KR20140146606A - Ang2 결합분자 - Google Patents

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Abstract

Ang2 결합분자, 바람직하게 VHH 및 항체 같은 Ang2 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인, 이를 함유하는 약학 조성물 및 신생혈관생성에서 Ang2 매개 효과와 연관된 질환의 치료에서 그의 용도. Ang2 결합분자를 코딩하는 핵산, 이를 제조하기 위한 숙주세포 및 방법.

Description

ANG2 결합분자{ANG2 BINDING MOLECULES}
본 발명은 사람의 치료요법 분야에 관한 것으로, 구체적으로 암 치료요법 및 이러한 치료요법에 유용한 제제와 조성물에 관한 것이다.
US 2008/0014196, WO 2008101985 및 US2011/0027286에 기술된 바와 같이, 신생혈관생성(angiogenesis)은 생물학적 과정으로, 새로운 혈관이 형성되고 안과 질환뿐만 아니라 고형 종양과 전이를 포함한 수많은 장애의 발병에 연루되어 있다. 종양의 임계크기가 약 1 mm3에 이르면 종양은 산소와 영양분으로 혈액공급을 유지하는 신생혈관생성에 의존하게 되어 추가 성장할 수 있다. 항(anti)-신생혈관생성 요법은 종양의 다양한 종류에 있어서 중요한 치료방법이 되고 있다.
가장 중요한 혈관형성유발 인자들 중 하나가 Tie2 리셉터(Tie2)의 리간드인 Angiopoietin2(Ang2)이며, 이것은 VEGF 같은 다른 혈관형성 인자들의 작용을 가능하게 하여 혈관 리모델링을 조절한다. Ang2는 또한 당분야에서 Tie2 리간드로도 지칭된다(미국 특허 제5,643,755호, Yancopoulos et al. 2000, Nature 407: 242-248).
Ang2는 내피세포에 의해 주로 발현되고, 저산소증과 다른 혈관형성인자들에 의해 강력하게 유도되며 종양 혈관 형성성을 조절하여 혈관이 VEGF 및 FGF2에 반응할 수 있도록 하는 것으로 입증되었다 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77). 이러한 역할에 부합하여, Ang2의 결실 또는 저해가 신생혈관생성을 감소시켰다(Falcon et al., Am J Pathol. 2009 Nov; 175(5):2159-70). 대장암, NSCLC 및 흑색종 환자에게서 높은 Ang2 혈청 농도가 보고되었다(Goede et al., Br J Cancer. 2010 Oct 26; 103(9): 1407-14),(Park et al., Chest. 2007 Jul;132(1): 200-6), (Helfrich et al., Clin Cancer Res. 2009 Feb 15; 15(4):1384-92). CRC 암에서 Ang2 혈청 농도는 항-VEGF 요법에 대한 치료반응과 연관되어 있다.
Ang-Tie 시스템은 2개의 리셉터(Tie1 및 Tie2)와 3개 리간드(Ang1, Ang2 및 Ang4)로 구성되어 있다(Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77.). Tie2, Ang1 및 Ang2는 이러한 종류들 중 가장 잘 연구된 것들이며, Tie1은 희귀 리셉터(orphan receptor)이고, 혈관 리모델링에서 Ang4의 역할은 여전히 규명되어야 한다. Ang2 및 Ang1은 Tie2 결합과 활성화에 대한 대항 작용을 매개한다. Ang2 매개 Tie2 활성화는 내피세포 활성화, 주위세포 분해, 혈관 누출 및 혈관 발아(vessel sprouting)의 유도를 유발한다. Ang2에 비하여 Ang1 시그널링은 주위세포의 보충에 의해 혈관 통합을 유지하여 내피세포 정적(quiescence)을 유지한다.
안지오포이에틴(Angiopoietin) 2(Ang2)는 Tie2 리셉터 티로신 키나제에 대해 분비된 66 kDa의 리간드이다(Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77). Ang2는 N-터미널의 꼬여진 코일 도메인과 C-터미널 피브리노겐 유사 도메인으로 구성되며, 후자는 Tie2 상호작용에 필요하다. Ang2는 내피세포에 의해 주로 발현되고, 저산소증과 VEGF를 포함한 다른 혈관신생인자들에 의해 강력하게 유도된다. Tie2는 내피세포, 조혈성줄기세포 및 종양세포에서 발견된다. Ang2-Tie2는 종양 혈관 형성성을 조절하여 혈관이 VEGF 및 FGF2에 반응할 수 있도록 하는 것으로 입증되었다.
시험관 내에서 Ang2는 완만한 미토겐, 화학유인물질 및 사람 제정맥 내피세포(HUVEC) 내 튜브 형성 인듀서로 작용하는 것으로 나타났다. Ang2는 섬유아세포에서 이소성으로 발현된 Tie2의 티로신 인산화를 유발하고, HUVEC 내에서 ERK-MAPK, AKT 및 FAK의 인산화 같은 하위 시그널링 이벤트를 촉진한다. Ang1 유도성 내피세포 반응에서 Ang2의 길항적 역할이 설명되어 있다.
Ang2 결핍은 마우스에서 중증의 림프 패턴화 결함을 유발하는 것으로 입증되었다. Ang2의 상실이 배아 혈관 발달에 불필요할 수 있지만 Ang2 결핍 마우스는 망막과 신장에서 지속적인 혈관 결함을 가진다. 신생혈관생성 부위(예를 들어, 난소)에서의 Ang2 발현의 다이나믹 패턴과 함께, 이러한 발견은 Ang2가 VEGF 같은 다른 혈관형성인자의 작용을 수행하여 혈관 리모델링을 조절하는 것을 시사한다.
Ang2-Tie2 시스템은 혈관형성 스위치와 종양 신생혈관생성의 후기 단계에서 결정적인 역할을 한다. Ang2 발현은 종양 연관 내피에서 강력하게 상향 조절된다. Ang2 결핍 마우스에, 특히 종양 성장의 초기 단계 동안 이식되었을 때 종양 성장의 감소가 관찰되었다. Ang2 mAbs에 의한 Ang2의 치료적 블로킹은 다양한 종양 이종이식 모델에서 광범위한 효능을 나타내었다.
상기한 US 2008/0014196에 요약된 바와 같이, 신생혈관생성은 고형 종양과 전이를 포함한 수많은 장애의 발명에 연관되어 있다.
종양 성장의 경우에 신생혈관생성은 과형성에서 신생물형성으로의 이행 및, 종양의 성장과 전이에 양분을 공급하는데 중요한 것으로 보인다. Folkman 등의 문헌[Nature 339-58 (1989)]에 따르면, 이렇게 하여 종양 세포가 정상 세포와 비교하여 성장 이점을 얻을 수 있다. 따라서, 항-신생혈관생성 요법은 다양한 종류의 종양에 있어서 중요한 치료방법이 되었다. 이러한 요법들은 VEGF 경로를 블로킹(blocking)하는데 집중하고 있다(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400).
Ang2 및 Ang1에 결합하는 항체와 다른 펩티드 저해제들이, 예를 들어 미국 특허 제6,166,185호, 제7,521,053호, 제7,205,275호 및 미국 특허출원 공개 제2006/0018909호 및 제2006/0246071호에 언급되어 있다. 또한, 미국 특허출원 공개 제2011/0027286호에서는 관련분자 Ang1에 길항하지 않는 특이적 모노클로날 Ang2 항체를 기술하였다.
그러나, 최신기술의 모노클로날 항체(MAbs)와 융합 단백질은 이들의 치료학적 적용 측면에서 몇가지 단점이 있다: 이들의 분해를 방지하기 위해 거의 동결온도에 보관해야만 한다. 또한, 이들은 소화관에서 빨리 분해되기 때문에 경구투여에 적합하지 않다. 암 치료요법에서 MAbs의 또다른 주요 제한점은 불량한 이송으로, 이로 인하여 농도가 낮고 종양에서 모든 세포를 표적으로 하지 못한다는 것이다.
본 발명의 목적은 신규한 향상된 Ang2-결합분자, 즉 Ang1과 Tie2의 결합이 아니라 Ang2와 Tie2의 결합을 차단(blocking)하는 나노바디(nanobody)를 제공하는 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 신규한 Ang2-결합분자, 및 특히 포유동물의 Ang1이 아니라 포유동물의 Ang2에 결합하는 Ang2-결합분자, 구체적으로 사람 Ang1이 아니라 사람 Ang2에 결합하는 Ang2-결합분자를 제공하는 것으로, 여기서 이러한 분자 또는 폴리펩티드는 여기에 기술된 치료 및 진단 목적에 적합하다. 본 발명의 다른 목적은 Ang1이 아니라 Ang2에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하는 것이다.
이러한 Ang2-결합분자, 또는 Ang2 길항제는 신생혈관생성에서 Ang2 매개 효과와 연관된 질환 또는 상태의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단을 위한 조성물의 약리학적 활성제로서 유용하다.
이러한 질환들의 예로는 암 또는 암성 질환, 예컨대 유방암, 신장세포 암종, 난소암 및 췌장암, 안과 질환, 예컨대 연령관련 황반변성 및 당뇨병성 망막증, 및/또는 만성 신장질환, 예컨대 당뇨병성 신장질환, 신후성 신부전증, 신전성 질소혈증(prerenal azotemia) 및 신성신부전이 있다.
본 발명의 다른 목적은 Ang2-결합분자와 이들을 포함하는 조성물의 사용 및/또는 투여를 포함하는, 상기한 질환, 장애 또는 상태의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단을 위한 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 당분야에서 현재 사용되거나/되고 공지된 제제, 조성물 및/또는 방법과 비교하여 이점을 제공하는 약리학적으로 활성인 Ang2-결합분자, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이점들은, 예를 들어 제조 목적에 있어서, 특히 일반적인 항체와 상기한 것들 또는 이들의 단편과 비교하여 향상된 치료적 및/또는 약리학적 특성 및/또는 다른 유리한 특성을 포함한다.
제1 측면에 따라, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Ang2-결합분자를 제공하며, 상기한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 3개의 상보성결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하고, 여기서 CDR1은 서열번호 168 내지 170에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호 171 내지 173에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, CDR3는 서열번호 174 내지 177에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 상기한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Ang2-결합분자에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 서열번호: 167, 166, 129 및 138을 포함하는 군에서 선택된 서열을 갖는 Ang2-결합분자에 관한 것이다.
다른 측면에 따라, Ang2-결합분자를 코딩하는 핵산과 이 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기한 핵산을 포함하는 하나 이상의 발현벡터를 담지하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다음 단계들을 포함하는, 본 발명에 따른 Ang2-결합분자를 제조 또는 생성하는 방법에 관한 것이다:
(a) 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터로 숙주세포를 형질감염하고,
(b) 숙주세포를 배양하고,
(c) Ang2-결합분자를 회수 및 정제하는 단계.
본 발명의 다른 측면은 활성성분으로 하나 이상의 Ang2-결합분자와 적어도 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 Ang2-결합분자, 핵산, 숙주세포, 생성물 및 조성물의 적용 및 사용과, 신생혈관생성, 바람직하게 암, 암성 질환 및 안과 질환에 대한 Ang2와 매개된 효과와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 대한 이러한 측면과 다른 측면, 구체예, 이점 및 적용은 이하의 상세한 설명에 의해 더욱 명확해질 수 있다.
정의
달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어들은 당업자들에게 명백한 당업계에서의 일반적인 의미를 가진다. 예를 들어, 다음과 같은 표준 핸드북뿐만 아니라 여기에서 인용된 일반적인 배경기술을 참조할 수 있다: Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), 및 Roitt et al ., "Immunology" (2nd　Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989). 또한, 달리 표시되지 않는 한, 상세하게 특별히 기술되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자들에게 자명하게 그 자체로 알려진 방법으로 수행될 수 있고 수행되었다. 또한, 예를 들어 표준 핸드북, 위에서 언급된 일반적 배경기술 및 거기에 인용된 추가 참고문헌을 참조할 수 있다.
"안지오포이에틴(angiopoietin)-2" 또는 "Ang2"란 용어는, 인간이 아닌 종에서 유래하는 것(예를 들어 "마우스 Ang2" 등)으로서 특정되지 않는 한, 인간 Ang2 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서 신생혈관생성을 유발할 수 있는 Ang2 단백질의 단편), 즉 기탁번호 NM_001147.2의 인간 Ang2(변이체 1), 기탁번호 NM_001118887.1의 인간 Ang2(변이체 2) 또는 기탁번호 NM_001118888.1의 인간 Ang2(변이체 3), 및/또는 이들의 상응하는 생물학적으로 활성인 단편을 지칭한다. 비인간 종 Ang2, 예컨대 마우스 Ang2 및 cyno Ang2의 아미노산 서열은 기탁번호 NM_007426.3 (서열번호: 188) 및 AB 172643.1(서열번호: 187)로 각각 단백질 서열 데이터베이스로부터 입수할 수 있다.
"안지오포이에틴(angiopoietin)-1" 또는 "Ang1"이란 용어는, 인간이 아닌 종에서 유래하는 것(예를 들어 "마우스 Ang2" 등)으로서 특정되지 않는 한, 인간 Ang1 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서 신생혈관생성를 유발할 수 있는 Ang1 단백질의 단편), 즉 기탁번호 NM 001146.3의 인간 Ang1, 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편을 지칭한다.
달리 표시되지 않는 한, "면역글로불린"과 "면역글로불린 서열"이란 용어는-여기에서 중쇄(heavy chain) 항체 또는 일반적인 4-사슬 항체를 지칭하는데 사용되던지 간에-, 일반적인 용어로 사용되어 전체 크기 항체, 그의 개별적 사슬, 이들의 모든 부분, (비제한적으로 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인 각각과 같은 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함하는)도메인 또는 단편을 포함한다. 또한, 여기에서 사용된 (예를 들어, "면역글로불린 서열", "항체 서열", "(단일) 가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열" 같은 용어에서)"서열"이란 용어는, 내용이 보다 제한된 설명을 필요로 하지 않는 한, 일반적으로 관련 아미노산 서열뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
여기에서 사용된 (폴리펩티드 또는 단백질의) "도메인"이란 용어는 나머지 단백질에 대하여 독립적으로 그의 삼차 구조를 유지하는 능력을 가지는 폴딩된 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 개별 작용특성을 담당하고, 많은 경우에 나머지 단백질 및/또는 도메인의 작용 손실 없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 전이될 수 있다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 도메인"은 항체 사슬(예컨대, 일반적인 4-사슬 항체의 사슬 또는 중쇄 항체의 사슬)의 구형 영역, 또는 본질적으로 이러한 구형 영역으로 구성되는 폴리펩티드를 지칭한다. 면역글로불린 도메인은 이것이 항체 분자의 면역글로불린 폴딩 특성을 유지하는 것을 특징으로 하며, 보존된 디설파이드 결합에 의해 임의로 안정화된 2개 베타 시트 내에 배열된 약 7개 역평행(antiparallel) 베타 가닥의 2층 샌드위치로 구성된다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 가변 도메인"은 당업계와 이하에서 "프레임워크(framework) 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 각각 지칭되는 4개 "프레임워크 영역"으로 본질적으로 구성되는 면역글로불린 도메인을 의미하며; 프레임워크 영역은 3개의 "상보성(Complementarity) 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 간섭되며, CDR은 당업계와 이하에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"로 각각 지칭된다. 그러므로, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 이것이 항원 결합 부위를 수반하여 항원에 항체에 대한 특이성을 제공하는 면역글로불린 가변 도메인이다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 추가적인 가변 면역글로불린 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명의 의미에서 면역글로불린 단일 가변 도메인의 일 예는 면역글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL(VH 도메인과 VL 도메인) 같은 "도메인 항체"이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 다른 예는 이하에 정의된, 카멜리드(camelid)에서 유래한 "VHH 도메인"(또는 간단하게 "VHH")이다.
상기한 정의의 관점에서, 일반적인 4 사슬 항체(예를 들어, 당업계에 공지된 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자), 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드 결합된 Fv 또는 scFv 단편 같은 Fv 단편, 또는 일반적 4 사슬 항체에서 유도된 다이아바디(diabody)(모두 종래기술에서 공지됨)의 항원 결합 도메인은 통상적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 여겨지지 않는데, 왜냐하면 이러한 경우들에 있어서 항원의 각 에피토프에 대한 결합이 일반적으로 하나(단일)의 면역글로불린 도메인에 의해서 발생하는 것이 아니라, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 같은 한 쌍의 (결합하고 있는)면역글로불린 도메인, 즉 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하고 있는 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 발생할 수 있기 때문이다.
VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 없는 항체"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993))의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로 기술되었다. "VHH 도메인"이란 용어는 일반적인 4 사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(여기에서는 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"으로 지칭)과 일반적인 4 사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(여기에서는 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"으로 지칭)으로부터 이들 가변 도메인을 구별하기 위해 선택된다. VHH 도메인은 특정하게 에피토프에 추가의 항원 결합 도메인 없이 결합할 수 있다(에피토프가 VH 도메인과 함께 VL 도메인에 의해 인식되는 일반적인 4-사슬 항체 내의 VH 또는 VL 도메인과 대조). VHH 도메인은 작고, 강력하며 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성된 효율적인 항원 인식 단위이다.
본 발명의 내용 중에서, VHH 도메인, VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, VHH 항체, "Nanobody®" 및 "Nanobody® 도메인"("Nanobody"는 Ablynx N.V.(Ghent, Belgium)의 상표명이다)은 상호교환적으로 사용되고, (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 구조를 가지며; 제2 면역글로불린 가변 도메인을 필요로 하지 않고 에피토프에 특이적으로 결합하는)대표적인 면역글로불린 단일 가변 도메인이며, 이들은 예를 들어 WO 2009/109635의 도 1에 정의된, 소위 "홀마크(hallmark) 잔기"에 의해 VH 도메인과는 구별된다.
면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH의 아미노산 잔기는 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38(1999)의 도 2에서 보이는 바와 같이 카멜리드의 VHH 도메인에 적용된, Kabat 등("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)이 제공한 VH 도메인에 대한 일반적 넘버링에 따라 번호가 매겨진다. 이 넘버링에 따르면,
- FR1은 1-30 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR1은 31-35 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR2는 36-49 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR2는 50-65 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR3는 66-94 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR3는 95-102 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR4는 103-113 위치의 아미노산 잔기를 포함한다.
그러나, -VH 도메인과 VHH 도메인에 대해 당분야에서 공지된 바와 같이- 각각의 CDR 내 아미노산 잔기의 총 수는 가변적일 수 있고 Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있다는 것에 유의해야 한다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열 내에 있지 않을 수 있거나, 실제 서열은 Kabat 넘버링에 의해 부여된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이것은 일반적으로 Kabat 넘버링이 실제 서열 내 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응하거나 상응하지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
유사한 방식으로 VHH 도메인에도 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기 넘버링을 위한 선택적 방법이 당분야에 공지되어 있다. 그러나, 본 명세서, 특허청구범위 및 도면에서, Kabat에 따르고 상기된 바와 같은 VHH 도메인에 적용된 넘버링은 별도의 지시가 없는 한, 다음과 같다.
VHH 도메인 내의 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 주로 112 내지 115의 범위가 된 것이다. 그러나, 더 짧은 서열 및 더 긴 서열 또한 여기에 기술된 목적에 적합할 수 있다는 것에 유의해야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 및 도메인 항체는 이들을 치료요법에서 작용성 항원-결합분자로 사용하는데 매우 유리하게 만드는 다수의 독특한 구조적 특징과 작용 특성을 갖는다. 특히, 이에 제한되지 않고, (경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루지 않으면서 항원에 작용적으로 결합하도록 자연적으로 "디자인된")VHH 도메인은 단일의 상대적으로 작은 작용성 항원 결합 구조 단위로서 기능할 수 있다.
그 독특한 특성으로 인하여 여기에 정의된 바와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 또는 VH(또는 VL)는 -단독으로 또는 거대 폴리펩티드, 예를 들어 바이파라토프 분자의 일부로서- 많은 중요한 이점을 제공한다:
- 높은 친화도와 고선택성으로 항원을 결합하는데 단일 도메인만이 필요하기 때문에 2개의 별개 도메인을 제공할 필요가 없고 이러한 2개 도메인은 정확한 공간 형태와 구조로 존재하지 않을 수 있으며(즉, scFv와 같이, 특별히 설계된 링커를 사용);
- 면역글로불린 단일 가변 도메인이 단일 핵산 분자로부터 발현될 수 있고 (글리코실레이션 같은)번역후 변성이 필요하지 않고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다가 및 다종(multispecific) 포맷으로 용이하게 조작될 수 있고(여기에서 상세히 언급됨);
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 그의 타겟에 대하여 높은 특이성과 친화도, 낮은 고유 독성을 가지며 주입 또는 주사 이외의 대안적 경로로 투여될 수 있고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 열, pH, 프로테아제 및 다른 분해제 또는 조건에 매우 안정하여 냉각장치를 사용하지 않고 제조, 보관 또는 수송이 가능하고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 소규모 및 상업적 규모로 제조하기 용이하고 비교적 저렴하다. 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 (예를 들어, 이하에 상세히 기술한 바와 같은)미생물 발효를 사용하여 생산할 수 있고, 예를 들어 일반적인 항체를 사용하는 것처럼, 포유동물 발현 시스템을 사용할 필요가 없으며;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 단편과 비교하여 상대적으로 작고(대략 15 kDa, 또는 일반적인 IgG 보다 10배 더 작음), 따라서 조직(제한적인 것은 아니나, 예를 들어 고체 종양 및 다른 치밀 조직 포함)으로의 침투성이 높으며, 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 단편보다 더 많은 투여량으로 투여할 수 있고;
- VHH는 (4 사슬 항체로부터의 VH 도메인과 비교하여 특히 이들의 연장된 CDR3 루프로 인한)특이적인 이른바 "공동(cavity) 결합 특성"을 가지며, 따라서 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 단편이 접근할 수 없는 타겟과 에피토프에 접근할 수 있으며;
- (Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989)에 기술된 마우스에서 유도된 항원 결합 도메인처럼)VHH는 매우 가용성이고 안정하며 응집경향이 없는 특별한 이점을 가진다.
본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이들을 얻는 특정한 생물학적 공급원 또는 특이적 제조방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, VHH는 다음 단계들을 포함하여 얻을 수 있다:
(1) 자연적으로 발생하는 중쇄 항체의 VHH 도메인을 단리하거나; 중쇄 항체 또는 VHH를 포함하는 라이브러리를 스크리닝하여 이들로부터 VHH를 단리하고;
(2) 자연적으로 발생한 서열을 가지는 VHH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(3) VHH를, 임의로 친화도 성숙 후에 자연적으로 발생한 서열로 (여기에 기술된 바와 같이)"인간화"하거나 인간화된 VHH를 코딩하는 핵산을 발현하고;
(4) 동물 종, 특히 포유동물 종, 예를 들어 사람에서 유래한 자연적으로 발생한 항체의 면역글로불린 단일 가변 헤비 도메인을 (하기한 바와 같이)"카멜화(camelizing)"하거나 이러한 카멜화된 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(5) VH를 "카멜화"하거나, 이러한 카멜화된 VH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(6) 합성적 또는 반합성적으로 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하는 방법을 사용하고;
(7) VHH 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 핵산 합성 기술을 사용하여 제조한 다음, 이렇게 얻어진 핵산을 발현하고;
(8) 중쇄 항체 또는 VHH에 대하여 친화도 성숙, 돌연변이(예를 들어, 랜덤 돌연변이 또는 부위 특이적 돌연변이) 및/또는 VHH의 친화도 및/또는 특이성을 증가시키기 위한 다른 방법을 수행하거나/하고;
(9) 이전 단계들을 조합 또는 선택하는 단계.
상기한 단계들을 수행하는데 적합한 방법과 기술은 당분야에 공지되어 있으며 당업자들에게는 명백한 것이다. 예를 들어, 특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH 도메인을 얻는 방법은 WO2006/040153 및 WO2006/122786에 기술되어 있다.
특정 구체예에 따라, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 자연적으로 발생한 VHH 도메인의 아미노산 서열에 본질적으로 상응하지만, 상기한 자연 발생 VHH 서열의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람에서 유래한 일반적인 4-사슬 항체의 가변 헤비 도메인 내의 상응하는 위치(들)에서 발생한 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 "인간화" 또는 "서열-최적화"(임의로 친화도-성숙 이후)된 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인이다. 이는 당업자들에 의해 일반적으로 사용될 수 있는 당분야에서 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 전체 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 보다 더 특정한 구체예에서, 인간 생식세포 Vh3 서열 DP-29, DP-47, DP-51 또는 그의 일부에서 유래된 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있거나, 그에 대해 고도로 상동성이고, 임의로 JH5 같은 JH 서열과 조합될 수 있다. 따라서, 인간화 프로토콜은 임의의 VHH 잔기를 DP 47, DP 29 및 DP 51 같은 생식세포 VH 유전자의 상응하는 프레임워크 1, 2 및 3(FR1, FR2 및 FR3) 잔기로 단독 또는 조합하여 대체하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 적합한 프레임워크 영역(FR)은, 예를 들어 WO 2006/004678에 개시된 것들로부터 선택될 수 있고, 구체적으로 소위 "KERE" 및 "GLEW" 클래스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대략 44 내지 47 위치에 아미노산 서열 G-L-E-W를 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인과 그의 개별적 인간화 대응물이다. 인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 전체 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다.
예를 들어, 103 P,R,S-그룹 및/또는 (이하에 정의된)GLEW-그룹에 속하는 VHH에 대한 인간화 치환은 108Q 내지 108L이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화 방법은 당분야에 알려져 있다.
치료상 적용을 고려하여 개선된 특성, 예를 들어 강화된 친화도 또는 감소된 면역원성을 갖는 결합한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 당분야에 공지된 기술, 예컨대 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 랜덤 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발), CDR 그래프팅, 인간화, 다른 면역글로불린 서열로부터 유도된 단편의 조합, 오버랩핑 프라이머를 사용하는 PCR 조립 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하는 유사 기술; 또는 여기에 기술된 "서열 최적화"라고도 지칭된, 상기한 것들의 임의의 적합한 조합에 의해 개별적인 결합분자로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 표준 핸드북뿐만 아니라 상세한 설명과 실시예를 참조할 수 있다.
적절한 경우, 친화도가 증가된 결합분자는 또다른 결합분자의 친화도-성숙에 의해 얻어질 수 있으며, 후자는 친화도-성숙 분자와 관련하여 "모체" 결합분자이다.
특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH를 얻는 방법은, 예를 들어 WO2006/040153 및 WO2006/122786에 이미 기술되어 있다. 또한, 거기에 상세히 기술된 바와 같이, 카멜리드로부터 유도된 VHH 도메인은 원래 VHH 서열의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간의 일반적인 4-사슬 항체 VH 도메인 내의 상응하는 위치에 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 "인간화 (humanized)"(여기에서 "서열-최적화"로도 지칭되며, "서열-최적화"는 인간화 이외에도 잠재적인 번역 후 변성 부위의 제거와 같은 개선된 특질을 갖는 VHH를 제공하는 하나 이상의 돌연변이에 의한 서열의 추가 변성을 포함할 수 있다)될 수 있다. 인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 전체 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 보다 더 특정한 구체예에서 임의로 JH5 같은 JH 서열과 조합된, DP-29, DP-47, DP-51, 또는 그의 일부로부터 유래된 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다.
"Dab" 및 "dAbs"로도 알려진 "도메인 항체"(용어 "Domain Antibodies"와 "dAbs"는 GlaxoSmithKline 그룹사의 상표로서 사용되고 있다)는, 예를 들어 Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); 및 WO2003/002609에 기술되어 있다.
도메인 항체는 본질적으로 비-카멜리드 포유동물 항체, 특히 인간 4-사슬 항체의 VH 또는 VL 도메인에 해당한다. 단일 항원 결합 도메인으로서 즉, VL 또는 VH 도메인 각각과 쌍을 이루지 않고 에피토프와 결합하기 위해서는, 예를 들어 인간의 단일 VH 또는 VL 도메인 서열 라이브러리(library)를 사용함으로써 이러한 항원 결합 특성에 대한 특이적인 선택을 필요로 한다.
도메인 항체는 VHH처럼 약 13 내지 약 16 kDa의 분자량을 가지며, 전체 인간 서열로부터 유래한 경우에는, 예를 들어 인간의 치료 용도를 위한 인간화를 필요로 하지 않는다. 또한, 그것은 VHH 도메인의 경우와 같이 원핵생물의(prokaryotic) 발현 시스템에서도 잘 발현되고, 전체 제조 비용에 있어서 상당한 감소를 제공한다.
또한, 하나 이상의 상기한 CDR을 다른 "스캐폴드(scaffold)", 예를 들어 비제한적으로 인간의 스캐폴드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드에 "이식(graft)"할 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 이러한 CDR 이식을 위한 적합한 스캐폴드 및 기술은 당분야에 잘 알려져 있다.
상호교환적으로 사용될 수 있는, "에피토프" 및 "항원 결정요인"이란 용어는 종래 항체 또는 본 발명의 폴리펩티드와 같은 항원-결합분자, 보다 구체적으로 상기 분자의 항원-결합부위에 의해 인식되는 폴리펩티드 같은 거대분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 면역글로불린에 대한 최소 결합부위를 정의하는 것이므로, 면역글로불린 특이성의 타겟을 나타낸다.
임의 에피토프, 항원 또는 단백질 (또는 적어도 하나의 그의 일부, 단편 또는 에피토프)에 "결합하거나" 또는 "특이적으로 결합할 수 있는", "친화도를 갖거나/갖고 특이성을 갖는" 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린, 항체, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 일반적으로 항원-결합분자 또는 그의 단편)는 상기 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대해" 또는 "그에 대향하는" 것이라고 일컬어지거나, 그러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합"분자이다. 본 명세서에서, Ang2-결합분자는 또한 "Ang2-중화하는 것"으로서 지칭될 수 있다.
일반적으로, "특이성"이란 용어는 특정한 항원-결합분자 또는 항원-결합 단백질(예컨대, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인) 분자가 결합할 수 있는 상이한 종류의 항원 또는 에피토프의 수를 지칭한다. 항원-결합분자의 특이성은 그의 친화도 및/또는 결합활성을 기초로 결정될 수 있다. 항원과 항원-결합 단백질의 분리에 대한 평형상수(KD)로 표시되는 친화도는 에피토프와 항원-결합 단백질상 항원-결합 부위 사이 결합력의 척도이다: KD값이 적을수록, 에피토프와 항원-결합분자 사이의 결합력은 더 강하다(선택적으로, 친화도는 또한 1/KD인 친화도 상수(KA)로서 표현될 수 있다). (예를 들어, 본 명세서의 상세한 설명에 기초하여)당업자에게 명확한 바와 같이, 친화도는 관심있는 특이적 항원에 따라 그 자체가 알려진 방식으로 측정될 수 있다. 결합활성은 항원-결합분자(예를 들어, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인) 또는 이를 함유하는 폴리펩티드와 적절한 항원 사이의 결합력에 대한 척도이다. 결합활성은 에피토프와 항원-결합분자상 그의 항원 결합 부위 사이 친화도 및 항원-결합분자상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수, 모두와 관련되어 있다.
에피토프를 인식하는 항원-결합분자(예컨대, 본 발명의 항체 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 일부를 파라토프(paratope)라 한다.
별도의 지시가 없는 한, 용어 "Ang2-결합분자"는 항-Ang2 항체, 항-Ang2 항체 단편, "항-Ang2 항체-유사 분자" 및 임의의 이들과의 컨쥬게이트를 포함한다. 항체는 단일클론 항체 및 키메릭(chimerized) 단일클론 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "항체"란 용어는 숙주세포에서 재조합 발현에 의해 생산된 모노클로날 항체와 같은 완전한 면역글로불린을 포함할 뿐만 아니라, Ang2 결합 항체 단편 또는 "항체 유사 분자", 예를 들어 WO 02/056910에 기술된 바와 같은 소위 "SMIP" ("Small Modular Immunopharmaceuticals")라 불리는 단일-사슬 항체 및 선형 항체를 포함한다. 항-Ang2 항체-유사 분자는 여기서 정의된 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 항체-유사 분자의 다른 예는 면역글로불린 슈퍼 패밀리 항체(IgSF) 또는 CDR-이식 분자이다.
"Ang2-결합분자"는 1가의 Ang2-결합분자(즉, Ang2의 하나의 에피토프와 결합하는 분자) 및, "포맷된(formatted)" Ang2-결합분자로도 지칭되는, 1 초과의 Ang2-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 Ang2-결합 분자를 지칭한다. 포맷된 Ang2-결합 분자는, Ang2-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 이외에 링커(linker) 및/또는 이펙터(effector) 작용을 갖는 잔기(moieties), 예를 들어 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인과 같은 반감기 연장(half-life-extending) 잔기, 및/또는 혈청 알부민 같은 융합 파트너 및/또는 PEG 같은 부착 폴리머를 포함할 수 있다.
포맷된 Ang2-결합분자는 또한 비록 덜 바람직하기는 하나, 2개의 동일한 Ang2-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는, 같거나 중첩하는 에피토프를 인식하는 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 이 경우, 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Ang2 다이머를 형성하는 2개 모노머 각각의 같거나 중첩하는 에피토프에 결합할 수 있다. 경쟁적 ELISA 어세이와 같은 실험 데이터는 단일 Ang2-결합분자의 개별적 결합 블록과 비교하여 포맷된 Ang2 다이머의 작용에서 상당한 개선을 나타내었다(데이터 미기재).
전형적으로, 본 발명의 Ang2-결합분자는 10E-5 내지 10E-14 몰/리터 (M) 이하, 바람직하게 10E-7 내지 10E-14 몰/리터 (M) 이하, 더욱 바람직하게 10E-8 내지 10E-14 몰/리터, 및 더욱 더 바람직하게는 10E-11 내지 10E-13의 해리상수(KD) (Biacore 또는 Kinexa 어세이로 측정), 및/또는 적어도 10E7 ME-1, 바람직하게 적어도 10E8 ME-1, 더욱 바람직하게 적어도 10E9 ME-1, 예컨대 적어도 10E11 ME-1의 결합상수(KA)로 결합한다. 10E-4 M을 초과하는 임의의 KD값은 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 목적하는 항원, 즉 Ang2에, 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 KD로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 대한 항원-결합 단백질의 특이적 결합은, 예를 들어 여기에 기술된 어세이, Scatchard 분석 및/또는 경쟁적 결합 어세이, 예컨대 방사면역어세이(RIA), 효소 면역어세이(EIA) 및 샌드위치 경쟁 어세이, 및 당분야에 그 자체가 알려진 이들의 다양한 이형을 포함하는, 공지된 임의의 적합한 방식으로 측정될 수 있다.
아미노산 잔기는 당분야에서 일반적으로 알려지고 동의된, 표준 3-문자 또는 1-문자 아미노산 코드에 따라 표시되었다. 두 개 아미노산 서열을 비교할 때, "아미노산 차이"란 용어는, 두 번째 서열에 비해, 참조 서열의 위치에서 지정된 번호의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 의미한다. 치환의 경우, 이러한 치환은 바람직하게 아미노산의 보존적 치환이며, 이는 아미노산 잔기가 유사한 화학 구조를 갖고, 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 기타 생물학적 특성에 영향을 거의 미치지 않거나 근본적인 영향이 없는 또다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 WO1998/49185에서는, 아미노산의 보존적 치환이 바람직하게 하기 그룹 (ⅰ) - (ⅴ)의 하나의 아미노산이 동일 그룹 내의 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (ⅰ) 작은 지방족, 비극성, 또는 약간의 극성을 띠는 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (ⅱ) 극성, 음전하의 잔기 및 그들의 (하전되지 않은(uncharged)) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (ⅲ) 극성, 양전하의 잔기: His, Arg 및 Lys; (ⅳ) 거대 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (ⅴ) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존적 아미노산 치환은 다음과 같다: Ala을 Gly 또는 Ser으로; Arg을 Lys으로; Asn을 Gln 또는 His로; Asp를 Glu로; Cys를 Ser으로; Gln을 Asn으로; Glu을 Asp로; Gly을 Ala 또는 Pro으로; His을 Asn 또는 Gln으로; Ile을 Leu 또는 Val으로; Leu을 Ile 또는 Val으로; Lys을 Arg, Gln 또는 Glu으로; Met을 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe을 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser을 Thr으로; Thr을 Ser으로; Trp을 Tyr으로; Tyr을 Trp 또는 Phe으로; Val을 Ile 또는 Leu으로 치환.
폴리펩티드 또는 핵산 분자는 - 예를 들어, 그의 본래 생물학적 공급원 및/또는 그것이 얻어진 반응 배지 또는 배양 배지와 비교할 때 - 상기 공급원 또는 배지에서 일반적으로 그와 결합된, 기타 단백질/폴리펩티드, 기타 핵산, 기타 생물학적 성분 또는 거대 분자와 같은, 적어도 하나의 기타 성분 또는 적어도 하나의 오염 물질, 불순물 또는 소량(minor) 성분으로부터 분리된 경우 "본질적으로 분리(형태)(로)"된 것으로 간주된다. 특히, 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 적어도 2-배, 특히 적어도 10-배, 더욱 특히 적어도 100-배, 및 1000-배 이상까지 정제된 경우 "본질적으로 분리"된 것으로 간주한다. "본질적으로 분리된 형태로" 존재하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 바람직하게 적합한 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 같은 적합한 크로마토그래피 기술을 사용하여 측정하였을 때, 바람직하게 본질적으로 상동성(homogeneous)이다.
"N-말단(terminus)"(아미노 말단, NH2-말단, N-터미널 말단 또는 아민-말단으로도 알려짐)이란 용어는 자유 아민 그룹(-NH2)을 갖는 아미노산으로 종결된 단백질/폴리펩티드(즉, Ang2-결합 분자)의 출발을 지칭한다. 펩티드 서열을 기재하는 협약은 왼쪽에 N-말단을 놓고 서열을 N-말단에서 C-말단으로 기재한다. 단백질이 메신저 RNA로부터 번역될 때 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 만들어진다.
두 개의 Ang2-결합분자 서열 간의 "서열 동일성(sequence identity)"은 그 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 의미한다. 이는 WO 08/020079의 49쪽 및 50쪽의 f) 단락에서 설명된 바와 같이 계산 또는 측정될 수 있다. "서열 유사성(sequence similarity)"은 동일하거나, 아니면 보존적으로 치환된 아미노산의 백분율을 의미한다.
VHH 도메인에 유사한 방식으로 적용될 수도 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기 넘버링의 대안적 방법이 당분야에 알려져 있다. 그러나, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 상세한 설명, 청구항 및 도면에서는 Kabat에 따른 위에 설명된 바와 같이 VHH 도메인에 적용된 넘버링을 따랐다.
"친화도-성숙된" Ang2-결합분자, 특히 VHH 또는 도메인 항체는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변경을 포함하는데, 이는 각 모체 Ang2-결합분자에 비해,Ang2에 대한 친화도를 개선한다. 본 발명의 친화도-성숙된 Ang2-결합분자는 당분야에서 공지된 방법으로, 예를 들어 Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, 또는 Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA　91: 3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J.　Mol. Biol. 226(3): 889 896; KS　Johnson 및 RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명에서, "서열번호: x의 아미노산 서열"은, 달리 언급되지 않는 한, 각 서열번호: x에 나타낸 서열과 100 % 동일한 아미노산 서열;
a) 각 서열번호: x에 나타낸 서열과 적어도 80 퍼센트의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
b) 각 서열번호: x에 나타낸 서열과 3, 2, 또는 1 개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "암" 및 "암성(cancerous)"은 제어되지 않은 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특성화되는 포유동물에서의 생리학적인 상태를 지칭하거나 기술한다. 본 발명의 Ang2-결합분자로 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는, 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 및 백혈병(leukemia)를 포함한다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는, 편평세포암종(squamous cell cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐 선암(adenocarcinoma of the lung), 폐 편평암종(squamous carcinoma of the lung), 복막 암(cancer of the peritoneum), 간세포 암(hepatocellular cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간세포암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 대장암(colorectal cancer), 신장세포 암종, 자궁내막암종(endometrial carcinoma) 또는 자궁암종(uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 위암(gastric cancer), 흑색종(melanoma), 및 다양한 유형의 두경부 암(head and neck cancer)을 포함한다. 신생혈관생성의 조절장애는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 많은 장애를 일으킬 수 있다. 이들 장애는 비종양성(non-neoplastic) 및 종양성(neoplastic) 상태 모두를 포함한다. 종양은 상기한 것들을 비제한적으로 포함한다.
비종양성 장애의 비제한적인 예는, 원하지 않거나 비정상적인 비대증(hypertrophy), 관절염(arthritis), 류마티스 관절염(RA), 건선(psoriasis), 건선판(psoriatic plaque), 사코이드증(sarcoidosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 죽상경화판(atherosclerotic plaque), 당뇨병(diabetic) 및 미숙아망막병증(retinopathy of prematurity)을 포함하는 기타 증식성 망막병증 (proliferative retinopathy), 수정체뒤섬유증식(retrolental fibroplasia), 신생혈관녹내장(neovascular glaucoma), 연령관련황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨황반부종(diabetic macular edema), 각막혈관신생(corneal neovascularization), 각막이식혈관신생(corneal graft neovascularization), 각막이식거부(corneal graft rejection), 망막/맥락막혈관신생(retinal/choroidal neovascularization), 전방각혈관신생(피부홍조)(neovascularization of the angle(rubeosis)), 혈관신생성 안질환(ocular neovascular disease), 혈관 재협착(vascular retenosis), 뇌동정맥기형(arteriovenous malformations: AVM), 뇌수막종(meningioma), 혈관종(hemangioma), 혈관섬유종(angiofibroma), 갑상선 과형성증 (thyroid hyperplasias, 그레이브스 병(Grave's disease) 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐염증, 급성 폐손상/ARDS, 패혈증, 원발(성) 폐고혈압증(primary pulmonary hypertension), 악성 폐낭삼출증(malignant pulmonary effusion), (예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄성 뇌손상(closed head injury)/외상과 연관된)뇌부종(cerebral edema), 활액염(synovial inflammation), RA에서의 판누스 형성(pannus formation), 골화근염(myositis ossificans), 비대 골형성 (hypertropic bone formation), 골관절염(osteoarthritis(OA)), 난치성 복수(refractory ascites), 다낭성 난소병(polycystic ovarian disease), 자궁내막증(endometriosis), 체액 질환의 3차 스페이싱(3rd spacing of fluid diseases; 췌장염, 구획증후군(compartment syndrome), 화상, 장질환), 자궁종양(uterine fibroid), 조숙산통(premature labor), IBD와 같은 만성 감염(크론병 및 궤양성대장염), 신장 동종이식거부반응(renal allograft rejection), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 신증후군(nephrotic syndrome), (암이 아닌)원하지 않거나 비정상적인 조직 중량 증가, 혈우병성 관절(hemophilic joint), 비후흉터(hypertrophic scar), 모발성장 저해, 오시어-웨버 증후군(Osier-Weber syndrome), 화농육아종(pyogenic granuloma), 수정체후부섬유증식증(retrolental fibroplasias), 공피증(scleroderma), 트라코마(trachoma), 혈관유착(vascular adhesion), 윤활막염(synovitis), 피부염(dermatitis), 전자간증(preeclampsia), 복수(ascites), (심장막염과 연관된 것 같은)심낭삼출(pericardial effusion), 및 흉막삼출(pleural effusion)을 포함한다.
"안과 질환"이란 용어는 증식성 망막증, 예를 들어 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 후수정체 섬유 증식(증), 혈관신생성녹내장, 연령관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신혈관신생(corneal neo-vascularization), 각막 이식 신혈관신생, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신혈관신생을 지칭한다.
"만성 신장 질환"이란 용어는 당뇨병성 신장병, 신후성 신부전증, 신전성 질소혈증(prerenal azotemia) 및 신성신부전을 지칭한다.
발명의 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Ang2-결합분자에 관한 것으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 3개의 상보성결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하고, 여기서 CDR1은 서열번호 168 내지 170에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호 171 내지 173에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, CDR3는 서열번호 174 내지 177에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
CDR1은 다음에서 선택된 서열을 갖는다:
서열번호: 168 DYAIG
서열번호: 169 DYALG
서열번호: 170 YYAIG
CDR2는 다음에서 선택된 서열을 갖는다:
서열번호: 171 AIRSSGGSTYYADSVKG
서열번호: 172 CIRCSGGSTYYADSVKG
서열번호: 173 CISSSGGITYYADSVKG
CDR3는 다음에서 선택된 서열을 갖는다:
서열번호: 174 VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA
서열번호: 175 VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA
서열번호: 176 SIVPRSKLEPYEYDA
서열번호: 177 DSGGYIDYDCSGLGYDY
바람직한 구체예에 따라, Ang2-결합분자는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기에서
(a) CDR1은 서열번호: 168에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 171에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 174에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나,
(b) CDR1은 서열번호: 168에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 171에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 175에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나,
(c) CDR1은 서열번호: 169에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 172에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 176에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나,
(d) CDR1은 서열번호: 170에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 173에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 177에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 구체예에 따라, Ang2-결합분자는 VHH 또는 도메인 항체인 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다.
보다 더 바람직한 구체예에 따라, Ang2-결합분자는 VHH인 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다.
특정 구체예에 따라, VHH는 서열번호: 167, 166, 129 및 138로 구성되는 군에서 선택된 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Ang2-결합분자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 Ang2 바인더의 서열은 그의 결합활성의 유의한 감소 없이 그의 N-말단에서 변성될 수 있다(즉, 제1 아미노산의 결실 또는 교환). 이러한 변성은 박테리아 숙주(예를 들어, 비제한적으로 Escherichia coli)에서 세포내/세포질 발현 동안 N-말단 메티오닌의 공동-/후-번역성 절단을 증강한다.
일 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 VHH는 N-말단에서 변성 또는 교환을 가지며, 여기에서 변성은 제1 아미노산의 결실이고 교환은 제1 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체이다.
바람직한 구체예들 중 하나에 있어서, N-말단의 제1 아미노산은, 예를 들어 알라닌(A)으로 대체된 발린(V) 또는 아스파트산(D)이다.
치료적 적용 측면에서, 향상된 친화도 또는 감소된 면역원성 (immunogenicity) 같은 개선된 특성을 갖는 Ang2-결합성분은 본 발명의 개별 Ang2-결합성분으로부터, (예를 들어, 합성, 랜덤 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발하는)친화도 성숙, CDR 그래프팅(grafing), 인간화, 서로 다른 면역글로불린 서열에서 유도된 단편의 조합, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 어셈블리(assembly), 및 당업자에게 공지된 면역글로불린 서열을 조작하는 유사 기술들 등의 기술; 또는 상기한 기술들의 임의의 적합한 조합에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 표준 핸드북뿐만 아니라 상세한 설명과 실시예를 참조할 수 있다.
바람직하게, 친화도가 증가된 본 발명의 Ang2-결합성분은 다른 Ang2-결합성분의 친화도 성숙으로 얻어지며, 후자는, 친화도 성숙 분자와 관련하여 "모체(parent)" Ang2-결합성분이다.
따라서, 더욱 바람직한 다른 구체예에서, 본 발명의 Ang2-결합분자는 위에서 정의한 모체 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙으로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
더욱 바람직한 다른 구체예에서, 본 발명은 VHH의 친화도 성숙으로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1, 17 및 80에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH의 인간화에 사용된 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 127, 132 및 146에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH의 인간화로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
본 발명은 또한 위에 정의된 VHH의 친화도 성숙 및/또는 서열 최적화로 얻어진 Ang2-결합분자, 예를 들어 서열번호: 167, 166, 129 및 138로서 표시된 아미노산 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화로 얻어진 VHH에 관한 것이다.
더욱 바람직한 다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 167에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH의 친화도 성숙으로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 166에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH의 친화도 성숙으로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
더욱 바람직한 다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 129에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH의 친화도 성숙으로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
보다 더 바람직한 다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 138에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH의 친화도 성숙으로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 본 발명의, 또는 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 Ang2-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 종류에서 대표적인 것은 "카멜화(camelized)"된, 즉 일반적인 4 사슬 항체에서 유래한 자연적으로 발생하는 가변 중쇄의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인 내의 상응하는 위치에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 자연적으로 발생한 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진다. 이것은 알려진 방법 자체로 수행할 수 있고, 당업자들에게 명백하며, 또한 WO 1994/04678을 참조할 수 있다. 이러한 카멜화는 VH-VL 경계와 소위 Camelidae Hallmark 잔기(예를 들어, WO 1994/04678 참조)에 존재하는 아미노산 위치에서 우선적으로 발생할 수 있다. 이러한 "인간화"와 "카멜화" 방법 및 이들과 일치하는 바람직한 프레임워크 영역 서열은 WO 2006/040153의 46 및 98 페이지와 WO 2006/122786의 107 페이지에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 Ang2-결합성분, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 이들을 함유하는 폴리펩티드들은, 이들이 Ang2 분자 내에서 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 점에서 Ang2에 대해 특이성을 가진다.
Ang2-결합성분과 그의 항원 Ang2의 특이적 결합은 공지된 적합한 방법, 예를 들어 여기에 기술된 어세이, 스캐쳐드(Scatchard) 분석 및/또는, 방사면역검정법(RIA), 효소면역검정법(EIA 및 ELISA) 및 샌드위치 경쟁 어세이 같은 경쟁적 결합 어세이와, 당업계에 알려진 자체로 이들의 상이한 변형으로 결정할 수 있다.
항원 Ang2와 관련하여, 본 발명의 Ang2-결합성분, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인은 종에 제한되지 않는다. 따라서, 사람의 치료를 목적으로 하는 경우, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드는 바람직하게 인간 Ang2와 결합한다. 그러나, 다른 포유동물 종에서 유래한 Ang2와 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드 또한 본 발명의 범위 내에 있다. Ang2의 하나의 종 형태와 결합한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 다른 종의 Ang2와 교차반응할 수 있다. 예를 들어, 인간 Ang2와 결합한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 영장류의 하나 이상의 다른 종의 Ang2 및/또는 질환에 대한 동물 모델, 예를 들어 원숭이(구체적으로 사이노몰거스(Cynomolgus) 또는 벵골(Rhesus)), 마우스, 래트, 래빗, 돼지, 개 및, 특히 신생혈관생성에서 Ang2-매개 효과와 연관된 질환 및 장애의 동물 모델(예컨대, 여기에서 언급된 종 및 동물 모델)에 사용된 하나 이상의 동물 종의 Ang2와 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 이러한 교차 반응성을 나타내는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 원숭이, 특히 사이노몰거스원숭이 또는 벵골원숭이, 또는 마우스와 래트 같은 숙지된 질환 모델에서 시험될 수 있도록 하기 때문에 연구 및/또는 의약 개발에 유리하다.
또한, 본 발명의 Ang2-결합성분은 이들이 관련된 특정 도메인 또는 항원결정부위에 의해 제한되거나 규정되지 않는다. 바람직하게, 치료적 Ang2 길항제의 개발에서 동물 모델로서 사용하고자 하는 사람 이외의 종에서 유래한 하나 이상의 Ang2 분자와의 교차 반응성 측면에서, Ang2-결합성분은 사람 Ang2와 고도의 동일성을 갖는 관심 Ang2의 영역 내 에피토프를 인식한다. 예를 들어, 마우스 모델을 사용하는데 있어서, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 'Kim H-Z, Jung K, Kim HM, Cheng Y, and Koh GY (2009)'에서 공개된 FLD-도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치하는 에피토프를 인식한다. 디자인된 안지오포이에틴-2 변이체, 펜타머 COMP-Ang2는 강력하게 Tie2 리셉터를 활성화하여 신생혈관생성을 자극하였다. Biochim Biophys Acta 1793, 772-780.
그러므로, 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 Ang2-결합성분, 구체적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드에 관한 것이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 FLD-도메인(서열번호: 188 내지 190) 내에 전체적으로 또는 부분적으로 함유된 에피토프에 결합하는 군에서 선택된다.
바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Ang2와 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합한다(표면 플라즈몬 공명 분석으로 측정).
바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 IC50값은 경쟁 ELISA 어세이로 측정하여 10-6 내지 10-10 몰/리터 이하, 더욱 바람직하게 10-8 내지 10-10 몰/리터 이하, 보다 더 바람직하게 10-9 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위이다.
본 발명의 비제한적인 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 Ang2-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드는 Ang2와 10-5 내지 10-12 몰/리터(M) 이하, 바람직하게 10-7 내지 10-12 몰/리터(M) 이하, 및 더욱 바람직하게 10-8 내지 10-12 몰/리터(M)의 해리상수(KD) 및/또는 적어도 107 M-1, 바람직하게 적어도 108 M-1, 더욱 바람직하게 적어도 109 M-1, 예컨대 적어도 1012 M-1의 결합상수(KA)로 결합하고; 특히 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 KD로 결합한다. Ang2에 대한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 KD 및 KA는 측정할 수 있다.
다른 구체예에 따라, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 여기서 정의된 도메인 항체이다.
본 발명의 단일특이적(monospecific) 결합 분자에 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 "카멜화(camelized)"된, 즉 일반적인 4 사슬 항체에서 유래한 자연적으로 발생하는 가변 중쇄의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인 내의 상응하는 위치에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 자연적으로 발생한 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 이것은 알려진 방법 자체로 수행할 수 있고, 당업자들에게 명백하며, 또한 WO 1994/04678을 참조할 수 있다. 이러한 카멜화는 VH-VL 경계와 소위 Camelidae Hallmark 잔기(예를 들어, WO 1994/04678 참조)에 존재하는 아미노산 위치에서 우선적으로 발생할 수 있다. 이러한 "인간화"와 "카멜화" 방법 및 이들과 일치하는 바람직한 프레임워크 영역 서열은, 예를 들어 WO 2006/040153의 46 및 98 페이지와 WO 2006/122786의 107 페이지에 상세히 설명되어 있다.
결합성분들은 바람직한 구체예에서 Ang2 분자 내에서 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 점에서 Ang2에 대해 특이성을 가진다.
결합성분과 그의 항원 Ang2의 특이적 결합은 공지된 적합한 방법 자체로, 예를 들어 여기에 기술된 어세이, 스캐쳐드(Scatchard) 분석 및/또는, 방사면역검정법(RIA), 효소면역검정법(EIA 및 ELISA) 및 샌드위치 경쟁 어세이 같은 경쟁적 결합 어세이와, 당업계에서 알려진 자체로 이들의 상이한 변형으로 결정할 수 있다.
항원 Ang2와 관련하여, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 종과 관련하여 제한되지 않는다. 따라서, 사람의 치료를 목적으로 하는 경우, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 인간 Ang2와 결합한다. 그러나, 다른 포유동물 종에서 유래한, Ang2와 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드 또한 본 발명의 범위 내에 있다. Ang2의 하나의 종 형태와 결합한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 다른 종의 개별 항원과 교차반응할 수 있다. 예를 들어, 인간 항원과 결합한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 영장류의 하나 이상의 다른 종의 개별 항원 및/또는 질환에 대한 동물 모델, 예를 들어 원숭이(구체적으로 사이노몰거스(Cynomolgus) 또는 벵골(Rhesus)), 마우스, 래트, 래빗, 돼지, 개 및, 특히 Ang2의 저해로 조절될 수 있는 질환 및 장애의 동물 모델(예컨대, 여기에서 언급된 종 및 동물 모델)에 사용된 하나 이상의 동물 종의 항원과 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 이러한 교차 반응성을 나타내는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 원숭이, 특히 사이노몰거스원숭이 또는 벵골원숭이, 또는 마우스와 래트 같은 숙지된 질환 모델에서 시험될 수 있도록 하였기 때문에 연구 및/또는 의약 개발에 유리하다.
또한, 결합성분은 이들이 관련된 항원의 특정 도메인 또는 항원결정부위에 의해 제한되거나 규정되지 않는다. 바람직하게, 치료적 Ang2 길항제의 개발에서 동물 모델로서 사용하고자 하는 사람 이외의 종에서 유래한 하나 이상의 항원 분자와의 교차 반응성 측면에서, 결합성분은 사람 항원과 고도의 동일성을 갖는 개별 항원의 영역 내 에피토프를 인식한다. 예를 들어, 마우스 모델을 사용하는데 있어서, 본 발명의 단일특이성 결합분자에 함유된 항-Ang2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 사람과 마우스 간에 높은 동일성을 나타내는, Ang2의 EGF-2 도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치한 에피토프를 인식한다.
그러므로, 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 단일특이성 결합분자는 FLD-도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 함유된 에피토프에 결합하는 서열번호: 167, 166, 129 및 138을 포함하는 군에서 선택된 면역글로불린 단일 가변 도메인인 Ang2-결합분자를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 Ang2-결합분자를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 Ang2-결합분자는 Escherichia coli에서 발현될 때 다음에서 선택된 뉴클레오티드 서열로 코딩된다:
서열번호: 178
Figure pct00001
서열번호: 179
Figure pct00002
서열번호: 180
Figure pct00003
및
서열번호: 181
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명은 본 발명의 단일특이성 결합분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 이러한 핵산 분자는 "본 발명의 핵산"으로서 여기에서 언급될 것이고, 여기에서 정의된 바와 같이 유전자 구조물의 형태로 존재할 것이다. 본 발명의 핵산은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA (예를 들어 목적하는 숙주세포 또는 숙주 유기체 내의 발현에 특이적으로 적응된 코돈 사용법을 갖는 DNA)일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산은 상기에 정의된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 Ang2-결합분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산은 또한, 예를 들어 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 YAC 같은 벡터의 형태일 수 있거나, 벡터 내에 존재할 수 있거나/있고 벡터 일부일 수 있다.
벡터는 특히 발현 벡터, 즉 시험관내 및/또는 생체내에서 (즉 적합한 숙주세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템 내에서) 단일특이성 결합분자의 발현에 제공할 수 있는 벡터일 수 있다. 이러한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 적합한 조절 구성요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 작동적으로 연결될 수 있는 본 발명의 핵산을 적어도 하나 포함한다. 특정한 숙주에서 특이적 서열의 발현 관점에서 이러한 구성요소 및 그의 선택은 당업자에게 있어서 일반적 지식이다. 본 발명의 이중특이성 결합분자를 발현하는데 유용하거나 필수적인 조절요소 및 다른 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 통합(integration) 인자, 선택 마커, 리더 서열, 리포터(reporter) 유전자 등의 특정한 예는 예를 들어 WO 2006/040153의 131 내지 133쪽에 개시되어 있다.
이러한 벡터는 본 발명의 하나 이상의 단일특이성 결합분자를 발현할 수 있거나/있고; 본 발명의 핵산을 함유한다.
여기에 제공된 본 발명의 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열 정보에 기초하여 본 발명의 핵산은 그 자체가 공지된 방식(예를 들어, 자동 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술)으로 제조되거나 얻어질 수 있거나/있고 적합한 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 Ang2-결합분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 발현벡터를 갖는 숙주세포에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에 따라, 상기 숙주세포는 박테리아 세포이고; 다른 유용한 세포는 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유동물 세포이다.
적합한 박테리아 세포는 Escherichia coli , Proteus, 및 Pseudomonas 균주와 같은 그람-음성 박테리아 균주 및 Bacillus , Streptomyces , Staphylococcus , 및 Lactococcus의 균주와 같은 그람-양성 박테리아 균주의 세포를 포함한다. 적합한 진균류 세포는 Trichoderma , Neurospora 및 Aspergillus 종의 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 Saccharomyces (예를 들어 Saccharomyces cerevisiae), Schizo-saccharomyces (예를 들어 Schizosaccharomyces pombe), Pichia (예를 들어 Pichia pastoris 및 Pichia methanolica), 및 Hansenula 종의 세포를 포함한다.
적합한 포유동물 세포는, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질 발현의 기술분야에 사용되는 임의의 다른 세포도 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단일특이성 결합분자를 제조하는 방법을 추가로 제공하고, 이러한 방법은 일반적으로 다음 단계들을 포함한다:
- 본 발명의 단일특이성 결합분자를 발현할 수 있는 조건 하에서 단일특이성 결합분자를 코딩할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계;
- 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 배양물로부터 회수 또는 단리하는 단계; 및
- 본 발명의 단일특이성 결합분자를 임의로 추가 정제 및/또는 변성 및/또는 제형화하는 단계.
바람직한 구체예는 다음 단계들을 포함하는 서열번호: 167, 166, 129 및 138의 서열을 갖는 Ang2-결합분자를 제조하는 방법이다:
(a) 하나 이상의 상기한 벡터로 숙주세포를 형질감염하고,
(b) 숙주세포를 배양하고,
(c) Ang2-결합분자를 회수하여 정제하는 단계.
산업적 규모의 생산을 위해, 바람직한 숙주 유기체는 큰 규모의 발현, 생산 및 발효, 및 특히 큰 규모의 약제학적 발현, 생산 및 발효에 적합한 E.　 coli , Pichia pastoris , 및 S. cerevisiae 균주를 포함한다.
특이적 발현 시스템의 선택은 특정한 번역후 변성, 더욱 구체적으로 글리코실화에 대한 요건에 일부 의존한다. 글리코실화가 바람직하거나 필요한 본 발명의 단일특이성 결합분자의 생산은 발현된 단백질을 글리코실화하는 능력을 갖는 포유동물의 발현 숙주 사용을 필요로 할 수 있다. 이러한 측면에서, 얻어진 글리코실화 패턴(즉, 결합된 잔기의 종류, 수 및 위치)은 발현에 사용되는 세포 또는 세포 계통에 따라 달라진다는 것은 당업자에게 명확할 것이다.
본 발명의 단일특이성 결합분자는 위에서 제시된 바와 같은 세포에서 (예를 들어, 세포기질, 주변세포질 또는 봉입체 내에서)세포내적으로 생산된 다음, 숙주세포로부터 단리되고 임의로 추가 정제하거나; 이들을 (예를 들어, 숙주세포가 배양된 배지에서)세포 외적으로 생산한 다음, 배양 배지로부터 단리하고 임의로 추가 정제할 수 있다.
폴리펩티드의 재조합 생산에 사용되는 방법 및 시약, 예를 들어 적합한 특이적 발현벡터, 형질전환 또는 형질감염 방법, 선택 마커, 단백질 발현 유도 방법, 배양 조건 등은 당분야에 알려져 있다. 마찬가지로, 본 발명의 폴리펩티드 제조 방법에 유용한 단백질 분리 및 정제 기술도 당업자들에게 잘 알려져 있다.
이러한 펩티드는 본 발명의 VHH로부터 유도된 CDR3에 상응한다. 펩티드, 특히 이들을 코딩하는 핵산 분자는 면역글로불린 사슬 내 CDR3를 대체하기 위한 CDR 그래프팅, 또는 비면역글로불린 스캐폴드, 예를 들어 프로테아제 저해제, DNA-결합 단백질, 시토크롬 b562, 헬릭스-번들 단백질, 디설파이드-가교 펩티드, 리포칼린 또는 안티칼린(anticalin) 내로의 삽입에 따라 이러한 스캐폴드에 타겟-결합 특질을 부여하는데 유용하다. CDR-그래프팅 방법은 당분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 인간화 항체(일반적으로 인간 항체의 Fv 프레임워크상에 설치류 항체의 CDR을 이식하는 것을 포함)에 널리 사용된다.
본 발명의 CDR3를 함유하는 면역글로불린 또는 비면역글로불린 스캐폴드를 얻기 위해, 이러한 분자를 코딩하는 DNA를 분자 생물학의 표준 방법, 예를 들어 유전자 합성, 올리고뉴클레오티드 어닐링(annealing) 또는, 예를 들어 Daugherty et al., 1991, Nucleic acid Research, Vol. 19, 9, 2471-2476에 기술된 중첩 PCR 단편에 의해 얻어질 수 있다. VHH CDR3를 비면역글로불린 스캐폴드 내로 삽입하는 방법은 Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13, 1882 - 1891에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 단일특이성 결합분자 및 임의로 그 자체가 알려진, 즉 조성물의 의도된 용도에 따른 조성물의 추가 성분 하나 이상을 함유하거나 포함하는 제품 또는 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단일특이성 결합분자의 의약으로서의 용도에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 암, 암성 질환 또는 안과 질환의 치료방법을 위한 본 발명의 단일특이성 결합분자의 용도에 관한 것이다.
약학적 용도를 위해, 본 발명의 단일특이성 결합분자 또는 이를 함유하는 폴리펩티드는 적어도 하나의 본 발명의 단일특이성 결합분자 및 적어도 하나의 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제 및/또는 보조제, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 활성인 추가 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학적 제제 또는 조성물로서 제제화될 수 있다. 비제한적 예에 의해, 이러한 제제는 경구 투여, 비경구 투여(예를 들어, 정맥주사, 근육내주사 또는 피하주사 또는 정맥 인퓨전), 국소 투여, 흡입에 의한 투여, 피부 패치, 임플란트, 좌약 등에 적합한 형태일 수 있다. -투여의 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는-이러한 적합한 투여 형태뿐만 아니라 그의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자에게 명확한 것이고 여기에서 추가로 기술되었다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 단일특이성 결합분자, 특히 하나의 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 (즉, 약학적 용도에 적합한)첨가제, 및 임의로 하나 이상의 추가적 활성 물질을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 단일특이성 결합분자는 공지된 적합한 방법으로 제제화되어 투여될 수 있으며: 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대하여는, 예를 들어 다음 문헌을 참조할 수 있다: WO 2004/041862, WO 2004/041863, WO 2004/041865, WO 2004/041867 및 WO 2008/020079, 및 표준 핸드북, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); 또는 the Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (예를 들어 252-255쪽 참조).
예를 들어, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일반적 항체 및 항체 단편(ScFv것 및 다이아바디 포함) 및 다른 약학적으로 활성인 단백질에 대하여 공지된 방법으로 제제화되어 투여할 수 있다. 이러한 제제와 이를 제조하는 방법은 당업자들에게 명확하고, 예를 들어 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 관내(intraluminal), 동맥내 또는 척추강내 투여) 또는 국소(즉, 경피 또는 피내) 투여에 적합한 조제물을 포함한다.
비경구 투여용 조제물은, 예를 들어 주입 또는 주사에 적합한, 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀젼일 수 있다. 이러한 조제물을 위한 적합한 담체 또는 희석제는, 예를 들어 멸균수 및 약학적으로 허용가능한 수성 완충액 및 용액, 예를 들어 생리적 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 Hank 용액; 워터 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 미네랄 오일, 동물성 오일 및 식물성 오일, 예를 들어 땅콩유, 콩기름, 및 적합한 이들의 혼합물이나, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 단일특이성 결합분자는 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체 같은 약학적으로 허용가능한 비히클과 조합하여 전신, 예를 들어 경구로 투여할 수 있다. 경구적 치료 투여를 위하여, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 하나 이상의 첨가제와 조합하여, 섭취가능한 정제(ingestible tablet), 구강정(buccal tablet), 트로키(troches), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 조성물과 조제물은 적어도 0.1%의 본 발명의 Ang2-결합분자를 포함하여야 한다. 조성물과 조제물에서 이들의 비율은, 물론 변경할 수 있으며, 간편하게 약 2 내지 약 60 중량%의 주어진 단위 용량 형태일 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물에서 본 발명의 이중특이성 결합분자의 양은 유효 투여 농도가 얻어질 수 있는 정도이다.
정제, 알약, 캡슐 등은 또한 결합제, 첨가제, 붕해제, 윤활제 및 감미제 또는 풍미제를 포함할 수 있으며, 이들에 대하여는 WO 08/020079의 143-144쪽에 언급되어 있다. 단위 복용 형태가 캡슐일 경우, 이것은 상기한 종류의 물질 이외에 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서 또는 고체 단위 복용 형태의 물리적 형태를 달리 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락(shellac) 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 본 발명의 이중특이성 결합분자, 감미제로서 슈크로스 또는 프럭토스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리향 또는 오렌지향 같은 향미제를 함유할 수 있다. 임의의 단위 복용 형태를 제조하는데 사용되는 물질은 사용된 양에 있어서 당연히 약학적으로 허용가능하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 서방성 제제 및 장치와 결합될 수 있다.
경구 투여용 조제물과 제제는 또한 본 발명의 구조물이 위장의 환경을 견디고 장을 통과할 수 있는 장용 코팅정으로 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 경구 투여용 조제물과 제제는 위장관의 원하는 부위에 전달하기 위해 적합하게 제제화될 수 있다. 또한, 적합한 좌약제는 위장관으로의 전달을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 단일특이성 결합분자는 또한 WO 2008/020079의 144-145쪽에 상세히 기술된 바와 같이 주입 또는 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여될 수 있다.
본 발명의 단일특이성 결합분자의 국소 투여에 있어서, 일반적으로 이들을 WO 2008/020079의 145쪽에 상세히 기술된 바와 같이 고체 또는 액체일 수 있는, 피부과학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 로션 같은 액체 조성물 내에서 본 발명의 단일특이성 결합분자의 농도는 약 0.1-25 wt-%, 바람직하게 약 0.5-10 wt-%이다. 반고체, 또는 겔이나 분말 같은 고체 조성물 중 농도는 약 0.1-5 wt-%, 바람직하게 약 0.5-2.5 wt-%이다.
치료에 사용하는데 필요한 본 발명의 단일특이성 결합분자의 양은 선택된 특정한 단일특이성 결합분자뿐만 아니라 투여경로, 치료되는 상태의 성질 및 환자의 연령과 상태에 따라 달라지며, 궁극적으로 주치의 또는 임상의 재량에 따른다. 또한, 본 발명의 단일특이성 결합분자의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 그래프트 또는 기관에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 단일 용량 또는, 예를 들어 1일 당 2, 3, 4 이상의 하위(sub) 용량으로서 적절한 간격으로 투여되는 분할 투여로 편리하게 제공될 수 있다. 하위 용량 자체는, 예를 들어 별개의 대략적으로 분산된 다수의 투여로 추가 분할될 수 있으며; 취입기로부터의 복수 흡입 또는 눈에 여러 방울을 적용하는 것을 예로 들 수 있다.
투약요법은 장기 치료, 1일 치료를 포함한다. "장기"란 용어는 적어도 2 주, 바람직하게 수 주, 수 개월 또는 수 년간의 기간을 의미한다. 당업자들이라면 여기에서 실시방법이 제공된 일반적인 실험만을 사용하여 투여량 범위의 필요한 변형을 결정할 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA 참조. 또한, 합병증이 있는 경우에 개별 주치의는 투여량을 조절할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은, 예컨대 다음과 같은 치료 목적을 위한 본 발명의 단일특이성 결합분자, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이들을 함유하는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다:
- 신생혈관생성에 대한 Ang2-매개 및/또는 Ang2-관련 효과와 연관되거나 Notch 시그널링 경로 및/또는 Tie2 시그널링 경로를 본 발명에 따른 단일특이성 결합분자로 조절하여 예방, 치료 또는 완화될 수 있는, 특히 사람의 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 및/또는 완화;
- 적어도 하나의 본 발명의 단일특이성 결합분자, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 이를 함유하는 약학 조성물의 약학적으로 활성인 양을 상기한 요법이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기한 요법이 필요한 환자의 치료방법;
- 신생혈관생성에 대한 Ang2-매개 및/또는 Ang2-매개 효과와 연관된 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 완화를 위한 의약의 제조;
- 상기한 목적으로 사용된 약학 조성물 또는 의약의 활성 성분.
특정 측면에 따르면, 장애, 질환 또는 상태는 여기에서 정의된 바와 같은 암 또는 암성 질환이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 암 및 암성 질환, 예컨대 유방, 신장세포 암종, 난소암 및 췌장암의 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에 따르면, 질환은 신생혈관생성에 대한 Ang2-매개 및/또는 Ang2-매개 효과와 연관되거나, Notch 시그널링 경로 및/또는 Tie2 시그널링 경로를 단일특이성 결합분자로 조절하여 치료되거나 완화될 수 있는 안과 질환이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 연령관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막병증 같은 안과 질환의 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
치료될 암/암성 질환, 안과 질환 및/또는 만성 신장 질환에 따라, 본 발명의 단일특이성 결합분자는 그 자체 또는, 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 사용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 활성성분으로서 하나 이상의 상기한 Ang2-결합분자를 포함하고, 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 DNA 손상제와 같은 화학요법제 및/또는 암세포의 항유사분열약(예: 탁솔) 또는 신생혈관생성을 저해하는 치료적 활성 화합물(항혈관형성약, 예컨대 항-VEGF/VEGF 리셉터 저해제, 예를 들어 아바스틴, 니테다닙(nitedanib) 및 수니티닙), 또는 신호전달경로 저해제, 예컨대 mTOR 저해제(예: 템시롤리무스(temsirolimus)) 또는 호르몬 요법제(예: 타목시펜)를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
추가 치료제를 임의로 동일한 약학 조제물의 성분으로서 단일특이성 결합분자와 동시에, 또는 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.
특정 구체예에서, 추가 치료제는 EGFR, VEGF, VEGFR, HER2-neu, Her3, 오로라(Aurora)A, 오로라B, PLK 및 PI3 키나제, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R 또는 IR의 저해제로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 저해제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다(리셉터의 경우에 각 리간드 포함).
추가 치료제의 또다른 예는 CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90의 저해제, 헤지호그(hedgehog) 길항제, JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, 프로테아좀(proteasome), Rho의 저해제, wnt 시그널링의 저해제 또는 유비퀴틴화 경로의 저해제 또는 Notch 시그널링 경로의 다른 저해제이다.
오로라 저해제의 예는 PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735이나, 이에 한정되지는 않는다.
PLK 저해제의 예는 GSK-461364이다.
VEGF 저해제의 예는 아바스틴(Roche),아플리버셉트(aflibercept)(Regeneron)이다.
raf 저해제의 예는 BAY-73-4506(또한 VEGFR의 저해제이기도 함), PLX 4032, RAF-265(또한 VEGFR 저해제 추가), 소라페닙(sorafenib)(또한 VEGFR 저해제 추가), 및 XL 281이다.
KSP 저해제의 예는 이스피네십(ispinesib), ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, 및 SB-743921이다.
src 및/또는 bcr-abl 저해제의 예는 다사티닙(dasatinib), AZD-0530, 보수티닙(bosutinib), XL 228 (IGF-1R의 저해제이기도 함), 닐로티닙 (PDGFR 및 cKit의 저해제이기도 함), 이마티닙 (또한 cKit 저해제), 및 NS-187이다.
PDK1 저해제의 예는 BX-517이다.
Rho 저해제의 예는 BA-210이다.
PI3 키나제 저해제의 예는 PX-866, BEZ-235(mTor의 저해제이기도 함), XL 418(Akt의 저해제이기도 함), XL-147, 및 XL 765(mTor의 저해제이기도 함)이다.
cMet 또는 HGF의 저해제의 예는 XL-184(또한 VEGFR, cKit, Flt3의 저해제이기도 함), PF-2341066, MK-2461, XL-880(또한 VEGFR 저해제), MGCD-265 (또한 VEGFR, Ron, Tie2의 저해제), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, 및 AV-299이다.
c-Myc 저해제의 예는 CX-3543이다.
Flt3 저해제의 예는 AC-220 (또한 cKit 및 PDGFR의 저해제), KW 2449, 레스타우르티닙(lestaurtinib) (또한 VEGFR, PDGFR, PKC의 저해제), TG-101348 (또한 JAK2 저해제), XL-999 (또한 cKit, FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제), 서니티닙(sunitinib) (또한 PDGFR, VEGFR 및 cKit의 저해제), 및 탄두티닙(tandutinib) (또한 PDGFR, 및 cKit의 저해제)이다.
HSP90 저해제의 예는 타네스피마이신(tanespimycin), 알베스피마이신 (alvespimycin), IPI-504 및 CNF 2024이다.
JAK/STAT 저해제의 예는 CYT-997 (또한 투불린과 상호작용), TG 101348 (또한 Flt3의 저해제), 및 XL-019이다.
Mek 저해제의 예는 ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 및 XL 518이다.
mTor 저해제의 예는 템시롤리무스(temsirolimus), AP-23573 (또한 VEGF 저해제로서 작용), 에베롤리무스(everolimus)(또한 VEGF 저해제), XL-765(PI3 키나제 저해제) 및 BEZ-235(PI3 키나제 저해제이기도 함)이다.
Akt 저해제의 예는 페리포신, GSK-690693, RX-0201 및 트리시리빈 (triciribine)이다.
cKit 저해제의 예는 AB-1010, OSI-930(VEGFR 저해제로서도 작용), AC-220(Flt3 및 PDGFR의 저해제이기도 함.), 탄두티닙(Flt3 및 PDGFR의 저해제이기도 함), 악시티닙(axitinib)(VEGFR 및 PDGFR의 저해제이기도 함), XL-999 (Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR의 저해제이기도 함), 수니티닙(Flt3, PDGFR, VEGFR의 저해제이기도 함), 및 XL-820(VEGFR- 및 PDGFR 저해제로서도 작용), 이마티닙(또한 bcr-abl의 저해제), 닐로티닙(nilotinib)(또한 bcr-abl 및 PDGFR의 저해제)이다.
헤지호그 길항제의 예는 IPI-609 및 CUR-61414이다.
CDK 저해제의 예는 셀리시클립(seliciclib), AT-7519, P-276, ZK-CDK (VEGFR2 및 PDGFR을 저해하기도 함), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 및 AG 024322이다.
프로테아좀 저해제의 예는 보르테조밉, 카필조밉(carfilzomib), 및 NPI-0052 (또한 NFkappaB의 저해제이기도 함)이다.
NFkappaB 경로 저해제의 예는 NPI-0052이다.
유비퀴틴화 경로 저해제의 예는 HBX-41108이다.
바람직한 구체예에서, 추가 치료제는 항-혈관형성제이다.
항-혈관형성제의 예는 FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제 또는 각각의 리간드(예를 들어, 페가프타닙(pegaptanib) 같은 VEGF 저해제 또는 항-VEGF 항체 베바시주맵), 및 탈리도마이드이며, 이러한 제제는 베바시주맵, 모테사닙(motesanib), CDP-791, SU-14813, 텔라티닙(telatinib), KRN-951, ZK-CDK(CDK의 저해제이기도 함), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (면역조절제), 탈리도마이드 유도체 CC-4047, 레날리도마이드, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, 브리바닙(brivanib), 세디라닙, XL-999(cKit 및 Flt3의 저해제이기도 함), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530(Flt3의 저해제이기도 함), 수니티닙(cKit 및 Flt3의 저해제이기도 함), 악시티닙(cKit의 저해제이기도 함), 베무라페닙(vemurafenib) (PLX4032, RG7204 또는 R05185426으로도 알려짐, zelboraf로서 판매), B-Raf 효소 저해제, ALK(역형성 림프종 키나제) 및 ROS1(c-ros 온코젠1, 리셉터 티로신 키나제) 저해제로 알려진 크리조티닙(crizotinib), 레스타우르니팁 (lestaurtinib) (Flt3 및 PKC의 저해제이기도 함), 바탈라닙, 탄두티닙 (Flt3 및 cKit의 저해제이기도 함), 파조파닙(pazopanib), GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, 소라페닙 토실레이트 (Raf의 저해제이기도 함), RAF-265 (Raf의 저해제이기도 함), 반데타닙(vandetanib), CP-547632, OSI-930, AEE-788 (EGFR 및 Her2의 저해제이기도 함), BAY-57-9352 (Raf의 저해제이기도 함), BAY-73-4506 (Raf의 저해제이기도 함), XL 880 (cMet의 저해제이기도 함), XL647 (EGFR 및 EphB4의 저해제이기도 함), XL 820 (cKit의 저해제이기도 함), 및 닐로티닙 (cKit 및 brc-abl의 저해제이기도 함) 및 니테다닙에서 선택되나, 이에 한정되지는 않는다.
추가 치료제는 또한 소분자 EGFR 저해제 또는 항EGFR 항체일 수 있는 EGFR 저해제 중에서 선택될 수 있다. 항EGFR 항체의 예는, 비제한적으로 세툭시맵, 파니투무맵, 마투주맵이며; 소분자 EGFR 저해제의 예는 제피티닙이다. 다른 EGFR 조절제의 예는 EGF 융합 독소이다.
EGFR 및 Her2 저해제 중에는 라파티닙(lapatinib), 게피티닙, 에를로티닙, 세툭시맵, 트라스투주맵, 니모투주맵, 잘루투무맵, 반데타닙(또한 VEGFR의 저해제), 페르투주맵(pertuzumab), XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (또한 VEGFR의 저해제), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab이 본 발명의 이중특이성 결합분자와의 조합에 유용하다.
본 발명의 단일특이성 결합분자로의 치료요법에서 유리하게 조합될 수 있는 다른 약제는 토시투무맵(tositumumab) 및 이브리투모맵 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan) (2개의 방사능표지된 항-CD20 항체), 알렘투주맵(항-CD52 항체), 데노수맵(파골세포 분화인자 리간드 저해제), 갈릭시맵(CD80 길항제), 오파투무맵 (ofatumumab) (CD20 저해제), 자놀리무맵(CD4 길항제), SGN40(CD40 리간드 리셉터 조절제), 리툭시맵(CD20 저해제) 또는 마파투무맵(mapatumumab)(TRAIL-1 리셉터 작용제), 또는 OMP-21M18(DII4 저해제)이다.
본 발명의 이중특이성 결합분자와 조합하여 사용될 수 있는 다른 화학요법제는 호르몬, 호르몬 유사체 및 항호르몬제(예: 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 풀베스트란트, 메제스트롤 아세테이트, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 사이프로테론 아세테이트, 피나스테라이드, 부세렐린 아세테이트, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 메드록시프로제스테론, 옥트레오타이드, 아르족시펜, 파시레오타이드, 바프레오타이드), 아로마타제 저해제(예: 아나스트로졸, 레트로졸, 리아로졸, 엑세메스탄, 아타메스탄, 포메스탄), LHRH 작용제 및 길항제(예: 고세렐린 아세테이트, 로이프롤라이드, 아바렐릭스, 세트로렐릭스, 데슬로렐린, 히스트렐린, 트리프토렐린), 항대사물질(예: 항엽산제, 예를 들어 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 피리미딘 유사체, 예를 들어 5 플루오로유라실, 카페시타빈, 데시타빈, 넬라라빈 및 젬시타빈, 퓨린 및 아데노신 유사체, 예를 들어 머캅토퓨린 티오구아닌, 클라드리빈 및 펜토스타틴, 사이타라빈, 플루다라빈); 항종양 항생제(예: 안트라사이클린, 예를 들어 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 이다루비신, 미토마이신-C, 블레오마이신 닥티노마이신, 플리카마이신, 미토잔트론, 픽산트론, 스트렙토조신); 백금 유도체(예: 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 로바플라틴, 사트라플라틴); 알킬화제(예: 에스트라무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 다카바진, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 하이드록시우레아, 테모졸로마이드, 니트로소우레아, 예를 들어 카무스틴 및 로무스틴, 티오테파); 항유사분열제(예: 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, 빈플루닌 및 빈크리스틴; 및 탁산, 예를 들어 파클리탁셀, 도세탁셀 및 이의 제형, 라로탁셀; 시모탁셀 및 에포틸론, 예를 들어 익사베필론, 파투필론, ZK-EPO); 토포이소머라제 저해제(예: 에피포도필로톡신, 예를 들어 에토포사이드 및 에토포포스, 테니포사이드, 암사크린, 토포테칸, 이리노테칸) 및 다수의 화학요법제, 예를 들어 아미포스틴, 아나그렐리드, 인터페론 알파, 프로카바진, 미토탄 및 포르피머, 벡사로텐, 셀레콕시브 중에서 선택되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 이중특이성 결합분자의 특히 바람직한 조합 파트너는 VEGF 길항제, 예를 들어 베바시주맵(Avastin®), 니테다닙, 소라페닙 및 수니티닙이다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면,
a) 샘플을 위에서 정의된 바와 같은 본 발명의 결합분자와 접촉하고,
b) 결합분자와 샘플의 결합을 검출하고,
c) (b) 단계에서 검출된 결합을 표준물과 비교하고, 샘플에 대한 결합의 차이가 신생혈관생성에서 VEGF- 및/또는 Ang2-매개 효과와 연관된 질환 또는 장애의 진단인 것인, 질환의 진단방법을 제공한다.
이러한 용도와 다른 용도에 있어서, 본 발명의 단일특이성 결합분자를, 예를 들어 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합쌍 같은 특이적 결합쌍의 일부인 작용그룹을 삽입하는 등으로 추가 변성하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 작용그룹을 사용하여 본 발명의 결합분자를 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 결합쌍의 다른 절반에 결합된 화학적 화합물에, 즉 결합쌍을 형성하여 연결할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단일특이성 결합분자는 비오틴에 컨쥬게이트되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 다른 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 컨쥬게이트된 단일특이성 결합분자는 검출가능한 시그널 생성제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 진단 시스템 등에서 리포터로 사용될 수 있다.
본 발명의 단일특이성 결합분자 또는 폴리펩티드, 및 이것을 포함하는 조성물의 효능은 적합한 시험관내 어세이, 세포 기반 어세이, 생체내 어세이 및/또는 공지된 동물 모델 또는 이들의 조합을 사용하여 관심있는 특정 질환 또는 장애에 따라 시험할 수 있다. 적합한 어세이와 동물 모델은 당업자들에게 명확하며, 예를 들어 여기에 기술되고 이하의 실시예에서 사용된 어세이, 예를 들어 증식 어세이가 있다.
본 발명의 단일특이성 결합분자는 친화도 성숙, 인간화 및 잠재적인 후번역 변성 부위의 제거를 포함하는 풍부한(extensive) 서열 최적화 공정을 수행하여 사람에서의 낮은 면역원성 포텐셜과 향상된 생체물리학적 안정성을 확보한다. 예상외로, 데이터는 본 발명의 단일특이성 결합분자가 종래의 결합분자들의 특성보다 훨씬 우위인 것을 나타내었다. 이러한 특성 중에는, 예를 들어 도 9 내지 10, 13 내지 14, 16 내지 19의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같은 Ang1 중화와 비교하여 Ang2 중화에 대한 높은 선택성; 도 6, 9, 13, 16, 18 및 20과 표 12 내지 13, 16 내지 17, 20 내지 22의 ELISA 데이터 및, 예를 들어 표 7(실시예 7)에 나타낸 AlphaScreen 어세이에서 VHH에 대한 IC50 (nM) 값으로부터 알 수 있는 바와 같은 높은 역가에 의한 Ang2-Tie2 상호작용의 완벽한 저해; 및 표 8, 14, 18 및 23의 재조합 인간 Ang2, cyno Ang2, 마우스 Ang2에 대한 정제된 VHH의 친화도 KD (nM)가 있다.
이러한 사실은 본 발명의 단일특이성 결합분자가 신생혈관생성에서 Ang2-매개 효과와 연관된 질환 및 장애, 예컨대 암, 암성 질환, 안과 질환 및/또는 만성 신장 질환에서 치료효과를 갖는 유망한 후보물질임을 나타낸다.
도 1 내지 4, 6 내지 7, 9 내지 10, 12 내지 14 및 16 내지 20의 축 주석: X축은 OD 450 (nm)을 나타내고, Y축은 로그 경쟁자(M)을 나타낸다.
도 1(도 1a 내지 1g): hAng2-hTie2 상호작용을 차단하는 정제된 VHH(ELISA).
도 2(도 2a 내지 2g): mAng2-mTie2 상호작용을 차단하는 정제된 VHH(ELISA).
도 3(도 3a 내지 3b): cAng2-cTie2 상호작용을 차단하는 정제된 VHH(ELISA).
도 4(도 4a 내지 4i): hAng1-hTie2 상호작용을 차단하는 정제된 VHH(ELISA).
도 5: VHH 28D10의 친화도 성숙 변이체의 서열 배열. 아미노산 서열은 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 대해 배열되었다. 잔기들은 Kabat에 따라 넘버링되었고, CDR은 AbM 정의에 따라 굵게 표시하였다. 치환된 잔기들은 밑줄 표시하였다.
도 6(도 6a 내지 6c): hAng2-hTie2 상호작용을 차단하는 VHH 28D10의 정제된 친화도 성숙 변이체(ELISA).
도 7(도 7a 내지 7c): hAng1-hTie2 상호작용을 차단하는 VHH 28D10의 정제된 친화도 성숙 변이체(ELISA).
도 8(도 8a 내지 8b): hVH3-JH 컨센서스를 갖는 VHH 1D01 (A)과 VHH 1D01의 서열 최적화 변이체 (B)의 서열 배열. 아미노산 서열은 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 대해 배열되었다. 잔기들은 Kabat에 따라 넘버링되었고, CDR은 AbM 정의에 따라 굵게 표시하였다. 해당되는 인간 카운터파트로 돌연변이될 잔기들은 밑줄 표시하였다. 태클될 잠재적 후번역 변성부위는 박스로 표시하였다.
도 9(도 9a 내지 9f): hAng2-hTie2 (10-1), mAng2-mTie2 (10-2) 및 cAng2-cTie2 (11-3) 상호작용을 차단하는 VHH 1D01의 정제된 서열 최적화 변이체(ELISA).
도 10: hAng1-hTie2 상호작용을 차단하는 VHH 1D01의 정제된 서열 최적화 변이체(ELISA).
도 11 (도 11a 내지 11c): hVH3-JH 컨센서스를 갖는 VHH 37F02 (A), VHH 37F02의 사이클 1 (B) 및 사이클 2 (C) 서열 최적화 변이체의 서열 배열. 아미노산 서열은 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 대해 배열되었다. 잔기들은 Kabat에 따라 넘버링되었고, CDR은 AbM 정의에 따라 굵게 표시하였다. 상응하는 인간 카운터파트로 돌연변이될 잔기들은 밑줄 표시하였다. 태클될 잠재적 후번역 변성부위는 박스로 표시하였다.
도 12(도 12a 내지 12c): hAng2-hTie2 (14-1), mAng2-mTie2 (14-2) 및 cAng2-cTie2 (14-3) 상호작용을 차단하는 VHH 37F02의 정제된 사이클 1 서열 최적화 변이체(ELISA).
도 13(도 13a 내지 13d): hAng2-hTie2 (15-1), mAng2-mTie2 (15-2) 및 cAng2-cTie2 (15-3) 상호작용을 차단하는 VHH 37F02의 정제된 사이클 2 서열 최적화 변이체(ELISA).
도 14: hAng1-hTie2 상호작용을 차단하는 VHH 37F02의 정제된 사이클 2 서열 최적화 변이체(ELISA).
도 15(도 15a 내지 15d): hVH3-JH 컨센서스를 갖는 VHH 28D10 (A), VHH 28D10의 사이클 1 서열 최적화 변이체 (B), 사이클 2 변이체 (C) 및 사이클 3 (D) 서열 최적화 변이체의 서열 배열. 아미노산 서열은 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 대해 배열되었다. 잔기들은 Kabat에 따라 넘버링되었고, CDR은 AbM 정의에 따라 굵게 표시하였다. 상응하는 인간 카운터파트로 돌연변이될 잔기들은 밑줄 표시하였다. 태클될 잠재적 후번역 변성부위는 박스로 표시하였다.
도 16(도 16a 내지 16i): hAng2-hTie2 (18-1), mAng2-mTie2 (18-2) 및 cAng2-cTie2 (18-3) 상호작용을 차단하는 VHH 28D10의 정제된 사이클 1 서열 최적화 변이체(ELISA).
도 17(도 17a 내지 17b): hAng1-hTie2 상호작용을 차단하는 VHH 28D10의 정제된 사이클 1 서열 최적화 변이체(ELISA).
도 18(도 18a 내지 18d): hAng2-hTie2 (20-1), mAng2-mTie2 (20-2) 및 cAng2-cTie2 (20-3) 상호작용을 차단하는 VHH 28D10의 정제된 서열 최적화 C50X-S53X 변이체(ELISA).
도 19: hAng1-hTie2 상호작용을 차단하는 VHH 28D10의 정제된 서열 최적화 C50X-S53X 변이체(ELISA).
도 20(도 20a 내지 20i): hAng2-hTie2 (22-1), mAng2-mTie2 (22-2) 및 cAng2-cTie2 (22-3) 상호작용을 차단하는 VHH 28D10의 정제된 사이클 2 서열 최적화 변이체(ELISA).
실시예
재료 및 방법
a) 사람 또는 마우스 Tie2 리셉터를 과발현하는 HEK293H 안정한 세포라인의 생성
인간 Tie2(NM_000459.3; 서열번호: 182), 마우스 Tie2 (NM_013690.2; 서열번호: 183) 및 cyno Tie2 (서열번호: 184)를 코딩하는 cDNA를 pcDNA3.1-neo 발현벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 클론하였다. 인간 Tie2 또는 마우스 Tie2를 과발현하는 인간배아신장(HEK) 세포를 구축하기 위해 모체 HEK293H 세포를 pcDNA3.1-neo-hTie2 또는 pcDNA3.1-neo-mTie2 각각을 갖는 Fugene (Roche)으로 지질 매개 형질감염시켰다. 모든 조건에서, 형질감염체를 1 mg/mL 제네티신 (geneticin)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 형질감염한 2일 후에 선택하였다. 인간, 마우스 및 cyno Tie2에 대하여 최종 고발현 클론은 PE 표지화 항-인간 Tie2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, US), PE 표지화 항-마우스 Tie2 (eBioscience, San Diego, CA, USA) 및 2-스텝 염소-항-인간 Tie2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, US), 이어서 PE 표지화 당나귀-항-염소(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) 각각과 결합하는 단일세포 선별 클론에 의해 FACSAria Cell Sorter (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 선별되었다.
b) 마우스 또는 사이노몰거스 Ang2를 과발현하는 HEK293T 세포라인의 생성 및 재조합 마우스 또는 사이노몰거스 Ang2 조건 배지의 제조
N-말단 FLAG-태그(tagged) 마우스 Ang2 (NM_007426.3; 서열번호: 185) 및 사이노몰거스 Ang2(AB172643.1; 서열번호: 186)를 코딩하는 cDNA를 pSecTag2B 발현벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 클론하였다. 마우스 Ang2 또는 사이노몰거스 Ang2를 일시적으로 과발현하는 인간배아신장(HEK) 세포를 HEK293T 모체 세포 라인에서 pSecTag2B-mAng2 또는 pSecTag2B-cAng2 각각의 지질 매개 형질감염(Fugene; Roche)에 의해 생성하였다. 1.5 리터 CF10 주머니에서 제조하였으며, 1.5L 조건화 배지(CM)를 형질감염 5일 후에 수집하였다.
c) HEK293-F 세포에서 재조합 사이노몰거스 Tie2/Fc 키메라(chimera)의 제조
Tie-2의 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA를 발현 플라스미드 pSecTag2b에 적절한 제한부위를 사용하여 Fc-융합 단백질을 생성하기 위해 서브클론하였다. 제조자가 기술한 바에 따라 플라스미드의 Megaprep (Qiagen) 제조물, Optimem-Medium (Invitrogen), 293-펙틴 (Invitrogen)을 사용하여 1 x 106 생균/mL의 초기 세포밀도에서 1 μg 플라스미드 DNA/106 세포로 HEK293-F 세포(Invitrogen) 내로의 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크에서 7일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 조건화 배지(CM)를 4000 g으로 10분 동안 원심분리하여 모아서 멸균 필터 (0.45μm 멤브레인)로 여과하였다.
Fc-융합 단백질을 DPBS로 평형화된 5 ml MabSelect SuRe Protein A 컬럼에 5 ml/min으로 CM을 적하하여 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. DPBS를 사용한 세척 단계 후, 결합된 Fc-단백질을 10 mM 시트르산나트륨 완충액 pH 3.0으로 용출하고, 이어서 1 M Tris/HCl pH 8.0을 첨가하여 pH 7.0으로 중화하였다. 정제된 단백질을 Millipore Amicon Ultra (10 kDa 분자량 컷오프) 원심분리 농축기를 사용하여 농축 및 DPBS로 완충액 교환하였다. 표준분석 방법으로 단백질의 존재를 확인하였다(Experion Pro 260 kit-BioRad에 의한 전기영동; 질량분광측정법). 추가로 단백질을 크기배제크로마토그래피로 분석하여 내독소 함량을 측정하였다(Endosafe PTS kit - Charles River).
d) HEK293-F 세포에서 재조합 인간, 사이노몰거스, 마우스 및 래트 Ang2-FLD의 제조
Tie2-Fc-융합 단백질에 대해 기술된 바와 같이 분자 클로닝과 세포 배양을 수행하였다. His-태그 단백질의 정제를 위해, CM을 DPBS로 평형화된 2 ml Ni2 + 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 컬럼(His-Trap - GE Healthcare Life Sciences)에 5 ml/min으로 적하하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 4% 용출 완충액(DPBS + 0.5% 이미다졸)의 존재 하에 적하한 후, 컬럼을 DPBS로 세척하였다. Ang2-FLD-단백질을 0.5% 이미다졸을 함유하는 DPBS로 컬럼으로부터 용출하였다. 이어서, 농축과 완충액 교환을 위해 한외여과 단계를 수행하였다(10 kDa 분자량 컷오프). 단백질 분액을 Tie2-Fc에 대해 기술한 바와 같이 분석 특성화를 위해 보관하였다.
실시예 1
재조합 인간 Ang2를 사용한 면역화는 라마에서 체액성 면역반응을 유발한다
1.1 면역화
Ethical Committee of the faculty of Veterinary Medicine (University Ghent, Belgium)의 승인 후에 4마리의 라마(지정번호 406, 408, 454,455)를 재조합 인간 Ang2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, US)의 4회 근육내 주사(0일: 50 μg, 14일: 20 μg, 28일: 17.5 μg 및 42일: 17.5 μg 투여)로 면역시켰다. 항원은 0일째의 최초 주사액용 Complete Freund 보조제(Difco, Detroit, MI, USA), 및 부스터(booster) 주사액용 Incomplete Freund 보조제(Difco, Detroit, MI, USA)에 배합하였다.
1.2 라마에서 유도된 면역반응의 평가
ELISA에 의해 인간 Ang2에 대한 동물에서의 면역반응 유도를 평가하기 위해, 혈청을 0일(면역 전), 35일 및 46일(말초혈액 림프구[PBL] 수집 시기)에 수집하였다. 요컨대, 1　μg/mL의 재조합 인간 Ang2(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 4 ℃, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 밤새 고정화하였다. 웰을 카제인 용액(PBS + 1% 카제인)으로 블로킹하였다. 연속 혈청 희석물을 첨가한 후, 특이적으로 결합된 면역글로불린을 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트 염소 항-라마 면역글로불린(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) 및 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘)(Pierce, Rockford, IL, USA) 기질 존재 하의 후속 효소반응을 사용하여 검출하였으며, 인간 Ang2에 대한 면역반응에 따른 상당한 항체가 유도된 것으로 나타났다. 항체 반응은 B-세포 레퍼토리를 발현하는 일반적 및 중쇄 단독 항체로 개시되는데, 왜냐하면 결합된 면역글로불린이 일반적 라마 IgG1 항체 또는 중쇄 단독 라마 IgG2 또는 IgG3 항체를 특별하게 인식하는 항체로 검출될 수 있기 때문이다. 인간 Ang2가 주사된 모든 라마에서 항체 반응은 특히 인간 Ang2에 대해 B-세포를 발현하는 일반적 및 중쇄 단독 항체로 개시되었다. 각 라마에 대한 Ang2 혈청 역가를 표 1에 나타내었다.
Figure pct00006

실시예 2
중쇄만의 항체 단편 레퍼토리의 클로닝 및 파지 제조
최종 면역원 주사 후에, 중쇄 항체를 생산하는 B-세포의 공급원인 면역조직을 면역된 라마에서 수집하였다. 전형적으로, 최종 항원 주사 후 4일과 10일째에 수집된 2개의 150 ml 혈액샘플, 및 최종 항원 주사 후 4일째에 수집된 하나의 림프절 생검을 각 동물에서 수집하였다. 혈액샘플에서 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 Ficoll-Hypaque를 사용하여 제조업자(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)의 설명서에 따라 제조하였다. PBMC와 림프절 생검(406번 라마에서 비검출(not prelevate))으로부터, 전체 RNA를 추출하고, RT-PCR의 출발물질로 사용하여 VHH를 코딩하는 DNA 세그먼트를 WO 2005/044858의 실시예 3(46쪽)에 기술된 바와 같이 증폭하였다. 각각의 면역된 라마에 대하여 수집된 이 동물의 모든 면역 조직으로부터 단리된 전체 RNA를 모아서 라이브러리를 구성하였다. 요컨대, PCR로 증폭된 VHH 레퍼토리를 특이적 제한부위에 의해 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진하기 위해 설계된 벡터에 클론하였다. 이 벡터는 pUC119에서 유도되었으며 LacZ 프로모터, M13 파지 gIII 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카베니실린에 대한 저항성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열을 함유하였다. VHH 코딩 서열을 가지는 프레임에서 벡터는 C-터미널 c-myc 태그와 His6 태그를 코딩한다. 파지는 표준방법에 따라 제조되고 추후 사용을 위해 4 ℃에서 멸균여과한 후 보관하였다.
실시예 3
파지 디스플레이에 의한 Ang2 특이적 VHH 의 선별
모든 라마에서 수득하여 파지 라이브러리로서 클론된 VHH 레퍼토리를 다양한 선택 조건을 적용하는 상이한 선택전략에서 사용하였다. 변수들은 다음과 같다: i) Ang2 단백질 포맷: 비오틴화(biotinylated) C-말단 His-태그 전장 재조합 인간 Ang2(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 C-말단 His-태그 전장 마우스 Ang2(GeneArt, 현 Invitrogen 제조, Carlsbad, CA, USA), ii) Ang2 프레젠테이션 방법: 플레이트를 마우스 Ang2로 직접 코팅하거나 비오틴화 인간 Ang2를 함유하는 용액 중에서 인큐베이션한 후, Neutravidin 코팅 플레이트에 캡쳐링, iii) 항원 농도. 모든 선별은 96 웰 Maxisorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, 독일)에서 수행하였다.
다회의 선별은 다음과 같이 수행되었다: 고체 및 용액상 선별 포맷을 위한 Ang2 제조물은 상기한 바와 같이 여러 가지 농도(비오틴화 인간 Ang2: 50, 5, 0.5, 0.05 및 0.005 nM; 마우스 Ang2: 10, 1, 0.1 및 0.01 g/mL)로 제공되었다. 파지 라이브러리와 2h 인큐베이션하고 충분히 세척한 후, 결합된 파지를 트립신(1 mg/mL)으로 15-30분 동안 실온에서 용출하였다. 이후, 트립신 활성을 0.8 mM 프로테아제 저해제 ABSF를 가하여 즉시 중화하였다. 백그라운드 대조군으로서 선별 w/o 항원을 동시에 수행하였다. 백그라운드에서 농축을 나타내는 파지 결과물을 사용하여 E. coli를 감염시켰다. 감염된 E. coli 세포를 다음 선별단계(파지 복구)에서 파지를 제조하기 위해 사용하거나, 개별 VHH 클론의 분석을 위한 LB 아가 플레이트(암피실린+글루코스2%)에 도말하였다. 특이적 결합제 또는 차단제에 대한 선별 결과물을 스크린하기 위해 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 추출하여 1 mL 96-딥웰 플레이트에서 배양하였다. LacZ-조절된 VHH 발현을 글루코스 부재 하에 IPTG (최종 0.1-1mM)를 첨가하여 유발하였다. 주변세포질 추출물(~80 μL의 부피)을 (예를 들어, 본 원에서 인용된 WO 2006/040153에 기술된)표준방법에 따라 제조하였다. 요컨대, 배양물을 15분 동안 4,500 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 밤새 또는 1시간 동안 -20 ℃에서 동결하였다. 다음으로, 펠렛을 실온에서 40분 동안 해동하고 15 ml peri 완충액(50 mM NaHP04, 300 mM NaCI)에 재현탁하여 1시간 동안 진탕하였다. 주변세포질 분획을 20분 동안 14000 rpm으로 원심분리하여 단리하였다.
실시예 4
Ang2 - Tie2 및 Ang1 - Tie2 ELISA 및 AlphaScreen 경쟁 어세이에서 주변세포질 추출물의 스크리닝
발현된 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 인간 Ang2-인간 Tie2 AlphaScreen 경쟁 어세이에서 스크린하여 그의 블로킹 능력을 평가하였다. 요컨대, 인간 Tie2/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 비오틴의 N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르를 사용하여 비오틴화하였다. FLAG 태그된 인간 Ang2(Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA)를 항-FLAG M2 항체(Sigma, St Louis, MO, USA)로 코팅된 Acceptor 비즈(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)를 사용하여 캡처하였다. 인간 Ang2의 그의 리셉터 인간 Tie2와의 결합을 저해하는 VHH의 능력을 평가하기 위하여, 발현된 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물의 1:25 희석물을 0.1 nM FLAG 태그된 인간 Ang2와 인큐베이션하였다. 이 혼합물에 Acceptor 비즈와 0.3 nM 비오틴화 인간 Tie2/Fc 키메라를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 스트렙타비딘 컨쥬게이트된 도너 비즈(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)를 첨가하고, 이 혼합물을 추가 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 어세이 완충액은 PBS + 0.03% Tween-20 + 0.1 % BSA였다. 형광을 680 nm의 여기 파장과 520 nm의 방출 파장을 사용하는 Envision Multilabel Plate 판독기(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 형광 시그널의 감소는 인간 Ang2와 인간 Tie2의 결합이 주변세포질 추출물에서 발현된 VHH에 의해 블로킹된 것을 의미한다. 인간 Ang2-인간 Tie2 상호작용을 적어도 50% 블로킹할 수 있는 VHH를 확인적 ELISA 기반 경쟁 어세이에서 스크린하였다. 또한, 마우스 Ang2와 결합하는 교차 반응성과 인간 Ang1에 대한 선택성도 경쟁 ELISA에서 평가하였다. 요컨대, 인간 또는 마우스 Tie2/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 2 μg/mL로 밤새 4 ℃에서 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, 독일)에 고정하였다. 웰을 1% 카제인 용액으로 블로킹하였다. 발현된 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물의 1:5 희석물을 어세이 종류에 따라 다음 Ang종과 인큐베이션하였다: 0.02 nM FLAG 태그된 인간 Ang2, FLAG 태그된 마우스 Ang2를 함유하는 HEK293 조건화 배지의 1:3,000 희석물 또는 0.02 nM FLAG-태그된 인간 Ang1(Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA). 이 혼합물을 Tie2/Fc 코팅된 웰에 첨가하여 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
Ang의 남은 결합을 HRP-컨쥬게이트 항-FLAG M2 항체(Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 검출하였다.
두 번째 스크리닝 사이클에서, 높은 다양성의 마우스 Ang2 교차 반응성 블로킹 VHH를 얻는 선별 결과물의 발현된 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 1:300 희석으로 스크리닝하였다. 인간 Ang2와 인간 Tie2, 마우스 Ang2와 마우스 Tie2의 결합을 저해하고 인간 Tie2와 결합하는 인간 Ang1의 저해를 나타내지 않는 VHH를 선별하였다. 서열 분석 결과, 38개의 상이한 B-세포 계통에 속하는 86개의 고유 VHH가 나타났다. 각각의 B-세포 계통, 대표 VHH 및 사용된 선별 조건으로 확인된 고유 서열 변이체의 전체 수를 표 2에 기재하였다. AlphaScreen 및 ELISA 기반 스크리닝 데이터의 개요를 표 3에 기재하였다. 모든 고유 VHH의 아미노산 서열을 서열목록(서열번호: 1내지 86)과 표 4에 나타내었다.
Figure pct00007

Figure pct00008

Figure pct00009
Figure pct00010

Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014

Figure pct00015

Figure pct00016

Figure pct00017

Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021

Figure pct00022

Figure pct00023

Figure pct00024

Figure pct00025

실시예 5
정제된 항- Ang2 VHH 의 특성화
실시예 4에 기술된 스크리닝으로부터 선별된 저해성 항-Ang2 VHH의 서브세트를 다시 정제하여 특성화하였다. 선별된 VHH는 E. coli TG1에서 c-myc, His6-태그 단백질로서 발현되었다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 37 ℃에서 4시간 동안 계속하였다. 세포 배양물을 스피닝한 후, 주변세포질 추출물을 펠릿을 동결-융해하여 제조하였다. 이들 추출물을 출발물질로 사용하여 VHH를 IMAC 및 크기배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하였으며, SDS-PAGE에 의한 평가 결과 ≥ 95%의 순도를 나타냈다.
5.1 ELISA에서 hAng2 블로킹 VHH의 평가
VHH의 블로킹 능력을 인간 Ang2-인간 Tie2 블로킹 ELISA에서 평가하였다. 요약하면, 2 μg/mL의 Tie2/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, 독일)에 코팅하였다. 고정 농도의 0.02 nM FLAG-태그 인간 Ang2 (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA)를 정제된 VHH (PBS+0.1 % 카제인+0.05% Tween-20으로 희석)의 연속 희석물에 첨가하고, 코팅된 인간 Tie2 리셉터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이트 항-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 인간 Ang2의 잔류 결합을 검출하였다(도 1). 참조 분자는 Ab536의 Fab 단편 (US2009/0191212)(도 1a-1d) 또는 펩티바디 AMG386의 펩티드 잔기(서열번호: 25 WO2004/092215) (도 1e-1g)이다. 음성 대조군으로는 무관한 VHH가 사용되었다. 인간 Ang2-인간 Tie2 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값은 표 5-1 및 표 5-2에 각각 기재하였다.
Figure pct00026
Figure pct00027

5.2 블로킹 ELISA에서 마우스 및 사이노몰거스 Ang2에 대한 교차 반응성 평가
VHH가 마우스 Ang2와 마우스 Tie2 및 cyno Ang2와 cyno Tie2의 결합을 저해하는지 측정하기 위해 경쟁 ELISA를 수행하였다. 요약하면, 2 μg/mL의 재조합 마우스 Tie2-Fc 또는 cyno Tie2-Fc를 밤새 4 ℃에서 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 코팅된 웰을 1% 카제인 용액으로 블로킹하였다. FLAG-태그 마우스 Ang2 (일시적 HEK 형질감염에서 유래한 조건화 배지의 1:3,000 희석물) 또는 FLAG-태그 cyno Ang2 (일시적 HEK 형질감염에서 유래한 조건화 배지의 1:800 희석물) 및 정제된 VHH의 연속 희석물(PBS+0.1 % 카제인+0.05% Tween-20으로 희석)을 코팅된 Tie2-Fc 리셉터에서 2시간 동안 실온으로 인큐베이션하여 결합 평형을 얻었다. HRP 컨쥬게이트 항-FLAG M2 mAb(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 FLAG-mAng2 또는 FLAG-cAng2의 잔류 결합을 검출하였다. 참조 분자는 Ab536의 Fab 단편 (마우스: 도 2a 내지 2d) 또는 펩티바디 AMG386의 펩티드 잔기(마우스: 도 2e 내지 2g; cyno: 도 3)이다. 음성 대조군으로는 무관한 VHH가 사용되었다. 마우스 Ang2-마우스 Tie2 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값은 표 6-1에 기재하였다. 마우스 및 cyno Tie2와 각각 결합하는 마우스 및 cyno Ang2를 블로킹하는 VHH의 IC50값은 표 6-2에 기재하였다.
Figure pct00028
Figure pct00029
5.3 ELISA에서 인간 Ang1에 대한 인간 Ang2 블로킹 VHH의 선택성 평가
항-Ang2 블로킹 VHH가 인간 Tie2에 결합하는 인간 Ang1에 대해 선택적인지를 측정하기 위해 경쟁 ELISA를 수행하였다. 요약하면, 2 μg/mL의 재조합 인간 Tie2-Fc(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 밤새 4 ℃에서 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 코팅된 웰을 1% 카제인 용액으로 블로킹하였다. 고정 농도(0.02 nM)의 FLAG-태그 재조합 인간 Ang1(Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA)과 VHH의 연속 희석물(PBS+0.1 % 카제인+0.05% Tween-20으로 희석)을 코팅된 리셉터 Tie2-Fc에서 2시간 동안 실온으로 인큐베이션하여 결합 평형을 얻었다. HRP 컨쥬게이트 항-FLAG M2 mAb를 사용하여 FLAG-hAng1의 잔류 결합을 검출하였다. 참조 분자는 AMG386 펩티바디의 펩티드 잔기(도 4)이다. 음성 대조군으로는 무관한 VHH가 사용되었다. 인간 Ang1 - 인간 Tie2 상호작용을 블로킹하는 VHH의 예시적 IC50값은 표 7에 기재하였다.
Figure pct00030
5.4 인간, 마우스, cyno Ang2 - VHH 상호작용의 친화도 결정
인간, 마우스 및 cyno Ang2에 결합하는 VHH의 친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석(Biacore T100)을 사용하여 측정하였다. 요컨대, VHH와 벤치마크 화합물을 아민 커플링을 통해 CM5 칩에 고정하였다. 멀티 사이클 동역학적 방법이 사용되었다: 상이한 농도의 인간, 마우스 및 Ang2-FLD (0.4-1-2.6-6.4-16-40-100 nM)를 주입하였다. Ang2-FLD 종을 2분 동안 결합하고 20분 동안 45 μL/min 유속으로 해리되도록 하였다. 주입 사이에 표면은 25 mM NaOH의 10초 펄스와 60초 안정화 기간으로 재생되었다. 결합/해리 데이터를 1:1 상호작용 모델(Langmuir binding)을 피팅(fitting)하여 평가하였다. 친화도 상수 KD를 얻어진 결합 및 해리 속도상수 ka 및 kd로부터 계산하여 표 8에 기재하였다.
Figure pct00031

실시예 6
선택된 VHH 의 친화도 성숙
VHH 28D10의 변이체(C50S/S53N 및 Q108L 치환을 수반하는 00027 - 실시예 7.3)에 대하여 친화도 성숙을 수행하였다. 제1 사이클에서, 아미노산 치환을 무작위로 프레임워크(FW)와 상보성결정영역(CDR)에 실수유발(error-prone) PCR 방법을 사용하여 삽입하였다. 1 ng의 VHH 00027 cDNA 템플레이트로 Genemorph II Random Mutagenesis 키트(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 2회 PCR 기반 방법으로 돌연변이를 수행한 다음, 1회차의 생성물 0.1 ng을 사용하는 제2 실수유발 PCR을 수행하였다. 폴리싱 단계 후에, PCR 생성물을 고유의 제한부위에 의해 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진하도록 설계된 벡터에 삽입하였다. 감소된 농도의 비오틴화 재조합 인간 Ang2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 트립신 용출을 사용하여 용액 중(in-solution) 선별의 연속 라운드를 수행하였다. 주변세포질 추출물(~ 80 uL 부피)을 표준 방법에 따라 제조하고 ProteOn (BioRad, Hercules, CA, USA) 오프율 어세이에서 재조합 인간 Ang2-FLD와의 결합을 스크린하였다. 요컨대, GLC ProteOn Sensor 칩을 "리간드 채널" L3, L4, L5 및 L6(참조 채널: L1/L2)에서 재조합 인간 Ang2-FLD로 코팅하였다. 친화도 성숙 클론의 주변세포질 추출물을 1:10으로 희석하고 "측정물질 채널" A1-A6에 주입하였다. 평균 오프율은 친화도 성숙 VHH와 같은 방법으로 제조 및 시험된 참조 VHH 00027에 대해 계산하여 오프율 개선을 계산하기 위한 레퍼런스로 사용하였다. 상위 25 친화도 성숙 변이체를 표 9에 기재하였다. VHH를 서열화(표 10-A)하고 오프율 향상에 유리한 아미노산 돌연변이를 동정하였다(표 10-B).
Figure pct00032

먼저, Kabat 위치 27, 29, 100b 및 10Oi에 돌연변이의 조합을 함유하는 12 VHH 변이체(표 11; 도 5)를 구성하였다. 이러한 4 돌연변이의 상이한 조합을 추가의 D54G 치환(실시예 6.3)을 함유하는 서열 최적화 VHH 00042 주쇄(도 17b)에 그래프팅하였다. 아미노산 서열을 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 배열하였다. 잔기들을 Kabat에 따라 넘버링하였고, CDR은 AbM 정의(Oxford 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어)에 따라 회색으로 표시하였다. 구조물을 C-말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 갖는 프레임의 발현벡터 pAX100에 클론하였다. VHH 변이체를 E. coli에서 생산하여 IMAC 및 SEC로 정제하였다. 서열을 표 11에 나타내었다. 이러한 VHH 모두를 hAng2/hTie2(실시예 5.1; 도 6과 표 12에 나타낸 결과), 및 hAng1/hTie2 경쟁 ELISA(실시예 5.3; 도 7과 표 12에 나타낸 결과)로 분석하였다. 또한, pH 7에서의 각 변이체의 용융 온도(Tm)를 Sypro Orange (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 결합시 형광 시그널의 온도에 따른 변화를 기초로 하는 열 이동 어세이로 측정하였다(Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), pp289-298) (표 12).
Figure pct00033

Figure pct00034

Figure pct00035

Figure pct00036

Figure pct00037

Figure pct00038

Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041

Figure pct00042
포텐시로부터, Tm과 서열 관점 VHH 00908은 조합된 친화도 성숙과 서열 최적화의 제2 사이클에서 사용되었다(실시예 7.3)
실시예 7
선택된 VHH 1 D01 , 28 D10 및 37F02의 서열 최적화
7.1 VHH 1D01
항-Ang2 VHH 1D01의 아미노산 서열(도 8a 참조)을 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 배열하였다. 잔기들을 Kabat에 따라 넘버링하였고, CDR은 AbM 정의(Oxford 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어)에 따라 회색으로 표시하였다. 상응하는 인간 카운터파트로 돌연변이될 잔기들을 밑줄 표시하였다. 태클(tackle)될 잠재적인 후번역 변성부위는 박스 표시하였다. 배열은 참조 생식세포 서열에 대해 6프레임워크 돌연변이를 함유하는 1D01을 나타내었다. 위치 14, 41, 71, 74, 83 및 108의 비인간 잔기들을 상응하는 인간 생식세포 카운터파트로의 치환을 위해 선택하였다. 이러한 위치에 인간 잔기들의 상이한 조합을 갖는 7개의 1D01 변이체 한 세트(도 8b)를 구성하여 제조하였다(실시예 5). 동시에, 이러한 7개 변이체 중 3개에서 위치 D54G55의 잠재적인 Asp 이성체화 부위를 D54G 치환을 삽입하여 제거하고, 이러한 7개 변이체 중 1개에서 위치 E1의 잠재적 pyroGlu 형성 부위를 E1D 치환으로 제거하였다(AA 서열을 표 15에 나열하였다).
이들 변이체를 정제된 단백질로서 인간(도 9a-9b), 마우스(도 9c-9d) 및 cyno(도 9c-9f) Ang2/Tie2 경쟁 ELISA (실시예 5.1; 실시예 5.2), hAng1/hTie2 경쟁 ELISA(실시예 5.3; 도 10)에서 특성화하였다. 또한, 각 변이체의 용융 온도(Tm)를 열 이동 어세이(실시예 6)로 측정하였다. 데이터의 개요는 표 13에서 확인할 수 있다. 또한, 인간 생식세포에 대한 FR 일치율(%)은 AbM 정의(Oxford 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어)에 따라 계산하였다. 사람, cyno, 마우스 및 래트 Ang2에 대한 VHH 00921의 친화도를 표 14에 나타내었다(실시예 5.4).
Figure pct00043

Figure pct00044

Figure pct00045
Figure pct00046

7.2 VHH 37F02
항-Ang2 VHH 37F02의 아미노산 서열(도 12a 참조)을 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 배열하였다. 잔기들을 Kabat에 따라 넘버링하였고, CDR은 AbM 정의(Oxford 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어)에 따라 회색으로 표시하였다. 상응하는 인간 카운터파트로 돌연변이될 잔기들을 밑줄 표시하였다. 태클(tackle)될 잠재적인 후번역 변성부위는 박스 표시하였다. 배열은 참조 생식세포 서열에 대해 4프레임워크 돌연변이를 함유하는 37F02를 나타내었다. 위치 60, 74, 83 및 108의 비인간 잔기들을 상응하는 인간 생식세포 카운터파트로의 치환을 위해 선택하였다. 동시에, 위치 D54G55의 잠재적인 Asp 이성체화 부위를 D54G 치환을 삽입하여 제거하였다. 이 위치들에 인간 잔기들의 상이한 조합을 갖는 3개 사이클 1 37F02 변이체 세트(도 12b)를 구성하여 제조하였다(실시예 5: AA 서열을 표 21-1에 나열하였다).
이들 변이체를 정제된 단백질로서 인간(도 12a), 마우스(도 12b) 및 cyno(도 12c) Ang2/Tie2 경쟁 ELISA (실시예 5.1; 실시예 5.2)에서 특성화하였다. 또한, 각 변이체의 용융 온도(Tm)를 열 이동 어세이(실시예 6)로 측정하였다. 데이터의 개요는 표 16에서 확인할 수 있다. 또한, 인간 생식세포에 대한 FR 일치율(%)은 AbM 정의(Oxford 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어)에 따라 계산하였다.
Figure pct00047
NNK 라이브러리 방법을 사용하여 2개의 잠재적 후번역 변성부위를 CDR3에서 넉아웃(knock out)하였다: i) 위치 100e에서의 산화 민감성 Met 및 ii) 위치 D95S96에서의 Asp 이성체화 부위. D54G가 용인되고 있으므로(VHH 00046 및 00920; 표 16 및 표 17) 이러한 잠재적 Asp 이성체화 부위를 넉아웃하기 위해 NNK 방법은 사용되지 않았다. 말단에서, 위치 D95, S96 및 M100e의 치환을 다른 모든 아미노산에 전달하는 VHH 클론을 함유하는 3 NNK 라이브러리를 hAng2/hTie2 경쟁 AlphaScreen 어세이(실시예 2)에서 스크린하였다. 요컨대, 발현된 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 3개의 상이한 희석물(대략 모체 VHH 37F02의 EC20, EC50 및 EC80에 해당)에서 스크리닝하고, 상이한 희석 포인트에서의 저해율(%) 변화를 모체 37F02와 비교하였다. 스크리닝 결과와 표 17에 나타낸 데이터에 기초하여 8개 추가 사이클 2 VHH 변이체를 (VHH 00920 주쇄를 기초로)구성하여 D95S96 및 M100e의 상이한 넉아웃 조합물을 수반하였다(도 11c; AA 서열은 표 19-2에 나열하였다).
이들 변이체 모두를 정제된 단백질로서 인간 (도 13a-13b), 마우스 (도 12b) 및 cyno (도 12c) Ang2/Tie2 경쟁 ELISA (실시예 5.1; 실시예 5.2)), hAng1/hTie2 경쟁 ELISA (실시예 5.3; 도 14)에서 특성화하였다. 또한, 각 변이체의 용융 온도(Tm)를 열 이동 어세이(실시예 6)로 측정하였다. 데이터의 개요는 표 17에서 확인할 수 있다. 또한, 인간 생식세포에 대한 FR 일치율(%)을 계산하였다. 인간, 마우스, cyno 및 래트 Ang2에 대한 VHH 00928의 친화도를 표 18에 나타내었다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051

Figure pct00052

7.3 VHH 28D10
항-Ang2 VHH 28D10의 아미노산 서열(도 15a 참조)을 인간 생식세포 VH3/JH 컨센서스 서열에 배열하였다. 잔기들을 Kabat에 따라 넘버링하였고, CDR은 AbM 정의(Oxford 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어)에 따라 회색으로 표시하였다. 상응하는 인간 카운터파트로 돌연변이될 잔기들을 밑줄 표시하였다. 태클(tackle)될 잠재적인 후번역 변성부위는 박스 표시하였다. 배열은 참조 생식세포 서열에 대해 5프레임워크 돌연변이를 함유하는 28D10을 나타내었다. 위치 14, 71, 74, 83 및 108의 비인간 잔기들을 상응하는 인간 생식세포 카운터파트로의 치환을 위해 선택하였다. 동시에, 위치 D54G55의 잠재적인 Asp 이성체화 부위를 D54G 치환을 삽입하여 제거하였다. 위치 50의 자유 시스테인은 Ala, Thr 또는 Ser로 치환하여 제거하였다. 말단에서, 인간 잔기들의 상이한 조합을 갖는 11개 사이클 1 28D10 변이체 세트를 구성하여 제조하였다(도 15b 참조: AA 서열을 표 24-1에 나열하였다).
이들 변이체를 정제된 단백질로서 인간(도 16a-16c), 마우스(도 16d-16f) 및 cyno(도 16g-16i) Ang2/Tie2 경쟁 ELISA(실시예 5.1; 실시예 5.2), hAng1/hTie2 경쟁 ELISA (실시예 5.3; 도 17)에서 특성화하였다. 또한, 각 변이체의 용융 온도(Tm)를 열 이동 어세이(실시예 6)로 측정하였다. 데이터의 개요는 표 20에서 확인할 수 있다. 또한, 인간 생식세포에 대한 FR 일치율(%)을 계산하였다.
Figure pct00053
변이체의 다른 세트(사이클 2)를 만들어서 위치 A24V에서 친화도 성숙 치환을 탐색하고 C50X-S53X 변이체를 추가로 탐색하였다(표 21; 도 15c; AA 서열은 표 23-4-2에 나열하였다). 이들 변이체를 정제된 단백질로서 인간 (도 18a-18b), 마우스 (도 18c) 및 cyno (도 18d) Ang2/Tie2 경쟁 ELISA (실시예 5.1; 실시예 5.2)), hAng1/hTie2 경쟁 ELISA (실시예 5.3; 도 19)에서 특성화하였다. 또한, 각 변이체의 용융 온도(Tm)를 열 이동 어세이(실시예 6)로 측정하였다.
Figure pct00054
동시에, NNK 라이브러리 방법을 사용하여 2개의 후번역 변성부위를 CDR2에서 넉아웃(knock out)하였다: 위치 D52aS53과 D54G55에서의 2개의 순차적 Asp 이성체화 부위. D54G가 용인되고 있으므로(실시예 6; 표 20) 이러한 잠재적 Asp 이성체화 부위를 넉아웃하기 위해 NNK 방법은 사용되지 않았다. 말단에서, 위치 D52a와 S53의 치환을 다른 모든 아미노산에 전달하는 VHH 클론을 함유하는 2 NNK 라이브러리를 hAng2/hTie2 경쟁 AlphaScreen 어세이(실시예 2)에서 스크린하였다. 요컨대, 발현된 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 3개의 상이한 희석물(대략 레퍼런스 00902의 EC20, EC50 및 EC80에 해당)에서 스크리닝하고, 상이한 희석 포인트에서의 저해율(%) 변화를 레퍼런스 00902와 비교하였다. 스크리닝 결과와 표 21에 나타낸 데이터에 기초하여 7개 추가 VHH 사이클 3 변이체를 (00908 주쇄에 기초하여)구성하였다(도 15d 참조). 최종 목표는 증가된 포텐시, 증가된 열 안정성을 보유하거나 나타내고 VHH 28D10과 비교하여 넉아웃된 관련 PTM 부위를 갖는 VHH 변이체를 구성하는 것이다(AA 서열은 표 24-3에 나열하였다). 이들 변이체를 정제된 단백질로서 인간(도 20a-20c), 마우스(도 20d-20f) 및 cyno(도 20g-20i) Ang2/Tie2 경쟁 ELISA (실시예 5.1; 실시예 5.2), hAng1/hTie2 경쟁 ELISA (실시예 5.3)에서 특성화하였다. 또한, 각 변이체의 용융 온도(Tm)를 열 이동 어세이(실시예 6)로 측정하였다. 데이터의 개요는 표 22에서 확인할 수 있다. 또한, 인간 생식세포에 대한 FR 일치율(%)을 계산하였다. 가장 최적 서열 변화는 최종적으로 비친화도 성숙 변이체 VHH 00956 (도 15d)에 적용하였다. 인간, 마우스, cyno 및 래트 Ang2에 대한 VHH 00919, 00938 및 00956의 친화도를 표 23에 나타내었다.
Figure pct00055

Figure pct00056

Figure pct00057
Figure pct00058

Figure pct00059

Figure pct00060

Figure pct00061
SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> ANG2-BINDING MOLECULES <130> 12-0350-PCT <160> 190 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Arg Cys Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Ile Val Pro Arg Ser Lys Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Lama glama <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val His Ser Gly Thr Ile Ser Ser Thr His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu His Val 35 40 45 Ala Thr Phe Thr Asn Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Thr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Lama glama <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Asp Ser Ala Gln Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly 85 90 95 Arg Ala Phe Leu Ala Arg Asp Thr Phe Tyr Tyr Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asp Asp His 20 25 30 Leu Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Pro Ala Trp Gly Arg Pro Ala Ser Pro Leu Pro Tyr Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 134 <212> PRT <213> Lama glama <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Leu Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Thr Asp Trp Asp Phe Glu Asp Ile Pro Glu Tyr Tyr Cys Ser 100 105 110 Gly Tyr Gly Cys Asp Glu Ser Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 6 <211> 130 <212> PRT <213> Lama glama <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Asp 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Thr Ser Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Asn Arg Arg Ile Tyr Tyr Ser Asp Tyr Ala Leu Ala Cys 100 105 110 Phe Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Met Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 35 40 45 Ala Ala Val Ile Trp Ser Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Tyr Asp Gly Asn Tyr Tyr Ile Pro Gly Phe Tyr Lys Asp 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 130 <212> PRT <213> Lama glama <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Asn Leu Arg Ile Tyr Tyr Ser Asp Tyr Ala Leu Ala Cys 100 105 110 Phe Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 9 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Met Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 35 40 45 Ala Ala Gly Ile Trp Ser Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Tyr Asp Gly Asn Tyr Tyr Ile Pro Gly Phe Tyr Lys Asp 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 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Glu Glu Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 12 Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asp Asp His 20 25 30 Leu Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Pro Ala Trp Gly Arg Pro Ala Ser Pro Leu Pro Tyr Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 134 <212> PRT <213> Lama glama <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 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Lama glama <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Arg Phe Gly Gly His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Tyr Trp Thr Ser Gly Met Thr Arg Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Ile Lys Asp Phe Gln Leu Arg Val Asp Val Thr Ser Ala Ser 100 105 110 Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 127 <212> PRT <213> Lama glama <400> 33 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Arg Phe Gly Gly His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Tyr Trp Thr Thr Gly Met Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 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glama <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Ala Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Asn Val Gly Arg Leu Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Ala Gly Leu Val Tyr Ser Gly Ile Pro Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Thr His Ile Thr Trp Asn Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Ser Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 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<213> Lama glama <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Arg Gly Arg Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Leu Val 100 105 110 Cys Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 60 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe 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Lama sequence <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Tyr Gly Glu Gln Trp Tyr Pro 100 105 110 Ile Tyr Glu Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 164 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated Lama sequence <400> 164 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Asp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 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<400> 178 gaggtacagc tggtcgagtc aggtggcgga ttagtgcagc ctgggggttc tctgcgctta 60 tcttgtgccg catcaggctt cacactggat gactacgcca tcggctggtt ccggcaagcg 120 cctggaaaag aacgcgaagg tgtttcagca atccgttcaa gcggtggttc aacatattac 180 gccgactctg ttaaaggacg cttcaccatt agctccgaca atagtaaaaa tacagtctac 240 ttacaaatga acagtttacg cccagaagat actgcggtat actattgcgc tgccgtgcct 300 gctggtcgct tacgctttgg cgagcaatgg tatcctctgt acgagtacga cgcctgggga 360 cagggtacgc tggtaacggt ttcaagc 387 <210> 179 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutated Lama sequence <400> 179 gaagtgcaac tggttgagtc aggtggcgga ctggtgcaac cgggtggttc actgcgcctg 60 agttgcgcag ttagcggtat taccctggat gattatgcaa ttggttggtt tcgccaagcc 120 ccaggcaaag agcgtgaagg cgttagcgca attcgtagca gcggtggtag cacctattat 180 gccgattcag ttaaaggccg ttttacgatc agcagcgata acagtaaaaa cacggtttat 240 ctgcaaatga actcattacg tccagaggac actgcagttt actattgcgc agcagttccg 300 gcaggtcgtc tgcgttatgg tgaacagtgg tatccgattt atgaatatga tgcatggggt 360 caaggtacac tggttacagt gagtagc 387 <210> 180 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutated Lama sequence <400> 180 gaagtgcagt tagtcgaaag tggcggaggc ctggtacaac ctggtggcag tctgcgctta 60 tcttgtgccg cttcaggttt tacattcgac gactacgccc tggggtggtt ccggcaagcg 120 cctggaaaag aacgtgaggg cgtttcatgc attcgttgtt caggtggttc aacctattat 180 gccgatagtg taaaaggtcg gttcaccatt agtagcgaca atagcaagaa tacagtctat 240 ctgcaaatga actctttacg tcctgaagat actgcggtgt actactgcgc tgcatcaatc 300 gttcctcgtt caaaacttga accttacgag tacgacgcct ggggtcaggg tacgttagta 360 acggtgtcaa gc 372 <210> 181 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutated Lama sequence <400> 181 gaagtgcaac tggttgagtc aggtggcggt ttagtgcaac cgggtggttc actgcgcctg 60 agttgcgcag ccagcggttt tgcactggat tattatgcaa ttggttggtt tcgccaagcc 120 ccaggcaaag agcgtgaagg cgttagctgt attagcagca gcggtggtat tacctattat 180 gccgattcag ttaaaggccg ttttacgatc tctcgtgata atagtaaaaa cacggtttac 240 ctgcagatga actcattaag accagaggac actgcagttt actattgtgc aaccgatagc 300 ggtggctata ttgattatga ttgtagcggt ctgggctacg attattgggg acaaggtacg 360 ctggtgacag ttagcagc 378 <210> 182 <211> 3375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 182 atggactctt tagccagctt agttctctgt ggagtcagct tgctcctttc tggaactgtg 60 gaaggtgcca tggacttgat cttgatcaat tccctacctc ttgtatctga tgctgaaaca 120 tctctcacct gcattgcctc tgggtggcgc ccccatgagc ccatcaccat aggaagggac 180 tttgaagcct taatgaacca gcaccaggat ccgctggaag ttactcaaga tgtgaccaga 240 gaatgggcta aaaaagttgt ttggaagaga gaaaaggcta gtaagatcaa tggtgcttat 300 ttctgtgaag ggcgagttcg aggagaggca atcaggatac gaaccatgaa gatgcgtcaa 360 caagcttcct tcctaccagc tactttaact atgactgtgg acaagggaga taacgtgaac 420 atatctttca aaaaggtatt gattaaagaa gaagatgcag tgatttacaa aaatggttcc 480 ttcatccatt cagtgccccg gcatgaagta cctgatattc tagaagtaca cctgcctcat 540 gctcagcccc aggatgctgg agtgtactcg gccaggtata taggaggaaa cctcttcacc 600 tcggccttca ccaggctgat agtccggaga tgtgaagccc agaagtgggg acctgaatgc 660 aaccatctct gtactgcttg tatgaacaat ggtgtctgcc atgaagatac tggagaatgc 720 atttgccctc 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agggcatcct ggacctgtga gacgcttcac aacagcttct 1620 atcggactcc ctcctccaag aggtctaaat ctcctgccta aaagtcagac cactctaaat 1680 ttgacctggc aaccaatatt tccaagctcg gaagatgact tttatgttga agtggagaga 1740 aggtctgtgc aaaaaagtga tcagcagaat attaaagttc caggcaactt gacttcggtg 1800 ctacttaaca acttacatcc cagggagcag tacgtggtcc gagctagagt caacaccaag 1860 gcccaggggg aatggagtga agatctcact gcttggaccc ttagtgacat tcttcctcct 1920 caaccagaaa acatcaagat ttccaacatt acacactcct cggctgtgat ttcttggaca 1980 atattggatg gctattctat ttcttctatt actatccgtt acaaggttca aggcaagaat 2040 gaagaccagc acgttgatgt gaagataaag aatgccacca tcattcagta tcagctcaag 2100 ggcctagagc ctgaaacagc ataccaggtg gacatttttg cagagaacaa catagggtca 2160 agcaacccag ccttttctca tgaactggtg accctcccag aatctcaagc accagcggac 2220 ctcggagggg ggaagatgct gcttatagcc atccttggct ctgctggaat gacctgcctg 2280 actgtgctgt tggcctttct gatcatattg caattgaaga gggcaaatgt gcaaaggaga 2340 atggcccaag ccttccaaaa cgtgagggaa gaaccagctg tgcagttcaa ctcagggact 2400 ctggccctaa acaggaaggt caaaaacaac ccagatccta caatttatcc agtgcttgac 2460 tggaatgaca tcaaatttca agatgtgatt ggggagggca attttggcca agttcttaag 2520 gcgcgcatca agaaggatgg gttacggatg gatgctgcca tcaaaagaat gaaagaatat 2580 gcctccaaag atgatcacag ggactttgca ggagaactgg aagttctttg taaacttgga 2640 caccatccaa acatcatcaa tctcttagga gcatgtgaac atcgaggcta cttgtacctg 2700 gccattgagt acgcgcccca tggaaacctt ctggacttcc ttcgcaagag ccgtgtgctg 2760 gagacggacc cagcatttgc cattgccaat agcaccgcgt ccacactgtc ctcccagcag 2820 ctccttcact tcgctgccga cgtggcccgg ggcatggact acttgagcca aaaacagttt 2880 atccacaggg atctggctgc cagaaacatt ttagttggtg aaaactatgt ggcaaaaata 2940 gcagattttg gattgtcccg aggtcaagag gtgtacgtga aaaagacaat gggaaggctc 3000 ccagtgcgct ggatggccat cgagtcactg aattacagtg tgtacacaac caacagtgat 3060 gtatggtcct atggtgtgtt actatgggag attgttagct taggaggcac accctactgc 3120 gggatgactt gtgcagaact ctacgagaag ctgccccagg gctacagact ggagaagccc 3180 ctgaactgtg atgatgaggt gtatgatcta atgagacaat gctggcggga gaagccttat 3240 gagaggccat catttgccca 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Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Tyr Pro Gln Lys Gln 450 455 460 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495 <210> 189 <211> 253 <212> PRT <213> Mouse <400> 189 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ile Leu 20 25 30 Glu Glu Gln Thr Thr Phe Arg Asp Cys Ala Glu Ile Phe Lys Ser Gly 35 40 45 Leu Thr Thr Ser Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn Ser Thr Glu 50 55 60 Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Asp Val Gly Gly Gly Gly Trp Thr 65 70 75 80 Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg Thr Trp 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Glu Gly Phe Gly Ser Pro Leu Gly Glu Tyr Trp Leu 100 105 110 Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Gly Gln His Arg Tyr Val Leu 115 120 125 Lys Ile Gln Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala His Ser Leu Tyr 130 135 140 Asp His Phe Tyr Leu Ala Gly Glu Glu Ser Asn Tyr Arg Ile His Leu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser Gln Pro 165 170 175 Gly Ser Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ser Asp Asn Asp Lys Cys Ile Cys 180 185 190 Lys Cys Ser Gln Met Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly 195 200 205 Pro Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Tyr Pro Gln Lys Gln Asn Thr Asn 210 215 220 Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly Tyr Ser 225 230 235 240 Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 245 250 <210> 190 <211> 253 <212> PRT <213> Cyno <400> 190 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ile Leu 20 25 30 Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe Lys Ser Gly 35 40 45 His Thr Thr Asn Gly Val Tyr Thr Leu Thr Leu Pro Asn Ser Thr Glu 50 55 60 Glu Val Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly Gly Trp Thr 65 70 75 80 Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg Thr Trp 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu 100 105 110 Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg Tyr Val Leu 115 120 125 Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr 130 135 140 Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile His Leu 145 150 155 160 Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser Gln Pro 165 170 175 Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Lys Cys Ile Cys 180 185 190 Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly 195 200 205 Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln Asn Thr Asn 210 215 220 Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly Tyr Ser 225 230 235 240 Leu Lys Gly Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 245 250

Claims (18)

  1. 3개의 상보성결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Ang2-결합분자(여기서 CDR1은 서열번호 168 내지 170에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호 171 내지 173에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, CDR3는 서열번호 174 내지 177에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다).
  2. 제1항에 있어서,
    (a) CDR1이 서열번호: 168에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 171에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 174에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나,
    (b) CDR1이 서열번호: 168에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 171에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 175에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나,
    (c) CDR1이 서열번호: 169에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 172에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 176에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나,
    (d) CDR1이 서열번호: 170에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호: 173에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, CDR3는 서열번호: 177에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 Ang2 결합분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 또는 도메인 항체인 Ang2 결합분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH인 Ang2 결합분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, VHH가 서열번호: 167, 166, 129 및 138로 구성되는 군에서 선택된 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Ang2 결합분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Ang2 결합분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 VHH가 N 말단에 변성 또는 교환을 갖고, 여기에서 변성은 제1 아미노산의 결실이며 교환은 다른 아미노산에 의한 제1 아미노산의 치환인 Ang2 결합분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 Ang2 결합분자를 코딩하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
  10. 제9항에 따른 하나 이상의 발현벡터를 갖는 숙주세포.
  11. (a) 제9항에 따른 하나 이상의 벡터로 숙주세포를 형질감염하고,
    (b) 숙주세포를 배양하고,
    (c) Ang2-결합분자를 회수 및 정제하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 Ang2 결합분자의 제조방법.
  12. 활성성분으로서 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 하나 이상의 Ang2 결합분자, 및 적어도 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 DNA 손상제와 같은 화학요법제 및/또는 암세포의 항유사분열약(예: 탁솔) 또는 신생혈관생성을 저해하는 치료적 활성 화합물(항혈관형성약, 예컨대 항-VEGF/VEGF 리셉터 저해제, 예를 들어 아바스틴, 니테다닙(nitedanib) 및 수니티닙), 또는 신호전달경로 저해제, 예컨대 mTOR 저해제(예: 템시롤리무스(temsirolimus)) 또는 호르몬 요법제(예: 타목시펜)를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 신생혈관생성에서 Ang2 매개 효과와 연관된 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 암과 암성 질환, 예컨대 유방암, 신장세포 암종, 난소암 및 췌장암의 치료를 위한 약학 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 안과 질환, 예컨대 연령관련 황반변성 및 당뇨병성 망막증을 치료하기 위한 약학 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 만성 신장질환, 예컨대 당뇨병성 신장질환, 신후성 신부전증, 신전성 질소혈증(prerenal azotemia) 및 신성신부전을 치료하기 위한 약학 조성물.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 하나 이상의 Ang2 결합분자, 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 약학 조성물을 제14항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 제14항 내지 제 17항 중 어느 하나에 언급된 질환의 치료방법.
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