JP2022137244A - アフリベルセプトを含むａａｖ２バリアントを使用したａｍｄの処置 - Google Patents

Abstract

【課題】アフリベルセプトを含むＡＡＶ２バリアントを使用したＡＭＤの処置の提供。【解決手段】本開示は、アフリベルセプトをコードする核酸配列を有するベクターを含む遺伝子療法に適合させた薬学的組成物を硝子体内に投与することによる、被験体における加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の処置のための薬学的組成物およびその方法を提供する。本開示は、霊長類またはヒト被験体におけるアフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸を含むベクターまたはウイルス粒子（例えばｒＡＡＶ）の薬学的に有効な量を含む薬学的組成物を硝子体内または網膜下に投与することによる、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、ＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）、網膜静脈閉塞、および関連した眼疾患または状態の予防または処置のための薬学的組成物および方法に関する。【選択図】なし

Description

相互参照
本願は、２０１６年６月１６日に出願された米国仮出願第６２／３５１，２３４号の利益を主張し、その開示全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

アフリベルセプトは、血管内皮増殖因子サブタイプＡおよびＢ（ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｂ）ならびに胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）のためのデコイ受容体として作用する組換え融合タンパク質である。これらのリガンドに結合することによって、アフリベルセプトは、これらのリガンドが血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、ＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２に結合して新血管形成を抑制し、血管透過性を低下させることを阻止することができる。アフリベルセプトは、ＩｇＧ１のＦｃ断片に融合したＶＥＧＦＲ－１のドメイン２およびＶＥＧＦＲ－２のドメイン３からなる。アフリベルセプトは商品名ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）の下で市販され、それは眼科の硝子体内アフリベルセプト融合タンパク質注射剤である。

ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）は患者において滲出型ＡＭＤを処置するための現在の標準治療であるが、眼にアフリベルセプトを送達する遺伝子治療方法は、患者に向上した処置選択肢を提供することができる。なぜなら、遺伝子療法が、一部の患者において炎症、感染症および他の有害作用のリスクを増加させ得る反復注射を必要とせずに、ｉｎ ｖｉｖｏでアフリベルセプトの長期または持続性の放出を提供することができるからである。さらに、服薬非遵守（ｎｏｎ－ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）は視力喪失および眼疾患または状態の悪化をもたらし得るので、遺伝子療法は、反復注射を必要としないことによって、反復注射を必要とする療法に関連した患者服薬遵守およびアドヒアランスの課題に対処する。投与のために診療所への反復または高頻度の訪問を必要とする処置レジメンへの服薬非遵守およびノンアドヒアランス（ｎｏｎ－ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）の率は、ＡＭＤによって最も影響を受ける高齢患者の間でより高い。遺伝子療法を通して患者の眼にアフリベルセプトを送達することは、したがって、患者により安全で、潜在的により費用効果がよく、より便利な処置選択肢を提供し、服薬非遵守およびノンアドヒアランスの問題に対処することによって、患者転帰を向上させることができる。

本開示は、霊長類またはヒト被験体における、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸を含む、ベクターまたはウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ）の薬学的に有効な量を含む薬学的組成物を硝子体内または網膜下に投与することによる、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、ＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）、網膜静脈閉塞、および関連した眼疾患または状態の予防または処置のための薬学的組成物および方法に関する。

一部の態様では、眼の状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする霊長類被験体の眼に硝子体内注射によって薬学的組成物の単位用量を投与するステップを含み、薬学的組成物が：（ａ）カプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間に挿入されるアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ、およびアフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２バリアント、ならびに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む、方法が本明細書に開示される。一部の場合には、眼の状態または疾患は、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である。一部の場合には、眼の状態または疾患は、脈絡膜新血管形成または滲出型ＡＭＤである。一部の場合には、単位用量は、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む。一部の場合には、単位用量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の場合には、単位用量は、１００μＬ以下の容量を含む。一部の場合には、単位用量は、５０μＬ以下の容量を含む。一部の場合には、被験体は、非ヒト霊長類である。一部の場合には、被験体は、ヒトである。一部の場合には、被験体は、アフリベルセプトに応答性である。一部の場合には、被験体は、アフリベルセプトで前処置されている。一部の場合には、硝子体内注射による投与は、少なくとも２年間で１回以下行われる。一部の場合には、硝子体内注射による投与は、少なくとも５年間で１回以下行われる。一部の場合には、硝子体内注射による投与は、１度限りの投与である。一部の場合には、薬学的組成物は、懸濁物または冷蔵された懸濁物である。一部の場合には、方法は、投与するステップに先立ち、懸濁物を撹拌して、懸濁物の均一な分布を確実にするステップをさらに含む。一部の場合には、方法は、投与するステップに先立ち、薬学的組成物を室温に温めるステップをさらに含む。

他の態様では、カプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間に挿入されるアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ、およびアフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２バリアントをさらに含む懸濁物を含む薬学的組成物。一部の場合には、核酸配列は、配列番号２の配列を含む。一部の場合には、組成物の単位用量は、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む。一部の場合には、薬学的組成物の単位用量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の場合には、キットは、懸濁物薬学的組成物および薬学的組成物を希釈するための溶液を含む。一部の場合には、薬学的組成物は、１ｍＬ以下を含む。一部の場合には、薬学的組成物は、０．５～１．０ｍＬ以下を含む。一部の場合には、薬学的組成物は、０．５ｍＬ未満またはそれと等量を含む。一部の場合には、キットの溶液は、緩衝液、塩、アルコール、界面活性物質またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の場合には、キットは、シリンジを含む。

他の態様では、眼の状態または疾患を処置する方法は、冷蔵された懸濁物を撹拌するステップであって、懸濁物が、カプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間に挿入されるアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ、およびアフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２バリアントを含む、ステップと；硝子体内注射を通してヒト被験体の眼に冷蔵された懸濁物の容量を投与するステップとを含む。一部の場合には、被験体は、アフリベルセプトで前処置されていることによって特徴付けられる。一部の場合には、被験体は、アフリベルセプトに応答性である。一部の場合には、冷蔵された懸濁物は、１ｍＬ以下の溶液を含む。一部の場合には、冷蔵された懸濁物は、０．５ｍＬ以下を含む。一部の場合には、被験体に投与される容量は、５０μＬ以下である。一部の場合には、被験体に投与される容量は、１００μＬ以下である。一部の場合には、容量は、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムの単位用量を含む。一部の場合には、容量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムの単位用量を含む。一部の場合には、投与するステップは、少なくとも２年間で１回以下行われる。一部の場合には、投与するステップは、１度限りの注射である。一部の場合には、方法は、組成物を投与する前にアフリベルセプトに対する応答性について被験体をアッセイするステップをさらに含む。一部の場合には、懸濁物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の場合には、賦形剤は、界面活性物質または安定剤を含む。一部の場合には、界面活性物質は、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される。一部の場合には、薬学的に許容される賦形剤は、フェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含む。一部の場合には、眼の状態または疾患は、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である。一部の場合には、眼の状態または疾患は、脈絡膜新血管形成または滲出型ＡＭＤである。一部の場合には、方法は、投与の前に懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
眼の状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする霊長類被験体の眼に硝子体内注射によって、単位用量の薬学的組成物を投与するステップを含み、前記薬学的組成物は：
（ａ）カプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間に挿入されるアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ、およびアフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２バリアント、ならびに
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、方法。
（項目２）
前記眼の状態または疾患が、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記眼の状態または疾患が、脈絡膜新血管形成または滲出型ＡＭＤである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記単位用量が、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、項目１～３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記単位用量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、項目１～３のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記単位用量が、１００μＬ以下の容量を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記単位用量が、５０μＬ以下の容量を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記被験体が、非ヒト霊長類である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記被験体が、ヒトである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記被験体が、アフリベルセプトに応答性である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記被験体が、アフリベルセプトで前処置されている、項目１に記載の方法。
（項目１２）
硝子体内注射による前記投与が、少なくとも２年間で１回以下行われる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
硝子体内注射による前記投与が、少なくとも５年間で１回以下行われる、項目１に記載の方法。
（項目１４）
硝子体内注射による前記投与が、１度限りの投与である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記薬学的組成物が、懸濁物である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記投与するステップに先立ち、前記懸濁物を撹拌して、前記懸濁物の均一な分布を確実にするステップをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記投与するステップに先立ち、前記薬学的組成物を室温に温めるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
カプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間に挿入されるアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ、およびアフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２バリアントを含む懸濁物を含む薬学的組成物。
（項目１９）
前記核酸配列が、配列番号２の配列を含む、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２０）
前記組成物の単位用量が、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２１）
前記薬学的組成物の単位用量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２のベクターゲノムを含む、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２２）
項目１８に記載の薬学的組成物および前記薬学的組成物を希釈するための溶液を含むキット。
（項目２３）
前記薬学的組成物が、１ｍＬ以下を含む、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
前記薬学的組成物が、０．５～１．０ｍＬ以下を含む、項目２２に記載のキット。
（項目２５）
前記薬学的組成物が、０．５ｍＬ未満またはそれと等量を含む、項目２２に記載のキット。
（項目２６）
前記溶液が、緩衝液、塩、アルコール、界面活性物質またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目２２に記載のキット。
（項目２７）
シリンジをさらに含む、項目２２に記載のキット。
（項目２８）
眼の状態または疾患を処置する方法であって、
（ａ）冷蔵された懸濁物を撹拌するステップであって、前記懸濁物が、カプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間に挿入されるアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ、およびアフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２バリアントを含む、ステップと、
（ｂ）硝子体内注射を通してヒト被験体の眼に、ある容量の前記冷蔵された懸濁物を投与するステップと
を含む方法。
（項目２９）
前記被験体が、アフリベルセプトで前処置されていることによって特徴付けられる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記被験体が、アフリベルセプトに応答性である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記冷蔵された懸濁物が、１ｍＬ以下の溶液を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記冷蔵された懸濁物が、０．５ｍＬ以下を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記被験体に投与される前記容量が、５０μＬ以下である、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
前記被験体に投与される前記容量が、１００μＬ以下である、項目２８に記載の方法。
（項目３５）
前記容量が、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムの単位用量を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３６）
前記容量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムの単位用量を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３７）
前記投与するステップが、少なくとも２年間で１回以下行われる、項目２８に記載の方法。
（項目３８）
前記投与するステップが、１度限りの注射である、項目２８に記載の方法。
（項目３９）
前記組成物を投与する前にアフリベルセプトへの応答性について前記被験体をアッセイするステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目４０）
前記懸濁物が、薬学的に許容される賦形剤を含む、項目２８に記載の方法。
（項目４１）
前記賦形剤が、界面活性物質または安定剤を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記界面活性物質が、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記薬学的に許容される賦形剤がフェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記眼の状態または疾患が、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である、項目２８に記載の方法。
（項目４５）
前記眼の状態または疾患が、脈絡膜新血管形成または滲出型ＡＭＤである、項目２８に記載の方法。
（項目４６）
投与の前に前記懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。

参照による組込み
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれていると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。

本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に示される。本発明の特徴および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および付随する図の参照によって得られる。

図１は、処置なしのレーザー照射によるＣＮＶ病変の誘導の後の、霊長類（アフリカミドリザル）の眼の例示的な眼底画像を図示する。４００ｍＷで処理した中央のスポット以外の全てのスポットについて７５０ｍＷ、５０μｍ、１００ｍｓのレーザー照射を使用した単一のレーザー適用によって、９つの病変を誘導した。レーザー病変を記録するために、レーザー照射の直後にカラー眼底写真撮影を実行した。

図２は、緩衝液だけを含むビヒクル対照またはＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトのいずれかによる硝子体内（ＩＶＴ）注射後、７０日目における蛍光血管造影の代表的な眼底画像を図示する。ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトで処置したサルは、ビヒクル対照だけを注射したサルより少ないグレードＩＶ病変およびより低くグレード分けされた病変を示した。

図３は、緩衝液だけを含むビヒクル対照と比較したときの、陽性対照として使用したＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）の硝子体内注射の後の、サルにおけるパーセントグレードＩＶ ＣＮＶ病変を図示する。ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）処置は、１４日目（薄灰色バー）および２８日目（暗灰色バー）に収集した眼底画像に基づく、ビヒクル対照と比較したグレードＩＶ病変の量の顕著な減少を示した。

図４は、硝子体内注射後の１４日目（薄灰色バー）および２８日目（暗灰色バー）の、ビヒクル対照、ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトまたはＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１の硝子体内注射で処置したサルにおけるパーセントグレードＩＶ ＣＮＶ病変を図示する。硝子体内のＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプト注射で処置したサルは、図３に図示した陽性対照の結果と同様に、１４日目および２８日目にビヒクル対照で処置したサルと比較して、グレードＩＶ病変の量の顕著な減少を示した。ＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１の硝子体内注射による処置は、ビヒクル対照と比較してグレードＩＶ病変のいかなる顕著な低減も示さなかった。

図５は、アフリベルセプトの核酸配列を図示する。

図６は、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１（ｓＦｌｔ－１またはｓＶＥＧＦＲ－１）の核酸配列を図示する。ｓＶＥＧＦＲ－１は、ＶＥＧＦ受容体１のスプライスバリアントである。

いくつかの態様について、例証のために実例適用を参照しつつ後述する。本明細書に記載されている特色の十分な理解が得られるように、多数の具体的詳細、関係性および方法を示していることを理解されたい。しかし、関連技術分野における当業者であれば、このような具体的詳細のうち１種もしくは複数を用いずに、または他の方法を用いて、本明細書に記載されている特色を実施することができることを直ちに認識するであろう。一部の行為は、異なる順序でおよび／または他の行為もしくは事象と同時発生的に行われ得るため、本明細書に記載されている特色は、行為または事象の例証されている順序付けによって限定されない。さらに、例証されている行為または事象の全てが、本明細書に記載されている特色に従って方法論を実行することを要求されているとは限らない。

本開示は、眼疾患または状態の処置または予防の薬学的組成物および方法であって、霊長類（例えば、サルまたはヒト）の眼への硝子体内注射により、アフリベルセプト、その機能的断片もしくはバリアントをコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含む遺伝子療法、ベクターまたは構築物を投与するステップを含む方法に関する。アフリベルセプト、その機能的断片もしくはバリアントの核酸配列を含む遺伝子療法、ベクターまたは構築物の硝子体内注射の際に、核酸配列はｉｎ ｖｉｖｏで、例えば網膜細胞で発現され、アフリベルセプト融合タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントを生成し、それは治療効果をもたらす。

一部の実施形態では、アフリベルセプトを含む遺伝子療法、ベクターまたは構築物は、霊長類またはヒト被験体における、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および／またはＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）、網膜静脈閉塞、または新血管形成（例えば、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ））を含む任意の他の関連する眼疾患もしくは状態を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の眼疾患または状態を処置または予防するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、アフリベルセプト（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標））に応答性である眼疾患または状態を処置するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、現在の標準治療に応答性である、またはＡＭＤ、ＲＶＯ、ＤＭＥもしくはＤＭＥ患者におけるＤＲのための承認された療法の少なくとも１つ、例えばアフリベルセプト注射、ラニビズマブ注射もしくはベバシズマブ注射に応答性である眼疾患または状態を処置するために使用される。

一部の実施形態では、アフリベルセプトと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同であるタンパク質もしくはポリペプチド、またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする核酸配列を含む、遺伝子療法に適合するまたは適する薬学的組成物、例えば、バリアントまたは修飾カプシドタンパク質ＶＰ１、例えば７ｍ８カプシドバリアントを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、硝子体内または網膜下に投与することによる。そのような相同性は、アフリベルセプトの核酸配列、アミノ酸配列、空間コンフォメーションまたはタンパク質構造に基づくことができる。

アフリベルセプトのタンパク質配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋデータベース、受託番号ＤＢ０８８８５で公開されている。一部の実施形態では、米国特許出願公開第２０１４／０３７１４３８号に開示されるように、アフリベルセプトは、融合タンパク質をコードする核酸配列を指す（図５）。

タンパク質注射と比べた遺伝子療法の１つの利点は、遺伝子療法が治療剤（例えば、アフリベルセプト）の長期のまたは継続した放出を提供すること、および、一部の実施形態では、複数のまたは反復の注射を必要としないことである。アフリベルセプトのこの長期のまたは持続性の放出は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現され治療効果をもたらす、アフリベルセプト融合タンパク質をコードする核酸配列の送達から生じる。一部の実施形態では、網膜細胞に送達される異種核酸からのアフリベルセプトの発現は、少なくとも１年間にわたって、１年間より長期にわたって、少なくとも２、３、４、５、１０年間またはそれよりも長い年数にわたって継続し得る。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、眼の標的細胞または組織（例えば、網膜細胞）のその感染力を増加させるカプシドバリアントタンパク質を含むことができ、ある期間にわたって（例えば、少なくとも１、１．５、２、３、４、５、１０年間またはそれよりも長い年数にわたって）治療用導入遺伝子を発現させることができる標的細胞または組織への、治療用導入遺伝子、例えばアフリベルセプト融合タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする核酸配列のより効率的な送達を可能にする。本明細書に開示される遺伝子療法は、目的の特異的組織または細胞型、例えば光受容細胞を標的とすることができ、このことは、オフターゲット効果を最小にするのを助ける、またはアフリベルセプトなどの治療用導入遺伝子のより多くの標的化送達をｉｎ ｖｉｖｏで提供することができる。

ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子療法によるアフリベルセプトの長期のまたは持続性の送達により、アフリベルセプト、その機能的断片、変異体またはバリアントをコードする核酸配列を含む薬学的組成物を、現在の標準治療（例えば、タンパク質注射または遺伝子療法に基づかない処置）と比較してある期間内により少ない用量で投与することができるだろう。一部の実施形態では、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含む遺伝子療法の投与される用量の総数は、少なくとも１．５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、少なくとも６年間、少なくとも７年間、少なくとも８年間、少なくとも９年間または少なくとも１０年間で１単位用量以下である。一部の実施形態では、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含む遺伝子療法の投与は、１度限りまたは患者の一生において一度である。一部の実施形態では、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含む遺伝子療法の１度限りの投与は、１年間を超えて、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年間を超えて持続する治療効果を患者においてもたらすことができる。一部の実施形態では、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含む遺伝子療法は、少なくとも２年間もしくはそれよりも長い、少なくとも３年間もしくはそれよりも長い、少なくとも４年間もしくはそれよりも長い、少なくとも５年間もしくはそれよりも長い、少なくとも６年間もしくはそれよりも長い、少なくとも７年間もしくはそれよりも長い、少なくとも８年間もしくはそれよりも長い、少なくとも９年間もしくはそれよりも長い、または少なくとも１０年間もしくはそれよりも長い年数で１回以下患者に投与される。一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列を含む遺伝子療法は、アフリベルセプトに応答性である、または本明細書に開示される遺伝子療法を受ける前にＥＹＬＥＡ（登録商標）による前処置を受けた患者に投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子療法（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプト）を受ける患者は、遺伝子療法を受けてから少なくとも２、３、４、５、１０年間またはそれよりも長い年数が経過した後に、アフリベルセプト、ラニビズマブおよび／またはベバシズマブによる療法を必要に応じて開始することができる。一部の実施形態では、患者が本明細書に開示される遺伝子療法による処置を受けた後に、抗ＶＥＧＦ療法は必要でない。

一部の実施形態では、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含む遺伝子療法の１度限りの投与は、患者が１年間より長く、１．５年間より長く、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間より長くＥＹＬＥＡ（登録商標）注射を受ける必要性をなくす。一部の実施形態では、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列を含む遺伝子療法の硝子体内注射を受ける患者は、患者の残りの人生の間にアフリベルセプトのいかなる追加の注射も必要としない。他の実施形態では、７ｍ８－アフリベルセプト遺伝子療法の１度限りの硝子体内注射を受ける患者は、遺伝子療法を受けてから少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間またはそれよりも長い年数の後に、アフリベルセプト、ラニビズマブおよび／またはベバシズマブのいずれか１つによる療法を必要に応じて開始することができる。

本開示の用語法は、単に特定の事例の記載を目的としており、本開示の組成物、方法および組成物の限定を意図するものではない。

本明細書に記載されている本開示の組成物および方法は、他に断りがなければ、当業者の技能範囲内で分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、免疫化学および眼科技法の従来技法および記載を用いることができる。斯かる従来技法は、被験体における網膜または視覚の観察および解析、組換えウイルスのクローニングおよび繁殖、薬学的組成物の製剤化、ならびに生化学的精製および免疫化学のための方法を含む。適した技法の具体的例証は、本明細書における実施例の参照により得ることができる。しかし、当然ながら等価な従来手順を使用することもできる。斯かる従来技法および記載は、Greenら
編、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series（Ｉ～ＩＶ巻）（１９９９年）；Weinerら編、Genetic Variation: A Laboratory Manual（２００７年）；Dieffenbach, Dveksler編、PCR Primer: A Laboratory Manual（２００３年）；BowtellおよびSambrook、DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual（２００３年）；Mount、Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis（２００４年）；SambrookおよびRussell、Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２００６年）；ならびにSambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２００２年）（全てCold Spring Harbor Laboratory Pressより）；Stryer, L.、Biochemistry（第４版）W.H. Freeman, N.Y.（１９９５年）；Gait「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」IRL Press, London（１９８４年）；NelsonおよびCox、Lehninger, Principles of Biochemistry、第３版、W.H. Freeman Pub., New York（２０００年）；ならびにBergら、Biochemistry、第５版、W.H. Freeman Pub., New York（２００２年）等の標準研究室マニュアルに見出すことができ、これらの全ては、あらゆる目的のためにこれらの全体を参照により本明細書に組み込む。

一部の実施形態では、（ａ）（ｉ）５８７位および５８８位の間にＬＧＥＴＴＲＰ挿入を含み、対応する非バリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して眼性細胞の感染力の増加を付与するバリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質；および（ｉｉ）アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする異種核酸配列を含む遺伝子療法のために適合させた組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ２）ビリオン；ならびに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、コードされる遺伝子産物は、アフリベルセプトと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する融合タンパク質またはポリペプチドである。

処置のためにアフリベルセプトが適応となるまたは承認されている眼の状態または疾患を処置する方法であって、遺伝子療法に、すなわち、本明細書に記載されるアフリベルセプトをコードする核酸配列を硝子体内注射によって被験体の眼にｉｎ ｖｉｖｏで送達するために適合させた薬学的製剤を投与するステップを含む方法も本明細書に開示される。

凍結乾燥することができるまたは懸濁物形態で供給することができるアフリベルセプトに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する融合タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子療法またはベクターを含む薬学的組成物も本明細書に開示される。一部の実施形態では、薬学的組成物の凍結乾燥された形態または懸濁物は、それぞれ薬学的組成物を再構成するためのまたは希釈のための緩衝液と一緒にキットで提供される。

冷蔵された懸濁物として供給されるアフリベルセプトに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する融合タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子療法またはベクターを含む薬学的組成物も本明細書に開示される。一部の実施形態では、薬学的組成物の冷蔵された懸濁物は、薬学的組成物を希釈するための緩衝液と一緒にキットで提供される。

脈絡膜新血管形成を低減するための遺伝子療法のために適合させた組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、（ａ）ＡＡＶ２の５８７と５８８の間のアミノ酸位置に挿入されるアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰのペプチド挿入を含むバリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質であって、ペプチド挿入が、対応する非バリアントまたは無修飾ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して眼性細胞の感染力の増加を付与する、バリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質；（ｂ）アフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドもしくは治療用導入遺伝子またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする異種核酸配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンも本明細書に開示される。

眼の状態または疾患を処置する方法であって、遺伝子療法および本明細書に記載されるアフリベルセプトまたはその機能的断片もしくはバリアントを発現する核酸配列のヒト被験体の眼へのｉｎ ｖｉｖｏ送達のために適合させたｒＡＡＶビリオンを投与するステップを含み、ヒト被験体が、新血管形成と関連した眼の状態を以前に診断されている、方法も本明細書に開示される。一部の実施形態では、アフリベルセプト遺伝子療法は、アフリベルセプトに応答性である、またはＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）で前処置された患者に投与される。

一部の実施形態では、（ａ）（ｉ）ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸挿入を含み、対応する非バリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、網膜細胞（例えば、光受容細胞または網膜色素上皮）への感染力の増加を付与するバリアントＡＡＶカプシドタンパク質；および（ｉｉ）アフリベルセプトをコードする異種核酸配列を含む遺伝子療法のために適合させた組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン；ならびに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む方法および薬学的製剤が本明細書に開示される。一部の実施形態では、コードされる遺伝子産物は、アフリベルセプトと少なくとも８０％の相同性を有する融合タンパク質もしくはポリペプチド、またはその機能的断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、本明細書に開示される薬学的組成物における凝集を防止する界面活性物質（例えば、非イオン性界面活性物質、プルロニック、ポロキサマーまたはポリソルベート）を含む。

他に定められていなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意義を有する。

本明細書で使用されている用語法は、単に特定の事例の記載を目的としており、限定を意図するものではない。本明細書において、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、複数形も同様に含むことが意図される。さらに、用語「含むこと（including）」、「含む（includes）」、「有していること（having）」、「有する（has）」、「備える（with）」またはこれらの異形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される程度まで、斯かる用語は、用語「含むこと（comprising）」と同様の様式で包括的であることが意図される。用語「含むこと（comprising）」は、本明細書において、「含むこと（including）」または「含有すること（containing）」と同義であり、包括的またはオープンエ
ンドである。

本明細書における「または」のいずれかの参照は、特に明記しない限り「および／または」を包含することが意図される。本明細書において、用語「約」がつく数は、この数プラス・マイナス１０％の数を指す。用語「約」がつく範囲は、その最小値のマイナス１０％およびその最大値のプラス１０％の範囲を指す。

用語「被験体」、「患者」または「個体」は、サル、例えばアフリカミドリザルおよびアカゲザルなどの非ヒト霊長類ならびにヒトを含む霊長類を指す。好ましい実施形態では、被験体はヒトまたはヒト患者である。

用語「処置する」、「処置すること」、「処置」、「好転させる（ameliorate）」または「好転させること」および他の文法的等価物は、本明細書において、疾患もしくは状態症状を軽減すること、緩解することもしくは好転させること、追加的な症状を予防すること、症状の根底にある代謝的原因を好転させるもしくは予防すること、疾患もしくは状態を阻害すること、例えば、疾患もしくは状態の発症を止めること、疾患もしくは状態を緩和すること、疾患もしくは状態の退縮を引き起こすこと、疾患もしくは状態に起因する状態を緩和すること、または疾患もしくは状態の症状を停止することを含み、予防法を含むことが意図される。この用語は、治療利益および／または予防利益を達成することをさらに含む。治療利益とは、処置されている根底にある疾患の根絶または好転を意味する。また、治療利益は、一部の実施形態では、患者が依然として根底にある疾患を患っているにもかかわらず、患者に改善が観察されるように、根底にある疾患に関連する生理的症状のうち１種または複数の根絶または好転により達成される。予防利益のため、疾患の診断が為されていなかったとしても、薬学的組成物が、特定の疾患の発症リスクがある患者または疾患の生理的症状のうち１種もしくは複数を報告する患者に投与される。

用語「投与する」、「投与すること」、「投与」その他は、本明細書において、生物学的作用の所望の部位への治療薬または薬学的組成物の送達を可能にするために使用される方法を指すことができる。このような方法は、眼への硝子体内または網膜下注射を含む。

用語「有効量」、「治療有効量」または「薬学的に有効な量」は、本明細書において、処置されている疾患または状態の症状のうち１種または複数をある程度まで緩和するであろう、投与されている少なくとも１種の薬学的組成物または化合物の十分な量を指すことができる。

用語「薬学的に許容される」は、本明細書において、本明細書に開示されている化合物の生物学的活性または特性を抑止しない、比較的無毒性の担体または希釈剤等の材料を指すことができる（すなわち、材料が個体に投与されたときに、望ましくない生物学的効果も引き起こさず、これが含有されている組成物の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用しない）。

用語「薬学的組成物」または単純に「組成物」は、本明細書において、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤その他等が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種の薬学的に許容される化学的構成成分と任意選択で混合された、生物学的に活性な化合物を指すことができる。

「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書において、典型的には、細胞の遺伝的形質転換の目的の配列である、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、治療用導入遺伝子、例えば、アフリベルセプトをコードする核酸配列等、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド）を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１個、一般に、２個のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。

「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１種のＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）およびポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されたウイルス粒子を指す。粒子は、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、典型的に、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単純に「ｒＡＡＶベクター」と称される。よって、ｒＡＡＶ粒子の産生は、ｒＡＡＶベクターの産生を必然的に含むが、これは、斯かるベクターが、ｒＡＡＶ粒子内に含有されるからである。

用語「パッケージング」は、本明細書において、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリおよびカプシド形成をもたらし得る一連の細胞内事象を指すことができる。

ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書において、ＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。

用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質および天然に存在しないタンパク質（例えば、融合タンパク質）の両方、これらのペプチド、断片、変異体、誘導体およびアナログを包含することができる。ポリペプチドは、単量体、二量体、三量体またはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、それぞれ１種または複数の別個の活性を有する、多数の異なるドメインを含むことができる。疑わしさをなくすため、「ポリペプチド」は、２アミノ酸を超えるいずれかの長さであり得る。

本明細書において、「ポリペプチドバリアント」または単純に「バリアント」は、その配列がアミノ酸修飾を含有するポリペプチドを指す。一部の実例では、修飾は、ネイティブまたは野生型タンパク質等、参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較した、１個または複数のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配列または置換であり得る。バリアントは、参照タンパク質の配列における、ある位置における単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変化された、１個または複数のアミノ酸点置換、１個または複数のアミノ酸がそれぞれ挿入または欠失された、１個または複数の挿入および／または欠失、および／またはアミノまたはカルボキシ末端のいずれか一方または両方におけるアミノ酸配列のトランケーションを有することができる。バリアントは、参照タンパク質または無修飾タンパク質と比較して、同じまたは異なる生物学的活性を有することができる。

一部の実施形態では、バリアントは、例えばその対応する参照タンパク質と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の全体的配列相同性を有することができる。一部の実施形態では、バリアントは、野生型タンパク質と少なくとも約９０％の全体的配列相同性を有することができる。一部の実施形態では、バリアントは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％または少なくとも約９９．９％の全体的配列同一性を示す。

本明細書において、「組換え」は、（１）その天然に存在する環境から除去された、（２）天然では当該遺伝子が見出されるポリヌクレオチドの全体もしくは部分と会合していない、（３）天然ではそれが連結されていないポリヌクレオチドに操作可能に連結されている、または（４）天然では発生しない、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質を指すことができる。用語「組換え」は、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、ならびに斯かる核酸によってコードされるタンパク質および／またはｍＲＮＡを参照して使用することができる。よって、例えば、微生物によって合成されるタンパク質は、例えば、細胞に存在する組換え遺伝子から合成されたｍＲＮＡから合成される場合、組換えである。

「操作可能に連結された」または「作動可能に連結された」または「カップリングされた」は、遺伝的エレメントの近位を指すことができ、これらのエレメントは、予想される様式での操作を可能にする関係性にある。例えば、プロモーターが、コード配列の転写開始に役立つ場合、プロモーターは、コード領域に操作可能に連結され得る。この機能的関係性が維持される限りにおいて、プロモーターおよびコード領域の間に介在残基が存在していてもよい。

用語「発現ベクター」または「発現構築物」または「カセット」または「プラスミド」または単純に「ベクター」は、配列をコードする核酸の一部または全体が転写され得、遺伝子療法に適応される、遺伝子産物をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有するＡＡＶまたはｒＡＡＶベクターを含む、いずれかの種類の遺伝的構築物を含むことができる。転写物は、タンパク質へと翻訳され得る。一部の事例では、転写物は、部分的に翻訳され得るまたは翻訳されない。ある特定の態様では、発現は、遺伝子の転写と、ｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の態様では、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。発現ベクターは、標的細胞におけるタンパク質の発現を容易にするために、コード領域に操作可能に連結された制御エレメントを含むこともできる。制御エレメント、および発現のために制御エレメントが作動可能に連結される遺伝子（単数または複数）の組み合わせは、時に「発現カセット」と称されることがあり、発現カセットの多数が、本技術分野で公知であり利用できる、または本技術分野で利用できる構成成分から直ちに構築することができる。

用語「異種」は、それが比較されている実体の残りとは遺伝子型として別個の実体を指すことができる。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに遺伝子操作技法によって導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドであり得る。そのネイティブコード配列から除去され、それと連結した状態で天然に見出されないコード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターであり得る。

本明細書において、「７ｍ８」は、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰを指す。

「７ｍ８バリアント」は、カプシドタンパク質の溶媒曝露ＧＨループにアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰが挿入された、いずれかの血清型のものであり得るｒＡＡＶを指す。

７ｍ８がｒＡＡＶ２に挿入される場合（ＡＡＶ２．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ２カプシドタンパク質の位置５８７および５８８の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ１に挿入される場合（ＡＡＶ１．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ５に挿入される場合（ＡＡＶ５．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のアミノ酸５７５および５７６の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ６に挿入される場合（ＡＡＶ６．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ６カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ６カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ７に挿入される場合（ＡＡＶ７．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ７カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ７カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ８に挿入される場合（ＡＡＶ８．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ９に挿入される場合（ＡＡＶ９．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８および５８９の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ１０に挿入される場合（ＡＡＶ１０．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間に挿入される。

本明細書で使用されるセクション見出しは体系づけだけが目的であり、記載される主題を限定するものと解釈するべきでない。

ベクター
一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物および方法は、それを必要とするヒト被験体または患者（例えば、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ＤＭＥと診断された患者）における網膜細胞への、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）の送達をもたらす。ｒＡＡＶまたはウイルスベクター等の送達系を使用した患者への治療用導入遺伝子の核酸の送達は、遺伝子療法とも称される。

一部の実施形態では、アフリベルセプト核酸配列の送達は、任意の適する「ベクター」（「遺伝子送達」または「遺伝子移入ビヒクル」とも呼ばれる）を使用して実行することができる。ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子移入ビヒクルは、標的細胞、例えば網膜細胞、例えば光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞または網膜色素上皮細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、任意の適する高分子または分子の複合体を包含することができる。一部の場合には、標的細胞は、核酸分子または遺伝子が送達される任意の細胞であってよい。送達されるポリヌクレオチドは、アフリベルセプト導入遺伝子などの治療用導入遺伝子のコード配列を含むことができる。

本開示の組成物および方法は、非ヒト霊長類またはヒト被験体の眼または網膜細胞への抗アフリベルセプト核酸配列の送達のためのいずれか適した方法を提供する。一部の事例では、核酸分子、ポリヌクレオチドまたは遺伝子療法の送達は、非ヒト霊長類またはヒト被験体の眼への硝子体内注射のために製剤化または適応される。

一部の実施形態では、適したベクターとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクター、リポソーム、脂質含有複合体、ナノ粒子、および網膜細胞にポリヌクレオチドを送達することができる他の高分子複合体が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結した強力な真核生物プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたは構成的プロモーターを含む。

一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の核酸分子を組み込む組換えウイルスベクターを含む。本明細書に記載されるように、核酸は、ポリヌクレオチドを指す。核酸およびポリヌクレオチドは、互換的に使用することができる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の場合には、核酸には、アフリベルセプトの発現のためのＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡが含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、目的の遺伝子（例えば、アフリベルセプト）、イントロン、非翻訳領域（ＵＴＲ）、終止配列の転写物などを含むことができる。他の実施形態では、ＤＮＡは、プロモーター配列、目的の遺伝子（例えばアフリベルセプト）、ＵＴＲ、終止配列などの配列を含むことができるがこれらに限定されない。一部の場合には、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを使用することができる。

一部の実施形態では、本開示は、被験体におけるアフリベルセプトの送達および発現のためのベクターとして、組換えウイルス、例えば組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法での使用のために、任意の適するウイルスベクターを操作するまたは最適化することができる。例えば、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する組換えウイルスベクターは、それがヒトまたは霊長類被験体において複製欠損であるように変更することができる。一部の実施形態では、当業者に公知である方法を使用してハイブリッドウイルスベクター系を得て、アフリベルセプトをコードする核酸を網膜細胞に送達するために使用することができる。一部の実施形態では、ウイルス送達系または遺伝子療法は、アフリベルセプト遺伝子を含む核酸配列を標的細胞ゲノム（例えば、網膜細胞のゲノム）に組み入れ、時間をわたり遺伝子の安定した遺伝子発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、アフリベルセプト遺伝子は、標的細胞ゲノムに組み入れられず、標的細胞に導入されるプラスミドまたはベクターから発現される。

一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列を網膜細胞に送達するのに適するウイルスベクターはＡＡＶまたはｒＡＡＶであり、それらは小さい非エンベロープ型の一本鎖ＤＮＡウイルスである。ｒＡＡＶは非病原性ヒトパルボウイルスであり、複製のために、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびＣＭＶを含むヘルパーウイルスに依存性にすることができる。野生型（ｗｔ）ＡＡＶへの曝露は、いかなるヒト病理にも関連していない、またはそれを引き起こすことも知られておらず、一般的な集団においてありふれており、ＡＡＶまたはｒＡＡＶを遺伝子療法のために適する送達系にする。治療用導入遺伝子、例えばアフリベルセプトの送達のために遺伝子療法で使用されるＡＡＶおよびｒＡＡＶは、任意の血清型であってよい。一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物および方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪおよびその任意のハイブリッドまたはキメラＡＡＶを含む、任意の適するＡＡＶ血清型の使用をもたらす。一部の実施形態では、使用される血清型は、ウイルスの親和性または目的の標的細胞の感染力に基づく。一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列を硝子体内または網膜下注射を通して被験体の眼または網膜細胞に送達するために、ＡＡＶ２またはｒＡＡＶ２が使用される。一部の実施形態では、被験体の網膜細胞にアフリベルセプトの核酸配列を送達するために、ｒＡＡＶ２．７ｍ８が使用される。

一部の実施形態では、被験体において網膜細胞の形質導入を増加させるために、または網膜細胞への遺伝子送達の標的化を増加させるために、標的細胞、例えば網膜細胞への増加した感染力を有するバリアントカプシドタンパク質を含むＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルス、粒子またはビリオンが使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドタンパク質ＧＨループ／ループＩＶにおけるアミノ酸修飾を含む。一部の場合には、修飾部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループ／ループＩＶの溶媒露出部分である。ＡＡＶカプシドのＧＨループ／ループＩＶの記載については、例えば、van Vlietら（２００６年）Mol. Ther.１４巻：８０９頁；Padronら（２００５年）J. Virol.７９巻：５０４７頁；およびShenら（２００７年）Mol. Ther.１５巻：１９５５頁を参照。７ｍ８バリアントを含む、いくつかのＡＡＶカプシドバリアントが公知である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してカプシドタンパク質のＧＨループに５アミノ酸～１１アミノ酸、例えば７アミノ酸の配列の挿入を含む、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含み、バリアントカプシドタンパク質は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞への感染力と比較して増加した網膜細胞への感染力を付与する。一部の実施形態では、以下のアミノ酸配列のいずれか１つを、カプシドタンパク質のＧＨループに挿入することができる：ＬＧＥＴＴＲＰ（７ｍ８）、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮ。一部の実施形態では、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（７ｍ８）、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮのいずれか１つが、ｒＡＡＶのＶＰ１カプシドタンパク質の溶媒曝露ＧＨループに挿入される。一部の実施形態では、アフリベルセプトを含むｒＡＡＶ．７ｍ８が、遺伝子療法のために使用される。

一部の実施形態では、次のアミノ酸配列：ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮのうちいずれか１種を、次の位置に挿入して、遺伝子療法における使用のためのｒＡＡＶバリアントを生成することができる：ＡＡＶ２カプシドタンパク質の位置５８７および５８８の間；ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間；ＡＡＶ５カプシドタンパク質のアミノ酸５７５および５７６の間；ＡＡＶ６カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間；ＡＡＶ７カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間；ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間；ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８および５８９の間；またはＡＡＶ１０カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間。

一部の実施形態では、アフリベルセプト等の遺伝子産物をコードする核酸は、遺伝子の転写を開始するプロモーターによる転写制御下に置くことができる。一部の実施形態では、プロモーターは、「強力な」または構成的に活性なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態では、コネキシン３６プロモーターを使用して、治療用導入遺伝子、例えば、アフリベルセプトの発現を駆動する。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターを使用して、網膜細胞等の特異的組織または細胞における転写をもたらして、非標的化細胞に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を低下させることができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスの生成に使用される組換えウイルスおよび／またはプラスミドは、ポリＡ（ポリアデニル化）配列、非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲまたは終結配列等、他の転写または調節エレメントを含むことができる。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多いタンパク質の同時発現を可能にするまたは多重遺伝子もしくはポリシストロニックｍＲＮＡをもたらす配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または同様のエレメントを使用して、ベクターまたはプラスミドから２種以上の遺伝子を発現させることができる。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスを生成するために使用されるｒＡＡＶおよび／またはプラスミドは、以下の核酸エレメントを含む：第１のＩＴＲ配列；プロモーター配列；イントロン配列；第１のＵＴＲ配列；アフリベルセプトをコードする配列；第２のＵＴＲ配列；ポリＡ配列；および第２のＩＴＲ配列。一部の実施形態では、これらの核酸エレメントの各々の間でリンカー配列が使用される。一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードする配列は、アフリベルセプト融合タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。

一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定される。一部の場合には、この開示の組換えウイルスの単位用量は、１×１０^１０～２×１０^１０の間、２×１０^１０～３×１０^１０の間、３×１０^１０～４×１０^１０の間、４×１０^１０～５×１０^１０の間、５×１０^１０～６×１０^１０の間、６×１０^１０～７×１０^１０の間、７×１０^１０～８×１０^１０の間、８×１０^１０～９×１０^１０の間、９×１０^１０～１０×１０^１０の間、１×１０^１１～２×１０^１１の間、２×１０^１１～３×１０^１１の間、３×１０^１１～４×１０^１１の間、４×１０^１１～５×１０^１１の間、５×１０^１１～６×１０^１１の間、６×１０^１１～７×１０^１１の間、７×１０^１１～８×１０^１１の間、８×１０^１１～９×１０^１１の間、９×１０^１１～１０×１０^１１の間、１×１０^１２～２×１０^１２の間、２×１０^１２～３×１０^１２の間、３×１０^１２～４×１０^１２の間、４×１０^１２～５×１０^１２の間、５×１０^１２～６×１０^１２の間、６×１０^１２～７×１０^１２の間、７×１０^１２～８×１０^１２の間、８×１０^１２～９×１０^１２の間、９×１０^１２～１０×１０^１２の間、１×１０^１３～２×１０^１３の間、２×１０^１３～３×１０^１３の間、３×１０^１３～４×１０^１３の間、４×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～６×１０^１３の間、６×１０^１３～７×１０^１３の間、７×１０^１３～８×１０^１３の間、８×１０^１３～９×１０^１３の間、または９×１０^１３～１０×１０^１３の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、この開示のｒＡＡＶは、約２．１×１０^１２のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶは、２Ｅ１２～６Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、この開示のｒＡＡＶは、１０^１０～１０^１３の間、１０^１０～１０^１１の間、１０^１１～１０^１２の間、１０^１２～１０^１３の間、１０^１３～１０^１４の間、２×１０^１１～４×１０^１１の間、３×１０^１１～５×１０^１１の間、４×１０^１１～６×１０^１１の間、５×１０^１１～７×１０^１１の間、６×１０^１１～８×１０^１１の間、７×１０^１１～９×１０^１１の間、８×１０^１１～１０×１０^１１の間、１×１０^１２～３×１０^１２の間、２×１０^１２～４×１０^１２の間、３×１０^１２～５×１０^１２の間、４×１０^１２～６×１０^１２の間、５×１０^１２～７×１０^１２の間、６×１０^１２～８×１０^１２の間、７×１０^１２～９×１０^１２の間、８×１０^１２～１０×１０^１２の間、１×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～１０×１０^１３の間、１０^１２～５×１０^１２の間、または５×１０^１２～１×１０^１３の間のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、凝集を回避するために、ベクターゲノムのより低い量または範囲が単位用量のために選択される。一部の実施形態では、注射のためにより小さい容量を使用することができるように、ベクターゲノムのより高い量または範囲が単位用量のために選択される。より小さい容量（例えば、５０、４０、３０、２０、１０または５μＬ未満）の注射は、眼圧の変化および硝子体内注射に関連した他の有害作用を低減するのを助けることができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのより高い濃度は、標的細胞への治療用導入遺伝子の効率的な送達を確実にするのも助ける。

一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、約１Ｅ１０、約１．５Ｅ１０、約２Ｅ１０、約２．５Ｅ１０、約３Ｅ１０、約３．５Ｅ１０、約４Ｅ１０、約４．５Ｅ１０、約５Ｅ１０、約５．５Ｅ１０、約６Ｅ１０、約６．５Ｅ１０、約７Ｅ１０、約７．５Ｅ１０、約８Ｅ１０、約８．５Ｅ１０、約９Ｅ１０、約９．５Ｅ１０、約１０Ｅ１０、約１Ｅ１１、約１．５Ｅ１１、約２Ｅ１１、約２．５Ｅ１１、約３Ｅ１１、約３．５Ｅ１１、約４Ｅ１１、約４．５Ｅ１１、約５Ｅ１１、約５．５Ｅ１１、約６Ｅ１１、約６．５Ｅ１１、約７Ｅ１１、約７．５Ｅ１１、約８Ｅ１１、約８．５Ｅ１１、約９Ｅ１１、約９．５Ｅ１１、約１０Ｅ１１、約１Ｅ１２、約１．３Ｅ１２、約１．５Ｅ１２、約２Ｅ１２、約２．１Ｅ１２、約２．３Ｅ１２、約２．５Ｅ１２、約２．７Ｅ１２、約２．９Ｅ１２、約３Ｅ１２、約３．１Ｅ１２、約３．３Ｅ１２、約３．５Ｅ１２、約３．７Ｅ１２、約３．９Ｅ１２、約４Ｅ１２、約４．１Ｅ１２、約４．３Ｅ１２、約４．５Ｅ１２、約４．７Ｅ１２、約４．９Ｅ１２、約５Ｅ１２、約５．１Ｅ１２、約５．３Ｅ１２、約５．５Ｅ１２、約５．７Ｅ１２、約５．９Ｅ１２、約６Ｅ１２、約６．１Ｅ１２、約６．３Ｅ１２、約６．５Ｅ１２、約６．７Ｅ１２、約６．９Ｅ１２、約７Ｅ１２、約７．１Ｅ１２、約７．３Ｅ１２、約７．５Ｅ１２、約７．７Ｅ１２、約７．９Ｅ１２、約８Ｅ１２、約８．１Ｅ１２、約８．３Ｅ１２、約８．５Ｅ１２、約８．７Ｅ１２、約８．９Ｅ１２、約９Ｅ１２、約９．１Ｅ１２、約９．３Ｅ１２、約９．５Ｅ１２、約９．７Ｅ１２、約９．９Ｅ１２、約１０Ｅ１２、約１０．１Ｅ１２、約１０．３Ｅ１２、約１０．５Ｅ１２、約１０．７Ｅ１２、約１０．９Ｅ１２、約１１Ｅ１２、約１１．５Ｅ１２、約１２Ｅ１２、約１２．５Ｅ１２、約１３Ｅ１２、約１３．５Ｅ１２、約１４Ｅ１２、約１４．５Ｅ１２、約１５Ｅ１２、約１５．５Ｅ１２、約１６Ｅ１２、約１６．５Ｅ１２、約１７Ｅ１２、約１７．５Ｅ１２、約１８Ｅ１２、約１８．５Ｅ１２、約１９Ｅ１２、約１９．５Ｅ１２、約２０Ｅ１２、約２０．５Ｅ１２、約３０Ｅ１２、約３０．５Ｅ１２、約４０Ｅ１２、約４０．５Ｅ１２、約５０Ｅ１２、約５０．５Ｅ１２、約６０Ｅ１２、約６０．５Ｅ１２、約７０Ｅ１２、約７０．５Ｅ１２、約８０Ｅ１２、約８０．５Ｅ１２、約９０Ｅ１２、約９５Ｅ１２または約１００Ｅ１２個であり、Ｅは、累乗法の底１０の略称であり、ｘＥｙは、ｘに、底１０のｙ乗（ｐｏｗｅｒ／ｅｘｐｏｎｅｎｔ）を掛けた数を指す。

一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物は、少なくとも５Ｅ１１、少なくとも５．５Ｅ１１、少なくとも６Ｅ１１、少なくとも６．５Ｅ１１、少なくとも７Ｅ１１、少なくとも７．５Ｅ１１、少なくとも８Ｅ１１、少なくとも８．５Ｅ１１、少なくとも９Ｅ１１、少なくとも９．５Ｅ１１、少なくとも１０Ｅ１１、少なくとも１Ｅ１２、少なくとも１．３Ｅ１２、少なくとも１．５Ｅ１２、少なくとも２Ｅ１２、少なくとも２．１Ｅ１２、少なくとも２．３Ｅ１２、少なくとも２．５Ｅ１２、少なくとも２．７Ｅ１２、少なくとも２．９Ｅ１２、少なくとも３Ｅ１２、少なくとも３．１Ｅ１２、少なくとも３．３Ｅ１２、少なくとも３．５Ｅ１２、少なくとも３．７Ｅ１２、少なくとも３．９Ｅ１２、少なくとも４Ｅ１２、少なくとも４．１Ｅ１２、少なくとも４．３Ｅ１２、少なくとも４．５Ｅ１２、少なくとも４．７Ｅ１２、少なくとも４．９Ｅ１２、少なくとも５Ｅ１２、少なくとも５．１Ｅ１２、少なくとも５．３Ｅ１２、少なくとも５．５Ｅ１２、少なくとも５．７Ｅ１２、少なくとも５．９Ｅ１２、少なくとも６Ｅ１２、少なくとも６．１Ｅ１２、少なくとも６．３Ｅ１２、少なくとも６．５Ｅ１２、少なくとも６．７Ｅ１２、少なくとも６．９Ｅ１２、少なくとも７Ｅ１２、少なくとも７．１Ｅ１２、少なくとも７．３Ｅ１２、少なくとも７．５Ｅ１２、少なくとも７．７Ｅ１２、少なくとも７．９Ｅ１２、少なくとも８Ｅ１２、少なくとも８．１Ｅ１２、少なくとも８．３Ｅ１２、少なくとも８．５Ｅ１２、少なくとも８．７Ｅ１２、少なくとも８．９Ｅ１２、少なくとも９Ｅ１２、少なくとも９．１Ｅ１２、少なくとも９．３Ｅ１２、少なくとも９．５Ｅ１２、少なくとも９．７Ｅ１２、少なくとも９．９Ｅ１２、少なくとも１０Ｅ１２、少なくとも１０．１Ｅ１２、少なくとも１０．３Ｅ１２、少なくとも１０．５Ｅ１２、少なくとも１０．７Ｅ１２、少なくとも１０．９Ｅ１２、少なくとも１１Ｅ１２、少なくとも１１．５Ｅ１２、少なくとも１２Ｅ１２、少なくとも１２．５Ｅ１２、少なくとも１３Ｅ１２、少なくとも１３．５Ｅ１２、少なくとも１４Ｅ１２、少なくとも１４．５Ｅ１２、少なくとも１５Ｅ１２、少なくとも１５．５Ｅ１２、少なくとも１６Ｅ１２、少なくとも１６．５Ｅ１２、少なくとも１７Ｅ１２、少なくとも１７．５Ｅ１２、少なくとも１８Ｅ１２、少なくとも１８．５Ｅ１２、少なくとも１９Ｅ１２、少なくとも１９．５Ｅ１２、少なくとも２０Ｅ１２、少なくとも２０．５Ｅ１２、少なくとも３０Ｅ１２、少なくとも３０．５Ｅ１２、少なくとも４０Ｅ１２、少なくとも４０．５Ｅ１２、少なくとも５０Ｅ１２、少なくとも５０．５Ｅ１２、少なくとも６０Ｅ１２、少なくとも６０．５Ｅ１２、少なくとも７０Ｅ１２、少なくとも７０．５Ｅ１２、少なくとも８０Ｅ１２、少なくとも８０．５Ｅ１２、少なくとも９０Ｅ１２、少なくとも９５Ｅ１２または少なくとも１００Ｅ１２のベクターゲノムの組換えウイルスを含み、Ｅは、累乗法の底１０の略称であり、ｘＥｙは、ｘに、底１０のｙ乗（ｐｏｗｅｒ／ｅｘｐｏｎｅｎｔ）を掛けた数を指す。

一部の実施形態では、単位用量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施態様では、単位用量は、１Ｅ１２～１．５Ｅ１２の間、１．５Ｅ１２～２Ｅ１２の間、２Ｅ１２～２．５Ｅ１２の間、２．５Ｅ１２～３．０Ｅ１２の間、３．０Ｅ１２～３．５Ｅ１２の間、３．５Ｅ１２～４．０Ｅ１２の間、４．０Ｅ１２～４．５Ｅ１２の間、４．５Ｅ１２～５．０Ｅ１２の間、５．０Ｅ１２～５．５Ｅ１２の間、５．５Ｅ１２～６．０Ｅ１２の間、６．０Ｅ１２～６．５Ｅ１２の間、６．５Ｅ１２～７．０Ｅ１２の間、７．０Ｅ１２～７．５Ｅ１２の間、７．５Ｅ１２～８．０Ｅ１２の間、８．０Ｅ１２～８．５Ｅ１２の間、８．５Ｅ１２～９．０Ｅ１２の間、９．０Ｅ１２～９．５Ｅ１２の間または９．５Ｅ１２～１０Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、少なくとも１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２以下のベクターゲノムを含む。

一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定される。一部の事例では、ＭＯＩは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸が送達され得る細胞に対する比または倍数を指す。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０^６である。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、少なくとも１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、１×１０^８～１×１０^１５ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、多くても１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８ＭＯＩであり得る。

一部の実施形態では、核酸は、ウイルスを使用せずに（すなわち、非ウイルスベクターを用いて）送達することができ、核酸の量として測定することができる。一般に、いずれか適した量の核酸を、本開示の薬学的組成物および方法により使用することができる。一部の事例では、核酸は、少なくとも１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇまたは５ｇである。一部の事例では、核酸は、多くても約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇまたは５ｇであり得る。

一部の実施形態では、自己相補的ベクター（ｓｃ）を使用することができる。参照により本明細書に組み込むWu、Hum Gene Ther.２００７年、１８巻（２号）：１７１～８２頁によって示される通り、自己相補的ＡＡＶベクターの使用は、ウイルス第２鎖ＤＮＡ合成の必要を迂回することができ、導入遺伝子タンパク質のより優れた発現率をもたらすことができる。

一部の態様では、いくつかのＡＡＶベクターを生成して、アフリベルセプト導入遺伝子による使用のための最適な血清型およびプロモーターの選択を可能にすることができる。

一部の場合には、ベクターは、標的化ベクター、特に、特異的細胞、例えば網膜細胞または光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞または網膜色素上皮細胞へのより高い感染力を示す標的化ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）であってよい。本開示で使用するためのウイルスベクターには、被験体において低い毒性および／または低い免疫原性を示し、被験体、例えばヒト患者においてアフリベルセプトタンパク質の治療有効分量を発現するものが含まれ得る。

非ヒト霊長類またはヒト被験体において、７ｍ８バリアントカプシドタンパク質またはｒＡＡＶ２．７ｍ８、およびアフリベルセプトをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶを使用して、アフリベルセプトをコードする核酸を被験体の標的網膜細胞に送達するための薬学的組成物および方法が、本明細書に開示される。一部の場合には、遺伝子療法によるアフリベルセプトの送達は、本明細書に開示される眼性疾患または状態を少なくとも部分的に好転させるかまたは予防するために使用することができる。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶバリアント（例えば、７ｍ８バリアント）の網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％である。一部の実施形態では、網膜細胞への感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、５％～１００％の間、５％～９５％の間、５％～９０％の間、５％～８５％の間、５％～８０％の間、５％～７５％の間、５％～７０％の間、５％～６５％の間、５％～６０％の間、５％～５５％の間、５％～５０％の間、５％～４５％の間、５％～４０％の間、５％～３５％の間、５％～３０％の間、５％～２５％の間、５％～２０％の間、５％～１５％の間、５％～１０％の間の増加である。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶバリアントの網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍または少なくとも２倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍である。

一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、１０倍～１００倍の間、１０倍～９５倍の間、１０倍～９０倍の間、１０倍～８５倍の間、１０倍～８０倍の間、１０倍～７５倍の間、１０倍～７０倍の間、１０倍～６５倍の間、１０倍～６０倍の間、１０倍～５５倍の間、１０倍～５０倍の間、１０倍～４５倍の間、１０倍～４０倍の間、１０倍～３５倍の間、１０倍～３０倍の間、１０倍～２５倍の間、１０倍～２０倍の間または１０倍～１５倍の間である。

一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、２倍～２０倍の間、２倍～１９倍の間、２倍～１８倍の間、２倍～１７倍の間、２倍～１６倍の間、２倍～１５倍の間、２倍～１４倍の間、２倍～１３倍の間、２倍～１２倍の間、２倍～１１倍の間、２倍～１０倍の間、２倍～９倍の間、２倍～８倍の間、２倍～７倍の間、２倍～６倍の間、２倍～５倍の間、２倍～４倍の間または２倍～３倍の間である。

一部の実施形態では、本明細書に記載されているカプシドタンパク質のアミノ酸修飾は、被験体の眼における内境界膜（ＩＬＭ）を横切る対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの能力と比較して、霊長類またはヒト被験体の眼におけるＩＬＭを横切る能力の増加を付与することができる。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の増加である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、５％～１００％の間、５％～９５％の間、５％～９０％の間、５％～８５％の間、５％～８０％の間、５％～７５％の間、５％～７０％の間、５％～６５％の間、５％～６０％の間、５％～５５％の間、５％～５０％の間、５％～４５％の間、５％～４０％の間、５％～３５％の間、５％～３０％の間、５％～２５％の間、５％～２０％の間、５％～１５％の間または５％～１０％の間の増加である。

一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍または少なくとも２倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍である。

一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、１０倍～１００倍の間、１０倍～９５倍の間、１０倍～９０倍の間、１０倍～８５倍の間、１０倍～８０倍の間、１０倍～７５倍の間、１０倍～７０倍の間、１０倍～６５倍の間、１０倍～６０倍の間、１０倍～５５倍の間、１０倍～５０倍の間、１０倍～４５倍の間、１０倍～４０倍の間、１０倍～３５倍の間、１０倍～３０倍の間、１０倍～２５倍の間、１０倍～２０倍の間または１０倍～１５倍の間である。

一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、２倍～２０倍の間、２倍～１９倍の間、２倍～１８倍の間、２倍～１７倍の間、２倍～１６倍の間、２倍～１５倍の間、２倍～１４倍の間、２倍～１３倍の間、２倍～１２倍の間、２倍～１１倍の間、２倍～１０倍の間、２倍～９倍の間、２倍～８倍の間、２倍～７倍の間、２倍～６倍の間、２倍～５倍の間、２倍～４倍の間または２倍～３倍の間である。

アフリベルセプト
一部の実施形態では、非ヒト霊長類またはヒト被験体の眼または眼の硝子体に投与されるとき、アフリベルセプトをコードするまたは発現する核酸配列を含む治療用導入遺伝子を送達するために、遺伝子療法が使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるカプシドバリアント（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むｒＡＡＶは、アフリベルセプトをコードする異種核酸配列を含み、被験体への硝子体内または網膜下注射の際に網膜細胞にアフリベルセプト遺伝子の配列を送達するために使用される。一部の実施形態では、アフリベルセプト遺伝子を含むｒＡＡＶは、遺伝子療法および硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、アフリベルセプト遺伝子は、その機能的断片またはバリアントを指す。一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列は、そのアミノ酸配列に由来する。一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列は、被験体におけるその発現を向上させるためにコドン最適化される。

コドン最適化は、本技術分野で公知のいずれかの方法により達成することができる。コドン最適化は、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブ配列の少なくとも１個のコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００個もしくはそれを超える、またはそれよりも多いコドン）を、宿主細胞においてより高頻度で使用されるまたは最も高頻度で使用されるコドンで置き換えることにより、目的の標的または宿主細胞、例えば、ヒト網膜細胞における遺伝子の発現増強のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｂｌｅ Ｔｏｏｌ、http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table；Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、http://www.kazusa.or.jp/codon/；およびNakamura, Y.ら「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000」Nucl. Acids Res.２８巻：２９２頁（２０００年）を含む、コドン使用表を直ちに利用できる。

アフリベルセプトは、１１５ｋＤａの融合タンパク質であり、それはグリコシル化されてもよい。アフリベルセプトは、ヒトＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２の細胞外ＶＥＧＦ受容体配列に融合したＩｇＧ骨格を含み、その天然のまたは内因性の受容体より大きな親和性でＶＥＧＦ－Ａに結合することよって可溶性デコイ受容体のように機能する。例えば、Stewart MW. Aflibercept (VEGF Trap-eye): the newest anti-VEGF drug. Br. J. Ophthalmol.２０１２年９月；９６巻（９号）：１１５７～８頁を参照。ＶＥＧＦへのアフリベルセプトの高い親和性は、ネイティブのまたは内因性のＶＥＧＦ受容体のその後の結合および活性化を妨害または破壊する。低下したＶＥＧＦ活性は、減少した血管新生および血管透過性に導くことができる。アフリベルセプトによる胎盤増殖因子ＰＩＧＦおよびＶＥＧＦ－Ｂの阻害は、血管新生状態の処置に寄与することもできる。ＰＩＧＦは血管新生と関連付けられており、滲出型ＡＭＤなどの複数の状態において上昇し得る。ＶＥＧＦ－Ｂ過剰発現は、血液網膜関門の破損および網膜血管新生に関連付けることができる。したがって、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－ＢおよびＰＩＧＦの阻害は、アフリベルセプトの効能に全て寄与することができる。

本明細書に開示される遺伝子産物は、アフリベルセプト、その機能的断片または変異体またはバリアントからなる。アフリベルセプトのアミノ酸配列は、当技術分野で公知である：Ｃ_４３１８Ｈ_６７８８Ｎ_１１６４Ｏ_１３０４Ｓ_３２、ＦＤＡ Ｕｎｉｑｕｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＵＮＩＩ）は１５Ｃ２ＶＬ４２７Ｄである。アフリベルセプトのアミノ酸配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋ、受託番号ＤＢ０８８８５で入手可能である：

アフリベルセプトの核酸配列（配列番号２）は、図５に図示する。一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列は、霊長類またはヒト被験体における発現のためにコドン最適化される。アフリベルセプトアミノ酸配列に対応する合成遺伝子の構築は、文献、例えば、Kanda A、Noda K、Saito W、Ishida S. Aflibercept Traps Galectin-1, an Angiogenic Factor Associated with Diabetic Retinopathy. Scientific Reports ５巻：１７９４６頁（２０１５年）（「ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ_Ｒ１Ｒ２（アフリベルセプトに対応する）ｃＤＮＡはＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成遺伝子として生成された」を記載する）に記載されている。アフリベルセプトの利用可能なアミノ酸配列を踏まえると、本明細書に記載される遺伝子療法またはｒＡＡＶで使用するためのアフリベルセプトのｃＤＮＡを生成するために、当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。

本明細書で使用する場合、「アフリベルセプト」は、上で特定されるアフリベルセプトアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い、または１００％の相同性を有するポリペプチドもしくはタンパク質配列、またはその機能的断片もしくはバリアントもしくは変異体を指す。相同性は、機能的断片、挿入、欠失、置換を含む配列、偽断片（ｐｓｅｕｄｏｆｒａｇｍｅｎｔ）、偽遺伝子、スプライスバリアントまたは人工最適化配列を含むがこれらに限定されない、２つの配列の間のアラインメントの残基の％保存を指す。

一部の場合には、アフリベルセプトのアミノ酸配列は、配列番号１のアフリベルセプトアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または１００％相同である。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子療法またはｒＡＡＶにおいて使用される核酸配列は、上で特定されるアフリベルセプトアミノ酸配列の対応するｃＤＮＡ配列と比較され、アフリベルセプトの核酸配列（例えば、配列番号２）の間で、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または１００％の配列相同性を示す。一部の場合には、アフリベルセプトは、アフリベルセプトと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または１００％空間的に相同である（例えば、その二次、三次および四次構造またはコンフォメーションに関して）。一部の場合には、本明細書に開示される薬学的組成物および方法のアフリベルセプトは、標準治療において使用されるアフリベルセプトと多くても８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または１００％空間的に相同である（例えば、二次、三次および四次構造またはコンフォメーション）。

一部の場合には、ｒＡＡＶに基づく遺伝子療法に含まれるようなアフリベルセプト遺伝子産物またはアフリベルセプト導入遺伝子は、本明細書に開示されるカプシドバリアント（例えば、７ｍ８バリアント）を含み、上の配列番号１のアミノ酸配列と、またはアフリベルセプトの対応するｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号２と比較して遺伝子療法で使用されるアフリベルセプト配列のｃＤＮＡ）の間で、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の相同性を有するタンパク質、融合タンパク質またはポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および薬学的組成物は、アフリベルセプトの機能的断片、またはそのバリアントもしくは変異体を含む。一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるその活性、発現、安定性および／または溶解性を増強するために修飾またはコドン最適化される。

一部の実施形態では、ＡＡＶ２．７ｍ８は、アフリベルセプトのための遺伝子療法または送達系として使用される。ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトは、ｒＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間の７ｍ８挿入およびアフリベルセプトをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２を指す。

薬学的組成物
一部の実施形態では、薬学的組成物は、１つまたは複数の活性成分、例えば、アフリベルセプト融合タンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８、ならびに、所望の治療効果または予防効果を達成するための、硝子体内または網膜下注射によるヒト患者への投与に適する、１つまたは複数の賦形剤、担体、安定剤または増量剤を含有する製剤である。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶもしくはＡＡＶ２．７ｍ８、およびアフリベルセプト融合タンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、再構成された均質な溶液として供給される。一部の実施形態では、溶液は懸濁物であってよい。一部の実施形態では、溶液は等張性である。他の実施形態では、ｒＡＡＶもしくはＡＡＶ２．７ｍ８、およびアフリベルセプト融合タンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、凍結乾燥された形態で供給され、患者への投与の前に再構成される。一部の実施形態では、本明細書に開示される眼疾患または状態の処置または予防の方法は、ｒＡＡＶ（例えばＡＡＶ２．７ｍ８）およびアフリベルセプト融合タンパク質、またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする核酸配列を含む凍結乾燥された薬学的組成物を緩衝液中に先ず再構成、溶解または可溶化するステップを含む。一部の実施形態では、そのような凍結乾燥された薬学的組成物は、凍結保護物質、界面活性物質、塩、安定剤またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。一部の実施形態では、薬学的組成物を含有する均質な溶液は、予め充填されたシリンジとして供給される。

一部の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、懸濁物として供給される。一部の実施形態では、懸濁物は溶液である。一部の実施形態では、懸濁物は冷蔵される。一部の実施形態では、本明細書に開示される眼疾患または状態の処置または予防の方法は、冷蔵された懸濁物を室温に温めるステップおよび／または患者への投与もしくは硝子体内注射の前に懸濁物を撹拌して、懸濁物の均一な分布を確実にするステップを含む。一部の実施形態では、懸濁物は、患者に投与する前に希釈される。一部の実施形態では、そのような薬学的組成物は、界面活性物質、塩、安定剤またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物を含有する懸濁物は、予め充填されたシリンジとして供給される。

一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法または薬学的組成物は、懸濁物または冷蔵された懸濁物として提供される。一部の実施形態では、懸濁物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、界面活性物質、グリセロール、非イオン性界面活性物質、緩衝液、グリコール、塩およびそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、溶液のｐＨを調整するために、塩酸および水酸化ナトリウムが使用される。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、中性ｐＨ、または６．５～７．５の間のｐＨである。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物のｐＨは、わずかに塩基性である（例えば、約７．５、８、８．２、８．４、８．５または９のｐＨ）。一部の実施形態では、懸濁物または溶液のｐＨは、わずかに酸性である（例えば、約６．５、６．３、６．１、６、５．５または５のｐＨ）。一部の実施形態では、懸濁物は溶液である。一部の実施形態では、懸濁物はミセルを含む。一部の実施形態では、懸濁物は、投与の前に撹拌され、および／または室温に温められる。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ（例えばＡＡＶ２．７ｍ８）およびアフリベルセプト核酸配列を含む薬学的組成物を含む遺伝子療法は、本明細書に開示される凍結乾燥またはフリーズドライされた薬学的組成物（例えば、バイアル中に１単位用量）ならびに凍結乾燥された薬学的組成物を溶解、希釈および／または再構成するための溶液を含むキットとして供給される。一部の実施形態では、再構成または希釈のための溶液は、予め充填されたシリンジとして供給されてもよい。一部の実施形態では、キットは、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むフリーズドライまたは凍結乾燥された薬学的組成物および所望の濃度または容量に薬学的組成物を再構成するための溶液を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に開示される薬学的組成物の再構成の際に凝集を防止するのを助ける緩衝液を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、予め充填されたシリンジとして提供される。一部の実施形態では、キットは、デュアルチャンバーシリンジまたは容器を含み、チャンバーの１つは薬学的組成物を溶解または希釈するための緩衝液を含有する。一部の実施形態では、キットは、注射のためのシリンジを含む。一部の実施形態では、再構成された溶液は、投与の前に濾過される。一部の実施形態では、キットは、患者への投与の前に再構成された薬学的組成物を濾過するためのフィルターまたはフィルターシリンジを含む。

一部の実施形態では、保存安定性および取扱いの便宜のために、ｒＡＡＶ（例えばＡＡＶ２．７ｍ８）およびアフリベルセプト融合タンパク質をコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、被験体への投与の前に食塩水、緩衝液または水で再構成することができる凍結乾燥、フリーズドライまたは真空乾燥された粉末として製剤化することができる。あるいは、薬学的組成物は、水溶液、例えば懸濁物または均質な溶液として製剤化することができる。薬学的組成物は、アフリベルセプトをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶビリオンまたは粒子を含有することができる。一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列を送達するために、異なるウイルスまたは送達系、例えばナノ粒子または脂質に基づく複合体を使用することができる。薬学的組成物を安定化するために、様々な賦形剤、例えばリン酸塩、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝液、グリコール、グリセロール、食塩水、界面活性物質（例えば、プルロニックまたはポリソルベート）、またはそれらの任意の組み合わせを使用することができる。さらに、アルコールなどの凍結保護物質は、凍結乾燥の凍結または乾燥条件の下で安定剤として使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子療法は、懸濁物または冷蔵された懸濁物として提供される。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法を含む凍結乾燥された薬学的組成物の懸濁物または再構成された形態は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μＬの容量を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法を含む薬学的組成物の懸濁物は、０．１～０．５ｍＬの間、０．１～０．２ｍＬの間、０．３～０．５ｍＬの間、０．５～１．０ｍＬの間、０．５～０．７ｍＬの間、０．６～０．８ｍＬの間、０．８～１ｍＬの間、０．９～１．１ｍＬの間、１．０～１．２ｍＬの間、または１．０～１．５ｍＬの間の容量を有する。他の実施形態では、容量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５ｍＬ以下である。

一部の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、硝子体内または網膜下注射による霊長類（例えば、非ヒト霊長類およびヒト被験体）への投与のために、設計、操作または適応される。一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物は、被験体の眼への硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、薬学的組成物は、約２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００μＬ以下または２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００μＬ以下の容量の硝子体内注射を可能にする濃度に製剤化または再構成される。一部の実施形態では、薬学的組成物の単位用量は、約２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００μＬ以下または２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００μＬ以下の容量を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される処置方法は、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）およびアフリベルセプトをコードする核酸配列を含む溶液の、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０μＬの容量の硝子体内注射を含む。

一部の場合には、本明細書に記載されるアフリベルセプト導入遺伝子の核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８ビリオンは、遺伝子療法薬学的組成物の構成成分であってよい。一部の実施形態では、フリーズドライまたは凍結乾燥された薬学的組成物またはその懸濁物を作製するために、本明細書に記載される７ｍ８バリアントカプシドタンパク質を含む任意の血清型のｒＡＡＶビリオンを使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子療法は、冷蔵された懸濁物として製剤化される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶ２である。一部の実施形態では、凍結乾燥された薬学的組成物または薬学的組成物の懸濁物は、７ｍ８バリアントカプシドタンパク質およびアフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントをコードするＤＮＡ配列を有するｒＡＡＶ２を含む。一部の実施形態では、懸濁物は冷蔵される。

一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物は、ヒト患者または非ヒト霊長類における治療剤としてのアフリベルセプトの遺伝子療法または硝子体内送達に適応される。一部の実施形態では、薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～１×１０^１３の間のウイルスゲノム（ｖｇ）を含む。一部の実施形態では、単位用量は、約２．１×１０^１１、約２．１×１０^１２または約２．１×１０^１３のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～３×１０^１２のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^９～３×１０^１３のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～１×１０^１１のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^８～３×１０^１４のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、少なくとも１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７または１×１０^１８のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～５×１０^１３のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、多くても約１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８のベクターゲノムである。

一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、ｐｆｕ（プラーク形成単位）として測定することができる。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量のｐｆｕは、約１×１０^８～約１×１０^１２ｐｆｕであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量のｐｆｕは、少なくとも約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１または１×１０^１２ｐｆｕであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量のｐｆｕは、多くても約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１または１×１０^１２ｐｆｕであり得る。

一部の事例では、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノム（ｖｇ）として測定することができる。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～１×１０^１３のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^９～１×１０^１４のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～１×１０^１１のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^８～１×１０^１５のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、少なくとも１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^８～１×１０^１５のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、多くても約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８のベクターゲノムである。一部の実施形態では、単位用量は、１０^１０～１０^１１の間、１０^１１～１０^１２の間、１０^１０～１０^１２の間、１０^１２～１０^１３の間、１０^１１～１０^１３の間、１０^１２～１０^１３の間、１０^１２～１０^１４の間、１０^１１～１０^１４の間、１０^１１～１０^１５の間、１０^１２～１０^１５の間、１０^１３～１０^１４の間、１０^１４～１０^１５の間、１０^１５～１０^１６の間、１０^１６～１０^１７の間、１０^１７～１０^１８の間、１０^１８～１０^１９の間または１０^１９～１０^２０の間のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～２×１０^１０の間、２×１０^１０～３×１０^１０の間、３×１０^１０～４×１０^１０の間、４×１０^１０～５×１０^１０の間、５×１０^１０～６×１０^１０の間、６×１０^１０～７×１０^１０の間、７×１０^１０～８×１０^１０の間、８×１０^１０～９×１０^１０の間、９×１０^１０～１０×１０^１０の間、１×１０^１１～２×１０^１１の間、２×１０^１１～３×１０^１１の間、２×１０^１１～２．５×１０^１１の間、２．５×１０^１１～３×１０^１１の間、３×１０^１１～４×１０^１１の間、４×１０^１１～５×１０^１１の間、５×１０^１１～６×１０^１１の間、６×１０^１１～７×１０^１１の間、７×１０^１１～８×１０^１１の間、８×１０^１１～９×１０^１１の間、９×１０^１１～１０×１０^１１の間、１×１０^１２～２×１０^１２の間、２×１０^１２～３×１０^１２の間、２．５×１０^１２～３×１０^１２の間、３×１０^１２～４×１０^１２の間、４×１０^１２～５×１０^１２の間、５×１０^１２～６×１０^１２の間、６×１０^１２～７×１０^１２の間、７×１０^１２～８×１０^１２の間、８×１０^１２～９×１０^１２の間、９×１０^１２～１０×１０^１２の間、１×１０^１３～２×１０^１３の間、２×１０^１３～３×１０^１３の間、３×１０^１３～４×１０^１３の間、４×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～６×１０^１３の間、６×１０^１３～７×１０^１３の間、７×１０^１３～８×１０^１３の間、８×１０^１３～９×１０^１３の間または９×１０^１３～１０×１０^１３の間のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、この開示のｒＡＡＶの単位用量は、２．１×１０^１１～２．１×１０^１２の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、この開示のｒＡＡＶの単位用量は、１０^１０～１０^１３の間、１０^１０～１０^１１の間、１０^１１～１０^１２の間、１０^１２～１０^１３の間または１０^１３～１０^１４の間のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶの単位用量は、１×１０^１０～２×１０^１０の間、２×１０^１０～４×１０^１０の間、３×１０^１０～５×１０^１０の間、４×１０^１０～６×１０^１０の間、５×１０^１０～７×１０^１０の間、６×１０^１０～８×１０^１０の間、７×１０^１０～９×１０^１０の間、８×１０^１０～１０^１１の間、１×１０^１１～２×１０^１１の間、２×１０^１１～４×１０^１１の間、３×１０^１１～５×１０^１１の間、４×１０^１１～６×１０^１１の間、５×１０^１１～７×１０^１１の間、６×１０^１１～８×１０^１１の間、７×１０^１１～９×１０^１１の間、８×１０^１１～１０×１０^１１の間、１×１０^１２～３×１０^１２の間、２×１０^１２～４×１０^１２の間、３×１０^１２～５×１０^１２の間、４×１０^１２～６×１０^１２の間、５×１０^１２～７×１０^１２の間、６×１０^１２～８×１０^１２の間、７×１０^１２～９×１０^１２の間、８×１０^１２～１０×１０^１２の間、１×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～１０×１０^１３の間、１０^１２～５×１０^１２の間、５×１０^１２～１×１０^１３の間、７×１０^１２～１×１０^１３の間、８×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～４×１０^１３の間、１×１０^１３～３×１０^１３の間、１×１０^１３～２×１０^１３の間、２×１０^１３～３×１０^１３の間、３×１０^１３～４×１０^１３の間、４×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～６×１０^１３の間、６×１０^１３～７×１０^１３の間、７×１０^１３～８×１０^１３の間、８×１０^１３～９×１０^１３の間または８×１０^１３～１×１０^１４の間のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、より高い濃度で発生する可能性のある凝集を防止するために、より低い濃度（例えば、ベクターゲノム）が単位用量のために使用される。一部の実施形態では、遺伝子療法の効能を増加させるために、または遺伝子療法の１回の注射もしくは１度限りの投与でのアフリベルセプト導入遺伝子の送達を最大にするために、より高い濃度、例えばより高いベクターゲノムが単位用量のために選択される。一部の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物のより高い濃度は、より小さい注射容量を可能にし、それは、硝子体内注射と関連した有害作用、例えば、高い眼内圧、炎症、刺激または疼痛を低減することができる。

一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定することができる。一部の事例では、ＭＯＩは、核酸（nucleic）が送達され得る細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比または倍数を指すことができる。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０^６であり得る。一部の事例では、ＭＯＩは、約１×１０^５～約１×１０^７の間であり得る。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０^４～１×１０^８であり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、約１×１０^８～約１×１０^１５ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、多くても約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８ＭＯＩであり得る。一部の実施形態では、ＭＯＩは、１×１０^１０～２×１０^１０の間、２×１０^１０～４×１０^１０の間、３×１０^１０～５×１０^１０の間、４×１０^１０～６×１０^１０の間、５×１０^１０～７×１０^１０の間、６×１０^１０～８×１０^１０の間、７×１０^１０～９×１０^１０の間、８×１０^１０～１０^１１の間、１×１０^１１～２×１０^１１の間、２×１０^１１～４×１０^１１の間、３×１０^１１～５×１０^１１の間、４×１０^１１～６×１０^１１の間、５×１０^１１～７×１０^１１の間、６×１０^１１～８×１０^１１の間、７×１０^１１～９×１０^１１の間、８×１０^１１～１０×１０^１１の間、１×１０^１２～３×１０^１２の間、２×１０^１２～４×１０^１２の間、３×１０^１２～５×１０^１２の間、４×１０^１２～６×１０^１２の間、５×１０^１２～７×１０^１２の間、６×１０^１２～８×１０^１２の間、７×１０^１２～９×１０^１２の間、８×１０^１２～１０×１０^１２の間、１×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～１０×１０^１３の間、１０^１２～５×１０^１２の間、５×１０^１２～１×１０^１３の間、７×１０^１２～１×１０^１３の間、８×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～４×１０^１３の間、１×１０^１３～３×１０^１３の間、１×１０^１３～２×１０^１３の間、２×１０^１３～３×１０^１３の間、３×１０^１３～４×１０^１３の間、４×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～６×１０^１３の間、６×１０^１３～７×１０^１３の間、７×１０^１３～８×１０^１３の間、８×１０^１３～９×１０^１３の間または８×１０^１３～１×１０^１４の間である。

眼での使用に適した薬学的組成物は、無菌注射用溶液、懸濁物または分散物の即時調製のための無菌水性溶液または分散物および無菌粉末を含む。硝子体内投与のため、適した担体は、生理食塩水、静菌水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および／または等張剤（isotonic agent）、例えば、グリセロールを含む。全事例では、薬学的組成物は、無菌でなければならず、容易にシリンジ使用可能（syringability）または注射可能（injectability）である程度まで流動性であるべきである。薬学的組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。一部の実施形態では、薬学的組成物は、塩またはグリセロール等、等張剤を含むことができる。一部の実施形態では、界面活性物質または安定剤を薬学的組成物に添加して、凝集を防止する。

一部の場合には、賦形剤は担体であってよい。担体は、例えば水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの任意の組み合わせを含有する溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は要求される粒子サイズの維持によって、ならびに、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ラウリルジメチルアミンオキシド、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標））、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミン－Ｎ－オキシド、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Ｂｒｉｊ ７２１（商標）、胆汁酸塩（デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム）、プルロニック酸（Ｆ－６８、Ｆ－１２７）、ポリオキシルヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標））、ノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標））、シクロデキストリンおよび塩化エチルベンゼトニウム（Ｈｙａｍｉｎｅ（商標））などの界面活性物質の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、クレゾール、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合には、等張剤（isotonic agent）、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによって、内部組成物の長期吸収をもたらすことができる。一部の実施形態では、薬学的担体には、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベートおよびスクロースが含まれる。一部の実施形態では、薬学的組成物は、界面活性物質、例えば、ポリソルベート、ポロキサマーまたはプルロニックなどの非イオン性界面活性物質を含む。一部の実施形態では、非イオン性界面活性物質の添加は、薬学的組成物における凝集を低減する。

一部の実施形態では、本開示のために有用な薬学的組成物は、本開示の適用を促進するために、キットにパッケージすることができる。一部の態様では、本方法は、本開示の組換え核酸（例えば、アフリベルセプトの核酸配列を含むｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ２．７ｍ８）を含むキットを提供する。一部の態様では、本方法は、本開示の組換えウイルスの凍結乾燥された形態、および患者への投与の前にウイルスを再構成するための溶液を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本明細書で提供される組換えウイルス、および組換えウイルスの治療有効量で被験体の眼または網膜細胞に投与するための指示を含む。一部の態様では、キットは、組換えウイルスを投与するための薬学的に許容される塩または溶液を含む。任意選択で、キットは、ラベルまたは別個の挿入物の形態の、適した操作上のパラメータのための指示をさらに含むことができる。例えば、キットは、組換えウイルスの単位用量を調製するための、および／または凍結乾燥された組成物を再構成するための情報を医師または研究室の技術者に知らせる標準的な指示を有することができる。一部の実施形態では、任意選択で、キットは投与のためのデバイス、例えばシリンジ、フィルター針、延長チューブ、カニューレまたは網膜下注射器をさらに含む。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、懸濁物または冷蔵された懸濁物として提供される。一部の実施形態では、懸濁物または冷蔵された懸濁物はキットで提供され、それは、希釈のためのシリンジまたは緩衝液を含むことができる。一部の実施形態では、懸濁物または冷蔵された懸濁物は、予め充填されたシリンジとして提供される。

一部の実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物での使用のための組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）の生化学的精製において、任意の適する方法を使用することができる。組換えＡＡＶウイルスは、細胞から、または細胞を含む培養培地から直接的に回収することができる。ウイルスは、凍結乾燥の前にまたは懸濁物として製剤化する前に、様々な生化学的手段、例えば、ゲル濾過、濾過、クロマトグラフィー、親和性精製、勾配超遠心分離またはサイズ排除方法を使用して精製することができる。

適応症
一部の場合には、本明細書に記載されるような７ｍ８バリアント（例えば、ｒＡＡＶ２．７ｍ８）を含む任意の血清型のｒＡＡＶビリオンまたはその薬学的組成物は、眼の新血管形成と関連するまたはＣＮＶと関連する眼の状態または疾患を少なくとも部分的に好転させることができる。一部の実施形態では、ヒト被験体の眼に、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントを送達するために、カプシドバリアントタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが使用される。

アフリベルセプト融合タンパク質に承認された適応症には、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）およびＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）が含まれる。一部の場合には、本明細書に開示される方法および薬学的組成物は、アフリベルセプトが承認されているまたは適応となる眼の状態または疾患を予防または処置するために使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子療法（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８に基づく遺伝子療法）は、ＣＮＶ、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、ＲＶＯ後の黄斑浮腫、およびＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症を含むがこれらに限定されない、アフリベルセプトに応答性の眼の状態または疾患を処置または予防するために使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子療法は、新血管形成またはＣＮＶによって特徴付けられる任意の眼の状態または障害を処置または予防するために使用される。別の態様では、本開示は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、血管新生関連の疾患、がん、自己免疫性疾患、感染性疾患生物体などの疾患の処置のための、本明細書で提供される薬学的組成物を提供する。

一部の実施形態では、眼状態は、糖尿病性黄斑浮腫であり得る。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、黄斑内の血管からの流体の漏出による、真性糖尿病における網膜の腫脹である。黄斑は、網膜の中心部分であり、これは、色を検出する特殊化された神経終末である錐体が豊富な小区域であり、昼間視力は錐体に依存する。黄斑浮腫が発達するにつれて、中心視野の中央またはすぐ横でぼやけが起こる。糖尿病性黄斑浮腫による失明は、数カ月間の期間にわたり進行し、明瞭に焦点を合わせることを不可能にし得る。ＤＭＥの一般的症状は、霧視、飛蚊症、複視であり、処置せずにおくと最終的に盲目となる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、ＤＭＥの処置に使用される。

一部の実施形態では、眼状態は、網膜静脈閉塞であり得る。網膜静脈閉塞は、網膜から血液を運び出す小さい静脈の遮断である。網膜は、光の像を神経シグナルに変換し、これを脳に送る、眼の内側の背部にある組織の層である。網膜静脈閉塞は、ほとんどの場合、動脈の硬化（アテローム性動脈硬化）および血餅の形成に起因する。網膜におけるより小さい静脈（分枝状静脈またはＢＲＶＯ）の遮断は、多くの場合、アテローム性動脈硬化によって肥厚または硬化した網膜動脈が交差し、網膜静脈に圧力をかける場所で起こる。網膜静脈閉塞の症状は、片眼の全体または一部における突発性のぼやけまたは視力喪失を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、網膜静脈閉塞の処置に使用される。

一部の実施形態では、眼状態は、滲出型ＡＭＤとしても公知の、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）であり得る。脈絡膜新血管形成は、ブルッフ膜における破損を通した、網膜色素上皮下（ｓｕｂ－ＲＰＥ）または網膜下腔への、脈絡膜に起源をもつ新たな血管の成長を伴う場合があり、これは、失明の主原因となり得る。ＣＮＶは、数週間以内に認められる、中心視の突発性の増悪を生じることができる。他の症状は、色覚障害および変形視症（直線が波形に見える歪み）を含み得る。新たな血管の出血は、ＣＮＶの症状の発病を加速することができる。ＣＮＶは、眼の奥の圧迫感を含むこともできる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、新血管形成に関連するＣＮＶまたは眼状態の処置に使用される。

進行型の「滲出型」形態（新生血管または滲出性）のＡＭＤは、より一般的でないが、患者における中心視の急速で多くの場合実質的な喪失を高頻度で引き起こすことがある。滲出型形態のＡＭＤにおいて、脈絡膜新血管形成は、網膜色素上皮の下およびそれを通って成長し得る血管のネットワークを形成および発達させる。これは、網膜下腔への血漿の漏出および／または出血を伴うため、黄斑において起こる場合、中心視の重篤な突発性の喪失が存在し得る。用語「ＡＭＤ」は、他に明記されていなければ、乾性ＡＭＤまたは滲出型ＡＭＤのいずれかであり得る。本開示は、ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤおよび／または乾性ＡＭＤの処置または予防を考慮する。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、ＡＭＤの処置に使用される。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および薬学的組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでアフリベルセプトに応答性である眼疾患または状態を予防または処置するために使用される。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および薬学的組成物、すなわち、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントを含むＡＡＶ遺伝子療法は、ＣＮＶ形成の後のグレードＩＶ病変のパーセンテージをカラー眼底写真撮影によって測定したとき、ビヒクルまたは緩衝液対照と比較して、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％の新血管形成またはＣＮＶの低減をもたらす。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および薬学的組成物、すなわち、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアントを含むＡＡＶ遺伝子療法は、ＣＮＶ形成の後のグレードＩＶ病変のパーセンテージをカラー眼底写真撮影によって測定したとき、アフリベルセプトまたは遺伝子療法に基づかないアフリベルセプトに同等である、新血管形成またはＣＮＶの低減をもたらす。一部の実施形態では、ＣＮＶの低減または治療効果は、遺伝子療法に基づかないアフリベルセプトまたはアフリベルセプトのタンパク質溶液による投与と比較して、アフリベルセプトを含む遺伝子療法の投与で、より長く持続する。一部の実施形態では、アフリベルセプト遺伝子療法の治療効果は、単一の硝子体内注射から少なくとも１年間、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間、またはそれよりも長い年数の間持続する。一部の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、内因性ＶＥＧＦおよび／またはＰＩＧＦを阻害または隔離する。

使用方法
一部の実施形態では、本開示は、病理学的血管新生関連眼疾患を処置するための方法であって、斯かる処置を必要とするヒト被験体に薬学的に有効な量の本明細書に提供される薬学的組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、網膜新血管形成、脈絡膜新血管形成糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症および糖尿病性網膜浮腫ならびにこれらのいずれかの組み合わせを含む眼性新生血管疾患の群から選択される。

一部の実施形態では、バリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）およびアフリベルセプトをコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、乾性ＡＭＤおよび滲出型ＡＭＤを含むＡＭＤを処置または予防するために使用される。一部の実施形態では、バリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）およびアフリベルセプトをコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、ＣＮＶを処置もしくは予防する、またはグレードＩＶのＣＮＶ病変を低減するために使用される。一部の実施形態では、バリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）およびアフリベルセプトをコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、網膜新血管形成、脈絡膜新血管形成糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分岐閉塞、ＲＶＯ、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症および糖尿病性網膜浮腫、ＤＭＥ患者におけるＤＲ、ならびにそれらの任意の組み合わせのいずれか１つを処置または予防するために使用される。

一部の実施形態では、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯまたはＤＲを処置する方法は、その患者にアフリベルセプトの核酸配列を含む遺伝子療法を投与する前に、ＥＹＬＥＡ（登録商標）で患者を前処置するステップを含む。一部の実施形態では、患者は、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法の１度限りの用量を受ける前に、ＥＹＬＥＡ（登録商標）で前処置される。一部の実施形態では、患者は、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法の１度限りの用量を受ける前に、アフリベルセプトに応答性である。一部の実施形態では、アフリベルセプトに応答性であるまたはアフリベルセプトで前処置された患者は、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法で処置され、その後、患者がＥＹＬＥＡ（登録商標）またはアフリベルセプト遺伝子療法のいずれも受けない、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間もしくはそれよりも長い年数、または１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間を超えるもしくはそれよりも長い年数が続く。一部の場合には、患者がアフリベルセプト遺伝子療法の硝子体内注射を受けた後、患者は、遺伝子療法処置から少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間またはそれよりも長い年数が経過するまで、ＥＹＬＥＡ（登録商標）もしくは別の標準治療の注射、または別の承認された療法（例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ注射）を受けることを開始しない。一部の実施形態では、処置方法は、アフリベルセプト遺伝子療法を患者に投与する前に、アフリベルセプトへの応答性について患者を評価（assess）または評価(evaluate)する（例えば、イムノアッセイまたは血液検査によって）ステップを含む。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法は、１度限りの投与である。一部の実施形態では、患者が本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法の単位用量を受けた後、患者はいかなる他のアフリベルセプトに基づく療法も使用する必要はない。

一部の場合には、ＥＹＬＥＡ（登録商標）または別の承認された療法の反復硝子体内注射に関連した有害作用、例えば炎症、高い眼内圧または細菌感染、を経験する患者は、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法による処置の候補であり得る。一部の場合には、遺伝子療法は、患者の人生で１回の注射だけを必要とする、または少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０年間もしくはそれよりも長い年数において１回以下しか与えられないので、そのようなリスクは遺伝子療法においてはより低い。一部の場合には、遺伝子療法の治療効果はより長く持続することができ、１度限りの遺伝子療法注射の費用はタンパク質の複数の反復注射の合わせた費用より低くなり得るので、本明細書に開示されるアフリベルセプト遺伝子療法による処置は、タンパク質に基づく注射より対費用効果が高くなり得る。

また、服薬非遵守（例えば、患者が、１回または複数の予定された注射を忘れるまたは見逃す場合）は、視力喪失および眼疾患または状態の増悪をもたらし得るため、反復した注射を要求しないことにより、遺伝子療法は、反復した注射を要求する治療法に伴う患者服薬遵守およびアドヒアランスの課題に取り組む。投与のために診療所への反復したまたは高頻度の来診を要求する処置レジメンに対する服薬非遵守およびノンアドヒアランスの比率は、ＡＭＤによって最も影響を受ける高齢患者の間でより高い。したがって、例えば、一度限りの硝子体内注射としての遺伝子療法による患者の眼へのアフリベルセプトの送達は、患者により便利な処置選択肢をもたらし、服薬非遵守およびノンアドヒアランスの問題に取り組むことにより患者転帰を改善することができる。

一部の実施形態では、使用方法は、現在の標準治療とみなされる薬物、例えば、アフリベルセプトタンパク質注射、ラニビズマブ注射またはベバシズマブ注射でヒト患者または被験体を前処置するステップと、アフリベルセプトへの患者の応答性を決定するステップと、アフリベルセプトに応答性である患者に本明細書に記載されるアフリベルセプト遺伝子療法を投与するステップとを含む。アフリベルセプトへの患者の応答性を決定するステップは、血液検査、イムノアッセイ、ｅｘ ｖｉｖｏ実験、または患者へのアフリベルセプトタンパク質注射の投与およびアフリベルセプトへの応答性について患者をアッセイすることを含むことができるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるアフリベルセプト遺伝子療法の使用方法は、本明細書に記載される薬学的組成物（すなわち、アフリベルセプト核酸配列を含むｒＡＡＶ２．７ｍ８）の凍結乾燥された形態を薬物のラベルに従って再構成するステップと、前記再構成されたアフリベルセプト遺伝子療法を被験体またはヒト患者に投与するステップとを含む。一部の実施形態では、アフリベルセプト遺伝子療法は、懸濁物として提供される。一部の実施形態では、懸濁物は、投与の前に撹拌される。一部の実施形態では、懸濁物は、冷蔵される。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、投与の前に室温に温められる。一部の実施形態では、そのようなヒト患者は、アフリベルセプト注射または別のタンパク質薬物注射、例えば、ラニビズマブ注射またはベバシズマブ注射で前処置された。一部の実施形態では、そのような患者は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間もしくはそれよりも長い年数の間に、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプト遺伝子療法の１回以下の注射もしくは投与を受ける；または、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間を超えるもしくはそれよりも長い年数において、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプト遺伝子療法の１回以下の注射もしくは投与を受ける。

一部の実施形態では、眼の状態または疾患を予防または処置する方法であって、それを必要とする個体、例えばアフリベルセプトに応答性である眼の状態または疾患を有する個体に、本明細書に記載されるアフリベルセプトをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶビリオンまたはその薬学的組成物の有効量を投与するステップを含む方法も本明細書に開示される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトビリオンは、眼内注射を通して、硝子体内注射によって、網膜下注射によって、または任意の他の便利な投与様式もしくは経路によって、個体の眼に投与することができる。他の便利な投与様式または経路は、例えば、静脈内、局所、点眼剤などを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および薬学的組成物は、硝子体内注射による投与を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法または薬学的組成物は、冷蔵された懸濁物として提供される。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、界面活性物質、グリセロール、非イオン性界面活性物質、緩衝液、グリコール、塩およびそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、溶液のｐＨを調整するために、塩酸および水酸化ナトリウムが使用される。一部の実施形態では、懸濁物は、中性ｐＨ、または６．５～７．５の間のｐＨである。一部の実施形態では、懸濁物のｐＨは、わずかに塩基性である（例えば、約７．５、８、８．２、８．４、８．５または９のｐＨ）。一部の実施形態では、懸濁物または溶液のｐＨは、わずかに酸性である（例えば、約６．５、６．３、６．１、６、５．５または５のｐＨ）。一部の実施形態では、懸濁物は、溶液である。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、ミセルを含む。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、投与の前に撹拌される。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、３５Ｆ～４６Ｆ（２Ｃ～８Ｃ）の間の温度で保存される。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、患者への投与の前に室温に温められる。

本明細書に記載される「治療有効量」は、臨床治験を通して決定することができる比較的広い範囲であってよい。眼への直接的注射または硝子体内注射のために、治療有効用量は、７ｍ８－アフリベルセプトの１０^１１～１０^１２または１０^１２～１０^１３程度のベクターゲノムであってよい。一部の実施形態では、７ｍ８－アフリベルセプトの単位用量または治療有効量は、１０^１０～１０^１１の間、１０^１１～１０^１２の間、１０^１０～１０^１２の間、１０^１２～１０^１３の間、１０^１１～１０^１３の間、１０^１２～１０^１３の間、１０^１２～１０^１４の間、１０^１１～１０^１４の間、１０^１１～１０^１５の間、１０^１２～１０^１５の間、１０^１３～１０^１４の間、１０^１４～１０^１５の間、１０^１５～１０^１６の間、１０^１６～１０^１７の間、１０^１７～１０^１８の間、１０^１８～１０^１９の間、または１０^１９～１０^２０の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示の７ｍ８－アフリベルセプトを含む薬学的組成物の単位用量は、１×１０^１０～２×１０^１０の間、２×１０^１０～３×１０^１０の間、３×１０^１０～４×１０^１０の間、４×１０^１０～５×１０^１０の間、５×１０^１０～６×１０^１０の間、６×１０^１０～７×１０^１０の間、７×１０^１０～８×１０^１０の間、８×１０^１０～９×１０^１０の間、９×１０^１０～１０×１０^１０の間、１×１０^１１～２×１０^１１の間、２×１０^１１～３×１０^１１の間、２×１０^１１～２．５×１０^１１の間、２．５×１０^１１～３×１０^１１の間、３×１０^１１～４×１０^１１の間、４×１０^１１～５×１０^１１の間、５×１０^１１～６×１０^１１の間、６×１０^１１～７×１０^１１の間、７×１０^１１～８×１０^１１の間、８×１０^１１～９×１０^１１の間、９×１０^１１～１０×１０^１１の間、１×１０^１２～２×１０^１２の間、２×１０^１２～３×１０^１２の間、２．５×１０^１２～３×１０^１２の間、３×１０^１２～４×１０^１２の間、４×１０^１２～５×１０^１２の間、５×１０^１２～６×１０^１２の間、６×１０^１２～７×１０^１２の間、７×１０^１２～８×１０^１２の間、８×１０^１２～９×１０^１２の間、９×１０^１２～１０×１０^１２の間、１×１０^１３～２×１０^１３の間、２×１０^１３～３×１０^１３の間、３×１０^１３～４×１０^１３の間、４×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～６×１０^１３の間、６×１０^１３～７×１０^１３の間、７×１０^１３～８×１０^１３の間、８×１０^１３～９×１０^１３の間、または９×１０^１３～１０×１０^１３の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示の７ｍ８－アフリベルセプトの単位用量は、２．１×１０^１１の間または２．１×１０^１２の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶの単位用量は、１０^１０～１０^１３の間、１０^１０～１０^１１の間、１０^１１～１０^１２の間、１０^１２～１０^１３の間、または１０^１３～１０^１４の間のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、本開示の７ｍ８－アフリベルセプトの単位用量は、１×１０^１０～２×１０^１０の間、２×１０^１０～４×１０^１０の間、３×１０^１０～５×１０^１０の間、４×１０^１０～６×１０^１０の間、５×１０^１０～７×１０^１０の間、６×１０^１０～８×１０^１０の間、７×１０^１０～９×１０^１０の間、８×１０^１０～１０^１１の間、１×１０^１１～２×１０^１１の間、２×１０^１１～４×１０^１１の間、３×１０^１１～５×１０^１１の間、４×１０^１１～６×１０^１１の間、５×１０^１１～７×１０^１１の間、６×１０^１１～８×１０^１１の間、７×１０^１１～９×１０^１１の間、８×１０^１１～１０×１０^１１の間、１×１０^１２～３×１０^１２の間、２×１０^１２～４×１０^１２の間、３×１０^１２～５×１０^１２の間、４×１０^１２～６×１０^１２の間、５×１０^１２～７×１０^１２の間、６×１０^１２～８×１０^１２の間、７×１０^１２～９×１０^１２の間、８×１０^１２～１０×１０^１２の間、１×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～１０×１０^１３の間、１０^１２～５×１０^１２の間、５×１０^１２～１×１０^１３の間、７×１０^１２～１×１０^１３の間、８×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～２×１０^１３の間、９×１０^１２～４×１０^１３の間、１×１０^１３～３×１０^１３の間、１×１０^１３～２×１０^１３の間、２×１０^１３～３×１０^１３の間、３×１０^１３～４×１０^１３の間、４×１０^１３～５×１０^１３の間、５×１０^１３～６×１０^１３の間、６×１０^１３～７×１０^１３の間、７×１０^１３～８×１０^１３の間、８×１０^１３～９×１０^１３の間、または８×１０^１３～１×１０^１４の間のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物の治療有効量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、１Ｅ１２～１．５Ｅ１２の間、１．５Ｅ１２～２Ｅ１２の間、２Ｅ１２～２．５Ｅ１２の間、２．５Ｅ１２～３．０Ｅ１２の間、３．０Ｅ１２～３．５Ｅ１２の間、３．５Ｅ１２～４．０Ｅ１２の間、４．０Ｅ１２～４．５Ｅ１２の間、４．５Ｅ１２～５．０Ｅ１２の間、５．０Ｅ１２～５．５Ｅ１２の間、５．５Ｅ１２～６．０Ｅ１２の間、６．０Ｅ１２～６．５Ｅ１２の間、６．５Ｅ１２～７．０Ｅ１２の間、７．０Ｅ１２～７．５Ｅ１２の間、７．５Ｅ１２～８．０Ｅ１２の間、８．０Ｅ１２～８．５Ｅ１２の間、８．５Ｅ１２～９．０Ｅ１２の間、９．０Ｅ１２～９．５Ｅ１２の間または９．５Ｅ１２～１０Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、少なくとも１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２、９．５Ｅ１２または１０Ｅ１２以下のベクターゲノムを含む。

一部の実施形態では、２～５年間または５～１０年間の期間以内にヒト患者または被験体に注射される７ｍ８－アフリベルセプトの総量は、１０^１０～１０^１３、１０^１０～１０^１１、１０^１１～１０^１２、１０^１２～１０^１３もしくは１０^１３～１０^１４以下のベクターゲノム、または１×１０^１０～２×１０^１０、２×１０^１０～４×１０^１０、３×１０^１０～５×１０^１０、４×１０^１０～６×１０^１０、５×１０^１０～７×１０^１０、６×１０^１０～８×１０^１０、７×１０^１０～９×１０^１０、８×１０^１０～１０^１１、１×１０^１１～２×１０^１１、２×１０^１１～４×１０^１１、３×１０^１１～５×１０^１１、４×１０^１１～６×１０^１１、５×１０^１１～７×１０^１１、６×１０^１１～８×１０^１１、７×１０^１１～９×１０^１１、８×１０^１１～１０×１０^１１、１×１０^１２～３×１０^１２、２×１０^１２～４×１０^１２、３×１０^１２～５×１０^１２、４×１０^１２～６×１０^１２、５×１０^１２～７×１０^１２、６×１０^１２～８×１０^１２、７×１０^１２～９×１０^１２、８×１０^１２～１０×１０^１２、１×１０^１３～５×１０^１３、５×１０^１３～１０×１０^１３、１０^１２～５×１０^１２、５×１０^１２～１×１０^１３、７×１０^１２～１×１０^１３、８×１０^１２～２×１０^１３、９×１０^１２～２×１０^１３、９×１０^１２～２×１０^１３、９×１０^１２～４×１０^１３、１×１０^１３～３×１０^１３、１×１０^１３～２×１０^１３、２×１０^１３～３×１０^１３、３×１０^１３～４×１０^１３、４×１０^１３～５×１０^１３、５×１０^１３～６×１０^１３、６×１０^１３～７×１０^１３、７×１０^１３～８×１０^１３、８×１０^１３～９×１０^１３もしくは８×１０^１３～１×１０^１４以下のベクターゲノムである。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ．７ｍ８－アフリベルセプトビリオンまたはその薬学的組成物は、単一の用量または１度限りの用量として投与することができる。一部の実施形態では、様々な間隔の持続期間にわたって所望の遺伝子発現レベルを達成するために、１回より多い、例えば、少なくとも２年間、または少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０年間もしくはそれよりも長い年数に１回以下の投与を用いることができる。一部の実施形態では、７ｍ８－アフリベルセプトの硝子体内注射は、患者が少なくとも１年間、１．５年間または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０年間もしくはそれよりも長い年数の間、アフリベルセプトタンパク質注射を受ける必要をなくす。

（実施例１：サルにおけるｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトの効能評価）

遺伝子療法による標的細胞または組織への治療用導入遺伝子（または、ペイロード）の送達は、ＡＡＶカプシドタンパク質および霊長類またはヒト被験体における関連のまたは標的の細胞をＡＡＶウイルスの標的とするそれらの役割に大きく依存すると仮定されている。硝子体内に注射したとき、７ｍ８バリアントは、網膜細胞への増加した感染力または標的化を示すことも報告されている。したがって、硝子体内に注射したとき、網膜細胞を様々な治療用導入遺伝子の標的とすることにおいて、７ｍ８バリアントが同様に働くと予想されるだろう。

目的：アフリカミドリザルにおけるレーザー光凝固によって誘導される脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）の発達を阻害するための、２×１０^１２ｖｇの用量での各遺伝子療法の硝子体内（ＩＶＴ）投与の後に、アフリベルセプトをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２．７ｍ８の効能を、ｓＶＥＧＦＲ－１をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２．７ｍ８の効能とともに評価すること。ｓＶＥＧＦＲ－１（ｓＦＬＴ－１とも呼ばれる）の核酸配列は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３７１４３８号に記載の通りに公開されている。

図５は、アフリベルセプトの核酸配列を図示する。図６は、ｓＦＬＴ－１の核酸配列（配列番号３）を図示する。

サルにおけるＣＮＶ病変モデルは、滲出型ＡＭＤなどの新血管形成に関連した眼の疾患を処置するための療法の潜在的効能を評価するための標準の霊長類モデルとして一般的に容認され、広く使用されている。

眼圧測定、細隙灯生体顕微鏡検査法、眼底検査、カラー眼底写真撮影（ＣＦＰ）、蛍光血管造影（ＦＡ）および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって眼および全般的な健康状態を評価するために、サルはベースラインスクリーニングを受けた。正常な所見を有するサルを研究に登録し、ベースライン体重および性別によって３つの処置群に無作為化した（表１）。ベースライン検査の後、アトロピン１％眼軟膏を塗布した。

本明細書で使用する場合、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１は、ｒＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位および５８８位の間の７ｍ８挿入およびｓＶＥＧＦＲ－１をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２を含む。

処置スケジュールに従って研究の０日目に、群１～３のサルは、硝子体内（ＩＶＴ）ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプト、ビヒクルまたはＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１ ＯＵを受けた（表１）。ＩＶＴ投薬の前に、局所的局部麻酔を投与し（０．５％プロパラカイン）、眼を５％Ｂｅｔａｄｉｎｅで消毒し、無菌のノーマルセーラインですすぐことができる。硝子体中心を標的として、下の耳側四半部（temporal quadrant）の縁から２ｍｍ後方に置かれた３１ゲージ０．５インチ針を使用して、ＩＶＴ注射を投与した。

研究の５６日目に、低減された注射容量（３０μＬ）を除いて群１～３のものと同一のＩＶＴ注射手順に従って、群４のサルはレーザー処置の直後にＩＶＴアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標）、３０μＬの４０ｍｇ／ｍＬ／眼）ＯＵを受けた。アフリベルセプトのＩＶＴ投与は、ＣＮＶのための臨床標準治療であり、したがって、この研究において陽性対照として用いられる。用量は、ヒト（４ｍＬ）と比較してアフリカミドリザル（２．７ｍＬ）の比較的より小さい硝子体容量に適合するように調整した。

全てのＩＶＴ注射の後に、０．３％シプロフロキサシンまたは同等の抗生物質眼科用液剤、および１％硫酸アトロピン軟膏の局所投与を行った。

５６日目に、レーザー熱傷により耳側血管アーケードの間でＣＮＶを誘導した。Ｉｒｉｄｅｘ Ｏｃｕｌｉｇｈｔ ＴＸ ５３２ｎｍレーザーを１００ｍｓのレーザー持続期間、スポットサイズ５０μｍ、出力７５０ｍＷで用いて、眼科医が９つのレーザースポットを各眼に対称的に置いた。レーザースポットは、０．９×接触レーザーレンズを使用して適用した。レーザースポット配置の間の参照のためにレーザー処置の前（および、ブレブ配置の後）に得られたカラー眼底画像の上に、レーザースポットの標的位置を訓練された眼科医がマッピングした。レーザー病変を記録するために、レーザー処置の直後にカラー眼底写真撮影を実行した。レーザー直後に重度の網膜／網膜下出血を示すいかなるスポットも、分析から排除した。図１は、処置なしのレーザー照射によるＣＮＶ病変の誘導の後の、非ヒト霊長類の眼の例示的な眼底写真を図示する。

網膜の両側のカラー眼底画像は、Ｔｏｐｃｏｎ ＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラをＣａｎｏｎ ６Ｄデジタル画像化ハードウェアおよびＮｅｗ Ｖｉｓｉｏｎ Ｆｕｎｄｕｓ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアと一緒に使用して、窩を中心にした５０度の視野で捕捉した。１０％フルオレセインナトリウムの０.１ｍＬ／ｋｇの静
脈内投与で、ＦＡを実行した。ＣＮＶ病変の血管撮影図におけるフルオレセイン漏出は、画像強度の均一な調整の後に生成されるコンポジットを評価するマスキングされた眼科医によってＩ～ＩＶにグレード分けされた（表２）。病変のグレード分け評価は、２名の他の訓練された眼科医によって眼底の画像で確認された。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、後期の未加工血管撮影図の画像蛍光デンシトメトリー分析を実行することもできる。

全般的な健康について、被験体を１日に２回評価した。１週間に１回、詳細な観察を実行した。ベースラインスクリーニング時および生存中の研究の間の２週ごとに体重を得た。

８５日目に、または画像の検査を保留する場合は８５日目より少し後に、眼底画像化の質を確認してから、全ての動物をペントバルビタールで安楽死させた。次いで動物をペントバルビタールで安楽死させ、眼球を摘出した。過剰な眼窩組織は切り取り、ＯＤおよびＯＳ眼球の両方を液体窒素で瞬間凍結させ、次いで、室温で凍結組織平面に沿って切開し、脈絡膜部分組織（choroidal sub-tissue）と一緒に硝子体および網膜を単離した。硝子体の収集の後、ＲＰＥ／脈絡膜と一緒の神経網膜の５ｍｍのパンチを黄斑ならびに上部、下部、耳側および鼻側の領域から採取した。各パンチからの、根底にあるＲＰＥ／脈絡膜組織を伴う網膜を、事前に風袋を計測したラベル付きの低温チューブに移し、秤量し、液体窒素で瞬間凍結させた。パンチ生検の収集の前後に、パンチが収集された領域を記録するために、平らにマウントした網膜の写真を配向の表示と一緒に撮影した。

統計的方法：異なる病変グレードの発生数を評価するために、フィッシャー直接検定を使用した。ＯＣＴ ＣＮＶ複合エリアおよび血管撮影図画像デンシトメトリーデータを分析するために、反復測定による二元ＡＮＯＶＡおよび続くチューキー－クレイマー検定またはコントラスト法（contrast procedure）を使用した。データが正規分布せず、不均一な分散を有した場合、ノンパラメトリック検定を適用した。０．０５またはそれ未満のＰ値は、統計的に有意とみなした。

試験被験体（サル）の各群において注射の直後にレーザー照射によってＣＮＶ病変を誘導し、各病変をＩ～ＩＶのスケールでグレード分けするためにカラー眼底写真撮影を使用した。図２は、ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトまたはビヒクル対照による２．１×１０^１２ｖｇの用量での硝子体内処置の後、７０日目にサルの病変を評価するために使用された例示的な眼底写真撮影を図示する。ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトで処置したサルは、ＩＩおよびＩＩＩにグレード分けされた病変を示したがグレードＩＶの病変は示さず、一方、ビヒクル対照で処置したサルは、より多くのＩＶにグレード分けされた病変を示した。複数のサルからの類似のデータをプールし、下にさらに記載される各試験群の定量分析のためにプロットした（図３および４）。

図３は、陽性対照としてＥＹＬＥＡ（登録商標）（または、遺伝子療法アプローチのないアフリベルセプト融合タンパク質）、または製剤緩衝液だけを含むビヒクル対照のいずれかを硝子体内注射した群４のサルの、１４日目および２８日目のグレードＩＶ病変のパーセンテージのプロットを図示する。ヒト（４ｍＬ）と比較してアフリカミドリザル（２．７ｍＬ）の比較的より小さい硝子体容量に適合するように低減された注射容量（３０μＬ）を除いて群１～３で使用したのと同一のＩＶＴ注射手順に従って（表１）、レーザー照射の直後に３０μＬの４０ｍｇ／ｍＬ／眼のＥＹＬＥＡ（登録商標）ＯＵを投与した。ＥＹＬＥＡ（登録商標）のＩＶＴ投与は、ＣＮＶのための臨床標準治療であり、したがって、この研究において陽性対照として用いられる。複数のサルからのデータを平均し、定量分析のためにプロットした。ＥＹＬＥＡ（登録商標）の硝子体内注射で処置した動物は、注射後の１４日目および２８日目に収集した眼底画像によって測定したとき、硝子体内注射によるビヒクル単独の投与と比較してグレードＩＶ病変の量の顕著な減少を示した。

図４は、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプト（７ｍ８バリアントカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ２およびアフリベルセプト核酸配列を含む遺伝子療法）；もしくはＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１（７ｍ８バリアントカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ２およびｓＶＥＧＦＲ－１核酸配列を含む遺伝子療法）のいずれかの各々２．１×１０^１２ｖｇの用量で、または製剤緩衝液だけを含むビヒクル対照によって硝子体内注射したサル（表１の群１～３）の１４日目および２８日目のグレードＩＶ病変のパーセンテージのプロットを図示する。レーザー照射によってＣＮＶ病変を誘導し、各病変をＩ～ＩＶのスケールでグレード分けするためにカラー眼底写真撮影を使用した。次いでグレードＩＶ病変のパーセンテージの測定値をプールし、プロットした。ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトの硝子体内注射で処置したサルは、１４日目および２８日目に収集した眼底画像に関して、ビヒクル対照単独と比較してグレードＩＶ病変の量の大幅な減少を示した。対照的に、および予想外にも、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１の硝子体内注射により処置したサルは、ビヒクル対照と比較してグレードＩＶのＣＮＶ病変の低減をほとんどまたは全く示さなかった。このデータは、多くの者が以前に考えていたものとは対照的に、カプシドのバリエーションおよび／または投与経路が全ての導入遺伝子について機能するとは限らないこと、ならびに、導入遺伝子の特性がＡＡＶ遺伝子療法の効能において重要な役割を果たし得ることを示唆する。サルにおけるそのようなｉｎ ｖｉｖｏデータは、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトによる霊長類の処置が、ビヒクル対照だけを受けたサルと比較してより少ないグレードＩＶ病変につながったことも示し、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトがヒトのための現実的な遺伝子療法選択肢であり得ることを示唆した。

ｒＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトのこれらのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、７ｍ８バリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ２が、アフリベルセプトをコードする核酸配列を硝子体内注射により被験体の網膜細胞に送達するための遺伝子療法として有効であり得ること、および、活性アフリベルセプトのｉｎ ｖｉｖｏ発現をもたらし、そのため、ＥＹＬＥＡ（登録商標）陽性対照の治療効果と類似したレベルでそれが治療効果、すなわちＣＮＶ病変の低減を発揮することを示した。

Claims (1)

1. 本願図面に記載の発明。

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