ES2729165T3 - Moléculas de unión a ANG2 - Google Patents

Abstract

Una molécula de unión a Ang2 que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en donde dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina comprende tres regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3, en donde CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 168, CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 171 y CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 175.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión a Ang2

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la terapia humana, en particular terapia contra el cáncer y agentes y composiciones útiles en tal terapia.

Antecedentes de la invención

Como se describe, por ejemplo, en los documentos US 2008/0014196, WO 2008101985 y US 2011/0027286, la angiogénesis es el proceso biológico por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos y que participa en la patogénesis de varios trastornos, que incluyen tumores sólidos y metástasis, además de enfermedades oculares. Cuando los tumores alcanzan un tamaño crítico de aproximadamente 1 mm3, se vuelven dependientes de la angiogénesis para mantener el riego sanguíneo con oxígeno y nutrientes para permitir el crecimiento adicional. Las terapias antiangiogénesis se han convertido en una importante opción de tratamiento para varios tipos de tumores.

Uno de los factores pro-angiogénicos más importantes es la angiopoyetina 2 (Ang2), un ligando del receptor Tie2 (Tie2), que controla el remodelado vascular permitiendo las funciones de otros factores angiogénicos, tales como VEGF. La Ang2 también se denomina en la materia ligando de Tie2 (patente de EE.UU. n° 5.643.755, Yancopoulos y col. 2000, Nature 407: 242-248).

La Ang2 se expresa principalmente por células endoteliales, se induce fuertemente por hipoxia y otros factores angiogénicos y se ha demostrado que regula la plasticidad de vasos tumorales, permitiendo que los vasos respondan a VEGF y FGF2 (Augustin y col., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77). De acuerdo con esta función, la deleción o inhibición de Ang2 produce angiogénesis reducida (Falcon y col., Am J Pathol. 2009 Nov; 175(5):2159-70). Se ha informado de elevadas concentraciones en suero de Ang2 para pacientes con cáncer colorrectal, NSCLC y melanoma (Goede y col., Br J Cancer. 2010 Oct 26; 103(9): 1407-14), (Park y col., Chest. 2007 Jul;132(1): 200-6), (Helfrich y col., Clin Cancer Res. 2009 Feb 15; 15(4): 1384-92). En cáncer CRC, los niveles en suero de Ang2 se correlacionan con respuesta terapéutica a terapia anti-VEGF.

El sistema Ang-Tie consiste en 2 receptores (Tie1 y Tie2) y 3 ligandos (Ang1, Ang2 y Ang4) (Augustin y col., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77). Tie2, Ang1 y Ang2 son los miembros más estudiados de esta familia, Tie1 es un receptor de orfano y la función de Ang4 para remodelado vascular todavía necesita definirse. Ang2 y Ang1 median en funciones opuestas tras la unión a Tie2 y activación. La activación de Tie2 mediada por Ang2 produce activación celular endotelial, disociación de pericitos, fuga de vasos e inducción de la formación de vasos. A diferencia de Ang2, la señalización de Ang1 mantiene la integridad de vasos por el reclutamiento de pericitos, manteniendo así la quiescencia de células endoteliales.

La angiopoyetina 2 (Ang2) es un ligando secretado de 66 kDa para la tirosina cinasa del receptor Tie2 (Augustin y col., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77). La Ang2 consiste en un dominio de superenrrollamiento del extremo N y un dominio similar a fibrinógeno del extremo C, el último se requiere para la interacción con Tie2. La Ang2 se expresa principalmente por células endoteliales y se induce fuertemente por hipoxia y otros factores angiogénicos, que incluyen VEGF. Tie2 se encuentra en células endoteliales, citoblastos hematopoyéticos y células tumorales. Se ha demostrado que Ang2-Tie2 regula la plasticidad de vasos tumorales, permitiendo que los vasos respondan a VEGF y FGF2.

Se ha mostrado que Ang2 in vitro actúa de un modesto mitógeno, quimioatrayente e inductor de la formación de tubos en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Ang2 induce la fosforilación de tirosina de Tie2 ectópicamente expresado en fibroblastos y promueve eventos de señalización aguas abajo, tales como fosforilación de ERK-MAPK, AKT y FAK en HUVEC. Se ha descrito una función antagonista de Ang2 en respuestas de células endoteliales inducidas por Ang1.

Se ha mostrado que la deficiencia de Ang2 produce un profundo defecto de modelado linfático en ratones. Aunque la pérdida de Ang2 es dispensable para el desarrollo vascular embrionario, los ratones deficientes en Ang2 tienen defectos vasculares persistentes en la retina y riñón. Junto con el patrón dinámico de la expresión de Ang2 en sitios de angiogénesis (por ejemplo, ovario), estos hallazgos indican que Ang2 controla la remodelación vascular permitiendo las funciones de otros factores angiogénicos, tales como VEGF.

El sistema Ang2-Tie2 ejerce funciones cruciales durante el cambio angiogénico y etapas tardías de la angiogénesis tumoral. La expresión de Ang2 está fuertemente regulada por incremento en el endotelio asociado a tumor. Se ha observado el crecimiento reducido de tumores cuando se implanta en ratones deficientes en Ang2, especialmente durante fases tempranas del crecimiento tumoral. El bloqueo terapéutico de Ang2 con mAb para Ang2 ha mostrado una amplia eficacia en una variedad de modelos de xenoinjerto de tumor.

Como se ha resumido en el documento US 2008/0014196 anteriormente mencionado, la angiogénesis participa en la patogénesis de varios trastornos, que incluyen tumores sólidos y metástasis.

En el caso de crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia, y para proporcionar nutriente para el crecimiento y metástasis del tumor. Folkman y col., Nature 339-58 (1989), que permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento en comparación con las células normales. Por tanto, las terapias anti-angiogénesis se han convertido en una importante opción de tratamiento para varios tipos de tumores. Estas terapias se han basado en bloquear la ruta de VEGf (Ferrara y col., Nat Rev Drug Discov. 2004 May; 3(5):391-400)).

Anticuerpos y otros inhibidores de péptidos que se unen a Ang2 y Ang1 se mencionan en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 6.166.185; 7.521.053; 7.205.275; y las solicitudes de patente de EE.UU. n°: 2006/0018909 y 2006/0246071. Además, el documento US 2011/0027286 desvela anticuerpos para Ang2 monoclonales específicos que no antagonizan la Ang1 de molécula relacionada.

Sin embargo, los anticuerpos monoclonales (mAb) del estado de la materia y proteínas de fusión tienen varios inconvenientes en vista de su aplicación terapéutica: Para prevenir su degradación, deben almacenarse a temperaturas próximas a la congelación. Es decir, como se digieren rápidamente en el intestino, no son aptos para administración por vía oral. Otra restricción importante de mAb para la terapia contra el cáncer es el mal transporte, que produce bajas concentraciones y una falta de elección de diana de todas las células en un tumor.

Ha sido un objetivo de la presente invención proporcionar novedosas moléculas de unión a Ang2 mejoradas, es decir, nanocuerpos que bloquean la unión de Ang2 a Tie2, pero no la unión de Ang1 a Tie2.

Más en particular, ha sido un objetivo de la invención proporcionar novedosas moléculas de unión a Ang2, y específicamente moléculas de unión a Ang2 que se unen a Ang2 de mamífero, pero no a Ang1 de mamífero, y especialmente a Ang2 humana, pero no a Ang1 humana, en las que tales moléculas o polipéptidos son adecuados para los fines terapéuticos y diagnósticos que se describen en el presente documento. Ha sido otro objetivo de la invención proporcionar dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen específicamente a Ang2, pero no a Ang1.

Tales moléculas de unión a Ang2, o antagonistas de Ang2, son útiles como agentes farmacológicamente activos en composiciones en la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de enfermedades o afecciones asociadas a efectos mediados por Ang2 sobre la angiogénesis.

Ejemplos de tales enfermedades son cáncer o enfermedades cancerosas tales como cáncer de mama, carcinoma de células renales, cáncer de ovario y cáncer pancreático, enfermedades oculares tales como degeneración macular senil y retinopatía diabética, y/o enfermedades renales crónicas tales como nefropatía diabética, insuficiencia posrrenal, azotemia prerrenal e insuficiencia renal intrínseca.

Ha sido otro objetivo de la invención proporcionar métodos para la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de tales enfermedades, trastornos o afecciones, que implican el uso y/o administración de tales moléculas de unión a Ang2 y composiciones que las comprenden. En particular, ha sido un objetivo de la invención proporcionar tales moléculas de unión a Ang2 farmacológicamente activas, composiciones y/o métodos que proporcionan ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o métodos actualmente usados y/o conocidos en la técnica. Estas ventajas incluyen propiedades terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas y/u otras propiedades ventajosas, por ejemplo, para fines de fabricación, especialmente con respecto a anticuerpos convencionales como aquellos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos.

Breve compendio de la invención

Según un primer aspecto, se proporciona una molécula de unión a Ang2 que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en la que dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina comprende tres regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3, en la que CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 168, CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 171 y CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 175.

La invención se refiere además a una molécula de unión a Ang2 que consiste en dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina.

Además, la invención se refiere a una molécula de unión a Ang2 que tiene una secuencia según la SEC ID N°: 166.

Según otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico que codifica dicha molécula de unión a Ang2, además de un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico.

La invención se refiere además a una célula huésped que lleva uno o más vectores de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos.

La invención se refiere además a un método de producción o generación de una molécula de unión a Ang2 según la invención, que comprende las etapas de:

(a) transfectar una célula huésped con uno o más de dichos vectores que comprenden dicha molécula de ácido nucleico,

(b) cultivar dicha célula huésped, y

(c) recuperar y purificar dicha molécula de unión a Ang2.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, una o más de dichas moléculas de unión a Ang2 como se define anteriormente y al menos un vehículo fisiológicamente aceptable.

La invención se refiere además a aplicaciones y usos de las moléculas de unión a Ang2, ácidos nucleicos, células huésped, productos y composiciones descritos en anteriormente, además de a métodos para la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas a efectos mediados por Ang2 sobre la angiogénesis, preferiblemente cáncer, enfermedades cancerosas y enfermedades oculares usando las moléculas de unión a Ang2 como se define anteriormente.

Estos y otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención serán evidentes de la descripción adicional en el presente documento más adelante.

Definiciones

A menos que se indique o defina de otro modo, todos los términos usados tienen sus significados usuales en la materia, que serán evidentes para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los libros de texto convencionales, tales como Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratorio Manual” (2a Ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, “Genes IV”, Oxford University Press, New York, (1990), y Roitt y col., “ Immunology” (2a ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), además de a la técnica anterior general citada en el presente documento. Además, a menos que se indique lo contrario, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de un modo en sí conocido, como será evidente para el experto. De nuevo se hace referencia, por ejemplo, a los libros de texto convencionales, a la técnica anterior general citada anteriormente y a las otras referencias citadas en su interior.

El término “angiopoyetina-2” o “Ang2”, a menos que se especifique que es de especies no humanas (por ejemplo, “Ang2 de ratón”, etc.), se refiere a Ang2 humana o un fragmento biológicamente activo de la misma (por ejemplo, un fragmento de la proteína Ang2 que puede inducir angiogénesis in vitro o in vivo), es decir, a Ang2 humana (variante 1) con n° de acceso NM 001147.2, a Ang2 humana (variante 2) que tiene n° de acceso NM_001118887.1 o a Ang2 humana (variante 3) que tiene n° de acceso NM_001118888.1, y/o sus fragmentos biológicamente activos de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de especies no humanas de Ang2, tales como Ang2 de ratón y Ang2 de cino, están disponibles de la base de datos de secuencias de proteínas bajo n° de acceso: NM_007426.3 (SEC ID N°: (SEC ID 188) y AB172643.1 (SEC ID N°: 187), respectivamente.

El término “angiopoyetina-T o “A n g l”, a menos que se especifique que es de especies no humanas (por ejemplo, “Ang2 de ratón”, etc.), se refiere a Angl humana o un fragmento biológicamente activo de la misma (por ejemplo, un fragmento de la proteína Ang1 que puede inducir angiogénesis in vitro o in vivo), es decir, a Ang1 humana con n° de acceso NM_001146.3, o un fragmento biológicamente activo de la misma.

A menos que se indique lo contrario, los términos “ inmunoglobulina” y “secuencia de inmunoglobulina’’ - tanto si se usan en el presente documento para referirse a un anticuerpo de cadena pesada como a un anticuerpo de 4 cadenas convencional - se usan como términos generales para incluir tanto el anticuerpo de tamaño completo, las cadenas sencillas de los mismos, además de todas las partes, dominios o fragmentos de los mismos (que incluyen, pero no se limitan a, dominios de unión al antígeno o fragmentos tales como dominios VHH o dominios VH/VL, respectivamente). Además, el término “secuencia", como se usa en el presente documento (por ejemplo, en términos como “secuencia de inmunoglobulina”, “secuencia de anticuerpos”, “secuencia del dominio variable (individual)”, “secuencia VHH” o “secuencia de proteínas”), debe generalmente entenderse que incluye tanto la secuencia de aminoácidos relevante, además de secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que codifican la misma, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada.

El término “dominio" (de un polipéptido o proteína), como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura de proteína plegada que tiene la capacidad de retener su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales discretas de proteínas y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio.

El término “dominio de inmunoglobulina”, como se usa en el presente documento, se refiere a una región globular de una cadena de anticuerpo (tal como, por ejemplo, una cadena de un anticuerpo de 4 cadenas convencional o de un anticuerpo de cadena pesada), o a un polipéptido que consiste esencialmente en una región globular tal. Los dominios de inmunoglobulina se caracterizan porque retienen la característica de plegamiento de inmunoglobulinas de moléculas de anticuerpo, que consiste en un sándwich de 2 capas de aproximadamente 7 cadenas beta antiparalelas dispuestas en dos hojas beta, opcionalmente estabilizadas por un enlace disulfuro conservado.

El término “dominio variable de inmunoglobulina’’, como se usa en el presente documento, significa un dominio de inmunoglobulina que consiste esencialmente en cuatro “regiones estructurales” que se denominan en la materia y en el presente documento más adelante “región estructural 1” o “FR1”; “región estructural 2” o ”FR2”; “región estructural 3” o “FR3”; y “región estructural 4” o “FR4”, respectivamente; regiones estructurales que están interrumpidas por tres “regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR”, que se denominan en la materia y en el presente documento más adelante “región determinante de la complementariedad 1” o “CDR1”; “región determinante de la complementariedad 2” o “CDR2”; y “región determinante de la complementariedad 3” o “CDR3”, respectivamente. Así, la estructura general o secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede indicarse del siguiente modo: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Es el (los) dominio(s) variable(s) de inmunoglobulina el (los) que confieren especificidad a un anticuerpo para el antígeno llevando el sitio de unión al antígeno.

El término “dominio variable sencillo de inmunoglobulina’’, como se usa en el presente documento, significa un dominio variable de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a un epítope del antígeno sin aparearse con un dominio de inmunoglobulina variable adicional. Un ejemplo de dominios variables sencillos de inmunoglobulina en el significado de la presente invención son “anticuerpos de dominio”, tales como los dominios variables sencillos de inmunoglobulina VH y VL (dominios VH y dominios VL). Otro ejemplo de dominios variables sencillos de inmunoglobulina son “dominios VHH” (o simplemente “VHH”) de camélidos, como se define en lo sucesivo.

En vista de la anterior definición, el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo de 4 cadenas convencional (tal como una molécula de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE; conocida en la técnica) o de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv tal como un fragmento Fv o scFv ligado a disulfuro, o un diacuerpo (todos conocidos en la técnica) derivado de tal anticuerpo de 4 cadenas convencional no se consideraría normalmente como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, ya que, en estos casos, la unión al epítope respectivo de un antígeno no se produciría normalmente por un (único) dominio de inmunoglobulina, sino por un par de dominios de inmunoglobulina (de asociación) tales como dominios variables de la cadena pesada y ligera, es decir, por un par VH-VL de dominios de inmunoglobulina, que se unen conjuntamente a un epítope del antígeno respectivo.

“Dominios VHH", también conocidos como VHH, dominios V^hH, fragmentos de anticuerpos VHH y anticuerpos VHH, se han descrito originalmente como el dominio (variable) de inmunoglobulina de unión al antígeno de “anticuerpos de cadena pesada” (es decir, de “anticuerpos que carecen de cadenas ligeras”; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: “Naturally occurring antibodies devoid of light chains”; Nature 363, 446-448 (1993)). El término “dominio VHH” se ha elegido con el fin de distinguir estos dominios variables de los dominios variables de la cadena pesada que están presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominan en el presente documento “dominios V^h” o “dominios VH”) y de los dominios variables de la cadena ligera que están presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominan en el presente documento “dominios V^l” o “dominios VL”). Los dominios VHH pueden unirse específicamente a un epítope sin un dominio de unión al antígeno adicional (a diferencia de los dominios VH o VL en un anticuerpo de 4 cadenas convencional, en cuyo caso el epítope es reconocido por un dominio VL junto con un dominio VH). Los dominios VHH son unidades de reconocimiento de antígeno pequeñas, robustas y eficaces formadas por un único dominio de inmunoglobulina.

En el contexto de la presente invención, los términos dominio VHH, VHH, dominio V ^hH, fragmento de anticuerpo VHH, anticuerpo VHH, además de “Nanobody®” y “dominio de Nanobody®” (siendo “Nanobody” una marca registrada de la empresa Ablementenx N.V.; Gante; Bélgica) se usan indistintamente y son representativos de dominios variables sencillos de inmunoglobulina (que tienen la estructura FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y que se unen específicamente a un epítope sin requerir la presencia de un segundo dominio variable de inmunoglobulina), y que se distinguen de dominios VH por los llamados “residuos distintivos”, como se define en, por ejemplo, el documento WO2009/109635, Fig. 1.

Los residuos de aminoácidos de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, por ejemplo, VHH, están numerados según la numeración general para dominios VH facilitada por Kabat y col. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publicación n° 91), como se aplica a dominios VHH de camélidos, como se muestra, por ejemplo, en la Figura 2 de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999).

Según esta numeración

- FR1 comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 1-30,

- CDR1 comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 31-35,

- FR2 comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49,

- CDR2 comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 50-65,

- FR3 comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 66-94,

- CDR3 comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 95-102, y

- FR4 comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 103-113.

Sin embargo, debe observarse que - como es muy conocido en la técnica para dominios V^h y para dominios VHH -el número total de residuos de aminoácidos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponderse con el número total de residuos de aminoácidos indicados por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones según la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia actual, o la secuencia actual puede contener más residuos de aminoácidos que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, generalmente, la numeración según Kabat puede o puede no corresponderse con la numeración actual de los residuos de aminoácidos en la secuencia actual.

Métodos alternativos de numeración de los residuos de aminoácidos de dominios V ^h, métodos que también pueden aplicarse de una manera análoga a dominios VHH, se conocen en la técnica. Sin embargo, en la presente descripción, reivindicaciones y figuras se seguirá la numeración según Kabat y se aplica a dominios VHH como se ha descrito anteriormente, a menos que se indique lo contrario.

El número total de residuos de aminoácidos en un dominio VHH estará normalmente en el intervalo de 110 a 120, frecuentemente entre 112 y 115. Debe, sin embargo, observarse que también pueden ser adecuadas secuencias más pequeñas y más largas para los fines descritos en el presente documento.

Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina, por ejemplo, VHH y anticuerpos de dominio, según las realizaciones preferidas de la invención como se define anteriormente, tienen varias características estructurales únicas y propiedades funcionales que las hacen altamente ventajosas para su uso en terapia en moléculas de unión al antígeno funcionales. En particular, y sin limitarse a esto, los dominios VHH (que se han “diseñado” por la naturaleza para unirse funcionalmente a un antígeno sin aparearse con un dominio variable de la cadena ligera) pueden funcionar como unidades estructurales de unión al antígeno individuales, relativamente pequeñas, funcionales.

Debido a sus propiedades únicas, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina, como se define en el presente documento, como VHH o VH (o VL) - tanto solos como parte de un polipéptido mayor, por ejemplo, una molécula biparatópica - ofrecen varias ventajas significativas:

• solo se requiere un único dominio para unir un antígeno con alta afinidad y con alta selectividad, de manera que no hay necesidad de tener dos dominios separados presentes, ni asegurar que estos dos dominios están presentes en la conformación y configuración espacial correcta (es decir, mediante el uso de ligadores especialmente diseñados, como con scFv);

• los dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden expresarse a partir de una única molécula de ácido nucleico y no requieren ninguna modificación postraduccional (como glicosilación);

• los dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden manipularse fácilmente en formatos multivalentes y multiespecíficos (como se trata adicionalmente en el presente documento);

• los dominios variables sencillos de inmunoglobulina tienen alta especificidad y afinidad por su diana, baja toxicidad inherente y pueden administrarse mediante vías alternativas a la infusión o inyección;

• los dominios variables sencillos de inmunoglobulina son altamente estables al calor, pH, proteasas y otros agentes o condiciones desnaturalizantes y, así, pueden prepararse, guardarse o transportarse sin el uso de equipos de refrigeración;

• los dominios variables sencillos de inmunoglobulina son fáciles y relativamente baratos de preparar, tanto a pequeña escala como a escala de fabricación. Por ejemplo, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden producirse usando fermentación microbiana (por ejemplo, como se describe adicionalmente más adelante) y no requieren el uso de sistemas de expresión de mamífero como con, por ejemplo, anticuerpos convencionales;

• los dominios variables sencillos de inmunoglobulina son relativamente pequeños (aproximadamente 15 kDa, o 10 veces más pequeños que una IgG convencional) en comparación con anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión al antígeno de los mismos y, por tanto, muestran alta (mayor) penetración en tejidos (que incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos y otros tejidos densos) y pueden administrarse en dosis mayores que tales anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión al antígeno de los mismos;

• los VHH tienen las llamadas “propiedades de unión a la cavidad” específicas (entre otras, debido a su bucle CDR3 extendido, en comparación con dominios VH de anticuerpos de 4 cadenas) y pueden, por tanto, también acceder a dianas y epítopes no accesibles a anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión al antígeno de los mismos;

• los VHH tienen la ventaja particular de que son altamente solubles y muy estables y no tienen una tendencia a agregarse (como con los dominios de unión al antígeno derivados de ratón descritos por Ward y col., Nature 341: 544-546 (1989)).

Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención no están limitados con respecto a una fuente biológica específica de la que se han obtenido o a un método de preparación específico. Por ejemplo, obtener VHH puede incluir las siguientes etapas:

(1) aislar el dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada que se produce naturalmente; o cribar una biblioteca que comprende anticuerpos de cadena pesada o VHH y aislar VHH de la misma;

(2) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica un VHH con la secuencia que se produce naturalmente;

(3) “humanizar” (como se describe en el presente documento) un VHH, opcionalmente después de la maduración por afinidad, con una secuencia que se produce naturalmente o que expresa un ácido nucleico que codifica tal VHH humanizado;

(4) “camelizar” (como se describe más adelante) un dominio pesado variable sencillo de inmunoglobulina de un anticuerpo que se produce naturalmente de una especie de animal, en particular una especie de mamífero, tal como de un ser humano, o expresar una molécula de ácido nucleico que codifica tal dominio camelizado;

(5) “camelizar” una VH, o expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una VH camelizada tal;

(6) usar técnicas para preparar sintéticamente o semi-sintéticamente proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos;

(7) preparar una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio VHH usando técnicas para la síntesis de ácidos nucleicos, seguido de expresión del ácido nucleico así obtenido;

(8) someter anticuerpos de cadena pesada o VHH a maduración por afinidad, a mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis al azar o mutagénesis dirigida al sitio) y/o cualquier otra técnica con el fin de aumentar la afinidad y/o especificidad del VHH; y/o

(9) combinaciones o selecciones de las etapas anteriores.

Métodos y técnicas adecuados para realizar las etapas anteriormente descritas se conocen en la técnica y serán evidentes para el experto. A modo de ejemplo, los métodos de obtención de dominios de VHH que se unen a un antígeno o epítope específico se han descrito en los documentos WO2006/040153 y WO2006/122786.

Según realizaciones específicas, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención o presentes en los polipéptidos de la invención son dominios VHH con una secuencia de aminoácidos que se corresponde esencialmente con la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH que se produce naturalmente, pero que se ha “humanizado” u “optimizado en la secuencia” (opcionalmente después de la maduración por afinidad), es decir, reemplazando uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de VHH que se produce naturalmente con uno o más de los residuos de aminoácidos que se producen en la(s) posición (posiciones) correspondiente(s) en un dominio pesado variable de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano. Esto puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica, que pueden usarse rutinariamente por el experto.

Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de la región estructural completamente humanas y, en una realización incluso más específica, puede contener secuencias de la región estructural humanas derivadas de secuencias de la línea germinal humana Vh3 DP-29, DP-47, DP-51, o partes de las mismas, o ser altamente homólogo a las mismas, opcionalmente combinado con secuencias JH, tales como JH5. Así, un protocolo de humanización puede comprender la sustitución de cualquiera de los residuos de VHH con los residuos de la región estructural correspondiente 1, 2 y 3 (FR1, FR2 y FR3) de los genes de la línea germinal VH tales como DP 47, DP 29 y DP 51 tanto solas como en combinación. Regiones estructurales (FR) adecuadas de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención pueden seleccionarse de aquellas como se explica, por ejemplo, en el documento WO 2006/004678 y específicamente incluyen las llamadas clases “KERE” y “GLEW”. Ejemplos son los dominios variables sencillos de inmunoglobulina que tienen la secuencia de aminoácidos G-L-E-W en aproximadamente las posiciones 44 a 47, y sus homólogos humanizados respectivos. Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de la región estructural completamente humanas.

A modo de ejemplo, una sustitución humanizante para VHH que pertenece al grupo 103 P,R,S y/o el grupo GLEW (como se define más adelante) es 108Q a 108L. Métodos para humanizar los dominios variables sencillos de inmunoglobulina se conocen en la técnica.

La unión de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina con propiedades mejoradas en vista de la aplicación terapéutica, por ejemplo, potenciada afinidad o disminuida inmunogenicidad, puede obtenerse de moléculas de unión sencillas por técnicas conocidas en la técnica tales como maduración por afinidad (por ejemplo, a partir de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o que se producen naturalmente), injerto de CDR, humanización, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por PCR usando cebadores de solapamiento, y técnicas similares para manipular secuencias de inmunoglobulina muy conocidas para el experto; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores, también llamada “optimización de secuencias”, como se describe en el presente documento. Se hace referencia, por ejemplo, a libros de texto convencionales, además de a la descripción y ejemplos adicionales.

Si es apropiado, una molécula de unión con elevada afinidad puede obtenerse por maduración por afinidad de otra molécula de unión, representando la última, con respecto a la molécula madurada por afinidad, la molécula de unión “parental”.

Los métodos de obtención de VHH que se unen a un antígeno o epítope específico se han descrito anteriormente, por ejemplo, en los documentos WO2006/040153 y WO2006/122786. Como también se describe en su interior en detalle, los dominios VHH derivados de camélidos pueden “humanizarse” (también llamados “de secuencias optimizadas” en el presente documento, la “optimización de secuencias” puede englobar, además de la humanización, una modificación adicional de la secuencia con una o más mutaciones que suministran el VHH con propiedades mejoradas, tales como la eliminación de posibles sitios de modificación postraduccionales) reemplazando uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la secuencia VHH original con uno o más de los residuos de aminoácidos que se producen en la(s) posición (posiciones) correspondientes en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano. Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de la región estructural completamente humanas y, en una realización incluso más específica, pueden contener secuencias de la región estructural humanas derivadas de DP-29, DP-47, DP-51, o partes de las mismas, opcionalmente combinadas con secuencias JH, tales como JH5.

Se han descrito “anticuerpos de dominio", también conocidos como “Dab” y “dAb” (siendo usados los términos “anticuerpos de dominio” y “dAb” como marcas registradas por el grupo GlaxoSmithKline de empresas) en, por ejemplo, Ward, E.S. y col.: “Binding Activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli”; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. y col.: “Domain Antibodies: proteins for therapy”; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); y el documento WO2003/002609.

Los anticuerpos de dominio se corresponden esencialmente con los dominios VH o VL de anticuerpos de mamíferos no camélidos, en particular anticuerpos de 4 cadenas humanos. Con el fin de unir un epítope como único dominio de unión al antígeno, es decir, sin aparearse con un dominio VL o VH, respectivamente, se requiere la selección específica para tales de propiedades de unión al antígeno, por ejemplo, usando bibliotecas de secuencias de dominios Vh o VL individuales humanas.

Los anticuerpos de dominio tienen, como VHH, un peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa y, si se derivan de secuencias completamente humanas, no requieren humanización para, por ejemplo, uso terapéutico en seres humanos. Como en el caso de dominios VHH, también se expresan en sistemas de expresión procariotas, proporcionando una reducción significativa en el coste de fabricación global.

Además, también será evidentes para el experto que es posible “injertar” una o más de las CDR mencionadas anteriormente sobre otros “andamiajes”, que incluyen, pero no se limitan a, andamiajes humanos o andamiajes de no inmunoglobulina. Andamiajes y técnicas adecuados para tal injerto de CDR se conocen en la técnica.

Los términos “epítope" y “determinante antigénico", que pueden usarse indistintamente, se refieren a la parte de una macromolécula, tal como un polipéptido, que es reconocida por moléculas de unión al antígeno, tal como anticuerpos convencionales o los polipéptidos de la invención, y más particularmente por el sitio de unión al antígeno de dichas moléculas. Los epítopes definen el sitio de unión mínimo para una inmunoglobulina, y así representan la diana de especificidad de una inmunoglobulina.

Un polipéptido (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención, o generalmente una molécula de unión al antígeno o un fragmento de la misma) que puede “unirse a” o “se une específicamente a”, que “tiene afinidad por” y/o que “tiene especificidad por” un cierto epítope, antígeno o proteína (o por al menos una parte, fragmento o epítope de la misma) se dice que está “contra” o “se dirige contra” dicho epítope, antígeno o proteína o es una molécula de “unión” con respecto a tal epítope, antígeno o proteína. En este contexto, una molécula de unión a Ang2 también puede denominarse “neutralizante de Ang2".

Generalmente, el término “especificidad” se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o epítopes a los que puede unirse una molécula de unión al antígeno particular o molécula de proteína de unión al antígeno (tal como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención). La especificidad de una molécula de unión al antígeno puede determinarse basándose en su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión al antígeno (K^d), es una medida de la fuerza de unión entre un epítope y un sitio de unión al antígeno sobre la proteína de unión al antígeno: cuanto menor sea el valor de K^d, más fuerte será la fuerza de unión entre un epítope y la molécula de unión al antígeno (alternativamente, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (K^a), es 1/K^d). Como será evidente para el experto (por ejemplo, basándose en la divulgación adicional en el presente documento), la afinidad puede determinarse de un modo en sí conocido, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión al antígeno (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o un polipéptido que lo contiene y el antígeno pertinente). La avidez está relacionada con tanto la afinidad entre un epítope y su sitio de unión al antígeno sobre la molécula de unión al antígeno como el número de sitios de unión pertinentes presentes sobre la molécula de unión al antígeno.

La parte de una molécula de unión al antígeno (tal como un anticuerpo o un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención) que reconoce el epítope se llama un “paratope”.

A menos que se indique lo contrario, el término “molécula de unión a Ang2" incluye anticuerpos anti-Ang2, fragmentos de anticuerpos anti-Ang2, “moléculas similares a anticuerpos anti-Ang2" y conjugados con cualquiera de estos. Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales y monoclonales quimerizados. El término “anticuerpo" engloba inmunoglobulinas completas, como anticuerpos monoclonales producidos por expresión recombinante en células huésped, además de fragmentos de anticuerpos de unión a Ang2 o “moléculas similares a anticuerpo", que incluyen anticuerpos monocatenarios y anticuerpos lineales, los llamados “SMIP” (“productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños”), como se describe, por ejemplo, en el documento WO02/056910. Las moléculas similares a anticuerpos anti-Ang2 incluyen los dominios variables sencillos de inmunoglobulina, como se define en el presente documento. Otros ejemplos de moléculas similares a anticuerpo son los anticuerpos de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF), o moléculas injertadas en CDR.

“Molécula de unión a Ang2" se refiere a moléculas de unión a Ang2 monovalentes (es decir, moléculas que se unen a un epítope de Ang2), además de a moléculas de unión a Ang2 que contienen más de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de unión a Ang2, también llamadas moléculas de unión a Ang2 “formateadas". Las moléculas de unión a Ang2 formateadas pueden comprender, además de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a Ang2, ligadores y/o restos con funciones efectoras, por ejemplo, restos que prolongan la semivida como los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a albúmina, y/o un componente de fusión como albúmina de suero y/o un polímero unido como PEG.

Una molécula de unión a Ang2 formateada también puede comprender, aunque es menos preferido, dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a Ang2 idénticos o dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina diferentes que reconocen los mismos epítopes o epítopes que se solapan. En este caso, los dos los dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden unirse al mismo epítope o a un epítope que se solapa en cada uno de los dos monómeros que forman el dímero de Ang2. Datos experimentales que incluyen ensayo de ELISA competitivo desvelan una mejora significativa en la potencia de los dímeros de Ang2 formateados cuando se compara con los bloques de unión sencillos de mono-moléculas de unión a Ang2 (datos no mostrados).

La unión específica de una proteína de unión al antígeno a un antígeno o epítope puede determinarse de cualquier manera adecuada en sí conocida, que incluye, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición de sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas en la materia.

Los residuos de aminoácidos se indicarán según el código de aminoácidos de tres letras o de una letra convencional, como generalmente se conoce y se acuerda en la materia. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término “diferencia de aminoácidos” se refiere a inserciones, deleciones o sustituciones del número de residuos de aminoácidos indicado en una posición de la secuencia de referencia, en comparación con una segunda secuencia. En el caso de sustitución (sustituciones), tal(es) sustitución (sustituciones) serán preferiblemente sustitución (sustituciones) de aminoácidos conservativa(s), que significa que un residuo de aminoácido se sustituye con otro residuo de aminoácido de estructura química similar y que tiene poca influencia o esencialmente ninguna influencia sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Tales sustituciones de aminoácidos conservativas son muy conocidas en la técnica, por ejemplo, a partir del documento WO98/49185, en el que sustituciones de aminoácidos conservativas son preferiblemente sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (i) -(v) está sustituido con otro residuo de aminoácido dentro del mismo grupo: (i) residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (ii) residuos polares, negativamente cargados y sus amidas (sin cargar): Asp, Asn, Glu y Gln; (iii) residuos polares, positivamente cargados: His, Arg y Lys; (iv) residuos alifáticos grandes no polares: Met, Leu, Ile, Val y Cys; y (v) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Sustituciones de aminoácidos conservativas particularmente preferidas son las siguientes:

Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; Ile en Leu o en Val; Leu en Ile o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; Met en Leu, en Tyr o en Ile; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp o en Phe; Val en Ile o en Leu.

Un polipéptido o molécula de ácido nucleico se considera que está “(en) (forma) esencialmente aislada" - por ejemplo, cuando se compara con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o medio de cultivo del que ha sido obtenida - cuando se ha separado de al menos otro componente con el que normalmente está asociado en dicha fuente o medio, tal como otra proteína/polipéptido, otro ácido nucleico, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente menor. En particular, un polipéptido o molécula de ácido nucleico se considera “esencialmente aislado" cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces, y hasta 1000 veces o más. Un polipéptido o molécula de ácido nucleico que está “en forma esencialmente aislada" es preferiblemente esencialmente homogéneo, como se ha determinado usando una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida.

El término “extremo N” (también conocido como el extremo amino, extremo de NH2, extremo N o extremo amina) se refiere al inicio de una proteína/polipéptido (es decir, molécula de unión a Ang2) terminada por un aminoácido con un grupo amina libre (-NH2). La convención para escribir las secuencias de péptidos es poner el extremo N a la izquierda y escribir la secuencia del extremo N al extremo C. Cuando la proteína se traduce a partir de ARN mensajero, se crea del extremo N al extremo C.

“Identidad de secuencias" entre dos secuencias de moléculas de unión de Ang2 indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. Puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento WO08/020079. “Similitud de secuencias" indica el porcentaje de aminoácidos que tanto es idéntico como que representa sustituciones de aminoácidos conservativas.

Métodos alternativos para numerar los residuos de aminoácidos de dominios VH, métodos que también puede aplicarse en un modo análogo a los dominios VHH, se conocen en la técnica. Sin embargo, en la presente descripción, reivindicaciones y figuras se seguirá la numeración según Kabat y se aplica a dominios VHH como se ha descrito anteriormente, a menos que se indique lo contrario.

Una molécula de unión a Ang2 “madurada por afinidad", en particular un VHH o un anticuerpo de dominio, tiene una o más alteraciones en una o más CDR que producen una afinidad por Ang2 mejorada, con respecto a la molécula de unión a Ang2 parental respectiva. Las moléculas de unión a Ang2 maduradas por afinidad de la invención pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Marks y col., 1992, Biotechnology 10:779-783, o Barbas y col., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Shier y col., 1995, Gene 169:147-155; Yelton y col., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson y col., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; y Hawkins y col., 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889896; KS Johnson y RE Hawkins, “Affinity maduration of antibodies using phage display”, Oxford University Press 1996.

“Una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: x” implica una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la secuencia mostrada en SEC ID N°: x respectiva;

Los términos “cáncer' y “canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento/proliferación celular no regulado. Ejemplos del cáncer que va a tratarse con una molécula de unión a Ang2 de la invención incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, cáncer gástrico, melanoma, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. La desregulación de la angiogénesis puede conducir a muchos trastornos que pueden tratarse por composiciones y métodos de la invención. Estos trastornos incluyen tanto afecciones no neoplásicas como neoplásicas. Las neoplasias incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas anteriormente.

Los trastornos no neoplásicos incluyen, pero no se limitan a, hipertrofia no deseada o anómala, artritis, artritis reumatoide (AR), psoriasis, placas psoriásicas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, retinopatías diabéticas y otras proliferativas que incluyen retinopatía de prematuridad, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular senil, edema macular diabético, neovascularización de la córnea, neovascularización de injerto de córnea, rechazo de injerto de córnea, neovascularización retiniana/coroidal, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas (incluyendo enfermedad de Graves), trasplante de córnea y de otro tejido, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/SDA, septicemia, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado a accidente cerebrovascular agudo / lesión de cabeza cerrada / traumatismo), inflamación sinovial, formación de paño en AR, miositis osificante, formación ósea hipertrófica, osteoartritis (OA), ascitis resistente al tratamiento, poliquistosis ovárica, endometriosis, 3° espacio de enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad intestinal), fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica tal como EII (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tejido no deseada o anómala (no cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento de pelo, síndrome de Osier-Weber, fibroplasias retrolentales por granuloma piogénico, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada a pericarditis) y efusión pleural.

El término “enfermedades oculares" se refiere a retinopatías proliferativas que incluyen retinopatía de la prematuridad, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular senil, edema macular diabético, neovascularización de la córnea, neovascularización de injerto de la córnea, rechazo de injerto de la córnea, neovascularización retiniana/coroidal.

El término “enfermedades renales crónicas" se refiere a nefropatía diabética, insuficiencia posrrenal, azotemia

1

prerrenal e insuficiencia renal intrínseca.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de unión a Ang2 que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en la que dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina comprende tres regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3, en la que CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 168, CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 171 y CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 175.

SEC ID N°: 168 DYAIG

SEC ID N°: 171 AIRSSGGSTYYADSVKG

SEC ID N°: 175 VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA

Según realizaciones preferidas, la molécula de unión a Ang2 comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en la que dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH o un anticuerpo de dominio.

Según una realización preferida, la molécula de unión a Ang2 comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en el que dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina es VHH.

Según realizaciones específicas, dicho VHH consiste en un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tiene una SEC ID N°: 166.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de unión a Ang2 que consiste en dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina.

La secuencia de los ligantes de Ang2 según la invención puede modificarse en su extremo N (es decir, deleción o intercambio del primer aminoácido) sin reducción significativa de su actividad de unión. Esta modificación potencia la escisión co-/pos-traduccional de la metionina del extremo N durante la expresión intracelular/citoplásmica en huéspedes bacterianos (por ejemplo, pero no se limita a, Escherichia coli).

En un aspecto, dicho VHH que consiste en un dominio variable sencillo de inmunoglobulina tiene una modificación o intercambio en el extremo N, en el que dicha modificación es una deleción de un primer aminoácido y dicho intercambio es una sustitución del primer aminoácido con otro aminoácido.

En una de las realizaciones preferidas, el primer aminoácido en el extremo N es valina (V) o ácido aspártico (D) sustituido con, por ejemplo, alanina (A).

Los componentes de unión a Ang2 con propiedades mejoradas en vista de la aplicación terapéutica, por ejemplo, afinidad potenciada o inmunogenicidad disminuida, pueden obtenerse de componentes de unión a Ang2 individuales de la invención por técnicas tales como maduración por afinidad (por ejemplo, a partir de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o que se producen naturalmente), injerto de CDR, humanización, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por PCR usando cebadores de solapamiento, y técnicas similares para manipular secuencias de inmunoglobulina muy conocidas para el experto; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de las anteriores. Se hace referencia, por ejemplo, a libros de texto convencionales, además de a la descripción y ejemplos adicionales.

En otra realización más, los representantes de la clase de dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a Ang2 de la invención que incluyen CDR como se propone anteriormente tienen secuencias de aminoácidos que se corresponden con la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se produce naturalmente que se ha “camelizado”, es decir, reemplazando uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable que se produce naturalmente de un anticuerpo de 4 cadenas convencional con uno o más residuos de aminoácidos que se producen en la(s) posición (posiciones) correspondiente(s) en un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Esto puede realizarse de un modo en sí conocido, que será evidente para el experto, y se hace referencia adicionalmente al documento WO 1994/04678. Tal camelización puede producirse preferencialmente en posiciones de aminoácidos que están presentes en la superficie de separación VH-VL y en los llamados residuos distintivos de Camelidae (véase también, por ejemplo, el documento WO 1994/04678). Una descripción detallada de tales técnicas de “humanización” y “camelización” y secuencias de la región estructural preferidas consistentes con las mismas puede tomarse adicionalmente de, por ejemplo, la pág. 46 y la pág. 98 del documento WO 2006/040153 y la pág. 107 del documento WO 2006/122786.

Los componentes de unión a Ang2 de la invención, por ejemplo, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina y o polipéptidos que los contienen, tienen especificidad por Ang2 porque comprenden uno o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen específicamente a uno o más epítopes dentro de la molécula de Ang2.

La unión específica de un componente de unión a Ang2 a su antígeno Ang2 puede determinarse de cualquier manera adecuada en sí conocida, que incluye, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA y ELISA) y ensayos de competición de sándwich, y las diferentes variantes de los mismos en sí conocidas en la materia.

Según otra realización, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina son anticuerpos de dominio, como se define en el presente documento.

En dicho caso, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina como se define anteriormente presentes en las moléculas de unión específicas de la invención tienen secuencias que se corresponden con la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se produce naturalmente que ha sido “camelizado”, es decir, reemplazando uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable que se produce naturalmente de un anticuerpo de 4 cadenas convencional con uno o más residuos de aminoácidos que se producen en la(s) posición (posiciones) correspondiente(s) en un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Esto puede realizarse de un modo en sí conocido, que será evidente para el experto, y se hace referencia adicional al documento WO 94/04678. Tal camelización puede producirse preferencialmente en posiciones de aminoácidos que están presentes en la superficie de separación VH-VL y en los llamados residuos distintivos de Camelidae (véase, por ejemplo, también el documento WO 94/04678). Una descripción detallada de tales técnicas de “humanización” y “camelización” y secuencias de la región estructural preferidas de acuerdo con las mismas pueden tomarse adicionalmente de, por ejemplo, la pág. 46 y la pág. 98 del documento WO 2006/040153 y la pág. 107 del documento WO 2006/122786.

Los componentes de unión tienen especificidad por Ang2, porque comprenden un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se unen específicamente a la molécula de Ang2.

La unión específica de un componente de unión a su antígeno Ang2 puede determinarse de cualquier manera adecuada en sí conocida que incluye, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA y ELISA) y ensayos de competición de sándwich, y las diferentes variantes de los mismos en sí conocidas en la materia.

La presente invención también se refiere a un ácido nucleico que codifica la molécula de unión a Ang2 según la invención.

En una realización preferida, una molécula de unión a Ang2 según la invención cuando se expresa en Escherichia coli está codificada por la secuencia de nucleótidos:

SEC ID N°: 179

GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGACTGGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTG AGTTGCGCAGTTAGCGGTATTACCCTGGATGATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCC CAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCGCAATTCGTAGCAGCGGTGGTAGCACCTATTATG CCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCAGCAGCGATAACAGTAAAAACACGGTTTATCTG CAAATGAACTCATTACGTCCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGCGCAGCAGTTCCGGCAG GTCGTCTGCGTTATGGTGAACAGTGGTATCCGATTTATGAATATGATGCATGGGGTCAAGG T ACACT G GTT ACAGT GAGTAGC

La invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención. Tales moléculas de ácidos nucleicos también se denominarán en el presente documento “ácidos nucleicos de la invención” y también pueden estar en forma de una construcción genética, como se define en el presente documento. Un ácido nucleico de la invención puede ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con un uso de codones que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula huésped prevista u organismo huésped). Según una realización de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se define anteriormente en el presente documento.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula de unión a Ang2 según la invención.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, puede estar presente en y/o puede ser parte de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido o YAC.

El vector puede ser especialmente un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresión de la molécula de unión monoespecífica in vitro y/o in vivo (es decir, en una célula huésped adecuada, organismo huésped y/o sistema de expresión). Tal vector de expresión generalmente comprende al menos un ácido nucleico de la invención que está operativamente ligado a uno o más elementos reguladores adecuados, tales como promotor(es), potenciador(es), terminador(es) y similares. Tales elementos y su selección en vista de la expresión de una secuencia específica en un huésped específico son conocimiento común del experto. Ejemplos específicos de elementos reguladores y otros elementos útiles o necesarios para expresar las moléculas de la invención, tales como promotores, potenciadores, terminadores, factores de integración, marcadores de selección, secuencias conductoras, genes indicadores, y similares, se desvelan por ejemplo, en las pág. 131 a 133 del documento WO 2006/040153.

Tales vectores expresan o pueden expresar una o más moléculas de unión monoespecífica de la invención; y/o contienen un ácido nucleico de la invención.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse de un modo en sí conocido (por ejemplo, por síntesis de ADN automatizada y/o tecnología de ADN recombinante), basándose en la información sobre las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos de la invención facilitada en el presente documento, y/o pueden aislarse de una fuente natural adecuada.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped que lleva uno o más vectores de expresión que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de unión a Ang2 según la invención.

Según una realización particularmente preferida, dichas células huésped son células bacterianas; otras células útiles son células de levadura, células fúngicas o células de mamífero.

Células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas de bacterias Gram-negativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas, y cepas de bacterias Gram-positivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris y Pichia methanolica) y Hansenula.

Células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibio, células de insecto, células vegetales, y cualquier otra célula usada en la materia para la expresión de proteínas heterólogas.

La invención proporciona además métodos de fabricación de una molécula de unión monoespecífica de la invención, comprendiendo tales métodos generalmente las etapas de:

- cultivar células huésped que comprenden un ácido nucleico que puede codificar una molécula de unión monoespecífica en condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión monoespecífica de la invención; y - recuperar o aislar el polipéptido expresado por las células huésped del cultivo; y

- opcionalmente purificar y/o modificar y/o formular adicionalmente la molécula de unión monoespecífica de la invención.

La realización preferida representa un método de producción de una molécula de unión a Ang2 que tiene la secuencia SEC ID N°: 166 que comprende las etapas de:

(a) transfectar una célula huésped con uno o más de dichos vectores

(b) cultivar dicha célula huésped, y

(c) recuperar y purificar dicha molécula de unión a Ang2.

Para la producción a escala industrial, organismos huésped preferidos incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris y S. cerevisiae que son adecuadas para la expresión, producción y fermentación a gran escala, y en particular para la expresión, producción y fermentación farmacéutica a gran escala.

La elección del sistema de expresión específico depende en parte del requisito para ciertas modificaciones postraduccionales, más específicamente glicosilación. La producción de una molécula de unión monoespecífica de la invención para la que se desea la glicosilación o se requiere necesitaría el uso de huéspedes de expresión de mamífero que tienen la capacidad de glicosilar la proteína expresada. A este respecto, será evidente para el experto que el patrón de glicosilación obtenido (es decir, el tipo, número y posición de residuos unidos) dependerá de la célula o línea celular que se use para la expresión.

Las moléculas de unión monoespecífica de la invención pueden producirse tanto en una célula como se explica anteriormente intracelularmente (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y luego aislarse de las células huésped y purificarse opcionalmente adicionalmente; como pueden producirse extracelularmente (por ejemplo, en el medio en el que las células huésped se cultivan) y luego aislarse del medio de cultivo y purificarse opcionalmente adicionalmente.

Métodos y reactivos usados para la producción recombinante de polipéptidos, tales como vectores de expresión adecuados específicos, métodos de transformación o transfección, marcadores de selección, métodos de inducción de la expresión de proteínas, condiciones de cultivo, y similares, se conocen en la técnica. Similarmente, técnicas de

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aislamiento y purificación de proteínas útiles en un método de fabricación de un polipéptido de la invención son muy conocidas para el experto.

La invención se refiere además a un producto o composición que contiene o que comprende al menos una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención y opcionalmente uno o más componentes adicionales de tales composiciones en sí conocidos, es decir, dependiendo del uso previsto de la composición.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención como un medicamento.

En otro aspecto adicional, la invención se refiere al uso de una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención para el método de tratamiento de cáncer, enfermedades cancerosas u oculares.

Para uso farmacéutico, una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención o un polipéptido que contiene la misma puede formularse como preparación o composición farmacéutica que comprende al menos una de tales moléculas de unión monoespecífica de la invención y al menos un vehículo, diluyente o excipiente y/o adyuvante fisiológicamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Por medio de ejemplos no limitantes, una formulación tal puede estar en una forma adecuada para administración por vía oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea, o infusión intravenosa), para administración tópica, para administración por inhalación, por un parche de la piel, por un implante, por un supositorio, etc. Tales formas de administración adecuadas - que pueden ser sólidas, semi-sólidas o líquidas, dependiendo del modo de administración - además de métodos y vehículos para su uso en la preparación de las mismas, serán evidentes para el experto, y se describen adicionalmente en el presente documento.

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2, en particular un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención como se define anteriormente o un polipéptido que contiene el mismo y al menos un vehículo, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmacéutico), y opcionalmente una o más sustancias adicionalmente activas.

Las moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención pueden formularse y administrarse en cualquier modo adecuado en sí conocido: se hace referencia, en particular para los dominios variables sencillos de inmunoglobulina, por ejemplo, a los documentos WO 2004/041862, WO 2004/041863, WO 2004/041865, WO 2004/041867 y WO 2008/020079, además de a los libros de texto convencionales, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams y Wilkins (2005); o Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (véanse, por ejemplo, las páginas 252-255).

Por ejemplo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención como se define anteriormente puede formularse y administrarse de cualquier modo en sí conocido para anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpos (incluyendo ScFv y diacuerpos) y otras proteínas farmacéuticamente activas. Tales formulaciones y métodos para preparar los mismos serán evidentes para el experto y, por ejemplo, incluyen preparaciones adecuadas para administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial o intratecal) o para administración tópica (es decir, transdérmica o intradérmica).

Las preparaciones para administración parenteral pueden ser, por ejemplo, disoluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que son adecuadas para infusión o inyección. Vehículos o diluyentes adecuados para tales preparaciones incluyen, por ejemplo, sin limitación, agua estéril y tampones y disoluciones acuosas farmacéuticamente aceptables tales como solución salina fisiológica tamponada con fosfato, disoluciones de Ringer, disolución de dextrosa y disolución de Hank; aceites acuosos; glicerol; etanol; glicoles tales como propilenglicol o además de aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, además de mezclas adecuadas de los mismos. Normalmente se preferirán disoluciones o suspensiones acuosas.

Así, la molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención puede administrarse sistémicamente, por ejemplo, por vía oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Para administración terapéutica oral, la molécula de de la invención puede combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos el 0,1 % de la molécula de unión a Ang2 de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60 % del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de la molécula de la invención en tales composiciones terapéuticamente útiles es de forma que se obtendrá un nivel de dosificación eficaz.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener ligantes, excipientes, disgregantes, lubricantes y edulcorantes o aromatizantes, por ejemplo, aquellos mencionados en las páginas 143-144 del documento WO 08/020079. Si la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la forma sólida de dosificación unitaria. Por ejemplo, comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, Shellac o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener las moléculas de la invención, sacarosa o fructosa como edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como aroma de cereza o de naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, las moléculas de la invención pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.

Las preparaciones y formulaciones para administración por vía oral también pueden proporcionarse con un recubrimiento entérico que permitirá que las construcciones de la invención resistan al entorno gástrico y pasen a los intestinos. Más generalmente, las preparaciones y formulaciones para administración por vía oral pueden formularse adecuadamente para la administración en cualquier parte deseada del tubo gastrointestinal. Además, pueden usarse supositorios adecuados para la administración en el tubo gastrointestinal.

Las moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención también pueden administrarse intravenosamente o intraperitonealmente por infusión o inyección, como se ha descrito adicionalmente en las páginas 144 y 145 del documento WO 2008/020079.

Para administración tópica de las moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención, generalmente se deseará administrarlas a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido, como se ha descrito adicionalmente en la página 145 del documento WO 2008/020079.

Generalmente, la concentración de las moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente el 0,1-25 % en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,5-10 % en peso. La concentración en una composición semi-sólida o sólida tal como un gel o un polvo será aproximadamente el 0,1-5 % en peso, preferiblemente aproximadamente el 0,5-2,5 % en peso.

La cantidad de moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención requerida para su uso en tratamiento variará no solo con la molécula de unión monoespecífica particular seleccionada, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección que está tratándose y la edad y condición del paciente, y será por último lugar a criterio del médico adjunto o profesional clínico. Por tanto, la dosificación de las moléculas de unión monoespecífica de la invención varía dependiendo de la célula diana, tumor, tejido, injerto u órgano. La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis única o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis por día. La propia subdosis puede dividirse adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones libremente separadas discretas; tales como múltiples inhalaciones de un insuflador o por administración de una pluralidad de gotas en el ojo.

Una pauta de administración puede incluir tratamiento diario a largo plazo. Por “largo plazo” se indica al menos dos semanas y preferiblemente varias semanas, meses o años de duración. Modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación pueden determinarse por un experto habitual en la materia usando solo experimentación rutinaria dadas las enseñanzas en el presente documento. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificación también puede ajustarse por el médico individual en el caso de cualquier complicación.

Según otra realización, la invención se refiere al uso de moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención, es decir, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina o polipéptidos que los contienen, para fines terapéuticos, tales como

- para la prevención, tratamiento y/o alivio de un trastorno, enfermedad o afección, especialmente en un ser humano, que está asociado con efectos mediados con Ang2 y/o relacionados con Ang2 sobre la angiogénesis o que puedan prevenirse, tratarse o aliviarse modulando la ruta de señalización de Notch y/o la ruta de señalización de Tie2 con una molécula de unión monoespecífica según la invención;

- en un método de tratamiento de un paciente en necesidad de tal terapia, comprendiendo tal método

administrar, a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una molécula de unión monoespecífica de la invención, por ejemplo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, o una composición farmacéutica que contiene la misma;

- para la preparación de un medicamento para la prevención, tratamiento o alivio de trastornos, enfermedades o afecciones asociados a efectos mediados por Ang2 y/o mediados por Ang2 sobre la angiogénesis;

- como principio activo en una composición farmacéutica o medicamento usado para los fines anteriores.

Según un aspecto específico, dicho trastorno, enfermedad o afección es un cáncer o enfermedad cancerosa, como se define en el presente documento.

En realizaciones preferidas, la invención se refiere a dicha composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer y enfermedades cancerosas, tales como carcinoma de mama, de células renales, cáncer de ovario y cáncer pancreático.

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Según otro aspecto, la enfermedad es una enfermedad ocular asociada a efectos mediados por Ang2 y/o mediados por Ang2 sobre la angiogénesis o que puede tratarse o aliviarse modulando la ruta de señalización de Notch y/o la ruta de señalización de Tie2 con una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención.

En otras realizaciones preferidas, la invención se refiere a dicha composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades oculares, tales como degeneración macular senil y retinopatía diabética.

En todavía otras realizaciones preferidas, la invención se refiere a dicha composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades renales crónicas.

Dependiendo del cáncer/enfermedades cancerosas, enfermedades oculares y/o enfermedades renales crónicas que van a tratarse, una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención puede usarse por sí misma o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales.

En realizaciones preferidas, la invención se refiere a la composición farmacéutica que comprende, como principio activo, una o más de dichas moléculas de unión a Ang-2 de la invención, que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como agentes quimioterapéuticos como agentes de lesión de ADN y/o fármacos antimitóticos en células cancerosas (por ejemplo, taxol) o compuestos terapéuticamente activos que inhiben la angiogénesis (un fármaco anti-angiogénico tal como inhibidor de receptores anti-VEGF/VEGF, por ejemplo, avastin, nitedanib y sunitinib), o inhibidores de la ruta de transducción de señales tales como inhibidores de mTOR (por ejemplo, temsirolimus) o agentes de terapia hormonal (por ejemplo, tamoxifeno).

El agente terapéutico adicional puede administrarse simultáneamente con, opcionalmente como un componente de la misma preparación farmacéutica, o antes o después de la administración de la molécula de unión monoespecífica. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser, sin limitación (y en el caso de los receptores, que incluyen los ligandos respectivos), uno o más inhibidores seleccionados del grupo de inhibidores de EGFR, VEGf , VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK y PI3 cinasa, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R o IR. Otros ejemplos de agentes terapéuticos adicionales son inhibidores de CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, antagonistas hedgehog, inhibidores de JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, el proteasoma, Rho, un inhibidor de la señalización de wnt o un inhibidor de la ruta de ubiquitinación u otro inhibidor de la ruta de señalización de Notch.

Ejemplos de inhibidores de Aurora son, sin limitación, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.

Un ejemplo de un inhibidor de PLK es GSK-461364.

Ejemplos de inhibidor de VEGF son avastin (Roche), aflibercept (Regeneron).

Ejemplos de inhibidores de raf son BAY-73-4506 (también un inhibidor de VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (también además un inhibidor de VEGFR), sorafenib (también además un inhibidor de VEGFR) y XL 281.

Ejemplos de inhibidores KSP son ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731 y SB-743921.

Ejemplos de inhibidores de src y/o bcr-abl son dasatinib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (también un inhibidor de IGF-1R), nilotinib (también un inhibidor de PDGFR y cKit), imatinib (también un inhibidor de cKit) y NS-187.

Un ejemplo de un inhibidor de PDK1 es BX-517.

Un ejemplo de un inhibidor de Rho es BA-210.

Ejemplos de inhibidores de cinasas PI3 son PX-866, BEZ-235 (también un inhibidor de mTor), XL 418 (también un inhibidor de Akt), XL-147 y XL 765 (también un inhibidor de mTor).

Ejemplos de inhibidores de cMet o HGF son XL-184 (también un inhibidor de VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (también un inhibidor de VEGFR), MGCD-265 (también un inhibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 y AV-299.

Un ejemplo de un inhibidor de c-Myc es CX-3543.

Ejemplos de inhibidores de Flt3 son AC-220 (también un inhibidor de cKit y PDGFR), KW 2449, lestaurtinib (también un inhibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (también un inhibidor de JAK2), XL-999 (también un inhibidor de cKit, FGFR, PDGFR y VEGFR), sunitinib (también un inhibidor de PDGFR, VEGFR y cKit) y tandutinib (también un inhibidor de PDGFR, y cKit).

Ejemplos de inhibidores de HSP90 son tanespimicina, alvespimicina, IPI-504 y CNF 2024.

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Ejemplos de inhibidores de JAK/STAT son CYT-997 (que también interacciona con tubulina), TG 101348 (también un inhibidor de Flt3) y XL-019.

Ejemplos de inhibidores de Mek son ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 y XL 518.

Ejemplos de inhibidores de mTor son temsirolimus, AP-23573 (que también actúa de inhibidor de VEGF), everolimus (además un inhibidor de VEGF), XL-765 (también un inhibidor de cinasas PI3) y BEZ-235 (también un inhibidor de cinasas PI3).

Ejemplos de inhibidores de Akt son perifosina, GSK-690693, RX-0201 y triciribina.

Ejemplos de inhibidores de cKit son AB-1010, OSI-930 (también actúa de inhibidor de VEGFR), AC-220 (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), axitinib (también un inhibidor de VEGFR y PDGFR), XL-999 (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinib (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR) y XL-820 (también actúa de inhibidor de VEGFR y PDGFR), imatinib (también un inhibidor de bcrabl), nilotinib (también un inhibidor de bcr-abl y PDGFR).

Ejemplos de antagonistas de hedgehog son IPI-609 y CUR-61414.

Ejemplos de inhibidores de CDK son seliciclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (que también inhibe VEGFR2 y PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 y AG 024322.

Ejemplos de inhibidores del proteasoma son bortezomib, carfilzomib y NPI-0052 (también un inhibidor de NFkappaB).

Un ejemplo de un inhibidor de la ruta de NFkappaB es NPI-0052.

Un ejemplo de un inhibidor de la ruta de ubiquitinación es HBX-41108.

En realizaciones preferidas, el agente terapéutico adicional es un agente antiangiogénico.

Ejemplos de agentes antiangiogénicos son inhibidores de FGFR, PDGFR y VEGFR o los ligandos respectivos (por ejemplo, inhibidores de VEGF como pegaptanib o el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab), y talidomidas, estando tales agentes seleccionados de, sin limitación, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (también un inhibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (fármacos inmunomoduladores), derivado de talidomida CC-4047, lenalidomida, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanib, cediranib, XL-999 (también un inhibidor de cKit y Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (también un inhibidor de Flt3), sunitinib (también un inhibidor de cKit y Flt3), axitinib (también un inhibidor de cKit), vemurafenib (también conocido como PLX4032, RG7204 o RO5185426, comercializado como zelboraf), un inhibidor de la enzima B-Raf, crizotinib conocido como ALK (cinasa de linfoma anaplásico) e inhibidor de ROS1 (oncogén 1 de c-ros, tirosina cinasa de receptor), lestaurtinib (también un inhibidor de Flt3 y PKC), vatalanib, tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y cKit), pazopanib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, tosilato de sorafenib (también un inhibidor de Raf), RAF-265 (también un inhibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (también un inhibidor de EGFR y Her2), BAY-57-9352 (también un inhibidor de Raf), BAY-73-4506 (también un inhibidor de Raf), XL 880 (también un inhibidor de cMet), XL-647 (también un inhibidor de EGFR y EphB4), XL 820 (también un inhibidor de cKit) y nilotinib (también un inhibidor de cKit y brc-abl) y nitedanib.

El agente terapéutico adicional también puede seleccionarse de inhibidores de EGFR; puede ser un inhibidor de EGFR de molécula pequeña o un anticuerpo anti-EGFR. Ejemplos de anticuerpos anti-EGFR, sin limitación, son cetuximab, panitumumab, matuzumab; un ejemplo de un inhibidor de EGFR de molécula pequeña es gefitinib. Otro ejemplo de un modulador de EGFR es la toxina de fusión de EGF.

Entre los inhibidores de EGFR y Her2 útiles para la combinación con la molécula de la invención están lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuximab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (también un inhibidor de VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS-599626, ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (también un inhibidor de VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab.

Otros agentes que pueden combinarse ventajosamente en una terapia con la molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención son tositumumab y ibritumomab tiuxetan (dos anticuerpos anti-CD20 radiomarcados), alemtuzumab (un anticuerpo anti-CD52), denosumab (un inhibidor del ligando del factor de diferenciación de osteoclastos), galiximab (un antagonista de CD80), ofatumumab (un inhibidor de CD20), zanolimumab (un antagonista de CD4), SGN40 (un modulador del receptor del ligando CD40), rituximab (un inhibidor de CD20) o mapatumumab (un agonista del receptor de TRAIL-1) u OMP-21M18 (inhibidores de DII4).

Otros fármacos quimioterapéuticos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la presente invención se seleccionan de, pero no se limitan a, hormonas, análogos hormonales y antihormonales (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreotida, arzoxifeno, pasireotida, vapreotida), inhibidores de aromatasa (por ejemplo, anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas y antagonistas de LHRH (por ejemplo, acetato de goserelina, leuprolida, abarelix,

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cetrorelix, deslorelina, histrelina, triptorelina), antimetabolitos (por ejemplo, antifolatos como metotrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina similares a 5-fluorouracilo, capecitabina, decitabina, nelarabina y gemcitabina, análogos de purina y adenosina tales como mercaptopurina, tioguanina, cladribina y pentostatina, citarabina, fludarabina); antibióticos antitumorales (por ejemplo, antraciclinas como doxorubicina, daunorubicina, epirubicina e idarubicina, mitomicina-C, bleomicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados de platino (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, lobaplatino, satraplatino); agentes alquilantes (por ejemplo, estramustina, mecloretamina, melfalan, clorambucilo, busulfano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiurea, temozolomida, nitrosoureas tales como carmustina y lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca como vinblastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina y vincristina; y taxanos como paclitaxel, docetaxel y sus formulaciones, larotaxel; simotaxel, y epotilonas como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y etopofos, tenipósido, amsacrina, topotecan, irinotecan) y diversos quimioterapéuticos tales como amifostina, anagrelida, interferón alfa, procarbazina, mitotano y porfímero, bexaroteno, celecoxib.

Componentes de combinación particularmente preferidos de las moléculas de la presente invención son antagonistas de VEGF como bevacizumab (Avastin®), nitedanib, Sorafenib y Sunitinib.

Según otra realización de la invención, se proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad

a) poniendo en contacto una muestra con una molécula de unión a Ang2 de la invención como se ha definido anteriormente, y

b) detectando la unión de dicha molécula de unión a dicha muestra, y

c) comparando la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión con respecto a dicha muestra es diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado a efectos mediados por VEGF y/o por Ang2 sobre la angiogénesis.

Para estos y otros usos puede ser útil modificar adicionalmente una molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención, tal como por introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de unión específica, tal como el par de unión de biotina-(estrept)avidina. Un grupo funcional tal puede usarse para enlazar la molécula de unión de la invención a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que está unido a la otra mitad del par de unión, es decir, mediante la formación del par de unión. Por ejemplo, una molécula de unión monoespecífica de la invención puede conjugarse con biotina, y ligarse a otra proteína, polipéptido, compuesto o vehículo conjugado con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, tal molécula de unión monoespecífica conjugada de la invención puede usarse como indicadora, por ejemplo, en un sistema de diagnóstico en el que un agente que produce señal detectable está conjugado con avidina o estreptavidina.

La eficacia de la molécula de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención o polipéptidos, y de composiciones que comprenden la misma, puede probarse usando cualquier ensayo adecuado in vitro, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal en sí conocido, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específico de interés. Ensayos y modelos animales adecuados serán evidentes para el experto y, por ejemplo, incluyen los ensayos descritos en el presente documento y usados en los ejemplos más adelante, por ejemplo, un ensayo de proliferación.

Las moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención se han sometido a un amplio procedimiento de optimización de secuencias que implica maduración por afinidad, humanización y eliminación de posibles sitios de modificación postraduccional para garantizar bajo potencial de inmunogenicidad en el hombre y estabilidad biofísica mejorada. Inesperadamente, los datos muestran que las moléculas de unión monoespecífica de la invención tienen propiedades que son superiores a las de moléculas de unión de la técnica anterior. Entre tales propiedades están alta selectividad por la neutralización de Ang2 con respecto a la neutralización de Ang1, como puede deducirse, por ejemplo, de los datos de las Figuras 9 a 10, 13 a 14, 16 a 19; inhibición completa de la interacción Ang2-Tie2 con alta potencia, como puede deducirse, por ejemplo, de los datos de ELISA de las Figuras 6, 9, 13, 16, 18 y 20 y las Tablas 12 a 13, 16 a 17, 20 a 22, además de los valores de IC50 (nM) para VHH en el ensayo AlphaScreen como se muestra, por ejemplo, en la Tabla 7 (Ejemplo 7); y la afinidad K^d (nM) de VHH purificados sobre Ang2 humana recombinante, Ang2 de cino, Ang2 de ratón en las Tablas 8, 14, 18 y 23.

Esto indica que las moléculas de unión monoespecífica de unión a Ang2 de la invención son candidatos prometedores para tener eficacia terapéutica en enfermedades y trastornos asociados a efectos mediados por Ang2 sobre la angiogénesis, tales como cáncer, enfermedades cancerosas, enfermedades oculares y/o enfermedades renales crónicas.

Breve descripción de las figuras:

La anotación de los ejes en las Figuras 1 a 4, 6 a 7, 9 a 10, 12 a 14 y 16 a 20: los ejes X representan DO 450 (nm) y los ejes Y representan log Competidor (M).

Figura 1 (Figura 1-1A a 1-2C): VHH purificados que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (ELISA).

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Figura 2 (Figura 2-1A a 2-2C): VHH purificados que bloquean la interacción mAng2-mTie2 (ELISA).

Figura 3 (Figura 3A a 3B): VHH purificados que bloquean la interacción cAng2-cTie2 (ELISA).

Figura 4 (Figura 4A a 4I): VHH purificados que bloquean la interacción hAng1-hTie2 (ELISA).

Figura 5: Alineamiento de secuencias de variantes maduradas por afinidad de VHH 28D10. La secuencia de aminoácidos está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en negrita según la definición de AbM. Los residuos que han sido sustituidos están subrayados.

Figura 6 (Figura 6A a 6C): Variantes maduradas por afinidad purificadas de VHH 28D10 que bloquea la interacción hAng2-hTie2 (ELISA).

Figura 7 (Figura 7A a 7C): Variantes maduradas por afinidad purificadas de VHH 28D10 que bloquea la interacción hAng1-hTie2 (ELISA).

Figura 8 (Figura 8A a 8B): Alineamiento de secuencias de VHH 1D01 con consenso de hVH3-JH (A) y variantes de secuencia optimizada de VHH 1D01 (B). La secuencia de aminoácidos está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en negrita según la definición de AbM. Los residuos que van a mutarse a su homólogo humano están subrayados. Los posibles sitios de modificación postraduccional que van a atacarse están recuadrados.

Figura 9 (Figura 9-1A a 9-3B): Variantes de secuencia optimizada purificadas de VHH 1D01 que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (10-1), mAng2-mTie2 (10-2) y cAng2-cTie2 (11-3) (ELISA).

Figura 10: Variantes de secuencia optimizada purificadas de VHH 1D01 que bloquean la interacción hAng1-hTie2 (ELISA).

Figura 11 (Figura 11A a 11C): Alineamiento de secuencias de VHH 37F02 con consenso de hVH3-JH (A), de variantes de secuencia optimizada del ciclo 1 (B) y del ciclo 2 (C) de VHH 37F02. La secuencia de aminoácidos está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en negrita según la definición de AbM. Los residuos que van a mutarse a su homólogo humano están subrayados. Los posibles sitios de modificación postraduccional que van a atacarse están recuadrados.

Figura 12 (Figura 12-1 a 12-3): Variantes de secuencia optimizada del ciclo 1 purificadas de VHH 37F02 que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (14-1), mAng2-mTie2 (14-2) y cAng2-cTie2 (14-3) (ELISA).

Figura 13 (Figura 13-1A a 13-3): Variantes de secuencia optimizada del ciclo 2 purificadas de VHH 37F02 que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (15-1), mAng2-mTie2 (15-2) y cAng2-cTie2 (15-3) (ELISA).

Figura 14: Variantes de secuencia optimizada del ciclo 2 purificadas de VHH 37F02 que bloquean la interacción hAng1-hTie2 (ELISA).

Figura 15 (Figura 15A a 15D): Alineamiento de secuencias de VHH 28D10 con consenso de hVH3-JH (A), de variantes de secuencia optimizada del ciclo 1 (B), de variantes del ciclo 2 (C) y de variantes de secuencia optimizada del ciclo 3 (D) de VHH 28D10. La secuencia de aminoácidos está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en negrita según la definición de AbM. Los residuos que van a mutarse a su homólogo humano están subrayados. Los posibles sitios de modificación postraduccional que van a atacarse están recuadrados.

Figura 16 (Figura 16-1A a 16-3C): Variantes de secuencia optimizada del ciclo 1 purificadas de VHH 28D10 que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (18-1), mAng2-mTie2 (18-2) y cAng2-cTie2 (18-3) (ELISA).

Figura 17 (Figura 17A a 17B): Variantes de secuencia optimizada del ciclo 1 purificadas de VHH 28D10 que bloquean la interacción hAng1-hTie2 (ELISA).

Figura 18 (Figura 18-1A a 18-3): Variantes de secuencia optimizada C50X-S53X purificadas de VHH 28D10 que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (20-1), mAng2-mTie2 (20-2) y cAng2-cTie2 (20-3) (ELISA).

Figura 19: Variante de secuencia optimizada purificada C50X-S53X de VHH 28D10 que bloquea la interacción hAng1-hTie2 (ELISA).

Figura 20 (Figura 20-1A a 20-3C): Variantes de secuencia optimizada del ciclo 2 purificadas de VHH 28D10 que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (22-1), mAng2-mTie2 (22-2) y cAng2-cTie2 (22-3) (ELISA).

Ejemplos

Materiales y métodos

1

a) Generación de líneas de células estables HEK293H que expresan en exceso el receptor Tie2 humano o de ratón

Los ADNc que codifican Tie2 humano (NM_000459.3; SEC ID N°: 182), Tie2 de ratón (NM_013690.2; SEC ID N°: 183) y Tie2 de cino (SEC ID N°: 184) se clonan en el vector de expresión pcDNA3.1-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Para establecer células de riñón embrionario humano (HEK) que expresan en exceso Tie2 humano o Tie2 de ratón, células HEK293H parentales se someten a transfección mediada por lípidos con Fugene (Roche) con pcDNA3.1-neohTie2 o pcDNA3.1-neo-mTie2, respectivamente. Para todas las condiciones, los transfectantes se seleccionan 2 días después de la transfección añadiendo 1 mg/ml de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Para Tie2 humano, de ratón y de cino, los clones de alta expresión finales se seleccionan clasificando células individuales de clones que se unen a anti-Tie2 humano marcado con PE (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.), anti-Tie2 de ratón marcado con PE (eBioscience, San Diego, CA, USA) y un anti-Tie2 humano de cabra de 2 etapas (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.), seguido de anti-cabra de burro marcado con PE (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU.), respectivamente, usando el citómetro FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).

b) Generación de líneas de células HEK293T que expresan en exceso Ang2 de ratón o cinomolgo y la producción de medio acondicionado con Ang2 de ratón y cinomolgo recombinante

Los ADNc que codifican Ang2 de ratón marcada con FLAG del extremo N (NM_007426.3; SEC ID SEC ID N°: 185) y Ang2 de cinomolgo (AB172643.1; SEC ID N°: 186) se clonan en un vector de expresión pSecTag2B (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se generan células de riñón embrionarias humanas (HEK) que expresan en exceso transitoriamente Ang2 de ratón o Ang2 de cinomolgo por transfección mediada por lípidos (Fugene; Roche) de pSecTag2B-mAng2 o pSecTag2B-cAng2, respectivamente, en la línea de células parental HEK293T. Las producciones se realizan en 1,5 litros de CF10 Bag y se recogen 1,5 l de medio acondicionado (MA) 5 días después de la transfección.

c) Producción de la quimera de Tie2 de cinomolgo/Fc recombinante en células HEK293-F

El ADNc que codifica el dominio extracelular de Tie-2 se subclona en el plásmido de expresión pSecTag2b usando sitios de restricción apropiados para generar una proteína de fusión de Fc. La transfección en células HEK293-F (Invitrogen) se realiza como se describe por el fabricante usando preparaciones Megaprep (Qiagen) de plásmidos, medio Optimem (Invitrogen), 293-fectina (Invitrogen) a una densidad de células inicial de 1 x 106 células viables/ml con 1 pg de ADN de plásmido/106 células. Las células transfectadas se cultivaron en matraces agitadores durante 7 días a 37 °C. El medio acondicionado (MA) se recoge por centrifugación a 4000 g durante 10 min y se filtra a través de un filtro estéril (membrana de 0,45 pm).

Se purifican proteínas de fusión de Fc usando cromatografía de afinidad cargando MA a 5 ml/min sobre una columna de proteína A MabSelect SuRe de 5 ml equilibrada con DPBS. Después de una etapa de lavado con DPBS, la proteína de Fc unida se eluye con tampón citrato de sodio 10 mM a pH 3,0 y posteriormente se neutraliza a pH 7,0 añadiendo Tris/HCI 1 M a pH 8,0. La proteína purificada se concentra y el tampón se intercambia a DPBS con un concentrador centrífugo Millipore Amicon Ultra (corte de peso molecular de 10 kDa). La presencia de la proteína se confirma con métodos analíticos convencionales (electroforesis con el kit Experion Pro 260 - BioRad; espectrometría de masas). La proteína se analiza adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño y se determina el contenido de endotoxina (kit Endosafe PTS - Charles River).

d) Producción de Ang2 humana, de cinomolgo, de ratón y de rata-FLD recombinante en células HEK293-F

Se realiza clonación molecular y cultivo celular como se describe para la proteína de fusión Tie2-Fc. Para la purificación de proteínas marcadas con His, el MA se carga a 5 ml/min sobre una columna Fast Flow de quelante de Ni2+-Sepharosa de 2 ml (His-Trap - GE Healthcare Life Sciences) equilibrada con DPBS. Después de cargar en presencia de 4 % de tampón de elución (DPBS 0,5 % de imidazol) para prevenir la unión no específica, la columna se lava con DPBS. Las proteínas Ang2-FLD se eluyeron de la columna con DPBS que contenía 0,5 % de imidazol. Posteriormente se hizo una etapa de ultrafiltración para concentración e intercambio de tampón (corte de peso molecular de 10 kDa). Se retiene una alícuota de la proteína para la caracterización analítica como se describe para Tie2-Fc.

Ejemplo 1

La inmunización con Ang2 humana recombinante induce una respuesta inmunitaria humoral en llama

1.1. Inmunizaciones

Después de la autorización del Comité ético de la Facultad de veterinaria (Universidad de Gante, Bélgica), 4 llamas (designadas n° 406, 408, 454, 455) se inmunizan con 4 inyecciones intramusculares (día 0: 50 pg, día 14: 20 pg, día 28: 17,5 pg y día 42: 17,5 pg de dosis) de Ang2 humana recombinante (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.). El antígeno se formula en adyuvante completo de Freund para la inyección de sensibilización en el día 0 (Difco, Detroit, MI, EE.UU.) y en adyuvante incompleto de Freund para las inyecciones de recuerdo (Difco, Detroit, MI, EE.UU.).

1.2. Evaluación de respuestas inmunitarias inducidas en llama

2

Para evaluar la inducción de una respuesta inmunitaria en los animales contra Ang2 humana por ELISA, se recogen sueros en el día 0 (pre-inmune), día 35 y día 46 (tiempo de recogida de linfocitos de sangre periférica [PBL]). En resumen, 1 pg/ml de Ang2 humana recombinante (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.) se inmoviliza durante la noche a 4 °C en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos se bloquean con una disolución de caseína (PBS 1 % de caseína). Después de la adición de diluciones de suero en serie, se detectan inmunoglobulinas específicamente unidas usando un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de llama conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, EE.UU.) y se induce una posterior reacción enzimática en presencia del sustrato TMB (3,3',5,5'-tetramentilbencidina) (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), que muestra que se induce una respuesta inmunitaria dependiente de anticuerpos significativa contra Ang2 humana. La respuesta de anticuerpos se organiza tanto por anticuerpo convencional como de cadena pesada solo que expresa repertorios de linfocitos B, ya que las inmunoglobulinas unidas pueden detectarse con anticuerpos que reconocen específicamente los anticuerpos para lgG1 de llama convencionales o los anticuerpos para lgG2 o lgG3 de llama solo de cadena pesada. En todas las llamas inyectadas con Ang2 humana, una respuesta de anticuerpos se organiza por anticuerpo convencional y de solo cadena pesada que expresa linfocitos B específicamente contra Ang2 humana. Las respuestas del título en suero de Ang2 para cada llama se representan en la Tabla 1.

Tabla 1: Respuesta de suero específica mediada por anticuerpo contra Ang2 humana recombinante.

Ejemplo 2

Clonación de repertorios de fragmentos de anticuerpos de solo cadena pesada y preparación de fago

Tras la inyección de inmunogén final, los tejidos inmunes como fuente de linfocitos B que producen los anticuerpos de solo cadena pesada se recogen de las llamas inmunizadas. Normalmente, dos muestras de sangre de 150 ml recogidas 4 y 10 días después de la última inyección de antígeno y una biopsia de ganglio linfático, recogida 4 días después de la última inyección de antígeno, se recogen por animal. De las muestras de sangre, células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se preparan usando Ficoll-Hypaque según las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, e E.u U.). De las CMSP y la biopsia de ganglio linfático (no procedente del animal n° 406), se extrae ARN total, que se usa como material de partida para RT-PCR para amplificar el VHH que codifica segmentos de ADN, como se describe en el Ejemplo 3 (página 46) del documento WO 05/044858. Para cada llama inmunizada se construye una biblioteca reuniendo el ARN total aislado de todos los tejidos inmunitarios recogidos de ese animal. En resumen, el repertorio de VHH amplificado por PCR se clona mediante sitios de restricción específicos en un vector diseñado para facilitar la expresión en fago de la biblioteca de VHH. El vector se deriva de pUC119 y contiene el promotor LacZ, una secuencia codificante de la proteína glII del fago M13, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia conductora de glll-pelB híbrido. En marco con la secuencia codificante de VHH, el vector codifica una marca c-myc del extremo C y una marca de His6. Los fagos se preparan según protocolos convencionales y se guardan después de la esterilización por filtración a 4 °C para uso posterior.

Ejemplo 3

Selección de VHH específicos de Ang2 mediante expresión en fago

Repertorios de VHH obtenidos de todas las llamas y clonados como biblioteca de fagos se usan en diferentes estrategias de selección, aplicando una multiplicidad de condiciones de selección. Variables incluyen i) el formato de la proteína Ang2: Ang2 humana recombinante de longitud completa marcada con His del extremo C biotinilada (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.) y Ang2 de ratón de longitud completa marcada con His del extremo C (producida en GeneArt, ahora Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), ii) el método de presentación de Ang2: placas directamente recubiertas con ratón Ang2 o incubación en disolución con Ang2 humana biotinilada, seguido de captura sobre placas recubiertas con neutravidina, y iii) la concentración de antígeno. Todas las selecciones se hacen en placas MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania).

Se realizan selecciones de múltiples rondas del siguiente modo: preparaciones de Ang2 para formatos de selección en fase sólida y en disolución se presentan como se ha descrito anteriormente en múltiples concentraciones (Ang2 humana biotinilada: 50, 5, 0,5, 0,05 y 0,005 nM; Ang2 de ratón: 10, 1, 0,1 y 0,01 pg/ml). Después de 2 h de incubación con las bibliotecas de fagos, seguido de amplios lavados, los fagos unidos se eluyeron con tripsina (1 mg/ml) durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Entonces, la actividad de tripsina se neutraliza inmediatamente aplicando el inhibidor de proteasas ABSF 0,8 mM. Como control de referencia, selecciones sin antígeno se realizan en paralelo. Las salidas de fagos que muestran enriquecimiento con respecto a la referencia se usan para infectar E. coli. Se usan células de E. coli infectadas tanto para preparar fago para la siguiente ronda de selección (rescate de fagos) como se siembras sobre placas de agar LB (ampicilina glucosa2%) para el análisis de clones de VHH individuales. Con el fin de cribar una salida de selección para ligantes o bloqueantes específicos, colonias individuales se recogen de las placas de agar y se cultivan en placas de 96 pocillos profundos de 1 mL. Se induce la expresión de VHH controlada por LacZ añadiendo IPTG (0,1 - 1 mM final) en ausencia de glucosa. Los extractos periplásmicos (en un volumen de -80 ul) se preparan según protocolos convencionales (como se desvela en, por ejemplo, el documento WO 2006/040153 citado en el presente documento). Brevemente, los cultivos se centrifugaron durante 15 minutos a 4.500 rpm. El sedimento se congeló durante la noche o durante 1 hora a -20 °C. A continuación, el sedimento se descongeló a temperatura ambiente durante 40 minutos, se resuspendió en 15 ml de tampón peri (NaHPO450 mM, NaCI 300 mM) y se agitó durante 1 hora. La fracción periplásmica se aisló por centrifugación durante 20 minutos a 14000 rpm.

Ejemplo 4

Selección de extractos periplásmicos en ELISA de Ang2-Tie2 y Ang1-Tie2 y ensayos de competición AlphaScreen

Los extractos periplásmicos que contienen VHH expresados se criban en un ensayo de competición AlphaScreen de Ang2 humana-Tie2 humano para evaluar su capacidad de bloqueo. En resumen, la quimera de Tie2 humano/Fc (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.) se biotinila usando éster de N-hidroxisulfosuccinimida de biotina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Se captura Ang2 humana marcada con FLAG (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, EE.UU.) usando perlas aceptoras (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) recubiertas con anticuerpo M2 anti-FLAG (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). Para evaluar la capacidad de los VHH para inhibir la unión de Ang2 humana a su receptor Tie2 humano, diluciones 1:25 de los extractos periplásmicos que contienen VHH expresado se incuban con Ang2 humana marcada con FLAG 0,1 nM. A esta mezcla se añaden las perlas aceptoras y las quimeras de Tie2 humano/Fc biotiniladas 0,3 nM y adicionalmente se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, se añaden perlas donantes conjugadas con estreptavidina (Perkin Elmer, Waltham, Ma , EE.UU.) y la mezcla se incuba durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente. El tampón de ensayo es PBS 0,03 % de Tween-20 0,1 % de BSA. La fluorescencia se mide usando el lector de placas Envision Multilabel (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. La disminución en la señal de fluorescencia indica que la unión de Ang2 humana a Tie2 humano se bloquea por el VHH expresado en el extracto periplásmico. Los VHH capaces de bloquear la interacción de Ang2 humana-Tie2 humano para al menos el 50 % se criban en un ensayo de competición basado en ELISA confirmatorio. Adicionalmente, la reactividad cruzada para la unión a Ang2 de ratón y la selectividad con respecto a Ang1 humana también se evalúa en un ELISA de competición. En resumen, la quimera de Tie2 humano o de ratón/Fc (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.) se inmoviliza a 2 pg/ml durante la noche a 4 °C en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos se bloquean con una disolución al 1 % de caseína. Se incuba una dilución 1:5 de extracto periplásmico que contiene VHH expresado con las siguientes especies de Ang según el tipo de ensayo: Ang2 humana marcada con FLAG 0,02 nM, una dilución 1:3.000 de medio acondicionado con HEK293 que contiene Ang2 de ratón marcado con FLAG o Ang1 humana marcada con FLAG 0,02 nM (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, EE.UU.). Esta mezcla se añade a la placa recubierta con Tie2/Fc y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.

La unión residual de Ang se detecta usando anticuerpo M2 anti-FLAG conjugado con HRP (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.).

En un segundo ciclo de selección, extractos periplásmicos que contienen VHH expresados de salidas de selección que dieron una alta diversidad de VHH de bloqueo reactivos de forma cruzada de Ang2 de ratón se criban a una dilución 1:300. Se seleccionan los VHH que inhiben la unión de Ang2 humana a Tie2 humano, Ang2 de ratón a Tie2 de ratón y que no muestran inhibición de la unión de Ang1 humana a Tie2 humano. Los análisis de secuencias revelaron 86 VHH únicos que pertenecen a 38 linajes de linfocitos B diferentes. El número total de variantes de secuencia única encontradas en cada linaje de linfocitos B, un VHH representativo y la condición de selección usada, se representa en la Tabla 2. Una visión general de datos de selección basados en AlphaScreen y ELISA se facilita en la Tabla 3. Las secuencias de aminoácidos de todos los VHH únicos se muestran en el Listado de secuencias (SEC ID N°: 1 a 86) y en la Tabla 4.

Tabla 2: Parámetros de selección usados para la identificación de linajes de linfocitos B de VHH específicos de Ang2.

2

Tabla 3: Selección de extractos periplásmicos que contienen VHH anti-Ang2 expresado(a)

2

2

2

2

2

1

2 Ejemplo 5

Caracterización de VHH anti-Ang2 purificados

Un subconjunto de VHH anti-Ang2 inhibidores seleccionados del cribado descrito en el Ejemplo 4 se purifican adicionalmente y se caracterizan. Los VHH seleccionados se expresan en TG1 de E. coli como c-myc, proteínas marcadas con His6. La expresión se induce mediante la adición de IPTG 1 mM y se deja que continúe durante 4 horas a 37 °C. Después de centrifugar los cultivos celulares, los extractos periplásmicos se preparan por congelacióndescongelación de los sedimentos. Estos extractos se usan como material de partida y los VHH se purifican mediante IMAC y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) produciendo > 95% de pureza como se evalúa mediante SDS-PAGE.

5.1. Evaluación de VHH que bloquean hAng2 en ELISA

La capacidad de bloqueo de los VHH se evalúa en un ELISA que bloquea Ang2 humana-Tie2 humano.

En resumen, 2 pg/ml de la quimera Tie2/Fc (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.) se recubre en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Una concentración fija de Ang2 humana marcada con FLAG 0,02 nM (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, EE.UU.) se añade a una serie de dilución del VHH purificado (diluido en PBS 0,1 % de caseína 0,05 % de Tween-20), y se incuba sobre el receptor Tie2 humano recubierto durante 2 horas. La unión residual de Ang2 humana se detecta usando M2 anti-FLAG conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) (Figura 1). La molécula de referencia es el fragmento Fab de Ab536 (documento US2009/0191212) (Figura 1-1) o el resto de péptido del pepticuerpo AMG386 (SEC ID N°: 25 en el documento WO2004/092215) (Figura 1-2). Como control negativo se usa un VHH irrelevante. Los valores de IC50 para VHH que bloquean la interacción de Ang2 humana-Tie2 humano se representan en la Tabla 5-1 y la Tabla 5-2, respectivamente.

Tabla 5-1: Valores de IC50 (nM) de VHH purificados que bloquean la interacción hAng2/hTie2 (ELISA de competición; VHH: n=2-3; Fab Ab536: n=6)

Tabla 5-2: Valores de IC50 (nM) de VHH purificados que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (ELISA de competición; VHH: n=1-3; péptido AMG386: n=3)

5.2. Evaluación de la reactividad cruzada hacia Ang2 de ratón y de cinomolgo en ELISA de bloqueo

Con el fin de determinar si el VHH inhibe la unión de Ang2 de ratón a Tie2 de ratón y Ang2 de cino a Tie2 de cino, se realiza un ELISA de competición. En resumen, 2 pg/ml de Tie2 de ratón-Fc o Tie2 de cino-Fc recombinante se recubre durante la noche a 4 °C en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos recubiertos se bloquean con una disolución al 1 % de caseína. La Ang2 de ratón marcada con FLAG (dilución 1:3.000 de medio acondicionado de transfección de HEK transitoria) o Ang2 de cino marcada con FLAG (dilución 1:800 de medio acondicionado de transfección de HEK transitoria) y una serie de dilución de VHH purificado (diluido en PBS 0,1 % de caseína 0,05 % de Tween-20) se incuban sobre el receptor Tie2-Fc recubierto durante 2 horas a temperatura ambiente para alcanzar el equilibrio de unión. La unión residual de FLAG-mAng2 o FLAG-cAng2 se detecta usando mAb M2 anti-FLAG conjugado con HRP (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). La molécula de referencia es el fragmento Fab de Ab536 (ratón: Figura 2-1) o el resto de péptido del pepticuerpo AMG386 (ratón: Figura 2-2; cino: Figura 3). Como control negativo se usa un VHH irrelevante. Los valores de IC50 para VHH que bloquean la interacción de Ang2 de ratón-Tie2 de ratón se representan en la Tabla 6-1. Los valores de IC50 para VHH que bloquean la unión de Ang2 de ratón y de cino a Tie2 de ratón y de cino, respectivamente, se muestra en la Tabla 6-2.

Tabla 6-1: Valores de IC50 (nM) de VHH purificados que bloquean la interacción de mAng2 a mTie2 (ELISA de competición; VHH: n=2-3; Fab Ab536: n=5)

4

Tabla 6-2: Valores de IC50 (nM) de VHH purificados que bloquean la interacción de mAng2 y cAng2 a mTie2 y cTie2, respectivamente (ELISA de competición; VHH: n=1-3; péptido AMG386: n=3; n.d., no determinado)

5.3. Evaluación de la selectividad de VHH que bloquean Ang2 humana hacia Ang1 humana en ELISA

Con el fin de determinar si los VHH que bloquean anti-Ang2 son selectivos o no con respecto a la unión de Ang1 humana a Tie2 humano, se realiza un ELISA de competición. En resumen, 2 pg/ml de Tie2 humano-Fc recombinante (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.) se recubren durante la noche a 4 °C en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos recubiertos se bloquean con una disolución al 1 % de caseína. Una concentración fija (0,02 nM) de Ang1 humana recombinante marcada con FLAG (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, EE.UU.) y una serie de dilución de VHH (diluida en PBS 0,1 % de caseína 0,05 % de Tween-20) se incuban sobre el receptor recubierto Tie2-Fc durante 2 horas a temperatura ambiente para alcanzar el equilibrio de unión. La unión residual de FLAG-hAng1 se detecta usando mAb M2 anti-FLAG conjugado con HRP. La molécula de referencia es el resto de péptido del pepticuerpo AMG386 (Figura 4). Como control negativo se usa un VHH irrelevante. Los valores de IC50 indicativos para VHH que bloquean la interacción de Ang1 humana - Tie2 humano se representan en la Tabla 7.

Tabla 7: Valores IC50 (nM) de VHH purificados que bloquean la interacción de Ang1 humana a Tie2 humano (ELISA de competición; VHH: n=2-3; péptido AMG386: n=3)

5.4. Determinación de la afinidad de la interacción Ang2 humana, de ratón, de cino - VHH

Las afinidades del VHH por unirse a Ang2 humana, de ratón y de cino se determinan usando análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) (Biacore T100). En resumen, VHH y compuestos de comparación se inmovilizan sobre un chip CM5 mediante acoplamiento de amina. Se usa un enfoque cinético multicíclico: se inyectan diferentes concentraciones de Ang2 humana, de ratón y cino-FLD (0,4-1-2,6-6,4-16-40-100 nM). Se permite que las especies de Ang2-FLD se asocien durante 2 min y se disocien durante 20 min a una velocidad de flujo de 45 pl/min. Entre inyecciones, las superficies se regeneran con un pulso de 10 s de NaOH 25 mM y periodo de estabilización de 60 s. Los datos de asociación/disociación se evalúan ajustando un modelo de interacción 1:1 (unión de Langmuir). La constante de afinidad Kd se calcula de las constantes de velocidad de asociación y disociación resultantes ka y kd y se representan en la Tabla 8.

Tabla 8: Afinidad Kd (nM) de VHH purificados para Ang2 humana, de ratón y de cino

Ejemplo 6

Maduración por afinidad de VHH seleccionado

Una variante de VHH 28D10 (00027 que lleva la sustitución C50S/S53N y Q108L - Ejemplo 7.3) se somete a maduración por afinidad.

En un primer ciclo, las sustituciones de aminoácidos se introducen aleatoriamente en tanto la región estructural (FW) como las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) usando el método de PCR propensa al error. La mutagénesis se realiza en un enfoque basado en PCR de dos rondas usando el kit de mutagénesis al azar Genemorph II (Stratagene, La Jolla, CA, EE.u U.) usando 1 ng de molde de ADNc de VHH 00027, seguido de una segunda p Cr propensa al error usando 0,1 ng del producto de la ronda 1. Después de una etapa de pulido, los productos de PCR se insertan mediante sitios de restricción únicos en un vector diseñado para facilitar la expresión en fago de la biblioteca de VHH. Se realizan rondas consecutivas de selecciones en disolución usando concentraciones decreciente de Ang2 humana recombinante biotinilada (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE.UU.) y eluciones con tripsina. Se preparan extractos periplásmicos (en un volumen de ~ 80 uL) según métodos convencionales y se criban para unirse a Ang2 humana-FLD recombinante en un ensayo de constante de disociación ProteOn (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.). En resumen, un chip GLC ProteOn Sensor se recubre con Ang2 humana-FLD recombinante sobre los “canales de ligandos” L3, L4, L5 y L6 (con L1/L2 como canal de referencia). El extracto periplásmico de los clones madurados por afinidad se diluye 1:10 y se inyecta a través de los “canales de analito” A1-A6. Se calcula una constante de disociación promedio del VHH 00027 de referencia que se prepara y se prueba de la misma forma que los VHH madurados por afinidad y sirve de referencia para calcular las mejoras de las constantes de disociación. Las 25 variantes maduradas por afinidad principales se muestran en la Tabla 9. Los VHH se secuencian (Tabla 10-A) para identificar mutaciones de aminoácidos beneficiosas para mejorar la constante de disociación (Tabla 10-B).

Tabla 9: Constante de disociación y veces de mejora de las variantes maduradas por afinidad de VHH 00027.

Inicialmente se construyen 12 variantes de VHH que contienen combinaciones de mutaciones en la posición de Kabat 27, 29, 100b y 100i (Tabla 11; Figura 5). Las diferentes combinaciones de estas 4 mutaciones se injertan sobre el esqueleto de VHH 00042 de secuencia optimizada (Figura 17-B) que contiene un sustitución D54G adicional (Ejemplo 6.3). La secuencia de aminoácidos está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en gris según la definición de AbM (software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular). Las construcciones se clonan en el vector de expresión pAX100 en marco con una marca de c-myc del extremo C y una marca de (His)6. Las variantes de VHH se producen en E. coli y se purifican por IMAC y SEC. Las secuencias se representan en la Tabla 11. Todos estos VHH se analizan en hAng2/hTie2 (Ejemplo 5.1; resultados mostrados en la Figura 6 y Tabla 12), y ELISA de competición de hAng1/hTie2 (Ejemplo 5.3; resultados mostrados en la Figura 7 y la Tabla 12). Adicionalmente, la temperatura de fusión (Tm) de cada variante a pH7 se determina en un ensayo de desplazamiento térmico, que se basa en el cambio dependiente en la temperatura en la señal de fluorescencia tras la incorporación de Sypro Orange (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) (Ericsson y col., Anal. Biochem. 357 (2006), pág. 289-298) (Tabla 12).

Tabla 10-B: Mutaciones individuales o combinación de las mismas que dan mejoras en la constante de disociación

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Tabla 12: Visión general de T^m, IC⁵⁰ (pM) en ELISA de competición de Ang2 humana, de ratón y de cino y relaciones de IC⁵⁰ de hAng1/hAng2 de variantes maduradas por afinidad de VHH 00027

A partir de la potencia, Tm y la perspectiva de secuencias, VH 00908 se lleva a un segundo ciclo de maduración por afinidad y optimización de secuencias combinados (Ejemplo 7.3).

Ejemplo 7

Optimización de secuencias de VHH 1D01, 28D10 y 37F02 seleccionados

7.1. VHH 1D01

La secuencia de aminoácidos de VHH 1D01 anti-Ang2 (véase la Figura 8-A) está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en gris según la definición de AbM (software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular). Los residuos que van a mutarse a su homólogo humano están subrayados. Los posibles sitios de modificación postraduccional que van a atacarse están recuadrados. El alineamiento muestra que 1D01 contiene 6 mutaciones de la región estructural con respecto a la secuencia de la línea germinal de referencia. Los residuos no humanos en las posiciones 14, 41, 71, 74, 83 y 108 están seleccionados para sustitución con su homólogo de la línea germinal humana. Se construye y se produce un conjunto de siete variantes 1D01 que llevan diferentes combinaciones de residuos humanos sobre estas posiciones (Figura 8-B) (Ejemplo 5). En paralelo, en 3 de estas 7 variantes, un posible sitio de isomerización de Asp en la posición D54G55 se elimina introduciendo una sustitución D54G, y en 1 de estas 7 variantes un posible sitio de formación de pyroGlu en la posición E1 se elimina por una sustitución E1D (las secuencias de AA se enumeran en la Tabla 15).

Estas variantes se caracterizan como proteína purificada en el ELISA de competición de Ang2 humana (Figura 9-1), de ratón (Figura 9-2) y de cino (Figura 9-3) /Tie2 (Ejemplo 5.1; Ejemplo 5.2), el ELISA de competición de hAng1/hTie2 (Ejemplo 5.3; Figura 10). Adicionalmente, la temperatura de fusión (Tm) de cada variante se determina en el ensayo de desplazamiento térmico (Ejemplo 6). Una visión general de los datos puede encontrarse en la Tabla 13. Adicionalmente, el % de identidad de FR con la línea germinal humana se calcula según la definición de AbM (software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular). La afinidad de VHH 00921 por Ang2 humana, de cino, de ratón y de rata se muestra en la Tabla 14 (Ejemplo 5.4).

Tabla 13: Visión general de T^m, IC⁵⁰ (nM) en ELISA de competición de Ang2 humana, de ratón y de cino y relaciones de IC⁵⁰ de hAng1/hAng2 de variantes de secuencia optimizada de VHH 1D01

Tabla 14: Afinidad Kd de VHH 00921 purificado para Ang2 humana, de cino, de ratón y de rata recombinante

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7.2 VHH 37F02

La secuencia de aminoácidos de VHH 37F02 anti-Ang2 (véase la Figura 12-A) está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en gris según la definición de AbM (software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular). Los residuos que van a mutarse a su homólogo humano están subrayados. Los posibles sitios de modificación postraduccional que van a atacarse están recuadrados. El alineamiento muestra que 37F02 contiene 4 mutaciones de la región estructural con respecto a la secuencia de la línea germinal de referencia. Los residuos no humanos en las posiciones 60, 74, 83 y 108 están seleccionados para sustitución con su homólogo de la línea germinal humana. En paralelo, un posible sitio de isomerización de Asp en la posición D54G55 se elimina introduciendo una sustitución D54G. Se construye y se produce un conjunto de tres variantes de 37F02 del ciclo 1 que llevan diferentes combinaciones de residuos humanos en estas posiciones (Figura 12-B) (Ejemplo 5; las secuencias de AA se enumeran en la Tabla 21-1).

Estas variantes se caracterizan como proteína purificada en el ELISA de competición de Ang2 humana (Figura 12-1), de ratón (Figura 12-2) y de cino (Figura 12-3)/ Tie2 (Ejemplo 5.1; Ejemplo 5.2). Adicionalmente, la temperatura de fusión (Tm) de cada variante se determina en el ensayo de desplazamiento térmico (Ejemplo 6). Una visión general de los datos puede encontrarse en la Tabla 16. Adicionalmente, el % de identidad de FR con la línea germinal humana se calcula según la definición de AbM (software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular).

Tabla 16: Visión general de Tm, IC50 (pM) en ELISA de competición de Ang2 humana, de ratón y de cino y relaciones de IC50 de hAng1/hAng2 de variantes de secuencia optimizada del ciclo 1 de VHH 37F02

Se usa un enfoque de biblioteca de NNK para inactivar dos posibles sitios de modificaciones postraduccionales en CDR3: i) Met sensible a la oxidación sobre la posición 100e y ii) sitio de isomerización de Asp sobre la posición D95S96. Como D54G es tolerado (VHH 00046 y 00920; Tabla 16 y Tabla 17) no se usó enfoque de NNK para inactivar este posible sitio de isomerización de Asp.

Al final, 3 bibliotecas de NNK que contienen clones de VHH que llevan sustituciones en las posiciones D95, S96 y M100e con respecto a todos los otros aminoácidos se criban en un ensayo AlphaScreen de competición de hAng2/hTie2 (Ejemplo 2). Brevemente, extractos periplásmicos que contienen VHH expresado se criban en 3 diluciones diferentes (que se corresponden aproximadamente con CE20, CE50 y CE80 del VHH 37F02 parental) y cambios en el % de inhibición en los diferentes puntos de dilución se comparan con 37F02 parental. Basándose en los resultados de cribado y los datos mostrados en la Tabla 17, se construyen 8 variantes de VHH del ciclo 2 adicionales (basadas en el esqueleto de VHH 00920) que llevan combinaciones de inactivación diferentes de D95S96 y M100e (Figura 11-C; las secuencias de AA se enumeran en la Tabla 19-2).

Todas estas variantes se caracterizan como proteína purificada en el ELISA de competición de Ag2 humana (Figura 13-1), de ratón (Figura 12-2) y de cino (Figura 12-3)/ Tie2 (Ejemplo 5.1; Ejemplo 5.2), el ELISA de competición de hAng1/hTie2 (Ejemplo 5.3; Figura 14). Adicionalmente, la temperatura de fusión (Tm) de cada variante se determina en el ensayo de desplazamiento térmico (Ejemplo 6). Una visión general de los datos puede encontrarse en la Tabla 17. Adicionalmente, se calcula el % de identidad de FR con la línea germinal humana.

La afinidad de VHH 00928 por Ang2 humana, de ratón, de cino y de rata se muestra en la Tabla 18.

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Tabla 17: Visión general de T^m, IC⁵⁰ (pM) en ELISA de competición de Ang2 humana, de ratón y de cino y relaciones de IC⁵⁰ de hAng1/hAng2 de variantes de secuencia optimizada del ciclo 2 de VHH 37F02

Tabla 18: Afinidad Kd de VHH 00928 purificado para Ang2 humana, de cino, de ratón y de rata recombinante

4

4 7.3. VHH 28D10

La secuencia de aminoácidos de VHH 28D10 anti-Ang2 (véase la Figura 15-A) está alineada con la secuencia consenso de la línea germinal humana VH3/JH. Los residuos están numerados según Kabat, las CDR se muestran en gris según la definición de AbM (software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular). Los residuos que van a mutarse a su homólogo humano están subrayados. Los posibles sitios de modificación postraduccional que van a atacarse están recuadrados. El alineamiento muestra que 28D10 contiene 5 mutaciones de la región estructural con respecto a la secuencia de la línea germinal de referencia. Los residuos no humanos en las posiciones 14, 71, 74, 83 y 108 están seleccionados para sustitución con su homólogo de la línea germinal humana. En paralelo, un posible sitio de isomerización de Asp en la posición D54G55 se elimina introduciendo una sustitución D54G. La cisteína libre en la posición 50 se eliminó por sustitución con Ala, Thr o Ser. Al final se construye y se produce un conjunto de once variantes 28D10 del ciclo 1 que llevan diferentes combinaciones de residuos humanos sobre estas posiciones (véase la Figura 15-B; las secuencias de AA se enumeran en la Tabla 24-1).

Estas variantes se caracterizan como proteína purificada en el ELISA de competición de Ang2 humana (Figura 16-1), de ratón (Figura 16-2) y de cino (Figura 16-3)/ Tie2 (Ejemplo 5.1; Ejemplo 5.2), el ELISA de competición de hAng1/hTie2 (Ejemplo 5.3; Figura 17). Adicionalmente, la temperatura de fusión (Tm) de cada variante se determina en el ensayo de desplazamiento térmico (Ejemplo 6). Una visión general de los datos puede encontrarse en la Tabla 20. Adicionalmente se calcula el % de identidad de FR con la línea germinal humana.

Tabla 20: Visión general de Tm, IC50 (nM) en ELISA de competición de Ang2 humana, de ratón y de cino y relaciones de IC50 de hAng1/hAng2 de variantes de secuencia optimizada del ciclo 1 de VHH 28D10

Se crea un conjunto adicional de variantes (ciclo 2) para explorar la sustitución de maduración por afinidad sobre la posición A24V y para explorar adicionalmente las variantes C50X-S53X (Tabla 21; Figura 15-C; las secuencias de AA se enumeran en la Tabla 23-4-2). Estas variantes se caracterizan como proteína purificada en el ELISA de competición de Ang2 humana (Figura 18-1), de ratón (Figura 18-2) y de cino (Figura 18-3)/ Tie2 (Ejemplo 5.1; Ejemplo 5.2), el ELISA de competición de hAng1/hTie2 (Ejemplo 5.3; Figura 19). Adicionalmente, la temperatura de fusión (Tm) de cada variante se determina en el ensayo de desplazamiento térmico (Ejemplo 6).

4

Tabla 21: Visión general de T^m, IC⁵⁰ (nM) en ELISA de competición de Ang2 humana, de ratón y de cino y relaciones de IC⁵⁰ de hAng1/hAng2 de variantes de secuencia optimizada del ciclo 2 de VHH 28D10

En paralelo, se usa un enfoque de biblioteca de NNK para inactivar dos posibles sitios de modificaciones postraduccionales en CDR2: dos sitios de isomerización de Asp secuenciales sobre la posición D52aS53 y D54G55. Como D54G es tolerado (Ejemplo 6; Tabla 20) no se usó enfoque de NNK para inactivar este posible sitio de isomerización de Asp. Al final, 2 bibliotecas de NNK que contenían clones de VHH que llevan sustituciones en las posiciones D52a y S53 para todos los otros aminoácidos se criban en un ensayo AlphaScreen de competición de hAng2/hTie2 (Ejemplo 2). Brevemente, extractos periplásmicos que contienen v Hh expresado se criban a 3 diluciones diferentes (que se corresponden aproximadamente con CE20, CE50 y CE80 de 00902 de referencia) y cambios en el % de inhibición en los diferentes puntos de dilución se comparan con 00902 de referencia. Basándose en los resultados de cribado y los datos mostrados en la Tabla 21, se construyen 7 variantes de VHH del ciclo 3 adicionales (basadas en el esqueleto de 00908) (véase la Figura 15-D). El objetivo final es construir variantes de VHH que retengan o muestren elevada potencia, elevada termoestabilidad y tienen sitios de PTM relevantes inactivados en comparación con VHH 28D10 (las secuencias de AA se enumeran en la Tabla 24-3). Estas variantes se caracterizan como proteína purificada en el ELISA de competición de Ang2 humana (Figura 20-1), de ratón (Figura 20-2) y de cino (Figura 20-3)/ Tie2 (Ejemplo 5.1; Ejemplo 5.2), el ELISA de competición de hAng1/hTie2 (Ejemplo 5.3). Adicionalmente, la temperatura de fusión (Tm) de cada variante se determina en el ensayo de desplazamiento térmico (Ejemplo 6). Una visión general de los datos puede encontrarse en la Tabla 22. Adicionalmente se calcula el % de identidad de FR con la línea germinal humana. Los cambios de secuencia más óptimos se aplicaron finalmente a un VHH 00956 de variante no madurada por afinidad (Figura 15-D). La afinidad de VHH 00919, 00938 y 00956 para Ang2 humana, de ratón, de cino y de rata se muestra en la Tabla 23.

Tabla 22: Visión general de Tm, IC50 (nM) en ELISA de competición de Ang2 humana, de ratón y de cino y relaciones de IC50 de hAng1/hAng2 de variantes de secuencia optimizada del ciclo 3 de VHH 28D10

n.d. no determinado

4

Tabla 23: Afinidad K^d de los VHH purificados 00919, 00936 y 00959 para Ang2 humana, de cino, de ratón y de rata recombinante

1

2

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión a Ang2 que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en donde dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina comprende tres regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3, en donde

CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 168,

CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 171 y

CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 175.

2. La molécula de unión a Ang2 según la reivindicación 1, en donde dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH.

3. La molécula de unión a Ang2 según la reivindicación 2, en donde dicho VHH consiste en un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tiene una secuencia consiste en SEC ID N°: 166.

4. La molécula de unión a Ang2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho VHH o dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina tiene una modificación o intercambio sobre su extremo N, en donde dicha modificación es una deleción del primer aminoácido y dicho intercambio es una sustitución del primer aminoácido por otro aminoácido.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de unión a Ang2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión que comprende dicha molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. Una célula huésped que lleva uno o más vectores de expresión según la reivindicación 6.

8. Un método de producción de la molécula de unión a Ang2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:

transfectar una célula huésped con uno o más de dichos vectores de expresión según la reivindicación 6, cultivar dicha célula huésped, y

recuperar y purificar dicha molécula de unión a Ang2.

9. Una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, una o más de tales moléculas de unión a Ang2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y al menos un vehículo fisiológicamente aceptable.

10. La composición farmacéutica según la reivindicación 9, que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales.

11. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 para uso en el tratamiento de una enfermedad que está asociada con efectos mediados por Ang2 sobre la angiogénesis.

12. La composición farmacéutica según la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de cáncer y enfermedades cancerosas.

13. La composición farmacéutica según la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de enfermedades oculares.

14. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 13, en donde dicha enfermedad ocular es degeneración macular senil o retinopatía diabética.

15. La composición farmacéutica según la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de enfermedades renales cronicas.