KR102218265B1 - Aav2 변이체를 아플리베르셉트와 함께 사용하는 amd의 치료 - Google Patents

Aav2 변이체를 아플리베르셉트와 함께 사용하는 amd의 치료 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 벡터를 포함하는, 유전자 요법을 위해 적합화된 제약 조성물을 유리체 내로 투여함으로써 대상체에서 연령 관련 황반 변성 (AMD)을 치료하기 위한 제약 조성물 및 그의 방법을 제공한다.

Description

AAV2 변이체를 아플리베르셉트와 함께 사용하는 AMD의 치료
상호 참조
본 출원은 2016년 6월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/351,234를 우선권 주장하며, 이 가출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
아플리베르셉트(Aflibercept)는 혈관 내피 성장 인자 하위유형 A 및 B (VEGF-A 및 VEGF-B) 및 태반 성장 인자 (PIGF)에 대한 유인체 수용체로서 작용하는 재조합 융합 단백질이다. 아플리베르셉트는 이들 리간드와 결합함으로써, 이들 리간드가 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)인 VEGFR-1 및 VEGFR-2와 결합하지 못하게 할 수 있고, 혈관신생을 억제할 수 있고 혈관 투과성을 감소시킬 수 있다. 아플리베르셉트는 IgG1의 Fc 단편과 융합된 VEGFR-1의 도메인 2 및 VEGFR-2의 도메인 3으로 이루어진다. 아플리베르셉트는 상표명 EYLEA® (아플리베르셉트) 하에 상업적으로 판매되며, 안과용 유리체 내 아플리베르셉트 융합 단백질 주사제이다.
EYLEA® (아플리베르셉트)가 환자에서 습성 AMD를 치료하기 위한 현재의 표준 진료이긴 하지만, 아플리베르셉트를 눈에 전달하는 유전자 요법 방법은 환자에게 개선된 치료 옵션을 제공할 수 있는데, 이는 유전자 요법이 일부 환자에서 염증, 감염 및 다른 부작용의 위험을 증가시킬 수 있는 반복적인 주사를 필요로 하지 않으면서도 생체 내에서 아플리베르셉트의 연장되거나 또는 지속된 방출을 제공할 수 있기 때문이다. 부가적으로, 유전자 요법은 반복적인 주사가 필요하지 않음으로써, 반복적인 주사가 필요한 요법과 연관된 환자의 순응 및 처방 준수 문제 (준수하지 않으면 시력 상실 및 눈 질환 또는 병태의 악화를 초래할 수 있다)를 해결해 준다. AMD의 영향을 가장 많이 받는 노인 환자 중에는, 투여를 위해 진료소를 반복적으로 또는 자주 방문해야 하는 치료 요법에 순응하지 않고 그 처방을 준수하지 않는 비율이 더 높다. 따라서 유전자 요법을 통해 아플리베르셉트를 환자의 눈에 전달하는 것이 환자에게 보다 안전하고, 잠재적으로 더 비용 효율적이며, 보다 편리한 치료 옵션을 제공할 수 있고, 비-순응 및 비-처방 준수 문제를 해결함으로써 환자 성과를 개선시킬 수 있다.
본 개시내용은 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 바이러스 입자 (예를 들어, rAAV)의 제약상 유효량을 포함하는 제약 조성물을 유리체 내로 또는 망막 하로 투여함으로써 영장류 또는 인간 대상체에서 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 (RVO) 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증 (DR), 망막 정맥 폐색증, 및 관련 눈 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물 및 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본원에는 눈 병태 또는 질환의 치료를 필요로 하는 영장류 대상체의 눈에 유리체 내 주사함으로써 제약 조성물의 단위 용량을 투여하는 것을 포함하는, 눈 병태 또는 질환을 치료하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 제약 조성물은: (a) 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 삽입된 아미노산 서열 LGETTRP, 및 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 변이체와 적어도 80% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2 변이체, 및 (b) 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 또는 DME와 연관된 당뇨병성 망막병증이다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 맥락막 혈관신생 또는 습성 AMD이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1E12 내지 1E13 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 100 μL 이하인 용적을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 50 μL 이하인 용적을 포함한다. 일부 경우에, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 일부 경우에, 대상체는 아플리베르셉트에 반응한다. 일부 경우에, 대상체는 아플리베르셉트로 미리 치료받은 적이 있다. 일부 경우에, 유리체 내 주사에 의해 투여하는 것은 적어도 2년에 1회 이하 일어난다. 일부 경우에, 유리체 내 주사에 의해 투여하는 것은 적어도 5년에 1회 이하 일어난다. 일부 경우에, 유리체 내 주사에 의해 투여하는 것은 1회 투여이다. 일부 경우에, 제약 조성물은 현탁액 또는 냉장된 현탁액이다. 일부 경우에, 상기 방법은 투여 단계에 앞서 현탁액의 균등한 분배를 보장하기 위해 현탁액을 진탕시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 투여 단계에 앞서 제약 조성물을 실온으로 가온시키는 것을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 제약 조성물은 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 삽입된 아미노산 서열 LGETTRP, 및 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 변이체와 적어도 80% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2 변이체를 추가로 포함하는 현탁액을 포함한다. 일부 경우에, 상기 핵산 서열은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 2의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 조성물의 단위 용량은 1E12 내지 1E13 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 제약 조성물의 단위 용량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 키트는 현탁액 제약 조성물 및 이러한 제약 조성물을 희석시키기 위한 용액을 포함한다. 일부 경우에, 제약 조성물은 1 mL 이하를 포함한다. 일부 경우에, 제약 조성물은 0.5 내지 1.0 mL 이하를 포함한다. 일부 경우에, 제약 조성물은 0.5 mL 이하를 포함한다. 일부 경우에, 키트 내의 용액은 완충제, 염, 알콜, 계면활성제, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 키트는 주사기를 포함한다.
다른 측면에서, 눈 병태 또는 질환을 치료하는 방법은: 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 삽입된 아미노산 서열 LGETTRP, 및 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 변이체와 적어도 80% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2 변이체를 포함하는 냉장된 현탁액을 진탕시키고; 상기 냉장된 현탁액의 소정의 용적을 유리체 내 주사를 통해 인간 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 대상체는 아플리베르셉트로 미리 치료받은 적이 있는 것을 특징으로 한다. 일부 경우에, 대상체는 아플리베르셉트에 반응한다. 일부 경우에, 냉장된 현탁액은 1 mL 이하의 용액을 포함한다. 일부 경우에, 냉장된 현탁액은 0.5 mL 이하를 포함한다. 일부 경우에, 대상체에게 투여된 용적은 50 μL 이하이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여된 용적은 100 μL 이하이다. 일부 경우에, 용적은 1E12 내지 1E13 벡터 게놈의 단위 용량을 포함한다. 일부 경우에, 용적은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈의 단위 용량을 포함한다. 일부 경우에, 투여 단계는 적어도 2년에 1회 이하 일어난다. 일부 경우에, 투여 단계는 1회 주사이다. 일부 경우에, 상기 방법은 조성물을 투여하기 전에 아플리베르셉트에 대한 반응성에 대하여 대상체를 검정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 현탁액은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 부형제는 계면활성제 또는 안정화제를 포함한다. 일부 경우에, 계면활성제는 폴리소르베이트, 소듐 도데실 술페이트, 소듐 라우릴 술페이트, 라우릴 디메틸 아민 옥시드, 폴리에톡실화 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 옥톡시놀, 브리즈, 플루로닉, 및 폴리옥실 피마자유로부터 선택된다. 일부 경우에, 제약상 허용되는 부형제는 페놀, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함한다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 또는 DME와 연관된 당뇨병성 망막병증이다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 맥락막 혈관신생 또는 습성 AMD이다. 일부 경우에, 상기 방법은 투여 전에 현탁액을 실온으로 가온시키는 것을 추가로 포함한다.
참조로 포함됨
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에서 상세하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 수득될 것이다:
도 1은 처리 없이 레이저 방사선 조사에 의한 CNV 병변의 유도 후 영장류 (아프리카 그린 원숭이)의 눈의 예시적인 안저 영상을 예시한다. 400 mW로 처리한 중심 스팟을 제외한 모든 스팟에 대하여 750 mW, 50 μm, 100 ms의 레이저 방사선 조사를 이용하여 단일 레이저 적용함으로써 9개의 병변을 유도시켰다. 이러한 레이저 방사선 조사 직후에 컬러 안저 촬영을 수행하여 레이저 병변을 기록하였다.
도 2는 완충제 만을 포함하는 비히클 대조군 또는 AAV2.7m8-아플리베르셉트 중 하나로 유리체 내 (IVT) 주사한 후 제70일에 형광 혈관 조영술의 대표적인 안저 영상을 예시한다. AAV2.7m8-아플리베르셉트로 처리된 원숭이는 비히클 대조군 만을 주사한 원숭이보다 더 적은 등급 IV 병변과 더 낮은 등급의 병변을 나타내었다.
도 3은 완충제 만을 포함하는 비히클 대조군과 비교 시, 양성 대조군으로서 사용되었던 EYLEA® (아플리베르셉트)의 유리체 내 주사 후 원숭이에서의 퍼센트 등급 IV CNV 병변을 예시한다. EYLEA® (아플리베르셉트) 처리는 제14일 (연회색 막대) 및 제28일 (암회색 막대)에 수집된 안저 영상에 근거하여 비히클 대조군과 비교 시 등급 IV 병변의 양에 있어서의 상당한 감소를 나타내었다.
도 4는 유리체 내 주사 후 제14일 (연회색 막대) 및 제28일 (암회색 막대)에 비히클 대조군, AAV2.7m8-아플리베르셉트, 또는 AAV2.7m8-sVEGFR-1의 유리체 내 주사로 처리된 원숭이에서의 퍼센트 등급 IV CNV 병변을 예시한다. 유리체 내 AAV2.7m8-아플리베르셉트 주사로 처리된 원숭이는 도 3에 예시된 양성 대조군의 결과와 유사하게, 제14일 및 제28일에 비히클 대조군으로 처리된 원숭이와 비교 시 등급 IV 병변의 양에 있어서의 상당한 감소를 나타내었다. AAV2.7m8-sVEGFR-1의 유리체 내 주사로의 처리는 비히클 대조군과 비교 시 등급 IV 병변에 있어서의 어떠한 상당한 저하도 나타내지 않았다.
도 5는 아플리베르셉트의 핵산 서열을 예시한다.
도 6은 가용성 fms-유사 티로신 키나제-1 (sFlt-1 또는 sVEGFR-1)의 핵산 서열을 예시한다. sVEGFR-1은 VEGF 수용체 1의 스플라이스 변이체이다.
예시를 위해 예시적인 적용을 참조하여 몇 가지 측면이 아래에 설명된다. 본원에 기재된 특징을 완전히 이해하기 위해 수많은 구체적 세부 사항, 관계 및 방법이 제시되어 있다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 특징이 구체적 세부 사항 중 하나 이상 없이도 또는 다른 방법을 사용하여 실시될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기재된 특징은 일부 행위가 상이한 순서로 및/또는 다른 행위 또는 사건과 공동으로 발생할 수 있기 때문에, 행위 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 더욱이, 예시된 모든 행위 또는 사건이 본원에 기재된 특징에 따라서 특정 방법론을 구현하는 데 필요한 것은 아니다.
본 개시내용은 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, cDNA)을 포함하는 유전자 요법, 벡터, 또는 구축물을 영장류 (예를 들어, 원숭이 또는 인간)의 눈 내로 유리체 내 주사함으로써 투여하는 것을 포함하는, 눈 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 제약 조성물 및 방법에 관한 것이다. 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체의 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법, 벡터, 또는 구축물의 유리체 내 주사 시, 상기 핵산 서열이 생체 내에서, 예를 들어, 망막 세포에서 발현되어, 치료 효과를 발생시키는 아플리베르셉트 융합 단백질, 또는 그의 기능적 단편, 또는 변이체를 생성한다.
일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 포함하는 유전자 요법, 벡터, 또는 구축물은 영장류 또는 인간 대상체에서 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 (RVO) 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 및/또는 DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증 (DR), 망막 정맥 폐색증, 또는 혈관신생 (예를 들어, 맥락막 혈관신생 (CNV))을 수반한 임의의 다른 관련 눈 질환 또는 병태를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 눈 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 아플리베르셉트 (예를 들어, EYLEA®)에 반응하는 눈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 현재의 표준 진료에 반응하거나 또는 AMD, RVO, DME, 또는 DME 환자에서의 DR에 대한 승인된 요법 중 적어도 하나, 예컨대 아플리베르셉트 주사, 라니비주맙(ranibizumab) 주사, 또는 베바시주맙(bevacizumab) 주사에 반응하는 눈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 유전자 요법을 위해 적합화시키거나 또는 유전자 요법에 적합한 제약 조성물, 예를 들어, 아플리베르셉트, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동인 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 변이체 또는 변형된 캡시드 단백질 VP1, 예컨대 7m8 캡시드 변이체를 수반하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV)가 유리체 내로 또는 망막 하로 투여된다. 이러한 상동성은 아플리베르셉트의 핵산 서열, 아미노산 서열, 공간 입체 형태, 또는 단백질 구조에 근거할 수 있다.
아플리베르셉트의 단백질 서열은 드럭뱅크(DrugBank) 데이터베이스, 수탁 번호 DB08885 하에 공개적으로 입수 가능하다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트는 미국 특허 공보 2014/0371438에 개시된 바와 같은, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다 (도 5).
단백질 주사에 비해 유전자 요법의 한 가지 이점은 유전자 요법이 치료제 (예를 들어, 아플리베르셉트)의 연장되거나 또는 지속적인 방출을 제공하고, 일부 실시양태에서, 다수의 또는 반복적인 주사를 필요로 하지 않는다는 것이다. 이러한 아플리베르셉트의 연장되거나 또는 지속적인 방출은 생체 내에서 발현되어 치료 효과를 제공하는 아플리베르셉트 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 전달로부터 비롯된다. 일부 실시양태에서, 망막 세포에 전달된 이종 핵산으로부터의 아플리베르셉트의 발현은 적어도 1년에 걸쳐, 1년 초과에 걸쳐, 적어도 2, 3, 4, 5, 10년, 또는 그 초과에 걸쳐 지속될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV는 눈 내의 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, 망막 세포)의 그의 감염력을 증가시키는 캡시드 변이체 단백질을 포함할 수 있어, 치료용 트랜스진, 예컨대 아플리베르셉트 융합 단백질, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 표적 세포 또는 조직 내로 더 효율적으로 전달할 수 있게 해주며, 여기서 치료용 트랜스진은 소정의 기간에 걸쳐 (예를 들어, 적어도 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10년 또는 그 초과에 걸쳐) 발현될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 유전자 요법은 특이적 관심 조직 또는 세포 유형, 예를 들어, 광수용체 세포를 표적으로 할 수 있으며, 이는 표적을 벗어난 효과를 최소화하거나 또는 생체 내에서 치료용 트랜스진, 예컨대 아플리베르셉트의 더 표적화된 전달을 제공하는 데 도움을 줄 수 있다.
유전자 요법을 통한 생체 내 아플리베르셉트의 연장되거나 또는 지속적인 전달을 고려하여, 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 돌연변이체 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물을, 현재의 표준 진료 (예를 들어, 단백질 주사 또는 비-유전자 요법 기반 치료)와 비교 시 소정의 기간 내에 더 적은 수의 용량으로 투여할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 투여된 용량의 총 수는 적어도 1.5년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 적어도 5년, 적어도 6년, 적어도 7년, 적어도 8년, 적어도 9년, 또는 적어도 10년에 1 단위 용량 이하이다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 투여는 환자의 생애에 단 1회 또는 한번뿐이다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 1회 투여는 환자에서 1년 초과, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년 초과 동안 지속되는 치료 효과를 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법은 환자에게 적어도 2년 이상, 적어도 3년 이상, 적어도 4년 이상, 적어도 5년 이상, 적어도 6년 이상, 적어도 7년 이상, 적어도 8년 이상, 적어도 9년 이상, 또는 적어도 10년 이상에 1회 이하 투여된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법은 아플리베르셉트에 반응하거나 또는 본원에 개시된 유전자 요법을 받기 전에 EYLEA®로 미리 치료받았던 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 요법 (예를 들어, AAV2.7m8-아플리베르셉트)을 받은 환자는 이러한 유전자 요법을 받은 후 적어도 2, 3, 4, 5, 10년 또는 그 초과가 경과한 후에, 필요에 따라 아플리베르셉트, 라니비주맙, 및/또는 베바시주맙으로의 요법을 시작할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자가 본원에 개시된 유전자 요법을 이용한 치료를 받은 후에는 항-VEGF 요법이 필요하지 않다.
일부 실시양태에서, 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 1회 투여는 환자가 1년 초과 동안, 1.5년 초과 동안, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 초과 동안 EYLEA® 주사를 받을 필요를 없앤다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 유리체 내 주사를 받은 환자는 환자의 나머지 생애 동안 아플리베르셉트의 어떠한 부가의 주사도 필요로 하지 않는다. 다른 실시양태에서, 7m8-아플리베르셉트 유전자 요법의 1회 유리체 내 주사를 받은 환자는 이러한 유전자 요법을 받은 후 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과에 필요에 따라, 아플리베르셉트, 라니비주맙, 및/또는 베바시주맙 중 어느 하나로의 요법을 시작할 수 있다.
본 개시내용의 용어는 특별한 경우만을 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 조성물, 방법 및 조성물을 제한하고자 하는 것은 아니다.
본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 조성물 및 방법은 달리 표시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학, 면역화학 및 안과 기술의 통상적인 기술 및 설명을 이용할 수 있다. 이러한 통상적인 기술은 대상체의 망막 또는 시력, 재조합 바이러스의 클로닝 및 번식, 제약 조성물의 제형, 및 생화학적 정제 및 면역화학을 관찰 및 분석하는 방법을 포함한다. 적합한 기술의 구체적인 예시는 본원의 실시예를 참조할 수 있다. 그러나, 등가의 통상적인 과정이 물론 사용될 수도 있다. 이러한 통상적인 기술 및 설명은 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, et al., Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); and Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000); and Berg et al., Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002)] (이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) 변이체 AAV2 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 AAV2 캡시드 단백질은 위치 587과 588 사이에 LGETTRP 삽입을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 비-변이체 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여 안구 세포의 감염력에 있어서의 증가를 부여해 준다); 및 (ii) 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는, 유전자 요법을 위해 적합화된 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV2) 비리온; 및 (b) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 제형이 개시된다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 유전자 산물은 아플리베르셉트와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 상동성을 갖는 융합 단백질 또는 폴리펩티드이다.
또한 본원에는 유리체 내 주사에 의해 대상체의 눈에 본원에 기재된 바와 같이, 유전자 요법을 위해 적합화된 제약 제형을 투여하는 것, 즉 생체 내에서 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 전달하는 것을 포함하는, 그에 대한 치료를 위하여 아플리베르셉트가 권고되거나 또는 승인되는 눈 병태 또는 질환을 치료하는 방법이 개시된다.
또한 본원에는 아플리베르셉트와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 상동성을 갖는 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 요법 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물이 개시되며, 이는 동결 건조될 수 있거나, 또는 현탁액 형태로 공급될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 동결 건조된 형태 또는 현탁액은 이러한 제약 조성물을 재구성하기 위한 또는 희석시키기 위한 완충제 각각과 함께 키트에 제공된다.
또한 본원에는 아플리베르셉트와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 상동성을 갖는 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 요법 또는 벡터를 포함하는, 냉장된 현탁액으로서 공급되는 제약 조성물이 개시된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 냉장된 현탁액은 이러한 제약 조성물을 희석시키기 위한 완충제와 함께 키트에 제공된다.
또한 본원에는 (a) AAV2 내의 587과 588 사이의 아미노산 위치에 삽입된 아미노산 서열 LGETTRP의 펩티드 삽입을 포함하는 변이체 AAV2 캡시드 단백질 (여기서, 이러한 펩티드 삽입은 상응하는 비-변이체 또는 비변형된 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여 안구 세포의 감염역에 있어서의 증가를 부여해 준다); 및 (b) 아플리베르셉트, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체와 적어도 80% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 치료용 트랜스진을 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는, 맥락막 혈관신생을 저하시키기 위한 유전자 요법을 위해 적합화된 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온이 개시된다.
또한 본원에는 인간 대상체의 눈에 본원에 기재된 바와 같이, 유전자 요법 및 아플리베르셉트, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 발현시키기 위한 핵산 서열의 생체내 전달을 위해 적합화된 rAAV 비리온을 투여하는 것을 포함하는, 눈 병태 또는 질환을 치료하는 방법이 개시되며; 여기서 인간 대상체는 혈관신생과 연관된 눈 병태가 있는 것으로 이전에 진단받은 적이 있다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트 유전자 요법은 아플리베르셉트에 반응하거나 또는 EYLEA® (아플리베르셉트)로 미리 치료받았던 환자에게 투여한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) AAV2 내의 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 570-611에 상응하는 위치에 LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN으로부터 선택된 아미노산 삽입을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 비-변이체 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포 또는 망막 색소 상피)의 감염력에 있어서의 증가를 부여해 준다); 및 (ii) 아플리베르셉트를 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는, 유전자 요법을 위해 적합화된 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온; 및 (b) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 방법 및 제약 제형이 개시된다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 유전자 산물은 아플리베르셉트, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체와 적어도 80% 상동성을 갖는 융합 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 부형제는 본원에 개시된 제약 조성물에서의 응집을 방지하는 계면활성제 (예를 들어, 비이온성 계면활성제, 플루로닉, 폴록사머, 또는 폴리소르베이트)를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어는 특별한 경우만을 설명하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥상 달리 명백히 표시하지 않는 한, 또한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 용어 "포함한", "포함하다", "갖는", "가지며", "수반한", 또는 그의 파생어가 상세한 설명 및/또는 청구범위에 사용되는 정도로, 상기 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 "포함한" 또는 "함유하는"과 동의어이고, 포괄적이거나 또는 제약을 두지 않는다.
본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약" 숫자는 그러한 숫자의 플러스 또는 마이너스 10% 숫자를 지칭한다. 용어 "약" 범위는 그의 최저 값의 마이너스 10% 내지 그의 가장 큰 값의 플러스 10%인 범위를 지칭한다.
용어 "대상체", "환자", 또는 "개체"는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이, 예를 들어, 아프리카 그린 원숭이 및 레서스(rhesus) 원숭이, 및 인간을 포함한 영장류를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 인간 환자이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는", "치료", "완화하다" 또는 "완화하는" 및 기타 문법적으로 동등한 용어는 질환 또는 병태 증상의 경감, 감소 또는 완화, 부가 증상의 예방, 증상의 근본적인 대사 원인의 완화 또는 예방, 질환 또는 병태의 억제, 예를 들어, 질환 또는 병태의 발생 저지, 질환 또는 병태의 구제, 질환 또는 병태의 퇴행 유발, 질환 또는 병태에 의해 유발된 병태의 구제, 또는 질환 또는 병태의 증상 중지를 포함하고, 예방을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 추가로, 치료적 혜택 및/또는 예방적 혜택을 달성하는 것을 포함한다. 치료적 혜택이란 치료받는 근본적인 질환의 근절 또는 완화를 의미한다. 또한, 치료적 혜택은 근본적인 질환과 연관된 생리학적 증상 중 하나 이상의 근절 또는 완화를 이용하여 달성되므로, 일부 실시양태에서, 환자가 여전히 근본적인 질환을 앓고 있음에도 불구하고, 환자에서 개선이 관찰된다. 예방적 혜택을 위해, 제약 조성물은 특별한 질환이 발생할 위험이 있는 환자, 또는 특정 질환의 진단이 이루어진 적이 없었던 경우에라도, 이러한 질환의 생리학적 증상 중 하나 이상이 보고되는 환자에게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하다", "투여하는", "투여" 등은 치료제 또는 제약 조성물을 생물학적 작용의 목적하는 부위에 전달할 수 있게 해주는데 사용되는 방법을 지칭할 수 있다. 이러한 방법은 눈에 대한 유리체 내 또는 망막 하 주사를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량", "치료상 유효량" 또는 "제약상 유효량"은 치료되는 질환 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 구제시킬, 투여되는 적어도 하나의 제약 조성물 또는 화합물의 충분한 양을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는"은 본원에 개시된 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 폐기시키지 않는 물질, 예컨대 담체 또는 희석제를 지칭할 수 있고, 비교적 무독성이다 (즉, 상기 물질을 개체에게 투여할 때, 이는 바람직하지 못한 생물학적 효과를 유발시키지 않거나 또는 이것이 함유되는 조성물의 성분 중 임의의 것과 해로운 방식으로 상호 작용하지도 않는다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약 조성물," 또는 간단히 "조성물"은, 예를 들어 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 부형제 등이지만 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 제약상 허용되는 화학적 성분과 임의로 혼합된, 생물학적으로 활성인 화합물을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "AAV 벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터; 또는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, AAV에 대해 이종인 폴리뉴클레오티드, 예컨대 치료용 트랜스진, 예를 들어, 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열), 전형적으로 세포의 유전적 형질전환에 대한 관심 서열을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터를 지칭한다. 일반적으로, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 적어도 1개, 및 일반적으로 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열 (ITRs)에 의해 플랭킹된다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자와 rAAV 벡터 플라스미드 둘 다를 포괄한다. rAAV 벡터는 단일 가닥 (ssAAV)이거나 또는 자기 상보적 (scAAV)일 수 있다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 (전형적으로 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질) 및 폴리뉴클레오티드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 이러한 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로, "rAAV 벡터 입자" 또는 간단히 "rAAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, rAAV 입자의 생산은 반드시, rAAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 rAAV 입자 내에 함유되기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "패키징"은 rAAV 입자의 어셈블리 및 캡시드로 둘러 싸기를 발생시킬 수 있는 일련의 세포내 사건을 지칭할 수 있다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노 연관 바이러스의 복제 및 캡시드로 둘러싼 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap는 AAV "패키징 유전자"로서 본원에 지칭된다.
용어 "폴리펩티드"는 자연적으로 발생하는 것과 비-자연적으로 발생하는 단백질 (예를 들어, 융합 단백질), 그의 펩티드, 단편, 돌연변이체, 유도체 및 유사체 둘 다를 포괄할 수 있다. 폴리펩티드는 단량체성, 이량체성, 삼량체성, 또는 중합체성일 수 있다. 추가로, 폴리펩티드는 각각 한 가지 이상의 별개의 활성을 갖는 수많은 상이한 도메인을 포함할 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위하여, "폴리펩티드"는 2개의 아미노산보다 더 큰 어떠한 길이일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "폴리펩티드 변이체" 또는 간단히 "변이체"는 그의 서열이 아미노산 변형을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 경우에, 이러한 변형은 참조 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 천연 또는 야생형 단백질의 아미노산 서열과 비교해서 하나 이상의 아미노산의 삽입, 중복, 결실, 재배열 또는 치환일 수 있다. 변이체는 특정 위치에서의 단일 아미노산이 또 다른 아미노산으로 변화된 하나 이상의 아미노산 점 치환, 참조 단백질의 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 각각 삽입 또는 결실되는 하나 이상의 삽입 및/또는 결실, 및/또는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 둘 다에서의 아미노산 서열의 말단절단을 가질 수 있다. 변이체는 참조 단백질, 또는 비변형된 단백질과 비교해서 동일하거나 또는 상이한 생물학적 활성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 변이체는, 예를 들어, 그의 대응물 참조 단백질과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 전반적 서열 상동성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 야생형 단백질과 적어도 약 90% 전반적 서열 상동성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 약 99.9% 전반적 서열 동일성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, "재조합"은 (1) 그의 자연적으로 발생하는 환경으로부터 제거되었거나, (2) 유전자가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 연합되지 않거나, (3) 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결되거나, 또는 (4) 자연에서는 발생되지 않는 생체 분자, 예를 들어, 유전자 또는 단백질을 지칭할 수 있다. 용어 "재조합"은 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성되는 폴리뉴클레오티드 유사체뿐만 아니라 이러한 핵산에 의해 코딩된 단백질 및/또는 mRNA와 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 세포에 존재하는 재조합 유전자로부터 합성된 mRNA로부터 합성되는 경우에, 예를 들어, 미생물에 의해 합성된 단백질이 재조합이다.
"작동적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된" 또는 "커플링된"은 유전적 요소의 병렬을 지칭할 수 있으며, 여기서 이러한 요소는 그들이 예상된 방식으로 작동할 수 있게 해주는 관계에 있다. 예를 들어, 특정 프로모터가 코딩 서열의 전사를 개시하는 데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역과 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한은 프로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물" 또는 "카세트" 또는 "플라스미드" 또는 간단히 "벡터"는 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있고 유전자 요법을 위해 적합화되는 유전자 산물을 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, AAV 또는 rAAV 벡터를 포함한 임의의 유형의 유전적 구축물을 포함할 수 있다. 전사체가 단백질로 번역될 수 있다. 일부 경우에, 이는 부분적으로 번역되거나 또는 번역되지 않을 수 있다. 특정 측면에서, 발현은 유전자의 전사와, mRNA의 유전자 산물로의 번역 둘 다를 포함한다. 다른 측면에서, 발현은 관심 유전자를 코딩하는 핵산의 전사만을 포함한다. 발현 벡터는 또한, 표적 세포에서의 단백질의 발현을 촉진시키기 위해 코딩 영역과 작동적으로 연결된 제어 요소를 포함할 수 있다. 제어 요소와, 발현을 위해 이것과 작동 가능하게 연결되는 유전자(들)의 조합이 종종 "발현 카세트"로서 지칭될 수 있으며, 이의 대다수가 관련 기술분야에 공지되어 있고 입수 가능하거나 또는 관련 기술분야에서 입수 가능한 성분으로부터 용이하게 구축될 수 있다.
용어 "이종"은 그것과 비교되는 실체의 나머지 부분과 유전자형별로 완전히 다른 실체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 상이한 종으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 도입된 폴리뉴클레오티드가 이종 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 그의 천연 코딩 서열로부터 제거되었고 그와는 자연적으로 연결된 것으로 발견되지 않는 코딩 서열과 작동적으로 연결된 프로모터가 이종 프로모터일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "7m8"은 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP를 지칭한다.
"7m8 변이체"는 캡시드 단백질의 용매 노출된 GH 루프에 삽입된 아미노산 서열 LGETTRP를 수반한, 임의의 혈청형의 것일 수 있는 rAAV를 지칭한다.
7m8이 rAAV2에 삽입되는 경우 (AAV2.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV2 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV2 캡시드 단백질, VP1의 위치 587과 588 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV1에 삽입되는 경우 (AAV1.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV1 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV5에 삽입되는 경우 (AAV5.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV5 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV5 캡시드 단백질의 아미노산 575와 576 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV6에 삽입되는 경우 (AAV6.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV6 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV6 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV7에 삽입되는 경우 (AAV7.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV7 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV7 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV8에 삽입되는 경우 (AAV8.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV8 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV8 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV9에 삽입되는 경우 (AAV9.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV9 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 588과 589 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV10에 삽입되는 경우 (AAV10.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV10 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV10 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이에 삽입된다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
벡터
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물 및 방법은 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, cDNA 서열)을, 그를 필요로 하는 인간 대상체 또는 환자 (예를 들어, AMD, RVO, DME를 동반한 것으로 진단된 환자) 내의 망막 세포에 전달하는 것을 제공한다. 전달 시스템, 예컨대 rAAV 또는 바이러스 벡터를 사용하여 환자에게 치료용 트랜스진의 핵산을 전달하는 것이 또한, 유전자 요법으로서 지칭된다.
일부 실시양태에서, 임의의 적합한 "벡터" ("유전자 전달" 또는 "유전자 전이 비히클"로서 지칭되기도 함)를 사용하여 아플리베르셉트 핵산 서열의 전달을 수행할 수 있다. 벡터 (예를 들어, rAAV), 전달 비히클, 유전자 전달 비히클 또는 유전자 전이 비히클은 표적 세포, 예를 들어, 광수용체, 망막 신경절 세포, 뮐러(Muller) 세포, 양극성 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포를 포함한 망막 세포에 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 적합한 거대분자 또는 분자의 복합체를 포괄할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 핵산 분자 또는 유전자가 전달되는 임의의 세포일 수 있다. 전달될 폴리뉴클레오티드는 치료용 트랜스진, 예컨대 아플리베르셉트 트랜스진의 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 아플리베르셉트 핵산 서열을 비-인간 영장류 또는 인간 대상체의 눈 또는 망막 세포 내로 전달하는 데 적합한 임의의 방법을 제공한다. 일부 경우에, 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드, 또는 유전자 요법의 전달은 비-인간 영장류 또는 인간 대상체의 눈 내로의 유리체 내 주사용으로 제형화 또는 적합화시킨다.
일부 실시양태에서, 적합한 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (AAV), 및 레트로바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 리포솜, 지질 함유 복합체, 나노 입자, 및 폴리뉴클레오티드를 망막 세포로 전달할 수 있는 다른 거대분자 복합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 강력한 진핵 프로모터, 예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 또는 구성적 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 핵산 분자가 혼입되는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 핵산은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 핵산과 폴리뉴클레오티드는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 아플리베르셉트의 발현을 위한 DNA (예를 들어, cDNA) 또는 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 관심 유전자 (예를 들어, 아플리베르셉트)의 전사체, 인트론, 비번역된 영역 (UTR), 종결 서열 등을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA는 서열, 예컨대 프로모터 서열, 관심 유전자 (예를 들어 아플리베르셉트), UTR, 종결 서열 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, DNA와 RNA의 조합을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 아플리베르셉트의 전달 및 발현을 위한 벡터로서의 재조합 바이러스, 예컨대 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 임의의 적합한 바이러스 벡터는 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용하도록 조작되거나 또는 최적화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 (Ad) 또는 아데노 연관 바이러스 (AAV)로부터 유래된 재조합 바이러스 벡터는 그것이 인간 또는 영장류 대상체에서 복제 결함있는 것이 되도록 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 혼성체 바이러스 벡터 시스템을 수득할 수 있고, 이를 사용하여 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산을 망막 세포에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 전달 시스템 또는 유전자 요법은 아플리베르셉트 유전자를 포함하는 핵산 서열을 표적 세포 게놈 (예를 들어, 망막 세포의 게놈) 내로 통합시킬 수 있고, 이로써 시간 경과에 따라 상기 유전자의 안정적인 유전자 발현이 발생된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트 유전자는 표적 세포 게놈 내로 통합되지 않고, 표적 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 벡터로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 아플리베르셉트의 핵산 서열을 망막 세포 내로 전달하는 데 적합한 바이러스 벡터는 AAV 또는 rAAV이며, 이는 작은 비-외피보유 단일 가닥 DNA 바이러스이다. rAAV는 비-병원성 인간 파르보바이러스이고, 복제를 위하여, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 CMV를 포함한 헬퍼 바이러스에 의존적이 되도록 만들 수 있다. 야생형 (wt) AAV에 대한 노출은 임의의 인간 병원체를 유발시키는 것으로 공지되지 않거나 또는 이와 연관되지 않고, 일반적 집단에서 흔한 것이므로, AAV 또는 rAAV를 유전자 요법에 적합한 전달 시스템으로 만들어 준다. 치료용 트랜스진, 예를 들어, 아플리베르셉트의 전달을 위한 유전자 요법을 위해 사용된 AAV 및 rAAV는 임의의 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물 및 방법은 AAV1, AAV2, AAV2.5, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10, AAV-DJ, 및 그의 임의의 혼성체 또는 키메라 AAV를 포함한, 임의의 적합한 AAV 혈청형의 사용을 제공한다. 일부 실시양태에서, 사용된 혈청형은 바이러스의 지향성, 또는 관심 표적 세포의 감염력에 근거한다. 일부 실시양태에서, AAV2 또는 rAAV2는 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 유리체 내 또는 망막 하 주사를 통해 대상체의 눈 또는 망막 세포 내로 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, rAAV2.7m8은 아플리베르셉트의 핵산 서열을 대상체의 망막 세포 내로 전달하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포, 예를 들어 망막 세포의 증가된 감염력을 갖는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 또는 rAAV 바이러스, 입자, 또는 비리온은 망막 세포의 형질도입을 증가시키거나 또는 대상체 내의 망막 세포로의 유전자 전달의 표적화를 증가시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 AAV 캡시드 단백질의 캡시드 단백질 GH 루프/루프 IV 내에 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 변형 부위는 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프/루프 IV의 용매 접근 가능한 부분이다. AAV 캡시드의 GH 루프/루프 IV에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; and Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955]을 참조할 수 있다. 7m8 변이체를 포함한 몇 가지 AAV 캡시드 변이체가 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 5개 아미노산 내지 11개 아미노산, 예를 들어, 7개 아미노산 서열의 삽입을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 이러한 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염력과 비교해서 망막 세포의 증가된 감염력을 부여해 준다. 일부 실시양태에서, 하기 아미노산 서열 중 어느 하나가 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입될 수 있다: LGETTRP (7m8), NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 LGETTRP (7m8), NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN 중 어느 하나가 rAAV 내의 VP1 캡시드 단백질의 용매 노출된 GH 루프 내에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 포함하는 rAAV.7m8이 유전자 요법을 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 하기 아미노산 서열: NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN 중 어느 하나가 하기 위치에 삽입되어, 유전자 요법에 사용하기 위한 rAAV 변이체를 생성시킬 수 있다: AAV2 캡시드 단백질의 위치 587과 588 사이; AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이; AAV5 캡시드 단백질의 아미노산 575와 576 사이; AAV6 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이; AAV7 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이; AAV8 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이; AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 588과 589 사이; 또는 AAV10 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이.
일부 실시양태에서, 유전자 산물, 예컨대 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산은 유전자의 전사를 개시시키는 프로모터에 의해 전사 제어하에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 프로모터는 "강력한" 또는 구성적으로 활성인 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 커넥신 36 프로모터가 치료용 트랜스진, 예를 들어, 아플리베르셉트의 발현을 구동시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터가 특이적 조직 또는 세포, 예컨대 망막 세포에서의 전사를 가져다주기 위해 사용되어, 비-표적화된 세포에 대한 잠재적 독성 또는 바람직하지 못한 효과를 저하시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 바이러스를 생성하기 위해 사용되는 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 다른 전사 또는 조절 요소, 예컨대 폴리 A (폴리아데닐화) 서열, 비번역된 영역 (UTR), 3' UTR, 또는 종결 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 2개 이상의 단백질의 공동 발현을 허용하거나 또는 다유전자, 또는 폴리시스트론성 mRNA를 생성시키는 유사한 요소를 사용하여 2개 이상의 유전자가 상기 벡터 또는 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 바이러스를 생성하기 위해 사용되는 rAAV 및/또는 플라스미드는 하기 핵산 요소를 포함한다: 제1 ITR 서열; 프로모터 서열; 인트론 서열; 제1 UTR 서열; 아플리베르셉트를 코딩하는 서열; 제2 UTR 서열; 폴리 A 서열; 및 제2 ITR 서열. 일부 실시양태에서, 이들 핵산 요소 각각의 사이에 링커 서열이 사용된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 서열은 아플리베르셉트 융합 단백질 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 벡터 게놈으로서 측정된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 3x1010, 3x1010 내지 4x1010, 4x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 6x1010, 6x1010 내지 7x1010, 7x1010 내지 8x1010, 8x1010 내지 9x1010, 9x1010 내지 10x1010, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 3x1011, 3x1011 내지 4x1011, 4x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 6x1011, 6x1011 내지 7x1011, 7x1011 내지 8x1011, 8x1011 내지 9x1011, 9x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 3x1012, 3x1012 내지 4x1012, 4x1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 6x1012, 6x1012 내지 7x1012, 7x1012 내지 8x1012, 8x1012 내지 9x1012, 9x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 9x1013 내지 10x1013 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 약 2.1x1012 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 1013 내지 1014, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 또는 5x1012 내지 1x1013 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 더 낮은 양 또는 범위의 벡터 게놈이 응집을 피하기 위한 단위 용량에 선택된다. 일부 실시양태에서, 더 높은 양 또는 범위의 벡터 게놈이 단위 용량에 선택되어, 더 작은 용적이 주사에 사용될 수 있다. 더 작은 용적 (예를 들어, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5 μL 미만)의 주사가 안구 압력에 있어서의 변화 및 유리체 내 주사와 연관된 다른 부작용을 저하시키는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 높은 농도의 rAAV가 또한, 치료용 트랜스진을 표적 세포 내로 효율적으로 전달하는 것을 보장하는 데 도움을 준다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1E10, 약 1.5E10, 약 2E10, 약 2.5E10, 약 3E10, 약 3.5E10, 약 4E10, 약 4.5E10, 약 5E10, 약 5.5E10, 약 6E10, 약 6.5E10, 약 7E10, 약 7.5E10, 약 8E10, 약 8.5E10, 약 9E10, 약 9.5E10, 약 10E10, 약 1E11, 약 1.5E11, 약 2E11, 약 2.5E11, 약 3E11, 약 3.5E11, 약 4E11, 약 4.5E11, 약 5E11, 약 5.5E11, 약 6E11, 약 6.5E11, 약 7E11, 약 7.5E11, 약 8E11, 약 8.5E11, 약 9E11, 약 9.5E11, 약 10E11, 약 1E12, 약 1.3E12, 약 1.5E12, 약 2E12, 약 2.1E12, 약 2.3E12, 약 2.5E12, 약 2.7E12, 약 2.9E12, 약 3E12, 약 3.1E12, 약 3.3E12, 약 3.5E12, 약 3.7E12, 약 3.9E12, 약 4E12, 약 4.1E12, 약 4.3E12, 약 4.5E12, 약 4.7E12, 약 4.9E12, 약 5E12, 약 5.1E12, 약 5.3E12, 약 5.5E12, 약 5.7E12, 약 5.9E12, 약 6E12, 약 6.1E12, 약 6.3E12, 약 6.5E12, 약 6.7E12, 약 6.9E12, 약 7E12, 약 7.1E12, 약 7.3E12, 약 7.5E12, 약 7.7E12, 약 7.9E12, 약 8E12, 약 8.1E12, 약 8.3E12, 약 8.5E12, 약 8.7E12, 약 8.9E12, 약 9E12, 약 9.1E12, 약 9.3E12, 약 9.5E12, 약 9.7E12, 약 9.9E12, 약 10E12, 약 10.1E12, 약 10.3E12, 약 10.5E12, 약 10.7E12, 약 10.9E12, 약 11E12, 약 11.5E12, 약 12E12, 약 12.5E12, 약 13E12, 약 13.5E12, 약 14E12, 약 14.5E12, 약 15E12, 약 15.5E12, 약 16E12, 약 16.5E12, 약 17E12, 약 17.5E12, 약 18E12, 약 18.5E12, 약 19E12, 약 19.5E12, 약 20E12, 약 20.5E12, 약 30E12, 약 30.5E12, 약 40E12, 약 40.5E12, 약 50E12, 약 50.5E12, 약 60E12, 약 60.5E12, 약 70E12, 약 70.5E12, 약 80E12, 약 80.5E12, 약 90E12, 약 95E12, 또는 약 100E12이며, 여기서 E는 지수화를 위한 기수 10에 대한 약칭이고, xEy는 x에 y 제곱 지수에 대한 기수 10을 곱한 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 적어도 5E11, 적어도 5.5E11, 적어도 6E11, 적어도 6.5E11, 적어도 7E11, 적어도 7.5E11, 적어도 8E11, 적어도 8.5E11, 적어도 9E11, 적어도 9.5E11, 적어도 10E11, 적어도 1E12, 적어도 1.3E12, 적어도 1.5E12, 적어도 2E12, 적어도 2.1E12, 적어도 2.3E12, 적어도 2.5E12, 적어도 2.7E12, 적어도 2.9E12, 적어도 3E12, 적어도 3.1E12, 적어도 3.3E12, 적어도 3.5E12, 적어도 3.7E12, 적어도 3.9E12, 적어도 4E12, 적어도 4.1E12, 적어도 4.3E12, 적어도 4.5E12, 적어도 4.7E12, 적어도 4.9E12, 적어도 5E12, 적어도 5.1E12, 적어도 5.3E12, 적어도 5.5E12, 적어도 5.7E12, 적어도 5.9E12, 적어도 6E12, 적어도 6.1E12, 적어도 6.3E12, 적어도 6.5E12, 적어도 6.7E12, 적어도 6.9E12, 적어도 7E12, 적어도 7.1E12, 적어도 7.3E12, 적어도 7.5E12, 적어도 7.7E12, 적어도 7.9E12, 적어도 8E12, 적어도 8.1E12, 적어도 8.3E12, 적어도 8.5E12, 적어도 8.7E12, 적어도 8.9E12, 적어도 9E12, 적어도 9.1E12, 적어도 9.3E12, 적어도 9.5E12, 적어도 9.7E12, 적어도 9.9E12, 적어도 10E12, 적어도 10.1E12, 적어도 10.3E12, 적어도 10.5E12, 적어도 10.7E12, 적어도 10.9E12, 적어도 11E12, 적어도 11.5E12, 적어도 12E12, 적어도 12.5E12, 적어도 13E12, 적어도 13.5E12, 적어도 14E12, 적어도 14.5E12, 적어도 15E12, 적어도 15.5E12, 적어도 16E12, 적어도 16.5E12, 적어도 17E12, 적어도 17.5E12, 적어도 18E12, 적어도 18.5E12, 적어도 19E12, 적어도 19.5E12, 적어도 20E12, 적어도 20.5E12, 적어도 30E12, 적어도 30.5E12, 적어도 40E12, 적어도 40.5E12, 적어도 50E12, 적어도 50.5E12, 적어도 60E12, 적어도 60.5E12, 적어도 70E12, 적어도 70.5E12, 적어도 80E12, 적어도 80.5E12, 적어도 90E12, 적어도 95E12, 또는 적어도 100E12 벡터 게놈의 재조합 바이러스를 포함하며, 여기서 E는 지수화를 위한 기수 10에 대한 약칭이고, xEy는 x에 y 제곱 지수에 대한 기수 10을 곱한 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 단위 용량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 약 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12 내지 1.5E12, 1.5E12 내지 2E12, 2E12 내지 2.5E12, 2.5E12 내지 3.0E12, 3.0E12 내지 3.5E12, 3.5E12 내지 4.0E12, 4.0E12 내지 4.5E12, 4.5E12 내지 5.0E12, 5.0E12 내지 5.5E12, 5.5E12 내지 6.0E12, 6.0E12 내지 6.5E12, 6.5E12 내지 7.0E12, 7.0E12 내지 7.5E12, 7.5E12 내지 8.0E12, 8.0E12 내지 8.5E12, 8.5E12 내지 9.0E12, 9.0E12 내지 9.5E12, 또는 9.5E12 내지 10E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 적어도 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈 이하를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 감염 다중도 (MOI)를 사용하여 측정된다. 일부 경우에, MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비 또는 배수를 지칭한다. 일부 경우에, MOI는 1x106이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 적어도 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 1x108 내지 1x1015 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 많아야 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 및 1x1018 MOI일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스를 사용하지 않고서도 (즉, 비-바이러스 벡터를 사용함) 전달될 수 있고, 핵산의 수량으로서 측정될 수 있다. 일반적으로, 핵산의 임의의 적합한 양이 본 개시내용의 제약 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 적어도 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 μg, 10 μg, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 또는 5 g이다. 일부 경우에, 핵산은 많아야 약 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 μg, 10 μg, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 또는 5 g일 수 있다.
일부 실시양태에서, 자기 상보적 벡터 (sc)가 사용될 수 있다. 자기 상보적 AAV 벡터의 사용은 바이러스 제2 가닥 DNA 합성에 대한 요구 사항을 우회할 수 있고, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Wu, Hum Gene Ther. 2007, 18(2):171-82]에 의해 제공된 바와 같이, 트랜스진 단백질의 더 큰 발현 속도를 유발시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아플리베르셉트 트랜스진과 함께 사용하기 위한 가장 최적의 혈청형 및 프로모터의 선택을 허용해 주기 위해 몇 가지 AAV 벡터가 생성될 수 있다.
일부 경우에, 이러한 벡터는 표적화된 벡터, 특히 특이적 세포, 예컨대 망막 세포, 또는 광수용체, 망막 신경절 세포, 뮐러 세포, 양극성 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포의 더 높은 감염력을 나타내는 표적화된 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8)일 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 바이러스 벡터는 대상체에서 낮은 독성 및/또는 낮은 면역원성을 나타내고 대상체, 예를 들어, 인간 환자에서 치료상 유효량의 아플리베르셉트 단백질을 발현하는 것을 포함할 수 있다.
본원에는 비-인간 영장류 또는 인간 대상체에서 7m8 변이체 캡시드 단백질, 또는 rAAV2.7m8, 및 아플리베르셉트을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 사용하여, 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산을 대상체의 표적 망막 세포 내로 전달하기 위한 제약 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 경우에, 유전자 요법을 통한 아플리베르셉트의 전달은 본원에 개시된 안구 질환 또는 병태를 적어도 부분적으로 완화 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 변이체 (예를 들어, 7m8 변이체)의 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%이다. 일부 실시양태에서, 망막 세포의 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%의 증가이다.
일부 실시양태에서, rAAV 변이체의 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 1배, 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 또는 적어도 2배이다. 일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배이다. 일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 65배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 85배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배이다.
일부 실시양태에서, 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 10배 내지 100배, 10배 내지 95배, 10배 내지 90배, 10배 내지 85배, 10배 내지 80배, 10배 내지 75배, 10배 내지 70배, 10배 내지 65배, 10배 내지 60배, 10배 내지 55배, 10배 내지 50배, 10배 내지 45배, 10배 내지 40배, 10배 내지 35배, 10배 내지 30배, 10배 내지 25배, 10배 내지 20배, 또는 10배 내지 15배이다.
일부 실시양태에서, 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 2배 내지 20배, 2배 내지 19배, 2배 내지 18배, 2배 내지 17배, 2배 내지 16배, 2배 내지 15배, 2배 내지 14배, 2배 내지 13배, 2배 내지 12배, 2배 내지 11배, 2배 내지 10배, 2배 내지 9배, 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배, 또는 2배 내지 3배이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡시드 단백질의 아미노산 변형은 대상체의 눈에서 내부 제한 막 (ILM)을 가로지를 수 있는, 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온의 능력과 비교 시, 영장류 또는 인간 대상체의 눈에서 ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가를 부여해 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%의 증가이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질과 비교 시 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 또는 5% 내지 10%의 증가이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 1배, 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 또는 적어도 2배이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 65배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 85배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 10배 내지 100배, 10배 내지 95배, 10배 내지 90배, 10배 내지 85배, 10배 내지 80배, 10배 내지 75배, 10배 내지 70배, 10배 내지 65배, 10배 내지 60배, 10배 내지 55배, 10배 내지 50배, 10배 내지 45배, 10배 내지 40배, 10배 내지 35배, 10배 내지 30배, 10배 내지 25배, 10배 내지 20배, 또는 10배 내지 15배이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 2배 내지 20배, 2배 내지 19배, 2배 내지 18배, 2배 내지 17배, 2배 내지 16배, 2배 내지 15배, 2배 내지 14배, 2배 내지 13배, 2배 내지 12배, 2배 내지 11배, 2배 내지 10배, 2배 내지 9배, 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배, 또는 2배 내지 3배이다.
아플리베르셉트
일부 실시양태에서, 유전자 요법은 비-인간 영장류 또는 인간 대상체의 눈 또는 눈의 유리체에 투여할 때 아플리베르셉트를 코딩하거나 또는 발현하는 핵산 서열을 포함하는 치료용 트랜스진을 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡시드 변이체를 포함하는 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8)는 아플리베르셉트를 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, 대상체에 대한 유리체 내 또는 망막 하 주사 시 아플리베르셉트 유전자의 서열을 망막 세포 내로 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트 유전자를 포함하는 rAAV는 유전자 요법 및 유리체 내 주사를 위하여 제형화된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트 유전자는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트의 핵산 서열은 그의 아미노산 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트의 핵산 서열은 대상체에서의 그의 발현을 개선시키기 위해 코돈 최적화된다.
코돈 최적화는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100개 또는 그 초과의 코돈)을, 천연 아미노산 서열을 유지하는 동안 숙주 세포에 더 자주 사용되거나 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 표적 또는 숙주 세포, 예를 들어, 인간 망막 세포에서의 특정 유전자의 증강된 발현을 위하여 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 지칭한다. 예를 들어, 젠스크립트(GenScript) 코돈 활용 빈도 테이블 도구 (http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table); 코돈 활용 데이터베이스 (http://www.kazusa.or.jp/codon/; 및 문헌 [Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)])를 포함한 코돈 활용 테이블이 용이하게 입수 가능하다.
아플리베르셉트는 글리코실화될 수 있는 115 kDa 융합 단백질이다. 아플리베르셉트는 인간 VEGFR-1 및 VEGFR-2의 세포외 VEGF 수용체 서열과 융합된 IgG 백본을 포함하고, 그의 자연 또는 내인성 수용체보다 더 큰 친화도로 VEGF-A와 결합함으로써 가용성 유인체 수용체와 유사한 기능을 한다. 예를 들어, 문헌 [Stewart MW. Aflibercept (VEGF Trap-eye): the newest anti-VEGF drug. Br. J. Ophthalmol. 2012 Sep;96(9):1157-8]을 참조할 수 있다. VEGF에 대한 아플리베르셉트의 높은 친화도는 천연 또는 내인성 VEGF 수용체의 후속 결합과 활성화를 방해하거나 또는 파괴시킨다. 저하된 VEGF 활성은 감소된 혈관형성 및 혈관 투과성을 유발시킬 수 있다. 아플리베르셉트에 의한 태반 성장 인자 PIGF 및 VEGF-B의 억제가 또한, 혈관형성 병태의 치료에 기여할 수 있다. PIGF는 혈관형성과 연관되어 왔고, 이는 다수의 병태, 예컨대 습성 AMD에서 상승될 수 있다. VEGF-B 과다발현은 혈액-망막 장벽의 붕괴 및 망막 혈관형성과 연관될 수 있다. 따라서, VEGF-A, VEGF-B, 및 PIGF의 억제가 모두, 아플리베르셉트의 효능에 기여할 수 있다.
본원에 개시된 유전자 산물은 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 돌연변이체 또는 변이체로 이루어진다. 아플리베르셉트의 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다: C4318H6788N1164O1304S32. FDA 고유 성분 식별자 (UNII)는 15C2VL427D이다. 아플리베르셉트의 아미노산 서열은 드럭뱅크, 수탁 번호 DB08885 하에 입수 가능하다: SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열식별번호: 1).
아플리베르셉트의 핵산 서열 (서열식별번호: 2)이 도 5에 예시된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트의 핵산 서열은 영장류 또는 인간 대상체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 아플리베르셉트 아미노산 서열에 상응하는 합성 유전자의 구축이, 예를 들어, 하기 문헌에 기재되었다 [Kanda A, Noda K, Saito W, Ishida S. Aflibercept Traps Galectin-1, an Angiogenic Factor Associated with Diabetic Retinopathy. Scientific Reports 5:17946 (2015)] (이에는 "VEGF-TrapR1R2 (아플리베르셉트에 상응함) cDNA가 IDT (미국 아이오아주 코럴빌)에 의해 합성 유전자로서 생성되었다"라고 기재되어 있음). 아플리베르셉트의 입수 가능한 아미노산 서열을 고려해 볼 때, 본원에 기재된 유전자 요법 또는 rAAV에 사용하기 위한 아플리베르셉트의 cDNA를 생성시키기 위해 관련 기술분야에 공지된 어떠한 방법도 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "아플리베르셉트"는 상기 확인된 아플리베르셉트 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과, 또는 100% 상동성을 수반한 폴리펩티드 또는 단백질 서열, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체 또는 돌연변이체를 지칭한다. 상동성은 기능적 단편, 삽입, 결실, 치환을 포함하는 서열, 가성 단편, 가성 유전자, 스플라이스 변이체 또는 인공적으로 최적화된 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 두 서열 간의 정렬의 잔기의 % 보존을 지칭한다.
일부 경우에, 아플리베르셉트의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 아플리베르셉트 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 상동이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 요법 또는 rAAV에 사용된 핵산 서열을 상기 확인된 아플리베르셉트 아미노산 서열의 상응하는 cDNA 서열과 비교하면, 아플리베르셉트의 핵산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 2) 간에 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 서열 상동성을 나타낸다. 일부 경우에, 아플리베르셉트는 아플리베르셉트와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 공간상 상동이다 (예를 들어, 그의 2차, 3차, 및 4차 구조 또는 입체 형태의 관점에서). 일부 경우에, 본원에 개시된 제약 조성물 및 방법의 아플리베르셉트는 표준 진료에 사용된 아플리베르셉트와 많아야 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 공간상 상동이다 (예를 들어, 2차, 3차, 및 4차 구조 또는 입체 형태).
일부 경우에, rAAV에 근거한 유전자 요법에 포함된 바와 같은 아플리베르셉트 유전자 산물, 또는 아플리베르셉트 트랜스진은 본원에 개시된 바와 같은 캡시드 변이체 (예를 들어, the 7m8 변이체)를 포함하고, 서열식별번호 1의 상기 아미노산 서열과의, 또는 아플리베르셉트의 상응하는 cDNA 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 2와 비교해서 유전자 요법에 사용된 아플리베르셉트 서열의 cDNA) 간에 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 상동성을 갖는 단백질, 융합 단백질, 또는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물은 아플리베르셉트의 기능적 단편, 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트의 핵산 서열은 생체 내에서의 그의 활성, 발현, 안정성, 및/또는 용해도를 증강시키도록 변형되거나 또는 코돈 최적화된다.
일부 실시양태에서, AAV2.7m8은 아플리베르셉트에 대한 유전자 요법 또는 전달 시스템으로서 사용된다. AAV2.7m8-아플리베르셉트는 rAAV2의 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 7m8 삽입을 포함하고 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2를 지칭한다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 활성 성분, 예를 들어, 아플리베르셉트 융합 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV2.7m8 뿐만 아니라 목적하는 치료 또는 예방 효과를 달성하기 위해 유리체 내 또는 망막 하 주사를 통해 인간 환자에게 투여하는 데 적합한 하나 이상의 부형제, 담체, 안정화제, 또는 벌킹제를 함유하는 제형이다.
일부 실시양태에서, rAAV 또는 AAV2.7m8, 및 아플리베르셉트 융합 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물은 재구성된 균질한 용액으로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 용액은 현탁액일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액은 등장성이다. 다른 실시양태에서, rAAV 또는 AAV2.7m8, 및 아플리베르셉트 융합 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물은 동결 건조된 형태로 공급되고, 환자에게 투여하기 전에 재구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 눈 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 방법은 먼저, rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 아플리베르셉트 융합 단백질, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 동결 건조된 제약 조성물을 완충제에서 재구성, 용해 또는 가용화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 동결 건조된 제약 조성물은 동결 방지제, 계면활성제, 염, 안정화제, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제약 조성물을 함유하는 균질한 용액은 미리 채워진 주사기로서 공급된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 현탁액으로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 용액이다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 냉장되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 눈 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 방법은 환자에게 투여하거나 또는 유리체 내 주사하기 전에 상기 냉장된 현탁액을 실온으로 가온시키고/시키거나 균등한 분배를 보장하도록 현탁액을 진탕시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 환자에게 투여하기 전에 희석시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 제약 조성물은 계면활성제, 염, 안정화제, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물을 함유하는 현탁액은 미리 채워진 주사기로서 공급된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 요법 또는 제약 조성물은 현탁액 또는 냉장된 현탁액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어, 계면활성제, 글리세롤, 비이온성 계면활성제, 완충제, 글리콜, 염, 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염산 및 수산화나트륨이 용액의 pH를 조정하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 중성 pH, 또는 pH 6.5 내지 7.5 하에 있다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액의 pH는 약간 염기성 (예를 들어, pH 약 7.5, 8, 8.2, 8.4, 8.5, 또는 9)이다. 일부 실시양태에서, 현탁액 또는 용액의 pH는 약간 산성 (예를 들어, pH 약 6.5, 6.3, 6.1, 6, 5.5, 또는 5)이다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 용액이다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 미셀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 투여 전에 진탕시키고/시키거나 실온으로 가온시킨다.
일부 실시양태에서, rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 아플리베르셉트 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물을 포함하는 유전자 요법은 본원에 개시된 동결 건조되거나 또는 냉동 건조된 제약 조성물 (예를 들어, 바이알 내의 하나의 단위 용량), 및 동결 건조된 제약 조성물을 용해, 희석 및/또는 재구성하기 위한 용액을 포함하는 키트로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 재구성하거나 또는 희석시키기 위한 용액은 미리 채워진 주사기로서 공급될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8)를 포함하는 냉동 건조되거나 또는 동결 건조된 제약 조성물, 및 이러한 제약 조성물을 목적하는 농도 또는 용적으로 재구성하기 위한 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 제약 조성물의 재구성 시 응집되는 것을 방지하는 데 도움을 주는 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 미리 채워진 주사기에 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 이중 챔버 주사기 또는 용기를 포함하며, 여기서 이러한 챔버 중 하나가 제약 조성물을 용해 또는 희석시키기 위한 완충제를 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 주사를 위한 주사기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액은 투여 전에 여과시킨다. 일부 실시양태에서, 키트는 환자에게 투여하기 전에 재구성된 제약 조성물을 여과시키기 위한 필터 또는 필터 주사기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 저장 안정성과 조작의 편의성을 위하여, rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 아플리베르셉트 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물은 동결 건조되거나, 냉동 건조되거나 또는 진공 건조된 분말로서 제형화될 수 있으며, 이는 대상체에게 투여하기에 앞서 식염수, 완충제, 또는 물로 재구성될 수 있다. 또 다른 한편으론, 제약 조성물은 수성 용액, 예컨대 현탁액 또는 균질한 용액으로서 제형화될 수 있다. 제약 조성물은 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 비리온 또는 입자를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 바이러스 또는 전달 시스템, 예를 들어, 나노 입자 또는 지질 기반 복합체가, 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 부형제, 예컨대 인산염, PBS, 또는 트리스 완충제, 글리콜, 글리세롤, 식염수, 계면활성제 (예를 들어, 플루로닉 또는 폴리소르베이트), 또는 그의 임의의 조합이 제약 조성물을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 부가적으로, 동결 방지제, 예컨대 알콜이 동결 건조의 냉동 또는 건조 상태하에 안정화제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법은 현탁액 또는 냉장된 현탁액으로서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 아플리베르셉트 유전자 요법을 포함하는 동결 건조된 제약 조성물의 현탁액 또는 재구성된 형태는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 μL의 용적을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 아플리베르셉트 유전자 요법을 포함하는 제약 조성물의 현탁액은 0.1 내지 0.5 mL, 0.1 내지 0.2 mL, 0.3 내지 0.5 mL, 0.5 내지 1.0 mL, 0.5 내지 0.7 mL, 0.6 내지 0.8 mL, 0.8 내지 1 mL, 0.9 내지 1.1 mL, 1.0 내지 1.2 mL, 또는 1.0 내지 1.5 mL의 용적을 갖는다. 다른 실시양태에서, 용적은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 또는 1.5 mL 이하이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 유리체 내 또는 망막 하 주사를 통해 영장류 (예를 들어, 비-인간 영장류 및 인간 대상체)에게 투여하도록 설계, 조작 또는 적합화된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 비리온을 포함하는 제약 조성물은 대상체의 눈 내로 유리체 내 주사하도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 약 2, 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μL 또는 그 이하 용적의 유리체 내 주사를 허용해 주는 농도가 되도록 제형화되거나 또는 이러한 농도로 재구성된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 단위 용량은 약 2, 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μL 또는 그 이하의 용적을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 방법은 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 용액의 약 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150 μL의 용적의 유리체 내 주사를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 아플리베르셉트 트랜스진의 핵산 서열을 포함하는 AAV2.7m8 비리온이 유전자 요법 제약 조성물의 한 성분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 7m8 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 임의의 혈청형의 rAAV 비리온이 냉동 건조되거나 또는 동결 건조된 제약 조성물 또는 그의 현탁액을 만들기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법은 냉장된 현탁액으로서 제형화된다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 rAAV2이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 동결 건조된 또는 현탁액은 7m8 변이체 캡시드 단백질, 및 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 rAAV2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 냉장되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 인간 환자 또는 비-인간 영장류에서의 치료제로서의 아플리베르셉트의 유리체 내 전달을 위하여 또는 유전자 요법을 위해 적합화된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1013 바이러스 게놈 (vg)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 약 2.1x1011, 약 2.1x1012, 또는 약 2.1x1013 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 3x1012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x109 내지 3x1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1011 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x108 내지 3x1014 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 적어도 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 또는 1x1018 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 5x1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 많아야 약 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 및 1x1018 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 pfu (플라크 형성 단위)로서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량의 pfu는 약 1x108 내지 약 1x1012 pfu일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량의 pfu는 적어도 약 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011 또는 1x1012 pfu일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량의 pfu는 많아야 약 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011 또는 1x1012 pfu일 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 벡터 게놈 (vg)으로서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1013 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x109 내지 1x1014 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1011 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x108 내지 1x1015 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 적어도 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x108 내지 1x1015 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 많아야 약 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1010 내지 1012, 1012 내지 1013, 1011 내지 1013, 1012 내지 1013, 1012 내지 1014, 1011 내지 1014, 1011 내지 1015, 1012 내지 1015, 1013 내지 1014, 1014 내지 1015, 1015 내지 1016, 1016 내지 1017, 1017 내지 1018, 1018 내지 1019, 또는 1019 내지 1020 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 3x1010, 3x1010 내지 4x1010, 4x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 6x1010, 6x1010 내지 7x1010, 7x1010 내지 8x1010, 8x1010 내지 9x1010, 9x1010 내지 10x1010, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 3x1011, 2x1011 내지 2.5x1011, 2.5x1011 내지 3x1011, 3x1011 내지 4x1011, 4x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 6x1011, 6x1011 내지 7x1011, 7x1011 내지 8x1011, 8x1011 내지 9x1011, 9x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 3x1012, 2.5x1012 내지 3x1012, 3x1012 내지 4x1012, 4x1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 6x1012, 6x1012 내지 7x1012, 7x1012 내지 8x1012, 8x1012 내지 9x1012, 9x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 9x1013 내지 10x1013 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 2.1x1011 또는 2.1x1012 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 또는 1013 내지 1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 더 낮은 농도 (예를 들어, 벡터 게놈)가 응집 (이는 더 높은 농도하에 발생될 수 있다)을 방지하기 위해 단위 용량에 사용된다. 일부 실시양태에서, 더 높은 농도, 예를 들어, 더 높은 벡터 게놈이 유전자 요법의 효능을 증가시키거나, 또는 유전자 요법의 한번 주사 또는 1회 투여에서 아플리베르셉트 트랜스진의 전달을 최대화하기 위해 단위 용량에 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물의 더 높은 농도는 더 작은 용적의 주사를 허용해 주며, 이는 유리체 내 주사와 연관된 부작용, 예를 들어, 상승된 안구내 압력, 염증, 자극, 또는 통증을 저하시킬 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 감염 다중도 (MOI)를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비 또는 배수를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1x106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 약 1x105 내지 약 1x107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1x104 내지 1x108일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 적어도 약 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1x108 내지 약 1x1015 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 많아야 약 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 MOI일 수 있다. 일부 실시양태에서, MOI는 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014이다.
안구 사용에 적합한 제약 조성물은 멸균성 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균성 주사 가능한 용액, 현탁액 또는 분산액의 즉각적인 제조를 위한 멸균성 분말을 포함한다. 유리체 내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리학적 식염수, 정균 수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 및/또는 등장제, 예를 들어, 글리세롤을 포함한다. 모든 경우에, 상기 제약 조성물은 멸균성이어야만 하고, 용이한 주사 가능성 또는 주사성이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정해야만 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야만 한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 등장제, 예컨대 염 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 계면활성제 또는 안정화제가 제약 조성물에 부가되어 응집을 방지한다.
일부 경우에, 부형제는 담체일 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 임의의 조합을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 트윈™, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80), 소듐 도데실 술페이트 (소듐 라우릴 술페이트), 라우릴 디메틸 아민 옥시드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 폴리에톡실화 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 옥톡시놀 (트리톤 X100™), N,N-디메틸도데실아민-N-옥시드, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (HTAB), 폴리옥실 10 라우릴 에테르, 브리즈 721™, 담즙 염 (소듐 데옥시콜레이트, 소듐 콜레이트), 플루론산 (F-68, F-127), 폴리옥실 피마자유 [크레모포르(Cremophor™)], 노닐페놀 에톡실레이트 [테르기톨(Tergitol™)], 시클로덱스트린 및 에틸벤제토늄 클로라이드 [히아민(Hyamine™)]의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 크레솔, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 내부 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 담체는 인산나트륨, 염화나트륨, 폴리소르베이트, 및 수크로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 계면활성제, 예를 들어, 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머, 또는 플루로닉을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비이온성 계면활성제의 부가는 제약 조성물에서의 응집을 저하시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 유용한 제약 조성물은 본 개시내용의 적용을 촉진시키기 위해 키트 내에 패키징될 수 있다. 일부 측면에서, 본 방법은 본 개시내용의 재조합 핵산 (예를 들어, 아플리베르셉트의 핵산 서열을 포함하는 rAAV 또는 rAAV2.7m8)을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법은 본 개시내용의 재조합 바이러스의 동결 건조된 형태, 및 환자에게 투여하기 전에 상기 바이러스를 재구성하기 위한 용액을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 제공된 재조합 바이러스, 및 대상체의 눈 또는 망막 세포에 치료상 유효량의 재조합 바이러스를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 측면에서, 키트는 재조합 바이러스를 투여하기 위한 제약상 허용되는 염 또는 용액을 포함한다. 임의로, 키트는 표지 또는 별도의 삽입물의 형태의 적합한 작동적 파라미터에 관한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 의사 또는 실험실 기술자에게 단위 용량의 재조합 바이러스를 제조하고/하거나 동결 건조된 조성물을 재구성하도록 알리는 표준 설명서를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의로, 키트는 투여용 장치, 예컨대 주사기, 필터 바늘, 연장 튜빙, 캐눌라, 또는 망막 하 주사기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 현탁액 또는 냉장된 현탁액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 현탁액 또는 냉장된 현탁액은 주사기 또는 희석을 위한 완충제를 포함할 수 있는 키트에 제공된다. 일부 실시양태에서, 현탁액 또는 냉장된 현탁액은 미리 채워진 주사기로서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물에 사용하기 위한 재조합 바이러스 (예를 들어, rAAV)의 생화학적 정제에 적합한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 재조합 AAV 바이러스는 세포로부터, 또는 세포를 포함하는 배양 배지로부터 직접적으로 수거될 수 있다. 바이러스는 현탁액으로서 제형화하기 전 또는 동결 건조시키기 전에 다양한 생화학적 수단, 예컨대 겔 여과, 여과, 크로마토그래피, 친화 정제, 구배 초원심분리, 또는 크기 배제 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
적응증
일부 경우에, 7m8 변이체를 포함하는 임의의 혈청형의 rAAV 비리온 (예를 들어, rAAV2.7m8), 또는 본원에 기재된 바와 같은 그의 제약 조성물은 눈의 혈관신생과 연관되거나 또는 CNV와 연관된 눈 병태 또는 질환을 적어도 부분적으로 완화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡시드 변이체 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편, 또는 변이체를 인간 대상체의 눈에 전달하기 위해 사용된다.
아플리베르셉트 융합 단백질에 대해 승인된 적응증은 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 (RVO) 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME) 및 DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증 (DR)을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물은, 그에 대한 치료를 위하여 아플리베르셉트가 승인되거나 또는 권고되는 눈 병태 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 (예를 들어, AAV2.7m8 기반 유전자 요법)은 CNV, 습성 AMD, 건성 AMD, DME, RVO, RVO 후 황반 부종, 및 DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 아플리베르셉트에 반응하는 눈 병태 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, rAAV 유전자 요법은 혈관신생 또는 CNV를 특징으로 할 수 있는 임의의 눈 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 질환, 예컨대 AMD, DME, RVO, 혈관형성 관련 질환, 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 유기체 등의 치료를 위한, 본원에 제공된 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 눈 병태는 당뇨병성 황반 부종일 수 있다. 당뇨병성 황반 부종 (DME)은 황반 내의 혈관으로부터 유체가 누출되기 때문에 당뇨병에서 망막이 부어 오르는 것이다. 황반은 망막의 중앙 부분, 추상체가 많은 작은 영역, 색을 검출하고 낮의 시력에 의존하는 특수한 신경 종말이다. 황반 부종이 발생함에 따라, 중심부 시야의 중간 또는 바로 옆에서 흐려짐이 발생한다. 당뇨병성 황반 부종으로부터의 시력 상실은 수개월에 걸쳐 진행될 수 있으며 명확하게 초점을 맞추지 못하게 한다. DME의 통상적인 증상은 흐릿한 시력, 부유물, 이중 시력이고, 치료를 받지 않으면 결국에는 실명한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 DME를 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 눈 병태는 망막 정맥 폐색증일 수 있다. 망막 정맥 폐색증은 망막으로부터 혈액을 옮기는 작은 정맥의 막힘이다. 망막은 빛의 영상을 신경 신호로 전환시키고 이를 뇌에 보내는 내부 눈의 뒤쪽에 있는 조직의 층이다. 망막 정맥 폐색증은 동맥 경화 (아테롬성 경화증)와 혈전 형성에 의해 가장 종종 유발된다. 망막에서 더 작은 정맥 (분지 정맥 또는 BRVO)의 막힘은 종종, 아테롬성 경화증에 의해 두껍게 되거나 또는 경화된 망막 동맥이 교차하여 망막 정맥에 압력을 가하는 장소에서 발생한다. 망막 정맥 폐색증의 증상은 한쪽 눈 전체 또는 일부의 갑작스런 흐려짐 또는 시력 상실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 망막 정맥 폐색증을 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 눈 병태는 습성 AMD로서 공지되기도 한 맥락막 혈관신생 (CNV)일 수 있다. 맥락막 혈관신생은 브루크(Bruch) 막의 파열을 통해 망막 하 색소 상피 (sub-RPE) 또는 망막 하 공간으로 진행되는, 맥락막으로부터 유래되는 새로운 혈관의 성장을 수반할 수 있으며, 이는 시력 상실의 주요 원인이 될 수 있다. CNV는 중심 시력의 갑작스러운 악화를 유발할 수 있으며, 몇 주 내에 눈에 띄게 나타난다. 다른 증상은 색상 장애 및 변시증(metamorphopsia) (직선이 물결 모양으로 보이는 왜곡)을 포함한다. 새로운 혈관의 출혈은 CNV의 증상 발병을 가속화시킬 수 있다. CNV는 눈 뒤의 압박감도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 CNV, 또는 혈관신생과 연관된 눈 병태를 치료하기 위해 사용된다.
AMD의 진행된 "습성" 형태 (신생혈관 또는 삼출성)는 덜 흔하지만, 환자의 중심 시력의 급격하고 종종 실질적인 상실을 빈번히 유발시킬 수 있다. 습성 형태의 AMD에서는, 맥락막 혈관신생이 형성되어 망막 색소 상피 하에 및 이를 통해 성장할 수 있는 혈관 조직으로 발달된다. 이것은 망막 하 공간으로의 혈장의 누출 및/또는 출혈을 수반하기 때문에, 황반에서 발생하는 경우 중심 시력이 심각하게 갑자기 상실될 수 있다. 용어 "AMD"는 달리 명시되지 않는 한, 건성 AMD 또는 습성 AMD 중 하나일 수 있다. 본 개시내용은 AMD, 습성 AMD 및/또는 건성 AMD의 치료 또는 예방을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 AMD를 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 생체 내에서 아플리베르셉트에 반응하는 눈 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물, 즉 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하는 AAV 유전자 요법은 컬러 안저 촬영에 따라서 CNV 형성 후 등급 IV 병변의 백분율로써 측정된 바와 같이, 비히클 또는 완충제 대조군과 비교 시 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 혈관신생 또는 CNV에 있어서의 저하를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물, 즉 아플리베르셉트, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하는 AAV 유전자 요법은 컬러 안저 촬영에 따라서 CNV 형성 후 등급 IV 병변의 백분율로써 측정된 바와 같이, 아플리베르셉트 또는 비-유전자 요법-기반 아플리베르셉트와 대등한 수준으로 혈관신생 또는 CNV에 있어서의 저하를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, CNV에 있어서의 저하, 또는 치료 효과는 비-유전자 요법-기반 아플리베르셉트 또는 아플리베르셉트의 단백질 용액으로의 투여와 비교 시, 아플리베르셉트를 포함하는 유전자 요법의 투여의 경우에 더 오래 지속된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트 유전자 요법의 치료 효과는 단일 유리체 내 주사 후 적어도 1년, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 내인성 VEGF 및/또는 PIGF를 억제 또는 격리시킨다.
사용 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 제약 조성물의 제약상 유효량을, 병리학적 혈관형성 관련 눈 질환의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 연령 관련 황반 변성 (AMD), 습성 AMD, 건성 AMD, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색증, 망막 중심 정맥 폐색증, 망막 정맥 분지 폐색증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 허혈성 망막병증 및 당뇨병성 망막 부종, 및 그의 임의의 조합을 포함한 안구 신생혈관 질환의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 변이체 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV.7m8) 및 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 포함하는 제약 조성물은 건성 AMD 및 습성 AMD를 포함한 AMD를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 변이체 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV.7m8) 및 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 포함하는 제약 조성물은 CNV를 치료 또는 예방하거나, 또는 등급 IV CNV 병변을 저하시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 변이체 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV.7m8) 및 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 포함하는 제약 조성물은 AMD, 습성 AMD, 건성 AMD, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색증, 망막 중심 정맥 폐색증, 망막 정맥 분지 폐색증, RVO, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 허혈성 망막병증 및 당뇨병성 망막 부종, DME 환자에서의 DR, 및 그의 임의의 조합 중 어느 하나를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, AMD, DME, RVO, 또는 DR을 치료하는 방법은 아플리베르셉트의 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법을 특정 환자에게 투여하기 전에, EYLEA®를 이용하여 동일한 환자를 미리 치료하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 본원에 개시된 바와 같은 아플리베르셉트 유전자 요법의 1회 용량을 받기 전에, EYLEA®로 미리 치료한다. 일부 실시양태에서, 환자는 본원에 개시된 바와 같은 아플리베르셉트 유전자 요법의 1회 용량을 받기 전에, 아플리베르셉트에 반응한다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트에 반응하거나, 또는 아플리베르셉트로 미리 치료받았던 환자는 본원에 개시된 바와 같은 아플리베르셉트 유전자 요법으로 치료받은 후, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과, 또는 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과의 기간에 치료하며, 그 동안에 환자는 EYLEA® 또는 아플리베르셉트 유전자 요법 중 어느 것도 받지 않는다. 일부 경우에, 환자가 아플리베르셉트 유전자 요법의 유리체 내 주사를 받은 후, 이 환자는 유전자 요법 치료 후 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과가 경과될 때까지는 EYLEA® 또는 또 다른 표준 진료 주사, 또는 또 다른 승인된 요법 (예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙 주사)을 받기 시작하지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 아플리베르셉트 유전자 요법을 환자에게 투여하기 전에 아플리베르셉트에 대한 반응성에 대하여 (예를 들어, 면역검정 또는 혈액 시험에 의해) 환자를 사정 또는 평가하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 아플리베르셉트 유전자 요법은 1회 투여이다. 일부 실시양태에서, 환자가 본원에 개시된 아플리베르셉트 유전자 요법의 단위 용량을 받은 후, 이 환자에게 임의의 다른 아플리베르셉트-기반 요법을 사용할 필요가 없다.
일부 경우에, EYLEA® 또는 또 다른 승인된 요법의 반복적인 유리체 내 주사와 연관된 부작용, 예를 들어, 염증, 상승된 안구내 압력, 또는 박테리아성 감염을 경험한 환자는 본원에 개시된 아플리베르셉트 유전자 요법을 이용한 치료에 대한 후보일 수 있다. 일부 경우에, 이러한 위험은 유전자 요법에서 더 낮은데, 이는 환자의 생애 동안 단 한번의 주사만 있으면 되거나, 또는 적어도 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50년 또는 그 초과에 1회 이하로 제공되기 때문이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 아플리베르셉트 유전자 요법을 이용한 치료는 단백질-기반 주사보다 비용면에서 더 효과적일 수 있는데, 이는 유전자 요법의 치료 효과가 더 오래 지속될 수 있고 1회 유전자 요법 주사의 비용이 단백질의 다수의 반복적인 주사를 합한 비용보다 더 낮을 수 있기 때문이다.
또한, 유전자 요법은 반복적인 주사가 필요하지 않음으로써, 반복적인 주사가 필요한 요법과 연관된 환자의 순응 및 처방 준수 문제 (준수하지 않으면 (예를 들어, 환자가 1회 이상의 예정된 주사를 잊어버리거나 또는 누락시킨 경우) 시력 상실 및 눈 질환 또는 병태의 악화를 초래할 수 있다)를 해결해 준다. AMD의 영향을 가장 많이 받는 노인 환자 중에는, 투여를 위해 진료소를 반복적으로 또는 자주 방문해야 하는 치료 요법에 순응하지 않고 그 처방을 준수하지 않는 비율이 더 높다. 따라서 유전자 요법을 통해, 예를 들어, 1회 유리체 내 주사로서 아플리베르셉트를 환자의 눈에 전달하는 것이 환자에게 보다 편리한 치료 옵션을 제공하고, 비-순응 및 비-처방 준수 문제를 해결함으로써 환자 성과를 개선시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 사용 방법은 현재의 표준 진료, 예를 들어, 아플리베르셉트 단백질 주사, 라니비주맙 주사, 또는 베바시주맙 주사로 간주되는 약물을 이용하여 인간 환자 또는 대상체를 미리 치료하고, 아플리베르셉트에 대한 상기 환자의 반응성을 결정하며, 본원에 기재된 아플리베르셉트 유전자 요법을, 아플리베르셉트에 반응하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 아플리베르셉트에 대한 환자의 반응성을 결정하는 것은 혈액 시험, 면역검정, 생체외 실험, 또는 아플리베르셉트 단백질 주사를 환자에게 투여하는 것, 및 아플리베르셉트에 대한 환자의 반응성을 검정하는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아플리베르셉트 유전자 요법의 사용 방법은 약물 표지에 따라서 본원에 기재된 제약 조성물 (즉, 아플리베르셉트 핵산 서열을 포함하는 rAAV2.7m8)의 동결 건조된 형태를 재구성하고, 이와 같이 재구성된 아플리베르셉트 유전자 요법을 대상체 또는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트 유전자 요법은 현탁액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 투여 전에 진탕시킨다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 냉장되어 있다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 투여 전에 실온으로 가온시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 인간 환자는 아플리베르셉트 주사 또는 또 다른 단백질 약물 주사, 예를 들어, 라니비주맙 주사 또는 베바시주맙 주사로 미리 치료하였다. 일부 실시양태에서, 상기 환자는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과 동안 rAAV2.7m8-아플리베르셉트 유전자 요법의 1회 이하 주사 또는 투여를 받거나; 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과 내에 rAAV2.7m8-아플리베르셉트 유전자 요법의 1회 이하 주사 또는 투여를 받는다.
일부 실시양태에서, 또한 본원에는 눈 병태 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 개시되며, 이러한 방법은 상기와 같은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 아플리베르셉트에 반응하는 눈 병태 또는 질환이 있는 개체에게, 본원에 기재된 바와 같은 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 비리온 또는 그의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV2.7m8-아플리베르셉트 비리온은 안구내 주사를 통해, 유리체 내 주사에 의해, 망막 하 주사에 의해, 또는 개체의 눈 내로의 투여의 임의의 다른 편리한 방식 또는 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 편리한 투여 방식 또는 경로는, 예를 들어, 정맥내, 국소, 점안 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물은 유리체 내 주사에 의한 투여를 수반한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 요법 또는 제약 조성물은 냉장된 현탁액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 냉장된 현탁액은 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어, 계면활성제, 글리세롤, 비이온성 계면활성제, 완충제, 글리콜, 염, 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염산 및 수산화나트륨이 용액의 pH를 조정하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 중성 pH, 또는 pH 6.5 내지 7.5 하에 있다. 일부 실시양태에서, 현탁액의 pH는 약간 염기성 (예를 들어, pH 약 7.5, 8, 8.2, 8.4, 8.5, 또는 9)이다. 일부 실시양태에서, 현탁액 또는 용액의 pH는 약간 산성 (예를 들어, pH 약 6.5, 6.3, 6.1, 6, 5.5, 또는 5)이다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 용액이다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 미셀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 투여 전에 진탕시킨다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 35F 내지 46F (2℃ 내지 8℃)의 온도하에 저장한다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 환자에게 투여하기 전에 실온으로 가온시킨다.
본원에 기재된 바와 같은 "치료상 유효량"은 임상 시험을 통하여 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위일 수 있다. 눈에 직접적으로 주사하거나 또는 유리체 내 주사하는 경우, 치료상 유효 용량은 7m8-아플리베르셉트의 1011 내지 1012 또는 1012 내지 1013 벡터 게놈의 정도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 7m8-아플리베르셉트의 단위 용량 또는 치료상 유효량은 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1010 내지 1012, 1012 내지 1013, 1011 내지 1013, 1012 내지 1013, 1012 내지 1014, 1011 내지 1014, 1011 내지 1015, 1012 내지 1015, 1013 내지 1014, 1014 내지 1015, 1015 내지 1016, 1016 내지 1017, 1017 내지 1018, 1018 내지 1019, 또는 1019 내지 1020 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 7m8-아플리베르셉트를 포함하는 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 3x1010, 3x1010 내지 4x1010, 4x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 6x1010, 6x1010 내지 7x1010, 7x1010 내지 8x1010, 8x1010 내지 9x1010, 9x1010 내지 10x1010, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 3x1011, 2x1011 내지 2.5x1011, 2.5x1011 내지 3x1011, 3x1011 내지 4x1011, 4x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 6x1011, 6x1011 내지 7x1011, 7x1011 내지 8x1011, 8x1011 내지 9x1011, 9x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 3x1012, 2.5x1012 내지 3x1012, 3x1012 내지 4x1012, 4x1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 6x1012, 6x1012 내지 7x1012, 7x1012 내지 8x1012, 8x1012 내지 9x1012, 9x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 9x1013 내지 10x1013 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 7m8-아플리베르셉트의 단위 용량은 2.1x1011 또는 2.1x1012 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 또는 1013 내지 1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 7m8-아플리베르셉트의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물의 치료상 유효량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 약 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12 내지 1.5E12, 1.5E12 내지 2E12, 2E12 내지 2.5E12, 2.5E12 내지 3.0E12, 3.0E12 내지 3.5E12, 3.5E12 내지 4.0E12, 4.0E12 내지 4.5E12, 4.5E12 내지 5.0E12, 5.0E12 내지 5.5E12, 5.5E12 내지 6.0E12, 6.0E12 내지 6.5E12, 6.5E12 내지 7.0E12, 7.0E12 내지 7.5E12, 7.5E12 내지 8.0E12, 8.0E12 내지 8.5E12, 8.5E12 내지 9.0E12, 9.0E12 내지 9.5E12, 또는 9.5E12 내지 10E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 적어도 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 9.5E12, 또는 10E12 벡터 게놈 이하를 포함한다.
일부 실시양태에서, 2 내지 5년 또는 5 내지 10년의 기간 이내에 인간 환자 또는 대상체 내로 주사된 7m8-아플리베르셉트의 총 양은 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 또는 1013 내지 1014 벡터 게놈 이하, 또는 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014 벡터 게놈 이하이다.
일부 실시양태에서, rAAV.7m8-아플리베르셉트 비리온 또는 그의 제약 조성물은 단일 용량 또는 1회 용량으로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2회 이상의 투여를 이용하여, 다양한 간격, 예를 들어, 적어도 2년, 또는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년, 또는 그 초과에 1회 이하의 지속적인 기간에 걸쳐 목적하는 수준의 유전자 발현을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 7m8-아플리베르셉트의 유리체 내 주사는 환자가 적어도 1년, 1.5년, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30년 또는 그 초과 동안 아플리베르셉트 단백질 주사를 받을 필요를 없애준다.
실시예
실시예 1: 원숭이에서 rAAV2 .7m8- 아플리베르셉트의 효능 평가
유전자 요법을 통해 표적 세포 또는 조직에 치료용 트랜스진 (또는 페이로드)을 전달하는 것은 주로, AAV 캡시드 단백질 및 영장류 또는 인간 대상체에서 관련 또는 표적 세포에 AAV 바이러스를 표적화하는 데 있어서의 그들의 역할에 의존적이라고 가정되었다. 7m8 변이체가 유리체 내로 주사될 때 망막 세포의 증가된 감염력 또는 표적화를 나타내는 것으로 또한 보고되었다. 따라서, 7m8 변이체가 유리체 내로 주사될 때 다양한 치료용 트랜스진을 망막 세포로 표적화하는 데 있어서 유사하게 작동할 것으로 예상된다.
목적: 아프리카 그린 원숭이에서 레이저 광응고술에 의해 유도된 맥락막 혈관신생 (CNV)의 발생을 억제하기 위하여 2 x 1012 vg의 용량하에 각각의 유전자 요법의 유리체 내 (IVT) 투여 후, 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2.7m8의 효능을, sVEGFR-1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2.7m8의 효능과 함께 평가하기 위한 것이다. sVEGFR-1 (sFLT-1로서 지칭되기도 함)의 핵산 서열은, 예를 들어, 미국 특허 공보 2014/0371438에 기재된 바와 같이 공개적으로 입수 가능하다.
도 5는 아플리베르셉트의 핵산 서열을 예시한다. 도 6은 sFLT-1의 핵산 서열 (서열식별번호: 3)을 예시한다.
원숭이에서의 CNV 병변 모델은 혈관신생과 연관된 눈 질환, 예컨대 습성 AMD를 치료하는 요법의 잠재적 효능을 평가하기 위한 표준 영장류 모델로서 일반적으로 허용되고 광범위하게 사용되고 있다.
원숭이는 안압 측정법, 슬릿 램프 생체 현미경 검사, 안저 검사, 컬러 안저 촬영 (CFP), 형광 혈관 조영술 (FA) 및 광학 단층 촬영 (OCT)에 의해 안구 및 전반적인 건강 상태를 평가하기 위한 기준선 스크리닝을 받았다. 정상 소견을 보인 원숭이를 본 연구에 등록시켰고 기준선 체중 및 성별에 따라 3가지 처리 군으로 무작위 추출하였다 (표 1). 아트로핀 1% 안과용 연고가 기준선 검사 후에 적용되었다.
본원에 사용된 바와 같이, rAAV2.7m8-sVEGFR-1은 rAAV2의 캡시드 단백질 VP1 내의 위치 587과 588 사이에 7m8 삽입 및 sVEGFR-1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2를 포함한다.
<표 1>
처리 배정
Figure 112019003583047-pct00001
* CFP는 제14일 영상이 안정화된 수포의 명확한 영상을 보이지 않으면 제21일에 부가적으로 수행되었다. 슬릿 램프는 제56일에 레이저 이전에 수행되었지만 제0일 주사 직후에는 수행되지 않았다.
연구 제0일에, 군 1 내지 3의 원숭이에게 처리 스케줄에 따라서 AAV2.7m8-아플리베르셉트, 비히클, 또는 AAV2.7m8-sVEGFR-1 OU를 유리체 내 (IVT) 투여하였다 (표 1). IVT 투여에 앞서, 국소 마취제 (0.5% 프로파라카인)를 투여하였고, 눈을 5% 베타딘으로 소독하고 멸균 생리 식염수로 세정할 수 있다. IVT 주사는 중심 유리체를 표적으로 하여 하사 측두엽 내의 윤부 후방 2 mm에 배치된 31번 게이지 0.5인치 바늘을 사용하여 투여하였다.
연구 제56일에, 군 4의 원숭이에게, 감소된 용적 (30 μL)을 주사하는 것을 제외하고는 군 1 내지 3의 것과 동일한 IVT 주사 절차에 따라서, 레이저 처리 직후 아플리베르셉트 (EYLEA®, 30 μL의 40 mg/mL/눈) OU를 IVT 투여하였다. 아플리베르셉트의 IVT 투여는 CNV에 대한 임상 표준 진료이므로, 본 연구에서 양성 대조군으로서 이용되었다. 용량은 인간 (4 mL)과 비교하여 아프리카 그린 원숭이 (2.7 mL)에서 비교적 더 적은 용적의 유리체를 수용하도록 조정되었다.
모든 IVT 주사 후에, 0.3% 시프로플록사신, 또는 등가의 항생제 안과 용액, 및 1% 아트로핀 술페이트 연고를 국소 투여하였다.
제56일에, CNV는 레이저 빔으로 측두 혈관 아케이드 사이에서 유도되었다. 안과 전문의는 레이저 지속 시간 100 ms, 스팟 크기 50 μm, 파워 750 mW의 이리덱스 오쿠라이트(Iridex Oculight) TX 532 nm 레이저를 이용하여 각각의 눈에 9개의 레이저 스팟을 대칭적으로 배치시켰다. 레이저 스팟은 0.9x 접촉 레이저 렌즈를 사용하여 적용되었다. 레이저 스팟의 표적 위치는 레이저 스팟 배치 동안 참조용으로 레이저 처리에 앞서 수득된 컬러 안저 영상 (및 수포 배치 이후)에 훈련된 안과 전문의에 의해 매핑되었다. 레이저 병변을 기록하기 위해 레이저 처리 직후에 컬러 안저 촬영을 수행하였다. 레이저 직후에 심각한 망막/망막 하 출혈을 명확하게 보여주는 어떠한 스팟도 분석에서 배제하였다. 도 1은 처리 없이 레이저 방사선 조사에 의한 CNV 병변의 유도 후 비-인간 영장류의 눈의 예시적인 안저 사진을 예시한다.
캐논 6D 디지털 영상화 하드웨어와 뉴 비젼(New Vision) 안저 영상 분석 시스템 소프트웨어가 장착된 탑콘(Topcon) TRC-50EX 망막 카메라를 사용하여 망막의 양측 컬러 안저 영상을 중심와(fovea)를 중심으로 한 50도의 시야로 포착하였다. FA는 0.1 mL/kg의 10% 소듐 플루오레세인의 정맥내 투여로 수행되었다. CNV 병변의 혈관 조영상에서의 플루오레세인 누출은, 영상 강도의 균일한 조정 후에 생성된 복합체를 평가하는 마스킹된 안과 전문의에 의해 등급 I 내지 IV을 매겼다 (표 2). 병변 등급 지정 평가는 다른 두 명의 훈련된 안과 전문의에 의해 안저 영상에서 확인되었다. 이미지J(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 후기 미가공 혈관 조영상의 영상 형광 밀도 측정 분석을 수행할 수도 있다.
<표 2>
레이저 병변 등급 지정 스케일
Figure 112019003583047-pct00002
대상체는 일반적인 웰빙을 대하여 1일 2회 평가하였다. 상세한 관찰은 매주 1회 수행되었다. 체중은 기준선 스크리닝 시, 및 평생 연구 동안 2주마다 수득하였다.
모든 동물은 제85일, 또는 그 직후에 영상의 검토가 진행될 때까지 안저 영상화의 품질을 확인한 후 펜토바르비탈로 안락사시켰다. 동물을 펜토바르비탈로 안락사시키고 글로브를 적출하였다. 과도한 안와 조직을 잘라내어 OD와 OS 글로브 둘 다를 액체 질소로 급속 동결시킨 다음, 냉동된 조직 평면을 따라 실온하에 해부하여 맥락막 하부조직을 수반한 망막과 유리체를 단리하였다. 유리체의 수집 후, RPE/맥락막을 수반한 신경 망막의 5mm 펀치는 황반과 상측, 하측, 측두 및 비강 영역으로부터 취하였다. 각각의 펀치로부터의 하층 RPE/맥락막 조직을 수반한 망막을, 미리 용기의 무게를 단 표지된 동결 튜브로 옮기고, 무게를 달고 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 펀치 생검을 수집하기 전후에, 그로부터 펀치가 수집된 영역을 기록하기 위해 방향의 지표가 수반된 평평하게 마운트된 망막의 사진을 찍었다.
통계적 방법: 피셔의 직접 확률 시험을 사용하여 상이한 병변 등급의 발생률을 평가하였다. OCT CNV 복합체 면적 및 혈관 조영상 영상 밀도 측정 데이터를 분석하기 위해, 반복적인 측정에 이어 투키-크레이머(Tukey-Kramer) 시험 또는 대조 절차를 이용하는 양방향 ANOVA를 사용하였다. 데이터가 정상적으로 분포되지 않고 분산이 동일하지 않은 경우에는 비모수적 검정을 적용하였다. 0.05 이하의 P 값이 통계상 유의적인 것으로 간주되었다.
CNV 병변은 시험 대상체 (원숭이)의 각각의 군에서 주사 직후 레이저 방사선 조사에 의해 유도되었고, 컬러 안저 촬영을 사용하여 I 내지 IV의 스케일로 각각의 병변의 등급을 매겼다. 도 2는 AAV2.7m8-아플리베르셉트 또는 비히클 대조군을 2.1 x 1012 vg의 용량하에 유리체 내로 처리한 후 제70일에 원숭이의 병변을 평가하기 위해 사용되는 예시적인 안저 촬영을 예시한다. AAV2.7m8-아플리베르셉트로 처리된 원숭이는 등급 II 및 III의 병변을 나타내었고 등급 IV 병변은 나타내지 않은 반면, 비히클 대조군으로 처리된 원숭이는 등급 IV 병변을 더 많이 나타내었다. 다수의 원숭이로부터의 유사한 데이터를 풀링하고, 하기에 추가로 기재된 각각의 시험 군에 대한 정량적 분석을 위하여 플롯하였다 (도 3 및 4).
도 3은 양성 대조군으로서의 EYLEA® (또는 유전자 요법 접근법을 수반하지 않은 아플리베르셉트 융합 단백질) 또는 제제 완충제 만을 포함하는 비히클 대조군 중 하나를 유리체 내로 주사한 군 4의 원숭이의 제14일 및 제28일에서의 등급 IV 병변의 백분율의 플롯을 예시한다. 인간 (4 mL)과 비교하여 아프리카 그린 원숭이 (2.7 mL)에서 비교적 더 적은 용적의 유리체를 수용하도록 감소된 용적 (30 μL)을 주사하는 것을 제외하고는 군 1 내지 3에 대해 사용된 바와 동일한 IVT 주사 절차에 따라서 (표 1), 레이저 방사선 조사 직후 30 μL의 40 mg/mL/눈 EYLEA® OU를 투여하였다. EYLEA®의 IVT 투여는 CNV에 대한 임상 표준 진료이므로, 본 연구에서 양성 대조군으로서 이용되었다. 다수의 원숭이로부터의 데이터를 평균내고, 정량적 분석을 위하여 플롯하였다. EYLEA®의 유리체 내 주사로 처리된 동물은 주사 후 제14일 및 제28일에 수집된 안저 영상에 의해 측정된 바와 같이, 유리체 내 주사에 의한 비히클 단독의 투여와 비교 시 등급 IV 병변의 양에 있어서의 상당한 감소를 나타내었다.
도 4는 각각 2.1 x 1012 vg의 용량하의 rAAV2.7m8-아플리베르셉트 (이는 7m8 변이체 캡시드 단백질 및 아플리베르셉트 핵산 서열을 수반한 rAAV2를 포함하는 유전자 요법이다); 또는 AAV2.7m8-sVEGFR-1 (이는 7m8 변이체 캡시드 단백질 및 sVEGFR-1 핵산 서열을 수반한 rAAV2를 포함하는 유전자 요법이다) 중 하나, 또는 제제 완충제 만을 포함하는 비히클 대조군이 유리체 내로 주사된 원숭이 (표 1에서의 군 1 내지 3)의 제14일 및 제28일에서의 등급 IV 병변의 백분율의 플롯을 예시한다. CNV 병변은 레이저 방사선 조사에 의해 유도되었고, 컬러 안저 촬영을 사용하여 I 내지 IV의 스케일로 각각의 병변의 등급을 매겼다. 이어서, 등급 IV 병변의 백분율의 측정치를 풀링하고 플롯하였다. rAAV2.7m8-아플리베르셉트의 유리체 내 주사로 처리된 원숭이는 제14일 및 제28일에 수집된 안저 영상에 대하여 비히클 대조군 단독과 비교 시 등급 IV 병변의 양에 있어서의 상당한 감소를 나타내었다. 반대로, 및 예상치 못하게도, rAAV2.7m8-sVEGFR-1의 유리체 내 주사로 처리된 원숭이는 비히클 대조군과 비교 시 등급 IV CNV 병변의 저하를 거의 또는 전혀 나타내지 못하였다. 이러한 데이터는 캡시드 변이 및/또는 투여 경로가 모든 트랜스진에 대하여 작동하지 않을 수 있다는 것 (이는 이전에 많은 사람이 생각했던 것과는 상반된다)과, 트랜스진의 특성이 AAV 유전자 요법의 효능에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 원숭이에서의 생체내 데이터는 또한, 영장류를 rAAV2.7m8-아플리베르셉트로 처리하면, 비히클 대조군 만을 투여한 원숭이와 비교 시 더 적은 수의 등급 IV 병변이 유발되었다는 것을 예시하였는데, 이는 rAAV2.7m8-아플리베르셉트가 인간에 대하여 실행 가능한 유전자 요법 옵션일 수 있다는 것을 암시한다.
이들 rAAV2.7m8-아플리베르셉트의 생체내 연구는 7m8 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV2가 아플리베르셉트를 코딩하는 핵산 서열을 유리체 내 주사에 의해 대상체의 망막 세포로 전달하기 위한 유전자 요법으로서 유효할 수 있고, 생체 내에서 활성 아플리베르셉트의 발현을 발생시켜, EYLEA® 양성 대조군의 치료 효과와 유사한 수준하에 치료 효과, 즉 CNV 병변의 저하를 발휘한다는 것을 보여주었다.
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Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 420 425 430 <210> 2 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttccggaag tgataccggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaatc 120 cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca 180 cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa 240 cgcataatct gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata 300 gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca 360 catcgacaaa ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta 420 tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 480 gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540 ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600 gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660 aagaacagca catttgtcag ggtccatgaa aaggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1377 <210> 3 <211> 2064 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120 cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180 tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240 tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300 cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360 gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420 gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 480 acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540 ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600 gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660 ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720 aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg 780 agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga 840 cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa 900 atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa 960 tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagcattca tcactgtgaa acatcgaaaa 1020 cagcaggtgc ttgaaaccgt agctggcaag cggtcttacc ggctctctat gaaagtgaag 1080 gcatttccct cgccggaagt tgtatggtta aaagatgggt tacctgcgac tgagaaatct 1140 gctcgctatt tgactcgtgg ctactcgtta attatcaagg acgtaactga agaggatgca 1200 gggaattata caatcttgct gagcataaaa cagtcaaatg tgtttaaaaa cctcactgcc 1260 actctaattg tcaatgtgaa accccagatt tacgaaaagg ccgtgtcatc gtttccagac 1320 ccggctctct acccactggg cagcagacaa atcctgactt gtaccgcata tggtatccct 1380 caacctacaa tcaagtggtt ctggcacccc tgtaaccata atcattccga agcaaggtgt 1440 gacttttgtt ccaataatga agagtccttt atcctggatg ctgacagcaa catgggaaac 1500 agaattgaga gcatcactca gcgcatggca ataatagaag gaaagaataa gatggctagc 1560 accttggttg tggctgactc tagaatttct ggaatctaca tttgcatagc ttccaataaa 1620 gttgggactg tgggaagaaa cataagcttt tatatcacag atgtgccaaa tgggtttcat 1680 gttaacttgg aaaaaatgcc gacggaagga gaggacctga aactgtcttg cacagttaac 1740 aagttcttat acagagacgt tacttggatt ttactgcgga cagttaataa cagaacaatg 1800 cactacagta ttagcaagca aaaaatggcc atcactaagg agcactccat cactcttaat 1860 cttaccatca tgaatgtttc cctgcaagat tcaggcacct atgcctgcag agccaggaat 1920 gtatacacag gggaagaaat cctccagaag aaagaaatta caatcagagg tgagcactgc 1980 aacaaaaagg ctgttttctc tcggatctcc aaatttaaaa gcacaaggaa tgattgtacc 2040 acacaaagta atgtaaaaca ttaa 2064 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Asn Glu Thr Ile Thr Arg Pro 1 5 <210> 6 <211> 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Claims (46)

  1. (a) 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 삽입된 아미노산 서열 LGETTRP, 및 아플리베르셉트와 적어도 95% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2 변이체, 및
    (b) 제약상 허용되는 부형제
    를 포함하는, 눈 병태 또는 질환의 치료 방법에서 사용하기 위한 제약 조성물로서, 여기서 방법은 눈 병태 또는 질환의 치료를 필요로 하는 영장류 대상체의 눈에 유리체 내 주사함으로써 제약 조성물의 단위 용량을 투여하는 것을 포함하고, 투여가 1년 초과 동안 치료 효과를 제공하는 것인, 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 아플리베르셉트와 적어도 95% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 눈 병태 또는 질환이 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 또는 DME와 연관된 당뇨병성 망막병증인 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 눈 병태 또는 질환이 맥락막 혈관신생 또는 습성 AMD인 제약 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 아플리베르셉트와 100% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단위 용량이 (a) 1E12 내지 1E13 벡터 게놈; (b) 2E12 내지 6E12 벡터 게놈; (c) 1E9 내지 3E13 벡터 게놈; (d) 1E10 내지 3E12 벡터 게놈; 또는 (e) 1E8 내지 3E14 벡터 게놈인 제약 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단위 용량이 (a) 100 μL 이하의 용적이거나; 또는 (b) 50 μL 이하의 용적인 제약 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 제약 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 아플리베르셉트에 반응하는 것인 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 아플리베르셉트로 미리 치료받은 적이 있는 것인 제약 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유리체 내 주사에 의해 투여하는 것이 적어도 2년에 1회 이하 일어나는 것인 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 유리체 내 주사에 의해 투여하는 것이 적어도 5년에 1회 이하 일어나는 것인 제약 조성물.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유리체 내 주사에 의해 투여하는 것이 1회 투여인 제약 조성물.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁액인 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 투여 단계에 앞서 현탁액의 균등한 분배를 보장하기 위해 현탁액을 진탕시키는 것을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계에 앞서 제약 조성물을 실온으로 가온시키는 것을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
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