode ser determinado na expressão da superfície celular (membranosa) ou citoplasmática, expressão apenas por células tumorais e/ou por outras células do meio tumoral (por exemplo, células imunes). Os limiares para considerar a expressão positiva de PD-L1 podem ser, por exemplo, pelo menos 1%, pelo menos 5% ou pelo menos 10% de expressão de PD-L1 em células, por exemplo, tumor e/ou células imunes, em que amostras com >1%, >5% ou >10% de expressão de PDL1 em células, por exemplo, conforme determinado por imunohistoquímica, podem ser consideradas positivas para PD-L1. Em uma modalidade preferencial, o status de expressão de PD-L1 é determinado em células tumorais ou células imunes, com mais preferência, em células tumorais, em que uma expressão de PD-L1 de 1% a 5% das células é considerada baixa expressão de PD-L1 e uma expressão de PD-L1 de >5% das células, por exemplo, >5% a 40% de células, é considerada alta expressão de PD-L1, como acima, de preferência, por determinação por imuno-histoquímica, por exemplo, como descrito por Han et al. ou Wang et al. Os pacientes a serem tratados podem ser pacientes com baixa expressão de PD-L1, pacientes com alta expressão de PD-L1, pacientes com baixa expressão de PDL1, excluindo pacientes com alta expressão de PD-L1 ou pacientes com alta expressão de PD-L1, excluindo pacientes com baixa expressão de PD-L1.

[00129] Em uma modalidade, o câncer é um melanoma, por exem

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49/57 pio, um melanoma avançado. Em uma modalidade, o câncer é um melanoma avançado ou irressecável que não responde a outras terapias. Em outras modalidades, o câncer é um melanoma com uma mutação BRAF (por exemplo, uma mutação BRAF V600).

[00130] Em outra modalidade, o câncer é um hepatocarcinoma, por exemplo, um hepatocarcinoma avançado, com ou sem uma infecção viral, por exemplo, uma hepatite viral crônica.

[00131] Em uma outra modalidade, o câncer é um câncer de próstata, por exemplo, um câncer de próstata avançado.

[00132] Em ainda outra modalidade, o câncer é um mieloma, por exemplo, mieloma múltiplo.

[00133] Em ainda outra modalidade, o câncer é um câncer renal, por exemplo, um carcinoma de células renais (RCC) (por exemplo, um RCC metastático ou carcinoma de células renais claras (CCRCC)).

[00134] Como descrito acima, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o Composto A e o Composto B como definido neste pedido e a um kit compreendendo uma primeira composição farmacêutica compreendendo o Composto A como definido neste pedido e a uma segunda composição farmacêutica compreendendo o Composto B como definido neste pedido.

[00135] O termo composição farmacêutica, como definido neste pedido, refere-se a uma preparação que é de forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nela seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a composição seria administrada. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo versado, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.

[00136] Independentemente da via de administração selecionada,

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50/57 os Compostos utilizados em uma terapia combinada da presente invenção e/ou a composição farmacêutica, a primeira composição farmacêutica e a segunda composição farmacêutica da presente invenção, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecido por aqueles versados na técnica.

[00137] O kit como definido neste pedido pode compreender um recipiente adequado ou vários recipientes adequados compreendendo a primeira composição farmacêutica e/ou a segunda composição farmacêutica, em que a primeira e a segunda composição farmacêutica podem estar contidas no mesmo recipiente ou em diferentes recipientes. O kit pode ser utilizado em qualquer método ou em qualquer uso da invenção.

[00138] De preferência, o kit de acordo com a presente invenção compreende ainda um folheto informativo compreendendo instruções legíveis para o uso do Composto A e/ou Composto B no tratamento e/ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, de preferência, câncer ou uma doença tumoral, especialmente CPNPC, em um paciente em necessidade do mesmo. As instruções podem fornecer mais detalhes conforme descrito acima em relação ao método inventivo e qualquer uma de suas modalidades preferenciais.

[00139] O uso da palavra um ou uma quando usada em conjunto com o termo compreendendo nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar um, mas também é consistente com o significado de um ou mais, pelo menos um e um ou mais de um.

[00140] Aproximadamente, conforme utilizado neste pedido, significa um grau aceitável de erro para a quantidade medida, dada a natureza da precisão das medições. Graus de erro exemplificadores estão dentro de 20%, tipicamente dentro de 10% e mais tipicamente dentro de 5% de um determinado valor ou faixa de valores.

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[00141] O termo tratar ou tratamento, conforme utilizado neste pedido, significa curar um estado ou condição de doença já presente ou aumentar a probabilidade de recuperação do estado ou condição de doença. O tratamento também pode incluir a inibição, ou seja, interromper o desenvolvimento de um estado ou condição de doença e melhorar, ou seja, causar regressão ou retardar a progressão de uma doença. O tratamento pode ser para melhorar os sintomas da doença sem curar um paciente.

[00142] O termo prevenir ou prevenção, conforme utilizado neste pedido, não significa impedir que um estado ou condição de doença ocorra completamente em um paciente ou indivíduo, mas também pode se referir a um risco reduzido de desenvolver um estado ou condição de doença.

[00143] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, sem ser necessariamente limitada pelas modalidades da invenção. Um exemplo ou parte do mesmo, incluindo compostos, doses e vias de administração, bem como combinações de tratamento, cada um como tal ou em combinação com a descrição detalhada acima, faz parte da invenção.

EXEMPLOS

Acrônimos e Abreviações

CD Agrupamento de diferenciação

DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco

SFB Soro Fetal Bovino

ID Identificador

i.p. intraperitoneal

LAG-3 gene 3 de ativação de linfócitos

M Molar

MEM Meio Essencial Mínimo

PBS Solução salina tamponada com fosfato

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PD-1 Morte celular programada 1

PD-L1 Ligante de morte celular programada 1 PD-L2 Ligante de morte celular programada 2 q3ou4d a cada 3^o ou 4^o dia (duas vezes por semana) R Resposta

TGI Inibição do crescimento tumoral, calculada com a fórmula:

TGI = 100 x {1 - [(Tratado dia final - Tratado dia 1) / (Controle dia final Controle dia 1)]}

TIL Linfócitos infiltrantes de tumor

Exemplo 1

Compostos de teste

[00144] Um anticorpo anti-PD-1 murino lgG2a de rato EX101359 (clone RMP1-14) (10 mg/kg), a proteína de ligação biespecífica para VEGF e Ang2, VEGFANGBII22 (com uma estrutura/sequência conforme definidas acima e nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13), a pequena molécula TKI vatalanibe e o anticorpo CrossMab vanucizumabe (antiVEGF-A humano e anti-Ang-2 humana/murina) foram utilizados para esses experimentos. Para o grupo de controle, foi utilizado o isotipo correspondente ao anticorpo PD-1 lgG2a de rato (EX101362) (10 mg/kg), isto é, um anticorpo que possui uma sequência semelhante, mas não se liga a PD-1. Todos os anticorpos foram diluídos em PBS 1x e foram encomendados à BioXcell, West Lebanon, NH, EUA.

Células

[00145] LL/2(LLC1) é uma linhagem celular de carcinoma de pulmão murina, adquirida na American Type Culture Collection (ATCC), EUA (CRL-1642). As células foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos T175 a 37 °C e CO2 5%. O meio utilizado foi DMEM suplementado com 10% de SFB (Soro Fetal Bovino HyClone® Caracterizado; Cat No SH30071.03; Thermo Scientific). As culturas foram divididas a cada dois ou três dias, com uma proporção de 1:4/1:6.

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Camundongos

[00146] C57BL/6NTac é uma linhagem de camundongo totalmente imune, fornecida pela Taconic Denmark. Camundongos fêmeas foram enviadas da Taconic com 7 semanas de idade para uma instalação animal local. Após a chegada à instalação animal, os camundongos foram deixados se ajustando às condições pelo menos por 5 dias antes de serem utilizados para os experimentos. Foram alojados em grupos de 10 em condições padronizadas a 21,5 ± 1,5 °C de temperatura e 55 ± 10% de umidade. Dieta padronizada (PROVIMI KLIBA) e água da torneira autoclavada foram fornecidas ad libitum. Microchips subcutâneos implantados sob anestesia com isoflurano foram utilizados para identificar cada camundongo. Cartões de gaiola mostrando o número do estudo, o número de identificação do animal, o anticorpo e os níveis de composto e dose, a via de administração e o cronograma permaneceram com os animais durante todo o estudo.

Estabelecimento de tumores, randomização

[00147] Os animais foram despachados aleatoriamente pelo programa de computador SEPIA para os diferentes grupos. Para estabelecer o modelo de tumor subcutâneo, as células LL/2 foram coletadas, ressuspensas em PBS/SFB 5% e misturadas 1:2 com Matrigel Matrix (sem fatores de crescimento, Corning, Tewksbury, MA, EUA) a 5 x 10⁵/ml. 100 μΙ de suspensão de células contendo 5 x 10⁴ células foram injetados por camundongo (dia 5).

Administração do composto de teste

[00148] Os anticorpos foram diluídos em PBS a 1 mg/mL e injetados intraperitonealmente com um volume de 10 ml/kg. A diluição foi mantida a 4°C por um máximo de 5 dias. O início do tratamento (dia 1) foi de 3 dias após a injeção celular. Vatalanibe foi suspenso em uma solução de Natrosol 5% (hidroxietilcelulose) e ministrado intragastricamente por agulha de gavagem (Infusionskanüle Olive A, Acufirm,

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No. 14 64 11-1). O volume de administração foi de 10 ml por kg de peso corporal. A administração era uma vez a cada 24 h. Para preparar a suspensão, o composto foi adicionado à solução de Natrosol e a mistura foi agitada durante a noite. Às vezes, era necessária ultrassonicação. As soluções foram mantidas à temperatura ambiente no escuro por no máximo 1 semana.

Tabela 2: Grupos de tratamento

Grupo	n° de camundongos	Composto(s) de tratamento	Dose [mg/kg]	Cronograma	Via
1	10	- anticorpo isotipo PD-1 (ΕΧ101362)	10 mg/kg	g3ou4d	i.p.
2	10	- anticorpo anti-PD-1 murino (ΕΧ101359)	10 mg/kg	g3ou4d	i.p.
3	10	- VEGFANGBII22	15 mg/kg	g3ou4d	i.p.
4	10	- Vatalanibe (EXBF003)	100mg/kg	gd	po
5	10	- anticorpo anti-PD-1 murino (EX101359); - VEGFANGBII22; - Vatalanibe (EXBF003)	10 mg/kg, 15 mg/kg, 100mg/kg	g3ou4d, gd	ip, po
6	10	- anticorpo anti-VEGF/Ang2 (vanucizumabe);	15 mg/kg	g3ou4d	i.p.
7	10	- anticorpo anti-PD-1 murino (EX101359); - anticorpo anti-VEGF/Ang2 (vanucizumabe); - Vatalanibe (EXBF003)	10 mg/kg, 15 mg/kg, 100mg/kg	g3ou4d, gd	iP, po

Monitorando o crescimento do tumor e a progressão da doença

[00149] Os diâmetros dos tumores foram medidos três vezes por semana (segunda, quarta e sexta-feira) com um paquímetro. Do dia 14 ao dia 28 após o início do tratamento, todos os tumores foram medidos diariamente. O volume de cada tumor [em mm³] foi calculado de acordo com a fórmula volume do tumor = comprimento * diâmetro² * pi/6. Para monitorar os efeitos colaterais do tratamento, os camundongos foram inspecionados diariamente quanto a anormalidades e o peso corporal foi determinado pelo menos três vezes por semana. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram um tamanho de 1500 mm³ ou uma necrose tumoral foi maior do que 1/3 da superfície do tumor. Além disso, animais com perda de peso corporal >18% foram sacrificados por razões éticas. Os valores de inibição do crescimento tumoral (TGI) foram calculados da seguinte forma:

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TGI = 100 x {1-[(tratados dia finai - tratados _dia 1) / (controle dia finai - controle dial)]}

Análise estatística - eficácia antitumoral

[00150] Para a avaliação da significância estatística da inibição tumoral, foi realizado um teste U paramétrico Mann-Whitney-Wilcoxon unilateral, baseado na hipótese de que um efeito seria mensurável apenas em uma direção (ou seja, expectativa de inibição tumoral, mas não de estimulação tumoral). Nesse caso, o teste U compara a classificação dos tumores individuais de dois grupos, de acordo com o volume absoluto em um dia específico (comparações pareadas entre grupos). A análise foi realizada no dia 17 do experimento. Os valores de p obtidos pelo teste U foram ajustados pela correção de BonferroniHolm. Por convenção, os valores de p < 0,05 indicam significância das diferenças.

Resultados

[00151] Os camundongos no grupo de controle isotópico foram tratados duas vezes por semana com EX101362 por via intraperitoneal. Durante o período de tratamento, os tumores cresceram de um volume médio de 41 mm³ para um volume de 1275 mm³. O tratamento com 10 mg/kg de EX101359, o anticorpo anti-murino PD-1, foi administrado duas vezes por semana por via intraperitoneal. O tratamento com EX101359 reduziu o crescimento do tumor em comparação com o controle do isotipo (TGI mediana = 51%).

[00152] O tratamento apenas com VEGFANGBII22 resultou em uma TGI de 49%. O tratamento apenas com vatalanibe resultou em uma TGI de 54%. O tratamento combinado com vatalanibe, VEGFANGBII22 e anti-PD1 resultou em uma TGI de 79%.

[00153] O tratamento apenas com vanucizumabe resultou em uma TGI de 64%. O tratamento combinado com vatalanibe, vanucizumabe e anti-PD1 resultou em uma TGI de 81%.

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[00154] Resultados adicionais da combinação e resultados de compostos comparativos são mostrados na Figura 1.

Conclusão

[00155] Neste estudo, as monoterapias de anti-PD1, vatalanibe (direcionado a VEGFR), VEGFANGBII22 e vanucizumabe mostraram uma resposta antitumoral mínima a média com valores de TGI de 51%, 54%, 49% e 64%, respectivamente. As combinações triplas de fármacos de anti-PD1 mais vatalanibe mais VEGFANGBII22 ou antiPD1 mais vatalanibe mais vanucizumabe foram claramente mais eficazes com valores de TGI de 79% e 81%. Ao analisar as curvas de resposta dos tumores individuais, a combinação tripla de fármacos de anti-PD1 mais vatalanibe mais VEGFANGBII22 se destaca, pois um dos tumores tratados mostra encolhimento, enquanto todos os tumores no grupo tratado com anti-PD1 mais vatalanibe e vanucizumabe mostram crescimento tumoral reduzido.

[00156] As combinações triplas de fármacos mostram um melhor efeito antitumoral comparado ao controle do isotipo e às monoterapias. A combinação tripla de fármacos anti-PD1 mais vatalanibe mais VEGFANGBII22 até induziu encolhimento do tumor em um indivíduo tratado. Todos os tratamentos foram bem tolerados neste experimento.

[00157] Deverá ser entendido do exposto acima que, ao transferir esses resultados para uma terapia em seres humanos, o composto VEGFANGBII22 incluirá uma atividade anti-Ang2 e também antiVEGF, pois esse composto se liga ao VEGF humano. Dessa forma, não será necessário o uso adicional de um agente anti-VEGF, como o vatalanibe, no experimento descrito acima. Dessa forma, os dados acima indicam que o tratamento de seres humanos com VEGFANGBII22 mais um antagonista de PD1, como um anticorpo anti-PD1, trará efeitos terapêuticos úteis em pacientes humanos.

Exemplo 2

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[00158] Uma experiência adicional foi criada essencialmente como descrita no Exemplo 1, comparando monoterapias com a combinação tripla de fármacos VEGFANGBII22 mais anticorpo anti-PD1 mais vatalanibe (com o vatalanibe mimetizando novamente a atividade antiVEGF em camundongos, cuja atividade não pode ser esperada de VEGFANGBII22 porque o componente de ligação a VEGF desse composto não se liga ao VEGF de camundongo).

[00159] Novamente, os valores de TGI foram determinados, sendo atingidos 80% após a administração da combinação tripla. Em contraste, valores de TGI de 22% (anticorpo anti-PD-1), 27% (atividade antiAng2 de VEGFANGBII22) e 43% (vatalanibe) foram alcançados pelas monoterapias.

[00160] Além disso, a sobrevida dos camundongos no respectivo grupo de tratamento foi determinada. Como pode ser visto na Figura 2, apenas o tratamento com VEGFANGBII22, vatalanibe e o antagonista de PD1 proporcionou sobrevida significativamente além do limite de 30 dias. Novamente, isso mostra que se pode esperar que o tratamento proposto atinja efeitos superiores também em seres humanos (novamente entendido que a atividade anti-VEGF já será fornecida pelo componente VEGFANGBII22, de modo que não será necessária a adição de vatalanibe).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratamento ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente em necessidade do mesmo

a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto A e

b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto B, em que o Composto A é uma molécula de ligação biespecífica compreendendo um domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF, um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica, e um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 em que o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação a VEGF possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: SYSMG (SEQ ID NO: 1),

CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG (SEQ ID NO: 2),

CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY (SEQ ID NO: 3);

o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: SFGMS (SEQ ID NO: 4),

CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 5),

CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO: 6);

o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 possui as seguintes sequências de CDR:

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CDR1: DYAIG (SEQ ID NO: 7),

CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 8),

CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO: 9); e em que o Composto B é um antagonista de PD-1.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença oncológica ou hiperproliferativa é câncer ou uma doença tumoral.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a doença oncológica ou hiperproliferativa é câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os ditos domínios variáveis únicos de imunoglobulina do Composto A são domínios VHH.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o Composto A tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:13.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo que consiste em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, PD1-1, PD12, PD1-3, PD1-4e PD1-5.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o Composto A é administrado si

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3/8 multaneamente, concorrentemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto B.
10. Composto A, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, de preferência, câncer ou uma doença tumoral, especialmente preferencialmente CPNPC, o dito método compreendendo a administração do Composto A em combinação com o Composto B a um paciente em necessidade dos mesmos, em que o composto B é definido como em qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 8.
11. Composto A, para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o Composto A é administrado simultaneamente, concorrentemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto B.
12. Composto B, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, em particular câncer ou uma doença tumoral, especialmente CPNPC, o dito método compreendendo a administração do Composto B em combinação com Composto A a um paciente em necessidade dos mesmos, em que o Composto A é como definido na reivindicação 1,4 ou 5.
13. Composto B para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o Composto B é administrado simultaneamente, concorrentemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto A.
14. Uso do Composto A, como definido na reivindicação 1, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, de preferência, câncer ou uma

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4/8 doença tumoral, com mais preferência, CPNPC, em que o Composto A deve ser usado em combinação com o composto B, em que o composto B é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 8.
15. Uso do Composto A, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o Composto A deve ser administrado simultaneamente, concorrentemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto B.
16. Uso do Composto B, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 8, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, de preferência, câncer ou uma doença tumoral, com mais preferência, CPNPC, em que o composto B deve ser usado em combinação com o Composto A, em que o Composto A é como definido na reivindicação 1,4 ou 5.
17. Uso do Composto B, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o Composto B deve ser administrado simultaneamente, concorrentemente, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente ou separadamente com o Composto A.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende

a) um Composto A e

b) um Composto B em que o Composto A é uma molécula de ligação biespecífica compreendendo um domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF, um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica, e um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à

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Ang2 em que o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação a VEGF possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: SYSMG (SEQ ID NO: 1),

CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG (SEQ ID NO: 2),

CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY (SEQ ID NO: 3);

o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: SFGMS (SEQ ID NO: 4),

CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 5),

CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO: 6);

o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: DYAIG (SEQ ID NO: 7),

CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 8),

CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO: 9); e em que o Composto B é um antagonista de PD-1.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que os ditos domínios variáveis únicos de imunoglobulina do Composto A são domínios VHH.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que o Composto A tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13.
21. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PDL1.

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22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo que consiste em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.
24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais veículos, excipientes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método de tratamento e prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, de preferência, câncer ou uma doença tumoral, com mais preferência, CPNPC.
26. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende

a) uma primeira composição farmacêutica compreendendo o Composto A e

b) uma segunda composição farmacêutica compreendendo o Composto B, em que o Composto A é uma molécula de ligação biespecífica compreendendo um domínio variável único de imunoglobulina de ligação ao VEGF, um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica, e um domínio variável único de imunoglobulina de ligação à

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Ang2 em que o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação a VEGF possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: SYSMG (SEQ ID NO: 1),

CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG (SEQ ID NO: 2),

CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY (SEQ ID NO: 3);

o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à albumina sérica possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: SFGMS (SEQ ID NO: 4),

CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 5),

CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO: 6);

o dito domínio variável único de imunoglobulina de ligação à Ang2 possui as seguintes sequências de CDR:

CDR1: DYAIG (SEQ ID NO: 7),

CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 8),

CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO: 9); e em que o Composto B é um antagonista de PD-1.
27. Kit, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os ditos domínios variáveis únicos de imunoglobulina do Composto A são domínios VHH.
28. Kit, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o Composto A tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13.
29. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1.
30. Kit, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo que con

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8/8 siste em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4e PD1-5.
31. Kit, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.
32. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um folheto informativo compreendendo instruções legíveis para administração simultânea, concorrente, sequencial, sucessiva, alternativa ou separada a um paciente em tratamento ou prevenção de uma doença oncológica ou hiperproliferativa, de preferência, câncer ou uma doença tumoral, CPNPC especialmente preferencial, em um paciente em necessidade do mesmo.