JP7360208B2 - 遺伝子発現増強のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年3月17日に出願された米国仮特許出願第62/472,892号の利益を主張するものであり、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、AVBI_009_01WO_ST25.txtである。このテキストファイルは86KBであり、2018年3月16日に作成され、EFS-Webを介して電子的に提出される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現増強のための非天然ポリヌクレオチドカセットであって、5’から3’の順に、
(a)第1のエンハンサー領域、
(b)プロモーター領域、
(c)分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、
(d)第2のエンハンサー領域、および
(e)ポリアデニル化部位を含み、
前記コード配列は、前記プロモーター領域に作動可能に連結され、
哺乳動物細胞における前記ポリヌクレオチドカセットからの前記分泌型ポリペプチドの発現は、前記哺乳動物細胞における参照カセットからの前記分泌型ポリペプチドの発現よりも少なくとも5倍高く、
前記参照カセットは、5’から3’の順に、CMVエンハンサー配列(配列番号2)、CMVプロモーター(配列番号21)、キメライントロン(配列番号22)、5’UTR(配列番号23)、前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、3’UTR(配列番号25)、およびSV40ポリA配列(配列番号26)を含む、ポリヌクレオチドカセット。
(項目2)
前記カセットはRNA核外輸送シグナルを含有しない、項目1に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目3)
前記第1のエンハンサー領域は、配列番号1に記載のサイトメガロウイルス(CMV)配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、項目1または2のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目4)
前記プロモーター領域は、配列番号4に記載のCMVプロモーター配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、項目1~3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目5)
前記プロモーター領域の下流かつ前記コード配列の上流にある非翻訳領域(5’UTR)をさらに含み、前記5’UTRは、5’から3’の順に、配列番号11によるTPL配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、および配列番号12によるeMLP配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、項目1~4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目6)
前記第2のエンハンサーは、配列番号13に記載の完全EES配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、項目1~5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目7)
前記ポリアデニル化部位は、配列番号14に記載のヒト成長ホルモン(HGH)ポリアデニル化部位またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、項目1~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目8)
配列番号76~80から選択される配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む1つ以上の領域をさらに含む、項目1~7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目9)
前記分泌型ポリペプチドは抗血管新生ポリペプチドである、項目1~8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目10)
前記分泌型ポリペプチドは、可溶性fms様チロシンキナーゼ1(sFLT-1)またはsFLT-1のVEGF結合断片を含む、項目1~9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目11)
5’から3’に、
(a)配列番号1からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第1のエンハンサー領域、
(b)配列番号4からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
(c)5’から3’の順に、配列番号11からなるTPL配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、および配列番号12からなるeMLP配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、5’UTR領域、
(d)前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列であって、前記プロモーター領域に作動可能に連結される、コード配列、
(e)配列番号13からなる完全EES配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第2のエンハンサー領域、ならびに
(f)配列番号14からなるHGHポリアデニル化部位またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、を含み、
任意選択的に、前記カセットはRNA核外輸送シグナルを含まない、項目1に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目12)
配列番号76~80の各々をさらに含む、項目11に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目13)
5’から3’に、
(a)配列番号1からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第1のエンハンサー領域、
(b)配列番号3からなるEF1α配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
(c)配列番号5からなるEF1α配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、イントロン領域、
(d)配列番号6からなるUTR2配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、5’UTR領域、
(e)前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列であって、前記プロモーター領域に作動可能に連結される、コード配列、
(f)配列番号7からなる511~810EES配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第2のエンハンサー領域、
(g)配列番号8からなるWPRE RNA核外輸送配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、および
(h)配列番号9からなるBGHポリアデニル化部位またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、を含む、項目1に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目14)
配列番号70~75の各々をさらに含む、項目13に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目15)
5’から3’に、
(a)配列番号1からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第1のエンハンサー領域、
(b)配列番号4からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
(c)5’から3’の順に、それぞれ、配列番号11および配列番号12からなるTPLおよびeMLP配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、5’UTR領域、
(e)ペプチドまたはポリペプチドをコードする、コード配列、
(f)配列番号16からなる410~564EES配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第2のエンハンサー領域、
(g)配列番号17からなるHPRE RNA核外輸送配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、ならびに
(h)配列番号9からなるBGHポリアデニル化部位またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、を含む、項目1に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目16)
配列番号81~86の各々をさらに含む、項目15に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目17)
5’から3’に、
(a)配列番号1からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第1のエンハンサー領域、
(b)配列番号96からなるアクチン配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
(c)配列番号12からなるeMLP配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、5’UTR、
(e)ペプチドまたはポリペプチドをコードする、コード配列、
(f)配列番号7からなる511~810EES配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第2のエンハンサー領域、
(g)配列番号17からなるHPRE RNA核外輸送配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、および
(h)配列番号20からなるウサギβグロビンポリアデニル化部位またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、を含む、項目1に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目18)
配列番号87~91の各々をさらに含む、項目17に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目19)
5’から3’に、
(a)配列番号1からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第1のエンハンサー領域、
(b)配列番号4からなるCMV配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
(c)配列番号18からなるCMVc配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、イントロン領域、
(d)配列番号19からなるUTR1配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、5’UTR領域、
(e)ペプチドまたはポリペプチドをコードする、コード配列、
(f)配列番号13からなる完全EES配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、第2のエンハンサー領域、
(g)配列番号8からなるWPRE RNA核外輸送配列またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、および
(h)配列番号20からなるウサギβグロビンポリアデニル化部位またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、を含む、項目1に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目20)
配列番号92~95の各々をさらに含む、項目19に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目21)
a)カプシドタンパク質、および
b)項目1~20のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット、を含む、組換えウイルス。
(項目22)
前記組換えウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルスである、項目21に記載の組換えウイルス。
(項目23)
前記カプシドタンパク質は、AAV変異型7m8カプシドタンパク質であるか、または前記AAV変異型7m8カプシドタンパク質に由来する、項目22に記載の組換えウイルス。
(項目24)
項目21~23のいずれか一項に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
(項目25)
項目1に記載のポリヌクレオチドカセットでトランスフェクトまたは形質導入した、単離された宿主細胞。
(項目26)
哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させるための方法であって、1つ以上の哺乳動物細胞を、ある量の項目21~23のいずれか一項に記載の組換えウイルスと接触させることを含み、前記分泌型ポリペプチドは、前記細胞を、前記分泌型ポリペプチドをコードする参照カセットを含む組換えウイルスと接触させることによって得られるレベルよりも少なくとも5倍高いレベルで前記1つ以上の哺乳動物細胞において発現し、前記参照カセットは、5’から3’の順に、CMVエンハンサー配列(配列番号2)、CMVプロモーター(配列番号21)、キメライントロン(配列番号22)、5’UTR(配列番号23)、前記分泌型ポリペプチドをコードするコード配列、3’UTR(配列番号25)、およびSV40ポリA配列(配列番号26)を含む、方法。
(項目27)
疾患の治療または予防を必要とする哺乳動物における疾患の治療または予防のための方法であって、前記哺乳動物に有効量の項目24に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
(項目28)
前記疾患は眼疾患であり、前記薬学的組成物は前記哺乳動物の眼に投与される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記薬学的組成物は、眼内注射または硝子体内注射によって前記哺乳動物の眼に投与される、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記眼疾患は、脈絡膜新生血管および黄斑変性症からなる群から選択される、項目29に記載の方法。
「非天然」ポリヌクレオチドカセットは、天然には見られないポリヌクレオチドカセットである。
本開示のいくつかの態様において、真核生物細胞(複数可)における導入遺伝子の発現のための組成物が提供される。いくつかの態様において、真核生物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、網膜細胞、例えば、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容体細胞、錐体細胞、桿体細胞、ミュラーグリア細胞、または網膜色素上皮細胞である。
本発明の遺伝子発現カセットを選択した標的細胞にインビボで送達し、形質導入後に細胞内および細胞外環境で治療有効量の遺伝子産物を得る能力は、新しい血管の成長に依存するものを含む多くの異なる疾患の治療に有益であり得、治療の目的は、標的細胞に治療有効量の抗血管新生タンパク質を分泌する能力を持たせることである。いずれかの理論によって拘束されることを望むものではないが、治療用タンパク質の発現、そして最終的にはその分泌を増強することが可能な発現カセットは、たとえ遺伝子送達ベクターによる形質導入が標的細胞のサブセットのみで成功した場合であっても、患者に臨床的に重要な利益をもたらすのに役立ち得る。形質導入細胞による治療用タンパク質の高レベルの分泌は、任意の所与の用量または一連の遺伝子治療で達成される感染性または形質導入効率のバランスを取るのに役立ち得る。
ポリヌクレオチド発現カセットの構築
任意の遺伝子治療法の開発において考慮するべき重要な事項は、一旦細胞内に入ると導入遺伝子の産生を駆動するために用いられる遺伝子および発現カセットを送達するために使用されるビヒクルである。カセットは、迅速かつ長期にわたる治療上の利益を患者に提供するのに十分なレベルで導入遺伝子のロバストな発現を促進するものであることが好ましい。そのために、標準的な組換えDNAクローニング技法を用いて、種々の組み合わせおよび順列の調節エレメントおよびタンパク質コード配列を含有する一連のポリヌクレオチド発現カセットを作製した(図1)。
組換えプラスミドの構築
従来のDNA組換えおよびクローニング技法を用いて、候補ポリヌクレオチドカセットおよびアフリベルセプトをコードするコード配列の各々を含む組換えプラスミドを構築し、E.coliにクローニングした。後のAAVゲノムへのカセットの移動および組換えAAVビリオンの調製のために、カセット11のベクターマップに示すように、各カセットをアデノ随伴ウイルス血清型2(AAV2)の逆位末端反復(ITR)配列間に配置した(図11)。
トランスフェクトした哺乳動物細胞におけるインビトロでのタンパク質発現
各カセットの発現特性をインビトロで評価するために、FuGENE(登録商標)6 Transfection Reagent(Promega)を使用して、各組換え構築物を哺乳動物細胞にトランスフェクトした。最初の一連の実験では(図2)、カセットは、翻訳の際に細胞から分泌されたタンパク質をコードした。トランスフェンクション後、細胞を48時間インキュベートした。次いで、各培養物からの細胞培養上清の試料を採取し、免役アッセイにより定量してトランスフェクトした各細胞培養物によって分泌されたタンパク質のレベルを評価した。図2は、図1に記載される「基本プラスミド」の発現レベルと比較してカセットC1~C18の発現レベルを示す。図2に示すように、Hela細胞による最も高い平均発現は、カセット11および12でトランスフェクトした細胞で観察された。
形質導入した哺乳動物細胞におけるインビトロでのタンパク質発現
図2に示す結果に基づいて、5つのカセット(C7、C11、C12、C13、およびC14)をさらなる試験のために選択した。実験を行って、組換えアデノ随伴ウイルスによってインビトロで哺乳動物細胞に送達されたときの各カセットからの分泌タンパク質の発現を比較した。図2に示すHeLa細胞試験に使用したC7、C11、C12、C13、およびC14カセットを、それぞれAAV7m8カプシド中にパッケージングした(Dalkara et al.Sci.Transl.Med.,2013,Vol.5,Issue 189,189ra76)。HEK293細胞の別々の培養物を3×105のMOIで各組換えAAV7m8ベクターを用いて形質導入し、次いで3日間インキュベートした。インキュベーション後、各培養物から上清を回収し、イムノアッセイを用いて定量し、3日間のインキュベーションにわたって各培養物によって上清中に分泌されたタンパク質の量を測定した。トランスフェクトしたHeLa細胞(図2)と同様に、HEK293細胞における最も高い平均発現は、カセット11および12で形質導入した細胞で観察された(図3)。
形質導入したブタ網膜外植片培養物におけるタンパク質発現
図3に示す試験に使用した組換えAAV2.7m8ベクターを、ブタ網膜外植片培養物系においてさらに試験した。ブタ網膜は、ヒトに類似する解剖学的および生理学的特徴を有し、そのため前臨床試験において好適な代替物としての役割を果たすことができる。全層の外植片培養物は、複雑な細胞内プロセスおよび神経網膜細胞間の伝達を保存しており、AAVベクター変異型の標的‐組織検証における有用なモデルである。
7m8.AAV2ベクターは、野生型AAV2よりも良好に光受容体を形質導入することができる変異型AAV2ベクターである(Dalkara et al.Sci.Transl.Med.“In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous”,2013,Vol.5,Issue 189,189ra76)。全層網膜を用いたブタ網膜外植片を2×104のMOIで7m8ベクターを用いて形質導入した。形質導入の1週間後および2週間後に上清を回収し、上清中に存在する分泌タンパク質の量をイムノアッセイにより測定した。実験を2度繰り返して行い(外植片1および2)、培養物上清中のタンパク質の量によって測定されるように、形質導入した各外植片から発現および分泌されたタンパク質のレベルを示す結果を、非形質導入「ビヒクル」対照外植片のバックグラウンドレベルとともに図4に示す。図4に示すように、このパネルのカセットのタンパク質発現レベルにおける傾向は、形質導入したHEK293細胞にインビトロで観察された傾向(図3)と相関しており、カセット11、12、および14が3つの最も高い発現レベルを提供し、カセット7および13が最も低い発現レベルを提供した。
トランスフェクトした哺乳動物細胞におけるインビトロでのSFLT-1の発現
他のタンパク質および他の哺乳動物細胞型に関してカセットの発現特性を試験することを対象とした。この目的のために、他の2つのタンパク質sFLT-1および緑色蛍光タンパク質(GFP)に対するコード配列を、ポリヌクレオチドカセットC10、C11、およびC12に別個にクローニングした。比較のために、sFLT1をコードする配列も、基本プラスミドカセット(図1)およびCMV対照カセットに別個にクローニングした(「CMV-sFLT1」)。表5に記載されるように、CMV-sFLT1対照構築物は、5’から3’の順に、CMVエンハンサー配列(配列番号2)、CMVプロモーター(配列番号21)、キメライントロン(配列番号22)、5’UTR(配列番号23)、sFLT-1をコードするコード配列(配列番号24)、3’UTR(配列番号25)、およびSV40ポリA配列(配列番号26)を含んでいた。CMV-sFLT1対照構築物を例外として、sFLT-1(本明細書においてsFLT1とも称される)に対するコード配列を霊長類細胞における発現のために最適化(CO)した。
形質導入した哺乳動物細胞におけるsFLT-1の発現
さらなる試験において、ヒトFLT-1をコードするコドン最適化コード配列を含有するC10およびC11カセットと、対照CMV-sFLT-1カセットを7m8カプシドにパッケージングし、種々のカセット構築物の制御下でsFLT-1をコードする組換え7m8.AAV2ビリオンを形成した。CMV-sFLT1対照構築物も、野生型AAV2カプシドにパッケージングした(AAV2-CMV-sFLT1)。HEK293細胞を、1×105のMOIで各アデノ随伴ウイルス構築物を用いて形質導入した。形質導入の3日後、各培養物から上清を回収し、各上清試料中のsFLT-1の濃度をsFLT-1 ELISAキットを使用して定量した。図9に示すように、カセット11(C11)で形質導入したHEK293細胞において最も高い発現が観察された。形質導入したHEK293細胞におけるカセット11からのsFLT1の発現は、対照CMV-sFLT1カセットからのsFLT1の発現よりも約50X高かった(718pg/mLに対して33661pg/mL)。図9の右側に示されるデータは、試料がアッセイの標準曲線の範囲内になるように、C11で形質導入した細胞からの上清をさらに希釈しなければならなかったことを示す。
形質導入したブタ網膜外植片におけるsFLT-1の発現
sFLT-1網膜組織の発現を比較するために、ブタ網膜外植片を図9に示す組換えAAVベクターの各々で形質導入した。実験を3度繰り返して行い、各外植片を4×104のMOIで形質導入した。形質導入後、3日ごとに培地を交換した。2週間後、各外植片培養物から3日目の培地を回収し、各培養物から培地中のsFLT-1の量をsFLT-1 ELISAキットを使用して評価した。さらに、網膜外植片を溶解し、組織ライセートを細胞内のsFLT-1発現についてELISAにより定量した。その結果を図10に示す。図10に示すように、カセット11の制御下でsFLT-1をコードするAAV2.7m8(7m8-C11-CO.sFLT)で形質導入した外植片からの上清中のsFLT-1の量は、平均して、CMVカセットの制御下でsFLT-1をコードするAAV2.7m8(7m8-CMV-sFLT1)で形質導入した外植片からの上清中のsFLT-1の量よりも約60X高い。種々の外植片培養物からの上清中のsFLT-1の量における相対的差異は、細胞内に見られたsFLT-1タンパク質の量における相対的差異と相関しており(図10、組織ライセート)、カセット11が哺乳動物細胞においてsFLT-1のより高い発現を促進し、それによって、図9および10に示すように、7m8-CMV-sFLT1対照カセットおよび他のsFLT-1をコードするカセットで形質導入した細胞の中および周囲に(すなわち、細胞外環境において)観察されるsFLT-1のレベルと比較して、細胞外培地において形質導入細胞外でより高いレベルのタンパク質の分泌が促進されることが示唆される。
形質導入したスナネズミの眼におけるアフリベルセプトの発現
さらなる試験において、カセットC7、C11、C12、C13、C14によって駆動されるアフリベルセプトの発現をスナネズミにおいてインビボで比較した。AAVベクターを実施例4に記載されるように構築した。さらに、コドン最適化アフリベルセプトを発現するMNTC発現カセットを含有するAAV7m8カプシドを構築した。8匹の動物の群に、ビヒクル、AAV.7m8-C7-Co-アフリベルセプト、AAV.7m8-C11-Co-アフリベルセプト、AAV.7m8-C12-Co-アフリベルセプト、AAV.7m8-C13-Co-アフリベルセプト、またはAAV.7m8-C14-Co-アフリベルセプトのいずれかの両側硝子体内(IVT)注射を2×1010vg/眼で行った。注射後8週目および16週目に、4匹の動物を屠殺し、(i)網膜、(ii)硝子体、(iii)網膜/脈絡膜、および(iv)虹彩/毛様体に解体し、各眼(各時点で群当たり合計8つの眼)におけるアフリベルセプトの発現を分析した。
Claims (16)
- 5’から3’の順に、
(a)配列番号1からなるCMV配列または配列番号1と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、第1のエンハンサー領域、
(b)配列番号4からなるCMV配列または配列番号4と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、プロモーター領域、
(c)5’から3’の順に、配列番号11からなるトリパータイトリーダー(TPL)配列または配列番号11と少なくとも99%の同一性を有する配列、配列番号12からなるアデノウイルス主要後期プロモーター由来のエンハンサーエレメント(eMLP)配列または配列番号12と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、5’UTR領域、
(d)分泌型ポリペプチドをコードする、コード配列であって、前記コード配列は霊長類における翻訳のために最適化されたコドンであり、前記プロモーター領域に作動可能に連結されている、コード配列
(e)配列番号16からなる410~564発現エンハンサー配列(EES)配列または配列番号16と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、第2のエンハンサー領域、ならびに
(f)配列番号17からなるHPRE RNA核外輸送配列または配列番号17と少なくとも99%の同一性を有する配列、
(g)配列番号9からなるウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化部位または配列番号9と少なくとも99%の同一性を有する配列、を含み、
ここで、前記第1のエンハンサー領域(a)、前記プロモーター領域(b)、および前記5’UTR領域(c)が5’アームを定義し、第2のエンハンサー領域(e)、前記HPRE RNA核外輸送配列(f)、および前記BGHポリアデニル化部位(g)が3’アームを定義する、非天然ポリヌクレオチドカセット。 - 配列番号81~86の各々をさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記5’アームが、配列番号49と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記5’アームが、配列番号49からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記3’アームが、配列番号50と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記3’アームが、配列番号50からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記3’アームが、配列番号50と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記3’アームが、配列番号50からなる、請求項4に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記分泌型ポリペプチドが、可溶性fms様チロシンキナーゼ1、sFLT-1のVEGF結合断片およびアフリベルセプトからなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記分泌型ポリペプチドがアフリベルセプトである、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- カプシドタンパク質であって、前記カプシドタンパク質は、AAV変異型7m8カプシドタンパク質であるか、または前記AAV変異型7m8カプシドタンパク質に由来する、カプシドタンパク質、および
請求項1に記載のポリヌクレオチドカセットを含む、アデノ随伴ウイルスベクターゲノム
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス。 - 前記分泌型ポリペプチドがアフリベルセプトである、請求項11に記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
- 請求項11に記載の組換えアデノ随伴ウイルス、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 前記分泌型ポリペプチドがアフリベルセプトである、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記5’アームが配列番号49と少なくとも99%の同一性を有する配列を含み、前記3’アームが配列番号50と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 前記5’アームが配列番号49を含み、前記3’アームが配列番号50を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
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