CN105636986B

CN105636986B - 包含vegf拮抗剂和抗-ctla-4抗体的组合的方法和组合物

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Publication number: CN105636986B
Application number: CN201480054902.1A
Authority: CN
Inventors: E·约费; I·洛伊; G·瑟斯顿; E·布罗瓦
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2034-10-17
Also published as: IL244599A0; WO2015058048A1; KR102338453B1; CA2926853C; KR20160067978A; CA2926853A1; JP6607850B2; AU2014337135B2; EA201690633A1; US20180236070A1; CN105636986A; US20160243225A1; IL244599B; JP2016539096A; EA037890B1; US10532096B2; EP3057990B1; US9968674B2; MX2016004736A; EP3057990A1

Abstract

本发明提供包含VEGF拮抗剂和抗‑CTLA‑4抗体的药物组合物以及使用它的方法。本发明的组合物和方法可用于治疗癌症和其它疾病和病症，其中抗血管生成疗法和/或靶向的免疫反应可能是有益的。

Description

包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合的方法和组合物

发明领域

本发明涉及用于治疗癌症及其它疾病和病症的组合治疗。更具体地,本发明涉及包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的治疗组合及其使用方法。

发明背景

血管内皮生长因子(VEGF)是参与血管生成的细胞因子。配体VEGF-A与VEGF受体-1(VEGFR1)和VEGFR2相互作用,从而在正常血管和肿瘤血管中引发血管生成信号传导途径。已知VEGF的拮抗剂可用于治疗许多种疾病和病症，包括癌症、眼睛疾病和与过度的、不需要的或不适当的血管生成有关的其它状况。VEGF拮抗剂的一个例子是aflibercept(也被称为VEGF Trap；以

销售,Regeneron Pharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)。Aflibercept是基于VEGF受体的嵌合分子，它包含与来自VEGFR2的结构域3融合的来自VEGFR1的结构域2,结构域3又通过铰链区连接到人IgG1的Fc(a)结构域。Aflibercept被批准用于治疗结肠直肠癌并且也正在被开发用于治疗其它癌性状况。VEGF Trap被描述在例如美国专利号7,070,959中；也参见,Holash et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:11393-11398(2002)。

细胞毒性的与T-淋巴细胞有关的抗原-4(CTLA-4)是免疫球蛋白超级蛋白家族的成员并且参与T-细胞激活的负调节。在T细胞激活时,CTLA-4被上调并且与CD28竞争与B7的结合,从而为T细胞激活传导抑制信号。已经显示抗CTLA-4的抗体阻断CTLA-4与共激发的分子B7.1和B7.2(CD80和CD86)之间的相互作用。这种阻断消除了T-细胞上CTLA-4-介导的抑制信号，从而激发抗癌细胞的天然免疫反应。已经显示抗-CTLA-4抗体在临床上治疗例如转移性黑素瘤是有效的。实例性的抗-CTLA-4抗体包括伊匹木单抗(

Bristol-Myers Squibb,公开在US6,984,720中)或tremelimumab(Pfizer,公开在US8,491,895中)。

尽管VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体已经个别地显示了在肿瘤和其它癌性状况的治疗中的巨大前景,但是需要更加定向的、强有力的并且持续的治疗选择来有效地治疗这样的疾病和病症。因此，在现有技术中对于用于治疗癌症的新治疗方法存在未满足的需要。

发明概述

根据本发明的一个方面,提供了药物组合物，该药物组合物包含:(i)VEGF拮抗剂；(ii)抗-CTLA-4抗体；和(iii)药学上可接受的载体或稀释剂。

根据本发明的另一个方面,提供了用于抑制或减弱受试者中肿瘤生长的方法。根据本发明的这个方面所述的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。

根据本发明的另一个方面,提供了用于增长或延长受肿瘤折磨的受试者的存活的方法。根据本发明的这个方面的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。

根据本发明的另一个方面,提供了用于在受试者中诱导肿瘤免疫的方法。根据本发明的这个方面的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。在某些实施方式中,根据本发明的这个方面治疗的受试者，在给所述受试者施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体之前或之时，遭受肿瘤折磨。

关于包括向受试者施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的本发明方面,可以以分开的剂型或以单个剂型(例如联合制剂)向所述受试者施用所述的VEGF拮抗剂和所述的抗-CTLA-4抗体。正如本文别处所公开的那样，各种定量给药计划和施用方案都被考虑在本发明的这些方面中。

被包括在以及被用于本发明的组合物和方法中的VEGF拮抗剂可以是抗-VEGF抗体、抗-VEGF受体抗体或基于VEGF受体的嵌合分子(VEGF Trap)。在某些实施方式中,所述的VEGF拮抗剂是aflibercept。

被包括在以及被用于本发明的组合物和方法中的抗-CTLA-4抗体可以是拮抗剂抗体。在某些实施方式中,所述抗-CTLA-4抗体是伊匹木单抗或tremelimumab。

从随后详细描述的综述中，本发明的其它实施方式将会变为显而易见的。

附图简述

图1-3举例说明在第0天被植入了Colon-26肿瘤细胞并且在第3、7、10、14和18天通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果("早治疗肿瘤模型")。图1描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm³表示)。图2显示在植入后第22天每一个实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)。图3描绘在植入后在各个时间点不同实验组中小鼠的存活百分数。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。"IgG"是IgG2同种型对照；"Fc"是人Fc对照；"hVGT"是aflibercept(akaVEGF Trap)；"抗-CTLA-4"是抗-小鼠CTLA-4IgG2b克隆9D9。

图4A-4B举例说明在初始的肿瘤激发和用所指示的分子组合治疗，然后在初始肿瘤植入后第60天用Colon-26肿瘤细胞再激发(没有额外的治疗)后,小鼠中肿瘤体积的测量值。图4A显示在所述肿瘤再激发后第14天在所指示的实验组(或原始[未治疗的]对照)中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)；以及图4B显示在所述肿瘤再激发后第32天在所指示的实验组(或原始[未治疗的]对照)中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)。"IgG"是IgG2同种型对照；"Fc"是人Fc对照；"hVGT"是aflibercept(akaVEGF Trap)；"抗-CTLA-4"是抗-小鼠CTLA-4IgG2b克隆9D9。

图5-7举例说明在第0天被植入了Colon-26肿瘤细胞并且在第11、15、17、21和25天通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果("晚治疗肿瘤模型")。图5描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm³表示)。图6显示在植入后第70天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)。图7描绘在植入后在各个时间点不同实验组中小鼠的存活百分数。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。"IgG"是IgG2同种型对照；"Fc"是人Fc对照；"hVGT"是aflibercept(akaVEGF俘获剂)；"抗-CTLA-4"是抗-小鼠CTLA-4IgG2b克隆9D9。

图8-12举例说明在Colon-26肿瘤植入后第7天开始，在用所指示的单独疗法或组合疗法或对照组合治疗的小鼠中肿瘤生长、消退、坏死和组织病理学参数。图8描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm³表示)。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。图9显示在植入后第21天时每一个实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)。

图10显示在第21天时在每个治疗组中小鼠肿瘤消退的程度(在1至4的分级尺度上打分)。以H&E切片中受坏死、肿瘤/肿瘤周围浸润液或纤维化影响的肿瘤块的分数的估算值形式来给肿瘤消退分级。1级＝0-25％,2级＝25-50％,3级＝50-75％,4级＝75-100％。

图11显示在第21天时从每个治疗组中的小鼠中采集并且接受组织病理学检查的肿瘤的肿瘤坏死程度(在1至4的分级尺度上打分)。分级是基于肿瘤块中坏死组织的百分数的。1级＝0-25％,2级＝25-50％,3级＝50-75％,4级＝75-100％。

图12,A-C组分别显示在第21天时每个治疗组中小鼠的炎性细胞浸润液象、肿瘤纤维化象和有丝分裂象的程度。A组显示炎性细胞浸润液的程度(在1至3的分级尺度上打分)。1级＝很少的小的细胞聚集物/灶,2级＝较大的炎性细胞灶,3级＝汇合的灶常常变成肿瘤块边界和内部的局部广泛的淋巴组织细胞浸润液。B组显示肿瘤纤维化的程度(在0至2的分级尺度上打分)。纤维化分数是基于马森的三色染色剂的:0级＝罕见至偶尔有胶原纤维疏落在肿瘤处，要么作为肿瘤基质的一部分，要么作为血管周围或与其它结构(例如骨骼肌)缔合的预先存在的胶原；或者疏落在坏死的区域，在那里偶见的细胶原束被认为是预先存在的肿瘤基质的部分；1级＝细胶原纤维的灶性沉积至灶性广泛性沉积,受限于肿瘤边界，该边界常常与肿瘤/肿瘤周围浸润液的区域重叠或靠近坏死区域；2级＝多灶性的或局部广泛性的如针对1级所描述的胶原纤维沉积的区域。在肿瘤周围以同心方式沉积的纤维组织或在真皮中预先存在的胶原纤维没有被包括在所述的估算中。C组显示个别治疗组的有丝分裂象。将有丝分裂象表示成在每个肿瘤的5个有活力的不相重叠的高倍40倍视野(hpf)中观察到的有丝分裂象的总数。

图13和14举例说明在第0天时被植入了Colon-26肿瘤细胞并且在肿瘤建立后在第12、15、19、22、26、30、33、37和41天时用所指示的抗-CTLA-4抗体(具有IgG2a或IgG2b同种型)或同种型对照治疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果("晚治疗肿瘤模型")。图13描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm³表示)。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。图14描绘在植入后在各个时间点不同实验组中小鼠的存活百分数。

图15-17举例说明在第0天时被植入了MC38肿瘤细胞并且在肿瘤建立后在第10、14、17、21和24天时用所指示的抗-CTLA-4抗体(具有IgG2a或IgG2b同种型)或同种型对照治疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果("晚治疗肿瘤模型")。图15描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm³表示)。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。图16显示在植入后在第21天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)。图17描绘在植入后在各个时间点不同实验组中小鼠的存活百分数。

图18和19举例说明在第0天时被植入了MC38肿瘤细胞并且在第15、17、23、25、27、33、35和7天时通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠肿瘤生长的结果("晚治疗肿瘤模型")。图18描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm³表示)。图19显示在植入后在第24天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)。"IgG2a"是IgG2a同种型对照；"Fc"是人Fc对照；"hVGT"是aflibercept(akaVEGF Trap)；"抗-CTLA-4IgG2a"是具有IgG2a同种型的抗-小鼠CTLA-4抗体。

图20和21举例说明在第0天时被植入了MC38肿瘤细胞并且在第10、14、18、21和25天时通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长结果("晚治疗肿瘤模型")。图20描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm³表示)。图21显示在植入后在第18天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm³表示)。

图22举例说明在第0天时被植入了MC38肿瘤细胞并且在第9、13、16和20天时通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长结果(肿瘤体积[用mm³表示])("晚治疗肿瘤模型")。

图23、24和25描绘血管生成标记基因Dll4(图23)、Ang2(图24)和Robo4(图25)的相对表达水平,正如在用所指示的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样。

图26描绘E-选择蛋白的相对表达水平，正如在用所指示的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样。

图27和28分别描绘CD8和CD247的相对表达水平,正如在用所指示的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样；它们的表达反映各个治疗组中浸润肿瘤的淋巴细胞的表达水平。

图29和30分别描绘炎性细胞因子IFNγ和TNFα的相对表达水平,正如在用所指示的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样。

图31、32和33分别描绘Itgam(CD11b)、Emr1(F4/80)和Itgax(CD11c)的相对表达水平,正如在用所指示的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样；它们的表达反映各个治疗组中骨髓细胞浸润液的水平(分别是骨髓细胞、巨噬细胞和树突细胞)。

详细描述

在描述本发明之前，应该理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件,因为这样的方法和条件可以变化。也应该理解本文所用的术语仅仅用于描述具体实施方式的目的，并不想要限定本发明的保护范围，因为本发明的保护范围仅仅由所附的权利要求来限定。

除非以其它方式定义，本文中使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的意义。正如本文中所用的那样，当参考具体引述的数值被使用时，术语"大约"的意思是该数值可以从所引述的值变化不超过1％。例如，正如本文中所用的那样,表达"大约100"包括99和101以及所有处于其间的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。

尽管在本发明的实践中可以使用与本文中所描述的相似或等价的任何方法和材料，但是现在描述了优选的方法和材料。通过引用并入了本文中提到的所有出版物来描述它们整体。

VEGF拮抗剂

正如本文中所用的那样,表达"VEGF拮抗剂"意指阻断、减小或干扰血管内皮生长因子(VEGF)或VEGF受体的正常生物学活性的任何分子。VEGF拮抗剂包括干扰VEGF和天然VEGF受体之间的相互作用的分子,例如与VEGF或VEGF受体结合并且阻止或以其它方式阻碍VEGF和VEGF受体之间的相互作用的分子。具体的示例性的VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体(例如bevacizumab

)、抗-VEGF受体抗体(例如抗-VEGFR1抗体、抗-VEGFR2抗体等)和基于VEGF受体的嵌合分子(本文中也被称为"VEGF-Traps")。

基于VEGF受体的嵌合分子包括嵌合多肽，它包括两个或更多个免疫球蛋白(Ig)-样的VEGF受体结构域，例如VEGFR1(也被称为Flt1)和/或VEGFR2(也被称为Flk1或KDR),并且也可以包含多聚化结构域(例如Fc结构域，它促进两个或更多个嵌合多肽的多聚化[例如二聚化])。示例性的基于VEGF受体的嵌合分子是被称为VEGFR1R2-FcΔC1(a)(也被称为aflibercept)的分子，它被SEQ ID NO:1的核酸序列编码。VEGFR1R2-FcΔC1(a)包括3个组件:(1)VEGFR1组件，它包含SEQ ID NO:2的氨基酸27-129；(2)VEGFR2组件，它包含SEQ IDNO:2的氨基酸130-231；和(3)多聚化组件("FcΔC1(a)")，它包含SEQ ID NO:2的氨基酸232-457(SEQ ID NO:11的C-末端氨基酸[即K458]可以或不可以被包括在本发明的方法中所使用的VEGF拮抗剂中；参见例如美国专利7,396,664)。SEQ ID NO:2的氨基酸1-26是信号序列。

抗-CTLA-4抗体

正如本文中所用的那样,表达"抗-CTLA-4抗体"是指特异性地结合与细胞毒性的T淋巴细胞缔合的抗原-4(CTLA-4)的任何抗体或其抗原结合片段。人CTLA-4具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

可以被使用或包括在本发明的方法和组合物中的非限定性的示例性的抗-CTLA-4抗体包括,例如伊匹木单抗(

Bristol-Myers Squibb,Princeton,NJ)和tremelimumab(Pfizer,New York,NY)。可以被使用在本发明的上下文中的其它抗-CTLA-4抗体包括任何所述的抗-CTLA-4抗体，如记载在,例如美国专利号6,682,736；6,984,720；7,605,238；8,491,895；8,318,916；8,263,073；8,143,379；以及其中所引用的参考文献中。

抗体

术语"抗体,"正如本文中所用的那样(例如抗-VEGF抗体、抗-VEGF受体抗体、抗-CTLA-4抗体等)包括包含4条多肽链:通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链及其多聚体的免疫球蛋白分子(例如IgM)。在典型的抗体中,每一条重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。所述重链恒定区包括3个结构域,C_H1、C_H2和C_H3。每一条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包括一个结构域(C_L1)。可以进一步把所述V_H和V_L区细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区,散布着被称为构架区(FR)的较为保守的区。每一条V_H和V_L由3个CDR和4个FR组成,以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同的实施方式中,所述抗-IL-4R抗体(或其结合抗原的部分)的FR可以与所述人种系序列相同,或者可以是天然或人工修饰的。可以基于对两个或更多个CDR的并列分析来确定氨基酸共有序列。

如本文中所用的术语"抗体也包括完整抗体分子的抗原结合片段。术语抗体的"结合抗原的部分"、抗体的"结合抗原的片段"等,正如本文中所用的那样,包括特异性地结合抗原而形成复合物的任何天然存在的、可通过酶促方式获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。可以使用任何合适的标准技术，例如涉及编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的操纵和表达的蛋白水解消化或重组基因工程技术，来例如从完整的抗体分子衍生抗体的抗原结合片段。这样的DNA是已知的并且/或容易从,例如商业来源,DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)获得,或者能够被合成。可以测序所述的DNA并且以化学方式或者通过使用分子生物学技术对所述的DNA进行操作,例如用来把一个或更多个可变的结构域和/或恒定的结构域排列成合适的构型,或者用来引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。

抗原结合片段的非限定性实例包括:(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)最小识别单元，它由模仿抗体高变区的氨基酸残基(例如分离的互补决定区(CDR)例如CDR3肽)或受限制的FR3-CDR3-FR4肽组成。其它工程化的分子,例如结构域特异性的抗体、单个结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳抗体(例如一价的纳抗体、二价的纳抗体等)、小的模块式免疫药物(SMIPs)和鲨鱼可变IgNAR结构域也被包括在如本文中所用的表述"抗原结合片段"内。

抗体的抗原结合片段典型地将会包括至少一个可变结构域。所述的结构域可以是任何尺寸或氨基酸组成的并且一般地将会包括至少一个CDR，该CDR相邻于或处于具有一个或更多个构架序列的构架中。在具有与V_L结构域缔合的V_H结构域的抗原结合片段中,所述V_H结构域和V_L结构域可以相对于彼此处于任何合适的排列中。例如，所述可变区可以是二聚的并且含有V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。备选地,抗体的抗原结合片段可以含有单体V_H或V_L结构域。

在某些实施方式中,抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明抗体的抗原结合片段中找到的非限定性的示例性的可变结构域和恒定结构域的构型包括:(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在包括上述列举的任何示例性的构型在内的可变结构域和恒定结构域的任何构型中,所述的可变结构域和恒定结构域彼此之间可以直接相连或者可以通过全长或部分铰链或接头区相连。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，这导致在单个多肽分子中相邻的可变结构域和/或恒定结构域之间柔性或半柔性连接。而且,本发明抗体的抗原结合片段可以包括彼此之间并且/或与一个或更多个单体V_H或V_L结构域以非共价缔合(例如通过二硫键)的具有上述列举的任何可变结构域和恒定结构域构型的均二聚体或杂二聚体(或其它多聚体)。

本文中所用的术语"抗体,"也包括多特异性(例如双特异性)抗体。多特异性抗体或抗体的抗原结合片段典型地将会包含至少两个不同的可变结构域,其中每一个可变结构域能够与分离的抗原或同一个抗原上不同的表位特异性地结合。可以使用本领域中可利用的常规技术，对任何多特异性抗体形式进行调适以用于本发明的抗体或抗体的抗原结合片段背景中。例如，本发明包括包含使用双特异性抗体的方法，其中免疫球蛋白的一条臂对于VEGF,VEGFR、CTLA-4或其片段是特异性的,并且免疫球蛋白的另一条臂对于第二个治疗靶是特异性的并且与治疗部分缀合。可以被用在本发明的上下文中的示例性的双特异性形式包括但不限于,例如基于scFv的形式或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双可变结构域(DVD)-Ig、Quadroma、钮孔、普通的轻链(例如具有钮孔的普通的轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab²双特异性形式(参见例如Klein et al.2012,mAbs 4:6,1-11,及其中引用的参考文献,关于前述形式的综述)。也可以使用肽/核酸缀合来构建双特异性抗体,例如其中使用具有正交的化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性的抗体-寡核苷酸缀合物，后者然后自组装成具有确定的组成、价和几何形状的多聚复合物。(参见,例如Kazane等人,J.Am.Chem.Soc.[电子公开:2012年12月4日])。

本发明的方法中所用的抗体可以是人抗体。术语"人抗体"，正如本文中所用的那样,意指包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。虽然如此，本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过随机的或位点特异性的体外诱变或通过体内体细胞突变引入的突变),例如在CDR中特别是CDR3中的。然而,术语"人抗体"，正如本文中所用的那样,并不意指包括其中衍生自另一哺乳动物物种的种系(例如小鼠)的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上的抗体。

本发明的方法中所用的抗体可以是重组的人抗体。术语"重组的人抗体"，正如本文中所用的那样,意指包括所有通过重组手段制备、表达、创造或分离的人抗体,例如利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下面进一步描述)、从重组的、组合的人抗体库中分离的抗体(下面进一步描述)、从对于人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过任何其它涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的手段制备、表达、创造或分离的抗体。这样的重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式中,让这样的重组人抗体接受体外诱变(或者,当使用用于人Ig序列的转基因动物时,体内体细胞诱变)，因此所述重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是那些序列:它们虽然衍生自人种系V_H和V_L序列并且与它们相关,但是可以不天然地存在于体内人抗体种系的所有组成成分中。

根据某些实施方式,本发明的组合物和方法中所用的抗体特异性地结合靶抗原(例如VEGF、VEGF受体、CTLA-4等)。术语"特异性地结合"诸如此类,意指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。用于确定抗体是否与抗原特异性地结合的方法是本领域中熟知的并且包括例如，平衡透析、表面等离振子共振等。例如，如本发明的上下文中所用的"特异性地结合"CTLA-4的抗体包括结合CTLA-4或其部分的抗体，其K_D小于大约1000nM、小于大约500nM、小于大约300nM、小于大约200nM、小于大约100nM、小于大约90nM、小于大约80nM、小于大约70nM、小于大约60nM、小于大约50nM、小于大约40nM、小于大约30nM、小于大约20nM、小于大约10nM、小于大约5nM、小于大约4nM、小于大约3nM、小于大约2nM、小于大约1nM或小于大约0.5nM,如表面等离振子共振实验中所测定的那样。然而，特异性地结合人IL-4Rα的分离的抗体可以与来自其它(非人)物种的其它抗原(例如IL-4Rα分子)具有交叉反应性。

在本发明的组合物和方法的上下文中使用的抗体可以具有pH-依赖性的结合特性。例如，与在中性pH时相比，在酸性pH时，用于本发明的组合物和方法中的抗体可以展示减小的与其抗原的结合。备选地,与在中性pH时相比，在酸性pH时，本发明的抗体可以展示增强的与其抗原的结合。表述"酸性pH"包括小于大约6.2的pH值,例如大约6.0、5.95、5.9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小。正如本文中所用的那样,表述"中性pH"是指大约7.0至大约7.4的pH。表述"中性pH"包括大约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。

在某些情形中,根据在酸性pH时抗体和其抗原结合的K_D值与在中性pH时抗体和其抗原结合的K_D值的比率(或反过来也一样)来表示"与在中性pH时相比，在酸性pH时减小的与抗原的结合"。例如，为了本发明的目的，如果所述抗体或其抗原结合片段展示大约3.0或更大的酸性/中性K_D比率，可以认为抗体或其抗原结合片段展示了"与在中性pH时相比，在酸性pH时减小的与CTLA-4的结合"。在某些示例性的实施方式中,本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性K_D比率可以是大约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。

可以获得具有pH-依赖性的结合特性的抗体,例如通过筛查抗体群的与在中性pH时相比，在酸性pH时减小的(或增强的)与特定抗原的结合。此外,在氨基酸的水平上对结合抗原的结构域的修饰可以产生具有pH-依赖性特性的抗体。例如，通过把结合抗原的结构域(例如在CDR内)的一个或更多个氨基酸替换为组氨酸,可以获得相对于在中性pH时，在酸性pH时具有减小的结合抗原的抗体。正如本文中所用的那样,表达"酸性pH"是指6.0或更小的pH。

在本发明的组合物和方法的上下文中所用的抗体可以包括包含一个或更多个突变的Fc结构域，所述突变增强或减小抗体与FcRn受体的结合,例如在酸性pH时，与在中性pH时相比增强或减小抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括在所述Fc结构域的C_H2或C_H3区包含突变的抗体(例如抗-VEGF,抗-VEGF受体,抗-CTLA-4等),其中所述的突变在酸性环境中(例如在内体中，那里的pH范围为大约5.5至大约6.0)增大所述Fc结构域与FcRn的亲和力。当向动物施用时，这样的突变可以导致所述抗体的血清半寿期增大。这样的Fc修饰的非限定性的例子包括,例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一种实施方式中,所述的修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。

例如，本发明包括包含抗体(例如抗-VEGF,抗-VEGF受体,抗-CTLA-4等)的方法和组合物，所述抗体包含Fc结构域，该Fc结构域含有一对或更多对或组的选自由下列组成的组的突变:250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。在本发明的保护范围内考虑了本文公开的前述Fc结构域突变和所述抗体的可变结构域中的其它突变的所有可能的组合。

本发明人已经证明:在小鼠模型系统中，与VEGF拮抗剂(例如VEGF Trap)和抗-CTLA-4IgG2b抗体的组合相比，VEGF拮抗剂(例如VEGF Trap)和抗-CTLA-4IgG2a抗体的组合提供优越的抗-肿瘤效果(参见,例如本文下面的实施例4)。提供ADCC和CDC效应子活性的小鼠IgG2a的人抗体等同物是IgG1。因此,本发明包括包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合物和方法,其中所述抗-CTLA-4抗体具有提供ADCC和CDC效应子活性的Fc同种型，例如IgG1。

包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的药物组合物

本发明包括包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的药物组合物。根据本发明的这个方面的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。用于联合配制生物学治疗剂的方法是本领域中已知的并且可以被本领域普通技术人员使用来制造本发明的药物组合物。

正如本文中所用的那样,表述"药学上可接受的载体或稀释剂"包括合适的载体、赋形剂和提供合适的转移、递送、耐药性等等的其它药剂。可用于本发明的上下文中的示例性的制剂能够在Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中找到。可以接受的制剂包括,例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡状物、油状物、脂质、含有脂质(阳离子的或阴离子的)的小泡(例如LIPOFECTIN^TM)、DNA缀合物、无水的吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。也参见Powell等人"Compendium of excipients for parenteralformulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311.

治疗方法和施用方法

本发明包括用于抑制或减轻受试者中肿瘤生长的方法。根据本发明的这个方面的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。可以通过测量在施用本发明的治疗组合(例如施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体)前后受试者中肿瘤的尺寸来评估对肿瘤生长的抑制和/或减弱。与在施用本发明的治疗组合之前相比，在施用本发明的治疗组合后，肿瘤尺寸的减小或肿瘤生长速度的减小指示在受试者中肿瘤生长的抑制或减弱。在某些实施方式中,本发明的方法导致肿瘤消退。根据本发明的某些实施方式,肿瘤生长的减弱意味着在施用本发明的治疗组合后肿瘤的生长速度比在施用本发明的治疗组合之前肿瘤的生长速度至少小大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。正如本文中所用的那样,"肿瘤生长的减弱"也包括肿瘤体积的减小(例如肿瘤消退)。

本发明也包括用于增加或延长遭受肿瘤折磨的受试者存活的方法。根据本发明的这个方面的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。增长或延长患有肿瘤的受试者的存活意味着:与不接受任何治疗或一般性地接受被谈论的肿瘤的护理标准的情况相似的携带肿瘤的受试者相比，在施用本发明的治疗组合(例如施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体)后,受试者具有更长的存活时间。改善的存活时间意味着与不接受任何治疗或一般性地接受被谈论的肿瘤的护理标准的情况相似的携带肿瘤的受试者相比，大约1个星期、2个星期、4个星期、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月、26个月、28个月、30个月、36个月、40个月或更长的存活。

本发明也包括用于在受试者中诱导肿瘤免疫的方法。根据本发明的这个方面的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。根据本发明的这个方面的某些实施方式,在用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体治疗所述受试者之前，所述受试者可能遭受肿瘤折磨,并且在这样的治疗之后，所述受试者变成对未来的肿瘤免疫或抗性的。正如本文中所用的那样,诱导肿瘤免疫意味着在接受本发明的治疗组合后，受试者对未来的肿瘤有抗性或实质上有抗性。肿瘤免疫也意味着以前遭受肿瘤折磨并且被成功地治疗(例如通过施用本发明的治疗组合)的受试者在未来将不会经历相同或相似类型肿瘤的发展。

根据某些实施方式,本发明的方法可以包括以分开的剂型向所述受试者施用所述的VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体。例如，可以以分开的注射、灌输或本领域已知的其它药物递送手段向所述受试者递送所述的VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体。当分开施用时，可以同时地或顺序地给所述受试者施用分开的剂型(即一个包含VEGF拮抗剂，而另一个包含抗-CTLA-4抗体)。如果同时地施用，在小于大约1分钟的时间跨度内向所述受试者施用两种药剂。如果顺序地施用,在第一个时间点施用一种药剂，并且在第二个较晚的时间点施用另一种药剂。第二个时间点可以是在第一个时间点之后1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时或更长。在某些实施方式中,首先施用VEGF拮抗剂,之后施用抗-CTLA-4抗体。在其它实施方式中,首先施用抗-CTLA-4抗体,之后施用VEGF拮抗剂。

根据本发明的方法,可以以分开的剂型以相同的施用频度(例如一星期一次、每两个星期一次、每四个星期一次、每八个星期一次、每十个星期一次、每十二个星期一次等)向受试者施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体。备选地,可以以分开的剂型以不同的施用频度向受试者施用这两种药剂。例如，可以以比抗-CTLA-4抗体更高的频度向受试者施用VEGF拮抗剂；或者可以以比VEGF拮抗剂更高的频度向受试者施用抗-CTLA-4抗体。

根据某些实施方式,本发明的方法可以包括以单一剂型向受试者施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体。正如本文中所用的那样,"单一剂型"是指包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体两者的组合物。在某些实施方式中,所述的单一剂型可包含一种或更多种药学上可接受的载体或稀释剂，正如本文别处所公开的那样。用于把两种或更多种生物学治疗剂联合配制成单一剂型的方法是本领域中已知的，并且视情况而定,可以被用在本发明的这个方面的上下文中。

本发明的方法和组合物可用于治疗产生于大脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男女生殖道、肌肉、骨头、皮肤和附件、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝脏和尿道以及特殊的感觉器官例如眼睛中的原发性和/或转移性肿瘤。根据本发明的方法和组合物，能够治疗的具体的癌症包括,例如肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、成胶质细胞瘤和黑素瘤。

在某些实施方式中,本发明的方法和组合物可用于治疗受试者中抗-VEGF-抗性的肿瘤。"抗-VEGF-抗性的肿瘤"，正如本文中所用的那样,是指对采用抗-VEGF药剂例如抗-VEGF抗体、抗-VEGF受体抗体或任何其它VEGF-特异性的结合蛋白(包括例如VEGF-trap,正如本文中所定义的那样)的治疗不应答或仅仅部分应答的肿瘤。例如，抗-VEGF-抗性的肿瘤可以是例如当其与一定量的平常能够抑制或减弱至少一种肿瘤的生长的VEGF拮抗剂接触时，继续在体外或在体内(例如在细胞培养物中或当被植入动物中时)生长的肿瘤。抗-VEGF-抗性的肿瘤可以是衍生自最初只对抗-VEGF治疗应答的肿瘤细胞,但是通过选择、突变或适应已经获得对一种或更多种抗-VEGF药剂的抗性的肿瘤。

使用本发明的方法和组合物能够治疗的受试者包括被诊断患有癌症或被鉴定患有肿瘤的任何受试者。在某些实施方式中,所述受试者是已经被诊断或鉴定患有至少部分地对抗-VEGF治疗有抗性的肿瘤的患者。用于诊断患者患有抗-VEGF抗性的肿瘤的方法对于本领域普通技术人员将会是已知的并且能够使用常规诊断方法实施。

另外的治疗剂

本发明包括包含与一种或更多种另外的治疗活性组分联合的VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合物和治疗制剂以及治疗方法，所述方法包括向需要的受试者施用这样的组合。

可以与本发明的上下文中的VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体联合和/或联合施用的另外的治疗活性组分包括,例如下列中的一种或更多种:EGFR拮抗剂(例如抗-EGFR抗体[例如西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR的小分子抑制剂[例如吉非替尼或埃罗替尼])、另一EGFR家族成员例如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如抗-ErbB2[例如曲妥单抗或T-DM1

]、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvIII的拮抗剂(例如特异性地结合EGFRvIII的抗体)、cMET激动剂(例如抗-cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如抗-IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如维罗菲尼、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如抗-PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如抗-PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂例如,伊马替尼甲磺酸盐或舒尼替尼苹果酸盐)、PDGF配体抑制剂(例如抗-PDGF-A,-B,-C,或-D抗体、适体、siRNA等)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼))、DLL4拮抗剂(例如在US2009/0142354中公开的抗-DLL4抗体例如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如在US2011/0027286中公开的抗-Ang2抗体例如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如抗-FOLH1抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如抗-STEAP1抗体或抗-STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗-TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗-MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗-CA9抗体)、uroplakin拮抗剂(例如抗-uroplakin[例如抗-UPK3A]抗体)、MUC16拮抗剂(例如抗-MUC16抗体)、Tn抗原拮抗剂(例如抗-Tn抗体)、CLEC12A拮抗剂(例如抗-CLEC12A抗体)、TNFRSF17拮抗剂(例如抗-TNFRSF17抗体)、LGR5拮抗剂(例如抗-LGR5抗体)、单价CD20拮抗剂(例如单价抗-CD20抗体例如利妥昔单抗)等。可以有益地与VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体联合施用或联合配制的其它药剂包括,例如他莫昔芬、芳香酶抑制剂和细胞因子抑制剂,包括小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18)或其各自的受体结合的抗体。

本发明包括与一种或更多种化疗剂联合的包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合物、治疗制剂和治疗方法。可用于本发明这个方面的上下文中的化疗剂的例子包括烷基化剂例如噻替哌和环磷酰胺(Cytoxan^TM)；烷基磺酸酯例如白消安、二丙胺磺酯和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯并多巴、卡波醌、四甲尿烷亚胺和乌瑞替哌；乙烯亚胺和甲基蜜胺类包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；氮芥类例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、氧化氮芥盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、罗氮芥、尼莫司汀、雷诺氮芥；抗生素例如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、加利车霉素、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、培来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物例如甲氨喋呤、伊立替康、甲酰四氢叶酸和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、氨甲叶酸、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类例如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；抗肾上腺药例如安鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物例如frolinicacid；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；5-氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；单哌潘生丁；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK^TM；雷佐生；西作非兰；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类,例如紫杉醇(Taxol^TM,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,新泽西)和多西他赛(Taxotere^TM；Aventis Antony,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任何一个的药学上可接受的盐、酸或衍生物。包括在这个定义中的还有起作用以调节或抑制肿瘤上的激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟三苯氧胺、曲沃昔芬、那洛西芬、LY117018、奥那斯酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素剂例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何一个的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

本发明也包括与抗病毒剂、抗生素、止痛剂、皮质类固醇、类固醇、氧气、抗氧化剂、COX抑制剂、保心药、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAIDs联合的包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合物、治疗制剂和治疗方法。

在本发明的上下文中，可以刚好在施用VEGF拮抗剂和/或抗-CTLA-4抗体之前，与施用VEGF拮抗剂和/或抗-CTLA-4抗体同时，或者在施用VEGF拮抗剂和/或抗-CTLA-4抗体之后不久，施用另外的治疗活性组分,例如上述列举的药剂中的任何一种或其衍生物或组合；(为了本公开的目的,这样的施用方案被认为是"联合"另外的治疗活性组分施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体)。本发明包括药物组合物，其中把VEGF拮抗剂和/或抗-CTLA-4抗体与一种或更多种另外的治疗活性组分联合配制，正如本文别处所描述的那样。

药物递送和施用方法

各种递送系统是已知的并且可以被用来施用本发明的药物组合物,例如封装在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见,例如Wu等人,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。施用方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻腔内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径，例如通过灌输或快速浓注、通过透过上皮或皮肤黏膜衬里(例如口腔黏膜、直肠粘膜和肠黏膜等)来施用所述的组合物并且可以与其它生物学活性剂一起施用所述的组合物。

可以采用标准的针和注射器以皮下或静脉内方式递送本发明的药物组合物(包含例如单一治疗活性剂或两种或更多种治疗活性剂的组合)。此外,关于皮下递送,笔递送装置便利地在递送本发明的药物组合物中有应用。这样的笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置一般利用可替换的包含药物组合物的药筒。一旦药筒内所有的药物组合物已经被施用并且药筒是空的，就能够便利地把空的药筒去掉并且替换成包含药物组合物的新药筒。于是就能够重复使用所述的笔递送装置。在一次性笔递送装置中,没有可替换的药筒。相反，所述的一次性笔递送装置开始预装填了容纳在装置内的库中的药物组合物。一旦所述的库清空了药物组合物，整个装置就被扔掉了。

在某些情况中,能够以控制释放的系统递送药物组合物。在一种实施方式中,可以使用泵。在另一种实施方式中,可以使用聚合材料；参见,Medical Applications ofControlled Release,Langerand Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。还在一种实施方式中,可以把控制释放的系统放置接近所述组合物的靶处,这样只需要全身性剂量的一小部分(参见,例如Goodson,1984,在Medical Applications of ControlledRelease,同上,vol.2,pp.115-138中)。在Langer于1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论了其它控制释放的系统。

能够注射的制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。可以通过已知的方法制备能够注射的制剂。例如，可以例如通过把上述抗体或其盐溶解、混悬或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备能够注射的制剂。作为用于注射的水性介质,有例如，生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助药剂等的等渗溶液,可以将其与合适的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等联合使用。作为油性介质,使用例如蓖麻油、大豆油等,可以将其与增溶剂例如苯甲酸苄基酯、苯甲醇等联合使用。优选地将这样制备的注射剂填充在合适的安瓿中。

有利地,把上述用于口服或肠胃外用途的药物组合物制成被调适以适应活性组分的剂量的呈单位剂量形式的剂型。这样呈单位剂量形式的剂型包括,例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。

剂量

根据本发明的方法，被包含在本发明的药物组合物中并且/或给受试者施用的活性组分(例如VEGF拮抗剂和/或抗-CTLA-4抗体)的量一般是治疗有效量。正如本文中所用的那样,在VEGF拮抗剂和/或抗-CTLA-4抗体的上下文中,表述"治疗有效量"是指单独的或与另一种治疗剂联合的能够在人或动物受试者中产生能够测量的生物学效果的治疗剂的量。这样的能够测量的生物学效果的例子包括,例如在受试者的血清中检测到治疗剂分子、在从受试者采集的生物学样品中检测到相关的代谢产物、在从受试者采集的样品中相关生物标记物浓度的变化、肿瘤尺寸的减小、肿瘤生长速度的减小、肿瘤消退、改善的受试者存活和/或任何其它相关的治疗或临床参数方面的改善。

在VEGF拮抗剂(例如VEGF Trap)或抗-CTLA-4抗体的情形中,治疗有效量可以是大约0.05mg至大约600mg,例如大约0.05mg、大约0.1mg、大约1.0mg、大约1.5mg、大约2.0mg、大约10mg、大约20mg、大约30mg、大约40mg、大约50mg、大约60mg、大约70mg、大约80mg、大约90mg、大约100mg、大约110mg、大约120mg、大约130mg、大约140mg、大约150mg、大约160mg、大约170mg、大约180mg、大约190mg、大约200mg、大约210mg、大约220mg、大约230mg、大约240mg、大约250mg、大约260mg、大约270mg、大约280mg、大约290mg、大约300mg、大约310mg、大约320mg、大约330mg、大约340mg、大约350mg、大约360mg、大约370mg、大约380mg、大约390mg、大约400mg、大约410mg、大约420mg、大约430mg、大约440mg、大约450mg、大约460mg、大约470mg、大约480mg、大约490mg、大约500mg、大约510mg、大约520mg、大约530mg、大约540mg、大约550mg、大约560mg、大约570mg、大约580mg、大约590mg或大约600mg的VEGF拮抗剂或抗-CTLA-4抗体。

可以以抗体的毫克数/千克受试者体重(即mg/kg)来表示给受试者施用的VEGF拮抗剂(例如VEGF Trap)和/或抗-CTLA-4抗体的量。例如，可以以大约0.0001至大约10mg/kg受试者体重的剂量，给患者施用VEGF拮抗剂(例如VEGF Trap)和/或抗-CTLA-4抗体。

实施例

提供下列实施例以便给本领域普通技术人员提供怎么制造和使用本发明的方法和组合物的完全公开和描述,并且其目的不是限定本发明人认为它们的发明的保护范围。已经付出了努力来确保关于所用数值(例如量、温度等)的准确性，但是应该会产生一些实验误差和偏差。除非以其它方式指示,份数是重量份数,分子量是平均分子量,温度是以摄氏度表示的,而压力是在大气压下或附近。

实施例1.在小鼠早治疗肿瘤模型中，抗-CTLA-4抗体和VEGF拮抗剂的组合的抗肿瘤效果

开发了一种早治疗肿瘤模型以测试抗-CTLA-4抗体和VEGF拮抗剂的组合的效力。在这个模型中,在肿瘤植入以后不久施用所述的组合治疗。在这个实验中所用的抗-CTLA-4抗体是抗-小鼠CTLA-4IgG2b克隆"9D9"(BioX Cell,West Lebanon,NH,目录号BE0164)。在这个实验中所用的VEGF拮抗剂是aflibercept(基于VEGF受体的嵌合分子,也被称为"VEGF-Trap"或"VEGFR1R2-FcΔC1(a)"，在本文的别处提供了对它的完全描述)。

对于这个实验模型,在第0天时把1.0x10⁶Colon-26肿瘤细胞植入小鼠中。在第三天开始,在建立能够测量的肿瘤之前,用单一疗法或组合疗法中的一种或对照组合治疗小鼠,如表1中所列的那样:

表1

在两个星期的时期内在5个不同的时间点施用各种疗法(即在第3天,第7天、第10天、第14天和第18天时注射)。

根据在第50天时肿瘤发生率、肿瘤体积、中值存活时间和不含肿瘤的动物数目，评估每个治疗组中的动物(即持续50天)。将肿瘤生长的程度概括在图1(肿瘤生长曲线)和图2(在第22天时的肿瘤体积)中,并且将随时间而变的存活百分数描绘在图3中。也把结果概括在表2中。

表2

与单一药剂治疗组相比，在用VEGF Trap+抗-CTLA-4抗体的组合治疗的动物中，肿瘤生长被实质性地减少了(参见图1和2)。而且在VEGF Trap+抗-CTLA-4抗体组中,存活率被实质性地增大了，有70％的动物存活到肿瘤植入后至少第50天。相比之下,对于抗-CTLA-4和VEGF Trap单一治疗组,存活到第50天的分别只有30％和0％(参见图3和表2)。

因此，这个实施例证明:抗-CTLA-4抗体和VEGF拮抗剂的组合,当在肿瘤发展过程中的早期时间点被施用时,能够抑制肿瘤生长并且改善存活率，达到比单独一种治疗剂远远更大的程度。

实施例2.在小鼠早治疗肿瘤模型中，事先用抗-CTLA-4抗体和VEGF拮抗剂的组合治疗的动物的肿瘤免疫

作为对实施例1的随访,从各个治疗组(参见表1和2)中选择不含肿瘤的动物，并且在初始肿瘤植入后第60天时，用1.0x10⁶个Colon-26肿瘤细胞再激发。还包括在这个实验中作为对照的是没有接受肿瘤激发或治疗的幼稚动物。将用于这个随访实验的各个治疗组概括在表3中。

表3

在所述初始肿瘤细胞植入后第60天时，给来自每个治疗组的动物植入了1.0x10⁶个Colon-26肿瘤细胞(参见实施例1)。在所述肿瘤再激发后第14和32天，评估肿瘤体积和存活率。将结果概括在图4A和4B中。正如所显示的那样,仅仅抗-CTLA-4和VEGF Trap+抗-CTLA-4动物在整个实验进程中仍然是不含肿瘤的(即直到第32天),而没有接受过任何治疗性预处理的幼稚动物正如预期的那样产生了肿瘤。在仅仅抗-CTLA-4组中，所有的三只动物在所述的再激发中存活,而在VEGF Trap+抗-CTLA-4组中，6只动物中的5只在所述的肿瘤再激发中存活，直到实验结束(第32天)。

这个实施例证明:单独用抗-CTLA-4抗体或与VEGF拮抗剂联合治疗诱导免疫记忆反应，后者保护被治疗的受试者免受未来的肿瘤激发影响。

实施例3.在小鼠晚治疗肿瘤模型中，抗-CTLA-4抗体和VEGF拮抗剂的组合的抗-肿瘤效果

在实施例1中,在肿瘤植入以后不久，让小鼠接受治疗性处理。在这个实施例中,相比之下,有目的地延迟治疗，直到肿瘤被建立。按照下列进行实验:在第0天,把1.0x10⁶个Colon-26肿瘤细胞植入小鼠中。在第11天,在肿瘤已经生长到大约60mm³时,把具有相同平均肿瘤尺寸的小鼠随机地分组并且用单一疗法或组合疗法之一或对照组合治疗，正如实施例1中所用的那样(参见表1)。在两个星期的时期内在5个不同的时间点施用各个疗法(即在第11天、第15天、第17天、第21天和第25天时注射)。

根据直到第70天的肿瘤发生率、肿瘤体积、中值存活时间和不含肿瘤的动物数目来评价每个治疗组中的动物。将肿瘤生长的程度概括在图5(肿瘤生长曲线)和图6(在第70天时的肿瘤体积),并且把存活率百分数描绘在图7中。也把结果概括在表4中。

表4

在晚治疗模型中,在抗-CTLA-4单一治疗组中以及在VEGF Trap+抗-CTLA-4组合治疗组中观察到抗肿瘤反应。此外，在抗-CTLA-4单一治疗组以及在VEGF Trap+抗-CTLA-4组合治疗组中观察到增强的存活率,截止到第70天，中值存活百分数分别是86％和80％。

然后进行相似的实验，来评价VEGF Trap+抗-CTLA-4组合以及各种单一药剂和对照组合对Colon-26肿瘤模型中个别肿瘤的肿瘤生长和组织病理学特性的影响。简单来说,在第0天给40只Balb/c成年雄性小鼠(7-8个星期龄)植入Colon-26肿瘤细胞(1.0x10⁶个Colon-26肿瘤细胞/只小鼠，注射到右肋腹中)。允许肿瘤生长到60-80mm³的合适体积(截止到第7天)。在植入后第7天,把小鼠分组并且用单一疗法或组合疗法中的一种或对照组合治疗,正如实施例1中所用的那样(参见表1)。在5个不同的时间点给小鼠施用各种疗法(即在第7天、第11天、第14天、第17天和第20天时注射)。测量治疗期间过程中的肿瘤体积。在植入后第21天,在每个治疗组中从小鼠中采集5个肿瘤用于病理学评价。将肿瘤与相邻的皮瓣一起切除,并且通过浸入新鲜制备的并且pH平衡的10％福尔马林溶液中持续24小时来进行固定，然后用70％乙醇冲洗并且储存在室温下的70％乙醇中。将石蜡包埋的肿瘤切片并且用H&E以及马森的三色组织学特种着色剂着色。把肿瘤体积显示在图8和9中；把在第21天时的肿瘤消退和坏死分别显示在图10和11中。

这第二个实验的结果证实:在这个模型中，抗-CTLA-4或VEGF Trap各自作为单一的药剂都抑制了所建立的Colon-26肿瘤的生长速度,并且组合疗法(VEGF Trap+抗-CTLA-4)引起了肿瘤生长的甚至更大的减少。在这个模型中也观察到:抗-CTLA4抗体疗法增大浸润肿瘤性CD8+T细胞的密度,没有增大CD4+T细胞的密度。

在这个实验中，对肿瘤的组织病理学评价显示由抗-CTLA-4和VEGF Trap两种疗法促进的肿瘤消退；然而,每一种药剂促进肿瘤消退所经由的机制似乎是不同的。特别是,VEGF Trap治疗促进了增加的肿瘤坏死,然而单独的抗-CTLA-4治疗没有促进肿瘤坏死的确定性的增加(图11)。VEGF Trap+抗-CTLA-4的组合治疗导致增强的肿瘤坏死，该肿瘤坏死显著大于在单独的VEGF Trap治疗组中观察到的肿瘤坏死(图11)。

组织病理学评价也显示:抗-CTLA-4治疗(单独或组合)导致增加的肿瘤/肿瘤周围浸润液，该浸润液主要由淋巴细胞和巨噬细胞组成。在所有的治疗组中，增加的肿瘤坏死、炎性细胞浸润液和纤维化都有助于肿瘤消退，但是在抗-CTLA-4治疗组中是突出的(图12A-C)。

这个实施例的结果证实:抗-CTLA-4治疗对于已经建立的肿瘤来说是一种有效的治疗策略,并且采用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合取得了相似的治疗益处。

实施例4.免疫球蛋白恒定区(Fc)对抗-CTLA-4抗体的抗肿瘤效果的影响,以及与高效应子功能(IgG2a)抗-CTLA-4抗体组合的VEGF Trap的增强的抗肿瘤效果

在上面介绍的前述实施例中,在实验中使用了IgG2b同种型的抗-CTLA-4抗体(即商业上可得到的抗-小鼠CTLA-4IgG2b克隆"9D9")。已知IgG2b抗体具有低效应子功能,然而IgG2a抗体具有高效应子功能。因此,在这个实施例中，论述了抗-CTLA-4抗体的免疫球蛋白恒定区的作用。特别是,在晚治疗小鼠Colon-26和MC38肿瘤异种移植模型中，对小鼠抗-CTLA-4抗体的鼠IgG2a和IgG2b形式的抗肿瘤效果作了相互比较。

在第一个实验中,以皮下方式以1x10⁶个细胞/只小鼠，给BalbC小鼠植入了Colon-26肿瘤细胞。在植入后第10天,按照肿瘤体积(60-80mm³)把小鼠随机地分成5组。把不同的治疗组概括在表5中。

表5

在第12、15、19、22、26、30、33、37和41天(即在实验期间，每星期两次)，用100μg抗-CTLA-4抗体或对照抗体，经由腹膜内注射(IP)治疗小鼠,正如表5中所列的那样。一个星期测定两次肿瘤体积和存活。把结果显示在图13(肿瘤体积)和14(存活)中。把中值存活时间显示在表6中。

表6

治疗组	中值存活(天)
		没有治疗的	37
mIgG2a同种型的抗-CTLA-4	>70
		mIgG2b同种型(9D9)的抗-CTLA-4	70
mIgG2a同种型对照	35
		mIgG2b同种型对照	39

在第二个实验中，以皮下方式以3x10⁶个细胞/只小鼠，给C57/BL6小鼠植入了MC38肿瘤细胞。在植入后,在肿瘤达到40-50mm³的平均尺寸后,把小鼠随机地分成5个不同的组。把不同的治疗组概括在表7中。

表7

在第10、14、17、21和24天(即在2个星期内注射5次)，用200μg抗-CTLA-4抗体或对照抗体经由腹膜内注射(IP)治疗小鼠，正如表7中所列的那样。一个星期测定两次肿瘤体积和存活。把结果显示在图15(肿瘤体积随时间的变化)、图16(在第21天时的肿瘤体积)和图17(存活)中。把中值存活时间显示在表8中。

表8

治疗组	中值存活(天)
		没有治疗的	24
mIgG2a同种型的抗-CTLA-4	>31
		mIgG2b同种型(9D9)的抗-CTLA-4	24
mIgG2a同种型对照	24
		mIgG2b同种型对照	24

这些实验结果证明:抗-CTLA-4IgG2a抗体明显地比所述的IgG2b形式更强有力,导致已经建立的Colon-26肿瘤被根除以及已经建立的MC38肿瘤生长被部分地抑制。相比之下,这些已经建立的肿瘤对IgG2b疗法有抗性。

在第三个实验中,在体内研究了抗-CTLA-4mIgG2a抗体和VEGF Trap的组合的抗肿瘤效果。在这个实验中,在第0天以皮下方式以3x10⁵个细胞/只小鼠，给小鼠植入了MC38肿瘤细胞。在植入后,在肿瘤达到60-80mm³的平均尺寸(在第14天)后,把小鼠随机地分成4个不同的组。把不同的治疗组概括在表9中。

表9

在第15、17、23、25、27、33、35和37天，经由腹膜内注射(IP),用所述的对照和实验组合治疗小鼠，正如表9中所列的那样。一个星期两次测定肿瘤体积。把结果显示在图18(肿瘤体积随时间的变化)和19(在第24天时的肿瘤体积)中。

在第四个实验中,在体内研究了抗-CTLA-4mIgG2b抗体和VEGF Trap的组合的抗肿瘤效果。在这个实验中,在第0天以皮下方式以3x10⁵个细胞/只小鼠，给小鼠植入了MC38肿瘤细胞。在植入后,在肿瘤达到60-80mm³的平均尺寸(在第10天)后,把小鼠随机地分成4个不同的组。把不同的治疗组概括在表10中。

表10

在第10、14、18、21和25天，经由腹膜内注射(IP),用所述的对照和实验组合治疗小鼠，正如表10中所列的那样。一个星期两次测定肿瘤体积。把结果显示在图20(肿瘤体积随时间的变化)和21(在第18天时的肿瘤体积)中。

重要地,正如上述第三个和第四个实验中所显示的那样,抗-CTLA-4IgG2a抗体和VEGF Trap(aflibercept)在已经建立的MC38肿瘤中具有强健的组合效应,然而抗-CTLA4IgG2b抗体不能增强VEGF Trap的效力。这些结果提供了关于下列的另外的证据:在临床环境下，把免疫疗法(例如抗-CTLA-4治疗)和VEGF拮抗作用组合可能有利于治疗已经建立的肿瘤。

实施例5.在用抗-CTLA4抗体和VEGF Trap的组合治疗的小鼠中，对于T细胞浸润、激活的免疫和新血管形成的定量评估

在这个实施例中,在已经建立的MC38小鼠癌皮下肿瘤模型中，检查了组合的VEGF-Trap和抗-CTLA-4抗体治疗对肿瘤生长的效果和其它与定量的基因表达和肿瘤浸润相关的参数。

在第0天，给处于8-10星期龄的同基因C57/Bl6小鼠的右肋腹中植入100μl 3x10⁵个MC38细胞的悬浮液。在第9天,把已经建立了肿瘤的具有平均肿瘤体积50mm³的小鼠随机地分组(n＝8只小鼠/组),并且在第9、13、16和20天给它们施用下列四种治疗:抗-CTLA-4抗体(抗-小鼠CTLA4,克隆9D9，具有mIgG2a同种型)、VEGF-Trap(VEGFR1R2-FcΔC1(a))、抗-CTLA-4抗体和VEGF-Trap的组合或同种型对照。以皮下方式以10mg/kg定量给药VEGF-Trap和hFc对照,并且以腹膜内方式以200μg/只小鼠定量给药抗-CTLA-4抗体和mIgG2a同种型对照。

在实验的整个进程中在多个时间点，通过电卡钳测量肿瘤尺寸(体积用mm³表示)。

在第21天,杀死小鼠，并且取下肿瘤用于对特定基因的mRNA进行定量的实时聚合酶链反应(PCR)分析

根据生产商的说明书，使用用于微阵列总RNA分离试剂盒(Ambion by Life Technologies)的MagMAX^TM-96，从组织中纯化总RNA。使用来自上面列举的MagMAX试剂盒(Ambion by Life Technologies)的MagMAX^TMTurbo^TMDNA酶缓冲液和TURBO DNA酶去除基因组DNA。使用

VILO^TMMaster Mix(Invitrogen byLife Technologies)把mRNA逆转录为cDNA。把cDNA稀释到5ng/μL和25ng，并且采用

基因表达主混合物(Applied Biosystems by Life Technologies)，利用ABI7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)扩增cDNA。使用亲环蛋白B(Ppib)作为内部内源性对照基因来把任何cDNA输入差异归一化。将FAM染料标记的Taqman MGB探针(LifeTechnologies)用于小鼠CD247(Mm00446171_m1)、mIFNγ(Mm01168134_m1)、mTNFα(Mm00443260_g1)、mDll4(Mm01338015_m1)、mAng2(Mm00545822_m1)、mRobo4(Mm00452963_m1)、mItgam(Mm00434455_m1)、mEmr1(Mm00802529_m1)、mItgax(Mm00498701_m1)、E-选择蛋白(Mm01310197_m1)。把FAM染料标记的BHQ1探针(BiosearchTechnologies)用于小鼠CD8b。所述PCR的热循环条件如下:初始步骤在95℃持续10分钟,然后是40个循环的95℃持续3秒和60℃持续30秒。按照下列方式计算每种基因的mRNA水平的比例:(每种基因的绝对拷贝数)/(亲环蛋白B的绝对拷贝数)。

将结果表示成平均值+/-标准误差,并且使用带有Tukey的多重比较检验的普通单向ANOVA来评价统计学显著性。小于0.05的值被认为是统计学上显著的。*P<0.05；**P<0.005；***P<0.0005；****P<0.0001。

与对照相比，采用抗-CTLA-4抗体或VEGF-Trap对已经建立的MC38肿瘤的体内治疗导致对肿瘤生长的显著性抑制(图22,分别是实心方块■和空心圆圈○)。采用这两种药剂阻断进一步减少了MC38肿瘤生长,显示了组合抗肿瘤效果(图22,实心三角▲)。

对肿瘤RNA的实时PCR分析已经显示出抗-血管生成剂VEGF-Trap下调血管生成标记基因Dll4、Ang2和Robo4的表达,然而抗-CTLA-4疗法没有影响这些基因(分别是图23、24和25)。VEGF-Trap与抗-CTLA-4Ab的组合显著地增大了E-选择蛋白的水平(图26)，这表明了内皮细胞的激活,该激活反映了淋巴细胞向肿瘤迁移的改善的能力。

为了评估抗肿瘤免疫反应，还利用实时PCR分析来评估浸润肿瘤的淋巴细胞的表达。尽管VEGF-Trap并不影响T淋巴细胞募集,但是抗-CTLA-4Ab疗法实质性地增大了CD8+和CD3+T细胞(CD247)的数目,在所述的组合组中，这些细胞的数目被进一步增加了(图27和28)。使用抗-CTLA4Ab但是不使用VEGF-Trap的治疗,也导致Treg细胞标记物叉头盒蛋白3(FoxP3)增加的表达(没有显示)。

通过评估炎性细胞因子的表达进一步分析了肿瘤免疫环境。抗-CTLA4抗体和所述的组合治疗显著地增加了干扰素(IFNγ)和肿瘤坏死因子(TNFα)的水平,然而VEGF-Trap单一疗法没有这些效果中的任何一种(分别是图29和30)。

为了分析骨髓细胞浸润液,评估了分别作为骨髓细胞、巨噬细胞和树突细胞的标记物的Itgam(CD11b)、Emr1(F4/80)和Itgax(CD11c)的mRNA水平。抗-CTLA4抗体或所述的组合疗法促进了骨髓细胞浸润液的显著增加(图31、32和33),在所述的组合组中，浸润到肿瘤中的树突细胞有最突出的增加。

总的来说,这个实施例进一步证明了抗-CTLA4抗体和VEGF-Trap针对已经建立的肿瘤的显著的组合效果。对被治疗的肿瘤的分子免疫概况分析提示:抗-CTLA4和VEGF-Trap疗法分别通过调节免疫调制和血管生成的信号途径而介导它们的效应,在所述的组合组中，这两者可能都对改善的抗肿瘤免疫反应有贡献。施用VEGF-Trap显示了激活的内皮和血管生成因子Dll4、Ang2和Robo4的下调。在所述的组合组中E-选择蛋白的增强的表达可能指示改善的淋巴细胞粘着和滚动,该粘着和滚动可能导致增强的淋巴细胞向肿瘤组织中的浸润。这个结果与增加的T细胞和骨髓细胞数目以及在抗-CTLA-4治疗的肿瘤中观察到的炎性细胞因子的上调和在所述的组合组中进一步增加相一致,这指示了对于双重的VEGF和CTLA-4阻断的抗肿瘤免疫反应的协同性。

本发明在保护范围方面不限于本文中描述的具体实施方式。实际上,从前述的描述和附图出发，除了本文中描述的那些修饰以外，对本发明的各种修饰对于本领域普通技术人员来说将会变成显而易见的。预期这样的修饰也落入了所附的权利要求书的保护范围里。

Claims

1.一种药物组合物，其包含:(i)包含由SEQ ID NO:1的核酸序列编码的VEGFR1R2-FcΔC1(a)的VEGF Trap；(i i)伊匹木单抗；和(i i i)药学上可接受的载体或稀释剂。

2.组合物在生产用于在受试者中抑制或减轻肿瘤生长的药物中的用途，所述组合物包含治疗有效量的包含由SEQ I D NO:1的核酸序列编码的VEGFR1R2-FcΔC1(a)的VEGFTrap和治疗有效量的伊匹木单抗。

3.权利要求2所述的用途，其中生产的所述组合物用于以单一剂型施用。

4.权利要求2的用途，其中生产所述VEGF trap用于静脉内或皮下施用。

5.权利要求2的用途，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所述伊匹木单抗。

6.组合物用于生产用于增长或延长遭受肿瘤折磨的受试者存活的药物的用途，所述组合物包含治疗有效量的包含由SEQ ID NO:1的核酸序列编码的VEGFR1R2-FcΔC1(a)的VEGF Trap和治疗有效量的伊匹木单抗。

7.权利要求6的用途，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所述的VEGF trap。

8.权利要求6和7中的任意一项所述的用途,其中对所述受试者静脉内或皮下施用所述的伊匹木单抗。

9.组合物在生产用于在受试者中诱导肿瘤免疫的药物中的用途，所述的组合物包含治疗有效量的包含由SEQ ID NO:1的核酸序列编码的VEGFR1R2-FcΔC1(a)的VEGF Trap和治疗有效量的伊匹木单抗。

10.权利要求9的用途，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所述的VEGFtrap。

11.权利要求9-10中的任意一项所述的用途,其中生产所述的伊匹木单抗用于静脉内或皮下施用。