JP2016539096A

JP2016539096A - Ｖｅｇｆアンタゴニスト及び抗ｃｔｌａ−４抗体の組み合わせを含む方法及び組成物

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Publication number: JP2016539096A
Application number: JP2016524116A
Authority: JP
Inventors: エラ・イオッフェ; イザレル・ロウィ; ギャビン・サーストン; エレナ・ブローヴァ
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2016-12-15
Anticipated expiration: 2034-10-17
Also published as: CN105636986A; WO2015058048A1; EA037890B1; KR102338453B1; EP3057990B1; KR20160067978A; MX2016004736A; IL244599B; EP3057990A1; US10532096B2; US20180236070A1; CN105636986B; IL244599A0; CA2926853A1; US20160243225A1; CA2926853C; JP6607850B2; EA201690633A1; US9968674B2; AU2014337135B2

Abstract

本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む医薬組成物、並びにその使用方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、癌並びに抗血管新生治療及び／又は標的化免疫応答が有益であり得る他の疾患及び障害の処置のために有用である。

Description

発明の分野
本発明は、癌並びに他の疾患及び障害の処置のための組み合わせ治療に関する。より詳細には、本発明は、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を含む治療的組み合わせ、並びにその使用方法に関する。

背景
血管内皮増殖因子(VEGF)は、血管新生に関与するサイトカインである。リガンドVEGF-Aは、VEGF受容体-1(VEGFR1)及びVEGFR2と相互作用し、それにより正常及び腫瘍血管において血管新生シグナル伝達経路を開始する。VEGFのアンタゴニストは、癌、眼疾患、及び過剰な、不要な、又は不適切な血管新生を含む他の状態を含む様々な疾患及び障害の処置に有用であることが公知である。VEGFアンタゴニストの例は、アフリベルセプト（aflibercept）(VEGF Trapとしても知られる；ZALTRAP^(R)、Regeneron Pharmaceuticals、Inc.、Tarrytown、NY)である。アフリベルセプトは、VEGFR2からのドメイン3に融合され、今度はヒトIgG1のFc(a)ドメインにヒンジ領域を通して結合された、VEGFR1からのドメイン2を含む、VEGF受容体ベースのキメラ分子である。アフリベルセプトは、結腸直腸癌の処置について認可されており、そして他の癌性状態の処置のためにも開発されている。VEGF Trapは、例えば、特許文献１に記載される；非特許文献１も参照のこと。

細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)は、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、そしてT細胞活性化の負の調節に関与する。T細胞活性化の際に、CTLA-4は上方調節され、そしてB7への結合についてCD28と競合し、それによりT細胞活性化に関する抑制シグナルを伝達する。CTLA-4に対する抗体は、CTLA-4と同時刺激性分子B7.1及びB7.2(CD80及びCD86)との間の相互作用をブロックすることが示された。この遮断は、T細胞でのCTLA-4媒介阻害性シグナルを除去し、それにより癌細胞に対する天然の免疫応答を刺激する。抗CTLA-4抗体は、例えば、転移性黒色腫の処置において臨床的に有効であることが示された。例となる抗CTLA-4抗体としては、イピリムマブ(Yervoy^(R)、Bristol-Myers Squibb、特許文献２に開示される)及びトレメリムマブ(Pfizer、特許文献３に開示される)が挙げられる。

米国特許第7,070,959号 US 6,984,720 US 8,491,895

Holash et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11393-11398 (2002)

VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体は、腫瘍及び他の癌性状態の処置において個々に非常に有望であったが、それにもかかわらず、より方向づけられ、強力で持続した治療選択肢がこのような疾患及び障害の有効な処置のために必要とされている。従って、癌の処置のための新規な治療アプローチの満たされない必要性が当該分野において存在する。

発明の要旨
本発明の一局面によれば：(i)VEGFアンタゴニスト；(ii)抗CTLA-4抗体；及び(iii)薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物が提供される。

本発明の別の局面によれば、被験体において腫瘍の成長を阻害又は軽減するための方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、被験体に、治療有効量のVEGFアンタゴニスト及び治療有効量の抗CTLA-4抗体を投与することを含む。

本発明の別の局面によれば、腫瘍に罹患した被験体の生存を延長するか又は長くするための方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、被験体に、治療有効量のVEGFアンタゴニスト及び治療有効量の抗CTLA-4抗体を投与することを含む。

本発明の別の局面によれば、被験体において腫瘍免疫を誘導する方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、被験体に治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト及び治療有効量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む。特定の実施態様において、本発明のこの局面に従って処置される被験体は、被験体へのＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の前に、又は投与の時点で腫瘍に罹患している。

VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を被験体に投与することを含む本発明の局面に関して、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体は、別々の投薬形態又は単一投薬形態(例えば、同時処方（co-formulation）)で被験体に投与され得る。本明細書の他所に開示されるような、様々な投薬スケジュール及び投与計画は本発明のこれらの局面内で検討される。

本発明の組成物及び方法において含まれ、本発明の組成物及び方法とともに使用されるVEGFアンタゴニストは、抗VEGF抗体でも、抗VEGF受容体抗体でも、VEGF受容体ベースのキメラ分子(VEGF Trap)でもよい。特定の実施態様において、VEGFアンタゴニストはアフリベルセプト（aflibercept）である。

本発明の組成物及び方法において含まれ、本発明の組成物及び方法とともに使用される抗CTLA-4抗体は、アンタゴニスト抗体でもよい。特定の実施態様において、抗CTLA-4抗体はイピリムマブ（ipilimumab）又はトレメリムマブ（tremelimumab）である。

本発明の他の実施態様は、次の詳細な説明の検討から明らかとなるだろう。

図１〜３は、０日目にColon-26腫瘍細胞を移植され、そして示された分子の組み合わせで3、7、10、14及び18日目の注射により処置されたマウス(「初期処置腫瘍モデル」)についての腫瘍成長及び生存結果を示す。図1は、移植後の様々な時点での異なる実験群についての腫瘍体積(mm³)を示す。図2は、移植後２２日目での各実験群における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。図３は、移植後の様々な時点での異なる実験群におけるマウスの生存パーセントを示す。X軸に沿った上向きの矢印は、処置注射のタイミングを示す。「IgG」はIgG2アイソタイプ対照であり；「Fc」はヒトFc対照であり；「hVGT」はアフリベルセプト(VEGF Trapとしても知られる)であり；「抗CTLA-4」は抗マウスCTLA-4 IgG2bクローン9D9である。図4A-4Bは、初期腫瘍負荷及び示された分子の組み合わせを用いた処置後に腫瘍を有しておらず、次いで初期腫瘍負荷の６０日後（追加の処置無し）にColon-26腫瘍細胞を再負荷されたマウスにおける腫瘍体積測定を示す。図4Aは、腫瘍再負荷の１４日後の示された実験群（又はナイーブ［未処置］対照）における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。そして図4Bは、腫瘍再負荷の３２日後の示された実験群（又はナイーブ［未処置］対照）における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。「IgG」は IgG2アイソタイプ対照であり；「Fc」はヒトFc対照であり；「hVGT」はアフリベルセプト(VEGF Trapとしても知られる)であり；「抗CTLA-4」は抗マウスCTLA-4 IgG2bクローン9D9である。図5〜7は、０日目にColon-26腫瘍細胞を移植され、そして示された分子の組み合わせで11、15、17、21及び25日目に注射により処置されたマウス(「後期処置腫瘍モデル」)についての腫瘍成長及び生存結果を示す。図5は、移植後の様々な時点での異なる実験群についての腫瘍体積(mm³)を示す。図6は、移植後７０日目の示された実験群における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。図7は、移植後様々な時点での異なる実験群におけるマウスの生存パーセントを示す。X軸に沿った上向きの矢印は処置注射のタイミングを示す。「IgG」はIgG2アイソタイプ対照であり；「Fc」はヒトFc対照であり；「hVGT」はアフリベルセプト(VEGF Trapとしても知られる)であり；「抗CTLA-4」は抗マウスCTLA-4 IgG2bクローン9D9である。図8〜12は、Colon-26腫瘍移植の７日後に開始して示された単剤もしくは組み合わせ療法、又は対照組み合わせで処置されたマウスにおける腫瘍成長、退縮、壊死及び組織病理学的パラメーターを示す。図8は、移植後の様々な時点での異なる実験群についての腫瘍体積(mm³)を示す。X軸に沿った上向きの矢印は処置注射のタイミングを示す。図9は、移植の２１日後の各実験群における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。図10は、２１日目の各処置群におけるマウスについての腫瘍退縮の程度(1から4の評価尺度でスコア付けされた)を示す。腫瘍退縮は、H&E切片における壊死、腫瘍/腫瘍周囲浸潤又は線維症の影響を受けた腫瘍量の割合として等級付けられた。グレード1=0〜25%、グレード2=25〜50%、グレード3=50〜75%、グレード4=75〜100%。図11は、２１日目に各処置群におけるマウスから集められ、そして組織病理学的試験にかけられた腫瘍についての腫瘍壊死の程度（１から４の評価尺度でスコア付けされた）を示す。等級付けは腫瘍量における壊死組織のパーセントに基づく。グレード1=0〜25%、グレード2=25〜50%、グレード3=50〜75%、グレード4=75〜100%。図12、パネルA〜Cは、21日目の各処置群におけるマウスについてのそれぞれ炎症性細胞浸潤、腫瘍線維症及び有糸分裂像の程度を示す。パネルAは、炎症性細胞浸潤(１から３の評価尺度でスコア付けされた)の程度を示す。グレード1=細胞の少数の小さな凝集体/病巣、グレード2=炎症性細胞のより大きな病巣、グレード3=リンパ組織球境界及び腫瘍塊内の局所的に多数の浸潤にしばしばなる集密的な病巣。パネルBは、腫瘍線維症の程度(０から２の評価尺度でスコア付けされた)を示す。線維症スコアは、Massonのトリクローム染色に基づく：グレード0=稀であるか時折の、腫瘍間質もしくは血管周囲の既存のコラーゲンの一部として又は他の構造（例えば、骨格筋）に付随して腫瘍全体にわたって散在した；又は時折の細いコラーゲン鎖が既存の腫瘍間質の一部と考えられる壊死の領域における、コラーゲン繊維；グレード1=腫瘍/腫瘍周囲浸潤の領域としばしば重なるか又は壊死の領域付近の腫瘍境界に限定された、限局性から局所的に広範囲の細いコラーゲン繊維の沈着；グレード2=グレード１について記載されるようなコラーゲン繊維沈着の多巣性又は局所的に広範囲の領域。腫瘍周囲に同心円状沈着された線維性組織又は真皮における既存のコラーゲン繊維は評価に含まれなかった。パネルCは、個々の処置群についての有糸分裂像を示す。有糸分裂像は、腫瘍あたり5つの実行可能な重なっていない高倍率40X視野(hpf）において観察された有糸分裂像の合計として表される。図13及び14は、０日目にColon-26腫瘍細胞を移植され、そして示された抗CTLA-4抗体(IgG2a又はIgG2bアイソタイプを有する)又はアイソタイプ対照で、腫瘍樹立後12、15、19、22、26、30、33、37及び41日目(「後期処置腫瘍モデル」)に処置されたマウスについての腫瘍成長及び生存の結果を示す。図１３は、移植後の様々な時点での異なる実験群についての腫瘍体積(mm³)を示す。X軸に沿った上向きの矢印は、処置注射のタイミングを示す。図14は、移植後の様々な時点での異なる実験群におけるマウスの生存パーセントを示す。図15〜17は、０日目にMC38腫瘍細胞を移植され、そして腫瘍樹立後10、14、17、21、及び24日目に(「後期処置腫瘍モデル」)示された抗CTLA-4抗体(IgG2a又はIgG2bアイソタイプを有する)又はアイソタイプ対照で処置されたマウスについての腫瘍成長及び生存の結果を示す。図15は、移植後様々な時点での異なる実験群についての腫瘍体積(mm³)を示す。X軸に沿った上向きの矢印は処置注射のタイミングを示す。図16は、移植後２１日目の示された実験群における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。図17は、移植後の様々な時点での異なる実験群におけるマウスの生存パーセントを示す。図18及び19は、０日目にMC38腫瘍細胞を移植され、そして15、17、23、25、27、33、35及び37日目(「後期処置腫瘍モデル」)に注射により示された分子の組み合わせで処置されたマウスについての腫瘍成長結果を示す。図18は、移植後の様々な時点の異なる実験群についての腫瘍体積(mm³)を示す。図19は、移植後２４日目の示された実験群における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。「IgG2a」はIgG2aアイソタイプ対照であり；「Fc」はヒトFc対照であり；「hVGT」はアフリベルセプト(VEGF Trapとしても知られる)であり；「抗CTLA-4 IgG2a」はIgG2aアイソタイプを有する抗マウスCTLA-4抗体である。図20及び21は０日目にMC38腫瘍細胞を移植され、そして10、14、18、21及び25日目(「後期処置腫瘍モデル」)に注射により示された分子の組み合わせで処置されたマウスについての腫瘍成長結果を示す。図20は、移植後の様々な時点での異なる実験群についての腫瘍体積(mm³)を示す。図２１は、移植後１８日目の示された実験群における個々のマウスの腫瘍体積(mm³)を示す。図２２は、０日目にMC38腫瘍細胞を移植され、そして9、13、16及び20日目（「後期処置腫瘍モデル」)に注射により示された分子の組み合わせで処置されたマウスについての腫瘍成長結果（腫瘍体積[mm³])を示す。図23、24及び25は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定した、血管新生マーカー遺伝子Dll4(図23)、Ang2(図24)、及びRobo4(図25)の発現の相対的レベルを示す。図23、24及び25は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定した、血管新生マーカー遺伝子Dll4(図23)、Ang2(図24)、及びRobo4(図25)の発現の相対的レベルを示す。図23、24及び25は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定した、血管新生マーカー遺伝子Dll4(図23)、Ang2(図24)、及びRobo4(図25)の発現の相対的レベルを示す。図26は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した細胞の実時間PCR分析により測定された、E-セレクチンの発現の相対的レベルを示す。図27及び28は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定された、それぞれCD8及びCD247の発現の相対的レベルを示す；その発現は、様々な処置群における腫瘍浸潤リンパ球の発現レベルを表す。図27及び28は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定された、それぞれCD8及びCD247の発現の相対的レベルを示す；その発現は、様々な処置群における腫瘍浸潤リンパ球の発現レベルを表す。図29及び30は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定された、それぞれ炎症性サイトカインIFNγ及びTNFαの発現の相対的レベルを示す。図29及び30は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定された、それぞれ炎症性サイトカインIFNγ及びTNFαの発現の相対的レベルを示す。図31、32及び33は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定された、それぞれ Itgam(CD11b)、Emr1(F4/80)及びItgax(CD11c)の発現の相対的レベルを示す；これらの発現は、様々な処置群における骨髄性細胞浸潤(それぞれ骨髄細胞、マクロファージ、及び樹状細胞)のレベルを表す。図31、32及び33は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定された、それぞれ Itgam(CD11b)、Emr1(F4/80)及びItgax(CD11c)の発現の相対的レベルを示す；これらの発現は、様々な処置群における骨髄性細胞浸潤(それぞれ骨髄細胞、マクロファージ、及び樹状細胞)のレベルを表す。図31、32及び33は、示された分子の組み合わせを用いた処置後のマウスから得られた樹立した腫瘍の実時間PCR分析により測定された、それぞれ Itgam(CD11b)、Emr1(F4/80)及びItgax(CD11c)の発現の相対的レベルを示す；これらの発現は、様々な処置群における骨髄性細胞浸潤(それぞれ骨髄細胞、マクロファージ、及び樹状細胞)のレベルを表す。

詳細な説明
本発明を説明する前に、当然のことながら、記載される特定の方法及び実験条件は変わり得るので、本発明はこのような記載される特定の方法及び実験条件に限定されない。また当然のことながら、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的ためのみのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図されない。

別の規定がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において使用される、特定の列挙される数値を参照して使用される場合の用語「約」は、その値が記載される値から１％未満だけ変動し得るということを意味する。例えば、本明細書で使用される表現「約100」は99及び101、並びに間の全ての値(例えば、99.1、99.2、99.3、99.4など)を含む。

本明細書に記載される方法及び材料と類似するか又は等価ないずれの方法及び材料も本発明の実施において使用され得るが、好ましい方法及び材料がここで記載される。本明細書において言及される全ての刊行物は、それら全体として説明のための参照により本明細書に加入される。

VEGFアンタゴニスト
本明細書で使用される表現「VEGFアンタゴニスト」は、血管内皮増殖因子(VEGF)又はVEGF受容体の通常の生物学的活性をブロックするか、低減するか又は妨害するいずれかの分子を意味する。VEGFアンタゴニストは、VEGFと天然VEGF受容体との間の相互作用を妨害する分子、例えばVEGF又はVEGF受容体に結合してVEGFとVEGF受容体との間の相互作用を防止するか又は他の方法で妨げる分子を含む。特定の例となるVEGFアンタゴニストとしては、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ[AVASTIN^(R)])、抗VEGF受容体抗体(例えば、抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体など)、及びVEGF受容体ベースのキメラ分子(本明細書では「VEGF-Traps」とも呼ばれる)が挙げられる。

VEGF受容体ベースのキメラ分子は、VEGFR1(Flt1とも呼ばれる)及び／又はVEGFR2(Flk1又はKDRとも呼ばれる)のようなVEGF受容体の2つ又はそれ以上の免疫グロブリン(Ig)様ドメインを含むキメラポリペプチドを含み、そして多量体化ドメイン(例えば、2つ又はそれ以上のキメラポリペプチドの多量体化［例えば二量体化］を促進するFcドメイン)も含有し得る。例となるVEGF受容体ベースのキメラ分子は、配列番号1の核酸配列によりコードされるVEGFR1R2-FcΔC1(a) (アフリベルセプトとしても知られる)と呼ばれる分子である。VEGFR1R2-FcΔC1(a)は３つの成分を含む：(1)配列番号2のアミノ酸27〜129を含むVEGFR1成分；(2)配列番号2のアミノ酸130〜231を含むVEGFR2成分；及び(3)配列番号2のアミノ酸232〜457(配列番号11のC末端アミノ酸[すなわちK458]は本発明の方法において使用されるVEGFアンタゴニストに含まれていても含まれていなくてもよい；例えば、米国特許第7,396,664を参照のこと)を含む多量体化成分(「FcΔC1(a)」)。配列番号2のアミノ酸1〜26はシグナル配列である。

抗CTLA-4抗体
本明細書で使用される表現「抗CTLA-4抗体」は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)に特異的に結合するいずれかの抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。ヒトCTLA-4は配列番号3のアミノ酸配列を有する。

本発明の方法及び組成物内で使用され得るか又は含まれ得る非限定的な例となる抗CTLA-4抗体としては、例えばイピリムマブ(Yervoy^(R)、Bristol-Myers Squibb、Princeton、NJ)及びトレメリムマブ(Pfizer、New York、NY)が挙げられる。本発明の状況において使用され得る他の抗CTLA-4抗体としては、例えば米国特許第6,682,736号；同第6,984,720号；同第7,605,238号；同第8,491,895号；同第8,318,916号；同第8,263,073号；同第8,143,379号；及びそれらに引用される参考文献に記載される抗CTLA-4抗体のいずれかが挙げられる。

抗体
本明細書において使用される用語「抗体」(例えば、抗VEGF抗体、抗VEGF受容体抗体、抗CTLA-4抗体など)は、４つのポリペプチド鎖：ジスルフィド結合により相互接続された２つの重(H)鎖及び２つの軽(L)鎖を含む免疫グロブリン分子、さらにはそれらの多量体(例えば、IgM)を含む。典型的な抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVR又はV_Hと略される)及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインC_H1、C_H2及びC_H3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVR又はV_Lと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン(C_L1)を含む。V_H及びV_L領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が組み入れられた、相補性決定領域（CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各V_H及びV_Lは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのCDR及び４つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本発明の異なる実施態様において、抗IL-4R抗体(又はその抗原結合部分)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であっても、天然又は人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、2つ又はそれ以上のCDRの対照分析（side-by-side analysis）に基づいて規定され得る。

本明細書中で使用される用語「抗体」はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、抗原に特異的に結合して複合体を形成するいずれかの天然に存在するか、酵素により入手可能か、合成的又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解消化、又は抗体の可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするDNAの操作及び発現を含む組み換え遺伝子操作技術のようないずれかの適切な標準的技術を使用して完全抗体分子から誘導され得る。このようなDNAは公知であるか、かつ／又は例えば市販の供給源、DNAライブラリ（例えば、ファージ−抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成され得る。DNAは配列決定され得、そして化学的に又は分子生物学技術を使用することにより操作されて、例えば、１つもしくはそれ以上の可変及び／若しくは定常ドメインを適切な構成に配置し得るか、又はコドンを導入し得るか、システイン残基を作製し得るか、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失などし得る。

抗原結合フラグメントの非限定的な例としては：(i)Fabフラグメント；(ii)F(ab’)2フラグメント；(iii)Fdフラグメント；(iv)Fvフラグメント；(v)単鎖Fv(scFv)分子；(vi)dAbフラグメント；及び(vii)抗体の超可変性領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位(例えば、CDR3ペプチドのような単離された相補性決定領域(CDR))、又は拘束性（constrained）FR3-CDR3-FR4ペプチドが挙げられる。他の操作された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、二特異性抗体（diabodies）、三特異性抗体（triabodies）、四特異性抗体（tetrabodies）、ミニボディ（minibodies）、ナノボディ(例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど)、小モジュラー免疫薬（small modular immunopharmaceuticals）(SMIP)、及びサメ可変IgNARドメインもまた、本明細書で使用される表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。

抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、いずれのサイズ又はアミノ酸組成のものでもよく、そして一般的には、1つ又はそれ以上のフレームワーク配列に隣接するかそれらとインフレームである少なくとも１つのCDRを含む。V_Lドメインに付随するV_Hドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、V_H及びV_Lドメインは、互いに対していずれかの適切な配置で位置し得る。例えば、可変領域は二量体であり得、かつV_H-V_H、V_H-V_L又はV_L-V_L二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体V_H又はV_Lドメインを含有し得る。

特定の実施態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出され得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例となる構成としては：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii) V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii) V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii) V_L-C_H2-C_H3；及び(xiv)V_L-C_Lが挙げられる。上に列挙された例となる構成を含めて、可変ドメイン及び定常ドメインのいずれかの構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されていても、全長又は部分的ヒンジ又はリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変及び／又は定常ドメイン間の可動性又は半可動性連結を生じる、少なくとも2つ(例えば、5、10、15、20、40、60又はそれ以上)のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに、及び／又は1つもしくはそれ以上の単量体V_HもしくはV_Lドメインと非共有結合で結合した(例えば、ジスルフィド結合により)上に列挙された可変及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体(又は他の多量体)を含み得る。

本明細書で使用される用語「抗体」はまた、多選択性(例えば、二重特異性)抗体も含む。多選択性抗体又は抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、この場合、各可変ドメインは別々の抗原に特異的に結合することができるか、又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。いずれの多選択性抗体形式も、当該分野で利用可能な通常の技術を使用して、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの状況における使用のために適合され得る。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがVEGF、VEGFR、CTLA-4又はそのフラグメントに特異的であり、かつ免疫グロブリンの他方のアームが第二の治療標的に特異的であるか、もしくは治療的部分に結合されている二重特異性抗体の使用を含む方法を含む。本発明の状況において使用され得る例となる二重特異性形式としては、限定されないが、例えば、scFvベース又は二特異性抗体二重特異性形式、IgG-scFv融合、二重可変ドメイン(DVD)-Ig、クアドローマ（Quadroma）、ノブ・イントゥー・ホール（knobs-into-holes）、共通軽鎖(例えば、ノブ・イントゥー・ホールを有する共通軽鎖など)、CrossMab、CrossFab、(SEED)ボディ、ロイシンジッパー、Duobody、IgG1/IgG2、二重作用Fab(DAF)-IgG、及びMab²二重特異性形式(前述の形式の概説については、例えば、Klein et al. 2012、mAbs 4:6、1-11及びそれらに引用される参考文献を参照のこと)。二重特異性抗体はまた、例えば、直交する（orthogonal）化学反応性を有する非天然アミノ酸が部位特異的抗体-オリゴヌクレオチド結合体を生成するために使用され、次いでこれが自己集合して規定された組成、結合価及び配置を有する多量体複合体になるペプチド／核酸結合体を使用して構築され得る(例えば、Kazane et al.、J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4、2012])。

本発明の方法において使用される抗体はヒト抗体でもよい。本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図される。本発明のヒト抗体は、それでもなお、例えばCDRにおいて、特にCDR3において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発により、又はインビボで体細胞突然変異により導入された変異）を含み得る。しかし、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことを意図されない。

本発明の方法において使用される抗体は組み換えヒト抗体であってもよい。本明細書で使用される用語「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段により製造、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体、例えば宿主細胞(以下にさらに記載される)にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（以下にさらに記載される）から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体(例えば、Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照のこと)又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含むいずれかの他の手段により製造、発現、作製もしくは単離された抗体を含むことを意図される。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する。しかし、特定の実施態様において、このような組み換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発にかけられ(又は、ヒトIg配列にトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異)、従って組み換え抗体のV_H及びV_L領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列V_H及びV_L配列由来でありかつこれらに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在していなくてもよい。

特定の実施態様によれば、本発明の組成物及び方法において使用される抗体は、標的抗原(例えば、VEGF、VEGF受容体、CTLA-4など)に特異的に結合する。用語「特異的に結合する」又は同様のものは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、生理的条件下で比較的安定である抗原との複合体を形成するということを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等が挙げられる。例えば、本発明の状況において使用される、CTLA-4「に特異的に結合する」抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約1000nM未満、約500nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約100nM未満、約90nM未満、約80nM未満、約70nM未満、約60nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満又は約0.5nM未満のK_DでCTLA-4又はその部分に結合する抗体を含む。しかし、ヒトIL-4Rαに特異的に結合する単離された抗体は、他の(非ヒト)種由来のIL-4Rα分子のような他の抗原に対して交差反応性を有し得る。

本発明の組成物及び方法の状況において使用される抗体は、ｐH依存性結合特徴を有し得る。例えば、本発明の組成物および方法における使用のための抗体は、中性ｐHと比較して、酸性ｐHでその抗原に対して減少した結合を示し得る。あるいは、本発明の抗体は、中性ｐHと比較して酸性ｐHでその抗原に対して増強された結合を示し得る。表現「酸性ｐH」は、約6.2未満、例えば約6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0又はそれ以下のｐH値を含む。本明細書で使用される表現「中性ｐH」は、約7.0〜約7.4のｐHを意味する。表現「中性ｐH」は、約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、及び7.4のｐH値を含む。

特定の場合において、「中性ｐHと比較して酸性ｐHでの抗原に対する減少した結合」は、中性ｐHでのその抗原に対する抗体結合のK_D値に対する、酸性ｐHでのその抗原に対する抗体結合のK_D値（又はその反対）の比で表される。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又はその抗原結合フラグメントが約3.0又はそれ以上の酸性/中性K_D比を示す場合に、本発明の目的のために「中性ｐHと比較して酸性ｐHでCTLA-4に対して減少した結合」を示すとみなされ得る。特定の例となる実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントについての酸性/中性K_D比は、約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0. 25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0又はそれ以上であり得る。

pH依存性結合特徴を有する抗体は、例えば、中性ｐHと比較して酸性ｐHでの特定の抗原に対する減少した（又は増強された）結合について抗体の集団をスクリーニングすることにより得られ得る。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの改変により、ｐH依存特徴を有する抗体が得られ得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えば、CDR内）の1つ又はそれ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置き換えることにより、中性ｐHと比較して酸性ｐHで減少した抗原結合を有する抗体が得られ得る。本明細書で使用される表現「酸性ｐH」は6.0又はそれ以下のｐHを意味する。

本発明の組成物及び方法の状況において使用される抗体は、例えば、中性ｐHと比較して酸性ｐHで、FcRn受容体に対する抗体結合を増強させるか又は減少させる1つ又はそれ以上の変異を含むFcドメインを含み得る。例えば、本発明は、FcドメインのC_H2又はC_H3領域に変異を含む抗体(例えば、抗VEGF、抗VEGF受容体、抗CTLA-4など)を含み、ここで変異は、酸性環境において(例えば、ｐHが約５．５から約６．０の範囲に及ぶエンドソームにおいて）FcRnに対するFcドメインの親和性を増加させる。このような変異は、動物に投与された場合に抗体の血清半減期の増加を生じ得る。このようなFc改変の非限定的な例としては、例えば、位置250(例えば、E又はQ)；250及び428(例えば、L又はF)；252(例えば、L/Y/F/W又はT)、254(例えば、S又はT)、並びに256(例えば、S/R/Q/E/D又はT)での改変；又は位置428及び／若しくは433(例えば、H/L/R/S/P/Q又はK)及び／若しくは434(例えば、H/F又はY)における改変；又は位置250及び／若しくは428における改変；又は位置307もしくは308(例えば、308F、V308F)、及び434における改変が挙げられる。一実施態様において、改変は、428L(例えば、M428L)及び434S(例えば、N434S)改変；428L、259I(例えば、V259I)、及び308F(例えば、V308F)改変；433K(例えば、H433K)及び434(例えば、434Y)改変；252、254、及び256(例えば、252Y、254T、及び256E)改変；250Q及び428L改変(例えば、T250Q及びM428L)；並びに307及び／又は308改変(例えば、308F又は308P)を含む。

例えば、本発明は、250Q及び248L(例えば、T250Q及びM248L)；252Y、254T及び256E(例えば、M252Y、S254T及びT256E)；428L及び434S(例えば、M428L及びN434S)；並びに433K及び434F(例えば、H433K及びN434F)からなる群より選択される変異の1つもしくはそれ以上の対又は群を含むFcドメインを含む抗体(例えば、抗VEGF、抗VEGF受容体、抗CTLA-4など)を含む方法及び組成物を含む。前述のFcドメイン変異、及び本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせは、本発明の範囲内で検討される。

本発明者らは、VEGFアンタゴニスト(例えば、VEGF Trap)と抗CTLA-4 IgG2a抗体との組み合わせが、VEGFアンタゴニスト(例えば、VEGF Trap)と抗CTLA-4 IgG2b抗体との組み合わせと比較して、マウスモデル系において優れた抗腫瘍作用をもたらすということを実証した(例えば、本明細書以下の実施例4を参照のこと)。ADCC及びCDCエフェクター活性をもたらすマウスIgG2aのヒト抗体等価物はIgG1である。従って、本発明は、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を含む組成物及び方法を含み、ここで抗CTLA-4抗体は、IgG1のようなADCC及びCDCエフェクター活性を生じるFcアイソタイプを有する。

VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を含む医薬組成物
本発明は、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を含む医薬組成物を含む。本発明のこの局面に従う医薬組成物は、薬学的に許容しうる担体又は希釈剤をさらに含み得る。生物学的治療剤を同時処方する（co-formulating）ための方法は当該分野で公知であり、そして本発明の医薬組成物を製造するために当業者により使用され得る。

本明細書で使用される表現「薬学的に許容しうる担体又は希釈剤」は、適切な輸送、送達、耐性などを生じる適切な単体、賦形剤、及び他の薬剤を含む。本発明の状況において有用な例となる処方は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PAに見出され得る。許容しうる処方としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質(カチオン性又はアニオン性)含有小胞(例えば、LIPOFECTIN^TM)、DNA結合体、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、エマルションcarbowax(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固形ゲル、及びcarbowaxを含有する半固形コング汚物が挙げられる。Powell et al.「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311も参照のこと。

処置方法及び投与方法
本発明は、被験体において腫瘍の成長を阻害又は軽減するための方法を含む。本発明のこの局面に従う方法は、被験体に治療有効量のVEGFアンタゴニスト及び治療有効量の抗CTLA-4抗体を投与することを含む。腫瘍成長の阻害及び／又は軽減は、本発明の治療的組み合わせの投与(例えば、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体の投与)の前及び後に被験体における腫瘍のサイズを測定することにより評価され得る。本発明の治療的組み合わせの投与の前の腫瘍のサイズ及び／又は成長速度と比較して、本発明の治療的組み合わせの投与後の腫瘍サイズの減少、又は腫瘍成長速度の減少は、被験体における腫瘍の成長の阻害又は軽減を示す。特定の実施態様において、本発明の方法は腫瘍退縮を生じる。本発明の特定の実施態様によれば、腫瘍成長の軽減は、本発明の治療的組み合わせの投与後の腫瘍成長速度が、本発明の治療的組み合わせの投与前の成長速度より少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%少ないということを意味する。本明細書で使用される「腫瘍成長の軽減」は、腫瘍体積の減少(例えば、腫瘍退縮)も含む。

本発明はまた、腫瘍に罹患した被験体の生存を延長するか又は長くするための方法を含む。本発明のこの局面に従う方法は、治療有効量のVEGFアンタゴニスト及び治療有効量の抗CTLA-4抗体を被験体に投与することを含む。腫瘍を有する被験体の生存の延長又は長くすることは、本発明の治療的組み合わせの投与(例えば、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体の投与)後の被験体が、処置を受けていないか又は問題の腫瘍のための一般的に受け入れられた標準の介護を受ける同様の状態にある腫瘍保有被験体と比較して、より長い生存期間を有するということを意味する。改善された生存期間は、処置を受けていないか又は問題の腫瘍のための一般的に受け入れられた標準の介護を受ける同様の状態にある腫瘍保有被験体と比較して、約1週、2週、4週、2ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、8ヶ月、10ヶ月、12ヶ月、14ヶ月、16ヶ月、18ヶ月、20ヶ月、22ヶ月、24ヶ月、26ヶ月、28ヶ月、30ヶ月、36ヶ月、40ヶ月、又はそれ以上長い生存を意味する。

本発明はまた、被験体において腫瘍免疫を誘導する方法を含む。本発明のこの局面に従う方法は、被験体に治療有効量のVEGFアンタゴニスト及び治療有効量の抗CTLA-4抗体を投与することを含む。本発明のこの局面の特定の実施態様によれば、被験体は、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いて処置される前に腫瘍に罹患していてもよく、そして上記処置の後に将来の腫瘍に対して免疫性になるか又は抵抗性になる。本明細書で使用される、免疫の誘導は、被験体が、本発明の治療的組み合わせを投与された後に将来の腫瘍に対して抵抗性であるか、又は実質的に抵抗性であることを意味する。腫瘍免疫はまた、以前に腫瘍に罹患しており、そして首尾よく処置された(例えば、本発明の治療的組み合わせの投与により）被験体が、将来同じか又は類似した腫瘍型の発症を経験しないということを意味する。

特定の実施態様によれば、本発明の方法は、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を被験体に別々の投薬形態で投与することを含み得る。例えば、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体は、別々の注射、注入、又は当該分野で公知の他の薬物送達手段で被験体に送達され得る。別々に投与される場合、別々の投薬形態(すなわち、一方がVEGFアンタゴニストを含み、他方が抗CTLA-4抗体を含む)は、被験体に同時に又は連続して投与され得る。同時に投与される場合、両方の薬剤は、被験体に約１分未満の期間内に投与される。連続して投与される場合、一方の薬剤は第一の時点で投与され、他方の薬剤は、第二のより遅い時点で投与される。第二の時点は、第一の時点の１分後、２分後、５分後、１０分後、20分後、30分後、１時間後、又はそれ以上後であり得る。特定の実施態様において、VEGFアンタゴニストが最初に投与され、続いて抗CTLA-4抗体が投与される。他の実施態様において、抗CTLA-4抗体が最初に投与され、続いてVEGFアンタゴニストが投与される。

本発明の方法によれば、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体は、被験体に別々の投薬形態で同じ投与頻度で(例えば、週に1回、2週ごとに1回、4週ごとに1回、8週ごとに1回、１０週ごとに１回、１２週ごとに１回など)投与され得る。あるいは、２つの薬剤は、被験体に別々の投薬形態で異なる投薬頻度で投与され得る。例えば、VEGFアンタゴニストは、抗CTLA-4抗体よりも頻繁に被験体に投与されてもよく；又は抗CTLA-4抗体は、VEGFアンタゴニストよりも頻繁に被験体に投与されてもよい。

特定の実施態様によれば、本発明の方法は、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を被験体に単一投薬形態で投与することを含み得る。本明細書で使用される「単一投薬形態」は、VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体の両方を含む組成物を意味する。単一投薬形態は、特定の実施態様において、本明細書の他所に開示されるような1つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含み得る。2つ又はそれ以上の生物学的療法（therapeutics）を単一投薬形態に同時処方するための方法は当該分野で公知であり、そして必要に応じて、本発明のこの局面の状況において使用され得る。

本発明の方法および組成物は、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、胃腸管、雄性及び雌性生殖器官、筋肉、骨、皮膚及び付属器、結合組織、脾臓、免疫系、造血細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、並びに眼のような特別感覚器官において生じる原発性及び／又は転移性腫瘍の処置のために有用である。本発明の方法及び組成物に従って処置可能である具体的な癌としては、例えば、腎細胞癌、膵癌、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、神経膠芽腫、及び黒色腫が挙げられる。

特定の実施態様において、本発明の方法及び組成物は、被験体における抗VEGF抵抗性腫瘍の処置に有用である。本明細書で使用される「抗VEGF抵抗性腫瘍」は、抗VEGF抗体、抗VEGF受容体抗体、又はいずれかの他のVEGF特異的結合タンパク質(例えば、本明細書で定義されるVEGF-trapを含む)のような抗VEGF剤での処置に応答しないか、又は部分的にしか応答しない腫瘍を意味する。例えば、抗VEGF抵抗性腫瘍は、例えば、通常は少なくとも１つの型の腫瘍の成長を阻害又は軽減することができる量のVEGFアンタゴニストと接触した場合に、インビトロ又はインビボで(例えば、細胞培養において、又は動物に移植された場合に）成長及び／又は増殖し続ける腫瘍であってもよい。抗VEGF抵抗性腫瘍は、通常は抗VEGF治療に応答するが、選択、変異又は適合を通して、1つ又はそれ以上の抗VEGF剤に対する抵抗性を獲得した腫瘍細胞由来の腫瘍であってもよい。

本発明の方法及び組成物を使用して処置可能な被験体は、癌と診断されたか又は腫瘍を有すると同定されたいずれかの被験体を含む。特定の実施態様において、被験体は、抗VEGF処置に対して少なくとも部分的に抵抗性である腫瘍を有すると診断されたか同定された患者である。抗VEGF抵抗性腫瘍を有すると患者を診断するための方法は当業者に公知であり、かつ通常の診断方法を使用して実施され得る。

さらなる治療剤
本発明は、1つ又はそれ以上のさらなる治療活性成分と組み合わせてVEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を含む組成物及び治療製剤、並びにこのような組み合わせをそれを必要とする被験体に投与することを含む処置方法を含む。

本発明の状況においてVEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体と組み合わせられ得、かつ／又は組み合わせて投与され得るさらなる治療活性成分としては、例えば、以下の1つ又はそれ以上が挙げられる：EGFRアンタゴニスト(例えば、抗EGFR抗体[例えば、セツキシマブ又はパニツムマブ]又はEGFRの小分子阻害剤[例えば、ゲフィチニブ又はエルロチニブ])、Her2/ErbB2、ErbB3又はErbB4のような別のEGFRファミリーメンバーのアンタゴニスト(例えば、抗ErbB2[例えば、トラスツズマブ又はT-DM1｛KADCYLA^(R)｝]、抗ErbB3又は抗ErbB4抗体又はErbB2、ErbB3もしくはErbB4活性の小分子阻害剤)、EGFRvIIIのアンタゴニスト(例えば、EGFRvIIIに特異的に結合する抗体)、cMETアンタゴニスト(例えば、抗cMET抗体)、IGF1Rアンタゴニスト(例えば、抗IGF1R抗体)、B-raf阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α阻害剤(例えば、抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β阻害剤(例えば、抗PDGFR-β抗体又は例えば、メシル酸イマチニブもしくはリンゴ酸スニチニブのような小分子キナーゼ阻害剤)、PDGFリガンド阻害剤(例えば、抗PDGF-A、-B、-C、又は-D抗体、アプタマー、siRNAなど)、VEGF受容体の小分子キナーゼ阻害剤(例えば、スニチニブ、ソラフェニブ又はパゾパニブ))、DLL4アンタゴニスト(例えば、US 2009/0142354に開示されるREGN421のような抗DLL4抗体)、Ang2アンタゴニスト(例えば、H1H685PのようなUS 2011/0027286に開示される抗Ang2抗体)、FOLH1アンタゴニスト(例えば、抗FOLH1抗体)、STEAP1又はSTEAP2アンタゴニスト(例えば、抗STEAP1抗体又は抗STEAP2抗体)、TMPRSS2アンタゴニスト(例えば、抗TMPRSS2抗体)、MSLNアンタゴニスト(例えば、抗MSLN抗体)、CA9アンタゴニスト(例えば、抗CA9抗体)、ウロプラキンアンタゴニスト(例えば、抗ウロプラキン[例えば、抗UPK3A]抗体)、MUC16アンタゴニスト(例えば、抗MUC16抗体)、Tn抗原アンタゴニスト(例えば、抗Tn抗体)、CLEC12Aアンタゴニスト(例えば、抗CLEC12A抗体)、TNFRSF17アンタゴニスト(例えば、抗TNFRSF17抗体)、LGR5アンタゴニスト(例えば、抗LGR5抗体)、一価CD20アンタゴニスト(例えば、リツキシマブのような一価抗CD20抗体)など。VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体と組み合わせて有利に投与されるか又は同時処方され得る他の薬剤としては、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、並びにIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18のようなサイトカインに、又それらのそれぞれの受容体に結合する小分子サイトカイン阻害剤及び抗体を含むサイトカイン阻害剤が挙げられる。

本発明は、1つ又はそれ以上の化学療法剤と組み合わせたVEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を含む組成物、治療製剤、及び処置方法を含む。本発明のこの局面の状況において有用な化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド(Cytoxan^TM)のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン（piposulfan）のようなアルキルスルホネート類；ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、及びウレドパ（uredopa）のようなアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類（methylamelamine）；クロラムブシル、クロルナファジン（chlornaphazine）、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン（chlorozotocin）、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア類（nitrosureas）；アクラシノマイシン（aclacinomysins）、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カリチアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗菌剤；メトトレキサート、イリノテカン、ロイコボリン、及び5-フルオロウラシル(5-FU)のような代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキサートのような葉酸アナログ；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎（anti-adrenals）；フロリン酸（frolinic acid）のような葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド(aldophosphamide glycoside）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビスアントレン（bisantrene）；エダトレキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン（diaziquone）；エルフォルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；2-エチルヒドラジン；プロカルバジン；PSK^TM；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2’,2’’-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類、例えば、パクリタキセル(Taxol^TM、Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)及びドセタキセル(Taxotere^TM；Aventis Antony、France)；クロラムブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンのような白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド(VP-16)；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン(DMFO)；レチノイン酸；エスペラミシン類；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容しうる塩、酸又は誘導体が挙げられる。例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、4(5)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン（keoxifene）、LY 117018、オナプリストン（onapristone）、及びトレミフェン(フェアストン)を含む抗エストロゲン薬；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンのような抗アンドロゲン薬；並びに上記のいずれかの薬学的に許容しうる塩、酸又は誘導体のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。

本発明はまた、抗ウイルス剤、抗菌剤、鎮痛薬、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、COX阻害剤、心保護薬（cardioprotectants）、金属キレート剤、IFN-ガンマ、及び／又はNSAIDと組み合わせてVEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体を含む組成物、治療製剤、及び処置方法を含む。

さらなる治療活性成分、例えば、上に列挙された薬剤のいずれか又はその誘導体又はそれらの組み合わせは、本発明の状況内で、VEGFアンタゴニスト及び／又は抗CTLA-4抗体の投与の直前、投与と同時、又は投与の直後に投与され得る；(本開示の目的のために、このような投与計画は、さらなる治療活性成分「と組み合わせた」VEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体の投与とみなされる。本発明は、VEGFアンタゴニスト及び／又は抗CTLA-4抗体が、本明細書の他所に記載されるような1つ又はそれ以上のさらなる治療活性成分と同時処方されている医薬組成物を含む。

薬物送達及び投与方法
様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム中の封入、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス(例えば、Wu et al.、1987、J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと)。投与方法としては、限定されないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口の経路が挙げられる。組成物は、いずれかの都合の良い経路により、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚裏層(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など)を通した吸収により投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。

本発明の医薬組成物(例えば、単一の治療活性剤、又は2つもしくはそれ以上の治療活性剤の組み合わせを含む)は、皮下又は静脈内に標準的な針及びシリンジを用いて送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達の際に容易に有用性を有する。このようなペン型送達デバイスは、再使用可能でも使い捨てでもよい。再使用可能ペン型送達デバイスは、一般的には医薬組成物を含有した交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄されて医薬組成物を含有する新しいカートリッジと置き換えられ得る。次いでペン型送達デバイスは再使用され得る。使い捨てペン型送達デバイスには、交換可能なカートリッジは無い。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバーに保持された医薬組成物で予め充填されている。リザーバーから医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。

特定の状況において、医薬組成物は、徐放系で送達され得る。一実施態様において、ポンプが使用され得る。別の実施態様において、ポリマー材料が使用され得る；Medical Applications of Controlled Release、Langer and Wise (eds.)、1974、CRC Pres.、Boca Raton、Floridaを参照のこと。なお別の実施態様において、徐放系は、組成物の標的に近接して置くことができ、従って全身用量のわずかしか必要としない(例えば、Goodson、1984、Medical Applications of Controlled Release、前出、vol. 2、pp. 115-138を参照のこと)。他の徐放系は、Langer、1990、Science 249:1527-1533による概説において考察される。

注射可能製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋内注射、点滴などのための投薬形態を含み得る。これらの注射可能製剤は公知の方法により製造され得る。例えば、注射可能製剤は、上記の抗体又はその塩を、従来注射に使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に、例えば、溶解、懸濁又は乳化させることにより製造され得る。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤などを含有する等張液があり、これらはアルコール(例えば、エタノール)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤[例えば、ポリソルベート80、HCO-50(硬化ひまし油のポリオキシエチレン(50mol)付加物)]などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて使用され得る。このようにして製造された注射剤は、好ましくは適切なアンプル中に充填される。

有利には、上記の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適した単位用量で投薬形態へと製造される。単位用量でのこのような投薬形態としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤等が挙げられる。

投薬量
本発明の医薬組成物内に含有され、かつ／又は本発明の方法に従って被験体に投与される活性成分(例えば、VEGFアンタゴニスト及び／又は抗CTLA-4抗体)の量は、一般的には治療有効量である。本明細書で使用されるVEGFアンタゴニスト及び／又は抗CTLA-4抗体の文脈における表現「治療有効量」は、ヒト又は動物被験体において測定可能な生物学的効果を生じることができる、単独又は別の治療剤と組み合わせた、治療剤の量を意味する。このような測定可能な生物学的効果の例としては、例えば、被験体の血清中の治療分子の検出、被験体から採取された生物学的サンプル中の関連する代謝産物の検出、被験体から採取されたサンプル中の関連するバイオマーカーの濃度の変化、腫瘍サイズの減少、腫瘍成長速度の減少、腫瘍退縮、被験体の改善された生存、及び／又はいずれかの他の関連する治療的もしくは臨床的パラメーターの改善が挙げられる。

VEGFアンタゴニスト(例えば、VEGF Trap)又は抗CTLA-4抗体の場合、治療有効量は、VEGFアンタゴニスト又は抗CTLA-4抗体約0.05mg〜約600mg、例えば、約0.05mg、約0.1mg、約1.0mg、約1.5mg、約2.0mg、約10mg、約20mg、約30mg、約40mg、約50mg、約60mg、約70mg、約80mg、約90mg、約100mg、約110mg、約120mg、約130mg、約140mg、約150mg、約160mg、約170mg、約180mg、約190mg、約200mg、約210mg、約220mg、約230mg、約240mg、約250mg、約260mg、約270mg、約280mg、約290mg、約300mg、約310mg、約320mg、約330mg、約340mg、約350mg、約360mg、約370mg、約380mg、約390mg、約400mg、約410mg、約420mg、約430mg、約440mg、約450mg、約460mg、約470mg、約480mg、約490mg、約500mg、約510mg、約520mg、約530mg、約540mg、約550mg、約560mg、約570mg、約580mg、約590mg、又は約600mgであり得る。

被験体に投与されるVEGFアンタゴニスト(例えば、VEGF Trap)及び／又は抗CTLA-4抗体の量は、被験体の体重１キログラムあたりの抗体のミリグラムで表され得る(すなわち、mg/kg)。例えば、VEGFアンタゴニスト(例えば、VEGF Trap)及び／又は抗CTLA-4抗体は、約0.0001〜約10mg/被験体体重kgの用量で患者に投与され得る。

以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造しかつ使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を制限することは意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされてきたが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。そうではないと示されていなければ、部数は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧又は大気圧付近である。

実施例１. マウス早期処置腫瘍モデルにおける抗CTLA-4抗体及びVEGFアンタゴニストの組み合わせの抗腫瘍効果
早期処置腫瘍モデルを、抗CTLA-4抗体及びVEGFアンタゴニストの組み合わせの有効性を試験するために開発した。このモデルにおいて、組み合わせ治療は、腫瘍移植の直後に投与された。この実験において使用された抗CTLA-4抗体は、抗マウスCTLA-4 IgG2bクローン「9D9」(Bio X Cell、West Lebanon、NH、カタログ番号BE0164)であった。この実験で使用されたVEGFアンタゴニストはアフリベルセプト(VEGF受容体ベースのキメラ分子、「VEGF-trap」又は「VEGFR1R2-FcΔC1(a)」としても知られる、その十分な説明は本明細書の他所に提供される)。であった。

この実験モデルのために、1.0x10⁶ Colon-26腫瘍細胞をマウスに０日目に移植した。測定可能な腫瘍の樹立前に、３日目に開始して、マウスを、表１に示されるように、単剤もしくは組み合わせ療法、又は対照組み合わせのうちの１つで処置した：

様々な治療を、２週の期間にわたって５つの異なる時点で投与した(すなわち、3日目、7日目、10日目、14日目及び18日目の注射)。

各治療群の動物を、５０日目に（すなわち、５０日間）、腫瘍発生率、腫瘍体積、生存期間中央値、及び腫瘍のない動物の数に関して評価した。腫瘍成長の程度を図１(腫瘍成長曲線)及び図2(22日目の腫瘍体積)にまとめ、経時的な生存パーセントを図３に示す。結果を表２にもまとめる。

腫瘍成長は、単剤処置群と比較して、VEGF Trap＋抗CTLA-4抗体の組み合わせで処置された動物において実質的に減少された(図1及び2を参照のこと)。さらに、生存はVEGF Trap＋抗CTLA-4抗体群において実質的に増加し、動物の70%が腫瘍移植の少なくとも５０日後まで生存した。一方、抗CTLA-4及びVEGF Trap単剤治療群については、50日目までの生存はそれぞれ30%及び0%しかなかった(図3及び表2を参照のこと)。

従って、この実施例は、抗CTLA-4抗体及びVEGFアンタゴニストの組み合わせが、腫瘍発生過程の早期に投与された場合、腫瘍成長を阻害することができ、かついずれかの治療剤単独よりもかなり多く生存を改善することができるということを実証する。

実施例２. マウス早期処置腫瘍モデルにおいて抗CTLA-4抗体及びVEGFアンタゴニストの組み合わせで事前に処置された動物の腫瘍免疫
実施例１の追跡調査として、様々な処置群（表１及び２を参照のこと）からの腫瘍のない動物を選択し、そして初期腫瘍移植の６０日後に1.0x10⁶ Colon-26腫瘍細胞を再負荷した。腫瘍負荷も処置も受けていない未処置動物も対照としてこの実験に含まれた。この追跡実験のための様々な処置群を表３にまとめる。

各処置群からの動物に、1x10⁶ Colon-26腫瘍細胞を初期腫瘍細胞移植の６０日後に移植した(実施例１を参照のこと)。腫瘍体積及び生存を、腫瘍再負荷の１４日後及び３２日後に評価した。結果を図4A及び4Bにまとめる。示されるように、抗CTLA-4のみ及びVEGF Trap＋抗CTLA-4動物は、実験の過程全体を通して（すなわち、３２日間の間中)腫瘍のないままであったが、一方でいずれの治療的予備処置を受けていなかった未処置動物は、予想通り腫瘍を発生した。抗CTLA-4のみの群の全ての３匹の動物は再負荷で生存し、そしてVEGF Trap＋抗CTLA-4群中の６匹の動物のうち5匹は実験の終わり（３２日目）まで腫瘍再負荷を生き延びた。

この実施例は、単独又はVEGFアンタゴニストと組み合わせた抗CTLA-4抗体での処置が、処置された被験体を将来の腫瘍負荷から保護する免疫学的記憶応答を誘導するということを実証する。

実施例３. マウス後期処置腫瘍モデルにおける抗CTLA-4抗体及びVEGFアンタゴニストの組み合わせの抗腫瘍効果
実施例１において、マウスは腫瘍移植の直後に治療的処置を受けた。この実施例では、対照的に、腫瘍が樹立された後まで処置を意図的に遅らせた。実験を以下のように行った：０日目に、1x10⁶ Colon-26腫瘍細胞をマウスに移植した。11日めに、腫瘍が約60mm³に成長した後、マウスを同じ平均腫瘍サイズを有する群に無作為に選び、そして実施例１で使用したような単剤療法もしくは組み合わせ療法、または対照組み合わせのうちの１つで処置した(表１を参照のこと）。様々な治療を、２週の期間にわたって５つの異なる時点で投与した(すなわち、11日目、15日目、17日目、21日目及び25日目の注射)。

各治療群の動物を、７０日目までの、腫瘍発生率、腫瘍体積、生存期間中央値、及び腫瘍のない動物の数に関して評価した。腫瘍成長の程度を図5(腫瘍成長曲線)及び図6(７０日目の腫瘍体積)にまとめ、そして生存パーセントを図７に示す。結果を表４にもまとめる。

後期処置モデルにおいて、抗腫瘍応答が、抗CTLA-4単剤処置群のほかに、VEGF Trap＋抗CTLA-4組み合わせ処置群においても観察された。さらに、増強された生存が、抗CTLA-4単剤処置群のほかに、VEGF Trap＋抗CTLA-4組み合わせ処置群においても観察され、７０日目までの生存パーセント中央値はそれぞれ86%及び80%であった。

次いで同様の実験を、VEGF Trap＋抗CTLA-4組み合わせ、さらには様々な単剤及び対照組み合わせの、Colon-26腫瘍モデルにおける個々の腫瘍の腫瘍成長及び病理組織学的特徴に対する効果を評価するために行った。手短には、40 Balb/c成体雄性マウス(7〜8週齢)に、Colon-26腫瘍細胞を0日目に移植した(マウスあたり1x10⁶ Colon-26腫瘍細胞を右側腹部に注射した)。腫瘍を約60〜80mm³の体積まで成長させた(7日目まで)。移植後7日目に、マウスを群に分け、そして実施例１で使用されたような、単剤もしくは組み合わせ治療、又は対照組み合わせで処置した(表1を参照のこと)。様々な治療を、５つの異なる時点でマウスに投与した（すなわち、7日目、11日目、14日目、17日目、及び20日目の注射）。腫瘍体積を、処置期間にわたって測定した。移植後２１日目に、5つの腫瘍を各処置群のマウスから病理評価のために集めた。隣接する皮弁と一緒に腫瘍を切除し、そしてｐH平衡化した作製したばかりの１０％ホルマリン液中に２４時間浸し、次いで70%エタノールですすいで70%エタノール中室温で保存した。パラフィン包埋腫瘍を薄片にして、H&E及びMassonのトリクローム組織学的特別染色で染色した。腫瘍体積を図8及び9に示す；２１日目の腫瘍退縮及び壊死を図１０及び１１にそれぞれ示す。

第二の実験の結果は、抗CTLA-4又はVEGF Trapがそれぞれ単剤として樹立されたColon-26腫瘍の成長速度を抑制したこと、そして組み合わせ治療(VEGF Trap＋抗CTLA-4)がこのモデルにおいて腫瘍成長のなおより大きな減少を生じたということを裏付ける。抗CTLA4抗体治療が、腫瘍浸潤CD8+ T細胞の密度を増加させるが、CD4+ T細胞の密度は増加させないということもこのモデルにおいて観察された。

この実験における組織病理学的評価は、抗CTLA-4及びVEGF Trap治療の療法により促進される腫瘍退縮を明らかにした；しかし、各薬剤が腫瘍退縮を促進した機構は異なっているように思われた。特に、VEGF Trap処置は増加した腫瘍壊死を促進したが、抗CTLA-4処置単独では腫瘍壊死の確実な増加は促進しなかった(図11)。VEGF Trap＋抗CTLA-4処置の組み合わせは、VEGF Trap処置群単独で観察されたものより有意に大きな増加した腫瘍壊死を生じた（図11)。

組織病理学的評価はまた、抗CTLA-4処置(単独又は組み合わせ)が、主にリンパ球及びマクロファージから構成される増加した腫瘍/腫瘍周囲浸潤を生じたということを示した。増加した腫瘍壊死、炎症細胞浸潤及び線維症は、全ての処置群で腫瘍退縮に寄与したが、抗CTLA-4処置群において突出していた(図12A-C)。

この実施例の結果は、抗CTLA-4処置が樹立した腫瘍に有効な治療ストラテジーであるということ、及び同様の治療利益がVEGFアンタゴニスト及び抗CTLA-4抗体の組み合わせで達成されるということを裏付ける。

実施例４. 抗CTLA-4抗体の抗腫瘍効果に対する免疫グロブリン定常領域（Fc)の影響、及び高エフェクター機能(IgG2a)抗CTLA-4抗体と組み合わされたVEGF Trapの増強された抗腫瘍効果
上に示された以前の実施例において、IgG2bアイソタイプの抗CTLA-4抗体(すなわち、市販の抗マウスCTLA-4 IgG2bクローン「9D9」)を実験で使用した。IgG2b抗体は低いエフェクター機能を有するが、IgG2a抗体は高いエフェクター機能を有するということが知られている。従って、この実施例では、抗CTLA-4抗体の免疫グロブリン定常領域の役割に取り組む。特に、マウス抗CTLA-4抗体のマウスIgG2a及びIgG2bバージョンの抗腫瘍効果を、後期処置マウスColon-26及びMC38腫瘍異種移植モデルにおいて互いと比較した。

第一の実験において、BalbCマウスに、Colon-26腫瘍細胞をマウスあたり1x10⁶細胞で皮下移植した。移植後10日目に、マウスを腫瘍体積(60〜80mm³)により5つに無作為に選んだ。様々な処置群を表５にまとめる。

マウスを、表５に示されるように、12、15、19、22、26、30、33、37及び41日目に(すなわち、実験期間の間、週に２回)、抗CTLA-4抗体又は対照抗体100μgで腹腔内注射(IP)で処置した。腫瘍体積及び生存を週に２回測定した。結果を図13(腫瘍体積)及び14(生存)に示す。生存期間中央値を表6に示す。

第二の実験において、C57/BL6マウスに、MC38腫瘍細胞をマウスあたり3x10⁶で皮下移植した。移植後、腫瘍が平均サイズ40〜50mm³に達した後、マウスを５つの異なる群に無作為に選んだ。様々な処置群を表７にまとめる。

表７に示されるように、マウスを、10、14、17、21、及び24日目に(すなわち、２週以内に５回の注射)、抗CTLA-4抗体又は対照抗体200μgで腹腔内注射(IP)により処置した。腫瘍体積及び生存を週に２回測定した。結果を図15(経時的腫瘍体積)、図16(21日目の腫瘍体積)及び図17(生存)に示す。生存期間中央値を表８に示す。

これらの実験の結果は、抗CTLA-4 IgG2a抗体がIgG2bバージョンよりも有意により強力であり、樹立したColon-26腫瘍の根絶及び樹立したMC38腫瘍の部分的成長阻害を生じるということを実証した。一方、これらの樹立した腫瘍はIgG2b治療に対して抵抗性であった。

第三の実験において、抗CTLA-4 mIgG2a抗体及びVEGF Trapの組み合わせの抗腫瘍効果をインビボで調べた。この実験において、マウスに、MC38腫瘍細胞をマウスあたり3x10⁵細胞を0日目に皮下移植した。移植後、腫瘍が平均サイズ60〜80mm³に達した後(14日目)、マウスを４つの異なる群に無作為に選んだ。異なる処置群を表９にまとめる。

マウスを、対照及び実験的組み合わせで、15、17、23、25、27、33、35及び37日目に腹腔内注射(IP)により、表９に示されるように処置した。腫瘍体積を週に２回測定した。結果を図18(経時的腫瘍体積)、及び図19(２４日目の腫瘍体積)に示す。

第四の実験において、抗CTLA-4 mIgG2b抗体及びVEGF Trapの組み合わせの抗腫瘍効果をインビボで調べた。この実験において、マウスにMC38腫瘍細胞を、マウスあたり3x10⁵細胞で０日目に皮下移植した。移植後、腫瘍が平均サイズ60〜80mm³に達した後(10日目)、マウスを４つの異なる群に無作為に選んだ。異なる処置群を表１０にまとめる。

マウスを、対照及び実験的組み合わせで、10、14、18、21、及び25日目に腹腔内注射(IP)により、表10に示されるように処置した。腫瘍体積を週に2回測定した。結果を図20（経時的腫瘍体積)、及び図21(１８日目の腫瘍体積)に示す。

重要な事には、上記の第三及び第四の実験において示されるように、抗CTLA-4 IgG2a抗体及びVEGF Trap(アフリベルセプト）は、樹立したMC38腫瘍において確かな組み合わせ効果を有するが、一方で抗CTLA4 IgG2b抗体はVEGF Trap有効性を増強しない。これらの結果は、免疫療法(例えば、抗CTLA-4処置)とVEGF拮抗作用を組み合わせることが臨床状況における樹立した腫瘍の処置のために有益であり得るというさらなる証拠を提供する。

実施例５. 抗CTLA4抗体及びVEGF Trapの組み合わせで処置されたマウスにおけるT細胞浸潤、活性化免疫、及び血管新生の定量的評価
この実施例において、組み合わせたVEGF-Trap及び抗CTLA-4抗体の処置の腫瘍成長及び他の定量的遺伝子発現及び腫瘍浸潤関連パラメーターに対する効果を、樹立したMC38マウス癌皮下腫瘍モデルにおいて調べた。

8〜10週齢の同系C57/Bl6マウスに、3x10⁵ MC38細胞の100μl懸濁液を右側腹部に0日目に移植した。9日目に、樹立した細胞を有するマウスを平均腫瘍体積50 mm³を有する群に無作為に選択し(n=8マウス/群)、そして抗CTLA-4抗体(抗マウスCTLA4、mIgG2aアイソタイプを有するクローン9D9)、VEGF-Trap(VEGFR1R2-FcΔC1(a))、抗CTLA-4抗体とVEGF-Trapとの組み合わせ、又はアイソタイプ対照の４つの処置を、9、13、16及び20日目に投与した。VEGF-Trap及びhFc対照を皮下に10mg/kgで投薬し、そして抗CTLA-4抗体及びmIgG2aアイソタイプ対照を腹腔内（i.p.）にマウスあたり200μgで投薬した。

腫瘍サイズ(体積mm³)を実験の全体を通して様々な時点で電気ノギスにより測定した。

21日目にマウスを屠殺し、そして特定の遺伝子のmRNAの定量的実時間ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析(Taqman^(R))のために腫瘍を取り出した。総RNAを、MagMAX^TM-96を使用してマイクロアレイ総RNA単離キット(Life TechnologiesによるAmbion)のために製造者の仕様書に従って組織から精製した。ゲノムDNAを、上記のMagMAXキット(Life TechnologiesによるAmbion)からのMagMAX^TMTurbo^TMDNase緩衝液及びTURBO DNaseを使用して取り出した。SuperScript^(R) VILO^TMマスターミックス(Life TechnologiesによるInvitrogen)を使用してmRNAをcDNAに逆転写した。cDNAを5ng/μL及び25ngに希釈し、そしてcDNAをTaqMan^(R)遺伝子発現マスターミックス(Life TechnologiesによるApplied Biosystems)を用いてABI 7900HT配列検出システム(Applied Biosystems)を使用して増幅した。Cyclophilin B (Ppib)を内部内因性対照遺伝子として使用して任意のcDNA入力差異を正規化した。FAM色素標識Taqman MGBプローブ(Life Technologies)を、マウスCD247(Mm00446171_m1)、mIFNγ(Mm01168134_m1)、mTNFα(Mm00443260_g1)、mDll4(Mm01338015_m1)、mAng2(Mm00545822_m1)、mRobo4(Mm00452963_m1)、mItgam(Mm00434455_m1)、mEmr1(Mm00802529_m1)、mItgax (Mm00498701_m1)、E-セレクチン(Mm01310197_m1)に使用した。FAM色素標識BHQ1プローブ(Biosearch Technologies)をマウスCD8bに使用した。PCR熱サイクル条件は以下のとおりであった：初期工程95℃で10分、続いて95℃3秒及び60℃３０秒間の40サイクル。各遺伝子のmRNAレベルの比を以下のように計算した：(各遺伝子の絶対コピー数)／(シクロフィリンBの絶対コピー数)。

結果を平均値+/-標準誤差として表し、そして一般的一要因（ordinary one-way）ANOVAをTukeyの多重比較検定を使用して統計的有意性を評価した。0.05未満の値を統計的に有意とみなした。^*P<0.05；^**P<0.005；^***P<0.0005；^****P<0.0001。

抗CTLA-4抗体又はVEGF-Trapのいずれかでの樹立したMC38腫瘍のインビボ処置は、対照と比較して腫瘍成長の有意な阻害を生じた(図22、それぞれ黒四角■、及び白丸○)。両方の薬剤での遮断はMC38腫瘍成長をさらに減少させ、組み合わせ抗腫瘍効果を示した(図22、黒三角▲)。

腫瘍RNAの実時間PCR分析は、抗血管新生剤VEGF-Trapが血管新生マーカー遺伝子Dll4、Ang2及びRobo4の発現を下方調節するが、抗CTLA-4治療はこれらの遺伝子に影響を及ぼさなかったということを明らかにした。(それぞれ図23、24及び25)。抗CTLA-4 AbとのVEGF-Trap組み合わせはE-セレクチンのレベルを有意に増加し(図26)、内皮細胞活性化を示し、このことは、腫瘍に移動するリンパ球の改善された能力を表す。

実時間PCR分析を使用して、抗腫瘍免疫応答を評価するために、腫瘍浸潤リンパ球の発現も評価した。VEGF-TrapはTリンパ球動員に影響を及ぼさなかったが、抗CTLA-4 Ab治療は、CD8+及びCD3+T細胞の数を実質的に増加させ(CD247)、これは組み合わせ群においてさらに増加した(図27及び28)。抗CTLA4 Abを用いるが、VEGF-Trapは用いない処置もまた、Treg細胞マーカーフォークヘッドボックスタンパク質3(FoxP3)の増加した発現を生じた(示していない)。

腫瘍免疫環境を、炎症性サイトカインの発現を評価することによりさらに分析した。抗CTLA4抗体及び組み合わせ治療は、インターフェロン(IFNγ)及び腫瘍壊死因子(TNFα)のレベルを有意に増加させたが、VEGF-Trap単剤療法はこれらの効果をどちらも有していなかった(それぞれ図29及び30)。

骨髄細胞浸潤を分析するために、Itgam(CD11b)、Emr1(F4/80)及びItgax(CD11c) mRNAレベルを、それぞれ骨髄細胞、マクロファージ及び樹状細胞のマーカーとして評価した。抗CTLA4抗体又は組み合わせ治療は、骨髄細胞浸潤の有意な増加を促進し(図31、32及び33)、最も顕著な増加は組み合わせ群における腫瘍への樹状細胞浸潤の増加であった。

要約すれば、本実施例は、樹立した腫瘍に対する抗CTLA4抗体及びVEGF-Trapの有意な組み合わせ効果をさらに実証する。処置された腫瘍の分子免疫プロファイリングは、抗CTLA
4及びVEGF-Trap治療が、それぞれ免疫調節性及び血管新生シグナル伝達経路を調節することによりそれらの効果を媒介し、それらの両方が組み合わせ群における改善された抗腫瘍免疫応答に寄与し得るということを示唆する。VEGF-Trapの投与は、活性化された内皮並びに血管新生因子Dll4、Ang2及びRobo4の下方調節を明らかにした。組み合わせ群におけるE-セレクチンの増加した発現は、改善されたリンパ球接着及び回転を示し得、これらは腫瘍組織への増加したリンパ球浸潤を生じ得る。この結果は、T細胞及び骨髄細胞の増加した数、さらには抗CTLA-4処置腫瘍において観察された炎症性サイトカインの上方調節、そして組み合わせ群におけるさらる増加と一致しており、二重VEGF及びCTLA-4遮断に対する抗腫瘍免疫応答の相乗的性質を示す。

本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様による範囲に限定されるべきではない。実際に、本明細書中に記載されるものに加えて本発明の様々な改変が前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内であることを意図される。

Claims

（ｉ）ＶＥＧＦアンタゴニスト；（ｉｉ）抗ＣＴＬＡ−４抗体；及び（ｉｉｉ）薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、及び抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群より選択される分子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子（ＶＥＧＦＴｒａｐ）を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１の１つ又はそれ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ＶＥＧＦＲ２の１つ又はそれ以上のＩｇ様ドメイン、及び多量体化ドメインを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３、及び多量体化ドメインを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、（１）配列番号２のアミノ酸２７〜１２９を含むＶＥＧＦＲ１成分；（２）配列番号２のアミノ酸１３０〜２３１を含むＶＥＧＦＲ２成分；及び（３）配列番号２のアミノ酸２３２〜４５７を含む多量体化成分を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、配列番号１の核酸配列にコードされるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がアンタゴニスト抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がイピリムマブ又はトレメリムマブである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
被験体において腫瘍の成長を阻害又は軽減するための方法であって、被験体に、治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト及び治療有効量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、上記方法。
ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体が、別々の投薬形態で被験体に投与される、請求項１０に記載の方法。
別々の投薬形態が被験体に同時に投与される、請求項１１に記載の方法。
別々の投薬形態が、被験体に連続して投与される、請求項１１に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体が、単一投薬形態で被験体に投与される、請求項１０に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、被験体に静脈内投与又は皮下投与される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体が被験体に静脈内投与又は皮下投与される、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、及び抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群より選択される分子を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子（ＶＥＧＦＴｒａｐ）を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１の１つ又はそれ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ＶＥＧＦＲ２の１つ又はそれ以上のＩｇ様ドメイン、及び多量体化ドメインを含む、請求項１８に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３、及び多量体化ドメインを含む、請求項１９に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、（１）配列番号２のアミノ酸２７〜１２９を含むＶＥＧＦＲ１成分；（２）配列番号２のアミノ酸１３０〜２３１を含むＶＥＧＦＲ２成分；及び（３）配列番号２のアミノ酸２３２〜４５７を含む多量体化成分を含む、請求項２０に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、配列番号１の核酸配列によりコードされるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を含む、請求項２１に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がアンタゴニスト抗体である、請求項１０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がイピリムマブ又はトレメリムマブである、請求項１０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
腫瘍に罹患した被験体の生存を延長するか又は長くするための方法であって、被験体に治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト及び治療有効量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、上記方法。
ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体が、別々の投薬形態で被験体に投与される、請求項２５に記載の方法。
別々の投薬形態が被験体に同時に投与される、請求項２６に記載の方法。
別々の投薬形態が、被験体に連続して投与される、請求項２６に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体が単一投薬形態で被験体に投与される、請求項２５に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが被験体に静脈内投与又は皮下投与される、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体が、被験体に静脈内投与又は皮下投与される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、及び抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群より選択される分子を含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子（ＶＥＧＦＴｒａｐ）を含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１の１つ又はそれ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ＶＥＧＦＲ２の１つ又はそれ以上のＩｇ様ドメイン、及び多量体化ドメインを含む、請求項３３に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３、及び多量体化ドメインを含む、請求項３４に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、（１）配列番号２のアミノ酸２７〜１２９を含むＶＥＧＦＲ１成分；（２）配列番号２のアミノ酸１３０〜２３１を含むＶＥＧＦＲ２成分；及び（３）配列番号２のアミノ酸２３２〜４５７を含む多量体化成分を含む、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、配列番号１の核酸配列によりコードされるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を含む、請求項３６に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がアンタゴニスト抗体である、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がイピリムマブ又はトレメリムマブである、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
被験体において腫瘍免疫を誘導する方法であって、被験体に、治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト及び治療有効量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、上記方法。
被験体が、被験体へのＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の前に腫瘍に罹患している、請求項４０に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体が、別々の投薬形態で被験体に投与される、請求項４０又は４１に記載の方法。
別々の投薬形態が被験体に同時に投与される、請求項４２に記載の方法。
別々の投薬形態が、被験体に連続して投与される、請求項４２に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＣＴＬＡ−４抗体が、単一投薬形態で被験体に投与される、請求項４０又は４１に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが被験体に静脈内投与又は皮下投与される、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体が被験体に静脈内投与又は皮下投与される、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、及び抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群より選択される分子を含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子（ＶＥＧＦＴｒａｐ）を含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１の１つ又はそれ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ＶＥＧＦＲ２の１つ又はそれ以上のＩｇ様ドメイン、及び多量体化ドメインを含む、請求項４９に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３、及び多量体化ドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、（１）配列番号２のアミノ酸２７〜１２９を含むＶＥＧＦＲ１成分；（２）配列番号２のアミノ酸１３０〜２３１を含むＶＥＧＦＲ２成分；及び（３）配列番号２のアミノ酸２３２〜４５７を含む多量体化成分を含む、請求項５１に記載の方法。
ＶＥＧＦＴｒａｐが、配列番号１の核酸配列によりコードされるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を含む、請求項５２に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がアンタゴニスト抗体である、請求項４０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がイピリムマブ又はトレメリムマブを含む、請求項４０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター活性を生じるＦｃアイソタイプを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項５６に記載の医薬組成物。
抗ＣＴＬＡ−４抗体が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター活性を生じるＦｃアイソタイプを有する、請求項１０〜２３、２５〜３８、又は４０〜５４のいずれか１項に記載の方法。
抗ＣＴＬＡ−４抗体がＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項５８に記載の方法。