KR20200140817A - Il-6 항체 그리고 이의 융합 작제물 및 접합체 - Google Patents

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KR20200140817A
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레이첼 디. 제이콥슨
페르난도 코레아
홍 리앙
디. 빅터 펄로스
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코디악 사이언시스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 IL-6에 결합하는 길항 항체, VEGF Trap과의 이의 융합 단백질, 및 이의 접합체, 및 이들의 사용 방법을 제공한다. 항-IL-6 항체는 단독으로 또는 질환에 대한 다른 치료제와 병용하여 치료적으로 사용될 수 있다.

Description

IL-6 항체 그리고 이의 융합 작제물 및 접합체
임의의 우선 출원에 대한 참조에 의한 원용
외국 또는 국내 우선권 주장이 본 출원과 함께 제출된 출원 데이터 시트에서 확인되는 임의의 그리고 모든 출원은 37 CFR §1.57 하에 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
서열목록
본 출원은 전자 형식의 서열목록과 함께 출원 중이다. 서열목록은 2019년 3월 1일자로 생성되고, 용량이 395,430바이트인 파일명 KDIAK044.txt로서 제공한다. 전자 형식의 서열목록의 정보는 본 명세서에 전체가 참조에 의해 포함된다.
생물학적 샘플 기탁 언급
일부 실시형태에서, 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라, _____에 번호 ____로 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC)에 기탁된 항-IL-6 항체, 이의 융합(fusion) 및 접합체(conjugate)가 제공된다.
이들 기탁물은 특허절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and the Regulations thereunder)(부다페스트 조약)의 제공 하에 제조된다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC에 의해 이용 가능하게 되며, 출원인과 ATCC간의 동의를 조건으로, 관련 있는 미국 특허의 발행 시 또는 임의의 미국 또는 외국 출원의 공중에 대한 개방 시, 어느 쪽이든 먼저 일어날 때, 공중에 대한 기탁물의 영구하고 제한 없는 이용 가능성을 보장하며, 35 U.S.C. § 122 및 이에 따른 특허 시행령(37 C.F.R. § 1.14)에 따라 미국 특허 및 상표청장이 권한을 부여한 것으로 결정된 곳에 대한 기탁물의 이용 가능성을 보장한다. 기탁된 생물학적 물질의 이용 가능성이 특허법에 따라 임의의 정부의 권한 하에 부여된 권리의 위반 시 본 발명의 실행에 대한 라이센스로서 해석되어서는 안 된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 IL-6 및/또는 VEGF에 결합하는 융합 작제물에 관한 것이다.
혈관내피 성장인자 A(VEGF-A)는 신생혈관유발 작용(pro-angiogenic function), 예컨대, 내피세포 생존, 증식, 이동 및 세포-세포 투과성을 매개하는 신호 단백질이다. 이의 활성은 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 당뇨 황반 부종(DME)에서 망막질환, 예컨대, 맥락막신생혈관형성(CNV)의 진행을 촉진시키는 것으로 나타났다. VEGF-A 신호전달의 저해는 신혈관 망막질환의 진행을 중단시키는 효과적인 수단인 것이 증명되었다(Ferrara et al, Retina, 2006). VEGF 작용을 저해하는 다양한 치료 분자가 개발되었다. 이 중에서, 항-VEGF 단클론성 항체, 예컨대, 라니비주맙 및 베바시주맙은 병리학적 혈관신생에 대해 안전하고 유효한 치료가 되는 것으로 나타났다. 더 최근에, VEGF "트랩(trap, Trap)"으로서 작용하는 재조합적으로 생성한 VEGFR 융합 단백질, 예컨대, 아플리버셉트(Aflibercept)(Eylea) 및 컨버셉트(Conbercept)(중국)는 더 효과적이며 이들의 항체 경쟁자보다 더 오래 지속되는 것으로 증명되고 있다.
염증은 망막질환 병리의 원인인 것으로 나타났고, 항-염증 요법, 예컨대, 스테로이드는 포도막염 및 당뇨 황반 부종(DME)을 치료하는 데 효과적이었다. 눈의 염증 및 감염을 살펴보는 상세한 연구는 전염증 사이토카인, 인터류킨-6(IL-6)이 난치성/만성 포도막염 환자의 안구액에서 유의하게 상승되며, 동물 모델에서 IL-6의 저해는 포도막염의 개시를 저해하는 것으로 나타났다. IL-6의 높은 안구액 수준은 DME 및 망막 정맥 폐쇄를 갖는 환자에서도 발견된다. 추가적으로, 만성 염증 세포는 신혈관 AMD를 갖는 눈의 부르크막(Bruch's membrane) 표면 상에서 보였으며, AMD가 있는 환자는 IL-6의 증가된 혈청 수준을 갖는 것으로 보고되었다. 흥미롭게도, IL-6은 또한 결함 혈관신생을 자극하는 것으로 관찰되었다. 류마티스 관절염과 같은 자가면역 장애에 추가로, 항-IL-6 치료는 포도막염 및 포도막염 황반부종을 효과적으로 치료하는 것으로 나타났다.
일부 양상에서, 중합체에 접합된 IL-6에 특이적으로 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다.
일부 양상에서, 단리된 길항 항체가 제공된다. 항체는 표 1A에서 중쇄를 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역; 및 표 1B에서 경쇄를 포함하는 경쇄 아미노산 가변 영역을 포함한다.
일부 양상에서, 단리된 길항 항체가 제공된다. 상기 항체는 표 1A의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 표 1B의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 양상에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 항체는 EU 넘버링에 기반한 다음의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다: L234A, L235A 및 G237A.
일부 양상에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 항체는 표 1A의 CDRH1인 CDRH1; 표 1A CDRH2인 CDRH2; 표 1A의 CDRH3인 CDRH3: 표 1B의 CDRL1인 CDRL1; 표 1B의 CDRL2인 CDRL2; 표 1B의 CDRL3인 CDRL3; 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A; 및 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): Q347C 또는 L443C를 포함한다.
일부 양상에서, 단리된 길항 항체; 및 VEGF 결합 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
일부 양상에서, 본 명세서의 임의의 단리된 길항 항체 및 중합체를 포함하는 접합체가 제공된다. 중합체는 항체에 공유적으로 부착된다.
일부 양상에서, 접합체가 제공된다. 접합체는 본 명세서에 제공된 융합 단백질 및 중합체를 포함하되, 중합체는 융합 단백질에 공유적으로 부착된다.
일부 양상에서, 단리된 길항 항체 또는 융합 단백질을 생성하는 단리된 세포주가 제공된다.
일부 양상에서, 단리된 길항 항체 또는 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다.
일부 양상에서, 재조합 발현 벡터가 제공된다. 벡터는 본 명세서에 제공된 임의의 이들 작제물을 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일부 양상에서, IL-6 길항 항체 또는 이의 융합 단백질의 생성 방법이 제공된다. 상기 방법은 항체가 생성되는 조건 하에 단리된 길항 항체 또는 융합 단백질을 재조합적으로 생성하는 세포주를 배양시키는 단계; 및 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물이 제공된다. 이는 본 명세서에 제공된 바와 같은 단리된 길항 항체 또는 융합 단백질 및/또는 접합체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일부 양상에서, 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에서 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 본 명세서에 제공된 바와 같은 단리된 길항 항체 또는 융합 단백질 및/또는 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에서 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 과활성 IL-6 및/또는 VEGF 활성을 갖는 환자를 확인하는 단계; 및 본 명세서에 제공된 바와 같은 단리된 길항 항체 또는 융합 단백질 및/또는 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, IL-6 VH, IL-6 VL, IL-6 Fc 및 VEGF Trap을 포함하는 융합 단백질이 제공되되, VEGF Trap은, 다음의 방식 중 하나로: 1) IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 N-말단 단부에; 또는 2) 힌지 영역과 IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 CH1 도메인 다음 사이에서, IL-6에 융합된다.
일부 양상에서, 서열번호 7 내지 13, 19 내지 27, 89, 90, 256 내지 262 중 적어도 하나의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역; 및 서열번호 91 내지 93, 28 내지 30 중 적어도 하나의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역을 포함하는 단리된 길항 IL-6 항체가 제공된다.
일부 양상에서, 서열번호 256에 열거된 CDR로부터의 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역: VH (CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 91 내지 93에 열거된 CDR의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 길항 IL-6 항체가 제공된다.
일부 양상에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 항체는 EU 넘버링에 기반한 다음의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다: L234A, L235A 및 G237A.
일부 실시형태에서,IL-6에 결합하며, 서열번호 172에서 CDRH1인 CDRH1; 서열번호 173에서 CDRH2인 CDRH2; 서열번호 174에서 CDRH3인 CDRH3: 서열번호 199에서 CDRL1인 CDRL1; 서열번호 200에서 CDRL2인 CDRL2; 서열번호 201에서 CDRL3인 CDRL3; 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A; 및 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): Q347C 또는 L443C를 포함하는 단리된 길항 항체가 제공된다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 임의의 하나(이의 단편을 포함)의 단리된 길항 항체 및 VEGF Trap을 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 임의의 단리된 길항 항체(단편을 포함); 및 중합체를 포함하는 접합체가 제공되되, 중합체는 항체에 공유적으로 부착된다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 융합 단백질; 및 중합체를 포함하는 접합체가 제공되되, 중합체는 융합 단백질에 공유적으로 부착된다.
일부 양상에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제가 제공된다. VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 항-IL 6 항체 및 항-VEGF 트랩(VEGFR1/2)의 트랩 항체 융합을 포함하되, 이중 저해제는 VEGFR 단백질의 절단을 감소시키기 위해 VEGFR 서열 내에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다.
일부 양상에서, 단백질 작제물은 적어도 3개의 중쇄 CDR; 적어도 3개의 경쇄 CDR; VEGF 트랩 서열; 및 링커 서열을 포함하되, 각각의 서열은 도 18 내지 도 25에서 대응하는 서열로부터 또는 본 명세서의 표로부터의 대응하는 서열(예를 들어, 0.1A, 0.1B, 1A, 1B, 0.2A 및 0.2B)로부터 선택된다.
일부 양상에서, IL-6 VH; IL-6 VL; IL-6 Fc; 및 VEGF Trap을 포함하는 융합 단백질이 제공되되, 융합 단백질은 HUVEC 증식을 변경시킨다. 일부 실시형태에서, HUVEC 증식을 변경시키는 것은 VEGF/IL6 매개 증식의 저해이다.
일부 양상에서, 서열번호 263에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 117에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 융합 단백질이 제공되되, 융합 단백질은 중합체에 추가로 접합된다.
일부 양상에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 항체는 EU 넘버링에 기반한 다음의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다: L234A, L235A 및 G237A.
일부 양상에서,IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공되며, 상기 항체는 서열번호 172에서 CDRH1인 CDRH1; 서열번호 173에서 CDRH2인 CDRH2; 서열번호 174에서 CDRH3인 CDRH3: 서열번호 199에서 CDRL1인 CDRL1; 서열번호 200에서 CDRL2인 CDRL2; 서열번호 201에서 CDRL3인 CDRL3; 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A; 및 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): Q347C 또는 L443C를 포함한다.
일부 양상에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 서열번호 7 내지 13, 89, 90 및/또는 256 내지 262로부터 선택된 항-IL-6 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 양상에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 서열번호 145, 15, 16 또는 17 중 적어도 하나로부터 선택된 VEGF 트랩 서열을 가진다.
일부 양상에서, 링커 서열은 서열번호 18이다.
일부 양상에서, 서열번호 19 내지 27 중 적어도 하나로부터 선택되거나 서열번호 89, 90, 256 내지 262의 서열 중 적어도 하나를 포함하는 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열이 제공된다.
일부 양상에서, 서열번호 76 내지 84 중 적어도 하나로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 항-IL-6 분자에 대한 경쇄 서열이 제공된다.
일부 양상에서, 서열번호 49 내지 75 중 적어도 하나로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열이 제공된다.
일부 양상에서, 서열번호 85 내지 88 중 적어도 하나로부터의 VEGFR-Fc 서열을 포함하는 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제가 제공된다.
일부 양상에서, 서열번호 7 내지 13, 145, 15 내지 17, 18 내지 84 중 임의의 하나 이상에서 서열 중 하나 이상을 포함하는 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제가 제공된다.
양상 실시형태에서, IL-6 VH; IL-6 VL; IL-6 Fc; VEGF Trap; 및 링커를 포함하는 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제가 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-6 VH는 서열번호 19 내지 27, 31 내지 39, 89, 90 또는 256 내지 262 중 임의의 하나에서 IL6 VH 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-6 VL은 서열번호 28 내지 30 또는 91 내지 93 중 임의의 하나에서 IL6 VL 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc는 서열번호 40 내지 48 중 임의의 하나에서 Fc 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF Trap은 서열번호 145, 15, 16 또는 17 중 임의의 하나에서 VEGF 트랩 서열로부터의 서열을 포함한다.
일부 양상에서, IL-6 VH; IL-6 VL; IL-6 Fc; 및 VEGF Trap을 포함하는 융합 단백질이 제공되되, 융합 단백질은 HUVEC 증식을 변경시킨다. 일부 실시형태에서, HUVEC 증식을 변경시키는 것은 VEGF/IL6 매개 증식의 저해이다.
일부 양상에서, 서열번호 263에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 117에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 융합 단백질은 중합체에 추가로 접합된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 263에 대해 적어도 95% 동일하고 서열번호 117에 대해 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 단백질은 적어도 a) 서열번호 172, 173, 174, 199, 200, 및 201, 또는 b) 서열번호 172, 173, 174, 199, 200 및/또는 201 내의 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환을 포함하되, 상기 치환은 보존적 치환이다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 임의의 하나의 항체는 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 임의의 하나의 융합 단백질은 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 임의의 하나의 접합체는 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 임의의 하나의 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 임의의 하나의 단백질은 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
도 1은 IL-6의 서열을 도시한 도면.
도 2a는 화합물 L을 나타내는 도면.
도 2b는 화합물 K를 나타내는 도면.
도 2c는 R3707로부터의 OG1802의 합성을 나타내는 도면.
도 2d는 OG1786을 나타내는 도면.
도 2e는 OG1550으로부터의 OG1546의 합성을 나타내는 도면.
도 2f는 OG1546 및 OG1563으로부터의 OG1784의 합성을 나타내는 도면.
도 2g는 OG1784로부터의 OG1405의 합성을 나타내는 도면.
도 2h는 OG1405로부터의 OG 1785의 합성을 나타내는 도면.
도 2i는 OG1785로부터의 OG1786의 합성을 나타내는 도면.
도 2j는 OG1801을 나타내는 도면.
도 2k는 OG1802를 나타내는 도면.
도 2l은 화합물 E를 나타내는 도면.
도 3은 항체 선택 및 최적화에 대한 흐름도를 도시한 도면.
도 4는 항-IL-6 mAb가 IL-6에는 결합하지만, IL-6/IL-6R 복합체에는 결합하지 않는다는 것과, IL-6/IL-6R 복합체 형성이 항-IL-6 mAb에 의해 저해된다는 것을 나타내는 ELISA 데이터를 도시한 도면.
도 5는 IL-6-Ab의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부 실시형태를 도시한 도면. CDR의 실시형태를 박스 영역에 나타낸다. 이들 서열은 또한 IL-6 Ab-VEGF Trap 융합 작제물에서 사용될 수 있다.
도 6은 IL-6-VEGF Trap 융합 단백질의 일부 실시형태를 도시한다. VEGF Trap 도메인은 가변 도메인 바로 앞의 N-말단에 위치되거나(좌측) 또는 항체의 Fab 영역과 힌지 영역 사이에 위치된다(우측).
도 7은 이중 저해제 분자 VEGFR-항IL-6 및 항IL-6-VEGFR이 VEGF-A에 대해 항-VEGF 항체 OG1950 및 Eylea와 유사한 친화도로 결합한다는 것을 보여주는 센소그램(sensorgram) 및 표를 도시한 도면. 따라서, VEGF 트랩의 위치는 이의 표적에 대한 친화도를 변경시키지 않는다.
도 8은 이중 저해제에 대한 독립적 또는 조합된 VEGF-A 및 IL-6 결합의 센소그램을 도시한 도면. 혼합된 표적의 IL-6 센소그램은 이론적 곡선(개개 IL-6과 VEGF-A 센소그램의 합)과 비교되었다. 결과는 이론적 및 실험적 곡선이 겹쳐진다는 것을 나타내는데, 이는 표적이 둘 다 서로의 결합에 영향을 미치는 일 없이 이중 저해제 분자에 결합할 수 있다는 것을 정성적으로 나타낸다.
도 9는 OD450㎚에서 다양한 ELISA IL-6 분석으로부터의 결과를 도시한다. 브리징(bridging) ELISA(상부)에서, 이중 저해제는 둘 다 btVEGF 내지 IL-6에 브리징되는데, 입체배치가 둘 다 표적 둘 다에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. EC50 VEGF Trap-항IL-6 = 0.079nM 및 항IL-6-VEGF Trap = 0.026nM. Eylea 및 항-IL-6은 음성 대조군으로서 작용하였다. 도 9는 또한 IL-6/IL-6R 복합체 ELISA(중간)의 결과를 나타낸다. 이중 저해제 및 항IL-6은 IL-6/IL-6R 복합체 형성을 동일한 정도로 저해하였다. IC50 값: 항-IL-6 = 0.36nM, VEGF Trap-항IL-6 = 0.47nM, 및 항IL-6-VEGF Trap = 0.32nM. Eylea는 음성 대조군으로서 작용하였다. 도 9는 또한 VEGF/VEGFR 경쟁적 ELISA 결과를 나타낸다(하부). 이중 저해제, Eylea 및 OG1950은 VEGFR에 대한 VEGF 결합을 다양한 정도로 저해하였다. Eylea 및 항IL-6-VEGF Trap 작제물은 비슷하지만(4.24nM 대 4.53nM), VEGF Trap-항IL-6 작제물은 대략 2배 더 양호하였고(1.74nM), OG1950은 다른 저해제보다 더 우수한 최대 저해를 나타내었다(1.55nM).
도 10은 항체 접합체(Ab-Trap 또는 Trap-Ab 접합체에 대해서도 적용될 수 있음)의 제조 방법의 일부 실시형태를 도시한 도면. 항체로서 도시하였지만, 당업자는 본 문맥에서, 도 10의 Ab 도시가 트랩 융합과 교환될 수 있다는 것을 인식할 것이다(도 6에 나타낸 바와 같음). 간명함을 위해, 본 명세서에 도시된 일반적 항체는 항체로서의 옵션과 융합 트랩 내용에서 융합 배열로서의 옵션을(물론, 이미 융합으로서 도시되지 않았다면) 둘 다 나타낸다.
도 11a 내지 도 11b는 씨블루(등록상표)플러스2(SeeBlue®Plus2) 표준, 항-IL-6, 항-IL-6-VEGFR 및 VEGFR-항-IL-6의 SDS-PAGE 밴드를 도시한다. 도 11c는 포스포릴콜린-기반 중합체와 접합된 항-VEGF(VEGFR1/2) 및 항-IL-6의 융합인 VEGFR-항-IL6의 접합 작제물을 도시한 도면.
도 12는 절단 산물이 동일한 N-말단의 서열(LTHRQT)을 공유한다는 것을 나타내며, 절단 부위가 VEGF 트랩 영역에 위치된다는 것을 나타내는 PVDF 막에 대한 전달 결과인 N-말단의 에드먼(Edman) 서열분석을 도시한 도면.
도 13A 내지 도 13B는 씨블루(등록상표)플러스2 표준 및 19 VEGF 트랩 작제물의 SDS-PAGE 밴드를 도시한 도면.
도 13C 내지 도 13E는 VEGF_트랩_변이체_1, VEGF_트랩_변이체_2 및 VEGF_트랩_변이체_3의 서열목록을 도시한 도면.
도 13F 내지 도 13G는 이중 점 돌연변이 T94I 및 H95I를 갖는 VEGFR_변이체_3을 포함하는, 씨블루(등록상표)플러스 2 표준 및 4 VEGF 트랩 변이체의 SDS-PAGE 밴드를 도시한 도면.
도 14A 내지 도 14F는 비아코어(Biacore) 분석 결과 및 VEGF-A에 대한 친화도 측정을 도시한 도면.
도 15는 세포 기반 VEGF 자극된 VEGFR 리포터 분석을 도시한 도면.
도 16a는 VEGF/IL6 매개 인간 제정맥 내피세포("HUVEC") 세관 형성의 저해 분석을 도시한 도면.
도 16b 내지 도 16c는 상이한 파라미터로 세관 형성 분석의 통계학을 도시한 도면.
도 17은 HUVEC 증식 분석 결과를 도시한 도면.
도 18은 항-IL-6 중쇄 가변 영역 서열의 실시형태를 도시한 도면. CDR을 밑줄 표시한다.
도 19는 VEGF 트랩 서열의 다양한 실시형태를 도시한 도면. 서열 사이의 변하는 부분은 볼드체이며 밑줄 표시한다.
도 20은 링커(GS) 서열 실시형태의 일부 실시형태를 도시한다. 이는 이중 반복부 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 링커(GS)로서 존재할 수 있다.
도 21은 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열의 일부 실시형태를 도시한 도면. CDR을 밑줄 표시한다. 도 21은 주목한 서열 내의 CDR의 다양한 실시형태를 제공하는 도 21A와 도 21B를 둘 다 포함한다.
도 22은 항-IL-6 분자에 대한 경쇄 서열의 일부 실시형태를 도시한 도면. CDR을 밑줄 표시한다. 도 22는 주목한 서열 내의 CDR의 다양한 실시형태를 제공하는 도 22A와 도 22B를 둘 다 포함한다.
도 23은 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열의 일부 실시형태를 도시한 도면. CDR을 밑줄 표시한다. 도 23은 주목한 서열 내의 CDR의 다양한 실시형태를 제공하는 도 23A와 도 23B를 둘 다 포함한다.
도 24A 내지 도 24B는 도 21 내지 도 23의 CDR 조합의 일부 실시형태를 도시한 도면.
도 25는 VEGFR-Fc 서열 변이체의 일부 실시형태를 도시한다. 서열 사이의 변하는 부분은 볼드체이며 밑줄 표시한다.
도 26A 내지 도 26C는 친화도 결합 데이터를 도시한 도면.
도 27은 VEGFR-항IL6-서열의 일부 실시형태의 서열을 도시한 도면. CDR(카바트(Kabat)로 정함)은 밑줄표시된다. 회색 부분은 VEGFR 작제물을 나타낸다. 볼드체 내용은 링커 부분을 나타낸다. 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 L443C(EU 넘버링)를 이중 밑줄표시된다. 각각의 이들 부분은 본 명세서에 제공된 다른 대응하는 부분(예를 들어, 대안의 링커 또는 CDR 등)으로 교환될 수 있다.
도 28은 VEGFR-항IL6 환원(Cys - 캡제거(decapping)) 반응 생성물의 SDS-PAGE를 도시한 도면. 레인은 다음과 같다: 1. VEGFR-항IL6; 2. VEGFR-항IL6 - 완전히 환원(TCEP); 3. 노벡스 샤프 염색전 단백질 표준(Novex sharp pre-stained protein standard); 4. VEGFR-항IL6 + 30x TCEP, 시작점; 5. 30분 후에 VEGFR-항IL6 + 30x TCEP; 6. 60분 후에 VEGFR-항IL6 + 30x TCEP; 7. 완충제 교환 처리된 VEGFR-항IL6 TCEP; 8. VEGFR-항IL6 + 15x dHAA, 시작점; 9. 30분 후 VEGFR-항IL6 + 15x dHAA; 10. 60분 후 VEGFR-항IL6 + 15x dHAA; 11. 캡제거된 VEGFR-항IL6; 12. 캡제거되고, 완전히 환원된 VEGFR-항IL6(TCEP); 겔: NuPAGE 비스-트리스 4 내지 12% 단백질 양: 4 ㎍/레인; 30x TCEP = 30배 몰과량의 TCEP 15x dHAA = 15배 몰과량의 dHAA
도 29는 VEGFR-항IL6-OG1802 접합체 CEX 크로마토그래피의 SDS-PAGE를 도시한 도면. 비-환원 겔: NuPAGE 비스-트리스 4-12%. 완충제 A: 20mM 아세트산나트륨 pH 5.5. 완충제 B: 20mM 아세트산나트륨 pH 5.5, 500mM NaCl. 레인은 다음과 같다: 1. VEGFR-항IL6; 2. VEGFR-항IL6-OG1802 (부하(load)); 3. 노벡스 샤프 염색전 단백질 표준; 4. 통과액(Flow-through); 5. 체이스(Chase); 6. 30% 완충제 B - 분취액 1; 7. 30% 완충제 B - 분취액 2; 8. 30% 완충제 B - 분취액 3; 9. 30% 완충제 B - 분취액; 10. 40% 완충제 B - 분취액 1; 11. 40% 완충제 B - 분취액 2; 12. 40% 완충제 B - 분취액 3; 13. 40% 완충제 B - 분취액 4; 14. 60% 완충제 B - 분취액 1; 15. 60% 완충제 B - 분취액 2; 16. 60% 완충제 B - 분취액 3; 17. 100% 완충제 B - 스트립. 레인 6 내지 13은 단백질 접합 물질을 나타내며, 접합체는 큰 크기 때문에 겔을 침투할 수 없다. 레인 14 내지 17은 응집, 접합 및 비접합 단백질 물질을 가능하게 함유하는 단백질 혼합물을 나타낸다.
도 30은 단백질-중합체 접합 및 비-접합 단백질 물질의 SDS-PAGE를 도시한 도면. 겔 분석은 생체접합체(레인 3)가 VEGFR-항IL6 기준 표준(레인 2)과 비교될 때 57% 중쇄 및96% 경쇄 밴드 강도비를 보여주는데, 이는 VEGFR-항IL6 분자 환원겔당 하나의 OG1802 중합체의 존재가 NuPAGE 비스-트리스(Bis-Tris) 4 내지 12%이고, 환원겔은 NuPAGE 비스-트리스 4 내지 12%라는 것을 나타낸다.
도 31은 VEGFR-항IL6-OG1802의 SEC-MALS를 도시한 도면. VEGFR-항IL6 접합체의 분자량은 통합 크기 배제 크로마토그래피(Shodex-SB806M-HQ) 및 광산란(MALS)으로 결정하였다. 상부 패널. 크로마토그램은 단일 용리 피크의 존재를 나타낸다. 추가적인 피크 및 숄더(shoulder)의 부재는 접합 및 후속적 CEX 분리 단계 후에 응집물이 없으며 분해된 물질이 존재한다는 것을 시사한다. 하부 패널. 선택된 피크의 단백질 접합 분석은 VEGFR-항IL6-OG1802 생체접합체에 대해 983kDa의 경험적으로 측정된 평균 분자량(Mw)을 나타내었다. 이 값은 하나의 VEGFR-항IL6 분자(Mw ~ 189kDa) 및 하나의 OG1802 중합체(Mw ~ 794kDa)의 접합으로부터 초래된다.
도 32는 VEGFR-항IL6 CEX 크로마토그래피의 결과를 도시한 도면. 겔은 노벡스 8 내지 16% 트리스-글리신(환원 조건)이고, M = 씨블루(등록상표)플러스2 표준 레인 D12-F11은 크로마토그램 무손상(intact)(I) 상에 나타낸 바와 같은 상이한 완충제 B 농도로 분치된 샘플에 대응하고, 절단된(C) 중쇄를 나타낸다. 칼럼 포루스(Porus) XS에서 완충제 A는 20mM 인산나트륨 pH 6이고, 완충제 B는 20mM 인산나트륨 pH 6, 1M NaCl이다.
도 33은 VEGFR-항IL6 HIC 크로마토그래피의 결과를 도시한 도면. 겔은 노벡스 8 내지 16% 트리스-글리신/환원 조건, M = 씨블루(등록상표)플러스2 표준이다. L = VEGFR-항IL6 무손상 및 절단 혼합물(부하). 남아있는 레인은 크로마토그램에 나타난 바와 같은 상이한 완충제 B 농도에서 분취된 샘플에 대응한다. 무손상(I) 및 절단된(C) 중쇄가 나타난다. 칼럼 Hi Trap 부틸 HP에서 완충제 A는: 20mM 인산나트륨 pH 6, 1M 황산암모늄이다. 완충제 B는: 20mM 인산나트륨 pH 6이다.
도 34는 VEGF/VEGFR 경쟁적 ELISA의 결과를 도시한 도면.
도 35는 IL6/IL6R 복합체 ELISA의 결과를 도시한 도면.
도 36은 세포 기반 VEGF 자극된 VEGFR 리포터 분석의 결과를 도시한 도면.
도 37은 HUVEC에서 지질다당류 자극된 세관 형성을 도시한 도면.
도 38은 HUVEC에서 지질다당류 자극된 세관 형성을 도시한 도면.
도 39는 HUVEC에서 지질다당류 자극된 세관 형성을 도시한 도면.
도 40a는 HUVEC의 VEGF/IL6 매개 증식의 저해를 도시한 도면.
도 40b는 웰당 세포수가 증가됨에 따른 HUVEC 증식의 저해를 도시한 도면.
신생혈관 망막 병리학의 발병을 유도하는 동시 염증 및 결함 혈관신생을 직접적으로 감소시키기 위해, 전염증 사이토카인 IL-6 및 신생혈관유발 신호 단백질 VEGF의 기능을 동시에 차단하는 설계 분자가 본 명세서에 제시된다. 이들 분자는 (1) 항-IL-6 단클론성 항체를 포함하는데, 이는 (2) VEGF 수용체(VEGFR)의 2개의 VEGF 결합 도메인에 융합되어 있다. 항-IL-6 모이어티는 IL-6에 특이적으로 결합하고, 이의 IL-6 수용체(IL-6R)과의 상호작용을 저해한다. VEGF Trap 모이어티는 VEGF 트랩으로서 작용하여, VEGF가 VEGF 수용체에 결합하는 것을 방지하는 2개의 VEGF 결합 도메인(VEGFR1 도메인 2, VEGFR2 도메인 3)의 융합을 포함한다. 추가적으로, 일부 실시형태에서, 각각의 이들 이중 저해제 분자는 반감기 연장 포스포릴콜린 기반 생체중합체와 접합될 수 있는 이의 C-말단에서 짝지어지지 않은 시스테인을 시스테인을 구비한다.
본 명세서에 제공된 다양한 실시형태는, 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내의 분자 생물학(재조합 기법을 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]과 같은 문헌에서 완전하게 설명된다.
다음의 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해된다: 용어 "단리된 분자"는 (1) 천연 상태에서 수반하는 자연적으로 연관된 성분과 연관되지 않거나, (2) 동일한 공급원, 예를 들어, 종으로부터의 다른 분자, 이로부터 발현된 세포, 라이브러리 등이 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 천연에서 발생되지 않는, 유래된 기원 또는 공급원에 의한 분자(여기서, 분자는, 예를 들어, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체임)를 지칭함. 따라서, 자연적으로 유래된 시스템과 상이한 세포 시스템에서 화학적으로 합성되거나 발현된 분자는 이의 자연적으로 연관된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 당업계에 잘 공지된 정제 기법을 이용하여 단리에 의해 자연적으로 연관된 성분이 실질적으로 없는 분자가 또한 제공될 수 있다. 분자 순도 또는 동질성은 당업계에 잘 공지된 다수의 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 샘플의 순도는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 및 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하여 폴리펩타이드를 시각화하기 위한 겔의 염색을 이용하여 분석될 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 당업계에 잘 공지된 다른 수단을 이용함으로써 보다 높은 분해능이 제공될 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어"IL-6" 또는 "IL6"은 인간 IL-6을 지칭한다. 일부 실시형태에서, IL-6의 다른 형태가 상정되며, 다른 유기체, 예를 들어, 개, 고양이, 말 및 소에 대한 구체적 언급에 의해 표기될 것이다. 하나의 예시적인 인간 IL-6은 유니프롯(UniProt) 수탁 번호 P05231로서 발견된다.
항-IL-6 항체 또는 본 명세서에 기재된 다른 생물물질은 전형적으로 단리된 형태로 제공된다. 이는 항체가 전형적으로 적어도 50% w/w 순수한 간섭 단백질 및 이의 생산 또는 정제로부터 생기는 다른 오염물질이지만, 항체가 이의 사용을 용이하게 하는 것으로 의도되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합될 확률을 제외하지 않는다는 것을 의미한다. 때때로 항체는 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% w/w 순수한 간섭 단백질 및 생성 또는 정제로부터의 오염물질이다. 종종 항체(또는 항체 접합체)는 이의 정제 후에 남아있는 우세한 거대분자 종이다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치된 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 무손상 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라, 달리 구체화되지 않는 한, 특이적 결합을 위해 무손상 항체와 경쟁하는 이의 임의의 항원 결합 부분, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체배치를 포함한다. 항원 결합 부분은, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 도메인 항체(dAb, 예를 들어, 상어 및 낙타 항체), 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편, 단일쇄 가변 단편 항체(scFv), 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 다이어바디(diabody), 트라이어바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩타이드에 대한 특정 항원 결합을 부여하는 데 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대, IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하위부류)을 포함하고, 항체는 임의의 특정 부류를 가질 필요가 없다. 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류로 부여될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 입체배치는 잘 공지되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합하여 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어지고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 대상 가변 영역의 변이체가 요망된다면, 특히 CDR 영역 밖의 (즉, 프레임워크 영역 내의) 아미노산 잔기의 치환, 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 대상 가변 영역을 해당 대상 가변 영역과 동일한 정규(canonical) 부류에서 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역과 비교함으로써 확인될 수 있다(Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987).
특정 실시형태에서, CDR의 확정적 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체 구조를 해결하고/내거나 항체-리간드 복합체 구조를 해결함으로써 달성된다. 특정 실시형태에서, 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기법, 예컨대, X-선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시형태에서, CDR 영역을 확인하거나 어림잡기 위해 다양한 분석 방법이 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, CDR 영역을 확인하거나 어림잡기 위해 다양한 분석 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트 정의, 코티아(Chothia) 정의, IMGT 접근(Lefranc et al., 2003) Dev Comp Immunol. 27:55-77), 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 파라톰(Paratome)(Kunik et al., 2012, Nucl Acids Res. W521-4), AbM 정의 및 입체형태 정의를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
카바트 정의는 항체 내 잔기를 넘버링하기 위한 표준이며, 전형적으로 CDR 영역을 확인하는데 사용된다. 예를 들어, 문헌[Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8] 참조. 코티아 정의는 카바트 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정 구조적 루프 영역 위치를 고려한다. 예를 들어, 문헌[Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83] 참조. AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 옥스포드 몰레큘러 그룹(Oxford Molecular Group)에 의해 생성되는 컴퓨터 프로그램의 통합 세트를 사용한다. 예를 들어, 문헌[Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; "AbM™A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd] 참조. AbM 정의는 지식 데이터베이스와 애초의 방법, 예컨대, 문헌[Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198]에 의해 기재된 것의 조합을 이용하여 1차 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델링한다. 컨택트 정의는 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반한다. 예를 들어, 문헌[MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45] 참조. 다른 접근에서, 본 명세서에서 CDR의 "입체형태 정의"로서 지칭되며, CDR의 위치는 항원 결합에 대한 엔탈피 기여를 만드는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166] 참조. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근 중 하나에 엄격하게 따르지 않을 수도 있지만, 그럼에도 불구하고 적어도 일부의 카바트 CDR과 중복될 것이고, 그렇더라도 특정 잔기 또는 잔기의 그룹이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, CDR은 접근의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 접근에 의해 정해진 CDR을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용된 방법은 임의의 이들 접근에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 하나 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시형태에 대해, CDR은 임의의 카바트, 코티아, 연장(extended), IMGT, 파라톰(Paratome), AbM 및/또는 입체형태 정의, 또는 임의의 앞서 언급한 것의 조합에 따라 정의될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독으로 또는 조합하여 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "단클론성 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위로 향하게 된다. 더 나아가, 상이한 결정소(에피토프)로 향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정소로 향한다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는 문헌[Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 생성될 수 있거나, 또는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다. 단클론성 항체는, 예를 들어, 문헌[McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기재된 기법을 이용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이며, 이때 수용자의 CDR로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 수용자 항체에서도 또는 이입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않았지만, 항체 성능을 추가로 개선시키거나 최적화하기 위해 포함된 잔기를 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 대응하고/하거나 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기법을 이용하여 생성된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이런 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특이적으로 제외한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대, 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "에피토프"는 항체의 항원-결합 영역 중 하나 이상에서 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄의 표면 그룹화로 이루어지며, 특정 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 가진다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형 또는 입체형태일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예컨대, 항체) 사이의 상호작용 지점은 모두 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라서 선형으로 발생된다. "비선형 에피토프" 또는 "입체형태 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체에 결합하는 항원성 단백질 내에서 비인접 폴리펩타이드(또는 아미노산)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항원성 에피토프"는 항체가 당업계에 잘 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 통상적인 면역분석에 의해 결정된 바와 같이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 일부로서 정의된다. 일단 항원 상에서 목적하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 기법을 이용하여 해당 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 발견 과정 동안에, 항체의 생성 및 특성규명은 바람직한 에피토프에 관한 정보를 설명할 수 있다. 이어서, 이 정보로부터, 항체가 동일한 에피토프에 결합하는 것을 경쟁적으로 선별할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근은 IL-6에 대한 결합에 대해 경쟁하거나 서로 교차 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이며, 예를 들어, 항체는 항원에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
항체에 관해서 본 명세서에서 사용되는 용어 "경쟁하다"는, 동족 에피토프를 갖는 제1 항체의 결합 결과가 제2 항체의 부재 하에 제1 항체의 결합에 비해 제2 항체의 존재 하에 검출 가능하게 감소되도록 제1 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다. 제2 항체의 에피토프에 대한 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출 가능하게 감소된 대안이 있을 수 있지만, 그런 경우가 필요하지는 않다. 즉, 제1 항체는 제1 항체의 이의 각각의 에피토프에 대한 결합을 저해하는 제2 항체 없이 제2 항체가 에피토프에 결합하는 것을 저해할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출 가능하게 저해하는 경우에, 동일한, 보다 큰 또는 보다 적은 정도로, 항체는 이들의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "상호경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 항체와 교차경쟁 항체는 둘 다 본 발명에 포함된다. 이러한 경쟁 또는 교차 경쟁이 일어나는 메커니즘(예를 들어, 입체 장애, 입체형태 변화, 또는 공통 에피토프에 대한 결합, 또는 이의 부분)과 상관없이, 당업자는 본 명세서에 제공된 교시에 기반하여 이러한 경쟁 및/또는 교차 경쟁 항체가 포함되고 본 명세서에 개시된 방법에 유용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 항체는 평형 해리 상수가 20nM 이하, 바람직하게는 약 6nM 미만, 더 바람직하게는 약 1nM 미만, 가장 바람직하게는 약 0.75nM 미만일 때, IL-6과 "상호작용한다". 일부 실시형태에서, 항체의 친화도는 400 내지 800pM, 예를 들어, 450 내지 700, 또는 500 내지 600pM이다.
IL-6 길항 항체는 IL-6 생물학적 활성, 예컨대, IL-6R에 대한 결합, gp130에 대한 IL-6/IL-6R 복합체 결합, Stat3의 인산화 및 활성화, 세포 증식, 및 IL-6 매개된 염증 또는 신생혈관유발 경로의 자극을 (유의하게를 포함하는 임의의 정도로) 차단하거나, 길항하거나, 감소시키는 항체를 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "IL-6 길항 항체"는 모두 이전에 확인된 용어, 표제 및 기능적 상태 및 특징을 포함하며, 이에 의해 IL-6 그 자체, IL-6 생물학적 활성, 또는 생물학적 활성의 결과는 임의의 의미있는 정도로 실질적으로 무효화되거나, 감소되거나 중화된다는 것이 명확하게 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 IL-6에 결합한다. IL-6 길항 항체의 예는 본 명세서에 제공된다.
에피토프에 "우선적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"(본 명세서에서 상호 호환적으로 사용됨) 항체는 당업계에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 또는 우선적인 결합을 결정하는 방법은 또한 당업계에 잘 공지되어 있다. 분자가 대안의 세포 또는 물질에 대해서보다 특정 세포 또는 물질에 대해 더 빈번하게 및/또는 더 빠르게 및/또는 더 긴 지속기간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 결합한다면, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도 및/또는 결합활성, 및/또는 더 빠르게 및/또는 더 긴 지속기간으로 결합한다면 표적에 "특이적으로 결합하거나" 또는 "우선적으로 결합한다". 예를 들어, IL-6 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 IL-6 에피토프 또는 비-IL-6 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도 및/또는 결합활성으로 및/또는 더 빠르게 및/또는 더 큰 지속기간으로 이 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한 본 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 결합하지 않을 수도 있다는 것이 이해된다. 이렇게 해서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 필수적인 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적인 결합을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수(즉, 오염물질 없음), 더 바람직하게는, 적어도 90% 순수, 더 바람직하게는, 적어도 95% 순수, 또한 더 바람직하게는, 적어도 98% 순수, 가장 바람직하게는, 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물의 포함을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자인 개개 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우연한 또는 의도적인 돌연변이에 기인하여 본래의 모 세포와 완전히 (형태 또는 게놈 DNA 보체가) 동일할 필요는 없을 수도 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
당업계에 공지된 바와 같은 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 Cys226 위치의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 이의 카복실-말단까지 신장(stretch)되는 것으로 정의된다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 색인에 의한다. 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉, CH2 및 CH3을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체(이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함함)를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 주로 이의 세포질 도메인과는 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함한다. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; 및 de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에서 검토된다. "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달을 초래하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다(Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; 및 Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 가진다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 상보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성; 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절(예를 들어, B 세포 수용체) 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 하며, 이러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위한 당업계에 공지된 다양한 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해, 또한 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 보유하는 천연 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 모 폴리펩타이드의 천연 서열 Fc 영역 또는 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서의 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는, 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 가진다. 본 명세서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역과 그리고/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는, 이에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성, 더 바람직하게는, 이에 대해 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
본 명세서에서 사용되는, "치료"는 유리한 또는 목적하는 임상 결과를 얻기 위한 접근이다.
본 명세서에서 사용되는, "IL-6 및/또는 VEGF 관련 장애"는, 예를 들어, 안구 장애 및 전신 장애를 포함한다. 안구 장애는 안과적 염증 질환 공막염, 비증식성 당뇨망막병증, 증식성 당뇨망막병증, 당뇨 황반 부종, 당뇨 황반 부종의 예방, 증식성 당뇨망막병증의 예방, 삼출성 연령-관련 황반 변성, 습성(wet) 연령-관련 황반 변성의 예방, 건성(dry) 연령-관련 황반 변성, 정맥, 동맥 또는 안구의 다른 차단 및 또는 망막 부종을 동반하거나 또는 동반하지 않는 망막 혈관, 전측 및 후측 포도막염, 포도막염 황반 부종 및 안구내 종양과 같은 안구 장애를 포함한다. IL-6 관련 장애는 또한 IL-6R 또는 가용성 IL-6R(sIL-6R)과 상호작용하는 IL-6에 기인하는 상승된 수준의 IL-6 활성이 있는 장애를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질 중 임의의 하나 이상 및/또는 본 명세서에 제공된 접합체 중 임의의 하나 이상은 IL-6 및/또는 VEGF 관련 장애 중 임의의 하나 이상의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 장애는 그레이브스병 또는 시속척수염(neuromyelitis optica)과 같은 눈에 영향을 미치는 전신 질환, 또는 다발성 경화증, 류마티스 관절염과 같이 눈에 영향을 미치는 전신 질환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 장애는 CAR-T 또는 유사한 면역-종양 치료 후에 사이토카인 방출 증후군을 포함한다.
추가적으로, 항-IL6 분자는 항-PD-1/PD-L1 분자에 의한 치료 후에 관찰된 IL-6 발현의 유도를 없앤다(Tsukamoto et al, Cancer Res; 2018 78(17); 5011-22 ). 또한 VEGF 신호전달 차단이 항-PD-L1 치료를 개선시킬 수 있다는 것이 나타났다(Allen et al, Sci Transl Med 2017 April 12: 9(385)). 따라서, 이들 이중 저해제는 암을 상승적으로 치료하기 위해 PD-1/PDL-1 조절제 및/또는 다른 면역 관문 저해제와 병용하여 사용될 수 있다. 다른 장애는 항-IL6 요법이 항-VEGF 치료에 대해 추가적인 이점을 나타낼 수 있는 교모세포종에서의 뇌부종을 포함할 수 있다. 다른 장애는 고형 종양을 갖는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "개선시키는"은 IL-6 항체, IL-6 항체-VEGF Trap 융합, IL-6 항체의 접합체 및/또는 IL-6 항체-VEGF Trap 융합의 접합체를 투여하지 않는 것에 비해 하나 이상의 증상의 감소 또는 개선을 의미한다. "개선시키는"은 또한 증상의 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "VEGF Trap" 또는 유사한 용어는 VEGF 결합 도메인(VEGFR1 도메인 2, VEGFR2 도메인 3)을 의미한다. 이 단편은 단백질이 VEGF 트랩으로서 작용하는 것을 가능하게 하여, VEGF가 세포 발현된 VEGF 수용체에 결합하는 것을 방지한다. 이 서열의 예는 표 1C에서 찾을 수 있다. 일부 실시형태에서, VEGF Trap은 VEGFR1 도메인 2, VEGFR2 도메인 3만을 포함한다. Trap 단백질의 다양한 실시형태는 당업계에 공지되어 있고, 다양한 VEGF Trap 실시행태(이는 VEGFR 단백질 또는 이의 단편임) 및 이의 융합에 대해, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 미국 특허 공개 제20150376271호에서 찾을 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "VEGF Trap" 또는 유사한 용어는 적어도 하나의 VEGF와 VEGFR 사이의 신호전달을 길항할 수 있는 상이한 VEGF 수용체로부터의 전장 세포외 영역 또는 이의 임의의 부분, 또는 부분의 조합을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "IL-6 항체-VEGF Trap 융합", "IL-6 항체-VEGF Trap", "Ab IL-6-VEGF Trap", "항IL-6-VEGF Trap", "VEGFR-항IL6", "VEGFR-항IL-6", "VEGF Trap-항-IL6 항체 융합(TAF)", "VEGF Trap-IL6", "VEGFR IL-6", "IL6-VEGFR" 또는 유사한 용어 또는 반대의 용어(예를 들어, "VEGF Trap-IL-6 Ab", "VEGF Trap-IL-6 항체 융합" 등)는 IL-6 항체와 VEGF Trap 사이의 융합을 나타낸다. 실시형태를 도 6에 나타낸다. 일반적으로 사용될 때, 두 용어의 순서는 전환될 수 있다. 구체적으로 사용될 때, 두 용어의 순서는 작제물에서의 성분의 상대적 위치를 나타낸다. 용어 "Ab-Trap", "IL-6 Ab-VEGF Trap" "Ab IL-6 VEGF Trap" 또는 "Ab IL-6-Trap" 또는 "항IL-6 VEGF Trap", "Trap-Ab", 항IL-6-VEGFR, 항IL6-VEGFR 또는 다른 유사한 용어 또는 반대의 용어(예를 들어, "VEGF Trap-IL-6 Ab", "VEGF Trap-IL-6 항체 융합" 등)는 VEGF 트랩을 제공하기 위해 VEGF 결합 단백질의 적절한 도메인에 융합된 Ab의 배열을 나타낸다. 상기 언급된 바와 같이, VEGF 결합 단백질의 이 부문은 VEGF가 VEGF 수용체에 결합하는 것을 방지하는 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, Trap 및 항체 부문의 배열(순서)은 달라질 수 있다. 따라서, 달리 명확하게 또는 문맥에 의해 나타내지 않는 한, Ab-Trap (또는 Il-6/VEGF Trap 등) 융합에 관해 본 명세서에서 사용되는 어구는 항체 및 Trap의 위치화를 위한 모든 개시된 실시형태를 나타낸다. 따라서, 달리 설명되지 않는 한, 어구 Ab-Trap(또는 Il-6/VEGF Trap 등)은 도 6의 좌측 실시형태, 및 도 6의 우측 실시형태, 및 도 6의 실시형태 둘 다를 나타낸다. 따라서, 일반적 언어는 편리함을 위해 모두 3가지의 옵션을 개시하는 것으로 나타난다. 배향이 구체적으로 나타난다면, 예를 들어, "배열"이 Trap-Ab, Trap IL-6 Ab, VEGF Trap Ab IL-6, VEGF Trap Ab IL6 중 하나일 수 있다는 것을 언급함으로써, 나타낼 수 있다. 유사하게, 실시예와 관련하여 나타내는 분자의 본 실시예 특이적 배향 또는 배열의 내용이 인식될 것이다. 배열 둘 다(대안 및 조합) 본 명세서에 제공된 융합 단백질의 모든 논의에 대해 명확하게 상정된다. 추가로, 순서 때문에, 어구 IL-6 Ab는 융합 단백질과 관련하여 사용될 때, 항체가 인접하는 옵션(도 6, 좌측)과 TRAP가 Ab "내에" 위치되는 옵션(도 6 우측)을 둘 다 포함한다는 것이 인식된다. 또한, 용어 "Ab" 또는 "항체"는, 융합 단백질 내용(또는 다른 유사한 용어)에서 사용될 때, 달리 언급되지 않는 한, 모두 3가지 옵션(도 6의 좌측, 도 6의 우측 및 옵션 둘 다)을 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF Trap은 IL-6에 대해 다음의 방식 중 하나로: IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 N-말단 단부에; 또는 힌지 영역과 IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 CH1 도메인 다음 사이에 융합된다. 항체 또는 이의 단편을 표기하기 위한 명칭에서 사용될 때 Ab, 항체, "항" 또는 다른 유사한 용어의 표기 간의 차이는 없다. "Il-6" 또는 "IL6" 또는 "IL-6"의 표기 간의 차이는 없다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, IL-6과의 융합 작제물을 언급할 때, 용어 "VEGF", "VEGFR", "VEGF Trap", "VEGFR Trap"은 상호호환적으로 사용된다. 용어는 당해 용어의 내용에 따라서 IL-6 융합 배열과 별개로 사용될 때 상이한 의미를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생체중합체"는 중합체가 관심 대상의 단백질과 연결된 것을 의미한다. 용어는 또한 단백질의 "접합" 형태로서 기재될 수 있다. 이는 본 명세서에 기재된 모든 단백질에 대해 행해질 수 있다. 따라서, IL-6 Ab 생체중합체 및 IL-6 항체-VEGF Trap 생체중합체는 본 명세서에 제공된 모든 이러한 IL-6 Ab 및 IL-6 항체-VEGF에 대해 상정된다. 추가로, VEGF Trap 생체중합체가 또한 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "길항 항체"는 항체가 결합하는 분자의 하나 이상의 기능 또는 활성을 차단하는 항체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유효 투약량" 또는 "유효량"의 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물은 임의의 하나 이상의 유리한 또는 목적하는 결과를 달성하는 데 충분한 양이다. 더 구체적인 양상에서, 유효량은 치료 중인 대상체의 질환 증상을 예방하거나, 완화시키거나, 개선시키고/시키거나 대상체의 생존을 연장시킨다. 예방적 용도를 위해, 유리한 또는 목적하는 결과는 질환의 발생 동안 제공되는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 이의 합병증 및 즉시 병리학적 표현형을 포함하는 질환을 제거하거나, 위험을 감소시키거나, 중증도를 줄이거나, 질환의 개시를 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 용도를 위해, 유리한 또는 목적하는 결과는 임상 결과, 예를 들어, 환자에서의 AMD, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 건성 AMD 및 습성 AMD를 포함하는 AMD와 같은 질환의 하나 이상의 증상의 감소, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 의약 용량의 감소, 다른 의약 효과의 향상, 및/또는 AMD 진행의 지연을 포함한다. 유효 투약량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효 투약량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방 또는 치료적 치료를 달성하는 데 충분한 양이다. 임상 내용에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효 투약량은 다른 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물과 함께 달성될 수도 있고 달성되지 않을 수도 있다. 따라서, "유효 투약량"은 1종 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 제제는,1종 이상의 다른 제제와 함께, 목적하는 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면 유효량으로 주어지도록 고려될 수 있다.
항-IL-6 항체는 개시를 지연시키고/시키거나 중증도를 감소시키고/시키거나, 추가적인 악화를 저해하고/하거나 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선시키는 투약량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 유효 요법으로 투여된다. 환자가 이미 장애를 앓고 있다면, 요법은 치료적 유효 요법으로서 지칭될 수 있다. 환자가 일반 집단에 비해 장애의 위험이 상승되어 있지만, 아직 증상을 경험하지 않았다면, 요법은 예방적으로 유효한 요법으로서 지칭될 수 있다. 일부 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 동일한 환자에서의 병력 조절 또는 과거의 경험에 대해 개개 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 비치료 환자의 대조군 집단에 비해 치료 환자 집단에서의 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
항-IL-6-VEGF Trap은 개시를 지연시키고/시키거나 중증도를 감소시키고/시키거나, 추가적인 악화를 저해하고/하거나 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선시키는 투약량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 유효 요법으로 투여된다. 환자가 이미 장애를 앓고 있다면, 요법은 치료적 유효 요법으로서 지칭될 수 있다. 환자가 일반 집단에 비해 장애의 위험이 상승되어 있지만, 아직 증상을 경험하지 않았다면, 요법은 예방적으로 유효한 요법으로서 지칭될 수 있다. 일부 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 동일한 환자에서의 병력 조절 또는 과거의 경험에 대해 개개 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 비치료 환자의 대조군 집단에 비해 치료 환자 집단에서의 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
물질의 "생물학적 반감기"는 유기체에 대한 물질의 도입 후 물질의 1/2이 유기체로부터 제거되는 데 필요한 시간을 구체화하는 약물동태학적 파라미터이다.
용어 "예방하는" 또는 "예방하다"는 (a) 장애가 발생되는 것으로부터 지키거나, (b) 장애의 개시 또는 장애 증상의 개시를 지연시키거나, 또는 (c) 존재하는 병태의 진행을 늦추는 것을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, "예방하는"은 사건이 일어나는 것의 절대적 금지가 필요한 것은 아니다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유류 또는 조류, 더 바람직하게는, 인간이다. 포유류는 또한 농장 동물(예를 들어, 소, 돼지, 말, 닭 등), 스포츠 동물, 반려동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 숙주 세포에서 관심 대상의 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에서 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터 및 특정 진핵 세포, 예컨대, 생산자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는, "발현 조절 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 프로모터, 예컨대, 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 활성 성분과 조합될 때, 성분이 생물학적 활성을 보유하고 대상체의 면역계와 비반응성이 되는 것을 가능하게 하는 임의의 물질을 포함한다. 예는 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대, 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 세정제, 예컨대, 응집을 방지하기 위한 폴리솔베이트 20 및 동결보존제로서의 당, 예컨대, 수크로스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 정상(0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화된다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).
본 명세서에서 사용되는 용어 "kon"은 항원에 대한 항체(또는 생체접합체)의 회합을 위한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 속도 상수(kon 및 koff) 및 평형 해리 상수는 전장 항체 및/또는 Fab 항체 단편(즉, 1가) 및 IL-6을 이용하여 측정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체(또는 생체접합체)의 해리 속도 상수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "KD"는 항체-항원(또는 생체접합체-항원) 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.
본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 해당 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 실시형태를 포함한다(기재한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치적 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함한다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 대상체(포유류를 포함)를 포함한다.
보존적 또는 비보존적으로서 아미노산 치환을 분류하기 위한 목적을 위해, 아미노산은 다음과 같이 그룹화된다: 그룹 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류 내 아미노산 간의 치환을 수반한다. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 구성한다.
서열 동일성 백분율은 가변 영역에 대한 카바트 넘버링 협약 또는 불변 영역에 대한 EU 넘버링에 의해 최대로 정렬되는 항체 서열에 의해 결정된다. 정렬 후에, 대상 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 기준 항체의 동일 영역과 비교된다면, 대상과 기준 항체 영역 간의 서열 동일성 백분율은 대상과 기준 항체 영역 둘 다에서 동일한 아미노산으로 점유되는 위치의 수를, 갭을 계수하지 않고, 두 영역의 정렬 위치의 총 수로 나누고 나서 100을 곱하여 백분율로 전환한다. 다른 서열의 서열 동일성은 위스콘신주 메디슨 575 사이언스 드라이브에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)에서 BESTFIT, FASTA 및 TFASTA와 같은 알고리즘을 이용하여, 또는 검사, 및 최상의 정렬(즉, 비교창에 대해 가장 높은 서열 유사성 백분율을 초래함)에 의해 결정될 수 있다. 서열 동일성 백분율은 비교창에 대해 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 서열 둘 다에서 동일한 잔기가 생기는 위치 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 수득하고, 매칭된 위치의 수를 비교창(즉, 창 크기)에서 위치의 총 수로 나누고 나서, 결과에 100을 곱하여서 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산된다.
용어 "항체-의존적 세포의 세포독성", 또는 ADCC는 항체-코팅 표적 세포(즉, 항체와 결합된 세포)와 면역 세포용해 활성을 갖는 면역 세포(효과기 세포로도 지칭됨)의 상호작용에 따라서 세포사를 유도하는 메커니즘이다. 이러한 효과기 세포는 자연살해 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. ADCC는 면역 효과기 세포, 예컨대, 호중구, 대식세포 및 자연살해 세포 상에서, 세포에 결합된 항체의 Fc 영역과 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 및 FcγRIII 간의 상호작용에 의해 촉발된다. 표적 세포는 효과기 세포를 매개할 수 있는 유형에 따라서 식세포작용 또는 용해에 의해 제거된다. 항체-코팅 표적 세포의 사멸은 효과기 세포 활성의 결과로서 생긴다.
인간화된 항체는 비-인간 "공여자" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용자" 항체 서열에 접합된 유전자 조작된 항체이다(예를 들어, 퀸(Queen)의 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호; 윈터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호, 카터(Carter)의 미국 특허 제6,407,213호, 아다르(Adair)의 미국 특허 제5,859,205호, 제6,881,557호, 푸트(Foote)의 미국 특허 제6,881,557호). 수용자 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 공통 서열 또는 생식계열 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화된 항체는 공여자 항체 및 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역으로부터 완전히 또는 실질적으로, 존재한다면 인간 항체 서열로부터 완전히 또는 실질적으로 일부 또는 모든 CDR을 갖는 항체이다. 유사하게 인간화된 중쇄는 완전히 또는 실질적으로 공여자 항체 중쇄, 및 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역, 존재한다면 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 실질적으로 적어도 1, 2 및 보통 모두 3개의 CDR을 가진다. 유사하게 인간화된 경쇄는 완전히 또는 실질적으로 공여자 항체 경쇄, 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역, 존재한다면 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 실질적으로 적어도 1, 2 및 보통 모두 3개의 CDR을 가진다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화된 항체에서 CDR은, 대응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%(카바트에 의해 정의됨)가 각각의 CDR 간에 동일할 때, 비-인간 항체에서 대응하는 CDR로부터 실질적으로 유래된다. 항체쇄의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체쇄의 불변 영역은 카바트에 의해 정의되는 대응하는 잔기의 적어도 85, 90, 95 또는 100%가 동일할 때 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 실질적으로 유래된다.
인간화된 항체는 종종 마우스 항체로부터의 모두 6개의 CDR(바람직하게는 카바트에 의해 정의됨)을 포함하지만, 이들은 또한 모든 CDR보다 적게 생성될 수 있다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 적어도 3, 4 또는 5개의 CDR)(예를 들어, 문헌[Pascalis et al, J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36: 1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164: 1432-1441, 2000]).
키메라 항체는 비-인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합되는 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 완전히 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하며, 약 2/3의 인간 서열이다.
베니어드(veneered) 항체는 비-인간 항체의 CDR의 일부 및 보통은 모두, 및 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기를 보유하지만, B- 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어, 인간 항체 서열의 대응하는 위치로부터의 잔기를 갖는 노출된 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기를 대체하는 인간화된 항체의 유형이다. 결과는 CDR이 완전히 또는 실질적으로 비-인간 항체로부터 유래되고, 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크는 치환에 의해 더 인간-유사로 생성된 항체이다. 인간 항체는 인간으로부터 단리되거나, 또 다르게는 (예를 들어, 유전자이식 마우스, 시험관내 또는 파지 디스플레이에 의해) 인간 면역글로불린 유전자의 발현으로부터 초래될 수 있다. 인간 항체를 생성하는 방법은 문헌[Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983)]; 외스트베르크(Oestberg)의 미국 특허 제4,634,664호; 및 엔글만(Engleman) 등의 미국 특허 제4,634,666호의 트리오마(trioma) 방법을 포함하며, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자이식 마우스를 사용한다(예를 들어, 론베르크(Lonberg) 등의, W093/12227 (1993); 미국 특허 제5,877,397호, 미국 특허 제5,874,299호, 미국 특허 제5,814,318, 미국 특허 제5,789,650, 미국 특허 제5,770,429호, 미국 특허 제5,661,016호, 미국 특허 제5,633,425호, 미국 특허 제5,625,126호, 미국 특허 제5,569,825호, 미국 특허 제5,545,806호, 문헌[Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826(1996), 쿠체르라파티(Kucherlapati) 등의 WO 91/10741 (1991) 및 파지 디스플레이 방법(예를 들어, 도워(Dower) 등의 WO 91/17271 및 맥카페티(McCafferty) 등의 WO 92/01047, 미국 특허 제5,877,218호, 미국 특허 제5,871,907호, 미국 특허 제5,858,657호, 미국 특허 제5,837,242호, 미국 특허 제5,733,743호 및 미국 특허 제5,565,332호 참조).
"중합체"는 다수의 반복 서브유닛으로 구성된 분자이다. 때때로 "단량체"로서도 지칭되는 서브유닛은 동일 또는 상이할 수 있다. 천연과 합성 중합체가 둘 다 있다. DNA, 단백질 및 복합체 탄수화물은 천연 중합체의 예이다. 폴리-스타이렌 및 폴리-아크릴아마이드는 합성 중합체의 예이다. 단일 단량체의 반복 단위로 구성된 중합체는 동종중합체로 불린다. 둘 이상의 단량체로 구성된 중합체는 공중합체 또는 때때로 이형중합체로 불린다. 특정 단량체 유형이 함께 클러스터링된 공중합체는 때때로 블럭 공중합체로 불린다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 중합체가 분지될 때, 공통 기원을 갖는 중합체 쇄는 때때로 중합체 아암(arm)(들)으로 지칭된다.
"개시제"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단량체 또는 공단량체를 이용하여 1회 이상의 중합이 일어나는 기재로서 작용할 수 있는 화합물이다. 중합은 통상적인 유리 라디칼 중합 또는 바람직하게는 제어된/"살아있는" 라디칼 중합, 예컨대, 원자 이동 라디칼 중합(Atom Transfer Radical Polymerization: ATRP), 가역적 첨가-단편화-종결(Reversible Addition-Fragmentation-Termination: RAFT) 중합 또는 나이트록사이드 매개 중합(nitroxide mediated polymerization: NMP)일 수 있다. 중합은 "유사(pseudo)" 제어된 중합, 예컨대, 변성 전달일 수 있다. ATRP에 적합한 개시제는 개시제 단편인 I를 형성하도록 균일 분해될 수 있는 하나 이상의 불안정한 결합을 함유하며, 라디칼은 중합을 가역적으로 종결시키기 위해 점점 늘어나는 중합체 쇄의 라디칼과 반응하는 라디칼 중합, 및 라디칼 스캐빈저(scavenger)인 I'를 개시할 수 있다. 라디칼 스캐빈저 I'는 전형적으로 할로겐이지만, 또한 유기 모이어티, 예컨대, 나이트릴일 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 개시제는 ATRP를 통해 중합을 위한 부위로서 하나 이상의 2-브로모아이소뷰티레이트기를 함유한다.
"화학적 링커"는 2개의 기, 예컨대, 반감기 연장 모이어티와 단백질을 함께 연결하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 절단 가능한 링커는 특히 가수 분해 가능, 효소적으로 절단 가능, pH 민감성, 광불안정성 또는 이황화물 링커일 수 있다. 다른 링커는 동종2작용성 및 이종2작용성 링커를 포함한다. "연결기"는 생활성제에 대해 하나 이상의 결합으로 이루어진 공유 결합을 형성할 수 있는 작용기이다. 비제한적 예는 WO2013059137(참고로 포함됨)의 표 1에 예시된 것을 포함한다.
용어 "반응기"는 공유 결합을 형성하기 위해 다른 화학기와 반응할 수 있는 기를 지칭하며, 즉, 적합한 반응 조건 하에 공유적으로 반응성이며, 일반적으로 다른 물질에 대한 부착 지점을 나타낸다. 반응기는 모이어티, 예컨대, 말레이미드 또는 석신이미딜 에스터이며, 공유 결합을 형성하기 위해 상이한 모이어티 상의 작용기와 화학적으로 반응할 수 있다. 반응기는 일반적으로 친핵체, 친전자체 및 광활성화 가능한기를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "포스포릴콜린"은 "PC"로도 나타내며 다음을 지칭한다:
Figure pct00001
식 중, *는 부착지점을 나타낸다. 포스포릴콜린은 양쪽성기이며, 이의 염(예컨대, 내부 염), 양성자화된 형태 및 탈양성자화된 형태를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "포스포릴콜린-기반 중합체"는 포스포릴콜린을 함유하는 중합체이다. "양쪽성 이온 함유 중합체"는 양쪽성 이온을 함유하는 중합체를 지칭한다.
폴리(아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) 함유 중합체는 단량체로서 2-(아크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트를 함유하는 중합체를 지칭한다.
중합체를 함유하는 폴리(메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린)은 단량체로서 2-(메타크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트를 함유하는 중합체를 지칭한다.
중합체와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "분자량"은 수 평균 분자량, 또는 중량 평균 분자량 또는 피크 분자량으로서 표현될 수 있다.　 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서의 분자량에 대한 모든 언급은 피크 분자량을 지칭한다.　 이들 분자량 결정, 수 평균(Mn), 중량 평균(Mw) 및 피크(Mp)는 크기 배제 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 기법을 이용하여 측정될 수 있다.　 분자량을 측정하기 위한 다른 방법, 예컨대, 수 평균 분자량의 결정하기 위한 말단기 분석의 사용 또는 총괄성 특성의 측정(예를 들어, 어는점 내림, 끓는점 오름, 또는 삼투압), 또는 중량 평균 분자량을 결정하기 위한 광산란 기법, 초원심분리 또는 점도측정의 사용이 또한 사용될 수 있다.　 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 분자량은 SEC-MALS(크기 배제 크로마토그래피 - 다중각 광산란)에 의해 측정된다.　 본 발명의 중합체 시약은 전형적으로 다분산성이다(즉, 중합체의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 동일하지 않다). 다분산지수(Poly Dispersity Index: PDI)는 혼합물에서 중합체 분산도 측정을 제공한다. PDI는 식 Mw/Mn으로 제공된다. 이와 관련하여, 균질한 단백질은 PDI가 1.0일 것이다(Mn은 Mw와 동일하다). 전형적으로, 중합체에 대한 PDI는 1.0 초과일 것이다. 본 발명에 따른 중합체는, 예를 들어, SEC-MALS에 의해 판단하여, 바람직하게는 상대적으로 낮은 다분산도(PDI) 값, 예를 들어, 약 1.5 미만이다. 다른 실시형태에서, 다분산도(PDI)는 더 바람직하게는 약 1.4 내지 약 1.2, 훨씬 더 바람직하게는 약 1.15 미만, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1.05 미만 및 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 범위이다.
본 명세서에서 사용되는, "보호된", "보호된 형태", "보호성 기" 및 "보호기"는 특정 반응 조건 하에 분자에서 특정 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 방지하거나 차단시키는 기(즉, 보호기)의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호 중인 화학적 반응기뿐만 아니라 사용될 반응 조건 및 만약에 있다면 분자 내 추가적인 반응기 또는 보호기의 존재에 따라 다르다. 적합한 보호기는 문헌[Greene et al., "Protective Groups In Organic Synthesis,"3rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999]에 의해 논문에서 발견되는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "알킬"은 탄소 원자의 수가 나타난 직쇄 또는분지쇄, 포화, 지방족 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, tert-뷰틸, 펜틸, 아이소펜틸, 헥실 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 알킬기는 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 알킬은 임의의 수의 탄소, 예컨대, 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6개의 탄소를 포함할 수 있다.
각각 유기 라디칼 또는 화합물과 관련하여 상기 그리고 본 명세서에서 이후에 지칭되는 용어 "저급"은 최대 7(7을 포함), 바람직하게는 최대 4(4를 포함) 및 (비분지) 1 또는 2개의 탄소 원자로 분지 또는 비분지될 수 있는 화합물 또는 라디칼을 정의한다.
본 명세서에서 사용되는, "알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가의 탄화수소 라디칼을 연결하는 상기 정의한 바와 같은 알킬기를 지칭한다. 알킬렌에 연결된 두 모이어티는 알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 예를 들어, 직쇄 알킬렌은 -(CH2)n의 2가의 라디칼일 수 있으며, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 알킬렌기는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 아이소프로필렌, 뷰틸렌, 아이소뷰틸렌, sec-뷰틸렌, 펜틸렌 및 헥실렌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
알킬, 알켄일, 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 헤테로알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알켄일 및 헤테로사이클로알켄일 라디칼에 대한 치환체는 1 내지 (2m'+1) 범위의 수로, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R"-SR', -할로겐, -SiR'R""', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R"-OC(O)NR'R"-NR"', -NR'-C(O)NR""', -NR"2R', -NR-C(NR'R"'")=NR""-NR-C(NR'R"'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R"-NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 기 중 하나 이상일 수 있으며, 여기서 m'는 이러한 라디칼에서 탄소 원자의 총 수이다. 각각의 R', R", R"' 및 R""는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 예를 들어, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기 또는 아릴알킬기를 지칭한다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착될 때, 이들은 질소 원자와 조합되어 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리딘일 및 4-몰폴린일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "알콕시"는 산소 원자에 부착된 알킬기를 지칭하고, 라디칼 -O-R를 형성하되, R은 알킬이다. 알콕시기는, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소-프로폭시, 뷰톡시, 2-뷰톡시, 아이소-뷰톡시, sec-뷰톡시, tert-뷰톡시, 펜톡시, 헥속시 등을 포함한다. 알콕시기는 본 명세서에 기재된 다양한 치환체로 추가로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알콕시기는 "할로-알콕시"기를 형성하기 위해 할로겐으로 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "카복시알킬"은 카복시기로 치환된 알킬기(본 명세서에 정의된 바와 같음)를 의미한다. 용어 "카복시사이클로알킬"은 카복시기로 치환된 사이클로알킬기(본 명세서에 정의된 바와 같음)를 의미한다. 용어 알콕시알킬은 알콕시기로 치환된 알킬기(본 명세서에 정의된 바와 같음)를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "카복시"는 카복실산 및 이들의 에스터를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "할로알킬"은 일부 또는 모든 수소 원자가 할로겐 원자로 치환되는 상기 정의한 바와 같은 알킬을 지칭한다. 할로겐(할로)은 바람직하게는 클로로 또는 플루오로를 나타내지만, 또한 브로모 또는 아이오도일 수 있다. 예를 들어, 할로알킬은 트라이플루오로메틸, 플루오로메틸, 1,2,3,4,5-펜타플루오로-페닐 등을 포함한다. 용어 "퍼플루오로"는 모든 이용 가능한 수소가 플루오린으로 대체된 화합물 또는 라디칼을 정의한다. 예를 들어, 퍼플루오로페닐은 1,2,3,4,5-펜타플루오로페닐을 지칭하고, 퍼플루오로메틸은 1,1,1-트라이플루오로메틸을 지칭하며, 퍼플루오로메톡시는 1,1,1-트라이플루오로메톡시를 지칭한다. 할로알킬은 또한 할로-치환 알킬, 예컨대, 플루오로-치환 알킬로서 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 본 발명과 관련하여 "사이토카인"은 면역 및 염증 반응에서 세포-세포 통신(cell-cell communication)에 참여할 수 있는 단백질 신호전달 분자 그룹의 구성원이다. 사이토카인은 질량이 약 8 내지 35kDa인 전형적으로 작고, 수용성인 당단백질이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "사이클로알킬"은 약 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 7, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 포화된 단환식 또는 다환식 지방족 고리계를 지칭한다. 사이클로알킬기가 둘 이상의 고리로 구성될 때, 고리는 축합 고리 또는 스피로 고리 구조와 함께 결합될 수 있다. 사이클로알킬기가 3개 이상의 고리로 구성될 때, 고리는 또한 브리징된 고리 구조를 함께 형성할 수 있다. 단환식 고리는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로옥틸을 포함한다. 이환식 및 다환식 고리는, 예를 들어, 바이사이클로[1.1.1]펜탄, 바이사이클로[2.1.1]헵탄, 노보난, 데카하이드로나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 예를 들어, C3-8 사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로옥틸 및 노보난을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "내향고리(endocyclic)"는 환식 고리 구조 부분을 포함하는 원자 또는 원자의 기를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "외향고리(exocyclic)"는 부착되어 있지만 환식 고리 구조를 정하지는 않는 원자 또는 원자의 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "환식 알킬 에터"는 3 또는 4개의 내향고리 탄소 원자 및 1개의 내향고리 산소 또는 황 원자를 갖는 4 또는 5원 환식 알킬기(예를 들어, 옥세탄, 티에탄, 테트라하이드로퓨란, 테트라하이드로티오펜); 또는 1 또는 2 내향고리 산소 또는 황 원자를 갖는 6 내지 7원 환식 알킬기(예를 들어, 테트라하이드로피란, 1,3-다이옥산, 1,4-다이옥산, 테트라하이드로티오피란, 1,3-다이티안, 1,4-다이티안, 1,4-옥사티안)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "알켄일"은 적어도 하나의 이중결합을 갖는 2 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지형 탄화수소 중 하나를 지칭한다. 알켄일기의 예는 비닐, 프로펜일, 아이소프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일, 아이소뷰텐일, 뷰타다이엔일, 1-펜텐일, 2-펜텐일, 아이소펜텐일, 1,3-펜타다이엔일, 1,4-펜타다이엔일, 1-헥센일, 2-헥센일, 3-헥센일, 1,3-헥사다이엔일, 1,4-헥사다이엔일, 1,5-헥사다이엔일, 2,4-헥사다이엔일 또는 1,3,5-헥사트라이엔일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 알켄일기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6개의 탄소를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "알켄일렌"은 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 연결하는 상기 정의한 바와 같은 알켄일기를 지칭한다. 알켄일렌에 연결된 두 모이어티는 알켄일렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 알켄일렌기는 에텐일렌, 프로펜일렌, 아이소프로펜일렌, 뷰텐일렌, 아이소뷰텐일렌, sec-뷰텐일렌, 펜텐일렌 및 헥센일렌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "알킨일"은 적어도 하나의 삼중결합을 갖는 2 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지형 탄화수소 중 하나를 지칭한다. 알킨일기의 예는 아세틸렌일, 프로핀일, 1-뷰틴일, 2-뷰틴일, 아이소뷰틴일, sec-뷰틴일, 부타다이인일, 1-펜틴일, 2-펜틴일, 아이소펜틴일, 1,3-펜타다이인일, 1,4-펜타다이인일, 1-헥신일, 2-헥신일, 3-헥신일, 1,3-헥사다이인일, 1,4-헥사다이인일, 1,5-헥사다이인일, 2,4-헥사다이인일 또는 1,3,5-헥사트라이인일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 알킨일기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6개의 탄소를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "알킨일렌"은 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가의 탄화수소 라디칼을 연결하는 상기 정의한 바와 같은 알킨일기를 지칭한다. 알킨일렌에 연결된 두 모이어티는 알킨일렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 알킨일렌기는 에틴일렌, 프로핀일렌, 뷰틴일렌, sec-뷰틴일렌, 펜틴일렌 및 헥신일렌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는, "사이클로알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가의 탄화수소 라디칼을 연결하는 상기 정의한 바와 같은 사이클로알킬기를 지칭한다. 사이클로알킬렌에 연결된 두 모이어티는 사이클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 사이클로알킬렌기는 사이클로프로필렌, 사이클로뷰틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌 및 사이클로옥틸렌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "헤테로사이클로알킬"은 3개의 고리 구성원 내지 약 20개의 고리 구성원 및 1 내지 약 5개의 헤테로원자, 예컨대, N, O 및 S를 갖는 고리계를 지칭한다. B, Al, Si 및 P를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 추가적인 헤테로원자가 또한 유용할 수 있다. 헤테로원자는 또한, 이하로 제한되는 것은 아니지만, -S(O)- 및 -S(O)2-와 같이 산화될 수 있다. 예를 들어, 헤테로사이클은 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로티오페닐, 몰폴리노, 피롤리딘일, 피롤린일, 이미다졸리딘일, 이미다졸린일, 피라졸리딘일, 피라졸린일, 피페라진일, 피페리딘일, 인돌린일, 퀴뉴클리딘일 및 1,4-다이옥사-8-아자-스피로[4.5]데크-8-일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "헤테로사이클로알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기를 연결하는 상기 정의한 바와 같은 헤테로사이클알킬기를 지칭한다. 헤테로사이클로알킬렌에 연결된 두 모이어티는 헤테로사이클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "아릴"은 6 내지 16개의 탄소 원자를 함유하는 단환식 또는 다환식(예를 들어, 축합 이환식, 삼환식 또는 더 큰 것) 방향족 고리 조립체를 지칭한다. 예를 들어, 아릴은 페닐, 벤질 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐일 수 있다. 아릴기는 알킬, 알콕시, 아릴, 하이드록시, 할로겐, 사이아노, 아미노, 아미노-알킬, 트라이플루오로메틸, 알킬렌다이옥시 및 옥시-C2-C3-알킬렌(이들 모두 선택적으로, 예를 들어 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같이 추가로 치환됨); 또는 1- 또는 2-나프틸; 또는 1- 또는 2-페난트렌일로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 라디칼에 의해 1-, 2- 또는 3-치환될 수 있다. 알킬렌다이옥시는 페닐의 두 인접한 탄소 원자에 부착된 2가의 치환체, 예를 들어, 메틸렌다이옥시 또는 에틸렌다이옥시이다. 옥시-C2-C3-알킬렌은 또한 페닐의 두 인접한 탄소 원자에 부착된 2가의 치환체, 예를 들어, 옥시에틸렌 또는 옥시프로필렌이다. 옥시- C2-C3-알킬렌-페닐에 대한 예는 2,3-다이하이드로벤조퓨란-5-일이다.
알콕시, 페닐, 할로겐, 알킬 또는 트라이플루오로메틸에 의해 나프틸, 페닐 또는 페닐 일- 또는 이치환된, 특히 알콕시, 할로겐 또는 트라이플루오로메틸, 및 특히 페닐에 의해 페닐 또는 페닐-일 또는 이치환된 아릴이 바람직하다.
R로서 치환된 페닐의 예는, 예를 들어, 헤테로사이클릭 고리에서 선택적으로 치환된 4-클로로펜-1-일, 3,4-다이클로로펜-1-일, 4-메톡시펜-1-일, 4-메틸펜-1-일, 4-아미노메틸펜-1-일, 4-메톡시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-하이드록시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-하이드록시에틸-(메틸)-아미노메틸펜-1-일, 3-아미노메틸펜-1-일, 4-N-아세틸아미노메틸펜-1-일, 4-아미노펜-1-일, 3-아미노펜-1-일, 2-아미노펜-1-일, 4-페닐-펜-1-일, 4-(이미다졸-1-일)-페닐, 4-(이미다졸-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(몰폴린-1-일)-펜-1-일, 4-(몰폴린-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(2-메톡시에틸아미노메틸)-펜-1-일 및 4-(피롤리딘-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(티오페닐)-펜-1-일, 4-(3-티오페닐)-펜-1-일, 4-(4-메틸피페라진-1-일)-펜-1-일 및 4-(피페리딘일)-페닐 및 4-(피리딘일)-페닐이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "아릴렌"은 적어도 2개의 다른 기를 연결하는 상기 정의된 바와 같은 아릴기를 지칭한다. 아릴렌에 연결된 두 모이어티는 아릴렌의 상이한 원자에 연결된다. 아릴렌기는 페닐렌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "아릴렌-옥시"는 아릴렌에 연결된 모이어티 중 하나가 산소 원자를 통해 연결된 상기 정의된 바와 같은 아릴렌기를 지칭한다. 아릴렌-옥시기는 페닐렌-옥시를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
유사하게, 아릴 및 헤테로아릴기에 대한 치환체는 변하며, 방향족 고리계 상의 개방 원자가가 0 내지 총 수의 범위에 있는 수로 -할로겐, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO2, -CO2R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"C(O)2R', -NR'-C(O)NR"R"', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, 퍼플루오로(C1-C4)알콕시 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며; 여기서 R', R" 및 R"'은 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환 아릴 및 헤테로아릴, (비치환 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환체 중 둘은 선택적으로 화학식 -T-C(O)-(CH2)q-U-의 치환체로 대체될 수 있되, T 및 U는 독립적으로 -NH-, -O-, -CH2- 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 2의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환체 중 둘은 선택적으로 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환체로 대체될 수 있되, A 및 B는 독립적으로 -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 3의 정수이다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환체 중 둘은 선택적으로 화학식 -(CH2)s-X-(CH2)t-의 치환체로 대체될 수 있으며, 여기서 s 및 t는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- 또는 -S(O)2NR'-이다. -NR'- 및 -S(O)2NR'-에서 치환체 R'는 수소 또는 비치환 (C1-C6)알킬로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "헤테로아릴"은 5 내지 16개의 고리 원자를 함유하는 단환식 또는 축합된 이환식 또는 삼환식 방향족 고리 조립체를 지칭하며, 고리 원자 중 1 내지 4개는 각각 N, O 또는 S의 헤테로원자이다. 예를 들어, 헤테로아릴 피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살린일, 퀴놀린일, 아이소퀴놀린일, 벤조티엔일, 벤조퓨란일, 퓨란일, 피롤릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티엔일, 또는, 예를 들어, 알킬, 나이트로 또는 할로겐으로 치환된, 특히 일- 또는 이-치환된 임의의 다른 라디칼을 포함한다. 피리딜은 2-, 3- 또는 4-피리딜, 유리하게는 2- 또는 3-피리딜을 나타낸다. 티엔일은 2- 또는 3-티엔일을 나타낸다. 퀴놀린일은 바람직하게는 2-, 3- 또는 4-퀴놀린일을 나타낸다. 아이소퀴놀린일은 바람직하게는 1-, 3- 또는 4-아이소퀴놀린일을 나타낸다. 벤조피란일, 벤조티오피란일은 각각 바람직하게는 3-벤조피란일 또는 3-벤조티오피란일을 나타낸다. 티아졸릴은 바람직하게는 2- 또는 4-티아졸릴, 가장 바람직하게는, 4-티아졸릴을 나타낸다. 트라이아졸릴은 바람직하게는 1-, 2- 또는 5-(1,2,4-트라이아졸릴)이다. 테트라졸릴은 바람직하게는 5-테트라졸릴이다.
바람직하게는, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 퀴놀린일, 피롤릴, 티아졸릴, 아이소옥사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티엔일, 퓨란일, 벤조티아졸릴, 벤조퓨란일, 아이소퀴놀린일, 벤조티엔일, 옥사졸릴, 인다졸릴, 또는 치환된, 특히 일- 또는 이-치환된 임의의 라디칼이다.
용어 "헤테로알킬"은 1 내지 3개의 헤테로원자, 예컨대, N, O 및 S를 갖는 알킬기를 지칭한다. B, Al, Si 및 P를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 추가적인 헤테로원자가 또한 유용할 수 있다. 헤테로원자는 또한, 이하로 제한되는 것은 아니지만, -S(O)- 및 -S(O)2-와 같이 산화될 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬은 에터, 티오에터, 알킬-아민 및 알킬-티올을 포함할 수 있다.
용어 "헤테로알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기를 연결하는 상기 정의한 바와 같은 헤테로알킬기를 지칭한다. 헤테로알킬렌에 연결된 두 모이어티는 헤테로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "친전자체"는 친전자성 중심, 즉, 친핵체와 반응할 수 있는 전자 추구 중심을 갖는 이온성일 수 있는 이온 또는 원자 또는 원자의 중심을 지칭한다. 친전자체(또는 친전자성 시약)는 반응 상대로부터의 결합 전자를 둘 다 수용함으로써 반응 상대(친핵체)에 대한 결합을 형성하는 시약이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "친핵체"는 친핵성 중심, 즉, 친전자성 중심을 추구하거나 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온성일 수 있는 이온 또는 원자 또는 원자의 수집물을 지칭한다. 친핵체(또는 친핵성 시약)는 결합 전자를 둘 다 공여함으로써 반응 상대(친전자체)에 대한 결합을 형성하는 시약이다. "친핵성 기"는 반응기와 반응한 후의 친핵체를 지칭한다. 비제한적 예는 아미노, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "말레이미도"는 하기 구조를 갖는 피롤-2,5-다이온-1-일기를 지칭한다:
Figure pct00002
설프하이드릴(예를 들어, 티오 알킬)과 반응 시 하기 구조를 갖는 -S-말레이미도기를 형성한다,
Figure pct00003
여기서 "
Figure pct00004
"는 말레이미도기에 대한 부착지점을 나타내고, "
Figure pct00005
"는 본래의 설프하이드릴 보유기의 나머지에 대한 티올 황 원자의 부착 지점을 나타낸다.
본 개시내용의 목적을 위해, 단백질 및 폴리펩타이드에서 발견되는 "천연 유래 아미노산"은 L-알라닌, L-알기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루타민, L-글루탐산, L-글리신, L-히스티딘, L-아이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신 및 또는 L-발린이다. 단백질에서 발견되는 "비-천연 유래 아미노산"은 천연 유래 아미노산으로서 열거된 것 이외의 임의의 아미노산이다. 비-천연 유래 아미노산은 천연 유래 아미노산의 D 이성질체, 및 천연 유래 아미노산의 D와 L 이성질체의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 아미노산, 예컨대, 4-하이드록시프롤린, 데스모신, 아이소데스모신, 5-하이드록시라이신, 엡실론-N-메틸라이신, 3-메틸히스티딘은 천연 유래 단백질에서 발견되지만, 본 개시내용의 목적을 위한 단백질에서 발견되는 비-천연 유래 아미노산인 것으로 간주되는데, 이들이 일반적으로 mRNA의 리보솜 번역 이외의 수단에 의해 도입되기 때문이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 중합체의 기하학, 구조 또는 전반적 구조에 관해 "선형"은 단일 중합체 아암을 갖는 중합체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 중합체의 기하학, 구조 또는 전반적 구조에 관해 "분지형"은 개시제 내에 함유된 코어 구조로부터 연장되는 2개 이상의 중합체 "아암"을 갖는 중합체를 지칭한다. 개시제는 원자 이동 라디칼 중합(ATRP) 반응에서 사용될 수 있다. 분지형 중합체는 2개의 중합체 쇄(아암), 3개의 중합체 아암, 4개의 중합체 아암, 5개의 중합체 아암, 6개의 중합체 아암, 7개의 중합체 아암, 8개의 중합체 아암, 9개 이상의 중합체 아암을 가질 수 있다. 각각의 중합체 아암은 중합체 개시 부위로부터 연장된다. 각각의 중합체 개시 부위는 단량체 첨가에 의해 중합체 쇄의 성장을 위한 부위일 수 있다. 예를 들어 그리고 제한 없이, ATRP를 이용하여, 개시제 상의 중합체 개시 부위는 전형적으로 전이 금속 화합물, 예컨대, 할로겐화제1구리에 의해 촉매된 가역적 산화환원 공정을 겪는 유기 할로겐화물이다. 바람직하게는, 할로겐화물은 브로민이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "약제학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고 환자에 대해 유의한 유해 독성 효과를 야기하지 않으며, 특히 인간의 치료용으로 FDA에서 승인되거나 승인 가능한 부형제를 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 비제한적 예는 물, NaCl, 정상 식염수 용액, 락트산 링거, 정상 수크로스, 정상 글루코스 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "OG1786"은 트라이플루오로아세트산과의 OG1786 염 형태를 도시하는, 도 2d에 나타내는 구조로 중합체 합성을 위해 사용한 9-아암 개시제이다. OG1786은 다른 염으로서 또는 유리 염기로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "OG1801"은 단량체 HEMA-PC를 이용하여 ATRP 합성을 위한 개시제로서 OG1786을 이용하여 생성된 대략(+/- 15%) 750kDa의 중합체(Mn 또는 Mp에 의함)이다. OG1801의 구조를 도 2j에 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "OG1802"는 말레이미드 작용기가 더해진 OG1801이며, 도 2k에 나타낸 구조를 갖되, 중합체의 총 분자량이 (Mw) 750,000 ± 15% 달톤이 되도록 각각의 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 정수(양수)(0 내지 최대 약 3000)이다. 용어 OG1802가 단백질 용어(예컨대, VEGF 트랩 또는 항-IL-6 항체)를 변형시키는 데 사용될 때, 단백질은 접합 단백질이라는 것을 표기한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서로 조절할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전체적으로, 단어 "포함한다(comprise)" 또는 변형, 예컨대, "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹의 제외를 의미하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 용어 "예컨대" 또는 "예를 들어" 다음의 임의의 예(들)는 완전하거나 제한적인 것을 의미하지는 않는다.
단수 형태의 독립체는 하나 이상의 해당 독립체를 지칭하며; 예를 들어, 화합물은 하나 이상의 화합물 또는 적어도 하나의 화합물을 지칭한다. 이렇게 해서, 단수 형태의 용어, "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "약"은 상이한 기기, 샘플 및 샘플 제조에서 취한 측정에서 보게 될 변동을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, CDR 위치는 설명할 때 가변 도메인의 출현 순서에 따른다. 예를 들어, 중쇄 위치는 S35H 또는 G66D로서 기재될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, Fc 위치는 EU 넘버링으로 기재되거나 언급될 때 EU 넘버링에 따른다. 예를 들어, 항체의 돌연변이는 EU 넘버링에 따라 L234A 또는 L235A로서 기재될 수 있다. 위치는 또한 특정 서열번호 또는 본 명세서에 제공된 서열 내의 구체화된 위치에 따라 정의될 수 있다.
다중각 광산란(MALS)은 거대분자를 분석하는 기법이며, 레이저 광은 분자에 영향을 미치며, 광의 진동 전기장은 그 안에서 진동 쌍극자를 유도한다. 이런 진동 쌍극자는 광을 재방사시키고, MALS 검출기, 예컨대, 와이어트 미니다운 트레오스(Wyatt miniDawn TREOS)를 이용하여 측정될 수 있다. 방사된 광의 강도는 거대분자에서 유도된 쌍극자의 규모에 따르며, 이는 결국 거대 분자의 분극률, 레이저, 유도된 쌍극자 및 그에 따른 산란광의 보다 큰 강도에 비례한다. 따라서, 이러한 거대분자 용액으로부터의 산란을 분석하기 위해, 주위 매질(예를 들어, 용매)에 대한 이들의 분극률을 알아야 한다. 이는 와이어트 옵틸랩(Wyatt Optilab) T-rEX　시차 굴절계를 이용하여 dn/dc (=Δn/Δc) 값을 측정함으로써 분자 농도 변화인 Δc와 함께 용액의 굴절률　n　 변화인 Δn의 측정으로부터 결정될 수 있다. MALS 결정이 사용하는 두 가지의 몰 중량 파라미터는 수 평균 분자량(Mn) 및 중량 평균 분자량(Mw)이며, 다분산지수(PDI)는 Mw을 Mn으로 나눈 것과 동일하다. SEC는 또한 SEC에서 가장 높은 피크의 분자량으로서 정의되는 피크 분자량 Mp의 다른 평균 분자량 결정을 가능하게 한다.
PDI는 다분산 생체중합체(예를 들어, OG1802)에 대한 별개 단백질의 접합으로부터 유래된 중합체 및 생체중합체의 분자량 분포의 퍼짐(broadness) 측정으로서 사용된다. 단백질 샘플에 대해, 이의 다분산도는, 용액 중의 모든 단백질 분자가 거의 동일한 길이 및 몰량을 갖는 것으로 예상되는 번역 생성물이라는 사실 때문에 대략 1.0이다. 대조적으로, 중합체 쇄의 다양한 길이가 중합 과정 동안 합성되는 경우 생체중합체의 다분산 특성에 기인하여, 샘플의 PDI를 결정하는 것은 매우 중요한데, 이의 특성 중 하나가 좁은 분자량 분포에 기여하기 때문이다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 중의 분자가 이들의 크기에 따라 분리되는 크로마토그래피 기법이다. 전형적으로, 수용액은 다양한 기공 크기의 수지와 함께 패킹된 칼럼을 통해 샘플을 수송하도록 적용된다. 수지는 칼럼을 통과할 때 분석물에 대해 비활성인 것으로 예상되며, 분석물은 이들의 독특한 크기 및 선택된 칼럼의 기공 크기 특징에 기반하여 서로로부터 분리된다.
SEC와 MALS 또는 SEC/MALS의 결합은 SEC 교정 표준 세트에 대한 신뢰와 대조적으로 몰질량 및 크기(제곱 평균 제곱근 반지름)의 정확한 분포를 제공한다. 이 유형의 배열은 전통적인 칼럼 교정 방법 이상으로 다수의 이점을 가진다. 광산란 및 농도는 각각의 용리 분획에 대해 측정되기 때문에, 몰량 및 크기는 독립적으로 용리 위치와 독립적으로 결정될 수 있다. 이는 비구형 거대분자, 예컨대, 생체중합체(OG1802) 또는 생체접합체를 갖는 종에 대해 특히 적절하며; 이러한 종은 전형적으로 칼럼 교정 표준의 세트에 의해 기재될 수 있는 방식으로 용리시키지 않는다.
일부 실시형태에서, SEC/MALS 분석은 얼라이언스(Alliance) 2695 용매 전달 모듈을 갖는 워터스(Waters) HPLC 시스템 및 Shodex SEC-HPLC 칼럼(7.8×300㎜)을 구비한 워터스 2996 포토다이오드 어레이 검출기를 포함한다. 이는 와이어트 미니다운 트레오스 및 와이어트 옵틸랩(Wyatt Optilab) T-rEX 시차 굴절계과 온라인 연결되어 있다. 워터스사로부터의 엠파워(Empower) 소프트웨어는 워터스 HPLC 시스템을 제어하기 위해 사용될 수 있고, 와이어트사로부터의 ASTRA V 6.1.7.16 소프트웨어는 와이어트 미니다운 트레오스로부터의 MALS 데이터, T-rEX 검출기로부터의 dn/dc 데이터 및 워터스 2996 광다이오드 어레이 검출기로부터의 A280 흡광도 신호를 이용하는 질량 회수 데이터를 획득하는 데 사용될 수 있다. SEC는 샘플 주사 시 1×PBS pH 7.4에서 1㎖/분으로 수행될 수 있고, MALS 및 RI 신호는 절대 몰질량(Mp, Mw, Mn) 및 다분산지수(PDI)의 결정을 위해 ASTRA 소프트웨어에 의해 분석될 수 있다. 추가로, 계산은 또한 중합체 및 단백질에 대해 각각 0.142 및 0.183의 입력 dn/dc 값을 수반한다. 생체접합체 dn/dc 값에 대해, dn/dc는 이하의 식을 이용하여 중합체 및 단백질의 중량 MW가 약 0.148이 되는 것에 기반하여 계산된다:
Figure pct00006
SEC-MALS에 의해 측정된 OG1802에 대한 MW중합체.r 이 약 800kDa이고 SEC-MALS에 의해 측정된 항-IL-6에 대한 MW단백질이 약 145kDa인 경우, SEC-MALS에 의해 측정된 생체접합체의 예상되는 총 분자량은 약 1000kDa이다. 항IL-6 VEGF Trap 또는 VEGF Trap-항IL-6에 대한 MW단백질은 약 192kDa이며, 생체접합체의 예상된 총 분자량은 1000 내지 1100kDa이다.
예시적인 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
I. IL-6 길항 항체, IL-6 Ab-VEGF 트랩 및/또는 이의 접합체
본 명세서에서 IL-6에 의해 매개되는 하류의 사건을 포함하는 IL-6 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나 또는 감소시키는(유의하게 감소시키는 것을 포함) 항-IL-6 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 본 명세서에 제공된 본 명세서에 제공된 CDR 서열 중 하나 이상을 가질 것이다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항체는 IL-6에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 항체는 바람직하게는 IL-6 신호전달 기능을 저해하는 방식으로 IL-6과 반응한다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 영장류 IL-6에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 유용한 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이성 항체, 이형접합체 항체, 단일쇄(ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분(예를 들어, 도메인 항체)을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유적으로 변형된 항체를 포함하는 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체배치를 포함할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간 또는 임의의 다른 유래(키메라 또는 인간화된 항체를 포함)일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2 또는 도 5에 나타낸 바와 같은 중쇄 아미노산 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 나타난 것의 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 표에 나타낸 것의 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공된다. 항체는 효과기 기능을 감소시키기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 돌연변이는 보체 캐스케이드와 관련된 항체의 효과기 기능, 예를 들어, 보체 캐스케이드의 감소된 활성화를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 효과기 기능의 감소는 적어도 약 50%이다.
일부 실시형태에서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 IL-6에 특이적으로 결합하는 단리된 길항 항체가 제공되되, 항체는 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링에 기반함)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항체는 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이를 갖는 단리된 길항 항체는 FC 감마 수용체 또는 C1q에 대해 최소화된 결합을 가진다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A를 갖는 단리된 길항 항체는 FC 감마 수용체 또는 C1q에 대해 최소화된 결합을 가진다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 돌연변이(들)는 다음의 아미노산 위치 중 하나 이상에 위치된다(EU 넘버링): E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 돌연변이(들)는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공된다. 중쇄 불변 도메인은 재조합 DNA 기술에 의해 도입된 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 Q347C 및 L443C(EU 넘버링)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 L443C(EU 넘버링)이다.
일부 실시형태에서, 항체는 다음의 돌연변이(EU 넘버링) L234A, L235A 및 G237A 모두 셋을 포함하고, 항체는 L443C(EU 넘버링)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG1이고, 항체의 중쇄 불변 도메인은 면역-매개 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표 1A 및 1B, 및/또는 11.3 중 임의의 하나 이상에서 아미노산 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 중복되는 인간 IL-6 상의 에피토프에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, cys을 가지면서 해당 시스테인을 통해 중합체에 연결된 IL-6 항체가 제공된다(본 명세서의 화학식 17에 나타낸 바와 같음).
일부 실시형태에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체는 C-말단의 라이신이 있거나 없는, 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일하며, CDR 내에 있지 않은 잔기 내 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 도 5의 HCDR1, 도 5의 HCDR2, 도 5의 HCDR3; 도 5의 LCDR1, 도 5의 LCDR2, 도 5의 LCDR3 중 하나 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 모두 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-6에 결합하는 항체가 제공되되, 상기 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 CDRH1인 CDRH1, 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 CDRH2인 CDRH2, 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 CDRH3인 CDRH3, 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 CDRL1인 CDRL1, 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 CDRL2인 CDRL2, 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 CDRL3인 CDRL3, 다음의 돌연변이 중 적어도 하나: EU 넘버링에 기반한 L234A, L235A 및 G237A, 및 다음의 돌연변이 중 적어도 하나: EU 넘버링에 기반한 Q347C 또는 L443C를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공된다. 항체의 중쇄 가변 영역은 표 1A에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체의 경쇄 가변 영역은 표 1B에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 도 5에서 확인되는 서열 중 하나 이상, 예를 들어, CDRS 중 하나 이상(박스 CDR 중 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함) 및/또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 함유하는 것이다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체는 표 1A에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 표 1B에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공된다. VH는 표 1A에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 영역은 표 1B에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체는 표 1B에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에서 하나의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체는 표 1A에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에서 수개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항체가 제공되되, 항체는 C-말단의 라이신을 갖는 표 1A에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 표 1B에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항체가 제공되되, 항체는 C-말단의 라이신이 없는 표 1A에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 표 1B에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
IL-6 길항 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 인간 및 마우스 항체의 생성을 위한 일반적 기법은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본 명세서에 기재되어 있다.
IL-6 길항제 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인되거나 특성규명될 수 있고, 이에 의해 IL-6 생물학적 활성의 감소, 개선 또는 중화가 검출되고/되거나 측정된다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 IL-6과 함께 후보 항체를 인큐베이션시키고, IL-6R에 대한 결합 또는 gp130에 대한 IL-6/IL-6R 결합 및/또는 IL-6의 생물학적 활성의 수반되는 감소 또는 중화를 모니터링함으로써 확인된다. 결합 분석은, 예를 들어, 정제된 IL-6 폴리펩타이드(들)를 이용하여, 또는 자연적으로 발현되는 세포(예를 들어, 다양한 균주)에 의해 수행될 수 있거나, IL-6 폴리펩타이드(들)를 발현시키도록 형질감염된다. 일 실시형태에서, 결합 분석은 경쟁적 결합 분석이며, 여기서 IL-6 결합을 위해 후보 항체가 공지된 IL-6 길항 항체와 경쟁하는 능력이 평가된다. 분석은 ELISA 형식을 포함하는 다양한 형식으로 수행될 수 있다.
초기 확인 후에, 후보 IL-6 길항 항체의 활성은 표적화된 생물학적 활성을 검사하기 위해 공지된 생체 분석에 의해 추가로 확인되고 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험관내 세포 분석은 후보 IL-6 길항 항체를 추가로 특성규명하는 데 사용된다.
IL-6 길항 항체는 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 특성규명될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 이것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌[Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기재된 바와 같이 항체-항원 복합체의 결정 구조 해결, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석 및 합성 펩타이드-기반 분석을 비롯한, 단백질 상의 에피토프 위치를 맵핑하거나 특성규명하기 위한 당업계에 공지된 다수의 방법이 있다. 추가적인 예에서, 에피토프 맵핑은 IL-6 길항 항체가 결합하는 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. IL-6 길항 항체 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어, 펩스칸 시스템즈(Pepscan Systems)로부터 상업적으로 이용 가능하다(Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). 에피토프는 선형 에피토프일 수 있고, 즉, 아미노산의 단일 신장, 또는 단일 신장에서 반드시 함유되지 않을 수도 있는 아미노산의 3차 상호작용에 의해 형성된 입체형태 에피토프에 함유될 수 있다. 다양한 길이의 펩타이드(예를 들어, 적어도 4 내지 6개의 아미노산 길이)는 단리되거나(예를 들어, 재조합적으로) 합성될 수 있고 IL-6 길항 항체를 이용한 결합 분석을 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, IL-6 길항 항체가 결합하는 에피토프는 IL-6 서열로부터 유래된 중복 펩타이드를 이용하고, IL-6 길항 항체에 의한 결합을 결정함으로써, 전신 선별에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 분석에 따르면, IL-6을 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 무작위로 또는 특정 유전자 작제물에 의해 단편화되고, 시험될 항체와 IL-6의 발현된 단편의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들어, PCR에 의해 생성될 수 있고, 이어서, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내 단백질로 전사되고 번역된다. 이어서, 방사성 표지된 IL-6 단편에 대한 항체의 결합은 면역침전 및 겔 전기영동법에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자(파지 라이브러리) 또는 효모(효모 디스플레이) 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩타이드 서열의 거대 라이브러리를 이용함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 중복 펩타이드 단편의 정해진 라이브러리는 단순 결합 분석에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가적인 예에서, 항원의 돌연변이유발, 도메인 교환 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 에피토프 결합에 필요하고/하거나 충분하고/하거나 필수적인 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 실험은 돌연변이체 IL-6을 이용하여 수행될 수 있으며, 이때 IL-6 폴리펩타이드의 다양한 잔기는 알라닌으로 대체되었다. 돌연변이체 IL-6에 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 IL-6 잔기의 중요성이 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체는 약 0.01pM 내지 약 10nM의 친화도로 인간 IL-6에 결합한다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체는 약 0.1pM 내지 약 2nM의 친화도로 인간 IL-6에 결합한다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체는 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000pM의 친화도로 인간 IL-6에 결합한다.
IL-6에 대한 IL-6 길항 항체의 결합 친화도(KD)는 약 0.001 내지 약 200nM일 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 친화도는 약 200nM, 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 20pM, 약 15pM, 약 10pM, 약 5pM, 약 2pM, 또는 약 1pM 중 어느 것이다. 일부 실시형태에서, 결합 친화도는 약 250nM, 약 200nM, 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 약 50pM, 약 20pM, 약 10pM, 약 5pM, 약 2pM, 약 1pM, 약 0.5pM, 약 0.1pM, 약 0.05pM, 약 0.01pM, 약 0.005pM, 또는 약 0.001pM 중 어느 것 미만이다.
일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체는 37도에서 적어도 5.0E-03인 Koff로 인간 IL-6에 결합한다. 일부 실시형태에서, koff는 5E-04이다. 일부 실시형태에서, 단리된 길항 항-IL-6 항체가 제공되되, 항체는 37도에서 5.0E-04보다 양호한 Koff로 인간 IL-6에 결합한다.
일부 실시형태에서, 결합 친화도는 결합 상수(ka), 해리상수(kd), 및 절반의 최대 결합력(KD)을 달성하는 분석물 농도 중 하나 이상에 관해 정해질 수 있다. 일부 실시형태에서, ka는 약 0.50E+05 내지 약 5.00E+08의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, kd는 약 0.50E-06 내지 약 5.00E-03의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, KD는 약 0.50E-12 내지 약 0.50E-07의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 접합체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 액체이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 내독소 수준이 약 0.2 EU/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 액체이며, 내독소 수준은 약 0.2 EU/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 액체이며, 내독소 수준은 약 2.0, 1, 0.5, 0.2 EU/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 유리체강내 주사에서, 내독소 한계는 0.01 내지 0.02 EU/주사/눈이다.
일부 실시형태는 다음 중 어느 것, 또는 표 1A 및 표 1B에서 발견되는 바와 같은 부분적 경쇄 서열 및 부분적 중쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물(약제학적 조성물을 포함)을 제공한다. 표 1A 및 표 1B에서, 밑줄표시된 서열은 본 명세서에 제공된 바와 같은 CDR 서열의 일부 실시형태이다.
[표 1A]
Figure pct00007
[표 1B]
Figure pct00008
일부 실시형태에서, 항체는 다음의 CDR 중 하나 이상(또는 어느 것)을 갖지 않는다, 표 1E(표 1E1, 표 1E2 및/또는 표 1E3을 포함함).
[표 1E1]
Figure pct00009
[표 1E2]
Figure pct00010
[표 1E3]
Figure pct00011
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물은 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 제공된 임의의 옵션으로부터의 부분적 또는 완전한 경쇄 서열 및 부분적 또는 완전한 중쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체(또는 이의 결합 단편)는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 제공된 CDR 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체(또는 이의 결합 단편)는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 제공된 CDR 중 임의의 셋 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체(또는 이의 결합 단편)는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 제공된 CDR 중 임의의 여섯 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중쇄 및/또는 경쇄는, 예를 들어, 도 5, 18, 및/또는 21 내지 24 및 표 0.1, 표 0.2, 표 1A, 및/또는 표 1E에 제공된 것을 포함하는 본 명세서에 제공된 다른 항체 작제물 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물은 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 제공된 임의의 옵션으로부터의 부분적 또는 완전한 경쇄 CDR 서열 및 부분적 또는 완전한 중쇄 CDR 서열을 갖는 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체의 CDR 부분이 또한 제공된다. CDR 영역의 결정은 당업계의 기술 내에서 용이하다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT와 파라톰 CDR의 조합("조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"로도 지칭됨)일 수 있다는 것이 이해된다. CDR의 결정은 당업계의 기술 내에서 용이하다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT CDR이다. 다른 실시형태에서, CDR은 파라톰 CDR이다. 다른 실시형태에서, CDR은 연장, AbM, 입체형태, 카바트 또는 코티아 CDR이다. 하나 초과의 CDR에 의한 실시형태에서, CDR은 임의의 IMGT, 파라톰, 연장, 카바트, 코티아, AbM, 입체형태 CDR 또는 이들의 조합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다른 CDR 정의가 또한 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 정의 중 2, 3, 4, 5, 6 또는 7가지 간에 공통된 잔기만이 사용될 수 있다(더 짧은 서열을 야기함). 일부 실시형태에서, 상기 정의 중 임의의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에서 임의의 잔기가 사용될 수 있다(더 긴 서열을 야기함).
일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 나타낸 중쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2에 나타낸 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 표 1A에 나타낸 중쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR, 및 표 1B에 나타낸 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR은 이하의 표 0.1(표 0.1A 및/또는 0.1B를 포함) 또는 0.2(표 0.1A 및/또는 0.1B를 포함)에 표기된 것 중 하나 이상이다:
[표 0.1A]
Figure pct00012
[표 0.1B]
Figure pct00013
[표 0.2A]
Figure pct00014
[표 0.2B]
Figure pct00015
일부 실시형태에서, IL-6에 대한 결합을 위해 사용되는 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 서열 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-6에 대한 결합을 위해 사용되는 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2의 서열 중 셋 이상을 포함하는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-6에 대한 결합을 위해 사용되는 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2 중 어느 하나에서 서열 중 여섯을 포함하는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-6에 결합하는 항체는 표 1A, 표 1B, 표 0.1 및/또는 표 0.2 중 어느 하나에서 구체화된 CDR 중 6개를 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 VEGF Trap 서열에 연결되거나 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 Trap 서열은 표 1C에 나타낸 바와 같을 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열은 표 1C에 나타낸 것과 적어도 80% 동일하고, 예를 들어, 표 1C에 나타낸 것과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 미국 특허 공개 제20150376271호에서 임의의 VEGF Trap 분자는 본 명세서에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, VEGF Trap 서열은 다음의 방식 중 하나로: IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 N-말단 단부에(도 6, 좌측), 또는 힌지 영역과 IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 CH1 도메인 다음 사이에서(도 6, 우측), IL-6에 융합된다. 달리 표기되지 않는 한, 대안의 옵션은 둘 다 함께 본 명세서에 제공된 실시형태에 대해 상정되며, 임의의 Ab-Trap 융합이 논의된다. 일부 실시형태에서, 용어 "Trap"은 적어도 하나의 VEGF와 VEGFR 사이의 신호전달을 길항할 수 있는 상이한 VEGF 수용체로부터의 전장 세포외 영역 또는 이의 임의의 부분, 또는 부분의 조합을 지칭한다. 바람직하게는, 세포외 트랩 세그먼트는 VEGFR-1, -2 또는 -3 중 하나로부터의 적어도 하나의 도메인, 및 더 바람직하게는 적어도 2개의 인접한 도메인, 예컨대, D2 및 D3을 포함한다. 선택적으로, 세포외 도메인은 적어도 2개의 상이한 VEGFR로부터의 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 바람직한 세포외 도메인은 VEGFR-1의 D2 및 VEGFR-2의 D3을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
[표 0.1C]
Figure pct00016
일부 실시형태에서, IL-6 Ab VEGF Trap 작제물은 표 1D에 제공된 임의의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 표 1D의 서열, 예를 들어, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상에 대해 적어도 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 항체 IL-6 도메인이 표 1E의 CDR 중 하나 이상을 함유하지 않는다는 것을 제외하고, 해당 백분율에 따를 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 VEGF Trap 서열(표 1C)과 마찬가지로, 도 5에서 확인되는 서열 중 하나 이상, 예를 들어, CDRS 중 하나 이상(박스 CDR 중 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함) 및/또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 함유하는 것이다. 일부 실시형태에서, 서열은 서로 직접 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 가요성 연결 서열 또는 부문이 사용될 수 있다. 연결 서열은 Ab 서열과 VEGF Trap 서열 사이에 위치될 수 있다. 이들 서열은 길이가 5 내지 30개의 아미노산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결 서열은 약 4:1의 비로 G 및 S를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 다음의 서열을 포함한다: GGGGSGGGGS (서열번호 115). 일부 실시형태에서, 임의의 가요성 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Il-6 Ab의 Fc 부분은 IgG1이다.
[표 1D]
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
본 명세서에 제공된 항-IL-6 항체 및/또는 IL-6 VEGF Trap을 발현시키기 위해, 기재된 VH 및 VL 영역을 암호화하는 DNA 단편이 처음 얻어질 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 다양한 변형, 예를 들어, 돌연변이, 결실 및/또는 첨가가 또한 DNA 서열에 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발은 표준 방법, 예컨대, PCR-매개 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있으며, 이때 PCR 산물이 목적하는 돌연변이 또는 부위 지정 돌연변이유발을 함유하도록 돌연변이된 뉴클레오타이드는 PCR 프라이머에 혼입된다.
본 발명은 본 명세서에 나타난 가변 영역에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 가변 영역 및 CDR뿐만 아니라 향상된 또는 감소된 활성 및/또는 친화도를 갖는 변이체를 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열은 IL-6에 대해 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 얻도록 돌연변이될 수 있다. 폴리펩타이드의 변형은 당업계의 일상적인 실행이며, 본 명세서에서 상세하게 기재할 필요는 없다. 변형된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능성 활성을 유의미하게 해롭게 변화시키지 않거나, 이의 리간드에 대한 폴리펩타이드의 친화도를 성숙시키는(향상시키는) 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가, 또는 화학적 유사체의 사용을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기로부터 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단의 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단의 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환에서 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
치환 변이체는 제거되는 항체 분자 내 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 이의 자리에 삽입된 상이한 잔기를 가진다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 가장 큰 관심 대상 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경이 또한 상정된다. 보존적 치환은 표제 "보존적 치환" 하에 표 0.4에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래한다면, 표 0.4에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 대해 이하에 추가로 기재하는 바와 같은 더 실질적인 변화가 도입되고, 생성물이 선별될 수 있다.
[표 0.4]
Figure pct00023
항체의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격 구조를, 예를 들어, β-시트 또는 나선 입체형태로서, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지함에 있어서 이들의 효과와 유의하게 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 유래 잔기는 통상적인 측쇄 특성에 기반하여 하기의 그룹으로 나눈다:
(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 하전 없이 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성(음으로 하전됨): Asp, Glu;
(4) 염기성(양으로 하전됨): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환함으로써 이루어진다.
이루어질 수 있는 치환 중 한 가지 유형은, 예를 들어, 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 내 하나 이상의 시스테인을 다른 잔기, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 알라닌 또는 세린으로 바꾸는 것이다. 예를 들어, 비-정규 시스테인의 치환일 수 있다. 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스테인은 정규이다. 항체의 적절한 입체형태를 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 세린으로 치환되어 분자의 산화적 안정성을 개선시킬 수 있고, 비정상적 가교를 방지할 수 있다. 정반대로, 시스테인 결합(들)은 안정성을 개선시키기 위해, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에, 항체에 더해질 수 있다.
항체는 또한, 예를 들어, 항체의 결합 특성을 변경시키기 위해, 예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 변형될 수 있다. 가변 영역의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 1 이하 내지 5개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 생성된다. 다른 실시형태에서, 1 이하 내지 3개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 생성된다. 예를 들어, 돌연변이는 IL-6에 대한 항체의 KD를 증가 또는 감소시키기 위해, koff를 증가 또는 감소시키 위해 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 CDR 영역 중 하나 이상에서 생성될 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발의 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et　al. and Ausubel et　al., 상기 참조] 참조.
양상에 따르면, IL-6 길항 항체의 IgG 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다. 다른 양상에 따르면, IgG 도메인은 불변 영역이 상기 아이소타입 중 하나 이상으로부터 형성되는 복합체일 수 있다(예를 들어, IgG2 또는 IgG4로부터의 CH1 영역, 힌지, IgG1로부터의 CH2 및 CH3 영역). 아이소타입을 선택함에 있어서, 인간 아이소타입 IgGl 및 IgG3은 보체-매개 세포독성을 갖는 반면, 인간 아이소타입 IgG2 및 IgG4는 불량한 보체-매개 세포독성을 갖거나 전혀 갖지 않는다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 아이소타입은 IgG1이다.
경쇄 불변 영역은 인간 람다 또는 카파일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 인간 카파 경쇄 불변 영역을 가진다.
인간 불변 영역은 상이한 개체 간에 알로타이프(allotypic) 변이 및 아이소알로타이프 변이를 나타내며, 즉, 개체가 다른 경우에 하나 이상의 다형성 위치에서 불변 영역이 다를 수 있다. 아이소알로타이프를 인식하는 혈청이 하나 이상의 다른 아이소타입의 비-다형성 영역에 결합한다는 점에서 아이소알로타이프는 알로타이프와 다르다. 인간 불변 영역에 대한 언급은 임의의 천연 알로타이프를 갖는 불변 영역 또는 천연 알로타이프에서 다형성 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열 또는 이하에 기재하는 바와 같은 효과기 기능을 감소시키거나 증가시키기 위한 최대 3, 5 또는 10개의 치환을 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서 하나 또는 수개의 아미노산, 예컨대, 중쇄의 C-말단의 라이신은 분자의 일부 또는 모두에서 상실되거나 유도체화될 수 있다.
효과기 기능, 예컨대, 보체-매개 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 감소시키거나 증가시키기 위해(예를 들어, 윈터(Winter) 등의 미국 특허 제5,624,821호; 초(Tso) 등의 미국 특허 제5,834,597호; 및 라자르(Lazar) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해 불변 영역에서 치환이 이루어질 수 있다(예를 들어, 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 IL-6 길항 항체는 상보체 매개 세포독성을 감소시키는 하나 이상의 치환을 포함한다. 보체 매개 세포독성의 감소는 돌연변이(들)의 특성에 따라서 Fc 수용체 결합의 감소와 함께 또는 감소 없이 달성될 수 있다. 보체 매개 세포독성이 감소되지만 Fc 수용체의 감소가 거의 없거나 전혀 없는 항체는 부작용에 기여할 수 있는 보체를 활성화시키는 일 없이 iC3b의 Fc-매개의 목적하는 효과를 가능하게 한다. 인간 불변 영역에서 보체-매개 세포독성을 감소시키는 것으로 알려진 예시적인 돌연변이는 EU 넘버링에 의해 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 및 331번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 318, 320 및 322번 위치의 돌연변이는 마우스 항체에서 보체 활성화를 감소시키는 것으로 보고되었다. 알라닌은 돌연변이된 불변 영역에서 이들 위치를 점유하는 바람직한 잔기이다. 사용된 일부 예시적인 인간 돌연변이는 인간 IgG3에서 F241A, V264A, D265A, V296A, N297A, K322A 및 P331S 및 인간 IgGl에서 D270A 또는 E, N297Q, K322A, P329A 및 P331S(EU 넘버링)를 포함한다.
본 명세서의 다른 곳에서, 항체의 불변 영역에서 아미노산을 넘버링하기 위해 EU 넘버링 체계가 사용된다. 가변 영역 내 잔기가 본 명세서에서 언급될 때(달리 표기되지 않는 한), 잔기 넘버링은 가변 도메인에 따른다(또는, 표기된다면, 서열번호). 임의의 또는 모든 234, 235, 236 및/또는 237번 위치에서 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대해 친화도를 감소시키며, 또한 보체 결합 및 활성화를 감소시킨다(예를 들어, 미국 특허 제6,624,821호, WO/2009/052439). 234, 235 및 237번 위치에서 알라닌 치환은, 특히 인간 IgGl와 관련하여 효과기 기능을 감소시킨다. 선택적으로, 인간 IgG2에서 234, 236 및/또는 237번 위치는 알라닌으로 235번 위치에서 글루타민으로 치환된다. (예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 참조) Fc 수용체 결합을 감소시킴. 반감기를 증가시키기 위한 예시적인 치환은 250번 위치에서 Gln 및/또는 428번 위치에서 Leu을 포함한다. 본 발명의 양상에 따르면, 제시된 항-IL-6 항체가 인간 IgG1 아이소타입을 갖는 경우에, 항체는 불변 영역에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 돌연변이는 불변 영역에 의해 보체 고정 또는 활성화를 감소시킨다. 본 발명의 특히 바람직한 양상에서, 항체는 EU 넘버링에 의해 E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 훨씬 더 바람직하게는, 돌연변이는 EU 넘버링에 의해 다음의 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S 중 하나 이상을 구성한다. 가장 바람직한 실시형태에서, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 의해 다음의 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A를 가진다.
접합체
IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap의 반감기는 "반감기 연장 모이어티" 또는 "반감기 연장기"의 부착에 의해 연장될 수 있으며, 이 용어는 하나 이상의 아미노산 측쇄 작용기, 예컨대, -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2, 또는 하나 이상의 N- 및/또는 O-글리칸 구조에 부착되고 이들 단백질/펩타이드에 접합될 때 단백질/펩타이드의 생체내 순환 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 화학기를 지칭하기 위해 상호 호환적으로 사용된다. 반감기 연장 모이어티의 예는 본 명세서에 기재된 중합체, 특히 양쪽성 이온 단량체의 모이어티, 예컨대, HEMA-포스포릴콜린, PEG, 생체 적합 지방산 및 이의 유도체, 하이드록시 알킬 전분(HAS), 예를 들어, 하이드록시 에틸 전분(HES), 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(Glyx-Sery)(HAP), 히알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 플렉시머, 덱스트란, 폴리-시알산(PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 25 알부민, 엘라스틴 유사(ELP) 펩타이드, XTEN 중합체, PAS 중합체, PA 중합체, 알부민 결합 펩타이드, CTP 펩타이드, FcRn 결합 펩타이드 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 포스포릴콜린 함유 중합체와 접합된다. 일부 실시형태에서, 항체는 폴리(아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) 함유 중합체, 예컨대, 적어도 하나의 아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 단량체, 예컨대, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린(즉, 2-메타크릴로일-2'-트라이메틸암모늄 에틸 포스페이트)를 함유하는 아크릴산의 중합체와 접합된다.
일부 실시형태에서, 항체 및/또는 항체 VEGF Trap 융합은 물에서 가용성인 중합체를 지칭하는 수용성 중합체와 접합된다. 수용성 중합체의 용액은 여과 후 동일한 용액에 의해 전파되는 광의 적어도 약 75%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%의 광을 전파할 수 있다. 중량 기준으로, 수용성 중합체 또는 이의 세그먼트는 물에서 적어도 약 35%, 적어도 약 50%, 약 70%, 약 85%, 약 95% 또는 100%(건조 중합체의 중량으로) 가용성일 수 있다.
일 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스터를 이용하여 단백질의 유리 아미노기를 통해 IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap에 접합될 수 있다. 아민기에 대한 접합을 표적화하는 시약은 라이신의 ε-아민기, N-말단 아미노산의 α-아민기 및 히스티딘의 δ-아민기와 무작위로 반응할 수 있다.
그러나, 본 발명의 IL-6 길항 항체는 중합체 접합을 위해 이용 가능한 다수의 아민기를 가진다. 따라서, 유리 아미노기에 대한 중합체의 접합은 항체가 에피토프에 결합하는 능력에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다.
다른 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 말레이미드 화학, 또는 산화 후 IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap의 탄수화물 모이어티에 대한 중합체 혼성체 또는 중합체 아민의 결합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적절한 티올-반응 화학을 이용하여, 하나 이상의 유리 SH 기에 결합된다. 말레이미드 결합의 사용은 본 발명의 특히 바람직한 실시형태이다. 결합은 바람직하게는 자연적으로 존재하는 시스테인에서 일어나거나 유전자 조작을 통해 도입된다.
일부 실시형태에서, 중합체는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 내로 도입된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap의 Fc 부분에서 시스테인 잔기가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 영역 내로 시스테인 잔기를 도입하기 위한 부위는 본 명세서에 모든 목적을 위해 참조에 의해 원용되는 WO 2013/093809, 미국 특허 제7,521,541호, WO 2008/020827, 미국 특허 제8,008,453호, 미국 특허 제8,455,622호 및 미국 특허 제2012/0213705호에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 돌연변이는 카바트의 EU 색인에 의한 인간 IgG 중쇄에 관해 Q347C 및 L443C이다. 일부 실시형태에서, 후속적 중합체 부착에 대한 지정 돌연변이유발에 의해 첨가된 시스테인은 L443C이다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 대 중합체의 화학량론은 1:1이고; 다시 말해서, 접합체는 중합체의 하나의 분자에 접합된 IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 중 하나의 분자를 각각 포함하는 분자로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 결합은 하나 이상의 라이신에서 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서, 접합체는 IL-6에 특이적으로 결합하는 단리된 길항 항체를 포함하거나 또는 IL-6 Ab VEGF Trap은 중합체에 접합된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 양쪽성 이온 단량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 양쪽성 이온 단량체는, 제한 없이, HEMA-포스포릴콜린, PEG, 생체 적합 지방산 및 이의 유도체, 하이드록시 알킬 전분(HAS), 예를 들어, 하이드록시 에틸 전분(HES), 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(Glyx-Sery)(HAP), 히알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 플렉시머, 덱스트란, 폴리-시알산(PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 25 알부민, 엘라스틴 유사(ELP) 펩타이드, XTEN 중합체, PAS 중합체, PA 중합체, 알부민 결합 펩타이드, CTP 펩타이드 또는 FcRn 결합 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 양쪽성 이온 단량체를 포함하는 중합체는 반감기 연장 모이어티이다.
일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap은 부착된 반감기 연장 모이어티를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 양쪽성 이온 중합체이지만, 이하에 논의되는 PEG 또는 다른 반감기 연장제가 대안적으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 양쪽성 이온 중합체는 포스포릴콜린기를 갖는 단량체로 형성된다. 일부 실시형태에서, 단량체는 2-(아크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸)포스페이트이다. 일부 실시형태에서, 단량체는 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸) 포스페이트(HEMA-PC)이다.
일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap에 접합된 중합체는 적어도 2 또는 3개 이상의 아암을 가진다. 일부 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, 중합체는 3, 6 또는 9개의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, 중합체는 9개의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, 중합체 피크 분자량은 300,000 내지 1,750,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 피크 분자량이 500,000 내지 1,000,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 피크 분자량이 600,000 내지 800,000Da이다.
일부 실시형태에서, 길항적 항-IL-6 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap과 중합체의 접합체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 크기 배제 크로마토그래피 - 다중각 광산란(본 명세서에서 이후에 "SEC-MALS")에 의해 측정되는 바와 같이 피크 분자량이 300,000 내지 1,750,000 달톤이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 SEC-MALS에 의해 측정할 때 피크 분자량이 500,000 내지 1,000,000 달톤이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 SEC-MALS에 의해 측정할 때 피크 분자량이 600,000 내지 800,000 달톤이다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 본 명세서에 제공된 IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap의 천연 유래 시스테인 잔기에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 부위 지정 돌연변이유발을 통해 첨가된 시스테인에 접합된다. 일부 실시형태에서, 시스테인은 경쇄 또는 중쇄 중 하나의 C-말단에 펩타이드 SGGGC 또는 CAA를 첨가하기 위해 재조합 DNA 기술을 이용함으로써 첨가된다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 중쇄에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 기술을 통해 도입된 시스테인 잔기는 (EU 넘버링) Q347C 및 L443C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 및 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는 약제학적 조성물이 제시된다.
IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap(또는 본 명세서에 제공된 다른 작제물)은 (i) 유전자 조작에 의한 재조합 DNA의 생성, (ii) 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 형질감염, 전기천공법 또는 미량주사법에 의한 원핵 또는 진핵 세포 내로 재조합 DNA의 도입, (iii) 형질전환 세포의 배양, (iv) 항-IL-6 항체를, 예를 들어, 구성적으로 또는 유도 시 발현, 및 (v) 예를 들어, 배양 배지로부터 또는 형질전환 세포를 채취하는 것에 의한 항-IL-6 항체의 단리를 포함하는, 재조합 발현에 의해, (vi) 정제된 항-IL-6 항체를 얻기 위해, 생성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap과 중합체를 포함하는 접합체(뿐만 아니라 본 명세서에 제공된 다른 작제물, 예컨대, 생체접합체)가 제공된다. 항체 및/또는 Ab-Trap은 본 명세서에 개시된 항체 및/또는 Trap이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 설프하이드릴기에 공유결합된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 시스테인 잔기로부터의 설프하이드릴기에 공유결합된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 중쇄 상의 시스테인 잔기로부터의 설프하이드릴기에 공유결합된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 IgG의 중쇄 상의 시스테인 잔기로부터의 설프하이드릴기에 공유결합된다. 일부 실시형태에서, 항체는 347 또는 443(EU 넘버링)번 위치에서 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체는 347 또는 443(EU 넘버링)번 위치에서 시스테인 잔기로부터의 설프하이드릴기에 공유결합된다.
IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap은 약학적으로 허용 가능한 항-IL-6 항체 분자를 생성하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 발현에 의해 생성될 수 있다. 진핵 세포의 예는 포유류 세포, 예컨대, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip 및 HepG2이다. 다른 적합한 발현 시스템은 원핵(예를 들어, pET/BL21 발현 시스템을 갖는 이콜라이(E. coli)), 효모(사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및/또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 시스템) 및 곤충 세포이다. 일부 실시형태에서, 임의의 본 명세서에 개시된 항체 및/또는 Ab-Trap을 생성하는 단리된 세포주가 제공된다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포주는 CHO, k1SV, XCeed, CHOK1SV, GS-KO 중 하나 이상으로부터 선택되지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 항체 및/또는 Ab-Trap을 암호화하는 핵산이 제공된다. 일부 실시형태에서, 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함한다.
IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap의 제조를 위해 다양한 벡터가 사용될 수 있으며, 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 원핵 발현을 위한 벡터의 예는 플라스미드, 예컨대, 제한 없이, 프리셋(preset), 페트(pet) 및 패드(pad)를 포함하되, 원핵 발현 벡터에서 사용되는 프로모터는, 이하로 제한되지 않고, lac, trc, trp, recA 또는 araBAD 중 하나 이상을 포함한다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예는, 이하로 제한되지 않고: (i) 효모에서 발현을 위해, 프로모터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고, AOX1, GAP, GAL1 또는 AUG1을 이용하여, 벡터 예컨대, 이하로 제한되지 않고, pAO, pPIC, pYES 또는 pMET; (ii) 곤충 세포에서 발현을 위해, 프로모터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 또는 polh를 이용하여 벡터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고, pMT, pAc5, pIB, pMIB 또는 pBAC, 및 (iii) 포유류 세포에서 발현을 위해, 프로모터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 베타-액틴을 이용하여 벡터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 또는 pBPV, 및 일 양상에서, 바이러스 시스템, 예컨대, 이하로 제한되지 않고 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap을 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체가 생성되고 회수되는 조건 하에 임의의 본 명세서에 개시된 항체 및/또는 Ab-Trap을 재조합적으로 생성하는 세포주를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap을 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap이 생성되고 회수되는 조건 하에 표 1A에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 표 1B에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 및/또는 Ab-Trap을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포주를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap의 중쇄 및 경쇄는 별개의 벡터 상에서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap의 중쇄 및 경쇄는 동일한 벡터 상에서 암호화된다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 양쪽성 이온 중합체-IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 접합체를 합성하는 방법이 제공되되, 접합체는 하나 이상의 작용제 및 하나 이상의 중합체 아암을 갖고, 각각의 중합체 아암은 하나 이상의 단량체 단위를 갖고, 단위 중 적어도 하나는 양쪽성 이온을 가진다. 예를 들어, 이러한 방법은 하기 단계들을 가질 수 있다:
a. 단량체 중합을 위한 하나 이상의 부위를 갖는 개시제 및 아민기를 갖는 제1 링커를 제공하는 단계로서, 개시제는 트라이플루오로 아세트산염인, 상기 개시제와 제1 링커를 제공하는 단계;
b. 중합에 적합한 하나 이상의 단량체를 제공하는 단계로서, 단량체 중 적어도 하나는 양쪽성 이온인, 상기 단량체를 제공하는 단계;
c. 단량체 중합을 위한 부위에 각각 대응하는 하나 이상의 중합체 아암을 형성하기 위해 개시제와 단량체를 반응시켜 아민기를 지니는 제1 링커를 갖는 개시제-중합체 접합체를 제공하는 단계;
d. 적어도 제2 반응기 및 제3 반응기를 갖는 제2 링커를 제공하는 단계;
e. 제2 링커의 제2 반응기 및 제3 반응기 중 하나를 개시제-중합체 접합체의 제1 링커의 아민기에 결합시켜 결합 단계에서 사용되지 않은 하나 이상의 반응기를 갖는 링커-개시제-중합체 접합체를 제공하는 단계; 및
f. 링커-개시제-중합체 모이어티의 비반응 반응기 중 하나 이상에 하나 이상의 작용제를 결합시켜 중합체-작용제 접합체를 제공하는 단계.
일부 실시형태에서, IL-6 및 포스포릴콜린-함유 중합체에 특이적으로 결합하는 단리된 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap을 포함하는 접합체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 항체 및/또는 Ab-Trap에 공유결합된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 항체 및/또는 Ab-Trap에 비공유결합된다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 및 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하는 접합체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 항체의 가변 영역 외부의 항체에 공유결합된다. 일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 및 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하는 접합체가 제공된다. 중합체는 항체의 가변 영역 외부의 시스테인에서 항체에 공유결합된다. 일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 및 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하는 접합체가 제공되되, 중합체는 항체의 가변 영역 외부의 시스테인에서 항체에 공유결합되고, 상기 시스테인은 재조합 DNA 기술을 통해 첨가되었다. 접합체의 일부 실시형태에서, 중합체는 2(메타크릴로일옥시)에틸 (2-(트라이메틸암모니오)에틸) 포스페이트(MPC) 단량체를 포함한다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 중합체 합성 후에 접합기(예를 들어, 말레이미드)가 첨가되는 방법이 제공된다. 이는 때때로 "스냅-온(snap-on) 전략" 또는 "보편적 중합체 전략"으로서 지칭된다. 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 미국 특허 출원 제14/916,180호(미국 특허 출원 공개 제20160199501호로서 공개됨) 참조. 일부 실시형태에서, 단일 개시제 모이어티는 대규모 중합체 합성을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 최적 중합체 합성의 규모 확장을 위한 조건이 개발될 수 있다. 이어서, 이러한 중합체는 다양한 유형의 링커를 "스냅-온"함으로써 다양한 유형의 작용제에 적합화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 중합체, 예컨대, 심지어 Fab 단편의 항체에 더 큰 작용제를 접합시키는 것이 요망된다면, 더 긴 링커 서열이 중합체로 스냅온될 수 있다. 대조적으로, 더 작은 작용제는 상대적으로 더 짧은 링커 서열을 호출(call)할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 개시제는 중합체 개시를 위해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 부위를 가진다. 일부 실시형태에서, 개시제는 중합체 개시를 위해 약 3, 약 6, 또는 약 9개의 부위를 가진다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 제2 링커는 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 반응기를 가진다. 더 바람직하게는, 제2 링커는 제2 반응기 및 제3 반응기만을 가진다.
본 발명의 양상에 따르면, 각각의 중합체 아암은 약 20 내지 약 2000개의 단량체 단위를 가진다. 바람직하게는, 각각의 아안은 약 100 내지 500개의 단량체 단위 또는 약 500 내지 1000개의 단량체 단위 또는 약 1000 내지 1500개의 단량체 단위 또는 약 1500 내지 2000개의 단량체 단위를 가진다.
본 발명의 양상에 따르면, 중합체-작용제 접합체의 피크 분자량은 약 100,000 내지 1,500,000Da이다. 바람직하게는, 중합체-작용제 접합체의 피크 분자량은 약 200,000 내지 약 300,000Da, 약 400,000 내지 약 600,000Da 또는 약 650,000 내지 약 850,000Da이다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 제1 링커는 바람직하게는 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 사이클릭 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도 또는 이들의 임의의 조합이다. 더 바람직하게는, 제1 링커는 하기 화학식을 가진다:
Figure pct00024
m은 1 내지 10이다. 일부 실시형태에서, 제1 링커는 상기 화학식(화학식 (1))을 가지며, m은 4이다.
일부 실시형태에서, 개시제는 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 포함한다
Figure pct00025
Figure pct00026
식 중, X는 NCS, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 화학식 (2), 화학식 (3) 및/또는 화학식 (4)에서 X는 Br이다.
일부 실시형태에서, 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다
Figure pct00027
Figure pct00028
식 중, R7은 H 또는 C1-6 알킬이고, t는 1 내지 6이다.
더 바람직하게는, 단량체는 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸)포스페이트(HEMA-PC) 및 2-(아크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸) 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 단량체는 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸) 포스페이트이다.
제2 링커 모이어티는 바람직하게는 하기 구조를 갖는 활성화된 에스터를 포함한다
Figure pct00029
식 중, R8은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며
Figure pct00030
R9는 하기이고
Figure pct00031
p는 1 내지 12이다.
본 발명의 더 바람직한 실시형태에서, 중합체는 9개의 아암이며, m은 2 내지 4이고, R9는
Figure pct00032
이며,
p는 4 내지 15이다. 훨씬 더 바람직하게는, m은 4이고, p는 12이다.
일부 실시형태에서, 라디칼로 중합 가능한 단량체는
Figure pct00033
이며,
R1은 H 또는 C1-6 알킬이고, R2, R3, R4는 동일 또는 상이하며, H 또는 C1-4알킬이고, X 및 Y는 동일 또는 상이하며, 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (12)에서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 메틸이고, X 및 Y는 각각 2이다.
일부 실시형태에서, 라디칼로 중합 가능한 단량체는
Figure pct00034
이며,
R1은 H 또는 C1-6 알킬이고, R2와 R3은 동일 또는 상이하며, H 또는 C1-4알킬이고, R4는 PO4-, SO3- 또는 CO2-이고, X 및 Y는 동일 또는 상이하며, 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (13)에서 R1, R2 및 R3은 메틸이고, R4는 PO4-이며, X 및 Y는 각각 2이다.
일부 실시형태에서, 단량체는
Figure pct00035
이며,
R1은 H 또는 C1-6 알킬이고, R2, R3과 R4는 동일 또는 상이하며, H 또는 C1-4알킬이고, R5는 PO4-, SO3- 또는 CO2-이고, X 및 Y는 동일 또는 상이하며, 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (14)에서 R1, R2, R3 및 R4는 메틸이고, R5는 PO4-이며, X 및 Y는 2이다.
중합체가 시스테인(또는 다른 구체화된 잔기)을 통해 접합될 때, 중합체는잔기에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 개재 개시제 및 또는 스페이서 등을 이용) 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 포스포릴콜린 함유 중합체는 이하에 제시되는 바와 같은 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(MPC) 단량체를 포함한다:
Figure pct00036
이렇게 해서 중합체는 다음의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00037
n은 1 내지 3000의 정수이고, 물결선은 중합체에서 단량체 간의 부착 지점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 중합체는 3개 이상의 아암을 갖거나, 3개 이상의 중합체 개시 부위를 포함하는 개시제로 합성된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아암을 갖거나, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 중합체 개시 부위를 포함하는 개시제로 합성된다. 더 바람직하게는, 중합체는 3, 6 또는 9개의 아암을 갖거나, 또는 3, 6 또는 9개의 중합체 개시 부위를 포함하는 개시제로 합성된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 9개의 아암을 갖거나, 또는 9개의 중합체 개시 부위를 포함하는 개시제로 합성된다.
일부 실시형태에서, 첨가된 중합체는 분자량이 약 300,000 내지 약 1,750,000Da(SEC-MAL)이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 분자량이 약 500,000 내지 약 1,000,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 분자량이 약 600,000 내지 약 900,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 분자량이 약 750,000 내지 약 850,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 분자량이 약 800,000 내지 약 850,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 분자량이 약 750,000 내지 약 800,000Da이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 및/또는 Ab-Trap은 생체접합체를 형성하기 위해 중합체에 추가로 접합될 수 있다. 생체접합체의 분자량(전체적으로, SEC-MAL)은 약 350,000 내지 2,000,000 달톤, 예를 들어, 약 450,000 내지 1,900,000 달톤, 약 550,000 내지 1,800,000 달톤, 약 650,000 내지 1,700,000 달톤, 약 750,000 내지 1,600,000 달톤, 약 850,000 내지 1,500,000 달톤, 약 900,000 내지 1,400,000 달톤, 약 950,000 내지 1,300,000 달톤, 약 900,000 내지 1,000,000 달톤, 약 1,000,000 내지 1,300,000 달톤, 약 850,000 내지 1,300,000 달톤, 약 850,000 내지 1,000,000 달톤, 및 약 1,000,000 내지 1,200,000 달톤일 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체접합체는 분자량이 약 350,000 내지 1,900,000 달톤이다.
일부 실시형태에서, 항체 및/또는 Ab-Trap 접합체가 정제된다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 Ab-Trap 접합체 양상에서 중합체는 다분산성이며, 즉, 중합체 PDI는 1.0이 아니다. 일부 실시형태에서, PDI는 1.5 미만이다. 일부 실시형태에서, PDI는 1.4 미만이다. 일부 실시형태에서, PDI는 1.3 미만이다. 일부 실시형태에서, PDI는 1.2 미만이다. 일부 실시형태에서, PDI는 1.1 미만이다. 일부 실시형태에서, 접합체 PDI는 1.5 이하이다.
일부 실시형태에서, 항체 및/또는 Ab-Trap 접합체는 중합체에 결합된 항-IL-6 면역글로불린 G(IgG)를 가지며, 이 중합체는 MPC 단량체를 포함하되, 항-IL-6 중쇄의 서열은 표 1A에 있고, 항-IL-6 경쇄의 서열은 표 1B에 있으며, 항체 및/또는 Ab-Trap은 중합체에 대해 C442에서만 결합된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 9개의 아암이고, 분자량은 약 600,000 내지 약 1,000,000Da이다.
일부 실시형태에서, 항체 및/또는 Ab-Trap 접합체는 중합체에 결합된 항-IL-6 면역글로불린 G(IgG)를 가지며, 이 중합체는 MPC 단량체를 포함하되, 항-IL-6 중쇄의 서열은 표 1A에 포함되고, 항-IL-6 경쇄의 서열은 표 1B에 포함되며, 항체는 중합체에 대해 C443(EU 넘버링)에서만 결합된다. 일부 실시형태에서, 중합체는 9개의 아암이고, 분자량은 약 600,000 내지 약 1,000,000Da이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 9개의 아암을 갖는 중합체를 포함하고, 중합체는 분자량이 약 600,000 내지 약 900,000Da이다.
일부 실시형태에서, 항체 접합체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pct00038
항-IL-6 항체의 각각의 중쇄는 글자 H로 나타내며, 항-IL-6 항체의 각각의 경쇄는 글자 L로 나타내고(일부 실시형태에서, 도 6에 나타낸 바와 같이 Ab-Trap 배열에 추가로 연결될 수 있음);
중합체는 C443(EU 넘버링)의 설프하이드릴을 통해 항-IL-6 항체(및/또는 Ab-Trap)에 결합되며, 이 결합은 중쇄 중 하나에 대해 도시되며; PC는
Figure pct00039
이며,
상기 곡선은 중합체 나머지에 대한 부착지점을 나타내며; 여기서, X는 a) OR, 여기서 R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할로겐화물; n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 및 n9의 합이 2500 + 또는 - 10%가 되도록 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일 또는 상이하다. 일부 실시형태에서, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일 또는 상이하고, 정수는 0 내지 3000이다. 일부 실시형태에서, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일 또는 상이하고, 정수는 0 내지 500이다. 일부 실시형태에서, X=OR이며, 여기서 R은 당, 아미노알킬, 다음 잔기: 포화된 C1 -C24 알킬, 불포화 C2 -C24 알켄일 또는 C2 -C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보닐옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설폰일, 카복시, 사이아노 및 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, --CO--O--R7, 카보닐 --CCO--R7, --CO--NR8R9, --(CH2)n--COOR7, --CO--(CH)n--COOR7, --(CH2)n--NR8R9, 에스터, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐의 일치환, 다치환 또는 비치환된 변이체이되, n은 1 내지 6의 정수이고, 각각의 R7, R8 및 R9는 수소 원자, 할로겐원자, 다음 잔기: 포화 C1- C24 알킬, 불포화 C2 -C24 알켄일 또는 C2- C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보닐옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설폰일, 카복시, 사이아노, 및 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 5-원 고리 및 6-원 고리의 일치환, 다치환 또는 비치환 변이체로 이루어진 군으로부터 별개로 선택된다. 일부 실시형태에서, 화학식 17은 IL-6 Ab VEGF Trap 융합 단백질을 생성하기 위해 표 1C 서열의 일부 또는 모두를 추가로 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 일부 실시형태에서, 도 27에서 융합은 융합을 도시된 항체로 대체하여, 화학식 17에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 접합체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pct00040
식 중:
항체의 각각의 중쇄는 글자 H로 나타내며, 항-IL-6 항체의 각각의 경쇄는 글자 L로 나타내고(일부 실시형태에서, 도 6에 나타낸 바와 같이 Ab-Trap 배열에 추가로 연결될 수 있음);
중합체는 C443(EU 넘버링)의 설프하이드릴을 통해 항체에 결합되며, 이 결합은 중쇄 중 하나에 대해 도시되며;
PC는
Figure pct00041
이고, 여기서, 곡선은 중합체 나머지에 대한 부착지점을 나타내며; 여기서, X는 a) OR, 여기서 R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할로겐화물이며; 그리고
n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 및 n9의 합이 2500 + 또는 - 15%가 되도록 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일 또는 상이하다. 일부 실시형태에서, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 및 n9의 합은 약 1500 내지 약 3500 + 또는 - 약 10% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 도 27에서 융합은 융합을 도시된 항체로 대체하여, 화학식 17에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 및/또는 Ab-Trap 접합체는 액체 제형에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 Ab-Trap 접합체는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 중쇄의 아이소타입은 IgG1이고, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 가진다. 일부 실시형태에서, 경쇄 아이소타입은 카파이다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)의 IgG1 도메인은 효과기 기능, 예컨대, ADCC, ADCP 및 CDC를 조절하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 일부 실시형태에서, IgG1 돌연변이는 효과기 기능을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 효과기 기능 돌연변이에 대한 사용을 위한 아미노산은 (EU 넘버링) E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322X, A327X, P329X, A330X, A330X, P331X 및 P331X를 포함하며, 이때 X는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 다음 중 하나 이상을 포함한다: E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링). 일부 실시형태에서, 항-IL-6 중쇄는 다음의 돌연변이(EU 넘버링)를 가진다: L234A, L235A 및 G237A. 일부 실시형태에서, 천연 인간 IgG1 서열에 대한 효과기 기능 돌연변이의 수는 10 이하이다. 일부 실시형태에서, 천연 인간 IgG1 서열에 대한 효과기 기능 돌연변이의 수는 5, 4, 3, 2 또는 1 이하이다. 일부 실시형태에서, 항체가 효과기 기능을 초래하는 능력이 감소되도록 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 감소된 Fc 감마 결합 및/또는 보체 C1q 결합을 가진다. 이는 안구 적응증/장애에 특히 유리할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 다음의 아미노산 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다: L234A, L235A, G237A 및 L443C (EU 넘버링, 또는 도 27에서 이중 밑줄로 나타내는 바와 같은 서열번호 170에서 451A, 452A, 및 454A 및 660C).
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab VEGFTrap)는 인간 면역글로불린 G(IgG1)이거나 이의 부분이다.
일부 실시형태에서, IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 면역-매개 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 중쇄는 반감기 연장 모이어티를 접합하는 데 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 의해 돌연변이로서 첨가된 시스테인 잔기를 가진다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 Q347C(EU 넘버링) 및/또는 L443C(EU 넘버링)이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 L443C(EU 넘버링)이다. 일부 실시형태에서, 항체 대 중합체의 화학량론은 1:1이며; 다시 말해서, 접합체는 중합체의 하나의 분자에 접합된 항체의 하나의 분자를 가진다.
항-IL-6 항체의 반감기는 "반-감기("반감기") 연장 모이어티" 또는 "반-감기("반감기") 연장 기"의 부착에 의해 연장될 수 있다. 반감기 연장 모이어티는 문제의(또는 상황에 따라서 화학적으로 접합된) 생물학적 약물과 함께 틀 내에서 발현될 수 있는 펩타이드 및 단백질, 및 1종 이상의 아미노산 측쇄 또는 말단 작용기, 예컨대, -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2, 또는 1종 이상의 N- 및/또는 O-글리칸 구조에 부착되거나 접합될 수 있는 다양한 중합체를 포함한다. 반감기 연장 모이어티는 일반적으로 생물학적 약물의 생체내 순환 반감기를 증가시키는 작용을 한다.
펩타이드/단백질 반감기 연장 모이어티의 예는 Fc 융합(Capon DJ, Chamow SM, Mordenti J, et al. Designing CD4 immunoadhesions for AIDS therapy. Nature. 1989. 337:525-31), 인간 혈청 알부민(HAS) 융합(Yeh P, Landais D, Lemaitre M, et al. Design of yeast-secreted albumin derivatives for human therapy: biological and antiviral properties of a serum albumin-CD4 genetic conjugate. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:1904-08), 카복시 말단 펩타이드(CTP) 융합(Fares FA, Suganuma N. Nishimori K, et al. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:4304-08), 부정확 반복부 펩타이드 서열(non-exact repeat peptide sequence: XTEN) 융합의 유전자 융합(Schellenberger V, Wang CW, Geething NC, et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009. 27:1186-90), 엘라스틴 유사 펩타이드(ELPylation)(MCpherson DT, Morrow C, Minehan DS, et al. Production and purification of a recombinant elastomeric polypeptide, G(VPGVG19-VPGV, from Escheriachia coli. Biotechnol Prog. 1992. 8:347-52), 인간 트랜스페린 융합(Prior CP, Lai C-H, Sadehghi H et al. Modified transferrin fusion proteins. 특허 WO2004/020405. 2004), 프롤린-알라닌-세린(PASylation)(Skerra A, Theobald I, Schlapsky M. Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability. 특허 WO2008/155134 A1. 2008), 호모-아미노산 중합체(HAPylation)(Schlapschy M, Theobald I, Mack H, et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007. 20:273-84) 및 젤라틴 유사 단백질(GLK) 융합(Huang Y-S, Wen X-F, Zaro JL, et al. Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating-factor by fusion with gelatin-like protein polymer. Eur J. Pharm Biopharm. 2010. 72:435-41)을 포함한다.
중합체 반감기 연장 모이어티의 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 분지형 PEG, PolyPEG(등록상표)(워틱 이펙트 폴리머즈(Warwick Effect Polymers); 영국 코번트리에 소재), 폴리시알산(PSA), 전분, 하이드록실에틸 전분(HES), 하이드록시알킬 전분(HAS), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴황산, 더마탄황산염, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란,폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일몰폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 양쪽성 이온 중합체, 포스포릴콜린 함유 중합체 및 MPC를 함유하는 중합체, 폴리(Glyx-Sery), 히알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 플렉시머, 덱스트란 및 폴리-시알산(PSA)을 포함한다.
일 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스터를 이용하여 단백질의 유리 아미노산 기를 통해 항체에 접합될 수 있다. 아민기에 대한 접합을 표적화하는 시약은 라이신의 ε-아민기, N-말단 아미노산의 α-아민기 및 히스티딘의 δ-아민기와 무작위로 반응할 수 있다.
그러나, 본 명세서에 개시된 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 중합체 접합에 이용 가능한 다수의 아민기를 가질 수 있다. 따라서, 유리 아미노기에 대한 중합체의 접합은 항체 단백질이 IL-6(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)에 결합하는 능력에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 말레이미드 화학, 또는 산화 후 항체의 탄수화물 모이어티에 대한 중합체 혼성체 또는 중합체 아민의 결합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적절한 티올-반응 화학을 이용하여, 하나 이상의 유리 SH 기에 결합된다. 일부 실시형태에서 말레이미드 결합이 사용된다. 일부 실시형태에서, 결합은 유전자 조작을 통해 자연적으로 존재하거나 도입되는 시스테인에서 생긴다.
일부 실시형태에서, 항체의 접합체 및 반감기 연장제로서 작용하는 고 MW 중합체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 접합체는 양쪽성 이온 중합체에 결합되는 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)를 포함하되, 중합체는 하나 이상의 단량체 단위로부터 형성되고, 적어도 하나의 단량체 단위는 양쪽성이온 기를 가진다. 일부 실시형태에서, 양쪽성이온기는 포스포릴콜린이다.
일부 실시형태에서, 단량체 단위 중 하나는 HEMA-PC이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 HEMA-PC인 단일 단량체로부터 합성된다.
일부 실시형태에서, 일부 항체(및/또는 IL-6 Ab VEGFTrap) 접합체는 2, 3개 이상의 중합체 아암을 갖되, 단량체는 HEMA-PC이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 중합체 아암을 갖되, 단량체는 HEMA-PC이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 3, 6 또는 9개의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, 접합체는 9개의 아암을 가진다.
일부 실시형태에서, 중합체-항체(및/또는 중합체-IL-6 Ab-VEGFTrap) 접합체는 분자량이 100,000 내지 1,500,000Da인 중합체 부분을 가진다. 일부 실시형태에서, 접합체는 분자량이 500,000 내지 1,000,000Da인 중합체 부분을 가진다. 일부 실시형태에서, 접합체는 분자량이 600,000 내지 800,000Da인 중합체 부분을 가진다. 일부 실시형태에서, 접합체는 분자량이 600,000 내지 850,000Da인 중합체 부분을 가지며, 9개의 아암을 가진다. 분자량이 중합체에 접합된 항체에 대해 제공될 때, 분자량은 연관된 임의의 탄수화물 모이어티를 포함하는 단백질의 분자량, 및 중합체의 분자량이 더해질 것이다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap)는 Mw가 약 100kDa 내지 1650kDa으로 측정된 분자량을 갖는 HEMA-PC 중합체를 가진다. 일부 실시형태에서, Mw로 측정할 때 중합체의 분자량은 약 500kDa 내지 1000kDa이다. 일부 실시형태에서, Mw로 측정할 때 중합체의 분자량은 약 600kDa 내지 약 900kDa이다. 일부 실시형태에서, Mw로 측정할 때 중합체의 분자량은 750 또는 800kDa + 또는 - 15%이다.
일부 실시형태에서, 중합체는 하나 이상의 중합체 개시 부위를 갖는 ATRP에 적합한 개시제로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 중합체 개시 부위는 2-브로모아이소뷰티레이트 부위를 가진다. 일부 실시형태에서, 개시제는 3개 이상의 중합체 개시 부위를 가진다. 일부 실시형태에서, 개시제는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 중합체 개시 부위를 가진다. 일부 실시형태에서, 개시제는 3, 6 또는 9개의 중합체 개시 부위를 가진다. 일부 실시형태에서, 개시제는 9개의 중합체 개시 부위를 가진다. 일부 실시형태에서, 개시제는 OG1786이다.
항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGFTrap)는 (i) 유전자 조작에 의한 재조합 DNA의 생성, (ii) 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 형질감염, 전기천공법 또는 미량주사법에 의한 원핵 또는 진핵 세포 내로 재조합 DNA의 도입, (iii) 형질전환 세포의 배양, (iv) 항체를, 예를 들어, 구성적으로 또는 유도 시 발현, 및 (v) 예를 들어, 배양 배지로부터 또는 형질전환 세포를 채취하는 것에 의한 항체의 단리를 포함하는, 재조합 발현에 의해, (vi) 정제된 항체를 얻기 위해, 생성될 수 있다.
항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 약학적으로 허용 가능한 항체 분자를 생성하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 발현에 의해 생성될 수 있다. 진핵 세포의 예는 포유류 세포, 예컨대, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip 및 HepG2이다. 다른 적합한 발현 시스템은 원핵(예를 들어, pET/BL21 발현 시스템을 갖는 이콜라이(E. coli)), 효모(사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및/또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 시스템) 및 곤충 세포이다.
본 명세서에 개시된 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)의 제조를 위해 다양한 벡터가 사용될 수 있고, 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵 발현을 위한 벡터의 예는 플라스미드, 예컨대, 제한 없이, 프리셋(preset), 페트(pet) 및 패드(pad)를 포함하되, 원핵 발현 벡터에서 사용되는 프로모터는, 이하로 제한되지 않고, lac, trc, trp, recA 또는 araBAD 중 하나 이상을 포함한다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예는: (i) 효모에서 발현을 위해, 프로모터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고, AOX1, GAP, GAL1 또는 AUG1을 이용하여, 벡터 예컨대, 이하로 제한되지 않고, pAO, pPIC, pYES 또는pMET; (ii) 곤충 세포에서 발현을 위해, 프로모터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 또는 polh를 이용하여 벡터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고,pMT, pAc5, pIB, pMIB 또는 pBAC, 및 (iii) 포유류 세포에서 발현을 위해, 프로모터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 베타-액틴을 이용하여 벡터, 예컨대, 이하로 제한되지 않고, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 또는 pBPV, 및 일 양상에서, 바이러스 시스템, 예컨대, 이하로 제한되지 않고 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질당 적어도 하나의 중하체가 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 대 중합체의 비는 1:4 내지 1:6이다. 일부 실시형태에서, 단백질(Ab) 대 중합체의 비는 1:5 몰비이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 양은 5, 4, 3, 2, 또는 약 2.4㎎/㎖이다.
일부 실시형태에서, 중합체와 항체 조합 후 정제는 양이온 교환 칼럼을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap에 부착된 중합체의 존재는 중합체 그 자체의 존재에 기인하여 더 깊은 효능을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 헤파린 결합 도메인과 조합하여 사용될 때, (예컨대, VEGF에서) 중합체의 존재는 더 깊은 효능을 갖는 접합 분자를 초래한다. 일부 실시형태에서, 이하의 실시예에 제공하는 HUVEC 데이터에서 나타내는 바와 같이, 분자는 혈관신생에서 우수하다. 일부 실시형태에서, 이는 접합 분자의 특성에 차이가 있으며, 단순히 정도의 차이는 아니다(예를 들어, 접합체를 비접합 분자와 비교함). 더 나아가, 이하의 실시예에서 HUVEC 증식 분석에 나타낸 바와 같이, 일부 실시형태에서, 중합체의 존재는 상승적 저해를 제공한다.
추가로, 일부 실시형태에서, 세포 밀도가 증가됨에 따라(예를 들어, 4,000 내지 6,000), 접합체의 효능은 또한 개선될 수 있다.
일부 실시형태에서, 사용되는 접합체의 양은 (단백질의 중량으로) 50㎎/㎖ 초과이다. 이는, 예를 들어, 55, 60, 65, 70㎎/㎖ 이상(접합 전 단백질의 중량)일 수 있다.
중합체에 단백질을 접합시키는 방법
일부 실시형태에서, 치료적 단백질-반감기 연장 모이어티 접합체를 제공하기 위해 말레이미드, 비닐설폰, 오쏘피리딜-이황화물 및 아이오도아세트아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 설프하드릴 특이적 반응기를 갖는 반감기 연장 모이어티에 재조합 DNA 기술을 통해 첨가된 시스테인 잔기를 갖는 치료적 단백질을 접합하는 단계를 갖는 치료적 단백질 반감기 연장 모이어티를 제조하는 방법이 제시된다.
일부 실시형태에서, 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체의 제조 방법이 제공된다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 방법은 30x 몰 과량의 TCEP 환원제를 이용하여 단백질을 환원시키는 단계를 포함한다(도 10). 환원 후에, 항체 내 천연 유래 경쇄 및 중쇄간 및 경쇄 및 중쇄 내 이황화 결합이 형성되는 경우 캡 제거된 항체를 제거하기 위해 항체가 산화되지만, 중쇄 L443C 위치(EU 넘버링) 상의 조작된 시스테인은 캡 제거된 채로 남아있다(도 10). 이어서, 항체는 부형제를 첨가하고, 2 내지 10x 몰 과량의 말레이미드 생체중합체를 첨가함으로써 접합된다. (도 10). 생체중합체는 공유 티올에터 결합을 통해 항체에 연결한다(도 10). 접합 후에, 항체 접합체는 비접합 항체와 제거된 중합체 둘 다에 의해 정제된다(도 10). 단백질이 Ab-Trap인 실시형태에서, 항체 상의 동일한 위치가 사용될 수 있고, 동일한 접근이 사용된다.
상기 기재한 단백질 및 방법은 마찬가지로 달라질 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 접합 단백질(항체 또는 항-IL-6 항체는 필요하지 않음)의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 용액에서 캡 제거된 단백질을 형성하기 위해 단백질에서 하나 이상의 시스테인을 환원시키는 단계를 포함한다. 하나 이상의 시스테인을 환원시킨 후에, 캡 제거된 단백질은 환원 단백질에서 적어도 하나의 이황화 결합을 회복하도록 재산화되는 한편, 단백질에서 조작된 시스테인 잔기는 유리 티올 형태로 남아서 용액 중의 재산화된 캡 제거 단백질을 형성하는 것을 보장한다. 이어서, 적어도 1종의 부형제가 용액에 첨가된다. 부형제는 중합체 유도된 단백질 침전을 감소시킨다. 부형제가 첨가된 후에, 중합체는 용액에 첨가되며, 이는 조작된 시스테인 잔기에서 재산화된 캡 제거 단백질을 재산화시키도록 접합되어 접합 단백질을 형성한다.
일부 실시형태에서, 몰 과량의 환원제는 작용하는 임의의 양으로 변경될 수 있다. 일부 실시형태에서 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90x 몰 과량의 환원제(모든 실시형태에서 TCEP가 필요하지는 않음)가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환원제는 트라이소듐 3,3',3"-포스핀트라이일트리스(벤젠-1-설포네이트)(TPPTS)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 항체(치료적 또는 기타)가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15x 몰 과량의 말레이미드 생체중합체가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체에 대해 과량의 캡 제거된 단백질이 있다. 일부 실시형태에서, 환원된 단백질의 양은 중합체의 양보다 적다. 일부 실시형태에서, 환원된 단백질의 양은 중합체 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%이다. 일부 실시형태에서, 중합체의 10 내지 15배가 단백질로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 환원된 항체의 양은 중합체의 양보다 많다. 일부 실시형태에서, 중합체의 양은 환원된 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)의 양보다 많다.
일부 실시형태에서, 정제 단계는 선택적이다.
일부 실시형태에서, 항체 접합체(및/또는 Ab-Trap)의 제조 방법은 포스포릴콜린 함유 중합체에 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)를 접합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 포스포릴콜린 함유 중합체에 항-IL-6 항체를 접합시키는 단계를 포함한다. 항-IL-6 항체는 재조합 DNA 기술을 통해 첨가된 아미노 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 첨가된 아미노산 잔기는 시스테인 잔기이다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 항체 가변 영역 외부에 첨가된다. 시스테인 잔기는 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나에 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체는 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 포스포릴콜린 함유 중합체는 말레이미드, 비닐설폰, 오쏘피리딜-다이설파이드 및 아이오도아세트아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 설프하이드릴 특이적 반응기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포스포릴콜린 함유 중합체 상의 설프하이드릴 특이적 반응기는 항-IL-6 항체 상의 시스테인 잔기와 반응하여 항체(및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap) 접합체를 생성한다.
일부 실시형태에서, 접합될 단백질은 항체, 항체 단백질 융합(예를 들어, IL-6 Ab-VEGF Trap) 또는 이의 결합 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체가 아니지만, 효소, 리간드, 수용체 또는 다른 단백질 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체이다. 일부 실시형태에서, 천연 단백질은 적어도 하나의 이황화 결합 및 적어도 하나의 비천연 시스테인을 함유한다.
일부 실시형태에서, 부형제는 산 또는 염기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 부형제는 세정제, 당 또는 하전된 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 부형제는 중합체에 대한 접합 동안 용액 중의 단백질을 유지하는 것을 돕는다. 일부 실시형태에서, 부형제는 단백질을 함유하는 용액에 대한 중합체의 첨가 전에 단백질을 함유하는 용액에 첨가된다.
일부 실시형태에서, 반응은 약 pH 5 내지 약 pH 9의 수성 조건 하에 일어난다. 일부 실시형태에서, 반응은 6.0 내지 8.5, 6.5 내지 8.0 또는 7.0 내지 7.5에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 중합체는 2 내지 37℃에서 단백질에 접합된다. 일부 실시형태에서, 접합은 0 내지 40℃, 5 내지 35℃, 10 내지 30℃ 및 15 내지 25℃에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 접합된 단백질은 정제를 위해(비접합으로부터 접합을 제거하기 위해) 이온 교환 배지 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피 배지와 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이온 교환 배지, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및/또는 친화도 크로마토그래피 배지는 비접합 유리 중합체로부터 그리고 비접합 산화환원 캡 제거 단백질로부터 접합 단백질을 분리시킨다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재되고 도 10에 약술하는 방법은 용해 시스템을 용이하게 하고/하거나 유지할 수 있는 부형제를 수반한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상호작용하도록 의도된 두 성분의 용해도를 유지하는 것을 가능하게 한다. 이는 단백질 및 중합체의 용해성 및 이어서, 말단 접합체도 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 부형제 접근 없이, 문제는 단백질이 용해성이지만, 생체중합체가 첨가될 때, 용액(예를 들어, 단백질)의 용해성이 하락하며, 이것이 용액 밖으로 붕괴되고/침전된다는 것일 수 있다. 물론, 단백질이 붕괴될 때, 생체중합체와 효율적으로 접합할 수 없다. 따라서, 부형제는 생체중합체의 존재 하에 단백질의 용해도를 유지하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 둘은 단백질 접합체를 형성하도록 결합될 수 있다(또는 도 10에 도시된 바와 같음, 항체 접합체). 이는 또한 접합체의 용해도가 유지되는 것을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 중합체는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 양쪽성 이온, 포스포릴콜린, 또는 말레이미드 작용기에 중합체 분지점의 중심을 브리징하는 PEG 링커. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 중합체는 본 명세서에 제공된 방법을 통해 단백질에 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 단백질은 본 명세서에 제공된 하나 이상의 방법을 통해 본 명세서에 제공된 임의의 중합체에 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법(들)은 단백질 및/또는 항체 접합체를 생성하고 정제하는 대규모 가공을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 사용된 용적은 적어도 1 리터, 예를 들어 1, 10, 100, 1,000, 5,000, 10,000 리터 이상이다. 일부 실시형태에서, 생성되고/되거나 정제된 항체 접합체의 양은 0.1, 1, 10, 100, 1000 그램 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 첨가된 시스테인 잔기를 갖는 본 명세서에 기재된 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체 중쇄는 다음의 CDR을 가진다: 표 1A에서 CDRH1, 표 1A에서 CDRH2, 및 표 1A에서 CDRH3. 중쇄는 또한 84번 위치에서 (순차적 넘버링을 통해) 알기닌(R)을 가진다. 일부 실시형태에서, 항-IL-6 경쇄는 다음의 CDR을 가진다: 표 1B에서 CDRL1, 표 1B에서 CDRL2, 및 표 1B에서 CDRL3.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 IgG1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄는 효과기 기능을 조절하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 다음의 아미노산 위치(EU 넘버링) 중 하나 이상에 대한 것이다: E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링). 일부 실시형태에서, 돌연변이는 (EU 넘버링) L234A, L235A 및 G237A이다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 기술을 통해 치료적 단백질에 첨가된 시스테인 잔기는 Cys-Cys 이황화결합 짝짓기에 관여되어서는 안 된다. 이와 관련하여, 치료적 단백질은 이량체일 수 있다. 따라서 예를 들어, 무손상 항-IL-6 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 가진다. Cys 잔기가, 예를 들어, 중쇄 내로 도입된다면, 무손상 항체는 동일한 위치에서 2개의 이러한 도입된 시스테인을 가질 것이고, 이들 시스테인 잔기가 쇄간 이황화 결합을 형성할 확률이 존재한다. 도입된 시스테인 잔기가 Cys-Cys 이황화 결합을 형성하거나 이렇게 되는 경향이 있다면, 도입된 Cys 잔기는 접합에 유용하지 않을 것이다. 쇄간 이황화물 짝짓기가 일어날 중쇄 및 경쇄 내 위치를 피하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제2015/0158952호 참조.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 기술을 통해 도입된 시스테인 잔기는 (EU 넘버링) Q347C 및 L443C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 L443C(EU 넘버링)이다. 일부 실시형태에서, 항체의 중쇄는 표 1A에 제시되는 아미노산 서열을 가지며, 경쇄는 표 1B의 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, 설프하이드릴 특이적 반응기는 말레이미드이다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 분지형 PEG, 폴리PEG(등록상표)(워틱 이펙트 폴리머즈(Warwick Effect Polymers); 영국 코번트리에 소재), 폴리시알산(PSA), 전분, 하이드록실에틸 전분(HES), 하이드록시알킬 전분(HAS), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴황산, 더마탄황산염, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일몰폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메티에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 양쪽성 이온 중합체, 포스포릴콜린 함유 중합체 및 2-메타크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)를 포함하는 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 양쪽성 이온 중합체이다. 일부 실시형태에서, 양쪽성이온은 포스포릴콜린, 즉, 포스포릴콜린 함유 중합체이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 MPC 단위로 구성된다.
일부 실시형태에서, MPC 중합체는 3개 이상의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, MPC 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, MPC 중합체는 3, 6 또는 9개의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, MPC 중합체는 9개의 아암을 가진다. 일부 실시형태에서, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 중합체 개시 부위를 포함하는 개시제로 합성된다.
일부 실시형태에서, MPC 중합체는 분자량이 약 300,000 내지 1,750,000Da이다. 일부 실시형태에서, MPC 중합체는 분자량이 약 500,000 내지 1,000,000Da 또는 약 600,000 내지 900,000Da이다.
일부 실시형태에서, 치료적 단백질-반감기 연장 모이어티 접합체의 제조 방법은 감소된 시스테인 설프하이드릴기를 생성하는 조건 하에 치료적 단백질을 티올 환원제와 접촉시키는 추가적인 단계를 가진다. 상기 논의한 바와 같이, 재조합 DNA 기술을 통해 첨가된 시스테인 잔기는 짝지어지지 않으며, 즉, Cys-Cys 쇄내 이황화 결합에 수반되지 않거나 또는 일어한 결합에 실질적으로 수반되지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 이러한 Cys-Cys 이황화 결합에 관여되지 않고 접합을 위해 유리되는 Cys 잔기는 배양 배지에서 유리 시스테인과 반응하여 이황화물 부가물을 형성하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, WO 2009/052249 참조. 이렇게 유도체화된 시스테인은 접합을 위해 이용 가능하지 않을 것이다. 이황화물 부가물로부터 새로 첨가된 시스테인을 유리시키기 위해, 정제 후 단백질은 환원제, 예를 들어, 다이티오트레이톨로 처리된다. 그러나, 환원제에 의한 이러한 처리는 천연 시스테인을 비롯한 치료적 단백질에서 모든 시스테인 잔기를 환원시킬 것이며, 이 중 다수는 쇄간 및 쇄내 Cys-Cys 이황화 결합에 관여한다. 천연 Cys-Cys 이황화물은 일반적으로 단백질 안정성 및 활성에 중요하며, 이들은 재형성되어야 한다. 일부 실시형태에서, 모든 천연 (예를 들어, 쇄간 및 쇄내) Cys-Cys 이황화물이 재형성된다.
천연 쇄간 및 쇄내 이황화물 잔기를 재형성하기 위해, 시스테인 이황화물 부가물을 제거하기 위한 환원 후에, 치료적 단백질은 미리 정해진 일정 시간, 예를 들어, 밤새 동안 산화 조건 및/또는 산화제에 노출된다. 일부 실시형태에서, 천연 이황화 결합의 재형성을 달성하기 위해 주위 공기 노출이 밤새 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 산화제는 천연 이황화물을 회복하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 산화제는 수성 CuSO4 및 데하이드로아스코브산(DHAA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 산화제는 DHAA이다. 일부 실시형태에서, 사용되는 DHAA의 범위는 5 내지 30 당량의 범위에 있다. 일부 실시형태에서, 범위는 10 내지 30 당량이다. 일부 실시형태에서, 범위는 15 당량이다.
일부 실시형태에서, 티올 환원제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다 3,3',3"-포스판트라이일트라이프로판산(TCEP), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 수소화 붕소 나트륨(NaBH4), 사이아노수소화붕소나트륨(NaCNBH3), β-머캅토에탄올(BME), 시스테인 염산, 삼나트륨 3,3',3"-포스핀트라이일트리스(벤젠-1-설포네이트)(TPPTS) 및 시스테인. 일부 실시형태에서, 티올 환원제는 TCEP이다.
일부 실시형태에서, 티올 환원제 농도는 치료적 단백질 농도에 비해 1 내지 100배 몰 과량이다. 일부 실시형태에서, 티올 환원제 농도는 치료적 단백질 농도에 비해 20 내지 50배 몰 과량이다. 일부 실시형태에서, 티올 환원제는 산화 전에 치료적 단백질과 함께 인큐베이션 후에 제거된다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티에 치료적 단백질을 접합시키는 방법은 접합 후에 치료적 단백질 접합체를 정제하는 추가적인 단계를 가진다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질 접합체는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 친화도 크로마토그래피 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기법을 이용하여 정제된다.
일부 실시형태에서, 치료적 단백질 접합체는 비접합 치료적 단백질에 비해 적어도 20%의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질 접합체는 비접합 치료적 단백질에 비해 적어도 50%의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질 접합체는 천연 치료적 단백질에 비해 적어도 90%의 생물학적 활성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 치료적 단백질 접합체는 비접합 치료적 단백질에 비해 증가된 반감기를 가진다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질 접합체는 비접합 치료적 단백질에 비해 반감기의 적어도 1.5배 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질 접합체는 비접합 치료적 단백질에 비해 반감기의 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5배 증가가 있다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티에 치료적 단백질을 접합하는 방법의 양쪽성 이온 중합체는 양쪽성 이온기를 갖는 라디칼 중합 가능한 단량체이며, 상기 방법은 중합 매질에서 유리 라디칼로 중합 가능한 양쪽성 이온 단량체를 중합하여 중합체를 제공하는 추가적인 단계를 가지고, 상기 매질은 라디칼 중합 가능한 양쪽성 이온 단량체; 전이금속 촉매 Mt (q-1)+; 리간드; 및 개시제를 포함하되, 여기서 Mt는 전이금속이고, q는 더 높은 금속 산화 상태이며, q-1은 더 낮은 금속 산화상태이고, 금속 촉매는 형태 Mt(q-1)+X'(q-1)의 염으로서 공급되되, X'은 반대이온 또는 기이거나, 또는 전이금속 촉매는 산화된 비활성 상태로부터 환원된 활성 상태로 전이금속을 환원시킬 수 있는 환원제와 함께 더 높은 산화 상태 Mt q+X'q로 비활성 금속염을 제공함으로써 그 자리에서 공급된다.
ATRP 전이금속 촉매로서 작용하기 위해, 전이금속은 하나의 전자, 더 높은 산화 상태 및 더 낮은 산화 상태에 의해 분리되는 적어도 2개의 용이하게 접근 가능한 산화 상태를 가져야 한다. ATRP에서, 가역적 산화환원 반응은 전이금속 촉매가 더 높은 산화 상태와 더 낮은 산화 상태 간을 순화하도록 야기하는 한편, 중합체 쇄가 연장되는 쇄 말단과 잠재성(dormant) 쇄 말단 간의 순환하도록 야기한다. 예를 들어, 미국 특허 제7,893,173호 참조.
일부 실시형태에서, 라디칼 중합 가능한 양쪽성 이온 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00042
R1은 H 또는 C1-6 알킬이며, ZW는 양쪽성이온이고, n은 1 내지 6의 정수이다.
일부 실시형태에서, 라디칼로 중합 가능한 단량체는
Figure pct00043
이며,
R1은 H 또는 C1-6 알킬이고, R2, R3, R4는 동일 또는 상이하며, H 또는 C1-4알킬이고, X 및 Y는 동일 또는 상이하며, 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (12)에서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 메틸이고, X 및 Y는 각각 2이다.
일부 실시형태에서, 라디칼로 중합 가능한 단량체는
Figure pct00044
이며,
R1은 H 또는 C1-6 알킬이고, R2와 R3은 동일 또는 상이하며, H 또는 C1-4알킬이고, R4는 PO4-, SO3- 또는 CO2-이고, X 및 Y는 동일 또는 상이하며, 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (13)에서 R1, R2 및 R3은 메틸이고, R4는 PO4-이며, X 및 Y는 각각 2이다.
일부 실시형태에서, 단량체는
Figure pct00045
이고,
R1은 H 또는 C1-6 알킬이고, R2, R3과 R4는 동일 또는 상이하며, H 또는 C1-4알킬이고, R5는 PO4-, SO3- 또는 CO2-이고, X 및 Y는 동일 또는 상이하며, 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (14)에서 R1, R2, R3 및 R4는 메틸이고, R5는 PO4-이며, X 및 Y는 2이다.
일부 실시형태에서, 전이금속 Mt은 Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au 및 Ag로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 금속 촉매는 형태 Mt(q-1)+X'(q-1)의 염으로서 공급된다. Mt (q-1)+는 Cu1+, Fe2+, Ru2+, Cr2+, Mo2+, W2+, Mn3+, Rh3+, Re2+, Co+, V2+, Zn+, Au+ 및 Ag+로 이루어진 군으로부터 선택되고, X'는 할로겐, C1-6 알콕시, (SO4)1/2, (PO4)1/3, (R7PO4)1/2, (R72PO4), 트라이플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄설포네이트, 아릴설포네이트, CN 및 R7CO2로 이루어진 군으로부터 선택되며, R7은 할로겐으로 1 내지 5회 치환될 수 있는 H 또는 직선형 또는 분지형 C1-6 알킬기이다. 일부 실시형태에서, Mt (q-1)+는 Cu1+이고, X'은 Br이다.
일부 실시형태에서, Mt (q-1)+는 그 자리에서 공급된다. 일부 실시형태에서, Mt q+Xq는 CuBr2이다. 일부 실시형태에서, 환원제는 무기 화합물이다. 일부 실시형태에서, 환원제는 낮은 산화 수준의 황 화합물, 아황산수소나트륨, 금속 이온을 포함하는 무기염, 금속, 하이드라진 수화물 및 이러한 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 환원제는 금속이다. 일부 실시형태에서, 환원제는 Cu0이다.
일부 실시형태에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 실시형태에서, 유기 화합물은 알킬티올, 머캅토에탄올, 또는 용이하게 엔올화, 아스코브산, 아세틸 아세토네이트, 캄포설폰산, 하이드록시 아세톤, 환원 당, 단당류, 글루코스, 알데하이드 및 이러한 유기 화합물의 유도체일 수 있는 카보닐 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 리간드는 2,2'-바이피리딘, 4,4'-다이-5-노닐-2,2'-바이피리딘, 4,4-다이노닐-2,2'-다이피리딜, 4,4',4"-트리스(5-노닐)-2,2':6',2"-테트라피리딘, N,N,N',N',N"-펜타메틸다이에틸렌트라이아민, 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트라이에틸렌테트라민, 트리스(2-다이메틸아미노에틸)아민, N,N-비스(2-피리딜메틸)옥타데실아민, N,N,N',N'-테트라[(2-피리달)메틸]에틸렌다이아민, 트리스[(2-피리딜)메틸]아민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-뷰톡시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-(2-에틸헥속시)-3-옥소프로필)아미노에틸)아민 및 트리스(2-비스(3-도데콕시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 2,2'-바이피리딘이다.
일부 실시형태에서, 개시제는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00046
R1은 친핵성 반응기이고, R2는 링커를 포함하며, R3은 구조를 갖는 중합체 합성 개시제 모이어티를 포함한다:
Figure pct00047
R4 및 R5는 동일 또는 상이하고, 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 사이클릭 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; Z는 할로겐 또는 CN이고; s는 1 내지 20의 정수이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (23)의 Z는 Br이고, R4 및 R5는 각각 메틸이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (22)의 R1은 NH2-, OH- 및 SH-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (22)의 R2는 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 사이클릭 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (22)의 R2는
Figure pct00048
이며,
X와 Y는 동일 또는 상이하고, 1 내지 20의 정수이다. 일부 실시형태에서, X 및 Y는 각각 4이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (22)의 R3은
Figure pct00049
이며,
R6, R7 및 R8은 동일 또는 상이하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00050
Z는 NCS, F, Cl, Br 또는 I이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (26), 화학식 (27) 및/또는 화학식 (28)에서 Z는 Br이고, 화학식 (25)에서 R6, R7 및 R8는 각각
Figure pct00051
이다.
일부 실시형태에서, 개시제는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00052
A와 B는 동일 또는 상이하고 2 내지 12의 정수이며, Z는 임의의 할로겐화물, 예를 들어 Br이다. 일부 실시형태에서, A 및 B는 각각 화학식 (30)에서 4이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 중합체를 말레이미드 시약과 반응시켜 말단의 말레이미드를 갖는 중합체를 제공하는 단계를 추가로 가진다. 일부 실시형태에서, 말레이미드 화합물은
Figure pct00053
이다.
IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 변형 또는 돌연변이가 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 00/09560 참조. 항체의 면역원성을 변경시키기 위해, 다른 분자에 대한 공유 또는 비공유 결합 부위를 제공하기 위해, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성으로서 이러한 특성을 변경시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 돌연변이가 또한 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1 이하 내지 5개의 보존적 아미노산 치환이 프레임워크 영역 또는 불변 영역 내에서 생성된다. 다른 실시형태에서, 1 이하 내지 3개의 보존적 아미노산 치환이 프레임워크 영역 또는 불변 영역 내에서 생성된다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 중 임의의 하나 이상에서 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.
변형은 또한 글리코실화 및 비글리코실화 폴리펩타이드뿐만 아니라 다른 번역후 변형, 예를 들어, 상이한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 포스포릴화를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 이들의 불변 영역 내 보존된 위치에서 글리코실화된다(Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질 작용(Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) 및 당단백질의 입체형태 및 제시된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있는 당 단백질 부분 사이의 분자내 상호작용(Jefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416)에 영향을 미친다. 올리고당은 또한 특정 인식 구조에 기반하여 특정 분자에 주어진 당단백질을 표적화하는 작용을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 이용하여 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 부착을 위한 인식 서열이며, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩타이드 내 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
항체(및/또는 Ab-Trap)에 대한 글리코실화의 첨가는 (N-연결된 글리코실화 부위에 대해) 상기 기재한 트라이펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다. (O-연결된 글리코실화 부위에 대해) 본래의 항체 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 이에 의한 첨가에 의한 변경이 또한 생성될 수 있다.
근본 뉴클레오타이드 서열을 변경시키지 않고 항체(및/또는 Ab-Trap)의 글리코실화 패턴이 또한 변경될 수 있다. 글리코실화는 대체로 항체를 발현시키기 위해 사용되는 숙주 세포에 따른다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어, 항체의 발현을 위해 사용되는 세포 유형은 거의 천연 세포가 아니며, 항체의 글리코실화 패턴 변형이 예상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조).
숙주 세포의 선택에 추가로, 항체(및/또는 Ab-Trap)의 재조합 생성 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 제형, 배양물 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고당 생성에 관여하는 특정 효소를 도입하거나 과발현시키는 것을 포함하는 특정 숙주 유기체에서 글리코실화 패턴을 변경시키는 다양한 방법이 제안되었다(미국 특허 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 글리코실화 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어, 엔도글리코시다제 H(Endo H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 이용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 추가로, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 다당류를 가공하는 데 결함이 있도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 및 유사한 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 염증성 망막질환 및/또는 염증 성분을 갖는 망막 혈관 질환에 대한 치료제로서 사용될 수 있다. 혈관신생에 추가로, 염증은 이들 망막 질환의 발병에 관련되었다. 항-염증 요법, 예컨대, 스테로이드는 포도막염(정해진 특징으로서 안구내 염증을 갖는 질환의 범위)과 당뇨 황반 부종(DME)을 둘 다 치료하는 데 효과적이었다. 유사하게, IL-6에서 유전적으로 타고난 다형성은 2형 당뇨병을 갖는 환자에서의 더 높은 PDR 발생률과 연관되었다. 게다가, AMD, DR 및 RVO에서 질환 진행은 IL-6의 증가된 혈청 및/또는 안구 수준과 연관된 것으로 보고되었다. 추가적으로, 신생혈관 AMD를 갖는 눈에서 부르크막의 표면 상에 만성 염증 세포가 보였다. IL-6은 DME 환자에서의 항-VEGF 치료에 대한 내성과 관련되었다. 이 부분은 VEGF 발현[기준]의 IL-6 매개 상향조절의 간접적인 결과뿐만 아니라 VEGF 저해제의 존재 하에 생기는 IL-6 신호전달에 의해 매개되는 더 직접적인 VEGF-독립적 혈관형성 작용인 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 이들 조건 중 임의의 하나 이상은 본 명세서에 제공된 조성물 중 하나 이상으로 치료되고/되거나 예방될 수 있다.
도 11c는 포스포릴콜린-기반 생체중합체와 접합된 VEGF 트랩(VEGFR1/2) 및 항-IL-6 항체의 Trap-항체 융합(TAF)인 생체접합체 작제물의 일부 실시형태를 도시한 도면. 일부 실시형태에서, 항-VEGF/항-IL-6 생체접합체는, 일부 실시형태에서, 6.0㎎의 임상 용량일 때, 분자량이 1.0MDa일 수 있다. 생체접합체에서 항-VEGF 부분의 등가 몰 용량은 임상 라니비주맙(Ranibizumab) 용량보다 6배일 수 있는 반면, 안구 반감기는 라니비주맙보다 3 내지 5배일 수 있었다. CH는 불변 중쇄를 나타내고, CL은 불변 경쇄를 나타내며, Fab는 단편 항원-결합을 나타내고, Fc는 결정화 가능한 단편을 나타내며, VEGFR은 혈관 내피 성장 인자 수용체를 나타내고, VH는 각변 중쇄를 나타내며, VL은 가변 경쇄를 나타내고, *는 CDR 영역이다. 라니비주맙에 대한 배수 변화로서 동등한 값이 나타난다.
항-IL-6 항체/VEGF 트랩(VEGFR1/2)의 다양한 서열 배열이 사용되거나 상이한 배열로 제공될 수 있다. 도 21은 가능한 항-IL-6 중쇄 가변 영역 서열의 일부 실시형태를 도시한 도면. CDR을 밑줄 표시한다.
VEGF 트랩 변이체 및 개선된 항-IL-6 파라토프에 의한 결과에 기반하여, 도 19, 20, 21, 22 및 23에 나타낸 바와 같은 서열의 조합을 포함하는 두 상이한 입체배치에서 216개의 분자를 설계하였고, 제조하였다. 제1 입체배치(VEGFR-항-IL-6)에 대해, 도 19의 서열 1A 내지 1D에 나타낸 바와 같은 VEGF 트랩은 단백질의 시작에 위치되고, 그 다음에 도 20의 서열 2A에 나타내는 바와 같은 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 링커 (GS)의 이중 반복부에 위치되는데, 이는 도 21의 서열 3A 내지 3I에 의해 나타내는 바와 같은 항-IL-6 중쇄의 N-말단에 트랩을 연결한다. 이들 작제물은 도 22의 서열 4A 내지 4C에 열거된 경쇄와 짝지어질 수 있다. 일부 실시형태에서, VEGF 트랩(도 19)은 본 명세서에 제공된 임의의 도면 또는 표에 나타낸 임의의 항-IL-6 경쇄 및/또는 중쇄와 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 VEGF 트랩 변이체는 임의의 본 명세서에 제공된 IL-6 항체의 중쇄 및 경쇄 서열과 짝지어질 수 있고, 본 명세서에 제공된 임의의 중합체에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 VEGF 트랩 변이체는 임의의 본 명세서에 제공된 IL-6 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 서열과 짝지어질 수 있고, 본 명세서에 제공된 임의의 중합체에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 VEGF 트랩 변이체는 임의의 본 명세서에 제공된 IL-6 항체의 중쇄 및 경쇄 3 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)과 짝지어질 수 있고, 본 명세서에 제공된 임의의 중합체에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-6-VEGF 트랩 융합은 도 27의 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6-VEGF 트랩(또는 이의 이중 저해제, 융합 단백질, 또는 접합체)의 서열은 링커를 통해 VEGFR 트랩에 융합된 경쇄로서의 서열번호 169, 중쇄로서의 서열번호 170을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-IL-6-VEGF 트랩(또는 이의 이중 저해제, 또는 융합 단백질 또는 접합체)의 서열은, 예를 들어, 서열번호 170과 169의 조합에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상의 동일성을 포함하여, 서열번호 169 및 170을 포함하는 분자에 대해 적어도 80% 동일하다. 일부 실시형태에서, 항-IL-6-VEGF 트랩(또는 이의 접합체)의 서열은, 예를 들어, 서열번호 170에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 동일성 및 서열번호 169에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 동일성을 포함하여, 서열번호 169를 포함하는 분자에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170을 포함하는 분자에 대해 적어도 80% 동일하다. 일부 실시형태에서, CDR은 항-IL-6 항체(서열번호 170 및 169를 포함)에 대해 본 명세서에 제공된 임의의 CDR에서 검출된 바와 같이 남아있는 한편, 전체 서열이 본래의 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상의 동일하도록 서열의 나머지(중쇄 및 경쇄, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및/또는 전체 융합 서열(예컨대, 서열번호 169 및 170)은 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 1, 2 또는 3개의 보존적 변경에 의해 달라질 수 있는 한편, 전체 서열이 본래의 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상이도록, 서열의 나머지(중쇄 및 경쇄, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및/또는 전체 융합 서열(예컨대, 서열번호 169 및 170)은 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랩 서열(도 27에서, 또는 도 19에서 회색으로 나타냄)은 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 이상 동일성을 보유할 수 있고, CDR은 1, 2 또는 3개의 보존적 변경에 의해 달라질 수 있는 반면, 전체 서열이 본래 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 이상 동일하도록 서열의 나머지(중쇄 및 경쇄, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및/또는 전체 융합 서열(예컨대, 서열번호 169 및 170)은 달라질 수 있다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질(또는 이중 저해제) 또는 이의 접합체는 본 명세서에 제공된 1, 2, 3, 4, 5 또는 모두 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질 또는 이의 접합체는 적어도 서열번호 49, 50 및 51(또는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환을 갖는 변이체)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질(또는 이중 저해제) 또는 이의 접합체는 적어도 서열번호 172, 173 및 174(또는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환을 갖는 변이체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질 또는 이의 접합체는 적어도 서열번호 49, 50 및 51(또는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환을 갖는 변이체) 및 적어도 서열번호 172, 173 및 174(또는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환을 갖는 변이체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 6개의 CDR(또는 이의 변이체)은 인간 항체 프레임워크 영역 내에 함유한다. 일부 실시형태에서, CDR은 중쇄에 대해 표 1A 및 경쇄에 대해 1B에 있는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 본 명세서에 제공된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 이상인 본 명세서에 제공된 임의의 항체, 또는 이의 변이체의 프레임워크 영역 내에 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질(또는 이중 저해제) 또는 이의 접합체는 적어도 서열번호 49, 50 및 51(또는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환을 갖는 변이체) 및 적어도 서열번호 172, 173 및 174(또는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환을 갖는 변이체)를 포함하고, 이들 CDR(변이체를 포함)은 표 1D 내 서열 중 하나 이상 내의 CDR, 또는 표 1D 내 변이체 내의 CDR을 치환한다(여기서, 표 1D의 CDR은 무시하고, 남아있는 서열은 표 1D의 중쇄 함유 부문 및 경쇄 부문에 대해 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% 이상임). 따라서, 일부 실시형태에서, 이들 6개의 CDR(및 이의 변이체)은 표 1에서 언급하는 서열의 CDR뿐만 아니라 이의 변이체를 치환할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표 1E(1A1, 1E2 및 1E3을 포함)에 제공된 CDR은 가능한 CDR의 변이체 내의 옵션으로서 제외된다. 일부 실시형태에서, 항체(이의 단편을 포함)는 도 27에 도시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체에 대해 적어도 80% 동일한 한편, 도 27의 특정 CDR을 유지하는 것이다(따라서 본 실시형태 내 CDR 부문 내의 변형은 없음).
일부 실시형태에서, 단리된 길항 IL-6 항체가 제공된다. 이는 서열번호 7 내지 13, 19 내지 27, 89, 90, 256 내지 262 중 적어도 하나의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역; 및 서열번호 91 내지 93, 28 내지 30 중 적어도 하나의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열번호 256에 열거된 CDR로부터의 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역: VH (CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 91 내지 93에 열거된 CDR의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 길항 IL-6 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공된다. 항체는 EU 넘버링에 기반한 다음의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다: L234A, L235A 및 G237A.
일부 실시형태에서, IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체가 제공되며, 상기 항체는 서열번호 172에서 CDRH1인 CDRH1; 서열번호 173에서 CDRH2인 CDRH2; 서열번호 174에서 CDRH3인 CDRH3: 서열번호 199에서 CDRL1인 CDRL1; 서열번호 200에서 CDRL2인 CDRL2; 서열번호 201에서 CDRL3인 CDRL3; 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A; 및 다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): Q347C 또는 L443C를 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 서열번호 7 내지 13, 89, 90 및/또는 256 내지 262로부터 선택된 항-IL-6 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 서열번호 145, 15, 16 또는 17 중 적어도 하나로부터 선택된 VEGF 트랩 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, 링커 서열은 서열번호 18이다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열은 서열번호 19 내지 27 중 적어도 하나로부터 선택되거나 서열번호 89, 90, 256 내지 262의 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 분자에 대한 경쇄 서열은 서열번호 76 내지 84 중 적어도 하나로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열은 서열번호 49 내지 75 중 적어도 하나로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 서열번호 85 내지 88 중 적어도 하나로부터의 VEGFR-Fc 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 서열번호 7 내지 13, 145, 15 내지 17, 18 내지 84 중 임의의 하나 이상에서 서열 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 IL-6 VH; IL-6 VL; IL-6 Fc; VEGF Trap; 및 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-6 VH는 서열번호 19 내지 27, 31 내지 39, 89, 90 또는 256 내지 262 중 임의의 하나에서 IL6 VH 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-6 VL은 서열번호 28 내지 30 또는 91 내지 93 중 임의의 하나에서 IL6 VL 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc는 서열번호 40 내지 48 중 임의의 하나에서 Fc 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF Trap은 서열번호 145, 15, 16 또는 17 중 임의의 하나에서 VEGF 트랩 서열로부터의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-6 VH; IL-6 VL; IL-6 Fc; 및 VEGF Trap을 포함하는 융합 단백질이 제공되되, 융합 단백질은 HUVEC 증식을 변경시킨다. 일부 실시형태에서, HUVEC 증식을 변경시키는 것은 VEGF/IL6 매개 증식의 저해이다.
일부 실시형태에서, 서열번호 263에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 117에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 융합 단백질은 중합체에 추가로 접합된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 263에 대해 적어도 95% 동일하고 서열번호 117에 대해 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 단백질은 적어도 a) 서열번호 172, 173, 174, 199, 200, 및 201, 또는 b) 서열번호 172, 173, 174, 199, 200 및/또는 201 내의 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환을 포함하되, 상기 치환은 보존적 치환이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 작제물은 VEGFR 서열의 94 및/또는 95번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이(들)는 T94I 및 H95I일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 VEGFR 단백질의 임의의 절단을 감소시킨다(이하의 실시예에서 상술하는 바와 같음).
일부 실시형태에서, (항-IL-6-VEGFR이 배향인 경우), 중쇄 - Fab, 도 23의 서열 5A 내지 5I에 의해 도시되는 중쇄의 가변 및 불변 도메인은 도 20의 서열 2A에 의해 도시되는 GS 링커를 통해 도 19의 서열 1A 내지 1D에 의해 도시된 VEGF 트랩에 연결되고, 이어서, 중쇄 - Fc, 도 23의 서열 5A 내지 5I에 의해 도시되는 Fc 도메인은 VEGF 트랩의 C-말단 단부에 융합된다. 따라서, VEGF 트랩은 항체 Fab와 Fc 영역 사이에 샌드위치된다. 일부 실시형태에서, 이들 작제물은 도 22의 서열 4A 내지 4C 상에 열거된 경쇄와 짝지어질 수 있다.
도 19는 VEGF 트랩 서열의 일부 실시형태를 도시한다. 서열 간의 변형은 밑줄표시되어 있고, 볼드체로 강조된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 융합 작제물은 본 명세서 또는 본 명세서의 임의의 도면에 제공된 임의의 강조되고 볼드체 표시된 변형을 포함할 수 있다.
도 20은 이중 반복부 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 링커(GS) 서열의 일부 실시형태를 도시한다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 서열 단위가 사용될 수 있다(예를 들어, 둘, 이중 반복부에 대해, 셋 이상이 사용될 수 있다). 일부 실시형태에서, 다른 링커 서열이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대안의 링커 서열이 사용될 수 있다.
도 21은 항-IL-6 분자의 일부 실시형태에 대한 중쇄 서열을 도시한다. CDR을 밑줄 표시한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서의 임의의 서열은 본 명세서의 융합 작제물의 부분인 다른 중쇄 서열 대신에 사용될 수 있다.
도 22은 항-IL-6 분자에 대한 경쇄 서열의 일부 실시형태를 도시한다. CDR을 밑줄 표시한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서의 임의의 서열은 본 명세서의 융합 작제물의 부분인 다른 경쇄 서열 대신에 사용될 수 있다.
도 23은 항-IL-6 분자에 대한 중쇄(Fab 및 Fc로 분리된) 서열의 일부 실시형태를 도시한다. CDR을 밑줄 표시한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서의 임의의 서열은 본 명세서의 융합 작제물의 부분인 다른 중쇄 서열 대신에 사용될 수 있다.
도 24A 내지 도 24B는 도 21 내지 도 23으로부터의 CDR의 조합을 도시한다. 도 24A는 도 21 및 도 23에 나타내는 중쇄 CDR 서열을 도시한다. 도 24B는 도 22에 나타내는 경쇄 CDR 서열을 도시한다. 일부 실시형태에서, 작제물에서 사용되는 전체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역보다는, 본 명세서에 제공된 도면 중 하나 이상으로부터의 CDR만이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, VEGFR-Fc 트랩 융합은 조작된 IgG1 프레임워크의 부분이다. VEGFR-항-IL-6 및 항-IL-6-VEGFR 작제물에 추가로, 상기 기재한 바와 같이 절단 저항성 변이체를 갖는 VEGF 트랩 및 도 25의 서열 6A 내지 6D에 도시된 바와 같이 조작된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항-VEGF (VEGFR-Fc) 분자가 제공될 수 있다. 이들 분자에 대한 Fc 도메인은 효과기 기능을 최소화하는 L234A, L235A 및 G237A 치환, 및 반감기 연장 포스포릴콜린 기반 생체중합체를 갖는 부위-특이적 접합을 가능하게 하는 L443C(잔기 위치는 EU 넘버링에 따름)를 함유할 수 있다. 도 25는 VEGFR-Fc 서열 변이체의 일부 실시형태를 도시한다. 서열 내 변형은 밑줄표시되어 있고, 볼드체로 강조된다. 이들 변형 및/또는 조합은 요법에서 현재 사용되는 다른 화합물보다 더 우수한 생체치료제 및/또는 대안을 제공할 수 있다는 것이 주목된다.
도 26A 내지 도 26C에 나타내는 바와 같이, VEGFR-Fc 및 Eylea는 VEGF에 대해 유사한 친화도로 결합한다. 도 26A는 VEGFR-Fc의 비아코어 분석을 도시한다. 도 26B는 Eylea의 비아코어 분석을 도시한다. 도 26C는 VEGFR-Fc 및 Eylea의 실험 결과(Ka, Kd, KD 및 Rmax)를 도시한다.
일부 실시형태에서, 도 18 내지 도 23, 및 도 25 중 임의의 하나 이상에서 구체화된 아미노산 서열에 대한 임의의 하나 이상의 서열은 본 명세서에 제공된 임의의 다른 실시형태의 대응하는 구조로 바뀔 수 있거나 또는 본 명세서에 제공된 임의의 다른 서열로 교환될 수 있다. 예를 들어, 도 13C 내지 도 13E, 도 19, 또는 도 25 내의 임의의 서열은 도 18, 도 21 또는 도 23으로부터의 임의의 IL-6 중쇄, 본 명세서에 제공된 임의의 링커(예를 들어, 도 20), 임의의 경쇄(도 22)와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 VEGFR-항-IL-6 입체배치이며, 링커(예를 들어, 도 20, 서열 2A)에 연결되고, 중쇄 IL-6 서열(예를 들어, 도 21, 서열 3A 또는 3B)에 연결되며, 경쇄 서열(예를 들어, 도 22, 서열 4A)에 연결된, 서열 1A 내지 1D 중 하나의 조합(도 19)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 1A 내지 1D 중 임의의 하나(도 19)는 링커(도 20)와, 중쇄 항-IL-6 서열(도 21, 서열 3A 내지 3I)과, 그리고 경쇄 항-IL-6 서열(도 22, 서열 4A 내지 4C)과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 작제물의 임의의 특정 단위에 대한 임의의 다른 대응하는 서열은 이들 단위 중 임의의 하나로 바뀌거나 대신할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중 저해제는 하나 이상의 상승적 결과를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이중 저해제는 단일요법으로서 투여되는 각각의 부문보다 상승적으로 더 양호하다(예를 들어, IL-6 요법과 VEGF 요법이 조합됨). 일부 실시형태에서, 조합된 VEGFR-IL-6 작제물은 증식 분석 결과에 나타낸 바와 같은 상승적 결과를 제공한다(예를 들어, 이중 저해제가 HUVEC 증식의 분명한 효과, 혈관신생의 중요한 성분을 갖는 경우에, Eylea 또는 항-IL-6 중 어느 것도 임의의 변화를 달성하지 않음). 따라서, 일부 실시형태에서, HUVEC 증식을 제어하는 방법이 제공되며, 이에 의해 본 명세서에 제공된 VEGFR-항-IL-6 작제물을 사용한다.
다른 실시형태에서, 융합 작제물은 VEGF 트랩 결과와 항-IL-6 결과를 둘 다 달성함으로써 단순히 상가적 이점을 제공한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 작제물이 생성되도록 또는 항-IL-6-VEGFR 작제물이 생성되도록 본 명세서에 제공된 표 중 임의의 하나 이상에서 하나 이상의 성분이 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 또한 Fc 영역을 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역일 수 있다.
일부 실시형태에서, CDR 단독(임의의 특정 프레임워크 부문과 함께 또는 프레임워크 부문 없이)은 항체 부문으로서 사용될 수 있다. 따라서, 각각의 쇄 또는 쇄(중쇄 및 경쇄)의 쌍 내의 CDR 중 임의의 하나 이상(예를 들어, 3 또는 6)은 임의의 다른 성분(VEGFR 및/또는 링커)와 조합하여 본 명세서에 제공된 임의의 표 또는 도면으로부터 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 IL-6 작제물로부터의 CDR(및/또는 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR)은 본 명세서에 제공된 VEGFR 서열 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 IL-6 작제물로부터의 임의의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 본 명세서에 제공된 VEGFR 서열 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 링커는 최종 작제물 내에서도 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 임의의 핵산 서열이 (예를 들어, 단리에서, 벡터 내에, 또는 세포에서 등) 마찬가지로 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생체접합체를 형성하는 접합을 위한 임의의 하나 이상의 중합체는 본 명세서에 제공된 임의의 VEGFR-IL6 작제물과 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3A 또는 3B)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1A 내지 1D(도 19)이다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3A)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1A(도 19)이다. 일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3A)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1B(도 19)이다. 일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3A)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1C(도 19)이다. 일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3A)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1D(도 19)이다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3B)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1A(도 19)이다. 일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3B)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1B(도 19)이다. 일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3B)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1C(도 19)이다. 일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 조합은 링커(도 20의 2A)에 연결되고, 중쇄(도 21의 3B)에 연결되며, 도 22로부터의 경쇄 4A와 결합된 VEGFR에 대해 서열 1D(도 19)이다.
일부 실시형태에서, 임의의 IL-6 항체 서열은 본 명세서에 제공된 임의의 VEGFR 서열과 함꼐 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR(1, 2 또는 3 경쇄 및 1, 2 또는 3개의 중쇄) 항-IL-6 서열은 임의의 VEGFR 배열과 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 임의의 항-IL-6 항체 경쇄 및/또는 중쇄가 사용될 수 있으며, 임의의 하나 이상의 점 돌연변이가 표 18.1 내지 18.4 중 임의의 하나 이상에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 융합 작제물은 표 18.1 내지 18.4 중 임의의 하나 이상에서 확인되는 임의의 하나 이상의 위치에서 점 돌연변이를 갖는 항-IL-6 작제물을 사용한다. 일부 실시형태에서, 변경된 위치는 하전된 잔기를 나타내는 적절한 도면에서 밑줄 표시되고 볼드체 표시된 것이다. 일부 실시형태에서, 작제물은 중쇄의 변화가 S35H, G66D, L100A 또는 L100S 중 하나 이상을 포함하고, 경쇄의 변화가 M32L, M50D, N52S 또는 M88Q 중 하나 이상을 포함하는 것이다. CDR 위치는 설명할 때 가변 도메인의 출현 순서에 따른다(예를 들어, S35H, G66D…). 설명할 때의 Fc 위치는 EU 넘버링을 따른다(예를 들어, L234A, L235A…). 일부 실시형태에서, 작제물(예를 들어, (본 명세서에 제공된 생체중합체 중 하나 이상에 대한) Il-6, 및/또는 IL-6 VEGF Trap, 및/또는 IL-6 VEGF Trap 생체접합체에 대한 항체)은 중쇄 및 경쇄에서 다음 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8을 포함한다: 중쇄에서 S35H, G66D, L100A 및/또는 L100S 및 경쇄에서 M32L, M50D, N52S 및/또는 M88Q. 일부 실시형태에서, 이들 점 돌연변이는 본 명세서에 제공된 Il-항체 또는 Il-6 항체를 함유하는 작제물 중 임의의 하나에서 사용될 수 있다.
당업자에 의해 인식될 바와 같이, 본 명세서에 제공된 다양한 작제물이 있다. 일반적으로, 이들 작제물은 Il-6에 대한 항체, 및/또는 항-IL-6 VEGF Trap(항체와 VEGF Trap의 융합), 및/또는 IL-6 VEGF Trap 생체접합체(본 명세서에 제공된 생체중합체 중 하나 이상과의 융합), 및/또는 VEGF Trap 작제물 및/또는 VEGF Trap 생체중합체로 그룹화될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 임의의 별개의 성분(및 이의 변이체)은 별개로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 이들 그룹화의 작제물(Il-6에 대한 항체, 및/또는 항-IL-6 VEGF Trap(항체와 VEGF Trap의 융합), 및/또는 IL-6 VEGF Trap 생체접합체(본 명세서에 제공된 하나 이상의 생체중합체와의 융합), 및/또는 VEGF Trap 작제물 및/또는 VEGF Trap 생체중합체)은 본 명세서에 제공돈 임의의 방법 또는 다른 조성물에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 이들 옵션은 IL-6 VEGF Trap 요법, 및/또는 IL-6 요법, 및/또는 IL-6 VEGF Trap 생체접합체에 관해 기재된 임의의 치료 방법에 대해 사용될 수 있다. 인식될 바와 같이, 각각의 작제물의 특징 및 특성은 본 명세서에 상술된 성분의 특성과 일치되게 각각의 치료에 대해 상이할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 세포주, 핵산, 요법, 및 다른 실시형태에 관해 본 명세서에 제공된 설명은 항-IL-6-VEGF Trap 및/또는 이의 생체접합체에 대해서 뿐만 아니라 항체(및, 예를 들어, 이의 단편), 항체-생체접합체, 항-IL-VEGF Trap 및/또는 생체접합체와 별개인 VEGF Trap 작제물에 대해 특이적으로 상정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IL-6에 대한 임의의 점 돌연변이(또는 이의 조합)은 항체 및 VEGF 트랩 기반 배열 대신에, 단순히 항체 기반 치료를 위한 항체(또는 이의 결합 단편)에서 사용될 수 있다. 따라서, VEGF Trap 및 IL-6 항체에 대한 점 돌연변이는 융합 배열과 별개인 이러한 작제물(및 이의 용도 및 제조 방법)을 기재하기 때문에, 융합 배열의 내용으로 (제공하고 있다고 해도) 제한되지 않는다. 모든 이러한 실시형태를 별개로 반복하기 보다는, 배열(Il-6에 대한 항체, 및/또는 항-IL-6 VEGF Trap(항체와 VEGF Trap의 융합), 및/또는 IL-6 VEGF Trap 생체접합체(하나 이상의 본 명세서에 제공된 생체중합체와의 융합), 및/또는 VEGF Trap 작제물, 및/또는 VEGF Trap 생체중합체) 중 하나에 대한 임의의 이러한 설명을 적용하며, 모든 다른 이러한 배열(Il-6에 대한 항체, 및/또는 항-IL-6 VEGF Trap(항체와 VEGF Trap의 융합), 및/또는 IL-6 VEGF Trap 생체접합체(하나 이상의 본 명세서에 제공된 생체중합체와의 융합), 및/또는 VEGF Trap 작제물, 및/또는 VEGF Trap 생체중합체)에 대한 옵션을 확인한다는 것이 주목된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 실시형태의 도 13C 내지 도 13E, 도 19, 및 도 25에 있는 것을 포함하여, 조성물, 성분 또는 요법으로서 사용하기 위한 임의의 VEGF Trap 작제물이 상정된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 실시형태의 표 1A 및 표 1E 및 도 5, 도 18, 도 21, 도 22, 도 23 및 도 24에 있는 것을 포함하여, 조성물, 성분 또는 요법으로서 사용하기 위한 임의의 항-IL-6 항체 작제물이 상정된다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 VEGF Trap 서열 내 94번 위치에서, VEGF Trap 서열 내 95번 위치에서, 또는 VEGF Trap 서열 내 T94I 및 H95I에서 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제가 제공된다. VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 항-IL6 항체 및 VEGF (VEGFR1/2) 트랩의 트랩 항체 융합을 포함하되, 이중 저해제는 VEGFR 서열의 절단을 감소시키기 위해 VEGFR 서열 내에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 분자량이 1.0MDa이다.
일부 실시형태에서, VEGR-항-IL-6 이중 저해제는 염증 망막질환에 대한 요법을 제공한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 불변 중쇄, 불변 경쇄, 단편 항원 결합, 단편 결정화 가능(Fc), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 가변 중쇄, 가변 경쇄 및 CDR 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 중쇄 가변 영역 서열은 도 18의 옵션 VI, VII, VIII, IX, X, XI 또는 XII로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, VEGF 트랩 서열은 도 19의 옵션 1A, 1B, 1C 또는 1D 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, VEGR-항-IL-6 이중 저해제에 대해, 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열은 도 21의 옵션 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H 또는 3I 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제에 대해, 항-IL-6 분자에 대한 경쇄 서열은 도 24B의 옵션 4A, 4B, 또는 4C 중 적어도 하나로부터 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제에 대해, 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열은 도 24A의 옵션 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 또는 5I 중 적어도 하나로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 도 25의 옵션 6A, 6B, 6C 또는 6D 중 적어도 하나로부터의 VEGFR-Fc 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 도 18 내지 도 25의 서열 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 IL-6 VH; IL-6 VL; IL-6 Fc; VEGF Trap; 및 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-6 VH는 도 21 또는 도 23의 IL6 VH 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-6 VL은 도 22의 IL6 VL 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc는 도 23의 Fc 서열로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF Trap은 VEGF 트랩 서열로부터의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 3개의 중쇄 CDR; 적어도 3개의 경쇄 CDR; VEGF 트랩 서열; 및 링커 서열을 포함하는 단백질 작제물이 제공되되, 각각의 서열은 도 18 내지 25 내의 서열로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL-6 VH, IL-6 VL, IL-6 Fc, VEGF Trap을 포함하는 융합 단백질이 제공되되, 융합 단백질은 HUVEC 증식을 변경시킨다. 일부 실시형태에서, 각각의 서열은 도 18 내지 25 내의 서열로부터 선택된다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 단편 및 변형된 항체를 포함하는 임의의 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 뉴클레오타이드의 제조 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성되고 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 임의의 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 약제학적 조성물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 조성물을 제공한다.
임의의 이러한 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드는 또한 본 발명에 의해 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 대응하는 HnRNA 분자 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가적인 암호화 또는 비암호화 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있지만, 필요하지 않을 수도 있고, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수도 있지만, 필요하지 않을 수도 있다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 약 70%의 동일성, 더 바람직하게는, 적어도 약 80%의 동일성, 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 약 90%의 동일성, 가장 바람직하게는, 적어도 약 95%의 동일성을 나타낸다.
두 서열 내 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열이 이하에 기재하는 바와 같은 최대 대응도로 정렬될 때와 동일하다면, 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 "동일한" 것으로 언급된다. 두 서열 간의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 비교창에 걸쳐 서열을 비교함으로써 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 "비교창"은 적어도 약 20개의 인접한 위치, 보통 30 내지 약 75, 또는 40 내지 약 50의 세그먼트를 지칭하며, 이때 두 서열이 최적으로 정렬된 후에, 서열은 동일한 수의 인접한 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 디폴트 파라미터를 이용하여 생물정보학(bioinformatics) 소프트웨어(DNASTAR(등록상표), Inc., 위스콘신주 메디슨에 소재)의 Lasergene(등록상표) 세트에서 MegAlign(등록상표) 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 다음의 참고문헌에 기재된 몇몇 정렬 체계를 구현한다: 문헌[Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. InDayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].
바람직하게는, "서열 동일성 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되되, 비교창 내 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 부분은 두 서열의 최적의 정렬에 대해 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해, 20% 이하, 보통 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 서열 둘 다에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 생기는 위치 수를 결정하여 매칭 위치 수를 얻고, 매칭 위치 수를 기준 서열(즉, 창 크기) 내 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 백분율을 계산한다.
변이체는 또한, 또는 대안적으로 천연 유전자, 또는 이의 부분 또는 보체에 대해 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 변이체는 천연 항체를 암호화하는 천연 유래 DNA 서열(또는 상보성 서열)에 대해 중간으로 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.
적합한 "보통으로 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0) 용액에서 사전 세척하는 것; 50℃ 내지 65℃, 5 X SSC에서 밤새 혼성화시키는 단계; 이어서, 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "고도로 엄격한 조건" 또는 "높은 엄격 조건"은 하기와 같다: (1) 예를 들어, 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 도데실 황산나트륨으로 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 고온을 사용하는 단계; (2) 혼성화 동안에 세정제, 예컨대, 폼아마이드, 예를 들어, 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충제와 함께 50%(v/v) 폼아마이드를 pH 6.5에서 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨과 42℃에서 사용하는 단계; 또는 (3) 42℃에서 50% 폼아마이드, 5×SSC (0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 파이로인산나트륨, 5×덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50 ㎍/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 황산덱스트란을 사용하고 나서, 42℃에서 0.2×SSC(염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 50% 폼아마이드로 세척한 다음에, 0.1×SSC 함유 EDTA로 55℃에서 이루어진 높은 엄격 세척을 사용하는 단계. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하는 데 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인식할 것이다.
당업자는 유전자 암호의 축퇴(degeneracy) 결과로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 다수의 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈출현빈도(codon usage) 차이에 따라 다른 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 구체적으로 상정된다. 추가로, 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범주 이내이다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 및/또는 치환으로서 변경되는 내인성 유전자이다. 얻어진 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 필요하지 않을 수도 있다. 대립유전자는 표준 기법(예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)를 이용하여 확인될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 이용하여 얻을 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 본 명세서에 상세하게 기재할 필요는 없다. 당업자는 목적하는 DNA 서열을 생성하기 위해 본 명세서에 제공된 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용할 수 있다.
재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위해, 목적하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 벡터 내로 삽입될 수 있고, 벡터는 결국 본 명세서에서 추가로 논의되는 바와 같이 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 세포는 직접 흡수, 내포작용, 형질감염, F-메이팅(F-mating) 또는 전기천공법에 의해 외인성 폴리뉴클레오타이드를 도입함으로써 형질전환된다. 일단 도입된다면, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 비통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 세포 내에서 유지되거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재도입을 가능하게 한다. PCR 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호 및 제4,683,202호뿐만 아니라 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내 단리된 DNA를 이용하고, 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 얻어질 수 있다. 세포가 복제되고, DNA가 RNA로 전사될 때, 이어서, RNA는 당업자에게 잘 공지되고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, 상기 참조] 방법을 이용하여 단리될 수 있다.
표준 기법에 따라 적합한 클로닝 벡터가 작제되거나 또는 당업계에서 이용 가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용되도록 의도되는 숙주 세포에 따라 다를 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기 복제하는 능력을 가질 것이고, 특정 제한 엔도뉴클레아제를 위한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 운반할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예를 들어, pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대, pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 상업적 공급업자, 예컨대, 바이오래드(BioRad), 스트라겐(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 이용 가능하다.
발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 복제 가능한 폴리뉴클레오타이드 작제물이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 세포에서 복제 가능하여야 한다는 것이 나타난다. 적합한 발현 벡터는 국제 특허 WO 87/04462에 개시된 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드 및 발현 벡터(들)를 포함하는, 플라스미드, 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않을 수 있다: 신호 서열; 복제기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결자). 발현(즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 조절 요소, 예컨대, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 중단 코돈이 또한 보통 필요하다.
관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 전기천공법, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용하는 형질감염; 미세입자 투사법(microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 감염제, 예컨대, 백시니아 바이러스인 경우)을 포함하는, 다수의 절절한 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 선택은 숙주 세포의 특징에 따를 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종성 DNA를 과발현시킬 수 있는 임의의 숙주 세포는 관심 대상의 항체, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 단리시킬 목적을 위해 사용될 수 있다. 포유류 숙주 세포의 비제한적 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 국제 특허 출원 WO 87/04462 참조. 적합한 비포유류 숙주 세포는 원핵(예컨대, 이콜라이(E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisae), 쉬조카카로마이세스 폼베(S. pombe); 또는 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는, 존재한다면, 숙주 세포에서 관심 대상의 대응하는 내인성 항체 또는 단백질보다 약 5배 높은, 더 바람직하게는, 10배 더 높은, 훨씬 더 바람직하게는, 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현시킨다. IL-6에 특이적인 결합을 위한 숙주 세포의 선별은 면역분석 또는 FACS에 의해 달성된다. 관심 대상의 항체 또는 단백질을 과발현시키는 세포가 확인될 수 있다.
발현 벡터는 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)의 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 생체내 외인성 단백질의 발현을 얻기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호 참조. 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자총 또는 카테터 투여 및 국소 투여를 비롯한 국소 또는 전신 투여를 포함한다. 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 교감신경간 또는 결절종에, 또는 관상동맥, 심방, 심실 또는 심막 내로 직접적으로 투여된다.
발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개된 DNA 전달 기법은, 예를 들어, 문헌[Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200㎎ DNA의 범위로 투여된다. 유전자 요법 프로토콜 동안 ㅇ약 500 ng 내지 약 50㎎, 약 1㎍ 내지 약 2㎎, 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 및 약 20㎍ 내지 약 100㎍의 DNA가 또한 사용될 수 있다. 치료적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비바이러스 유래일 수 있다(일반적으로, 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51; Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148] 참조). 이러한 암호화 서열의 발현은 내인성 포유류 또는 이종성 프로모터를 이용하여 유도될 수 있다. 암호화 서열의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오타이드의 전달 및 목적하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스 기반 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스(예를 들어, 국제 특허 출원 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호), 알파바이러스 기반 벡터(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터(Sindbis virus vector), 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki forest virus)(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스강 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, 국제 특허 출원 제 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기재된 바와 같은 사멸 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
사멸 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다음이온 응축 DNA(예를 들어, 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147] 참조); 리간드-연결 DNA(예를 들어, 문헌[Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985]); 진핵 세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,814,482호; 국제 특허 출원 제 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 비바이러스 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 국제 특허 공개 WO 90/11092 및 미국 특허 제5,580,859호에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 미국 특허 제5,422,120; 국제 특허 출원 제 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 유럽 특허 제0524968호에 기재되어 있다. 문헌[Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411] 및 문헌[Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581]에 추가적인 접근이 기재되어 있다.
조성물
본 발명은 또한 유효량의 본 명세서에 기재된 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 예뿐만 아니라 제형화하는 방법이 또한 본 명세서에 기재된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 및/또는 항체(및/또는 Ab-Trap) 접합체를 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)은 인간 IL-6을 인식한다. 다른 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체는 원치않는 또는 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대, 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발시키지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-6 길항제(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 항체의 하나 이상의 CDR(들)(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는, 일부 실시형태에서, 모두 6개의 CDR)을 포함한다.
조성물은 하나 초과의 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)(예를 들어, IL-6의 상이한 에피토프를 인식하는 IL-6 항체의 혼합물)을 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 하나 초과의 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap), 또는 IL-6의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 IL-6의 상이한 변이체를 인식하는 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)의 혼합물을 포함한다. 추가로, 일부 실시형태에서, 조성물은 또한, 또는 대신에, 하나 초과의 VEGF Trap을 포함할 수 있다. 부문이 적어도 본 명세서에 언급된 바와 동일하거나 유사한 기능성을 가진다면, 이들 대안의 VEGF Trap 부문은 VEGF Trap 부문에 대해 상이한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 조성물은 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정제(Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)를 추가로 포함할 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이며, 완충제, 예컨대, 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기산; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 염화옥타데실다이메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리솔베이트, 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 본 명세서에서 추가로 기재된다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 항산화제, 완충제, 정균제 및 의도된 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성인 제형을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 농조화제(thickening agent)를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 주사용 용액에 사용될 수 있는 부형제는, 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 조성물은 단위 용량 또는 다회 용량 용기, 예를 들어, 밀봉 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에, 운반되는 멸균 액체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉시 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 실질적으로 등장성이며, 삼투질농도가 약 250 내지 350mOsm/㎏ 물임을 나타낼 수 있다.
약제학적 조성물은 보존제, 가용화제, 안정제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 취기제, 염(본 발명의 물질은 그 자체가 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제공될 수 있음), 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 물질에 추가로 치료적 활성제를 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염과 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 부형제는 식염수, 완충 식염수(예컨대, 인산염 완충 식염수), 덱스트로스, 리포좀, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap), IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 화합물, 예컨대, 치료적 화합물 또는 분자, 예를 들어, 항-염증 약물, 진통제 또는 항생제와 함께 사용될 수 있다. 다른 화합물과의 이러한 투여는 동시, 별개 또는 순차적일 수 있다. 성분은 적절한 경우 설명서를 포함할 수 있는 키트의 형태로 제조될 수 있다.
눈 장애를 예방하거나 치료하는 방법
일부 실시형태에서, 치료적 처치 방법을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 및 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체가 다양한 적용분야에서 유용하다.
일부 실시형태에서, 안질환, 예를 들어 AMD를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 AMD를 치료하는 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 항-IL-6 항체 또는 IL6 Ab-VEGF Trap을 포함하는 유효량의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 AMD의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, AMD는 건성 AMD 및 습성 AMD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 IL-6 길항 항체 또는 IL-6 Ab-VEGF Trap 또는 이들의 접합체를 포함하는 유효량의 조성물을 AMD의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 AMD를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-6 항체 및/또는 IL-6 Ab VEGF Trap 및/또는 이의 접합체는 습성 또는 신생혈관 황반변성, 습성 또는 신생혈관 연령-관련 황반변성, 건성 연령-관련 황반 변성, 정맥, 동맥 또는 안구의 다른 차단 및 또는 망막 부종을 동반하거나 또는 동반하지 않는 망막 혈관, 전측 및 후측 포도막염, 포도막염 황반 부종, 당뇨망막병증, 증식성 당뇨망막병증, 당뇨 황반 부종, 비증식성 당뇨 황반 부종, 및 안구내 종양의 위험을 치료 및/또는 예방 및/또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 IL-6 Ab-VEGFTrap은: (i) VEGF 요법-내성 환자, (ii) 추가적인 기저 병리, 예컨대, 섬유증, 상처 치유 및 위축증의 진행에 기인하는 항-VEGF 제제에 대한 효능을 상실한 환자 및/또는 (iii) 빈번한 유리체강내 주사에 대한 필요로 인한 불충분한 치료(undertreatment)에 대해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 안질환, 예컨대, 전신 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 그레이브스병 또는 시속척수염과 같은 눈에 영향을 미치는 전신 질환, 또는 다발성 경화증, 류마티스 관절염과 같이 눈에 영향을 미치지 않는 전신 질환은 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 통해 치료될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 종양 적응증에 대한 면역 조절제, 예컨대, PD-1/PDL-1과 병용하여 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 요법의 하나 이상의 추가적인 형태(들)를 이용하여 대상체를 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 형태의 요법은 비쥬다인(Visudyne)(등록상표), 레이저 광응고화 또는, 예를 들어, 루센티스(Lucentis)(등록상표), 마쿠겐(Macugen)(등록상표), Eylea(등록상표), 오저덱스(Ozurdex)(등록상표), 일루비엔(iluvien)(등록상표), 트리에센스(Triesence)(등록상표), 또는 트리바리스(Trivaris)(등록상표)의 유리체강내 주사를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 추가적인 AMD 요법이다.
본 명세서에 기재된 모든 방법에 관해, IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)에 대한 언급은 또한 하나 이상의 추가적인 제제를 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 잘 공지된 완충제를 포함하는 적합한 부형제, 예컨대, 약제학적으로 허용 가능한 염을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 또는 다른 치료 방법과 병용하여 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에서 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 임의의 단리된 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 임의의 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 임의의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 과활성 IL-6 활성을 갖는 환자를 확인하는 단계 및 본 명세서에 개시된 임의의 단리된 길항 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 과활성 IL-6 활성을 갖는 환자를 확인하는 단계 및 본 명세서에 개시된 임의의 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 과활성 IL-6 활성을 갖는 환자를 확인하는 단계 및 본 명세서에 개시된 임의의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 상승된 IL-6 활성 대신에, 또는 추가로 상승된 VEGF 활성을 가진다.
일부 실시형태에서, 장애는 습성 또는 신생혈관 황반변성, 습성 또는 신생혈관 연령-관련 황반변성, 건성 연령-관련 황반 변성, 정맥, 동맥 또는 안구의 다른 차단 및 또는 망막 부종을 동반하거나 또는 동반하지 않는 망막 혈관, 전측 및 후측 포도막염, 포도막염 황반 부종, 당뇨망막병증, 증식성 당뇨망막병증, 당뇨 황반 부종, 비증식성 당뇨 황반 부종, 및 안구내 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 단리된 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap), 접합체 (및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap-접합체), 조성물 또는 이들의 조합물은 1개월에 1회보다 덜 빈번하게 투여된다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체, 접합체, 조성물 또는 이들의 조합물은 2개월마다 1회보다 덜 빈번하게 투여된다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap), 접합체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)-접합체, 조성물 또는 이의 조합물은 3개월마다 1회보다 덜 빈번하게 투여된다. 일부 실시형태에서, 단리된 작제물(예를 들어, 중합체와 함께 또는 중합체 없이 Ab 또는 Ab-Trap)은 1년에 1회 내지 2개월마다 1회의 빈도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료는 항체의 단일 적용일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 결과에 필요하거나 요망된다면 항체의 다회 적용일 수 있다.
IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 또는 이의 접합체는 임의의 적합한 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 실시예는 이용 가능한 기법을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 예시적인 것임은 당업자에게 분명하여야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 공지된 방법, 예컨대, 정맥내 투여, 예를 들어, 볼루스로서 또는 일정 시간에 걸친 지속적 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 경피, 피하, 관절내, 설하, 활액내, 흡입을 통해, 초내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 따라 대상체에게 투여된다. 투여는 전신, 예를 들어, 정맥내 투여일 수 있거나, 또는 국소화될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 비롯한 액체 제형용의 상업적으로 입수 가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접적으로 네뷸라이징될 수 있고, 재구성 후에 동결건조 분말이 네뷸라이징될 수 있다. 대안적으로, IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 플루오로카본 형성 및 정량 흡입기를 이용하여 에어로졸화될 수 있거나 또는 동결건조 및 분쇄 분말로서 흡입된다.
일부 실시형태에서, IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap), IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체 및 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 안질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위해 사용된다. 이렇게 사용된, 접합체는 전형적으로 점안액 및/또는 연고의 형태로 안구, 안구내 및/또는 유리체강내 주사 및/또는 공막옆 주사 , 및/또는 테논낭하(subtenon) 주사, 및/또는 맥락막상 주사 및/또는 국소 투여용으로 제형화되고 이들에 의해 투여된다. 이러한 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap), IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체, 및 조성물은 문헌[Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)]과 같은 참고문헌에 기재된 것을 포함하는, 유리체 내로의 화합물의 서방출을 가능하게 하는 장치 및/또는 데포(depot)로서 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 유리체강내로 전달될 수 있다. 일례에서, 장치는 장기간의 시간 동안 화합물을 방출시키는 최소 및/또는 기질(matrix) 및/또는 수동 확산 시스템 및/또는 캡슐화된 세포의 형태일 수 있다(Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006). 요법 또는 예방으로서, 활성제는 개체에게 주사 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 분산물, 바람직하게는 등장성 또는 실질적으로 등장성으로 투여될 수 있다.
안구, 안구내 또는 유리체강내 투여용 제형은 당업계에 공지된 방법에 의해 그리고 당업계에 공지된 성분을 이용함으로써 제조될 수 있다. 눈 내로 적절한 침투는 효율적인 치료에 바람직하다. 눈의 전방부 질환과 달리, 약물이 국소로 전달될 수 있는 경우에, 망막질환은 보다 부위 특이적인 접근의 가치가 있다. 점안액 및 연고는 눈의 뒤쪽을 거의 침투하지 않으며, 혈액-안구 장벽은 안구 조직 내로 전신으로 투여된 약물의 침투를 방해한다. 일부 실시형태에서, 망막 질환, 예컨대, AMD 및 CNV를 치료하기 위한 약물 전달을 위한 선택 방법은 직접적인 유리체강내 주사이다. 일부 실시형태에서, 유리체강내 주사는 환자의 병태, 및 전달된 약물의 특성 및 반감기에 따르는 간격으로 반복된다.
포유류 및 특히 인간에 대한 투여를 위해, 활성제의 투약량은 전신 투여용으로 0.01㎎/㎏ 체중, 내지 전형적으로 대략 1㎎/㎏인 것이 예상된다. 국소 투여(예를 들어, 유리체강내, 맥락막상, 안구주위 등)가 필요한 안질환에 대해, 투약량은 전형적으로 0.1㎎/눈/용량 내지 10㎎/눈/용량 이상이다. 일부 실시형태에서, 투약량은 100㎕/용량/눈이다. 일부 실시형태에서, 투약량을 투여하기 위해 바늘이 사용될 수 있다. 바늘은, 예를 들어, 30 게이지 ½ 인치 바늘 또는 27G 또는 29G인 ½ 인치 바늘일 수 있다. 의사는 개체의 연령, 체중, 성별 및 반응, 치료 중인 질환 또는 장애 및 치료 중인 개체의 연령 및 병태를 비롯한 인자에 따라서 개체에 가장 적합한 실제 투약량을 결정할 수 있다. 상기 투약량은 평균 사례의 예시이다. 물론 더 높은 또는 더 낮은 투약량이 더 유리한 경우가 있을 수 있다.
이 투약량은 적절하다면 종종(예를 들어, 매주, 40일마다, 매달, 분기별로) 반복될 수 있다. 부작용이 발생한다면, 투약량의 양 및/또는 빈도는 정상적인 임상 실행에 따라 감소될 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1 내지 30일마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)는 환자에서 생체내 이러한 펩타이드의 발현, 즉, 유전자 요법에 의해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 환자 세포 내로 핵산을 (선택적으로 벡터에 함유됨)얻기 위한 2가지 주된 접근이 있다: 생체내 및 생체외. 생체내 전달을 위해, 핵산은 환자에게 직접적으로, 보통 치료적 단백질이 필요한, 즉 치료적 단백질의 생물학적 활성이 필요한 부위에서 환자에게 직접적으로 주사된다. 생체외 치료를 위해, 환자의 세포가 제거되며, 핵산은 이들 단리된 세포 내로 도입되고, 변형된 세포는 환자에게 직접적으로 투여되거나 또는, 예를 들어, 환자에게 이식된 다공성 막 내에서 캡슐화된다(예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 생세포 내로 핵산을 도입하기 위해 이용 가능한 다양한 기법이 있다. 핵산이 시험관 내 배양 세포에 전달되는지 또는 생체내에서 의도된 숙주의 세포에서 전달되는지의 여부에 따라 기법은 달라진다. 시험관내 포유류 세포 내로 핵산의 전달에 적합한 기법은 리포좀, 전기천공법, 미량주사법, 형질도입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 방법 등의 사용을 포함한다. 형질도입은 복제-결함, 재조합 바이러스(바람직하게는 레트로바이러스) 입자와 세포 수용체의 결합, 다음에 입자에 의해 함유되는 핵산의 세포 내로의 도입을 수반한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기법은 바이러스 또는 비-바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스(AAV)) 및 지질-기반 시스템(유전자의 지질-매개 전달을 위한 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임; 예를 들어, 문헌[Tonkinison et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)] 참조)을 이용한 형질감염을 포함한다. 유전자 요법에서 사용하기 위한 가장 바람직한 벡터는 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스이다. 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터는 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서 또는 좌위-한정 요소(들), 또는 다른 수단, 예컨대, 교번의 스플라이싱, 핵 RNA 유출 또는 메신저의 번역 후 변형에 의해 유전자 발현을 제어하는 다른 요소를 포함한다. 추가로, 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터는 치료적 단백질을 암호화하는 유전자의 존재 하에 전사될 때, 이에 작동 가능하게 연결되고 번역 개시 서열로서 작용하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 벡터 작제물은 또한 패키징 신호, 긴 말단 반복부(LTR) 또는 이의 일부, 및 사용한 바이러스에 적절한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위를 (이들이 바이러스 벡터에 이미 존재하지 않는다면) 포함한다. 추가로, 이러한 벡터는 전형적으로 이것이 위치되는 숙주 세포로부터의 PRO 폴리펩타이드의 분비를 위해 신호 서열을 포함한다. 바람직하게는 이 목적을 위한 신호 서열은 포유류 신호 서열, 가장 바람직하게는 치료적 단백질에 대한 천연 신호 서열이다. 선택적으로, 벡터 작제물은 또한 폴리아데닐화를 지시하는 신호뿐만 아니라 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 예로서, 이러한 벡터는 전형적으로 5' LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성 기원, 및 3' LTR 또는 이의 일부를 포함할 것이다. 비바이러스, 예컨대, 양이온성 지질, 폴리라이신 및 덴드리머인 다른 벡터가 사용될 수 있다.
일부 상황에서, 표적 세포, 예컨대, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 표적화하는 제제와 함께 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우에, 내포작용과 연관된 세포-표면 막 단백질에 결합하는 단백질은, 예를 들어, 특정 세포 유형에 친화성이 있는 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 순환 시 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질의 표적화를 위해 그리고/또는 흡수를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개 내포작용 기법은, 예를 들어, 문헌[Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414(1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 제조 및 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해, 문헌[Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992)] 참조. 또한 WO 93/25673 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다.
레트로바이러스 입자 및 구조적 단백질의 제조를 위한 적합한 유전자 요법 및 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,681,746호에서 찾을 수 있다.
일부 양상에 따르면, IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)를 암호화하는 핵산 분자가 투여되는, 포유류에서의 안질환의 치료 또는 예방 방법이 제시된다.
일부 실시형태에서, 이들 IL6/VEGF 이중 저해제 분자는 안과적 염증 질환 공막염, 비증식성 당뇨망막병증, 증식성 당뇨망막병증(PDR), 당뇨 황반 부종, 당뇨 황반 부종의 예방, 증식성 당뇨망막병증의 예방, 삼출성 연령-관련 황반 변성, 삼출성 연령-관련 황반 변성의 예방, 포도막염, 및 포도막염 황반 부종과 같은 안 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
VEGFR-항IL6 치료제는 또한 그레이브스병 또는 시속척수염과 같은 눈에 영향을 미치는 전신 질환, 또는 다발성 경화증, 류마티스 관절염과 같이 눈에 영향을 미치는 전신 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있었다.
이들 분자는 또한 CAR-T 또는 유사한 면역-종양 치료 후에 사이토카인 방출 증후군을 치료하기 위해 사용될 수 있었다. 추가적으로, 항-IL6 분자는 항-PD-1/PD-L1 분자에 의한 치료 후 관찰된 IL-6 발현의 유도를 없앤다(Tsukamoto et al, 2018). 추가적으로, VEGF 신호전달 차단은 또한 항-PD-L1 치료를 개선시킬 수 있다(Allen et al, 2017). 따라서, 이들 이중 저해제는 암을 상승적으로 치료하기 위해 면역관문 저해제(예컨대, PD-1/PDL-1 조절제)와 병용하여 사용될 수 있었다. VEGF 저해는 이것 외의 추가적인 이점을 제공할 것이다. 이의 다른 적용분야는 항-IL6 요법이 항-VEGF 치료에 대해 추가적인 이점을 나타낼 수 있는 교모세포종에서의 뇌부종에 사용될 수 있었다. 생체중합체는 고형 종양을 침투하는 데 유리한 증가된 조직 분포를 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 접합체(또는 다양한 단백질)은 본 명세서에 제공된 임의의 하나 이상의 장애의 예방에 유용하다.
제형
본 발명에 따라 사용되는 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 및 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체의 치료적 제형은 목적하는 순도를 갖는 항체를 선택적 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 저장을 위해 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이며, 완충제, 예컨대, 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기산; 염화나트륨과 같은 염; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 염화옥타데실다이메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(TWEEN)(상표명), 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 및/또는 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체를 함유하는 리포좀은 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 향상된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 목적하는 지름을 갖는 리포좀을 얻기 위해 정해진 기공 크기의 필터를 통해 압출된다.
활성 성분은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 거대구체, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 거대에멀션에 포집될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 기질이 형상화된 물품의 형태, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐인, 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함한다. 지속-방출 기질의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 아이소뷰티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다.
생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균이어야 한다. 이는, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료적 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 및/또는 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 접합체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액백 또는 바이알에 넣는다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 항체 접합체 조성물은 주사기에 넣어서 사전 충전된 주사기를 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 내독소 및/또는 관련된 발열 물질이 실질적으로 없는 무발열원 조성물이다. 내독소는 미생물 내부로 국한되고 미숭물이 파괴되거나 사멸될 때에만 방출되는 독소를 포함한다. 발열 물질은 또한 박테리아 및 다른 미생물로부터의 발열-유도, 열안정성 물질을 포함한다. 이들 물질은 둘 다 인간에게 투여된다면 발열, 저혈압 및 쇼크를 야기할 수 있다. 잠재적으로 유해한 효과때문에, 소량의 내독소조차도 정맥내로 투여되는 약제학적 약물 용액으로부터 제거되어야 한다. 전신 주사, 예컨대, IV 또는 IP에 대해, 식품의약국(Food & Drug Administration: "FDA")은 정맥내 약물 적용을 위해 1회 1시간으로 5 내독소 단위(endotoxin unit: EU)/용량/킬로그램 체중의 상한을 설정하였다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26(1):223 (2000)). 치료적 단백질이 수백 또는 수천 밀리그램/킬로그램 체중의 양으로 투여될 때, 관심대상의 단백질(예를 들어, 항체)을 이용하는 경우에서와 같이, 미량의 유해하고 위험한 내독소조차도 제거되어야 한다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10 EU/㎎ 미만, 또는 5 EU/㎎ 미만, 또는 1 EU/㎎ 미만, 또는 0.1 EU/㎎ 미만, 또는 0.01 EU/㎎ 미만, 또는 0.001 EU/㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물 또는 방법은 0.1EU/눈/주사를 허용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물 또는 방법은 0.05EU/눈/주사를 허용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물 또는 방법은 0.02EU/눈/주사를 허용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물 또는 방법은 0.01EU/눈/주사를 허용한다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여를 위한, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 단위 투약 형태, 예컨대, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌약일 수 있다.
고체 조성물, 예컨대, 정제를 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 약제학적 담체, 예를 들어, 통상적인 정제 성분, 예컨대, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 솔비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 약제학적 희석제, 예를 들어, 물과 혼합되어, 본 발명의 화합물, 또는 이의 비독성의 약제학적으로 허용 가능한 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 사전제형 조성물을 형성한다. 이들 사전제형 조성물을 균질한 것으로 지칭할 때, 활성 성분은 조성물 전체를 통해서 균질하게 분산되며 따라서 조성물은 동일하게 효과적인 단위 투약 형태, 예컨대, 정제, 알약 및 캡슐로 용이하게 다시 나누어질 수 있다는 것을 의미한다. 이어서, 본 고체 사전제형 조성물은 약 0.1 내지 약 500㎎의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기재한 유형의 투약 형태로 다시 나누어진다. 신규한 조성물의 정제 또는 알약은 투약 형태를 제공하도록 코팅되거나 달리 조제되어 장기간 작용의 이점을 얻는다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투약 및 외부 투약 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자 위로 외피를 형성한다. 두 성분은 위에서의 붕괴에 저항하는 작용을 하는 장용층에 의해 분리될 수 있고, 내부 성분이 온전하게 십이지장 내로 통과하거나 방출이 지연되는 것을 가능하게 한다. 이러한 장용층 또는 코팅에 대해 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 셸락, 세틸 알코올 및 아세트산셀룰로스로서 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 이러한 물질의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제는, 특히, 비이온성 제제, 예컨대, 폴리솔베이트 또는 폴리옥시에틸렌솔비탄(예를 들어, 트윈(Tween)(상표명) 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 솔비탄(예를 들어, 스팬(Span)(상표명) 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 0.01% 내지 5%의 표면-활성제를 편리하게 포함할 것이고, 0.01 내지 0.02% 또는 0.1 내지 2.5%(폴리솔베이트 20 또는 80)일 수 있다. 필요하다면, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
적합한 에멀션은 상업적으로 입수 가능한 지방 에멀션, 예컨대, 인트라리피드(Intralipid)(상표명), 리포신(Liposyn)(상표명), 인포누트롤(Infonutrol)(상표명), 리포푼딘(Lipofundin)(상표명) 및 리피산(Lipiphysan)(상표명)을 이용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전 혼합된 에멀션 조성물에 용해될 수 있거나 또는 대안적으로 오일(예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 참깨유, 옥수수유 또는 아몬드유) 및 인지질(예를 들어, 달걀 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴)과 물을 혼합할 때 형성된 에멀션에 용해될 수 있다. 다른 성분, 예를 들어, 글리세롤 또는 글루코스가 첨가되어 에멀션의 장성(tonicity)을 조절할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 적합한 에멀션은 전형적으로 최대 20%의 오일, 예를 들어, 5 내지 20%를 함유할 것이다. 지방 에멀션은 0.1 내지 1.0㎛, 특히 0.1 내지 0.5㎛의 지방 점적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0의 범위의 pH를 가진다.
에멀션 조성물은 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap)을 인트라리피드(Intralipid)(상표명) 또는 이의 성분(대두유, 달걀 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 조성물은 약제학적으로 허용 가능한, 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 및 분말 중의 용액 및 현탁액을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시한 바와 같은 적합한 약제학적으로 허용 가능한 염을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 멸균 약제학적으로 허용 가능한 용매 중의 조성물은 기체의 사용에 의해 네뷸라이징될 수 있다. 네뷸라이징 용액은 네뷸라이징 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나 네뷸라이징 장치는 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 또는 모든 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 또는 본 명세서에 기재된 접합체 및 본 명세서에 기재된 발명의 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 일반적으로, 이들 설명서는 상기 기재한 치료적 처치를 위한 IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 또는 접합체의 투여 설명을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트가 제공된다. 특정 실시형태에서, 키트는 건조 단백질을 갖는 제1 용기와 수성 제형을 갖는 제2 용기를 둘 다 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단일 및 다중 챔버의 사전 충전 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 동결주사기)를 함유하는 키트가 포함된다.
일부 실시형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성 항체이다. IL-6 길항 항체(및/또는 IL-6 Ab-VEGF Trap) 또는 접합체의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투약량, 투약 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회 용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 설명서는 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 기재된 설명서이지만, 기기-판독 가능 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에서 수행되는 설명서)가 또한 허용 가능하다.
본 발명의 키트는 적합하게 패키징된다. 적합한 패키징은 바이알, 보틀, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 특정 장치, 예컨대, 사전 충전된 주사기, 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 아토마이저(atomizer)) 또는 주입 장치, 예컨대, 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 상정된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 1종의 활성제는 IL-6 길항 항체 또는 접합체이다. 용기는 제2 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 선택적으로 추가적인 성분, 예컨대, 완충제 및 설명 정보를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 투약 주사기를 다시 충전시키기 위해 사용되는 추가적인 주사기 및 바늘을 포함할 수 있다. 정상적으로는, 키트는 용기 및 용기 상에 또는 이에 결합된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다.
다음의 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공하며, 본 발명의 범주를 임의의 방법으로 제한하고자 하는 의도는 아니다. 사실, 본 명세서에 나타내고 기재한 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명으로부터 당업자에게 분명하게 될 것이며, 첨부하는 청구범위의 범주 내에 속할 것이다.
실시예
신생혈관 망막질환의 치료를 위한 항-혈관내피 성장인자(VEGF) 생물학적 약물의 치료적 성공에도 불구하고, (i) VEGF 요법-내성 환자, (ii) 섬유증, 상처치유 및 위축증과 같은 추가적인 기저 병리의 진행으로 인해 항-VEGF 제제에 대한 효능을 상실한 환자 (iii) 빈번한 유리체강내 주사에 대한 필요로 인한 불충분 치료때문에, 궁극적 필요가 여전히 존재한다. 이하는 VEGF와 IL-6을 둘 다 저해하도록 설계된 신규한 이중특이성 생물학적 제제에 관한 결과이다.
방법 이중 저해제를 설계하였고, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance: SPR)에 의한 이들의 각각의 표적에 대한 이들의 결합 친화도에 대해 특성규명하였다. 분자의 기능적 양상은 (1) 각각의 표적의 각각의 수용체에 대한 경쟁적 차단을 표적화하는 ELISA 분석에 의해 시험하였고, (2) VEGF 및/또는 IL-6 자극된 1차 인간 망막 미세혈관 내피세포(HRMVEC) 증식 분석을 수행하고, 그리고 (3) 혈관형성 발아(sprouting)의 저해를 평가하는 3차원 1차 세포 공동배양 분석을 수행할 수 있다.
VEGF 및 IL-6에 대해 pM 친화도로 결합된 IL-6 Ab-VEGF Trap 작제물.각각의 표적의 결합 역학은 다른 것의 존재와 독립적이었는데, 이는 표적 둘 다 간섭 없이 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 분자의 각각의 표적에 대한 결합은 이들의 각각의 동족 수용체와의 상호작용을 저해한다.
생체중합체 접합체 플랫폼 내에서 조합될 때, 이들 이중 저해제 분자는 망막질환의 차세대 치료 및 예방을 위한 추가적인 치료제를 제공한다.
실시예 1 - 항체 생성 및 선별
방법/결과:
항-IL-6
본 실시예는 항-VEGF 트랩에 융합된 조작된 인간 IgG1 프레임워크 및 IgG1 Fc 도메인에서 IL-6 항체를 함유하는 항-IL-6 및 항-VEGF 이중 저해제 분자의 작제를 약술한다. 이들 분자에 대한 Fc 도메인은 효과기 기능을 최소화하는 L234A, L235A 및 G237A 치환, 및 반감기 연장 포스포릴콜린 기반 생체중합체를 갖는 부위 특이적 접합을 가능하게 하는 L443C(잔기 위치는 EU 넘버링에 따름)를 함유한다.
조작된 인간 IgG1 프레임워크 내 항-IL-6 파라토프는 이콜라이에서 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 다음에 포유류 시스템에서 부위 지정 돌연변이유발의 조합을 이용하여 친화도 성숙되었다. 항-IL-6 CDR 서열과 함께 중쇄 및 경쇄 Fab를 함유하는 이중 발현 플라스미드 시스템의 작제를 이콜라이에서 달성하였다. 도 3은 도 5에서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 야기하는 공정 흐름도를 도시한다.
이들 아미노산과 결합된 화학적 라이브러리로 인해 Cys, Met 및 Asn을 치환하는 것을 제외하고, 모두 71개의 CDR 위치에 대해 무작위 단일 점 돌연변이를 함유하는 Fab 라이브러리를 작제하였다. 96 웰 플레이트 형식에서의 소규모 발현은 Fab 라이브러리 선별에 대해 이용하였다. 무작위 단일 점 돌연변이를 함유하는 이콜라이 콜로니(TG1 세포, 자이모 리서치(Zymo Research))를 96 웰 플레이트(1.5㎖) 내로 선별하였고, LB Amp+2% 글루코스에서 밤새 30℃에서 성장시켰다. 100㎕의 배양물을 제거하고 100㎕의 30% 글리세롤을 첨가함으로써 다음 날에 별개의 96 웰 플레이트를 생성하였고, 이어서, -80℃에서 저장하였다. 남아있는 배양물을 20분 동안 교반하고, 이후에 30℃에서 단백질 발현의 유도를 위해 1mM IPTG를 함유하는 1.5㎖의 LB Amp에서 재현탁시켰다. 5시간 후에, 세포를 교반하고, 500㎕의 HBS-EP+ 완충제에서 재현탁시키고 나서, 1회의 냉동/해동 주기로 용해시켰다. 용해물은 30분 동안 원심분리시키고, 비아코어(Biacore) 분석을 위해 둥근 바닥 96 웰 플레이트 내로 진공여과시켰다(200㎕).
25℃에서 비아코어 T200(GE 헬스케어)를 이용하여 항-IL-6 Fab의 친화도를 결정하였다. CM5 칩을 EDC 및 NHS로 활성화시키고, 재조합 인간 IL-6(알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 10mM 아세트산나트륨 pH 5로 0.1㎎/㎖의 농도까지 희석시키고 나서, 활성칩 위로 주사하였다. 각각의 칩 통로에 대해 가변적 유동 시간을 이용함으로써 3가지 범위의 항원 밀도(100 내지 150 RU, 300 내지 400 RU, 400 내지 600 RU)를 얻었고, 이후에 에탄올아민으로 차단시켰다. 96-웰 여과시킨 배양 용해물의 상청액을 50㎕/분으로 120초 동안 주사하였다. 해리 속도(k off )의 결정을 위해 단일 지수 붕괴 곡선에 대한 해리 곡선의 적합화(300초)를 사용하였다. 샘플 결합 및 해리의 각각의 주기 후에 60초 동안 50㎕/분으로 주사한 10mM 글리신 pH 1.7을 이용하여 칩 표면을 재생하였다. 돌연변이 확인을 위한 DNA 서열분석을 위해 야생형과 유사한 또는 야생형에 비해 개선된 k off 값을 나타낸 클론을 제출하였다.
총 71개의 CDR 잔기 위치로부터, 선별 데이터는 15개의 잔기가 IL-6 결합에 중요하고 임의의 다른 아미노산으로 대체될 수 없다는 것을 나타내었다. 용인 가능한 위치의 치환은 모 분자와 유사한 k off 값을 초래하였다(표 1.1). 이들 단일 대체의 대부분은 이후에 포유류 발현 벡터에 클로닝된 전체 중쇄 및 경쇄의 유전자에 도입하였고, 이를 단백질 생성을 위해 Expi293 세포의 3㎖ 배양물에 공동형질감염시켰다. 제5일에, 이들 배양물을 원심분리시키고 나서, 분리된 항체를 함유하는 상청액을 채취하고 나서, HBS-EP+ 실행 완충제(1:20 비)로 희석시켰다. 점 돌연변이를 표 1.1 내지 표 1.6에 제시한다.
[표 1.1]
Figure pct00054
표는 정해진 CDR 내의 모든 용인 가능한 치환에 대한 koff 값(s-1)을 나타낸다. 전반적으로, 돌연변이체는 모 분자와 유사한 koff를 제시한다(4.94E-03 ±7.67E-04). IL-6 결합에 결정적인 잔기는 대체를 용인하지 않으며, 'crit'로서 표시한다.
[표 1.2]
Figure pct00055
표는 정해진 CDR 내의 모든 용인 가능한 치환에 대한 koff 값(s-1)을 나타낸다. 전반적으로, 돌연변이체는 모 분자와 유사한 koff를 제시한다(4.94E-03 ±7.67E-04). IL-6 결합에 결정적인 잔기는 대체를 용인하지 않으며, 'crit'로서 표시한다.
[표 1.3]
Figure pct00056
표는 정해진 CDR 내의 모든 용인 가능한 치환에 대한 koff 값(s-1)을 나타낸다. 전반적으로, 돌연변이체는 모 분자와 유사한 koff를 제시한다(4.94E-03 ±7.67E-04). IL-6 결합에 결정적인 잔기는 대체를 용인하지 않으며, 'crit'로서 표시한다.
[표 1.4]
Figure pct00057
표는 정해진 CDR 내의 모든 용인 가능한 치환에 대한 koff 값(s-1)을 나타낸다. 전반적으로, 돌연변이체는 모 분자와 유사한 koff를 제시한다(4.94E-03 ±7.67E-04). IL-6 결합에 결정적인 잔기는 대체를 용인하지 않으며, 'crit'로서 표시한다.
[표 1.5]
Figure pct00058
표는 정해진 CDR 내의 모든 용인 가능한 치환에 대한 koff 값(s-1)을 나타낸다. 전반적으로, 돌연변이체는 모 분자와 유사한 koff를 제시한다(4.94E-03 ±7.67E-04). IL-6 결합에 결정적인 잔기는 대체를 용인하지 않으며, 'crit'로서 표시한다.
[표 1.6]
Figure pct00059
표는 정해진 CDR 내의 모든 용인 가능한 치환에 대한 koff 값(s-1)을 나타낸다. 전반적으로, 돌연변이체는 모 분자와 유사한 koff를 제시한다(4.94E-03 ±7.67E-04). IL-6 결합에 결정적인 잔기는 대체를 용인하지 않으며, 'crit'로서 표시한다.
25℃에서 비아코어 T200을 이용하여 IL-6에 대한 이들 단일 돌연변이체 분자의 결합 역학을 측정하였다. 세포 상청액의 1:20 희석물을 10㎕/분으로 60초 동안 주사함으로써 단백질 A 칩(GE) 상에서 항체를 포획하였다. 포획 항체에 대해 60초 동안 30㎕/분의 유속으로 5가지 농도(0.56, 1.67, 5, 15 및 45nM)의 IL-6를 유동시키고, 단일 순환 역학 비아코어 분석 형식으로 180초 동안 해리시켰다. 50㎕/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사에 의해 센서칩을 재생하였다. 적용 가능할 때 정제 항체 샘플과 IL-6 간의 상호작용을 37℃에서 모니터링하기 위해 유사한 분석 셋업을 사용하였다. 이 셋업을 위해, 단백질 A 칩에 대해 10㎕/분으로 25 내지 28초 동안 1㎍/㎖의 정제된 항체를 주사하였다. BIAevaluation 소프트웨어(GE)를 이용하여 상청액 및 정제된 샘플에 대한 데이터 분석을 수행하였다. 모든 센소그램은 2배로 기준 차감하고, 1:1 랑그뮈어(Langmuir) 결합 모델을 이용하여 적합화시켰다.
시험한 모든 단일 점 돌연변이로부터(표 1.7), 중쇄 CDR2에서 G66D 돌연변이(항체 가변 도메인의 순차적 넘버링)는 표시된 친화도 부스트(야생형에 비해 KD의 대략 2배 감소: 각각 6.95×10-11M 대 1.58×10-10M)를 초래하였다. G66D를 보유하였고, 제조 관련 화학적 라이브러리(Cys, Met, Asn)를 가질 수 있는 남아있는 중쇄 및 경쇄 CDR 잔기를 돌연변이유발하였다. 이 전제에 기반하여, 삼중 돌연변이(표 1.9): I) M34I/G66D/I108V, II) M34W/G66D/I108V를 포함하는 2개의 중쇄 변이체, 및 삼중 및 사중 돌연변이(표 1.10): III) M32L/M50D/N52S/M88Q, IV) M32L/M50A/N52S/M88Q, V) M32L/M50D/M88Q를 포함하는 3개의 경쇄 변이체(잔기 위치는 항체 가변 중쇄의 순차적 넘버링에 따름)를 생성하였다. 본 발명자들은 단일 점 돌연변이에 대해 기재한 동일한 비아코어 분석 설정을 이용하여 이들 변이체 중에서 모든 가능한 조합에 대한 IL-6 결합을 평가하였다. 본 발명자들의 발견은 이들 돌연변이가 단일 점 G66D 돌연변이의 효과를 계수한 한편, IL-6에 대한 친화도를 모 CDR 서열에 더 가깝게 유지하였다는 것을 입증하였다(표 1.8). 이들 결과에 기반하여, 이들 변형된 CDR은 항-IL-6 및 IL-6 Ab-VEGF Trap의 설계에 포함시켰다.
[표 1.7]
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
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Figure pct00066
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Figure pct00071
Figure pct00072
항-IL-6 단일 점 돌연변이에 대한 비아코어 역학. 25℃에서 사전에(상청액) 그리고 37℃에서 정제 후에 데이터를 얻었다. 최종 CDR 조합물이 되도록 선택한 돌연변이(표 4)는 이탤릭체 표시한다. 박테리아 선별에서 돌연변이를 용인하지 않는 CDR 위치를 결정적으로 표시한다.
[표 1.8]
Figure pct00073
항-IL-6 CDR 변이체에 대한 비아코어 역학 데이터. 25℃에서 세포 배양물 상청액(sup)으로부터 그리고 37℃에서 정제 샘플로부터 역학 데이터를 얻었다. 중쇄 및 경쇄 CDR 돌연변이는 각각 좌측 및 우측에 나타낸다(중/경). 포획, kon(ka), koff(kd) 속도 및 해리 상수를 표에 열거한다.
[표 1.9]
Figure pct00074
[표 1.10]
Figure pct00075
실시예 2
항-IL-6 ab VEGF 트랩 분자 설계 및 작제
IL-6Ab-VEGF Trap의 VEGF 결합 모이어티는 VEGFR1 도메인 2와 VEGFR2 도메인 3 간의 융합으로 이루어졌다(표 2.0). 이 융합은 VEGF 트랩으로서 작용하여, VEGF가 세포의 VEGF 수용체에 결합하는 것을 방지한다.
Figure pct00076
두 별개의 입체배치에서 VEGF 트랩을 함유하는 12개의 작제물을 시험하였다(표 2.1). 제1 입체배치에서, VEGF 트랩을 단백질의 시작에 위치시키고, 그 다음에 항-IL-6 중쇄의 N-말단에 VEGF 트랩을 연결하는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 링커(GS)의 이중 시리즈를 위치시킨다(VEGF Trap-항IL-6; 표 2.1, 분자 A 내지 F). 제2 입체배치에서, 중쇄의 가변 및 불변 도메인(Fab 영역)을 GS 링커를 통해 VEGF 트랩에 연결시키고, 이어서, Fc 도메인은 VEGF 트랩의 C-말단에 융합시킨다. 따라서, 이 입체배치에서, VEGF 트랩은 항체 Fab와 Fc 영역 사이에 샌드위치된다(항IL-6-VEGF Trap; 표 2.1, 분자 G 내지 L).
[표 2.1]
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
비아코어(앞 세션에 기재한 바와 같은 설정) 역학 데이터는 모든 변이체 중에서 KD 값이 비슷하다고 해도, 상청액 샘플에 대한 포획 값에 편차가 있다는 것을 나타내었다(표 2.2). 이 파라미터는 용액에 존재하는 항체의 양에 대해 민감한데, 이는 상이한 CDR 조성물로 인한 이들 분자 중에서의 단백질 발현 수준에 대한 편차를 시사하였다. 다른 한편으로, 시험한 두 VEGF Trap 위치는 역학 데이터에 대한 현저한 영향을 나타내지 않았다. 발현 수준을 모니터링하는 실험(데이터 미제시)은 IL-6-VEGF Trap 입체배치가 VEGF Trap-항IL-6 입체배치에 비해 약 20% 더 높은 발현 수율을 가진다는 것을 나타내었다. 예비 비아코어 데이터는 또한 항IL-6-VEGF Trap 입체배치가 VEGF 상동체인 태반성장인자(placental growth factor: PLGF)에 대해 더 단단하게 결합한다는 것을 나타낸다(데이터 미제시).
[표 2.2]
Figure pct00081
IL-6에 대한 이중 저해제 변이체 A-L 결합에 대한 비아코어 역학 데이터. 25℃에서 세포 배양물 상청액(sup) 샘플로부터 그리고 37℃에서 정제 샘플로부터 역학 데이터를 얻었다. 포획, kon(ka), koff(kd) 속도 및 해리 상수를 열거한다.
실시예 3
비아코어를 통한 VEGF에 대한 이중 저해제 결합
VEGF에 대한 상이한 이중 저해제 입체배치의 결합 역학을 평가하기 위해, 이들 분자 간의 친화도를 측정하기 위한 일련의 비아코어 분석을 수행하였다. 37℃에서 1㎎/㎖ BSA를 함유하는 완충제 HBS-EP+에서 결합 역학을 측정하였다. 항-VEGF 제제(VEGF Trap-항IL-6(5㎍/㎖), 항IL-6-VEGF Trap(5㎍/㎖), OG1950(1㎍/㎖) 및 Eylea(0.5㎍/㎖))를 단백질 A 칩(GE) 상에서 10㎕/분으로 25초 동안 포획하였고, 5가지 농도의 VEGF-A165(0.19, 0.56, 1.67, 5, 15nM)를 포획 항체에 대해 120초 동안 30㎕/분으로 유동시키고, 30분 동안 해리시켰다. 50㎕/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사에 의해 센서 칩 표면을 재생하였다. 모든 센소그램은 2배로 기준 차감하고, 1:1 랑그뮈어 결합 모델을 이용하여 적합화시켰다.
데이터는 이중 저해제 분자 내 VEGF 트랩 성분이 입체배치와 독립적으로 VEGF-A에 단단하게 결합한다는 것을 나타낸다. 항-IL-6 분자 성분은 VEGF 트랩에 대한 VEGF-A 결합에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았는데, 이중 저해제 분자가 다른 VEGF 트랩 기반 분자(Eylea)와 유사한 VEGF 친화도를 나타내기 때문이다. (도 7)
이중 저해제 분자에 대한 IL-6 및 VEGF-A 결합
IL-6 및 VEGF-A의 이중 결합을 직접적으로 모니터링하기 위해 비아코어 분석을 실행하였다. 이중 저해제 분자(2㎍/㎖))를 단백질 A 칩(GE) 상에서 10㎕/분으로 25초 동안 포획하였고, 5가지 농도의 IL-6 및/또는 VEGF-A165(0.19, 0.56, 1.67, 5, 15nM)를 개개로 유동시키고, 포획 항체에 대해 120초 동안 30㎕/분으로 혼합하고 나서, 30분 동안 해리시켰다. 50㎕/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사에 의해 센서 칩 표면을 재생하였다. 모든 데이터는 2배로 기준 차감하고, 개개 IL-6과 VEGF-A 센소그램의 합을 사용하여 이론적 곡선을 생성하고, 이를 혼합 샘플의 센소그램과 비교하였다.
결과는 이론적 및 실험적 곡선이 거의 겹쳐진다는 것을 보여주는데, 이는 표적이 둘다 각각의 상호작용에 영향을 미치는 일 없이 이중 저해제 분자에 결합하는 모델을 강하게 뒷받침한다. (도 8)
IL-6/IL-6-R 복합 ELISA에 대한 항-IL-6 결합
IL-6/IL-6R 복합체는 막 결합 수용체인 gp130에 결합할 수 있고, 이 삼량체 복합체는 IL-6 신호전달, 예컨대, VEGF의 증식 및 상향조절을 자극한다. IL-6R에 대한 IL-6 결합 또는 gp130에 대한 IL-6/IL-6R 결합 중 하나의 저해는 IL-6 매개 하류의 신호전달 경로를 차단한다. 항-IL-6 항체가 이들 결합 사건 중 하나를 차단시키는지의 여부를 결정하도록, IL-6에 결합하는 한편, IL-6 수용체와 복합체화 할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해 ELISA를 처음 확인하였다.
Nunc MaxiSorp ELISA는 1㎍/㎖의 재조합 인간 IL-6R(알앤디 시스템즈) 100㎕로 밤새 코팅시켰다. 10nM의 IL-6(알앤디 시스템즈)을 항-IL-6의 3배 연속 희석물(30nM의 최종 농도를 10　pM로 낮춤)과 혼합하였다. 차단 및 세척 후에, 혼합물을 IL-6R 코팅 플레이트에 첨가하였다. 10nM IL-6과 함께 IL-6R 코팅 플레이트를 처음 인큐베이션한 다음, 세척하고, 이어서, 항-IL-6 항체를 첨가함으로써 이 분석을 또한 수행하였다. 방법 둘 다에 대해, 결합 항체/IL-6 복합체를 항-인간 IgG HRP 항체로 검출하고 나서, 10분 동안 TMB(KPL)를 이용하여 전개시켰다. 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus) 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 450nM에서의 흡광도를 측정하였고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 항체 농도에 플롯팅하고 비선형 회귀에 적합화시켰다.
Nunc MaxiSorp ELISA는 1㎍/㎖의 재조합 인간 IL-6(알앤디 시스템즈) 100㎕로 밤새 코팅시켰다. 항-IL-6의 3배 연속 희석(알앤디 시스템즈; 30nM의 최종 농도를 10pM로 낮춤)을 수행하고, 용액을 차단된 IL-6 코팅 플레이트에 첨가하였다. 항체/IL-6 복합체를 항-인간 IgG HRP 항체로 검출하고 나서, 10분 동안 TMB(KPL)를 이용하여 전개시켰다. 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus) 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 450nM에서의 흡광도를 측정하였고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 항체 농도에 플롯팅하고 비선형 회귀에 적합화시켰다.
시험 조건 하에, 본 명세서에 기재한 항-IL-6 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하지만, IL-6 수용체와 복합체화될 때는 그렇지 않았는데, 이는 항체 및 IL-6R이 IL-6 상에서 공통 에피토프를 공유한다는 것을 시사한다. 결과를 도 4에 나타낸다.
경쟁적 IL-6/IL-6R ELISA
IL-6이 IL-6R에 결합하는 것을 항-IL-6 항체 및 이중 IL-6/VEGF 저해제가 차단하는지의 여부를 결정하기 위한 ELISA를 수행하였다.
Nunc MaxiSorp ELISA를 1㎍/㎖의 항-IL-6/IL-6R 복합체 항체(알앤디 시스템즈; IL-6/IL-6R DuoSet)의 100㎕로 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBS-트윈(PBST)에서 2시간 동안 2% 소혈청 알부민(BSA)에서 차단시켰다. 차단 동안에, 6nM의 IL-6(알앤디 시스템즈), 1nM의 IL-6R(알앤디 시스템즈), 및 이중 저해제의 8점, 3배 연속 희석물 또는 단일 아암 대조군(30nM로 시작)을 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 이 혼합물을 세척 단계 후 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 1시간 후에, 플레이트를 세척하고 나서, 바이오티닐화된 항-IL-6/IL-6R 항체(알앤디 듀오셋(R&D Duoset))와 함께 인큐베이션시켰다. IL-6/IL-6R 복합체를 스트렙타비딘-HRP(1:2000 희석; 알앤디 시스템즈)로 검출하고 나서, TMB 시약(KPL)을 이용하여 10분 동안 전개시켰다. 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus) 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 450nM에서의 흡광도를 측정하였고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 항체 농도에 플롯팅하고 비선형 회귀에 적합화시켰다.
이들 조건 하에, 항-IL-6 항체 및 이중 IL-6/VEGF 저해제는 IL-6에 대한 결합에 대해 IL-6R과 효과적으로 경쟁하고, 따라서 IL-6/IL-6R 상호작용을 저해한다. 이중 저해제 분자에 대한 IC50 값은 비슷한다(항-IL-6 = 0.36nM, VEGF Trap-항-IL-6 = 0.47nM, 및 항-IL-6-VEGF Trap = 0.32nM), 이는 분자의 입체배치가 IL-6 결합 또는 저해에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. Eylea는 음성 대조군으로서 작용하였다(도 9).
경쟁적 VEGF/VEGFR ELISA
VEGF 트랩의 기능을 평가하기 위해, VEGF가 이의 수용체(VEGFR)에 결합하는 것을 차단하는 이중 IL-6/VEGF 저해제의 능력을 경쟁적 ELISA에 의해 시험하였다.
Nunc MaxiSorp ELISA는 1㎍/㎖의 재조합 인간 VEGFR-Fc(알앤디 시스템즈) 100㎕로 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBS-트윈(PBST)에서 2시간 동안 2% 소혈청 알부민(BSA)에서 차단시켰다. 차단 동안에, 100　pM의 바이오티닐화된 VEGF(btVEGF; 알앤디 시스템즈)를 증가된 농도의 항-IL-6-VEGF Trap, VEGF Trap-항-IL-6, 또는 2가 항-VEGF 항체 OG1950과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 bt-VEGF를 스트렙타비딘-HRP(1:2000 희석; 알앤디 시스템즈)로 검출하고 나서, TMB 시약(KPL)을 이용하여 10분 동안 전개시켰다. 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus) 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 450nM에서의 흡광도를 측정하였고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 항체 농도에 플롯팅하고 비선형 회귀에 적합화시켰다.
이들 조건 하에서, 이중 IL-6/VEGF 저해제는 VEGF에 결합하며, 이것이 수용체에 결합하는 것을 저해한다. VEGF 트랩이 항-IL-6 항체의 N-말단 단부에 위치될 때, VEGF 저해는, VEGF 트랩이 항-IL-6 항체의 Fab와 Fc 도메인 사이에 위치되는 분자보다 대략 2.5배 더 강력한데(각각 IC50 1.74nM 대 4.53nM), 이는 2개의 결합 부위로부터 1개의 결합 부위까지의 결합가의 변화에 기인할 가능성이 있다. 결과를 도 9에 나타낸다.
실시예 4
IL-6-VEGF 브리징 ELISA
이중 저해제가 IL-6과 VEGF 둘 다에 동시에 결합할 수 있다는 것을 보장하기 위해, 이들에 플레이트 결합된 IL-6과 처음 상호작용하는 경우 브리징 ELISA를 실시하고, 이어서, 바이오티닐화된 VEGF(btVEGF)와 함께 인큐베이션시켰다. 스트렙타비딘 HRP에 의한 btVEGF의 검출은 IL-6 결합 분자가 또한 btVEGF에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
Nunc MaxiSorp ELISA는 1㎍/㎖의 재조합 인간 IL-6(톤보 사이언시즈(Tonbo Sciences)) 100㎕로 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBS-트윈(PBST)에서 2시간 동안 2% 소혈청 알부민(BSA)에서 차단시켰다. 차단 동안에, 100pM의 btVEGF를 증가된 농도의 항-IL-6-VEGF Trap, VEGF Trap-항-IL-6, 또는 음성 대조군으로서 2가 항VEGF 항체 OG1950과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 btVEGF를 스트렙타비딘-HRP(1:2000 희석; 알앤디 시스템즈)로 검출하고 나서, TMB 시약(KPL)을 이용하여 10분 동안 전개시켰다. 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus) 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 450nM에서의 흡광도를 측정하였고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 항체 농도에 플롯팅하고 비선형 회귀에 적합화시켰다.
이 분석은 이중 IL-6/VEGF 저해제가 IL-6 및 btVEGF에 동시에 결합한다는 것을 확인하였다. 항-IL-6 및 VEGF Trap의 배향은 약간 가변적인 결합을 가지며, 항-IL-6-VEGF Trap 배향은 이들 조건 하에서 더 바람직하다(EC50 VEGF Trap-항IL-6 = 0.079nM 및 항IL-6-VEGF Trap = 0.026nM). Eylea 및 항-IL-6은 음성 대조군으로서 작용하였다. 결과를 도 9에 나타낸다.
실시예 5
OG1802의 경로 1 합성.
OG1802의 합성을 위한 제1 경로는 다음과 같다. 첫째로, 도 2a에 나타낸 구조를 갖는 TFA/아민염 개시제(화합물 L)는 다음과 같았다.
첫째로, 도 2b에 나타낸 구조를 갖는 화합물 K를 다음과 같이 합성하였다. 200㎖의 둥근 바닥 플라스크에 질소 하에서 화합물 J (OG1563)(1.9g, 2.67m㏖, 3.3 당량)를 넣었고
Figure pct00082
화합물 E(0.525g, 0.81m㏖, 1.0 당량)(도 2l 참조)를 넣은 다음, 다이메틸폼아마이드(10㎖), 이어서, 다이아이소프로필에틸아민(2.5㎖, 14.6m㏖, 18 당량)을 넣었다. 빙욕을 이용하여 플라스크를 0℃로 냉각시켰다. 이것에 프로필포스폰산 무수물 용액(에틸 아세테이트에서 50중량%, 2.5㎖, 4.04m㏖, 5 당량)을 대략 6분에 걸쳐 첨가하였다.
반응물을 실온으로 가온시키고, 15분 동안 교반하였다. 물(20㎖), 포화 수성 중탄산나트륨(20㎖)과 에틸아세테이트(100㎖)를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 유기층을 분리시키고 나서, 수층을 에틸아세테이트(75㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 수성 중탄산나트륨(30㎖), 0.5M 수성 시트르산(40㎖), 물(25㎖), 및 포화 수성 염화나트륨(40㎖)으로 세척하고, 이어서, 건조 후(황산나트륨)으로, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 추가 정제 없이 사용한 잔기는 2.0 g(0.80m㏖, 99%)의 화합물 K를 초래하였다.
1H NMR (400 MHz DMSO-d6): d = 1.36(s, 9H, OCCH3), 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.98 (d, J = 5.6 Hz, 6H, CCH2NH), 3.04 (q, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2CH2NH), 3.18 (s, 2H, OCH2C), 3.3-3.37 (m, 8H, CH2), 3.47-3.55 (m, 12H, CH2), 3.58 (s, 6H, OCH2C), 3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O), 6.74 (br t, 1H, CH2NHC=O), 7.69 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH2NHC=O), 7.84 (t, J = 6.0 Hz, 3H, CH2NHC=O).
LC-MS (ES, m/z): [(M+2H-boc)/2]+ (C84H136Br9N7O33+2H-Boc)에 대한 계산치/2 = 1196.6; 실측치 1196.6.
다음의 화합물 L(도 2a)을 다음과 같이 합성하였다: 질소 하에 100㎖ 둥근 바닥에 화합물 K (2.0g, 0.8 mmol), 다이클로로메탄(10㎖) 다음에 트라이플루오로아세트산(5㎖)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 반응물을 진공 하에 농축시켰다. 다이클로로메탄(10㎖)을 이용하여 반응물을 희석시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 아세토나이트릴(10㎖)을 이용하여 용해시키고 나서, 주사기 필터(아크로디스크(Acrodisc) CR25, PN 4225T)를 통해 여과시키고, 분취 HPLC 칼럼 상에 장입시키고 나서, 수 중의 60% 아세토나이트릴(0.1% 트라이플루오로아세트산과 함께) 내지 최대 98% 아세토나이트릴(0.1% 트라이플루오로아세트산)로 용리시켰다. 생성물을 함유하는 관을 모으고 나서, 진공 하에 농축시키고, 냉동 후 동결건조기 상에 넣었다. 이는 백색 고체로서 990㎎(0.4m㏖, 2단계에 걸쳐 50%)의 화합물 L을 초래하였다.
1H NMR (400 MHz DMSO-d6): d = 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.97-3.0 (m, 8H, CCH2NH 및 OCH2CH2NH), 3.17 (s, 2H, OCH2C), 3.3 (q, 6H, CH2CH2NHC=O), 3.4-3.59 (m, 20H, CH2), 3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7.69-7.84 (m, 9H, CH2NHC=O와 NH3+ 둘 다).
LC-MS (ES, m/z): [(M+2H)/2]+ (C84H136Br9N7O33+2H)에 대한 계산치/2 = 1196.6; 실측치 1197.4.
다음에, 화합물 L(도 2a)을 개시제로서 사용하여 MPC 중합체를 합성하였다. 개시제는 전형적으로 약 100㎎/㎖의 DMF에서 저장 용액으로서 제조한다. 개시제 및 리간드(2,2'-바이피리딜)를 슐랭크(Schlenk) 관에 도입하였다.　 얻어진 용액을 드라이 아이스/아세톤 혼합물을 이용하여 -78℃로 냉각시키고, 10분 동안 진공 하에 탈기시켰다.　 관을 아르곤 및 촉매(달리 표시하지 않는 한 CuBr) 하에 재충전시키고, 아르곤 하에 유지하고 나서, 슐랭크 관에 도입하였다(개시제/촉매(CuBr)/리간드 상의 브로민 원자의 몰비를 1/1/2에서 유지하였다).　 용액은 즉시 진한 갈색이 되었다.　 슐랭크 관을 밀봉하고 나서, 짧은 주기의 진공/아르곤을 적용함으로써 즉시 퍼지하였다. 정해진 양의 단량체를 혼합함으로써 HEMA-PC 용액을 제조하고 나서, 200 프루프(proof) 탈기 에탄올을 이용하여 질소 하에 유지한 글로브박스(glovebox)에서 제조하였다.　 단량체 용액을 슐랭크 관 내로(캐뉼라를 통해) 적가하였다(광 교반에 의해 균질화시켰다).　 온도를 -78℃에서 유지하였다.　적어도 10 내지 15분 동안 용액으로부터의 버블 형성이 중단될 때까지 반응 혼합물에 철저한 진공을 적용하였다.　 이어서, 관을 아르곤으로 채우고, 실온으로 가온시켰다.　 용액을 교반시키고, 중합이 진행됨에 따라, 용액은 점성이 되었다.　 3 내지 8시간 후에 또는 단지 밤새 둔 후에, Cu (I)을 Cu(II)로 산화시키기 위해 직접 노출에 의해 반응을 중단시키고, 혼합물은 색이 청녹색이 되었으며, 구리 촉매를 제거하기 위해 실리카 칼럼을 통과시켰다.　 수집한 용액을 회전 증발에 의해 농축시키고, 얻어진 혼합물을 테트라하이드로퓨란으로 침전시키거나 물에 대해 투석한 후에, 냉동 건조시켜 백색 분말을 수득하였다. 이하의 표 5.0는 개시제로서 화합물 L을 사용하는 중합체에 대한 중합체를 제시한다.
[표 5.0]
Figure pct00083
다음에, 말레이미드 Mal-PEG4-PFP 에스터를 (도 2c에 제시된 바와 같이) 상기 언급한 750kDa 중합체로 스냅 온하여 OG1802를 제공하였다. 20㎖ 바이알에 중합체 R3707(개시제로서 L을 이용하여 생성된 750kDa 중합체, 515㎎)을 넣고 나서, 40분 동안 교반시킨 후에 에탄올(4.0㎖)을 이용하여 용해시켰다.　 이것에 아세토나이트릴(22㎕) 중의 4-메틸몰폴린의 1% 용액을 첨가하였다.　 별개의 바이알에서 아세토나이트릴(1.0㎖)에 Mal-PEG4-PFP(1.97㎎)를 용해시키고, 이 용액을 대략 2분에 걸쳐 실온에서 중합체에 첨가하고, 얻어진 용액을 밤새 교반하였다.　 반응물을 0.1% 수성 트라이플루오로아세트산(2㎖)(pH 대략 5)로 희석시킨 후에 물(대략 12㎖)로 희석시키고, 주사기 필터(아크로디스크 수퍼(Acrodisc Supor), PN 4612)를 통해 여과시키고, 3 아미콘(Amicon) 원심분리막 투석관(30,000 mwco)에 균일하게 넣었다.　 관을 희석시키고 나서, 물(각각 대략 5㎖)과 혼합하고 나서, 25분 동안 원심분리(rpm 3200)에 넣었다.　 투석을 위해 여과액을 제거하는 한편, 보류액(retentate)을 희석시키고 물(대략 10㎖/관)과 혼합하였다.　 원심분리 절차를 5회 이상 반복하였고, 이후에, 보류액을 제거하고 나서, 바이알에 넣었다.　 아미콘 막 관을 물(2×대략 2㎖의 각각의 관)로 린스하고 나서, 이를 보류액과 합쳤다.　 보류액 용액을 주사기 필터(아크로디스크 수퍼, PN 4612)를 통해 여과시키고, 냉동 후, 동결건조기에 넣었다.　 이는 백색 분말로서 485㎎을 초래하였다.
실시예 6 - 개시제 OG1786의 합성
OG1786은 OG1802의 합성에서 전구체로서 사용하는 중합체 합성을 위한 9-아암 개시제이다. 각각의 아암은 ATRP 하에 중합을 개시할 수 있는 2-브로모아이소뷰티레이트로 종결된다. OG1786은 도 2d에 나타낸 바와 같은 트라이플루오로 아세트산(TFA)의 염이다. OG1786은 다음과 같이 제조한다. 처음에, OG1550을 TFA(트라이플루오로 아세트산)과 반응시켜 도 2e에 도시한 바와 같이 OG1546을 생성한다.
자기 교반막대 및 첨가 깔때기를 구비한 1ℓ 둥근 바닥 플라스크에 OG1550(14.8g), 메틸 tert-뷰틸 에터(MTBE)(350㎖)와 물(30㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 교반시켜 OG1550을 용해시키고, 이어서, 빙욕에서 냉각시켰다. 이 혼합물에 물(90㎖)에서 트라이플루오로아세트산(4.9㎖) 용액을 90분에 걸쳐 적가하였다. 첨가를 완료한 후에, 혼합물을 추가 15분 동안 교반하고, 이어서, 빙욕으로부터 제거하고 나서, 실온으로 가온시켰다. 혼합물을 (빙욕으로부터의 제거 후) tlc가 대략 5%의 출발물질이 남아있다는 것을 나타낼 때까지 추가 4 내지 5시간 동안 교반시키고, 수용액의 pH는 3 내지 4였다(pH 페이퍼).
혼합물을 분리시켰다. MTBE 층을 물(30㎖)로 세척하였다. 이어서, 합한 수성층을 MTBE(150㎖)로 수성 추출하였다. 이 제2 MTBE 상을 물(30㎖)로 세척하였다. 합한 수성층을 MTBE의 1/3 부분(100㎖)으로 세척하였다. 1/3 MBTE 상을 물(25㎖)로 세척하였다. 수성층을 다시 합하였다(대략 250㎖, pH 대략 4, pH 페이퍼에 의함).
동결건조에 의해 생성물을 수집하였다. 11.5 g의 백색 고체를 얻었다. 이 물질은 극도로 흡습성이며, 따라서 질소 하에 가장 잘 조절된다. 생성물을 LCMS에 의해 확인하였다.
이어서, 제조한 OG1546을 OG1563과 반응시켜 OG1784를 수득하였다(도 2f에 도시한 바와 같음).
교반 막대를 구비한 질소 하의 250㎖ 플라스크에 OG1546(흡습성, 9.0g), 다음에 N,N-다이메틸폼아마이드(110㎖)를 첨가하였다. 모든 OG1546이 용해될 때까지(약 15분) 혼합물을 실온에서 교반시키고, 이어서, OG1563(29.9g)을 첨가하고 나서, OG1563이 또한 용해될 때까지 혼합물을 추가 3분 동안 교반시켰다. 얻어진 용액을 빙욕에서 냉각시키고, N,N-다이아이소프로필에틸아민(37.6㎖)을 3분에 걸쳐 첨가한 후에, 에틸 아세테이트(34.5㎖) 중의 50%의 프로필포스폰산 무수물(T3P)을 5분에 걸쳐 적가하였다(T3P 첨가는 발열성이다). T3P 첨가가 완료된 후에, 플라스크를 빙욕으로부터 제거하고 실온에 도달되게 하였다. 이어서, LCMS 분석을 위해 샘플을 5분 간격으로 취하였다. 반응은 매우 밝은 황색/황갈색을 나타내었다.
20분 후에, 반응물을 다시 빙욕에서 냉각시키고, 5㎖의 물을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 빙욕으로부터 제거하고 나서, 추가 50㎖ 물 부분을 첨가한 후에, 50㎖의 0.5M 시트르산, 이어서, 아이소프로필아세테이트(300㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 분리시켰다. 수성층(대략 300㎖)을 추가 아이소프로필 아세테이트(150㎖)로 추출하였다. 수성상은 HPLC 시험에 대해 AQ1이었다. 합한 유기물을 수성 시스트산(115㎖, 15㎖의 0.5M 시트르산 + 100㎖ 물의 혼합물인 65mM)으로 세척하였고, 수성상은 AQ2 (pH~3)였다. 유기상을 물/포화 염화나트륨(100㎖/25㎖)으로 세척하였고, 수성상은 AQ3(pH~3)이었다. 유기상을 최종적으로 포화 염화나트륨(100㎖)으로 세척하였고, 수성상은 AQ4였다. AQ 분획 중 어느 것도 임의의 유의한 생성물을 함유하지 않았다(데이터는 제공하지 않음). 유기상은 LCMS를 통해 생성물을 확인하였다. 생성물을 황산나트륨(80g)으로 건조시키고, 여과 후, 아이소프로필 아세테이트(75㎖)로 린스하고 나서, 회전 증발기 상에서 황갈색 오일(33.2g)로 농축시켰다. 조질의 물질을 밤새 질소 하에 저장하였다.
다음 날 조질의 물질을 실온이 되게 하고, 이어서, 아세토나이트릴/물 (46㎖/12㎖)에 용해시키고 나서, HPLC 필터 디스크(콜-파머(Cole-Parmer) PTFE 0.2㎛, 생성물 번호 02915-20)를 이용하여 여과시켰다. 여과액을 3개의 동일한 부분으로 나누고, 3회 실행으로 정제하였다.
50% 아세토나이트릴/물을 이용하여 평형상태로 맏는 레디셉 Rf 골드(RediSep Rf Gold) C18 칼럼(275g, SN 69-2203-339, 로트# 24126-611Y) 상에 여과액을 장입시켰다. 다음의 구배(용매 A: 물, 용매 B: 아세토나이트릴)를 이용하여 100㎖/분으로 물질을 용리시켰다. 모든 적절한 분획을 HPLC에 의해 확인하였다. 충분히 순수한 것으로 판단한 분획을 풀링하고(모두 3회의 실행으로부터) 회전증발기 상에서 농축 후(욕 온도를 약 20℃에서 유지), 이어서, 다이클로로메탄(100㎖)과 물(5㎖)/포화 염화나트륨(25㎖)으로 나누었다. 수성층을 다이클로로메탄으로(2×30㎖) 2회 이상 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨(35g)으로 건조시키고, 여과 후, DCM(30㎖)로 린스하고 나서, 농축시켰다. 생성물 및 순도를 LCMS 방법에 의해 확인하였다. R5172 및 R5228 로트의 단리 수율 및 순도를 표 6.0에 나타낸다.
[표 6.0]
Figure pct00084
다음에 OG1405를 도 2g에 도시한 바와 같이 OG1784로부터 제조하였다. 자기 교반막대를 구비한 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 OG1784(20.9g)를 첨가한 다음, 다이클로로메탄(50㎖), 이어서, 트라이플루오로아세트산(20㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반시키고, HPLC 분석은 23분에 완전한 탈보호를 나타내었다. 혼합물을 회전 증발기 상에서 농축시키고, 다이클로로메탄(25㎖)에 재용해시키고 나서, 재농축시키고, 이어서, 아세토나이트릴(25㎖)에 재용해시키고, 재농축시켰다. 생성물을 LCMS에 의해 확인하였다. 상기로부터의 물질(OG1405, 34.5g, 정량적 수율로서 21.0g으로 추정)을 다음 단계에서 조질의 오일로서 사용하였다. 정제는 필요하지 않다.
다음에, OG1405를 OG1402와 반응시켜 도 2h에 제시한 바와 같이 OG1785를 제조하였다. 교반 막대를 구비한 질소 하의 500㎖ 플라스크에 OG1402(5.5g)를 넣은 다음, 아세토나이트릴(70㎖), 이어서, N,N-다이아이소프로필에틸아민(26.3㎖)과 T3P 용액(7.9㎖)을 넣었다(상기 참조). 용액을 실온에서 30분 동안 교반시키고, 이어서, 빙욕에서 냉각시키고, 아세토나이트릴(70㎖) 중의 OG1405 용액(상기로부터의 조질의 오일, 34.5g)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 20분 후에, 반응물을 빙욕에서 냉각시키고, 물(5㎖)로 반응을 중단시켰다. 이어서, 혼합물을 회전 증발기를 이용하여 진공 하에 절반의 용적으로 농축시켰다. LCMS를 위해 샘플을 취하였다.
더 많은 물(50㎖)을 첨가한 다음 0.5M 시트르산(75㎖)과 아이소프로필 아세테이트(175㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 5분 내로 분리시켰다. 수성층을 추가 아이소프로필 아세테이트(50㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 수성 시트르산(0.13M, 30㎖, 10㎖의 0.5M 시트르산과 20㎖ 물로 이루어짐)으로 세척하였다. 이어서, 유기층을 포화 염화나트륨(25㎖)과 물(25㎖)의 혼합물로 세척하였고, 이어서, 최종적으로 포화 염화나트륨(25㎖)으로 세척하였다. 이어서, 이들을 황산나트륨(124g)으로 건조시키고, 여과 후, 아이소프로필 아세테이트(30㎖)로 린스하고 나서, 회전 증발기 상에서 황갈색 오일(27.3g)로 농축시켰다. LCMS 분석을 위해 샘플을 취하였다.
오일을 아세토나이트릴/물(3:1, 15㎖/5㎖)에 용해시키고 나서, HPLC 필터 디스크(콜-파머(Cole-Parmer) PTFE 막 0.2㎛, 제품 번호 02915-20)를 통해 여과시키고, 3개의 동일한 부분으로 분할하고, 이들 각각은 다음과 같이 개개로 정제하였다.
부분을 50% 용매 B(아세토나이트릴)/50% 용매 A(물)로 평형상태로 만든 레디-셉 골드(Redi-Sep Gold) C18 칼럼(275g, SN - 69-2203-339, 로트 241234-611W) 상에 장입시켰다. 이어서, 물질을 용매 A: 물/용매 B: 아세토나이트릴 구배를 이용하는 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 풀링하고, 다이클로로메탄 (150㎖)과 물(5㎖)/포화 염화나트륨(25㎖)으로 나누었다. 수성층을 다이클로로메탄으로(2×50㎖) 2회 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨(60g)으로 건조시키고, 여과 후, 다이클로로메탄(40㎖)으로 린스하고 나서, 농축시켰다. LCMS를 포함하는 다양한 분석에 의해 구조 및 순도를 확인하였고: OG1785를 거품 같은 고체로서 단리시켰고(R5329, 19.0g, 83% 수율, 95.1% 순도(a/a 210㎚), 질소 하에 4℃에서 저장하였다.
다음에, 트라이플루오로아세트산(TFA)을 이용하여 OG1785 상의 tert-뷰틸옥시카보닐 보호기를 제거하여 도 2i에 도시한 바와 같이 OG1786을 생성하였다.
실시예 7 - 중합체 OG1801의 합성
중합체 OG1801을 개시제 OG1786으로부터 처음 생성한다. OG1801은 아민 작용기를 가지며, 이는 중합체 합성 동안 (말레이미드보다) 더 안정하다. 중합체 OG1801을 합성하기 위해, ATRP의 변형된 형태가 사용되되, 구리 종(Cu(I))은 금속 구리를 Cu(II)에 첨가함으로써 인시투(in situ)로 생성된다. 반응에서 출발물질 및 시약은 단량체(HEMA-PC) OG47의 배취(batch) 유입뿐만 아니라 표적화된 분자량(MW)에 기반하여 계산한다.
글로브 박스에서 50g 단량체 OG47을 칭량하고, 200㎖의 탈기된 EtOH를 첨가하여 단량체를 실온에서 용해시키고; 단량체 농도 시험을 위해 샘플링하였다. 500㎖ 플라스크에서 Cu(II), Bpy, Cu(0)를 칭량하고; 아르곤으로 퍼지하는 한편, 단량체 용액을 플라스크에 첨가하고; 플라스크를 마개로 밀봉하고 나서, 버블이 형성되지 않을 때까지 25분 동안 진공 상태로 만들었다. 반응물은 색이 점진적으로 밝은 녹색에서 진한 녹색으로 변하였고, 이어서, 밝은 갈색이 되었고; 글로브 박스에서 대략 200㎎의 개시제 OG1786을 칭량하고, 실온 하에 대략 2000㎕의 DMF에 용해시켜 100㎎/㎖ 저장액을 생성하고; 개시제 농도 및 순도 시험을 위해 샘플링하고 나서; 개시제 용액을 아르곤 하에 플라스크에 첨가하였다. 반응 용액은 진한 갈색이 되었고, 시간에 따라 농후화되기 시작하며; 시스템을 밀봉하고 나서 반응은 2일에 걸쳐 일어난다.
이어서, 말레이미드의 첨가를 위해 OG1801을 준비하고, 촉매(구리)를 다음과 같이 제거하였다: 사전 패킹한 레디셉(RediSep)(등록상표) Rf 정상상 실리카 칼럼을 사용하여 촉매를 제거한다. 칼럼의 크기를 반응 혼합물 내 구리의 양에 기반하여 선택한다. 예를 들어, OG1801의 50g 배취에 대해 330g 칼럼(카탈로그 번호 69-2203-330, 칼럼 크기 330g, CV=443㎖)을 사용하였다. EtOH를 용리 용매로 사용하기 때문에 모든 연결을 위해 테플론 관을 사용한다.
구리 제거 후에, 모든 분획을 배취 내 둥근 바닥 플라스크에 전달하고, 회전증발기에 의해 45 내지 50℃에서 감압 하에 EtOH를 증발시켜 건조시켰다. 이 단계에서, 축합으로부터 수집한 EtOH 용적을 모니터링하여 EtOH 제거가 90% 초과가 되도록 보장하였다. 중합체를 250㎖의 WFI에 용해시키고 나서, 0.2㎛ 필터를 이용하여 여과시켰다. 이는 대략 150㎎/㎖에서 맑은 내지 밝은 황색 중합체 용액을 초래하였다. 용액을 사용 전에 2 내지 8℃에서 최대 3개월까지 저장할 수 있었다.
실시예 8 - 중합체 OG1802의 합성
반응에서 출발물질 및 시약은 OG1801의 배취 유입에 기반하여 계산한다. 링커는 3-말레이미도프로피온산, NHS 에스터이다. 30㎖의 0.5M 인산나트륨(WFI에서, pH 8)을 50g 중합체 용액(대략 150㎎/㎖)에 첨가하였다. 1분 동안 교반시켰고; pH 페이퍼에 의해 pH는 8.0이었다. 204.8㎎의 링커를 칭량하였고, DMF 4.1㎖에 용해시켜 50㎎/㎖ 저장 용액을 제조하였다. 링커 용액을 강하게 교반시키면서 중합체에 분당 815 ㎕로 적가하였다. 4095㎕의 링커 용액을 첨가하는 데 5분이 걸렸다. 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 20㎖의 5% 아세트산으로 반응을 중단시켜 최종 pH 5를 달성하였다. 1ℓ 진공 필터(0.2㎛)를 이용하여 용액을 여과시켰다.
이어서, OG1802(도 2k에 나타냄)를 다음과 같이 정제한다: 수성 시스템에서 중합체 정제를 위해 중합체 밀리포어(Milipore) 직교류(cross flow) 카세트를 사용한다. 중합체 용액을 250㎖(대략 200㎎/㎖)로 농축시키기 시작한다. 저장소로부터 신선한 WFI를 첨가하고 나서, WFI 공급 유속을 투과액과 동일하게(대략 2㎖/분) 조절하였다. UF/DF를 2 내지 8℃에서 밤새 두었다. 전형적으로 2.5 L의 WFI를 사용하였다(중합체 용액에 대해 10x 용적비). 순도 시험을 위해 보류액의 샘플을 수집하였다. 표적화된 순도는 98% 초과였다. 0.2μM의 1ℓ 필터 보틀에 의해 중합체 용액을 여과시켰다. 중합체 용액을 접합 전에 2 내지 8℃에서 최대 3개월 동안 저장할 수 있었다.
실시예 9 - 대안의 포스포릴콜린 중합체
HEA-PC 중합체를 이하에 기재하는 바와 같이 합성하였다. 상기 기재한 메타크릴레이트 HEMA-PC와 대조적으로 아크릴레이트인, HEA-PC(2-(아크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트)는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pct00085
HEA-PC는 실시예 5에서 화합물　L로서 나타낸 개시제로 중합되었다.
[표 9.0]
Figure pct00086
11㎕의 건조 DMF에 2.2㎎의 개시제를 용해시킴으로써 200㎎/㎖로 개시제의 저장액을 제조하고 23㎕의 건조 DMF에 4.6㎎의 Me6TREN을 용해시킴으로써 200㎎/㎖ 용액의 리간드를 제조하였다. 8.25㎕의 개시제 저장 용액 및 13.6㎕의 리간드를 관에 제공한다. -78℃에서 5분 동안 탈기시키고, 이어서, 아르곤으로 재충전하고 나서, 1.2㎎의 CuBr을 첨가하였다. 탈기시키고 나서, 아르곤으로 재충전하였다. 메탄올에서 HEA-PC의 저장 용액(0.461 g의 HEA-PC를 칭량하고 나서, 이를 0.5㎖의 메탄올에 용해시킴)을 반응기 내부의 용액에 -78℃에서 첨가하였다. 바이알을 200㎕의 메탄올로 린스하고 나서, 이를 반응기 내부에 -78℃에서 첨가하고, 이어서, 0.5㎖의 증류수를 첨가한 다음에, 200㎕의 물을 다시 첨가한다. 버블링이 보이지 않고 모든 이질 성분이 사라질 때까지(고체 미립자가 용해되거나 사라질 때까지) 철저히 탈기시킨다. 4psi의 아르곤으로 다시 채우고, 실온에서 1시간 동안 반응을 진행시켰다. 반응물은 이미 점성이 되었다. 약 1시간 동안 반응을 진행시켰다. 메탄올 중의 바이피리딘 용액(0.5㎕ 중의 5㎎)을 첨가하였다. 다른 2 내지 3㎖의 메탄올을 첨가하고 나서, 촉매를 밤새 4℃에서 산화시켰다. 1H NMR에 의해 결정된 전환은 94%가 되는 것으로 추정하였다.
다음날 중합체를 투석하고 나서, 1x PBS pH 7.4에서 1㎖/분으로 쇼덱스(Shodex) SB806M_HQ 칼럼(7.8x300㎜)을 이용하여 SEC/MALS 분석을 실시하여, PDI 1.157, Mn 723.5kDa, Mp 820.4kDa 및 Mw 837.2kDa을 제공하였다(투석 전 PDI는 1.12, Mn = 695kDa, Mp = 778kDa임). 다음에, 말레이미드 작용기를 중합체에 첨가하였고, 따라서 단백질에 접합될 수 있었다.
다음에, 말레이미드 Mal-PEG4-PFP(상기 실시예 20 참조) 에스터를 실시예 20에서 나타낸 바와 같이 HEA-PC 중합체로 스냅 온 하였다. 이어서, 얻어진 말레이미드 작용기화된 HEA-PC 중합체를 HEMA-PC 중합체에 대해 본 명세서에 논의한 바와 같이 설프하이드릴기에 접합시킬 수 있다.
하기 구조를 갖는 단량체 2-(아크릴아밀)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트 (Am-PC)를 이용하여 아크릴아마이드 PC 중합체를 또한 생성하였다:
Figure pct00087
하기 구조를 갖는 3 아암 개시제(TFA 염)를 이용하는 중합을 위해 Am-PC를 사용하였다:
Figure pct00088
Am-PC 중합체의 합성을 다음과 같이 수행하였다:
[표 9.1]
Figure pct00089
45㎕의 건조 DMF에 9㎎의 Me6TREN을 용해시킴으로써 리간드의 저장액을 200㎎/㎖로 제조하였다. 19.7㎕의 저장 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 32.5㎕의 DMF에 6.5㎎의 물질을 용해시킴으로써 개시제의 저장 용액을 200㎎/㎖로 제조하였다. 11㎕의 개시제 저장 용액을 상기로부터의 리간드 용액에 첨가하였다. 5분 동안 탈기시킨다. 1㎎의 CuBr을 첨가하였다. 20㎕의 DMF에 4㎎ CuBr2를 용해시킴으로써 CuBr2의 저장 용액을 200㎎/㎖로 제조하였다. 0.5g의 단량체(AmPC)를 1㎖의 메탄올(느린 용해/점성 용액)에 첨가한 후에, CuBr2의 1㎕의 저장 용액을 첨가하였다. 단량체 용액을 상기 반응 혼합물에 적가하였다. 1㎖의 물로 세정하였다. 반응 혼합물을 철저히 탈기시킨다(냉동-해동). 반응을 24시간 동안 진행시킨다.
이후로, Am-PC 중합체를 투석할 수 있다. 상기 중합체의 분자량을 SEC/MALS에 의해 결정하였다: Mn은 215kDa이고, Mp는 250kDa이며, PDI는 1.17이다. 전환은 1H NMR에 의해 94%가 되는 것으로 추정하였다. 말레이미드 작용기는 HEMA-PC 및 HEA-PC에 대해 상기 논의한 바와 같이 Am-PC 중합체에 첨가될 수 있다. 말레이미드 작용기화된 Am-PC 중합체는 상기 기재한 바와 같이 단백질에 접합될 수 있다.
실시예 10 - 화합물에서 유리 말레이미드를 계산하기 위한 가역적 엘만 분석(Ellman's Assay)
중합체 OG1801에 말레이미드 작용기를 첨가하여 OG1802를 형성한 후에(상기 참조), 엘만 분석을 사용하여 샘플 내 말레이미드 작용기의 양을 작용기(즉, 접합 가능) 백분율로서 결정하였다. 티올은 엘만 시약(DTNB)으로부터 TNB-로 전환시켰고, 이어서, 중성 및 알칼리성 pH에서 수 중의 TNB2-로 전환시켜, 황색을 발하였다(412㎚에서 측정). 시스테인을 이용하여 표준 곡선을 확립하였다. 말레이미드는 티올과 반응하기 때문에, 이 분석은 사실상 남아있는 티올(시스테인)을 측정하였다. 저해를 (본래의 티올 - 말레이미드 중합체 첨가 후 남아있는 티올)/(본래의 티올)의 몰농도 비로서 계산하였고, 백분율로서 표현하며, 말레이미드 작용기화가 높을 수록 백분율이 더 높다.
분석에서 사용한 시약: 62.5μM로부터 2μM까지의 시스테인을 이용하여 표준 곡선을 제조하였다. 1xPBS pH7.4(반응 완충제)에 분말을 용해시키고 철저히 혼합함으로써 중합체 저장 용액을 제조하였다. 등몰의 중합체와 시스테인 용액을 혼합하고 나서, 27℃에서 30분 동안 반응시켰다. 150μM의 DTNB 용액을 시스테인 표준 및 중합체/시스테인 반응물에 첨가하고 나서, 27℃에서 5분 동안 발색되었다. 412㎚에서의 OD를 스펙트라맥스(Spectramax) 플레이트 판독기 상에서 판독하고, 저해 백분율을 소프트맥스 프로(Softmax Pro) 및 시스테인 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.
실시예 11 - 항IL-6-VEGF 트랩 분자의 정제 및 캡제거
중쇄 및 경쇄를 발현 플라스미드에 클로닝시키고, CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 세포를 적절한 배지에서 성장시키고, 채취할 수 있다. 단백질 A 친화도 칼럼 포획 및 용리를 이용하여 항체(또는 대안의 Ab-Trap)를 정제할 수 있다. 443번 위치(L443C(EU 넘버링)) 잔기에서 항체(또는 대안의 Ab-Trap) 시스테인은 세포 배양 배지에서 전형적으로 "캡핑"되거나 화학물질에 의해 산화되고, 접합에 이용 가능하지 않다. 이와 관련하여, 정제된 항체(또는 대안의 Ab-Trap)는 캡제거(즉, 환원) 절차를 실시하여 캡을 제거하고, 유리(즉, Cys-Cys 이황화 결합에 관련되지 않은 것) 시스테인 잔기가 중합체의 말레이미드 작용기에 접합되는 것을 가능하게 한다. 캡제거는 정제된 항체(또는 대안의 Ab-Trap) 단백질을 30x 몰 과량으로 1시간 동안 주위 온도 환원제, 예컨대, TCEP(3,3',3"-포스판트라이일트라이프로판산), 3나트륨 3,3',3"-포스핀트라이일트리스(벤젠-1-설포네이트)(TPPTS), 또는 유사한 것과 혼합함으로써 행할 수 있다. 환원 반응을 SDS-PAGE에 의해 모니터링할 수 있다. 환원 후에, 항체(또는 대안의 Ab-Trap) 단백질은 펠리컨(Pellicon) XL 한외여과 카세트를 이용하여 20mM 트리스 pH7.5, 100mM NaCl, 0.5mM TCEP 완충제로 완충제 교환하여 캡을 제거할 수 있다. 이어서, TCEP 시약은 20mM 트리스 pH7.5, 100mM NaCl을 이용하여 동일한 완충제 교환 설비에서 제거할 수 있다. 이어서, 환원 항체(또는 대안의 Ab-Trap)를 15x 몰 과량의 산화제 DHAA(데하이드록시 아스코브산)를 이용하여 1시간 동안 주위 온도에서 재산화시킬 수 있고, 이를 다시 SDS-PAGE 분석에 의해 모니터링한다. 이어서, DHAA 시약은 20mM 트리스 pH7.5, 100mM NaCl을 이용하여 동일한 완충제 교환 설비에서 제거할 수 있다.
실시예 12A - MPC 중합체에 대한 항체(또는 대안의 Ab-Trap)의 접합
캡제거된 항체(또는 대안의 Ab-Trap)는 중합체 OG1802에 접합되어 생체접합체를 수득할 수 있다. 과량의 OG1802를 사용한다(3 내지 20배 몰 과량). 양이온-교환 HPLC 크로마토그래피에 의해 접합을 모니터링할 수 있고, 거의 완료로 유도하였다. 항체(또는 대안의 Ab-Trap) 접합체는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있고, 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 제형 완충제와 교환하였다. 항체(또는 대안의 Ab-Trap) 접합체는 상기 기재한 바와 같이 크로마토그래피로 정제할 수 있다.
실시예 12B--OG1802와의 VEGFR-항IL6 접합 반응
OG1802와의 VEGFR-항IL6 접합 과정은 2단계를 수반하였다: 시스테인 S 보호기(캡제거)를 제거하기 위한 초기 환원 반응, 그 다음에 말레이미드-시스테인 화학을 통한 생체중합체 OG1802에 대한 접합. 30x 몰 과량의 3,3',3"-포스판트라이일트라이프로파온산(TCEP)으로 (30 내지 60분) VEGFR-항IL6을 처음 환원시킨 다음, 완충제를 20mM 트리스-HCl pH　7.5, 100mM NaCl로 교환하여 시스테인 캡 및 TCEP(도 28)를 제거함으로써 캡제거를 행하였다. 대안에서, 다른 환원제, 예컨대, 3',3"-포스판트라이일트리스(벤젠설폰산) 3나트륨 염(TPPTS)은 캡제거 단계에 대해 사용할 수 있었다.
이어서, 환원된 VEGFR-항IL6을 15x 몰 과량의 데하이드로-아스코브산(dHAA)으로 산화시킨 후(30 내지 60분) 20mM 트리스 pH　7.5, 100mM NaCl로 완충제 교환하여 산화 시약을 제거하였다(도 28). 캡제거 절차에 대한 누적 수율은 89%(TCEP 환원 - 94%, dHAA 산화 - 95%)였다.
2.4㎎/㎖(또는 12.5　μM)의 최종 농도의 VEGFR-항IL6을 5x 몰 과량의 생체중합체 OG1802와 pH　8.0에서 혼합함으로써 접합 과정을 행하였다. 접합 과정은 2 내지 8℃에서 2 내지 3일의 기간 동안 일어났다. 20mM 아세트산나트륨 pH　5.5를 함유하는 완충제에서 염 농도(0 내지 500mM NaCl)를 증가시키는 단계 구배를 이용하여 포로스 XS 수지로 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 이용함으로써 접합된 VEGFR-항-IL6을 비접합 물질로부터 정제하였다(도 29). 생체접합체 VEGFR-항IL6-OG1802를 함유하는 분획을 풀링하고 나서, 완충제를 인산염 완충 식염수(PBS) pH　7.4 완충제로 교환하였다. 접합 효율은 대략 60%였다(비환원 SDS-PAGE 및 ImageJ 분석에 의해 결정). 초기 단백질 물질로부터 생체접합체까지의 누적 수율은 대략 27%였다.
SDS-PAGE(도 30) 및 SEC-MALS(도 31) 분석은 하나의 VEGFR-항IL6 분자(대략 189kDa가 OG1802 중합체 분자(대략 794　kDa)와 접합된다는 것을 입증하였는데, 이는 대략 983kDa의 생체접합체를 초래하였다. SEC-MALS 실험은 광산란(미니다운 트레오스(miniDAWN TREOS)) 및 굴절률(옵티랩(Optilab) T-rEX) 검출기(와이어트 테크놀로지(Wyatt Technology))와 연결되도록 완충제로 사전에 평형상태로 만든 크기 배제 크로마토그래피 칼럼(쇼덱스-SB806M-HQ)에 10㎍(단백질 질량)을 1㎖/분의 유속으로 주사함으로써 수행하였다. ASTRA 7(와이어트 테크놀로지)에서 데이터 및 단백질 접합체 분석을 행하였다.
실시예 13 - VEGF 트랩 절단 확인 및 제거
도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, 단백질 A 정제된 VEGFR-항-IL-6 및 ExpiCHO-S 세포로부터 유래된 항-IL-6-VEGFR 환원 생성물의 SDS-PAGE는 작제물 배향에 따라서 크기에 의한 예상치 못한 밴드를 나타내었다. 이들 밴드는 생성 동안 이중 저해제 분자의 분획이 절단된다는 것을 나타낸다. 본 실시예에서, VEGFR-항IL6은 서열 4A를 함유하는 경쇄와 짝지어지는 서열 1A-2A-3H를 포함하는 중쇄 분자에 대응한다. 항IL-6 VEGFR은 서열 4A를 함유하는 중쇄와 짝지어지는 서열 5H(Fab)-2A-1A-5H(Fc)를 포함하는 중쇄에 대응한다.
도 12에 도시하는 바와 같이, 이들 단백질 밴드를 PVDF 막에 옮겼고, 단백질 밴드의 첫번째 6개의 잔기를 에드만(Edman)의 N-말단 서열분석(프로사이즈(Procise) 494HT 기기)을 통해 서열분석하였다. 결과는 절단된 생성물이 VEGF 트랩 영역에서 VEGFR1 도메인 2 내에 위치된 동일한 N-말단의 서열(93LTHRQT)을 공유한다는 것을 나타내었다.
도 13A 및 도 13B는 단백질 절단을 붕괴시키는 한편 단백질 전반적 안정성 및 VEGF 특성에 대한 결합을 유지하는 절단 부위에 측적하는 영역에서의 돌연변이(K89TNY/LTHR96) 결과를 나타낸다. 해당 돌연변이는 서열 보존에 기반하여 선택하였고, 이 목적을 위해 VEGFR1 도메인 2 서열과 포유류 부류(Mammalia class) 내의 단백질 상동체 간의 서열 유사성 검색 및 정렬을 위해 기본적 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST)를 사용하였다. 500개의 최고의 히트는 이들의 BLAST E 값 스코어에 기반하여 선택하였다. 500개의 서열을 함유하는 이런 초기 클러스터(클러스터_1)로부터, 각각의 개개 종에 대한 최고 스코어링 서열을 선택하여 106개의 대표적 서열 세트(클러스터_2)로 환원시켰다. 클러스터_2에서 관찰된 영역에 측접하는 절단 부위 내의 서열 변형에 기반하여, 16개의 항-IL-6-VEGFR 단일 점 돌연변이를 생성하였고, 단백질 절단에 대해 평가하였다. 이들 돌연변이는 항-IL-6-VEGFR 작제물에 처음에만 도입하였는데, 이들의 분자량 차이(대략 35kDa)로 인해 절단 생성물과 무손상 생성물 간에 더 양호한 크기 분리를 나타내기 때문이다.
도 13A 및 도 13B는 절단 생성물 양을 감소시키는 경향이 있는 절단 부위에서(화살표로 표시) 변형을 보여주는 항-IL-6 VEGFR 돌연변이체의 SDS-PAGE 결과를 도시한다. 돌연변이 T94I 및 H95I(VEGF 트랩 서열에서 위치에 기반한 잔기 넘버링)는 VEGF 트랩 절단을 현저히 감소시켰다. 구체적으로는, 도 13A 및 도 13B는 도 13C에 도시된 대부분의 돌연변이 감소 단백질 절단 및 돌연변이 T94I(VEGFR_변이체_1), 및 도 13D에 도시된 H95I(VEGFR_변이체_2)는 더 현저한 효과를 가진다는 것을 도시한다. 도 13E에 도시한 바와 같은 단일 점 돌연변이(T94I, H95I) 및 이중 점 돌연변이(T94I/H95I, VEGFR_변이체_3)를 후속적으로 VEGFR-항-IL-6 작제물에 도입하였다. 도 13C는 T94I의 위치를 나타낸다(밑줄). 도 13D는 H95I의 위치를 나타낸다(밑줄). 도 13E는 T94I 및 H95I의 위치를 나타낸다(밑줄). 도 13F 및 도 13G에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE는 단백질 절단의 유사한 감소가 관찰되었고, 이 효과는 이중 돌연변이가 도입될 때 추가로 향상된다는 것을 나타내었다.
실시예 14 - 비아코어를 통한 VEGF에 대한 이중 저해제 VEGFR 변이체 결합
도 14A 내지 도 14F는 항-VEGF 제제와 VEGF 간의 친화도를 결정하기 위한 일련의 비아코어 분석 결과를 도시한다. 37℃에서 1㎎/㎖ BSA를 함유하는 완충제 HBS-EP+에서 비아코어 T200(GE 헬스케어)을 이용하여 분자 간의 결합 역학을 측정하였다. 항-VEGF 제제(VEGFR-항-IL-6(5㎍/㎖), VEGFR_변이체_1-항-IL-6(5㎍/㎖), VEGFR_변이체_2-항-IL-6(5㎍/㎖), VEGFR_변이체_3-항-IL-6(5㎍/㎖) 및 Eylea(3㎍/㎖))를 단백질 A 칩(GE) 상에서 10㎕/분으로 25초 동안 포획하였고, 5가지 농도의 VEGF-A165(0.19, 0.56, 1.67, 5, 15nM)를 포획 항체에 대해 120초 동안 30㎕/분으로 유동시키고, 60분 동안 해리시켰다. 50㎕/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사에 의해 센서 칩 표면을 재생하였다. 모든 센소그램은 2배로 기준 차감하고, 1:1 랑그뮈어 결합 모델을 이용하여 적합화시켰다. 도 14A 내지 도 14F는 단일 점 돌연변이 T94I(VEGFR_변이체_1-항-IL-6), H95I(VEGFR_변이체_2-항-IL-6) 및 이중 돌연변이체 T94I/H95I (VEGFR_변이체_3-항-IL-6)의 도입이 VEGF에 대한 결합에 최소로 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 도 14F에서 알 수 있는 바와 같이, 센소그램은 이중 저해제 분자 VEGFR-항-IL-6 및 Eylea로서 변이체가 VEGF-A에 단단히 결합한다는 것을 입증한다. 본 실시예에서, VEGFR-항IL6 분자는 서열 4A을 함유하는 경쇄와 짝지어진 GS 링커(서열 2A 내지 3H)을 통해 항IL-6 모이어티에 융합된 VEGFR 변이체(서열 1A 내지 1D)에 대응한다.
실시예 15 - 세포 기반 VEGF 자극된 VEGFR 리포터 분석
세포-기반 VEGF 자극된 VEGFR 리포터 분석의 결과를 도 15에 제공한다. 상기 언급한 바와 같은 이중 저해제 VEGFR-항IL6은 VEGF가 VEGFR에 결합하는 것을 차단하고 Eylea와 동일한 정도로(IC50 0.18nM 대 0.11nM) 하류의 신호전달을 자극하는 한편, 항-IL-6 항체는 임의의 효과를 갖지 않았다.
실험에 대해, 프로메가(Promega) KDR/VEGF HEK293 해동-및-사용 세포(CS181405; 프로메가)를 해동시키고, 4.6㎖의 분석 배지(DMEM에서 10%FBS)에 첨가하였다. 25㎕의 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 옮겼다. VEGF(500　pM 최종 농도)를 100nM(최종 농도)에서 시작하여 저해제의 10점, 1:3 연속 희석물과 혼합하였고, 30분 동안 인큐베이션시킨 후에 플레이팅 세포에 50㎕를 첨가하였다. 6시간 후에, 75㎕의 준비된 바이오-글로(Bio-Glo) 시약(프로메가)을 세포에 첨가하고 나서, 3 내지 10분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. iD3 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices)) 상에서 발광을 측정하였다. 각각의 곡선에 대해 가장 낮은 저해제 농도에 상대적 발광 단위를 정규화시키고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 항체 농도의 log에 대해 표준 오차를 갖는 복제물의 평균으로서 플롯팅하고 비선형 회귀 곡선에 적합화시켰다. 본 실시예에서, VEGFR-항IL6은 서열 4A를 함유하는 경쇄와 짝지어지는 서열 1A-2A-3H를 포함하는 중쇄 분자에 대응한다.
실시예 16 - HUVEC 관 형성 분석
도 16a 내지 도 16c는 HUVEC 관 형성 분석 결과를 도시한다.
5% CO2 중에 37℃에서 1x 소 뇌 추출물 내피세포 성장 키트(ATCC; 성장 배지)로 보충한 혈관 기본 배지에서 2 또는 3회 계대시킨 HUVEC 세포를 배양시켰다. 일단 세포가 70% 합류(confluency)에 도달되면, 트립신(0.05%; ATCC) 및 성장 배지 내 T25 플라스크에서 플레이팅한 0.75×10^6개의 세포를 이용하여 플레이트로부터 세포를 들어올렸다. 다음날 배지를 분석 배지(혈관 기본 배지에서 2% FBS)로 바꾸었다. 6시간 후에, 5㎍/㎖의 칼세인 AM을 배지에 직접 첨가하고 나서, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 동시에, 200㎕의 사전-해동 매트리겔(Matrigel)(환원된 성장 인자; 코닝(Corning))을 8-웰 유리 챔버 슬라이드의 각각의 웰에 첨가하였고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 동안, 25nM의 각각의 저해제(최종 농도)를 3nM VEGF (R&D), 12.5nM IL6(톤보(Tonbo)) 및 25nM IL6R(톤보)(모든 최종 농도)과 혼합하였다. 30분의 칼세인 AM 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 이어서, 트립신 처리하였다. 채취한 세포를 3분 동안 1,500×g에서 원심분리시키고, 500,000개의 세포/㎖의 밀도로 분석 배지에서 재현탁시켰다. 이어서, 100㎕의 세포를 100㎕의 제조 저해제/복합체 용액과 혼합하고, 이어서, 매트리겔 코팅 챔버 슬라이드에 옮기고, 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, EVOS 형광 현미경(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 상에서 10x 대물렌즈 및 GFP 필터를 이용하여 관을 영상화하였다. 적어도 2개의 대표적인 영상을 각각의 조건에 대해 촬영하고, 이어서, ImageJ에 대한 혈관신생 분석기 플러그인(Angiogenesis Analyzer Plugin for ImageJ)(NIH)을 이용하여 분석하고, 20개의 관 네트워크 형성 파라미터를 평가하고 정량화한다.
도 16a 내지 도 16c는 4개의 독립적 실험으로부터 표준 오차의 평균으로서 데이터를 나타낸다. 독립, 양측 스튜던트 t-검정(unpaired, two-tailed Students t-test)을 이용하여 4가지 독립적 실험으로부터의 모든 복제물로부터의 통계학적 유의도를 결정하였다. 도 16c에 도시된 바와 같이, VEGFR-항IL6은 대조군에 비해 17/20 파라미터에서 혈관형성 파라미터를 유의하게 저해하였다. 대조적으로, Eylea는 4/20 파라미터로 저해하였고, 항-IL-6은 7/20 파라미터로 저해하였다. VEGFR-항IL6은 도 16b에서 별표로 나타낸 바와 같이 12/20 파라미터에서 Eylea 및 항-IL-6보다 유의하게 더 양호하였다. 더 나아가, t-검정 통계학을 도 16c에 제시한다. 본 실시예에서, VEGFR-항-IL6은 서열 4A를 함유하는 경쇄와 짝지어지는 서열 1A-2A-3H를 포함하는 중쇄 분자에 대응한다.
일부 실시형태에서, VEGFR-항-IL6 작제물은 특정 위험 집단에서 효능 및 지속성을 개선시키기 위한 상승적 메커니즘을 가능하게 한다. 위험 집단은 당뇨망막병증 또는 하나 이상의 염증 망막 질환의 위험에 있거나 또는 이것으로 진단된 집단을 포함한다.
실시예 17 - HUVEC 증식 분석
도 17은 HUVEC 증식 분석 결과를 도시한다. 5% CO2 중에 37℃에서 1x 소 뇌 추출물 내피세포 성장 키트(ATCC; 성장 배지)로 보충한 혈관 기본 배지에서 HUVEC 세포(2 내지 5회 계대)를 배양시켰다. 일단 세포가 70% 합류에 도달되면, 트립신(0.05%; ATCC)을 이용하여 플레이트로부터 세포를 들어올리고, 3,500개?? 세포/웰을 100㎕의 분석 배지(l-글루타민, 아스코브산, 황산헤파란, 하이드로코티손 및 1%FBS로 보충한 혈관 기본 배지)(코닝)에서 96-웰 젤라틴 코팅된 플레이트의 중간 60개의 웰에 파종하였다. 24시간의 기아 상태(starvation) 후에, 세포를 100nM에서 시작해서 저해제의 10-점, 1:3 연속 희석물과 혼합한 VEGF(1.5nM), IL-6(5nM) 및 IL6R(10nM)로 자극하였다. VEGF 및 IL-6의 이들 농도는 서로 독립적으로 첨가될 때 최대하(sub-maximal) 수준으로 증식을 유도하였지만, 조합할 때 상승적 성장 곡선을 입증하였다. 48시간 후에, iD3 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 제조업자의 설명서에 따라 셀타이터블루(CellTiterBlue) 시약(프로메가)을 이용하여 세포 생존도를 측정하였다. 흡광도 측정을 위해, A570/A605의 비를 결정하고, 데이터를 각각의 복제물에 대해 대조군(저해제 없음) 세포에 정규화시켰다. 형광 측정(555ex/605em)을 각각의 복제물에 대해 대조군 세포에 정규화시켰다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 정규화시킨 값을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 항체 농도의 log에 대해 표준 오차를 갖는 복제물의 평균으로서 플롯팅하고 비선형 회귀 곡선에 적합화시켰다.
도 17에서 알 수 있는 바와 같이, VEGFR-항IL6 이중 저해제는 IL-6 및 VEGF에 의한 HUVEC 증식의 상승적 자극을 차단한 반면, Eylea도 항-Il-6항-IL-6도 이들 조건 하에서 HUVEC 성장에 영향을 미치지 않았다.
실시예 18 - 개선된 항-IL-6 파라토프의 생성
개선된 항-IL-6 파라토프의 생성을 본 실시예에 기재한다. 비아코어 역학 결과를 표 18.1, 18.2, 18.3 및 18.4에 나타낸다.
조작된 인간 IgG1 프레임워크 상에서 우수한 항-IL-6 파라토프를 제공하기 위해, G66D(CDR2) 중쇄 돌연변이체를 친화도 성숙시켰다. 처음에, 이들 아미노산과 연관된 화학적 라이브러리로 인한 Cys, Met 및 Asn의 치환을 제외하고, S35, I51, T63 및 T65 위치에서 무작위 단일 점 돌연변이를 함유하는 G66D 완전 중쇄 라이브러리를 작제하였다. 박테리아 및 포유류 선별에서 관찰한 바와 같은 돌연변이에 대한 내약성에 기반하여 해당되는 4개의 위치를 선택하였다. 중쇄 돌연변이를 함유하는 포유류 발현 벡터를 Expi293 세포의 3㎖ 배양물 내로 경쇄 야생형 및 변이체 M32L/M50D/N52S/M88Q로 공동 형질감염시키고, 5일 동안 인큐베이션시켰다. 이들 배양물을 원심분리시키고 나서, 분리된 항체를 함유하는 상청액을 채취하고 나서, HBS-EP+ 실행 완충제(1:20 비)로 희석시켰다.
다양한 작제물 및 얻어진 역학 특성을 이하의 표 18.1 내지 표 18.4에 제공한다.
[표 18.1]
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
[표 18.2]
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
[표 18.3]
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
[표 18.4]
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
37℃에서 비아코어 T200을 이용하여 IL-6에 대한 이들 돌연변이체 분자의 결합 역학을 측정하였다. 세포 상청액의 1:20 희석물을 10㎕/분으로 60초 동안 주사함으로써 단백질 A 칩(GE) 상에서 항체를 포획하였다. 포획 항체에 대해 60초 동안 30㎕/분의 유속으로 5가지 농도(0.56, 1.67, 5, 15 및 45nM)의 IL-6를 유동시키고, 단일 순환 역학 비아코어 분석 형식으로 180초 동안 해리시켰다. 50㎕/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사에 의해 센서칩을 재생하였다. 적용 가능할 때 정제 항체 샘플과 IL-6 간의 상호작용을 37℃에서 모니터링하기 위해 유사한 분석 셋업을 사용하였다. 이 셋업을 위해, 단백질 A 칩에 대해 10㎕/분으로 25초 동안 1㎍/㎖의 정제된 항체를 주사하였다. 포획 항체에 대해 60초 동안 30㎕/분의 유속으로 5가지 농도(0.56, 1.67, 5, 15 및 45nM)의 IL-6를 유동시키고, 단일 순환 역학 비아코어 분석 형식으로 1800초 동안 해리시켰다. 50㎕/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사에 의해 센서칩을 재생하였다. BIAevaluation 소프트웨어(GE)를 이용하여 상청액 및 정제된 샘플에 대한 데이터 분석을 수행하였다. 모든 센소그램은 2배로 기준 차감하고, 1:1 랑그뮈어 결합 모델을 이용하여 적합화시켰다.
표 18.1 및 표 18.2에 나타낸 바와 같이, S35H G66D 이중 돌연변이체 중쇄는 야생형 중쇄에 비해 포획 수준의 대략 2배 증가로 나타내는 바와 같이, 단백질 발현에 대한 부스트를 제시하였다. 이 돌연변이체는 또한 짝지어진 경쇄에 따라 친화도의 적은 증가를 제시하였다(야생형: 대략 2배, M32L/M50D/N52S/M88Q: 대략 1.3배). 표 18.1은 항-IL-6 중쇄 이중 돌연변이체에 대한 LC 야생형 비아코어 역학의 G66D 최적화를 도시한다. 사전에(상청액) 그리고 정제 후에, 둘 다 37℃에서 데이터를 얻었다. 표 18.2는 돌연변이유발 경쇄와 짝지어진 항-IL-6 중쇄 이중 돌연변이체에 대한 LC 돌연변이체 비아코어 역학의 G66D 최적화를 도시한다. 사전에(상청액) 그리고 정제 후에, 둘 다 37℃에서 데이터를 얻었다.
따라서, 이 이중 돌연변이체를 다른 라운드에 대한 시작점으로서 선택하였고, 여기서 CDR3에서 치환-용인 Q99 및 L100 위치를 무작위 돌연변이시키고, 발현시키고 나서, G66D 선별 라운드에 대해 기재한 바와 같이 IL-6 결합에 대해 평가하였다. 표 18.3 및 표 18.4에 나타낸 바와 같이, Ala, Ser, Gly, Thr, Gln, Lys에 대한 L100 치환은 포획 수준으로 나타내는 바와 같이 야생형과 비교할 때 우수한 발현을 제시하였다. 따라서 정제 및 IL-6 결합 평가를 위해 이들 돌연변이체를 선택하였다. 정제된 물질을 이용하는 친화도 측정은 또한 표 18.3 및 표 18.4에 도시된 바와 같이 우수한 IL-6 결합을 나타내었다. 이들 결과에 기반하여, 도 18에 도시한 바와 같은 이들 추가적인 변형된 CDR을 항-IL-6 및 항-VEGF 이중 저해제 분자의 설계에 포함시켰다.
표 18.3은 항-IL-6 중쇄 삼중 돌연변이체에 대한 LC 야생형 비아코어 역학과 짝지어진 G66D/S35H 중쇄 변형을 도시한다. 사전에(상청액) 그리고 정제 후에, 둘 다 37℃에서 데이터를 얻었다. 표 18.4는 돌연변이유발된 경쇄와 짝지어진 항-IL-6 중쇄 삼중 돌연변이체에 대한 LC 돌연변이체 비아코어 역학과 짝지어진 G66D/S35H 중쇄 변형을 도시한다. 사전에(상청액) 그리고 정제 후에, 둘 다 37℃에서 데이터를 얻었다.
실시예 19- 항-IL-6 항-VEGF 이중 저해제 변이체
VEGF 트랩 변이체 및 우수한 항-IL-6 파라토프에 의한 결과에 기반하여, 도 19, 20, 21, 22 및 23에 나타낸 바와 같은 서열의 조합을 포함하는 두 상이한 입체배치에서 216개의 분자를 설계하였다. 제1 입체배치(VEGFR-항-IL-6)에 대해, 도 19의 서열 1A 내지 1D에 나타낸 바와 같은 VEGF 트랩은 단백질의 시작에 위치되고, 그 다음에 도 20의 서열 2A에 나타내는 바와 같은 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 링커 (GS)의 이중 반복부에 위치되는데, 이는 도 21의 서열 3A 내지 3I에 의해 나타내는 바와 같은 항-IL-6 중쇄의 N-말단에 트랩을 연결한다. 이들 작제물은 도 22의 서열 4A 내지 4C에 열거된 경쇄와 짝지어질 수 있다. 제2 입체배치에서, (항-IL-6-VEGFR), 중쇄 - Fab, 도 23의 서열 5A 내지 5I에 의해 도시되는 중쇄의 가변 및 불변 도메인은 도 20의 서열 2A에 의해 도시되는 GS 링커를 통해 도 19의 서열 1A 내지 1D에 의해 도시된 VEGF 트랩에 연결되고, 이어서, 중쇄 - Fc, 도 23의 서열 5A 내지 5I에 의해 도시되는 Fc 도메인은 VEGF 트랩의 C-말단 단부에 융합된다. 따라서, VEGF 트랩은 항체 Fab와 Fc 영역 사이에 샌드위치된다.
도 19는 VEGF 트랩 서열을 도시한다. 서열 내 변형은 밑줄 표시되어 있고, 볼드체로 강조된다. 도 20은 이중 반복부 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 링커(GS) 서열을 도시한다. 도 21은 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열을 도시한다. CDR을 밑줄 표시한다. 도 22는 항-IL-6 분자에 대한 경쇄 서열을 도시한다. CDR을 밑줄 표시한다. 도 23은 항-IL-6 분자에 대한 중쇄(Fab 및 Fc로 분리된) 서열을 도시한다. CDR을 밑줄 표시한다.
일부 실시형태에서, VEGF 트랩의 임의의 옵션은 도 22의 서열 4A 내지 4C에 열거된 경쇄와 짝지어질 수 있되, 이는 항체 Fab와 Fc 영역 사이에 샌드위치된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 도 19에 약술된 작제물(VEGFR 서열)은 본 명세서에 제공된 임의의 VEGF 트랩 배열 또는 그 자체에 대해 사용될 수 있다.
실시예 20 - VEGFR-트랩 Fc 융합과 VEGF 사이의 결합 역학
항-IL-6항-IL-6 도 26A 내지 도 26C는 항-VEGF 제제와 VEGF 간의 친화도를 결정하기 위한 비아코어 분석 결과를 도시한다. 37℃에서 비아코어 T200을 이용하여 1㎎/㎖ BSA를 함유하는 완충제 HBS-EP+에서 결합 역학을 측정하였다. VEGFR-Fc (1㎍/㎖) 및 Eylea(1㎍/㎖)를 단백질 A 칩(GE) 상에서 10㎕/분으로 25초 동안 포획하였고, 5가지 농도의 VEGF-A165(0.19, 0.56, 1.67, 5, 15nM)를 포획 항-VEGF 분자에 대해 120초 동안 30㎕/분으로 유동시키고, 30분 동안 해리시켰다. 50㎕/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사에 의해 센서 칩 표면을 재생하였다. 모든 센소그램은 2배로 기준 차감하고, 1:1 랑그뮈어 결합 모델을 이용하여 적합화시켰다. 도 26A 내지 도 26C에 나타내는 바와 같이, VEGFR-Fc 및 Eylea는 VEGF에 대해 유사한 친화도로 결합한다. 본 실시예에서, VEGFR-Fc는 서열 6A를 함유한다.
실시예 21 - 절단 생성물의 제거
실시예 13에 논의한 바와 같이, VEGFR-항IL6은 VEGF 트랩 영역에서 VEGFR1 도메인 2의 약간의 절단 정도를 제시한다. 본 발명자들은 단백질 A 정제 단계 후에 절단 물질로부터 무손상 단백질을 분리시키는 2가지의 직교 크로마토그래피 방법을 개발하였다: i) 양이온 교환(CEX) 및 ii) 소수성 상호작용(HIC).
CEX 방법에 대해, VEGFR-항IL6 단백질 A 용리액 pH 용액을 6으로 조절하고, 이어서, 20mM 인산나트륨 pH　6으로 사전 평형상태로 만든 포러스 XS 칼럼에 주사하였다. 무손상 단백질을 절단 물질보다 더 낮은 이온 강도에서 용리시키고, 증가된 이온 강도의 선형 구배(0 내지 1M 염화나트륨) 내에서 거의 완전하게 분리시킨다(도 32). 무손상 단백질이 농축된 분획을 모았고, 전반적 회수 수율은 대략 57%였다.
HIC 방법에 대해, 절단된 물질이 농축된 VEGFR-항IL6 무손상 단백질의 혼합물을 20mM 인산나트륨 pH　6, 500mM 내지 1M의 황산암모늄으로 사전 평형상태로 만든 뷰틸 HP 칼럼에 주사하였다. 무손상 단백질 및 절단된 단백질을 감소된 이온 강도의 선형 구배(1 내지 0M 황산암모늄) 내에서 분리시켰고, 여기서 무손상 단백질은 절단 물질보다 더 낮은 이온 강도로 용리되고 풀링한 분획에 따라 부분적으로 또는 완전히 분리시킬 수 있었다(도 33).
실시예 22--KinExA에 의해 측정한 IL6 및 VEGF-A에 대한 VEGFR 항IL6 친화도
역학 제외 분석(Kinetic Exclusion Assay)(KinExA(등록상표)) 3200 시스템(사피다인 인스트루먼츠 인코포레이티드(Sapidyne Instruments Inc.), 아이다주 보이시에 소재)을 사용하여 평형상태 결합 친화도 및 용액 중의 VEGFR-항IL6 또는 VEGFR-항IL6-OG1802(도 27에 나타낸 단백질 성분)와 VEGF 또는 IL6 사이의 역학을 측정한다. VEGF 또는 IL6으로 코팅한 아즈락톤(Azlactone) 비드를 VEGFR-항IL6 또는 VEGFR-항IL6-OG1802 및 VEGF 또는 IL6의 평형상태 샘플로부터의 유리 VEGFR-항IL6 또는 VEGFR-항IL6-OG1802의 분획을 포획하는 데 사용하였다. 포획된 이중 저해제 분자를 형광 표지된 다클론성 항-인간 항체(알렉사(Alexa) 647 염소, 항-인간 IgG)로 검출하였다.
하기에 열거하는 증가된 이중 저해제 농도 및 이들의 대응하는 VEGF 적정 연속 희석물(괄호에 표시)에서 2 내지 3개의 적정 곡선으로부터 이중 저해제 분자와 VEGF 사이의 친화도를 결정하였다: I) VEGFR-항IL6: 1nM (20nM, 2배 희석, 12개의 희석) 3.5시간 인큐베이션; 50pM(500　pM, 2배 희석, 14개의 희석) 2.5시간 인큐베이션; 10pM(1nM, 2배 희석, 13개의 희석) 23시간 인큐베이션; II) VEGFR-항IL6-OG1802: 2nM(30nM, 2배 희석, 12개의 희석) 45분의 인큐베이션; 100pM(15nM, 2배 희석, 14개의 희석) 6시간 인큐베이션; 7.5pM(1nM, 2배 희석, 14개의 희석) 48시간 인큐베이션. 다음의 조건 하에 IL6을 이용하여 유사한 측정을 수행하였다: III) VEGFR-항IL6: 1nM (20nM, 2배 희석, 13개의 희석) 7시간 인큐베이션; 10pM(1nM, 2배 희석, 13개의 희석) 42시간 인큐베이션; 100pM(1nM, 2배 희석, 13개의 희석) 2.5시간 인큐베이션; IV) VEGFR-항IL6-OG1802: 1nM (22.5nM, 2배 희석, 13개의 희석) 5.5시간 인큐베이션; 100pM(22.5nM, 2배 희석, 14개의 희석) 12시간 인큐베이션.
이중 저해제 분자와 VEGF 또는 IL6 사이의 온 속도(On rate)(k on, M-1s-1)를 역학 측정 실험으로부터 직접적으로 결정한 한편(각각의 분석 쌍에 대해 1 내지 2개의 곡선), 다음의 식에 기반하여 오프 속도(k off, s-1)를 계산하였다: k off = Kd× k on. i) 100　pM VEGFR-항IL6 및 86.4　pM VEGF, ii) 217　pM VEGFR-항IL6-OG1802 내지 200　pM VEGF, iii) 100pM VEGFR-항IL6 내지 84.3　pM IL6, iv) 1000　pM VEGFR-항IL6 내지 900　pM IL6을 함유하는 4개의 제제에 대한 측정을 수행하였다.
모든 측정을 37℃에서 1x PBS 실행 완충제(pH　7.4)를 이용하여 행하였고, 샘플을 1㎎/㎖ BSA로 1xPBS (pH　7.4)에서 제조하였다. KinExA 프로 소프트웨어 4.3.11를 이용하여 데이터 분석을 행하였다.
시험한 조건 하에서, VEGFR-항IL6-OG1802는, VEGFR-항IL6 및 VEGF에 대해 2.10　pM, VEGFR-항IL6-OG1802 및 VEGF에 대해 1.02　pM, VEGFR-항IL6 및 IL6에 대해 21.10pM, VEGFR-항IL6-OG1802 및 IL6에 대해 12.10　pM의 Kd 값으로 VEGFR-항IL6과 비슷한 방식으로 VEGF 및 IL6에 결합한다(표 22.1 및 표 22.2 참조).
[표 22.1]
Figure pct00105
[표 22.2]
Figure pct00106
VEGFR-항IL6 및 VEGFR-항IL6-OG1802의 측정 친화도는 IL6과 VEGF 둘 다에 대해 오차 이내였고, 따라서 이들 결과는 이중 저해제가 이의 표적에 결합하는 것에 생체중합체가 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 23--VEGF/VEGFR 경쟁적 ELISA
실시예 3에 기재한 바와 같이 이 분석을 수행하였다. 이 분석에서, VEGFR-항IL6, VEGFR-항IL6-OG1802(도 27에 나타낸 바와 같음), 및 Eylea는 모두 VEGF의 VEGFR에 대한 결합을 다양한 정도로 저해하였다(도 34). VEGFR-항IL6-OG1802는 VEGFR-항-IL6(IC50 = 1.98nM) 및 Eylea(IC50 = 1.38nM)와 비교할 때 우수한 저해(IC50 = 0.99nM)를 나타내었다. 추가적으로, VEGFR-항IL6은 Eylea보다 우수한 최대 저해를 나타낸 반면, VEGFR-항IL6-OG1802는 훨씬 더 확연한 최대 저해를 가졌다(VEGFR-항IL6-OG1802 = 79.5%, VEGFR-항-IL6 = 67.0% 대 Eylea = 49.6%). 이들 데이터는 VEGFR-항IL6에 대한 생체중합체 OG1802의 첨가가, VEGFR에 VEGF가 결합하는 추가적인 저해 능력을 만들어 낸다는 것을 나타낸다. 따라서 생체중합체는 분자의 작용기에 첨가된다.
실시예 24--IL-6/IL-6R 경쟁 ELISA
실시예 3에 기재한 바와 같이 이 분석을 수행하였다.
이들 조건 하에서, VEGFR-항IL6-OG1802는 VEGFR-항IL6에 대해 0.26nM 및 VEGFR-항IL6-OG1802에 대해 0.23nM의 IC50 값으로 VEGFR-항IL6과 비슷한 방식으로 IL-6/IL-6R 상호작용을 효과적으로 차단시킨다(도 35). 이들 결과는 IL6이 수용체에 결합하는 것에 대해 생체중합체가 이중 저해제의 저해 효과를 변경시키지 않는다는 것을 나타낸다. Eylea는 음성 대조군으로서 작용하였다.
실시예 25--세포 기반 VEGF 자극된 VEGFR 리포터 분석:
실시예 15에 기재한 바와 같이 이 분석을 수행하였다.
시험한 조건 하에서, VEGFR-항IL6-OG1802는 VEGFR-항IL6 및 Eylea와 비슷한 방식으로 VEGF 자극된 VEGFR 수용체 세포를 저해하였고, 평균 IC50 값은 각각 0.35±0.10nM, 0.51±0.07nM 및 0.35±0.03nM이었다(도 36). VEGR-항IL6-OG1802(도 27에 나타낸 바와 같은 단백질 성분) 및 Eylea가 VEGFR-항IL6보다 적절하게 더 효능이 있는 경향이 있을 수 있지만, 이는 상당한 발견이 아니며, 분석 오차 내에 속한다. 본 발명자들은 이들 데이터로부터 생체접합체가 이의 단백질 전구체와 유사하게 VEGFR2 신호전달을 저해한다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 26--HUVEC에서 지질다당류 자극된 관 형성:
5% CO2 중에 37℃에서 1x 소 뇌 추출물 내피세포 성장 키트(ATCC; 성장 배지)로 보충한 혈관 기본 배지에서 2회 계대시킨 HUVEC 세포를 배양시켰다. 일단 세포가 70% 합류(confluency)에 도달되면, 트립신(0.05%; ATCC) 및 성장 배지 내 T25 플라스크에서 플레이팅한 0.75×10^6개의 세포를 이용하여 플레이트로부터 세포를 들어올렸다.
다음날 배지를 분석 배지(혈관 기본 배지에서 2% FBS)로 바꾸었다. 6시간 후에, 5㎍/㎖의 칼세인 AM을 배지에 직접 첨가하고 나서, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
동시에, 200㎕의 사전-해동 매트리겔(Matrigel)(환원된 성장 인자; 코닝(Corning))을 8-웰 유리 챔버 슬라이드의 각각의 웰에 첨가하였고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 동안에, 저해제(37.5nM 최종 농도)를 지질다당류(LPS; 시그마(Sigma); 1㎍/㎖ 최종 농도)와 혼합하였다.
30분의 칼세인 AM 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 이어서, 트립신 처리하였다. 채취한 세포를 3분 동안 1,500×g에서 원심분리시키고, 500,000개의 세포/㎖의 밀도로 분석 배지에서 재현탁시켰다. 이어서, 150㎕의 세포를 100㎕의 제조 저해제/복합체 용액과 혼합하고, 이어서, 매트리겔 코팅 챔버 슬라이드에 옮기고, 밤새 인큐베이션시켰다.
다음 날, EVOS 형광 현미경(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 상에서 10x 대물렌즈 및 GFP 필터를 이용하여 관을 영상화하였다. 적어도 2개의 대표적인 영상을 각각의 조건에 대해 촬영하고, 이어서, ImageJ에 대한 혈관신생 분석기 플러그인(Angiogenesis Analyzer Plugin for ImageJ)(NIH)을 이용하여 분석하고, 20개의 관 네트워크 형성 파라미터를 평가하고 정량화한다.
독립, 양측 스튜던트 t-검정을 이용하여 독립적 실험으로부터의 모든 복제물로부터의 통계학적 유의도를 결정하였다.
이들 조건 하에서, VEGFR-항IL6은 대조군 이상으로 15/20 측정된 혈관형성 파라미터의 통계학적으로 유의한 저해를 나타낸 반면, 대조군 처리 세포에 비해 Eylea는 5/20으로 유의하게 저해하였고 항-IL6은 3/20으로 저해하였다. 종합하면, Eylea 또는 항-IL6에 의해 영향받는 경향이 있거나 유의하게 영향 받은, 한 가지 파라미터를 제외한 모든 파라미터는 VEGFR-항IL6에 의해 유의하게 저해되었다. 추가적으로, VEGFR-항IL6이 Eylea(7/20) 및 항-IL6(10/20) 이상으로 유의하게 더 양호한 저해를 나타낸 몇몇 파라미터가 있으며, 이 중 3가지는 VEGFR-항IL6이 Eylea와 항-IL6 둘 다보다 유의하게 양호하였다. (도 37 및 도 38 및 도 11)
VEGFR-항IL6-OG1802는 HUVEC 관 형성을 유의하게 저해하였고, 흥미롭게도, VEGFR-항IL6-OG1802는 VEGFR-항IL6 이상으로 9/20 파라미터에서 증가된 저해의 경향을 나타내었다. (도 39). 이는 VEGFR-항IL6-OG1802는 이의 비접합 상대 이상으로 이점을 첨가한다는 것을 나타낸다.
실시예 27--HUVEC 증식 분석:
실시예 17에 기재한 바와 같이 이 분석을 수행하였다.
시험한 조건 하에, VEGFR-항IL6-OG1802(도 27에 나타낸 바와 같은 단백질 성분)는 VEGFR-항IL6과 비슷한 방식으로 VEGF/IL6 자극된 HUVEC 증식을 저해한 반면, Eylea는 효과가 없었다(도 40a).
흥미롭게도, 실험의 시작 시 웰당 상이한 밀도의 세포를 파종하였을 때 VEGFR-항IL6-OG1802는 VEGFR-항IL6에 비해 증가된 효능을 나타내었다. 도 40b에 나타낸 바와 같이, 웰당 2,000개의 세포로, VEGFR-항IL6 및 VEGFR-항IL6-OG1802는 HUVEC 증식의 거의 동일한 저해를 나타내었다. 웰당 4,000개의 세포로, VEGFR-항IL6-OG1802는 VEGFR-항IL6보다 약간 더 양호한 최대 저해를 나타내었고(각각 40% 대 30%), 웰당 6,000개의 세포로, VEGFR-항IL6-OG1802는 대조군에 비해 25%만큼 증식을 저해한 반면, VEGFR-항IL6은 효과가 없었다.
상기 실시예에 나타낸 바와 같이, 이론으로 제한되는 일 없이, 생체중합체는 플레이트 및 세포의 표면에 이의 단백질 상대를 전달하는 것을 돕는 것으로 나타난다. 이는 약물이 VEGF 및 IL6의 풀(pool)을 주로 저해하도록 하는데, 이는 세포 신호전달을 활성화시키고, 유체상에서보다 더 크게 현탁되는 VEGF 및 IL6에 의해 포화되는 것을 피하게 할 수 있으며, 세포 신호전달에 영향을 미칠 가능성은 더 적다. 세포수가 증가함에 따라, 더 많은 약물이 더 많은 세포 상에서 작용할 필요가 있기 때문에 이 효과는 더 확연할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 접합체는 분자의 분포를 도울 수 있다는 점에서 우수한 생성물을 제공한다.
상기 또는 이하에 열거하는 모든 특허 출원, 웹사이트, 기타 간행물, 수탁 번호 등은 각각의 개개 항목이 참고로 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타나는 것과 동일한 정도로 이들의 전문이 모든 목적을 위해 참조에 의해 원용된다. 상이한 버전의 서열이 상이한 시간의 수탁 번호와 연관된다면, 본 출원의 유효한 출원일에 수탁 번호와 연관된 버전을 의미한다. 유효한 출원일은 실제 출원일은 실제 출원일 또는 적용 가능하다면 수탁 번호에 관한 우선권 출원의 출원일 중 더 빠른 날을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 형 간행물, 웹사이트 등이 상이한 시간에 공개된다면, 달리 표시되지 않는 한 출원의 유효한 출원일에 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시형태 또는 양상은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 명확함과 이해의 목적을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 기재하였지만, 특정 변화 및 변형이 첨부하는 청구범위의 범주 내에서 실행될 수 있다는 것은 분명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> KODIAK SCIENCES INC. <120> IL-6 ANTIBODIES AND FUSION CONSTRUCTS AND CONJUGATES THEREOF <130> WO/2019/169341 <140> PCT/US2019/020418 <141> 2019-03-01 <150> US 62/637575 <151> 2018-03-02 <150> US 62/727950 <151> 2018-09-06 <160> 269 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln 1 5 10 15 Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu 20 25 30 Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met 35 40 45 Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 50 55 60 Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 65 70 75 80 Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr 85 90 95 Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg 100 105 110 Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys 115 120 125 Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala 130 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Gly 210 215 220 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 225 230 235 240 Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 245 250 255 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp 260 265 270 Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp 275 280 285 Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 290 295 300 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala 305 310 315 320 Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 325 330 335 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 340 345 350 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 355 360 365 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 370 375 380 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 385 390 395 400 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 405 410 415 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 420 425 430 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 435 440 445 Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 450 455 460 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 465 470 475 480 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 485 490 495 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 500 505 510 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 515 520 525 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 530 535 540 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 545 550 555 560 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 565 570 575 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 580 585 590 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 595 600 605 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 610 615 620 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 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Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val 225 230 235 240 Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 245 250 255 Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr 260 265 270 Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile 275 280 285 Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys 290 295 300 Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr 305 310 315 320 Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val 325 330 335 Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu 340 345 350 Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe 355 360 365 Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn 370 375 380 Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser 385 390 395 400 Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr 405 410 415 Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val 420 425 430 Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 435 440 445 Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 450 455 460 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 465 470 475 480 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 485 490 495 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 500 505 510 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 515 520 525 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 530 535 540 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 545 550 555 560 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 565 570 575 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 580 585 590 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 595 600 605 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 610 615 620 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 625 630 635 640 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 645 650 655 Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys 660 <210> 268 <211> 664 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion <400> 268 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val 50 55 60 Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val 225 230 235 240 Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 245 250 255 Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr 260 265 270 Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile 275 280 285 Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys 290 295 300 Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr 305 310 315 320 Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val 325 330 335 Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu 340 345 350 Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe 355 360 365 Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn 370 375 380 Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser 385 390 395 400 Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr 405 410 415 Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val 420 425 430 Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 435 440 445 Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 450 455 460 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 465 470 475 480 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 485 490 495 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 500 505 510 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 515 520 525 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 530 535 540 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 545 550 555 560 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 565 570 575 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 580 585 590 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 595 600 605 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 610 615 620 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 625 630 635 640 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 645 650 655 Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys 660 <210> 269 <211> 664 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion <400> 269 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 210 215 220 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 225 230 235 240 Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 245 250 255 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp 260 265 270 Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp 275 280 285 Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 290 295 300 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala 305 310 315 320 Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 325 330 335 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 340 345 350 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 355 360 365 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 370 375 380 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 385 390 395 400 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 405 410 415 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 420 425 430 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 435 440 445 Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 450 455 460 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 465 470 475 480 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 485 490 495 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 500 505 510 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 515 520 525 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 530 535 540 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 545 550 555 560 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 565 570 575 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 580 585 590 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 595 600 605 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 610 615 620 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 625 630 635 640 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 645 650 655 Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys 660

Claims (88)

  1. 중합체에 접합된 IL-6에 특이적으로 결합하는, 단리된 길항 항체.
  2. 단리된 길항 IL-6 항체로서,
    서열번호 7 내지 13, 19 내지 27, 89, 90, 256 내지 262 중 적어도 하나의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역; 및
    서열번호 91 내지 93, 28 내지 30 중 적어도 하나의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 경쇄 아미노산 가변 영역
    을 포함하는, 단리된 길항 IL-6 항체.
  3. 단리된 길항 IL-6 항체로서,
    서열번호 256에 열거된 CDR로부터의 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역: VH(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 91 내지 93에 열거된 CDR의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 단리된 길항 IL-6 항체.
  4. IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체로서,
    상기 항체는 EU 넘버링에 기반한 다음의 돌연변이 중 적어도 하나: L234A, L235A 및 G237A를 포함하는, 단리된 길항 항체.
  5. IL-6에 결합하는 단리된 길항 항체로서,
    상기 항체는,
    서열번호 172에서 CDRH1인 CDRH1;
    서열번호 173에서 CDRH2인 CDRH2;
    서열번호 174에서 CDRH3인 CDRH3:
    서열번호 199에서 CDRL1인 CDRL1;
    서열번호 200에서 CDRL2인 CDRL2;
    서열번호 201에서 CDRL3인 CDRL3;
    다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A; 및
    다음의 돌연변이 중 적어도 하나(EU 넘버링): Q347C 또는 L443C
    를 포함하는, 단리된 길항 항체.
  6. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 약 10pM 내지 약 1nM의 친화도로 인간 IL-6에 결합하는, 단리된 길항 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 불변 도메인은 재조합 DNA 기술에 의해 도입된 시스테인 잔기를 더 포함하는, 단리된 길항 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 Q347C 및 L443C(EU 넘버링)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 단리된 길항 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 L443C(EU 넘버링)인, 단리된 길항 항체.
  10. 융합 단백질(fusion protein)로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체; 및
    VEGF Trap
    을 포함하는, 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 VEGF Trap은,
    1. IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 N-말단 단부에; 또는
    2. 힌지 영역과 IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 CH1 도메인 다음 사이
    중 하나에 위치된, 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 VEGF Trap은 IL-6 VH를 포함하는 상기 중쇄의 N-말단 단부에 있는, 융합 단백질.
  13. 제11항에 있어서, 상기 VEGF Trap은 상기 힌지 영역과 IL-6 VH를 포함하는 상기 중쇄의 CH1 도메인 다음 사이에 있는, 융합 단백질.
  14. 제10항에 있어서, 상기 VEGF 결합 도메인은 VEGFR1 도메인 2 및 VEGFR2 도메인 3을 포함하는, 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 VEGF 결합 도메인은 서열번호 114의 서열로 이루어진, 융합 단백질.
  16. 제14항에 있어서, 상기 VEGF 결합 도메인은 VEGF 트랩(trap)으로서 작용하여, VEGF가 세포에서 발현된 VEGF 수용체에 결합하는 것을 방지하는, 융합 단백질.
  17. 접합체(conjugate)로서,
    (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체; 및
    (b) 중합체를 포함하되,
    상기 중합체는 상기 항체에 공유적으로 부착된, 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 중합체는 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하는, 접합체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 중합체는 양쪽성이온 단량체를 포함하되, 상기 양쪽성이온 단량체는 HEMA-포스포릴콜린, PEG, 생체 적합 지방산 및 이의 유도체, 하이드록시 알킬 전분(HAS), 하이드록시 에틸 전분(HES), 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(Glyx-Sery)(HAP), 히알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 플렉시머, 덱스트란, 폴리-시알산(PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 25 알부민, 엘라스틴 유사(ELP) 펩타이드, XTEN 중합체, PAS 중합체, PA 중합체, 알부민 결합 펩타이드, CTP 펩타이드 및 FcRn 결합 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  20. 접합체로서,
    제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질; 및
    중합체를 포함하되,
    상기 중합체는 상기 융합 단백질에 공유적으로 부착된, 접합체
  21. 제20항에 있어서, 상기 중합체는 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하는, 접합체.
  22. 제20항에 있어서, 상기 중합체는 양쪽성이온 단량체를 포함하되, 상기 양쪽성이온 단량체는 HEMA-포스포릴콜린, PEG, 생체 적합 지방산 및 이의 유도체, 하이드록시 알킬 전분(HAS), 하이드록시 에틸 전분(HES), 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(Glyx-Sery)(HAP), 히알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 플렉시머, 덱스트란, 폴리-시알산(PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 25 알부민, 엘라스틴 유사(ELP) 펩타이드, XTEN 중합체, PAS 중합체, PA 중합체, 알부민 결합 펩타이드, CTP 펩타이드 및 FcRn 결합 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 2(메타크릴로일옥시)에틸 (2-(트라이메틸암모니오)에틸) 포스페이트(MPC) 단량체를 포함하는, 접합체.
  24. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 크기 배제 크로마토그래피 - 다중각 광산란(size exclusion chromatography - multi angle light scattering)(이후에 "SEC-MALS"로 지칭)에 의해 측정할 때 피크 분자량이 300,000 내지 1,750,000 달톤인, 접합체.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 SEC-MALS에 의해 측정할 때 피크 분자량이 500,000 내지 1,000,000 달톤인, 접합체.
  26. 제22항에 있어서, 상기 중합체는 SEC-MALS에 의해 측정할 때 피크 분자량이 600,000 내지 800,000 달톤인, 접합체.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 2개 이상의 아암을 갖는, 접합체.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아암을 갖는, 접합체.
  29. 제28항에 있어서, 상기 중합체는 9개의 아암을 갖는, 접합체.
  30. 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG인, 접합체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 중합체는 상기 IgG 중쇄 상의 시스테인 잔기로부터의 설프하이드릴기에 공유 결합된, 접합체.
  32. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 347 또는 443번 위치(EU 넘버링)에서 시스테인 잔기를 포함하는, 접합체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 중합체는 347 또는 443번 위치(EU 넘버링)에서 시스테인 잔기로부터의 설프하이드릴기에 공유결합된, 접합체.
  34. 제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중합체에 추가로 접합되어 생체접합체를 형성하고, 상기 생체접합체는 분자량이 약 350,000 내지 1,900,000 달톤인, 접합체.
  35. 제17항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다분산지수(PolyDispersity Index: PDI)는 1.5 이하인, 접합체.
  36. 제17항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체는 9개의 아암을 갖고; 그리고
    상기 중합체는 분자량이 약 600,000 내지 약 900,000Da인, 접합체.
  37. 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조를 포함하되:
    Figure pct00107

    식 중:
    상기 항-IL-6 항체의 각각의 중쇄는 글자 H로 나타내고, 상기 항-IL-6 항체의 각각의 경쇄는 글자 L로 나타내며;
    상기 중합체는 C443(EU 넘버링)의 설프하이드릴을 통해 상기 항체에 결합되며, 이 결합은 상기 중쇄 중 하나에 대해 도시되고;
    PC는
    Figure pct00108
    이되, 상기 곡선은 상기 중합체 나머지에 대한 부착지점을 나타내며; X는 a) OR, 여기서 R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할로겐화물이며; 그리고
    n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 및 n9의 합이 2500 + 또는 - 15%가 되도록 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일 또는 상이하며,
    상기 접합체가 VEGF Trap을 포함한다면, 상기 VEGF Trap은:
    a) 상기 중쇄의 N-말단 단부에; 또는
    b) 상기 중쇄의 힌지 영역과 Fab 영역(상기 CH1 도메인 다음) 사이에 융합된, 접합체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 접합체가 VEGF Trap을 포함할 경우, 상기 VEGF Trap은 VEGFR1 도메인 2, 및 이어서, VEGFR2-도메인 3을 이 순서대로 포함하는, 접합체.
  39. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체 또는 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 생성하는, 단리된 세포주.
  40. 제39항에 있어서, 상기 세포주는 CHO, k1SV, XCeed, CHOK1SV 및 GS-KO로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 세포주.
  41. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체 또는 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는, 단리된 핵산.
  42. 제41항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  43. 제42항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  44. IL-6 길항 항체 또는 이의 융합 단백질의 생성 방법으로서,
    상기 항체가 생성되는 조건 하에서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체 또는 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 재조합적으로 생성하는 세포주를 배양시키는 단계; 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, IL-6 길항 항체 또는 이의 융합 단백질의 생성 방법.
  45. 약제학적 조성물로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체 또는 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및/또는 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항의 접합체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 조성물은 액체이며, 내독소 수준이 약 0.2 EU/㎖ 미만인, 약제학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 조성물은 액체이며, 내독소 수준이 약 2.0, 1, 0.5 또는 0.2 EU/㎖ 미만인, 약제학적 조성물.
  48. 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체 또는 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및/또는 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항의 접합체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  49. 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에서 질환의 치료 또는 예방 방법으로서,
    과활성 IL-6 및/또는 VEGF 활성을 갖는 환자를 확인하는 단계; 및
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 길항 항체 또는 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및/또는 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항의 접합체를 상기 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 질환은 눈 장애인, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 눈 장애는 습성(wet) 또는 신생혈관 황반변성, 습성 또는 신생혈관 연령-관련 황반변성, 건성(dry) 연령-관련 황반 변성, 정맥, 동맥 또는 안구의 다른 차단 및 또는 망막 부종을 동반하거나 또는 동반하지 않는 망막 혈관, 전측 및 후측 포도막염, 포도막염 황반 부종, 당뇨망막병증, 비증식성 당뇨망막병증, 당뇨 황반 부종, 비증식성 당뇨 황반 부종, 안과적 염증 질환 공막염 및 안구내 종양 중 적어도 하나인, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항체, 융합 단백질, 또는 상기 접합체는 1개월에 1회보다 덜 빈번하게 투여되는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  53. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항체, 융합 단백질, 또는 상기 접합체는 2개월마다 1회보다 덜 빈번하게 투여되는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  54. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항체, 융합 단백질, 또는 상기 접합체는 3개월마다 1회보다 덜 빈번하게 투여되는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항체, 융합 단백질, 또는 상기 접합체는 1년에 1회 내지 2개월마다 1회의 빈도로 투여되는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  56. 융합 단백질로서,
    IL-6 VH
    IL-6 VL
    IL-6 Fc;
    VEGF Trap을 포함하되,
    상기 VEGF Trap은,
    1. IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 N-말단 단부에; 또는
    2. 힌지 영역과 IL-6 VH를 포함하는 중쇄의 CH1 도메인 다음 사이에서
    중 하나의 방식으로 IL-6에 융합된, 융합 단백질.
  57. 제56항에 있어서, 상기 접합체가 VEGF Trap을 포함할 경우, 상기 VEGF Trap은 VEGFR1 도메인 2, 및 이어서 VEGFR2-도메인 3을 이 순서대로 포함하는, 융합 단백질.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF Trap 서열 내 94번 위치에서 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF Trap 서열 내 95번 위치에서 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF Trap 서열 내 T94I 및/또는 H95I의 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
  61. VEGFR-항-IL-6 이중 저해제로서,
    상기 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 항-IL 6 항체 및 항-VEGF 트랩(VEGFR1/2)의 트랩 항체 융합을 포함하되, 상기 이중 저해제는 상기 VEGFR 단백질의 절단을 감소시키기 위해 VEGFR 서열 내에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  62. 제61항에 있어서, 상기 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제의 분자량은 1.0MDa인, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  63. 제61항에 있어서, 상기 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 염증 망막질환에 대한 요법을 제공하는, VEGR-항-IL-6 이중 저해제.
  64. 제61항에 있어서, 불변 중쇄, 불변 경쇄, 단편 항원 결합, 단편 결정화 가능(Fc), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  65. 제64항에 있어서, 상기 항-IL-6 중쇄 가변 영역 서열은 옵션 서열번호 7 내지 13, 89, 90 및/또는 256 내지 262로부터 선택된, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 VEGF 트랩 서열은 서열번호 145, 15, 16 또는 17 중 적어도 하나로부터 선택된, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 서열은 서열번호 18인, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-6 분자에 대한 중쇄 서열은 서열번호 19 내지 27 중 적어도 하나로부터 선택되거나 서열번호 89, 90, 256 내지 262의 서열 중 적어도 하나를 포함하는, VEGR-항-IL-6 이중 저해제.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-6 분자에 대한 상기 경쇄 서열은 서열번호 76 내지 84 중 적어도 하나로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6 분자에 대한 상기 중쇄 서열은 서열번호 49 내지 75 중 적어도 하나로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 85 내지 88 중 적어도 하나로부터의 VEGFR-Fc 서열을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 7 내지 13, 145, 15 내지 17, 18 내지 84 중 임의의 하나 이상에서 서열 중 하나 이상을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  73. 제72항에 있어서,
    IL-6 VH;
    IL-6 VL;
    IL-6 Fc;
    VEGF Trap; 및
    링커를 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  74. 제73항에 있어서, 상기 IL-6 VH는 서열번호 19 내지 27, 31 내지 39, 89, 90 또는 256 내지 262 중 어느 하나에서 IL6 VH 서열로부터의 서열을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 IL-6 VL은 서열번호 28 내지 30 또는 91 내지 93 중 어느 하나에서 IL6 VL 서열로부터의 서열을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc는 서열번호 40 내지 48 중 어느 하나에서 Fc 서열로부터의 서열을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF Trap은 서열번호 145, 15, 16 또는 17 중 어느 하나에서 VEGF Trap 서열로부터의 서열을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  78. 단백질 작제물로서,
    적어도 3개의 중쇄 CDR;
    적어도 3개의 경쇄 CDR;
    VEGF 트랩 서열; 및
    링커 서열을 포함하되, 각각의 상기 서열은 도 18 내지 도 25 내의 대응하는 서열로부터 선택된, 단백질 작제물.
  79. 융합 단백질로서,
    IL-6 VH;
    IL-6 VL;
    IL-6 Fc; 및
    VEGF Trap을 포함하되,
    상기 융합 단백질은 HUVEC 증식을 변경시키는, 융합 단백질.
  80. 제79항에 있어서, HUVEC 증식을 변경시키는 것은 VEGF/IL6 매개 증식의 저해인, 융합 단백질.
  81. 융합 단백질로서, 서열번호 263에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 117에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하되, 상기 융합 단백질은 중합체에 추가로 접합되는, 융합 단백질.
  82. 제81항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 263에 대해 적어도 95% 동일하고 서열번호 117에 대해 적어도 95% 동일한, 융합 단백질.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 단백질은 적어도 a) 서열번호 172, 173, 174, 199, 200, 및 201, 또는 b) 서열번호 172, 173, 174, 199, 200 및/또는 201 내의 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환을 포함하되, 상기 치환은 보존적 치환인, 융합 단백질.
  84. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 길항 항체.
  85. 제10항 내지 제16항, 제56항 내지 제60항 및 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  86. 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 접합체.
  87. 제61항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGFR-항-IL-6 이중 저해제는 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, VEGFR-항-IL-6 이중 저해제.
  88. 제78항에 있어서, 상기 단백질은 a) 서열번호 169 및 170의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 169에 대해 적어도 80% 동일하고 서열번호 170에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
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