BR112020017872A2 - Anticorpos de il-6 e construtos de fusão e conjugados dos mesmos - Google Patents

Anticorpos de il-6 e construtos de fusão e conjugados dos mesmos Download PDF

Info

Publication number
BR112020017872A2
BR112020017872A2 BR112020017872-1A BR112020017872A BR112020017872A2 BR 112020017872 A2 BR112020017872 A2 BR 112020017872A2 BR 112020017872 A BR112020017872 A BR 112020017872A BR 112020017872 A2 BR112020017872 A2 BR 112020017872A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
seq
vegf
polymer
trap
Prior art date
Application number
BR112020017872-1A
Other languages
English (en)
Inventor
Rachel D. Jacobson
Fernando Corrêa
Hong Liang
D. Victor Perlroth
Original Assignee
Kodiak Sciences Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kodiak Sciences Inc. filed Critical Kodiak Sciences Inc.
Publication of BR112020017872A2 publication Critical patent/BR112020017872A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

a presente invenção fornece anticorpos antagonizantes que se ligam a il-6, proteínas de fusão dos mesmos com vegf-trap, e conjugados de qualquer um dos mesmos, e métodos de uso dos mesmos. os anticorpos anti-il-6 podem ser usados terapeuticamente sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos para doenças.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “ANTICORPOS DE IL-6 E CONSTRUTOS DE FUSÃO E CONJUGADOS DOS MESMOS”
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA A QUAISQUER PEDIDOS DE PRIORIDADE
[001] Quaisquer e todos os pedidos para os quais uma reivindicação de prioridade estrangeira ou nacional é identificada na Folha de Dados do Pedido, conforme depositada com o presente pedido, são aqui incorporados por referência sob 37 CFR §1.57.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado KDIAK044.txt, criado em 1 de março de 2019, com 395.430 bytes de tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE DEPÓSITO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS
[003] Em algumas modalidades, anticorpos anti-IL- 6, fusões e conjugados dos mesmos são fornecidos, sendo depositados no American Type Culture Collection (ATCC), de acordo com o Tratado de Budapeste, sob os números ____, em ____.
[004] Estes depósitos são feitos sob as provisões do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os propósitos do Procedimento de Patente e dos Regulamentos abaixo (Tratado de Budapeste). Isto garante a manutenção do depósito por 30 anos a partir da data de depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste, e sujeito a um acordo entre o requerente e a ATCC, que garante disponibilidade permanente e irrestrita do depósito ao público mediante emissão da patente americana pertinente ou mediante colocação aberta para o público de qualquer pedido de patente americano ou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade do depósito a um determinado pelo Comissário Americano de Patentes e Marcas a serem intituladas de acordo com as regras 35 U.S.C § 122 e as regras do Comissário de acordo com o mesmo (incluindo 37 C.F.R. § 1.14). Disponibilidade do material biológico depositado não deve ser interpretada como uma licença para a prática da invenção em contraste dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patentes.
CAMPO
[005] A presente invenção refere-se geralmente a construtos de fusão que se ligam a IL-6 e/ou VEGF.
FUNDAMENTOS
[006] O fator de crescimento endotelial vascular a (VEGF-A) é uma proteína de sinal que media funções pró- angiogênicas tais como sobrevivência celular endotelial, proliferação, migração e permeabilidade célula-célula.
Mostrou-se que sua atividade promove a progressão de doenças da retina, tais como neovascularização coroidal (CNV) em Degeneração Macular Relacionada à Idade (AMD) e Edema Macular Diabético (DME). A inibição da sinalização de VEGF-A mostrou ser um meio eficaz para interromper a progressão de doenças de retina neovasculares (Ferrara et al, Retina, 2006). Várias moléculas terapêuticas foram desenvolvidas para inibir a função de VEGF. Entre estas, anticorpos monoclonais anti- VEGF, tais como Ranibizumabe e Bevacizumabe, demonstraram ser tratamentos seguros e eficazes contra a angiogênese patológica. Mais recentemente, proteínas de fusão VEGFR recombinantemente produzidas, tais como Aflibercept (Eylea) e Conbercept (China), que agem como "traps" de VEGF ("VEGF- trap"), são provadas serem mais eficazes e mais duradouras que seus competidores de anticorpos.
[007] A inflamação foi implicada na patogênese de doenças da retina, e as terapias anti-inflamatórias, tais como os esteroides, têm sido eficazes no tratamento de uveíte e edema macular diabético (DME). Estudos detalhados procurando inflamação e infecção no olho mostraram que a citocina pró-inflamatória, interleucina-6 (IL-6) é significativamente elevada nos fluidos oculares de pacientes com uveíte refratária/crônica, e a inibição de IL-6 em modelos animais inibe o início da uveíte. Altos níveis de fluidos oculares de IL-6 são também encontrados em pacientes com DME e oclusão da veia da retina. Adicionalmente, as células inflamatórias crônicas foram observadas sobre a superfície da membrana de Bruch em olhos com AMD neovascular, e pacientes com AMD foram relatados como tendo níveis séricos aumentados de IL-6. De forma interessante, IL-6 também foi observada a estimular a angiogênese defeituosa. Além de distúrbios autoimunes, tais como artrite reumatoide, tratamento anti-IL-6 foi mostrado como eficaz para tratar a uveíte e edema macular uveítico.
RESUMO
[008] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga especificamente a IL-6 que é conjugado a um polímero.
[009] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado. O anticorpo compreende uma região variável de aminoácidos de cadeia pesada que compreende uma cadeia pesada na Tabela IA; e uma região variável de aminoácidos de cadeia leve que compreende a cadeia leve na Tabela 1B.
[0010] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado. O anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade VH (CDR1), VH CDR2 e VH CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das CDRs na Tabela 1A; e uma região variável de cadeia Leve (VL) compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das CDRs na Tabela 1B.
[0011] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6. O anticorpo compreende pelo menos uma das seguintes mutações baseadas em numeração EU: L234A, L235A e G237A.
[0012] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6. O anticorpo compreende uma CDRH1 que é a CDRH1 na Tabela 1A; uma CDRH2 que é a CDRH2 na Tabela 1A; uma CDRH3 que é CDRH3 na Tabela 1A; uma CDRL1 que é a CDRL1 na Tabela 1B; uma CDRL2 que é a CDRL2 na Tabela 1B; uma CDRL3 que é a CDRL3 na Tabela 1B; pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): L234A, L235A e G237A; e pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): Q347C ou L443C.
[0013] Em alguns aspectos, é fornecida uma proteína de fusão que compreende o anticorpo antagonista isolado; e um fragmento de uma proteína de ligação de VEGF.
[0014] Em alguns aspectos, é fornecido um conjugado compreendendo qualquer um dos anticorpos antagonistas isolados aqui e um polímero. O polímero é covalentemente ligado ao anticorpo.
[0015] Em alguns aspectos, é fornecido um conjugado.
O conjugado compreende a proteína de fusão como fornecida aqui e um polímero, em que o polímero é covalentemente ligado à proteína de fusão.
[0016] Em alguns aspectos, é fornecida uma linhagem celular isolada que produz o anticorpo antagonista isolado ou a proteína de fusão.
[0017] Em alguns aspectos, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo antagonista isolado ou a proteína de fusão.
[0018] Em alguns aspectos, é fornecido um vetor de expressão recombinante. O vetor compreende um ácido nucleico que codifica qualquer um destes construtos aqui fornecidos.
[0019] Em alguns aspectos, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão como fornecido aqui.
[0020] Em alguns aspectos, é fornecido um método para produzir um anticorpo antagonista de IL-6 ou proteína de fusão do mesmo. O método compreende: cultivar uma linhagem celular que produz de forma recombinante um anticorpo antagonista isolado ou a proteína de fusão sob condições em que o anticorpo é produzido; e recuperar o anticorpo.
[0021] Em alguns aspectos, é fornecida uma composição farmacêutica. Compreende um anticorpo antagonista isolado ou a proteína de fusão e/ou um conjugado como fornecido aqui, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0022] Em alguns aspectos, é fornecido um método para o tratamento ou profilaxia de uma doença em um paciente em necessidade do mesmo. O método compreende administrar ao paciente um anticorpo antagonista isolado ou a proteína de fusão e/ou um conjugado como fornecido aqui.
[0023] Em alguns aspectos, é fornecido um método para o tratamento ou profilaxia de uma doença em um paciente em necessidade do mesmo. O método compreende identificar um paciente tendo atividade hiperativa de IL-6 e/ou VEGF; e administrar ao paciente um anticorpo antagonista isolado ou a proteína de fusão e/ou um conjugado como fornecido aqui.
[0024] Em alguns aspectos, é fornecida uma proteína de fusão que compreende uma VH de IL-6, uma VL de IL-6, um Fc de IL-6 e uma VEGF-trap, em que a VEGF-trap é fundida a IL-6 em uma das seguintes maneiras: 1) a uma extremidade N- terminal de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6; ou 2) entre uma região de dobradiça e após um domínio CH1 de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6.
[0025] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo IL-6 antagonista isolado que compreende uma região variável de aminoácidos de cadeia pesada que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 7-13, 19-27, 89, 90, 256-262; e uma região variável de aminoácidos de cadeia leve que compreende a cadeia leve que tem uma sequência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 91-93, 28-30.
[0026] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo IL-6 antagonista isolado que compreende: uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo 3 regiões determinantes de complementaridade: VH (CDR1), VH CDR2, e VH CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de CDRs listadas em SEQ ID NO: 256; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de CDRs listadas em SEQ ID NO: 91-93.
[0027] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6. O anticorpo compreende pelo menos uma das seguintes mutações baseadas em numeração EU: L234A, L235A e G237A.
[0028] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6 e compreende: uma CDRH1 que é CDRH1 na SEQ ID NO: 172; uma CDRH2 que é uma CDRH2 na SEQ ID NO: 173; uma CDRH3 que é uma CDRH3 na SEQ ID NO: 174; uma CDRL1 que é uma CDRL1 na SEQ ID NO: 199; um CDRL2 que é uma CDRL2 na SEQ ID NO: 200; um CDRL3 que é uma CDRL3 na SEQ ID NO: 201; pelo menos uma das mutações seguintes (numeração EU): L234A, L235A e G237A; e pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): Q347C ou L443C.
[0029] Em alguns aspectos, é fornecida uma proteína de fusão compreendendo: o anticorpo antagonista isolado de qualquer um fornecido aqui (incluindo seus fragmentos) e uma VEGF-trap.
[0030] Em alguns aspectos, é fornecido um conjugado compreendendo: qualquer um dos anticorpos antagonistas isolados (incluindo fragmentos) fornecidos aqui; e um polímero, em que o polímero é covalentemente ligado ao anticorpo.
[0031] Em alguns aspectos, é fornecido um conjugado que compreende a proteína de fusão como aqui fornecida; e um polímero, em que o polímero é covalentemente ligado à proteína de fusão.
[0032] Em alguns aspectos, é fornecido um inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6. O inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL- 6 compreende uma fusão de anticorpo trap de um anticorpo anti-IL 6 e uma anti-VEGF-trap (VEGFR1/2), em que o inibidor duplo inclui pelo menos uma mutação pontual dentro de uma sequência VEGFR para reduzir a clivagem da proteína VEGFR.
[0033] Em alguns aspectos, um construto de proteína compreendendo: pelo menos 3 CDRs de cadeia pesada; pelo menos 3 CDRs de cadeia leve; uma sequência de VEGF-trap; e uma sequência ligante, em que cada uma das sequências é selecionada a partir de uma sequência correspondente nas Figuras 18-25 ou de sequências correspondentes das tabelas aqui (incluindo, por exemplo, 0,1A, 0,1B, 1A, 1B, 0,2A e 0,2B).
[0034] Em alguns aspectos, é fornecida uma proteína de fusão compreendendo uma VH de IL-6; uma VL de IL-6; um Fc de IL-6; e uma VEGF-trap, em que a proteína de fusão altera a proliferação de HUVEC. Em algumas modalidades, a alteração da proliferação de HUVEC é a inibição da proliferação mediada por VEGF/IL6.
[0035] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão compreendendo uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 263 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 117 é fornecida, em que a proteína de fusão é adicionalmente conjugada a um polímero.
[0036] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6. O anticorpo compreende pelo menos uma das seguintes mutações baseadas em numeração EU: L234A, L235A e G237A.
[0037] Em alguns aspectos, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6, o anticorpo compreendendo: uma CDRH1 que é CDRH1 na SEQ ID NO: 172; uma CDRH2 que é CDRH2 na SEQ ID NO: 173; uma CDRH3 que é CDRH3 na SEQ ID NO: 174: uma CDRL1 que é CDRL1 na SEQ ID NO: 199; uma CDRL2 que é CDRL2 na SEQ ID NO: 200; uma CDRL3 que é uma CDRL3 na SEQ ID NO: 201; pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): L234A, L235A e G237A; e pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): Q347C ou L443C.
[0038] Em alguns aspectos, o inibidor duplo de VEGFR- Anti-IL-6 compreende uma região variável de cadeia pesada anti-IL-6 selecionada a partir de SEQ ID NO: 7-13, 89, 90 e/ou 256-262.
[0039] Em alguns aspectos, o inibidor duplo de VEGFR- Anti-IL-6 tem uma sequência de VEGF-trap selecionada de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 145, 15, 16 ou 17.
[0040] Em alguns aspectos, a sequência ligante é a SEQ ID NO: 18.
[0041] Em alguns aspectos, é fornecida uma sequência de cadeia pesada para a molécula Anti-IL-6 que é selecionada de pelo menos uma das SEQ ID NOs 19-27 ou inclui pelo menos a sequência em uma das SEQ ID NOs: 89, 90, 256-262.
[0042] Em alguns aspectos, é fornecida uma sequência de cadeia leve para a molécula anti-IL-6 que compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs de cadeia leve de pelo menos uma das SEQ ID NOs 76-84.
[0043] Em alguns aspectos, é fornecida uma sequência de cadeia pesada para a molécula Anti-IL-6 que compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs de cadeia pesada de pelo menos uma das SEQ ID NOs 49-75.
[0044] Em alguns aspectos, é fornecido um inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 que compreende uma sequência VEGFR- Fc de pelo menos uma das SEQ ID NOs 85-88.
[0045] Em alguns aspectos, é fornecido um inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 que compreende uma ou mais das sequências em qualquer uma ou mais das SEQ ID Nos. 7-13, 145, 15-17, 18-84.
[0046] Em certas modalidades, é fornecido um inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 que compreende uma VH de IL-6; uma VL de IL-6; um Fc de IL-6; uma VEGF-trap; e um ligante. Em algumas modalidades, a VH de IL-6 compreende uma sequência de uma sequência de VH de IL6 em qualquer uma das SEQ ID Nos 19-27, 31-39, 89, 90 ou 256-262. Em algumas modalidades, a VL de IL-6 compreende uma sequência de uma sequência de VL de IL6 em qualquer uma das SEQ ID nos 28-30 ou 91-93. Em algumas modalidades, o Fc compreende uma sequência de uma sequência Fc em qualquer uma das SEQ ID NOs 40-48. Em algumas modalidades, a VEGF-trap compreende uma sequência de uma sequência de VEGF-trap em qualquer uma das SEQ ID NOs: 145, 15, 16 ou 17.
[0047] Em alguns aspectos, é fornecida uma proteína de fusão que compreende uma VH de IL-6; uma VL de IL-6; um Fc de IL-6; e uma VEGF-trap, em que a proteína de fusão altera a proliferação de HUVEC. Em algumas modalidades, a alteração da proliferação de HUVEC é a inibição da proliferação mediada por VEGF/IL6.
[0048] Em alguns aspectos, é fornecida uma proteína de fusão que compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 263 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 117. A proteína de fusão é também conjugada a um polímero. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 263 e pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 117. Em algumas modalidades, a proteína compreende pelo menos a) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 e 201, ou b) uma substituição de 1, 2 ou 3 aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 e/ou 201, em que a substituição é uma substituição conservativa.
[0049] Em alguns aspectos, um anticorpo de qualquer um dos referidos aqui compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
[0050] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão de qualquer uma aqui fornecida compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
[0051] Em alguns aspectos, um conjugado de qualquer um fornecido aqui compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
[0052] Em alguns aspectos, um inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 de qualquer um fornecido aqui compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
[0053] Em alguns aspectos, uma proteína de qualquer uma aqui fornecida compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0054] A Figura 1 ilustra uma sequência de IL-6.
[0055] A Figura 2A mostra o Composto L.
[0056] A Figura 2B mostra o Composto K.
[0057] A Figura 2C mostra a síntese de OG1802 a partir de R3707.
[0058] A Figura 2D mostra OG1786.
[0059] A Figura 2E mostra a síntese de OG1546 a partir de OG1550.
[0060] A Figura 2F mostra a síntese de OG1784 a partir de OG1546 e OG1563.
[0061] A Figura 2G mostra a síntese de OG1405 a partir de OG1784.
[0062] A Figura 2H mostra a síntese de OG1785 a partir de OG1405.
[0063] A Figura 2I mostra a síntese de OG1786 a partir de OG1785.
[0064] A Figura 2J mostra OG1801.
[0065] A Figura 2K mostra OG1802.
[0066] A Figura 2L mostra o Composto E.
[0067] A Figura 3 ilustra um fluxograma para a seleção e otimização de anticorpos.
[0068] A Figura 4 ilustra dados ELISA que mostram que mAb anti-IL-6 se liga a IL-6, mas não um complexo de IL- 6/IL-6R, e que a formação de complexo de IL-6/IL-6R é inibida por mAb anti-IL-6.
[0069] A Figura 5 ilustra algumas modalidades das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um IL-6-Ab.
Modalidades de CDRs são mostradas em regiões em caixa. Estas sequências também podem ser empregadas em um construto de fusão de IL-6 Ab-VEGF-Trap.
[0070] A Figura 6 ilustra algumas modalidades de uma proteína de fusão de IL-6-VEGF-Trap. Os domínios de VEGF- trap são posicionados tanto no N-terminal precedendo imediatamente o domínio variável (esquerda) ou posicionado entre a Região Fab e a região de dobradiça do anticorpo (direita).
[0071] A Figura 7 representa os sensogramas e tabela que demonstram moléculas inibidoras duais VEGFR-AntiIL-6 e AntiIL-6-VEGFR se ligam com afinidade similar ao VEGF-A como o anticorpo anti-VEGF OG1950 e Eylea. Assim, a posição da VEGF-trap não altera sua afinidade por seu alvo.
[0072] A Figura 8 ilustra os sensogramas de ligação de VEGF-A e IL-6 independente ou combinada a inibidores duais. Os sensogramas de IL-6 de alvos mistos foram comparados a uma curva teórica (soma de sensogramas individuais de IL-6 e VEGF-A). Os resultados mostram curvas teóricas e experimentais sobrepostas, que indicam qualitativamente que ambos os alvos podem se ligar à molécula inibidora dupla sem influenciar a ligação de outros.
[0073] A Figura 9 representa OD450nm os resultados de vários ensaios de ELISA IL-6. No ELISA de ligação por ponte (topo), ambos os inibidores duplos ligados em ponte por VEGF a IL-6, indicando que ambas as conFigurações podem se ligar a ambos os alvos. EC50 VEGF Trap-antiIL-6 = 0,079 nM e antiIL-6-VEGF Trap = 0,026 nM. Eylea e anti-IL-6 serviram como controles negativos. A Figura 9 também mostra os resultados de um ELISA de complexo de IL-6/IL-6R (meio).
Inibidores duplos e antiIL-6 inibiram a formação de complexo de IL-6/IL-6R no mesmo grau. Valores de IC50: anti-IL-6 =
0,36 nM, VEGF Trap-antiIL-6 = 0,47 nM, e antiIL-6-VEGF Trap = 0,32 nM. Eylea serviu como um controle negativo. A Figura 9 também mostra os resultados de um ELISA competitivo de VEGF/VEGFR (base). Inibidores duplos, Eylea e OG1950 inibiram a ligação de VEGF a VEGFR em graus variáveis. Eylea e o construto de antiIL-6-VEGF Trap são comparáveis (4,24 nM vs 4,53 nM), enquanto o construto de VEGF Trap-antiIL-6 foi de ~2 vezes melhor (1,74 nM), e OGI950 mostrou inibição máxima superior a outros inibidores (1,55 nM).
[0074] A Figura 10 ilustra algumas modalidades de um método para a preparação de um conjugado anticorpo (que também pode ser aplicado para um conjugado Ab-Trap ou Trap- Ab). Embora descrito como anticorpo, um técnico no assunto apreciará, no presente contexto, que a representação de Ab dentro da Figura 10 pode ser trocada com uma fusão trap (conforme mostrado na Figura 6). Para maior simplicidade, o anticorpo genérico retratado aqui representa ambas opções como um anticorpo e opções como um arranjo de fusão no contexto de fusão trap (a menos que, naturalmente, já esteja representado como uma fusão).
[0075] As Figuras 11A-11 B representam bandas de padrão Seseblue®Plus2, Anti-IL-6, Anti-IL-6-VEGFR, e VEGFR- Anti-IL-6. A Figura 11C ilustra o construto conjugado de VEGFR-Anti-IL6, que é uma fusão de Anti-VEGF (VEGFR1/2) e
Anti-IL-6 conjugada com um polímero baseado em fosforilcolina.
[0076] A Figura 12 ilustra os resultados de transferência para uma membrana PVDF, sequenciamento de Edman N-terminal, que mostram que os produtos clivados compartilham a mesma sequência N-Terminal (LTHRQT), que mostra que o sítio de clivagem está localizado na região de VEGF-trap.
[0077] As Figuras 13A-B representam bandas SDS-PAGE de padrão SeeBlue®Plus2 e 19 construtos VEGF-trap.
[0078] As Figuras 13C-13E representam as listagens de sequência de VEGF_trap_variante_1, VEGF_trap_variante_2 e VEGF_trap_variante_3.
[0079] As Figuras 13F-13G representam bandas de SDS- PAGE de padrão SeeBlue®Plus2 e 4 variantes de VEGF-trap, incluindo VEGFR_variante_3, que tem mutações de ponto duplo T94I e H95I.
[0080] As Figuras 14A-14F representam resultados de ensaio Biacore e medições de afinidade a VEGF-A.
[0081] A Figura 15 ilustra um ensaio de repórter de VEGFR estimulado por VEGF baseado em células.
[0082] A Figura 16A ilustra um ensaio de inibição de formação de túbulos de células endoteliais da veia umbilical humana ("HUVEC") mediadas por VEGF/IL6.
[0083] As Figuras 16B-16C representam estatísticas dos ensaios de formação de túbulos com diferentes parâmetros.
[0084] A Figura 17 ilustra os resultados de um ensaio de proliferação de HUVEC.
[0085] A Figura 18 ilustra modalidades de sequências de região variável de cadeia pesada Anti-IL-6. As CDRs estão sublinhadas.
[0086] A Figura 19 ilustra várias modalidades de sequências de VEGF-trap. A seção que varia entre as sequências está em negrito e sublinhada.
[0087] A Figura 20 ilustra algumas modalidades de modalidades de sequência ligante (GS). Pode estar presente como um ligante de repetição dupla Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GS).
[0088] A Figura 21 ilustra algumas modalidades de sequência de cadeia pesada para moléculas Anti-IL-6. As CDRs estão sublinhadas. A Figura 21 inclui ambas a Figura 21A e a Figura 21B, que proporcionam várias modalidades de CDRs dentro das sequências notadas.
[0089] A Figura 22 ilustra algumas modalidades de sequências de cadeia leve para moléculas anti-IL-6. As CDRs estão sublinhadas. A Figura 22 inclui ambas as Figuras 22A e 22B, que proporcionam várias modalidades de CDRs dentro das sequências notadas.
[0090] A Figura 23 ilustra algumas modalidades de sequências de cadeia pesada para moléculas Anti-IL-6. As
CDRs estão sublinhadas. A Figura 23 inclui ambas a Figura 23A e a Figura 23B, que proporcionam várias modalidades de CDRs dentro das sequências notadas.
[0091] As Figuras 24A-24B ilustram algumas modalidades de combinações de CDRs das Figuras 21-23.
[0092] A Figura 25 ilustra algumas modalidades de variantes de sequência VEGFR-Fc. A seção que varia entre as sequências está em negrito e sublinhada.
[0093] As Figuras 26A-26C ilustram dados de ligação por afinidade.
[0094] A Figura 27 ilustra as sequências de algumas modalidades das sequências de VEGFR-AntiIL6. As CDRs (como definidas por Kabat) estão sublinhadas. As seções em cinza indicam os construtos de VEGFR. O texto em negrito indica a seção de ligação. As mutações L234A, L235A, G237A e L443C (numeração EU) estão duplamente sublinhadas. Cada uma destas seções pode ser trocada por outras seções correspondentes fornecidas aqui (por exemplo, ligantes alternativos ou CDRs, etc.).
[0095] A Figura 28 ilustra um SDS-PAGE de produtos de reação de redução de VEGFR-AntiIL6 (Cis-decapeamento). As bandas são como segue: 1. VEGFR-AntiIL6; 2. VEGFR-AntiIL6 - completamente reduzido (TCEP); 3. Padrão de proteína pré- corada forte de Novex; 4. VEGFR-AntiIL6 + 30x TCEP, ponto inicial; 5. VEGFR-AntiIL6 + 30x TCEP, após 30 minutos; 6.
VEGFR-AntiIL6 + 30x TCEP, após 60 Minutos; 7. VEGFR-AntiIL6 TCEP tratado, tampão trocado; 8. VEGFR-AntiIL6 + 15x dHAA, ponto inicial; 9. VEGFR-AntiIL6 + 15x dHAA, após 30 minutos;
10. VEGFR-AntiIL6 + 15x dHAA, após 60 minutos; 11. VEGFR- AntiIL6 decapeado; 12. VEGFR-AntiIL6 decapeado, completamente reduzido (TCEP); Gel: NuPAGE Bis-Tris 4-12% Quantidade de proteína: 4 µg/banda; 30x TCEP = 30 Vezes em excesso molar TCEP 15x dHAA = 15 vezes em excesso molar de dHAA.
[0096] A Figura 29 ilustra um SDS-PAGE de cromatografia CEX de conjugado de VEGFR-AntiIL6-OG1802. Gel não-redutor: NuPAGE bis-tris 4-12%. Tampão A: 20 mM de acetato de sódio pH 5,5. Tampão B: 20 mM de acetato de sódio pH 5,5, 500 mM de NaCl. As bandas são como segue: 1. VEGFR- AntiIL6; 2. VEGFR-AntiIL6-OG1802 (carga); 3. Padrão de proteína pré-corada forte de Novex; 4. Fluxo de escoamento;
5. Chase; 6. 30 tampão B - alíquota 1; 7. 30% tampão B - alíquota 2; 8. 30% tampão B - alíquota 3; 9. 30% tampão B - alíquota; 10. 40% tampão B -alíquota 1; 11. 40% tampão B - alíquota 2; 12. 40% tampão B - alíquota 3; 13. 40% tampão B - alíquota 4; 14. 60% tampão B - alíquota 1; 15. 60% tampão B - alíquota 2; 16. 60% tampão B - alíquota 3; 17. 100% tampão B - banda. As bandas 6-13 mostram material conjugado de proteína, o conjugado não pode penetrar no gel devido ao grande tamanho. As bandas 14-17 mostram a mistura de proteínas possivelmente contendo material proteico agregado, conjugado e não conjugado.
[0097] A Figura 30 ilustra um SDS-PAGE de um conjugado de proteína-polímero versus material de proteína não conjugado. A análise de gel demonstra 57% de cadeia pesada e 96% de cadeia leve para razões de intensidade de banda quando o bioconjugado (banda 3) é comparado com o padrão de referência de VEGFR-AntiIL6 (banda 2), que indica a presença de um polímero OG1802 por molécula de VEGFR- AntiIL6. O gel de redução é: NuPAGE Bis-Tris 4-12%.
[0098] A Figura 31 ilustra uma SEC-MALS de VEGFR- AntiIL6-OG1802. O peso molecular do conjugado VEGFR-AntiIL6 foi determinado com cromatografia de exclusão de tamanho integrado (Shodex-SB806M-HQ) e espalhamento de luz (MALS).
Painel superior. O cromatograma mostra a presença de um único pico de eluição. A ausência de picos e ressaltos adicionais sugerem que agregados e material degradado não estavam presentes após a conjugação e etapas de separação de CEX subsequentes. Painel inferior. Análise de conjugado de proteína do pico selecionado mostrou um peso molecular médio medido experimentalmente (Mw) de 983 kDa para o bioconjugado de VEGFR-AntiIL6-OG1802. Este valor resulta da conjugação de uma molécula de VEGFR-AntiIL6 (Mw ~ 189 kDa) e um polímero OG1802 (Mw ~ 794 kDa).
[0099] A Figura 32 ilustra os resultados de uma cromatografia de VEGFR-AntiIL6 CEX. Gel: é Novex 8-16% Tris- Glicina (condições de redução), M = SeeBlue®Plus2 bandas padrão D12-F11 correspondem às amostras divididas em diferentes concentrações de tampão B conforme indicado no cromatograma de cadeias pesadas intactas (I) e clivadas (C).
Na Coluna Porus XS, o tampão A é 20 mM de Fosfato de Sódio pH 6 e o tampão B é 20 mM de Fosfato de Sódio pH 6, 1 M NaCl.
[00100] A Figura 33 ilustra os resultados de uma cromatografia de VEGFR-AntiIL6 HIC. Gel: é Novex 8-16% Tris- Glicina/condições redutoras, M = padrão SeeBlue®Plus2. L = VEGFR-AntiIL6 intacta e mistura clivada (carga). As bandas restantes correspondem às amostras divididas em concentrações diferentes de tampão B como indicado no cromatograma. Cadeias pesadas intactas (I) e clivadas (C) são indicadas. Na Coluna Hi Trap Butly HP, o tampão A é: 20 mM de Fosfato de Sódio pH 6, 1 M de Sulfato de amônio. Tampão B é: 20 mM de Fosfato de Sódio pH 6.
[00101] A Figura 34 ilustra os resultados de um ELISA competitivo VEGF/VEGFR.
[00102] A Figura 35 ilustra os resultados de um ELISA complexo IL6/IL6R.
[00103] A Figura 36 ilustra os resultados de um ensaio de repórter de VEGFR estimulado por VEGF baseado em células.
[00104] A Figura 37 ilustra a formação de túbulos estimulada por lipopolissacarídeo em HUVECs.
[00105] A Figura 38 ilustra a formação de túbulos estimulada por lipopolissacarídeo em HUVECs.
[00106] A Figura 39 representa a formação de túbulos estimulada por lipopolissacarídeo em HUVECs.
[00107] A Figura 40A ilustra a inibição da proliferação mediada por VEGF/IL6 de HUVECs.
[00108] A Figura 40B ilustra a inibição da proliferação de HUVEC com número crescente de células por poço.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00109] Para reduzir diretamente a inflamação concomitante e a angiogênese defeituosa que acionam a patogênese das patologias de retina neovasculares, aqui são apresentadas moléculas desenvolvidas que bloqueiam simultaneamente as funções da citocina pró-inflamatória IL- 6 e da proteína VEGF de sinal pró-angiogênico. Estas moléculas são compreendidas de (1) anticorpo monoclonal anti-IL-6 fundido a (2) dois domínios de ligação VEGF de receptores de VEGF (VEGFRs). A porção anti-IL-6 se liga especificamente a IL-6 e inibe sua interação com o receptor IL-6 (IL-6R). A porção de VEGF-trap inclui uma fusão de dois domínios de ligação de VEGF (domínio 2 VEGFR1, domínio 3 VEGFR2) que funcionam como um VEGF-trap, impedindo que a
VEGF se ligue a receptores de VEGF. Adicionalmente, em algumas modalidades, cada uma destas moléculas inibidoras duplas é equipada com uma cisteína não disposta em seu C- terminal que pode ser conjugada com um biopolímero à base de fosforilcolina com extensão de meia-vida.
[00110] Várias modalidades aqui fornecidas empregarão, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica.
Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths e D.G. Newell, eds. 1993-1998) J.
Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C.
Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR:
The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al. eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty. ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, eds. Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J.D.
Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
[00111] Os seguintes termos, a menos que de outro modo indicado, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados: o termo "molécula isolada" refere-se a uma molécula (onde a molécula é, por exemplo, um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou um anticorpo) que em virtude de sua origem ou fonte de derivação (1) não está associada a componentes naturalmente associados que acompanham o seu estado nativo, (2) é substancialmente livre de outras moléculas da mesma fonte, por exemplo, espécie, célula a partir da qual ela é expressa, biblioteca, etc. (3) é expressa por uma célula a partir de espécies diferentes, ou (4) não ocorre em natureza. Assim, uma molécula que é sintetizada quimicamente, ou expressa em um sistema celular diferente do sistema a partir do qual se origina naturalmente, será "isolada" de seus componentes naturalmente associados. Uma molécula também pode ser tornada substancialmente isenta de componentes naturalmente associados por isolamento, utilizando técnicas de purificação bem conhecidas na arte da técnica. A pureza ou a homogeneidade da molécula pode ser testada por vários meios bem conhecidos na arte da técnica. Por exemplo, a pureza de uma amostra de polipeptídeo pode ser analisada usando-se eletroforese de gel de poliacrilamida e coloração do gel para visualizar o polipeptídeo utilizando técnicas bem conhecidas na arte da técnica. Para certas finalidades, uma maior resolução pode ser provida utilizando-se HPLC ou outros meios bem conhecidos na arte da técnica para purificação.
[00112] Como aqui usado, a menos que de outro modo designado, o termo "IL-6" ou "IL6" refere-se a IL-6 humana.
Em algumas modalidades, outras formas de IL-6 são contempladas, e serão designadas por referência específica aos outros organismos, por exemplo, caninos, felinos, equinos e bovinos. Uma IL-6 humana exemplar é encontrada como o número de acesso P05231 UniProt.
[00113] Anticorpos Anti-IL-6 ou outras biologias aqui descritas são tipicamente providas em forma isolada. Isto significa que um anticorpo é tipicamente pelo menos 50% p/p puro de interferência proteínas e outros contaminantes que surgem de sua produção ou purificação, mas não excluem a possibilidade de que o anticorpo seja combinado com um excipiente farmaceuticamente aceitável destinado a facilitar seu uso. Algumas vezes, os anticorpos são pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99% p/p puros de proteínas interferentes e contaminantes de produção ou purificação. Frequentemente, um anticorpo (ou conjugado de anticorpo) é a espécie macromolecular predominante remanescente após sua purificação.
[00114] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como aqui usado, o termo abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também, a menos que especificado de outra forma, qualquer porção de ligação de antígeno do mesmo que compete com o anticorpo intacto para ligação específica, proteínas de fusão compreendendo uma porção de ligação de antígeno, e qualquer outra conFiguração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno.
Porções de ligação de antígeno incluem, por exemplo, Fab, Fab', F (ab')2, Fd, Fv, anticorpos de domínio (dAbs, por exemplo, anticorpos de tubarão e de camelídeo), fragmentos incluindo regiões determinantes de complementaridade (CDRs),
anticorpos de fragmento variável de cadeia simples (scFv), maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação antigênica específica ao polipeptídeo.
Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou sub-classe do mesmo), e o anticorpo não precisa ser de qualquer classe particular. Dependendo da sequência de aminoácidos do anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidades e conFigurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[00115] Uma "região variável" de um anticorpo se refere à região variável da cadeia leve de anticorpo ou região variável da cadeia pesada de anticorpo, sozinha ou em combinação. Como conhecido na técnica, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve consistem em quatro regiões estruturais (FRs) conectadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs), também conhecidas como regiões hipervariáveis, e contribuem para a formação do sítio de ligação a antígenos de anticorpos. Se variantes de uma região variável em questão são desejadas, particularmente com substituição em resíduos de aminoácidos fora de uma região CDR (isto é, na região de estrutura), substituição apropriada de aminoácidos, preferivelmente substituições conservativas de aminoácidos, podem ser identificados por comparação da região variável em questão com as regiões variáveis de outros anticorpos que contêm sequências CDR1 e CDR2 na mesma classe canônica como a região variável em questão (Chothia e Lesk, J Mol Biol 196 (4): 901-917, 1987).
[00116] Em certas modalidades, a delineação definitiva de uma CDR e identificação de resíduos compreendendo o sítio de ligação de um anticorpo é realizada resolvendo a estrutura do anticorpo e/ou resolvendo a estrutura do complexo anticorpo-ligante. Em certas modalidades, isto pode ser realizado por qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas por aqueles técnicos no assunto, tais como cristalografia de raios-X. Em certas modalidades, vários métodos de análise podem ser empregados para identificar ou aproximar as regiões CDR. Em certas modalidades, vários métodos de análise podem ser empregados para identificar ou aproximar as regiões CDR. Exemplos de tais métodos incluem, mas não estão limitados a, a definição de Kabat, a definição de Chothia, a abordagem de IMGT (Lefranc et al., 2003) Dev Comp Immunol. 27: 55-77), programas computacionais tais como Paratome (Kunik et al., 2012, Nucl Acids Res. W521-4), a definição de AbM, e a definição conformacional.
[00117] A definição de Kabat é um padrão para numeração dos resíduos em um anticorpo e é tipicamente usada para identificar regiões CDR. Ver, por exemplo, Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8. A definição de Chothia é similar à definição de Kabat, mas a definição de Chothia leva em conta posições de certas regiões de loop estruturais. Veja, por exemplo, Chothia et al., 1986, J.
Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83. A definição de AbM utiliza um conjunto integrado de programas de computador produzidos por Oxford Molecular Group que modela estrutura de anticorpos. Ver, por exemplo, Martin et al. 1989, Proc Natl Acad Sei (EUA), 86: 9268-9272; "AbM™, um Programa de Computador para Modelar Regiões Variáveis de anticorpos", Oxford Molecular, Reino Unido; Oxford Molecular, Ltd. A definição de AbM modela a estrutura terciária de um anticorpo a partir da sequência primária usando uma combinação de bases de dados de conhecimento e métodos ab initio, tais como aqueles descritos por Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach", publicado em PROTEINS,
Structure, Function and Genetics Suppl. 3: 194-198. A definição de contato é baseada em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis.
Veja, por exemplo,
MacCallum et al., 1996, J.
Mol.
Biol., 5:732-45. Em outra abordagem, referida aqui como "definição conformacional" de
CDRs, as posições das CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas à ligação de antígenos.
Veja, por exemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166. Ainda, outras definições de limite CDR podem não seguir estritamente uma das abordagens acima, mas não obstante se sobrepõem com pelo menos uma porção das CDRs Kabat, embora elas possam ser encurtadas ou alongadas em luz de predição ou descobertas experimentais que resíduos ou grupos particulares de resíduos não impactam significativamente a ligação de antígeno.
Como usado aqui, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer abordagem conhecida na técnica,
incluindo combinações de abordagens.
Os métodos aqui usados podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer uma destas abordagens.
Para qualquer modalidade dada contendo mais de uma CDR, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer um de Kabat, Chothia, estendido, IMGT, Paratome,
AbM, e/ou definições conformacionais, ou uma combinação de qualquer um dos precedentes.
[00118] Como conhecido na técnica, uma "região constante" de um anticorpo se refere à região constante da cadeia leve de anticorpo ou a região constante da cadeia pesada de anticorpo, sozinha ou em combinação.
[00119] Como aqui usado, "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades.
Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser concebido como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito primeiro por Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante tal como descrito na patente U.S. No. 4.816.567. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fagos geradas usando as técnicas descritas em McCferty et al., 1990, Nature 348:552-554, por exemplo. Como usado aqui, anticorpo "humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas, ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana.
Preferencialmente, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma CDR do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. O anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo.
[00120] Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou foi feito utilizando-se qualquer uma das técnicas para a produção de anticorpos humanos conforme aqui descritas. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígeno não-humano.
[00121] O termo "anticorpo quimérico" se destina a se referir a anticorpos em que as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo no qual as sequências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as sequências de região constante são derivadas de um anticorpo humano. O termo "epítopo" refere-se àquela porção de uma molécula capaz de ser reconhecida por e ligada por um anticorpo em uma ou mais das regiões de ligação ao antígeno do anticorpo.
Epítopos frequentemente consistem em um agrupamento superficial de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Em algumas modalidades, o epítopo pode ser um epítopo proteico. Epítopos de proteínas podem ser lineares ou conformacionais. Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula de interação (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência primária de aminoácidos da proteína. Um "epítopo não linear" ou "epítopo conformacional" compreende polipeptídeos não-contíguos (ou aminoácidos) dentro da proteína antigênica à qual um anticorpo específico ao epítopo se liga. O termo "epítopo antigênico" como aqui usado, é definido como uma porção de um antígeno ao qual um anticorpo pode se ligar especificamente como determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, por imunoensaios convencionais. Uma vez que é determinado um epítopo desejado sobre um antígeno, é possível gerar anticorpos para esse epítopo, por exemplo, utilizando as técnicas descritas no presente relatório descritivo.
Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração e caracterização de anticorpos pode elucidar informação sobre epítopos desejáveis. A partir desta informação, é então possível selecionar competitivamente anticorpos para ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para se conseguir isto é conduzir a competição e estudos de competição cruzada para encontrar anticorpos que competem ou competem de forma cruzada um com o outro para ligação a IL- 6, por exemplo, os anticorpos competem por ligação ao antígeno.
[00122] O termo "competir", como aqui usado com relação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente similar à ligação de um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de modo que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato é detectavelmente diminuído na presença do segundo anticorpo em comparação com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo a seu epítopo também é detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa ser o caso.
Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo a seu epítopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo a seu respectivo epítopo. No entanto, quando cada anticorpo detectavelmente inibe a ligação do outro anticorpo com seu epítopo cognato ou ligante, seja à mesma, maior ou menor extensão, os anticorpos são referidos como "competindo de forma cruzada" ("cross-compete") entre si para ligação de seu(s) epítopo(s) respectivo(s). Ambos os anticorpos competitivos e competitivos de forma cruzada são abrangidos pela presente invenção. Independente do mecanismo pelo qual ocorre tal competição ou competição cruzada (por exemplo, impedimento estérico, mudança conformacional, ou ligação a um epítopo comum, ou porção do mesmo), o técnico no assunto apreciaria, com base nos ensinamentos aqui fornecidos, que tais anticorpos competindo e/ou competindo de forma cruzada são abrangidos e podem ser úteis para os métodos aqui descritos.
[00123] Como aqui usado, um anticorpo "interage com" IL-6 quando a constante de dissociação de equilíbrio é igual a ou menor do que 20 nM, preferencialmente menor do que cerca de 6 nM, mais preferivelmente menor do que cerca de 1 nM, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,75 nM. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo está entre 400 e 800 pM, por exemplo, 450-700 ou 500-600 pM.
[00124] Um anticorpo antagonista de IL-6 abrange anticorpos que bloqueiam, antagonizam, suprimem ou reduzem (a qualquer grau incluindo significativamente) uma atividade biológica de IL-6 tal como ligação ao complexo de ligação IL-6R, IL-6/IL-6R a gp130, fosforilação e ativação de Stat3, proliferação celular e estimulação de vias inflamatórias mediadas por IL-6 ou pró-angiogênicas. Para o propósito da presente descrição, deve-se entender explicitamente que o termo "anticorpo antagonista de IL-6" abrange todos os termos, títulos e estados funcionais e características previamente identificados por meio do qual a própria IL-6, uma atividade biológica de IL-6, ou as consequências da atividade biológica, são substancialmente anuladas, diminuídas ou neutralizadas em qualquer grau significativo.
Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de IL-6 se liga a IL-6. Exemplos de anticorpos antagonistas de IL-6 são fornecidos aqui.
[00125] Um anticorpo que "se liga preferencialmente" ou "se liga especificamente" (aqui intercambiavelmente) a um epítopo é um termo bem entendido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial são também bem conhecidos na técnica. Diz-se que uma molécula exibe "ligação específica" ou "ligação preferencial" se ela reage ou se associa mais frequentemente, e/ou mais rapidamente e/ou com maior duração e/ou maior afinidade com uma célula ou substância particular do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "se liga especificamente" a uma proteína ou "se liga preferencialmente" a um alvo se ele se liga com maior afinidade, e/ou avidez e/ou mais facilmente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias.
Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um epítopo IL-6 é um anticorpo que se liga a esse epítopo com maior afinidade, e/ou avidez e/ou mais facilmente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos IL-6 ou epítopos não IL-6. Também é compreendido pela leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se liga especificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação preferencial.
[00126] Como aqui usado, o termo "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferivelmente, pelo menos 90% puro, mais preferivelmente, pelo menos 95% puro, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98% puro, e mais preferivelmente, pelo menos 99% puro.
[00127] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura celular que pode ser ou tenha sido um receptor para o(s) vetor(s) para incorporação de inserções de polinucleotídeos. Células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula parental original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com (um) polinucleotídeo(s) desta invenção.
[00128] Como conhecido na técnica, o termo "região Fc" é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fc" pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida para estirar de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila do mesmo. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice de EU como em Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991.
A Região Fc de uma imunoglobulina compreende geralmente dois domínios constantes, CH2 e CH3. Como é conhecido na técnica, uma região Fc pode estar presente em forma de dímero ou monomérica.
[00129] Conforme usado na técnica, "receptor Fc" e "FcR" descrevem um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcgRI, FcgRII e FcgRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas emendadas destes receptores. Os receptores FcgRII incluem FcgRIIA (um "receptor de ativação") e FcgRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplásmicos. FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9: 457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; e de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41. "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol, 117:587; e Kim et al., 1994, J.
Immunol., 24: 249).
[00130] Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função efetora de uma região Fc de sequência nativa. As "funções efetoras" exemplares incluem ligação Clq; citotoxicidade dependente do complemento; ligação do receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes do anticorpo; fagocitose; a infrarregulação dos receptores da superfície celular (por exemplo, o receptor da célula B), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e pode ser avaliado utilizando-se vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar tais funções efetoras de anticorpos.
[00131] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda retendo pelo menos uma função efetora da região Fc de sequência nativa. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada a uma região Fc de sequência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante aqui conterá, de preferência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com o mesmo, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com o mesmo.
[00132] Como aqui usado, "tratamento" é uma abordagem para a obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados.
[00133] Como aqui usado, "distúrbios relacionados a VEGF e/ou IL-6" incluem, por exemplo, distúrbios oculares e distúrbios sistêmicos. Os distúrbios oculares incluem distúrbios oculares tais como doença inflamatória oftálmica da esclera, retinopatia diabética não proliferativa, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, prevenção de edema macular diabético, prevenção de retinopatia diabética proliferativa, degeneração macular úmida relacionada à idade, prevenção de degeneração macular úmida relacionada à idade, degeneração macular seca relacionada à idade, bloqueio venoso, arterial ou outro dos vasos sanguíneos oculares e ou retinais com ou sem edema da retina, uveíte anterior e posterior, edema macular uveítico e tumores intraoculares. Distúrbios relacionados a IL-6 também incluem distúrbios onde existe um nível elevado de atividade de IL-6 devido a IL-6 interagindo com IL-6R ou IL- 6R solúvel (sIL-6R). Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais das proteínas de fusão fornecidas aqui e/ou qualquer um ou mais dos conjugados fornecidos aqui podem ser usados para tratamento ou prevenção de qualquer um ou mais dos distúrbios relacionados a IL-6 e/ou VEGF. Em algumas modalidades, os distúrbios incluem doenças sistêmicas que afetam o olho tal como doença de Graves ou neuromielite óptica, ou doenças sistêmicas que não afetam o olho tal como esclerose múltipla, artrite reumatoide. Em algumas modalidades, os distúrbios incluem a síndrome de liberação de citocina seguida de CAR- T ou terapêuticas imune-oncológicas similares.
[00134] Adicionalmente, as moléculas anti-IL6 interrompem a indução da expressão de IL-6 observada após o tratamento com moléculas anti-PD-1/PD-L1 (Tsukamoto et al., Cancer Res; 2018 78(17);5011-22). Também foi mostrado que o bloqueio de sinalização de VEGF pode melhorar o tratamento anti-PD-L1 (Allen et al. Sci Transl Med 2017 Abril 12: 9 (385)). Assim, estes inibidores duplos podem ser usados em combinação com moduladores de PD-1/PDL-1 e/ou outros inibidores de ponto de controle imune, para tratar sinergicamente o câncer. Outros distúrbios podem incluir edema cerebral em glioblastoma onde a terapia anti-IL6 pode apresentar benefícios adicionais aos tratamentos anti-VEGF.
Outros distúrbios incluem aqueles com tumores sólidos.
[00135] Conforme aqui utilizado, o termo "melhorar" significa uma diminuição ou melhoria de um ou mais sintomas em comparação com a não administração de um anticorpo de IL- 6, fusão de anticorpo de IL-6-VEGF-trap, conjugado de anticorpo IL-6 e/ou conjugado de fusão de anticorpo de IL- 6-VEGF-trap. "Melhorar" também inclui o encurtamento ou a redução da duração de um sintoma.
[00136] Como aqui usado, "VEGF-trap" ou similar denota os domínios de ligação de VEGF (domínio 2 de VEGFR1, domínio 3 de VEGFR2). Este fragmento permite que a proteína funcione como VEGF-trap, evitando que VEGF se ligue a receptores de VEGF expressos celularmente. Um exemplo desta sequência pode ser encontrado na Tabela 1C. Em algumas modalidades, a VEGF-trap somente inclui domínio 2 de VEGFR1, domínio 3 de VEGFR2. Várias modalidades de proteínas Trap são conhecidas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, na Publicação US No. 20150376271, a totalidade das quais, com relação a várias modalidades de VEGF-trap (que são proteínas VEGFR ou seus fragmentos) e suas fusões, é incorporada aqui por referência. Em algumas modalidades, o termo "VEGF-trap" ou termo similar refere-se a uma região extracelular de comprimento total ou qualquer porção da mesma, ou combinação de porções de diferentes receptores de VEGF que podem antagonizar a sinalização entre pelo menos um VEGF e VEGFR.
[00137] Como aqui usado, "fusão de anticorpo IL-6- VEGF-Trap", "Ab IL-6-VEGF-trap", "AntiIL-6-VEGF-trap", "VEGFR-AntiIL6", "VEGFR-AntiIL-6", "fusão de VEGF-trap- anticorpo anti-IL6 (TAF)", "VEGF-trap-IL6", "VEGFR IL-6", "IL6-VEGFR" ou termo similar ou termos inversos (por exemplo, "VEGF-Trap-Ab IL-6", "fusão de VEGF-trap-anticorpo IL-6", etc.) denotam a fusão entre o anticorpo de IL-6 e a VEGF- trap. Modalidades são descritas na Figura 6. Quando usado genericamente, a ordem dos dois termos pode ser trocada.
Quando usado especificamente, a ordem dos dois termos denota a posição relativa dos componentes no construto. O termo "Ab-trap", "IL-6 Ab-VEGF trap", "Ab IL-6-VEGF-trap", ou "Ab IL-6-Trap", ou "antiIL-6 VEGF trap", "Trap-Ab", "AntiIL-6- VEGFR", "AntiIL6-VEGFR" ou outro termo similar ou termos inversos (por exemplo, "VEGF-trap-IL-6 Ab", "fusão de VEGF trap-anticorpo de IL-6), etc.) denota a disposição do Ab fundido aos domínios relevantes de uma proteína de ligação de VEGF de modo a fornecer uma VEGF-trap. Como observado acima, esta seção da proteína de ligação de VEGF é uma que impede que VEGF se ligue a receptores de VEGF. Como descrito aqui, o arranjo (ordem) da Trap e das seções de anticorpos pode ser variado. Assim, a menos que indicado de outra forma explicitamente ou pelo contexto, as frases usadas aqui com relação às fusões de Ab-trap (ou IL-6/VEGF-trap, etc.), denotam todas as modalidades descritas para o posicionamento do anticorpo e da trap. Desse modo, a menos que de outro modo explicado, a frase Ab-trap (ou IL-6/VEGF-trap, etc.), denota a modalidade esquerda na Figura 6, e a modalidade direita na Figura 6, e ambas as modalidades na Figura 6.
Assim, a língua geral é denotada como apresentando todas as três opções para conveniência. Se a orientação for especificamente indicada, pode-se denotar, por exemplo, que o "arranjo" pode ser um de: Trap-Ab, Trap IL-6 Ab, VEGF Trap Ab IL-6, VEGF Trap Ab IL6. Similarmente, será apreciado que o contexto de alguns dos presentes exemplos especifica orientações ou arranjos das moléculas, que são denotadas pelo contexto do exemplo. Ambas os arranjos (em alternativa e combinados) são explicitamente contemplados para todas as discussões das proteínas de fusão fornecidas aqui. Além disso, devido ao ordenamento, percebe-se que a frase IL-6 Ab (ou Ab IL-6), quando usada no contexto da proteína de fusão, inclui ambas as opções onde o anticorpo é contíguo, Figura 6, lado esquerdo, e onde o TRAP é posicionado "dentro" do Ab (lado direito da Figura 6). Mais uma vez, o termo "Ab" ou "anticorpo", quando usado no contexto de proteína de fusão
(ou outro termo similar), abrange todas as três opções (lado esquerdo da Figura 6, lado direito da Figura 6, e ambas as opções), a menos que de outra forma denotado. Em algumas modalidades, a VEGF-trap é fundida a IL-6 em uma das seguintes maneiras: a uma extremidade N-terminal de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6; ou entre uma região de dobradiça e após um domínio CH1 de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6. Não há diferença entre as designações de Ab, anticorpo, "anti" ou outro termo similar quando usado em um nome para designar um anticorpo ou fragmento do mesmo. Não há diferença entre as designações de "Il-6" ou "IL6" ou "IL-6". Como aqui usado, ao se referir a um construto de fusão com IL-6, os termos "VEGF", "VEGFR", "VEGF-trap" e "VEGFR-trap" são usados de forma intercambiável. Os termos podem ter diferentes significados quando usados separadamente do arranjo de fusão de IL-6, que dependerá do contexto do termo em questão.
[00138] Como aqui usado, o termo "biopolímero" significa que um polímero foi ligado à proteína de interesse.
O termo também pode ser descrito como a forma "conjugada" da proteína. Isto pode ser feito para todas as proteínas descritas aqui. Desse modo, os biopolímeros de Ab IL-6 e os biopolímeros de anticorpo IL-6-VEGF-trap são contemplados para todos esses Ab IL-6 e anticorpo IL-6-VEGF-trap fornecidos aqui. Além disso, biopolímeros de VEGF-trap também são fornecidos.
[00139] Como aqui usado, "anticorpo antagonista" compreende um anticorpo que bloqueia uma ou mais funções ou atividade da molécula a que o anticorpo se liga.
[00140] Como aqui usado, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar qualquer um ou mais resultados benéficos ou desejados. Em aspectos mais específicos, uma quantidade eficaz previne, alivia ou melhora os sintomas da doença, e/ou prolonga a sobrevivência do indivíduo que está sendo tratado. Para o uso profilático, resultados benéficos ou desejados incluem eliminar ou reduzir o risco, diminuir a severidade, ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos tais como redução de um ou mais sintomas de uma doença tal como, por exemplo, AMD incluindo, por exemplo, sem limitação, AMD seca e AMD úmida, diminuindo a dose de outros medicamentos requeridos para tratar a doença, melhorando o efeito de outra medicação, e/ou retardando a progressão da AMD em pacientes. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os propósitos desta invenção, uma dosagem eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar tratamento profilático ou terapêutico, tanto direta quanto indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser obtida em conjunto com um outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado como sendo dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é obtido.
[00141] Anticorpos Anti-IL-6 são administrados em um regime eficaz, significando uma dosagem, via de administração e frequência de administração que retarda o início, reduz a severidade, inibe a deterioração adicional e/ou melhora pelo menos um sinal ou sintoma de um distúrbio.
Se um paciente já está sofrendo de um distúrbio, o regime pode ser referido como um regime terapeuticamente eficaz. Se o paciente está em risco elevado do distúrbio relativo à população geral mas ainda não está experimentando sintomas, o regime pode ser referido como um regime profilaticamente eficaz. Em alguns casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser observada em um paciente individual com relação a controles históricos ou experiência passada no mesmo paciente. Em outros casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser demonstrada em um ensaio prévio ou clínico em uma população de pacientes tratados com relação a uma população de controle de pacientes não tratados.
[00142] Anti-IL-6-VEGF-traps são administradas em um regime eficaz, significando uma dosagem, via de administração e frequência de administração que retarda o início, reduz a severidade, inibe a deterioração adicional e/ou melhora pelo menos um sinal ou sintoma de um distúrbio.
Se um paciente já está sofrendo de um distúrbio, o regime pode ser referido como um regime terapeuticamente eficaz. Se o paciente está em risco elevado do distúrbio em relação à população geral mas ainda não está experimentando sintomas, o regime pode ser referido como um regime profilaticamente eficaz. Em alguns casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser observada em um paciente individual com relação a controles históricos ou a experiência passada no mesmo paciente. Em outros casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser demonstrada em um ensaio pré-clínico ou clínico em uma população de pacientes tratados com relação a uma população de controle de pacientes não tratados.
[00143] A "meia-vida biológica" de uma substância é um parâmetro farmacocinético que especifica o tempo necessário para que metade da substância seja removida de um organismo após a introdução da substância no organismo.
[00144] O termo "prevenção" ou "prevenir" refere-se a (a) impedir que um distúrbio ocorra (b) retardar o início de um distúrbio ou início de sintomas de um distúrbio, ou (c) retardar a progressão de uma condição existente. A menos que indicado de outra forma, "prevenir" não requer absoluta proibição de que o evento ocorra.
[00145] Um "sujeito" ou um "indivíduo" é um mamífero ou pássaro, mais preferencialmente, um ser humano. Mamíferos também incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, galinhas, etc.), animais de esporte, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos.
[00146] Como usado aqui, "vetor" significa um construto que é capaz de fornecer, e, preferencialmente, expressar, um ou mais genes(s) ou sequência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de RNA ou DNA nu, plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fagos, vetores de expressão de RNA ou DNA associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.
[00147] Como usado aqui, "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácido nucleico que direciona transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou induzível, ou um intensificador. A sequência de controle de expressão é operavelmente ligada à sequência de ácido nucleico a ser transcrita.
[00148] Como usado aqui, "carreador farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e não seja reativo com o sistema imunológico do indivíduo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões como emulsão de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, detergentes tais como polissorbato 20 para evitar agregação, e açúcares tais como sacarose como crioprotetor. Diluentes preferidos para administração de aerossol ou parenteral são solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina normal (0,9%). Composições compreendendo tais carreadores são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edição, A. Gennaro, ed., Mack
Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ª Ed. Mack Publishing, 2000).
[00149] O termo "kon", como usado aqui, refere-se à constante de taxa para associação de um anticorpo (ou bioconjugado) a um antígeno. Especificamente, as constantes de taxa (kon e koff) e constantes de dissociação de equilíbrio são medidas utilizando-se anticorpos de comprimento total e/ou fragmentos de anticorpos Fab (isto é, univalente) e IL-
6.
[00150] O termo "koff", conforme aqui usado, refere- se à constante de taxa para dissociação de um anticorpo (ou bioconjugado) do complexo anticorpo/antígeno.
[00151] O termo "KD", conforme aqui usado, refere-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno (ou bioconjugado-antígeno).
[00152] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição com referência à "cerca de X" inclui a descrição de "X". Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa.
[00153] O termo "paciente" inclui humanos e outros indivíduos (incluindo mamíferos) que recebem tratamento seja profilático ou terapêutico.
[00154] Para os propósitos de classificação de substituições de aminoácidos como substituições conservativas ou não-conservativas, os aminoácidos são agrupados como segue: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduos influenciando a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não- conservativas constituem a troca de um membro de uma destas classes para um membro de outra.
[00155] As identidades de sequência percentual são determinadas com sequências de anticorpos maximamente alinhadas pela convenção de numeração Kabat para uma região variável ou numeração EU para uma região constante. Após o alinhamento, se uma região do anticorpo em questão (por exemplo, a região variável madura inteira de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de sequência percentual entre as regiões de anticorpo em questão e de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido em ambas região do anticorpo em questão e do anticorpo de referência dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com intervalos não contados, multiplicado por 100 para converter em porcentagem. As identidades de sequência de outras sequências podem ser determinadas pelo alinhamento de sequências usando algoritmos, tais como BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, usando parâmetros de lacuna padrão, ou por inspeção, e o melhor alinhamento (isto é, resultando na maior porcentagem de similaridade de sequência sobre uma janela de comparação).
A porcentagem de identidade de sequência é calculada comparando duas sequências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, determinando o número de posições nas quais ocorre os resíduos idênticos em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.
[00156] O termo "citotoxicidade celular dependente de anticorpos", ou ADCC, é um mecanismo para induzir a morte celular que depende da interação das células alvo revestidas com anticorpos (isto é, células com anticorpo ligado) com células imunes que possuem atividade lítica (também referidas como células efetoras). Tais células efetoras incluem células natural killer, monócitos/macrófagos e neutrófilos. A ADCC é ativada por interações entre a região Fc de um anticorpo ligado a uma célula e receptores Fcg, particularmente FcgRI e FcgRIII, em células efetoras imunes, tais como neutrófilos, macrófagos e células natural killer.
A célula alvo é eliminada por fagocitose ou lise, dependendo do tipo de célula efetora de mediação. A morte da célula alvo revestida com anticorpo ocorre como resultado da atividade da célula efetora.
[00157] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado no qual as CDRs de um anticorpo "doador" não humano são enxertadas em sequências de anticorpos "recptores" humanos (veja, por exemplo, Queen, US
5.530.101 e 5.585.089; Winter, US 5.225.539, Carter, US
6.407.213, Adair, US 5.859.205, 6.881.557, Rodapé, US
6.881.557). As sequências do anticorpo receptor podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpos humanos maduros, um composto de tais sequências, uma sequência de consenso de sequências de anticorpos humanos, ou uma sequência da região da linhagem germinativa. Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo que tem algumas ou todas as CDRs inteiramente ou substancialmente de um anticorpo doador e sequências estruturais de região variável e regiões constantes, se presentes, inteiramente ou substancialmente de sequências de anticorpos humanos. Similarmente, uma cadeia pesada humanizada tem pelo menos um, dois e usualmente todos as três CDRs inteiramente ou substancialmente de uma cadeia pesada de anticorpo doador, e uma sequência de estrutura de região variável de cadeia pesada e região constante de cadeia pesada, se presente, substancialmente de estrutura de região variável de cadeia pesada humana e sequências de região constante.
Similarmente, uma cadeia leve humanizada tem pelo menos uma, duas e usualmente todas as três CDRs inteiramente ou substancialmente a partir de uma cadeia leve de anticorpo doador, e uma sequência de estrutura de região variável de cadeia leve e região constante de cadeia leve, se presente,
substancialmente de estrutura de região variável de cadeia leve humana e sequências de região constante.
Além de nanocorpos e dAbs, um anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada.
Uma
CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente a partir de uma CDR correspondente em um anticorpo não-humano quando pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos correspondentes
(como definido por Kabat) são idênticas entre as respectivas
CDRs.
As sequências de estrutura de região variável de uma cadeia de anticorpo ou região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente de uma sequência de estrutura de região variável humana ou região constante humana,
respectivamente, quando pelo menos 85, 90, 95 ou 100% de resíduos correspondentes definidos por Kabat são idênticos.
[00158] Apesar de anticorpos humanizados poderem incorporar todas as seis CDRs (preferencialmente como definidas por Kabat) a partir de um anticorpo de camundongo, elas também podem ser feitas com menos de todas as CDRs (por exemplo, pelo menos 3, 4 ou 5 CDRs de um anticorpo de camundongo) (por exemplo, Pascalis et al, J. Immunol. 169: 3076, 2002; Vajdos et al. Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36: 1079-1091, 1999; Tamura et al. Journal of Immunology, 164: 1432-1441, 2000).
[00159] Um anticorpo quimérico é anticorpo no qual as regiões variáveis maduras de cadeias leve e pesadas de um anticorpo não humano (por exemplo, de um camundongo) são combinadas com regiões constantes de cadeia pesada e pesada humanas. Tais anticorpos retêm substancialmente ou completamente a especificidade de ligação do anticorpo de camundongo e são de cerca de dois terços da sequência humana.
[00160] Um anticorpo revestido é um tipo de anticorpo humanizado que retém algumas e usualmente todas as CDRs e alguns dos resíduos de estrutura variável não-humana de um anticorpo não-humano, mas substitui outros resíduos estruturais de região variável que podem contribuir para epítopos de células B ou T, por exemplo, resíduos expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) com resíduos das posições correspondentes de uma sequência de anticorpo humano. O resultado é um anticorpo no qual as CDRs são inteiramente ou substancialmente de um anticorpo não-humano e as estruturas de região variável do anticorpo não-humano são feitas mais de tipo-humano pelas substituições. Um anticorpo humano pode ser isolado de um humano ou, de outro modo, resultar da expressão genes de imunoglobulina humana (por exemplo, em um camundongo transgênico, in vitro ou por exibição de fagos). Métodos para a produção de anticorpos humanos incluem o método de trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2: 361-367 (1983); Oestberg, Patente U.S.
4.634.664; e Engleman et al., patente U.S. 4.634.666, uso de camundongos transgênicos incluindo genes de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, Lonberg et al., W093/12227 (1993); U.S. 5.877.397, U.S. 5.874.299, U.S. 5.814.318, U.S.
5.789.650, U.S. 5.770.429, U.S. 5.661.016, U.S. 5.633.425, U.S. 5.625.126, U.S. 5.569.825, U.S. 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) e métodos de exibição de fagos (veja, por exemplo, Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047, U.S. 5.877.218, U.S.
5.871.907, U.S. 5.828.657, U.S. 5.837.242, U.S. 5.733.743 e U.S. 5.565.332.
[00161] Um "polímero" é uma molécula composta de muitas subunidades repetidas. As subunidades, também algumas vezes referidas como "monômeros", podem ser as mesmas ou diferentes. Há ambos polímeros naturais e sintéticos. DNA, proteína e carboidratos complexos são exemplos de polímeros naturais. Poli-estireno e poli-acrilamida são exemplos de polímeros sintéticos. Um polímero composto por unidades de repetição de um único monômero é chamado de homopolímero. Um polímero composto de dois ou mais monômeros é chamado um copolímero ou algumas vezes um heteropolímero. Um copolímero no qual certos tipos de monômero são agrupados juntos são algumas vezes chamados de copolímeros em bloco. Os polímeros podem ser lineares ou ramificados. Quando o polímero é ramificado, cadeias poliméricas tendo uma origem comum são algumas vezes referidas como braço(s) polimérico(s).
[00162] Um "iniciador" é um composto capaz de servir como um substrato sobre o qual uma ou mais polimerizações podem ocorrer utilizando monômeros ou comonômeros como aqui descrito. A polimerização pode ser uma polimerização de radical livre convencional ou preferivelmente uma polimerização de radical livre controlada/"viva", tal como polimerização de radical de Transferência de Átomo (ATRP), Polimerização Reversível por Adição-Fragmentação-Terminação (RAFT) ou polimerização mediada por nitróxido (NMP). A polimerização pode ser uma polimerização "pseudo" controlada, tal como a transferência degenerativa.
Iniciadores adequados para ATRP contêm uma ou mais ligações instáveis que podem ser clivadas homoliticamente para formar um fragmento iniciador, I, sendo um radical capaz de iniciar uma polimerização de radical, e um sequestrador de radicais, I', que reage com o radical da cadeia polimérica crescente para terminar reversivelmente a polimerização. O sequestrador de radicais I' é tipicamente um halogênio, mas também pode ser uma porção orgânica, tal como uma nitrila.
Em algumas modalidades da presente invenção, o iniciador contém um ou mais grupos 2-bromoisobutirato como sítios para polimerização via ATRP.
[00163] Um "ligante químico" se refere a uma porção química que liga dois grupos entre si, tal como uma porção de extensão da meia-vida e uma proteína. O ligante pode ser clivável ou não-clivável. Os ligantes cliváveis podem ser hidrolisáveis, enzimaticamente cliváveis, sensíveis ao pH, fotolábeis, ou ligantes de dissulfeto, entre outros. Outros ligantes incluem ligantes homobifuncionais e heterobifuncionais. Um "grupo ligante" é um grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente consistindo em uma ou mais ligações a um agente bioativo. Exemplos não limitantes incluem aqueles ilustrados na Tabela 1 do WO2013059137 (incorporado por referência).
[00164] O termo "grupo reativo" refere-se a um grupo que é capaz de reagir com outro grupo químico para formar uma ligação covalente, isto é, é covalentemente reativo sob condições de reação adequadas, e geralmente representa um ponto de fixação para outra substância. O grupo reativo é uma porção, tal como maleimida ou éster de succinimidila, é capaz de reagir quimicamente com um grupo funcional em uma porção diferente para formar uma ligação covalente. Grupos reativos geralmente incluem nucleófilos, eletrófilos e grupos fotoativáveis.
[00165] Como usado aqui, o termo "fosforilcolina", também denotado como "PC", refere-se ao seguinte:
O * O P O N+(CH3)3 -
O
[00166] onde * denota o ponto de fixação. A fosforilcolina é um grupo zwiteriônico e inclui sais (tais como sais internos) e suas formas protonadas e desprotonadas.
[00167] Como aqui usado, "polímero à base de fosforilcolina" é um polímero que contém fosforilcolina. O "polímero contendo zwiteríon" refere-se a um polímero que contém um zwiteríon.
[00168] Polímero contendo poli(acriloiloxietil fosforilcolina) refere-se a um polímero contendo 2- (acriloiloxi)etil-2-(trimetilamônio)etil fosfato como monômero.
[00169] Polímero contendo poli(metacriloiloxietil fosforilcolina) refere-se a um polímero contendo 2-
(metacriloilóxi)etil-2-(trimetilamônio)etil fosfato como monômero.
[00170] Como aqui usado, "peso molecular" no contexto do polímero pode ser expresso como um peso molecular médio numérico, ou um peso molecular médio ponderal ou um peso molecular de pico. A menos que de outra forma indicado, todas as referências ao peso molecular aqui referem-se ao peso molecular de pico. Estas determinações de peso molecular, média numérica (Mn), média ponderal (Mw) e pico (Mp) podem ser medidas utilizando cromatografia de exclusão de tamanho ou outras técnicas de cromatografia líquida. Outros métodos para medir valores de peso molecular também podem ser usados, tais como o uso de análise de grupo terminal ou a medição das propriedades coligativas (por exemplo, depressão do ponto de congelamento, elevação do ponto de ebulição, ou pressão osmótica) para determinar o peso molecular médio numérico, ou o uso de técnicas de dispersão de luz, ultracentrifugação ou viscometria para determinar o peso molecular médio ponderal. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o peso molecular é medido por SEC-MALS (cromatografia por exclusão de tamanho - espalhamento de luz em múltiplos ângulos). Os reagentes poliméricos da invenção são tipicamente polidispersos (isto é, o peso molecular médio numérico e o peso molecular médio ponderal dos polímeros não são iguais). O Índice de Polidispersidade (PDI) proporciona uma medida para a dispersidade de polímeros em uma mistura.
O PDI é dado pela fórmula Mw/Mn. A este respeito, uma proteína homogênea terá um PDI de 1,0 (Mn é o mesmo que Mw).
Tipicamente, o PDI para polímeros será acima de 1,0. Os polímeros de acordo com a presente invenção têm, de preferência, valores de polidispersidade relativamente baixos (PDI), por exemplo, menores do que cerca de 1,5, como julgado, por exemplo, por SEC-MALS. Em outras modalidades, as polidispersidades (PDI) estão mais preferivelmente na faixa de cerca de 1,4 a cerca de 1,2, ainda mais preferivelmente menores que cerca de 1,15, e ainda mais preferivelmente menores que cerca de 1,10, ainda mais preferivelmente menores que cerca de 1,05 e acima de tudo preferivelmente menores que cerca de 1,03.
[00171] Como usado aqui, "protegido", "forma protegida", "grupo de proteção" e "grupo protetor" se refere à presença de um grupo (isto é, o grupo protetor) que impede ou bloqueia a reação de um grupo funcional quimicamente reativo particular em uma molécula sob certas condições de reação. Grupos de proteção variam dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo que está sendo protegido, assim como as condições de reação a serem empregadas e a presença de grupos reativos ou protetores adicionais na molécula, se houver.
Grupos de proteção adequados incluem aqueles tais como encontrados no tratado por Greene et al., "Protective Groups in Organic Synthesis", 3ª edição, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999.
[00172] Conforme aqui utilizado, o termo "alquila" refere-se a um radical alifático linear ou ramificado, saturado, tendo o número de átomos de carbono indicados. Por exemplo, alquila C1-C6 inclui, mas não está limitada a, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec- butila, terc-butila, pentila, isopentila, hexila, etc.
Outros grupos alquila incluem, mas não estão limitados a, heptila, octila, nonila, decila, decila, etc. Alquila pode incluir qualquer número de carbonos, tais como 1-2, 1-3, 1- 4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 e 5-6 carbonos.
[00173] O termo "menor" referido acima e em seguida em conexão com os radicais orgânicos ou compostos, respectivamente, define um composto ou radical que pode ser ramificado ou não ramificado com até e incluindo 7, de preferência até e incluindo 4 e (como não ramificado) um ou dois átomos de carbono.
[00174] Conforme aqui utilizado, o termo "alquileno" refere-se a um grupo alquila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto divalente. As duas porções ligadas ao alquileno podem ser ligadas ao mesmo átomo ou diferentes átomos do alquileno. Por exemplo, um alquileno de cadeia linear pode ser o radical bivalente de -(CH2)n, onde n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Grupos alquileno incluem, sem limitação, metileno, etileno, propileno, isopropileno, butileno, isobutileno, sec-butileno, pentileno e hexileno.
[00175] Substituintes para os radicais alquila, alquenila, alquileno, heteroalquila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila e heterocicloalquenila podem ser um ou mais dentre uma variedade de grupos selecionados dentre, mas não limitados a: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogênio, -SiR'R"R"', -OC(O)R', - C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"-C(O)R', -NR'- C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR- C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R',-CN e -NO2 em um número que varia de 1 a (2m'+1), onde m' é o número total de átomos de carbono neste radical. Cada um de R', R", R"' e R"" se refere independentemente a hidrogênio, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, por exemplo, arila substituída com 1-3 halogênios, grupos alquila, alcóxi ou tioalcóxi substituídos ou não substituídos, ou grupos arilalquila. Quando R' e R" estão ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5-, 6- ou 7- membros. Por exemplo, -NR'R" significa incluir, mas não está limitado a, 1-pirrolidinila e 4-morfolinila.
[00176] Conforme aqui utilizado, "alcóxi" refere-se a um grupo alquila anexado a um átomo de oxigênio e forma o radical -O-R, em que R é alquila. Grupos alcóxi incluem, por exemplo, metóxi, etóxi, propóxi, iso-propóxi, butóxi, 2- butóxi, iso-butóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, pentóxi, hexóxi, etc. Os grupos alcóxi podem ser ainda substituídos com uma variedade de substituintes aqui descritos. Por exemplo, os grupos alcóxi podem ser substituídos com halogênios para formar um grupo "halo-alcóxi".
[00177] Conforme aqui utilizado, "carboxialquila" significa um grupo alquila (conforme aqui definido) substituído com um grupo carbóxi. O termo "carboxicicloalquila" significa um grupo cicloalquila (conforme aqui definido) substituído com um grupo carboxila.
O termo alcoxialquila significa um grupo alquila (conforme aqui definido) substituído com um grupo alcóxi. O termo "carbóxi" aqui empregado refere-se a ácidos carboxílicos e seus ésteres.
[00178] Conforme aqui utilizado, "haloalquila" refere-se a alquila, conforme definido acima, em que alguns ou todos os átomos de hidrogênio são substituídos com átomos de halogênio. Halogênio (halo) preferencialmente representa cloro ou flúor, mas pode também ser bromo ou iodo. Por exemplo, haloalquila inclui trifluormetila, fluormetila, 1,2,3,4-pentafluoro-fenila, etc. O termo "perflúor" define um composto ou radical que tem todos os hidrogênios disponíveis que são substituídos com flúor. Por exemplo, perfluorofenila refere-se a 1,2,3,4,5-pentafluorofenila, perfluorometila refere-se a 1,1,1-trifluormetila, e perfluorometóxi refere-se a 1,1,1-trifluorometóxi.
Haloalquila pode também ser referida como alquila halo- substituída, tal como alquila fluoro-substituída.
[00179] Como aqui usado, "citocina" no contexto desta invenção é um membro de um grupo de moléculas de sinalização de proteína que podem participar em comunicação célula- célula em respostas imunes e inflamatórias. Citocinas são tipicamente glicoproteínas solúveis em água, pequenas, que têm uma massa de cerca de 8-35 kDa.
[00180] Conforme aqui utilizado, "cicloalquila" refere-se a um sistema de anel alifático mono- ou multi- cíclico saturado que contém de 3 a 12, de 3 a 10, de 3 a 7, ou de 3 a 6 átomos de carbono. Quando o grupo cicloalquila é composto de dois ou mais aneis, os aneis podem ser unidos entre si com um anel fundido ou uma estrutura de anel espiro.
Quando o grupo cicloalquila é composto de três ou mais aneis, os aneis podem também se unir formando uma estrutura de anel em ponte. Aneis monocíclicos incluem, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila e ciclo-octila. Aneis bicíclicos e policíclicos incluem, por exemplo, biciclo[1,1,1]pentano, biciclo[2,1,1]heptano, norbornano, decahidronaftaleno e adamantano. Por exemplo, cicloalquila C3-8 inclui ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-octila, e norbornano.
[00181] Conforme aqui utilizado, "endocíclico" refere-se a um átomo ou grupo de átomos que compreendem parte de uma estrutura cíclica do anel.
[00182] Como aqui usado, "exocíclico" refere-se a um átomo ou grupo de átomos que são ligados, mas não definem a estrutura de anel cíclico.
[00183] Como aqui usado, "éter alquila cíclico" refere-se a um grupo alquila cíclico de 4 ou 5 membros tendo 3 ou 4 átomos de carbono endocíclicos e 1 átomo de oxigênio ou enxofre endocíclico (por exemplo, oxetano, tietano, tetraidrofurano, tetrahidrotiofeno); ou um grupo alquila cíclico de 6 a 7 membros tendo 1 ou 2 átomos de oxigênio ou enxofre endocíclicos (por exemplo, tetraidropirano, 1,3- dioxano, 1,4-dioxano, tetra-hidrotiopirano, 1,3-ditiano, 1,4-ditiano, 1,4-oxatiano).
[00184] Conforme aqui utilizado, "alquenila" refere- se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada de 2 a 6 átomos de carbono, tendo pelo menos uma ligação dupla.
Exemplos de grupos alquenila incluem, mas não estão limitados a, vinila, propenila, isopropenila, 1-butenila, 2-butenila,
isobutenila, butadienila, 1-pentenil, 2-pentenil, isopentenila, 1,3-pentadienila, 1,4-pentadienila, 1- hexenila, 2-hexenila, 3-hexenila, 1,3-hexadienila, 1,4- hexadienila, 1,5-hexadienila, 2,4-hexadienila, ou 1,3,5- hexatrienila. Grupos alquenila também podem ter de 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4 a 5, 4 a 6 e 5 a 6 carbonos.
[00185] Conforme aqui utilizado, "alquenileno" refere-se a um grupo alquenila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto divalente. As duas porções ligadas ao alquenileno podem ser ligadas ao mesmo átomo ou diferentes átomos do alquenileno. Grupos alquenileno incluem, mas não estão limitados a, etenileno, propenileno, isopropenileno, butenileno, isobutenileno, sec-butenileno, pentenileno e hexenileno.
[00186] Conforme aqui utilizado, "alquinila" refere- se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada de 2 a 6 átomos de carbono, tendo pelo menos uma ligação tripla.
Exemplos de grupos alquinila incluem, sem limitação, acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, isobutinila, sec-butinila, butadiinila, 1-pentinila, 2-pentinila, isopentinila, 1,3-pentadiinila, 1,4-pentadiinila, 1- hexinila, 2-hexinila, 3-hexinila, 1,3-hexadiinila, 1,4- hexadiinila, 1,5-hexadiinila, 2,4-hexadiinila, ou 1,3,5-
hexatriinila. Grupos alquinila também podem ter de 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4 a 5, 4 a 6 e 5 a 6 carbonos.
[00187] Conforme aqui utilizado, "alquinileno" refere-se a um grupo alquinila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto divalente. As duas porções ligadas ao alquinileno podem ser ligadas ao mesmo átomo ou diferentes átomos do alquinileno. Grupos alquinileno incluem, mas não estão limitados a, etinileno, propinileno, butinileno, sec- butilinileno, pentinileno e hexinileno.
[00188] Conforme aqui utilizado, "cicloalquileno" refere-se a um grupo cicloalquila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto divalente. As duas porções ligadas ao cicloalquileno podem ser ligadas ao mesmo átomo ou átomos diferentes do cicloalquileno. Grupos cicloalquileno incluem, mas não estão limitados a, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, cicloexileno e ciclo-octileno.
[00189] Conforme aqui utilizado, "heterocicloalquila" refere-se a um sistema de anel tendo de 3 membros de anel a cerca de 20 membros de anel e de 1 a cerca de 5 heteroátomos tais como N, O e S. Heteroátomos adicionais também podem ser úteis, incluindo, mas não limitados a, B, Al, Si e P. Os heteroátomos também podem ser oxidados, tais como, mas não limitados a, -S(O)- e -S(O)2-. Por exemplo, o heterociclo inclui, sem limitação, tetrahidrofuranila, tetrahidrotiofenila, morfolino, pirrolidinila, pirrolinila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, piperazinila, piperidinila, indolinila, quinuclidinila e 1,4-dioxa-8-aza-espiro[4,5]dec-8-il.
[00190] Conforme aqui utilizado, "heterocicloalquileno" refere-se a um grupo heterocicloalquila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos. As duas porções ligadas ao heterocicloalquileno podem ser ligadas ao mesmo átomo ou diferentes átomos do heterocicloalquileno.
[00191] Conforme aqui utilizado, o termo "arila" refere-se a um conjunto de anel aromático monocíclico ou multicíclico (por exemplo, bicíclico fundido, tricíclico ou maior) contendo 6 a 16 átomos de carbono. Por exemplo, arila pode ser fenila, benzila ou naftila, preferencialmente fenila. Grupos arila podem ser mono-, di- ou tri- substituídos por um, dois ou três radicais selecionados de alquila, alcóxi, arila, hidróxi, halogênio, ciano, amino, amino-alquila, trifluormetila, alquilenodióxi e oxi-C2-C3- alquileno; todos os quais são opcionalmente substituídos adicionalmente, por exemplo, como definido anteriormente; ou 1- ou 2-naftila; ou 1- ou 2-fenantrenila. Alquilenodióxi é um substituto divalente ligado a dois átomos de carbono adjacentes de fenil, por exemplo, metilenodióxi ou etilenodióxi. Oxi-C2-C3-alquileno é também um substituinte divalente ligado a dois átomos de carbono adjacentes de fenila, por exemplo oxietileno ou oxipropileno. Um exemplo para oxi-C2-C3-alquileno-fenila é 2,3-diidrobenzofuran-5- ila.
[00192] Preferido como arila é naftila, fenila ou fenila mono- ou dissubstituída por alcóxi, fenila, halogênio, alquila ou trifluorometil, especialmente fenila ou fenila-mono- ou dissubstituída por alcóxi, halogênio ou trifluormetil, e em particular fenila.
[00193] Exemplos de grupos fenila substituídos como R são, por exemplo, 4-clorofen-l-ila, 3,4-diclorofen-l-ila, 4- metoxifen-l-ila, 4-metilfen-1-ila, 4-aminometilfen-1-ila, 4-metoxietilaminometilfen-1-ila, 4- hidroxietilaminometilfen-1-ila, 4-hidroxietil-(metil)- aminometilfen-1-ila, 3-aminometilfen-1-ila, 4-N- acetilaminometilfen-1-il, 4-aminofen-1-il, 3-aminofen-1-il, 2-aminofen-l-il, 4-fenil-fen-1-il, 4-(imidazol-1-il)-fenil, 4-(imidazol-1-ilmetil)-fen-1-il, 4-(morfolin-1-il)-fen-1- il, 4-(morfolin-1-ilmetil)-fen-1-il, 4-(2- metoxietilaminometil)-fen-1-il e 4-(pirrolidin-1-ilmetil)- fen-1-il, 4-(tiofenil)-fen-1-il, 4-(3-tiofenil)-fen-1-il, 4-(4-metilpiperazin-1-il)-fen-1-il, e 4-(piperidinil)-fenil e 4-(piridinil)-fenil opcionalmente substituído no anel heterocíclico.
[00194] Conforme aqui utilizado, "arileno" refere-se a um grupo arila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos. As duas porções ligadas ao arileno são ligadas a diferentes átomos do arileno. Grupos arileno incluem, mas não estão limitados a, fenileno.
[00195] Conforme aqui utilizado, "arileno-oxi" refere-se a um grupo arileno, conforme definido acima, em que uma das porções ligadas ao arileno é ligada através de um átomo de oxigênio. Grupos arileno-oxi incluem, mas não estão limitados a, fenileno-oxi.
[00196] Similarmente, os substituintes para os grupos arila e heteroarila são variados e são selecionadosa partir de: -halogênio, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, - NO2, -CO2R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R"-, -NR"-C(O)R', - NR"-C(O)2R', -NR'-C(O)NR"R"', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -N3, - CH(Ph)2, perfluoro(C1-C4)alcóxi, e perfluoro(C1-C4)alquila, em um número que varia de zero até o número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e onde R', R" e R"' são independentemente selecionados de hidrogênio, (C1- C8)alquila e heteroalquila, arila e heteroarila não- substituída, (arila não-substituída)-(C1-C4)alquila, e (arila não-substituída)oxi-(C1-C4)alquila.
[00197] Dois dos substituintes nos átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila podem opcionalmente ser substituídos por um substituinte da fórmula -T-C(O)-(CH2)q- U-, em que T e U são independentemente -NH-, -O-, -CH2- ou uma ligação simples, e q é um número inteiro de 0 a 2.
Alternativamente, dois dos substituintes nos átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila podem opcionalmente ser substituídos por um substituinte da fórmula -A-(CH2)r-B- , onde A e B são independentemente -CH2-, -O-, -NH-, -S-, - S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- ou uma ligação simples, e r é um número inteiro de 1 a 3. Uma das ligações simples do novo anel assim formada pode opcionalmente ser substituída por uma ligação dupla. Alternativamente, dois dos substituintes nos átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila podem opcionalmente ser substituídos por um substituinte da fórmula -(CH2)s-X-(CH2)t-, onde s e t são independentemente números inteiros de 0 a 3, e X é -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, - S(O)2-, ou -S(O)2NR'-. O substituinte R' em -NR'- e -S(O)2NR'- é selecionado a partir de hidrogênio ou alquila não- substituída (C1-C6).
[00198] Como aqui usado, "heteroarila" refere-se a um conjunto de anel aromático monocíclico ou bicíclico fundido ou tricíclico fundido contendo de 5 a 16 átomos de anel, onde de 1 a 4 dos átomos de anel são um heteroátomo cada N, O ou S. Por exemplo, heteroarila inclui piridila, indolila,
indazolila, quinoxalinila, quinolinila, isoquinolinila, benzotienila, benzofuranila, furanila, pirrolila, tiazolila, benzotiazolila, oxazolila, isoxazolila, triazolila, tetrazolila, pirazolila, imidazolila, tienila, ou quaisquer outros radicais substituídos, especialmente mono- ou di- substituído, por exemplo, alquila, nitro ou halogênio.
Piridila representa 2-, 3- ou 4-piridila, vantajosamente 2- ou 3-piridila. Tienila representa 2- ou 3-tienila.
Quinolinila representa, de preferência, 2-, 3- ou 4- quinolinila. Isoquinolinila representa, de preferência, 1-, 3- ou 4-isoquinolinila. Benzopiranila, benzotiopiranila representa, de preferência, 3-benzopiranila ou 3- benzotiopiranila, respectivamente. Tiazolila representa, de preferência, 2- ou 4-tiazolila, e mais preferencialmente, 4- tiazolila. Triazolila é, de preferência, 1-, 2- ou 5-(1, 2,4-triazolila). Tetrazolila é, de preferência, 5- tetrazolila.
[00199] Preferivelmente, heteroarila é piridila, indolila, quinolinila, pirrolila, tiazolila, isoxazolila, triazolila, tetrazolila, pirazolila, imidazolila, tienila, furanila, benzotiazolila, benzofuranila, isoquinolinila, benzotienila, oxazolila, indazolila, ou qualquer um dos radicais substituídos, especialmente mono- ou di- substituídos.
[00200] O termo "heteroalquila" refere-se a um grupo alquila tendo de 1 a 3 heteroátomos tais como N, O e S.
Heteroátomos adicionais também podem ser úteis, incluindo, mas não limitados a, B, Al, Si e P. Os heteroátomos também podem ser oxidados, tais como, mas não limitados a, -S(O)- e -S(O)2-. Por exemplo, heteroalquilas podem incluir éteres, tioéteres, alquil-aminas e alquil-tióis.
[00201] O termo "heteroalquileno" refere-se a um grupo heteroalquila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos. As duas porções ligadas ao heteroalquileno podem ser ligadas ao mesmo átomo ou diferentes átomos do heteroalquileno.
[00202] Conforme aqui utilizado, "eletrófilo" refere- se a um íon ou átomo ou coleção de átomos, que podem ser iônicos, tendo um centro eletrofílico, isto é, um centro que busca por elétron, capaz de reagir com um nucleófilo. Um eletrófilo (ou reagente eletrofílico) é um reagente que forma uma ligação com seu parceiro de reação (o nucleófilo) ao aceitar ambos os elétrons de ligação daquele parceiro de reação.
[00203] Conforme aqui utilizado, "nucleófilo" se refere a um íon ou átomo ou coleção de átomos, que podem ser iônicos, tendo um centro nucleofílico, isto é, um centro que busca um centro eletrofílico ou capaz de reagir com um eletrófilo. Um nucleófilo (ou reagente nucleofílico) é um reagente que forma uma ligação com seu parceiro de reação (o eletrófilo) pela doação de ambos os elétrons de ligação. Um "grupo nucleofílico" se refere a um nucleófilo após ter reagido com um grupo reativo. Exemplos não limitativos incluem amino, hidroxila, alcóxi, haloalcóxi e semelhantes.
[00204] Conforme aqui utilizado, "maleimido" refere- se a um grupo pirrol-2,5-diona-l-ila que tem a estrutura:
O N O •
[00205] que mediante reação com uma sulfidrila (por exemplo, um tio alquila) forma um grupo -S-maleimido que tem a estrutura
[00206] em que "•" indica ponto de ligação para o grupo maleimido e " " indica o ponto de ligação do átomo de enxofre do tiol ao restante do grupo contendo sulfidrila original.
[00207] Para o propósito desta descrição, "aminoácidos de ocorrência natural" encontrados em proteínas e polipeptídeos são L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-glutamina, ácido L- glutâmico, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina,
L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e ou L-valina. Os "aminoácidos de ocorrência não natural" encontrados em proteínas são quaisquer aminoácido que não aqueles mencionados como aminoácidos de ocorrência natural.
Aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, sem limitação, os isômeros D dos aminoácidos que ocorrem naturalmente, e misturas de isômeros D e L dos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Outros aminoácidos, tais como 4- hidroxiprolina, desmosina, isodesmosina, 5-hidroxilisina, epsilon-N-metillisina, 3-metilhistidina, embora encontrados em proteínas de ocorrência natural, são considerados como aminoácidos que não ocorrem naturalmente encontrados em proteínas para o propósito desta descrição, visto que elas são geralmente introduzidas por meios que não a tradução ribossomal de mRNA.
[00208] Conforme aqui utilizado, "linear" em referência à geometria, arquitetura ou estrutura geral de um polímero, refere-se ao polímero que tem um único braço de polímero.
[00209] Conforme aqui utilizado, "ramificado", com referência à geometria, arquitetura ou estrutura geral de um polímero, refere-se a um polímero que tem 2 ou mais "braços" de polímero, que se estendem a partir de uma estrutura de núcleo contida dentro de um iniciador. O iniciador pode ser empregado em uma reação de polimerização de radical de transferência de átomo (ATRP). Um polímero ramificado pode possuir 2 cadeias de polímero (braços), 3 braços de polímero, 4 braços de polímero, 5 braços de polímero, 6 braços de polímero, 7 braços de polímero, 8 braços de polímero, 9 braços de polímero ou mais. Cada braço de polímero se estende a partir de um sítio de iniciação de polímero. Cada sítio de iniciação de polímero é capaz de ser um sítio para o crescimento de uma cadeia polimérica pela adição de monômeros. Por exemplo, e não a título de limitação, usando ATRP, o sítio de iniciação do polímero em um iniciador é tipicamente um haleto orgânico que sofre um processo redox reversível catalisado por um composto de metal de transição, tal como haleto cuproso. De preferência, o haleto é um bromo.
[00210] Como aqui usado, "excipiente farmaceuticamente aceitável" se refere a um excipiente que pode ser incluído nas composições da invenção e que não causa efeito toxicológico adverso significativo no paciente e é aprovado ou aprovável pelo FDA para uso terapêutico, particularmente em seres humanos. Exemplos não limitantes de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem água, NaCl, soluções salinas normais, Ringer lactada, sacarose normal, glicose normal e semelhantes.
[00211] Tal como é aqui utilizado, "OG1786" é um iniciador de 9-braços usado para a síntese de polímeros com a estrutura mostrada na Figura 2D, que representa a forma de sal de OG1786 com ácido trifluoroacético. OG1786 pode ser usado de acordo com a presente invenção como outros sais ou como base livre.
[00212] Como aqui usado, "OG1801" é um polímero de aproximadamente (+/- 15%) 750 kDa (tanto por Mn ou Mp) feito usando OG1786 como iniciador para síntese ATRP utilizando o monômero HEMA-PC. A estrutura da OG1801 é mostrada na Figura 2J.
[00213] Como aqui usado, "OG1802" é OG1801 com uma funcionalidade maleimida adicionada, e tem a estrutura mostrada na Figura 2K, onde cada um de nl, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 e n9 é um número inteiro (positivo) (de 0 até cerca de 3000) de tal modo que o peso molecular total do polímero é (Mw) 750.000 ± 15% Daltons. Quando o termo OG1802 é usado para modificar um termo de proteína (tal como um VEGF-trap ou anticorpo anti-IL-6), ele designa que a proteína é a proteína conjugada.
[00214] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, irá controlar. Em todo este relatório descritivo e reivindicações, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" será entendida como significando a inclusão de um inteiro especificado ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros. A menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular. Qualquer(isquer) exemplo(s) seguindo o termo "por exemplo" ou "como" não se destina a ser exaustivo ou limitativo.
[00215] A frase "um" ou "uma" entidade refere-se a uma ou mais de uma entidade; por exemplo, um composto refere- se a um ou mais compostos ou pelo menos um composto. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais", e "pelo menos um" podem ser usados intercambiavelmente aqui.
[00216] Conforme usado aqui, "cerca de" significa variação que se pode observar em medições obtidas entre diferentes instrumentos, amostras e preparações de amostras.
[00217] Como aqui usado, as posições CDR seguem a sua ordem de aparência no domínio variável quando descrito. Por exemplo, posições de cadeia pesada podem ser descritas como S35H ou G66D. Como usado aqui, as posições Fc seguem numeração EU quando descritas ou quando observadas em numeração EU. Por exemplo, mutações de anticorpos podem ser descritas como L234A ou L235A, que seriam de acordo com a numeração EU. As posições podem também ser definidas de acordo com as posições específicas dentro de uma SEQ ID específica ou sequência fornecida aqui.
[00218] O espalhamento de luz de múltiplos ângulos (MALS) é uma técnica de análise de macromoléculas onde a luz laser incide sobre a molécula, o campo elétrico oscilante da luz induz um dipolo oscilante dentro da mesma. Este dipolo oscilante re-irradiará luz e pode ser medido utilizando-se um detector MALS tal como Wyatt mmiDawn TREOS. A intensidade da luz irradiada depende da magnitude do dipolo induzido na macromolécula que, por sua vez, é proporcional à capacidade de polarização da macromolécula, quanto maior o dipolo induzido, portanto, maior a intensidade da luz espalhada.
Portanto, a fim de analisar o espalhamento de uma solução de tais macromoléculas, deve-se conhecer sua polarizabilidade em relação ao meio circundante (por exemplo, o solvente).
Isto pode ser determinado a partir de uma medição da mudança, Δn, do índice refrativo de solução n com a alteração de concentração molecular, Δc, medindo-se o valor dn/dc (= Δn/Δc), utilizando-se um refratômetro diferencial Wyatt Optilab T-rEX. Dois parâmetros de peso molar que a determinação MALS emprega são peso molecular médio numérico (Mn) e peso molecular médio ponderal (Mw) onde o índice de polidispersidade (PDI) é igual a Mw dividido por Mn. A SEC também permite uma outra determinação de peso molecular médio do peso molecular de pico Mp, que é definido como o peso molecular do pico mais alto na SEC.
[00219] O PDI é usado como uma medida da amplitude de uma distribuição de peso molecular de um polímero e bioconjugado que é derivado da conjugação de uma proteína discreta a um biopolímero polidisperso (por exemplo, OG1802). Para uma amostra de proteína, sua polidispersidade é próxima a 1,0 devido ao fato de que é um produto de tradução onde se espera que toda molécula de proteína em uma solução tenha quase o mesmo comprimento e massa molar. Em contraste, devido à natureza polidispersa do biopolímero onde os vários comprimentos de cadeias poliméricas são sintetizados durante o processo de polimerização, é muito importante determinar o PDI da amostra como um de seu atributo de qualidade para distribuição estreita de peso molecular.
[00220] A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é uma técnica de cromatografia em que as moléculas em solução são separadas por seu tamanho. Tipicamente, uma solução aquosa é aplicada para transportar a amostra através da coluna que é empacotada com resinas de vários tamanhos de poros. Espera-se que a resina seja inerte ao analito quando passa através da coluna e os analitos separados um do outro com base em seu tamanho único e as características de tamanho de poros da coluna selecionada.
[00221] O acoplamento da SEC com MALS ou SEC/MALS proporciona uma distribuição precisa de massa molar e tamanho (raio quadrado médio da raiz) em oposição a tomar como base um conjunto de padrões de calibração SEC. Este tipo de arranjo tem muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais de calibração de colunas. Uma vez que o espalhamento e a concentração de luz são medidos para cada fração de eluição, a massa molar e o tamanho podem ser determinados independentemente da posição de eluição. Isto é particularmente relevante para espécies com macromoléculas conformadas não globulares tais como os biopolímeros (OG1802) ou bioconjugados; tais espécies tipicamente não eluem de uma maneira que pode ser descrita por um conjunto de padrões de calibração de coluna.
[00222] Em algumas modalidades, uma análise SEC/MALS inclui um sistema Waters HPLC com um Módulo de aplicação de solvente Alliance 2695 e um Detector de Matriz Waters 2996 Photodiole equipado com uma coluna Shodex SEC-HPLC (7,8 x 300 mm). Este é conectado online com um Wyatt miniDawn TREOS e um refratômetro diferencial Wyatt Optilab T-rEX. O software Empower de Waters pode ser usado para controlar o sistema Waters HPLC e o software ASTRA V 6.1.7.16 da Wyatt pode ser usado para adquirir os dados de MALS a partir dos dados de Watt miniDawn TREOS, dos dados dn/dc do detector de T-rEX e dos dados de recuperação de massa utilizando o sinal de absorbância A280 do Detector de Matriz Waters 2996 Photodiole. A SEC pode ser realizada a 1 ml/min em 1xPBS pH 7,4, sob injeção de amostra, os sinais de MALS e RI podem ser analisados pelo software ASTRA para determinação da massa molar absoluta (Mp, Mw, Mn) e índice de polidispersidade (PDI). Além disso, o cálculo também envolve os valores de entrada dn/dc para polímero e proteína como 0,142 e 0,183, respectivamente. Para o valor dn/dc de bioconjugados, a dn/dc é calculada com base no MW pesado do polímero e da proteína a ser de cerca de 0,148 utilizando a fórmula abaixo: Conjugado dn/dc = 0,142 x [MWpolímero/(MWpolímero +/MWproteína)] + 0,183 x [MWproteína/(MWpolímero +/MWproteína)]
[00223] Quando MWpolímero para OG1802 medido por SEC- MALS é cerca de 800 kDa e o MWproteína para anti-IL-6 medida por SEC-MALS é cerca de 145 kDa, o peso molecular total esperado do bioconjugado medido por SEC-MALS é cerca de 1000 kDa. O MWproteína para o antiIL-6 VEGF-trap ou VEGF-trap- antiIL-6 é de cerca de 192 kDa, e o peso molecular total esperado do bioconjugado é de 1000-1100 kDa.
[00224] Métodos e materiais exemplares são descritos aqui, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam também ser usados na prática ou teste da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a serem limitativos.
I. ANTICORPOS ANTAGONISTAS DE IL-6, IL-6 AB-VEGF TRAPS E/OU CONJUGADOS DOS MESMOS
[00225] São fornecidos aqui anticorpos anti-IL-6 que bloqueiam, suprimem ou reduzem (incluindo redução significativa) a atividade biológica de IL-6, incluindo os eventos a jusante mediados pela IL-6. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 terá uma ou mais das sequências de CDR fornecidas aqui.
[00226] Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista isolado se liga especificamente a IL-6.
[00227] Em algumas modalidades, o anticorpo reage preferencialmente com IL-6 em uma maneira que inibe a função de sinalização de IL-6. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 especificamente se liga a IL-6 de primatas.
[00228] Os anticorpos úteis na presente invenção podem abranger anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo (por exemplo anticorpo de domínio), anticorpos humanizados, e qualquer outra conFiguração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos, e anticorpos covalentemente modificados. Os anticorpos podem ser murino, de rato, de humano ou qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados). Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado.
[00229] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de aminoácidos de cadeia pesada como mostrado nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2 ou na Figura 5. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista isolado compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade VH (CDRl), VH CDR2 e VH CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos daquela mostrada nas tabelas 1A, 1B, 0,1 e/ou 0, 2, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos daquela mostrada na tabela.
[00230] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado. O anticorpo compreende um domínio constante de cadeia pesada que compreende uma ou mais mutações para reduzir a função efetora. Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações reduzem as funções efetoras do anticorpo relacionado à cascata de complemento, por exemplo, uma ativação reduzida da cascata de complemento. Em algumas modalidades, a redução na função efetora é de pelo menos cerca de 50%.
[00231] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga especificamente a IL-6 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que o anticorpo compreende as mutações L234A, L235A e GA237A (com base na numeração EU). Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista isolado compreende as mutações L234A, L235A e G237A. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista isolado com mutações minimiza a ligação a receptores gama FC ou C1q. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista isolado com mutações L234A, L235A e G237A reduziu a ligação a receptores gama FC ou C1q. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-6 antagonista isolado é fornecido, em que a(s) mutação(ões) está(ão) localizada(s) em uma ou mais das seguintes posições de aminoácidos (numeração EU): E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330, e P331. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que a(s) mutação(ões) é(são) selecionada(s) do grupo consistindo em E233P, L234V, L234A, L235A, GA237A, A327G, A330S e P331S.
[00232] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado. O domínio constante de cadeia pesada ainda compreende um resíduo de cisteína introduzido pela tecnologia de DNA recombinante. Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína é selecionado do grupo consistindo em Q347C e L443C (numeração EU). Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína é L443C (numeração EU).
[00233] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende todas as três mutações seguintes (numeração EU) L234A, L235A e GA237A, e o anticorpo compreende L443C (numeração EU). Em algumas modalidades, o anticorpo é IgG1 humana, e um domínio constante de cadeia pesada do anticorpo compreende uma ou mais mutações que reduzem uma função efetora mediada por imunização.
[00234] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a um epítopo em IL-6 humana que é igual ou sobrepõe-se ao epítopo reconhecido por um anticorpo que compreende as sequências de aminoácidos em qualquer uma ou mais das Tabelas: 1A e 1B e/ou 11,3. Em algumas modalidades, um anticorpo IL-6 com um cys e que é ligado através da cisteína a um polímero é fornecido (conforme mostrado na Fórmula 17, aqui).
[00235] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada nas Tabelas 1A, 1 B, 0.1 e/ou 0.2, com ou sem a lisina C-terminal e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2.
[00236] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6. O anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, ou uma sequência que é pelo menos 90% idêntica à mesma, tendo substituições de aminoácidos em resíduos que não estão dentro de uma CDR.
Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um ou mais de: HCDR1: na Figura 5, HCDR2: na Figura 5, HCDR3: na Figura 5; LCDR1: na Figura 5, LCDR2: na Figura 5, LCDR3: na Figura 5, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 CDRs.
[00237] Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga a IL-6 é fornecido, em que o anticorpo compreende uma CDRH1 que é a CDRH1 nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, uma CDRH2 que é a CDRH2 nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, uma CDR3 que é a CDRH3 nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, uma CDRL1 que é a CDRL1 nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, uma CDRL2 que é a CDRL2 nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, uma
CDRL3 que é a CDRL3 nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, pelo menos uma das seguintes mutações: L234A, L235A e GA237A com base na numeração EU, e pelo menos uma das seguintes mutações: Q347C ou L443C com base na numeração EU.
[00238] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado. A região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) compreendendo as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1A. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-IL-6 antagonista isolado, em que a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) compreendendo as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1B. Em algumas modalidades, o anticorpo é um que contém uma ou mais das sequências identificadas na Figura 5, por exemplo, um ou mais das CDRS (incluindo 2, 3, 4, 5 ou 6 das CDRS em caixa) e/ou as regiões variáveis de cadeia pesada e leve inteiras.
[00239] Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs compreendendo as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1A, e a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo compreende três CDRs compreendendo as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1B.
[00240] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado. A VH compreende as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1A e a região variável da cadeia leve do anticorpo compreende três CDRs compreendendo as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1B.
[00241] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que o anticorpo compreende uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1B, ou uma variante da mesma com uma substituição de aminoácido em aminoácidos que não estão dentro de uma CDR. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1A, ou uma variante da mesma com várias substituições de aminoácidos em aminoácidos que não estão dentro de uma CDR.
[00242] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1A, com uma lisina C-terminal, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1B. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista isolado é fornecido, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1A, sem uma lisina C-terminal, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1B.
[00243] Os anticorpos antagonistas de IL-6 podem ser feitos por qualquer método conhecido na técnica. Técnicas gerais para a produção de anticorpos humanos e de camundongo são conhecidas na técnica e/ou são descritas aqui.
[00244] Anticorpos antagonistas de IL-6 podem ser identificados ou caracterizados usando métodos conhecidos na técnica, por meio do qual redução, melhora ou neutralização de atividade biológica de IL-6 é detectada e/ou medida. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de IL-6 é identificado pela incubação de um anticorpo candidato com IL-6 e monitoramento de ligação à IL-6R ou IL-6/IL-6R se ligando a gp130 e/ou redução concomitante ou neutralização de uma atividade biológica de IL-6. O ensaio de ligação pode ser realizado com, por exemplo, polipeptídeo(s) IL-6 purificado(s), ou com células que expressam naturalmente (por exemplo, várias cepas), ou transfectadas para expressar, polipeptídeo(s) IL-6. Em uma modalidade, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitiva, onde a capacidade de um anticorpo candidato competir com um anticorpo antagonista de IL-6 conhecido para ligação de IL- 6 é avaliada. O ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo o formato ELISA.
[00245] Após a identificação inicial, a atividade de um anticorpo antagonista de IL-6 candidato pode ser adicionalmente confirmada e refinada por bioensaios, conhecidos para testar as atividades biológicas alvo. Em algumas modalidades, um ensaio de célula in vitro é usado para caracterizar ainda mais um anticorpo antagonista de IL- 6 candidato.
[00246] Anticorpos antagonistas de IL-6 podem ser caracterizados usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é identificar o epítopo ao qual se liga, ou um "mapeamento de epítopos". Existem muitos métodos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a localização de epítopos em proteínas, incluindo resolver a estrutura cristalina de um complexo anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmentos de genes, e ensaios baseados em peptídeos sintéticos, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1999. Em um exemplo adicional, mapeamento de epítopos pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo antagonista de IL-6 se liga. O mapeamento de epítopos de anticorpos antagonistas de IL-6 é comercialmente disponível de várias fontes, por exemplo, sistemas Pepscan (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holanda). O epítopo pode ser um epítopo linear,
isto é, contido em um único estiramento de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que não podem necessariamente estar contidas em um único estiramento. Peptídeos de comprimentos variados (por exemplo, pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, recombinantemente) e usados para a ligação de ensaios com um anticorpo antagonista de IL-6.
Em outro exemplo, o epítopo ao qual se liga o anticorpo antagonista de IL-6 pode ser determinado por meio de triagem sistemática pelo uso de peptídeos sobrepostos derivados da sequência de IL-6 e determinação de ligação pelo anticorpo antagonista de IL-6. De acordo com os ensaios de expressão de fragmento de gene, a fase de leitura aberta que codifica IL-6 é fragmentada ou randomicamente ou por construções genéticas específicas e a reatividade dos fragmentos expressos de IL-6 com o anticorpo a ser testado é determinada. Os fragmentos de genes podem, por exemplo, ser produzidos por PCR e então transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos.
A ligação do anticorpo aos fragmentos IL-6 radioativamente marcados é então determinada por imunoprecipitação e eletroforese em gel. Certos epítopos também podem ser identificados pelo uso de bibliotecas grandes de sequências de peptídeos aleatórios exibidas sobre a superfície de partículas de fagos (bibliotecas de fagos) ou levedura (exibição de levedura). Alternativamente, uma biblioteca definida de fragmentos de peptídeos sobrepostos pode ser testada para ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, mutagênese de um antígeno, experimentos de troca de domínios e mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos requeridos, suficientes, e/ou necessários para ligação de epítopo. Por exemplo, experimentos de mutagênese de varredura de alanina podem ser realizados utilizando-se um mutante IL-6 no qual vários resíduos do polipeptídeo de IL-6 foram substituídos por alanina. Pela avaliação da ligação do anticorpo à IL-6 mutante, a importância dos resíduos de IL-6 particulares à ligação de anticorpos pode ser avaliada.
[00247] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que o anticorpo se liga a IL-6 humana com uma afinidade entre cerca de 0,01 pM a cerca de 10 nM. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que o anticorpo se liga a IL-6 humana com uma afinidade entre cerca de 0,1 pM a cerca de 2 nM. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que o anticorpo se liga a IL-6 humana com uma afinidade de cerca de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 pM.
[00248] A afinidade de ligação (KD) de um anticorpo antagonista de IL-6 a IL-6 pode ser de cerca de 0,001 a cerca de 200 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é de cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, cerca de 2 pM, ou cerca de 1 pM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é menor que qualquer um de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, cerca de 2 pM, cerca de 1 pM, cerca de 0,5 pM, cerca de 0,1 pM, cerca de 0,05 pM, cerca de 0,01 pM, cerca de 0,005 pM, ou cerca de 0,001 pM.
[00249] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que o anticorpo se liga a IL-6 humana com um koff que é pelo menos 5,0E-03 a 37 graus. Em algumas modalidades, o koff é 5E-04. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista anti-IL-6 isolado, em que o anticorpo se liga a IL-6 humana com um koff que é melhor do que 5,0E-04 a 37 graus.
[00250] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação pode ser definida em termos de uma ou mais de constante de associação (ka), constante de dissociação (kd), e concentração de analito que alcança a capacidade de ligação média-máxima (KD). Em algumas modalidades, ka pode variar de cerca de 0,50E+05 a cerca de 5,00E+08. Em algumas modalidades, kd pode variar de cerca de 0,50E-06 a cerca de 5,00E-03. Em algumas modalidades, KD pode variar de cerca de 0,50E-12 a cerca de 0,50E-07.
[00251] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos aqui descritos. Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos conjugados aqui descritos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem um nível de endotoxina menor do que cerca de 0,2 EU/ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido e tem um nível de endotoxina menor do que cerca de 0,2 EU/ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido e tem um nível de endotoxina menor que cerca de 2,0, 1, 0,5, 0,2 EU/ml. Em algumas modalidades, por exemplo, em injeção intravítrea, o limite de endotoxina é de 0,01-0,02 EU/injeção/olho.
[00252] Algumas modalidades fornecem qualquer um dos seguintes, ou composições (incluindo composições farmacêuticas) compreendendo um anticorpo tendo uma sequência de cadeia leve parcial e uma sequência de cadeia pesada parcial como encontrada nas Tabelas 1A e 1B, ou suas variantes. Nas Tabelas 1A e 1B, as sequências sublinhadas são algumas modalidades de sequências de CDR conforme aqui fornecidas.
TABELA 1A Tabela 1A. Sequências de região variável de cadeia pesada Anti-IL-6. As CDRs estão sublinhadas.
ID Sequência
I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 89)
II EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 90) IIa EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQAWGYYALDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 256) IIb EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSWGYYALDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 257)
IIc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGWGYYALDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 258) IId EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQTWGYYALDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 259) IIe EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVWGYYALDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 260) IIf EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQQWGYYALDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 261) IIg EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQKWGYYALDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 262) TABELA 1B Tabela 1B. Sequências de região variável de cadeia leve Anti-IL-6. As CDRs estão sublinhadas.
ID Sequência
III DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSYLYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGYPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO: 91)
IV DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSYLYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 92)
V DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSYLYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 93)
[00253] Em algumas modalidades, o anticorpo não tem uma ou mais (ou qualquer) das seguintes CDRs, Tabela 1E (que inclui a Tabela 1E1, Tabela 1E2 e/ou tabela 1E3).
TABELA 1E1 Sequência CDR1 GFTFSPFAMS (SEQ ID NO: 94) Cadeia pesada CDR2 KISPGGSWTYYSDTVTG (SEQ ID NO: 95) CDR3 QLWGYYALDI (SEQ ID NO: 171) CDR1 SASISVSYMY (SEQ ID NO: 96) Cadeia Leve CDR2 DMSNLAS(SEQ ID NO: 97) CDR3 MQWSGYPYT (SEQ ID NO: 98) TABELA 1E2 Sequência CDR1 PFAMS (SEQ ID NO: 244) Cadeia pesada CDR2 KISPGGSWTYYSDTVTG (SEQ ID NO: 245) CDR3 QLWGYYALDI (SEQ ID NO: 246) CDR1 SASISVSYMY (SEQ ID NO: 247) Cadeia Leve CDR2 DMSNLAS (SEQ ID NO: 248) CDR3 MQWSGYPYT (SEQ ID NO: 249) TABELA 1E3 Sequência Cadeia pesada CDR1 GFTFSPFAMS (SEQ ID NO: 250) CDR2 WVAKISPGGSWTYYSDTVTG (SEQ ID NO: 251)
CDR3 ARQLWGYYALDI (SEQ ID NO: 252) CDR1 SASISVSYMY (SEQ ID NO: 253) CDR2 LLIYDMSNLAS (SEQ ID NO: 254) Cadeia Leve CDR3 MQWSGYPYT (SEQ ID NO: 255)
[00254] Em algumas modalidades, uma composição como aqui revelada compreende um anticorpo que tem uma sequência de cadeia leve parcial ou completa e uma sequência de cadeia pesada parcial ou completa a partir de qualquer uma das opções fornecidas nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2, ou suas variantes. Em algumas modalidades, o anticorpo (ou fragmento de ligação do mesmo) pode incluir qualquer uma ou mais das CDRs fornecidas nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2. Em algumas modalidades, o anticorpo (ou fragmento de ligação do mesmo) pode incluir quaisquer três ou mais das CDRs fornecidas nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2. Em algumas modalidades, o anticorpo (ou fragmento de ligação do mesmo) pode incluir quaisquer seis das CDRs fornecidas nas tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2. Em algumas modalidades, a cadeia pesada e/ou leve pode ser qualquer uma ou mais dos outros construtos de anticorpos fornecidos aqui, incluindo, por exemplo, aqueles fornecidos nas Figuras 5, 18 e/ou 21-24 e Tabelas 0.1, 0.2, 1A, e/ou 1E.
[00255] Em algumas modalidades, uma composição como aqui revelada compreende um anticorpo que tem uma sequência de CDR de cadeia leve parcial ou completa e uma sequência de CDR de cadeia pesada parcial ou completa a partir de qualquer uma das opções fornecidas nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2.
[00256] Em algumas modalidades, são também fornecidas porções de CDR de anticorpos antagonistas de IL-6. A determinação das regiões CDR está dentro da arte da técnica.
Entende-se que em algumas modalidades, as CDRs podem ser uma combinação das CDRs IMGT e Paratome (também denominadas "CDRs combinadas" ou "CDRs estendidas"). A determinação das CDRs está dentro da arte da técnica. Em algumas modalidades, as CDRs são as CDRs IMGT. Em outras modalidades, as CDRs são as CDRs Paratome. Em outras modalidades, as CDRs são as CDRs estendidas, AbM, conformacionais, Kabat ou Chothia. Em modalidades com mais de uma CDR, as CDRs podem ser qualquer uma de IMGT, Paratome, estendida, Kabat, Chothia, AbM, CDRs conformacionais, ou suas combinações. Em algumas modalidades, outras definições de CDR também podem ser usadas. Em algumas modalidades, somente resíduos que são em comum entre 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 das definições acima são usados (resultando em uma sequência mais curta). Em algumas modalidades, qualquer resíduo em qualquer um de 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 das definições acima pode ser usado (resultando em uma sequência mais longa).
[00257] Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de IL-6 compreende três CDRs de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada mostradas nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende três CDRs de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve mostradas nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2.
Em algumas modalidades, o anticorpo compreende três CDRs de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada mostradas nas Tabelas 1A, e três CDRs de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve mostradas na Tabela 1B. Em algumas modalidades, as CDRs são um ou mais daquelas designadas nas Tabelas 0.1 (que inclui a Tabela 0.1A e/ou 0.1B) ou 0.2 (que inclui a Tabela 0.1A e/ou 0.1B) abaixo: Tabela 0.1A. Sequências CDR de cadeia pesada anti IL-
6.
ID CDR1 CDR2 CDR3 GFTFSPFAIS (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQLWGYYALDV (SEQ
I ID NO: 99) (SEQ ID NO: 100) ID NO: 101) GFTFSPFAWS (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQLWGYYALDV (SEQ
II ID NO: 102) (SEQ ID NO: 103) ID NO: 104) GFTFSPFAMH (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQAWGYYALDI (SEQ IIa ID NO: 49) (SEQ ID NO: 50) ID NO: 51) GFTFSPFAMH (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQSWGYYALDI (SEQ IIb ID NO:52) (SEQ ID NO:53) ID NO:54)
GFTFSPFAMH (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQGWGYYALDI (SEQ IIc ID NO:55) (SEQ ID NO: 56) ID NO: 57) GFTFSPFAMH (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQTWGYYALDI (SEQ IId ID NO: 58) (SEQ ID NO: 59) ID NO: 60) GFTFSPFAMH (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQVWGYYALDI (SEQ IIe ID NO: 61) (SEQ ID NO: 62) ID NO: 63) GFTFSPFAMH (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQQWGYYALDI (SEQ IIf ID NO: 64) (SEQ ID NO: 65) ID NO: 66) GFTFSPFAMH (SEQ VAKISPGGSWTYYSDTVTD ARQKWGYYALDI (SEQ IIg ID NO: 67) (SEQ ID NO: 68) ID NO: 69) Tabela 0.1B. Sequências CDR de cadeia pesada anti IL-
6. Kabat CDR1 CDR2 CDR3 PFAMH (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QAWGYYALDI (SEQ NO. 172) (SEQ ID NO. 173) ID NO. 174) PFAMH (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QSWGYYALDI (SEQ NO. 175) (SEQ ID NO. 176) ID NO. 177) PFAMH (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QGWGYYALDI (SEQ NO. 178) (SEQ ID NO. 179) ID NO. 180) PFAMH (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QTWGYYALDI (SEQ NO. 181) (SEQ ID NO. 182) ID NO. 183) PFAMH (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QVWGYYALDI (SEQ NO. 184) (SEQ ID NO. 185) ID NO. 186) PFAMH (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QQWGYYALDI (SEQ NO. 187) (SEQ ID NO. 188) ID NO. 189)
PFAMH (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QKWGYYALDI (SEQ NO. 190) (SEQ ID NO. 191) ID NO. 192) PFAIS (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QLWGYYALDV (SEQ NO. 193) (SEQ ID NO. 194) ID NO. 195) PFAWS (SEQ ID KISPGGSWTYYSDTVTD QLWGYYALDV (SEQ NO. 196) (SEQ ID NO. 197) ID NO. 198) Tabela 0.2A. Sequências CDR de cadeia leve anti IL-6.
ID CDR1 CDR2 CDR3 SASISVSYLY (SEQ ID LLIYDDSSLAS (SEQ QQWSGYPYT (SEQ ID
III NO: 105) ID NO: 106) NO: 107) SASISVSYLY (SEQ ID LLIYDASSLAS (SEQ QQWSGYPYT (SEQ ID
IV NO: 108) ID NO: 109) NO: 110) SASISVSYLY (SEQ ID LLIYDDSNLAS (SEQ QQWSGYPYT (SEQ ID
V NO: 111) ID NO: 112) NO: 113) Tabela 0.2B. Sequências CDR de cadeia leve anti IL-6.
CDR1 CDR2 CDR3 SASISVSYLY (SEQ ID DDSSLAS (SEQ ID QQWSGYPYT (SEQ ID NO. 199) NO. 200) NO. 201) SASISVSYLY (SEQ ID DASSLAS (SEQ ID QQWSGYPYT (SEQ ID NO. 202) NO. 203) NO. 204) SASISVSYLY (SEQ ID DDSNLAS (SEQ ID QQWSGYPYT (SEQ ID NO. 205) NO. 206) NO. 207)
[00258] Em algumas modalidades, o anticorpo usado para ligação a IL-6 pode ser um que inclui uma ou mais das sequências nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2. Em algumas modalidades, o anticorpo usado para ligação a IL-6 pode ser um que inclui três ou mais das sequências nas Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2. Em algumas modalidades, o anticorpo usado para ligação a IL-6 pode ser um que inclui seis das sequências em qualquer uma das Tabelas 1A, 1B, 0.1 e/ou 0.2.
Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a IL-6 pode ser um que compete para ligação com um anticorpo que inclui 6 das CDRs especificadas em qualquer uma das tabelas 1A, 1B,
0.1 e/ou 0.2.
[00259] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser ligado ou fundido a uma sequência de VEGF-trap. Em algumas modalidades, esta sequência trap pode ser conforme mostrado na Tabela 1C. Em algumas modalidades, a sequência é pelo menos 80% idêntica àquela mostrada na Tabela 1C, por exemplo, pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idêntica àquela mostrada em 1C. Em algumas modalidades, qualquer uma das moléculas de VEGF-trap na Publicação U.S. No. 20150376271 pode ser aqui empregada. Em algumas modalidades, a sequência de VEGF-trap é fundida a IL-6 em uma das seguintes maneiras: a uma extremidade N-terminal de uma cadeia pesada compreendendo IL-6 VH (Figura 6 à esquerda), ou entre uma região de dobradiça e depois de um domínio CH1 de uma cadeia pesada compreendendo IL-6 VH (Figura 6 à direita). A menos que de outra forma designado, ambas as opções na alternativa e em conjunto são contempladas para as modalidades aqui fornecidas, em que qualquer fusão Ab-trap é discutida. Em algumas modalidades, o termo "trap" refere-se a uma região extracelular de comprimento total ou qualquer porção da mesma, ou combinação de porções de diferentes receptores de VEGF que podem antagonizar a sinalização entre pelo menos um VEGF e VEGFR. Preferivelmente, o segmento trap extracelular inclui pelo menos um domínio de um de VEGFR-1, -2 ou -3, e mais preferivelmente pelo menos dois domínios contíguos, tais como D2 e D3. Opcionalmente, um domínio extracelular inclui pelo menos um domínio de pelo menos dois VEGFRs diferentes. Um domínio extracelular preferido compreende ou consiste essencialmente em D2 de VEGFR-1 e D3 de VEGFR-2.
Tabela 1C. Sequência de fusão VEGFR1, domínio 2 e VEGFR2, domínio 3
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWD SRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGE
KLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTR SDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO: 114)
[00260] Em algumas modalidades, o construto de IL-6 Ab VEGF Trap pode ter qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 1D. Em algumas modalidades, o construto pode ser pelo menos idêntico às sequências na Tabela 1D, por exemplo, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais alta. Em algumas modalidades, a proteína de fusão pode estar alinhada com aquelas percentagens, com a exceção de que o domínio IL-6 de anticorpo não contém uma ou mais das CDRs na Tabela 1E. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é uma que contém uma ou mais das sequências identificadas na Figura 5, por exemplo, uma ou mais das CDRS (incluindo 2, 3, 4, 5 ou 6 das CDRs em caixa) e/ou as regiões variáveis de cadeia pesada e leve inteiras, junto com uma sequência de VEGF-trap (por exemplo, Tabela 1C). Em algumas modalidades, as sequências podem ser fundidas diretamente umas às outras. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências ou seções de ligação flexíveis podem ser usadas. A sequência de ligação pode ser posicionada entre a sequência Ab e a sequência de VEGF-trap.
Estas sequências podem ser de 5 a 30 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de ligação pode incluir G e S em uma relação de cerca de 4:1. Em algumas modalidades, o ligante inclui a seguinte sequência: GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 115). Em algumas modalidades, qualquer ligante flexível pode ser empregado. Em algumas modalidades, a porção Fc do IL-6 Ab é IgG1.
Tabela 1D. Sequências de cadeia pesada e leve para moléculas inibidoras duplas. As CDRs estão sublinhadas nas cadeias pesada e leve, a sequência da VEGF-trap está em negrito preto, o ligante Gly-Ser está em itálico.
ID Cadeia pesada Cadeia leve
A SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 117)
ISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 116)
B SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 119)
ISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 118)
C SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV (SEQ ID NO: 121)
TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 120)
D SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 123)
WSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 122)
E SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 125)
WSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 124)
F SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 127)
WSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 126)
G SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 117)
MHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQAWGYYALDIWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 263)
H SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 119)
MHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQAWGYYALDIWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 263)
I SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 121)
MHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQAWGYYALDIWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 263)
J EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 129)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 128)
K EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 131)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 130)
L EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 133)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 132)
M EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 135)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 134)
N EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 137)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 136)
O EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 139)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 138)
P EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQAWGYYALDIWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 117)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 266)
Q EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQAWGYYALDIWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 119)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 267)
R EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAMHWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQAWGYYALDIWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 121)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 268)
[00261] Para expressar os anticorpos anti-IL-6 e/ou IL-6 VEGF Traps fornecidas aqui, fragmentos de DNA que codificam regiões VH e VL descritas podem ser primeiramente obtidos. Várias modificações, por exemplo, mutações, eliminações e/ou adições também podem ser introduzidas nas sequências de DNA usando métodos padrão conhecidos por aqueles técnicos no assunto. Por exemplo, mutagênese pode ser realizada usando métodos padrão, tais como mutagênese mediada por PCR, em que os nucleotídeos mutados são incorporados nos iniciadores de PCR de modo que o produto de PCR contenha as mutações desejadas ou mutagênese direcionada ao sítio.
[00262] A invenção abrange modificações nas regiões variáveis mostradas aqui. Por exemplo, a invenção inclui anticorpos que compreendem regiões variáveis funcionalmente equivalentes e CDRs que não afetam significativamente suas propriedades, assim como variantes que têm atividade e/ou afinidade aumentada ou diminuída. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser mutada para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada a IL-6. A modificação de polipeptídeos é prática rotineira na técnica e não precisa ser descrita em detalhes aqui. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou mais eliminações ou adições de aminoácidos que não alteram significativamente a atividade funcional, ou que amadurecem (intensificam) a afinidade do polipeptídeo para seu ligante, ou uso de análogos químicos.
[00263] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxila-terminal que variam em comprimento de um resíduo para polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou o anticorpo fundido a um epítopo marcador. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo na circulação sanguínea.
[00264] As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removida e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de estrutura também são contempladas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 0.4 na coluna de "substituições conservativas". Se tais substituições resultam em uma mudança na atividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 0.4, ou conforme descrito mais abaixo em referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos selecionados.
Tabela 0.4 - Substituições de Aminoácidos Substituições Resíduo original Substituições Exemplares Conservativas Ala (A) Val Val; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg
Substituições Resíduo original Substituições Exemplares Conservativas Leu; Val; Met; Ala; Phe; Ile (I) Leu Norleucina Norleucina; Ile; Val; Leu (L) Ile Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Val (V) Leu Norleucina
[00265] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas pela seleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção de (a) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha-b ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) a massa da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns:
[00266] (1) Não-polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[00267] (2) Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[00268] (3) Ácido (carregado negativamente): Asp, Glu;
[00269] (4) Básico (carregado positivamente): Lys, Arg;
[00270] Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e
[00271] (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.
[00272] As substituições não-conservativas são feitas pela troca de um membro de uma destas classes para outra classe.
[00273] Um tipo de substituição, por exemplo, que pode ser feito é alterar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que podem ser quimicamente reativas, para um outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Por exemplo, pode haver uma substituição de uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma CDR ou região de estrutura de um domínio variável ou na região constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação aberrante. Inversamente, ligação de cisteína(s) pode ser adicionada ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade, particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv.
[00274] Os anticorpos podem também ser modificados, por exemplo, nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Mudanças na região variável podem alterar a afinidade de ligação e/ou especificidade. Em algumas modalidades, não mais do que uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio CDR. Em outras modalidades, não mais do que uma a três substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio CDR. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões CDR para aumentar ou diminuir a KD do anticorpo para IL-6, para aumentar ou diminuir koff, ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo.
Técnicas de mutagênese direcionada ao sítio são bem conhecidas na arte da técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al. e Ausubel et al., supra.
[00275] De acordo com um aspecto, o domínio IgG de um anticorpo antagonista de IL-6 pode ser IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. De acordo com outro aspecto, o domínio IgG pode ser um composto no qual uma região constante é formada a partir de mais de um dos isotipos acima (por exemplo, região CH1 a partir de regiões IgG2 ou lgG4, dobradiça, CH2 e CH3 de IgG1).
Na escolha de um isotipo, é conhecido na técnica que os isótopos humanos IgG1 e IgG3 têm citotoxicidade mediada por complemento, ao passo que os isotipos humanos IgG2 e IgG4 têm uma citotoxicidade deficiente ou não mediada por complemento. Em algumas modalidades, o isotipo de anticorpo antagonista de IL-6 é IgG1.
[00276] A região constante de cadeia leve pode ser ou lambda ou kappa humana. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 tem uma região constante de cadeia leve de kappa humana.
[00277] Regiões constantes humanas mostram variação alotípica e variação isoalotípica entre diferentes indivíduos, isto é, as regiões constantes podem diferir em diferentes indivíduos em uma ou mais posições polimórficas.
Isoalotipos diferem de alotipos em que o soro que reconhece um isoalotipo se liga a uma região não polimórfica de um ou mais outros isotipos. A referência a uma região constante humana inclui uma região constante com qualquer alotipo natural ou qualquer permutação de resíduos ocupando posições polimórficas em alotipos naturais ou até 3, 5 ou 10 substituições para reduzir ou aumentar a função efetora como descrito abaixo.
[00278] Um ou vários aminoácidos no amino- ou carbóxi- terminal das cadeias leve e/ou pesada tais como a lisina C- terminal da cadeia pesada, podem estar faltando ou derivatizados em uma proporção ou todas as moléculas.
[00279] As substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora, tal como a citotoxicidade mediada por complemento (CDC), a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) (ver, por exemplo, Winter et al., Patente U.S. No.
5.624.821; Tso et al., Patente U.S. No. 5.834.597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005,2006), ou para prolongar a meia-vida em humanos (ver, por exemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004).
[00280] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas de IL-6 fornecidos aqui incluem uma ou mais substituições que reduzem a citotoxicidade mediada por complemento. A redução na citotoxicidade mediada por complemento pode ser realizada com ou sem redução na ligação do receptor Fc dependendo da natureza da(s) mutação(ões).
Anticorpos com citotoxicidade mediada por complemento reduzida mas pouca ou nenhuma redução no receptor Fc permitem um efeito desejado de fagocitose mediada por Fc de iC3b sem ativação do complemento, que pode contribuir para efeitos colaterais. Mutações exemplares conhecidas para reduzir a citotoxicidade mediada por complemento em regiões constantes humanas incluem mutações nas posições 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 e 331 por numeração EU. Mutações nas posições 318, 320 e 322 foram relatadas para reduzir a ativação de complemento em anticorpos de camundongo. A alanina é um resíduo preferido para ocupar estas posições em uma região constante mutada. Algumas mutações humanas exemplares que foram usadas incluem F241A, V264A, D265A, V296A, N297A, K322A e P331S em IgG3 humano e D270A ou E, N297Q, K322A, P329A, e P331S em IgG1 humano (numeração EU).
[00281] Aqui, como em outro lugar, o esquema de numeração EU é usado para numeração de aminoácidos na região constante de um anticorpo. Quando um resíduo em uma região variável é aqui referido (a menos que designado de outra forma) a numeração de resíduo é de acordo com o domínio variável (ou, se designado, a SEQ ID NO). A substituição em qualquer ou todas as posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduzem a afinidade para os receptores Fcg, particularmente o receptor FcgRI e também reduz a ligação e a ativação do complemento (ver, por exemplo, US 6.624.821 WO/2009/052439).
Uma substituição de alanina nas posições 234, 235 e 237 reduz as funções efetoras, particularmente no contexto de IgG1 humana. Opcionalmente, as posições 234, 236 e/ou 237 em IgG2 humana são substituídas com alanina e a posição 235 com glutamina. (Veja, por exemplo, US 5.624.821) para reduzir a ligação do receptor Fc. Substituições exemplares para aumentar a meia-vida incluem uma Gln na posição 250 e/ou uma Leu na posição 428. De acordo com um aspecto da presente invenção, onde o anticorpo anti-IL-6 apresentado tem um isotipo IgG1 humana, é preferido que o anticorpo tenha pelo menos uma mutação na região constante. De preferência, a mutação reduz a fixação do complemento ou a ativação pela região constante. Em aspectos particularmente preferidos da presente invenção, o anticorpo tem uma ou mais mutações nas posições E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 e P331 por numeração EU. Ainda mais preferivelmente, as mutações constituem um ou mais dos seguintes E233P, L234V, L234A, L235A, GA237A, A327G, A330S e P331S por numeração EU. Nas modalidades mais preferidas, a IgG1 Humana tem as seguintes mutações L234A, L235A e G237A por numeração EU.
Conjugados
[00282] A meia-vida dos anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap pode ser estendida pela ligação de "porções de extensão de meia-vida" ou "grupos de extensão de meia-vida", em que tais termos são aqui usados de forma intercambiável para se referir a um ou mais grupos químicos ligados a uma ou mais funcionalidades de cadeia do sítio de aminoácido tais como -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2, ou uma ou mais estruturas de N- e/ou O-glicano e que podem aumentar a meia-vida circulatória in vivo de proteínas/peptídeos quando conjugados a estas proteínas/peptídeos. Exemplos de porções de extensão da meia-vida incluem polímeros descritos aqui, particularmente aqueles de monômeros zwiteriônicos, tais como HEMA-fosforilcolina, PEG, ácidos graxos biocompatíveis e derivados dos mesmos, Hidróxi Alquil Amido (HAS), por exemplo Hidróxi Etil Amido (HES), Poli Etileno Glicol (PEG), Poli (Glix-Sery) (HAP), Ácido hialurônico (HA), polímeros Heparosan (HEP), Fleximers, Dextrano, Ácidos poli- siálicos (PSA), domínios Fc, Transferrina, Albumina 25, elastina tipo peptídeos (ELP), polímeros XTEN, polímeros PAS, polímeros PA, peptídeos de ligação de albumina, peptídeos CTP, peptídeos de ligação de FcRn e qualquer combinação dos mesmos.
[00283] Em algumas modalidades, o anticorpo é conjugado com um polímero contendo fosforilcolina. Em algumas modalidades, o anticorpo é conjugado com um polímero contendo poli(acriloiloxietil fosforilcolina), tal como um polímero de ácido acrílico contendo pelo menos um monômero acriloiloxietil fosforilcolina tal como 2-metacriloilóxietil fosforilcolina (isto é, 2-metacriloil-2'-trimetilamônio etil fosfato).
[00284] Em algumas modalidades, o anticorpo e/ou anticorpo de fusão VEGF-trap é conjugado com um polímero solúvel em água, que se refere a um polímero que é solúvel em água. Uma solução de um polímero solúvel em água pode transmitir pelo menos cerca de 75%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de luz, transmitida pela mesma solução após a filtragem. Em uma base em peso, um polímero solúvel em água ou segmento do mesmo pode ser pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 50%, cerca de 70%, cerca de 85%, cerca de 95% ou 100% (em peso de polímero seco) solúvel em água.
[00285] Em uma modalidade, uma porção de extensão da meia-vida pode ser conjugada a anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap através de grupos amino livres da proteína utilizando ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). Reagentes direcionados para a conjugação com grupos amina podem reagir aleatoriamente a grupo ϵ-amina de lisinas, grupo a-amina de aminoácidos N-terminais e grupo d-amina de histidinas.
[00286] Entretanto, os anticorpos antagonistas de IL- 6 da presente invenção têm muitos grupos amina disponíveis para conjugação de polímeros. A conjugação de polímeros a grupos amino livres, assim, pode impactar negativamente a capacidade do anticorpo a se ligar ao epítopo.
[00287] Em outra modalidade, uma porção de extensão de meia-vida é acoplada a um ou mais grupos SH livres usando qualquer química reativa tiol apropriada incluindo, sem limitação, a química de maieimida, ou o acoplamento de hidrazidas de polímero ou aminas poliméricas a porções de carboidrato dos anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou de IL- 6 Ab VEGF-traps após a oxidação anterior. O uso de acoplamento de mailimida é uma modalidade particularmente preferida da presente invenção. O acoplamento ocorre preferencialmente em cisteínas naturalmente presentes ou introduzidos via engenharia genética.
[00288] Em algumas modalidades, os polímeros são covalentemente ligados a resíduos de cisteína introduzidos em anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-traps por mutagênese direcionada ao sítio. Em algumas modalidades, os resíduos de cisteína na porção Fc do anticorpo antagonista de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap podem ser usados. Em algumas modalidades, sítios para introduzir resíduos de cisteína em uma região Fc são providos em WO 2013/0938809, US 7.21.541, WO 2008/020827, US 8.008.453, US 8.455.622 e US 2012/0213705, incorporados aqui por referência para todos os propósitos.
Em algumas modalidades, as mutações de cisteína são Q347C e L443C com referência à cadeia pesada de IgG humana pelo índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a cisteína adicionada pela mutagênese direcionada para a ligação subsequente do polímero é L443C. Em algumas modalidades, a estequiometria do anticorpo antagonista de IL-6 para polímero é de 1:1; em outras palavras, um conjugado consiste essencialmente em moléculas cada uma compreendendo uma molécula de anticorpo antagonista de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-
trap conjugado a uma molécula de polímero. Em algumas modalidades, o acoplamento pode ocorrer em uma ou mais lisinas.
[00289] Em algumas modalidades, um conjugado compreende um anticorpo antagonista isolado que se liga especificamente ao IL-6 ou IL-6 Ab VEGF-trap é conjugado a um polímero. Em algumas modalidades, o polímero compreende um monômero zwiteriônico. Em algumas modalidades, o monômero zwiteriônico, sem limitações, é HEMA-fosforilcolina, PEG, ácidos graxos biocompatíveis e derivados dos mesmos, Hidróxi Alquil Amido (HAS), por exemplo Hidróxi Etil Amido (HES), Poli Etileno Glicol (PEG), Poli (Glix-Sery) (HAP), Ácido hialurônico (HA), polímeros Heparosan (HEP), Fleximers, Dextrano, Ácidos poli-siálicos (PSA), domínios Fc, Transferrina, Albumina 25, elastina tipo peptídeos (ELP), polímeros XTEN, polímeros PAS, polímeros PA, peptídeos de ligação de albumina, peptídeos CTP, ou peptídeos de ligação de FcRn. Em algumas modalidades, o polímero compreendendo um monômero zwiteriônico é uma porção de extensão da meia-vida.
[00290] Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap pode ter uma porção de extensão da meia-vida ligada. Em algumas modalidades, a porção de extensão da meia-vida é um polímero zwiteriônico, mas PEG ou outros extensores de meia-vida discutidos abaixo podem ser usados alternativamente. Em algumas modalidades, o polímero zwiteriônico é formado de monômeros tendo um grupo fosforilcolina. Em algumas modalidades, o monômero é 2-(acriloiloxietil)-2'- (trimetilamôniometil) fosfato. Em algumas modalidades, o monômero é 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamônioetil) fosfato (HEMA-PC).
[00291] Em algumas modalidades, o polímero conjugado ao anticorpo antagonista de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap tem pelo menos 2 ou 3 ou mais braços. Alguns polímeros têm 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 braços. Em algumas modalidades, o polímero tem 3, 6 ou 9 braços. Em algumas modalidades, o polímero tem 9 braços. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do polímero está entre 300.000 e 1.750.000 Da. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular de pico entre 500.000 e 1.000.000 Da. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular de pico entre 600.000 e
800.000 Da.
[00292] Em algumas modalidades, um conjugado de anticorpo antagonista anti-IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap e um polímero é fornecido. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular de pico entre 300.000 e 1.750.000 Daltons conforme medido por cromatografia de exclusão de tamanho - espalhamento de luz em múltiplos ângulos (referido como "SEC- MALS"). Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular de pico entre 500.000 e 1.000.000 Daltons conforme medido por SEC-MALS. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular de pico entre 600.000 a 800.000 Daltons, conforme medido por SEC-MALS.
[00293] Em algumas modalidades, uma porção de extensão da meia-vida pode ser conjugada a um resíduo de cisteína de ocorrência natural de um anticorpo antagonista de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap fornecido aqui. Em algumas modalidades, a porção de extensão de meia-vida é conjugada adicionada a uma cisteína que é adicionada via mutagênese direcionada ao sítio. Em algumas modalidades, a cisteína é adicionada pelo uso de tecnologia de DNA recombinante para adicionar o peptídeo SGGGC ou CAA ao C-terminal da cadeia leve ou pesada. Em algumas modalidades, o peptídeo é adicionado à cadeia pesada. Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína introduzido via tecnologia de DNA recombinante é selecionado do grupo consistindo em (numeração EU) Q347C e L443C.
[00294] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é apresentada uma composição farmacêutica tendo um anticorpo antagonista IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00295] Anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF Traps (ou outros construtos providos aqui) podem ser produzidos por expressão recombinante incluindo (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, (ii)
introdução de DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo e sem limitação, transfecção, eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivo das células transformadas, (iv) expressão de anticorpos anti-IL-6, por exemplo, constitutivamente ou em indução, e (v) isolamento do anticorpo anti-IL-6, por exemplo, do meio de cultura ou pela colheita das células transformadas, a fim de (vi) obter anticorpos anti-IL-6 purificados.
[00296] Em algumas modalidades, um conjugado compreendendo um anticorpo anti-IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap e um polímero é fornecido (bem como as outros construtos providos aqui, tal como um bioconjugado). O anticorpo e/ou Ab-trap é qualquer um dos anticorpos e/ou traps aqui descritos. Em algumas modalidades, o anticorpo é um IgG. Em algumas modalidades, o anticorpo é IgA, IgE, IgD ou IgM. Em algumas modalidades, o polímero é covalentemente ligado a um grupo sulfidrila. Em algumas modalidades, o polímero é covalentemente ligado a um grupo sulfidrila a partir de um resíduo cisteína. Em algumas modalidades, o polímero é covalentemente ligado a um grupo sulfidrila a partir de um resíduo cisteína na cadeia pesada. Em algumas modalidades, o polímero é covalentemente ligado a um grupo sulfidrila a partir de um resíduo cisteína na cadeia pesada da IgG. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um resíduo de cisteína na posição 347 ou 443 (numeração EU). Em algumas modalidades, o polímero é covalentemente ligado a um grupo sulfidrila a partir de um resíduo cisteína na posição 347 ou 443 (numeração EU).
[00297] Anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap podem ser produzidos por expressão em um sistema hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado, caracterizado por produzir uma molécula de anticorpo anti- IL-6 farmacologicamente aceitável. Exemplos de células eucarióticas são células de mamíferos, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip e HepG2. Outros sistemas de expressão adequados são procarióticos (por exemplo, E. coli com sistema de expressão pET/BL21), levedura (sistemas Saccharomyces cerevisiae e/ou Pichia pastoris), e células de insetos. Em algumas modalidades, é fornecida uma linhagem celular isolada que produz qualquer um dos anticorpos e/ou Ab-traps aqui descritos. Em algumas modalidades, a linhagem celular isolada é selecionada, sem limitações, a partir de um ou mais dentre CHO, klSV, XCeed, CHOK1SV, GS-KO.
[00298] Em algumas modalidades, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica qualquer um dos anticorpos e/ou Ab-traps aqui descritos. Em algumas modalidades, é fornecido um vetor de expressão recombinante que compreende o ácido nucleico isolado. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreende o vetor de expressão.
[00299] Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a preparação dos anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-traps e podem ser selecionados a partir de vetores de expressão eucariótica e procariótica. Exemplos de vetores para expressão procariótica incluem plasmídeos tais como, sem limitação, preset, pet e pad, em que os promotores usados em vetores de expressão procarióticos incluem um ou mais de, e sem limitação, lac, trc, trp, recA ou araBAD.
Exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem, sem limitação: (i) para expressão em leveduras, vetores tais como, e sem limitação, pAO, pPIC, pYES, ou pMET, usando promotores tais como, e sem limitação, AOX1, GAP, GAL1, ou AUG1; (ii) para expressão em células de insetos, vetores tais como e sem limitação, pMT, pAc5, pIB, pMIB, ou pBAC, usando promotores tais como e sem limitação PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 ou po1h, e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores tais como, e sem limitação, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 ou pBPV, e vetores derivados de, em um aspecto, sistemas virais tais como e sem limitação vírus de vaccinia, vírus adeno-associados, vírus da herpes ou retrovírus, usando promotores tais como e sem limitação CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e beta-actina.
[00300] Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir um anticorpo antagonista de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap. Em algumas modalidades, o método compreende o cultivo de uma linhagem celular que produz de forma recombinante qualquer um dos anticorpos e/ou Ab-traps descritos aqui sob condições em que o anticorpo é produzido e recuperado. Em algumas modalidades, é provido um método para produzir um anticorpo antagonista de IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap. Em algumas modalidades, o método compreende cultivar uma linhagem celular compreendendo ácido nucleico que codifica um anticorpo e/ou Ab-trap compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1A e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 1B sob condições em que o anticorpo e/ou IL-6 Ab VEGF-trap é produzido e recuperado. Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve do anticorpo e/ou IL-6 Ab VEGF-trap são codificadas em vetores separados. Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve do anticorpo e/ou IL-6 Ab VEGF-trap são codificadas no mesmo vetor.
[00301] De acordo com outro aspecto da presente invenção, são providos métodos para a síntese de um anticorpo antagonista polímero-IL-6 zwiteriônico e/ou conjugados de IL-6 Ab VEGF-trap, o conjugado tendo um ou mais agentes funcionais e um ou mais braços de polímero em que cada um dos braços de polímero tem uma ou mais unidades monoméricas em que pelo menos uma das unidades tem um zwiteríon. Por exemplo, tal método pode ter as etapas de:
a. fornecer um iniciador tendo um ou mais sítios para polimerização de monômero e um primeiro ligante tendo um grupo amina em que o iniciador é um sal de ácido trifluoro acético; b. fornecer um ou mais monômeros adequados para a polimerização, em que pelo menos um dos monômeros é zwiteriônico; c. reagir os monômeros com o iniciador para formar um ou mais braços poliméricos, cada um correspondendo aos sítios para polimerização de monômero para fornecer um conjugado iniciador-polímero tendo o primeiro ligante com o grupo amina; d. fornecer um segundo ligante tendo pelo menos um segundo e terceiro grupos reativos; e. acoplar um dos segundo e terceiro grupos reativos do segundo ligante ao grupo amina do primeiro ligante do conjugado iniciador-polímero para fornecer um conjugado ligante-iniciador-polímero tendo um ou mais grupos reativos que não foram usados na etapa de acoplamento; e f. acoplar um ou mais agentes funcionais a um ou mais dos grupos reativos não reagidos da porção ligante- iniciador-polímero para fornecer o conjugado de agente polímero-funcional.
[00302] Em algumas modalidades, um conjugado compreendendo um anticorpo antagonista isolado e/ou IL-6 Ab
VEGF-trap que se liga especificamente a IL-6 e um polímero contendo fosforilcolina é fornecido. Em algumas modalidades, o polímero é covalentemente ligado ao anticorpo e/ou Ab- trap. Em algumas modalidades, o polímero é ligado não- covalentemente ao anticorpo e/ou Ab-trap.
[00303] Em algumas modalidades, um conjugado compreendendo um anticorpo anti-IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap e um polímero contendo fosforilcolina é fornecido. Em algumas modalidades, o polímero é covalentemente ligado ao anticorpo fora de uma região variável do anticorpo. Em algumas modalidades, é fornecido um conjugado compreendendo um anticorpo anti-IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap e um polímero contendo fosforilcolina. O polímero é covalentemente ligado ao anticorpo em uma cisteína fora de uma região variável do anticorpo. Em algumas modalidades, um conjugado compreendendo um anticorpo anti-IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap e um polímero contendo fosforilcolina é fornecido, em que o polímero é covalentemente ligado ao anticorpo em uma cisteína fora de uma região variável do anticorpo em que a referida cisteína foi adicionada via tecnologia de DNA recombinante.
Em algumas modalidades do conjugado, o polímero compreende monômeros de 2(metacriloilóxi)etil (2-(trimetilamônio)etil) fosfato (MPC).
[00304] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um método onde o grupo de conjugação
(por exemplo, maleimida) é adicionado após a síntese do polímero. Isto é algumas vezes referido como uma "estratégia de snap-on", ou uma "estratégia de polímero universal". Veja, por exemplo, pedido de Patente U.S. No. 14/916.180 (publicado como pedido de patente U.S. No. 20160199501), incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, uma única porção iniciadora pode ser usada para síntese de polímero em grande escala. Assim, as condições podem ser desenvolvidas para a síntese ótima de polímero em escala. Tais polímeros podem, então, ser adaptados a vários tipos de agentes funcionais, por meio do "encaixe" ("snapping-on") de vários tipos de ligantes. Por exemplo, se for desejado conjugar um agente funcional maior a um polímero da presente invenção, tal como um anticorpo ou mesmo um fragmento Fab, uma sequência de ligação mais longa pode ser encaixada no polímero. Em contraste, agentes funcionais menores podem requerer sequências ligantes relativamente mais curtas.
[00305] Em algumas modalidades dos métodos, o iniciador tem cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 sítios para a iniciação do polímero. Em algumas modalidades, o iniciador tem cerca de 3, cerca de 6 ou cerca de 9 sítios para iniciação de polímero.
[00306] De acordo com outro aspecto da presente invenção, um segundo ligante possui segundo, terceiro,
quarto, quinto e sexto grupos reativos. Mais preferivelmente, um segundo ligante tem apenas segundo e terceiro grupos reativos.
[00307] De acordo com um aspecto da presente invenção, cada braço de polímero tem de cerca de 20 a cerca de 2.000 unidades de monômero. De preferência, cada braço tem de cerca de 100 a 500 unidades de monômero ou de cerca de 500 a 1000 unidades de monômero ou de cerca de 1000 a 1500 unidades de monômero ou de cerca de 1500 a 2.000 unidades de monômero.
[00308] De acordo com um aspecto da presente invenção, o peso molecular de pico do conjugado de agente polímero- funcional é de cerca de 100.000 a 1.500.000 Da. De preferência, o peso molecular de pico do conjugado de agente polímero-funcional é de cerca de 200.000 a cerca de 300.000 Da, cerca de 400.000 a cerca de 600.000 Da ou cerca de
650.000 a cerca de 850.000 Da.
[00309] De acordo com outro aspecto da presente invenção, o primeiro ligante é preferivelmente alquila, alquila substituída, alquileno, alcóxi, carboxialquila, haloalquila, cicloalquila, alquil éter cíclico, alquenil, alquenileno, alquinil, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquil, heterocicloalquileno, arila, arileno, arileno-óxi, heteroarila, amino, amido ou qualquer combinação dos mesmos. Mais preferivelmente, o primeiro ligante tem a fórmula:
m Fórmula (1) em que m é 1 a 10. Em algumas modalidades, o primeiro ligante tem a fórmula acima (fórmula (1)) e m é 4.
[00310] Em algumas modalidades, o iniciador de preferência inclui uma estrutura selecionada do grupo consistindo em
X Fórmula (2)
X
X Fórmula (3), e
X X
X Fórmula (4) em que X é selecionado do grupo consistindo em NCS, F, Cl, Br e I. Mais Preferivelmente, X Na fórmula (2), fórmula (3) e/ou fórmula (4) é Br.
[00311] Em algumas modalidades, o monômero é selecionado do grupo que consiste em Fórmula (5) Fórmula (6)
Fórmula (7)
Fórmula (8)
Fórmula (9)
em que R7 é H ou alquila C1-6 e t é 1 a 6.
[00312] Mais preferivelmente, o monômero é selecionado do grupo que consiste em fosfato de 2- (metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamônioetil) (HEMA-PC) e 2- (acriloiloxietil)-2'-(trimetilamônioetil) fosfato.
[00313] Mais preferencialmente, o monômero é o fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamônioetil).
[00314] A segunda porção ligante compreende, de preferência, um éster ativado que tem a estrutura Fórmula (10) em que R8 é selecionado do grupo consistindo em e e R9 é Fórmula (11) em que p é 1 a 12.
[00315] Em modalidades mais preferidas da presente invenção, o polímero tem 9 braços, m é 2-4, R9 é Fórmula (11) em que p é 4 a 15. Ainda mais preferivelmente, m é 4 e p é 12.
[00316] Em algumas modalidades, o monômero polimerizável por radicais é
X -O
Y +
N Fórmula (12)
em que R1 é H ou C1-6 alquila, R2, R3, R4 são iguais ou diferentes e são H ou C1-4 alquila e X e Y são iguais ou diferentes e inteiros de 1 a 6. Em algumas modalidades, R1, R2, R3 e R4 são cada um metila e X e Y são cada um 2 Na fórmula (12).
[00317] Em algumas modalidades, o monômero polimerizável por radicais é
X N
Y Fórmula (13) em que R1 é H ou C1-6 alquila, R2 e R3 são iguais ou diferentes e são H ou C1-4 alquila, R4 é PO4-, SO3- ou CO2- e X e Y são iguais ou diferentes e inteiros de 1 a 6. Em algumas modalidades, R1, R2 e R3 são metila, R4 é PO4- e X e Y são cada um 2 na fórmula (13).
[00318] Em algumas modalidades, o monômero é
X Y
N Fórmula (14) em que R1 é H ou C1-6 alquila, R2, R3 e R4 são iguais ou diferentes e são H ou C1-4 alquila, R5 é PO4-, SO3- ou CO2- e X e Y são iguais ou diferentes e inteiros de 1 a 6. Em algumas modalidades, R1, R2, R3 e R4 são metila, R5 é PO4- e X e Y são 2 na fórmula (14).
[00319] Quando um polímero é o conjugado através de uma cisteína (ou outro resíduo especificado), o polímero pode ser ligado diretamente ou indiretamente ao resíduo (por exemplo, com um iniciador interveniente, e ou espaçador ou similar).
[00320] Em algumas modalidades, o polímero contendo fosforilcolina compreende monômeros de 2- (metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamônio)etil fosfato (MPC) como apresentado abaixo:
-O
N + Fórmula (15), tal que o polímero compreende as seguintes unidades de repetição Fórmula (16); onde n é um número inteiro de 1 a 3000 e as linhas onduladas indicam os pontos de fixação entre unidades de monômero no polímero.
[00321] Em algumas modalidades, o polímero tem três ou mais braços, ou é sintetizado com um iniciador compreendendo 3 ou mais sítios de iniciação de polímero. Em algumas modalidades, o polímero possui 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 braços, ou é sintetizado com um iniciador compreendendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 sítios de iniciação de polímeros. Mais preferivelmente, o polímero tem 3, 6 ou 9 braços, ou é sintetizado com um iniciador compreendendo 3, 6 ou 9 sítios de iniciação de polímero. Em algumas modalidades, o polímero tem 9 braços, ou é sintetizado com um iniciador compreendendo 9 sítios de iniciação de polímero.
[00322] Em algumas modalidades, o polímero que é adicionado tem um peso molecular entre cerca de 300.000 e cerca de 1.750.000 Da (SEC-MALs). Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular entre cerca de 500.000 e cerca de 1.000.000 Da. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular entre cerca de 600.000 a cerca de 900.000 Da.
Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular entre cerca de 750.000 e cerca de 850.000 Da. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular entre cerca de
800.000 e cerca de 850.000 Da. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular entre cerca de 750.000 e cerca de 800.000 Da.
[00323] Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos e/ou Ab-traps descritos aqui podem ser adicionalmente conjugados a um polímero para formar um bioconjugado. O peso molecular do bioconjugado (no total, SEC-MALs) pode estar entre cerca de 350.000 e 2.000.000 Daltons, por exemplo, entre cerca de 450.000 e 1.900.000 Daltons, entre cerca de 550.000 e 1.800.000 Daltons, entre cerca de 650.000 e 1.700.000 Daltons, entre cerca de 750.000 e 1.600.000 Daltons, entre cerca de 850.000 e 1.500.000 Daltons, entre cerca de 900.000 e 1.400.000 Daltons, entre cerca de 950.000 e 1.300.000 Daltons, entre cerca de 900.000 e 1.000.000 Daltons, entre cerca de 1.000.000 e 1.300.000 Daltons, entre cerca de 850.000 e 1.300.000 Daltons, entre cerca de 850.000 e 1.000.000 Daltons, e entre cerca de
1.000.000 e 1.200.000 Daltons. Em algumas modalidades, o bioconjugado tem um peso molecular entre cerca de 350.000 e
1.900.000 Daltons.
[00324] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo e/ou de Ab-trap é purificado. Em algumas modalidades, o polímero em aspecto do conjugado de anticorpo e/ou conjugado Ab-trap é polidisperso, isto é, o PDI de polímero não é 1,0. Em algumas modalidades, o PDI é menor do que 1,5. Em algumas modalidades, O PDI é menor do que 1,4.
Em algumas modalidades, O PDI é menor do que 1,3. Em algumas modalidades, o PDI é menor do que 1, 2. Em algumas modalidades, o PDI é menor do que 1,1. Em algumas modalidades, o PDI é igual ou menor do que 1,5.
[00325] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo e/ou de Ab-trap tem uma imunoglobulina G (IgG) anti-IL-6 G ligada a um polímero, sendo que o polímero compreende monômeros de MPC, em que a sequência da cadeia pesada anti-IL-6 está na Tabela 1A, e a sequência da cadeia leve anti-IL-6 está na Tabela 1B, e em que o anticorpo e/ou o Ab-trap é ligado somente em C442 ao polímero. Em algumas modalidades, o polímero tem 9 braços e tem um peso molecular entre cerca de 600.000 a cerca de 1.000.000 Da.
[00326] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo e/ou de Ab-trap tem uma imunoglobulina G (IgG) anti-IL-6 ligada a um polímero, sendo que o polímero compreende monômeros de MPC, em que a sequência da cadeia pesada anti-IL-6 compreende na Tabela 1A, e a sequência da cadeia leve anti-IL-6 compreende na Tabela 1B, e em que o anticorpo é ligado apenas em C443 (numeração EU) ao polímero.
Em algumas modalidades, o polímero tem 9 braços e tem um peso molecular entre cerca de 600.000 a cerca de 1.000.000 Da. Em algumas modalidades, o conjugado compreende um polímero que tem 9 braços e o polímero tem um peso molecular entre cerca de 600.000 a cerca de 900.000 Da.
[00327] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo tem a seguinte estrutura:
Fórmula (17)
em que: cada cadeia pesada do anticorpo anti-IL-6 é indicada pela letra H, e cada cadeia leve do anticorpo anti-
IL-6 é indicada pela letra L (que, em algumas modalidades,
pode ainda ser ligada ao arranjo Ab-trap, conforme mostrado na Figura 6);
o polímero é ligado ao anticorpo anti-IL-6 (e/ou Ab-
trap) através da sulfidrila de C443 (numeração EU), cuja ligação é representada em uma das cadeias pesadas; PC é,
onde a linha ondulada indica o ponto de fixação ao restante do polímero; em que X = a) OR onde R = H, metila,
etila, propila, isopropila, b) H, ou c) qualquer haleto,
incluindo Br; e n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 e n9 são iguais ou diferentes de modo que a soma de n1, n2, n3, n4,
n5, n6, n6, n7, n8 e n9 é 2500 mais ou menos 10%. Em algumas modalidades, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 e n9 são iguais ou diferentes e são números inteiros de 0 a 3000. Em algumas modalidades, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 e n9 são iguais ou diferentes e são inteiros de 0 a 500. Em algumas modalidades, X = OR, onde R é um açúcar, uma aminoalquila,
variantes mono-substituídas, poli-substituídas ou não substituídas dos seguintes resíduos: alquila C1-C24 saturada,
alquenila C2-C24 ou alquinila C2-C24 insaturada, acila,
acilóxi, alquiloxicarbonilóxi, ariloxicarbonilóxi,
cicloalquila, cicloalquenila, alcóxi, cicloalcóxi, arila,
heteroarila, arilalcóxi carbonila, alcóxi carbonilacila,
amino, aminocarbonila, aminocarboilóxi, nitro, azido,
fenila, hidróxi, alquiltio, ariltio, oxisulfonila, carbóxi,
ciano e alquila halogenada incluindo alquila polihalogenada,
-CO-O-R7, carbonila -CCO-R7, -CO-NR8R9, -(CH2)n-COOR7, -CO-
(CH)n-COOR7, -(CH2)n-NR8R9, éster, alcoxicarbonila,
ariloxicarbonila, em que n é um número inteiro de 1 a 6, em que cada R7, R8 e R9 é separadamente selecionado do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, variantes mono-substituídas, poli-substituídas ou não substituídas dos seguintes resíduos: alquila C1-C24 saturada, alquenila C2-C24 ou alquinila C2-C24 insaturada, acila, acilóxi, alquiloxicarbonilóxi, ariloxicarbonilóxi, cicloalquila, cicloalquenila, alcóxi, cicloalcóxi, arila, heteroarila, arilalcóxi carbonila, alcóxi carbonilacila, amino, aminocarbonila, aminocarboilóxi, nitro, azido, fenila, hidróxi, alquiltio, ariltio, oxisulfonila, carbóxi, ciano e alquila halogenada incluindo alquila polihalogenada, um anel de 5 membros, e um anel de 6 membros. Em algumas modalidades, a fórmula 17 pode ser parte de uma proteína de fusão, que também incluiria alguma ou toda a sequência da Tabela 1C, de modo a produzir uma proteína de fusão IL-6 Ab VEGF-trap. Em algumas modalidades, a fusão na Figura 27 pode ser usada na fórmula 17, com a fusão substituindo o anticorpo representado.
[00328] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo tem a seguinte estrutura:
Fórmula (17)
em que:
cada cadeia pesada do anticorpo é indicada pela letra
H, e cada cadeia leve do anticorpo anti-IL-6 é indicada pela letra L (que, em algumas modalidades, pode ainda ser ligada ao arranjo Ab-trap, conforme mostrado na Figura 6);
o polímero é ligado ao anticorpo através da sulfidrila de C443 (numeração EU), cuja ligação é apresentada em uma das cadeias pesadas;
PC é onde a linha ondulada indica o ponto de fixação ao restante do polímero, onde X = a) OR em que R = H, metila, etila, propila, isopropila, B) H, ou c) qualquer haleto, incluindo Br; e n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 e n9 são iguais ou diferentes de modo que a soma de n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 e n9 é 2500 mais ou menos 15%. Em algumas modalidades, a soma de nl, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 e n9 é de cerca de 1500 a cerca de 3.500 mais ou menos de cerca de 10% a cerca de 20%. Em algumas modalidades, a fusão na Figura 27 pode ser usada na fórmula 17, com a fusão substituindo o anticorpo representado.
[00329] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo e/ou de Ab-trap está presente em uma formulação líquida. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo e/ou de Ab-trap é combinado com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00330] Em algumas modalidades, o isotipo do anticorpo anti-IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) de cadeia pesada é IgG1 e tem domínios CH1, de dobradiça, CH2 e CH3. Em algumas modalidades, o isotipo de cadeia leve é kappa.
[00331] Em algumas modalidades, o domínio IgG1 do anticorpo anti-IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) tem uma ou mais mutações para modular a função efetora, tal como ADCC, ADCP e CDC.
Em algumas modalidades, as mutações de IgG1 reduzem a função efetora.
Em algumas modalidades, os aminoácidos para uso para mutações de função efetoras incluem (numeração
EU) E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322X,
A327X, P329X, A330X, A330X, P331X, e P331X, em que X é qualquer aminoácido natural ou não natural.
Em algumas modalidades, as mutações incluem um ou mais dos seguintes:
E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S e P331S
(numeração EU). Em algumas modalidades, a cadeia pesada de anti-IL-6 tem as seguintes mutações (numeração EU): L234A,
L235A e G237A.
Em algumas modalidades, o número de mutações de função efetora em relação a uma sequência de IgG1 humana natural não é mais do que 10. Em algumas modalidades, o número de mutações de função efetora em relação a uma sequência de IgG1 humana natural não é mais do que 5, 4, 3,
2 ou 1. Em algumas modalidades, o anticorpo (e/ou IL-6 Ab-
VEGF-trap) reduziu a ligação de Fc gamma e/ou ligação de complemento C1q, de modo que a capacidade do anticorpo para resultar em função efetora é diminuída.
Isto pode ser especialmente vantajoso para indicações/distúrbios oftálmicos.
[00332] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL- 6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) compreende uma ou mais das seguintes mutações de aminoácidos: L234A, L235A, G237A e L443C (numeração EU, ou 451A, 452A e 454A, e 660C na SEQ ID NO: 170, conforme mostrado em sublinhado duplo na Figura 27).
[00333] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL- 6 (e/ou IL-6 Ab VEGF-trap) é ou é parte de uma imunoglobulina humana G (IgG1).
[00334] Em algumas modalidades, o anticorpo IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) compreende um domínio constante de cadeia pesada que compreende uma ou mais mutações que reduzem uma função efetora imuno-mediada.
[00335] Em algumas modalidades, a cadeia pesada de anti-IL-6 tem um resíduo de cisteína adicionado como uma mutação pela tecnologia de DNA recombinante que pode ser usada para conjugar uma porção de extensão da meia-vida. Em algumas modalidades, a mutação é Q347C (numeração EU) e/ou L443C (numeração EU). Em algumas modalidades, a mutação é L443C (numeração EU). Em algumas modalidades, a estequiometria de anticorpo para polímero é 1:1; em outras palavras, um conjugado tem uma molécula de anticorpo conjugado a uma molécula de polímero.
[00336] A meia-vida dos anticorpos anti-IL-6 pode ser estendida através da ligação de "porções de extensão da meia-
vida ("meia vida")" ou "grupos de extensão da meia-vida ("meia vida")". Porções de extensão da meia-vida incluem peptídeos e proteínas que podem ser expressas em estrutura com a droga biológica de emissão (ou conjugada quimicamente dependendo da situação) e vários polímeros que podem ser ligados ou conjugados a uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos ou funcionalidades terminais tais como -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2, ou uma ou mais estruturas de N- e/ou O- glicano. Porções de extensão da meia-vida geralmente atuam para aumentar a meia-vida circulatória in vivo de fármacos biológicos.
[00337] Exemplos de porções de extensão da meia-vida de peptídeo/proteína incluem a fusão Fc (Capon DJ, Chamow SM, Morder J, et al., Designing CD4 immunoadhesion for AIDS therapy. Nature. 1989. 337: 525-31), fusão de albumina de Soro humano (HAS) (Yeh P, Landais D, Lemaitre M, et al.
Design of yeast-secreted albumi derivadtives for human therapy: biological and antiviral properties of a serum albumin-CD4 genetic conjugate. Proc Natl Acad Sci USA. 1992.
89:1904-08), fusão de peptídeo carbóxi terminal (CTP) (Fares FA, Suganuma N. Nishimori K, et al. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89: 4304-08), fusão genética de uma sequência de peptídeos de repetição não-
exata (XTEN) (Schellenberger V, Wang CW, Geething NC, et al.
A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol.
2009. 27:1186-90), peptídeo tio elastina (ELPilação) (MCpherson DT, Morrow C, Minehan DS, et al. Production and purification of a recombinant elastomeric polypeptide, G (VPGVG19-VPGV, from Escheriachia coli. Biotechnol Prog.
1992. 8:347-52), fusão de transferrina humana (Prior CP, Lai C-H, Sadehghi H et al. Modified transferrina fusion proteins.
Patente WO2004/020405. 2004), prolina-alanina-serina (PASilação) (Skerra A, Theobald I, Schlapsky M. Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability. Patente WO2008/155134 A1. 2008), polímero de homo-aminoácido (HAPilação) (Schlapschy M, Theobald I, Mack H, et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007.
20:273-84) e proteína tipo gelatina (GLK) (Huang Y-S, Wen X- F, Zaro JL, et al. Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating factor fusion with gelatin-like protein polymer. Eur J Pharm Biopharm. 2010.
72:435-41).
[00338] Exemplos de porções de extensão de meia-vida de polímero incluem polietileno glicol (PEG), PEG ramificado, PoliPEG® (Warwick Effect Polymers; Coventry,
Reino Unido), ácido polisiálico (PSA), amido, amido de hidroxipropila (HES), amido de hidroxialquila (HAS), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosano, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, álcool polivinílico (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfazeno, polioxazolina, anidrido ácido polietileno-co- maléico, anidrido de ácido poliestireno-co-maléico, poli(1- hidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), um polímero zwiteriônico, um polímero contendo fosforilcolina e um polímero compreendendo MPC, Poli(Glix-Sery), ácido hialurônico (HA), polímeros Heparosan (HEP), Fleximers, dextrano, e ácidos poli-siálicos (PSA).
[00339] Em uma modalidade, uma porção de extensão da meia-vida pode ser conjugada a um anticorpo por meio de grupos amino livres da proteína, utilizando ésteres de N- hidroxisuccinimida (NHS). Reagentes direcionados para a conjugação com grupos amina podem reagir aleatoriamente no grupo ϵ-amina de lisinas, grupo a-amina de aminoácidos N- terminais e grupo d-amina de histidinas.
[00340] Entretanto, os anticorpos anti-IL-6 (e/ou IL- 6 Ab-VEGF-trap) descritos aqui podem ter muitos grupos amina disponíveis para conjugação de polímeros. Conjugação de polímeros de grupos amina livres, assim, pode impactar negativamente a capacidade das proteínas de anticorpos se ligar a IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap).
[00341] Em algumas modalidades, uma porção de extensão de meia-vida é acoplada a um ou mais grupos SH livres usando qualquer química tiol-reativa apropriada incluindo, sem limitação, a química de maleimida, ou o acoplamento de hidrazidas de polímero ou aminas poliméricas a porções de carboidrato do anticorpo após oxidação anterior.
Em algumas modalidades, o acoplamento de maleimida é usado.
Em algumas modalidades, o acoplamento ocorre em cisteínas naturalmente presentes ou introduzidos via engenharia genética.
[00342] Em algumas modalidades, são providos conjugados de anticorpos e polímeros de alto MW servindo como extensores de meia-vida. Em algumas modalidades, é fornecido um conjugado que compreende um anticorpo (e/ou IL- 6 Ab-VEGF-trap) que é acoplado a um polímero zwiteriônico, em que o polímero é formado a partir de uma ou mais unidades monoméricas e em que pelo menos uma unidade monomérica tem um grupo zwitteriônico. Em algumas modalidades, o grupo zwiteriônico é fosforilcolina.
[00343] Em algumas modalidades, uma das unidades monoméricas é HEMA-PC. Em algumas modalidades, um polímero é sintetizado a partir de um único monômero que é HEMA-PC.
[00344] Em algumas modalidades, alguns conjugados de anticorpos (e/ou IL-6 Ab VEGFT-trap) possuem 2, 3 ou mais braços poliméricos em que o monômero é HEMA-PC. Em algumas modalidades, os conjugados têm 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 braços de polímero em que o monômero é HEMA-PC. Em algumas modalidades, os conjugados têm 3, 6 ou 9 braços. Em algumas modalidades, o conjugado tem 9 braços.
[00345] Em algumas modalidades, conjugados de polímero-anticorpo (e/ou polímero-IL-6 Ab-VEGFT-trap) têm uma porção polimérica com um peso molecular entre 100.000 e
1.500.000 Da. Em algumas modalidades, o conjugado tem uma porção polimérica com um peso molecular entre 500.000 e
1.000.000 Da. Em algumas modalidades, o conjugado tem uma porção polimérica com um peso molecular entre 600.000 e
800.000 Da. Em algumas modalidades, o conjugado tem uma porção polimérica com um peso molecular entre 600.000 e
850.000 Da e tem 9 braços. Quando é dado um peso molecular para um anticorpo conjugado a um polímero, o peso molecular será a adição do peso molecular da proteína, incluindo quaisquer porções de carboidrato associadas com o mesmo, e o peso molecular do polímero.
[00346] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-IL-6 (e/ou IL-6 Ab VEGF-trap) que tem um polímero HEMA-PC que tem um peso molecular medido por Mw entre cerca de 100 kDa e 1650 kDa e 1650 kDa. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero medido por Mw está entre cerca de 500 kDa e 1000 kDa. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero medido por Mw é entre cerca de 600 kDa e cerca de 900 kDa. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero medido por Mw é 750 ou 800 kDa mais ou menos 15%.
[00347] Em algumas modalidades, o polímero é produzido a partir de um iniciador adequado para ATRP tendo um ou mais sítios de iniciação de polímero. Em algumas modalidades, o sítio de iniciação de polímero tem um sítio de 2-bromoisobutirato. Em algumas modalidades, o iniciador tem 3 ou mais sítios de iniciação de polímero. Em algumas modalidades, o iniciador tem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 sítios de iniciação de polímeros. Em algumas modalidades, o iniciador tem 3, 6 ou 9 sítios de iniciação de polímero.
Em algumas modalidades, o iniciador tem 9 sítios de iniciação de polímero. Em algumas modalidades, o iniciador é OG1786.
[00348] Os anticorpos anti-IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGFT- trap) podem ser produzidos por expressão recombinante incluindo (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, (ii) introdução de DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo e sem limitação, transfecção, eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivo das células transformadas, (iv) expressão de anticorpo, por exemplo, constitutivamente ou em indução, e (v) isolamento do anticorpo, por exemploa partir do meio de cultura ou pela colheita das células transformadas, a fim de (vi) obter anticorpo purificado.
[00349] Os anticorpos anti-IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF- trap) podem ser produzidos por expressão em um sistema hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado, caracterizado por produzir uma molécula de anticorpo farmacologicamente aceitável. Exemplos de células eucarióticas são células de mamíferos, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip e HepG2. Outros sistemas de expressão adequados são procarióticos (por exemplo, E. coli com sistema de expressão pET/BL21), leveduras (sistemas Saccharomyces cerevisiae e/ou Pichia pastoris) e células de insetos.
[00350] Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a preparação dos anticorpos (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) descritos aqui e são selecionados a partir de vetores de expressão eucariótica e procariótica. Exemplos de vetores para expressão procariótica incluem plasmídeos tais como, sem limitação, preset, pet e pad, em que os promotores usados em vetores de expressão procarióticos incluem um ou mais de, e sem limitação, lac, trc, trp, recA ou araBAD. Exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em leveduras, vetores tais como, esem limitação, pAO, pPIC, pYES, ou pMET, usando promotores tais como, e sem limitação, AOX1, GAP, GAL1, ou AUG1; (ii) para expressão em células de insetos, vetores tais como e sem limitação, pMT, pAc5, pIB, pMIB ou pBAC, usando promotores tais como e sem limitação PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 ou po1h, e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores tais como, e sem limitação, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 ou pBPV, e vetores derivados de, em um aspecto, sistemas virais tais como e sem limitação vírus de vaccinia, vírus adeno- associados, vírus da herpes, ou retrovírus, usando promotores tais como e sem limitação CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e beta-actina.
[00351] Em algumas modalidades, há pelo menos um polímero por proteína. Em algumas modalidades, a proporção de proteína para polímero é 1:4 a 1:6. Em algumas modalidades, a relação de proteína (Ab) para polímero é razão molar de 1:5. Em algumas modalidades, a quantidade de proteína é 5, 4, 3, 2, ou cerca de 2,4 mg/ml.
[00352] Em algumas modalidades, a purificação que segue a combinação do polímero e do anticorpo compreende ainda uma coluna de troca catiônica.
[00353] Em algumas modalidades, a presença do polímero anexado aos anticorpos antagonistas de IL-6 e/ou
IL-6 Ab VEGF-traps pode proporcionar uma potência mais profunda devido à presença do próprio polímero. Em algumas modalidades, a presença do polímero, quando usada em combinação com um domínio de ligação de heparina, (tal como em VEGF) resulta em uma molécula conjugada com potência mais profunda. Em algumas modalidades, conforme mostrado nos dados de HUVECs fornecidos nos exemplos abaixo, a molécula é superior em angiogênese. Em algumas modalidades, esta é uma diferença na natureza da molécula conjugada, não simplesmente uma diferença em grau (por exemplo, comparando o conjugado às moléculas não conjugadas). Além disso, conforme mostrado nos ensaios de proliferação de HUVEC nos exemplos abaixo, em algumas modalidades, a presença do polímero proporciona inibição sinérgica.
[00354] Além disso, em algumas modalidades, à medida que as densidades de células são aumentadas (por exemplo, de
4.000 a 6.000), a potência do conjugado também pode melhorar.
[00355] Em algumas modalidades, a quantidade (em peso de proteína) do conjugado usado é maior do que 50 mg/ml.
Pode ser, por exemplo, 55, 60, 65, 70 ou mais mg/ml (em peso de proteína de pré-conjugação).
Método de Conjugação de Proteínas a Polímeros
[00356] Em algumas modalidades, é apresentado um método para a preparação de um conjugado de proteína terapêutica-porção de extensão de meia-vida que tem a etapa de conjugar uma proteína terapêutica que tem um resíduo de cisteína adicionado através da tecnologia de DNA recombinante a uma porção de extensão de meia-vida tendo um grupo de reação de sulfidrila específico selecionado do grupo consistindo em maleimida, vinilsulfonas, dissulfetos de ortopiridil, e iodoacetamidas para fornecer o conjugado de proteína terapêutica-porção de extensão de meia-vida.
[00357] Em algumas modalidades, é fornecido um método de preparação do conjugado de anticorpo (e/ou IL-6 Ab-VEGF- trap). Conforme mostrado na Figura 10, o método compreende a redução da proteína com um excesso molar de 30x do agente redutor TCEP (Figura 10). Após a redução, o anticorpo é oxidado para produzir um anticorpo decapeado onde as ligações de dissulfeto de cadeia inter- e intra- leve e pesada que ocorrem naturalmente no anticorpo são formadas, mas a Cisteína engenheirada na posição de cadeia pesada L443C (numeração EU) permanece a ser decapeada (Figura 10). O anticorpo é então conjugado por adição de um excipiente e adição de um excesso molar de 2-10x de um biopolímero de maleimida. (Figura 10). O biopolímero é ligado ao anticorpo através de uma ligação covalente tiol-éter (Figura 10). Após a conjugação, o conjugado de anticorpo é purificado com anticorpo não conjugado e polímero removido (Figura 10). Em modalidades nas quais a proteína é Ab-trap, a mesma posição no anticorpo pode ser usada e a mesma abordagem empregada.
[00358] A proteína e o processo descritos acima podem ser variados também. Assim, em algumas modalidades, é fornecido um processo para a preparação de uma proteína conjugada (que não precisa ser anticorpo ou anticorpo anti- IL-6). O processo inclui a redução de uma ou mais cisteínas em uma proteína para formar uma proteína decapeada em uma solução. Após a redução de uma ou mais cisteínas, a proteína decapeada é reoxidada para restaurar pelo menos uma ligação de dissulfeto na proteína reduzida, enquanto se garante que um resíduo de cisteína engenheirado na proteína permaneça em forma de tiol livre para formar uma proteína decapeada reoxidada na solução. Pelo menos um excipiente é então adicionado à solução. O excipiente reduz a precipitação de proteína induzida por polímero. Depois que o excipiente é adicionado, adiciona-se um polímero à solução, que é conjugado à proteína decapeada reoxidada no resíduo de cisteína engenheirada para formar uma proteína conjugada.
[00359] Em algumas modalidades, o excesso molar do agente redutor pode ser alterado em qualquer quantidade que funcione. Em algumas modalidades 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90x em excesso molar do agente redutor (que não precisa ser TCEP em todas as modalidades) pode ser empregado. Em algumas modalidades, o agente redutor pode ser 3,3',3''- fosfinatriiltris(benzeno-l-sulfonato) trissódico (TPPTS).
Em algumas modalidades, qualquer anticorpo (terapêutico ou de outro modo) pode ser empregado. Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15x em excesso molar de um biopolímero de maleimida pode ser empregado. Em algumas modalidades, existe um excesso de proteína decapeada para polímero. Em algumas modalidades, a quantidade da proteína reduzida é menor do que a quantidade do polímero.
Em algumas modalidades, a quantidade da proteína reduzida é de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% da quantidade do polímero. Em algumas modalidades, 10-15 vezes do polímero é usado como proteína. Em algumas modalidades, a quantidade do anticorpo reduzido é maior do que a quantidade do polímero. Em algumas modalidades, a quantidade do polímero é maior do que a quantidade do anticorpo reduzido (e/ou da IL-6 Ab-VEGF-trap).
[00360] Em algumas modalidades, a etapa de purificação é opcional.
[00361] Em algumas modalidades, o método de produção de um conjugado de anticorpo (e/ou Ab-trap) compreende a conjugação de um anticorpo anti-IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF- trap) a um polímero contendo fosforilcolina. Em algumas modalidades, o método compreende as etapas de conjugar um anticorpo anti-IL-6 a um polímero contendo fosforilcolina.
O anticorpo anti-IL-6 compreende um resíduo amino adicionado via tecnologia de DNA recombinante. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido adicionado é um resíduo de cisteína.
Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína é adicionado fora de uma região variável do anticorpo. O resíduo cisteína pode ser adicionado à cadeia pesada ou à cadeia leve do anticorpo.
[00362] Em algumas modalidades, o polímero compreende ou consiste em um polímero contendo fosforilcolina. Em algumas modalidades, o polímero contendo fosforilcolina compreende um grupo de reação específico de sulfidrila selecionado a partir do grupo que consiste em uma maleimida, uma vinilsulfona, um ortopiridil-dissulfeto, e uma iodoacetamida. Em algumas modalidades, o grupo de reação específico de sulfidrila sobre o polímero contendo fosforilcolina reage com o resíduo de cisteína no anticorpo anti-IL-6 para produzir o conjugado de anticorpo (e/ou IL-6 Ab VEGF-trap).
[00363] Em algumas modalidades, a proteína a ser conjugada pode ser um anticorpo, uma fusão de proteína de anticorpo (por exemplo, IL-6 Ab-VEGF-trap), ou um fragmento de ligação do mesmo. Em algumas modalidades, a proteína não é um anticorpo, mas é uma enzima, um ligante, um receptor ou outra proteína ou mutantes ou suas variantes. Em algumas modalidades, a proteína nativa contém pelo menos uma ligação dissulfeto e pelo menos uma cisteína não nativa.
[00364] Em algumas modalidades, o excipiente pode ser um ácido ou uma base. Em algumas modalidades, o excipiente é um detergente, um açúcar, ou um aminoácido carregado. Em algumas modalidades, o excipiente ajuda a manter a proteína em solução durante a conjugação do polímero. Em algumas modalidades, o excipiente é adicionado à solução contendo a proteína, antes da adição do polímero à solução que contém a proteína.
[00365] Em algumas modalidades, a reação ocorre sob condições aquosas entre cerca de pH 5 a cerca de pH 9. Em algumas modalidades, a reação ocorre entre 6,0 e 8,5, entre 6,5 e 8,0 ou entre 7,0 e 7,5.
[00366] Em algumas modalidades, o polímero é conjugado à proteína a 2-37 graus Celsius. Em algumas modalidades, a conjugação ocorre a 0-40 graus Celsius, 5-35 graus Celsius, 10-30 graus Celsius, e 15-25 graus Celsius.
[00367] Em algumas modalidades, as proteínas conjugadas descritas aqui podem ser contatadas com um meio de troca iônica ou cromatografia de interação hidrofóbica ou meio de cromatografia por afinidade para purificação (para remover o conjugado do não conjugado). Em algumas modalidades, o meio de troca de íons, cromatografia de interação hidrofóbica, e/ou meio de cromatografia por afinidade separa a proteína conjugada do polímero livre não conjugado e da proteína decapeada reoxidada não conjugada.
[00368] Em algumas modalidades, os processos descritos aqui e delineados na Figura 10 envolvem um excipiente que é capaz de facilitar e/ou manter um sistema de solubilidade. Em algumas modalidades, o processo permite que a solução mantenha a solubilidade dos dois componentes destinados a interagir. Isto pode incluir a solubilidade da proteína e do polímero e então o conjugado final também. Em algumas modalidades, sem a abordagem de excipiente, o problema pode ser o fato de que enquanto a proteína é solúvel, quando o biopolímero é adicionado, a solubilidade da solução (por exemplo, proteína) diminui e ela cai/precipita da solução. Obviamente, quando a proteína precipita, ela não está disponível para conjugar-se eficientemente com o biopolímero. Assim, um excipiente pode ser empregado para manter a solubilidade da proteína na presença do biopolímero, de modo que os dois podem se acoplar para formar o conjugado de proteína (ou como representado na Figura 10, um conjugado de anticorpo). Isto também permite que a solubilidade do conjugado seja mantida.
[00369] Em algumas modalidades, os polímeros aqui descritos podem compreender um ou mais dos seguintes: um zwiteríon, uma fosforilcolina, ou um ligante PEG fazendo ponte com um centro de um ponto de ramificação de polímero para o grupo funcional de maleimida. Em algumas modalidades, qualquer um dos polímeros aqui providos pode ser adicionado a uma proteína através dos métodos aqui fornecidos.
[00370] Em algumas modalidades, qualquer uma das proteínas fornecidas aqui pode ser conjugada a qualquer um dos polímeros fornecidos aqui através de um ou mais dos métodos aqui fornecidos.
[00371] Em algumas modalidades, o(s) processo(s) fornecido(s) aqui permite(m) o processamento em escala maior para produzir e purificar conjugados de proteína e/ou de anticorpo. Em algumas modalidades, o volume empregado é de pelo menos 1 litro, por exemplo, 1, 10, 100, 1.000, 5.000,
10.000, litros ou mais. Em algumas modalidades, a quantidade do conjugado de anticorpo produzido e/ou purificado pode ser de 0,1, 1, 10, 100, 1000 ou mais gramas.
[00372] Em algumas modalidades, a proteína terapêutica pode ser qualquer dos anticorpos anti-IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-traps) descritas aqui tendo um resíduo de cisteína adicionado via tecnologia de DNA recombinante. Em algumas modalidades, a cadeia pesada de anticorpo anti-IL-6 tem as seguintes CDRs: CDRHl: na Tabela 1A, CDRH2: na Tabela 1A, e CDRH3: na Tabela 1A. A cadeia pesada também pode ter arginina (R) na posição 84 (via numeração sequencial). Em algumas modalidades, a cadeia leve de anti-IL-6 tem as seguintes CDRs: CDRL1: na Tabela 1B, CDRL2: na Tabela 1B, e CDRL3: na Tabela 1B.
[00373] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL- 6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) inclui IgG1. Em algumas modalidades, a cadeia pesada tem uma ou mais mutações para modular a função efetora. Em algumas modalidades, as mutações são para uma ou mais das seguintes posições de aminoácidos (numeração EU): E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 e P331. Em algumas modalidades, as mutações são selecionadas do grupo consistindo em: E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S e P331S (numeração EU). Em algumas modalidades, as mutações são (numeração EU) L234A, L235A e G237A.
[00374] Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína adicionado à proteína terapêutica através da tecnologia de DNA recombinante não deve ser envolvido no emparelhamento de ligação de dissulfeto Cys-Cys. A este respeito, as proteínas terapêuticas podem ser diméricas. Assim, por exemplo, um anticorpo anti-IL-6 intacto (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) tem duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Se um resíduo Cys for introduzido na cadeia pesada, por exemplo, o anticorpo intacto terá duas tais cisteínas introduzidas em posições idênticas e a possibilidade existe que estes resíduos de cisteína formarão a ligações de dissulfeto intra-cadeia. Se os resíduos de cisteína introduzidos formam ligações de dissulfeto de Cys-Cys ou têm uma propensão de fazê-lo, o resíduo Cys introduzido não será útil para conjugação. É conhecido na técnica como evitar posições nas cadeias pesada e leve que irão aumentar o pareamento de dissulfeto intra-
cadeia. Veja, por exemplo, pedido de Patente US No.
2015/0158952.
[00375] Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína introduzido via tecnologia de DNA recombinante é selecionado do grupo consistindo em (numeração EU) Q347C e L443C. Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína é L443C (numeração EU). Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo tem a sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 1A e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos na Tabela 1B.
[00376] Em algumas modalidades, o grupo de reação específico de sulfidril é maleimida.
[00377] Em algumas modalidades, a porção de extensão de meia-vida é selecionada a partir do grupo consistindo em polietileno glicol (PEG), PEG ramificado, Polipeg® (Warwick Effect Polymers; Coventry, Reino Unido), ácido polisiálico (PSA), amido, amido de hidroxietila (HES), amido de hidroxialquila (HAS), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosano, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, dextrano, carboximetil- dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, álcool polivinílico (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfazeno, polioxazolina, anidrido ácido de polietileno-co-maleico, anidrido ácido poliestireno-co-maleico, poli(1-
hidroximetietileno hidroximetilformal) (PHF), um polímero zwiteriônico, um polímero contendo fosforilcolina e um polímero compreendendo 2-metacriloilóxi-2',- etiltrimetilamôniofosfato (MPC).
[00378] Em algumas modalidades, a porção de extensão de meia-vida é um polímero zwiteriônico. Em algumas modalidades, o zwiteriônico é fosforilcolina, isto é, um polímero contendo fosforilcolina. Em algumas modalidades, o polímero é composto de unidades de MPC.
[00379] Em algumas modalidades, o polímero de MPC tem três ou mais braços. Em algumas modalidades, o polímero de MPC tem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 braços. Em algumas modalidades, o polímero de MPC tem 3, 6 ou 9 braços.
Em algumas modalidades, o polímero de MPC tem 9 braços. Em algumas modalidades, o polímero é sintetizado com um iniciador compreendendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais sítios de iniciação de polímero.
[00380] Em algumas modalidades, o polímero de MPC tem um peso molecular entre cerca de 300.000 e 1.750.000 Da. Em algumas modalidades, o polímero de MPC tem um peso molecular entre cerca de 500.000 e 1.000.000 Da ou entre cerca de
600.000 a 900.000 Da.
[00381] Em algumas modalidades, o método de preparação de um conjugado de proteína terapêutica-porção de extensão da meia-vida tem uma etapa adicional de contatar a proteína terapêutica com um agente redutor de tiol sob condições que produzem um grupo sulfidrila de cisteína reduzido. Como discutido acima, é preferível que o resíduo de cisteína adicionado através da tecnologia de DNA recombinante não seja disposto em pares, isto é, não esteja envolvido em ligações de dissulfeto de intra-cadeia Cys-Cys ou não esteja substancialmente envolvido em tal ligação.
Entretanto, resíduos Cys que não estão envolvidos em tal ligação de dissulfeto de Cys-Cys e são livres para conjugação são conhecidos por reagir com cisteína livre no meio de cultura para formar adutos de dissulfeto. Veja, por exemplo, WO 2009/052249. Uma cisteína assim derivada não estará disponível para conjugação. Para liberar a cisteína recentemente adicionada do aduto dissulfeto, a proteína após a purificação é tratada com um agente redutor, por exemplo, ditiotreitol. Entretanto, tal tratamento com um agente redutor reduzirá todos os resíduos de cisteína na proteína terapêutica, incluindo cisteínas nativas, muitas das quais estão envolvidas em ligações de dissulfetos de Cys-Cys intra- cadeia. Os dissulfetos Cys-Cys nativos são geralmente cruciais para a estabilidade e a atividade da proteína e devem ser reformados. Em algumas modalidades, todos os dissulfetos nativos (por exemplo, inter e intra) Cys-Cys são reformados.
[00382] Para reformar resíduos de dissulfeto inter e intra-cadeia nativos, após a redução para remover os adutos de dissulfeto de cisteína, a proteína terapêutica é exposta a condições oxidantes e/ou agentes oxidantes por um período de tempo prescrito, por exemplo, durante a noite. Em algumas modalidades, a exposição ao ar ambiente de um dia para o outro pode ser usada para obter a reforma das ligações de dissulfeto nativos. Em algumas modalidades, um agente oxidante é empregado para restaurar os dissulfetos nativos.
Em algumas modalidades, o agente oxidante é selecionado do grupo que consiste em CuSO4 aquoso e ácido desidroascórbico (DHAA). Em algumas modalidades, o agente oxidante é DHAA. Em algumas modalidades, a faixa de DHAA usada está na faixa de 5 a 30 equivalentes. Em algumas modalidades, a faixa é de 10 a 30 equivalentes. Em algumas modalidades, a faixa é de 15 equivalentes.
[00383] Em algumas modalidades, o agente redutor do tiol é selecionado do grupo que consiste em: ácido 3,3', 3''-Fosfanotriiltripropanoico (TCEP), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), boroidreto de sódio (NaBH4), cianoboroidreto de sódio (NaCNBH3), b-mercaptoetanol (BME), cloridrato de cisteína, 3,3',3''-fosfinatriiltris(benzeno- l-sulfonato) trissódico (TPPTS) e cisteína. Em algumas modalidades, o redutor do tiol é TCEP.
[00384] Em algumas modalidades, a concentração do agente redutor do tiol é entre 1 e 100 vezes molar em excesso relativo à concentração da proteína terapêutica. Em algumas modalidades, a concentração do agente redutor do tiol é entre 20 e 50 vezes em excesso molar em relação à concentração da proteína terapêutica. Em algumas modalidades, o redutor do tiol é removido após a incubação com a proteína terapêutica antes da oxidação da proteína terapêutica.
[00385] Em algumas modalidades, o método para conjugar uma proteína terapêutica a uma porção de extensão da meia-vida tem uma etapa adicional de purificação da proteína terapêutica conjugada após conjugação. Em algumas modalidades, o conjugado de proteína terapêutica é purificado usando uma técnica selecionada do grupo consistindo em cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia por afinidade ou suas combinações.
[00386] Em algumas modalidades, o conjugado de proteína terapêutica retém pelo menos 20% de atividade biológica relativa à proteína terapêutica não-conjugada. Em algumas modalidades, o conjugado de proteína terapêutica retém pelo menos 50% de atividade biológica relativa à proteína terapêutica não-conjugada. Em algumas modalidades, o conjugado de proteína terapêutica retém pelo menos 90% de atividade biológica relativa à proteína terapêutica nativa.
[00387] Em algumas modalidades, o conjugado de proteína terapêutica tem uma meia-vida aumentada em relação à proteína terapêutica não-conjugada. Em algumas modalidades, o conjugado de proteína terapêutica tem pelo menos um aumento de 1,5 vezes na meia-vida em relação à proteína terapêutica não-conjugada. Em algumas modalidades, o conjugado de proteína terapêutica tem pelo menos um aumento de 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 vezes em meia-vida em relação à proteína terapêutica não conjugada.
[00388] Em algumas modalidades, o polímero zwiteriônico do método de conjugar uma proteína terapêutica a uma porção de extensão da meia-vida é um monômero polimerizável radicalmente tendo um grupo zwiteriônico e o método tem uma etapa adicional de polimerizar o monômero zwiteriônico polimerizável por radicais livres em um meio de polimerização para fornecer um polímero, o meio compreendendo: o monômero zwiteriônico polimerizável por radicais; um catalisador de metal de transição Mt(q-l)+ em que Mt é um metal de transição, q é um estado de oxidação mais alto do metal e q-1 é um estado de oxidação mais baixo do metal, em que o catalisador metálico é fornecido como um sal da forma Mt(q-l)+X'(q-l) em que X' é um contra-íon ou grupo ou o catalisador de metal de transição é fornecido in situ pela provisão do sal metálico inativo em seu estado de oxidação mais alto Mtq+X'q juntamente com um agente redutor que é capaz de reduzir o metal de transição do estado inativo oxidado para o estado ativo reduzido; um ligante; e um iniciador.
[00389] Para funcionar como um catalisador de metal de transição ATRP, o metal de transição deve ter pelo menos dois estados de oxidação facilmente acessíveis separados por um elétron, um estado de oxidação mais elevado e estado de oxidação mais baixo. Em ATRP, uma reação redox reversível resulta na ciclagem do catalisador de metal de transição entre o estado de oxidação mais alto e o estado de oxidação mais baixo enquanto resulta na ciclagem das cadeias de polímero entre as extremidades da cadeia de propagação e as extremidades da cadeia dormente. Veja, por exemplo, a Patente US No. 893.173.
[00390] Em algumas modalidades, o monômero zwiteriônico radicalmente polimerizável é selecionado a partir do grupo que consiste em Fórmula (18)
Fórmula (19) Fórmula (20), e Fórmula (21) em que R1 é H ou alquila C1-6, ZW é um zwiteríon e n é um número inteiro de 1 a 6.
[00391] Em algumas modalidades, o monômero polimerizável por radicais é
X -O
Y +
N Fórmula (12) em que R1 é H ou alquila C1-6, R2, R3, R4 são iguais ou diferentes e são H ou alquila C1-4 e X e Y são iguais ou diferentes e são inteiros de 1 a 6. Em algumas modalidades, R1, R2, R3 e R4 são cada um metila e X e Y são cada um 2 na fórmula (12).
[00392] Em algumas modalidades, o monômero polimerizável por radicais é
X N
Y Fórmula (13) em que R1 é H ou alquila C1-6, R2 e R3 são iguais ou diferentes e são H ou alquila C1-4, R4 é PO4-, SO3- ou CO2- e X e Y são iguais ou diferentes e são inteiros de 1 a 6. Em algumas modalidades, R1, R2 e R3 são metila, R4 é PO4- e X e Y são cada um 2 na fórmula (13).
[00393] Em algumas modalidades, o monômero é
X Y
N Fórmula (14)
em que R1 é H ou alquila C1-6, R2 e R3 são iguais ou diferentes e são H ou alquila C1-4, R5 é PO4-, SO3- ou CO2- e X e Y são iguais ou diferentes e são inteiros de 1 a 6. Em algumas modalidades, R1, R2, R3 e R4 são metila, R5 é PO4- e X e Y são 2 na fórmula (14).
[00394] Em algumas modalidades, o metal de transição Mt é selecionado do grupo que consiste em Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au e Ag. Em algumas modalidades, o catalisador metálico é fornecido como um sal da forma Mt(q- 1)+X' Mt(q-l)+ é selecionado do grupo consistindo em Cu1+, (q-l).
Fe2+, Ru2+, Cr2+, Mo2+, W2+, Mn3+, Rh3+, Re3+, Co+, V2+, Zn+, Au+ e Ag+ e X' é selecionado do grupo consistindo em halogênio, alcóxi C1-6, (SO4)1/2, (PO4)1/3, (R7PO4)1/2, (R72PO4), triflato, hexaluorofosfato, metanossulfonato, arilsulfonato, CN e R7CO2, onde R7 é H ou um grupo alquila C1-6 linear ou ramificado que pode ser substituído de 1 a 5 vezes com um halogênio. Em algumas modalidades, Mt(q-l)+ é Cu1+ e X' é Br.
[00395] Em algumas modalidades, Mt(q-l)+ é fornecido in situ. Em algumas modalidades, Mtq+Xq é CuBr2. Em algumas modalidades, o agente redutor é um composto inorgânico. Em algumas modalidades, o agente redutor é selecionado do grupo consistindo em um composto de enxofre de um baixo nível de oxidação, sulfito de hidrogênio de sódio, um sal inorgânico compreendendo um íon metálico, um metal, hidrato de hidrazina e derivados de tais compostos. Em algumas modalidades, o agente redutor é um metal. Em algumas modalidades, o agente redutor é Cu0.
[00396] Em algumas modalidades, o agente redutor é um composto orgânico. Em algumas modalidades, o composto orgânico é selecionado do grupo consistindo em alquiltióis, mercaptoetanol, ou compostos carbonila que podem ser facilmente enolizados, ácido ascórbico, acetonato de acetila, ácido canforsulfônico, hidróxi acetona, açúcares redutores, monossacarídeos, glicose, aldeídos e derivados de tais compostos orgânicos.
[00397] Em algumas modalidades, o ligante é selecionado do grupo que consiste em 2,2'-bipiridina, 4,4'- Di-5-nonil-2,2'-bipiridina, 4,4-dinonil-2,2'-dipiridil, 4,4',4"-tris(5-nonil)-2,2':6',2"-terpiridina, N,N,N',N',N"- Pentametildietilenotriamina, 1,1,4,7,10,10- hexametiltrietilenotetramina, tris(2- dimetilaminoetil)amina, N,N-bis(2- Piridilmetil)octadecilamina, N,N,N',N'-tetra[(2- piridal)metil]etilenodiamina, tris[(2-piridil)metil]amina, tris(2-aminoetil)amina, tris(2-bis(3-butóxi-3-oxopropil) aminoetil)amina, tris(2-bis(3-(2-etilexóxi)-3-oxopropil) amino)amina e tris(2-bis(3-dodecóxi-3-oxopropil)aminoetil) amina. Em algumas modalidades, o ligante é 2,2'-bipiridina.
[00398] Em algumas modalidades, o iniciador tem a estrutura:
s Fórmula (22) em que R1 é um grupo reativo nucleofílico, R2 compreende um ligante, e R3 compreende uma porção de iniciador de síntese de polímero que tem a estrutura .
Z Fórmula (23) em que R4 e R5 e são iguais ou diferentes e são selecionados do grupo que consiste em alquila, alquila substituída, alquileno, alcóxi, carboxialquila, haloalquila, cicloalquila, éter alquílico cíclico, alquenila, alquenileno, alquinila, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquila, heterocicloalquileno, arila, arileno, arileno-óxi, heteroarila, amino, amido ou qualquer combinação dos mesmos; Z é um halogênio ou CN; e s é um número inteiro entre 1 e 20.
[00399] Em algumas modalidades, Z na fórmula (23) é Br e R4 e R5 são cada um metila. Em algumas modalidades, R1 na fórmula (22) é selecionado do grupo consistindo em NH2-, OH-, e SH-.
[00400] Em algumas modalidades R2 na fórmula (22) é alquila, alquila substituída, alquileno, alcóxi, carboxialquila, haloalquila, cicloalquila, éter alquílico cíclico, alquenila, alquenileno, alquinila, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquila, heterocicloalquileno, arila, arileno, arileno-óxi, heteroarila, amino, amido ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, R2 na fórmula (22) é . .
X Fórmula (24) em que X e Y são iguais ou diferentes e são números inteiros de 1 a 20. Em algumas modalidades, X e Y são, cada um, 4.
[00401] Em algumas modalidades, R3 na fórmula (22) é Fórmula (25) em que R6, R7 e R8 são iguais ou diferentes e são selecionados do grupo que consiste em
Z Fórmula (26)
Z
Z Fórmula (27), e
Z Z
Z Fórmula (28) em que Z é NCS, F, Cl, Br ou I. Em algumas modalidades, Z Na fórmula (26), fórmula (27) e/ou fórmula (28) é Br e R6, R7 e R8 na fórmula (28) são cada um
Z Z
Z Fórmula (29)
[00402] Em algumas modalidades, o iniciador tem a estrutura:
Z Z Z Z Z A B Z Z Z Z
Fórmula (30) em que A e B são iguais ou diferentes e são inteiros de 2 a 12 e Z é qualquer haleto, por exemplo, Br. Em algumas modalidades, A e B são, cada um, 4 na fórmula (30).
[00403] Em algumas modalidades, o método ainda tem a etapa de reagir o polímero com um reagente de maleimida para fornecer um polímero com uma maleimida terminal. Em algumas modalidades, o composto de maleimida é Fórmula (31)
[00404] Uma modificação ou mutação pode também ser feita em uma região de estrutura ou região constante para aumentar a meia-vida de um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap). Vide, por exemplo, a publicação PCT No. WO 00/09560. Uma mutação em uma região de estrutura ou região constante pode também ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio para ligação covalente ou não covalente a outra molécula, ou para alterar tais propriedades como fixação de complemento, ligação de FcR e citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos. Em algumas modalidades, não mais do que uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro da região de estrutura ou região constante.
Em outras modalidades, não mais do que uma a três substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro da região de estrutura ou região constante. De acordo com a invenção, um único anticorpo pode ter mutações em qualquer uma ou mais das CDRs ou regiões estruturais do domínio variável ou na região constante.
[00405] As modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não-glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-traducionais, tais como, por exemplo, glicosilação com diferentes açúcares, acetilação e fosforilação. Anticorpos são glicosilados em posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright e Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). As cadeias laterais de oligossacarídeo das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe e Howard, 1990, Biochem. 29: 4175-4180) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína, que pode afetar a conformação e a superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Jefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, 1996, Current Opin.
Biotech. 7:409-416). Os oligossacarídeos também podem servir para direcionar uma dada glicoproteína para certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. A glicosilação de anticorpos também foi relatada como afetando a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). Em particular, anticorpos produzidos por células de CHO com expressão regulada por tetraciclina de β(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GlcNAc, foi relatada como tendo atividade de ADCC melhorada (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).
[00406] A Glicosilação de anticorpos é tipicamente N- ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina.
As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a fixação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possa ser usada.
[00407] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo (e/ou Ab-trap) é convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo que contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeos acima descritas (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligados).
[00408] O padrão de glicosilação de anticorpos (e/ou Ab-trap) também pode ser alterado sem alterar a sequência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação depende grandemente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Uma vez que o tipo de célula usado para a expressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como terapêutica potencial é raramente a célula nativa, variações no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (ver, por exemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 9062-9070).
[00409] Além da escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos (e/ou Ab-trap) incluem modo de crescimento, formulação de meios, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e semelhantes.
Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação obtido em um organismo hospedeiro particular, incluindo a introdução ou superexpressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacáridos (patente U.S. Nos.
5.047.335 ; 5.510.261 e 5.278.299). Glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, pode ser enzimaticamente removida da glicoproteína, por exemplo, usando endoglicosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endoglicosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser modificada geneticamente para ser defeituosa no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estas e técnicas similares são bem conhecidas na arte da técnica.
[00410] Algumas modalidades aqui fornecidas podem ser empregadas como uma terapêutica para doenças da retina inflamatórias e/ou doenças vesiculares da retina com um componente de inflamação. Além da angiogênese, inflamação tem sido implicada na patogênese destas doenças retinais.
Terapias anti-inflamatórias, tais como esteroides, têm sido eficazes no tratamento de uveíte (um espectro de doenças com inflamação intraocular como característica de definição) e edema macular diabético (DME). Similarmente, polimorfismos geneticamente hereditários em IL-6 foram associados com maior incidência de PDR em pacientes com diabetes tipo 2.
Além disso, a progressão da doença em AMD, DR e RVO foi relatada como estando associada com níveis aumentados de soro e/ou oculares de IL-6. Adicionalmente, células inflamatórias crônicas foram observadas sobre a superfície da membrana de Bruch em olhos com AMD neovascular. A IL-6 foi implicada em resistência a tratamentos anti-VEGF em pacientes com DME. Acredita-se que este em parte é um resultado indireto da suprarregulação mediada por IL-6 da expressão de VEGF [referência] assim como funções angiogênicas dependentes de VEGF mais diretas mediadas por sinalização de IL-6 que ocorre na presença de inibidores de VEGF. Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais destas condições pode ser tratada e/ou prevenida por uma ou mais das composições fornecidas aqui.
[00411] A Figura 11 ilustra algumas modalidades de um construto de um bioconjugado, que é uma fusão trap-anticorpo (TAF) de VEGF-trap (VEGFRl/2) e anticorpo Anti-IL-6 conjugado com biopolímero à base de fosforilcolina. Em algumas modalidades, o bioconjugado anti-VEGF/anti-IL-6 pode ter um peso molecular de 1,0 MDa, com uma dose clínica de 6,0 mg. Em algumas modalidades, a dose molar equivalente da porção anti-VEGF no bioconjugado pode ser de 6 vezes aquela da dose clinica de Ranizumabe, enquanto a meia-vida ocular pode ser de 3 a 5 vezes daquela de Ranibizumabe. CH representa pesada constante, CL representa leve constante, Fab representa fragmento de ligação de antigêno, Fc representa fragmento cristalizável, VEGFR representa o receptor do fator de crescimento endotelial vascular, VH representa pesada variável, VL representa leve variável, e * são regiões CDR. Valores equivalentes são apresentados como mudanças de dobra em relação ao Ranibizumabe.
[00412] Vários arranjos de sequência do anticorpo anti-IL-6/VEGF-trap (VEGFRl/2) podem ser empregados ou providos em diferentes disposições. A Figura 21 ilustra algumas modalidades de possíveis sequências de região variável de cadeia pesada anti-IL-6. As CDRs estão sublinhadas.
[00413] Com base nos resultados com as variantes de VEGF-trap e parátopos Anti-IL-6 melhorados, 216 moléculas em duas conFigurações diferentes foram projetadas e preparadas que compreenderam combinações de sequências conforme exibido nas Figuras 19, 20, 21, 22 e 23. Para a primeira conFiguração (VEGFR-Anti-IL-6) de VEGF-trap, conforme mostrado pelas sequências 1A-1D da Figura 19, é posicionado no início da proteína, seguido por uma repetição dupla de um ligante Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (GS), conforme mostrado pela sequência 2A da Figura 20, que conecta o trap ao N-terminal da cadeia pesada de anti-IL-6, conforme mostrado pelas sequências 3A-3I da Figura 21. Estes construtos podem ser emparelhados com cadeias leves listadas como sequências 4A-4C da Figura 22.
Em algumas modalidades, o VEGF-trap (da Figura 19) pode ser combinado com qualquer uma das cadeias leves anti-IL-6 e/ou cadeias pesadas mostradas em qualquer uma das Figuras ou tabelas fornecidas aqui.
[00414] Em algumas modalidades, qualquer uma das variantes de VEGF-trap aqui providas pode ser emparelhada com qualquer uma de: as sequências de cadeia pesada e leve de anticorpos de IL-6 providos aqui, e pode ser adicionalmente modificada por qualquer um dos polímeros fornecidos aqui. Em algumas modalidades, qualquer uma das variantes de VEGF-trap aqui providas pode ser emparelhada com qualquer uma de: as sequências variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos de IL-6 providos aqui, e podem ser adicionalmente modificadas por qualquer um dos polímeros fornecidos aqui. Em algumas modalidades, qualquer uma das variantes de VEGF-trap aqui providas pode ser emparelhada com qualquer uma de: CDRs 3 de cadeias pesada e leve (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3) de anticorpos IL-6 providos aqui, e podem ser adicionalmente modificadas por qualquer um dos polímeros fornecidos aqui. Em algumas modalidades, a fusão de IL-6-VEGF-trap compreende os componentes na Figura 27.
[00415] Em algumas modalidades, a sequência de anti- IL-6-VEGF-trap (ou inibidor duplo, proteína de fusão, ou conjugado do mesmo) inclui a SEQ ID NO: 169 como a cadeia leve, SEQ ID NO: 170 como a cadeia pesada fundida ao VEGFR- trap, através de um ligante. Em algumas modalidades, a sequência de anti-IL-6-VEGF-trap (ou inibidor duplo, ou proteína de fusão ou conjugado do mesmo) é pelo menos 80% idêntica a uma molécula compreendendo a SEQ ID NO: 169 e 170, incluindo, por exemplo, pelo menos 85, 90, 95, 96, 97,
98, 99, ou maior identidade com a combinação de SEQ ID NO:
170 e 169. Em algumas modalidades, a sequência de anti-IL-
6-VEGF-trap (ou seu conjugado) é pelo menos 80% idêntica a uma molécula compreendendo a SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80%
idêntica à molécula compreendendo a SEQ ID NO: 170,
incluindo, por exemplo, pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98,
99% ou maior identidade com a SEQ ID NO: 170 e pelo menos
85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% ou maior identidade a 169. Em algumas modalidades, as CDRs permanecem como descritas em qualquer uma das CDRs fornecidas aqui para um anticorpo anti-
IL-6 (incluindo aqueles em SEQ ID NO: 170 e 169), enquanto o restante das sequências (cadeia pesada e leve, regiões variáveis pesada e leve, e/ou sequências de fusão completas
(tais como SEQ ID NO 169 e 170) podem variar de modo que a sequência completa seja pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97,
98, 99 ou maior identidade com a sequência original.
Em algumas modalidades, as CDRs podem variar de 1, 2 ou 3 alterações conservativas, enquanto o restante das sequências
(cadeia pesada e leve, regiões pesada e leve, e/ou sequências de fusão completas (tal como SEQ ID NO 169 e 170) são permitidas variar de modo que a sequência completa seja pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais para a sequência original.
Em algumas modalidades, a sequência trap (que é mostrada em cinza na Figura 27, ou na Figura 19) pode reter pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou maior percentual de identidade, e as CDRs podem variar por 1, 2 ou 3 alterações conservativas, enquanto o restante das sequências (cadeia pesada e leve, regiões variáveis pesada e leve, e/ou sequências de fusão completas (tal como a SEQ ID NO 169 e 170) podem variar de modo que a sequência total seja pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou maior identidade com a sequência original.
[00416] Em algumas modalidades, a proteína de fusão (ou inibidor duplo) ou conjugado do mesmo compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 das CDRs fornecidas aqui. Em algumas modalidades, a proteína de fusão ou seu conjugado inclui pelo menos SEQ ID NOs: 49, 50 e 51 (ou uma variante com 1, 2 ou 3 substituições conservativas). Em algumas modalidades, a proteína de fusão (ou inibidor duplo) ou seu conjugado inclui pelo menos SEQ ID NOs: 172, 173 e 174 (ou uma variante com 1, 2 ou 3 substituições conservativas). Em algumas modalidades, a proteína de fusão ou seu conjugado inclui pelo menos SEQ ID NOs: 49, 50 e 51 (ou uma variante com 1, 2 ou 3 substituições conservativas) e pelo menos SEQ ID NOs: 172, 173 e 174 (ou uma variante com 1, 2 ou 3 substituições conservativas). Em algumas modalidades, estas 6 CDRs (ou suas variantes) estão contidas dentro de uma região de estrutura de anticorpo humano. Em algumas modalidades, as CDRs estão dentro da região de estrutura de qualquer um dos anticorpos aqui fornecidos, ou suas variantes que são pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais por cento de identidade das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve fornecidas aqui, incluindo, sem limitação, aquelas nas tabelas 1A para a cadeia pesada e 1B para a cadeia leve. Em algumas modalidades, a proteína de fusão (ou inibidor duplo) ou seu conjugado inclui pelo menos SEQ ID NOs: 49, 50 e 51 (ou uma variante com 1, 2 ou 3 substituições conservativas) e pelo menos SEQ ID NOs: 172, 173 e 174 (ou uma variante com 1, 2 ou 3 substituições conservativas) e estas CDRs (incluindo as variantes) são substituídas pelas CDRs dentro de uma ou mais das sequências na tabela 1D, ou dentro de uma variante dentro da tabela 1D (onde, com relação às CDRs na tabela 1D, a sequência restante é pelo menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 ou maior percentual de identidade com a seção contendo cadeia pesada e a seção de cadeia leve na tabela 1D). Assim, em algumas modalidades, estas 6 CDRs (e suas variantes) podem ser substituídas não somente para as CDRs das sequências indicadas na Tabela 1, mas também para suas variantes. Em algumas modalidades, as CDRs fornecidas na tabela 1E (incluindo 1A1, 1E2 e 1E3) são excluídas como opções dentro das variantes de CDRs possíveis.
Em algumas modalidades, o anticorpo (incluindo seus fragmentos) é um que é pelo menos 80% idêntico a um anticorpo que tem as regiões variáveis de cadeia pesada e leve descritas na Figura 27, enquanto mantém as CDRs específicas na Figura 27 (assim não há variação dentro da seção CDR nesta modalidade).
[00417] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista de IL-6 isolado. Pode compreender uma região variável de aminoácidos de cadeia pesada que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 7-13, 19-27, 89, 90, 256-262; e uma região variável de aminoácidos de cadeia leve que compreende a cadeia leve que tem uma sequência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 91-93, 28-30.
[00418] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista de IL-6 isolado que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo 3 regiões determinantes de complementaridade: VH (CDR1), VH CDR2, e VH CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos das CDRs listadas em SEQ ID NO: 256; e uma região variável de cadeia Leve (VL) compreendendo um VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de CDRs listadas em SEQ ID NO: 91-93.
[00419] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6. O anticorpo compreende pelo menos uma das seguintes mutações baseadas em numeração EU: L234A, L235A e G237A.
[00420] Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6, o anticorpo compreendendo: uma CDRH1 que é uma CDRH1 na SEQ ID NO: 172; uma CDRH2 que é uma CDRH2 na SEQ ID NO: 173; uma CDRH3 que é uma CDRH3 na SEQ ID NO: 174: uma CDRL1 que é uma CDRL1 na SEQ ID NO: 199; uma CDRL2 que é uma CDRL2 na SEQ ID NO: 200; uma CDRL3 que é uma CDRL3 na SEQ ID NO: 201; pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): L234A, L235A e G237A; e pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): Q347C ou L443C.
[00421] Em algumas modalidades, o inibidor duplo VEGFR-anti-IL-6 compreende uma região variável de cadeia pesada anti-L-6 selecionada a partir de SEQ ID NO: 7-13, 89, 90 e/ou 256-262.
[00422] Em algumas modalidades, o inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6 tem uma sequência de VEGF-trap selecionada de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 145, 15, 16 ou 17.
[00423] Em algumas modalidades, a sequência de ligação é a SEQ ID NO: 18.
[00424] Em algumas modalidades, a sequência de cadeia pesada para as moléculas Anti-IL-6 é selecionada de pelo menos uma das SEQ ID NOs 19-27 ou inclui pelo menos a sequência em uma das SEQ ID NOs: 89, 90, 256-262.
[00425] Em algumas modalidades, a sequência de cadeia leve para a molécula anti-IL-6 compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs de cadeia leve de pelo menos uma das SEQ ID NOs 76-
84.
[00426] Em algumas modalidades, a sequência de cadeia pesada para a molécula Anti-IL-6 compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs de cadeia pesada de pelo menos uma das SEQ ID NOs 49-75.
[00427] Em algumas modalidades, o inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6 compreende uma sequência VEGFR-Fc de pelo menos uma das SEQ ID NOs 85-88.
[00428] Em algumas modalidades, o inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6 compreende uma ou mais das sequências em qualquer uma ou mais das SEQ ID Nos. 7-13, 145, 15-17, 18-
84.
[00429] Em algumas modalidades, o inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6 compreende uma VH de IL-6; uma VL de IL-6; um Fc de IL-6; um VEGF-trap; e um ligante. Em algumas modalidades, a VH de IL-6 compreende uma sequência de uma sequência VH de IL-6 em qualquer uma das SEQ ID Nos 19-27, 31-39, 89, 90 ou 256-262. Em algumas modalidades, a VL de IL-6 compreende uma sequência de uma sequência de VL de IL- 6 em qualquer uma das SEQ ID nos 28-30 ou 91-93. Em algumas modalidades, o Fc compreende uma sequência de uma sequência Fc em qualquer uma das SEQ ID Nos 40-48. Em algumas modalidades, o VEGF-trap compreende uma sequência de uma sequência de VEGF-trap em qualquer uma das SEQ ID NOs: 145, 15, 16 ou 17.
[00430] Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína de fusão que compreende VH de IL-6; VL de IL-6; Fc de IL-6; e um VEGF-trap, em que a proteína de fusão altera a proliferação de HUVEC. Em algumas modalidades, a alteração da proliferação de HUVEC é a inibição da proliferação mediada por VEGF/IL6.
[00431] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreendendo uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 263 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 117 é provida. A proteína de fusão é também conjugada a um polímero. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é pelo menos 90% indêntica a SEQ ID NO: 263 e pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 117. Eem algumas modalidades, a proteína compreende pelo menos a) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 e 201, ou b) uma substituição de 1, 2 ou 3 aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 e/ou 201, em que a substituição é uma substituição conservativa.
[00432] Em algumas modalidades, qualquer um dos construtos fornecidos aqui pode incluir uma ou mais mutações nas posições 94 e/ou 95 da sequência VEGFR. Em algumas modalidades, a(s) mutação(ões) pode(m) ser T94I e H95I. Em algumas modalidades, isto reduz qualquer clivagem da proteína VEGFR (como detalhado nos exemplos abaixo).
[00433] Em algumas modalidades, (onde Anti-IL-6-VEGFR é a orientação), os domínios variáveis e constantes da cadeia pesada, ilustrados por Cadeia pesada - Fab, sequências 5A - 5I da Figura 23, são conectados ao VEGF-trap, ilustrado pelas sequências 1A-1D da Figura 19, através do ligante GS, ilustrado pela sequência 2A da Figura 20, e então o domínio Fc, ilustrado por Cadeia pesada - Fc, sequências 5A -5I da Figura 23, é fundido à extremidade C-terminal do VEGF-trap.
Assim, o VEGF-trap é prensado entre as regiões Fab e Fc de anticorpo. Em algumas modalidades, estes construtos podem ser emparelhados com cadeias leves listadas nas sequências 4A-4C da Figura 22.
[00434] A Figura 19 ilustra algumas modalidades de sequências de VEGF-trap. A variação entre as sequências está sublinhada e realçada em negrito. Em algumas modalidades, qualquer um dos construtos de fusão aqui providos pode incluir qualquer uma das variações destacadas e em negrito providas aqui, ou qualquer uma das Figuras no presente relatório descritivo.
[00435] A Figura 20 ilustra algumas modalidades de uma sequência de ligação dupla Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GS). Em algumas modalidades, mais de uma unidade de sequência pode ser empregada (por exemplo, duas, para uma repetição dupla, três ou mais podem ser empregadas). Em algumas modalidades, outras sequências ligantes podem ser empregadas. Em algumas modalidades, sequências ligantes alternativas podem ser empregadas.
[00436] A Figura 21 ilustra sequências de cadeia pesada para algumas modalidades de moléculas anti-IL-6. As CDRs são sublinhadas. Em algumas modalidades, qualquer uma das sequências aqui pode ser usada no lugar de outras sequências de cadeia pesada que são parte de construtos de fusão no presente relatório descritivo.
[00437] A Figura 22 ilustra algumas modalidades de sequências de cadeia leve para moléculas Anti-IL-6. As CDRs são sublinhadas. Em algumas modalidades, qualquer uma das sequências aqui pode ser usada no lugar de outras sequências de cadeia leve que são parte dos construtos de fusão no presente relatório descritivo.
[00438] A Figura 23 ilustra algumas modalidades de sequências de cadeia pesada (separadas em Fab e Fc) para moléculas Anti-IL-6. As CDRs são sublinhadas. Em algumas modalidades, qualquer uma das sequências aqui pode ser usada no lugar de outras sequências de cadeia pesada que são parte de construtos de fusão no presente relatório descritivo.
[00439] As Figuras 24A-24B ilustram as combinações de CDRs das Figuras 21-23. A Figura 24A ilustra as sequências de CDR de cadeia pesada conforme definidas nas Figuras 21 e
23. A Figura 24B ilustra as sequências de CDR de cadeia Leve conforme definidas na Figura 22. Em algumas modalidades, ao invés de toda a região variável de cadeia pesada e/ou pesada sendo usada em um construto, apenas as CDRs de uma ou mais das Figuras fornecidas aqui podem ser empregadas.
[00440] Em algumas modalidades, a fusão trap VEGFR- Fc é parte de uma estrutura engenheirada de IgG1. Além dos construtos de VEGFR-anti-IL-6 e anti-IL-6-VEGFR, uma molécula anti-VEGF (VEGFR-Fc) compreendendo o VEGF-trap com variantes resistentes à clivagem, como descrito acima, e um domínio de IgG1 Fc engenheirado, conforme ilustrado pelas sequências 6A-6D da Figura 25, podem ser providos. O domínio Fc para estas moléculas pode conter substituições L234A, L235A e G237A que minimizam a função efetora, e L443C que permite a conjugação específica ao sítio com um biopolímero baseado em fosforilcolina de extensão da meia-vida (posições de resíduo seguem a numeração EU). A Figura 25 ilustra algumas modalidades de variantes de sequência VEGFR-Fc. A variação das sequências está sublinhada e realçada em negrito. Observa-se que estas variações e/ou combinações podem fornecer um bioterapêutico que é ainda superior a e/ou uma alternativa para outros compostos atualmente usados em terapia.
[00441] Como mostrado nas Figuras 26A-26C, VEGFR-Fc e Eylea se ligam com afinidade similar ao VEGF. A Figura 26A ilustra os ensaios Biacore de VEGFR-Fc. A Figura 26B ilustra os ensaios Biacore de Eylea. A Figura 26C ilustra os resultados experimentais (Ka, kd, KD e Rmax) de VEGFR-Fc e Eylea.
[00442] Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais das sequências para a sequência de aminoácidos especificada em qualquer uma ou mais das Figuras 18-23, e 25 pode ser trocada na estrutura correspondente de qualquer uma das outras modalidades fornecidas aqui ou permutadas com qualquer uma das outras sequências fornecidas aqui. Por exemplo, qualquer uma das sequências dentro das Figuras 13C- 13E, 19 ou 25 pode ser usada com qualquer uma das cadeias pesadas de IL-6 das Figuras 18, 21 ou 23, com qualquer um dos ligantes fornecidos aqui (por exemplo, Figura 20), com qualquer das cadeias leves (Figura 22). Em algumas modalidades, o construto é uma conFiguração de VEGFR-Anti- IL-6 e inclui uma combinação de uma das sequências 1A-1D (Figura 19), ligada ao ligante (por exemplo, Figura 20, sequência 2A), ligada a uma sequência de IL-6 de cadeia pesada (por exemplo, Figura 21, sequência 3A ou 3B), ligada a uma sequência de cadeia leve (por exemplo, Figura 22, sequência 4A). Em algumas modalidades, qualquer uma das sequências 1A-1D (Figura 19), pode ser combinada com um ligante (Figura 20), e com uma sequência Anti-IL-6 de cadeia pesada (Figura 21, sequências 3A-3I), e com uma sequência anti-IL-6 de cadeia leve (Figura 22, sequência 4A-4C). Em algumas modalidades, qualquer uma das outras sequências correspondentes para qualquer unidade particular de construto fornecida aqui pode ser trocada para ou no lugar de qualquer uma destas unidades.
[00443] Em algumas modalidades, o inibidor duplo fornece um ou mais resultados sinérgicos. Em algumas modalidades, o inibidor duplo é sinergisticamente melhor do que cada seção administrada como uma monoterapia (por exemplo, uma terapia de IL-6 e uma terapia de VEGF combinada). Em algumas modalidades, o construto combinado de VEGFR-IL-6 fornece um resultado sinérgico, conforme mostrado nos resultados do ensaio de proliferação (por exemplo, onde o inibidor duplo tem um efeito claro sobre a proliferação de HUVEC, um componente importante da angiogênese, enquanto nem a Eylea nem a Anti-IL-6 alcançam qualquer mudança). Assim, em algumas modalidades, é provido um método para controlar a proliferação de HUVEC, por meio do qual emprega-se um construto de VEGFR-Anti-IL-6 como aqui fornecido.
[00444] Em outras modalidades, o construto de fusão proporciona, simplesmente, um benefício aditivo ao se alcançar ambos resultados de VEGF-trap e resultados de anti- IL-6.
[00445] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos componentes em qualquer uma ou mais das tabelas fornecidas aqui podem ser combinados de modo que seja produzido um construto de VEGFR-anti-IL-6 ou tal que seja produzido um construto anti-IL-6-VEGFR. Em algumas modalidades, o construto também incluirá uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc pode ser uma região Fc humana.
[00446] Em algumas modalidades, as CDRs sozinhas (com ou sem qualquer seção de estrutura específica) podem ser empregadas como a seção de anticorpos. Assim, qualquer uma ou mais (por exemplo, 3 ou 6) das CDRs dentro de cada cadeia ou par de cadeias (pesada e leve) pode ser usada a partir de qualquer uma das tabelas ou Figuras aqui fornecidas, em combinação com qualquer um dos outros componentes (VEGFR e/ou ligantes). CDRs e/ou CDRs de cadeia pesada 1, 2 ou 3 de qualquer um dos construtos de IL-6 fornecidos aqui podem ser combinadas com qualquer uma ou mais das sequências de VEGFR fornecidas aqui. Em algumas modalidades, qualquer região variável de cadeia pesada e/ou leve de qualquer dos construtos de IL-6 providos aqui pode ser combinada com qualquer uma ou mais das sequências de VEGFR fornecidas aqui.
Em algumas modalidades, qualquer um dos ligantes pode ser fornecido no constructo final também.
[00447] Em algumas modalidades, qualquer sequência de ácido nucleico que codifica qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos providas aqui pode ser provida também (por exemplo, em isolamento, dentro de um vetor, ou em uma célula, etc.).
[00448] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos polímeros para conjugação para formar o bioconjugado pode ser combinado com qualquer um dos construtos de VEGFR- IL6 fornecidos aqui.
[00449] Em algumas modalidades, a combinação de VEGFR-anti-IL-6 é a sequência 1A-1D (Figura 19) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3A ou 3B na Figura 21), associada com a cadeia Leve 4A da Figura 22.
[00450] Em algumas modalidades, a combinação VEGFR- anti-IL-6 é a sequência 1A (Figura 19) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3A na Figura 21), associada com a cadeia leve 4A da Figura
22. Em algumas modalidades, a combinação de VEGFR-anti-IL-6 é a sequência 1B (Figura 19) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3A na Figura 21), associada com a cadeia leve 4A da Figura 22. Em algumas modalidades, a combinação de VEGFR-anti-IL-6 é a sequência 1C (Figura 19) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3A na Figura 21), associada com cadeia leve 4A da Figura 22. Em algumas modalidades, a combinação de VEGFR-anti-IL-6 é a sequência 1D (Figura 19) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3A na Figura 21), associada com a cadeia leve 4A da Figura 22.
[00451] Em algumas modalidades, a combinação VEGFR- anti-IL-6 é a sequência 1A (Figura 19) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3B na Figura 21), associada com a cadeia leve 4A da Figura
22. Em algumas modalidades, a combinação de VEGFR-anti-IL-6 é a sequência 1B (Figura) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura), ligada a uma cadeia pesada (3B na Figura), associada com a cadeia leve 4A da Figura 22. Em algumas modalidades, a combinação de VEGFR-anti-IL-6 é a sequência 1C (Figura 19) para o VEGFR, ligado a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3A na Figura 21), associada com cadeia leve 4A da Figura 22. Em algumas modalidades, a combinação VEGFR-anti-IL-6 é a sequência 1D (Figura 19) para o VEGFR, ligada a um ligante (2A na Figura 20), ligada a uma cadeia pesada (3B na Figura 21), associada com a cadeia leve 4A da Figura 22.
[00452] Em algumas modalidades, qualquer uma das sequências de anticorpo de IL-6 pode ser empregada com qualquer uma das sequências de VEGFR fornecidas aqui. Em algumas modalidades, qualquer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências anti-IL-6 CDRS (cadeia leve 1, 2 e 3 ou cadeia pesada 1, 2 ou 3) podem ser empregadas com qualquer um dos arranjos de VEGFR.
[00453] Em algumas modalidades, qualquer cadeia leve e/ou pesada de anticorpo anti-IL-6 e/ou pode ser empregada,
com qualquer uma ou mais das mutações pontuais providas em qualquer uma ou mais das Tabelas 18.1 a 18.4. Em algumas modalidades, o construto de fusão emprega um construto anti-
IL-6 que tem uma mutação de ponto em qualquer uma ou mais das posições identificadas em qualquer uma ou mais das
Tabelas 18.1 a 18.4. Em algumas modalidades, as posições alteradas são aquelas sublinhadas e em negrito nas figuras relevantes como mostrando resíduos alterados.
Em algumas modalidades, o construto é um que inclui mudanças em cadeia pesada incluindo um ou mais dentre S35H, G66D, L100A ou L100S e as mudanças na cadeia leve incluem um ou mais dentre M32L,
M50D, N52S ou M88Q.
As posições CDR seguem a sua ordem de aparência no domínio variável quando descrito (por exemplo,
S35H, G66D...). As posições Fc seguem numeração EU quando descrito (por exemplo, L234A, L235A...). Em algumas modalidades, o construto (por exemplo, anticorpo a IL-6,
e/ou IL-6 VEGF-trap, e/ou bioconjugado de IL-6 VEGF-trap (a um ou mais dos biopolímeros providos aqui)), inclui 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7 ou 8 das seguintes nas cadeias pesada e leve:
S35H, G66D, L100A e/ou L100S na cadeia pesada e M32L, M50D,
N52S e/ou M88Q na cadeia leve.
Em algumas modalidades, estas mutações pontuais podem ser usadas em qualquer um dos anticorpos IL ou construtos contendo anticorpos IL-6 fornecidos aqui.
[00454] Como será apreciado por um técnico no assunto, há uma variedade de construtos fornecidos aqui. Geralmente, estes construtos podem ser agrupados em: anticorpos a IL-6, e/ou Anti-IL-6 VEGF-trap (fusões do anticorpo e VEGF-trap) e/ou bioconjugado de IL-6 VEGF-trap (as fusões com um ou mais dos biopolímeros providos aqui), e/ou construtos de VEGF-trap e/ou biopolímeros de VEGF-trap. Assim, qualquer um dos componentes separados aqui providos (e suas variantes) pode ser usado separadamente ou em combinação um com o outro.
Em algumas modalidades, os construtos de qualquer um desses agrupamentos (anticorpos para IL-6, e/ou anti-IL-6 VEGF-trap (fusões do anticorpo e VEGF-trap), e/ou bioconjugado de IL- 6 VEGF-trap (as fusões com um ou mais dos biopolímeros providos aqui), e/ou construtos de VEGF-trap, e/ou biopolímeros de VEGF-trap) podem ser usados para qualquer um dos métodos ou outras composições aqui fornecidas. Por exemplo, qualquer uma destas opções pode ser usada para qualquer um dos métodos de tratamento que são descritos com relação às terapias de IL-6 VEGF-trap e/ou terapias de IL- 6, e/ou bioconjugados de IL-6 VEGF-trap. Como será apreciado, as características e propriedades de cada um dos construtos podem ser diferentes para cada um dos tratamentos, em linha com as propriedades dos componentes detalhados aqui. Assim, a descrição fornecida aqui com relação a, por exemplo, linhagens celulares, ácidos nucleicos, terapias e outras modalidades, não é apenas especificamente contemplada para o anti-IL-6-VEGF-trap e/ou seus bioconjugados, mas também para anticorpos (e, por exemplo, seus fragmentos),
anticorpos-bioconjugados, e construtos de VEGF-trap separados do anti-IL-6-VEGF-trap e/ou bioconjugados.
Por exemplo, em algumas modalidades, qualquer das mutações pontuais (ou suas combinações) para IL-6 pode ser usada em um anticorpo (ou fragmento de ligação do mesmo) para um tratamento que é simplesmente baseado em anticorpo, em vez de uma disposição baseada em anticorpo e VEGF-trap.
Assim,
as mutações pontuais para o VEGF-trap e anticorpos para IL-
6 não estão limitadas ao contexto de arranjos de fusão
(embora não forneça isso), como também descreve tais construtos (e seus usos e método de produção) separados de um arranjo de fusão.
Em vez de repetir todas essas modalidades separadamente, observa-se que qualquer tal descrição para um dos arranjos (anticorpos para IL-6, e/ou
Anti-IL-6 VEGF-trap (fusões do anticorpo e VEGF-trap), e/ou bioconjugado de IL-6 VEGF-trap (as fusões com um ou mais dos biopolímeros providos aqui), e/ou construtos de VEGF-trap,
e/ou biopolímeros de VEGF-trap) se aplica e identifica as opções para todas as outras referidas disposições
(anticorpos para IL-6, e/ou Anti-IL-6 VEGF-trap (fusões do anticorpo e VEGF-trap), e/ou bioconjugado de IL-6 VEGF-trap
(as fusões com um ou mais dos biopolímeros providos aqui),
e/ou construtos de EGF-trapd, e/ou biopolímeros de VEGF- trap).
[00455] Em algumas modalidades, quaisquer dos construtos de VEGF-trap são contemplados para uso como composições, componentes, ou terapias, incluindo, por exemplo, aquelas nas Figuras 13C-13E, 19 e 25 das modalidades fornecidas aqui.
[00456] Em algumas modalidades, quaisquer dos construtos de anticorpos anti-IL-6 são contemplados para uso como composições, componentes ou terapias, incluindo, por exemplo, aquelas nas tabelas 1A e 1E e Figuras 5, 18, 21, 22, 23 e 24 das modalidades fornecidas aqui.
[00457] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma mutação na posição 94 na sequência de VEGF- trap, na posição 95 na sequência de VEGF-trap, ou na T94I e H95I na sequência de VEGF-trap.
[00458] Em algumas modalidades, é fornecido um inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6. O inibidor duplo de VEGFR- Anti-IL-6 compreende uma fusão de anticorpo trap de anticorpo Anti-IL 6 e um VEGF(VEGFR1/2)trap, em que o inibidor duplo inclui pelo menos uma mutação pontual dentro de uma sequência VEGFR para reduzir a clivagem da sequência VEGFR. Em algumas modalidades, o inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 tem um peso molecular de 1,0 MDa.
[00459] Em algumas modalidades, o inibidor duplo VEGR-Anti-IL-6 fornece terapia para doenças inflamatórias da retina.
[00460] Em algumas modalidades, o inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 compreende uma pesada constante, leve constante, um fragmento de ligação de antígeno, um fragmento cristalizável (Fc), receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), uma pesada variável, uma pesada leve e regiões de CDR.
[00461] Em algumas modalidades, as sequências de região variável de cadeia pesada de Anti-IL-6 podem ser selecionadas a partir das opções VI, VII, VIII, IX, X, XI ou XII da Figura 18.
[00462] Em algumas modalidades, a sequência de VEGF- trap pode ser selecionada a partir de pelo menos uma das opções 1A, 1B, 1C ou 1D da Figura 19.
[00463] Em algumas modalidades para o inibidor duplo VEGR-anti-IL-6, a sequência de cadeia pesada para moléculas anti-IL-6 pode ser selecionada a partir de pelo menos uma das opções 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, ou 3I da Figura
21.
[00464] Em algumas modalidades para o inibidor duplo de VEGFR-anti-IL-6, a sequência de cadeia leve para moléculas anti-IL-6 compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs de cadeia leve de pelo menos uma das opções 4A, 4B ou 4C da Figura 24B.
[00465] Em algumas modalidades para o inibidor duplo de VEGFR-anti-IL-6, a sequência de cadeia pesada para a molécula anti-IL-6 compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs de cadeia pesada de pelo menos uma das opções 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H ou 5I da Figura 24A.
[00466] Em algumas modalidades, o inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 compreende uma sequência VEGFR-Fc de pelo menos uma das opções 6A, 6B, 6C ou 6D da Figura 25.
[00467] Em algumas modalidades, o inibidor duplo de VEGFR-anti-IL-6 compreende uma ou mais das sequências nas Figuras 18-25.
[00468] Em algumas modalidades, o inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 compreende uma VH de IL-6, uma VL de IL-6, uma Fc de IL-6, um VEGF-trap e um ligante. Em algumas modalidades, a VH de IL-6 compreende uma sequência de uma sequência de VH de IL6 nas Figuras 21 ou 23. Em algumas modalidades, a VL de IL-6 compreende uma sequência de uma sequência de VL de IL6 na Figura 22. Em algumas modalidades, o Fc compreende uma sequência de uma sequência Fc na Figura
23. Em algumas modalidades, o VEGF-trap compreende uma sequência de uma sequência de VEGF-trap.
[00469] Em algumas modalidades, é fornecido um construto de proteína que compreende: pelo menos 3 CDRs de cadeia pesada; pelo menos 3 CDRs de cadeia leve; uma sequência de VEGF-trap; e uma sequência ligante, em que cada uma das sequências é selecionada a partir de uma sequência dentro das Figuras 18-25.
[00470] Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína de fusão que compreende: uma VH de IL-6, uma VL de IL-6, um Fc de IL-6, um VEGF-trap, e em que a proteína de fusão altera a proliferação de HUVEC. Em algumas modalidades, cada sequência é selecionada a partir de uma sequência nas Figuras 18-25.
Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras
[00471] A invenção também fornece polinucleotídeos que codificam qualquer um dos anticorpos (e/ou IL-6 Ab-VEGF- trap), incluindo fragmentos de anticorpos e anticorpos modificados descritos aqui. Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a produção de qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui. Os polinucleotídeos podem ser produzidos e expressos por procedimentos conhecidos na arte da técnica. Consequentemente, a invenção fornece polinucleotídeos ou composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo polinucleotídeos, que codificam qualquer um dos anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF traps) fornecidos aqui.
[00472] Os polinucleotídeos complementares a quaisquer tais sequências também são abrangidos pela presente invenção. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples (codificante ou anti-sentido) ou de fita dupla, e podem ser DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou moléculas de RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA em uma maneira de um a um, e moléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Sequências de codificação ou não-codificação adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.
[00473] Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou um fragmento do mesmo) ou pode compreender uma variante de tal sequência. Variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, eliminações e/ou inserções tais que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não é diminuída, em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado como descrito aqui. Variantes preferivelmente exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 80% de identidade, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% de identidade a uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou um fragmento deste.
[00474] Duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são ditas serem "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhada para correspondência máxima como descrito abaixo. As comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas mediante comparação das sequências sobre uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", para uso na presente invenção, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, usualmente de 30 a cerca de 75, ou 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas.
[00475] Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido utilizando-se o programa MegAlign® no pacote Lasergene® de software de bioinformática (DNASTAR®, Inc. Madison, WI), utilizando parâmetros padrão.
Este programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical
Research Foundation, Washington DC vol. 5, Suppl. 3, pp.
345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. e Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. e Muller W., 1988, CABIOS 4: 11-17; Robinson, ED., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomia, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
[00476] De preferência, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, espaços) de 20 por cento ou menos, usualmente de 5 a 15 por cento, ou de 10 a 12 por cento, em comparação com as sequências de referência (que não compreendem adições ou eliminações) para o alinhamento ótimo das duas sequências.
A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.
[00477] Variantes também podem, ou alternativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo, ou uma porção ou complemento da mesma. Tais variantes de polinucleotídeos são capazes de hibridizar sob condições moderadamente rigorosas para uma sequência de DNA que ocorre naturalmente que codifica um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).
[00478] "Condições moderadamente rigorosas" adequadas podem incluir pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridizando a 50°C -65°C, 5 X SSC, durante a noite; seguido por lavagem duas vezes a 65°C durante 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X de SSC contendo 0,1% de SDS.
[00479] Como usado aqui, "condições altamente rigorosas" ou "condições de alto rigor" são aquelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, 0,015 M cloreto de sódio/0,0015 M citrato de sódio/0,1% dodecil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) utilizam 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x de solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 µg/ml), 0,1% de SDS, e 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 X SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido por uma lavagem de alto rigor consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C. O técnico no assunto reconhecerá como ajustar a temperatura, a força iônica, etc., conforme necessário para acomodar fatores tais como o comprimento da sonda e similares.
[00480] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que, como resultado da degeneração do código genético, existem muitas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo como descrito aqui. Alguns destes polinucleotídeos possuem homologia mínima à sequência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. Não obstante, os polinucleotídeos que variam devido às diferenças no uso do códon são especificamente contemplados pela presente invenção. Além disso, alelos dos genes que compreendem as sequências de polinucleotídeo fornecidas aqui estão dentro do escopo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações,
tais como eliminações, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e proteína resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Alelos podem ser identificados utilizando técnicas padrão (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequência de bases de dados).
[00481] Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos utilizando síntese química, métodos recombinantes, ou PCR. Métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos na arte da técnica e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Alguém versado na técnica pode usar as sequências fornecidas aqui e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.
[00482] Para a preparação de polinucleotídeos utilizando métodos recombinantes, um polinucleotídeo que compreende uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado, e o vetor por sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, conforme também discutido aqui. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno por captação direta, endocitose, transfecção, ligação-F ou eletroporação. Uma vez introduzida, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira por métodos bem conhecidos na arte da técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989.
[00483] Alternativamente, a PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na arte da técnica e é descrita nas Patentes U.S. No. 4.683.195,
4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds. Birkauswer Press, Boston, 1994.
[00484] O RNA pode ser obtido utilizando-se o DNA isolado num vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado utilizando métodos bem conhecidos por aqueles técnicos no assunto, como apresentado em Sambrook et al. 1989, supra, por exemplo.
[00485] Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão, ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na arte da técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira pretendida a ser usada, vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidade de auto-replicação, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem conter genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, Co1E1, pCR1, RP4, fagos de DNAs e vetores de transporte tais como pSA3 e pAT28.
Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis a partir de vendedores comerciais tais como BioRad, Strategene e Invitrogen.
[00486] Os vetores de expressão são também providos.
Vetores de expressão geralmente são construtos de polinucleotídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Entende-se que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras tanto como epissomas quanto como uma parte integral do DNA cromossômico.
Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos e vetor(es) de expressão descrito(s) na publicação PCT No. WO 87/04462. Os componentes de vetor podem geralmente incluir, mas não estão limitados a, uma ou mais das seguintes: uma sequência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricionais adequados (tais como promotores, intensificadores e terminador). Para expressão (isto é, tradução), um ou mais elementos de controle translacionais também são usualmente requeridos, tais como sítios de ligação de ribossoma, sítios de iniciação de tradução, e códons de parada.
[00487] Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso tal como vírus de vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente das características da célula hospedeira.
[00488] A invenção também fornece células hospedeiras que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui. Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usadas para o propósito de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitativos de células hospedeiras de mamíferos incluem mas não se limitam a células COS, HeLa e CHO. Vide também a publicação PCT No. WO 87/04462. Células hospedeiras não- mamíferas adequadas incluem procariotas (tais como E. coli ou B. subtillis) e levedura (tais como S. cerevisae, S.
pombe; ou K. lactis). De preferência, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes maior,
mais preferivelmente, 10 vezes maior, ainda mais preferivelmente, 20 vezes maior que aquela do anticorpo ou proteína endógena correspondente de interesse, se presente, nas celas hospedeiras. A seleção das células hospedeiras para uma ligação específica a IL-6 é efetuada por um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.
[00489] Um vetor de expressão pode ser usado para dirigir a expressão de um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap). Um técnico no assunto é familiar com a administração de vetores de expressão para obter a expressão de uma proteína exógena in vivo. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.741. A administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, injetor de partículas ou administração por cateterização, e administração tópica. Em outra modalidade, o vetor de expressão é administrado diretamente ao tronco ou gânglio simpático, ou em uma artéria coronária, átrio, ventrículo ou pericárdio.
[00490] A administração direcionada de composições terapêuticas contendo um vetor de expressão, ou polinucleotídeos subgenômicos, também pode ser usada. As técnicas de distribuição de DNA mediadas por receptor são descritas, por exemplo, em Findeis et al., Trends
Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem. 1988, 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem.
1991, 266:338. Composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia de genes. As faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 µg a cerca de 2 mg, cerca de 5 µg a cerca de 500 µg, e cerca de 20 µg a cerca de 100 µg de DNA também podem ser usadas durante um protocolo de terapia de genes. Os polinucleotídeos e polipeptídeos terapêuticos podem ser liberados utilizando carreadores de distribuição de genes. O carreador de distribuição de genes pode ser de origem viral ou não viral (veja em geral, Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51; Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148). A expressão de tais sequências de codificação pode ser induzida usando-se promotores endógenos de mamíferos ou heterólogos. A expressão da sequência codificante pode ser constitutiva ou regulada.
[00491] Vetores baseados em vírus para a entrega de um polinucleotídeo desejado e expressão em uma célula desejada são bem conhecidos na arte da técnica. Carreadores baseados em vírus exemplares incluem, mas não estão limitados a retrovírus recombinantes (ver, por exemplo, publicações PCT Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes U.S. Nos. 5.
219.740 e 4.777.127; Patente GB No. 2.200.651; e Patente EP No. 345242), vetores baseados em alfa vírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus de floresta de Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírus da encefalite equina venezuelana (ATCC VR- 923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e vetores de vírus adeno-associados (AAV) (veja, por exemplo, publicações PCT Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). Administração de DNA ligado a adenovírus morto como descrito em Curiel, Hum. Gene Ther.
1992, 3:147 também pode ser empregada.
[00492] Carreadores e métodos de distribuição não virais também podem ser empregados, incluindo, mas não se limitando a, DNA condensado policatiônico ligado ou não ligado a adenovírus morto sozinho (ver, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. 1992, 3:147); DNA ligado ao ligante (veja, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985); células de carreadores de distribuição de células eucarióticas (ver,
por exemplo, Patente U.S. No. 5.814.482; publicação PCT Nos.
WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização ou fusão de carga nucleica com membranas celulares. O DNA "nu" também pode ser empregado. Métodos de introdução de DNA nu exemplares são descritos na publicação PCT No. WO 90/11092 e na Patente U.S. No. 5.580.359.
Lipossomas que podem atuar como carreadores de distribuição de genes são descritos na Patente U.S. No. 5.422.120; publicações PCT Nos WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e EP 052768. Abordagens adicionais são descritas em Philip, Mol. Cell. Biol. 1994, 14:2411, e em Woffendin, Proc. Natl.
Acad. Sci., 1994, 91:1581.
Composições
[00493] A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab- VEGF-trap) descrito aqui. Exemplos de tais composições, bem sobre como formular, são também aqui descritos. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) e/ou conjugados de anticorpo (e/ou Ab-trap). Em outras modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab- VEGF-trap) reconhece IL-6 humana. Em outras modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 é um anticorpo humano. Em outras modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 compreende uma região constante que não dispare uma resposta imune indesejada ou malquista, tal como lise mediada por anticorpos ou ADCC. Em outras modalidades, o antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) compreende uma ou mais CDR(s) do anticorpo (tal como um, dois, três, quatro, cinco ou, em algumas modalidades, todas as seis CDRs).
[00494] Entende-se que as composições podem compreender mais de um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) (por exemplo, uma mistura de anticorpos IL-6 que reconhecem epítopos diferentes de IL-6). Outras composições exemplares compreendem mais de um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) que reconhecem o(s) mesmo(s) epítopo(s), ou espécies diferentes de anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) que se ligam a epítopos diferentes de IL-6. Em algumas modalidades, as composições compreendem uma mistura de anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) que reconhecem variantes diferentes de IL-6. Além disso, em algumas modalidades, a composição também pode, ou em vez disso, compreender mais de um VEGF-trap. Estas seções alternativas de VEGF-trap podem incluir diferentes sequências para a seção de VEGF-trap, contanto que as seções tenham pelo menos uma funcionalidade igual ou similar àquela mencionada aqui.
[00495] A composição usada na presente invenção pode ainda compreender carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed, 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para receptores nas dosagens e concentrações, e podem compreender tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzil; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextranos; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol,
trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos tais como Polissorbato, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são adicionalmente descritos aqui.
[00496] Composições farmacêuticas adaptadas para administração parenteral incluem solução de injeção estéril aquosa e não aquosa que pode conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação substancialmente isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Os excipientes que podem ser usados para soluções injetáveis incluem água, álcoois, poliois, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. As composições podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) requerendo apenas a adição do líquido estéril carregado, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões extemporâneas de injeção podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos. As composições farmacêuticas podem ser substancialmente isotônicas, implicando em uma osmolalidade de cerca de 250- 350 mOsm/kg de água.
[00497] As composições farmacêuticas podem conter agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, adoçantes, corantes, odorantes, sais (substâncias da presente invenção podem ser eles próprios na forma de um sal farmaceuticamente aceitável), tampões, agentes de revestimento ou antioxidantes. Elas também podem conter agentes terapeuticamente ativos além da substância da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção podem ser empregadas em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais excipientes podem incluir, mas não são limitados a, solução salina, solução salina tamponada (tal como solução salina tamponada com fosfato), dextrose, lipossomas, água, glicerol, etanol e suas combinações.
[00498] Os anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL- 6 Ab-VEGF-trap), conjugados de anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap), e composições farmacêuticas da invenção podem ser empregados sozinhos ou em conjunto com outros compostos, tais como compostos terapêuticos ou moléculas, por exemplo, fármacos anti-inflamatórios, analgésicos ou antibióticos. Tal administração com outros compostos pode ser simultânea, separada ou sequencial. Os componentes podem ser preparados na forma de um kit que pode compreender instruções apropriadas.
Métodos para prevenir ou tratar distúrbios oftálmicos
[00499] Em algumas modalidades, os anticorpos (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) e os conjugados de anticorpos (e/ou de IL-6 Ab-VEGF-trap) são úteis em várias aplicações incluindo, mas não estando limitados a, métodos de tratamento terapêutico.
[00500] Em algumas modalidades, é fornecido um método para o tratamento de doença ocular, tal como, por exemplo, AMD. Em algumas modalidades, o método de tratamento de AMD em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-IL-6 ou IL6 Ab-VEGF-traps como descritos aqui. Como usado aqui, AMD inclui AMD seca e AMD úmida. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de AMD em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo anticorpos antagonistas de IL-6 ou IL-6 Ab-VEGF-traps ou seus conjugados conforme descritos aqui. Em algumas modalidades, o anticorpo IL-6 e/ou IL-6 Ab VEGF-trap e/ou seus conjugados podem ser usados para tratar e/ou prevenir e/ou reduzir o risco de degeneração macular úmida ou neovascular, degeneração macular relacionada à idade úmido ou neovascular, degeneração macular relacionada à idade seco, bloqueio venoso, arterial ou outro dos vasos sanguíneos oculares e ou retinais com ou sem edema da retina, uveíte anterior e posterior, edema macular uveítico, retinopatia diabética, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, edema macular diabético não proliferativo e tumores intraoculares. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou IL-6 Ab-VEGFT-trap pode ser usado para: (i) pacientes resistentes à terapia de VEGF, (ii) pacientes que perdem eficácia a agentes anti-VEGF devido à progressão de patologias subjacentes adicionais tais como fibrose, cicatrização de feridas, e atrofia e/ou (iii) subtratamento devido à necessidade de frequentes injeções intravítreas.
[00501] Em algumas modalidades, é fornecido um método para o tratamento de uma doença ocular, tal como uma doença sistêmica. Em algumas modalidades, doenças sistêmicas que afetam o olho tal como doença de Grave ou neuromielite óptica, ou doenças sistêmicas que não afetam o olho tais como esclerose múltipla e artrite reumatoide podem ser tratadas através dos métodos e composições fornecidos aqui.
[00502] Em algumas modalidades, as composições aqui fornecidas podem ser usadas em combinação com moduladores imunes tais como PD-l/PDL-l para indicações de oncologia.
[00503] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos compreendem ainda uma etapa de tratamento de um indivíduo com uma ou mais formas adicionais de terapia. Em algumas modalidades, a forma adicional de terapia é uma terapia de AMD adicional incluindo, mas não limitada a, VISUDYNE®, fotocoagulação a laser ou injeção intravítrea de, por exemplo, LUCENTIS®, MACUGEN®, EYLEA®, OZURDEX®, ILUVIEN®, TRIESENCE®, ou TRIVARIS®.
[00504] Com relação a todos os métodos aqui descritos, referência a anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab- VEGF-trap) também inclui composições que compreendem um ou mais agentes adicionais. Estas composições podem compreender adicionalmente excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica. A presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros métodos de tratamento.
[00505] Em algumas modalidades, é fornecido um método para o tratamento ou profilaxia de uma doença em um paciente em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao paciente qualquer um dos anticorpos antagonistas isolados (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) aqui descritos. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao paciente qualquer um dos conjugados aqui descritos. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao paciente qualquer das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, o método compreende identificar um paciente tendo atividade de IL-6 hiperativa e administrar ao paciente qualquer um dos anticorpos antagonistas isolados aqui descritos. Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de um paciente tendo atividade de IL-6 hiperativa e administração ao paciente de qualquer um dos conjugados aqui descritos. Em algumas modalidades, o método compreende identificar um paciente tendo atividade de IL-6 hiperativa e administrar ao paciente qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, o paciente tem elevada atividade de VEGF em vez de, ou em adição a, elevada atividade de IL-6.
[00506] Em algumas modalidades, o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em degeneração macular úmida ou neovascular, degeneração macular relacionada à idade úmida ou neovascular, degeneração macular relacionada à idade seca, bloqueio venoso, arterial ou outro dos vasos sanguíneos oculares e ou retinais com ou sem edema da retina, uveíte anterior e posterior, edema macular uveítico, retinopatia diabética, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, edema macular diabético não proliferativo e tumores intraoculares.
[00507] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap), conjugado (e/ou conjugado de IL-6 Ab-VEGF-trap), composição ou uma combinação dos mesmos é administrada não mais frequentemente do que uma vez por mês.
Em algumas modalidades, o anticorpo isolado, conjugado, composição ou uma combinação dos mesmos é administrada não mais frequentemente do que uma vez a cada dois meses. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado (e/ou IL-6 Ab-VEGF- trap), conjugado (e/ou conjugado IL-6 Ab-VEGF), composição ou uma combinação dos mesmos é administrada não mais frequentemente do que uma vez a cada três meses. Em algumas modalidades, o construto isolado (por exemplo, Ab ou Ab- trap, com ou sem o polímero) é administrado com uma frequência entre uma vez por ano e uma vez a cada dois meses.
Em algumas modalidades, o tratamento pode ser uma única aplicação do anticorpo. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser tantas aplicações do anticorpo quanto necessário ou desejado para um resultado.
[00508] O anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) ou seu conjugado pode ser administrado a um indivíduo através de qualquer via adequada. Deve ficar aparente aos técnicos no assunto que os exemplos aqui descritos não se destinam a ser limitativos, mas devem ser ilustrativos das técnicas disponíveis. Consequentemente, em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) é administrado a um indivíduo de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo, como bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, transdérmica, subcutânea, intra- articular, sublingualmente, intra-sinovial, via insuflação, intratecal, oral, inalação ou tópica. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa, ou localizada. Nebulizadores comercialmente disponíveis para formulações líquidas, incluindo nebulizadores de jato e nebulizadores ultra-sônicos são úteis para administração. As formulações líquidas podem ser diretamente nebulizadas e o pó liofilizado pode ser nebulizado após a reconstituição.
Alternativamente, o anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL- 6 Ab-VEGF-trap) pode ser aerossolizado utilizando uma formulação de fluorocarboneto e um inalador de dose medida, ou inalado como um pó liofilizado e moído.
[00509] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap), conjugados de anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou conjugados de IL-6 Ab- VEGF-trap), e composições farmacêuticas aqui descritas são usadas para profilaxia ou tratamento de uma doença ou condição ocular. Assim usados, os conjugados são tipicamente formulados para e administrados por injeção ocular, intra- ocular e/ou intravítrea, e/ou injeção justascleral e/ou injeção subtenoniana e/ou injeção supracoroidal e/ou administração tópica na forma de gotas de olho e/ou pomada.
Tais anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-
trap), conjugados de anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou conjugados de IL-6 Ab-VEGF-trap), e composições podem ser aplicadas por uma variedade de métodos, por exemplo, intra- vitrealmente como um dispositivo e/ou um depósito que permite a liberação lenta do composto no vítreo, incluindo aqueles descritos em referências tais como Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton e Pearson, editores, Taylor & Francis (março de 2006). Em um exemplo, um dispositivo pode estar na forma de um mínimo e/ou uma matriz e/ou um sistema de difusão passiva e/ou células encapsuladas que liberam o composto por um período prolongado de tempo (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton e Pearson, editores, Taylor & Francis (março de 2006)). Em terapia ou como um profilático, o agente ativo pode ser administrado a um indivíduo como uma composição injetável, por exemplo, como uma dispersão aquosa estéril, de preferência isotônica ou substancialmente isotônica.
[00510] Formulações para administração ocular, intraocular ou intravítrea podem ser preparadas por métodos e utilização de ingredientes conhecidos na técnica. A penetração apropriada no olho é desejável para tratamento eficiente. Diferentemente das doenças da frente do olho, onde os fármacos podem ser aplicados topicamente, as doenças da retina personalizam uma abordagem mais específica do local. Colírios e pomadas raramente penetram na parte detrás do olho, e a barreira hemato-encefálica impede a penetração de fármacos sistemicamente administrados no tecido ocular.
Em algumas modalidades, o método de escolha para administração de fármaco para tratar doença retinal, tal como AMD e CNV, é injeção intramuscular direta. Em algumas modalidades, injeções intravítreas são repetidas em intervalos que dependem da condição do paciente, e das propriedades e meia-vida do fármaco liberado.
[00511] Para administração a mamíferos, e particularmente humanos, espera-se que a dosagem do agente ativo seja de 0,01 mg/kg de peso corporal, tipicamente em torno de 1 mg/kg, para administrações sistêmicas. Para doenças oculares que requerem administração local (por exemplo, intravítrea, supracoroidal, peri-ocular, etc), a dosagem é tipicamente 0,1 mg/olho/dose a 10 mg/olho/dose ou mais. Em algumas modalidades, a dosagem é 100 ul/dose/olho.
Em algumas modalidades, uma agulha pode ser usada para administrar a dosagem. A agulha pode ser, por exemplo, uma agulha de 30 gauge (0,255 mm) 1/2 polegada (12,7 mm) ou uma agulha de 1/2 polegada que é 27G (0,360 mm) ou 29G (0,286 mm). O médico pode determinar a dosagem real mais adequada para um indivíduo, o que depende de fatores incluindo a idade, peso, sexo e resposta do indivíduo, a doença ou distúrbio sendo tratado e a idade e condição do indivíduo que está sendo tratado. As dosagens acima são exemplares do caso médio. Pode, naturalmente, haver casos onde dosagens mais altas ou mais baixas são necessárias.
[00512] Esta dosagem pode ser repetida tantas vezes quanto apropriado (por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, trimestralmente). Se os efeitos colaterais se desenvolvem, a quantidade e/ou frequência da dosagem podem ser reduzidos, de acordo com a prática clínica normal. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser administrada uma vez a cada trinta dias.
[00513] Os anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL- 6 Ab-VEGF-trap) da presente invenção podem ser empregados de acordo com a presente invenção pela expressão de tais polipeptídeos in vivo em um paciente, isto é, terapia genética. Existem duas abordagens principais para a obtenção do ácido nucleico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente: in vivo e ex vivo. Para a administração in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente no paciente, usualmente nos sítios onde a proteína terapêutica é necessária, isto é, onde a atividade biológica da proteína terapêutica é necessária. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas, e as células modificadas são administradas ao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.892.538 e
5.283.187). Há uma variedade de técnicas disponíveis para a introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se o ácido nucleico é transferido em células cultivadas in vitro ou transferido in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico em células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão celular, DEAE-dextrano, método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. A transdução envolve a associação de uma partícula viral recombinante de replicação defeituosa (preferencialmente retroviral) com um receptor celular, seguido por introdução dos ácidos nucleicos contidos pela partícula na célula. Um vetor comumente usado para a entrega ex vivo do gene é um retrovírus.
[00514] Técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo atualmente preferidas incluem transfecção com vetores virais ou não virais (tais como adenovírus, lentivírus, vírus da Herpes simplex I ou vírus adeno- associado (AAV)) e sistemas baseados em lipídeo (lipídeos úteis para a transferência mediada por lipídeo do gene são, por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol; ver, por exemplo, Tonkinison et al., Cancer Investigation, 14(1):54-65 (1996)). Os vetores mais preferidos para utilização em terapia genética são vírus, mais preferivelmente adenovírus,
AAV, lentivírus ou retrovírus. Um vetor viral tal como um vetor retroviral inclui pelo menos um promotor transcricional/intensificador ou elemento(s) de definição do locus, ou outros elementos que controlam a expressão gênica por outros meios, tais como a splicing alternativo, exportação de RNA nuclear, ou a modificação pós-traducional do mensageiro. Além disso, um vetor viral tal como um vetor retroviral inclui uma molécula de ácido nucleico que, quando transcrita na presença de um gene que codifica a proteína terapêutica, é operavelmente ligada ao mesmo e atua como uma sequência de iniciação de tradução. Tais construtos de vetor também incluem um sinal de empacotamento, repetições terminais longas (LTRs) ou porções das mesmas, e sítios de ligação de iniciador de filamento positivo e negativo apropriados ao vírus usado (se estes já não estão presentes no vetor viral). Além disso, tal vetor tipicamente inclui uma sequência de sinal para a secreção do polipeptídeo PRO a partir de uma célula hospedeira em que ele é colocada. De preferência, a sequência de sinal para este propósito é uma sequência de sinal de mamífero, mais preferencialmente a sequência de sinal nativo para a proteína terapêutica.
Opcionalmente, o construto vetor pode também incluir um sinal que direciona a poliadenilação, bem como um ou mais sítios de restrição e uma sequência de terminação de tradução. A título de exemplo, tais vetores tipicamente incluirão uma 5'
LTR, um sítio de ligação de tRNA, um sinal de empacotamento, uma origem de síntese de DNA de segundo filamento, e uma 3' LTR ou uma porção da mesma. Outros vetores podem ser usados que são não virais, tais como lipídeos catiônicos, polilisina e dendrímeros.
[00515] Em algumas situações, é desejável fornecer a fonte de ácido nucleico com um agente que visa as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície celular ou a célula alvo, um ligante para um receptor na célula alvo, etc. Onde lipossomas são empregados, proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície celular associada com endocitose podem ser usadas para direcionar e/ou facilitar a absorção, por exemplo, proteínas capsídicas ou seus fragmentos trópicos para um tipo de célula particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclagem, e proteínas que visam a localização intracelular e aumentam a meia-vida intracelular. A técnica de endocitose mediada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 87:3410-3414 (1990). Para uma revisão dos protocolos de terapia de genes e marcação de genes atualmente conhecidos, veja Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992). Veja também WO 93/25673 e as referências aqui citadas.
[00516] Terapia genética adequada e métodos para a produção de partículas retrovirais e proteínas estruturais podem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. No.
5.681.746.
[00517] De acordo com alguns aspectos, é apresentado um método para tratamento ou profilaxia de uma doença ocular em mamífero em que é administrada uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap).
[00518] Em algumas modalidades, estas moléculas inibidoras duaplas de IL6/VEGF podem ser usadas para tratar distúrbios oculares tais como retinopatia diabética oftálmica, retinopatia diabética não proliferativa, retinopatia diabética proliferativa (PDR), edema macular diabético, prevenção de edema macular diabético, prevenção de retinopatia diabética proliferativa, degeneração macular relacionada à idade úmida, prevenção de degeneração macular relacionada à idade seca, uveíte e edema macular uveítico.
[00519] Os terapêuticos de VEGFR-AntiIL6 também poderiam ser usados para tratar doenças sistêmicas que afetam o olho tal como doença de Grave ou neuromielite óptica, ou doenças sistêmicas que não afetam o olho tal como esclerose múltipla, artrite reumatoide.
[00520] Estas moléculas também poderiam ser usadas para o tratamento da síndrome de liberação de citocinas após
CAR-T ou terapêuticas de imuno-oncologia similares.
Adicionalmente, as moléculas anti-IL6 interrompem a indução da expressão de IL-6 observada após o tratamento com moléculas anti-PD-I/PD-L1 (Tsukamoto et al., 2018).
Adicionalmente, o bloqueio de sinalização de VEGF também pode melhorar o tratamento anti-PD-L1 (Allen et al., 2017).
Assim, estes inibidores duplos poderiam ser usados em combinação com inibidores de ponto de controle imune (tais como moduladores de PD-l/PDL-1) para tratar sinergicamente o câncer. A inibição de VEGF proporcionaria um benefício adicional sobre o seu topo. Outra aplicação deste tipo poderia ser usada para edema cerebral em glioblastoma onde a terapia anti-IL6 pode apresentar benefícios adicionais para os tratamentos anti-VEGF. O biopolímero também pode permitir uma maior distribuição de tecido, o que seria benéfico para a penetração de tumores sólidos.
[00521] Em algumas modalidades, o conjugado (ou as várias proteínas) é útil para a prevenção de qualquer um ou mais dos distúrbios aqui fornecidos.
Formulações
[00522] Formulações terapêuticas dos anticorpos antagonistas de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) e conjugados de anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo tendo o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.
Mack Publishing, 2000), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e podem compreender tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais tais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzila; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeose outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de
Zn-proteína); e/ou tensoativos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).
[00523] Lipossomas contendo o anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) e conjugados de anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) são preparados por métodos conhecidos na arte da técnica, como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); e nas Patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com maior tempo de circulação são apresentados na Patente U.S.
No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado.
[00524] Os ingredientes ativos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).
[00525] Preparações de libertação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de libertação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogeis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido láctico degradáveis tais como LUPRON DEPOTTM (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarose e ácido poli-D-(-)-3- hidróxi-butírico.
[00526] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado, por exemplo, através de filtragem através de membranas de filtração estéreis. Anticorpo antagonista de IL-6 terapêutico (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) e/ou composições de conjugado de anticorpo (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) são geralmente colocadas em um recipiente que tem uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou ampola de solução intravenosa tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica. Em algumas modalidades, as composições de anticorpo e/ou conjugado de anticorpos são colocadas em uma seringa para fornecer uma seringa pré-enchida.
[00527] Em algumas modalidades, a composição é uma composição isenta de pirogênio que é substancialmente isenta de endotoxinas e/ou substâncias pirogênicas relacionadas.
Endotoxinas incluem toxinas que são confinadas dentro de um microrganismo e são liberadas somente quando os microrganismos são decompostos ou morrem. As substâncias pirogênicas também incluem a indução da febre, substâncias termoestáveis da membrana externa de bactérias e outros microrganismos. Ambas estas substâncias podem causar febre, hipotensão e choque se administrados a seres humanos. Devido aos efeitos nocivos potenciais, mesmo quantidades baixas de endotoxinas devem ser removidas de soluções farmacêuticas administradas intravenosamente. Para injeção sistêmica tal como IV ou IP, a FDA ("Food and Drug Administration") estabeleceu um limite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dose por quilograma de peso corporal em um único período de uma hora para aplicações de drogas intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1): 223 (2000)). Quando proteínas terapêuticas são administradas em quantidades de várias centenas ou milhares de miligramas por quilograma de peso corporal, como pode ser o caso com proteínas de interesse (por exemplo, anticorpos), mesmo quantidades traço de endotoxina prejudicial e perigosa devem ser removidas. Em algumas modalidades, os níveis de endotoxina e pirogênio na composição são menores do que 10 EU/Mg, ou menos do que 5 EU/Mg, ou menos do que 1 EU/Mg, ou menos do que 0,1 EU/Mg, ou menos do que 0,01 EU/Mg, ou menos do que 0,001 EU/Mg. Em algumas modalidades, as composições ou métodos aqui providos permitem 0,1 EU/olho/injeção. Em algumas modalidades, as composições ou métodos aqui providos permitem 0,05 EU/olho/injeção. Em algumas modalidades, as composições ou métodos aqui providos permitem 0,02 EU/olho/injeção. Em algumas modalidades, as composições ou métodos aqui providos permitem 0,01 EU/olho/injeção.
[00528] As composições de acordo com a presente invenção podem estar em formas de dosagem unitária como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões, ou supositórios, para administração oral, parenteral ou retal, ou administração por inalação ou insuflação.
[00529] Para a preparação de composições sólidas tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um carreador farmacêutico, por exemplo, ingredientes de comprimidos convencionais tais como amido de milho, lactose,
sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio ou gomas, e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção, ou seu sal farmaceuticamente aceitável não tóxico.
Quando se refere a estas composições de pré-formulação como homogêneas,
significa que o ingrediente ativo é disperso uniformemente por toda a composição, de modo que a composição possa ser facilmente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes, tais como comprimidos, pílulas e cápsulas.
Esta composição de pré-formulação sólida é então subdividida em formas de dosagem unitária do tipo descrito acima contendo de cerca de 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção.
Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou de outro modo compostos para fornecer uma forma de dosagem proporcionando a vantagem de ação prolongada.
Por exemplo,
o comprimido ou pílula pode compreender uma dosagem interna e um componente de dosagem externo, sendo o último na forma de um envelope sobre o primeiro.
Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir a desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto para dentro do duodeno ou seja retardado na liberação.
Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluindo um número de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais como goma- laca, álcool cetílico e acetato de celulose.
[00530] Agentes ativos de superfície adequados incluem, em particular, agentes não-iônicos, tais como polissorbato ou polioxietilenosorbitanos (por exemplo, TweenTM 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, SpanTM 20, 40, 60, 80 ou 85). As composições com um agente tensoativo compreenderão convenientemente entre 0,01% e 5% de agente tensoativo, e podem estar entre 0,01 e 0,02% ou 0,1 e 2,5% (polissorbato 20 ou 80). Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.
[00531] Emulsões adequadas podem ser preparadas usando-se emulsões de gordura comercialmente disponíveis, tais como INTRALIPIDTM, LIPOSYNTM, INFONUTROLTM, LIPOFUNDINTM e LIPIPHYSANTM. O ingrediente ativo pode ser dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada ou, alternativamente, pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho ou óleo de amêndoa) e uma emulsão formada mediante mistura com um fosfolipídeo (por exemplo, fosfolipídios de ovo, fosfolipídios de soja ou lecitina de soja) e água. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. As emulsões adequadas tipicamente conterão até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão de gordura pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 µm, particularmente 0,1 e 0,5 µm, e tem um pH na faixa de 5,5 a 8,0.
[00532] As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas por mistura de um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) com IntralipidTM ou seus componentes (óleo de soja, fosfolipídeos de ovo, glicerol e água).
[00533] Composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, ou misturas dos mesmos, e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados como apresentado acima. Em algumas modalidades, as composições são administradas pela via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. Composições em preferivelmente solventes farmaceuticamente aceitáveis estéreis podem ser nebulizadas pelo uso de gases. Soluções nebulizadas podem ser respiradas diretamente a partir do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser fixado a uma máscara facial, dreno ou máquina de respiração de pressão positiva intermitente. Composições de solução, suspensão ou pó podem ser administradas, preferencialmente oralmente ou nasalmente, a partir de dispositivos que distribuem a formulação de uma maneira apropriada.
Kits
[00534] A invenção também fornece kits que compreendem qualquer ou todos os anticorpos descritos aqui.
Kits da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) ou conjugado descrito aqui e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção aqui descritos.
Geralmente, estas instruções compreendem uma descrição de administração do anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) ou conjugado para os tratamentos terapêuticos acima descritos. Em algumas modalidades, são providos kits para a produção de uma única unidade de administração de dose única. Em certas modalidades, o kit pode conter um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Em certas modalidades, são incluídos kits contendo seringas pré- carregadas simples e multi-câmaras (por exemplo, seringas líquidas e lioseringas).
[00535] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. As instruções referentes ao uso de um anticorpo antagonista de IL-6 (e/ou IL-6 Ab-VEGF-trap) ou conjugado geralmente incluem informação quanto a dosagem, esquema de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multi-doses) ou doses subunitárias. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou inserção de embalagem (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transportadas sobre um disco magnético ou ótico de armazenamento) também são aceitáveis.
[00536] Os kits desta invenção estão em embalagem adequada. Embalagem adequada inclui, mas não está limitada a, frascos, garrafas, jarras, embalagem flexível (por exemplo, Mylar ou sacos plásticos selados), e semelhantes.
Também são contempladas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como uma seringa pré- enchida, um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão tal como uma minibomba. Um kit pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente também pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco dotado de uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo antagonista de IL-6 ou conjugado.
O recipiente pode ainda compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.
[00537] Kits podem opcionalmente fornecer componentes adicionais tais como tampões e informação interpretativa. Em algumas modalidades, os kits podem incluir uma seringa e agulha adicionais utilizadas para enchimento posterior da seringa dosadora. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou inserção de embalagem(ns) sobre ou associado com o recipiente.
[00538] Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos ilustrativos apenas, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes para aqueles técnicos no assunto a partir da descrição precedente e se enquadram dentro do escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLOS
[00539] A despeito do sucesso terapêutico de drogas biológicas do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) para o tratamento de doenças retinais neovasculares,
ainda existe a necessidade não atendida devido a (i) pacientes resistentes a terapia de VEGF, (ii) pacientes que perdem eficácia a agentes anti-VEGF devido à progressão de patologias subjacentes adicionais tais como fibrose, cicatrização de feridas e atrofia (iii) subtratamento devido à necessidade de injeções intravítreas frequentes. A seguir são resultados relativos a novos agentes biológicos biespecíficos projetados para inibir tanto o VEGF quanto a IL-6.
[00540] Métodos Inibidores duplos foram projetados e caracterizados por suas afinidades de ligação com seus respectivos alvos por ressonância de plasmon de superfície (SPR). Os aspectos funcionais das moléculas foram testados por (1) ensaios ELISA alvejando o bloqueio competitivo de cada alvo para seu respectivo receptor (2) ensaios de proliferação de células endoteliais microvasculares retinais humanas primárias estimuladas por VEGF e/ou IL-6 (HRMVEC) podem ser realizados, e (3) ensaios de co-cultura de células primárias tridimensionais para avaliar a inibição de brotamento angiogênico podem ser realizados.e (3) ensaios de co-cultura de células primárias tridimensionais para avaliar a inibição de germinação angiogênica podem ser realizados.
[00541] Construtos de IL-6 Ab-VEGF-trap se ligam com afinidade pM ao VEGF e IL-6. As cinéticas de ligação de cada alvo foram independentes da presença do outro, indicando que ambos os alvos podem se ligar simultaneamente sem interferência. A ligação destas moléculas a cada um dos seus alvos inibe as interações com seus respectivos receptores cognatos.
[00542] Quando combinados dentro de uma plataforma de conjugado de biopolímero, estas moléculas inibidoras duplas proporcionam um agente terapêutico adicional para a próxima geração de tratamento e prevenção de doenças retinais.
Exemplo 1 - Geração e Varredura de Anticorpos Métodos/resultados: Anti-IL-6
[00543] Os presentes exemplos delineiam o construto de uma molécula inibidora dupla anti-IL-6 e anti-VEGF contendo um anticorpo de IL-6 em uma estrutura IgG1 humana engenheirada e domínio Fc de IgG1 fundido a um anti-VEGF- trap. O domínio Fc para estas moléculas contém substituições L234A, L235A e G237A que minimizam a função efetora, e L443C que permite a conjugação específica do sítio com um biopolímero baseado em fosforilcolina de extensão da meia- vida (posições de resíduo seguem numeração EU).
[00544] O parátopo anti-IL-6 na estrutura de IgG1 humana engenheirada foi maturado com afinidade usando uma combinação de mutagênese de varredura de biblioteca em E.
coli seguido por mutagênese direcionada ao sítio em um sistema de mamífero. O construto de um sistema de plasmídeo de expressão dupla contendo Fab de cadeia pesada e leve com sequências de CDR anti-IL-6 foi obtida em E. coli. A Figura 3 ilustra um fluxograma do processo, que resultou nas regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos na Figura 5.
[00545] Bibliotecas de Fab foram construídas contendo mutações de ponto único aleatórias para todas as 71 posições de CDR, excluindo as substituições para Cys, Met e Asn devido às obrigações químicas associadas a estes aminoácidos. A expressão em escala pequena em formato de placas de 96 poços foi utilizada para triagem das bibliotecas de Fab. Colônias de E. coli (células TG1, Zyo Research) contendo mutações de ponto único aleatorizadas foram colhidas em placas de 96 poços (1,5 mL) e crescidas durante a noite a 30°C em LB Amp + 2% de glicose. Uma placa de 96 poços separada foi criada no dia seguinte pela remoção de 100 µL de cultura e adição de 100 µL de glicerol a 30%, e então armazenada a -80°C. A cultura restante foi centrifugada por 20 minutos e mais tarde ressuspensa em 1,5 mL de LB Amp contendo 1 mM de IPTG para indução de expressão de proteína a 30°C. Após 5 horas, as células foram centrifugadas, ressuspensas em 500 µL de tampão HBS-EP+ e lisadas por um ciclo de congelamento/descongelamento. Os lisados foram centrifugados durante 30 minutos e filtrados a vácuo (200 µL) em placas de 96 poços de fundo redondo para análise Biacore.
[00546] As afinidades de Fabs anti-IL-6 foram determinadas usando-se um Biacore T200 (GE Healthcare) a 25°C. Os chips CM5 foram ativados com EDC e NHS, IL-6 humana recombinante (R&D Systems) foi diluída em acetato de sódio 10 mM a pH 5 a uma concentração de 0,1 mg/mL e injetada sobre o chip ativado. Três faixas de densidade de antígenos (100- 150 RU, 300-400 RU, 400-600 RU) foram obtidas utilizando tempos de fluxo variáveis para cada canal de chip, posteriormente bloqueados com etanolamina. Os sobrenadantes dos lisados de cultura filtrados com 96 poços foram injetados a 50 µL/min durante 120 segundos. O ajuste das curvas de dissociação (300 segundos) para uma única curva de decaimento exponencial foi usado para a determinação das taxas de dissociação (koff). As superfícies de chip foram regeneradas com solução 10 mM de Glicina a pH de 1,7 injetada a 50 µL/min durante 60 segundos após cada ciclo de ligação e dissociação de amostra. Clones que mostraram valores de koff similares ou aperfeiçoados em comparação com o tipo selvagem foram submetidos ao sequenciamento de DNA para identificação de mutação.
[00547] A partir do total de 71 posições de resíduo de CDR, os dados de varredura mostraram que 15 resíduos foram críticos para a ligação de IL-6 e não puderam ser substituídos por qualquer outro aminoácido. As substituições em posições toleráveis resultaram em valores de koff similares à molécula de origem (Tabela 1.1). A maioria destas substituições únicas foi depois introduzida nos genes das cadeias pesada e leve completas, clonadas em vetores de expressão de mamíferos, que foram co-transfectados em culturas de 3 ml de culturas de células Expi293 para produção de proteína. No quinto dia, estas culturas foram centrifugadas e os sobrenadantes contendo anticorpos secretados foram colhidos e diluídos em tampão de corrida HBS-EP+ (razão de 1:20). Mutantes pontuais estão nas tabelas
1.1-1.6.
TABELA 1.1 CDR1 DE CADEIA PESADA
[00548] A tabela exibe valores de koff (s-l) para cada substituição tolerável dentro da CDR definida. No geral, mutantes apresentam koff similar à molécula parental (4.94E-
03 ± 7.67E-04). Resíduos críticos para ligação de IL-6 que não toleraram substituições são indicados como "crit".
TABELA 1.2 CDR2 DE CADEIA PESADA
[00549] A tabela exibe valores de koff (s-1) para cada substituição tolerável dentro da CDR definida. Em mutantes totais apresentam koff similar à molécula parental (4.94E- 03 ± 7.67E-04). Resíduos críticos para ligação de IL-6 que não toleraram substituições são indicados como "crit".
TABELA 1.3 CDR3 DE CADEIA PESADA
[00550] A tabela exibe valores de koff (s-l) para cada substituição tolerável dentro da CDR definida. No geral, mutantes apresentam koff similar à molécula parental (4.94E- 03 ± 7.67E-04). Resíduos críticos para ligação de IL-6 que não toleraram substituições são indicados como "crit".
TABELA 1.4
CDRL DE CADEIA LEVE
[00551] A tabela exibe valores de koff (s-l) para cada substituição tolerável dentro da CDR definida. No geral, mutantes apresentam koff similar à molécula parental (4.94E- 03 ± 7.67E-04). Resíduos críticos para ligação de IL-6 que não toleraram substituições são indicados como "crit".
TABELA 1.5 CDR2 DE CADEIA LEVE
[00552] A tabela exibe valores de koff (s-l) para cada substituição tolerável dentro da CDR definida.
No geral,
mutantes apresentam koff similar à molécula parental (4.94E-
03 ± 7.67E-04). Resíduos críticos para ligação de IL-6 que não toleraram substituições são indicados como "crit"
TABELA 1.6
CDR3 DE CADEIA LEVE
[00553] A tabela exibe valores de koff (s-l) para cada substituição tolerável dentro da CDR definida. No geral, mutantes apresentam koff similar à molécula parental (4.94E- 03 ± 7.67E-04). Resíduos críticos para ligação de IL-6 que não toleraram substituições são indicados como "crit".
[00554] A cinética de ligação destas moléculas mutantes únicas a IL-6 foi medida a 25°C usando um Biacore T200. Os anticorpos foram capturados em um chip de Proteína A (GE) por injeção de diluição 1:20 do sobrenadante celular a 10 µL/min por 60 segundos. Cinco concentrações (0,56, 1,67, 5, 15 e 45 nM) de IL-6 fluíram sobre os anticorpos capturados por 60 segundos a uma taxa de fluxo de 30 µL/min e dissociados por 180 segundos em um formato de ensaio Biacore de cinética de ciclo único. O chip sensor foi regenerado por uma injeção de 60 segundos de Glicina 10 mM pH 1,7 a uma taxa de fluxo de 50 µL/min. Uma configuração de ensaio semelhante foi usada para monitorar as interações entre as amostras de anticorpos purificados e IL-6 a 37°C, quando aplicável. Para esta configuração, 1 µg/mL de anticorpo purificado foi injetado sobre um chip de Proteína A a 10 µL/min por 25-28 segundos.
A análise dos dados para o sobrenadante e as amostras purificadas foram realizadas usando o software BIAevaluation (GE). Todos os sensogramas foram subtraídos de referência dupla e ajustados usando um modelo de ligação Langmuir 1:1.
[00555] De todas as mutações de ponto único testadas
(Tabela 1.7), a mutação G66D na CDR2 da cadeia pesada
(numeração sequencial do domínio variável do anticorpo)
resultou em um aumento de afinidade marcado (diminuição de
~ 2 vezes em KD em relação ao tipo selvagem: 6,95x10-11 M vs
1,58x10-10 M respectivamente). G66D foi retido e os resíduos de CDR de cadeia pesada e leve que poderiam ter passivos químicos relacionados à fabricação (Cys, Met, Asn) foram mutagenizados.
Com base nesta premissa, duas variantes de cadeia pesada foram geradas incluindo mutações triplas
(Tabela 1.9): I) M34I/G66D/I108V, II) M34W/G66D/I108V e três variantes de cadeia leve incluindo mutações triplas e quádruplas (Tabela 1.10): III) M32L/M50D/N52S/M88Q, IV)
M32L/M50A/N52S/M88Q, V)M32L/M50D/M88Q (as posições dos resíduos seguem a numeração sequencial da cadeia pesada variável do anticorpo). Avaliamos a ligação de IL-6 a todas as combinações possíveis entre essas variantes usando a mesma configuração de ensaio Biacore descrita para as mutações de ponto único.
Nossos resultados demonstraram que essas mutações neutralizaram o efeito da mutação G66D de ponto único, mantendo a afinidade para IL-6 mais próxima da sequência CDR parental (Tabela 1.8). Com base nesses resultados, essas CDRs modificadas foram incorporadas ao projeto do anti-IL-6 e IL-6 Ab-VEGF-Trap.
TABELA 1.7 Sup/25 ◦C Purificado/37 ◦C Cadeia pesada Cadeia C - leve - ka kd ka kd D muta- muta- Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² R ção ção tura Ms) s) (M) (RU) (RU²) tura Ms) s) (M) (RU) (RU²)
3.1 1.2 3.9 8.8 1.3 1.5
981. 5E+ 6E- 9E- 223. 0.10 138. 0E+ 9E- 8E- WT WT 4 05 04 10 2 8 1 05 04 10 34.6 0.397
5.5 1.1 2.0 8.4 3.9 4.6
437. 1E+ 5E- 9E- 0.03 172. 2E+ 0E- 3E- G26S WT 8 05 04 10 96.7 58 4 05 04 10 39.8 0.0688
4.0 1.2 3.0 7.0 3.2 4.6
638. 2E+ 1E- 2E- 141. 0.03 183. 2E+ 6E- 5E- G26R WT 4 05 04 10 5 04 3 05 04 10 42.8 0.185
8.5 2.0 2.4 6E+ 6E- 0E- 129. F27G WT 764 05 04 10 3 0.19
5.7 1.9 3.4
734. 0E+ 6E- 4E- 125. 0.09 F27P WT 7 05 04 10 9 13
5.0 2.0 4.1
809. 3E+ 9E- 5E- 137. 0.06 F27R WT 6 05 04 10 7 38
7.3 2.0 2.7
573. 1E+ 3E- 8E- F27S WT 2 05 04 10 93.5 0.12
4.7 2.0 4.4
699. 0E+ 8E- 2E- 0.05 F27V WT 4 05 04 10 114 48
3.3 1.3 4.1 Cadeia pesada - CDR1
797. 2E+ 7E- 2E- 165. 0.22 T28Y WT 6 05 04 10 6 9
3.8 1.4 3.7
773. 6E+ 3E- 0E- 0.15 T28K WT 6 05 04 10 171 7
3.9 1.3 3.5
705. 3E+ 9E- 4E- 157. 0.06 T28A WT 1 05 04 10 5 35
4.6 1.6 3.4
832. 9E+ 3E- 7E- 192. 0.11 T28E WT 8 05 04 10 9 2
4.9 1.3 2.7 8.5 3.9 4.6
653. 5E+ 5E- 3E- 148. 0.02 156. 0E+ 7E- 6E- F29H WT 3 05 04 10 1 71 2 05 04 10 37.2 0.0579
4.9 1.3 2.6 8.4 3.7 4.4
623. 9E+ 3E- 6E- 139. 0.04 174. 2E+ 4E- 4E- F29Y WT 6 05 04 10 3 23 1 05 04 10 40.2 0.078
4.1 1.5 3.7
619. 7E+ 7E- 6E- 127. 0.14 S30W WT 7 05 04 10 9 5
3.6 1.2 3.3
545. 5E+ 2E- 4E- 110. 0.08 S30Y WT 2 05 04 10 9 53
3.9 1.3 3.3
686. 8E+ 2E- 3E- 0.10 S30G WT 2 05 04 10 156 8 P31 WT CRÍTICO
4.1 1.3 3.1 6.5 3.7 5.6
328. 8E+ 3E- 8E- 0.03 155. 0E+ 0E- 9E- F32G WT 5 05 04 10 68.3 32 1 05 04 10 36.2 0.0601 A33 WT CRÍTICO
Sup/25 ◦C Purificado/37 ◦C Cadeia pesada Cadeia C - leve - ka kd ka kd D muta- muta- Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² R ção ção tura Ms) s) (M) (RU) (RU²) tura Ms) s) (M) (RU) (RU²)
2.9 1.1 3.9 5.9 2.3 3.9
634. 6E+ 5E- 0E- 119. 0.05 118. 9E+ 6E- 4E- M34W WT 5 05 04 10 6 57 3 05 04 10 24.2 0.226
3.4 1.3 3.7
942. 8E+ 2E- 9E- 202. 0.03 S35H WT 1 05 04 10 8 05
3.7 1.3 3.4
587. 5E+ 0E- 6E- 128. 0.08 S35Q WT 6 05 04 10 9 34
4.6 1.5 3.4
182. 0E+ 9E- 6E- 0.02 V48I WT 6 05 04 10 42.2 24
6.5 1.3 2.1 4E+ 8E- 0E- 0.04 V48Q WT 49.5 05 04 10 12.8 18
4.4 1.5 3.3
410. 8E+ 1E- 7E- 0.04 A49T WT 6 05 04 10 96.2 95 K50 WT CRÍTICO
4.6 7.6 1.6 6.7 3.4 5.0
605. 2E+ 0E- 5E- 132. 0.16 9E+ 3E- 5E- I51R WT 9 05 05 10 1 8 126 05 04 10 28.5 0.173 S52 WT CRÍTICO P53 WT CRÍTICO G54 WT CRÍTICO G55 WT CRÍTICO Cadeia pesada - CDR2
2.7 1.5 5.6
521. 3E+ 5E- 7E- 0.03 S56R WT 8 05 04 10 97.4 49
3.5 1.6 4.5
582. 6E+ 1E- 2E- 128. 0.03 S56H WT 3 05 04 10 4 84
5.7 1.2 2.2 8.6 4.5 5.2
335. 7E+ 8E- 2E- 0.02 146. 4E+ 3E- 4E- W57F WT 5 05 04 10 78.1 13 5 05 04 10 37.2 0.0527
4.6 1.7 3.9
553. 0E+ 9E- 0E- 0.01 T58K WT 5 05 04 10 121 68
3.5 1.5 4.2
606. 7E+ 2E- 6E- 131. 0.05 T58R WT 4 05 04 10 5 29
8.0 1.8 2.2
621. 3E+ 1E- 6E- 0.03 T58V WT 7 05 04 10 144 86 Y59 WT CRÍTICO Y60 WT CRÍTICO
3.4 1.6 4.6
510. 8E+ 2E- 7E- 119. 0.04 S61R WT 6 05 04 10 1 01
3.7 1.4 3.9
546. 9E+ 9E- 4E- 123. 0.03 S61A WT 2 05 04 10 6 76
4.0 1.4 3.6 8.7 6.0 6.8 1055 3E+ 8E- 6E- 237. 0.09 5E+ 1E- 7E- D62Q WT .5 05 04 10 3 74 70.3 05 04 10 17.5 0.156
Sup/25 ◦C Purificado/37 ◦C Cadeia pesada Cadeia C - leve - ka kd ka kd D muta- muta- Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² R ção ção tura Ms) s) (M) (RU) (RU²) tura Ms) s) (M) (RU) (RU²)
4.2 1.4 3.5
279. 0E+ 7E- 0E- 0.02 D62F WT 2 05 04 10 63.8 14
4.1 1.7 4.2
547. 0E+ 4E- 3E- 127. 0.06 T63D WT 4 05 04 10 4 77
3.8 1.6 4.4
622. 0E+ 9E- 5E- 141. 0.04 T63E WT 5 05 04 10 7 19
5.4 2.1 3.8
882. 6E+ 2E- 8E- 137. 0.13 T63K WT 7 05 04 10 4 4
5.1 2.0 4.0
702. 7E+ 9E- 4E- 0.04 T63G WT 6 05 04 10 134 25
3.0 1.8 5.9
900. 9E+ 4E- 4E- 208. 0.26 T63Q WT 9 05 04 10 1 1
4.4 1.7 4.0
558. 4E+ 8E- 2E- 130. 0.06 V64A WT 1 05 04 10 3 83
0.0 2.7
559. 749 002 5E- 123. 0.06 T65Y WT 1 000 06 10 8 42
5.6 9.5 597 9E- 4E- 0.04 T65G WT 3.2 000 05 11 3 98
1.0 1.1 1.0 1.9 1.7 8.9 2E+ 0E- 7E- 176. 0.24 105. 1E+ 1E- 5E- G66E WT 743 06 04 10 8 2 2 06 04 11 31.3 0.522
1.3 1.1 9.0 1.9 1.3 6.9
783. 0E+ 7E- 2E- 184. 0.25 142. 6E+ 6E- 5E- G66D WT 5 06 04 11 9 4 8 06 04 11 39.9 0.513
3.1 1.7 5.7
547. 1E+ 9E- 4E- 128. 0.06 A97V WT 3 05 04 10 2 54
1.7 2.5 1.4
693. 6E+ 1E- 2E- 148. 0.34 R98G WT 2 05 04 09 9 4
3.6 7.3 2.0
879. 8E+ 7E- 0E- 183. 0.05 Cadeia pesada - CDR3 Q99A WT 2 05 04 09 2 75
5.3 1.0 1.9 1004 9E+ 5E- 4E- 213. 0.09 Q99H WT .6 05 03 09 9 4
3.9 1.5 3.8 8.2 4.1 4.9 1264 8E+ 3E- 4E- 281. 0.04 121. 3E+ 0E- 9E- L100Q WT .1 05 04 10 2 85 4 05 04 10 28.4 0.155 W101 WT CRÍTICO
4.5 6.0 1.3
777. 2E+ 0E- 3E- 0.08 G102D WT 7 05 04 09 136 32
7.3 2.1 2.9
774. 7E+ 9E- 7E- 0.08 Y103D WT 6 05 04 10 140 26
5.4 2.3 4.2 1016 6E+ 1E- 3E- 177. 0.12 Y103S WT .4 05 04 10 8 5
Sup/25 ◦C Purificado/37 ◦C Cadeia pesada Cadeia C - leve - ka kd ka kd D muta- muta- Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² R ção ção tura Ms) s) (M) (RU) (RU²) tura Ms) s) (M) (RU) (RU²)
7.1 1.6 2.2
794. 8E+ 5E- 9E- 192. 0.02 Y103E WT 4 05 04 10 4 89
5.2 7.0 1.3
276. 5E+ 3E- 4E- 0.07 Y104V WT 8 05 04 09 41 45
4.7 4.9 1.0
524. 4E+ 3E- 4E- 0.10 A105Q WT 4 05 04 09 94.8 7
4.0 7.2 1.7
520. 4E+ 3E- 9E- 0.08 A105H WT 8 05 04 09 108 69
5.9 1.8 3.1 8.5 5.4 6.3 1138 1E+ 5E- 4E- 252. 0.09 444. 2E+ 1E- 4E- 100. L106F WT .8 05 04 10 2 55 9 05 04 10 5 0.17
4.7 1.3 2.7
268. 9E+ 4E- 9E- 0.08 L106I WT 1 05 04 10 60 89
5.0 1.4 2.9 7.6 4.0 5.2
900. 9E+ 7E- 0E- 200. 0.06 344. 2E+ 2E- 7E- D107E WT 1 05 04 10 7 43 2 05 04 10 78.7 0.145
3.6 1.4 3.9 6.8 4.0 5.8 1177 5E+ 6E- 9E- 251. 0.07 193. 3E+ 1E- 7E- I108F WT .7 05 04 10 7 28 5 05 04 10 42.7 0.216
5.7 1.7 3.0 9.2 3.7 4.0 1135 1E+ 4E- 5E- 254. 0.15 234. 1E+ 2E- 4E- I108E WT .2 05 04 10 4 6 8 05 04 10 53.8 0.255
5.5 1.4 2.5 8.5 3.3 3.9
815. 4E+ 1E- 6E- 177. 0.04 8E+ 6E- 1E- I108S WT 4 05 04 10 3 21 89.5 05 04 10 20.8 0.362
4.8 2.6 5.5 4E+ 7E- 1E- 0.05 WT S24P 44.3 05 06 12 11.2 02
3.1 1.3 4.2 1E+ 2E- 4E- 167. 0.02 WT S24K 739 05 04 10 3 5
3.4 1.3 4.0
787. 0E+ 7E- 3E- 180. 0.22 WT S24V 2 05 04 10 6 5
4.7 1.3 2.8
597. 6E+ 5E- 4E- 129. 0.05 Cadeia leve - CDR1 WT S24I 7 05 04 10 6 41
5.3 1.0 1.9 7.8 3.4 4.3
386. 5E+ 5E- 7E- 0.01 351. 2E+ 2E- 8E- WT A25S 6 05 04 10 90.6 95 4 05 04 10 86.1 0.21
5.0 1.1 2.3 8.8 3.7 4.2 8E+ 9E- 5E- 0.02 9E+ 8E- 5E- WT A25T 513 05 04 10 118 22 77.5 05 04 10 19.8 0.163
7.9 2.2 2.8 3E+ 3E- 1E- WT S26G 5.9 05 04 10 3.6 0.15
4.1 1.4 3.6
525. 5E+ 9E- 0E- 117. 0.11 WT S26H 5 05 04 10 4 1
3.7 1.6 4.3
696. 9E+ 4E- 3E- 155. 0.14 WT S26K 4 05 04 10 4 4
4.3 1.4 3.3 8.1 4.4 5.5
878. 7E+ 5E- 2E- 0.03 166. 1E+ 9E- 3E- WT I27L 5 05 04 10 202 56 2 05 04 10 39.1 0.18
Sup/25 ◦C Purificado/37 ◦C Cadeia pesada Cadeia C - leve - ka kd ka kd D muta- muta- Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² R ção ção tura Ms) s) (M) (RU) (RU²) tura Ms) s) (M) (RU) (RU²)
4.8 1.6 3.3 1.0 7.6 7.1
516. 7E+ 1E- 0E- 113. 0.12 151. 6E+ 4E- 9E- WT I27W 3 05 04 10 3 9 7 06 04 10 30.6 0.221
4.3 1.9 4.4 1.0 6.9 6.8
748. 6E+ 3E- 3E- 0.08 165. 1E+ 0E- 5E- WT I27F 4 05 04 10 168 02 3 06 04 10 38.5 0.186
4.2 1.2 2.8
673. 0E+ 1E- 9E- 159. 0.26 WT S28E 8 05 04 10 5 6
3.6 1.7 4.6 9E+ 1E- 4E- 110. 0.01 WT S28R 468 05 04 10 9 96
3.5 1.7 4.8
385. 1E+ 1E- 7E- 0.17 WT V29L 6 05 04 10 83.4 1
5.4 1.7 3.1 8E+ 3E- 6E- 0.08 WT S30G 84.5 05 04 10 19.3 63
2.5 1.6 6.3 5E+ 3E- 9E- 0.06 WT S30A 760 05 04 10 169 53
3.0 2.0 6.6
405. 5E+ 3E- 6E- 0.01 WT Y31G 9 05 04 10 92.8 83
2.9 1.3 4.7
745. 2E+ 8E- 2E- 184. 0.02 WT Y31F 1 05 04 10 2 74
5.9 1.1 1.9 8.8 3.5 3.9
563. 1E+ 8E- 9E- 0.01 188. 5E+ 0E- 5E- WT M32L 2 05 04 10 130 92 7 05 04 10 44.6 0.216
5.0 1.1 2.3 8.6 3.6 4.2
426. 5E+ 6E- 0E- 0.02 175. 1E+ 9E- 9E- WT M32V 5 05 04 10 98.8 26 6 05 04 10 43.4 0.188 WT Y33 CRÍTICO WT L45 CRÍTICO
4.6 2.0 4.4
486. 0E+ 3E- 2E- 0.03 WT L46V 4 05 04 10 96.3 11
4.7 1.9 4.1 1E+ 5E- 4E- 0.02 WT I47V 490 05 04 10 93.3 58
3.4 1.2 3.5 Cadeia leve - CDR2
500. 5E+ 3E- 6E- 121. 0.01 WT Y48W 3 05 04 10 7 46
4.5 1.1 2.4 6.6 4.1 6.2
376. 9E+ 1E- 1E- 0.07 164. 8E+ 7E- 4E- WT D49E 2 05 04 10 79.7 25 3 05 04 10 36.5 0.181
8.0 1.1 1.3 1.4 4.6 3.1
544. 6E+ 2E- 8E- 129. 0.03 9E+ 4E- 1E- WT M50D 3 05 04 10 3 28 48.4 06 04 10 13.7 0.188
3.9 2.1 5.3 6E+ 2E- 5E- 137. 0.04 WT S51K 817 05 04 10 3 79
4.9 2.3 4.6
419. 9E+ 1E- 3E- 0.04 WT S51R 5 05 04 10 64.6 01
7.2 2.1 2.9
552. 9E+ 6E- 6E- 0.04 WT S51D 6 05 04 10 77.5 87
Sup/25 ◦C Purificado/37 ◦C Cadeia pesada Cadeia C - leve - ka kd ka kd D muta- muta- Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² R ção ção tura Ms) s) (M) (RU) (RU²) tura Ms) s) (M) (RU) (RU²)
4.3 1.5 3.5
671. 0E+ 2E- 3E- 160. 0.02 WT N52S 2 05 04 10 2 46
5.4 2.1 4.0
420. 4E+ 8E- 1E- 0.03 WT L53H 5 05 04 10 64.9 96
1.1 6.1 5.1 9E+ 4E- 8E- 0.05 WT L53W 10.2 06 06 12 3.5 26
4.1 1.8 4.4
445. 6E+ 5E- 6E- 0.03 WT L53R 3 05 04 10 87.7 31
4.7 1.9 4.1 5E+ 8E- 6E- 0.02 WT A54G 302 05 04 10 54.2 41
6.5 1.0 1.6
104. 2E+ 9E- 8E- 0.07 WT A54Y 2 05 04 10 18 25
4.2 2.1 4.9
391. 0E+ 0E- 9E- 0.04 WT A54L 8 05 04 10 68.2 73
5.6 2.2 4.0
472. 3E+ 6E- 1E- 0.07 WT S55W 5 05 04 10 69.3 16
4.3 2.0 4.6
615. 6E+ 1E- 1E- 102. 0.03 WT S55Y 7 05 04 10 7 84
9.8 1.0 1.0 7E+ 7E- 9E- 0.09 WT S55R 17.8 05 04 10 5.2 81
6.6 2.2 3.2 8E+ 0E- 9E- 0.13 WT S55L 661 05 04 10 99.8 1
4.4 1.0 2.3 6.1 4.4 7.1
240. 8E+ 7E- 9E- 0.05 128. 9E+ 1E- 3E- WT M88V 3 05 04 10 49.4 02 8 05 04 10 29.8 0.176
4.5 1.2 2.8 5.8 1.3 2.2
328. 1E+ 7E- 2E- 0.97 151. 6E+ 2E- 5E- WT M88A 8 05 04 10 51.3 6 7 05 03 09 27.5 0.141
3.6 2.7 7.5
471. 2E+ 2E- 2E- 0.01 Cadeia leve - CDR3 WT Q89S 5 05 04 10 61.2 71
5.4 2.2 4.1
186. 3E+ 7E- 9E- 0.08 WT Q89A 6 05 04 10 32.2 5 WT W90 CRÍTICO
3.4 1.3 4.0
345. 1E+ 9E- 7E- 0.03 WT S91A 3 05 04 10 79 25 WT G92 CRÍTICO WT Y93 CRÍTICO WT P94 CRÍTICO
8.8 3.3 3.8
503. 2E+ 8E- 3E- 0.12 WT Y95G 8 05 04 10 51 6
Sup/25 ◦C Purificado/37 ◦C Cadeia pesada Cadeia C - leve - ka kd ka kd D muta- muta- Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² Cap- (1/ (1/ KD Rmax Chi² R ção ção tura Ms) s) (M) (RU) (RU²) tura Ms) s) (M) (RU) (RU²)
5.9 4.4 7.4
274. 3E+ 4E- 8E- 0.10 WT Y95I 3 05 03 09 42.2 7
5.2 1.3 2.5 8.8 7.9 9.0 0E+ 5E- 9E- 172. 2E+ 5E- 1E- WT T96L 399 05 04 10 83.8 1.01 8 05 04 10 37.1 0.234
4.5 1.9 4.2 9.2 6.3 6.9 4E+ 2E- 3E- 110. 0.16 147. 1E+ 9E- 5E- WT T96V 523 05 04 10 6 9 3 05 04 10 34.8 0.202
[00556] Cinética Biacore para mutações de ponto único anti-IL-6. Os dados foram obtidos para amostras antes (sup) a 25°C e depois da purificação a 37°C. as mutações selecionadas para estarem em combinações de CDR finais (Tabela 4) são canalizadas. As posições de CDR que não toleraram mutações na triagem bacteriana são indicadas como críticas.
TABELA 1.8
[00557] Dados de cinética Biacore para variantes de CDR de Anti-IL-6. Os dados cinéticos foram obtidos a partir de sobrenadantes de cultura celular (sup) a 25°C e amostras purificadas a 37°C. Mutações de CDR de cadeia pesada e leve são indicadas no lado esquerdo e direito, respectivamente
(pesada/leve). As taxas de captura, kon (ka), koff (kd) e constantes de dissociação são listadas na tabela.
TABELA 1.9. Sequências de região variável de cadeia pesada de anti-IL-6. Algumas modalidades de CDRS estão sublinhadas.
ID Sequência
I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDT VTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 140)
II EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDT VTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 141) TABELA 1.10. Sequências de região variável de cadeia leve de anti-IL-6. Algumas modalidades de CDRS estão sublinhadas.
ID Sequência
III DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSYLYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 142)
IV DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSYLYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 143)
V DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSYLYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 144)
Exemplo 2 - Desenvolvimento da molécula Anti-IL-6 Ab- VEGF-trap
[00558] A porção de ligação de VEGF do IL-6 Ab-VEGF- trap consistiu de uma fusão entre o domínio 2 de VEGFR1 e o domínio 3 de VEGFR2 (Tabela 2.0). Esta fusão funciona como um VEGF-trap, impedindo que o VEGF se ligue a receptores de VEGF celular.
TABELA 2.0. Sequência de VEGF-trap
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRII WDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIEL
SVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO: 145)
[00559] 12 construtos foram testados contendo o VEGF- trap em duas configurações distintas (Tabela 2.1). Na primeira configuração, o VEGF-trap foi posicionado no início da proteína, seguido por uma série em duplicata de um ligante Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GS), que conecta o VEGF-trap ao N- terminal da cadeia pesada de anti-IL-6 (VEGF-trap-AntIL-6; Tabela 2.1, moléculas A-F). Na segunda configuração, os domínios variáveis e constantes da cadeia pesada (região Fab) são conectados ao VEGF-trap através do ligante GS, e então o domínio Fc é fundido à extremidade C-terminal do VEGF-trap. Assim, nesta configuração, o VEGF-trap é prensado entre as regiões Fab e Fc de anticorpo (AntiIL-6-VEGF-trap; Tabela 2.1, moléculas G-L).
TABELA 2.1: Sequências de cadeia pesada e de cadeia leve para moléculas inibidoras duplas. Algumas modalidades de CDRS estão sublinhadas nas cadeias pesada e leve, a sequência de VEGF-trap está em negrito, o ligante GLY-SER está em itálico (e negrito).
ID Cadeia pesada Cadeia leve
A SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 146)
ISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
ID Cadeia pesada Cadeia leve
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 269)
B SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 148)
ISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
ID Cadeia pesada Cadeia leve
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 147)
C SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 150)
ISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 149)
ID Cadeia pesada Cadeia leve
D SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 152)
WSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 151)
E SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY
ID Cadeia pesada Cadeia leve
THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 154)
WSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 153)
F SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY VTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRK LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS GFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNC PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL TARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS KTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCA GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
ID Cadeia pesada Cadeia leve
ASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSEV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFA (SEQ ID NO: 156)
WSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTV TDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 155)
G EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 158)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD
ID Cadeia pesada Cadeia leve
TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 157)
H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 160)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY
ID Cadeia pesada Cadeia leve
PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 159)
I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAISWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 162)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK
ID Cadeia pesada Cadeia leve
DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 161)
J EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 164)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
ID Cadeia pesada Cadeia leve
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 163)
K EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 166)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
ID Cadeia pesada Cadeia leve
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 165)
L EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASISVSY FAWSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSD LYWYQQKPGKAPKLLIYDDSNLASGVPSRFS TVTDRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAV GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSGY YYCARQLWGYYALDVWGQGTLVTVSSASTKG PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EPKSCGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPE (SEQ ID NO: 168)
IIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLD TLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLT CEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEKDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSCSPGK (SEQ ID NO: 167)
[00560] Biacore (configuração conforme descrita nos dados cinéticos da sessão anterior) mostrou que, embora os valores de KD entre todas as variantes sejam comparáveis, há uma variação nos valores de captura para as amostras de sobrenadante (Tabela 2.2). Este parâmetro é sensível à quantidade de anticorpo presente em solução, que sugeriu uma variação no nível de expressão de proteína entre estas moléculas devido às diferentes composições de CDR. Por outro lado, as duas posições de VEGF-trap testadas não apresentaram influência acentuada nos dados cinéticos. Os experimentos que monitoram os níveis de expressão (dados não mostrados) mostraram que a configuração do IL-6-VEGF-trap tem cerca de 20% de aumento de produção de expressão em comparação com a configuração do VEGF-trap-AntiIL-6. Os dados de Biacore preliminar também indicam que a configuração de AntiIL-6- VEGF-trap se liga mais rigorosamente a um homólogo de VEGF, o fator de crescimento placentário (PLGF) (dados não mostrados).
TABELA 2.2
[00561] Dados cinéticos de Biacore para variantes de inibidor duplo A-L se ligando a IL-6. Dados cinéticos foram obtidos a partir de amostras de sobrenadantes de cultura celular (sup) a 25°C e amostras purificadas em a 37°C. As taxas de captura, kon (ka), koff (kd) e constantes de dissociação são listadas.
Sup/25°C Purificada/37°C ID Captura ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Captura ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) A 521.4 3.09E+05 1.82E-04 5.89E-10 100 1.11E+06 5.38E-04 4.84E-10 B 144.3 6.05E+05 1.85E-04 3.05E-10 106.6 1.06E+06 5.36E-04 5.07E-10 C 474.6 3.79E+05 1.50E-04 3.94E-10 92 1.01E+06 4.81E-04 4.77E-10 D 356.2 4.33E+05 1.09E-04 2.53E-10 105.4 1.23E+06 4.47E-04 3.65E-10 E 228 5.04E+05 1.51E-04 2.99E-10 97.9 1.08E+06 4.59E-04 4.24E-10 F 272.1 6.11E+05 1.37E-04 2.25E-10 93.9 1.31E+06 4.46E-04 3.4E-10 G 519 2.52E+05 1.49E-04 5.89E-10 109 1.26E+06 5.67E-04 4.51E-10 H 424.7 4.54E+05 1.62E-04 3.56E-10 97.3 1.34E+06 5.29E-04 3.96E-10 I 552.8 2.17E+05 1.47E-04 6.79E-10 108.9 1.15E+06 4.99E-04 4.35E-10 J 335 5.34E+05 1.49E-04 2.80E-10 88.9 1.42E+06 6.64E-04 4.68E-10 K 279.8 6.29E+05 1.78E-04 2.82E-10 93.9 1.28E+06 5.79E-04 4.52E-10 L 312.4 7.05E+05 1.69E-04 2.39E-10 91.9 1.49E+06 6.50E-04 4.36E-10 Exemplo 3 Inibidor duplo se ligando ao VEGF via Biacore
[00562] Para avaliar a cinética de ligação das diferentes configurações de inibidores duplos ao VEGF, uma série de ensaios Biacore foi realizada para medir a afinidade entre estas moléculas. A cinética de ligação foi medida a 37°C em tampão HBS-EP+ contendo 1 mg/mL de BSA. Os agentes Anti-VEGF (VEGF-trap-AntiIL-6 (5 µg/mL), AntiIL-6-VEGF-trap (5 µg/mL), OG1950 (1 µg/mL) e Eylea (0,5 µg/mL) foram capturados em um chip de Proteína a (GE) a 10 µL/min durante 25 segundos, cinco concentrações de VEGF-A165 (0,19, 0,56, 1,67, 5, 15 nM) foram fluidas sobre anticorpos capturados por 120 segundos a 30 µL/min e dissociadas por 30 min. A superfície do chip sensor foi regenerada por injeção de 60 segundos de 10 mM de Glicina, pH 1,7 a uma taxa de fluxo de 50 µL/min. Todos os sensogramas foram subtraídos de referência dupla e ajustados utilizando um modelo de ligação de Langmuir 1:1.
[00563] Os dados mostram que o componente VEGF-trap na molécula inibidora dupla se liga firmemente ao VEGF-A independente da configuração. O componente de molécula anti- IL-6 não parece influenciar a ligação de VEGF-A ao VEGF- trap, uma vez que as moléculas de inibidor duplo mostram afinidade similar à afinidade de VEGF como outra molécula baseada em VEGF-trap (Eylea) (Figura 7).
IL-6 e VEGF-A se ligando a moléculas inibidoras duplas
[00564] Um ensaio Biacore foi implementado para monitorar diretamente a ligação dupla de IL-6 e VEGF-A. As moléculas de inibidor duplo (2 µg/mL) foram capturadas sobre um chip de Proteína A (GE) a 10 µL/min durante 25 segundos, cinco concentrações de IL-6 e/ou VEGF-A165 (0,19, 0,56, 1,67, 5, 15 nM) foram fluidas individualmente ou misturadas sobre anticorpos capturados durante 120 segundos a 30 µL/min e dissociadas por 30 minutos. A superfície do chip sensor foi regenerada por injeção de 60 segundos de 10 mM de Glicina, pH 1,7 a uma taxa de fluxo de 50 µL/min. Todos os dados foram subtraídos de referência dupla, e a soma de IL-6 individuais e sensogramas de VEGF-A foram usados para criar uma curva teórica, que foi comparada com os sensogramas de amostras misturadas.
[00565] Os resultados demonstraram que as curvas teóricas e experimentais são quase superpostas, o que suporta fortemente um modelo onde ambos os alvos se ligam às moléculas inibidoras duplas sem afetar suas respectivas interações. (Figura 8) ELISA de ligação de Anti-IL-6 ao complexo IL-6/IL-6-R
[00566] Complexos de IL-6/IL-6R podem se ligar ao receptor ligado a membrana, gpl30, e este complexo trimérico estimula a sinalização de IL-6, tal como proliferação e suprarregulação de VEGF. A inibição de ligação de IL-6 a IL- 6R ou a ligação de IL-6/IL-6R a gp130 bloqueia as vias de sinalização a jusante mediadas por IL-6. Para determinar se os anticorpos anti-IL-6 bloqueiam estes eventos de ligação, foi primeiro estabelecido um ELISA para avaliar se eles podem se ligar a IL-6 enquanto ele é complexado com receptor de IL-6.
[00567] Um ELISA Nunc MaxiSorp foi revestido com 100 µL de 1 µg/ml de IL-6R humana recombinante (Sistemas R&D) de um dia para o outro. 10 nM de IL-6 (Sistemas R&D) foram misturados com uma série de diluição de 3 vezes de anti-IL- 6 (concentrações finais de 30 nM até 10 pM). Após o bloqueio e a lavagem, a mistura foi adicionada às placas revestidas com IL-6R. Este ensaio foi também realizado primeiro incubando a placa revestida de IL-6R com 10 nM de IL-6, lavagem e, então, adicionando o anticorpo anti-IL-6. Para ambos os métodos, os complexos de anticorpo ligado/IL-6 foram detectados com um anticorpo IgG anti-Humano e desenvolvido com TMB (KPL) durante 10 minutos. A absorbância a 450 nM foi medida em um leitor de placa SpectraMax Plus (Molecular Devices) e plotada contra a concentração de anticorpo utilizando o Software GraphPad Prism e ajustada com uma curva de regressão não linear.
[00568] Um ELISA Nunc MaxiSorp foi revestido com 100 µL de 1 µg/ml de IL-6 humana recombinante (sistemas R&D) de um dia para o outro. Uma série de diluição de 3 vezes de sistemas anti-IL-6 (R&D; concentrações finais de 30 nM até 10 pM) foram realizadas e soluções foram adicionadas às placas revestidas com IL-6 bloqueadas. Complexos anticorpo/IL-6 foram detectados com anticorpo HRP anti- humano IgG e desenvolvidos com TMB (KPL,) durante 10 minutos.
A absorbância a 450 nM foi medida em um leitor de placa SpectraMax Plus (Molecular Devices) e plotada contra a concentração de anticorpo utilizando o Software GraphPad Prism e ajustada com uma curva de regressão não linear.
[00569] Sob as condições testadas, o anticorpo anti- IL-6 descrito aqui se liga especificamente a IL-6, mas não quando ele é complexado com receptor de IL-6, sugerindo que o anticorpo e IL-6R compartilham um epítopo comum em IL-6.
Os resultados são mostrados na Figura 4.
ELISA de IL-6/IL-6R competitivo
[00570] Um ELISA para determinar se o anticorpo anti- IL-6 e inibidores duplos de IL-6/VEGF bloquearam IL-6 de se ligar a IL-6R foi então realizado.
[00571] Um ELISA Nunc MaxiSorp foi revestido com 100 µL de 1 µg/ml de anticorpo complexo anti-IL-6/IL-6R (Sistemas R&D; IL-6/IL-6R DuoSet) de um dia para o outro. A placa foi bloqueada em 2% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS- Tween (PBST) durante 2 horas. Durante o bloqueio, 6 nM de IL-6 (Sistemas R&D), 1 nM de IL-6 R (Sistemas R&D), e uma série de diluição de 3 vezes de 8 pontos de inibidores duplos ou controles de braço único (começando com 30 nM) foram incubadas à temperatura ambiente. Esta mistura foi então adicionada à placa ELISA seguindo uma etapa de lavagem. Após 1 hora, a placa foi lavada e incubada com anticorpo anti-IL- 6/IL-6R biotinilado (R&D Duoset). Os complexos IL-6/IL-6R foram detectados com a diluição de esteptravidina-HRP (1:
2.000; Sistemas R&D) e desenvolvidos usando reagente TMB (KPL) durante 10 minutos. A absorbância a 450 nM foi medida em um leitor de placa SpectraMax Plus (Molecular Devices) e plotada contra a concentração de anticorpo utilizando o Software GraphPad Prism e ajustada com uma curva de regressão não linear.
[00572] Sob estas condições, o anticorpo anti-IL-6 e inibidores duplos de IL-6/VEGF competem eficazmente com IL- 6R para ligação a IL-6 e, portanto, inibem a interação de IL-6/IL-6R. Os valores de IC50 para moléculas de inibidor duplo são comparáveis (anti-IL-6 = 0,36 nM, VEGF-trap-anti- IL-6 = 0,47 nM, e anti-IL-6-VEGF-trap = 0,32 nM), indicando que a configuração da molécula não influencia a ligação ou inibição de IL-6. Eylea serviu como um controle negativo.
(Figura 9) ELISA de VEGF/VEGFR competitivo
[00573] Para avaliar a função do VEGF-trap, a capacidade dos inibidores duplos de IL-6/VEGF bloquear a ligação de VEGF ao seu receptor (VEGFR) foi testada por ELISA competitivo.
[00574] Um ELISA Nunc MaxiSorp foi revestido com 100 µL de 1 µg/ml de VEGFR-Fc humano recombinante (Sistemas R&D) de um dia para o outro. A placa foi bloqueada em 2% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS-Tween (PBST) durante 2 horas. Durante o bloqueio, 100 pM de VEGF biotinilado (btVEGF; Sistemas R&D) foram incubados com concentrações crescentes de anti-IL-6-VEGF-trap, VEGF-trap-Anti-IL-6, ou o anticorpo anti-VEGF bivalente OG1950. Ligação bt-VEGF foi detectada com esteptravidina-HRP (diluição 1:2.000; Sistemas R&D) e desenvolvida usando reagente TMB (KPL) por 10 minutos.
A absorbância a 450 nM foi medida em um leitor de placa
SpectraMax Plus (Molecular Devices) e plotada contra a concentração de anticorpo utilizando o Software GraphPad Prism e ajustada com uma curva de regressão não linear.
[00575] Sob estas condições, os inibidores duplos IL- 6/VEGF se ligam ao VEGF e inibem a ligação a seu receptor.
Quando o VEGF-trap está situado na extremidade N-terminal do anticorpo anti-IL-6, a inibição de VEGF é aproximadamente 2,5 vezes mais potente do que a molécula cujo VEGF-trap é posicionado entre os domínios Fab e Fc do anticorpo anti-IL- 6 (IC50 1,74 nM vs 4,53 nM, respectivamente), provavelmente devido a uma mudança na valência de 2 sítios de ligação a um sítio de ligação. Os resultados são mostrados na Figura 9.
Exemplo 4 ELISA de ligação de ponte IL-6-VEGF
[00576] Para assegurar que os inibidores duplos possam se ligar simultaneamente tanto a IL-6 quanto ao VEGF, eles foram submetidos a um ELISA de ligação em ponte onde eles primeiramente interagem com IL-6 ligado a placa, e então são incubados com VEGF biotinilado (btVEGF). A detecção de btVEGF por estreptavidina-HRP indica que as moléculas ligadas a IL-6 também são capazes de se a ligar btVEGF.
[00577] Um ELISA Nunc MaxiSorp foi revestido com 100 µL de 1 µg/ml de IL-6 humana recombinante (Tonbo Sciences) de um dia para o outro. A placa foi bloqueada em 2% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS-Tween (PBST) durante 2 horas. Durante o bloqueio, 100 pM de btVEGF) foram incubadas com concentrações crescentes de anti-IL-6-VEGF-trap, VEGF- trap-anti-lL -6, ou o anticorpo anti-VEGF bivalente OG1950 como um controle negativo. O btVEGF ligado foi detectado com estreptavidina-HRP (diluição 1:2.000; Sistemas R&D) e desenvolvido utilizando reagente TMB (KPL) por 10 minutos.
A absorbância a 450 nM foi medida em um leitor de placa SpectraMax Plus (Molecular Devices) e plotada contra a concentração de anticorpo utilizando o Software GraphPad Prism e ajustada com uma curva de regressão não linear.
[00578] Este ensaio confirmou que os inibidores duplos de IL-6/VEGF se ligam simultaneamente IL-6 e btVEGF.
A orientação do anti-IL-6 e de VEGF-trap tem uma ligação ligeiramente variável, com a orientação do anti-IL-6-VEGF- trap sendo mais favorável sob estas condições (EC50 VEGF- trap-antiIL-6 = 0,079 nM e anti-IL-6-VEGF-trap = 0,026 nM).
Eylea e anti-IL-6 serviram como controles negativos. Os resultados são mostrados na Figura 9.
Exemplo 5 Síntese de rota I de OG1802.
[00579] Uma primeira rota para a síntese de OG1802 é como segue. Primeiro, TFA/iniciador de sal amina (Composto L) que tem a estrutura mostrada na Figura 2A foi sintetizado como segue.
[00580] Primeiro, o Composto K, tendo a estrutura mostrada na Figura 2B, foi sintetizado como segue.
Em um frasco de fundo redondo de 200 mL sob nitrogênio foi colocado o Composto J (OG1563) (1,9 g, 2,67 mmol, 3,3 equiv)
COMPOSTO J e Composto E (0,525 g, 0,81 mmol, 1,0 equiv) (ver Figura
2L) seguido por dimetilformamida (10 mL), então diisopropiletilamina (2,5 mL, 14,6 mmol, 18 equiv). O frasco foi resfriado a 0°C utilizando um banho de gelo.
A este foi adicionada solução de anidrido propilfosfônico (50% em peso em acetato de etila, 2,5 mL, 4,04 mmol, 5 equiv) por ~6 minutos.
[00581] A reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 15 minutos. A reação foi extinta pela adição de água (20 mL), bicarbonato de sódio aquoso saturado (20 mL) e acetato de etila (100 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa extraída com acetato de etila (75 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com bicarbonato de sódio aquoso saturado (30 mL), 0,5 M ácido cítrico aquoso (40 mL), água (25 mL), e cloreto de sódio aquoso saturado (40 mL), em seguida secado (sulfato de sódio), filtrado e concentrado a vácuo. O resíduo que foi usado sem purificação adicional resultou em 2,0 g (0,80 mmol, 99%) do Composto K. 1H NMR (400 MHz DMSO-d6): d = 1.36 (s, 9H, OCCH3), 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.98 (d, J = 5.6 Hz, 6H, CCH2NH), 3.04 (q, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2CH2NH), 3.18 (s, 2H, OCH2C), 3.3-3.37 (m, 8H, CH2), 3.47-3.55 (m, 12H, CH2), 3.58 (s, 6H, OCH2C),
3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O), 6.74 (br t, 1H, CH2NHC=O), 7.69 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH2NHC=O), 7.84 (t, J = 6.0 Hz, 3H, CH2NHC=O). LC-MS (ES, m/z): [(M+2H-boc)/2]+ calculado para (C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2 = 1196.6; Encontrado 1196,6.
[00582] O próximo Composto L (Figura) foi sintetizado como segue: em um balão de fundo redondo de 100 mL sob nitrogênio foi adicionado Composto K (2,0 g, 0,8 mmol), diclorometano (10 mL) seguido por ácido trifluoroacético (5 mL). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi concentrada sob vácuo. A reação foi diluída usando diclorometano (10 mL) e concentrada sob vácuo.
O resíduo foi dissolvido usando acetonitrila (10 mL), filtrado através de um filtro de seringa (Acrodisc CR25, PN 4225T) e carregado em uma coluna de HPLC preparatória e eluído com acetonitrila a 60% em água (com ácido trifluoroacético 0,1%) até 98% de acetonitrila (com ácido trifluoroacético 0,1%). Os tubos contendo o produto foram reunidos, concentrados sob vácuo, congelados e colocados em um liofilizador. Isto resultou em 990 mgs (0,4 mmol, 50% em 2 etapas) de Composto L como um pó branco. 1H NMR (400 MHz DMSO-d6): d = 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.97-3.0 (m, 8H, CCH2NH e OCH2CH2NH),
3.17 (s, 2H, OCH2C), 3.3 (q, 6H, CH2CH2NHC=O), 3.4-3.59 (m, 20H, CH2), 3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O),
7.69-7.84 (m, 9H, ambos CH2NHC=O e NH3+). LC-MS (ES, m/z): [(m + H)/2] + calculado para (C84H136Br9N7O33 + H)/2 = 1196,6; encontrado 1197,4.
[00583] A seguir, o Composto L (Figura 2A) foi usado como um iniciador para sintetizar o polímero de MPC.
Iniciador é tipicamente preparado como uma solução de estoque em DMF de cerca de 100 mg/mL. O iniciador e o ligante (2,2'- bipiridil) foram introduzidos em um tubo de Schlenk. A solução resultante foi resfriada a -78°C utilizando uma mistura de gelo seco/acetona e foi desgaseificada sob vácuo por 10 minutos. O tubo foi recarregado sob Argônio e o catalisador (CuBr a menos que de outro modo indicado), mantido sob Argônio, foi introduzido no tubo de Schlenck (a razão molar de átomo de bromo no iniciador/catalisador (CuBr)/ligante foi mantida em 1/1/2). A solução tornou-se marrom escuro imediatamente. O tubo de Schlenk foi selado e imediatamente purgado por aplicação de um curto ciclo de vácuo/Argônio de. Uma solução de HEMA-PC foi preparada pela misturade uma quantidade definida de monômero, preparado em uma caixa de luvas mantida sob nitrogênio, com etanol desgaseificado de 200 à prova. A solução de monômero foi adicionada gota a gota no tubo de Schlenk (via cânula) (e homogeneizada por agitação de luz). A temperatura foi mantida a -78°C. Um vácuo foi aplicado à mistura de reação por pelo menos 10 a 15 minutos até que o borbulhamento da solução cessasse. O tubo foi então preenchido com argônio e aquecido até a temperatura ambiente. A solução foi agitada, e à medida que a polimerização prosseguiu, a solução tornou-se viscosa.
Após 3 a 8 horas ou apenas deixado durante a noite, a reação foi resfriada bruscamente por exposição direta ao ar a fim de oxidar Cu (I) a Cu (II), a mistura tornou-se azul-verde em cor, e foi passada através de uma coluna de sílica para remover o catalisador de cobre. A solução coletada foi concentrada por evaporação rotativa e a mistura resultante foi ou precipitada com tetraidrofurano ou dialisada contra água, seguido por congelamento por congelamento para produzir um pó branco de fluxo livre. A tabela 5 abaixo apresenta os dados de polímero para o polímero que emprega o composto L como um iniciador.
TABELA 5.0 MW teor. Polímero ID No. Iniciador Mn(kDa) Mp(kDa) PDI (kDa) 500 130 L 490 530 1.1 750 150 L 645 750 1.1
[00584] A seguir, o éster maleimida Mal-PEG4-PFP foi encaixado (conforme apresentado na Figura 2C) ao polímero de 750 kDa referido acima para fornecer OG1802. Em um frasco de 20 mL foi colocado o polímero 33707 (polímero de 750 kDa feito usando-se L como iniciador, 515 mg) e dissolvido utilizando-se etanol (4,0 mL) após agitação por 40 minutos.
A este foi adicionado uma solução a 1% de 4-metilmorfolina em acetonitrila (22 uL). Em um frasco separado foi dissolvido Mal-PEG4-PFP (1,97mg) em acetonitrila (1,0 mL) e esta solução foi adicionada à solução de polímero por 2 minutos à temperatura ambiente e a solução resultante foi agitada durante a noite. A reação foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (2 mL) (pH~5) seguido por água (12 mL), filtrada através de um filtro de seringa (Acrodisc Supor, PN 4612) e colocada uniformemente em tubos de diálise de membrana centrífuga de 3 Amicon (30.000 mwco).
Os tubos foram diluídos e misturados com água (5 mL cada), colocados em centrífuga (rpm 3200) por 25 minutos. O filtrado é removido para análise enquanto o retido é diluído e misturado com água (10 mL/tubo). O procedimento de centrifugação foi repetido mais 5 vezes, após o que o retido é removido e colocado em um frasco. Os tubos de membrana de Amicon foram enxaguados com água (2 x ~2 mL de cada tubo) e isto combinado com o retido. A solução de retido foi filtrada através de um filtro de seringa (Acrodisc Supor, PN 4612), congelada e colocada em um liofilizador. Isto resultou em 485 mgs como um pó branco.
Exemplo 6 - Síntese do Iniciador OG1786
[00585] O OG1786 é o iniciador de nove braços para a síntese polimérica usado como precursor na síntese de OG1802.
Cada braço é terminado com 2-bromoisobutirato que é capaz de iniciar a polimerização sob ATRP. O OG1786 é um sal de ácido trifluoro acético (TEA) como mostrado na Figura 2D. O OG1786 é preparado como segue. Primeiro, OG1550 é reagido com TFA (ácido trifluoro acético) para produzir OG1546 como representado na Figura 2E.
[00586] Em um frasco de fundo redondo de 1L equipado com uma barra de agitação magnética e um funil de adição foi adicionado OG1550 (14,8 g), éter metil terc-butílico (MTBE) (350 ml) e água (30 ml). A mistura foi agitada para dissolver o OG1550, então resfriada em um banho de gelo. A esta mistura foi adicionada uma solução de ácido trifluoracético (4,9 ml) em água (90 ml) em gotas durante 90 minutos. Após a adição estar completa, a mistura foi agitada por mais 15 minutos depois removida do banho de gelo e deixada aquecer até a temperatura ambiente. A mistura foi agitada (depois da remoção do banho de gelo) por mais 4-5 horas, até que tlc mostrou ~5% de material de partida restante, e o pH da solução aquosa estava entre 3 e 4 (papel de pH).
[00587] A mistura foi dividida. A camada de MTBE foi lavada com água (30 ml). Camadas aquosas combinadas e em seguida a aquosa extraída com MTBE (150 ml). Esta segunda fase MTBE foi lavada com água (30 ml). As camadas aquosas combinadas foram lavadas com uma terceira porção de MTBE (100 ml). A terceira fase MBTE foi lavada com água (25 ml).
As camadas aquosas foram novamente combinadas (~250 ml, pH ~4, por papel de pH).
[00588] O produto foi coletado por liofilização.
Foram obtidos 11,5 g de sólido branco. Este material é extremamente higroscópico, assim sendo melhor manuseado sob nitrogênio. O produto foi confirmado por LCMS.
[00589] O OG1546 preparado foi então reagido com OG1563 para produzir OG1784 (como representado na Figura 2F).
[00590] Em um frasco de 250 ml sob nitrogênio equipado com uma barra de agitação foi adicionado OG1546 (higroscópico, 9,0 g), seguido por N,N-dimetilformamida (110 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente até que todo o OG1546 dissolveu (cerca de 15 minutos), então OG1563 (29,9 g) foi adicionado, e a mistura foi agitada por mais 3 minutos até que o OG1563 foi também dissolvido. A solução resultante foi resfriada em um banho de gelo, e N,N- diisopropiletilamina (37,6 ml) foi adicionado durante 3 minutos, seguido por anidrido propilfosfônico (T3P), 50% em acetato de etila (34,5 ml) em gotas durante 5 minutos (adição de T3P é exotérmica). Depois de completada a adição de T3P, o frasco foi removido do banho de resfriamento e deixado atingir a temperatura ambiente. Amostras foram então tomadas em intervalos de 5 minutos para análise LCMS. A reação mostrou cor amarela/castanho muito clara.
[00591] Após 20 minutos a reação foi novamente resfriada em um banho de gelo e 5 ml de água foram adicionados. A mistura foi então removida do banho de resfriamento e uma porção adicional de 50 ml de água adicionada, seguido por 50 ml de ácido cítrico a 0,5 M e em seguida acetato de isopropila (300 ml). A mistura foi dividida. A fase aquosa (~300 ml) foi extraída com acetato de isopropila adicional (150 ml). A fase aquosa foi AQ1 para teste de HPLC. Os orgânicos combinados foram lavados com ácido cítrico aquoso (115 ml, 65 mM, que foi a mistura de 15 ml de ácido cítrico 0,5 M mais 100 ml de água), e a fase aquosa foi AQ2 (pH~3). A fase orgânica foi lavada com água/cloreto de sódio saturado (100 ml/25 ml), e a fase aquosa foi AQ3 (pH~3). A fase orgânica foi finalmente lavada com cloreto de sódio saturado (100 ml), e a fase aquosa foi AQ4. Nenhuma das frações AQ continha qualquer produto significativo (dados não fornecidos). A fase orgânica confirmou o produto por LCMS. O produto foi secado sobre sulfato de sódio (80 g), filtrado e enxaguado com acetato de isopropila (75 ml), e concentrado em um evaporador rotativo a um óleo castanho (33,2 g). O produto bruto foi armazenado durante a noite sob nitrogênio.
[00592] No dia seguinte, o produto bruto foi deixado em temperatura ambiente, em seguida dissolvido em acetonitrila/água (46 ml/12 ml) e filtrado utilizando-se um disco filtrante de HPLC (Cole-Parmer PTFE 0,2 µm, número de produto 02915-20). O filtrado foi dividido em três porções iguais e purificado em três corridas.
[00593] O filtrado foi carregado em uma coluna RediSep Rf Gold C18 (275 g, SN 69-2203-339, Lote #24126-611Y) equilibrada com 50% de acetonitrila/água. O material foi eluído a 100 ml/min utilizando-se o gradiente a seguir (solvente A: água, solvente B: acetonitrila). Todas as frações relevantes foram verificadas por HPLC. As frações consideradas puras o suficiente foram reunidas (de todas as três corridas) e concentradas (temperatura do banho mantida a cerca de 20°C) em rotovap, em seguida, divididas entre diclorometano (100 ml) e água (5 ml)/cloreto de sódio saturado (25 ml). O aquoso foi extraído mais duas vezes com diclorometano (2 x 30 ml). Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio (35 g), filtrados, rinsados com DCM (30 ml) e concentrados. O produto e a pureza foram confirmados por métodos de LCMS. O rendimento isolado e a pureza dos lotes R5172 e R5228 são mostrados na Tabela 6.0.
TABELA 6.0 Lote OG1784 R5172 R5228 OG1546 usado 5.3 g 9.0 g OG1563 usado 17.6 g 29.9 g Rendimento isolado 53% 58% Pureza (a/a 210 nm) 99.3% 100.0%
[00594] A seguir OG1405 foi preparado a partir de OG1784 como representado na Figura 2G. Em um frasco de fundo redondo de 500 ml, equipado com uma barra de agitação magnética, foi adicionado OG1784 (20,9 g), seguido por diclorometano (50 ml) em seguida ácido trifluoroacético (20 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente e análise HPLC mostrou desproteção completa em 23 minutos. A mistura foi concentrada em um evaporador rotativo, redissolvida em diclorometano (25 ml) e re-concentrada, então redissolvida em acetonitrila (25 ml) e re-concentrada. O produto foi confirmado por LCMS. O material acima (OG1405, 34,5 g, assuma 21,0 g como rendimento quantitativo) foi usado como um óleo bruto na etapa seguinte. Nenhuma purificação é necessária.
[00595] A seguir, OG1405 foi reagido com OG1402 para preparar OG1785 como apresentado na Figura 2H. Em um frasco de 500 ml sob nitrogênio equipado com uma barra de agitação foi colocado OG1402 (5,5 g), seguido por acetonitrila (70 ml), N-diisopropiletilamina (26,3 Ml) e solução T3P (vide acima) (7,9 ml). A solução foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos, então resfriada em um banho de água gelada e uma solução de OG1405 (óleo bruto de cima, 34,5 g) em acetonitrila (70 ml) adicionada. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente. Após 20 minutos a reação foi resfriada em um banho de água gelada e extinta com água (5 ml). A mistura foi então concentrada sob vácuo utilizando um evaporador rotativo para meio volume. As amostras foram tomadas para LCMS.
[00596] Mais água (50 ml), seguida por ácido cítrico a 0,5 M (75 ml) e acetato de isopropila (175 ml) foi adicionada. A mistura foi dividida em 5 minutos. O aquoso foi extraído com acetato de isopropila adicional (50 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com ácido cítrico aquoso (0,13 M, 30 ml, consistem em 10 ml de ácido cítrico 0,5 M e 20 ml de água). Os orgânicos foram em seguida lavados com a mistura de cloreto de sódio saturado (25 ml) e água (25 ml), então, finalmente, lavados com cloreto de sódio saturado (25 ml). Eles foram então secos sobre sulfato de sódio (124 g), filtrados e rinsados com acetato de isopropila (30 ml), e concentrados sob evaporador giratório a um óleo castanho (27,3 g). Amostras foram tomadas para análise LCMS.
[00597] O óleo foi dissolvido em acetonitrila/água (3:1, 15 ml/5 ml), filtrado através de um disco filtrante de HPLC (membrana de PTFE Cole-Parmer 0,2µm, número de produto 02915-20) e dividido em três porções iguais, cada uma das quais foi purificada individualmente como segue.
[00598] Porções foram carregadas em coluna Cl8 Redi- Sep Gold (275 g, SN-69-2203-339, Lote 241234-611W) equilibrada a 50% de solvente B (acetonitrila)/50% de solvente A (água). O material foi então purificado por HPLC de fase reversa com um solvente A: água/solvente B: acetonitrila. Frações apropriadas foram reunidas e divididas entre diclorometano (150 ml) e água (5 ml)/cloreto de sódio saturado (25 ml). O aquoso foi extraído duas vezes com diclorometano (2 x 50 ml). Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio (60g), filtrados e rinsados com diclorometano (40 ml) e concentrados. A estrutura e a pureza foram confirmadas por vários analíticos incluindo LCMS: OG1785 foi isolado como um sólido espumoso (R5329, 19,0 g, 83% de rendimento, 95,1% de pureza (a/a 210 nm), armazenado sob nitrogênio a 4°C.
[00599] A seguir, o grupo protetor terc- butiloxicarbonila em OG1785 foi removido utilizando-se ácido trifluoracético (TFA) para produzir o OG1786 como representado na Figura 2I.
Exemplo 7 - Síntese do Polímero OG1801
[00600] O polímero OG1801 é feito primeiro a partir do iniciador OG1786. OG1801 tem uma funcionalidade amina, que é mais estável (do que a maleimida) durante a síntese do polímero. Para sintetizar o polímero OG1801, é usada uma versão modificada de ATRP, em que a espécie de cobre (Cu (I)) é gerada in situ pela adição de cobre metálico a Cu (II). Os materiais de partida e reagentes necessários na reação são calculados com base na entrada de lote do monômero (HEMA-PC) OG47, bem como o peso molecular visado (MW).
[00601] Pesado 50 g de monômero OG47 em caixa de luvas e adicionados 200 mL de EtOH desgaseificado para dissolver o monômero em temperatura ambiente; amostrado para teste de concentração de monômero. Pesado Cu (II), Bpy, Cu (0) em um frasco de 500 ml; purgado com argônio, enquanto se adiciona uma solução de monômero ao frasco; selado o frasco com rolha e submetido a vácuo por 25 mm até que não haja nenhuma bolha.
A reação mudou de cor gradualmente de verde claro para verde escuro, em seguida a marrom claro; pesado ~200 mg de iniciador QG1786 em caixa de luvas, e dissolvido em ~2.000 µL de DMF sob temperatura ambiente para produzir uma solução de estoque de 100 mg/mL; amostrado para o teste de concentração e concentração de iniciador; a adição da solução iniciadora ao frasco sob Argônio. A solução de reação tornou- se marrom escuro e começou a espessar com o tempo; vedado o sistema e a reação foi deixada para ocorrer durante 2 dias.
[00602] OG1801 foi então preparado para a adição de maleimida e catalisador (cobre) foi removido como segue: uma coluna de sílica de fase normal pré-empacotada Redi-Sep® Rf é usada para remover o catalisador. O tamanho da coluna é escolhido com base na quantidade de cobre na mistura de reação. Por exemplo, uma coluna de 330 g (Cat. # 69-2203- 330, tamanho de coluna 330g, CV = 443 mL) foi usada para uma batelada de 50 g de OG1801. Tubulação de Teflon é usada para toda a conexão como EtOH é o solvente a eluir.
[00603] Após a remoção de cobre, todas as frações foram transferidas para um frasco de fundo redondo em bateladas, e evaporou-se o EtOH por evaporador rotativo a 45-50°C em pressão reduzida até a secura. Nesta etapa, o volume de EtOH coletado da condensação foi monitorado para assegurar que a remoção de EtOH foi de > 90%. O polímero foi dissolvido em 250 mL de WFI e filtrado utilizando um filtro de 0,2 µm. Resultou em uma solução de polímero transparente à luz clara a ~150 mg/mL. A solução poderia ser armazenada a 2-8°C até 3 meses antes do uso.
Exemplo 8 - Síntese do Polímero OG1802
[00604] Materiais de partida e reagentes necessários na reação são calculados com base na entrada de lote de OG1801. O ligante é ácido 3-maleimidopropiônico, éster de NHS. Adicionados 30 ml de fosfato de sódio 0,5 M (em WFI, pH 8) a 50 g de solução de polímero (~150 mg/mL). Deixou-se a agitar durante 1 minuto; o pH foi de 8,0 por meio de um papel de pH. Pesado 204,8 mg de ligante e dissolvido em DMF 4,1 mL para produzir 50 mg/mL de estoque. Solução de ligante adicionada gota a gota de 815 µL por minuto ao polímero sln com forte agitação. Levou 5 minutos para adicionar 4095 µL de solução ligante. Reagiu-se à temperatura ambiente durante 30 minutos de reação. A reação foi interrompida com 20 mL de ácido acético a 5% para obter um pH final de 5. Filtrou-se a solução utilizando-se um filtro de vácuo L (0,2 nm).
[00605] OG1802 (mostrado na Figura 2K) é então purificado como segue: cassetes de fluxo cruzado de miliporos são usados para a purificação do polímero em sistema aquoso.
Iniciou-se com a concentração da solução de polímero para 250 mL (~200 mg/mL), Adicionou-se o WFI fresco do reservatório, e ajustou-se a taxa de fluxo da alimentação de
WFI fresca para o mesmo que o permeado (~2 mL/min). O UF/DF foi ajustado a 2-8°C durante a noite. Tipicamente 2,5 L de WFI foram usados (proporção de volume 10x para a solução de polímero). Uma amostra de retido foi coletada para teste de pureza. A pureza visada foi > 98%. Foi filtrada a solução de polímero por uma garrafa de filtro de 1L 0,2 µM. A solução polimérica poderia ser armazenada a 2-8°C por até 3 meses antes da conjugação.
Exemplo 9 - Polímeros de Fosforilcolina alternativos
[00606] Um polímero HEA-PC foi sintetizado como descrito abaixo. HEA-PC (2-(acriloiloxi)etil-2- (trimetilamônio)etil fosfato), que é um acrilato em oposição ao metacrilato HEMA-PC descrito acima, tem a seguinte estrutura: HEA-PC
[00607] HEA-PC foi polimerizado para o iniciador mostrado no Exemplo 5 como composto L.
TABELA 9.0 Reagente Nome Quantidade MW Iniciador Composto L (veja acima) 1,65 mg 2505,5 Monômero HEA-PC 0,461 g 281,24 Catalisador Brometo de Cu (I) 1,2 mg 143,45 Ligante Tris [2-(dimetilamino)etil] 2,73 mg 230,39 amina (Me6TREN) Solvente A N,N-Dimetilformamida (DMF) 21,85 µl 73,09 Solvente B Água 0,7 ml 18,02 Solvente C Metanol 0,7 ml 32,04
[00608] Foi preparada uma solução estoque de iniciador a 200 mg/ml dissolvendo-se 2,2 mg de iniciador em 11 µL de DMF seca e uma solução de 200 mg/ml de ligante dissolvendo 4,6 mg de Me6TREN em 23 µL de DMF seca. Dispensar 8,25 µL da solução estoque de iniciador e 13,6 µL do ligante em um tubo. Desgaseificar a -78°C por 5 min, então reencher com argônio e adicionar 1,2 mg de CuBr. Desgaseificar com Argônio. Adicionar uma solução de estoque de HEA-PC em metanol (pesar 0,461 g de HEA-PC e dissolvê-lo em 0,5 mL de metanol) à solução dentro do reator a -78°C. Rinsar o frasco com 200 µL de metanol e adicioná-lo dentro do reator a -78°C e, então, 0,5 mL de água destilada em seguida mais 200 µL de água. Desgaseificar completamente até que nenhum borbulhamento seja visto e toda a heterogeneidade desaparecer (partículas sólidas se dissolvem ou desaparecem). Reencher com 4 psi de Argônio e deixar que a reação prossiga a TA por uma hora. A reação já estava viscosa. A reação foi deixada proceder por cerca de uma hora.
Uma solução de bipirindina em metanol (5 mg em 0,5 µL) foi adicionada. Outros 2-3 ml de metanol foram adicionados e o catalisador foi deixado oxidar durante a noite a 4°C. A conversão determinada por RMN 1H foi estimada como sendo de 94%.
[00609] No dia seguinte o polímero foi dialisado e submetido à análise SEC/MALS usando-se coluna Shodex SB806M_HQ (7,8 x 300 mm) em lx PBS pH 7,4 a 1 ml/min, dando um PDI de 1,157, Mn de 723,5 kDa, Mp de 820,4 kDa e Mw de 837,2 kDa (antes da diálise, PDI é 1,12, Mn = 695 kDa, Mp = 778 kDa). A seguir uma funcionalidade maleimida foi adicionada ao polímero, de modo que ela poderia ser conjugada a uma proteína.
[00610] A seguir, o éster de maleimida Mal-PEG4-PFP (ver Exemplo 20 acima) foi encaixado no polímero HEA-PC conforme mostrado no Exemplo 20. O polímero HEA-PC funcionalizado com maleimida resultante pode então ser conjugado a grupos sulfidrila como discutido aqui para polímeros de HEMA-PC.
[00611] Um polímero de acrilamida PC foi também feito usando o monômero 2-(acrilamil)etil-2-(trimetilamônio)etila fosfato (Am-PC), tendo a seguinte estrutura:
[00612] O Am-PC foi usado para polimerização empregando um iniciador de 3 braços (um sal de TFA) com a estrutura:
[00613] A síntese do polímero Am-PC foi conduzida da seguinte forma:
TABELA 9.1 Reagente Nome/Identidade Quantidade MW Iniciador Iniciador 3-braços (veja 2,2 mg 885,35 acima) Monômero Am-PC 0,5 g 280,26 Catalisador Brometo de Cobre (I) 1 mg 143,45 (I) Catalisador Brometo de Cobre (II) 0,2 mg 223,35 (II) Ligante Tris[2-(dimetilamino) 3,94 mg 230,39 etil]amina (Me6TREN) Solvente A N,N-Dimetilformamida 31,7 µL 73,09 (DMF) Solvente B Água 1 ml 18,02 Solvente C Metanol 1 ml 32,04
[00614] Uma solução estoque de ligante a 200 mg/mL foi preparada dissolvendo-se 9 mg de Me6TREN em 45 µL de DMF ceca. Foi adicionado 19,7µL da solução de estoque a um vaso de reação. Preparar uma solução estoque de iniciador a 200 mg/mL por dissolução de 6,5 mg de material em 32,5 µL de DMF. Adicionar 11 µL da solução de estoque iniciadora ao ligante a partir de cima. Desgaseificar por 5 minutos.
Adicionar 1 mg de CuBr. Foi preparada uma solução de estoque de CuBr2 a 200 mg/mL por dissolução de 4 mg de CuBr2 em 20 µL de DMF. Adicionar 0,5 g de monômero (AmPC) a 1 mL de metanol (baixa dissolução/solução viscosa), seguido por 1 µL da solução de estoque de CuBr2. Adicionar a solução de monômero gota a gota à mistura de reação acima. Rinsar com 1 mL de água. Desgaseificar a mistura de reação completamente (congelamento-descongelamento). Deixar a reação prosseguir por 24 horas.
[00615] Em seguida, o polímero Am-PC pode ser dialisado. O peso molecular do polímero acima foi determinado por SEC/MALS: Mn é 215 kDa, Mp: 250 kDa, PDI é 1,17. A conversão foi estimada por RMN 1H a ser 94%. Uma funcionalidade maleimida pode ser adicionada ao polímero Am- PC como discutido acima para HEMA-PC e HEA-PC. Polímero de Am-PC funcionalizado com maleimida pode ser conjugado a uma proteína como descrito acima.
Exemplo 10 - Ensaio de Ellman de Reverso para o Cálculo da Maleimida Livre em um Composto
[00616] Após a adição da funcionalidade maleimida ao polímero OG1801 para formar QG1802 (veja acima), foi usado um ensaio de Ellman para determinar a quantidade de maleimida funcional expressa como percentual de função (isto é, conjugável) em uma amostra. Tiol converteu o reagente de Ellman (DTNB) a TNB- e em seguida a TNB2- em água em pH neutro e alcalino, que deu uma cor amarela (medida a 412 nm). Uma curva padrão foi estabelecida com cisteína. Uma vez que a maleimida reage com tiol, este ensaio realmente mede o tiol (cisteína) remanescente. A inibição foi calculada como as razões de molaridade de (tiol original - tiol restante após adição de polímero de maleimida)/(tiol original) e é expressa como uma porcentagem em que quanto maior a porcentagem, maior a funcionalização de maleimida.
[00617] Reagentes empregados no ensaio: uma curva padrão foi preparada usando a cisteína de 62,5 mM a 2 µM.
Soluções estoque de polímero foram preparadas dissolvendo o pó em 1xPBS pH 7,4 (tampão de reação) e misturando completamente. Um molar igual de soluções de polímero e cisteína foi misturado e deixado reagir a 27°C por 30 minutos. Os 150 µΜ de solução de de DTNB foram adicionados nos padrões de cisteína e reações de polímero/cisteína e a cor foi desenvolvida a 27°C por 5 minutos. OD a 412 nm foi lido no leitor de placa Spectramax e a inibição percentual foi calculada com o software Softmax Pro e a curva padrão de cisteína.
Exemplo 11 - Purificação e Decapeamento de moléculas de antiIL-6-VEGF-trap
[00618] As cadeias pesada e leve podem ser clonadas em plasmídeos de expressão e transfectadas em células de CHO. As células podem ser crescidas em meios apropriados e colhidas. O anticorpo (ou na alternativa o Ab-trap) pode ser purificado usando-se captura e eluição de coluna de afinidade de Proteína A.
O anticorpo (ou na alternativa o Ab-trap)
cisteína no resíduo de posição 443 (L443C (numeração EU)) é tipicamente "capeado" ("capped") ou oxidado por produtos químicos no meio de cultura celular e não está disponível para conjugação.
A este respeito, o anticorpo purificado (ou na alternativa o Ab-trap) pode ser submetido a um procedimento de decapeamento (isto é, redução) para remover a capa e permitir que o resíduo de cisteína livre (isto é,
aqueles não envolvidos em Ligações de dissulfeto de Cys-Cys)
sejam conjugados à funcionalidade de maleimida de um polímero.
Decapeamento pode ser feito misturando-se proteína de anticorpo purificado (ou na alternativa o Ab-trap) com um excesso molar de 30x durante 1 hora à temperatura ambiente de um agente redutor tal como TCEP (ácido 3,3',3"-fosfano triiltripropanoico), 3,3',3"-fosfinatriiltris(benzeno-l-
sulfonato) de trissódio (TPPTS), ou algo similar.
A reação de redução pode ser monitorada por SDS-PAGE.
Após a redução,
o anticorpo (ou na alternativa o Ab-trap) pode ser trocado por tampão utilizando um cassete de Ultrafiltração Pelon XL com 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,5 mM de tampão
TCEP para remover a capa.
O reagente de TCEP pode então ser removido na mesma configuração de permuta de tampão com 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl.
Anticorpo reduzido (ou na alternativa o Ab-trap) pode então ser deixado reoxidando usando um excesso molar de 15x do agente de oxidação DHAA
(Ácido Ascórbico DeHidróxi) durante 1 hora em temperatura ambiente que é novamente monitorado por ensaio SDS-PAGE. O reagente DHAA pode então ser removido na mesma configuração de permuta de tampão com Tris pH 7,5 a 20 mM, NaCl a 100 mM.
Exemplo 12A - Conjugação de anticorpo (ou na alternativa o Ab-trap) para Polímero MPC
[00619] Anticorpo decapeado (ou na alternativa o Ab- trap) pode ser conjugado ao polímero OG1802 para produzir o bioconjugado. Um excesso de OG1802 é usado (excesso molar de 3-20 vezes). A conjugação pode ser monitorada através de cromatografia por HPLC de troca catiônica e direcionada próximo ao término. Conjugado de anticorpo (ou na alternativa o Ab-trap) pode ser purificado através de cromatografia de troca catiônica e tampão trocado no tampão da formulação por ultrafiltração/diafiltração (UF/DF). Anticorpo (ou na alternativa o Ab-trap) pode ser purificado de forma cromatográfica conforme descrito acima.
Exemplo 12B - Reação de conjugação de VEGFR-AntiIL6 com OG1802
[00620] O processo de conjugação de VEGFR-AntiIL6 com OG1802 envolveu duas etapas: uma reação de redução inicial para remover os grupos de proteção de cisteína S (decapear), que foi seguido por conjugação com o biopolímero OG1802 por meio de química de maleimida-cisteína. O decapeamento foi feito primeiramente pela redução (30-60 minutos) de VEGFR-
AntiIL6 com um excesso molar de 30x de ácido 3,3',3"- fosfano triiltripropanoico (TCEP) seguido por permuta de tampão em 20 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl a 100 mM para remover a capa de cisteína e TCEP (Figura 28). Na alternativa, outros agentes redutores tais como o sal trissódico de ácido 3',3"-fosfano triiltris(ácido benzenossulfônico) (TPPTS) também poderiam ser usados para a etapa de decapeamento.
[00621] Então, a VEGFR-AntiIL6 reduzida foi oxidada (30-60 minutos) com um excesso molar de 15x de ácido desidro- ascórbico (dHAA) seguido por permuta de tampão em 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl para remover o reagente oxidante (Figura 28). O rendimento cumulativo para o procedimento de decapeamento foi de 89% (redução de TCEP - 94%, oxidação de dHAA - 95%).
[00622] O processo de conjugação foi feito pela mistura de VEGFR-AntiIL6 em uma concentração final de 2,4 mg/mL (ou 12,5 µΜ) com um excesso molar de 5x do biopolímero OG1802 em pH 8,0. O processo de conjugação ocorreu a 2-8°C por um período de 2 a 3 dias. Conjugado VEGFR-Anti-IL6 foi purificado a partir de material não conjugado por cromatografia de troca catiônica (CEX) com resina Poros XS usando uma etapa de gradiente de concentrações crescentes de sal (NaCl a 0-500 mM) em tampão contendo 20 mM de acetato de sódio pH 5,5 (Figura 29). As frações contendo o bioconjugado VEGFR-AntiIL6-OG1802 foram reunidas e tamponadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. A eficiência de conjugação foi de aproximadamente 60% (determinada por SDS- PAGE não-redutor e análise de ImageJ). O rendimento cumulativo de material proteico inicial para bioconjugado foi de aproximadamente 27%.
[00623] A análise de SDS-PAGE (Figura 30) e SEC-MALS (Figura 31) demonstra uma molécula de VEGFR-AntiIL6 (~189 kDa) conjugada com uma molécula de polímero OG1802 (~794 kDa), que resultou em um bioconjugado de aproximadamente 983 kDa. Experimento SEC-MALS foi realizado por injeção de 10 µg (massa de proteína) em taxa de fluxo de 1 mL/min em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (Shodex- SB806M-HQ) pré-equilibrada com tampão PBS, em linha com detectores de espalhamento de luz (miniDAWN TREOS) e detectores (Wyatt Technology) de índice refrativo (Optilab T-rEX). A análise do conjugado protéina e de dados foi feita em ASTRA 7 (Wyatt Technology).
Exemplo 13 - Identificação e Remoção de Clivagem do VEGF-trap
[00624] Conforme mostrado nas Figuras 11A e 11B, SDS- PAGE de produtos reduzidos de VEGFR-Anti-IL-6 e Anti-IL-6- VEGFR purificados por proteína A derivados de células ExpiCHO-S exibiram bandas inesperadas com tamanhos dependentes das orientações de construto. Essas bandas indicaram que uma fração das moléculas de inibidor duplo sofreu clivagem durante a produção. Neste exemplo, VEGFR- AntiIL6 corresponde a uma molécula de cadeia pesada compreendendo as sequências 1A-2A-3H emparelhadas com uma sequência contendo a cadeia leve 4A. AntiIL-6 VEGFR corresponde a uma cadeia pesada compreendendo as sequências 5H(Fab)-2A-1A-5H (Fc) emparelhadas com uma sequência contendo a cadeia leve 4A.
[00625] Como ilustrado na Figura 12, estas bandas de proteína foram transferidas para uma membrana de PVDF e os primeiros seis resíduos das bandas de proteína foram sequenciados através de sequenciamento de N-terminal de Edman (instrumento Procise 494 HT). Os resultados mostraram que os produtos clivados compartilham a mesma sequência N- terminal (93 LTHRQT), que é localizada dentro do domínio de VEGFR1 2 na região de Captação de VEGF.
[00626] As Figuras 13A e 13B mostram os resultados das mutações na região que flanqueia o local de clivagem (K89TNY/LTHR96) que interromperia a clivagem da proteína, mantendo a estabilidade geral da proteína e a ligação às propriedades de VEGF. Essas mutações foram escolhidas com base na conservação de sequência, para este propósito a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST) foi usada para fazer uma pesquisa de similaridade de sequência e alinhamento entre a sequência do domínio 2 do VEGFR1 e homólogos de proteínas dentro da classe Mammalia.
Os 500 melhores acertos foram selecionados com base em sua pontuação de valor do BLAST E. A partir deste cluster inicial contendo 500 sequências (cluster_1), a melhor sequência de pontuação para cada espécie individual foi selecionada reduzindo-a a um conjunto de 106 sequências representativas (cluster_2). Com base nas variações de sequência dentro da região flanqueadora do local de clivagem observada no cluster_2, 16 mutantes de ponto único Anti-IL-6-VEGFR foram gerados e avaliados na clivagem da proteína. Essas mutações foram inicialmente introduzidas apenas no construto Anti-IL- 6-VEGFR, uma vez que mostra uma melhor separação de tamanho entre produtos clivados e intactos devido às suas diferenças de peso molecular (~35 kDa).
[00627] As Figuras 13A e 13B ilustram resultados de SDS-PAGE de mutantes VEGFR Anti-IL-6 demonstrando que as modificações no sítio de clivagem tendem a reduzir a quantidade de produto clivado (indicado por setas). As mutações T94I e H95I (numeração dos resíduos com base na posição na sequência de VEGF-trap) reduziram significativamente a clivagem de VEGF-trap. Especificamente, as Figuras 13A e 13B ilustram que a maioria das mutações reduziu a clivagem da proteína e as mutações T94I (VEGFR_variante_1), ilustradas na Figura 13C e H95I (VEGFR_variante_2), ilustrado na Figura 13D, teve um efeito mais acentuado. Mutação de ponto único (T94I, H95I) e mutação de ponto duplo (T94I/H95I, VEGFR_variante_3), conforme ilustrado pela Figura 13E, foram subsequentemente introduzidos no construto VEGFR-Anti-IL-6. Figura 13C indica a posição de T94I (sublinhado). Figura 13D indica a posição de H95I (sublinhado). Figura 13E indica a posição de T94I e H95I (sublinhado). Conforme ilustrado nas Figuras 13F e 13G, SDS-PAGE mostrou que uma redução semelhante na clivagem de proteínas foi observada e este efeito é ainda mais intensificado quando a mutação dupla é introduzida.
Exemplo 14 - Variantes de VEGFR de Inibidor Duplo se Ligando ao VEGF Via Biacore
[00628] As Figuras 14A - 14F ilustram os resultados para uma série de ensaios Biacore usados para determinar a afinidade entre os agentes Anti-VEGF e VEGF. A cinética de ligação entre as moléculas foi medida usando-se um Biacore T200 (GE Healthcare) a 37°C no tampão HBS-EP+ contendo 1 mg/mL de BSA. Agentes Anti-VEGF (VEGFR-Anti-IL-6 (5 µg/mL), VEGFR_variante_1-Anti-IL-6 (5 µg/mL), VEGFR_variante_2- Anti-IL-6 (5 µg/mL), VEGFR_variante_3-Anti-IL-6 (5 pg/mL) e Eylea (3 pg/mL) foram capturadas em um chip de proteína A (GE) a 10 µL/min durante 25 segundos, cinco concentrações de VEGF-A165 (0,19, 0,56, 1,67, 5, 15 nM) foram fluidas sobre anticorpos capturados por 120 segundos a 30 µL/min e dissociadas por 60 minutos. A superfície do Chip sensor foi regenerada por injeção de 60 segundos de 10 mM de glicina,
pH 1,7 a uma taxa de fluxo de 50 µL/min. Todos os sensores foram subtraídos de referência dupla e ajustados utilizando um modelo de ligação de Langmuir 1:1. As Figuras 14A -14F mostram a introdução de mutações de ponto único T94I (VEGFR_variante_1-Anti-IL-6), H95I (VEGFR_variante_2-Anti- IL-6) e mutante duplo T94I/R95I (VEGFR_variante_3-Anti-IL- 6) que afeta minimamente a ligação ao VEGF. Como pode ser visto na Figura 14F, os sensogramas demonstram moléculas inibidoras duais VEGFR-Anti-IL-6 e variantes se ligam firmemente ao VEGF-A como Eylea. Neste exemplo, as moléculas de VEGFR-AntiIL6 correspondem às variantes de VEGFR (sequências 1A -1D) fundidas à porção AntiIL-6 através do ligante GS (sequências 2A -3H) emparelhadas com a sequência contendo cadeia leve 4A.
Exemplo 15 - Ensaio de Repórter VEGFR estimulado por VEGF com Base em Células
[00629] Os resultados de um ensaio de repórter de VEGFR estimulado por VEGF com base em células são providos na Figura 15. Inibidor Duplo de VEGFR-AntiIL6, conforme observado acima, bloqueia o VEGF da VEGFR de ligação e estimula a sinalização a jusante para o mesmo grau que Eylea (IC50 0,18nM vs. 0,11 nM), enquanto o anticorpo anti-IL-6 não teve qualquer efeito.
[00630] Para as experiências, as células Promega KDR/VEGF HEK293 degelo-uso (CS181405; Promega) foram descongeladas e adicionadas a 4,6 mL de meio de ensaio (10% FBS em DMEM). 25 µL de células foram transferidos para cada poço de uma placa de 96 poços. O VEGF (concentração final de 500 pM) foi misturado com uma série de inibidores de diluição 1: 3 de 10 pontos, começando em 100 nM (concentração final) e incubado por 30 minutos antes de adicionar 50 µL às células plaqueadas. Após 6 horas, 75 µL do reagente Bio-Glo preparado (Promega) foram adicionados às células e incubados durante 3-10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um leitor de placas iD3 (Molecular Devices). As unidades de luminescência relativa foram normalizadas para a concentração de inibidor mais baixa para cada curva e plotadas como a média de réplicas com erro padrão contra o log da concentração de anticorpo usando o software GraphPad Prism e ajustadas com uma curva de regressão não linear.
Neste exemplo, VEGFR-AntiIL6 corresponde a uma molécula de cadeia pesada compreendendo as sequências 1A-2A-3H emparelhadas com uma sequência contendo a cadeia leve 4A.
Exemplo 16 - Ensaio de Formação de Túbulos HUVEC
[00631] As Figuras 16A - 16C ilustram os resultados do ensaio de formulação de túbulos HUVEC.
[00632] As células da passagem 2 ou 3 HUVEC foram cultivadas em meio basal vascular suplementado com 1x kit de crescimento de células endoteliais de extrato de cérebro bovino (ATCC; meio de crescimento) em 5% de CO2 a 37°C. Uma vez que as células atingiram 70% de confluência, as células foram retiradas da placa usando tripsina (0,05%; ATCC) e 0,75x10^6 células plaqueadas em um frasco T25 em meio de crescimento. O meio foi trocado por meio de ensaio (2% FBS em meio vascular basal) no dia seguinte. Após 6 horas, 5 µg/ml de Calceína AM foi adicionado diretamente ao meio e incubado durante 30 minutos a 37°C. Ao mesmo tempo, 200 µL de Matrigel pré-descongelado (fator de crescimento reduzido; Corning) foram adicionados a cada poço de uma lâmina de câmara de vidro de 8 poços e incubados a 37°C por 30 minutos.
Durante as incubações, 25 nM de cada inibidor (concentrações finais) foram misturados com VEGF 3 nM (R&D), IL6 12,5 nM (Tonbo) e IL6R 25 nM (Tonbo) (todas as concentrações finais).
Após a incubação de 30 minutos com Calceína AM, as células foram lavadas 3x com PBS e então tripsinizadas. As células colhidas foram centrifugadas durante 3 minutos a 1.500xg e ressuspensas em meio de ensaio a uma densidade de 500.000 células/mL. 100 µL de células foram então misturados com 100 µL de soluções de inibidor/complexo preparadas e, em seguida, transferidos para as lâminas de câmara revestidas com Matrigel e incubadas durante a noite. No dia seguinte, os túbulos foram fotografados usando uma lente objetiva de 10x e o filtro GFP em um microscópio de fluorescência EVOS (Life Technologies). Pelo menos 2 imagens representativas foram tiradas para cada condição e então analisadas usando o
Angiogenesis Analyzer Plugin for ImageJ (NIH), que avalia e quantifica 20 parâmetros de formação de rede de túbulos.
[00633] As Figuras 16A - 16C mostram dados como médios com erro padrão de 4 experimentos independentes. A significância estatística foi determinada a partir de todas as réplicas de 4 experimentos independentes utilizando-se um teste t de Student de duas caudas, não pareados. Como ilustrado na Figura 16C, VEGFR-AntiIL6 inibiu significativamente os parâmetros angiogênicos em parâmetros de 17/20 em comparação com o controle. Em contraste, Eylea inibiu em parâmetros de 4/20 e anti-IL-6 inibiu em parâmetros de 7/20. VEGFR-AntiIL6 foi significativamente melhor do que Eylea e Anti-IL-6 em 12/20 parâmetros, conforme indicado pelos asteriscos na Figura 16B. Além disso, as estatísticas de teste t são apresentadas na Figura 16C. Neste exemplo, a VEGFR-Anti-IL6 corresponde a uma molécula pesada de cadeia que compreende as sequências 1A-2 a -3H emparelhadas com uma cadeia leve contendo a sequência 4A.
[00634] Em algumas modalidades, o construto de VEGFR- Anti-IL6 permite mecanismos sinérgicos para melhorar a eficácia e durabilidade em populações de risco específico.
Populações de risco incluem aquelas com risco de infecção ou diagnosticada com retinopatia diabética ou uma ou mais doenças inflamatórias retinais.
Exemplo 17 - Ensaio de Proliferação de HUVEC
[00635] A Figura 17 ilustra os resultados de um ensaio de proliferação de HUVEC.
As células HUVEC (passagens 2-5)
foram cultivadas em meio basal vascular suplementado com 1x de kit de crescimento de células endoteliais de extrato de cérebro bovino (ATCC; meio de crescimento) em 5% de CO2 a 37 graus.
Uma vez que as células atingiram 70% de confluência,
as células foram retiradas da placa usando tripsina (0,05%;
ATCC) e 3.500 células/poço foram semeadas nos 60 poços médios de uma placa revestida com gelatina de 96 poços em 100 uL de meio de ensaio (Vascular Basal Meio suplementado com l-
glutamina, ácido ascórbico, sulfato de heparan,
hidrocortisona e 1% de FBS) (Corning). Após 24 horas de fome,
as células foram estimuladas com VEGF (1,5 nM), IL-6 (5 nM)
e IL6R (10 nM) misturado com 10 pontos, série de diluição 1:
3 de inibidores começando em 100 nM.
Essas concentrações de
VEGF e IL-6 induzem proliferação em níveis submáximos quando adicionadas independentemente umas das outras, mas demonstram uma curva de crescimento sinérgica quando combinadas. 48 horas depois, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiterBlue (Promega) de acordo com as instruções do fabricante em um leitor de placa iD3 (Molecular
Devices). Para medições de absorbância, a proporção de
A570/A605 foi determinada e os dados foram normalizados para controlar (sem inibidor) células para cada réplica.
As medições de fluorescência (555ex/605em) foram normalizadas para células de controle para cada repetição.
[00636] Como mostrado na Figura 17, os valores normalizados foram plotados como a média de réplicas com erro padrão contra a concentração de anticorpo utilizando o software GraphPad Prism e ajustados com uma curva de regressão não linear.
[00637] Como pode ser visto na Figura 17, o inibidor duplo de VEGFR-anti-l6 bloqueou a estimulação sinérgica da proliferação de HUVEC por IL-6 e VEGF, enquanto que nem a Eylea nem Anti-IL-6 afetou o crescimento HUVEC sob estas condições.
Exemplo 18 - Geração de Parátopos Anti-IL-6 Melhorados
[00638] A geração de parátopos Anti-IL-6 melhorados é descrita no presente exemplo. Os resultados da cinética Biacore são mostrados nas tabelas 18.1, 18.2, 18.3 e 18.4.
[00639] Para fornecer um parátopo anti-IL-6 superior na estrutura de IgG1 humana projetada, o mutante de cadeia pesada G66D (CDR2) foi amadurecido por afinidade.
Inicialmente, as bibliotecas de cadeia pesada completa G66D contendo mutações pontuais aleatórias nas posições S35, I51, T63 e T65 foram construídas, excluindo substituições para Cys, Met e Asn devido aos passivos químicos associados a estes aminoácidos. Essas quatro posições foram selecionadas com base em sua tolerância a mutações, conforme observado em pesquisas de bactérias e mamíferos. Os vetores de expressão de mamífero contendo mutações de cadeia pesada foram co- transfectados com tipo selvagem de cadeia leve e variante M32L/M50D/N52S/M88Q em culturas de 3 mL de células Expi293 e incubados por cinco dias. Estas culturas foram centrifugadas e os sobrenadantes contendo anticorpos secretados foram colhidos e diluídos em tampão de corrida HBS-EP+ (proporção de 1:20).
[00640] Os vários construtos e propriedades cinéticas resultantes são fornecidas abaixo nas Tabelas 18.1-18.4.
Tabela 18.1 - Cinética Biacore para Mutantes Duplos de
Cadeia Pesada Anti-IL-6 Sup / 37 °C Purified / 37 °C Heavy chain - mutationLight chain - mutation Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU) Chi² (RU²) Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU) Chi² (RU²) WT WT 561.6 6.70E+05 2.55E-04 3.81E-10 125.50 0.0342 82.5 5.65E+05 1.28E-04 2.26E-10 17.4 0.171 G66D WT 878.9 1.83E+06 3.92E-04 2.15E-10 198.70 0.189 90.5 1.57E+06 1.78E-04 1.13E-10 20.4 0.166 S35H , G66D WT 1084.6 2.92E+06 3.97E-04 1.36E-10 231.60 0.839 78.1 1.77E+06 1.85E-04 1.05E-10 17.1 0.169 S35G , G66D WT 167 1.27E+06 3.60E-04 2.84E-10 39.60 0.0144 S35R , G66D WT 3.6 1.22E+02 2.95E-04 2.42E-06 0.00 0.0346 S35Y , G66D WT 129.2 1.10E+06 5.51E-04 5.03E-10 30.60 0.043 S35P , G66D WT 48.4 1.03E+05 1.23E-03 1.19E-08 8.30 0.016 S35W , G66D WT 161.5 9.23E+04 2.17E-03 2.35E-08 33.10 0.0784 S35I , G66D WT 384.4 1.12E+06 3.76E-04 3.34E-10 87.40 0.0524 S35V , G66D WT 856.3 1.13E+06 4.69E-04 4.14E-10 181.50 0.0742 S35A , G66D WT 723.8 1.65E+06 4.94E-04 3.00E-10 168.80 0.076 S35D , G66D WT 577.1 2.00E+06 6.41E-04 3.21E-10 147.80 0.0814 S35L , G66D WT 257.5 1.11E+06 3.51E-04 3.15E-10 57.70 0.0273 S35T , G66D WT 674.3 1.38E+06 4.09E-04 2.97E-10 146.20 0.117 S35K , G66D WT 16.4 1.70E+06 9.49E-04 5.57E-10 4.50 0.0309 S35E , G66D WT 137.7 8.74E+05 5.09E-04 5.82E-10 31.00 0.0558 S35F , G66D WT 143.6 1.59E+06 1.19E-03 7.49E-10 35.20 0.0522 S35Q , G66D WT 390.6 1.31E+06 3.95E-04 3.02E-10 84.90 0.0382
I51R , G66D WT 139.9 1.20E+06 2.02E-04 1.69E-10 31.60 0.0962 I51V , G66D WT -10.4 1.81E+06 6.68E-06 3.69E-12 0.80 0.32 I51W , G66D WT 559.1 1.91E+06 9.43E-03 4.93E-09 120.50 1.38 I51Y , G66D WT 433 1.48E+06 5.10E-03 3.45E-09 100.60 0.449 I51S , G66D WT 402.8 1.89E+06 3.62E-04 1.91E-10 94.90 0.186 I51A , G66D WT 668.5 1.76E+06 5.76E-04 3.27E-10 149.70 0.203 I51E , G66D WT 57.2 7.54E+05 7.60E-04 1.01E-09 10.70 0.056 I51T , G66D WT 435.2 1.79E+06 4.15E-04 2.32E-10 102.10 0.107 I51D , G66D WT 71.4 9.91E+05 2.67E-03 2.69E-09 12.40 0.0255 I51F , G66D WT 367.9 1.36E+06 3.05E-03 2.24E-09 82.90 0.13 I51L , G66D WT 519.6 1.90E+06 7.33E-04 3.86E-10 118.50 0.1 I51K , G66D WT 169.6 1.38E+06 4.02E-04 2.91E-10 40.60 0.0621 I51P , G66D WT 34 1.58E+04 6.12E-03 3.87E-07 9.80 0.0467 I51H , G66D WT 249 1.52E+06 5.29E-04 3.48E-10 57.70 0.075 I51Q , G66D WT 262 1.93E+06 6.48E-04 3.36E-10 61.40 0.1 I51G , G66D WT 608 1.36E+06 5.81E-04 4.28E-10 135.50 0.0597
T63S , G66D WT 723.7 2.52E+06 4.64E-04 1.84E-10 163.30 0.367 T63I , G66D WT 682.7 1.77E+06 3.73E-04 2.11E-10 153.20 0.156 T63H , G66D WT 811.6 1.98E+06 4.20E-04 2.13E-10 179.40 0.287 T63E , G66D WT 630.3 2.61E+06 4.64E-04 1.78E-10 144.80 0.289 77.9 1.72E+06 2.52E-04 1.47E-10 17.1 0.151 T63V , G66D WT 708.8 1.84E+06 3.99E-04 2.17E-10 158.80 0.249 T63G , G66D WT 585.7 1.86E+06 3.97E-04 2.13E-10 131.30 0.166 T63K , G66D WT 531.3 2.49E+06 4.61E-04 1.85E-10 120.50 0.333 77 1.46E+06 2.35E-04 1.61E-10 16.9 0.173 T63W , G66D WT 615.9 1.70E+06 4.27E-04 2.51E-10 136.30 0.143 T63Q , G66D WT 673.7 2.01E+06 4.08E-04 2.03E-10 150.00 0.255 70.9 1.30E+06 2.51E-04 1.93E-10 16.2 0.204 T63R , G66D WT 729 2.66E+06 4.60E-04 1.73E-10 165.20 0.384 T63L , G66D WT 698.9 1.73E+06 3.63E-04 2.10E-10 158.80 0.167 T63D , G66D WT 684.8 1.92E+06 3.92E-04 2.04E-10 154.80 0.103 T63A , G66D WT 632.4 2.80E+06 4.96E-04 1.77E-10 142.50 0.361 T63Y , G66D WT 701.2 1.82E+06 3.83E-04 2.10E-10 157.00 0.169 T63F , G66D WT 621.5 1.81E+06 4.01E-04 2.21E-10 137.80 0.169 T63P , G66D WT 481.3 2.08E+06 4.36E-04 2.10E-10 110.50 0.203
T65K , G66D WT 909.7 1.57E+06 4.12E-04 2.62E-10 199.50 0.226 T65D , G66D WT 648.1 2.18E+06 4.42E-04 2.03E-10 146.60 0.378 T65L , G66D WT 662.8 1.77E+06 3.75E-04 2.12E-10 148.80 0.363 T65W , G66D WT 749 1.64E+06 3.70E-04 2.26E-10 154.50 0.508 T65Q , G66D WT 863.8 3.28E+06 5.17E-04 1.58E-10 192.10 1.68 87.4 1.77E+06 2.62E-04 1.48E-10 19.1 0.135 T65E , G66D WT 937.2 2.20E+06 4.27E-04 1.94E-10 207.60 0.358 T65V , G66D WT 872.5 2.88E+06 5.04E-04 1.75E-10 193.90 0.555 T65S , G66D WT 935.4 1.82E+06 3.83E-04 2.10E-10 206.20 0.244 T65Y , G66D WT 593.7 1.61E+06 3.61E-04 2.24E-10 128.00 0.0985 T65P , G66D WT 341.4 1.54E+06 5.68E-04 3.69E-10 80.80 0.0563 T65A , G66D WT 690.4 1.64E+06 3.64E-04 2.22E-10 153.40 0.127 T65H , G66D WT 659.8 1.63E+06 3.56E-04 2.19E-10 146.80 0.122 T65R , G66D WT 730.4 2.00E+06 4.44E-04 2.22E-10 163.50 0.192 T65G , G66D WT 56.1 1.77E+06 2.18E-04 1.23E-10 14.20 0.033 T65F , G66D WT 587.6 1.56E+06 3.48E-04 2.23E-10 129.10 0.0947
Tabela 18.2 - Cinética Biacore para Mutantes Duplos de
Cadeia Pesada Anti-IL-6 com Cadeia Leve mutagenizada
Sup / 37 °C Purified / 37 °C Heavy chain - mutationLight chain - mutation Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU) Chi² (RU²) Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU) Chi² (RU²) WT M32L, M50D, N52S, M88Q 627.9 6.77E+05 4.14E-04 6.11E-10 133.3 0.0463 100.8 1.12E+06 3.19E-04 2.86E-10 19.5 0.133 G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 504.9 1.63E+06 4.83E-04 2.96E-10 110.5 0.0715 72.2 1.69E+06 4.12E-04 2.44E-10 16.2 0.137 S35H , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 1338.7 3.24E+06 5.39E-04 1.66E-10 270.1 1.6 83.4 1.20E+06 2.54E-04 2.12E-10 17.6 0.151 S35G , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 76.8 1.28E+06 7.81E-04 6.09E-10 17.1 0.0227 S35R , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 11.3 3.79E+03 1.21E-03 3.20E-07 0 0.0397 S35Y , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 75.4 1.18E+06 4.04E-03 3.43E-09 16.6 0.121 S35P , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 89.3 2.02E+05 5.48E-03 2.71E-08 13.4 0.0853 S35W , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 384.2 1.71E+05 5.91E-03 3.46E-08 75.4 0.336 S35I , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 519.3 9.04E+05 1.47E-03 1.62E-09 108.3 0.221 S35V , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 950.9 1.03E+06 1.37E-03 1.33E-09 194.4 0.0828 S35A , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 326.2 1.93E+06 1.26E-03 6.57E-10 73.3 0.107 S35D , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 251.8 2.35E+06 1.77E-03 7.53E-10 62.7 0.116 S35L , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 461.7 9.42E+05 2.43E-03 2.59E-09 100.2 0.0915 S35T , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 265.5 1.43E+06 7.11E-04 4.98E-10 57.2 0.236 S35K , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q -1.5 1.31E+06 3.46E-03 2.64E-09 1.80 0.0621 S35E , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 14.2 2.18E+06 1.89E-03 8.67E-10 4.90 0.0255 S35F , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 38.9 1.53E+06 4.84E-03 3.17E-09 8.10 0.0776 S35Q , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 154.9 2.09E+06 6.26E-04 3.00E-10 35.30 0.104
I51R , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 34.4 1.63E+06 5.80E-05 3.57E-11 7.7 0.0516 I51V , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 72.6 1.76E+06 1.95E-03 1.11E-09 17.1 0.214 I51W , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 46.5 7.91E+05 3.83E-03 4.84E-09 8.2 0.134 I51Y , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 48.2 6.10E+06 2.47E-02 4.04E-09 8.9 0.201 I51S , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 118.4 1.85E+06 4.01E-04 2.17E-10 28.1 0.136 I51A , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 196.7 1.61E+06 8.99E-04 5.59E-10 44.8 0.0388 I51E , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 21.2 9.14E+05 1.96E-03 2.14E-09 3.5 0.129 I51T , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 84.7 2.05E+06 4.78E-04 2.33E-10 20.4 0.131 I51D , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 13.5 8.34E+05 7.99E-03 9.58E-09 2.9 0.0922 I51F , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 32.3 1.37E+06 6.11E-03 4.45E-09 6.2 0.238 I51L , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 69.4 1.64E+06 1.61E-03 9.80E-10 1.67E+01 0.053 I51K , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 42.6 1.72E+06 6.01E-04 3.49E-10 9.00E+00 0.086 I51P , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q -4.4 1.25E+06 1.00E-02 8.04E-09 1.00E-01 0.154 I51H , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 17.3 2.07E+06 1.04E-03 5.00E-10 5.60E+00 0.0639 I51Q , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 43.5 1.96E+06 1.13E-03 5.75E-10 9.40E+00 0.123 I51G , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 152 1.40E+06 9.12E-04 6.52E-10 3.63E+01 0.208
T63S , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 292.2 1.80E+06 4.99E-04 2.78E-10 66.8 0.298 T63I , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 287 1.55E+06 4.46E-04 2.88E-10 64.4 0.0411 T63H , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 422.7 1.72E+06 4.81E-04 2.80E-10 93.5 0.138 T63E , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 325.9 2.00E+06 4.85E-04 2.42E-10 75.2 0.13 63.5 1.65E+06 3.27E-04 1.98E-10 14.2 0.154 T63V , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 263.7 1.57E+06 4.30E-04 2.74E-10 59 0.0516 T63G , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 136.6 1.73E+06 4.50E-04 2.61E-10 29.8 0.11 T63K , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 626.9 2.15E+06 5.29E-04 2.46E-10 140.5 0.233 63.5 1.59E+06 4.01E-04 2.52E-10 14.4 0.165 T63W , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 153.7 1.57E+06 4.49E-04 2.86E-10 34.1 0.051 T63Q , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 435.4 1.78E+06 4.61E-04 2.59E-10 96.6 0.164 61.9 1.69E+06 3.41E-04 2.01E-10 14.1 0.108 T63R , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 391.6 1.92E+06 5.26E-04 2.73E-10 88.7 0.184 T63L , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 473.4 1.60E+06 4.54E-04 2.83E-10 105.1 0.0607 T63D , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 294.9 1.66E+06 4.13E-04 2.49E-10 6.76E+01 0.0916 T63A , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 415.5 1.70E+06 4.58E-04 2.68E-10 9.23E+01 0.155 T63Y , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 198.4 1.91E+06 4.59E-04 2.41E-10 4.75E+01 0.266 T63F , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 152.7 1.67E+06 4.59E-04 2.74E-10 3.53E+01 0.194 T63P , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 144.9 1.70E+06 4.19E-04 2.46E-10 3.14E+01 0.257
T65K , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 1236.8 1.63E+06 5.79E-04 3.56E-10 261 0.301 T65D , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 391.9 1.03E+06 4.80E-04 4.65E-10 86.4 0.137 T65L , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 490.4 1.53E+06 4.46E-04 2.93E-10 109.5 0.0578 T65W , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 324.9 1.19E+06 3.84E-04 3.22E-10 67.8 0.0812 T65Q , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 631.4 2.18E+06 5.62E-04 2.58E-10 144.7 0.191 80.2 1.82E+06 3.80E-04 2.09E-10 17.1 0.144 T65E , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 538.6 1.70E+06 4.74E-04 2.79E-10 118.8 0.268 T65V , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 537.7 1.96E+06 5.51E-04 2.81E-10 118.6 0.303 T65S , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 563.8 1.42E+06 4.41E-04 3.10E-10 123.7 0.216 T65Y , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 313.4 1.55E+06 3.67E-04 2.37E-10 16.5 0.54 T65P , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 16.3 1.79E+06 1.08E-03 6.01E-10 4.7 0.673 T65A , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 677.3 2.27E+06 5.42E-04 2.39E-10 1.51E+02 0.863 T65H , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 385.7 1.43E+06 4.23E-04 2.97E-10 8.58E+01 0.0507 T65R , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 986.3 1.63E+06 5.32E-04 3.27E-10 2.10E+02 0.321 T65G , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 311.9 1.53E+06 4.77E-04 3.11E-10 7.20E+01 0.111 T65F , G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 300.9 1.34E+06 3.91E-04 2.91E-10 6.65E+01 0.131
Tabela 18.3 - Cinética Biacore para Mutantes Triplos de
Cadeia Pesada Anti-IL-6
Sup / 37 °C Purified / 37 °C Heavy chain - mutation Light chain - mutation Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU)Chi² (RU²) Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU)Chi² (RU²) WT WT 292.6 8.61E+05 5.59E-04 6.49E-10 60.7 0.141 71.1 6.15E+05 1.32E-04 2.14E-10 11.6 0.137 G66D WT 459.6 1.62E+06 4.80E-04 2.96E-10 98.7 0.176 S35H, G66D WT 583.7 1.46E+06 5.48E-04 3.74E-10 118.3 0.212 S35H, G66D, Q99V WT 233.5 8.98E+05 4.31E-03 4.80E-09 45.6 0.469 S35H, G66D, Q99L WT 15.5 1.07E+06 2.62E-04 2.44E-10 3.9 0.101 S35H, G66D, Q99F WT 17.9 4.89E+05 1.66E-03 3.39E-09 1.8 0.166 S35H, G66D, Q99S WT 462.8 3.96E+06 2.57E-02 6.48E-09 69.4 0.905 S35H, G66D, Q99E WT 456.3 4.93E+05 1.93E-03 3.91E-09 91.6 9.97 S35H, G66D, Q99R WT 391.4 1.41E+05 1.61E-03 1.14E-08 49.5 0.331 S35H, G66D, Q99H WT 237.2 8.02E+05 1.36E-03 1.70E-09 45 0.423 S35H, G66D, Q99G WT 862.2 3.43E+06 3.30E-03 9.61E-10 190.1 0.879 S35H, G66D, Q99I WT 56.9 8.68E+05 3.35E-03 3.86E-09 5.4 0.417 S35H, G66D, Q99D WT 778 1.29E+06 3.02E-03 2.34E-09 128.6 0.815 S35H, G66D, Q99A WT 328.3 1.85E+06 1.32E-03 7.17E-10 57 0.36 S35H, G66D, Q99K WT 142.5 2.20E+05 3.33E-03 1.51E-08 21.8 0.719 S35H, G66D, Q99Y WT 112.3 2.60E+06 2.15E-03 8.25E-10 12.6 0.191 S35H, G66D, Q99T WT 845.8 1.69E+06 2.22E-03 1.31E-09 165.8 0.625
S35H, G66D, L100I WT 525.4 9.31E+05 6.44E-04 6.92E-10 94.2 0.134 S35H, G66D, L100Y WT 529.9 1.01E+06 6.42E-04 6.38E-10 101.3 0.0737 S35H, G66D, L100H WT 523.5 7.23E+05 4.98E-04 6.88E-10 109.5 0.207 S35H, G66D, L100R WT 562 9.51E+05 9.57E-04 1.01E-09 101.6 0.518 S35H, G66D, L100E WT 438.7 1.13E+06 8.69E-04 7.66E-10 82.4 0.276 S35H, G66D, L100D WT 510.6 1.79E+06 7.99E-04 4.47E-10 102.4 0.426 S35H, G66D, L100A WT 870.7 4.52E+06 8.33E-04 1.84E-10 185.5 0.757 S35H, G66D, L100S WT 970.4 3.28E+06 6.44E-04 1.96E-10 194.3 0.635 S35H, G66D, L100G WT 1113.1 3.20E+06 9.60E-04 3.00E-10 228.6 0.655 S35H, G66D, L100T WT 820.2 3.34E+06 7.24E-04 2.17E-10 168.7 0.635 S35H, G66D, L100V WT 826.9 2.37E+06 5.79E-04 2.44E-10 151.4 0.515 S35H, G66D, L100Q WT 903.7 3.56E+06 6.40E-04 1.80E-10 181.4 0.88 S35H, G66D, L100K WT 882.8 5.88E+06 1.06E-03 1.80E-10 174.7 3.31 S35H, G66D, L100F WT 1002.3 2.51E+06 6.12E-04 2.44E-10 194.6 0.752
Tabela 18.4 - Cinética Biacore para Mutantes Triplos de Cadeia Pesada Anti-IL-6 Emparelhados com Cadeia Leve Mutagenizada Sup / 37 °C Purified / 37 °C Heavy chain - mutation Light chain - mutation Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU)Chi² (RU²) Capture (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU)Chi² (RU²) WT M32L, M50D, N52S, M88Q 239.2 9.20E+05 6.31E-04 6.86E-10 48.3 0.259 G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 149.1 1.66E+06 6.54E-04 3.93E-10 32.2 0.401 S35H, G66D M32L, M50D, N52S, M88Q 644 1.50E+06 6.07E-04 4.03E-10 128.2 0.329 68.7 1.22E+06 2.38E-04 1.95E-10 12 0.172 S35H, G66D, Q99P M32L, M50D, N52S, M88Q 421.1 1.25E+06 1.69E-03 1.35E-09 81.4 0.893 S35H, G66D, Q99V M32L, M50D, N52S, M88Q 9.7 7.94E+05 1.40E-03 1.76E-09 1.3 0.108 S35H, G66D, Q99L M32L, M50D, N52S, M88Q 6.1 1.30E+06 7.75E-04 5.95E-10 1 0.19 S35H, G66D, Q99F M32L, M50D, N52S, M88Q 56.4 1.14E+06 1.13E-04 9.97E-11 0.5 0.36 S35H, G66D, Q99S M32L, M50D, N52S, M88Q 599.7 2.01E+05 1.54E-03 7.66E-09 85.4 3 S35H, G66D, Q99E M32L, M50D, N52S, M88Q 609.4 1.89E+05 8.90E-04 4.71E-09 148.2 0.726 S35H, G66D, Q99W M32L, M50D, N52S, M88Q 5.6 1.12E+11 3.20E-03 2.85E-14 0.4 0.627 S35H, G66D, Q99R M32L, M50D, N52S, M88Q 39.1 2.80E+05 6.57E-04 2.34E-09 1 0.094 S35H, G66D, Q99H M32L, M50D, N52S, M88Q 31 7.98E+05 4.41E-03 5.52E-09 5.2 0.207 S35H, G66D, Q99G M32L, M50D, N52S, M88Q 790.1 3.00E+06 7.74E-03 2.58E-09 174.8 1.22 S35H, G66D, Q99I M32L, M50D, N52S, M88Q -1.8 5.41E+06 2.06E-04 3.81E-11 0.4 0.361 S35H, G66D, Q99D M32L, M50D, N52S, M88Q 399.6 2.57E+10 9.26E+01 3.61E-09 50.8 2.88 S35H, G66D, Q99A M32L, M50D, N52S, M88Q 574.6 1.47E+06 4.50E-03 3.07E-09 116.1 0.343 S35H, G66D, Q99K M32L, M50D, N52S, M88Q 11.3 3.97E+06 1.46E-03 3.68E-10 0.4 0.111 S35H, G66D, Q99Y M32L, M50D, N52S, M88Q 66.3 2.17E+06 5.47E-03 2.51E-09 4.5 0.0663 S35H, G66D, Q99T M32L, M50D, N52S, M88Q 854.1 7.52E+06 4.90E-02 6.51E-09 152.2 4.72 S35H, G66D, L100P M32L, M50D, N52S, M88Q 564.1 7.59E+05 3.54E-03 4.66E-09 100.6 14 S35H, G66D, L100I M32L, M50D, N52S, M88Q 557.6 1.91E+06 7.12E-04 3.72E-10 108 0.361 S35H, G66D, L100Y M32L, M50D, N52S, M88Q 491.9 8.58E+05 8.01E-04 9.34E-10 91.4 0.104 S35H, G66D, L100H M32L, M50D, N52S, M88Q 618.7 1.55E+06 1.29E-03 8.30E-10 132.4 0.381 S35H, G66D, L100W M32L, M50D, N52S, M88Q 456.4 6.25E+05 1.24E-03 1.98E-09 81.8 0.525 S35H, G66D, L100R M32L, M50D, N52S, M88Q 732.6 1.32E+06 1.16E-03 8.78E-10 136.9 0.0885 S35H, G66D, L100E M32L, M50D, N52S, M88Q 563.5 2.05E+06 1.45E-03 7.04E-10 112.8 0.197 S35H, G66D, L100D M32L, M50D, N52S, M88Q 454.2 5.77E+06 2.02E-03 3.50E-10 97.1 0.22 S35H, G66D, L100A M32L, M50D, N52S, M88Q 1033.5 5.82E+07 4.86E-03 8.34E-11 226.9 2.56 60.7 3.72E+06 4.06E-04 1.09E-10 11.3 0.139 S35H, G66D, L100S M32L, M50D, N52S, M88Q 1088.2 8.03E+06 9.13E-04 1.14E-10 229.1 1.17 86.7 3.61E+06 4.24E-04 1.17E-10 15.2 0.16 S35H, G66D, L100G M32L, M50D, N52S, M88Q 1193.9 6.87E+06 1.60E-03 2.33E-10 253.1 1.37 63.2 2.76E+06 6.94E-04 2.51E-10 12.6 0.153 S35H, G66D, L100T M32L, M50D, N52S, M88Q 939.8 1.36E+07 2.78E-03 2.04E-10 202.7 2.13 62.1 1.83E+06 4.81E-04 2.63E-10 11.2 0.14 S35H, G66D, L100V M32L, M50D, N52S, M88Q 985.4 5.01E+06 9.22E-04 1.84E-10 201 0.741 86.5 1.62E+06 3.85E-04 2.38E-10 14.2 0.16 S35H, G66D, L100Q M32L, M50D, N52S, M88Q 1087.6 4.97E+06 7.34E-04 1.48E-10 229.9 0.807 66.8 2.26E+06 3.36E-04 1.49E-10 12.9 0.152 S35H, G66D, L100K M32L, M50D, N52S, M88Q 1132.4 4.29E+06 8.22E-04 1.91E-10 233.6 1.71 88.8 1.49E+06 2.79E-04 1.88E-10 15.1 0.165 S35H, G66D, L100F M32L, M50D, N52S, M88Q 877.1 1.46E+06 6.14E-04 4.22E-10 168.2 0.231
[00641] A cinética de ligação dessas moléculas mutantes à IL-6 foi medida a 37°C usando um Biacore T200. Os anticorpos foram capturados em um chip de Proteína A (GE) por injeção de diluições de células de sobrenadante 1:20 a 10 µL/min por 60 segundos. Cinco concentrações (0,56, 1,67, 5, 15 e 45 nM) de IL-6 fluíram sobre os anticorpos capturados por 60 segundos a uma taxa de fluxo de 30 µL/min e dissociados por 180 segundos em um formato de ensaio Biacore de cinética de ciclo único. O chip sensor foi regenerado por uma injeção de 60 segundos de Glicina 10 mM pH 1,7 na taxa de fluxo de 50 µL/min. Uma configuração de ensaio semelhante foi usada para monitorar as interações entre as amostras de anticorpos purificados e IL-6 a 37°C, quando aplicável. Para esta configuração, 1 µg/mL de anticorpo purificado foi injetado sobre um chip de Proteína A a 10 µL/min por 25 segundos.
Cinco concentrações (0,56, 1,67, 5, 15 e 45 nM) de IL-6 fluíram sobre os anticorpos capturados por 60 segundos na taxa de fluxo de 30 µL/min e dissociados por 1800 segundos em um formato de ensaio Biacore de cinética de ciclo único.
O chip sensor foi regenerado por uma injeção de 60 segundos de Glicina 10 mM pH 1,7 a uma taxa de fluxo de 50 µL/min. A análise dos dados para o sobrenadante e as amostras purificadas foram realizadas usando o software BIAevaluation (GE). Todos os sensorgramas foram subtraídos de referência dupla e ajustados usando um modelo de ligação Langmuir 1: 1.
[00642] Como mostrado pelas Tabelas 18.1 e 18.2, a cadeia pesada mutante duplo S35H G66D apresentou um aumento na expressão de proteína, conforme indicado pelo aumento aproximado de duas vezes no nível de captura em relação à cadeia pesada do tipo selvagem. Este mutante também apresentou um pequeno aumento na afinidade dependendo da cadeia leve emparelhada (tipo selvagem: ~2 vezes, M32L/M50D/N52S/M88Q: ~1.3 vezes). A Tabela 18.1 ilustra a otimização G66D de cinética Biacore do tipo selvagem para mutantes duplos de cadeia pesada Anti-IL-6. Os dados foram obtidos para amostras antes (sup) e após a purificação, ambas a 37°C. A Tabela 18.2 ilustra a otimização G66D Das cinéticas de Biacore do mutante LC para mutantes duplos de cadeia pesada Anti-IL-6 pareados com cadeia leve mutagenizada. Os dados foram obtidos para amostras antes (sup) e após a purificação a 37°C.
[00643] Portanto, este mutante duplo foi selecionado como um ponto de partida para outra rodada onde as posições tolerantes a substituição Q99 e L100 em CDR3 foram aleatoriamente mutagenizadas, expressas e avaliadas quanto à ligação de IL-6 como descrito para a rodada de triagem de G66D. Como mostrado nas Tabelas 18.3 e 18.4, as substituições L100 para Ala, Ser, Gly, Thr, Gin, Lys apresentaram expressão superior quando comparadas com o tipo selvagem conforme indicado pelos níveis de captura. Estes mutantes foram, portanto, selecionados para a purificação e a avaliação da ligação de IL-6. As medições de afinidade com o material purificado também mostraram ligação superior de IL-6, como ilustrado nas Tabelas 18.3 e 18.4. Com base nestes resultados, estas CDRs modificadas adicionais, como ilustrado na Figura 18 foram incorporadas no projeto das moléculas inibidoras duplas anti-IL-6 e anti-VEGF.
[00644] A tabela 18.3 ilustra a modificação de cadeia pesada G66D/S35H associada com a cinética de Biacore do tipo selvagem LC para mutantes de cadeia pesada Anti-IL-6. Os dados foram obtidos para amostras antes (sup) e após a purificação, ambas a 37°C. A Tabela 18.4 ilustra a modificação de cadeia pesada G66D/S35H emparelhada para a cinética de Biacore de cadeia pesada Anti-IL-6 emparelhada com cadeia leve mutável. Os dados foram obtidos para amostras antes (sup) e após a purificação, ambas a 37°C.
Exemplo 19 - Variantes do Inibidor Duplo Anti-IL-6 Anti-
VEGF
[00645] Com base nos resultados com as variantes de VEGF-trap e parátopos anti-IL-6 superiores, 216 moléculas em duas configurações diferentes foram projetadas que eram compostas por combinações de sequências conforme exibido nas Figuras 19, 20, 21, 22 e 23. Para a primeira configuração (VEGFR-Anti-IL-6), a VEGF-trap, como mostrado pelas sequências 1A-1D da Figura 19, está posicionada no início da proteína, seguido por uma repetição dupla de um ligante Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (GS), como mostrado pela sequência 2A da Figura 20, que conecta o trap ao terminal N da cadeia pesada anti-IL-6, como mostrado pelas sequências 3A-3I da Figura
21. Estes construtos podem ser emparelhados com cadeias leves listadas como sequências 4A-4C da Figura 22. Na segunda configuração (Anti-IL-6-VEGFR), os domínios variável e constante da cadeia pesada, ilustrados por Cadeia pesada - Fab, sequências 5A-5I da Figura 23, estão ligados ao VEGF- trap, ilustrada pelas sequências 1A-1D da Figura 19, por meio do ligante GS, ilustrado pela sequência 2A da Figura 20, e então o domínio Fc, ilustrado por cadeia pesada - Fc, sequências 5A-5I da Figura 23, é fundido à extremidade C- terminal do VEGF-trap. Assim, VEGF-trap é prensado entre as regiões Fab e Fc do anticorpo.
[00646] A Figura 19 ilustra sequências de VEGF-trap.
A variação na sequência está sublinhada e realçada em negrito. A Figura 20 ilustra a sequência de ligação dupla Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GS). A Figura 21 ilustra sequências de cadeia pesada para moléculas Anti-IL-6. As CDRs são sublinhadas. A Figura 22 ilustra sequências de cadeia leve para moléculas Anti-IL-6. As CDRs são sublinhadas. A Figura 23 ilustra sequências de cadeia pesada (separadas em Fab e Fc) para moléculas Anti-IL-6. As CDRs são sublinhadas.
[00647] Em algumas modalidades, qualquer das opções do VEGF-trap, em que ele é intercalado entre as regiões Fab e Fc de anticorpo, pode ser emparelhada com cadeias leves listadas nas sequências 4A - 4C Da Figura 22. Assim, em algumas modalidades, os construtos esboçados na Figura 19 (as sequências de VEGFR) podem ser usados para qualquer um dos arranjos de VEGF-trap aqui providos, ou por si próprios.
Exemplo 20 - Cinética de Ligação entre fusão de VEGFR- trap Fc e VEGF
[00648] As Figuras 26A - 26C ilustram os resultados para os ensaios Biacore usados para determinar a afinidade entre os agentes Anti-VEGF e o VEGF. A cinética de ligação foi medida usando-se um Biacore T200 a 37°C no tampão HBS- EP+ contendo 1 mg/mL de BSA. VEGFR-Fc (1 µg/mL) e Eylea (1 µg/mL) foram capturados em um chip de proteína A (GE) a 10 µL/min durante 25 segundos, cinco concentrações de VEGF-A165 (0,19, 0,56, 1,67, 5, 15 nM) foram fluidas sobre moléculas anti-VEGF capturadas por 120 segundos a 30 gL/min e dissociadas durante 30 min. A superfície do chip sensor foi regenerada por injeção de 60 segundos de 10 mM de Glicina, pH 1,7 a uma taxa de fluxo de 50 mg/min. Todos os sensores foram subtraídos de referência dupla e ajustados utilizando um modelo de ligação de Langmuir 1:1. Como mostrado nas Figuras 26A - 26 C, VEGFR-Fc e Eylea se ligam com afinidade similar a VEGF. Neste exemplo, VEGFR-Fc contém sequência 6A.
Exemplo 21 - Remoção de produto de clivagem
[00649] Como discutido no Exemplo 13, VEGFR-AntiIL6 apresenta um menor grau de clivagem no domínio de VEGFR1 na região de VEGF-trap. Desenvolvemos dois métodos de cromatografia ortogonal para separar proteína intacta do material clivado após a etapa de purificação da proteína A: i) troca catiônica (CEX) e ii) interação hidrofóbica (HIC).
[00650] Para o método CEX, o pH da solução de eluição de proteína A VEGFR-AntiIL6 é ajustada para 6, e então injetada em uma coluna XS Porous pré-equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio pH 6. Proteína intacta eluiu em força iônica mais baixa do que o material clivado e é quase completamente separada dentro de um gradiente linear de resistência iônica crescente (0-1 M de Cloreto de sódio) (Figura 32). As frações enriquecidas com proteína intacta foram reunidas e o rendimento global de recuperação foi de aproximadamente 57%.
[00651] Para o método HIC, uma mistura de proteína intacta de VEGFR-AntiIL6 enriquecida com material clivado foi injetada em uma coluna de Butyl HP pré-equilibrada com 20 nM de fosfato de sódio pH 6, 500 mM de sulfato de amônio a 1 M. Proteínas intactas e clivadas foram separadas dentro de um gradiente linear de resistência iônica decrescente (sulfato de amónio 1-0 M), onde proteína intacta eluiu a uma resistência iônica mais baixa do que o material clivado e pode ser parcial ou completamente separada dependendo das frações reunidas (Figura 33).
Exemplo 22 - Afinidade de VEGFR AntiIL6 a IL6 e VEGF-A Medida por KinExA
[00652] O Sistema de Análise de Exclusão de Cinética (KinExA®) sistema 3200 (Sapidyne Instruments Inc. Boise, ID) foi usado para medir a afinidade de ligação de equilíbrio e cinética entre VEGFR-AntIL6 ou VEGFR-AntiIL6-OG1802 (o componente de proteína do mesmo é mostrado na Figura 27) e VEGF ou IL6 em solução. As esferas de azlactona revestidas com VEGF ou IL6 foram usadas para capturar uma fração de VEGFR-AntiIL6 ou VEGFR-AntiIL6-OG1802 livre de uma amostra equilibrada de VEGFR-AntiIL6 ou VEGFR-AntiIL6-OG1802 e VEGF ou IL6. Moléculas de inibidor duplo capturadas foram detectadas com um anticorpo anti-humano policlonal marcado fluorescente (Alexa 647 de cabra, IgG Anti-humana).
[00653] A afinidade entre as moléculas de inibidor duplo e VEGF foi determinada a partir de 2-3 curvas de titulação em concentrações crescentes de inibidor duplo e suas diluições em série de titulação de VEGF correspondentes (indicadas entre parênteses) listadas a seguir: I) VEGFR- AntiIL6: 1 nM (20 nM, diluição de 2 vezes, 12 diluições) 3,5 horas de incubação; 50 pM (500 pM, diluição de 2 vezes, 14 diluições) 2,5 horas de incubação; 10 pM (1 nM, diluição de 2 vezes, 13 diluições) incubação de 23 horas; II) VEGFR- AntiIL6-OG1802: incubação de 45 min 2 nM (30 nM, diluição de 2 vezes, 12 diluições); 100 pM (15 nM, diluição de 2 vezes, 14 diluições) 6 horas de incubação; 7,5 pM (1 nM, diluição de 2 vezes, 14 diluições) 48 horas de incubação. Medições semelhantes foram realizadas com IL6 nas seguintes condições: III) VEGFR-AntiIL6: 1 nM (20 nM, diluição de 2 vezes, 13 diluições) 7 horas de incubação; 10 pM (1 nM,
diluição de 2 vezes, 13 diluições) 42 horas de incubação; 100 pM (1 nM, diluição de 2 vezes, 13 diluições) 2,5 horas de incubação; IV) VEGFR-AntiIL6-OG1802: 1 nM (22,5 nM, diluição de 2 vezes, 13 diluições) 5,5 horas de incubação; 100 pM (22,5 nM, diluição de 2 vezes, 14 diluições) 12 horas de incubação.
[00654] As taxas (kon, M-1s-1) entre moléculas inibidoras duplas e VEGF ou IL6 foram determinadas diretamente a partir de experimentos de medição cinética (1- 2 curvas para cada par analisado), enquanto as taxas de saída (koff, s-1) foram calculadas com base na seguinte equação: koff = Kd x kon. As medições foram conduzidas em quatro preparações contendo i) 100 pM de VEGFR-AntiIL6 e 86,4 pM de VEGF, ii) 217 pM de VEGFR-AntiIL6-OG1802 e 200 pM de VEGF, iii) 100 pM de VEGFR-AntiIL6 e 84,3 pM de IL6, iv) 1000 pM de VEGFR- AntiIL6 e 900 pM de IL6.
[00655] Todas as medições foram feitas a 37°C utilizando tampão circulante de PBS lx (pH 7,4) e amostras preparadas em 1 xPBS (pH 7,4) com 1 mg/mL de BSA. Análises de dados foram feitas utilizando o software KinExA Pro 4311.
[00656] Sob as condições testadas, VEGFR-AntiIL6- OG1802 se liga a VEGF e IL6 em uma maneira comparável à VEGFR-AntiIL6 com valores Kd de 2,10 pM para VEGFR-AntiIL6 e VEGF, 1,02 pM para VEGFR-antiIL6-OG1802 e VEGF, 21,10 pM para VEGFR-AntiIL6 e IL6, 12,10 pM para VEGFR-AntiIL6-OG1802 e IL6 (ver Tabelas 22.1 e 22.2).
Tabela 22.1 VEGF VEGFR-AntiIL6 VEGFR-AntiIL6-OG1802 Kd (pM) 2,10 1,02 95% intervalo de 1,34 - 2,91 0,46 - 1,80 confiança (pM) Taxa kon ("on 4,04 x107 3,75 x106 rate") (M-1s-1) 95% intervalo de 3,31 x107 - 4,92 2,90 x106 - 4,90 x106 confiança x107 Taxa koff ("off 8,49 x10-5 3,83 x10-6 rate") (s-1) Tabela 22.2 - IL-6 VEGFR-AntiIL6 VEGFR-AntiIL6-OG1802 Kd (pM) 21,10 12,10 95% intervalo de 14,30 - 30,80 8,47 - 16,30 confiança (pM) Taxa kon ("on 1,15 x107 8,00 x106 rate") (M-1s-1) 95% intervalo de 9,57 x106 - 1,37 6,44 x106 - 9,93 x106 confiança x107 Taxa koff ("off 2,42 x10-4 9,66 x10-5 rate") (s-1)
[00657] As afinidades medidas de VEGFR-AntiIL6 e VEGFR-AntiIL6-OG1802 estavam dentro de erro tanto para IL6 quanto para VEGF, assim estes resultados demonstram que o biopolímero não afeta a ligação de inibidores duplos a seus alvos.
Exemplo 23 - ELISA Competitivo de VEGF/VEGFR
[00658] Este ensaio foi realizado conforme descrito no Exemplo 3. Neste ensaio, VEGFR-AntiIL6, VEGFR-AntiIL6- OG1802 (como mostrado na Figura 27) e Eylea inibiram a ligação de VEGF a VEGFR em vários graus (Figura 34). VEGFR- AntiIL6-OG1802 mostrou inibição superior (IC50 = 0,99 nM) quando comparado com VEGFR-Anti-IL6 (IC50 = 1,98 nM) e Eylea (IC50 = 1,38 nM). Além disso, VEGFR-AntiIL6 mostrou inibição máxima superior sobre Eylea, enquanto VEGFR-AntiIL6-OG1802 teve uma inibição máxima ainda mais pronunciada (VEGFR- AntiIL6-OG1802 = 79,5%, VEGFR-Anti-IL6 = 67,0%, vs. Eylea = 49,6%) Estes dados indicam que a adição do biopolímero OG1802 ao VEGFR-AntiIL6 cria capacidades inibitórias adicionais para a ligação do VEGF ao VEGFR. O biopolímero, portanto, contribui para a função da molécula.
Exemplo 24 - ELISA Competitivo IL-6/IL-6R
[00659] Este ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 3.
[00660] Sob estas condições, o VEGFR-AntiIL6-QG1802 bloqueou eficazmente a interação de IL-6/IL-6R de uma maneira comparável a VEGFR-AntiIL6 com valores de IC50 de 0,26nM para VEGFR-AntiIL6 e 0,23nM para VEGFR-AntiIL6-OG1802 (Figura 35). Estes resultados indicam que o biopolímero não altera os efeitos inibidores do inibidor duplo na Ligação de IL6 a seu receptor. Eylea serviu como um controle negativo.
Exemplo 25 - Ensaio de repórter de VEGFR estimulado por VEGF com base em Células
[00661] Este ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 15.
[00662] Sob as condições testadas, VEGFR-AntiIL6- OG1802 inibiu células repórter VEGFR estimuladas por VEGF de uma maneira comparável a VEGFR-AntiIL6 e Eylea com valores médios de IC50 de 0,35 ± 0,10 nM, 0,51 ± 0,07 nM e 0,35 ± 0,03 nM, respectivamente (Figura 36). Pode haver uma tendência de que VEGR-AntiIL6-OG1802 (o componente de proteína como mostrado na Figura 27) e Eylea sejam moderadamente mais eficazes do que VEGFR-AntiIL6, mas este não é um achado significativo e cai dentro do erro do ensaio.
Podemos concluir a partir desses dados que o bioconjugado inibe a sinalização de VEGFR2 de forma semelhante ao seu precursor de proteína.
Exemplo 26 - Formação de túbulos estimulada por Lipopolissacarídeo em HUVECs:
[00663] Células HUVEC de passagem 2 as foram cultivadas em meio Basal Vascular suplementado com o kit de crescimento de células endoteliais do extrato de cérebro Bovino 1x (ATCC; meio de crescimento) em CO2 a 5% a 37 graus.
Uma vez que as células alcançaram 70% de confluência, as células foram levantadas da placa utilizando-se tripsina (0,05%; ATCC) e 0,75 x lOx 6 células colocadas em um frasco T25 em meio de crescimento.
[00664] No dia seguinte, o meio foi trocado para o meio de ensaio (2% de FBS em Meio Basal Vascular). Após 6 horas, 5 µg/ml de Calceína AM Foram adicionados diretamente ao meio e incubados durante 30 minutos a 37 graus.
[00665] Ao mesmo tempo, 200 µls de Matrigel pré- descongelado (fator de crescimento reduzido; Corning) foram adicionados a cada cavidade de uma lâmina de vidro de 8 cavidades, e incubados a 37 graus por 30 minutos.
[00666] Durante as incubações, os inibidores (37,5 nM de concentração final) foram misturados com lipopolissacarídeo (LPS; Sigma; 1µ/ml de concentração final).
[00667] Após a incubação de Calceína AM por 30 minutos, as células foram lavadas 3x com PBS e, então, tripsinizadas. As células colhidas foram centrifugadas durante 3 minutos a 1.500 xg e ressuspensas em meio de ensaio a uma densidade de 500.000 células/ml. 150 µls de células foram então misturadas com 100 µls de soluções de inibidor/complexo preparadas, e então transferidas para as lâminas da câmara revestida com Matrigel e incubadas durante a noite.
[00668] No dia seguinte, os túbulos foram fotografados usando uma lente objetiva de 10x e o filtro GFP em um microscópio de fluorescência EVOS (Life Technologies).
Pelo menos 2 imagens representativas foram tiradas para cada condição e então analisadas usando o Angiogenesis Analyzer Plugin for ImageJ (NIH), que avalia e quantifica 20 parâmetros de formação de rede de túbulos.
[00669] A significância estatística foi determinada a partir de todas as repetições de experimentos independentes usando um teste t de Student bicaudal não emparelhado.
[00670] Nessas condições, VEGFR-AntiIL6 mostrou inibição estatisticamente significativa de 15/20 parâmetros angiogênicos medidos sobre o controle, enquanto Eylea inibiu significativamente 5/20 e o anti-IL6 inibiu 3/20 em relação às células tratadas de controle. Ao todo, todos, exceto um dos parâmetros que apresentaram tendência ou foram significativamente afetados por Eylea ou anti-IL6 foram significativamente inibidos por VEGFR-AntiIL6. Além disso, havia vários parâmetros em que VEGFR-AntiIL6 exibiu inibição significativamente melhor sobre Eylea (7/20) e anti-IL6 (10/20), 3 dos quais VEGFR-AntiIL6 foi significativamente melhor do que Eylea e anti-IL6. (Figura 37 e Figura 38 e 11).
[00671] A VEGFR-AntiIL6-OG1802 inibiu eficazmente a formação de túbulos HUVEC e, de modo interessante, VEGFR- antiIL6-OG1802 mostrou uma tendência de inibição aumentada em 9/20 dos parâmetros sobre VEGFR-AntiIL6. (Figura 39).
Isto implica que o VEGFR-antiIL6-OG1802 adicionou benefício em relação ao seu complemento não conjugado.
Exemplo 27 - Ensaio de proliferação de HUVEC:
[00672] Este ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 17.
[00673] Sob as condições testadas, VEGFR-AntiIL6- OG1802 (o componente de proteína como mostrado na Figura 27) inibiu a proliferação de HUVEC estimulada por VEGF/1L6 de uma maneira comparável à VEGFR-AntiIL6, enquanto a Eylea não teve efeito (Figura 40A).
[00674] Curiosamente, VEGFR-AntiIL6-OG1802 mostrou eficácia aumentada em relação a VEGFR-AntiIL6 quando diferentes densidades de células foram semeadas por poço no início do experimento. Como mostrado na FIG. 40B, a 2.000 células por poço, VEGFR-AntiIL6 e VEGFR-AntiIL6-OG1802 mostraram inibição quase idêntica da proliferação de HUVEC.
A 4.000 células por poço, VEGFR-AntiIL6-OG1802 mostrou inibição máxima ligeiramente melhor do que VEGFR-AntiIL6 (40% vs. 30%, respectivamente), e a 6.000 células por poço, VEGFR-AntiIL6-OG1802 inibiu a proliferação em 25% em relação a controle, enquanto o VEGFR-AntiIL6 não teve efeito.
[00675] Conforme mostrado nos exemplos acima, sem a intenção de ser limitado pela teoria, parece que o biopolímero ajuda a entregar sua contraparte de proteína à superfície da placa e das células. Isso permite que a droga iniba principalmente os pools de VEGF e IL6 que têm maior probabilidade de ativar a sinalização celular e evitar a saturação por VEGF e IL6 suspensos mais elevados na fase fluida e com menor probabilidade de afetar a sinalização celular. À medida que o número de células aumenta, esse efeito é mais pronunciado, pois mais droga é necessária para atuar em mais células. Assim, em algumas modalidades, o conjugado fornece um produto superior, pois pode auxiliar na distribuição da molécula.
[00676] Todos os pedidos de patentes depositados, sites, outras publicações, números de acesso e semelhantes citados acima ou abaixo são incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma medida como se cada item individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Se diferentes versões de uma sequência estiverem associadas a um número de acesso em momentos diferentes, será considerada a versão associada ao número de acesso na data de apresentação efetiva deste pedido. A data efetiva de depósito significa a mais cedo entre a data efetiva de depósito ou a data de depósito de um pedido de prioridade referente ao número de acesso, se aplicável.
Da mesma forma, se diferentes versões de uma publicação, site ou similar forem publicadas em momentos diferentes, a versão publicada mais recentemente na data efetiva do depósito do pedido é considerada, salvo indicação em contrário.
Qualquer característica, etapa, elemento,
modalidade ou aspecto da invenção pode ser usado em combinação com qualquer outro, a menos que especificamente indicado de outra forma.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (87)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo antagonista isolado caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a IL-6 que é conjugado a um polímero.
2. Anticorpo antagonístico IL-6 isolado caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável de aminoácido da cadeia pesada que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 7-13,19-27, 89, 90, 256-262; e uma região variável de aminoácido da cadeia leve que compreende a cadeia leve que tem uma sequência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 91 a 93, 28-30.
3. Anticorpo antagonista de IL-6 isolado caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1) VH, CDR2 VH, e CDR3 VH tendo uma sequência de aminoácidos das CDRs listadas na SEQ ID NO: 256; e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma CDR1 VL, uma CDR2 VL, e uma CDR3 VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de CDRs listadas nas SEQ ID NOs: 91 a 93.
4. Anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6 caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma das seguintes mutações com base na numeração EU: L234A, L235A e G237A.
5. Anticorpo antagonista isolado que se liga a IL-6, o anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende: uma CDRH1 que é uma CDRH1 na SEQ ID NO: 172; uma CDRH2 que é uma CDRH2 na SEQ ID NO: 173; uma CDRH3 que é uma CDRH3 na SEQ ID NO: 174: uma CDRL1 que é uma CDRL1 na SEQ ID NO: 199; uma CDRL2 que é uma CDRL2 na SEQ ID NO: 200; uma CDRL3 que é uma CDRL3 na SEQ ID NO: 201; pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): L234A, L235A e G237A; e pelo menos uma das seguintes mutações (numeração EU): Q347C ou L443C.
6. Anticorpo antagonista isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a IL-6 humana com uma afinidade dentre cerca de 10 pM a cerca de 1 nM.
7. Anticorpo antagonista isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio constante da cadeia pesada compreende adicionalmente um resíduo de cisteína introduzido por tecnologia de DNA recombinante.
8. Anticorpo antagonista isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o resíduo de cisteína é selecionado do grupo que consiste em Q347C e L443C (numeração EU).
9. Anticorpo antagonista isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o resíduo de cisteína é L443C (numeração EU).
10. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende: o anticorpo antagonista isolado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e VEGF-trap.
11. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a VEGF-trap está posicionado
1. em uma extremidade N-terminal de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6; ou
2. entre uma região de dobradiça e após um domínio CH1 de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6.
12. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a VEGF-trap está em uma extremidade N-terminal da cadeia pesada compreendendo VH IL-
6.
13. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a VEGF-trap está entre a região de dobradiça e após um domínio CH1 da cadeia pesada compreendendo VH de IL-6.
14. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação do
VEGF compreende o domínio 2 de VEGFR1 e o domínio 3 de VEGFR2.
15. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação do VEGF consiste na sequência da SEQ ID NO: 114.
16. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação do VEGF funciona como uma VEGF-trap, impedindo que VEGF se ligue a receptores de VEGF expressados por meio celular.
17. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende: (a) qualquer um dos anticorpos antagonistas isolados conforme definidos nas reivindicações 1 a 9; e (b) um polímero, em que o polímero é covalentemente ligado ao anticorpo.
18. Conjugado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polímero compreende um polímero contendo fosforilcolina.
19. Conjugado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polímero compreende um monômero zwitteriônico, em que o monômero zwitteriônico é selecionado do grupo que consiste em HEMA-fosforilcolina, PEG, ácidos graxos biocompatíveis e derivados dos mesmos, Hidroxialquilamido (HAS), Hidroxietilamido (HES), Polietilenoglicol (PEG), Poli(Glyx-Sery) (HAP), ácido hialurônico (HA), polímeros de heparosano (HEP), Flexímeros, Dextrano, ácidos poli-siálicos (PSA), domínios Fc, Transferrina, Albumina25, peptídeos semelhantes à elastina (ELP), polímeros XTEN, polímeros PAS, polímeros PA, peptídeos de ligação de albumina, peptídeos CTP e peptídeos de ligação de FcRn.
20. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende: a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16; e um polímero, em que o polímero é covalentemente ligado à proteína de fusão.
21. Conjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o polímero compreende um polímero contendo fosforilcolina.
22. Conjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o polímero compreende um monômero zwitteriônico, em que o monômero zwitteriônico é selecionado do grupo que consiste em HEMA-fosforilcolina, PEG, ácidos graxos biocompatíveis e derivados dos mesmos, Hidroxialquilamido (HAS), Hidroxietilamido (HES), Polietilenoglicol (PEG), Poli (Glyx-Sery) (HAP), ácido hialurônico (HA), polímeros de heparosano (HEP), Flexímeros, Dextrano, ácidos poli-siálicos (PSA), domínios Fc, Transferrina, Albumina 25, peptídeos semelhantes à elastina
(ELP), polímeros XTEN, polímeros PAS, polímeros PA, peptídeos de ligação de albumina, peptídeos CTP e peptídeos de ligação de FcRn.
23. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o polímero compreende monômeros de (2- (trimetilamônio)etil)fosfato de 2(metacriloiloxi)etila (MPC).
24. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o polímero tem um peso molecular de pico entre 300.000 e
1.750.000 Daltons, como medido por cromatografia por exclusão de tamanho - espalhamento de luz a múltiplos ângulos (daqui por diante “SEC-MALS”).
25. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de que o polímero tem um peso molecular máximo entre 500.000 e
1.000.000 Daltons, como medido por SEC-MALS.
26. Conjugado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o polímero tem um peso molecular de pico entre 600.000 a 800.000 Daltons como medido por SEC-MALS.
27. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que o polímero tem 2 ou mais braços.
28. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 27, caracterizado pelo fato de que o polímero tem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 braços.
29. Conjugado, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polímero tem 9 braços.
30. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um IgG.
31. Conjugado, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o polímero é covalentemente ligado a um grupo sulfidrila a partir de um resíduo de cisteína na cadeia pesada de IgG.
32. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um resíduo de cisteína na posição 347 ou 443 (numeração EU).
33. Conjugado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o polímero é covalentemente ligado a um grupo sulfidrila a partir de um resíduo de cisteína na posição 347 ou 443 (numeração EU).
34. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é adicionalmente conjugado a um polímero para formar um bioconjugado, e em que o bioconjugado tem um peso molecular entre cerca de 350.000 e 1.900.000 Daltons.
35. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 34, caracterizado pelo fato de que o Índice de Polidispersidade (PDI) é igual ou menor que 1,5.
36. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 35, caracterizado pelo fato de que o polímero tem 9 braços; e o polímero tem um peso molecular entre cerca de 600.000 e cerca de 900.000 Da.
37. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 36, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte estrutura: Fórmula (17)
em que: cada cadeia pesada do anticorpo anti-IL-6 é representada pela letra H, e cada cadeia leve do anticorpo anti-IL-6 é representada pela letra L; o polímero é ligado ao anticorpo através do sulfidril de C443 (numeração EU), cuja ligação é representada em uma das cadeias pesadas; PC é , em que a linha curva indica o ponto de ligação ao resto do polímero, e X = a) OR em que R=H, metila, etila, propila, isopropila, b) H, ou c) qualquer haleto, incluindo Br; e n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 e n9 são iguais ou diferentes, de modo que a soma de n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 e n9 é 2500 mais ou menos 15%, em que se o conjugado compreende uma VEGF-trap, a VEGF- trap é fundido: a) com a extremidade N-terminal da cadeia pesada; ou b) entre uma região de dobradiça e uma região Fab (após o domínio CH1) da cadeia pesada.
38. Conjugado, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que se o conjugado compreende uma VEGF-trap, ele compreende um domínio 2 de VEGFR1 e, em seguida, um domínio 3 de VEGFR2, nessa ordem.
39. Linha celular isolada caracterizada pelo fato de que produz um anticorpo antagonista isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
40. Linha celular isolada, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a linha celular é selecionada do grupo que consiste em CHO, k1SV, XCeed, CHOK1SV e GS-KO.
41. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo antagonista isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
42. Vetor de expressão recombinante caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 41.
43. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 42.
44. Método de produção de um anticorpo antagonista de IL-6 ou de uma proteína de fusão do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar uma linha celular que produz de forma recombinante um anticorpo antagonista isolado conforme definido em qualquer um de 1 a
9 ou a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16 sob condições em que o anticorpo é produzido; e recuperar o anticorpo.
45. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo antagonista isolado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16 e/ou um conjugado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 38, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
46. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a composição é um líquido e tem um nível de endotoxina inferior a cerca de 0,2 EU/ml.
47. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a composição é um líquido e tem um nível de endotoxina menor que cerca de 2,0; 1; 0,5 ou 0,2 EU/ml.
48. Método para o tratamento ou a profilaxia de uma doença em um paciente em necessidade do mesmo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao paciente de um anticorpo antagonista isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16 e/ou um conjugado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 38.
49. Método para o tratamento ou a profilaxia de uma doença em um paciente em necessidade do mesmo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: identificar um paciente tendo atividade hiperativa de IL-6 e/ou VEGF; e administrar ao paciente um anticorpo antagonista isolado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16 e/ou um conjugado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 38.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a doença é um distúrbio ocular.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ocular é pelo menos um de degeneração macular úmida ou neovascular, degeneração macular úmida ou neovascular relacionada à idade, degeneração macular seca relacionada à idade, bloqueio venoso, arterial ou outro bloqueio dos vasos sanguíneos oculares ou da retina com ou sem edema da retina, uveíte anterior e posterior, edema macular uveítico, retinopatia diabética, retinopatia diabética não proliferativa, edema macular diabético, edema macular diabético não proliferativo, esclerite por doença inflamatória oftálmica, e tumores intraoculares.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que o anticorpo isolado, a proteína de fusão ou o conjugado é administrado(a) não mais frequentemente do que uma vez por mês.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que o anticorpo isolado, a proteína de fusão ou o conjugado é administrado(a) não mais frequentemente do que uma vez a cada dois meses.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que o anticorpo isolado, a proteína de fusão ou o conjugado é administrado(a) não mais frequentemente do que uma vez a cada três meses.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo isolado, a proteína de fusão ou o conjugado é administrado(a) com uma frequência entre uma vez por ano e uma vez a cada dois meses.
56. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende: uma VH de IL-6 uma VL de IL-6 um Fc de IL-6; uma VEGF-trap, em que a VEGF-trap é fundida a IL-6 de uma das seguintes maneiras:
1. em uma extremidade N-terminal de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6; ou
2. entre uma região de dobradiça e após um domínio CH1 de uma cadeia pesada compreendendo VH de IL-6.
57. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que se o conjugado compreende uma VEGF-trap, ele compreende um domínio 2 de VEGFR1 e, em seguida, um domínio 3 de VEGFR2, nessa ordem.
58. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação na posição 94 na sequência de VEGF- trap.
59. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação na posição 95 na sequência de VEGF- trap.
60. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende mutações de T94I e/ou H95I na sequência de VEGF- trap.
61. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 caracterizado pelo fato de que o inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 compreende uma fusão de anticorpo trap de um anticorpo anti- IL 6 e uma anti-VEGF-trap (VEGFR1/2), em que o inibidor duplo inclui pelo menos uma mutação pontual dentro de uma sequência de VEGFR para reduzir a clivagem da proteína VEGFR.
62. Inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que um peso molecular do inibidor duplo de VEGFR-anti-IL-6 é 1,0 MDa.
63. Inibidor duplo VEGR-Anti-IL-6, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6 fornece terapia para doenças inflamatórias da retina.
64. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que compreende um peso constante, uma ligação de antígeno de fragmento pesado constante, leve constante, um fragmento cristalizável (Fc), um receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), uma região leve variável e uma região pesada variável.
65. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que as sequências da região variável da cadeia pesada Anti-IL-6 são selecionadas das opções SEQ ID NO: 7-13, 89, 90 e/ou 256-
262.
66. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 65, caracterizado pelo fato de que as sequências de VEGF-trap são selecionadas de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 145, 15, 16 ou 17.
67. Inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 66, caracterizado pelo fato de que a sequência ligante é SEQ ID NO: 18.
68. Inibidor duplo de VEGR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 67, caracterizado pelo fato de que a sequência da cadeia pesada para moléculas de Anti-IL-6 é selecionada de pelo menos uma das SEQ ID NOs 19- 27 ou inclui pelo menos a sequência em uma das SEQ ID NOs: 89, 90, 256-262.
69. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 68, caracterizado pelo fato de que a sequência da cadeia leve para moléculas de Anti-IL-6 compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs da cadeia leve de pelo menos uma das SEQ ID NOs 76-84.
70. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 69, caracterizado pelo fato de que a sequência da cadeia pesada para a molécula de Anti-IL-6 compreende pelo menos 1, 2 ou 3 CDRs da cadeia pesada de pelo menos um de SEQ ID NOs 49 a 75.
71. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 70, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de VEGFR-Fc de pelo menos uma das SEQ ID NOs 85-88.
72. Inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 71, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais das sequências em qualquer uma ou mais das SEQ ID Nos 7-13, 145, 15-17, 18-84.
73. Inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que compreende: uma VH de IL-6; uma VL de IL-6; um Fc de IL-6; uma VEGF-trap; e um ligante.
74. Inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a VH de IL- 6 compreende uma sequência de uma sequência VH de IL6 em qualquer uma das SEQ ID NOs 19-27, 31 a 39, 89, 90 ou 256-
262.
75. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que a VL de IL-6 compreende uma sequência de uma sequência de VL de IL-6 conforme definida em qualquer uma das SEQ ID Nos 28- 30 ou 91 a 93.
76. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 75, caracterizado pelo fato de que o Fc compreende uma sequência de uma sequência de Fc em qualquer uma das SEQ ID NOs 40-48.
77. Inibidor duplo de VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 76, caracterizado pelo fato de que a VEGF-trap compreende uma sequência conforme definida em uma sequência de VEGF-trap em qualquer uma das SEQ ID NOs: 145, 15, 16 ou 17.
78. Construto de proteína caracterizada pelo fato de que compreende: pelo menos 3 CDRs da cadeia pesada; pelo menos 3 CDRs da cadeia leve; uma sequência de VEGF-trap; e uma sequência ligante, em que cada uma das sequências é selecionada de uma sequência correspondente nas FIGs. 18-
25.
79. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende: uma VH de IL-6; uma VL de IL-6; um Fc de IL-6; e uma VEGF-trap, em que a proteína de fusão altera a proliferação de HUVEC.
80. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que alterar a proliferação de
HUVEC está inibindo a proliferação mediada por VEGF/IL6.
80. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 263 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 117, em que a proteína de fusão é adicionalmente conjugada a um polímero.
81. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 263 e pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 117.
82. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 80 ou 81, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende pelo menos a) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 e 201, ou b) substituições de 1, 2 ou 3 aminoácidos dentro SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 e/ou 201, em que a substituição é uma substituição conservativa.
83. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
84. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, 56-60 ou 79-81, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
85. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 38, caracterizado pelo fato de que o conjunto compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
86. Inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 77, caracterizado pelo fato de que o inibidor duplo VEGFR-Anti-IL-6 compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
87. Proteína, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende a) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e 170 ou b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 169 e pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 170.
BR112020017872-1A 2018-03-02 2019-03-01 Anticorpos de il-6 e construtos de fusão e conjugados dos mesmos BR112020017872A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862637575P 2018-03-02 2018-03-02
US62/637,575 2018-03-02
US201862727950P 2018-09-06 2018-09-06
US62/727,950 2018-09-06
PCT/US2019/020418 WO2019169341A1 (en) 2018-03-02 2019-03-01 Il-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020017872A2 true BR112020017872A2 (pt) 2020-12-22

Family

ID=67767365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020017872-1A BR112020017872A2 (pt) 2018-03-02 2019-03-01 Anticorpos de il-6 e construtos de fusão e conjugados dos mesmos

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20190270806A1 (pt)
EP (1) EP3758737A4 (pt)
JP (2) JP2021514656A (pt)
KR (1) KR20200140817A (pt)
CN (1) CN112203679A (pt)
AU (1) AU2019227997A1 (pt)
BR (1) BR112020017872A2 (pt)
CA (1) CA3092588A1 (pt)
IL (1) IL276978A (pt)
MX (1) MX2020009152A (pt)
SG (1) SG11202008242XA (pt)
WO (1) WO2019169341A1 (pt)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011075185A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Oligasis Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
EP3041513B1 (en) 2013-09-08 2020-08-05 Kodiak Sciences Inc. Factor viii zwitterionic polymer conjugates
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
WO2016061562A2 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Kodiak Sciences Inc. Butyrylcholinesterase zwitterionic polymer conjugates
US11066465B2 (en) 2015-12-30 2021-07-20 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
CA3059938A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 Kodiak Sciences Inc. Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
EP4146168A1 (en) * 2020-05-08 2023-03-15 Kodiak Sciences Inc. Use of il-6 antibodies and vegf traps, and fusion constructs and conjugates thereof
CN113350563B (zh) * 2021-03-01 2022-09-06 清华大学 一种组织粘合剂及其制备方法和应用
WO2023154822A2 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 Kodiak Sciences Inc. Methods of purifying a product

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7396664B2 (en) * 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
US20050100550A1 (en) * 2003-11-10 2005-05-12 Mohit Trikha Anti-angiogenic uses of IL-6 antagonists
PA8672101A1 (es) * 2005-04-29 2006-12-07 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, métodos y usos
WO2009120922A2 (en) * 2008-03-27 2009-10-01 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
RU2532826C2 (ru) * 2008-11-13 2014-11-10 Фемта Фармасьютикалз, Инк. Гуманизированные антитела против il-6
EP2643016A2 (en) * 2010-11-23 2013-10-02 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-il-6 antibodies for the treatment of anemia
WO2012162561A2 (en) * 2011-05-24 2012-11-29 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
PT2726510T (pt) * 2011-05-27 2023-05-03 Hoffmann La Roche Direcionamento duplo
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
SI2780022T1 (sl) * 2011-11-14 2019-09-30 Astellas Institute For Regenerative Medicine Farmacevtski preparati humanih rpe celic in njihova uporaba
JP6469012B2 (ja) * 2012-10-22 2019-02-13 ファウンテン バイオファーマ インコーポレーテッドＦｏｕｎｔａｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ． インターロイキン−６に対する抗体およびその使用
AU2013342163B2 (en) * 2012-11-08 2018-08-16 F. Hoffmann-La Roche Ltd IL-6 antagonists and uses thereof
CA2926853C (en) * 2013-10-18 2022-04-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of a vegf antagonist and an anti-ctla-4 antibody
US9416197B2 (en) * 2013-11-01 2016-08-16 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that neutralize both TNF-α and IL-6: novel therapeutic agent for autoimmune disease
WO2015109898A1 (zh) * 2014-01-24 2015-07-30 上海恒瑞医药有限公司 VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途
US9840553B2 (en) * 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
AU2015279560B2 (en) * 2014-06-28 2020-09-17 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
US11066465B2 (en) * 2015-12-30 2021-07-20 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3758737A4 (en) 2022-10-12
EP3758737A1 (en) 2021-01-06
JP2021514656A (ja) 2021-06-17
JP2024023401A (ja) 2024-02-21
CN112203679A (zh) 2021-01-08
MX2020009152A (es) 2020-11-09
IL276978A (en) 2020-10-29
KR20200140817A (ko) 2020-12-16
WO2019169341A1 (en) 2019-09-06
SG11202008242XA (en) 2020-09-29
CA3092588A1 (en) 2019-09-06
US20190270806A1 (en) 2019-09-05
AU2019227997A1 (en) 2020-09-24
RU2020128737A (ru) 2022-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020017872A2 (pt) Anticorpos de il-6 e construtos de fusão e conjugados dos mesmos
US20230382983A1 (en) Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof
US20210324063A1 (en) Antibodies and conjugates thereof
US9840553B2 (en) Dual PDGF/VEGF antagonists
JP2021091700A (ja) デュアルｖｅｇｆ／ｐｄｇｆアンタゴニスト
BRPI0809042A2 (pt) Proteínas de ligação, anticorpos, fragmentos de anticorpos, moléculas de ácido nucléico e de dna, vetor, célula hospedeira, composições, métodos e usos dos mesmos
US11912784B2 (en) Methods of treating an eye disorder
EP4146168A1 (en) Use of il-6 antibodies and vegf traps, and fusion constructs and conjugates thereof
RU2810777C2 (ru) Антитела к il-6 и их слитые конструкции и конъюгаты
EP4323399A1 (en) Methods of treating an eye disorder
PERLROTH et al. Patent 2953698 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]