TW201305202A - Ｖｅｇｆ－結合分子 - Google Patents

Abstract

本發明揭示VEGF-結合分子，較佳為VEGF-結合性免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH及結構域抗體)抗體，含有其之醫藥組合物及其在治療與VEGF所調介血管發生之效應相關的疾病中的用途。本發明揭示編碼VEGF-結合分子之核酸、宿主細胞及其製備方法。

Description

VEGF-結合分子

本發明係關於人類療法、具體而言癌症療法及用於該療法中之藥劑及組合物之領域。

如(例如)US 2008/0014196及WO 2008101985中所述，血管發生與多種病症(包括實體瘤及轉移以及眼病)之致病機理相關。最重要促血管生成因子之一係血管內皮生長因子(VEGF)，亦稱作VEGF-A或血管滲透因子(VPF)。VEGF屬於包括胎盤生長因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及VEGF-F之基因家族。人類VEGF之單一基因之mRNA的交替剪接產生至少六種同型異構體(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206)，VEGF165係最豐富之同型異構體。

已識別兩種與VEGF相互作用之VEGF酪胺酸激酶受體(VEGFR)，即VEGFR-1(亦稱作FIt-1)及VEGFR-2(亦稱作KDR或FIK-1)。VEGFR-1對VEGF具有最高親和力，而VEGFR-2對VEGF具有稍微較低親和力。Ferrara(Endocrine Rev. 2004,25: 581-611)提供VEGF之詳細說明，與其受體之相互作用及其在正常及病理過程中之功能可參見Hoeben等人Pharmacol. Rev. 2004,56: 549-580。

已報導VEGF為正常及異常兩種血管發生之關鍵調控子(Ferrara及Davis-Smyth，Endocrine Rev. 1997,18: 4-25；Ferrara J. MoL Med. 1999,77: 527-543)。與促進血管形成過程之其他生長因子相比，VEGF在對血管系統內之內皮細胞之高特異性中係獨特的。

VEGF mRNA由大多數人類腫瘤過表現。在腫瘤生長情形下，血管發生似乎對自增生至贅瘤形成之轉變、及為腫瘤之生長及轉移提供營養至關重要(Folkman等人，1989，Nature 339-58)，此容許腫瘤細胞與正常細胞相比獲得生長優勢。因此，抗血管發生療法已成為若干類型腫瘤之重要治療選擇。該等療法聚焦於阻斷VEGF途徑(Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov. 2004年5月；3(5): 391-400)。

VEGF亦與眼病有關。VEGF在眼液中之濃度與患有糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變之患者中之血管的活性增生之存在高度相關。此外，最近研究已證實VEGF在受年齡相關性黃斑變性(AMD)侵襲之患者中之脈絡膜新生血管膜中的定位。亦在各種發炎性病症中觀察到VEGF上調。VEGF與RA(一種血管發生起顯著作用之發炎性疾病)之致病機理相關。

VEGF及其在血管發生及不同過程中之作用的闡明已提供治療性幹預之潛在新目標。VEGF之功能受阻斷或防止VEGF受體酪胺酸激酶活化之小分子抑制(Schlaeppi及Wood，1999，Cancer Metastasis Rev.，18: 473-481)且因此干擾VEGF受體信號轉導途徑。含有細菌或植物毒素之細胞毒性偶聯物可抑制VEGF對腫瘤血管發生之刺激效應。例如，VEGF-DT385毒素偶聯物(與VEGF165融合或化學偶聯之白喉毒素結構域)有效抑制活體內腫瘤生長。腫瘤生長抑制亦可由逆轉錄病毒藉由遞送FIk-1突變體或可溶性VEGF受體達成。

已開發中和VEGF之抗體(例如A4.6.1及MV833)用以阻斷VEGF結合其受體且其已顯示臨床前抗腫瘤活性(Kim等人，Nature 1993,362: 841-844；Folkman Nat. Med. 1995,1: 27-31；Presta等人Cancer Res. 1997,57: 4593-4599；Kanai等人，Int. J. Cancer 1998,77: 933-936；Ferrara及Alitalo Nat. Med. 1999,5: 1359-1364；320,340)。關於治療性抗VEGF方法試驗之綜述，參見Campochiaro and Hackett(Oncogene 2003,22: 6537-6548)。

已利用A4.6.1(亦稱作貝伐珠單抗)觀察大多數臨床經驗(Avastin;Genentech,San Francisco,CA)。

WO 2008101985闡述結合VEGF之駱駝科之免疫球蛋白單一可變結構域(本文所定義VHH或「Nanobodies)、及其在治療特徵在於過度及/或病理血管發生或新血管形成之病狀及疾病中的用途。

本發明之目的係提供新穎改進之VEGF-結合分子。

本發明之又一目的係提供預防、治療、減輕及/或診斷該等疾病、病症或病狀之方法，其包括使用及/或投與該等藥劑及組合物。具體而言，本發明之目的係提供與目前所用及/或相關技藝中已知藥劑、組合物及/或方法相比提供優勢之該等藥理活性藥劑、組合物及/或方法。該等優勢包括例如出於製造目的、尤其與作為彼等上述者之習用抗VEGF抗體或其片段相比改進之治療及/或藥理性質及/或其他有利性質。

更具體而言，本發明之目的係提供新穎VEGF-結合分子及特別是結合哺乳動物VEGF及尤其人類VEGF的VEGF-結合分子，其中該等分子或多肽適於本文所述治療及診斷目的。本發明之又一目的係提供特異性結合VEGF之免疫球蛋白單一可變結構域。

根據第一態樣，提供VEGF-結合分子、較佳VEGF-結合免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH及結構域抗體)。

在另一態樣中，本發明係關於編碼VEGF-結合分子之核酸以及含有該等核酸之宿主細胞。

本發明進一步係關於含有或包含本發明之至少一種VEGF-結合分子及視情況該等組合物之一或多種其他組份的產物或組合物。

本發明進一步係關於製備或生成本文所述VEGF-結合分子、核酸、宿主細胞、產物及組合物之方法。

本發明進一步係關於本發明所述VEGF-結合分子、核酸、宿主細胞、產物及組合物之應用及用途，以及預防及/或治療與VEGF所調介血管發生之效應相關之疾病的方法。

自下文進一步說明可明瞭本發明之該等及其他態樣、實施例、優勢及應用。

定義

除非另外指明或定義，否則所用之所有術語具有其相關技藝中之常用含義，此為熟習此項技術者所明瞭。參照(例如)標準手冊，例如Sambrook等人，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(第2版)，第1至3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin，「Genes IV」，Oxford University Press,New York,(1990)，及Roitt等人，「Immunology」(第2版)，Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文所引用之一般背景；此外，除非另外指明，否則可以本身已知之方法實施並已實施未詳細地具體闡述之所有方法、步驟、技術及操作，如熟習此項技術者所明瞭。再次參照(例如)標準手冊、上文所提及之一般背景技術及其中引用之其他參考文獻。

除非另外指明，否則術語「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白序列」-不論在本文中用於指重鏈抗體或習用4-鏈抗體-用作包括全長抗體、其個別鏈、以及其所有部分、結構域或片段(分別包括但不限於抗原結合結構域或片段，例如VHH結構域或VH/VL結構域)的一般術語。另外，除非上下文需要更有限解釋，否則本文所用術語「序列」(例如，在如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「(單一)可變結構域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」等術語中)通常應理解為包括編碼其之相關胺基酸序列以及核酸序列或核苷酸序列。

本文所用術語(多肽或蛋白質之)「結構域」係指摺疊蛋白質結構，其具有保留獨立於蛋白質之剩餘部分之其三級結構的能力。通常，結構域負責蛋白質之獨立功能性質，且在許多情形下可添加、移除或轉移至其他蛋白質中而不損失蛋白質及/或結構域之剩餘部分之功能。

本文所用術語「免疫球蛋白結構域」係指抗體鏈(例如習用4鏈抗體或重鏈抗體之鏈)之球形區，或係指基本上由該球形區組成之多肽。免疫球蛋白結構域之特徵在於其保留抗體分子之免疫球蛋白摺疊特性，其由佈置成2個β片且視情況由保守二硫鍵穩定之約7條反平行β鏈之2層夾層組成。

本文所用術語「免疫球蛋白可變結構域」意指基本上由4個「框架區」組成之免疫球蛋白結構域，該等框架區在相關技藝中及下文中分別稱作「框架區1」或「FR1」；「框架區2」或「FR2」；「框架區3」或「FR3」及「框架區4」或「FR4」，該等框架區間雜有3個「互補決定區」或「CDR」，其在相關技藝中及下文中分別稱作「互補決定區1」或「CDR1」；「互補決定區2」或「CDR2」及「互補決定區3」或「CDR3」。因此，免疫球蛋白可變結構域之通用結構或序列可如下所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域藉由攜帶抗原結合位點而賦予抗體針對抗原之特異性。

本文所用術語「免疫球蛋白單一可變結構域」意指能夠特異性結合抗原之表位而不與另一可變免疫球蛋白結構域配對之免疫球蛋白可變結構域。本發明含義中之免疫球蛋白單一可變結構域之一個實例係「結構域抗體」，例如免疫球蛋白單一可變結構域VH及VL(VH結構域及VL結構域)。免疫球蛋白單一可變結構域之另一實例係下文所定義駱駝科之「VHH結構域」(或簡寫為「VHH」)。

鑒於上述定義，習用4鏈抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；相關技藝中已知)或源自該習用4鏈抗體之Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如二硫鍵鍵結之Fv或scFv片段)、或雙抗體(所有均為相關技藝中已知)的抗原結合結構域通常將不被視為免疫球蛋白單一可變結構域，此乃因在該等情形下通常將不由一個(單一)免疫球蛋白結構域而是由一對(結合)免疫球蛋白結構域(例如輕鏈及重鏈可變結構域)，即由共同結合各別抗原之表位之免疫球蛋白結構域之VH-VL對結合抗原之各別表位。

「VHH結構域」亦稱作VHH、V_HH結構域、VHH抗體片段及VHH抗體，其最初闡述為「重鏈抗體」(即「無輕鏈之抗體」；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:「Naturally occurring antibodies devoid of light chains」；Nature 363,446-448(1993))之抗原結合免疫球蛋白(可變)結構域。選擇術語「VHH結構域」以區分該等可變結構域與習用4鏈抗體中存在之重鏈可變結構域(其在本文中稱作「V_H結構域」或「VH結構域」)及習用4鏈抗體中存在之輕鏈可變結構域(其在本文中稱作「V_L結構域」或「VL結構域」)。VHH結構域可在無另一抗原結合結構域情況下特異性結合表位(與習用4鏈抗體中之VH或VL結構域相反，在該情形下由VL結構域與VH結構域一起識別表位)。VHH結構域係由單一免疫球蛋白結構域形成之小的穩健且有效抗原識別單元。

在本發明上下文中，術語VHH結構域、VHH、V_HH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體、以及「Nanobody」及「Nanobody結構域」(「Nanobody」為Ablynx N.V.公司之商標；Ghent;Belgium)可互換使用且可代表免疫球蛋白單一可變結構域(具有結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4並特異性結合表位而無需第二免疫球蛋白可變結構域之存在)，且藉由如WO 2009/109635之圖1中所定義所謂「標誌殘基」將其與VH結構域區分。

根據由Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」，US Public Health Services，NIH Bethesda，MD，公開案第91號)給出之針對V_H結構域之通用編號對免疫球蛋白單一可變結構域(例如VHH)之胺基酸殘基進行編號，如適於駱駝科之VHH結構域，如(例如)Riechmann及Muyldermans,J. Immunol. Methods 231,25-38(1999)之圖2中所示。根據此編號，- FR1包含位置1-30處之胺基酸殘基，- CDR1包含位置31-35處之胺基酸殘基，- FR2包含位置36-49處之胺基酸，- CDR2包含位置50-65處之胺基酸殘基，- FR3包含位置66-94處之胺基酸殘基，- CDR3包含位置95-102處之胺基酸殘基，且- FR4包含位置103-113處之胺基酸殘基。

然而，應注意-如針對V_H結構域及VHH結構域相關技藝中所熟知-CDR中之每一者中之胺基酸殘基的總數量可有所變化且可不對應於由Kabat編號指示之胺基酸殘基的總數量(即，實際序列中可不佔據根據Kabat編號之一或多個位置，或實際序列可含有比由Kabat編號容許之數量更多之胺基酸殘基)。此意指根據Kabat之編號通常可對應於或可不對應於實際序列中之胺基酸殘基之實際編號。

相關技藝中已知對V_H結構域之胺基酸殘基進行編號之替代方法，該等方法亦可以類似方式適於VHH結構域。然而，除非另外指明，否則在本發明說明、申請專利範圍及圖中，遵循如上文所述根據Kabat且適於VHH結構域之編號。

VHH結構域中之胺基酸殘基之總數量通常在110至120範圍內，經常介於112與115之間。然而，應注意，較小且較長序列亦可適於本文所述目的。

獲得結合特異性抗原或表位之VHH之方法先前闡述於(例如)WO 2006/040153及WO 2006/122786中。亦如其中詳細闡述，可藉由用人類習用4鏈抗體之VH結構域中之相應位置處出現之一或多個胺基酸殘基替代初始VHH序列之胺基酸序列中之一或多個胺基酸殘基來「人類化」(本文中亦稱作「序列優化(sequence-optimized)」，「序列優化(sequence-optimizing)」除人類化外亦涵蓋藉由一或多種為VHH提供改進性質之突變(例如移除潛在轉譯後修飾位點)另外修飾序列)源自駱駝科之VHH結構域。人類化VHH結構域可含有一或多個完整人類框架區序列，且在甚至更具體實施例中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分之人類框架區序列，其情況與JH序列(例如JH5)組合。

結構域抗體亦稱作「Dab」及「dAb」(術語「結構域抗體」及「dAb」由GlaxoSmithKline公司集團用作商標)，其闡述於(例如)Ward,E.S.等人：「Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli」；Nature 341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人：「Domain antibodies: proteins for therapy」；TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490(2003)；及WO 2003/002609中。

結構域抗體基本上對應於非駱駝科哺乳動物之抗體(具體而言人類4鏈抗體)的VH或VL結構域。為結合作為單一抗原結合結構域之表位，即不分別與VL或VH結構域配對，藉由(例如)使用人類單一VH或VL結構域序列之文庫需要特定選擇該等抗原結合性質。

與VHH一樣，結構域抗體具有約13 kDa至約16 kDa之分子量，且若源自完整人類序列，則不需要針對(例如)人類中治療用途之人類化。如在VHH結構域之情形下，其亦在原核表現系統中充分表現，從而顯著降低整體製造費用。

此外，熟習此項技術者亦應明瞭，可將上文所提及一或多個CDR「移植」於其他「架構」(包括但不限於人類架構或非免疫球蛋白架構)上。相關技藝中已知適宜架構及該CDR移植之技術。

術語「表位」及「抗原決定簇」可互換使用，其係指由抗原結合分子(例如本發明習用抗體或多肽)且更具體而言由該等分子之抗原結合位點識別之大分子(例如多肽)的部分。表位界定免疫球蛋白之最小結合位點，且因此代表免疫球蛋白之特異性的目標。

可「結合」或「特異性結合」某些表位、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或表位)而對其「具有親和力」及/或「具有特異性」之多肽(例如本發明免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域、或通常指抗原結合分子或其片段)係指「針對(「against」或「directed against」)」該表位、抗原或蛋白質或係關於該表位、抗原或蛋白質之「結合」分子。在此上下文中，VEGF-結合分子亦可稱作「VEGF中和分子」。

術語「特異性」通常係指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如本發明免疫球蛋白單一可變結構域)分子可結合之不同類型抗原或表位的數量。抗原結合分子之特異性可基於其親和力及/或抗體親抗原性測定。親和力由抗原與抗原結合蛋白之解離平衡常數(KD)代表，其係抗原結合蛋白上表位與抗原結合位點之間之結合強度的量度：KD值越小，則表位與抗原結合分子之間之結合強度越強(或者，親和力亦可親和力常數(KA)表示，其係1/KD)。如熟習此項技術者所明瞭(例如，基於本文其他揭示內容)，端視目標特異性抗原而定，可以本身已知方式測定親和力。抗體親抗原性係抗原結合分子(例如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域或含有其之多肽)與有關抗原之間之結合強度的量度。抗體親抗原性與抗原結合分子上之表位與其抗原結合位點之間之親和力及抗原結合分子上存在之有關結合位點的數量有關。

抗原結合分子中識別表位之部分稱為互補位(paratope)。

除非另外指明，否則術語「VEGF-結合分子」包括抗VEGF抗體、抗VEGF抗體片段、「抗VEGF抗體樣分子」及與該等中之任一者的偶聯物。抗體包括但不限於單株及嵌合單株抗體。術語「抗體」涵蓋完整免疫球蛋白，如由宿主細胞中之重組表現產生之單株抗體，以及VEGF-結合抗體片段或「抗體樣分子」(包括單鏈抗體及直鏈抗體)、所謂「SMIP」(「小分子免疫醫藥劑」)，如(例如)WO 02/056910中所述。抗VEGF抗體樣分子包括本文所定義免疫球蛋白單一可變結構域。抗體樣分子之其他實例係免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或CDR移植分子。

「VEGF-結合分子」係指單價VEGF-結合分子(即結合VEGF之一個表位的分子)以及二價或多價結合分子(即結合一個以上表位之結合分子，例如下文所定義「雙互補位」分子。含有一個以上VEGF-結合免疫球蛋白單一可變結構域之VEGF-結合分子亦稱作「模式化」VEGF-結合分子，除VEGF-結合免疫球蛋白單一可變結構域外其亦可包含連接體及/或具有效應子功能之部分，例如半衰期延長部分，如白蛋白結合免疫球蛋白單一可變結構域、及/或融合伴侶，如血清白蛋白及/或附接聚合物，如PEG。

本文所用術語「雙互補位VEGF-結合分子」或「雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域」應意指包含本文所定義第一免疫球蛋白單一可變結構域及第二免疫球蛋白單一可變結構域之VEGF-結合分子，其中兩種分子結合VEGF抗原之兩種不同、即非重疊表位。本發明雙互補位多肽由相對於表位具有不同特異性之免疫球蛋白單一可變結構域構成。抗原結合分子(例如本發明抗體或免疫球蛋白單一可變結構域)中識別表位之部分稱作互補位。

模式化VEGF-結合分子儘管較不佳但亦包含兩個相同VEGF-結合免疫球蛋白單一可變結構域或兩個不同免疫球蛋白單一可變結構域，其識別相同或重疊表位。在此情形下，兩個免疫球蛋白單一可變結構域可結合形成VEGF二聚體之兩種單體中之每一者中的相同或重疊表位。

通常，本發明VEGF-結合分子將以10E-5至10E-14莫耳/升(M)或更小、且較佳10E-7至10E-14莫耳/升(M)或更小、更佳10E-8至10E-14莫耳/升、且甚至更佳10E-11至10E-13之解離常數(K_D)(如Biacore或KinExA分析中所量測)、及/或至少10E7 ME-1、較佳至少10E8 ME-1、更佳至少10E9 ME-1(例如至少10E11 ME-1)之締合常數(K_A)結合。通常將大於10E-4 M之任一K_D值視為指示非特異性結合。較佳地，本發明多肽將以小於500 nM、較佳小於200 nM、更佳小於10 nM(例如小於500 pM)之K_D結合期望抗原，即VEGF。可以本身已知之任一適宜方式測定抗原結合蛋白與抗原或表位之特異性結合，所述方式包括(例如)本文所述分析、Scatchard分析及/或競爭性結合分析，例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾心競爭分析、及相關技藝中本身已知之其不同變化形式。

根據標準三字母或單字母胺基酸編碼指示胺基酸殘基，如相關技藝中通常所知並認可。在比較兩種胺基酸序列時，術語「胺基酸差別」係指與第二序列相比在參照序列位置處的所指示數量之胺基酸殘基的插入、缺失或取代。在取代之情形下，該(等)取代較佳為保守胺基酸取代，此意指胺基酸殘基經具有類似化學結構且對多肽之功能、活性或其他生物性質具有極小或基本上無影響之另一胺基酸殘基替代。該等保守胺基酸取代已為相關技藝中(例如)自WO 98/49185所熟知，其中保守胺基酸取代較佳係以下群組(i)-(v)中之一個胺基酸由同一群組中之另一胺基酸殘基取代的取代：(i)小的脂肪族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)極性、帶負電荷之殘基及其(不帶電荷)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)極性、帶正電荷之殘基：His、Arg及Lys；(iv)大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤佳之保守胺基酸取代係如下：Ala取代為Gly或取代為Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或取代為His；Asp取代為GIu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或取代為Pro；His取代為Asn或取代為Gln；Ile取代為Leu或取代為Val；Leu取代為Ile或取代為Val；Lys取代為Arg、取代為Gln或取代為Glu；Met取代為Leu、取代為Tyr或取代為Ile；Phe取代為Met、取代為Leu或取代為Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp或取代為Phe；Val取代為Ile或取代為Leu。

例如，在與獲得多肽或核酸分子之天然生物來源及/或反應介質或培養介質相比時-若多肽或核酸分子與通常在該來源或介質中結合其之至少一種另一組份(例如另一蛋白質/多肽、另一核酸、另一生物組份或大分子或至少一種污染物、雜質或次要組份)分離，則將其視為「(呈)基本上分離(形式)」。具體而言，若多肽或核酸分子純化至少2倍、具體而言至少10倍、更具體而言至少100倍及高達1000倍或更多倍，則將其視為「基本上分離」。「呈基本上分離形式」之多肽或核酸分子較佳基本上均勻，如使用適宜技術(例如適宜層析技術，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳)所測定。

兩個VEGF-結合分子之間之「序列一致性」表示序列間相同胺基酸之百分比。其可如WO 08/020079第49及50頁上第f)段中所述計算或測定。「序列相似性」指示一致或代表保守胺基酸取代之胺基酸之百分比。

相關技藝中已知對V_H結構域之胺基酸殘基進行編號之替代方法，該等方法亦可以類似方式適於VHH結構域。然而，除非另外指明，否則在本發明說明、申請專利範圍及圖中，遵循如上文所述根據Kabat且適於VHH結構域之編號。

「親和力成熟」VEGF-結合分子、具體而言VHH或結構域抗體與各別親本VEGF-結合分子相比在一或多個CDR中具有一或多個改變，此產生對VEGF改進之親和力。本發明親和力成熟VEGF-結合分子可藉由相關技藝中已知之方法製得，如Marks等人，1992,Biotechnology 10:779-783、或Barbas等人，1994,Proc. Nat. Acad. Sci,USA 91: 3809-3813；Shier等人，1995,Gene 169:147-155；Yelton等人，1995,Immunol. 155: 1994-2004；Jackson等人，1995,J. Immunol. 154(7):3310-9；及Hawkins等人，1992,J. MoI. Biol. 226(3): 889 896；KS Johnson及RE Hawkins,「Affinity maturation of antibodies using phage display」,Oxford University Press 1996所述。

關於本發明，「胺基酸序列SEQ ID NO: x」包括(若無另外說明)與各別SEQ ID NO: x中所示序列100%一致之胺基酸序列；

a)　與各別SEQ ID NO：x中所示序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列；

b)　與各別SEQ ID NO：x中所示序列具有3個、2個或1個胺基酸差別之胺基酸序列。

術語「癌症」及「癌性的」係指或描述哺乳動物之特徵通常在於細胞生長/增生失調之生理學病狀。欲用本發明VEGF-結合分子治療之癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。建議用US 2008/0014196中之VEGF拮抗劑治療之此等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌瘤、唾液腺癌瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、胃癌、黑色素瘤及各種類型之頭頸癌。血管生成失調可引起許多可藉由本發明組合物及方法治療之病症。該等病症包括非腫瘤性及腫瘤性病狀。腫瘤包括但不限於彼等上文所闡述者。

建議用US 2008/0014196中之VEGF拮抗劑治療之非腫瘤病症包括但不限於不期望的或異常的肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬斑塊、肉瘤樣病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性及其他增生性視網膜病變，包括早產兒視網膜病變、晶狀體後纖維增生、新生血管性青光眼、年齡相關性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新生血管形成、角膜移植片新生血管形成、角膜移植片排斥、視網膜/脈絡膜新生血管形成、眼角新生血管形成(發紅)、眼部新生血管性疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格拉夫氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性發炎、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺動脈高壓、惡性肺積液、腦水腫(例如，與急性中風/閉合性頭部外傷/創傷有關)、滑膜發炎、RA中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關節炎(OA)、頑固性腹水、多囊性卵巢病、子宮內膜異位症、第三間隙液體疾病(胰腺炎、間隔症候群、燒傷、腸疾病)、子宮纖維樣肌瘤、早產分娩、慢性發炎(例如IBD(克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)、腎臟同種異體移植排斥、發炎性腸病、腎病症候群、不期望的或異常的組織積聚生長(非癌症)、血友病性關節、肥厚性瘢痕、毛髮生長抑制、奧斯勒-韋伯症候群(Osier-Weber syndrome)、膿性肉芽腫、晶狀體後纖維增生、硬皮病、沙眼、血管黏連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包腔積液(例如與心包炎有關)及胸膜腔積液。

在第一態樣中，本發明係關於包含至少一可變結構域之VEGF-結合分子，該可變結構域具有四個框架區及三個互補決定區(分別為CDR1、CDR2及CDR3)，其中該CDR3具有如SEQ ID NO: 1中所示胺基酸序列SerArg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr，其中位置5處之Xaa係Gly或Ala；位置7處之Xaa係Ser或Gly；位置12處之Xaa係Gly、Ala或Pro；位置13處之Xaa係Asp或Gly；位置16處之Xaa係Asp或Glu；且其中該VEGF-結合分子能夠以60%之抑制率阻斷人類重組VEGF165與人類重組VEGFR-2之間之相互作用。

根據較佳實施例中，位置5處之Xaa係Gly、位置7處之Xaa係Ser、位置12處之Xaa係Ala、且位置13處之Xaa係Asp。

具體而言，該CDR3具有選自以下之序列SEQ ID NO: 2　SRAYGSSRLRLGDTYDY；SEQ ID NO: 3　SRAYGSSRLRLADTYDY；SEQ ID NO: 4　SRAYGSSRLRLADTYEY；SEQ ID NO: 5　SRAYGSGRLRLADTYDY；SEQ ID NO: 6　SRAYASSRLRLADTYDY；SEQ ID NO: 7　SRAYGSSRLRLPDTYDY；SEQ ID NO: 8　SRAYGSSRLRLPGTYDY。

根據某些實施例，VEGF-結合分子包含一或多個免疫球蛋白單一可變結構域，其各自含有

a.　CDR3，其具有選自SEQ ID NO: 2至8中所示第一群組序列之胺基酸序列；

b.　CDR1及CDR2，其具有如表3中所指示含於選自SEQ ID NO: 9至46中所示第二群組之胺基酸序列之序列中的胺基酸序列，其中該第二序列含有根據a)選擇之各別CDR3。

根據較佳實施例，免疫球蛋白單一可變結構域係VHH。

根據具體實施例，VHH具有選自SEQ ID NO: 9-46中所示序列之胺基酸序列。

根據另一具體實施例，VHH具有選自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。

本發明亦係關於藉由上文所定義VHH經過親和力成熟及/或序列優化獲得之VEGF-結合分子，例如藉由具有SEQ ID NO: 18中所示胺基酸序列之VHH之序列優化獲得的VHH。實例係具有選自SEQ ID NO: 47-57中所示序列之胺基酸序列的VHH。

根據某些實施例，可如本文所定義模式化本發明VEGF-結合分子，例如，其可為雙互補位或包含兩個相同免疫球蛋白單一可變結構域。該等VEGF-結合分子可包含兩個或更多個VHH，其係

a)相同VHH，其能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間之相互作用，或

b)不同VHH，其結合VEGF之非重疊表位，其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間之相互作用且其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷該相互作用。

分別以60%或60%之抑制率阻斷該相互作用的百分比係指藉由如實例中所用Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay()、競爭ELISA、基於電漿共振(SPR)之分析based assay()測定之抑制率。

在下文中，根據a)之VHH之能力亦稱作「阻斷受體」，而根據b)之VHH之能力亦稱作「非阻斷受體」。

較佳地，阻斷受體之VHH具有80%、更佳90%之抑制率；最佳地，VHH係完全受體阻斷劑，即具有100%之抑制率。

VEGF-結合可含有兩個或更多個相同VHH a)，其係選自具有SEQ ID NO: 9-46中所示胺基酸序列之VHH或由該VHH經過親和力成熟及/或序列優化獲得之VHH。VHH可選自具有SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 47-57中所示胺基酸之VHH。

根據較佳實施例，模式化VEGF-結合分子包含兩個各自具有SEQ ID NO: 57中所示胺基酸序列之VHH。

在包含兩個不同VHH之模式化VEGF-結合分子中

a)該一或多個抑制率60%之VHH選自

i.　具有選自SEQ ID NO: 9-46中所示胺基酸序列之胺基酸序列的VHH，或

ii.由該等VHH經過親和力成熟及/或序列優化所獲得之VHH，且其中

b)該一或多個抑制率60%之VHH選自

i. SEQ ID NO: 58-124，或

ii.由該VHH經過親和力成熟及/或序列優化所獲得之VHH。

根據較佳實施例，兩個VHH包含於具有SEQ ID NO: 128-168中所示胺基酸序列之多肽中，且由表15中所指示之連接體序列隔開。

在較佳VEGF-結合分子中，VHH a) i.具有SEQ ID NO: 18中所示胺基酸序列且VHH b) i.具有SEQ ID NO: 64中所示胺基酸序列。

在其他較佳VEGF-結合分子中，a) ii.之VHH選自具有SEQ ID NO: 47-57中所示胺基酸序列之VHH且b) ii.之VHH選自具有SEQ ID NO: 125-127中所示胺基酸序列之VHH。

包含兩個VHH之雙互補位VEGF-結合分子尤佳，其中之一者具有SEQ ID NO: 57中所示胺基酸且其中之一者具有SEQ ID NO: 127中所示胺基酸。

關於治療應用具有改進性質(例如，增強親和力或降低免疫原性)之VEGF-結合分子可自本發明個別VEGF-結合分子藉由相關技藝中已知之技術(例如親和力成熟(例如，自合成、隨機或天然免疫球蛋白序列開始)、CDR移植、人類化、組合源自不同免疫球蛋白序列之片段、使用重疊引物之PCR裝配、及熟習此項技術者熟知之改造免疫球蛋白序列之類似技術；或上述任一者之任一適宜組合，亦稱作「序列優化」，如本文所述)獲得。參照(例如)標準手冊、以及其他說明及實例。

若適當，具有改進親和力之本發明VEGF-結合分子可藉由另一VEGF-結合分子經過親和力成熟獲得，關於「親和力成熟分子」，後一VEGF-結合分子代表「親本」VEGF-結合分子。

本發明較佳實施例之免疫球蛋白單一可變結構域(例如VHH及結構域抗體)具有許多獨特結構特性及功能性質，該等特性及性質使其極有利於作為功能性抗原結合分子用於治療中。具體而言且不限於此，VHH結構域(其本質上經「設計」以功能性結合抗原而不與輕鏈可變結構域配對)可起相對較小之單一功能性抗原結合結構單元之作用。

由於其獨特性質，如本文所定義免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH或VH(或VL))(單獨或作為較大多肽(例如雙互補位分子)之一部分)提供許多顯著優勢：

‧　僅需要單一結構域以高親和力及高選擇性結合抗原，從而使得既不需要存在兩個單獨結構域，亦不需要確保該兩個結構域以適當空間構象及構型存在(即與scFv一般，經由使用經特別設計之連接體)；

‧　免疫球蛋白單一可變結構域可自單一核酸分子表現且不需任何轉譯後修飾(如糖基化)；

‧　免疫球蛋白單一可變結構域可容易地改造成多價及多特異性模式(如本文進一步論述)；

‧　免疫球蛋白單一可變結構域對其目標具有高特異性及親和力、低固有毒性且可經由除輸注或注射以外之替代路徑投與；

‧　免疫球蛋白單一可變結構域對熱、pH、蛋白酶及其他變性劑或條件高度穩定，且因此，可不使用冷凍設備即製備、儲存或運輸；

‧　免疫球蛋白單一可變結構域以小規模及製造規模製備起來容易且花費相對較少。舉例而言，免疫球蛋白單一可變結構域可使用微生物發酵(例如，如下文進一步闡述)產生且關於(例如)習用抗體不需使用哺乳動物表現系統；

‧　免疫球蛋白單一可變結構域與習用4鏈抗體及其抗原結合片段相比相對較小(約15 kDa，或為習用IgG之1/10)，且因此顯示進入組織(包括但不限於實體瘤及其他緻密組織)中之(較)高滲透性且可以比該等習用4鏈抗體及其抗原結合片段高之劑量投與；

‧　VHH具有所謂特異性「腔結合性質」(尤其由於與4鏈抗體之VH結構域相比之其延長CDR3環)且因此亦可到達習用4鏈抗體及其抗原結合片段不可到達之目標及表位；

‧　VHH所具有之特定優勢在於其高度可溶且極為穩定並且無聚集之趨勢(關於小鼠衍生之抗原結合結構域，由Ward等人，Nature 341: 544-546(1989)闡述)。

關於獲得本發明免疫球蛋白單一可變結構域之具體生物來源或具體製備方法，本發明免疫球蛋白單一可變結構域並不受限。舉例而言，VHH可包括以下步驟：

(1)分離天然存在之重鏈抗體之VHH結構域；或篩分包含重鏈抗體或VHH之文庫及自其分離VHH；

(2)表現編碼具有天然存在序列之VHH之核酸分子；

(3)視情況在親和力成熟後「人類化」(如本文所述)具有天然存在序列之VHH或表現編碼該人類化VHH之核酸；

(4)「駝峰化」(如下文所述)動物物種、具體而言哺乳動物物種(例如人類)之天然存在抗體之免疫球蛋白單一可變重結構域或表現編碼該駝峰化結構域之核酸分子；

(5)「駝峰化」VH、或表現編碼該駝峰化VH之核酸分子；

(6)使用以合成或半合成方式製備蛋白質、多肽或其他胺基酸序列之技術；

(7)使用核酸合成之技術製備編碼VHH結構域之核酸分子，之後表現由此獲得之核酸；

(8)使重鏈抗體或VHH經過親和力成熟、誘變(例如，隨機誘變或定點誘變)及/或任一其他技術以增大VHH之親和力及/或特異性；及/或

(9)組合或選擇上述步驟。

適於實施上述步驟之方法及技術已為相關技藝中所知且熟習此項技術者將明瞭。舉例而言，獲得結合特異性抗原或表位之VHH結構域的方法已闡述於WO 2006/040153及WO 2006/122786中。

根據具體實施例，本發明中或存於本發明多肽中之免疫球蛋白單一可變結構域係胺基酸序列基本上對應於天然存在VHH結構域之胺基酸序列、但即藉由用人類習用4鏈抗體之可變重結構域中相應位置處出現之胺基酸殘基中的一或多者替代該天然存在VHH序列之胺基酸序列中之一或多個胺基酸殘基「人類化」或「序列優化」(視情況在親和力成熟後)的VHH結構域。此可使用相關技藝中已知之方法實施，此可由熟習此項技術者常規使用。

人類化VHH結構域可含有一或多個完整人類框架區序列，且在甚至更具體實施例中，可含有源自人類種系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分之人類框架區序列，或與其高度同源，且視情況與JH序列(例如JH5)組合。因此，人類化方案可包含用單獨或組合之種系VH基因(例如DP 47、DP 29及DP 51)之相應框架1、2及3(FR1、FR2及FR3)殘基替代VHH殘基中之任一者。本發明免疫球蛋白單一可變結構域之適宜框架區(FR)可選自彼等如(例如)WO 2006/004678中所闡釋者且特別包括所謂「KERE」及「GLEW」類別。實例係在位置44至47附近具有胺基酸序列G-L-E-W之免疫球蛋白單一可變結構域及其各自的人類化對等部分。人類化VHH結構域可含有一或多個完整人類框架區序列。

在以EVQ開始之本發明VHH中，N端E可由D取代(此通常係序列優化之結果)或其可丟失(就大腸桿菌中之VHH表現而言)。對於模式化VEGF-結合分子而言，此通常僅適用於N端定位之VHH。

屬於103 P,R,S-群及/或GLEW群(如下文所定義)之VHH結構域之較佳但非限制性人類化取代係108Q取代為108L。人類化免疫球蛋白單一可變結構域之方法已為相關技藝中已知。

根據另一實施例，免疫球蛋白單一可變結構域係如本文所定義結構域抗體。

在又一實施例中，本發明VEGF-結合免疫球蛋白單一可變結構域之代表性類別具有對應於天然存在VH結構域之胺基酸序列的胺基酸序列，其即藉由用重鏈抗體之VHH結構域中相應位置處出現之一或多個胺基酸殘基替代習用4 鏈抗體之天然存在可變重鏈之胺基酸序列中的一或多個胺基酸序列來「駝峰化」。此可以本身已知且熟習此項技術者明瞭之方式實施，且另外參照WO 94/04678。該駝峰化可在存於VH-VL介面及所謂駱駝科標誌殘基處之胺基酸位置處優先發生(例如，亦參見WO 94/04678)。另外，可自(例如)WO 2006/040153第46頁及第98頁及WO 2006/122786第107頁獲得該等「人類化」及「駝峰化」技術及與其一致之較佳框架區序列的詳細說明。

本發明VEGF-結合分子(例如免疫球蛋白單一可變結構域)對VEGF具有特異性在於其包含特異性結合VEGF分子內之一或多個表位之一或多個免疫球蛋白單一可變結構域。

可以本身已知之任一適宜方式測定VEGF-結合分子與其抗原VEGF之特異性結合，所述方式包括(例如)本文所述分析、Scatchard分析及/或競爭性結合分析，例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夾心競爭分析、及相關技藝中本身已知之其不同變化形式。

關於抗原VEGF，本發明VEGF-結合分子(例如免疫球蛋白單一可變結構域)並不受限於物種。因此，若意欲用於人類中之治療目的，則本發明免疫球蛋白單一可變結構域較佳結合人類VEGF。然而，結合另一哺乳動物物種之VEGF的免疫球蛋白單一可變結構域亦在本發明範疇內。結合VEGF之一種物種形式之本發明免疫球蛋白單一可變結構域可與具有與人類、一或多種其他物種不同之序列的VEGF交叉反應。舉例而言，結合人類VEGF之本發明免疫球蛋白單一可變結構域可與靈長類之一或多個其他物種之VEGF及/或動物之一或多種物種之VEGF呈現交叉反應性，該動物用於疾病之動物模型(例如猴子、小鼠、大鼠、兔、豬、狗)且具體而言用於與VEGF所調介血管發生之效應相關之疾病及病症的動物模型(例如本文所提及物種及動物模型)。顯示該交叉反應性之本發明免疫球蛋白單一可變結構域在研究及/或藥物研發中有利，此乃因其容許以確認疾病模型(例如猴子，具體而言食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus)、或小鼠及大鼠)測試本發明免疫球蛋白單一可變結構域。

較佳地，鑒於與在治療性VEGF拮抗劑之研發期間意欲用作動物模型之除人類外之物種之一或多個VEGF分子的交叉反應性，VEGF-結合分子識別與人類VEGF具有高度一致性之目標VEGF之區中的表位。

本發明免疫球蛋白單一可變結構域識別完全或部分位於VEGF之區中之表位，該區涉及與其受體、具體而言VEGFR-2之結合，已顯示腫瘤之新血管形成有原因地涉及該受體VEGFR-2之活化。根據較佳態樣，本發明免疫球蛋白單一可變結構域至少部分、較佳實質上且最佳完全阻斷VEGF受體活化、具體而言VEGFR-2活化。

如上文所述，可藉由如實例中所述Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay()、競爭ELISA、或基於電漿共振(SPR)之分析()測定VEGF-結合分子阻斷VEGF與其受體(具體而言VEGFR-2)之間之相互作用的能力。

較佳地，本發明免疫球蛋白單一可變結構域以小於500 nM、較佳小於200 nM、更佳小於10 nM(例如小於500 pM)之親和力(如由表面電漿共振分析所測定，如實例5.7中所述)結合VEGF。

較佳地，本發明免疫球蛋白單一可變結構域之IC₅₀值(如實例5.1.中所述競爭ELISA分析中所量測)的範圍為10^-6至10^-10莫耳/升或更小，更佳範圍為10^-8至10^-10莫耳/升或更小且甚至更佳範圍為10^-9至10^-10莫耳/升或更小。

根據本發明之非限制性但較佳實施例，本發明之VEGF-結合免疫球蛋白單一可變結構域以10^-5至10^-12莫耳/升(M)或更小且較佳10^-7至10^-12莫耳/升(M)或更小且更佳10^-8至10^-12莫耳/升(M)之解離常數(K_D)、及/或以至少10⁷ M^-1、較佳至少10⁸ M^-1、更佳至少10⁹ M^-1(例如至少10¹² M^-1)之締合常數(K_A)；且具體而言以小於500 nM、較佳小於200 nM、更佳小於10 nM(例如小於500 pM)之K_D結合VEGF。可測定本發明免疫球蛋白單一可變結構域針對VEGF之K_D及K_A值。

包含兩個或更多個免疫球蛋白單一可變結構域之雙互補位VEGF-結合分子基本上由以下組成或包含以下：(i)特異性結合VEGF之第一表位之第一免疫球蛋白單一可變結構域，及(ii)特異性結合VEGF之第二表位之第二免疫球蛋白單一可變結構域，其中VEGF之第一表位及VEGF之第二表位係不相同表位。換言之，本發明之該多肽包含針對VEGF中存在之至少兩個非重疊表位的兩個或更多個免疫球蛋白單一可變結構域或基本上由其組成，其中該等免疫球蛋白單一可變結構域以使其能夠同時結合VEGF之方式彼此連接。在此意義上，亦可將本發明多肽視為「二價」或「多價」免疫球蛋白構造體，且尤其視為「多價免疫球蛋白單一可變結構域構造體」，其中多肽含有至少兩個VEGF結合位點。(該等構造體亦稱作「模式化」VEGF結合分子，例如「模式化」VHH)。

本發明之該VEGF-結合分子包括(至少)兩個抗VEGF免疫球蛋白單一可變結構域，其中(該)兩個免疫球蛋白單一可變結構域較佳針對VEGF分子內之非重疊表位。因此，該兩個免疫球蛋白單一可變結構域將具有不同抗原特異性且因此具有不同CDR序列。出於此原因，本發明之該等多肽在本文中亦分別命名為「雙互補位多肽」、或「雙互補位結構域抗體構造體」(若免疫球蛋白單一可變結構域由結構域抗體組成或基本上由其組成)、或「雙互補位VHH構造體」(若免疫球蛋白單一可變結構域由VHH組成或基本上由其組成)，此乃因兩個免疫球蛋白單一可變結構域包括兩個不同互補位。

若本發明多肽係如本文所定義之雙互補位分子，則免疫球蛋白單一可變結構域組份之至少一者結合表位以便以80%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間之相互作用。如本發明之實驗中所示，某些模式化分子含有兩個均以80%之抑制率阻斷VEGFR2受體的VHH。本發明之某些VHH以100%之抑制率阻斷VEGFR-2，即其係完全阻斷劑。

在兩種情形下，本發明VEGF-結合分子內，例如N端、C端或位於兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可存在其他序列及部分，例如連接體序列及提供效應子功能之序列，本文中更詳細闡釋。

根據另一儘管較不佳實施例，本發明VEGF-結合分子包括兩個以上抗VEGF免疫球蛋白單一可變結構域，即三個、四個或甚至更多個抗VEGFVHH。在此情形下，抗VEGF免疫球蛋白單一可變結構域之至少二者係針對VEGF分子內之非重疊表位，其中任一其他免疫球蛋白單一可變結構域可結合兩個非重疊表位中之任一者及/或VEGF分子內存在之又一表位。

根據本發明，兩個或更多個免疫球蛋白單一可變結構域可彼此獨立地為如本文所定義之VHH或結構域抗體、及/或任一其他種類之免疫球蛋白單一可變結構域，例如VL結構域，前提係該等免疫球蛋白單一可變結構域可結合抗原，即VEGF。

根據較佳實施例，第一及第二免疫球蛋白單一可變結構域基本上由如本文所定義VHH序列或結構域抗體序列組成。根據尤佳實施例，第一及第二免疫球蛋白單一可變結構域基本上由VHH序列組成。

根據本發明之某些實施例，本發明VEGF-結合分子中存在之至少兩個免疫球蛋白單一可變結構域可彼此直接(即不使用連接體)連接或經由連接體連接。連接體較佳係連接體肽且應經選擇以便容許至少兩個不同免疫球蛋白單一可變結構域結合一個且相同VEGF分子內或兩個不同分子內之VEGF之其至少兩個非重疊表位中的一者。

適宜連接體尤其取決於表位且特別是免疫球蛋白單一可變結構域結合之VEGF上之表位之間的距離，且基於本文揭示內容、視情況在一定有限程度之常規實驗後將為熟習此項技術者明瞭。

同時，在結合VEGF之兩個或更多個免疫球蛋白單一可變結構域係VHH或結構域抗體時，其可分別經由第三VHH或抗體彼此連接(在該等VEGF-結合分子中，兩個或更多個免疫球蛋白單一可變結構域可直接或經由適宜連接體與該第三免疫球蛋白單一可變結構域連接)。該第三VHH或結構域抗體可為(例如)可延長半衰期之VHH或結構域抗體。舉例而言，後一VHH或結構域抗體可為能夠結合(人類)血清蛋白(例如(人類)血清白蛋白或(人類)鐵傳遞蛋白)之結構域抗體或VHH。

或者，結合VEGF之兩個或更多個免疫球蛋白單一可變結構域可串聯連接(直接或經由適宜連接體)且第三VHH或結構域抗體(其可延長半衰期)可直接或經由連接體與該兩個或更多個上文所提及免疫球蛋白序列中之一者連接。

本文結合本發明之特異性多肽闡述適宜連接體且其可-例如且不限於-包含胺基酸序列，該胺基酸序列較佳具有9個或更多個胺基酸、更佳至少17個胺基酸(例如約20至40個胺基酸)之長度。然而，上限並非關鍵，但出於方便之原因關於(例如)該等多肽之生物醫藥生產進行選擇。

連接體序列可為天然存在之序列或非天然存在之序列。若用於治療目的，則連接體較佳在投與本發明VEGF-結合分子之個體中具有非免疫原性。

連接體序列之一個有用之群組係源自重鏈抗體之鉸鏈區，如WO 96/34103及WO 94/04678中所述。

其他實例係聚-丙胺酸連接體序列，例如Ala-Ala-Ala。

連接體序列之更佳實例係不同長度之Gly/Ser連接體，例如(gly_xser_y)_z連接體，包括(gly₄ser)₃、(gly₄ser)₄、(gly₄ser)、(gly₃ser)、gly₃及(gly₃ser₂)₃。

本發明VEGF-結合分子(SEQ ID NO 128-168)中含有表15中所示之連接體之一些非限制性實例，例如連接體GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS；SEQ ID NO: 169)；GGGGSGGGS(9GS；SEQ ID NO: 170)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS；SEQ ID NO: 171)。

若藉由附接聚合物(例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分)修飾本發明之模式化VEGF-結合分子，則連接體序列較佳包括胺基酸殘基，例如半胱胺酸或賴胺酸，其容許在連接體區中進行該修飾(例如聚乙二醇化)。

用於聚乙二醇化之連接體之實例係：GGGGCGGGS(「GS9,C5」，SEQ ID NO: 172)；GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(「GS25,C5」，SEQ ID NO:173)GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG(「GS27,C14」，SEQ ID NO:174)，GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(「GS35,C15」，SEQ ID NO:175)，及GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(「GS35,C5」，SEQ ID NO:176)。

此外，連接體亦可為聚(乙二醇)部分，如(例如)WO 04/081026中所示。

在另一實施例中，至少兩個VEGF-結合免疫球蛋白單一可變結構域經由另一部分(視情況經由一或多個連接體)、例如在較佳但非限制性實施例中可為上述又一免疫球蛋白單一可變結構域的多肽彼此連接。該部分可基本上無活性或可具有生物效應(例如改進多肽之期望性質)或可賦予多肽一或多種額外期望性質。舉例而言且不限於，該部分可改進蛋白質或多肽之半衰期，及/或可降低其免疫原性或改進任一其他期望性質。

根據較佳實施例，本發明VEGF-結合分子尤其在意欲使用或用作治療劑時包括延長本發明多肽在患者之血清或其他體液中之半衰期的部分。術語「半衰期」定義為(經修飾)多肽之血清濃度因(例如)多肽之降解及/或由天然機制之清除及/或隔離在活體內降低50%所耗費之時間。

更特別地，該半衰期延長部分可與免疫球蛋白單一可變結構域共價連接或融合且可為(不限於)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白部分之片段、白蛋白結合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域)、鐵傳遞蛋白結合部分(例如抗鐵傳遞蛋白免疫球蛋白單一可變結構域)、聚氧基伸烷基分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白結合肽或羥乙基澱粉(HES)衍生物。

在另一實施例中，本發明VEGF-結合分子包含結合血液中發現之抗原之部分(例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、纖維蛋白原或鐵傳遞蛋白)，藉此賦予本發明所得之多肽延長之活體內半衰期。根據特別佳之實施例，該部分係白蛋白結合免疫球蛋白及尤佳白蛋白結合免疫球蛋白單一可變結構域，例如白蛋白結合VHH結構域。

若意欲用於人類中，則該白蛋白結合免疫球蛋白單一可變結構域較佳結合人類血清白蛋白且較佳係人類化白蛋白結合VHH結構域。

結合人類血清白蛋白之免疫球蛋白單一可變結構域已為相關技藝中所知且更詳細闡述於(例如)WO 2006/122786中。特別地，有用之白蛋白結合VHH係ALB 1及其人類化對等部分、ALB 8(WO 2009/095489)。然而，亦可使用以上專利公開案中所提及之其他白蛋白結合VHH結構域。

特別有用之白蛋白結合VHH結構域係由SEQ ID NO: 177中所示胺基酸序列組成或含有其之ALB8。

根據本發明之又一實施例，可將兩個免疫球蛋白單一可變結構域(較佳VHH)與血清白蛋白分子融合，例如WO 01/79271及 WO 03/59934中所述。如(例如)WO 01/79271中所述，可藉由習用重組技術獲得融合蛋白：將編碼血清白蛋白之DNA分子或其片段與編碼VEGF-結合分子之DNA接合，將所得構造體插入適於在所選宿主細胞(例如酵母細胞(如甲醇酵母(Pichia pastoris))或細菌細胞)中表現之質粒中，且隨後用融合核苷酸序列轉染宿主細胞且使其在適宜條件下生長。有用之HSA序列示於SEQ ID NO: 178中。

根據另一實施例，本發明多肽之半衰期延長修飾(該修飾亦降低多肽之免疫原性)包含附接適宜之藥理上可接受之聚合物，例如直鏈或具支鏈聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可使用任一適宜形式之聚乙二醇化，例如相關技藝中用於抗體及抗體片段(包括但不限於結構域抗體及scFv)之聚乙二醇化；參照(例如)：Chapman,Nat. Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv. Drug Deliv. Rev. 54,453-456(2003)；Harris及Chess,Nat. Rev. Drug. Discov. 2(2003)；及WO 04/060965。

用於多肽之聚乙二醇化之各種試劑亦可購自例如Nektar Therapeutics,USA、或NOF公司，Japan，例如SunbrightEA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如Sunbright ME-100MA、Sunbright ME-200MA及Sunbright ME-400MA。

較佳地，具體而言經由半胱胺酸殘基使用定向聚乙二醇化(例如，參見Yang等人，Protein Engineering 16,761-770(2003))。舉例而言，出於此目的，可將PEG附接至天然存於本發明多肽中之半胱胺酸殘基，本發明多肽可經修飾以便適宜地引入一或多個用於附接PEG之半胱胺酸殘基，或可將包含一或多個用於附接PEG之半胱胺酸殘基之胺基酸序列與本發明多肽之N端及/或C端融合，其均使用本身為熟習此項技術者已知之蛋白質改造技術。

較佳地，對於本發明多肽而言，所用PEG之分子量超過5 kDa，例如超過10 kDa且小於200 kDa，例如小於100 kDa；例如範圍為20 kDa至80 kDa。

關於聚乙二醇化，應注意，本發明通常亦涵蓋在一或多個胺基酸位置處、較佳以使該聚乙二醇化出現以下情況之方式聚乙二醇化的任一雙互補位VEGF-結合分子：(1)延長活體內半衰期；(2)降低免疫原性；(3)為聚乙二醇化提供一或多種本身已知之其他有益性質；(4)基本上不會影響多肽對VEGF之親和力(例如，不會將該親和力降低超過50%，且更佳不超過10%，如由相關技藝中所述適宜分析測定)；及/或(4)不會影響本發明VEGF-結合分子之其他期望性質中的任一者。適宜PEG基團及附接其之方法特別或非特別地為熟習此項技術者所明瞭。用於多肽之聚乙二醇化之各種試劑亦可購自例如Nektar Therapeutics,USA、或NOF公司，Japan，例如Sunbright EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如SunbrightME-100MA、Sunbright ME-200MA及Sunbright ME-400MA。

根據本發明之尤佳實施例，本發明之聚乙二醇化多肽包括分子量為40 kDa或60 kDa之直鏈PEG的一個PEG部分，其中該PEG附接至連接體區中之多肽、且特別地在如SEQ ID NO: 172中所示GS9-連接體肽之位置5處、如SEQ ID NO:174中所示GS27-連接體肽之位置14處、或如SEQ ID NO:175中所示GS35-連接體肽之位置15處、或如SEQ ID NO:176中所示35GS-連接體肽之位置5處的Cys殘基處附接。

可用上文所提及PEG試劑中之一者聚乙二醇化本發明VEGF-結合分子，該等試劑係例如「Sunbright ME-400MA」，如以下化學式中所示：

在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明VEGF-結合分子之核酸分子。該等核酸分子在本文中亦可稱作「本發明核酸」且亦可呈如本文所定義之遺傳構造體形式。本發明核酸可為基因組DNA、cDNA或合成DNA(例如特別適於在預期宿主細胞或宿主有機體中表現之使用密碼子的DNA)。根據本發明之一個實施例，本發明核酸呈基本上分離形式，如上文所定義。

本發明核酸亦可呈載體(例如質粒、黏粒或YAC)形式，可存於該載體中及/或可為該載體之部分。載體尤其可為表現載體，即可在活體外及/或活體內(即在適宜宿主細胞、宿主有機體及/或表現系統中)表現VEGF-結合分子之載體。該表現載體通常包含本發明之至少一種核酸，其以可操作方式與一或多種適宜調控要素(例如啟動子、增強子、終止子及諸如此類)連接。關於具體宿主中之特異性序列之表現的該等要素及其選擇係熟習此項技術者之常識。調控要素及對於本發明VEGF-結合分子之表現有用或所需之其他要素(例如啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記、前導序列、報告基因及諸如此類)揭示於(例如)WO 2006/040153第131至133頁上。

本發明核酸可以本身已知之方式(例如，藉由自動DNA合成及/或重組DNA技術)基於本文給出之關於本發明多肽之胺基酸序列的資訊製備或獲得，及/或可分離自適宜天然來源。

在另一態樣中，本發明係關於表現或能夠表現一或多種本發明VEGF-結合分子；及/或含有本發明核酸之宿主細胞。根據尤佳實施例，該等宿主細胞係細菌細胞，其他有用細胞係酵母細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。

適宜細菌細胞包括來自革蘭氏(gram)陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)、變形菌(Proteus)及假單胞菌(Pseudomonas)等菌株)、及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽胞桿菌(Bacillus)、鏈黴菌(Streptomyces)、葡萄球菌(Staphylococcus)及乳球菌(Lactococcus)等菌株)的細胞。適宜真菌細胞包括來自木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌(Neurospora)及曲黴菌屬(Aspergillus)物種之細胞。適宜酵母細胞包括來自酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如甲醇酵母及甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢遜酵母屬(Hansenula)物種之細胞。

適宜哺乳動物細胞包括(例如)CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞及諸如此類。然而，亦可使用相關技藝中用於表現異源蛋白之兩棲動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞及任何其他細胞。

本發明進一步提供製造本發明VEGF-結合分子之方法，該等方法通常包含以下步驟：-　在容許本發明VEGF-結合分子表現之條件下培養包含能夠編碼VEGF-結合分子之核酸的宿主細胞；及-　自培養物回收或分離由宿主細胞表現之多肽；及-　視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明VEGF-結合分子。

對於工業規模之生產而言，較佳宿主有機體包括適於大規模表現、生產及發酵、且具體而言適於大規模醫藥表現、生產及發酵的大腸桿菌、甲醇酵母及釀酒酵母之菌株。

具體表現系統之選擇部分取決於對某些轉移後修飾、更特別地糖基化之需要。期望或需要糖基化之本發明VEGF-結合分子的產生將必須使用具有使表現蛋白質糖基化之能力的哺乳動物表現宿主。就此而言，熟習此項技術者應明瞭，所得糖基化模式(例如，所附接殘基之種類、數量及位置)將取決於用於表現之細胞或細胞系。

本發明VEGF-結合分子可在上文所闡釋細胞中在細胞內(例如，在細胞溶質中、在外周質中或在包涵體中)產生且隨後自宿主細胞分離並視情況進一步純化；或其可在細胞外(例如，在培養宿主細胞之培養基中)中產生且隨後自培養基分離並視情況進一步純化。

相關技藝中已知用於多肽之重組產生之方法及試劑(例如，特異性適宜表現載體、轉化或轉染方法、選擇標記、誘導蛋白質表現之方法、培養條件及諸如此類)。類似地，熟習此項技術者熟知用於本發明多肽之製造方法中的蛋白質分離及純化技術。

在又一態樣中，本發明係關於具有包含於抗VEGF-VHH中之CDR3的胺基酸序列之肽、及編碼其之核酸分子，該抗VEGF-VHH具有分別選自SEQ ID NO: 9至57或SEQ ID NO: 58-127中所示序列。

該等肽對應於衍生自本發明VHH之CDR3。該等肽(具體而言編碼其之核酸分子)可用於CDR移植以替代免疫球蛋白鏈中之CDR3、或用於插入非免疫球蛋白架構(例如蛋白酶抑制劑、DNA結合蛋白、細胞色素b562、螺旋束蛋白質、二硫鍵肽、脂質運載蛋白或抗運載蛋白(anticalin))中，由此賦予該架構目標結合性質。CDR移植之方法已在相關技藝中眾所周知且已廣泛用於(例如)人類化抗體(其通常包含將齧齒動物抗體之CDR移植至人類抗體之Fv框架上)。

為獲得含有本發明CDR3之免疫球蛋白或非免疫球蛋白架構，可根據分子生物學之標準方法藉由(例如)基因合成、藉由寡核苷酸退火或借助重疊PCR片段獲得編碼該分子之DNA，如(例如)Daugherty等人，1991，Nucleic Acids Research，第19卷，9，2471-2476所述。將VHH CDR3插入非免疫球蛋白架構中之方法已由Nicaise等人，2004，Protein Science，13，1882-1891闡述。

本發明進一步係關於產物或組合物，其含有或包含本發明之至少一種VEGF-結合分子及視情況(即端視組合物之預期用途而定)該等組合物中本身已知之一或多種其他組份。

對於醫藥用途而定，可將本發明VEGF-結合分子調配成包含本發明之至少一種VEGF-結合分子及至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及/或佐劑、及視情況一或多種其他醫藥活性多肽及/或多肽的醫藥製劑或組合物。借助非限制性實例，該調配物可呈適於經口投與、適於非經腸投與(例如藉由靜脈內、肌內或皮下注射或靜脈內輸注)、適於局部投與、適於藉由吸入、藉由皮膚貼劑、藉由植入物、藉由栓劑等投與的形式。該等適宜投與形式-端視投與方式而定，其可為固體、半固體或液體-以及其製備中所用方法及載劑將為熟習此項技術者所明瞭且在本文中進一步闡述。

因此，在又一態樣中，本發明係關於含有本發明之至少一種VEGF-結合分子、具體而言一種免疫球蛋白單一可變結構域及至少一種適宜載劑、稀釋劑或賦形劑(即適於醫藥用途)、及視情況一或多種其他活性物質之醫藥組合物。

可以本身已知之任一適宜方式調配並投與本發明VEGF-結合分子：具體而言對於免疫球蛋白單一可變結構域而言，參照(例如)WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867及WO 08/020079、以及標準手冊，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing公司，USA(1990)，Remington，the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或Handbook of Therapeutic Antibodies(S. Dubel編輯)，Wiley,Weinheim,2007(例如，參見第252-255頁)。

舉例而言，對於習用抗體及抗體片段(包括ScFv及雙抗體)及其他醫藥活性蛋白質而言，可以本身已知之任一方式調配並投與本發明免疫球蛋白單一可變結構域。該等調配物及其製備方法將為熟習此項技術者所明瞭且包括(例如)適於非經腸投與(例如靜脈內、腹膜腔內、皮下、肌內、管腔內、動脈內或鞘內投與)或適於局部(即晶片或皮內)投與的製劑。

非經腸投與之製劑可為(例如)適於輸注或注射之無菌溶液、懸浮液、分散液或乳液。適於該等製劑之載劑或稀釋劑包括(例如但不限於)無菌水及醫藥上可接受之水性緩衝液及溶液(例如生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏(Ringer's)溶液、右旋糖溶液及漢克氏(Hanks')溶液)；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇或以及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油、以及其適宜混合物。通常，水性溶液或懸浮液將較佳。

因此，本發明VEGF-結合分子可與醫藥上可接受之媒劑(例如惰性稀釋劑或可同化之食用載劑)組合全身(例如經口)投與。對於經口治療性投與而言，本發明VEGF-結合分子可與一或多種賦形劑組合且以可咀嚼錠劑、經頰錠劑、片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、乾膠片及諸如此類等形式使用。該等組合物及製劑應含有至少0.1%之本發明VEGF-結合分子。其在組合物及製劑中之百分比當然可有所變化且可方便地為所給出單位劑型之約2重量%至約60重量%。該等治療有用之組合物中之本發明VEGF-結合分子之量應使得可獲得有效劑量量。

錠劑、丸劑、膠囊及諸如此類亦可含有結合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑及調味劑或矯味劑，例如彼等WO 08/020079第143-144頁上所提及者。在單位劑型係膠囊時，除以上類型之材料外其亦可含有液體載劑，例如植物油或聚乙二醇。可存在作為塗層或以其他方式修飾固體單位劑型之物理形式之各種其他材料。舉例而言，錠劑、丸劑或膠囊可塗覆有明膠、蠟、蟲膠或糖及諸如此類。糖漿或酏劑可含有本發明VEGF-結合分子、作為甜味劑之蔗糖或果糖、作為防腐劑之對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、諸如櫻桃味或橙味調味劑等染料及調味料。當然，用於製備任一單位劑型之任一材料的所用量應在醫藥上可接受且實質上無毒。另外，可將本發明VEGF-結合分子納入持續釋放製劑及裝置中。

用於經口投與之製劑及調配物亦可提供有腸溶包衣，其容許本發明之構造物抵抗胃環境並進入腸。更通常，用於經口投與之製劑及調配物可經適宜調配用於遞送至胃腸道之任一期望部分中。另外，適宜栓劑可用於遞送至胃腸道中。

亦可藉由輸注或注射靜脈內或腹膜腔內投與本發明VEGF-結合分子，如WO 08/020079第144及145頁上進一步闡述。

對於本發明VEGF-結合分子之局部投與而言，通常期望將其以組合物或調配物形式與可為固體或液體之皮膚病學上可接受之載劑組合投與皮膚，如WO 08/020079第145頁上進一步闡述。

通常，液體組合物(例如洗液)中之本發明VEGF-結合分子之濃度可為約0.1-25 wt-%、較佳約0.5-10 wt-%。半固體或固體組合物(例如凝膠或粉末)中之濃度可為約0.1-5 wt-%、較佳約0.5-2.5 wt-%。

用於治療中所需本發明VEGF-結合分子之量可不僅隨所選之特定VEGF-結合分子而變，而且亦隨投與途徑、所治療病狀之性質及患者之年齡及狀況而定且最終由會診醫師或臨床醫師來判斷。同時，本發明VEGF-結合分子之劑量端視目標細胞、腫瘤、組織、移植物或器官而有所變化。

期望劑量可方便地以單一劑量或以適當間隔投與之分開劑量(例如，每天兩個、三個、四個或更多個分劑量)呈現。亞劑量本身可進一步分成(例如)許多離散鬆散間隔投與；例如自吹入器多次吸入或藉由向眼中施加複數滴。

投與方案可包括長期、每日治療。「長期」意指持續至少兩週且較佳若干週、月或年。熟習此項技術者可僅使用本文教示給出之常規實驗確定此劑量範圍中之必需修飾。參見Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin，E.W.，第4版)，Mack Publishing公司，Easton,PA。倘若任何複雜化，則可由個別醫師調節劑量。

根據又一實施例，本發明係關於VEGF-結合分子(例如免疫球蛋白單一可變結構域)用於治療目的之用途，例如-用於預防、治療及/或減輕尤其人類中之病症、疾病或病狀，該病症、疾病或病狀與VEGF所調介血管發生之效應相關且可藉由用VEGF-結合分子調節Notch信號傳導途徑得以預防、治療或減輕，-　用於治療需要該療法之患者的方法中，該方法包含向有需要之個體投與醫藥活性量之本發明之至少一種VEGF-結合分子(例如免疫球蛋白單一可變結構域)、或含有其之醫藥組合物；-　用於製備用於預防、治療或減輕與VEGF所調介血管發生之效應相關的病症、疾病或病狀的藥劑；-　作為活性成份用於出於以上目的使用之醫藥組合物或藥劑中。

根據具體態樣，該病症、疾病或病狀係癌症或癌症性疾病，如本文所定義。

根據另一態樣，該疾病係眼病，其與VEGF所調介血管發生之效應相關或可藉由用VEGF-結合分子調節Notch信號傳導途徑得以治療或減輕。

端視擬治療之癌症性疾病，本發明VEGF-結合分子可單獨或與一或多種額外治療劑組合使用，治療劑尤其選自如DNA破壞劑等化學治療劑或抑制血管發生、信號轉導途徑或癌細胞有絲分裂關卡之治療活性化合物。

該額外治療劑可與VEGF結合分子同時投與(視情況作為相同醫藥製劑之組份)，或在VEGF結合分子投與之前或之後投與。

在某些實施例中，該額外治療劑可為(不限於)(且在受體情形下，包括各自配體)一或多種選自由EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR抑制劑之群之抑制劑。

額外治療劑之其他實例係CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90抑制劑、刺蝟拮抗劑、JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB抑制劑、蛋白酶體、Rho、wnt信號傳導抑制劑或泛素化途徑抑制劑或Notch信號傳導途徑之另一抑制劑。

Aurora抑制劑之實例係(不限於)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。

PLK抑制劑之實例係GSK-461364。

raf抑制劑之實例係BAY-73-4506(亦為VEGFR抑制劑)、PLX 4032、RAF-265(另外亦為VEGFR抑制劑)、索拉非尼(sorafenib)(另外亦為VEGFR抑制劑)及XL 281。

KSP抑制劑之實例係伊帕尼西(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。

src及/或bcr-ab1抑制劑之實例係達沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL 228(亦為IGF-1R抑制劑)、尼羅替尼(nilotinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑)、伊馬替尼(imatinib)(亦為cKit抑制劑)及NS-187。

PDK1抑制劑之實例係BX-517。

Rho抑制劑之實例係BA-210。

PI3激酶抑制劑之實例係PX-866、BEZ-235(亦為mTor抑制劑)、XL418(亦為Akt抑制劑)、XL-147及XL 765(亦為mTor抑制劑)。

cMet或HGF抑制劑之實例係XL-184(亦為VEGFR、cKit、Flt3抑制劑)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦為VEGFR抑制劑)、MGCD-265(亦為VEGFR、Ron、Tie2抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。

c-Myc抑制劑之實例係CX-3543。

Flt3抑制劑之實例係AC-220(亦為cKit及PDGFR抑制劑)、KW 2449、來他替尼(lestaurtinib)(亦為VEGFR、PDGFR、PKC抑制劑)、TG-101348(亦為JAK2抑制劑)、XL-999(亦為cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib)(亦為PDGFR、VEGFR及cKit抑制劑)及坦度替尼(tandutinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑)。

HSP90抑制劑之實例係坦螺旋黴素(tanespimycin)、阿螺旋黴素(alvespimycin)、IPI-504及CNF 2024。

JAK/STAT抑制劑之實例係CY-T-997(亦與微管蛋白相互作用)、TG 101348(亦為Flt3抑制劑)及XL-019。

Mek抑制劑之實例係ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL518。

mTor抑制劑之實例係坦西莫司(temsirolimus)、AP-23573(其亦起VEGF抑制劑作用)、依維莫司(everolimus)(亦為VEGF抑制劑)、XL-765(亦為PI3激酶抑制劑)及BEZ-235(亦為PI3激酶抑制劑)。

Akt抑制劑之實例係哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱(triciribine)。

cKit抑制劑之實例係AB-1010、OSI-930(亦起VEGFR抑制劑作用)、AC-220(亦為Flt3及PDGFR抑制劑)、坦度替尼(亦為Flt3及PDGFR抑制劑)、阿西替尼(axitinib)(亦為VEGFR及PDGFR抑制劑)、XL-999(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR抑制劑)、舒尼替尼(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR抑制劑)及XL-820(亦起VEGFR及PDGFR抑制劑作用)、伊馬替尼(亦為bcr-abl抑制劑)、尼羅替尼(亦為bcr-abl及PDGFR抑制劑)。

刺蝟拮抗劑之實例係IPI-609及CUR-61414。

CDK抑制劑之實例係塞利西裏(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG 024322。

蛋白酶體抑制劑之實例係硼替佐米(bortezomib)、卡夫佐米(carfilzomib)及NPI-0052(亦為NFκB抑制劑)。

NFκB途徑抑制劑之實例係NPI-0052。

泛素化途徑抑制劑之實例係HBX-41108。

在較佳實施例中，額外治療即係抗血管生成劑。

抗血管生成劑之實例係FGFR、PDGFR及VEGFR或各自配體(例如VEGF抑制劑，如培加尼布(pegaptanib)，或抗VEGF抗體貝伐珠單抗)、EGFL7抑制劑(例如抗EGFL7 Mab)、血管生成素1/2抑制劑(例如AMG386)、及沙立度胺(thalidomide)，該等藥劑選自(不限於)貝伐珠單抗、莫特撒尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(亦為CDK抑制劑)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、ImiD(免疫調節藥物)、沙立度胺衍生物CC-4047、來那度胺(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、布瑞法尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(亦為cKit及Flt3抑制劑)、1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-1530(亦為Flt3抑制劑)、舒尼替尼(亦為cKit及Flt3抑制劑)、阿西替尼(亦為cKit抑制劑)、來他替尼(亦為Flt3及PKC抑制劑)、瓦他拉尼(vatalanib)、坦度替尼(亦為Flt3及cKit抑制劑)、易瑞莎(pazopanib)、GW 786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR-258、索拉非尼甲苯磺酸鹽(亦為Raf抑制劑)、RAF-265(亦為Raf抑制劑)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(亦為EGFR及Her2抑制劑)、BAY-57-9352(亦為Raf抑制劑)、BAY-73-4506(亦為Raf抑制劑)、XL 880(亦為cMet抑制劑)、XL-647(亦為EGFR及EphB4抑制劑)、XL 820(亦為cKit抑制劑)及尼羅替尼(亦為cKit及brc-abl抑制劑)。

該額外治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體。抗EGFR抗體之實例係(不限於)西土西單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制劑之實例係吉非替尼(gefitinib)。EGFR調節劑之另一實例係E GF融合毒素。

可與本發明VEGF結合分子組合使用之EGFR及Her2抑制劑係拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西土西單抗、曲司佐單抗(trastuzumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮妥木單抗(zalutumumab)、凡德他尼(亦為VEGFR抑制劑)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626 ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦為VEGFR抑制劑)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。

可有利地在療法中與本發明VEGF結合分子組合之其他藥劑係托西莫單抗(tositumomab)及替坦異貝莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(兩種經放射標記之抗CD20抗體)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)(抗CD52抗體)、狄諾塞麥(denosumab)(破骨細胞分化因子配體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab)(CD80拮抗劑)、奧法妥木單抗(ofatumumab)(CD20抑制劑)、紮木單抗(zanolimumab)(CD4拮抗劑)、SGN40(CD40配體受體調節劑)、利妥昔單抗(rituximab)(CD20抑制劑)、麥妥木單抗(mapatumumab)(TRAIL-1受體激動劑)、REGN421(SAR153192)或OMP-21M18(D114抑制劑)。

可用於與本發明VEGF-結合分子組合之其他化學治療藥物選自但不限於激素、激素類似物及抗激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氫可的松(fludrocortinsone)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、奧曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))、LHRH激動劑及拮抗劑(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、組胺瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代謝物(例如，如甲胺蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)等抗葉酸藥、如5氟尿嘧啶(5 fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、地西他濱(decitabine)、耐拉濱(nelarabine)、及吉西他濱(gemcitabine)等嘧啶類似物、諸如巰嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、克拉屈濱(cladribine)及噴司他丁(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)等嘌呤及腺苷類似物)；抗腫瘤抗生素(例如蒽環抗生素(anthracycline)，如多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊達比星(idarubicin)、絲裂黴素(mitomycin-C)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、普卡黴素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹克生瓊(pixantrone)、鏈尿黴素(streptozocin))；鉑衍生物(例如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、洛鉑(lobaplatin)、沙鉑(satraplatin))；烷基化劑(例如雌莫司汀(estramustine)、美克洛噻胺(meclorethamine)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、羥基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、諸如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine)等亞硝基脲、噻替派(thiotepa))；抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼，如長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春氟寧(vinflunine)及長春新鹼(vincristine)；及紫杉烷(taxane)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)及其調配物、拉洛他賽(larotaxel)；西莫他賽(simotaxel)及埃坡黴素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕妥匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼桕毒素(epipodophyllotoxin)，如依託泊苷(etoposide)及凡畢複(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及諸如胺磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干擾素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)及卟吩姆(porfimer)、貝沙羅汀(bexarotene)、塞來考昔(celecoxib)等混雜化學治療劑。

端視具體目標疾病或病症而定，可使用任一適宜活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知之動物模型、或其任一組合測試本發明之VEGF-結合分子或多肽及包含其之組合物的功效。適宜分析及動物模型將為熟習此項技術者所明瞭且包括(例如)本文所述且下文實例中所用之分析，例如增生分析。

本發明實驗中獲得之數據證實，本發明VEGF-結合分子具有優於先前技術之VEGF-結合分子之彼等性質的性質。其中該等性質係VEGF165-VEGFR2相互作用之競爭抑制及低IC50(如可(例如)自圖1及表5之ELISA數據取得)以及如圖3、17、18及表7中所示AlphaScreen分析中之VHH之IC₅₀(nM)值；及表9、10及圖5-1及5-2中之純化VHH對重組人類VEGF及小鼠VEGF之親和力K_D(nM)。同樣，如表13中所示，在HUVEC增生分析中，本發明之VEGF結合劑具有高效能，即在亞奈莫耳範圍內。此指示本發明VEGF-結合分子係在與VEGF所調介血管發生之效應相關之疾病及病症(例如癌症)中具有治療功效之有前景之候選者。

根據本發明之另一實施例，提供診斷疾病之方法，其係藉由以下方式完成：

a)試樣與如上文所定義之本發明VEGF-結合分子接觸，及

b)測該VEGF-結合分子與該試樣之結合，及

c)較步驟(b)中檢測之結合與標準品，其中相對於該試樣之結合差別可診斷與VEGF所調介血管發生之效應相關之疾病或病症。

對於此用途及其他用途，藉由(例如)引入作為特異性結合對(例如生物素-(鏈黴)抗生物素結合對)之一部分的官能團進一步修飾本發明VEGF-結合分子可為有用的。該官能團可用於連接本發明VEGF-結合分子與結合該結合對之另一半之另一蛋白質、多肽或化合物，即經由形成結合對。舉例而言，本發明VEGF-結合分子可與生物素偶聯或與另一蛋白質、多肽、化合物或載劑結合或與抗生物素或鏈黴抗生物素偶聯。舉例而言，本發明之該偶聯VEGF-結合分子可在(例如)診斷系統中用作受體，其中可檢測之產生信號之試劑與抗生物素或鏈黴抗生物素偶聯。

材料及方法： a) VEGF109之產生及功能性測試

將編碼人類血管內皮生長因子同型異構體VEGF165 GenBank：AAM03108.1；AA殘基27-135)之受體結合結構域的cDNA選殖至pET28a載體(Novagen,Madison,WI)中並在大腸桿菌(BL21 Star DE3)中過表現為His標記之不溶性蛋白質。藉由添加1 mM IPTG誘發表現並於37℃下繼續4小時。藉由離心收穫細胞並藉由超音波處理細胞沉澱使其裂解。藉由離心分離包涵體。在用1% Triton×100(Sigma-Aldrich)之洗滌步驟後，使用7.5 M鹽酸胍溶解蛋白質並藉由使用具有6 M至0 M之減小脲濃度之緩衝液連續進行幾輪過夜透析來再摺疊。藉由使用MonoQ5/50GL(Amersham BioSciences)管柱之離子交換層析、之後利用Superdex75 10/300 GL管柱(Amersheim BioSciences)之凝膠過濾純化再摺疊蛋白質。藉由SDS-PAGE及西方印跡確認蛋白質之純度及均勻性。另外，藉由ELISA監測與VEGFR1、VEGFR2及貝伐珠單抗之結合活性。為此，於4℃下將1 μg/mL重組人類VEGF109在96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定過夜。用酪蛋白溶液(1%)封阻各孔。向VEGF109塗覆板中添加VEGFR1、VEGFR2或貝伐珠單抗之連續稀釋物並使用鹼性磷酸酶(AP)偶聯之山羊抗人類IgG、Fc特異性試劑(Jackson Immuno Research Laboratories公司，West Grove,PA,USA)及隨後在受質PNPP(磷酸對硝基苯酯)(Sigma-Aldrich)存在下進行之酶反應來檢測結合。VEGF109可結合VEGFR1、VEGFR2及貝伐珠單抗，此指示所產生VEGF109具有活性。

b) VEGF165之KLH偶聯及KLH-偶聯之VEGF165之功能性測試

使用具有mcKLH(Pierce,Rockford,IL,USA)之Imject Immunogen EDC套組根據製造商之說明書將重組人類VEGF165(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)與海水養殖鑰孔蟲戚血蘭素mcKLH(Pierce,Rockford,IL,USA)偶聯。藉由SDS-PAGE確認多肽與mcKLH之有效偶聯。藉由ELISA檢查偶聯蛋白質之功能性：於4℃下將2 μg/mL KLH偶聯之VEGF165在96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定過夜。用酪蛋白溶液(1%)封阻各孔。添加VEGFRI或VEGFR2之連續稀釋物並使用辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯之山羊抗人類IgG、Fc特異性試劑(Jackson Immuno Research Laboratories公司，West Grove,PA,USA)及隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行之酶反應來檢測結合。KLH偶聯蛋白質仍可與VEGFR1、VEGFR2及貝伐珠單抗相互反應，此確認VEGF165上之相關表位仍可到達。

實例1 利用不同VEGF模式之免疫接種會誘發駱馬中之體液免疫反應 1.1　免疫接種

在獲得獸醫學院(University Ghent,Belgium)倫理委員會批准後，根據標準方案利用重組人類VEGF109之6次肌內注射(100或50 μg/劑量，以每週間隔)對4只駱馬(指定為第264、265、266、267號)進行免疫。將第0天時之第一次注射物調配於完全弗氏(Freund's)佐劑(Difco,Detroit,MI,USA)中，而將後續注射物調配於不完全弗氏佐劑(Difco,Detroit,MI,USA)中。另外，根據以下方案對四隻駱馬(指定為第234、235、280及281號)進行免疫：5次肌內注射KLH-偶聯之人類VEGH165(100或50 μg/劑量，以每兩週間隔)，之後4次肌內注射人類VEGF109(第一劑量100 μg，之後2週後以每週間隔三次50 μg/劑量)。

1.2　駱馬中之VEGF誘發之免疫反應的評價

為監測VEGF特異性血清效價，設定ELISA分析，其中於4℃下將2 μg/mL之重組人類VEGF165或VEGF109在96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定過夜。用酪蛋白溶液(1%)封阻各孔。在添加血清稀釋液後，使用辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯之山羊抗駱馬免疫球蛋白(Bethyl Laboratories公司，Montgomery，TX，USA)及隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行之酶反應來檢測結合之總IgG。對於駱馬264、265、266及267而言，實施額外ELISA，其中評價針對VEGF165及VEGF109之同種型特異性反應。先後使用特異性識別習用駱馬IgG1及僅有重鏈之駱馬IgG2及IgG3的小鼠mAb[Daley等人(2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386]及兔抗小鼠HRP偶聯物(DAKO)檢測同種型特異性反應。使用TMB作為發色受質使ELISA顯影且於450 nm下量測吸光度。每一駱馬之血清效價繪示於表1中。

表1：針對VEGF165及VEGF109之抗體調介之特異性血清反應

ELISA(重組蛋白質固相塗覆)

實例2 僅有重鏈之抗體片段譜之選殖及噬菌體之製備

在最後免疫原注射後，自免疫駱馬收集作為產生重鏈抗體之B細胞之來源的免疫組織。通常，每只動物收集在最後一次抗原注射4天及8天後收集之兩個150-ml血樣及在最後一次抗原注射4天後收集之一個淋巴結活檢。使用Ficoll-Hypaque根據製造商之說明書(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)自血樣製備周邊血單核細胞(PBMC)。自PBMC及淋巴結活檢提取總RNA，其作為起始材料用於RT-PCR以擴增編碼VHH之DNA區段，如WO 05/044858中所述。對於每一免疫駱馬而言，藉由彙集自該動物之所有收集免疫組織分離的總RNA構造文庫。簡言之，經由特定限制位點將PCR擴增之VHH譜選殖至指定載體中以有利於VHH文庫之噬菌體展示。載體源自pUC119且含有LacZ啟動子、M13噬菌體gIII蛋白質編碼序列、氨苄西林(ampicillin)或羧苄西林(carbenicillin)之抗性基因、多選殖位點及雜合gIII-pelB前導序列(pAX050)。在具有VHH編碼序列之框架中，載體編碼C端c-myc標籤及His6標籤。根據標準方案製備噬菌體並在過濾滅菌後於4℃下儲存用於進一步使用。

實例3 經由噬菌體展示之VEGF特異性VHH之選擇

VHH噬菌體文庫用於施加多個選擇條件之不同選擇策略。變量包括i)VEGF蛋白質模式(rhVEGF165、rhVEGF109或rmVEGF164)、ii)抗原遞呈方法(固相：直接塗覆或經由生物素-標籤塗覆至中性鏈親和素塗覆板上；溶液相：在溶液中培育，之後捕獲於中性鏈親和素塗覆板上)、iii)抗原濃度及iv)洗脫方法(胰蛋白酶或使用VEGFR2之競爭性洗脫)。所有選擇均係在Maxisorp 96孔板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中實施。

如下實施選擇：將噬菌體文庫在RT下與存於溶液中或固定於固體載體上之不同濃度之VEGF抗原一起培育。在培育2 hr並充分洗滌後，洗脫結合之噬菌體。在胰蛋白酶用於噬菌體洗脫之情形下，藉由添加0.8 mM蛋白酶抑制劑AEBSF立刻中和蛋白酶活性。顯示優於背景之富集之噬菌體輸出物用於感染大腸桿菌。經感染大腸桿菌細胞用於製備噬菌體用於下一輪選擇(噬菌體挽救)或平鋪於瓊脂板(LB+amp+葡萄糖^2%)上用於個別VHH純系之分析。為篩分特定結合劑之選擇輸出物，自瓊脂板挑選單一純系並使其在1 mL 96深孔板中生長。藉由添加IPTG(最終為0.1-1mM)誘發lacZ對照之VHH表現。根據標準方法製備周質提取物(體積為~80 μL)。

實例4 VEGF-結合及阻斷VEGF受體之VHH之識別

藉由ELISA測試周質提取物與人類VEGF165之結合。簡言之，於4℃下將2 μg/mL重組人類VEGF165在96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定過夜。用酪蛋白溶液(1%)封阻各孔。在添加通常10倍稀釋之周質提取物後，使用小鼠抗-myc(Roche)及抗小鼠-HRP偶聯物(DAKO)檢測VHH結合。將顯示ELISA信號比背景高>3倍之純系視為VEGF結合VHH。

另外，在人類VEGF165/人類VEGFR2 AlphaScreen分析(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)中篩分周質提取物以評定VHH之阻斷能力。使用硫代-NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL,USA)生物素化人類VEGF165。使用與受體珠粒偶合之抗人類FcVHH根據製造商之說明書(Perkin Elmer,Waltham,MA,US)捕獲人類VEGFR2/Fc嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。為評價VHH之中和能力，將周質提取物以1/25稀釋於含有0.03%吐溫(Tween) 20(Sigma-Aldrich)之PBS緩衝液中並於室溫(RT)下與0.4 nM生物素化人類VEGF165一起預培育15分鐘。向此混合物中添加受體珠粒(10 μg/ml)並添加0.4 nM VEGFR2-huFc並於RT下在黑暗中進一步培育1小時。隨後，添加供體珠粒(10 μg/ml)，之後於RT下在黑暗中培育1小時。藉由在Envision Multi label Plate讀數器(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上使用680 nm之激發波長及介於520 nm與620 nm之間之發射波長對板進行讀數來量測螢光。使用含有不相關VHH之周質提取物作為陰性對照。將能夠將螢光信號相對於陰性對照之信號減小60%以上之含有抗VEGF165 VHH的周質提取物識別為命中(hit)。在競爭ELISA中確認AlphaScreen中識別之所有命中。為此，將1 μg/mL人類VEGFR2嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)塗覆於96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在存於含有0.1%酪蛋白及0.05%吐溫20(Sigma-Aldrich)之PBS緩衝液中的固定濃度(4 nM)之生物素化人類VEGF165存在下培育5倍稀釋之周質提取物。使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之ExtrAvidin試劑(Sigma,St Louis,MO,USA)檢測該等VHH/生物-VEGF165複合物與人類VEGFR2嵌合體塗覆板之結合。VHH序列ID及VEGF-結合(非阻斷受體之)VHH及抑制性(阻斷受體之)VHH之相應AA序列分別列舉於表2及表3中。

表2：單價「非阻斷受體之」抗VEGFVHH之序列ID及AA序列(FR，框架；CDR，互補決定區)

表3：單價阻斷受體之抗VEGF VHH之序列I D及AA序列(FR，框架；CDR，互補決定區)SEQ ID NO: 9-46

在Biacore(Biacore T100儀器，GE Healthcare)上分析抑制性VHH之解離速率。HBS-EP+緩衝液用作運行緩衝液且在25℃下實施實驗。經由胺偶合(使用EDC及NHS)將重組人類VEGF165不可逆地捕獲於CM5感測器晶片上直至+/-1500 RU之目標含量。在固定後，以10 min之1 M乙醇胺(pH 8.5)注射來使表面失活。分別用EDC/NHS及乙醇胺使參照表面活化及失活。經2 min以45 μl/min注射VHH周質提取物之存於運行緩衝液中之10倍稀釋液並使其解離10 min或15 min。在不同試樣之間，利用再生緩衝液使表面再生。藉由減去參照通道上之曲線及空白運行緩衝液注射來對數據進行雙重引用。藉由在Biacore T100評價軟體2.0.1版中擬合兩相衰減模型來評價所處理曲線之數據。k_d-快、k_d-慢及快%之值列舉於表4中。

表4：利用Biacore之阻斷受體之VHH之解離速率測定

n/d，未測定

實例5 純化VHH之表徵

選擇三種抑制性抗VEGF VHH作為純化蛋白質用於進一步表徵：VEGFBII23B04、VEGFBII24C4及VEGFBII23A6。該等VHH在大腸桿菌TG1中表現為c-myc、His6標記蛋白質。藉由添加1 mM IPTG誘發表現並使其於37℃下繼續4小時。在使細胞培養物旋轉後，藉由使沉澱冷凍-解凍來製備周質提取物。該等提取物作為起始材料用於經由IMAC及尺寸排除層析(SEC)之VHH純化。最後VHH製劑顯示95%純化，如經由SDS-PAGE評定。

5.1　阻斷人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc之ELISA中之阻斷人類VEGF165/VEGFR2之VHH的評價

在阻斷人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc之ELISA中評價VHH之阻斷能力。簡言之，將1 μg/mL VEGFR2-Fc嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)塗覆於96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在4 nM生物素化VEGF165存在下培育存於含有0.1%酪蛋白及0.05%吐溫20(Sigma)之PBS中的純化VHH的稀釋系列(濃度範圍為1 mM-64 pM)。使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之ExtrAvidin試劑(Sigma,St Louis,MO,USA)及作為受質之TMB檢測生物-VEGF165與VEGFR2之殘餘結合。一起採用貝伐珠單抗(Avastin)及雷珠單抗(Ranibizumab)(Lucentis)作為對照。劑量抑制曲線示於圖1中；相應IC₅₀值及抑制%概述於表5中。

表5：hVEGF165/hVEGFR2-Fc競爭ELISA中之單價VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

5.2　阻斷人類VEGF165/VEGFR1-Fc之ELISA中之阻斷人類VEGF165/VEGFR2之VHH的評價

亦在阻斷人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc之ELISA中評價VHH。簡言之，將2 μg/mL VEGFR1-Fc嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)塗覆於96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在0.5 nM生物素化VEGF165存在下培育存於含有0.1%酪蛋白及0.05%吐溫20(Sigma)之PBS中的純化VHH的稀釋系列(濃度範圍為1 mM-64 pM)。使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之ExtrAvidin試劑(Sigma,St Louis,MO,USA)及作為受質之TMB檢測生物-VEGF165與VEGFR1之殘餘結合。一起採用貝伐珠單抗、雷珠單抗及不相關VHH(2E6)作為對照。劑量抑制曲線示於圖2中；相應IC₅₀值及抑制%概述於表6中。

表6：hVEGF165/hVEGFR1-Fc競爭ELISA中之單價VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

5.3　阻斷人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc之AlphaScreen中之抗VEGF165 VHH的評價

亦在阻斷人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc之AlphaScreen中評價VHH之阻斷能力。簡言之，向4 pM生物-VEGF165中添加存於含有0.03%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中的純化VHH的系列稀釋液(濃度範圍：200 nM-0.7 pM)並培育15 min。隨後，添加VEGFR2-Fc(0.4 nM)及抗Fc VHH塗覆受體珠粒(20 μg/ml)並將此混合物在黑暗中培育1小時。最後，添加鏈黴抗生物素供體珠粒(20 μg/ml)且在黑暗中培育1小時後，在Envision微板讀數器上量測螢光。劑量-反應曲線示於圖3中。阻斷人類VEGF165-人類VEGFR2-Fc相互作用之VHH之IC₅₀值概述於表7中。

表7：hVEGF165/hVEGFR2-Fc競爭AlphaScreen中之VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

5.4　阻斷人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc之AlphaScreen中之抗VEGF165 VHH的評價

亦在阻斷人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc之AlphaScreen中評價VHH之阻斷能力。簡言之，向0.4 nM生物-VEGF165中添加存於含有0.03%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中的純化VHH的系列稀釋液(濃度範圍：500 nM-1.8 pM)並培育15 min。隨後，添加VEGFR1-Fc(1 nM)及抗Fc VHH塗覆受體珠粒(20 μg/ml)並將此混合物在黑暗中培育1小時。最後，添加鏈黴抗生物素供體珠粒(20 μg/ml)且在黑暗中培育1小時後，在Envision微板讀數器上量測螢光。劑量-反應曲線示於圖4中。阻斷人類VEGF165-人類VEGFR1-Fc相互作用之VHH之IC₅₀值及抑制%概述於表8中。

表8：hVEGF165/hVEGFR1-Fc競爭AlphaScreen中之VHH的IC₅₀(nM)值

5 .5　人類VEGF165-VHH相互作用之親和力的測定

藉由SPR在Biacore T100儀器上分析VHH VEGFBII23B04與hVEGF165的結合動力學。在CM5晶片上經由胺偶合(使用EDC及NHS)直接固定重組人類VEGF165。以介於10 nM與360 nM之間之不同濃度分析VHH。將試樣注射2 min並使其以45 μl/min之流速解離20 min。在試樣注射之間，用100 mM HCl再生晶片表面。使用HBS-EP+(Hepes緩衝液(pH 7.4)+EDTA)作為運行緩衝液。使用兩態反應模型藉由Biacore T100評價軟體2.0.1版擬合結合曲線。抗VEGF VHH之計算親和性列舉於表9中。

表9：重組人類VEGF165之純化VHH的親和力K_D(nM)

^(a)不產生1:1擬合之非均相結合曲線，使用兩態反應模型藉由Biacore T100評價軟體2.0.1版擬合曲線

5.6　與小鼠VEGF164之結合

使用結合ELISA測定與小鼠VEGF164之交叉反應。簡言之，於4℃下將重組小鼠VEGF164(R&D Systems,Minneapo°is,MS,USA)以1 μg/mL塗覆於96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中過夜。用酪蛋白溶液(1%，存於PBS中)封阻各孔。以存於含有0.1%酪蛋白及0.05%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中的稀釋系列(濃度範圍：500 nM-32 pM)形式施加VHH且使用小鼠抗-myc(Roche)及抗小鼠-HRP偶聯物(DAKO)及隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行之酶反應來檢測結合(圖5-1及5-2)。包括作為陽性對照之小鼠VEGF164反應性mAb。作為參照，亦量測與人類VEGF165之結合。EC₅₀值概述於表10中。

表10：重組人類VEGF165及小鼠VEGF164結合ELISA中之VHH的EC₅₀(pM)值

5.7　與VEGF121之結合

經由固相結合ELISA評定與重組人類VEGF121之結合。簡言之，於4℃下將重組人類VEGF121(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)以1 μg/mL塗覆於96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中過夜。用酪蛋白溶液(1%，存於PBS中)封阻各孔。以存於含有0.1%酪蛋白及0.05%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中的稀釋系列(濃度範圍：500 nM-32 pM)形式施加VHH且使用小鼠抗-myc(Roche)及抗小鼠-HRP偶聯物(DAKO)及隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行之酶反應來檢測結合(圖6)。一起採用VEGFR2之系列稀釋液作為陽性對照。EC₅₀值概述於表11中。

表11：重組人類VEGF121結合ELISA中之單價VHH的EC₅₀(pM)值

5.8　與VEGF家族成員VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF之結合

經由固相結合ELISA評定與VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF之結合。簡言之，於4℃下將VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)以1 μg/mL塗覆於96孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中過夜。用酪蛋白溶液(1%，存於PBS中)封阻各孔。以稀釋系列(濃度範圍：500 nM-32 pM)形式施加VHH並使用小鼠抗-myc(Roche)及抗小鼠-AP偶聯物(Sigma,St Louis,MO,USA)檢測結合。一起採用適當受體之系列稀釋液作為陽性對照並用辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯之山羊抗人類IgG、Fc特異性抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司，West Grove,PA,USA)及隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行之酶反應來進行檢測。VHH及對照之劑量-反應曲線示於圖7-1至7-4中。結果顯示所選擇VHH與VEGFB、VEGFC、VEGFD或PlGF無可檢測到之結合。

5.9　表位方格化(binning)

實施基於Biacore之表位方格化實驗以研究何種VEGF結合劑結合作為VEGFBII23B04之類似或重疊表位。為此，將VEGFBII23B04固定於CM5感測器晶片上。對於每一試樣而言，使人類VEGF165流經晶片表面並由VEGFBII23B4可逆地捕獲。隨後注射純化VHH(100 nM)或周質提取物(1/10稀釋)，表面接觸時間為240秒且流速為10 μL/分鐘。在不同試樣之間，用再生緩衝液(100 mM HCl)再生表面。用Biacore T100評價軟體評價處理曲線。可將VHH分成兩組：第一組給予VEGFBII23B04捕獲之VEGF165額外結合且第二組不能同時結合VEGFBII23B04捕獲之VEGF165。表12-A概述所測試VHH之結合表位。

使用相同分析設定來評定VEGFR1、VEGFR2、雷珠單抗及貝伐珠單抗是否能夠同時結合人類VEGF-165與VEGFBII23B04。表12-B呈現對VEGFBII23B04捕獲之VEGF165的額外結合反應。僅VEGFR2不能結合VEGFBII23B04捕獲之VEGF165，此集中於VEGFBII23B04對VEGF-VEGFR2相互作用之阻斷能力。另外，該等數據顯示VEGFBII23B04表位不同於貝伐珠單抗及雷珠單抗表位。

表12-A：抗VEGF VHH之表位方格化-同時與VEGFBII23B04結合

表12-B：VEGFBII23B04之表位方格化-VEGFBII23B04捕獲之VEGF165上的基準抑制劑或同源受體的結合

5.10 HUVEC增生分析中之抗VEGF VHH的表徵

在增生分析中評價選擇VHH之效能。簡言之，使原代HUVEC細胞(Technoclone)缺乏補充過夜且隨後將4000個細胞/孔一式四份地接種於96孔組織培養板中。在VHH不存在或存在下用33ng/mL VEGF刺激細胞。在第4天藉由[³H]胸苷納入來量測增生比率。HUVEC增生分析之結果示於表中。

表13：VEGF HUVEC增生分析中之單價VEGFBII23B04、VEGFBII23A06及VEGFBII24C04的IC₅₀(nM)值及抑制%

5.11 HUVEC Erk磷酸化分析中之抗VEGF VHH的表徵

在HUVEC Erk磷酸化分析中評定選擇VHH之效能。簡言之，使原代HUVE細胞血清饑餓過夜且隨後在VHH不存在或存在下用10ng/mL VEGF刺激5 min。將細胞用存於PBS中之4%甲醛固定並藉由ELISA使用磷酸ERK特異性抗體(抗-磷酸MAP激酶pERK1及2，M8159，Sigma)及多株兔抗小鼠-免疫球蛋白-HRP偶聯物(PO161,Dako)量測ERK磷酸化量。如表14中所示，VEGFBII23B04及貝伐珠單抗將VEGF誘發之Erk磷酸化抑制至少90%，IC₅₀<1nM。

表14：VEGF HUVEC Erk磷酸化分析中之單價VEGFBII23B04的IC₅₀(nM)值及抑制%

實例6 單價阻斷抗VEGF之VHH之產生

VHH VEGFBII23B04以遺傳方式融合至VEGFBII23B04而產生同源二聚體VHH(AA序列參見表15)或融合至不同VEGF結合VHH而產生異源二聚體VHH。為生成異源二聚體VHH，經由9個或40個Gly-Ser撓性連接體以兩個不同定向連接10個獨特VEGF結合VHH之組與VEGFBII23B04(AA序列參見表15)。同源二聚體VEGFBII23B04(VEGFBII010)及40個異源二聚體二價VHH在大腸桿菌TG1中表現為c-myc、His6標記蛋白質。藉由添加1 mM IPTG誘發表現並使其於37℃下繼續4小時。在使細胞培養物旋轉後，藉由使沉澱冷凍-解凍來製備周質提取物。該等提取物用作起始材料且經由IMAC及去鹽純化VHH，產生90%純度，如經由SDS-PAGE所評定。

表15：二價抗VEGF VHH之序列ID、VHH ID及AA序列(在一個相關序列中突出所用連接體之每一者)。

在阻斷VEGFR2及VEGFR1之AlphaScreen分析中測試40個二價VHH之組，分別如實例5.3及5.4中所述。基於抑制之效能及最大量，選擇5種最佳二價VHH(VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBI023、VEGFBI024及VEGFBII025)用於進一步表徵。競爭性VEGFR2及VEGFR1 AlphaScreen中之5種選擇二價VHH的篩分結果之綜述示於表16中。

表16：VEGF/VEGFR1及VEGF/VEGFR2競爭AlphaScreen分析中之5種最佳二價VHH的效能及功效

實例7 模式化VHH之表徵

在阻斷VEGFR2及VEGFR1之ELISA(分別為圖8-1及8-2及9、表17及表18)及AlphaScreen分析(圖10及11、表19及20)中並排比較VHH VEGFBII010、VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBII023、VEGFBII024及VEGFBII025，分別如實例5.1、5.2、5.3及5.4中所述。

表17：hVEGF165/hVEGFR2-Fc競爭ELISA中之模式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

表18：VEGF165/hVEGFR1-Fc競爭ELISA中之模式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

表19：hVEGF165/hVEGFR2-Fc競爭AlphaScreen中之模式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

表20：VEGF165/hVEGFR1-Fc競爭AlphaScreen中之模式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

另外，亦測試模式化VHH阻斷mVEGF164/mVEGFR2-huFc相互作用之能力。簡言之，向0.1 nM生物素化mVEGF164中添加存於含有0.03%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中的純化VHH的系列稀釋液(濃度範圍：4 μM-14.5 pM)並培育15 min。隨後，添加小鼠VEGFR2-huFc(0.1 nM)及抗Fc VHH塗覆受體珠粒(20 μg/ml)並將此混合物培育1小時。最後，添加鏈黴抗生物素供體珠粒(20 μg/ml)且在培育1小時後，在Envision微板讀數器上量測螢光。劑量-反應曲線示於圖12中。阻斷小鼠VEGF164/VEGFR2-hFC相互作用之VHH之IC₅₀值概述於表21中。

表21：mVEGF164/mVEGFR2-hFc競爭AlphaScreen中之模式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

亦在ELISA中測試模式化VHH結合mVEGF164及人類VEGF165(實例5.6；圖13-1及13-2；表22)、VEGF121(實例5.7；圖15；表23)及VEGF家族成員VEGFB、VEGFC、VEGFD及P1GF(實例5.8；圖14-1至14-8)之能力。如實例5.5中所述分析人類VEGF165之結合動力學。K_D值列舉於表24中。

表22：重組人類VEGF165及小鼠VEGF164結合ELISA中之模式化VHH的EC₅₀(pM)值

表23：重組人類VEGF121結合ELISA中之模式化VHH的EC₅₀(pM)值

表24：重組人類VEGF165之純化模式化VHH的親和力K_D(nM)

^(a) K_D=k_d1/k_a1*(k_d2/(k_d2+k_a2))

^(b)使用兩態反應模型藉由Biacore T100評價軟體2.0.1版擬合曲線。

亦在VEGF調介之HUVEC增生及Erk磷酸化分析中測試VHH VEGFBII010、VEGFBII022、VEGFBII024及VEGFBII025。

在增生分析中評價選擇模式化VHH之效能。簡言之，使原代HUVEC細胞(Technoclone)缺乏補充過夜且隨後將4000個細胞/孔一式四份地接種於96孔組織培養板中。在VHH不存在或存在下用33ng/mL VEGF刺激細胞。在第4天藉由[³H]胸苷納入來量測增生比率。表25中所示結果證實，模式化VHH及貝伐珠單抗將VEGF誘發之HUVEC增生抑制90%以上，IC₅₀<1 nM。

表25：VEGF HUVEC增生分析中之模式化VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

在HUVEC Erk磷酸化分析中評定選擇模式化VHH之效能。簡言之，使原代HUVE細胞血清饑餓過夜且隨後在VHH不存在或存在下用10 ng/mL VEGF刺激5 min。將細胞用存於PBS中之4%甲醛固定並藉由ELISA使用磷酸ERK特異性抗體(抗-磷酸MAP激酶pERK1及2，M8159，Sigma)及多株兔抗小鼠-免疫球蛋白-HRP偶聯物(PO161,Dako)量測ERK磷酸化量。如表26中所示，模式化VHH及貝伐珠單抗將VEGF誘發之Erk磷酸化抑制90%以上，IC₅₀<1 nM。

表26：VEGF HUVEC Erk磷酸化分析中之模式化VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

實例8 序列優化 8.1 VEGFBII23B04之序列優化

將VEGFBII23B04之胺基酸序列與人類種系序列VH3-23/JH5比對，參見圖16(SEQ ID NO: 179)

比對顯示VEGFBII23B04相對於參照種系序列含有19個框架突變。選擇位置14、16、23、24、41、71、82、83及108處之非人類殘基用於經其人類種系對等部分取代。生成在該等位置處具有人類殘基之不同組合的一組8個VEGFBII23B04變體(AA序列列舉於表27中)。構造一個額外變體，其中藉由引入S60A突變去除位置D59S60處之潛在異構化位點(CDR2區，參見圖16，指示為粗斜體殘基)。

表27：VHH VEGFBII23B04之序列優化變體之AA序列(FR，框架；CDR；互補決定區)

在VEGF165/VEGFR2 AlphaScreen中該等變體表徵為純化蛋白(實例5.3，圖17)。在熱位移分析中測定每一純系之熔融溫度(T_m)，該分析係基於在納入Sypro Orange(Invitrogen)時螢光信號增大(Ericsson等人，Anal. Biochem. 357(2006)，第289-298頁)。所有變體在與VEGFBII23B04相比時均展示相當之IC₅₀且在與親本VEGFBII23B04相比時展示類似或更高之T_m值。表28概述pH 7下9種測試純系之IC₅₀值及T_m值。

表28：VEGFBII23B04之序列優化變體之IC₅₀(pM)值、抑制%及熔融溫度(在pH 7下)

在第二循環中，組合來自人類化努力之耐受突變(VEGFBII111G06)及在選擇位點處避免潛在轉譯後修飾之突變(D16G、S60A取代及E1D突變)，產生源自VEGFBII23B04: VEGFBII0037之序列優化純系。預計一種額外序列優化變體(VEGFBII038)，除I82M突變外，其與VEGFBII0037含有相同取代，此乃因此突變可與效能之微小下降相關。兩種序列優化純系之序列列舉於表29中。在阻斷VEGF165/VEGFR2之AlphaScreen中表徵VEGFBII0037及VEGFBII0038(實例5.3，圖18)，在上述熱位移分析中測定熔融溫度且在Biacore中測定VEGF165上之結合親和力(實例5.5)。2種序列優化VHH之特性的綜述呈現於表30中。

表29：VHH VEGFBII23B04之序列優化變體之AA序列

表30：序列優化純系VEGFBII037及VEGFBII038之IC₅₀(pM)值、抑制%、熔融溫度(在pH 7下)及親和力(pM)

8.2 VEGFBII5B05之序列優化

將VEGFBII5B05之胺基酸序列與人類種系序列VH3-23/JH5比對，參見圖19(SEQ ID:NO: 179。比對顯示VEGFBII5B05相對於參照種系序列含有15個框架突變。選擇位置23、60、83、105、108處之非人類殘基用於經其人類種系對等部分取代，而選擇位置44處之組胺酸用於由麩胺醯胺取代。構造一個具有6個所述突變之人類化變體(AA序列列舉於表31中)。

表31：VHH VEGFBII5B05之序列優化變體之AA序列(FR，框架；CDR；互補決定區)

構造一個額外變體，其中藉由引入M30I突變去除位置M30處之潛在氧化位點(CDR1區，參見圖19，指示為粗斜體殘基)。使用ProteOn測試兩個變體結合hVEGF165之能力。簡言之，用人類VEGF165塗覆GLC ProteOn感測器晶片。1/10稀釋變體之周質提取物並跨越塗覆有人類VEGF165之晶片注射。計算解離速率並與親本VEGFBII5B05之解離速率進行比較。2種變體之解離速率與親本VEGFBII5B05之解離速率在相同範圍內，指示所有突變均可耐受(表32)。

表32：序列優化變體VEGFBII5B05之解離速率

在第二循環中，組合來自人類化努力之突變與M30I取代，產生VEGFBII5B05之序列優化純系，其指定為VEGFBII032。序列列舉於表33中。藉由Biacore測定VEGFBII032之親和力(參見實例5.5)且在上述熱位移分析中測定熔融溫度。序列優化VHH VEGFBII032之特性的綜述呈現於表34中。

表33：序列優化純系VEGFBII032之AA序列(FR，框架；CDR；互補決定區)

表 34：序列優化純系VEGFBII032之熔融溫度(於pH 7下)及親和力(nM)

在增生分析中評價序列優化純系VEGFBII037及VEGFBII038之效能。簡言之，使原代HUVEC細胞(Technoclone)缺乏補充過夜且隨後將4000個細胞/孔一式四份地接種於96孔組織培養板中。在VHH不存在或存在下用33 ng/mL VEGF刺激細胞。在第4天藉由[³H]胸苷納入來量測增生比率。表35中所示結果證實，親本VHH VEGFBII23B04之活性(抑制效能及程度)在序列優化純系VEGFBII038中保守。

表35：VEGF HUVEC增生分析中之序列優化純系VEGFBII037及VEGFBII038的IC₅₀(nM)值及抑制%

<110>　德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司

<120>　VEGF-結合分子

<130>　12-0319-ff

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<141>　2011-09-02

<150>　10175318.4

<151>　2010-09-03

<160>　179

<170>　PatentIn version 3.3

<210>　1

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<212>　PRT

<213>

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(5)..(5)

<223>　美洲駝(Lama glama)

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(7)..(7)

<223>　Xaa可為Gly或Ala

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(12)..(12)

<223>　Xaa可為Ser或Gly

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(13)..(13)

<223>　Xaa可為Gly、Ala或Pro

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(16)..(16)

<223>　Xaa可為Asp或Gly

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<213>　美洲駝

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<213>　美洲駝

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<220>

<223>　突變美洲駝序列

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<400>　112

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<212>　PRT

<213>　美洲駝

<400>　113

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<211>　123

<212>　PRT

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<400>　114

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<211>　123

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<220>　

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<212>　PRT

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<213>　人工

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<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

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<213>　人工

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　159

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<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　160

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<211>　278

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　161

<210>　162

<211>　281

<212>　PRT

<213>　人工

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<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　162

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<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　163

<210>　164

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<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　164

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<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　165

<210>　166

<211>　288

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　166

<210>　167

<211>　280

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　167

<210>　168

<211>　289

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　包含美洲駝序列之人工多肽

<400>　168

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<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

<400>　169

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<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

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<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

<400>　171

<210>　172

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

<400>　172

<210>　173

<211>　25

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

<400>　173

<210>　174

<211>　27

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

<400>　174

<210>　175

<211>　35

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

<400>　175

<210>　176

<211>　35

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　合成連接體

<400>　176

<210>　177

<211>　115

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　突變美洲駝序列

<400>　177

<210>　178

<211>　585

<212>　PRT

<213>　智人

<400>　178

<210>　179

<211>　109

<212>　PRT

<213>　智人

<400>　179

圖1：純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)

圖2：純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)

圖3：純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

圖4：純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)

圖5-1及5-2：單價VHH與重組人類(圖5-2)及小鼠(圖5-1)VEGF之結合(ELISA)

圖6：單價VHH與人類VEGF121之結合

圖7-1至7-4：純化VHH不結合VEGFB(圖7-1)、VEGFC(圖7-2)、VEGFD(圖7-3)及P1GF(圖7-4)

圖8-1及8-2：模式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)

圖9-1及9-2：模式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)

圖10：模式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

圖11：模式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)

圖12：模式化VHH阻斷mVEGF164/mVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

圖13-1及13-2：模式化VHH結合小鼠(圖13-1)及人類VEGF(圖13-2)

圖14-1至14-8：模式化VHH不結合VEGFB(圖14-1及14-5)、VEGFC(圖14-2及14-6)、VEGFD(圖14-3及14-7)及PlGF(圖14-2及14-8)

圖15：模式化VHH結合VEGF121

圖16：VHH VEGFBII23B04與人類VH3/JH種系共有序列之序列比對

圖17：VEGFBII23B04之VHH變體阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

圖18：VEGFBII23B04之序列優化純系阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

圖19：VHH VEGFBII5B05與人類VH3/JH種系共有序列之序列比對

(無元件符號說明)

Claims (25)

1. 一種VEGF-結合分子，其包含至少一個可變結構域，該可變結構域具有四個框架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區，其中該CDR3具有如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr，其中位置5處之Xaa係Gly或Ala；位置7處之Xaa係Ser或Gly；位置12處之Xaa係Gly、Ala或Pro；位置13處之Xaa係Asp或Gly；位置16處之Xaa係Asp或Glu；且其中該VEGF-結合分子能夠以≧60%之抑制率阻斷人類重組VEGF165與人類重組VEGFR-2之間之相互作用。
2. 如請求項1之VEGF-結合分子，其中該CDR3具有選自以下之序列SEQ ID NO: 2　SRAYGSSRLRLGDTYDY，SEQ ID NO: 3　SRAYGSSRLRLADTYDY；SEQ ID NO: 4　SRAYGSSRLRLADTYEY；SEQ ID NO: 5　SRAYGSGRLRLADTYDY；SEQ ID NO: 6　SRAYASSRLRLADTYDY；SEQ ID NO: 7　SRAYGSSRLRLPDTYDY；SEQ ID NO: 8　SRAYGSSRLRLPGTYDY。
3. 如請求項2之VEGF-結合分子，其包含一或多個免疫球蛋白單一可變結構域，其各自含有a) CDR3，其具有選自SEQ ID NO: 2至8中所示第一群組序列之胺基酸序列；b) CDR1及CDR2，其具有如表3中所指示含於選自SEQ ID NO: 9至46中所示第二群組序列之序列中的胺基酸序列，其中該第二序列含有該根據a)選擇之序列中之各別CDR3。
4. 如請求項3之VEGF-結合分子，其中該一或多個免疫球蛋白單一可變結構域係VHH。
5. 如請求項4之VEGF-結合分子，其中該一或多個VHH具有選自SEQ ID NO: 9-46中所示胺基酸序列之胺基酸序列。
6. 如請求項5之VEGF-結合分子，其包含一或多個具有選自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的VHH。
7. 一種VEGF-結合分子，其係由如請求項6中所定義VHH經過親和力成熟及/或序列優化來獲得。
8. 如請求項7之VEGF-結合分子，其係由具有SEQ ID NO: 18中所示胺基酸序列之VHH經過序列優化來獲得。
9. 如請求項8之VEGF-結合分子，其具有選自SEQ ID NO: 47-57中所示序列之胺基酸序列。
10. 如請求項4之VEGF-結合分子，其包含兩個或更多個VHH，其係a)相同VHH，其能夠以≧60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與該重組人類VEGFR-2之間之相互作用，或b)不同VHH，其結合VEGF之非重疊表位，其中至少一個VHH能夠以≧60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與該重組人類VEGFR-2之間之相互作用，且其中至少一個VHH能夠以≦60%之抑制率阻斷該相互作用。
11. 如請求項10之VEGF-結合分子，其中該等相同VHH a)為選自具有SEQ ID NO: 9-46中所示胺基酸序列之VHH或為由該VHH經過親和力成熟及/或序列優化所獲得之VHH。
12. 如請求項11之VEGF-結合分子，其中該VHH為選自具有SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 47-57中所示胺基酸之VHH。
13. 如請求項12之VEGF-結合分子，其包含兩個各自具有SEQ ID NO: 57中所示胺基酸序列之VHH。
14. 如請求項13之VEGF-結合分子，其中a)該一或多個抑制率≧60%之VHH選自i.　具有選自SEQ ID NO: 9-46中所示胺基酸序列之胺基酸序列的VHH，或ii.由該等VHH經過親和力成熟及/或序列優化所獲得之VHH，且其中b)該一或多個抑制率≦60%之VHH選自i. SEQ ID NO: 58-124，或ii.由該VHH經過親和力成熟及/或序列優化所獲得之VHH。
15. 如請求項14之VEGF-結合分子，其中兩個VHH包含於具有SEQ ID NO: 128-168中所示胺基酸序列之多肽中，且由表13中所指示之連接體序列隔開。
16. 如請求項15之VEGF-結合分子，其中該VHH a) i.具有SEQ ID NO: 18中所示胺基酸序列且該VHH b) i.具有SEQ ID NO: 64中所示胺基酸序列。
17. 如請求項16之VEGF-結合分子，其中根據a) ii)之該等VHH選自具有SEQ ID NO: 47-57中所示胺基酸序列之VHH，且其中根據b) ii)之該等VHH選自具有SEQ ID NO: 125-127中所示胺基酸序列之VHH。
18. 如請求項17之VEGF-結合分子，其包含兩個VHH，其中之一者具有SEQ ID NO: 57中所示胺基酸且其中之一者具有SEQ ID NO: 127中所示胺基酸。
19. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至18中任一項之VEGF-結合分子；或含有該核酸分子之載體。
20. 一種宿主細胞，其含有如請求項19之核酸分子。
21. 一種醫藥組合物，其含有至少一種如請求項1至18中任一項之VEGF-結合分子作為活性成份。
22. 如請求項21之醫藥組合物，其用於治療與VEGF所調介血管發生之效應相關之疾病。
23. 如請求項22之醫藥組合物，其用於治療癌症及癌症性疾病。
24. 如請求項22之醫藥組合物，其用於治療眼病。
25. 一種如請求項1至18中任一項之VEGF-結合分子的用途，其用於製備用於預防、治療或減輕與VEGF所調介血管發生之效應相關之疾病的藥劑。