JP7343903B2 - 遺伝子発現増強のための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４７２，８９２号の利益を主張するものであり、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。

配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＡＶＢＩ＿００９＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは８６ＫＢであり、２０１８年３月１６日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。

本発明は、障害の遺伝子治療に関する。

遺伝性疾患および他の障害を治療および予防するための有望なアプローチは、遺伝子送達ベクターによる治療剤の送達である。ウイルスベクターは、高効率の遺伝子移入ビヒクルであり、遺伝子送達ベクターとして有用であり得る。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターは、それらのウイルス生活環の非組込み性のために、特に望ましい。

しかしながら、遺伝子治療に使用するためのポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターの設計に関して多くの課題が残っている。１つの重要な課題は、遺伝子移入後に標的細胞において導入遺伝子の十分な発現を得ることである。ある場合には、遺伝子送達ベクター（例えば、組換えウイルス）を使用した疾患または遺伝性障害の有効な治療は、治療用ポリペプチドのロバストな発現および効率的な分泌の両方に依存し得る。したがって、（例えば、形質導入した）標的細胞から高レベルのタンパク質の分泌を駆動することが可能な発現カセットは、治療的に有効なベクターおよび遺伝子治療法の成功の重要な要素であり得る。故に、哺乳動物細胞において遺伝子を発現させるための改善された方法ならびに最適化された核酸発現カセットおよびベクターの必要性が存在する。

本発明は、この必要性を満たす。

本発明は、概して、分子生物学およびウイルス学の分野に関し、特に、選択された治療構築物（例えば、ペプチドおよびポリペプチド）をコードする核酸セグメントを脊椎動物の選択された細胞および組織に送達するための遺伝子発現カセットおよびそれらを含むベクターに関する。これらの遺伝子構築物は、哺乳動物、具体的には、ヒトの疾患、障害、および機能不全を治療するための、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、およびＡＡＶベクターを含む遺伝子送達ベクターの開発において有用である。

より具体的には、本発明は、真核生物細胞または哺乳動物細胞による分泌タンパク質の発現増強のための遺伝子発現カセット、ならびに、限定されないが、それを必要とする対象において１つ以上のタンパク質の欠乏、不在、または機能喪失によって引き起こされるかまたはそれと関連する疾患または障害を治療する方法を含む、研究および治療用途の両方に使用するためにそのようなカセットを作製および使用する方法を対象とする。

本発明のカセットは、概して、ヒトまたは非ヒト動物対象における疾病の治療に有効なポリペプチドをコードする核酸配列または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは分泌型ポリペプチドである。カセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクターに組み込むことができ、次いで、真核生物細胞もしくは哺乳動物細胞にインビトロで（例えば、細胞培養物中で）投与することができるか、または疾病に苦しむもしくは疾病を発症するリスクのある哺乳動物対象に投与することができる。

開示される組成物は、ヒト疾患の予防および治療を含む、様々な研究、診断、および治療計画に利用することができる。例えば、本発明の組成物は、眼疾患、血管新生依存性疾患、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤による治療に応答する疾患の治療、または酵素補充療法（疾患が酵素の欠乏または機能喪失によって引き起こされるかまたはそれと関連する）に使用され得る。

動物、および特にヒトにおける疾患、障害、および機能不全の中心となる標的化遺伝子治療に有用な薬物の調製に使用するために、ポリヌクレオチド発現カセットおよび遺伝子送達ベクター組成物、例えば、これらの発現カセットを含むウイルスベクターを調製するための方法および組成物が提供される。

本発明の実施形態は、５’から３’の順に、（ａ）第１のエンハンサー領域、（ｂ）プロモーター領域、（ｃ）ポリペプチド遺伝子産物をコードするコード配列、（ｄ）第２のエンハンサー領域、および（ｅ）ポリアデニル化部位を含む、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のための非天然ポリヌクレオチドカセットを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、第２のエンハンサーの下流かつポリアデニル化部位の上流に位置するリボ核酸（ＲＮＡ）核外輸送シグナルをさらに含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドカセットはＲＮＡ核外輸送シグナルを含有しない。より具体的な形態において、カセットは、第２のエンハンサーの下流かつポリアデニル化部位の上流にＲＮＡ核外輸送シグナルを含有しない。

さらに他の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、プロモーターの下流かつコード配列の上流に位置するイントロンをさらに含む。

なおも他の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、コード配列の上流かつプロモーターの下流に位置する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む。

好ましい実施形態において、ポリペプチド遺伝子産物は分泌型タンパク質である。

本発明のポリヌクレオチドカセットは、プロモーター領域の上流に位置する第１のエンハンサー領域を含む。好ましい実施形態において、第１のエンハンサー領域は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）配列を含む。他の実施形態において、第１のエンハンサー領域は、伸長因子１α（ＥＦ１α）配列を含む。ある特定の実施形態において、第１のエンハンサー領域は、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態において、同一性は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。

本発明のポリヌクレオチドカセットは、プロモーター配列またはその機能的断片を含むプロモーター領域を含む。いくつかの実施形態において、プロモーター領域は、真核生物細胞、またはより具体的には哺乳動物細胞に特異的である。いくつかの実施形態において、プロモーター領域は、アクチンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１ａ）プロモーター、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列を含む。好ましい実施形態において、プロモーター領域は、ＣＭＶプロモーター配列またはＥＦ１ａプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態において、プロモーター領域は、以下の配列番号：３、４、または９６のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態において、同一性は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。

いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドカセットは、プロモーター領域の下流にイントロン領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、プロモーターの下流かつ５’ＵＴＲの上流に位置する。いくつかの実施形態において、イントロン領域は、伸長因子１α（ＥＦ１ａ）、アクチン、またはＣＭＶｃ配列を含む。ある特定の実施形態において、イントロンは、以下の配列番号：５、１８、または９７のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態において、同一性は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。

本発明のポリヌクレオチドカセットは、本明細書において５’ＵＴＲと称される、コード配列の非翻訳領域５’を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ配列は、プロモーター配列に対して異種である。５’ＵＴＲは、プロモーターの下流かつコード配列の上流に位置する。いくつかのそのような実施形態において、５’ＵＴＲは、ＵＴＲ１、ＵＴＲ２、アデノウイルス主要後期プロモーター由来のエンハンサーエレメント（ｅＭＬＰ）、およびアデノウイルス由来のトリパータイトリーダー配列（ＴＰＬ配列）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲはＵＴＲ１配列を含む。一実施形態において、５’ＵＴＲはＵＴＲ２配列を含む。好ましい実施形態において、５’ＵＴＲは、５’から３’の順に、ＴＰＬ配列およびｅＭＬＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲはポリヌクレオチドＡＴＧを含まない。ある特定の実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列番号：６、１１、１２、または１９のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態において、同一性は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。

本発明の実施形態は、導入遺伝子の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットを含む。したがって、本発明のポリヌクレオチドカセットは、導入遺伝子とも称されるコード配列を含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、１つのコード配列または導入遺伝子を含み、２つ以上の導入遺伝子を含まない。導入遺伝子は、例えば、ペプチドまたはポリペプチド等の治療剤をコードすることができる。好ましい実施形態において、導入遺伝子は分泌型ポリペプチド（本明細書において分泌タンパク質または分泌型タンパク質とも称される）をコードする。コード配列によってコードすることができる分泌型ポリペプチドの例として、限定されないが、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ－１としても知られる）、ｓＦＬＴ－１のＶＥＧＦ結合断片、アフリベルセプト、およびα１アンチトリプシンまたはα_１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、分泌型ポリペプチドは、抗血管新生または抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドである。

主題の発現カセットは、哺乳動物細胞における参照カセットからの導入遺伝子産物の発現と比較して、哺乳動物細胞における導入遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）の発現増強を提供する。好ましい実施形態において、主題の発現カセットは、インビボまたはインビトロでの真核生物細胞における参照カセットからの分泌型タンパク質の発現と比較して、インビボまたはインビトロでの（例えば、細胞培養物または組織外植片中の）真核生物細胞における分泌型タンパク質の発現増強を提供する。いくつかの態様において、真核生物細胞は哺乳動物細胞である。さらなる態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。

いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞におけるポリヌクレオチドカセットからの分泌型ポリペプチドの発現は、インビトロまたはインビボでの哺乳動物細胞における参照カセットからの分泌型ポリペプチドの発現よりも少なくとも約２Ｘ、３Ｘ、５Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、２０Ｘ、または５０Ｘ高い。

いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞においてポリヌクレオチドカセットから得られる非分泌ポリペプチドの発現レベルは、インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞において参照カセットから得られる非分泌ポリペプチドの発現レベルとほぼ同じか、それよりも約１．５Ｘ未満高いか、または約２Ｘ未満高い。非分泌ポリペプチドの非限定的な一例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。

いくつかの実施形態によれば、本明細書において前述および後述される参照カセット（本明細書においてＣＭＶ参照対照カセットとも称される）は、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）、ＣＭＶプロモーター（配列番号２１）、キメライントロン（配列番号２２）、５’ＵＴＲ（配列番号２３）、ペプチドまたはポリペプチド遺伝子産物をコードするコード配列、３’ＵＴＲ（配列番号２５）、およびＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号２６）を含む。

特定の実施形態によれば、ペプチドまたはポリペプチドの発現増強は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、およびＡＲＰＥ－１９細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞においてインビトロで観察される。別の実施形態において、哺乳動物細胞は網膜組織外植片に含まれる。

いくつかの形態において、インビトロまたはインビボでの（例えば、対象における）哺乳動物細胞におけるポリヌクレオチドカセットからの分泌型タンパク質の発現は、同じ条件下の哺乳動物細胞におけるＣＭＶ参照対照カセットからの分泌型タンパク質の発現よりも少なくとも２Ｘ、少なくとも５Ｘ、少なくとも１０Ｘ、または約５Ｘ～約１０Ｘ高く、ＣＭＶ参照対照カセットは、５’から３’の順に、配列番号２に記載のＣＭＶエンハンサー配列、配列番号２１に記載のＣＭＶプロモーター配列、配列番号２２に記載のキメライントロン配列、配列番号２３に記載の５’ＵＴＲ配列、分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、配列番号２５に記載の３’ＵＴＲ配列、および配列番号２６に記載のＳＶ４０ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、哺乳動物細胞における分泌型タンパク質の発現を、哺乳動物細胞におけるＣＭＶ参照対照カセットからのタンパク質の発現と比較して少なくとも２倍（２Ｘ）、５倍（５Ｘ）、１０倍（１０Ｘ）、または約５～約１０倍増加させる。一実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、形質導入した哺乳動物細胞における分泌タンパク質の発現を、形質導入した哺乳動物細胞におけるＣＭＶ参照対照カセットからの発現と比較して増強するまたは増加させる。

ポリヌクレオチドカセットは、コード配列の下流かつポリアデニル化シグナル配列の上流に位置する第２のエンハンサー領域を含む。ＲＮＡ核外輸送シグナル配列が存在する場合、第２のエンハンサー配列はＲＮＡ核外輸送シグナルの上流（すなわち、コード配列とＲＮＡ核外輸送シグナルとの間）に位置し、ＲＮＡ核外輸送シグナルはポリアデニル化シグナルの上流に位置する。好ましい実施形態において、第２のエンハンサー領域は、完全ＥＥＳ、４１０～５６４ＥＥＳ、および５１１～８１０ＥＥＳからなる群から選択される発現エンハンサー配列（ＥＥＳ）を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、第２のエンハンサーの下流かつポリアデニル化配列（本明細書において、ポリＡ配列、ポリＡ部位、またはポリアデニル化領域とも称される）の上流にＲＮＡ核外輸送シグナルを含む。ＲＮＡ核外輸送シグナルは、ヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）配列およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列からなる群から選択される配列を含み得る。ある特定の実施形態において、ＲＮＡ核外輸送シグナルは、以下の配列番号：８または１７のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態において、同一性は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。

本発明によるポリヌクレオチドカセットは、ポリアデニル化部位を含む。ポリアデニル化部位は、第２のエンハンサー領域の下流またはＲＮＡ核外輸送領域の下流に位置し得る。いくつかの実施形態において、ポリアデニル化領域は、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨもしくはｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨもしくはｂＧＨ）、またはβ－グロブリン（βグロブリン）ポリＡ配列を含む。ある特定の実施形態において、ポリアデニル化領域は、以下の配列番号：９、１４、または２０のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態において、同一性は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。

本発明のいくつかの実施形態は、細胞外環境におけるタンパク質の量（例えば、濃度または含量）によって測定されるように、哺乳動物細胞における参照カセットによるタンパク質の発現と比較して哺乳動物細胞による分泌型タンパク質の発現を増強するまたは増加させるためのポリヌクレオチドカセットを対象とする。試料中のタンパク質の量は、例えば、イムノアッセイによって測定することができる。

いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号１）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）ＥＦ１α配列（配列番号３）を含むプロモーター領域、（ｃ）ＥＦ１α配列（配列番号５）を含むイントロン領域、（ｄ）ＵＴＲ２配列（配列番号６）を含む５’ＵＴＲ領域、（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、（ｆ）５１１～８１０ＥＥＳ配列（配列番号７）を含む第２のエンハンサー領域、（ｇ）ＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列（配列番号８）、および（ｈ）ＢＧＨポリアデニル化部位（配列番号９）を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号７０～７５またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列から選択される１つ以上の配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの５’アームは、配列番号４５またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの３’アームは、配列番号４６またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

他の実施形態において、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号１）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）ＣＭＶ配列（配列番号４）を含むプロモーター領域、（ｃ）５’から３’の順に、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列（それぞれ、配列番号１１および配列番号１２）を含む５’ＵＴＲ領域、（ｄ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、（ｅ）完全ＥＥＳ配列（配列番号１３）を含む第２のエンハンサー領域、ならびに（ｆ）ＨＧＨポリアデニル化部位（配列番号１４）を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号７６～８０またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列から選択される１つ以上の配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの５’アームは、配列番号４７またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの３’アームは、配列番号４８またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

他の実施形態において、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号１）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）ＣＭＶ配列（配列番号４）を含むプロモーター領域、（ｃ）５’から３’の順に、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列（それぞれ、配列番号１１および配列番号１２）を含む５’ＵＴＲ領域、（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、（ｆ）４１０～５６４ＥＥＳ配列（配列番号１６）を含む第２のエンハンサー領域、（ｇ）ＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列（配列番号１７）、ならびに（ｈ）ＢＧＨポリアデニル化部位（配列番号９）を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号８１～８６またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列から選択される１つ以上の配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの５’アームは、配列番号４９またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの３’アームは、配列番号５０またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

他の実施形態において、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号１）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）アクチン配列（配列番号９６）を含むプロモーター領域、（ｃ）ｅＭＬＰ配列（配列番号１２）を含む５’ＵＴＲ、（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、（ｆ）５１１～８１０ＥＥＳ配列（配列番号７）を含む第２のエンハンサー領域、（ｇ）ＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列（配列番号１７）、および（ｈ）ウサギβグロブリンポリアデニル化部位（配列番号２０）を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号８７～９１またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列から選択される１つ以上の配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの５’アームは、配列番号５１またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの３’アームは、配列番号５２またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

他の実施形態において、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号１）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）ＣＭＶ配列（配列番号４）を含むプロモーター領域、（ｃ）ＣＭＶｃ配列（配列番号１８）を含むイントロン領域、（ｄ）ＵＴＲ１配列（配列番号１９）を含む５’ＵＴＲ領域、（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、（ｆ）完全ＥＥＳ配列（配列番号１３）を含む第２のエンハンサー領域、（ｇ）ＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列（配列番号８）、および（ｈ）ウサギβグロブリンポリアデニル化部位（配列番号２０）を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号９２～９５またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列から選択される１つ以上の配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの５’アームは、配列番号５３またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの３’アームは、配列番号５４またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

他の実施形態において、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号１）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）アクチン配列（配列番号９６）を含むプロモーター領域、（ｃ）ニワトリβアクチン配列（配列番号９７）を含むイントロン領域、（ｄ）ＵＴＲ１配列（配列番号１９）を含む５’ＵＴＲ領域、（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、（ｆ）４１０～５６４ＥＥＳ配列（配列番号１６）を含む第２のエンハンサー領域、（ｇ）ＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列（配列番号１７）、および（ｈ）ＢＧＨポリアデニル化部位（配列番号９）を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号９２～９５またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列から選択される１つ以上の配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの５’アームは、配列番号３９またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットの３’アームは、配列番号４０またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）５’アーム、（ｂ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、および（ｃ）３’アームを本質的に含むかまたはそれからなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、５’アームは、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、および６１からなる群から選択される配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含み、３’アームは、配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および６２からなる群から選択される配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態において、５’アームおよび３’アームは、それぞれ、配列番号２７および２８、または配列番号２９および３０、または配列番号３１および３２、または配列番号３３および３４、または配列番号３５および３６、または配列番号３７および３８、または配列番号３９および４０、または配列番号４１および４２、または配列番号４３および４４、または配列番号４５および４６、または配列番号４７および４８、または配列番号４９および５０、または配列番号５１および５２、または配列番号５３および５４、または配列番号５５および５６、または配列番号５７および５８、または配列番号５９および６０、または配列番号６１および６２である。

本発明の好ましい形態において、主題のポリヌクレオチドカセットにおいてコード配列によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、細胞内で発現した後にその細胞から分泌されるかまたは輸送されるものである。

本発明のいくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子送達ベクターは、（ａ）カプシドタンパク質および（ｂ）本発明のポリヌクレオチドカセットを含む組換えウイルスである。より具体的な実施形態において、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、組換えアデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶカプシドタンパク質および本発明のポリヌクレオチドカセットを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は野生型ＡＡＶカプシドタンパク質である。他の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は変異型ＡＡＶカプシドタンパク質であり、変異型カプシドタンパク質は、親カプシドタンパク質またはそのタンパク質が由来するカプシドタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む。例えば、一実施形態において、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、５～１１個のアミノ酸がＶＰ１カプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの挿入部位に挿入される。好適な例として、７ｍ８変異型カプシドタンパク質を有するＡＡＶ変異型カプシド、またはＡＡＶ変異型７ｍ８カプシドタンパク質に由来するカプシドタンパク質が挙げられる。ある特定の例において、変異型ＡＡＶはＡＡＶ２．７ｍ８カプシドタンパク質を含む。

本発明のいくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドカセットおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本発明の遺伝子送達ベクターおよび薬学的賦形剤を含む。

一実施形態は、本発明のポリヌクレオチドカセットでトランスフェクトまたは形質導入した、単離された宿主細胞である。

本発明のいくつかの態様において、インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させるための方法が提供され、該方法は、１つ以上の哺乳動物細胞をインビボまたはインビトロで、ある量の本発明のポリヌクレオチドカセット、遺伝子送達ベクター、または薬学的組成物と接触させることを含み、導入遺伝子は、１つ以上の哺乳動物細胞において検出可能なレベルで発現するか、またはより好ましくは、同じ条件下（すなわち、他の変数は一定のままである）で測定される、細胞または細胞培養物中の、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）、ＣＭＶプロモーター（配列番号２１）、キメライントロン（配列番号２２）、５’ＵＴＲ（配列番号２３）、対象となる導入遺伝子またはコード配列、３’ＵＴＲ（配列番号２５）、およびＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号２６）を含む参照ＣＭＶカセットから得られるものよりも（すなわち、そこからの導入遺伝子の発現と比較して）約２倍、５倍、または１０倍高いレベルで発現する。いくつかの実施形態は、１つ以上の哺乳動物細胞をインビトロまたはインビボで、ある量の本発明の組換えウイルスと接触させることを含む、インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させるための方法を提供し、組換えウイルスは、本開示によるポリヌクレオチドカセットを含む。好ましい実施形態において、カセットまたは導入遺伝子は分泌型タンパク質（本明細書において分泌型ポリペプチドとも称される）をコードし、分泌型タンパク質は、細胞を、同じタンパク質をコードするＣＭＶ参照対照カセットを含む組換えウイルスと接触させることによって得られるレベルよりも少なくとも２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、約５Ｘ～約１０Ｘ、または２０Ｘを超える高いレベルで１つ以上の哺乳動物細胞において発現するいくつかの態様において、哺乳動物細胞は、細胞の１つ以上の特徴を変化させるか、または個体における疾患の１つ以上の徴候もしくは症状を軽減するのに有効な、ある量のポリヌクレオチドカセット、薬学的組成物、またはベクターと接触させられる。

本発明のいくつかの態様において、疾患または障害の治療または予防を必要とする哺乳動物における疾患または障害の治療または予防のための方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、哺乳動物に有効量の本発明の薬学的組成物を投与することを含み、コード配列は治療遺伝子産物をコードする。一実施形態において、疾患は、眼疾患および／または細胞タンパク質産物の機能喪失もしくは欠乏と関連する疾患である。一実施形態において、眼疾患は、眼内血管新生に関連するかまたはそれによって引き起こされる。一実施形態は、治療を必要とする哺乳動物の眼に治療有効量の本発明の薬学的組成物を投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における眼疾患の治療のための方法である。より具体的な実施形態において、治療有効量の本発明の薬学的組成物は、眼内注射によってまたは硝子体内注射によって治療を必要とする個体の眼に投与される。

主題のカセット、組成物、および方法が使用され得る眼疾患として、急性黄斑神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜新生血管、糖尿病ブドウ膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、例えば、急性黄斑変性症、非滲出性加齢性黄斑変性症および滲出性加齢性黄斑変性症、浮腫、例えば、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、および糖尿病黄斑浮腫、多巣性脈絡膜炎、後眼部位または後眼位置に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜障害、例えば網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病網膜症（増殖性糖尿病網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ブドウ膜炎網膜疾患、交感神経性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ブドウ膜滲出、眼のレーザー治療によって引き起こされたまたはその影響を受けた後眼部状態、光線力学的療法によって引き起こされたまたはその影響を受けた後眼部状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、網膜症以外の糖尿病性網膜機能不全、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病（黄色斑眼底）、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性、レーバー先天黒内障、先天性停止夜盲症、脈絡膜欠如、バルデ・ビードル症候群、黄斑毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経萎縮症、未熟児網膜症、ならびに１色覚、１型２色覚、２型２色覚、および３型２色覚を含む色覚障害が挙げられる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のための非天然ポリヌクレオチドカセットであって、５’から３’の順に、
（ａ）第１のエンハンサー領域、
（ｂ）プロモーター領域、
（ｃ）分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、
（ｄ）第２のエンハンサー領域、および
（ｅ）ポリアデニル化部位を含み、
前記コード配列は、前記プロモーター領域に作動可能に連結され、
哺乳動物細胞における前記ポリヌクレオチドカセットからの前記分泌型ポリペプチドの発現は、前記哺乳動物細胞における参照カセットからの前記分泌型ポリペプチドの発現よりも少なくとも５倍高く、
前記参照カセットは、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）、ＣＭＶプロモーター（配列番号２１）、キメライントロン（配列番号２２）、５’ＵＴＲ（配列番号２３）、前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、３’ＵＴＲ（配列番号２５）、およびＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号２６）を含む、ポリヌクレオチドカセット。
（項目２）
前記カセットはＲＮＡ核外輸送シグナルを含有しない、項目１に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目３）
前記第１のエンハンサー領域は、配列番号１に記載のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、項目１または２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目４）
前記プロモーター領域は、配列番号４に記載のＣＭＶプロモーター配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、項目１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目５）
前記プロモーター領域の下流かつ前記コード配列の上流にある非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含み、前記５’ＵＴＲは、５’から３’の順に、配列番号１１によるＴＰＬ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、および配列番号１２によるｅＭＬＰ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目６）
前記第２のエンハンサーは、配列番号１３に記載の完全ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、項目１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目７）
前記ポリアデニル化部位は、配列番号１４に記載のヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化部位またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、項目１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目８）
配列番号７６～８０から選択される配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む１つ以上の領域をさらに含む、項目１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目９）
前記分泌型ポリペプチドは抗血管新生ポリペプチドである、項目１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１０）
前記分泌型ポリペプチドは、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ－１）またはｓＦＬＴ－１のＶＥＧＦ結合断片を含む、項目１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１１）
５’から３’に、
（ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
（ｂ）配列番号４からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
（ｃ）５’から３’の順に、配列番号１１からなるＴＰＬ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、および配列番号１２からなるｅＭＬＰ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
（ｄ）前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列であって、前記プロモーター領域に作動可能に連結される、コード配列、
（ｅ）配列番号１３からなる完全ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、ならびに
（ｆ）配列番号１４からなるＨＧＨポリアデニル化部位またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、を含み、
任意選択的に、前記カセットはＲＮＡ核外輸送シグナルを含まない、項目１に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１２）
配列番号７６～８０の各々をさらに含む、項目１１に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１３）
５’から３’に、
（ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
（ｂ）配列番号３からなるＥＦ１α配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
（ｃ）配列番号５からなるＥＦ１α配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、イントロン領域、
（ｄ）配列番号６からなるＵＴＲ２配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
（ｅ）前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列であって、前記プロモーター領域に作動可能に連結される、コード配列、
（ｆ）配列番号７からなる５１１～８１０ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、
（ｇ）配列番号８からなるＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、および
（ｈ）配列番号９からなるＢＧＨポリアデニル化部位またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、を含む、項目１に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１４）
配列番号７０～７５の各々をさらに含む、項目１３に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１５）
５’から３’に、
（ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
（ｂ）配列番号４からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
（ｃ）５’から３’の順に、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２からなるＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードする、コード配列、
（ｆ）配列番号１６からなる４１０～５６４ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、
（ｇ）配列番号１７からなるＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、ならびに
（ｈ）配列番号９からなるＢＧＨポリアデニル化部位またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、を含む、項目１に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１６）
配列番号８１～８６の各々をさらに含む、項目１５に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１７）
５’から３’に、
（ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
（ｂ）配列番号９６からなるアクチン配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
（ｃ）配列番号１２からなるｅＭＬＰ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ、
（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードする、コード配列、
（ｆ）配列番号７からなる５１１～８１０ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、
（ｇ）配列番号１７からなるＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、および
（ｈ）配列番号２０からなるウサギβグロビンポリアデニル化部位またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、を含む、項目１に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１８）
配列番号８７～９１の各々をさらに含む、項目１７に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目１９）
５’から３’に、
（ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
（ｂ）配列番号４からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
（ｃ）配列番号１８からなるＣＭＶｃ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、イントロン領域、
（ｄ）配列番号１９からなるＵＴＲ１配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
（ｅ）ペプチドまたはポリペプチドをコードする、コード配列、
（ｆ）配列番号１３からなる完全ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、
（ｇ）配列番号８からなるＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、および
（ｈ）配列番号２０からなるウサギβグロビンポリアデニル化部位またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列、を含む、項目１に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目２０）
配列番号９２～９５の各々をさらに含む、項目１９に記載のポリヌクレオチドカセット。
（項目２１）
ａ）カプシドタンパク質、および
ｂ）項目１～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット、を含む、組換えウイルス。
（項目２２）
前記組換えウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルスである、項目２１に記載の組換えウイルス。
（項目２３）
前記カプシドタンパク質は、ＡＡＶ変異型７ｍ８カプシドタンパク質であるか、または前記ＡＡＶ変異型７ｍ８カプシドタンパク質に由来する、項目２２に記載の組換えウイルス。
（項目２４）
項目２１～２３のいずれか一項に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目２５）
項目１に記載のポリヌクレオチドカセットでトランスフェクトまたは形質導入した、単離された宿主細胞。
（項目２６）
哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させるための方法であって、１つ以上の哺乳動物細胞を、ある量の項目２１～２３のいずれか一項に記載の組換えウイルスと接触させることを含み、前記分泌型ポリペプチドは、前記細胞を、前記分泌型ポリペプチドをコードする参照カセットを含む組換えウイルスと接触させることによって得られるレベルよりも少なくとも５倍高いレベルで前記１つ以上の哺乳動物細胞において発現し、前記参照カセットは、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）、ＣＭＶプロモーター（配列番号２１）、キメライントロン（配列番号２２）、５’ＵＴＲ（配列番号２３）、前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、３’ＵＴＲ（配列番号２５）、およびＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号２６）を含む、方法。
（項目２７）
疾患の治療または予防を必要とする哺乳動物における疾患の治療または予防のための方法であって、前記哺乳動物に有効量の項目２４に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
（項目２８）
前記疾患は眼疾患であり、前記薬学的組成物は前記哺乳動物の眼に投与される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記薬学的組成物は、眼内注射または硝子体内注射によって前記哺乳動物の眼に投与される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記眼疾患は、脈絡膜新生血管および黄斑変性症からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。

本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および付属の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られる。

導入遺伝子発現を評価するために構築された一連のポリヌクレオチドカセットを示す。各カセットに存在する調節エレメントおよびコード配列（すなわち、遺伝子）を、左から右へ、５’から３’の順に列挙する。カセットは、カセット番号によって識別される。例えば、カセット番号１１は、カセット番号１１、カセット１１、または単にＣ１１と称されてもよい。 ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後の、ポリヌクレオチドカセットによる分泌タンパク質、アフリベルセプトの発現を比較したチャートを示す。図１に示す「基本プラスミド」から得られるレベルと比較して発現レベルをプロットしている。 ＨＥＫ ２９３細胞に形質導入した後の、選択されたポリヌクレオチドカセットからの分泌タンパク質、アフリベルセプトの発現を示す。 形質導入の１週間後（図４Ａ）および２週間後（図４Ｂ）の、形質導入したブタ網膜外植片における選択されたポリヌクレオチドカセットからの分泌タンパク質、アフリベルセプトの発現を示す。各カセットは、ＡＡＶ２の変異型である７ｍ８カプシドにパッケージングした。アッセイに関連するバックグラウンドシグナルは、ビヒクル（緩衝液のみ）非ウイルス対照を用いて決定した。 形質導入の１週間後（図４Ａ）および２週間後（図４Ｂ）の、形質導入したブタ網膜外植片における選択されたポリヌクレオチドカセットからの分泌タンパク質、アフリベルセプトの発現を示す。各カセットは、ＡＡＶ２の変異型である７ｍ８カプシドにパッケージングした。アッセイに関連するバックグラウンドシグナルは、ビヒクル（緩衝液のみ）非ウイルス対照を用いて決定した。 トランスフェクトしたＡＲＰＥ－１９細胞における参照カセット（ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１）を含む種々のポリヌクレオチドカセット構築物からのｓＦＬＴ－１発現の比較を示す。カセット１０、１１、および１２においてｓＦＬＴ－１をコードする配列をコドン最適化（「ＣО」）した。基本プラスミドは、ユビキタスプロモーター下でコドン最適化されたｓＦＬＴ－１のみを有していたが、いずれか他の調節エレメントは有していなかった。 トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における種々の構築物からのｓＦＬＴ－１発現の比較を示す。 トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞における参照カセット（ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１）を含む種々の構築物からのｓＦＬＴ－１発現の比較を示す。 トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるポリヌクレオチドカセットＣ７、Ｃ１１、およびＣ１３からの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を、ＣＭＶ参照対照カセットからのＧＦＰの発現と比較して、およびビヒクル（緩衝液のみ）対照と比較して示す。 形質導入したＨＥＫ２９３細胞における種々のポリヌクレオチドカセットからのｓＦＬＴ－１発現の比較を示す。データは、７ｍ８ベクターで形質導入してから３日後の細胞培養上清中のｓＦＬＴ－１の量を表す。各場合において、示されるカセットをベクターにパッケージングした。カセットＣ１０およびＣ１１からのｓＦＬＴ－１の発現（細胞培養上清中で測定）を、ＣＭＶ参照カセットからのｓＦＬＴ－１の発現と比較した。バックグラウンドシグナルは、ビヒクル（緩衝液のみ）対照を用いて決定した。さらなる対照として、ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１参照対照カセットを含む組換えＡＡＶ２ベクターで細胞を形質導入した。１回目の実験では、カセット１１から分泌されたｓＦＬＴ１の量がイムノアッセイの範囲より高かったため、さらに希釈して分析しなければならなかった。 形質導入したブタ網膜外植片における選択されたポリヌクレオチドカセットからのｓＦＬＴ１の発現を示す。ｓＦＬＴ１の発現は、上清中（図１０Ａ）および組織ライセート中（図１０Ｂ）で測定される。 形質導入したブタ網膜外植片における選択されたポリヌクレオチドカセットからのｓＦＬＴ１の発現を示す。ｓＦＬＴ１の発現は、上清中（図１０Ａ）および組織ライセート中（図１０Ｂ）で測定される。 カセット１１を含む組換えプラスミドの例示的な一実施例を示す。アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）からの逆位末端配列（ＩＴＲ）はカセットに隣接している。

本開示は、細胞における遺伝子の発現のためのポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターを提供する。また、薬学的組成物、および、例えば、個体において、例えば、障害の治療または予防のために、細胞における遺伝子の発現を促進する際に該組成物のいずれかを使用するための方法も提供される。本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下により完全に記載されるような組成物および方法の詳細を読むと当業者により明白になるであろう。

定義
「非天然」ポリヌクレオチドカセットは、天然には見られないポリヌクレオチドカセットである。

本明細書において「分泌タンパク質」とも称される「分泌型タンパク質」または「分泌型ポリペプチド」は、生細胞によって分泌されるかまたはそこから輸送される任意のタンパク質である。本明細書に記載されるポリヌクレオチドカセットとともに使用される分泌型タンパク質の非限定的な一例は、ｓＦＬＴ－１である。

用語「疾患」、「障害」、および「疾病」は、同義であり、本明細書において互換的に使用される。

本明細書で使用される「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか、またはそれと会合し、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができる巨大分子または巨大分子の会合を指す。例示的なベクターとして、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（すなわち、アデノ随伴ウイルス等のウイルス）、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。

用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、別様に必要とされる場合を除いて、全ての亜型、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ－７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ－８）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す等である。

「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶ」と称される。一般に、異種ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される。

本発明のＡＡＶウイルスベクターに関して本明細書で使用される「複製欠損」という用語は、ＡＡＶベクターがそのゲノムを独立して複製およびパッケージングすることができないことを意味する。例えば、対象の細胞をｒＡＡＶビリオンに感染させた場合、感染細胞において異種遺伝子が発現されるが、感染細胞がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実に起因して、ｒＡＡＶはさらに複製することができない。

本明細書で使用される「ＡＡＶ変異型」または「ＡＡＶ変異体」は、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質からなるウイルス粒子を指し、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、変異型カプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して網膜細胞の感染性の増大を付与し、ＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質中に存在するアミノ酸配列を含まない。本開示のポリヌクレオチド発現カセットは、標的組織における特定の細胞型（例えば、網膜細胞）へのカセットの送達を促進するために、変異型ＡＡＶ粒子にパッケージングすることができる。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」または「コード配列」は、インビトロまたはインビボで遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を指す。用語「導入遺伝子」は、ベクターによって細胞内に送達されるコード配列または遺伝子を指す。コード配列または遺伝子は、ペプチドまたはポリペプチド分子をコードすることができる。

本明細書で使用される場合、「治療用遺伝子」および「治療用タンパク質」は、発現させると、それが存在する細胞もしくは組織に対して、または該遺伝子またはタンパク質が発現する哺乳動物に対して有益な効果を付与する遺伝子またはタンパク質を指す。有益な効果の例は、状態もしくは疾患の徴候もしくは症状の軽減もしくは寛解、状態もしくは疾患の予防もしくは阻害、または所望の特徴の付与であってもよい。治療用遺伝子および治療用タンパク質は、細胞または哺乳動物における遺伝的欠損を補正する遺伝子およびタンパク質を含む。

本発明のポリヌクレオチドカセット、組換えウイルス、または薬学的組成物の「治療有効量」または「有効量」は、対象における疾患または疾病の１つ以上の徴候または症状の軽減をもたらすのに十分な量であり、対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。

本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」という用語は、ペプチドまたはタンパク質等のポリヌクレオチド配列の所望の発現産物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。用語「ペプチド」は、約５０アミノ酸またはそれよりも少ないアミノ酸のポリマーを指す。また、この用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、またはリン酸化によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。いくつかの場合において、主題のポリペプチドは、５０アミノ酸を超える長さを有し得る。

「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キット等において必要とされるが、例えば、特許請求の範囲に記載の範囲内で組成物、方法、キット等を形成するために他の要素が含まれていてもよいことを意味する例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて他の要素、例えば、ポリアデニル化配列、エンハンサーエレメント、他の遺伝子、リンカードメイン等を含み得る発現カセットである。

「～から本質的になる」とは、例えば、組成物、方法、キット等の基本的および新規特徴（複数可）に実質的な影響を与えない特定の材料またはステップに対して記載される、例えば、組成物、方法、キット等の範囲の限界を意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、およびポリアデニル化配列「から本質的になる」発現カセットは、それらが遺伝子の転写または翻訳に実質的に影響を与えない限り、追加の配列、例えば、リンカー配列を含んでもよい。別の例として、列挙される配列「から本質的になる」変異型、または変異体、ポリペプチド断片は、それが由来する全長ナイーブポリペプチドに基づいて配列の境界に、列挙される配列のアミノ酸配列プラスまたはマイナス約１０アミノ酸残基の（例えば、列挙される結合アミノ酸残基よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１残基少ない、または列挙される結合アミノ酸残基よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０残基多い）アミノ酸配列を有する。

「～からなる」とは、組成物、方法、またはキットから、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、ステップ、または成分が除外されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、およびポリアデニル化配列から「なる」発現カセットは、プロモーター、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化配列のみからなる。別の例として、列挙される配列「からなる」ポリペプチドは、列挙される配列のみを含有する。

本明細書で使用される「発現ベクター」は、対象となる遺伝子産物をコードする主題のポリヌクレオチドカセットを含むベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソーム等を包含し、主題のポリヌクレオチドを目的の標的細胞に送達するために使用される。

本明細書で使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を誘導し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は遍在性であり得、これは、幅広い細胞、組織、および種において非常に活性であるか、または細胞型特異的、組織特異的、もしくは種特異的であることを意味する。プロモーターは、「構成的」であり得る、すなわち、絶えず活性であってもよいか、または「誘導性」であり得る、すなわち、生物的または非生物的要因の存在または不在によってプロモーターが活性化または非活性化されてもよい。本発明の核酸構築物またはベクターには、プロモーター配列と連続していてもまたはしていなくてもよいエンハンサー配列も含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼし、ネイティブな遺伝子の５’または３’領域に位置し得る。

本明細書で使用される「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントを包含する。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも称される。エンハンサーは、コード配列から、および転写される領域の下流の位置から、数キロベース対（ｋｂ）までの距離にわたって、いずれの方向にも機能することができる（すなわち、コード配列と会合することができる）。

本明細書で使用される「ポリアデニル化シグナル配列」は、ポリアデニル化コンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡが後に続く、ＲＮＡ転写物のエンドヌクレアーゼ切断に必要な認識領域を包含する。ポリアデニル化シグナル配列は、「ポリＡ部位」、すなわち、転写後ポリアデニル化によってアデニン残基が付加されるＲＮＡ転写物上の部位を提供する。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル配列、ポリアデニル化配列等が並列しており、エレメントが予測された様式でそれらが作動することを可能にする関係にあることを指す例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、プロモーターはコード領域に作動可能に連結される。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。

本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学の技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。別の例として、そのネイティブなコード配列から取り出され、天然では連結して見られないコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶには通常含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。

ヌクレオチド分子または遺伝子産物に関して本明細書で使用される「内在性」という用語は、宿主ウイルスまたは細胞に天然に存在するかまたはそれに付随する核酸配列、例えば、遺伝子もしくは遺伝子エレメント、または遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質を指す。

本明細書で使用される「ネイティブ」という用語は、野生型ウイルスまたは細胞に存在するヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、または遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質を指す。

本明細書で使用される「変異型」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の変異体、すなわち、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して１００％未満の配列同一性を有するものを指す。換言すると、ポリペプチド変異型は、参照ポリペプチド配列、例えば、ネイティブなポリペプチド配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、ポリヌクレオチド変異型は、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチド配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオシドの差異（例えば、ヌクレオチドもしくはヌクレオシドの置換、挿入、もしくは欠失）を含む。

本明細書で使用される場合、「配列同一性」または「パーセント同一性」という用語は、ヌクレオチド配列アラインメントプログラムを使用して整列させたときの２つ以上のポリヌクレオチドの間、またはアミノ酸配列アラインメントプログラムを使用して整列させたときの２つ以上のポリペプチド配列の間の同一性の程度を指す。同様に、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、２つ以上のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、例えば、配列比較アルゴリズム、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム等を使用して、または目視検査によって測定される、最大一致について比較および整列させたときに同じかまたは特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つの配列を指す。例えば、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いて決定することができる。別の例として、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いて決定することができる。特に好ましいパラメータのセット（および別段の指定がない限り使用されるべきもの）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を用いたＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列である。２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（１９８９，Ｃａｂｉｏｓ，４：１１－１７）を使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。本明細書に記載される核酸配列およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公的データベースに対して検索を実行するための「問い合わせ配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行い、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索行い、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ挿入アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９－３４０２）に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。

本明細書で使用される場合、「生物活性」および「生物学的に活性な」という用語は、細胞内の特定の生物学的エレメントに起因する活性を指す。例えば、「免疫グロブリン」、「抗体」またはその断片もしくは変異型の「生物活性」は、抗原性決定基に結合し、それによって免疫学的機能を促進する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異型の生物活性は、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異型が、例えば、結合、酵素活性等のネイティブな機能を行う能力を指す。第３の例として、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列等の生物活性は、調節エレメントまたはその機能的断片もしくは変異型が、それが作動可能に連結した遺伝子の発現の翻訳を調節する、すなわち、それぞれ、促進する、増強する、または活性化する能力を指す。

「投与」または「導入」という用語は、本明細書で使用される場合、組換えタンパク質発現のためのベクターを、細胞に、対象の細胞および／もしくは器官に、または対象に送達することを指す。そのような投与または導入は、インビボ、インビトロ、またはｅｘ ｖｉｖｏで行われ得る。遺伝子産物の発現のためのベクターは、典型的には、物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクションまたはリポフェクション）によって異種ＤＮＡを細胞に挿入することを意味するトランスフェクションによって、または、典型的には、感染病原体、すなわち、ウイルスもしくはウイルスベクターによって核酸分子を細胞に導入することを指す感染もしくは形質導入によって、細胞に導入することができる。

典型的には、異種ＤＮＡ（すなわち、ベクター）を細胞に投与、導入、または挿入するために用いられる手段に応じて、細胞は、「形質導入した」、「感染させた」、「トランスフェクトした」、または「形質転換した」と称される。ＤＮＡがウイルスまたはウイルスベクターによって細胞に導入される場合、細胞は外来性または異種ＤＮＡで形質導入される。ＤＮＡが非ウイルス法によって細胞に導入される場合、細胞は外来性または異種ＤＮＡでトランスフェクトされる。非ウイルス法は、化学的方法（例えば、リポフェクション）および非化学的方法を含む。用語「形質導入した」および「感染させた」は、ウイルスまたはウイルスベクターから異種ＤＮＡまたは異種ポリヌクレオチドを受け取った細胞を指すために本明細書において互換的に使用される。

「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターで形質導入した、感染させた、トランスフェクトした、または形質転換した細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であり得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に用いられたものであり、当業者には明白であろう。「宿主細胞」という用語は、元の形質導入した、感染させた、トランスフェクトした、または形質転換した細胞、およびその後代を指すことを理解されたい。

用語「治療」および「治療すること」は、疾患または障害の１つ以上の徴候または症状の軽減を指す。

「眼疾患」は、眼、または眼の部分もしくは領域の１つ以上に発症するかまたは関与する疾患、病気、または状態を意味する。そのため、眼疾患は、網膜疾患、または眼の後にある組織の感光層に発症する疾患を含む。眼は、眼球ならびに眼球を構成する組織および流体、眼周囲筋（斜紋筋および直筋等）、ならびに眼球内にあるかまたは眼球に隣接する視神経の一部を含む。

組織「外植片」は、動物から栄養培地に移された組織片である。

「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、限定されないが、サルおよびヒトを含むヒトおよび非ヒト霊長類；哺乳動物の競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ等）；哺乳動物の愛玩動物（イヌ、ネコ等）；およびげっ歯類（例えば、マウス、ラット等）を含む哺乳動物を指す。

本発明の種々の組成物および方法を以下に記載する。特定の組成物および方法が本明細書において例示されているが、多くの代替的な組成物および方法のいずれも、本発明を実施する際に使用するのに適用可能であり好適であることを理解されたい。また、本発明の発現構築物および方法の評価は、当該技術分野において標準的な手順を用いて行われ得ることも理解されたい。

本発明の実践には、別段の指示がない限り、当該技術分野の技能の範囲内である、細胞生物学、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、生化学、および免疫学の従来の技法が用いられる。そのような技法は、各々が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；および“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）等の文献に完全に説明されている。

本発明のいくつかの態様が、例示のために例示的な用途を参照して以下に記載される。多数の特定の詳細、関係、および方法は、本発明の完全な理解を提供するために記載されていることを理解されたい。しかしながら、本発明は、特定の詳細のうちの１つ以上を用いずに、または他の方法を用いて実施され得ることは、関連技術分野の当業者には容易に理解されよう。本発明は、例示される行為または事象の順序によって限定されず、いくつかの行為は、他の行為または事象と異なる順序で、かつ／またはそれと同時に行われ得る。さらに、例示される行為または事象の全てが本発明による方法を実行するために必要であるとは限らない。

本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の形態も同様に含むことが意図される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限り、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、包括的なものであることが意図される。

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し、それは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、１以内のまたは１を超える標準偏差を意味し得る。代替として、「約」または「およそ」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、およびより好ましくはさらに１％までの範囲を意味し得る。代替として、特に生体系または生物学的過程に関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、特定の値について許容誤差範囲内であることを意味する「約」という用語が想定されるべきである。

本明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が生じる場合には、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも取って代わることを理解されたい。

特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的な要素を排除するように立案され得ることにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」等の排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図される。

本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立して確認する必要があり得る。

別段の指示がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施には、当業者の知識の範囲内である微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法が用いられる。

組成物
本開示のいくつかの態様において、真核生物細胞（複数可）における導入遺伝子の発現のための組成物が提供される。いくつかの態様において、真核生物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、網膜細胞、例えば、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容体細胞、錐体細胞、桿体細胞、ミュラーグリア細胞、または網膜色素上皮細胞である。

本開示のいくつかの実施形態において、組成物はポリヌクレオチドカセットである。「ポリヌクレオチドカセット」は、典型的には、互いに作動可能に連結した、２つ以上の機能的ポリヌクレオチド配列、例えば、調節エレメント、翻訳開始配列、コード配列、終結配列等を含むポリヌクレオチド配列を意味する。一般に、主題のポリヌクレオチド配列はＤＮＡからなる。同様に、「哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現のためのポリヌクレオチドカセット」は、細胞における導入遺伝子の発現を促進する２つ以上の機能的ポリヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’ＵＴＲ、翻訳開始配列、コード配列、終結配列等を意味する。

例えば、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）任意選択的に、第１のエンハンサー領域、（ｂ）プロモーター領域（プロモーター領域は真核生物細胞に特異的である）、（ｃ）ポリペプチド遺伝子産物をコードするコード配列、（ｄ）第２のエンハンサー領域、および（ｅ）ポリアデニル化部位を含む。なおも他の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、コード配列の上流に５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む。さらに他の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、プロモーターの下流かつコード配列の上流にイントロン領域をさらに含む。他の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、第２のエンハンサーの下流かつポリアデニル化部位の上流にＲＮＡ核外輸送シグナルをさらに含む。本明細書に開示されるポリヌクレオチドカセットに関して、コード配列は、カセット内の発現対照配列に作動可能に連結されることを理解されたい。例えば、コード配列は、プロモーター領域、エンハンサー領域（複数可）、およびポリアデニル化部位に作動可能に連結される。

いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドカセットは、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強を提供する。ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチドカセット内の２つ以上の機能的ポリヌクレオチド配列の構成は、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強を提供する。「増強される」とは、本開示のポリヌクレオチドカセットを保有する細胞において、調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を保有する細胞と比較して、導入遺伝子の発現が増加する、増大する、またはより強力であることを意味する。換言すると、本開示のポリヌクレオチドカセットからの導入遺伝子の発現は、本開示の１つ以上の最適化されたエレメントを含まないポリヌクレオチドカセット、すなわち、本明細書に記載されるＣＭＶ参照対照カセット等の参照対照カセットからの発現と比較して増加する、増大する、またはより強力である。ある特定の実施形態において、発現増強は、１つ以上の所望の細胞型に特異的であるかまたは限定される。一実施形態において、導入遺伝子は、細胞からその細胞を取り囲む水性環境に分泌されたタンパク質をコードする。

例えば、本明細書に開示されるプロモーターを含むポリヌクレオチドカセットを含む細胞では、異なるプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を保有する細胞におけるよりも、導入遺伝子の発現が増強され得る、または増大し得る、またはより強力であり得る。別の例として、本明細書に開示されるエンハンサー配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む細胞では、異なるエンハンサー配列に作動可能に連結された導入遺伝子を保有する細胞におけるよりも、導入遺伝子の発現が増強され得る、または増加し得る、増大し得る、またはより強力であり得る。別の例として、本明細書に開示される５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドカセットを含む細胞では、異なる５’ＵＴＲコード配列に作動可能に連結された導入遺伝子を保有する細胞におけるよりも、導入遺伝子の発現が増強され得る、または増加し得る、増大し得る、またはより強力であり得る。別の例として、本明細書に開示されるイントロンを含むポリヌクレオチドカセットを含む細胞では、異なるイントロン配列に作動可能に連結された導入遺伝子を保有する細胞におけるよりも、導入遺伝子の発現が増強され得る、または増加し得る、増大し得る、またはより強力であり得る。さらに別の例として、本明細書に開示されるイントロンを含むポリヌクレオチドカセットを含む細胞では、本明細書に記載されるＣＭＶ参照対照カセット等の参照対照カセットに作動可能に連結された導入遺伝子を保有する細胞におけるよりも、導入遺伝子の発現が増強され得る、または増加し得る、増大し得る、またはより強力であり得る。

好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド発現カセットは、インビトロおよびインビボで１つ以上の特定の細胞型または組織型における導入遺伝子の発現（または参照カセットと比較してより高いレベルの発現）を促進する。細胞型の例として、限定されないが、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞（ヒト網膜色素上皮細胞株）、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容体細胞、錐体細胞、桿体細胞、ミュラーグリア細胞、および網膜色素上皮細胞が挙げられる。別の実施形態において、発現増強は、網膜組織外植片の細胞に観察される。

いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞におけるポリヌクレオチドカセットからの分泌型ポリペプチドの発現は、インビトロまたはインビボでの哺乳動物細胞における参照カセットからの分泌型ポリペプチドの発現よりも少なくとも約２Ｘ、３Ｘ、５Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、２０Ｘ、または５０Ｘ高い。より一般的には、分泌型ポリペプチドの発現は、哺乳動物細胞における参照カセットからのポリペプチドの発現よりも２～１０Ｘ、５～１０Ｘ、９～１０Ｘ、少なくとも２Ｘ、少なくとも５Ｘ、または少なくとも１０Ｘ高い。他の言い方をすると、ポリヌクレオチドカセットは、哺乳動物細胞培養物中（例えば、哺乳動物細胞の重複培養物中）の参照カセットから得られるものよりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、または約５～約１０倍高いかまたはそれを上回るレベルで哺乳動物細胞において分泌型タンパク質を発現する。

理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞における、または細胞外環境（例えば、培養上清または組織基質）における細胞外での導入遺伝子の発現増強は、細胞における遺伝子産物がより迅速に蓄積すること、または細胞における遺伝子産物がより安定であることに起因すると考えられる。したがって、本開示のポリヌクレオチドカセットによる導入遺伝子の発現増強は、多くの様式で観察され得る。例えば、ポリヌクレオチドカセットを細胞と接触させた後の導入遺伝子の発現が、導入遺伝子が本明細書に開示されるＣＭＶ参照対照カセットにおけるもの等の同等の調節エレメントに作動可能に連結された場合に検出されるであろう発現よりも早く、例えば、７日早く、２週間早く、３週間早く、４週間早く、８週間早く、１２週間早く、またはそれよりも早く検出されることによって発現増強が観察され得る。発現増強は、細胞当たりの遺伝子産物の量の増加によっても観察され得る。例えば、哺乳動物細胞当たりの遺伝子産物の量には、２倍以上の増加、例えば、３倍以上の増加、４倍以上の増加、５倍以上の増加、または１０倍以上の増加が見られる可能性がある。発現増強は、ポリヌクレオチドカセットに保有される検出可能なレベルの導入遺伝子を発現する哺乳動物細胞の数の増加としても観察され得る。例えば、検出可能なレベルの導入遺伝子を発現する哺乳動物細胞の数には、２倍以上の増加、例えば、３倍以上の増加、４倍以上の増加、５倍以上の増加、または１０倍以上の増加が見られる可能性がある。別の例として、本発明のポリヌクレオチドは、従来のポリヌクレオチドカセットと比較してより大きなパーセンテージの細胞において検出可能なレベルの導入遺伝子を促進することができる：例えば、従来のカセットが、例えば、ある特定の領域内の細胞の５％未満で検出可能なレベルの導入遺伝子発現を促進することができる場合、本発明のポリヌクレオチドは、その領域内の細胞の５％以上で検出可能なレベルの発現を促進し、例えば、接触した細胞の１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、または４５％以上、いくつかの場合において、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上が、検出可能なレベルの遺伝子産物を発現する。発現増強は、細胞の生存能および／または機能における変化としても観察され得る。

本開示のポリヌクレオチドカセットは、典型的には、プロモーター領域を含む。ある特定の実施形態において、プロモーター領域は、哺乳動物細胞におけるコード配列の発現を促進する。いくつかの場合において、プロモーターは、ユビキタスプロモーター、すなわち、広範囲の細胞、組織、および種において活性なプロモーターである。好適な例として、アクチン、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１ａ）、およびグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターが挙げられる。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは１つ以上のエンハンサーを含む。エンハンサーは、転写を増強する核酸エレメントである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、コード配列の上流に第１のエンハンサーを含み、コード配列の下流に第２のエンハンサーを含む。例示的な好適なエンハンサーとして、限定されないが、ＥＦ１ａ、ＣＭＶ、完全ＥＥＳまたはその一部、例えば、４１０～５６４ＥＥＳもしくは５１１～８１０ＥＥＳが挙げられる。ＥＥＳ（発現エンハンサー配列）は、ヒトβインターフェロンのヒト足場付着領域またはＳＡＲに対応する（Ａｇａｒｗａｌ，Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（５）：３７２０－３７２８）。ある特定の実施形態において、上流エンハンサーは、限定されないがＥＦ１ａまたはＣＭＶを含む。ある特定の実施形態において、下流エンハンサーは、限定されないが、完全発現エンハンサー配列（完全ＥＥＳ）、４１０～５６４ＥＥＳ、または５１１～８１０ＥＥＳを含む。

いくつかの実施形態において、主題のポリヌクレオチドカセットは、５’非翻訳領域をコードする配列、すなわち、コード配列に非翻訳領域５’（５’ＵＴＲとも称される）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲはポリヌクレオチドＡＴＧを含まない。例示的な好適な５’ＵＴＲ配列として、限定されないが、ｉ）アデノウイルス由来のトリパータイトリーダー配列（ＴＰＬ）（Ｌｏｇａｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．（Ｊｕｎｅ １９８４）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｌａｔｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３６５５－３６５９）、ｉｉ）アデノウイルス主要後期プロモーター由来のエンハンサーエレメント配列（ｅＭＬＰ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－ｇｒｏｗｉｎｇ ｈｕｍａｎ ２９３－ＥＢＮＡ１ ｃｅｌｌｓ”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（２）：ｅ９）、ｉｉｉ）ＵＴＲ１、およびｉｖ）ＵＴＲ２から選択される配列を含む。好ましい実施形態において、５’ＵＴＲは、５’から３’の順に、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列を含む。

いくつかの実施形態において、主題のポリヌクレオチドカセットは、スプライスドナー／アクセプター領域を含むイントロンをさらに含む。いくつかの実施形態において、イントロンは、プロモーター領域の下流に位置し、かつ遺伝子の翻訳開始配列の上流に位置する。イントロンは、ＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡプロセシングの間にイントロンスプライシングによって除去される、ＤＮＡポリヌクレオチドである。イントロンを含有するポリヌクレオチドカセットは、一般に、イントロンを含まないものよりも高い発現を有する。イントロンは、発現を２倍～５００倍刺激することができる（Ｂｕｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，１９８８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ，８（１０）：４３９５）。効率的にスプライシングされたイントロンは、プレスプライスドナー、分岐部位、およびＰｙリッチ領域を含有する（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ，１９９０；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，２５２－７８；Ｗｕ ａｎｄ Ｋｒａｉｎｅｒ，１９９９；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９（５）：３２２５－３６）。５’イントロンは、一般に、３’末端にあるイントロンと比較してより効率的である（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，１９９０；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ，１０：１８０５）。イントロンは、一般に、遺伝子発現レベルを上昇させることが知られているが、所与のｃＤＮＡの特異的な増加（ある場合は）は経験的であり、試験されなければならない：例えば、ｐＳＩベクター内のキメライントロンは、ＣＡＴ発現を２１倍増加させるが、ルシフェラーゼ発現は３倍増加させるのみである。例示的なイントロン配列として、限定されないが、アクチン、伸長因子１α（ＥＦ１ａ）、アデノウイルス主要後期プロモーター由来のエンハンサー（ｅＭＬＰ）、およびＣＭＶｃに由来する配列が挙げられる。

細胞で発現されるコード配列は、任意のポリヌクレオチド配列であり得、例えば、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子またはｃＤＮＡであってもよい。コード配列は、それが作動可能に連結したプロモーター配列および／または５’ＵＴＲ配列に対して異種であり得る、すなわち、天然ではそれと作動可能に会合していない場合がある。代替として、コード配列は、それが作動可能に連結したプロモーター配列および／または５’ＵＴＲ配列に対して内在性であり得る、すなわち、天然ではそのプロモーターまたは５’ＵＴＲと会合している。遺伝子産物は、哺乳動物細胞において内因的に作用してもよいか、または外因的に作用してもよく、例えば、分泌されてもよい。例えば、導入遺伝子が治療用遺伝子である場合、コード配列は、疾患または障害を治療するための治療薬として使用することができる所望の遺伝子産物またはその機能的断片もしくは変異型をコードする任意の遺伝子であり得る。したがって、ポリヌクレオチドカセットのコード配列は、例えば、オプシンタンパク質もしくはＶＥＧＦを阻害するタンパク質をコードすることができるか、またはポリヌクレオチドは、疾患の１つ以上の徴候または症状を軽減するのに有効なタンパク質もしくは酵素をコードすることができる。

種々の好ましい実施形態において、導入遺伝子は、細胞から分泌されるペプチドまたはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、分泌タンパク質は、治療用タンパク質、または対象の疾患の治療に有効なタンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、抗血管新生ポリペプチド、または新しい血管の成長（血管新生）を阻害するポリペプチドである。いくつかの形態において、分泌タンパク質は、抗ＶＥＧＦタンパク質、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害するタンパク質である。抗ＶＥＧＦタンパク質の例として、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびアフリベルセプトが挙げられる。抗ＶＥＧＦポリペプチドの別の例は、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ－１）である。他の場合において、分泌タンパク質は、米国特許第５，７１２，３８０号、同第５，８６１，４８４号、および同第７，０７１，１５９号に開示されるもののいずれか等のＶＥＧＦ結合タンパク質もしくはその機能的断片、または、例えば、米国特許第７，６３５，４７４号に開示されるＶＥＧＦ結合融合タンパク質を含むかまたはそれからなる。いくつかの形態において、分泌タンパク質は、例えば、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体等の一本鎖抗体を含むかまたはそれからなる。一実施形態によれば、導入遺伝子はｓＦＬＴ－１をコードし、より具体的な実施形態ではヒトｓＦＬＴ－１をコードする。代替として、導入遺伝子は、ｓＦＬＴ－１の機能的ＶＥＧＦ結合断片を含む配列を含んでもよい（Ｗｉｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｃｅｌｌ，９１：６９５－７０４）。別の実施形態によれば、導入遺伝子は、Ａ１ＡＴまたはα１アンチトリプシンをコードし（Ｃｈｉｕｃｈｉｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，２４（４）：１６１－１７３；Ｓｔｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ａｂｏｕｓｓｏｕａｎ（２０１２）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１８５（３）：２４６－５９）、これはＡ１ＡＴ欠損に関連する疾患を治療するための方法に使用され得る。

ｓＦＬＴ－１は、ＶＥＧＦ受容体ＦＬＴ－１の可溶性切断型であり、可溶性血管内皮増殖因子受容体－１（ｓＶＥＧＦＲ－１）としても知られている。組換えｓＦＬＴ－１は、ＶＥＧＦに結合して阻害する（Ｋｅｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，１９９３；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９０（２２）：１０７０５－１０７０９）。天然において、それは交互のｍＲＮＡスプライシングによって生成され、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域、および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。本明細書に記載される場合、「可溶性」ＦＬＴ－１またはｓＦＬＴ－１は、細胞膜に限定されないＦＬＴ－１を指す。未結合のｓＦＬＴ－１は、細胞外空間または溶液中で自由に拡散することができる。

本発明の一実施形態において、導入遺伝子コード配列は、出現頻度の低いコドンをより高い出現頻度のコドンで置き換えることによって発現を増強するように改変されるかまたは「コドン最適化される」。コード配列は、翻訳のためにアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の一部である。翻訳中、６１個のトリヌクレオチドコドンの各々が２０個のアミノ酸のうちの１つに翻訳され、遺伝暗号に縮重または重複性が生じる。しかしながら、異なる細胞腫および異なる動物種は、同じアミノ酸をコードするｔＲＮＡ（各々がアンチコドンを有する）を異なる頻度で用いる。遺伝子配列が、対応するｔＲＮＡでの出現頻度の低いコドンを含有する場合、リボソーム翻訳機構が遅くなり、効率的な翻訳が妨げられる可能性がある。特定の種に対する「コドン最適化」によって発現を改善することができ、コード配列は、同じタンパク質配列をコードするが、高度に出現するかつ／または高度に発現するヒトタンパク質によって利用されるコドンを利用するように改変される（Ｃｉｄ－Ａｒｒｅｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８）。一態様において、コード配列は、霊長類における翻訳のために最適化される。本発明の一態様において、導入遺伝子のコード配列は、哺乳動物または霊長類において発現頻度の低いコドンを、霊長類において発現頻度の高いコドンで置き換えるように改変される。例えば、いくつかの実施形態において、導入遺伝子によってコードされるコード配列は、上記またはここに開示される配列によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％配列同一性を有するポリペプチドをコードし、コード配列の少なくとも１つのコドンは、ヒトにおいて、上記またはここに開示される配列中の対応するコドンよりも高いｔＲＮＡ頻度を有する。

いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドカセットは、ＲＮＡ核外輸送シグナルをさらに含む。ＲＮＡ核外輸送シグナルは、核からのＲＮＡの輸送を増強するシス作用性転写後調節エレメントである。例示的なＲＮＡ核外輸送配列として、限定されないが、ヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）に由来する配列が挙げられる（Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００７，１４（１７）：１２９８－１３０４）。

いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドカセットは、ポリアデニル化領域をさらに含む。当該技術分野で理解されているように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物は、ポリ（Ａ）シグナル、ポリ（Ａ）領域、またはポリ（Ａ）尾部とも称されるポリアデニル化領域の切断および付加によって終結する。ポリＡ領域は、多くの場合モチーフＡＡＵＡＡＡの反復を有する、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する。ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、およびウサギβグロブリンを含むいくつかの効率的なポリアデニル化部位が同定されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ，２００１；Ｇｅｎｅ ２７２（１－２）：１４９－１５６；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．８１（１－２）：１５５－１６３）。哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させるための最も効率的なポリＡシグナルは、対象となる細胞型および種、ならびに使用される特定のベクターに依存し得る。本発明のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、およびβ－グロブリン（βグロブリン）からなる群から選択されるポリＡ領域を含む。

当業者には理解されるように、上述のポリヌクレオチドエレメントのうちの２つ以上を組み合わせて本開示のポリヌクレオチドカセットを作製することができる。したがって、例えば、主題のポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に作動可能に連結した、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶもしくはＥＦ１αプロモーター、任意選択的にＣＭＶｃもしくはＥＦ１α イントロン、ＵＴＲ１、ＵＴＲ２、またはＴＰＬおよびｅＭＬＰ ５’ＵＴＲ、ｓＦＬＴ１または分泌ポリペプチドに対するコード配列、完全ＥＥＳ、４１０～５６４ＥＥＳ、または５１１～８１０ＥＥＳエンハンサー、任意選択的にＨＰＲＥもしくはＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列、およびＢＧＨ、ＨＧＨ、またはβグロブリンポリアデニル化シグナル配列を含み得る。

別のポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に作動可能に連結した、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列を含む５’ＵＴＲ、治療剤（例えば、治療用ポリペプチド）をコードするコード配列、全長ＥＥＳエンハンサー、およびＨＧＨ ポリＡシグナル配列を含み得る。特定の実施形態において、コード配列は、抗血管新生ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、コード配列はコドン最適化される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号７６～８０から選択される１つ以上の配列を含む。

さらに別の実施例において、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に作動可能に連結した、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列を含む５’ＵＴＲ、治療剤をコードするコード配列、４１０～５６４ＥＥＳエンハンサー、ＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送領域、およびＢＧＨポリアデニル化シグナルを含み得る。特定の実施形態において、コード配列は、抗血管新生ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、コード配列はコドン最適化される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号８１～８６から選択される１つ以上の配列を含む。

さらに別の実施例において、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に作動可能に連結した、ＣＭＶエンハンサー、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦ１αイントロン、ＵＴＲ２ ５’ＵＴＲ、治療剤をコードするコード配列、５１１～８１０ＥＥＳエンハンサー、ＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送領域、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含み得る。特定の実施形態において、コード配列は、抗血管新生ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、コード配列はコドン最適化される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号７０～７５から選択される１つ以上の配列を含む。

さらに別の実施例において、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に作動可能に連結した、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｃイントロン、ＵＴＲ１ ５’ＵＴＲ、治療剤をコードするコード配列、全長ＥＥＳエンハンサー、ＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送領域、およびβ－グロブリン（βグロブリン）ポリアデニル化シグナルを含み得る。特定の実施形態において、コード配列は、抗血管新生ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、コード配列はコドン最適化される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号９２～９５から選択される１つ以上の配列を含む。

さらに別の実施例において、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に作動可能に連結した、ＣＭＶエンハンサー、アクチンプロモーター、ｅＭＬＰイントロン、治療剤をコードするコード配列、５１１～８１０ＥＥＳ配列、ＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列、およびβグロブリンポリアデニル化シグナルを含み得る。特定の実施形態において、コード配列は、抗血管新生ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、コード配列はコドン最適化される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号８７～９１から選択される１つ以上の配列を含む。

さらに別の実施例において、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に作動可能に連結した、ＣＭＶエンハンサー、アクチンプロモーター、ニワトリβ－アクチンイントロン、ＵＴＲ１ ５’ＵＴＲ、治療剤をコードするコード配列、４１０～５６４ＥＥＳ配列、ＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列、およびＢＧＨポリアデニル化部位を含み得る。特定の実施形態において、コード配列は、抗血管新生ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、コード配列はコドン最適化される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号９２～９５から選択される１つ以上の配列を含む。

当業者には理解されるように、ポリヌクレオチドカセットは、限定されないが、クローニングを容易にするための制限部位および特定の遺伝子発現ベクターに対する調節エレメントを含む他のエレメントを任意選択的に含有してもよい。調節配列の例として、ＡＡＶベクターに対するＩＴＲ、プラスミドベクターに対する細菌配列、ファージインテグラーゼベクターに対するａｔｔＰ部位またはａｔｔＢ部位、およびトランスポゾンに対する転移因子が挙げられる。

本明細書に開示されるように、本発明のいくつかの態様において、例えば、遺伝子が細胞の生存能および／または機能に与える影響を決定する、細胞障害を治療する等のために、主題のポリヌクレオチドカセットを使用して遺伝子を動物の細胞に送達する。したがって、本発明のいくつかの態様において、哺乳動物細胞において導入遺伝子の発現を提供する組成物は遺伝子送達ベクターであり、遺伝子送達ベクターは本開示のポリヌクレオチドカセットを含む。

哺乳動物細胞にポリヌクレオチド配列を送達することに使用される任意の好都合な遺伝子送達ベクターは、本開示の遺伝子送達ベクターに包含される。例えば、ベクターは、一本鎖核酸または二本鎖核酸、例えば、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含んでもよい。例えば、遺伝子送達ベクターは、ＤＮＡ、例えば、裸のＤＮＡ、例えば、プラスミド、ミニサークル等であってもよい。ベクターは、ＲＮＡの改変形態を含む一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを含んでもよい。別の例において、遺伝子送達ベクターは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡまたは改変ｍＲＮＡであってもよい。

別の例として、遺伝子送達ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、αウイルスまたはレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））またはレンチウイルス等のウイルスに由来するウイルスベクターであってもよい。アデノ随伴ウイルスの使用を包含する実施形態が以下により詳細に記載されているが、当業者は、当該技術分野における同様の知見および技術が非ＡＡＶ遺伝子送達ベクターにも影響を与えるようになり得ることを理解するであろうと予想される。例えば、米国特許第７，５８５，６７６号および米国特許第８，９００，８５８号におけるレトロウイルスベクターに関する考察、ならびに例えば、米国特許第７，８５８，３６７号におけるアデノウイルスベクターに関する考察を参照されたく、これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、遺伝子送達ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。そのような実施形態において、主題のポリヌクレオチドカセットは、５’末端および３’末端で機能的ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列によって隣接される。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」は、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングに関して意図されるように機能することを意味する。したがって、本発明の遺伝子送達ベクターに使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換によって変更されてもよいか、または、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０のいずれかに由来してもよい。好ましいＡＡＶベクターは、野生型ＲＥＰ遺伝子およびＣＡＰ遺伝子が全部または一部欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持する。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターはＡＡＶ２変異型７ｍ８である。

いくつかの実施形態において、主題のポリヌクレオチドカセットは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０等（いずれも遺伝子送達ベクターとして機能し得る）を含む任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来し得るＡＡＶカプシド内に包まれている。例えば、ＡＡＶカプシドは、野生型、またはネイティブなカプシドであり得る。特に興味深い野生型ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ９を含む。しかしながら、ＩＴＲと同様に、カプシドは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、むしろ、カプシドが哺乳動物細胞を形質導入することができる限り、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、またはＶＰ３配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更されてもよい。換言すると、ＡＡＶカプシドは、変位型ＡＡＶカプシドであってもよく、親カプシドタンパク質、またはそれが由来するＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む。特に興味深い変異型ＡＡＶは、米国特許第９，１９３，９５６号に開示されるものを含み、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、変異型ＡＡＶは、米国特許第９，１９３，９５６号に開示される７ｍ８変異型カプシドタンパク質（本明細書においてＡＡＶ２．７ｍ８または７ｍ８．ＡＡＶ２と称され得る）を含む。他の実施形態において、ＡＡＶは、米国特許第９，２３３，１３１号において配列番号４２として提供されるＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶＳｈＨ１０またはＡＡＶ６カプシドタンパク質を含む。米国特許出願公開第２０１２０１６４１０６号の図８Ａ～図８Ｃは、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質のアミノ酸配列を示しており、それはまたＫｌｉｍｃｚａｋ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ４（１０）：ｅ７４６７（Ｏｃｔｏｂｅｒ １４，２００９）にも記載されている。

好ましくは、ｒＡＡＶは、ＡＡＶベクターがそのゲノムを独立してさらに複製およびパッケージングすることができないという点で複製欠損である。例えば、錐体細胞をｒＡＡＶビリオンで形質導入した場合、形質導入された錐体細胞において遺伝子が発現されるが、形質導入された錐体細胞がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実に起因して、ｒＡＡＶは複製することができない。

本開示のポリヌクレオチドカセットを封入する遺伝子送達ベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）は、標準的な方法を使用して生成することができる。例えば、ｒＡＡＶビリオンの場合、本発明によるＡＡＶ発現ベクターをプロデューサー細胞に導入した後にＡＡＶヘルパー構築物を導入してもよく、ヘルパー構築物は、プロデューサー細胞において発現させることが可能なＡＡＶコード領域を含み、ＡＡＶベクターの非存在下でＡＡＶヘルパー機能を補完する。この後、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターがプロデューサー細胞に導入され、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターは、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支持することが可能なアクセサリー機能を提供する。次いで、プロデューサー細胞を培養してｒＡＡＶを産生させる。これらのステップは、標準的な方法を使用して行われる。本発明の組換えＡＡＶベクターを封入する複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を使用して、当該技術分野で既知の標準的な技法によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号、同第５，７５３，５００号、同第６，０４０，１８３号、同第６，０９３，５７０号、および同第６，５４８，２８６号に見出すことができ、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、パッケージングのためのさらなる組成物および方法は、同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇらの（ＵＳ２００２／０１６８３４２）に記載されている。

インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞と接触させるために、哺乳動物細胞を効率的に形質導入するのに適した任意の濃度のウイルス粒子を調製することができる。例えば、ウイルス粒子は、１０^８ベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）またはそれ以上、例えば、５×１０^８ベクターゲノム／ｍＬ、１０^９ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^９ベクターゲノム／ｍＬ、１０^１０ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１０ベクターゲノム／ｍＬ、１０^１１ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１１ベクターゲノム／ｍＬ、１０^１２ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１２ベクターゲノム／ｍＬ、１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ、１．５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ、３×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ、７．５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ、９×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ、１×１０^１４ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１４ベクターゲノム／ｍＬまたはそれ以上であるが、典型的には１×１０^１５ベクターゲノム／ｍＬ以下の濃度で製剤化され得る。同様に、所望の効果を付与するためまたは疾患を治療するために、細胞の適切な形質導入を提供するのに適した任意の総数のウイルス粒子を哺乳動物に投与することができる。種々の好ましい実施形態において、眼当たり少なくとも１０^８、５×１０^８、１０^９、５×１０^９、１０^１０、５×１０^１０、１０^１１、５×１０^１１、１０^１２、５×１０^１２、１０^１３、１．５×１０^１３、３×１０^１３、５×１０^１３、７．５×１０^１３、９×１０^１３、１×１０^１４個のウイルス粒子、または５×１０^１４個のウイルス粒子もしくはそれ以上であるが、典型的には１×１０^１５個以下のウイルス粒子が注射される。哺乳動物または霊長類の眼に任意の適切な回数のベクターの投与が行われ得る。一実施形態において、方法は単回投与を含み、他の実施形態において、担当臨床医によって適切であるとみなされる期間にわたって複数回の投与が行われる。

主題のウイルスベクターは、任意の好適な単位用量のベクターを含む薬学的組成物に製剤化することができ、対象に変化をもたらすため、または対象の疾患を治療するために対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、単位用量は、限定されないが、１×１０^８ベクターゲノムのウイルスベクターまたはそれ以上、例えば、少なくとも約１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、または少なくとも約３×１０^１４ベクターゲノムまたはそれ以上、特定の場合には、少なくとも約１×１０^１４ベクターゲノムであるが、通常は４×１０^１５ベクターゲノム以下を含む。ある場合には、単位用量は、多くとも約５×１０^１５ベクターゲノム、例えば、１×１０^１４または５×１０^１４ベクターゲノムまたはそれ以下、例えば、１×１０^１３、１×１０^１２、１×１０^１１、１×１０^１０、または１×１０^９ベクターゲノムもしくはそれ以下であり、特定の場合には１×１０^８ベクターゲノムまたはそれ以下であり、典型的には１×１０^８ベクターゲノムまたはそれ以上を含む。ある場合には、単位用量は、１×１０^１０～１×１０^１１ベクターゲノムを含む。ある場合には、単位用量は、１×１０^１０～３×１０^１２ベクターゲノムを含む。ある場合には、単位用量は、１×１０^９～３×１０^１３ベクターゲノムを含む。ある場合には、単位用量は、１×１０^８～３×１０^１４ベクターゲノムを含む。ある場合には、単位用量は、約１×１０^１０～約５×１０^１４ベクターゲノムを含む。

ある場合には、薬学的組成物の単位用量は、感染多重度（ＭＯＩ）を用いて測定することができる。ＭＯＩは、核酸が送達され得る細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比率または多重度を意味する。ある場合には、ＭＯＩは１×１０^６であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０^５～１×１０^７であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０^４～１×１０^８であり得る。ある場合には、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、および１×１０^１８ＭＯＩである。ある場合には、本開示の組換えウイルスは１×１０^８～３×１０^１４ＭＯＩである。ある場合には、本開示の組換えウイルスは、多くとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、および１×１０^１８ＭＯＩである。

いくつかの態様において、薬学的組成物の量は、約１×１０^８～約１×１０^１５個の組換えウイルス、約１×１０^９～約１×１０^１４個の組換えウイルス、約１×１０^１０～約１×１０^１３個の組換えウイルス、または約１×１０^１１～約３×１０^１２個の組換えウイルスを含む。

主題のｒＡＡＶ組成物の調製において、例えば、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物および酵母を含む、ｒＡＡＶビリオンを産生するための任意の宿主細胞が用いられ得る。宿主細胞はまた、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞において安定に維持されるパッケージング細胞であってもよいか、またはＡＡＶベクターゲノムが安定に維持およびパッケージングされるプロデューサー細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞およびプロデューサー細胞は、ＳＦ－９、２９３、Ａ５４９、またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して精製および製剤化される。

本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。例えば、一実施形態は、本開示のポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組換えウイルスを含む薬学的組成物である。特定の実施形態において、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターは、一般に安全、無毒性、かつ望ましい製剤の調製において有用な薬学的に許容される担体、希釈剤、および試薬と組み合わせることができ、霊長類への使用が許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体であり得るか、または、エアロゾル組成物の場合には気体であり得る。そのような担体または希釈剤の例として、限定されないが、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。また、補助的な活性化合物も製剤に組み入れることができる。製剤に使用される溶液または懸濁物として、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化化合物；アセテート、シトレートまたはホスフェート等の緩衝液；凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ２０等の洗浄剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧を調整するための化合物を挙げることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基を用いて調整することができる。特定の実施形態において、薬学的組成物は無菌である。

錐体細胞をインビボで接触させる場合、主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターは、眼への送達に適切であるように処理され得る。

本発明における使用に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液、または滅菌注射液もしくは分散液を即時調製するための分散液および滅菌粉末をさらに含む。したがって、薬学的組成物は、滅菌注射液の形態であってもよい。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。ある場合には、組成物は無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度まで流体であるべきである。ある特定の実施形態において、組成物は製造および保存条件下で安定であり、また、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトール等）、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。内部組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。

滅菌溶液は、必要に応じて、上に列挙される成分の１つまたはその組み合わせを含む適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組み込み、その後で濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本の分散媒、および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を得る。

一実施形態において、組成物は、遺伝子カセットまたは発現ベクターを体からの急速な排出から保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明白であろう。材料は、商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。

経口組成物、点眼組成物、または非経口組成物を、投与の容易さおよび用量の均一性のために単位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のために単位として用いられる用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の遺伝子送達ベクターまたはポリヌクレオチドカセットを含有する。本発明の単位剤形の仕様は、遺伝子送達ベクター、ポリヌクレオチドカセットの独特の特徴、および達成されるべき特定の治療効果によって左右される。

薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサー、例えば、シリンジ、例えば、充填済みシリンジに、投与のための指示書とともに含まれてもよい。

「薬学的に許容される賦形剤」は、それが投与される細胞または対象に実質的に無毒性の材料、物質、希釈剤、または担体を意味する。すなわち、薬学的に許容される賦形剤は、実質的に望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれと接触する組成物の他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、薬学的組成物に組み込んで細胞または患者に投与することができる。

主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば、組換えウイルス（ビリオン）は、哺乳動物の患者、具体的には霊長類、より具体的にはヒトに投与するために薬学的組成物に組み込むことができる。主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば、ビリオンは、無毒性、不活性の、薬学的に許容される水性担体中に、好ましくは３～８に及ぶｐＨ、より好ましくは６～８までに及ぶｐＨ、さらにより好ましくは７～８で製剤化することができる。そのような無菌組成物は、再構成の際に許容されるｐＨを有する水性緩衝液に溶解した治療分子をコードする核酸を含有するベクターまたはビリオンを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される薬学的組成物は、治療有効量のベクターまたはビリオンを、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ホスフェート、および任意選択的に１つ以上の他の薬剤、例えば、アミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤、タンパク質、および塩化ナトリウム等の無機塩との混合物中に含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖等は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、シトレート、アセテート、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールである。好ましくは、この製剤は、４℃で少なくとも６カ月間安定である。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される薬学的組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびＧｏｏｄらの（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５（２）：４６７－４７７に記載されているもの等の当業者に既知の他の緩衝液を含む。緩衝液のｐＨは、６．５～７．７５、好ましくは７～７．５、および最も好ましくは７．２～７．４の範囲内であり得る。薬学的組成物は、本開示のポリヌクレオチドカセットを含有するアデノウイルス、またはアデノ随伴アデノウイルスベクター送達系を含み得る。

方法
本発明の遺伝子発現カセットを選択した標的細胞にインビボで送達し、形質導入後に細胞内および細胞外環境で治療有効量の遺伝子産物を得る能力は、新しい血管の成長に依存するものを含む多くの異なる疾患の治療に有益であり得、治療の目的は、標的細胞に治療有効量の抗血管新生タンパク質を分泌する能力を持たせることである。いずれかの理論によって拘束されることを望むものではないが、治療用タンパク質の発現、そして最終的にはその分泌を増強することが可能な発現カセットは、たとえ遺伝子送達ベクターによる形質導入が標的細胞のサブセットのみで成功した場合であっても、患者に臨床的に重要な利益をもたらすのに役立ち得る。形質導入細胞による治療用タンパク質の高レベルの分泌は、任意の所与の用量または一連の遺伝子治療で達成される感染性または形質導入効率のバランスを取るのに役立ち得る。

したがって、本明細書において集合的に「主題の組成物」と称される主題のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子送達ベクターは、動物の細胞における導入遺伝子の発現に使用される。例えば、主題の組成物は、例えば、遺伝子が細胞の生存能および／または機能に与える影響を決定するために、研究において使用することができる。別の例として、主題の組成物は、例えば、障害を治療するために、薬物に使用されてもよい。本開示の方法および組成物は、少なくとも一部、細胞の遺伝子治療によって対処することができる任意の状態の治療に使用することができる。細胞は、限定されないが、血管、眼、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、胃、腸管、膵臓、および皮膚を含む。

したがって、本発明は、治療用遺伝子産物をコードする本発明のポリヌクレオチドカセットを含むウイルスベクターまたはビリオンをそれを必要とする対象に投与することを含む、必要とする対象において疾患または障害、例えば、眼疾患または眼障害を治療または予防するための方法を提供する。好ましい実施形態において、治療用遺伝子産物は、分泌型ポリペプチド、または細胞で合成された後に該細胞から分泌または輸送されるタンパク質であり、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’の順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号１）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）ＣＭＶ配列（配列番号４）を含むプロモーター領域、（ｃ）５’から３’の順に、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列（それぞれ、配列番号１１および配列番号１２）を含む５’ＵＴＲ領域、）、（ｄ）ペプチドまたはポリペプチドをコードするコード配列、（ｅ）完全ＥＥＳ配列（配列番号１３）を含む第２のエンハンサー領域、および（ｆ）ＨＧＨポリアデニル化部位（配列番号１４）を含む。

関連する実施形態において、いくつかの方法は、細胞を本開示の組成物と接触させることを含む、インビトロまたはインビボでの細胞における遺伝子の発現を提供する。いくつかの実施形態において、接触はインビトロで行われる。いくつかの実施形態において、接触はインビボで行われる、すなわち、主題の生成物が対象に投与される。組成物は、非経口的に、静脈内注射または注入によって、経口的に投与することができる。ある特定の実施形態において、組成物は、注射によって眼に投与され、例えば、網膜、網膜下、または硝子体に投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、網膜注射、網膜下注射、または硝子体内注射によって投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、例えば、肝臓への注射を介して、対象となる組織または器官に局所的にまたは直接的に投与される。

対象は、例えば、特定の疾患または障害の治療を必要とするヒト対象を含む哺乳動物であり得る。

哺乳動物細胞を主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターとインビトロで接触させる場合、細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、リス）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類、ヒトに由来し得る。細胞は、樹立細胞株に由来してもよいか、または初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」は、対象から誘導されて、培養物の限られた数の継代、すなわち分割のためにインビトロで成長させた細胞および細胞培養物を指すために本明細書において互換的に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されたが、クライシス期を経るのに十分な回数は継代されていない培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、インビトロで１０回未満の継代の間維持される。

細胞が初代細胞である場合、任意の好都合な方法、例えば、全外植、生検等によって哺乳動物から細胞を採取することができる。適切な溶液が、採取された細胞の分散または懸濁のために使用され得る。そのような溶液は、概して、低濃度の、通常５～２５ｍＭの許容される緩衝液とともに、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を都合よく補充した、平衡塩類溶液、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液等である。好都合な緩衝液として、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が挙げられる。細胞は、直ちに使用されてもよいか、または長期間にわたって凍結保存されてもよく、解凍して再使用することができる。そのような場合、通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地、またはそのような凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般に使用されるいくつかの他のそのような溶液中で細胞を凍結させ、凍結させた培養細胞を解凍するための当該技術分野で一般的に知られている様式で解凍する。

導入遺伝子の発現を促進するために、主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターを、細胞と約３０分～２４時間またはそれ以上、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間等接触させる。主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターは、主題の細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、または３回より多く提供されてもよく、各接触事象後のいくらかの時間、例えば、１６～２４時間、細胞を薬剤（複数可）とともにインキュベートすることができ、その期間後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに培養する。細胞を接触させることは、細胞の生存を促進する任意の培養培地において、かつ任意の培養条件下で行われ得る。例えば、細胞は、ウシ胎仔血清または熱失活ヤギ血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ １６４０等の好都合な任意の適切な栄養培地中に懸濁させることができる。培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有してもよい。本明細書において定義される増殖因子は、膜貫通受容体に対する特異的な効果を通じて、培養物中またはインタクトな組織中のいずれかで、細胞の生存、成長および／または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。

典型的には、細胞における導入遺伝子の発現をもたらすために、有効量の主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターが提供される。本明細書の他の箇所で論じられるように、有効量は、例えば、導入遺伝子の遺伝子産物の存在またはレベルを検出することによって、細胞の生存能または機能に対する影響を検出すること等によって、経験的に容易に決定することができる。典型的には、発現は、参照または対照ポリヌクレオチドカセットからの発現と比較して２倍またはそれ以上、例えば、３倍、４倍、または５倍もしくはそれ以上、いくつかの場合において１０倍、２０倍または５０倍もしくはそれ以上、例えば、１００倍増強される。比較目的の参照カセットの一例は、本明細書に記載されるＣＭＶ参照対照カセットである。特定の実施形態において、導入遺伝子は、哺乳動物細胞におけるＣＭＶ参照対照カセットからの分泌型タンパク質の発現レベルよりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、５～１０倍、５～１５倍、または１０～１５倍高いレベルで哺乳動物細胞において分泌型タンパク質および分泌型タンパク質を発現するポリヌクレオチドカセットをコードする。いくつかの実施形態によれば、導入遺伝子が非分泌タンパク質をコードする導入遺伝子である場合、本発明のポリヌクレオチドカセットは、哺乳動物細胞におけるＣＭＶ参照対照カセットからの非分泌タンパク質の発現のレベルとほぼ同じ、その１０～２０％以内、約１．５Ｘ未満、または約２Ｘ未満のレベルで哺乳動物細胞において非分泌タンパク質を発現する。各カセットの分泌型タンパク質の発現レベルは、イムノアッセイまたは抗原捕捉アッセイにより測定することができ、細胞外環境（例えば、細胞培養培地または上清）中の上清の体積当たりのタンパク質の量または濃度として表すことができる。

生物学的試料または細胞試料中のタンパク質の存在および量（ひいては発現レベル）を測定するためのイムノアッセイ法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．（１９９９）“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７１（１２）：２９４－３０４；Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３））。一般に、イムノアッセイは、標的タンパク質と、該タンパク質と特異的に結合する抗体または抗体断片との間の反応に基づくものである。イムノアッセイは、液相系または固相系において実行することができるが、検出の容易さのために固相が好ましい場合がある。好適なイムノアッセイとして、限定されないが、サンドイッチアッセイおよび競合アッセイ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）等が挙げられる。生物学的試料は、細胞培養培地または上清（細胞を溶解することなく培養物から採取される試料）、細胞ライセート、全細胞、血液、血清、血漿、または他の体液もしくは組織であり得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子が選択可能なマーカーである場合のように、改変された細胞を残りの集団から分離することによって、細胞集団が主題のポリヌクレオチドカセットを含むものについて濃縮されてもよい。分離は、使用される選択可能なマーカーに適した任意の好都合な分離技術によるものであり得る。例えば、導入遺伝子が蛍光マーカーである場合、蛍光活性化細胞分取によって細胞を分離することができる一方で、導入遺伝子が細胞表面マーカーである場合、アフィニティー分離技法、例えば、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに結合した親和性試薬を用いた「パニング」、または他の好都合な技術によって細胞を異種集団から分離することができる。正確な分離を提供する技法は、複数色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等の、様々な程度の精巧さを有し得る蛍光活性化細胞分取器を含む。死細胞に関連する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることにより、細胞を死細胞に対して選択することができる。細胞の生存能に過度に有害ではない任意の技法が用いられ得る。主題のポリヌクレオチドを含む細胞について高度に濃縮された細胞組成物が、この様式で達成される。「高度に濃縮された」とは、遺伝子改変された細胞が、細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、細胞組成物の約９５％以上、または９８％以上になることを意味する。

細胞を主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターとインビトロで接触させる場合、対象は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒト、または非ヒト霊長類であり得る。

本開示の方法および組成物は、少なくとも一部、細胞の遺伝子治療によって対処することができる任意の状態の治療に使用される。細胞は、限定されないが、血管、眼、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、胃、腸管、膵臓、および皮膚を含む。一実施形態は、治療を必要とする対象において疾病を治療するための方法であり、該方法は、対象に本明細書に開示されるポリヌクレオチドカセットを含有する遺伝子送達ベクターを投与することを含み、カセットは、疾病の１つ以上の徴候または症状を軽減するのに有効なポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、疾病は眼疾患であり、遺伝子送達ベクターはアデノ随伴ウイルスであり、ポリペプチドは、ベクターで形質導入した細胞によって分泌されるポリペプチドである。一実施形態において、分泌タンパク質はＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する。例えば、分泌タンパク質は、ＶＥＧＦ結合タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、眼疾患は脈絡膜新生血管または黄斑変性症である。特定の形態の黄斑変性症は、急性黄斑変性症、非滲出性加齢性黄斑変性症、および滲出性加齢性黄斑変性症を含み得る。投与は、例えば、眼球送達、硝子体内注射、眼内注射、網膜注射、網膜下注射、非経口投与、静脈内注射または注入、および肝臓への注射を含む任意の好適な手段によるものであり得る。

いくつかの実施形態において、遺伝子送達ベクターは、治療を必要とする対象の眼に投与される。いくつかの実施形態において、遺伝子送達ベクターは、眼内注射によって、硝子体内注射によって、または任意の他の好都合な投与方法もしくは投与経路によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象は、黄斑変性症または眼内血管新生に罹患しているかまたはそれを発症するリスクのあるヒト対象である。

いくつかの実施形態において、主題の方法は、障害の発症を予防する、障害の進行を停止する、障害の進行を逆行させる等の治療上の利益をもたらす。いくつかの実施形態において、主題の方法は、治療上の利益が得られたことを検出するステップを含む。当業者は、そのような治療上の利益の指標が改善される特定の疾患に適用可能であることを理解し、治療有効性を測定するために用いる適切な検出方法を認識するであろう。

主題の導入遺伝子を用いた導入遺伝子の発現は、ロバストであることが予想される。したがって、いくつかの場合において、遺伝子産物のレベルを測定すること、治療有効性を測定すること等によって検出される導入遺伝子の発現は、主題の組成物の投与後２ヶ月以内、例えば、投与後４、３、または２週以内、例えば、投与後１週間に観察され得る。導入遺伝子の発現はまた、経時的に持続することが予想される。したがって、いくつかの場合において、遺伝子産物のレベルを測定すること、治療有効性を測定すること等によって検出される導入遺伝子の発現は、主題の組成物の投与後２ヶ月以上、例えば、４、６、８、または１０ヶ月以上、いくつかの場合において１年以上、例えば、２、３、４、または５年で、特定の場合には５年を超えて観察され得る。

ある特定の実施形態において、方法は、細胞における導入遺伝子の発現を検出するステップを含み、１つ以上の本開示の改善されたエレメントを含まないポリヌクレオチドカセット、すなわち、参照対照からの発現と比較して発現が増強される。例えば、より早い検出、より高いレベルの遺伝子産物、細胞に対するより強力な機能的影響等から明らかなように、典型的には、発現は、参照、すなわち、対照ポリヌクレオチドカセットからの発現と比較して２倍またはそれ以上、例えば、３倍、４倍、または５倍もしくはそれ以上、いくつかの場合において１０倍、２０倍または５０倍もしくはそれ以上、例えば、１００倍増強される。一態様において、導入遺伝子は、ｓＦＬＴ１等の分泌型ポリペプチドをコードする。

典型的には、主題の組成物がウイルス、例えば、本開示のポリヌクレオチドカセットを含むｒＡＡＶである場合、対象において変化を達成するため、または治療効果をもたらすための有効量は、約１×１０^８ベクターゲノムまたはそれ以上、ある場合に１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、または１×１０^１３ベクターゲノムもしくはそれ以上、特定の場合には１×１０^１４ベクターゲノムまたは以上であり、通常、１×１０^１６ベクターゲノム以下である。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、多くとも約１×１０^１６ベクターゲノム、例えば、１×１０^１５ベクターゲノムまたはそれ以下、例えば、１×１０^１３、１×１０^１２、１×１０^１１、１×１０^１０、または１×１０^９ベクターゲノムもしくはそれ以下であり、特定の場合には１×１０^８ベクターゲノムであり、典型的には１×１０^８ベクターゲノム以上である。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^１０～１×１０^１１ベクターゲノムである。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^１０～３×１０^１２ベクターゲノムである。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^９～３×１０^１３ベクターゲノムである。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^８～３×１０^１４ベクターゲノムである。

ある場合には、投与される薬学的組成物の量は、感染多重度（ＭＯＩ）を用いて測定することができる。ある場合には、ＭＯＩは、ポリヌクレオチドカセットが送達され得る細胞に対するベクター粒子またはウイルスベノムの比率または多重度を指し得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０^６であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０^５～１×１０^７であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０^４～１×１０^８であり得る。ある場合には、本開示の組換えウイルスは、約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、または１×１０^７ＭＯＩである。

いくつかの態様において、薬学的組成物は、約１×１０^８～約１×１０^１５粒子の組換えウイルス、約１×１０^９～約１×１０^１４粒子の組換えウイルス、約１×１０^１０～約１×１０^１３粒子の組換えウイルス、または約１×１０^１１～約３×１０^１２粒子の組換えウイルスを含む。

個々の用量は、典型的には、対象に測定可能な効果をもたらすのに必要な量以上であり、主題の組成物またはその副産物の吸収、分布、代謝、および排出（「ＡＤＭＥ」）に関する薬物動態学および薬理学に基づいて、したがって、対象における組成物の体内動態に基づいて決定することができる。これは、投与経路および投与量の考察を含む用量および／または投与計画の有効量は、前臨床アッセイから、安全性および漸増および用量範囲試験、個々の臨床医と患者との関係、ならびにインビトロアッセイおよびインビボアッセイから、経験的に容易に決定することができる。

本明細書において参照されている上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

上記から、本発明の特定の実施形態は例示のために本明細書には記載されているが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の変更が行われ得ることを理解されたい。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲以外によっては限定されない。

以下の実施例は、当業者に本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために示されるのであって、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、以下の実験が行われる全てのまたは唯一の実験であることを意味するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は、大気圧またはその付近である。

分子生化学および細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ （Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；ａｎｄ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）等の標準的な教本に見出すことができる（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。本開示において言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈ等の商業的な供給業者から入手可能である。

実施例１
ポリヌクレオチド発現カセットの構築
任意の遺伝子治療法の開発において考慮するべき重要な事項は、一旦細胞内に入ると導入遺伝子の産生を駆動するために用いられる遺伝子および発現カセットを送達するために使用されるビヒクルである。カセットは、迅速かつ長期にわたる治療上の利益を患者に提供するのに十分なレベルで導入遺伝子のロバストな発現を促進するものであることが好ましい。そのために、標準的な組換えＤＮＡクローニング技法を用いて、種々の組み合わせおよび順列の調節エレメントおよびタンパク質コード配列を含有する一連のポリヌクレオチド発現カセットを作製した（図１）。

実施例２
組換えプラスミドの構築
従来のＤＮＡ組換えおよびクローニング技法を用いて、候補ポリヌクレオチドカセットおよびアフリベルセプトをコードするコード配列の各々を含む組換えプラスミドを構築し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングした。後のＡＡＶゲノムへのカセットの移動および組換えＡＡＶビリオンの調製のために、カセット１１のベクターマップに示すように、各カセットをアデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列間に配置した（図１１）。

図１１に示すように、カセット１１は、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ由来の配列を含む５’ＵＴＲ、タンパク質コード配列、完全発現エンハンサー配列（ＥＥＳ）、およびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＨＧＨポリＡ）を含んでいた。同様に、カセット１２は、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬおよびｅＭＬＰ ５’ＵＴＲ配列、タンパク質コード配列、発現エンハンサー配列の４１０～５６４部分（４１０～５６４ＥＥＳ）、Ｂ型肝炎ウイルスのシス作用性転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨポリＡ）を含んでいた。これらの試験に使用したカセット１０、１１、１２、および１４、ならびにＣＭＶ参照対照カセットのポリヌクレオチド配列を、表１、２、３、４、および５にそれぞれ示す。ＩＴＲ、調節エレメント、およびコード領域は、それらがプラスミド中で発生するように５’から３の順に列挙されており、表の上部から開始して表の下部へと続いている。ＣＭＶ参照カセット（表５）も構築し、選択された他の本開示のカセットとの対照比較において試験した。

実施例３
トランスフェクトした哺乳動物細胞におけるインビトロでのタンパク質発現
各カセットの発現特性をインビトロで評価するために、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、各組換え構築物を哺乳動物細胞にトランスフェクトした。最初の一連の実験では（図２）、カセットは、翻訳の際に細胞から分泌されたタンパク質をコードした。トランスフェンクション後、細胞を４８時間インキュベートした。次いで、各培養物からの細胞培養上清の試料を採取し、免役アッセイにより定量してトランスフェクトした各細胞培養物によって分泌されたタンパク質のレベルを評価した。図２は、図１に記載される「基本プラスミド」の発現レベルと比較してカセットＣ１～Ｃ１８の発現レベルを示す。図２に示すように、Ｈｅｌａ細胞による最も高い平均発現は、カセット１１および１２でトランスフェクトした細胞で観察された。

実施例４
形質導入した哺乳動物細胞におけるインビトロでのタンパク質発現
図２に示す結果に基づいて、５つのカセット（Ｃ７、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、およびＣ１４）をさらなる試験のために選択した。実験を行って、組換えアデノ随伴ウイルスによってインビトロで哺乳動物細胞に送達されたときの各カセットからの分泌タンパク質の発現を比較した。図２に示すＨｅＬａ細胞試験に使用したＣ７、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、およびＣ１４カセットを、それぞれＡＡＶ７ｍ８カプシド中にパッケージングした（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１３，Ｖｏｌ．５，Ｉｓｓｕｅ １８９，１８９ｒａ７６）。ＨＥＫ２９３細胞の別々の培養物を３×１０^５のＭＯＩで各組換えＡＡＶ７ｍ８ベクターを用いて形質導入し、次いで３日間インキュベートした。インキュベーション後、各培養物から上清を回収し、イムノアッセイを用いて定量し、３日間のインキュベーションにわたって各培養物によって上清中に分泌されたタンパク質の量を測定した。トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞（図２）と同様に、ＨＥＫ２９３細胞における最も高い平均発現は、カセット１１および１２で形質導入した細胞で観察された（図３）。

実施例５
形質導入したブタ網膜外植片培養物におけるタンパク質発現
図３に示す試験に使用した組換えＡＡＶ２．７ｍ８ベクターを、ブタ網膜外植片培養物系においてさらに試験した。ブタ網膜は、ヒトに類似する解剖学的および生理学的特徴を有し、そのため前臨床試験において好適な代替物としての役割を果たすことができる。全層の外植片培養物は、複雑な細胞内プロセスおよび神経網膜細胞間の伝達を保存しており、ＡＡＶベクター変異型の標的‐組織検証における有用なモデルである。

ブタ網膜外植片の形質導入
７ｍ８．ＡＡＶ２ベクターは、野生型ＡＡＶ２よりも良好に光受容体を形質導入することができる変異型ＡＡＶ２ベクターである（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．“Ｉｎ Ｖｉｖｏ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｕｔｅｒ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｖｉｔｒｅｏｕｓ”，２０１３，Ｖｏｌ．５，Ｉｓｓｕｅ １８９，１８９ｒａ７６）。全層網膜を用いたブタ網膜外植片を２×１０^４のＭＯＩで７ｍ８ベクターを用いて形質導入した。形質導入の１週間後および２週間後に上清を回収し、上清中に存在する分泌タンパク質の量をイムノアッセイにより測定した。実験を２度繰り返して行い（外植片１および２）、培養物上清中のタンパク質の量によって測定されるように、形質導入した各外植片から発現および分泌されたタンパク質のレベルを示す結果を、非形質導入「ビヒクル」対照外植片のバックグラウンドレベルとともに図４に示す。図４に示すように、このパネルのカセットのタンパク質発現レベルにおける傾向は、形質導入したＨＥＫ２９３細胞にインビトロで観察された傾向（図３）と相関しており、カセット１１、１２、および１４が３つの最も高い発現レベルを提供し、カセット７および１３が最も低い発現レベルを提供した。

実施例６
トランスフェクトした哺乳動物細胞におけるインビトロでのＳＦＬＴ－１の発現
他のタンパク質および他の哺乳動物細胞型に関してカセットの発現特性を試験することを対象とした。この目的のために、他の２つのタンパク質ｓＦＬＴ－１および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するコード配列を、ポリヌクレオチドカセットＣ１０、Ｃ１１、およびＣ１２に別個にクローニングした。比較のために、ｓＦＬＴ１をコードする配列も、基本プラスミドカセット（図１）およびＣＭＶ対照カセットに別個にクローニングした（「ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１」）。表５に記載されるように、ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照構築物は、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）、ＣＭＶプロモーター（配列番号２１）、キメライントロン（配列番号２２）、５’ＵＴＲ（配列番号２３）、ｓＦＬＴ－１をコードするコード配列（配列番号２４）、３’ＵＴＲ（配列番号２５）、およびＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号２６）を含んでいた。ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照構築物を例外として、ｓＦＬＴ－１（本明細書においてｓＦＬＴ１とも称される）に対するコード配列を霊長類細胞における発現のために最適化（ＣＯ）した。

ｓＦＬＴ１をコードするベクターを３つの異なる細胞株にトランスフェクトした：網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ１９細胞）、ＨＥＫ２９３細胞、およびＨｅＬａ細胞。トランスフェクションは、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して行った。トランスフェクションステップに続いて、細胞を４８時間インキュベートし、細胞培養上清中に存在するｓＦＬＴ１タンパク質の量をＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのｓＦＬＴ１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを使用して測定した。カセット７、１１、または１３の制御下でＧＦＰをコードするプラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、ＣＭＶプロモーター（前述のＣＭＶ－ｓＦＬＴ１）の制御下でＧＦＰをコードするプラスミドと比較した。約４８時間後、細胞をトリプシン処理して各培養物中のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）により評価した。その結果を図５～８に示す。全体的に、試験した他のいずれのカセットと比較しても、カセット１１および１２でトランスフェクトした細胞においてｓＦＬＴ１の最も高い発現が観察された（図５～７）。より具体的には、ＡＲＰＥ１９細胞におけるカセット１１からのｓＦＬＴ１の発現（ｘ^－＝１１８，７２１ｐｇ／ｍＬ）は、ＡＲＰＥ１９細胞におけるＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照カセットからのｓＦＬＴ１の発現（ｘ^－＝５４２６８．５３ｐｇ／ｍＬ）よりも約２．２Ｘ（または約２倍）高かった（図５）。ＨＥＫ２９３細胞におけるカセット１１からのｓＦＬＴ１の発現（ｘ^－＝１４８９８５．４０ｐｇ／ｍＬ）は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照カセットからのｓＦＬＴ１の発現（ｘ^－＝１６５２５．９ｐｇ／ｍＬ）よりも約９Ｘ高かった（図６）。また、トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるカセット１１からのｓＦＬＴ１の発現（ｘ^－＝２０４９５７．５７ｐｇ／ｍＬ）は、ＨｅＬａ細胞におけるＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照カセットからのｓＦＬＴ１の発現（ｘ^－＝２２３６３．０３ｐｇ／ｍＬ）よりも約９Ｘ高かった（図７）。しかしながら、驚くべきことに、カセット１１から発現されたｓＦＬＴ１のレベルは、試験した他のいずれのカセットから発現されたｓＦＬＴ１のレベルよりも一貫して高く、また、試験したあらゆる細胞株においてＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照カセットから発現されたｓＦＬＴ１のレベルよりも有意に高かった（図５～７）が、コード配列をＧＦＰをコードする配列に変更したとき、カセット１１は、ＣＭＶ－対照カセットと比較して同様のレベルの細胞当たりのタンパク質をもたらした。図８に示すように、各カセットがｓＦＬＴ１をコードしたときに以前に観察された、カセット１１およびＣＭＶ－ｓＦＬＴ１によって哺乳動物細胞において発現されたタンパク質の量の倍差は、コード配列を分泌タンパク質ｓＦＬＴ１をコードするものから非分泌細胞質タンパク質ＧＦＰをコードするものに変更したときに著しく減少した。これらの予想しなかった結果に基づいて、カセット１１は、他のカセットと比較して、細胞から分泌されるポリペプチドを発現させるのに特に適していると考えられる。

実施例７
形質導入した哺乳動物細胞におけるｓＦＬＴ－１の発現
さらなる試験において、ヒトＦＬＴ－１をコードするコドン最適化コード配列を含有するＣ１０およびＣ１１カセットと、対照ＣＭＶ－ｓＦＬＴ－１カセットを７ｍ８カプシドにパッケージングし、種々のカセット構築物の制御下でｓＦＬＴ－１をコードする組換え７ｍ８．ＡＡＶ２ビリオンを形成した。ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照構築物も、野生型ＡＡＶ２カプシドにパッケージングした（ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１）。ＨＥＫ２９３細胞を、１×１０５のＭＯＩで各アデノ随伴ウイルス構築物を用いて形質導入した。形質導入の３日後、各培養物から上清を回収し、各上清試料中のｓＦＬＴ－１の濃度をｓＦＬＴ－１ ＥＬＩＳＡキットを使用して定量した。図９に示すように、カセット１１（Ｃ１１）で形質導入したＨＥＫ２９３細胞において最も高い発現が観察された。形質導入したＨＥＫ２９３細胞におけるカセット１１からのｓＦＬＴ１の発現は、対照ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１カセットからのｓＦＬＴ１の発現よりも約５０Ｘ高かった（７１８ｐｇ／ｍＬに対して３３６６１ｐｇ／ｍＬ）。図９の右側に示されるデータは、試料がアッセイの標準曲線の範囲内になるように、Ｃ１１で形質導入した細胞からの上清をさらに希釈しなければならなかったことを示す。

実施例８
形質導入したブタ網膜外植片におけるｓＦＬＴ－１の発現
ｓＦＬＴ－１網膜組織の発現を比較するために、ブタ網膜外植片を図９に示す組換えＡＡＶベクターの各々で形質導入した。実験を３度繰り返して行い、各外植片を４×１０^４のＭＯＩで形質導入した。形質導入後、３日ごとに培地を交換した。２週間後、各外植片培養物から３日目の培地を回収し、各培養物から培地中のｓＦＬＴ－１の量をｓＦＬＴ－１ ＥＬＩＳＡキットを使用して評価した。さらに、網膜外植片を溶解し、組織ライセートを細胞内のｓＦＬＴ－１発現についてＥＬＩＳＡにより定量した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、カセット１１の制御下でｓＦＬＴ－１をコードするＡＡＶ２．７ｍ８（７ｍ８－Ｃ１１－ＣＯ．ｓＦＬＴ）で形質導入した外植片からの上清中のｓＦＬＴ－１の量は、平均して、ＣＭＶカセットの制御下でｓＦＬＴ－１をコードするＡＡＶ２．７ｍ８（７ｍ８－ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１）で形質導入した外植片からの上清中のｓＦＬＴ－１の量よりも約６０Ｘ高い。種々の外植片培養物からの上清中のｓＦＬＴ－１の量における相対的差異は、細胞内に見られたｓＦＬＴ－１タンパク質の量における相対的差異と相関しており（図１０、組織ライセート）、カセット１１が哺乳動物細胞においてｓＦＬＴ－１のより高い発現を促進し、それによって、図９および１０に示すように、７ｍ８－ＣＭＶ－ｓＦＬＴ１対照カセットおよび他のｓＦＬＴ－１をコードするカセットで形質導入した細胞の中および周囲に（すなわち、細胞外環境において）観察されるｓＦＬＴ－１のレベルと比較して、細胞外培地において形質導入細胞外でより高いレベルのタンパク質の分泌が促進されることが示唆される。

実施例９
形質導入したスナネズミの眼におけるアフリベルセプトの発現
さらなる試験において、カセットＣ７、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４によって駆動されるアフリベルセプトの発現をスナネズミにおいてインビボで比較した。ＡＡＶベクターを実施例４に記載されるように構築した。さらに、コドン最適化アフリベルセプトを発現するＭＮＴＣ発現カセットを含有するＡＡＶ７ｍ８カプシドを構築した。８匹の動物の群に、ビヒクル、ＡＡＶ．７ｍ８－Ｃ７－Ｃｏ－アフリベルセプト、ＡＡＶ．７ｍ８－Ｃ１１－Ｃｏ－アフリベルセプト、ＡＡＶ．７ｍ８－Ｃ１２－Ｃｏ－アフリベルセプト、ＡＡＶ．７ｍ８－Ｃ１３－Ｃｏ－アフリベルセプト、またはＡＡＶ．７ｍ８－Ｃ１４－Ｃｏ－アフリベルセプトのいずれかの両側硝子体内（ＩＶＴ）注射を２×１０^１０ｖｇ／眼で行った。注射後８週目および１６週目に、４匹の動物を屠殺し、（ｉ）網膜、（ｉｉ）硝子体、（ｉｉｉ）網膜／脈絡膜、および（ｉｖ）虹彩／毛様体に解体し、各眼（各時点で群当たり合計８つの眼）におけるアフリベルセプトの発現を分析した。

遊離型アフリベルセプトの発現は、改変サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを用いて組織試料中で測定される。具体的には、マイクロタイタープレートを組換えヒトＶＥＧＦタンパク質でコーティングした。タンパク質試料を各ウェル内でインキュベートし、その後で洗浄した。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を各ウェルに添加した。抗体は、アフリベルセプトタンパク質のＦｃドメインに結合し、それ自体はウェルの表面に結合したＶＥＧＦによって捕捉された。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、ルミノールの添加により結合酵素活性を決定し、４６６ｎｍの発光を測定した。

８週および１６週の両方の時点で調べた組織試料の各々において、各構築物から発現が検出され、両方の時点の各構築物で硝子体において最も高かった。

ＡＡＶ由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列は、カセット１１について例示されるように、後のＡＡＶゲノムへのカセットの移動のために、いずれかのカセットの周囲で隣接位置に配置され得る。コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ）は、コード配列の開始コドンの５’で生じ得る。ＣＭＶ参照対照カセットは、対象となる任意の導入遺伝子を含み得る。表５は、導入遺伝子がｓＦＬＴ－１をコードする例示的な一実施形態を示す。

Claims (18)

1. ５’から３’に、
   （ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
   （ｂ）配列番号４からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
   （ｃ）５’から３’の順に、配列番号１１からなるＴＰＬ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、および配列番号１２からなるｅＭＬＰ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
   （ｄ）分泌型ポリペプチドをコードするコード配列であって、前記プロモーター領域に作動可能に連結される、コード配列、
   （ｅ）配列番号１３からなる完全ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、ならびに
   （ｆ）配列番号１４からなるＨＧＨポリアデニル化部位またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、を含む、ポリヌクレオチドカセット。
2. 配列番号７６～８０の各々をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
3. ５’から３’に、
   （ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
   （ｂ）配列番号３からなるＥＦ１α配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
   （ｃ）配列番号５からなるＥＦ１α配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、イントロン領域、
   （ｄ）配列番号６からなるＵＴＲ２配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
   （ｅ）分泌型ポリペプチドをコードするコード配列であって、前記プロモーター領域に作動可能に連結される、コード配列、
   （ｆ）配列番号７からなる５１１～８１０ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、
   （ｇ）配列番号８からなるＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、および
   （ｈ）配列番号９からなるＢＧＨポリアデニル化部位またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、
   を含む、ポリヌクレオチドカセット。
4. 配列番号７０～７５の各々をさらに含む、請求項３に記載のポリヌクレオチドカセット。
5. ５’から３’に、
   （ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
   （ｂ）配列番号４からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
   （ｃ）５’から３’の順に、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２からなるＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
   （ｅ）分泌型ポリペプチドをコードする、コード配列、
   （ｆ）配列番号１６からなる４１０～５６４ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、
   （ｇ）配列番号１７からなるＨＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、ならびに
   （ｈ）配列番号９からなるＢＧＨポリアデニル化部位またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、
   を含む、ポリヌクレオチドカセット。
6. 配列番号８１～８６の各々をさらに含む、請求項５に記載のポリヌクレオチドカセット。
7. ５’から３’に、
   （ａ）配列番号１からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第１のエンハンサー領域、
   （ｂ）配列番号４からなるＣＭＶ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
   （ｃ）配列番号１８からなるＣＭＶｃ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、イントロン領域、
   （ｄ）配列番号１９からなるＵＴＲ１配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、５’ＵＴＲ領域、
   （ｅ）分泌型ポリペプチドをコードする、コード配列、
   （ｆ）配列番号１３からなる完全ＥＥＳ配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２のエンハンサー領域、
   （ｇ）配列番号８からなるＷＰＲＥ ＲＮＡ核外輸送配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、および
   （ｈ）配列番号２０からなるウサギβグロビンポリアデニル化部位またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列、
   を含む、ポリヌクレオチドカセット。
8. 配列番号９２～９５の各々をさらに含む、請求項７に記載のポリヌクレオチドカセット。
9. ａ）カプシドタンパク質、および
   ｂ）請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット、を含む、組換えウイルス。
10. 前記組換えウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルスである、請求項９に記載の組換えウイルス。
11. 前記カプシドタンパク質は、ＡＡＶ変異型７ｍ８カプシドタンパク質であるか、または前記ＡＡＶ変異型７ｍ８カプシドタンパク質に由来する、請求項１０に記載の組換えウイルス。
12. 請求項９～１１のいずれか一項に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
13. 請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットでトランスフェクトまたは形質導入した、単離された宿主細胞。
14. 哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させるための方法において使用するための組成物であって、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含み、前記方法は、１つ以上の哺乳動物細胞を前記組成物と接触させることを含み、前記分泌型ポリペプチドは、前記細胞を、前記分泌型ポリペプチドをコードする参照カセットを含む組換えウイルスと接触させることによって得られるレベルよりも少なくとも５倍高いレベルで前記１つ以上の哺乳動物細胞において発現し、前記参照カセットは、５’から３’の順に、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）、ＣＭＶプロモーター（配列番号２１）、キメライントロン（配列番号２２）、５’ＵＴＲ（配列番号２３）、前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、３’ＵＴＲ（配列番号２５）、およびＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号２６）を含む、組成物。
15. 疾患の治療または予防を必要とする哺乳動物における疾患の治療または予防のための方法において使用するための、請求項１２に記載の薬学的組成物。
16. 前記疾患は眼疾患であり、前記薬学的組成物は前記哺乳動物の眼に投与される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
17. 前記薬学的組成物は、眼内注射または硝子体内注射によって前記哺乳動物の眼に投与される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
18. 前記眼疾患は、脈絡膜新生血管および黄斑変性症からなる群から選択される、請求項１７に記載の薬学的組成物。