KR20120115217A - Ｄｌｌ４－결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Dll4 결합 분자, 바람직하게 VHH 및 VH 같은 Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인, 이를 포함하는 약학 조성물 및 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환의 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 VEGF-A에 결합하는 이중특이적 Dll4 결합 분자, Dll4 결합 분자를 코딩하는 핵산, 이를 제조하는 숙주 및 방법에 관한 것이다.

Description

ＤＬＬ４－결합 분자{DLL4-BINDING MOLECULES}
본 발명은 사람의 치료방법, 특히 암 치료요법, 이러한 치료요법에 유용한 약제 및 조성물에 관한 것이다.
US 2008/0014196에 요약된 바와 같이, 혈관형성(angiogenesis)은 고형 종양 및 전이를 포함하는 수많은 질병의 발병에 연관되어 있다. 종양 성장의 경우에, 혈관형성은 과다형성에서 신생물 형성(neoplasia)으로의 전이와, 종양의 성장과 전이에 자양분을 제공하는데 있어서 결정적인 것으로 보인다. Folkman 등, Nature 339 -58 (1989): 종양 세포는 정상 세포와 비교하여 성장 이점을 가질 수 있다. 그러므로, 항혈관형성 요법은 몇 가지 종류의 종양에 대해 중요한 치료방법이 될 수 있다. 이러한 치료요법들은 VEGF 경로를 블로킹(blocking)하는데 집중되어 있다(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400).
Notch 시그널링 경로는 세포-세포 커뮤니케이션에 중요하고, 배아 발생 동안과 성체에서 수많은 세포 분화 과정을 조절하는 유전자 조절 메카니즘에 관여한다. Notch 시그널링은 많은 암들, 예를 들면 T-세포 급성 림프구성 백혈병과 고체 종양에서 이상조절된다(Sharma et al. 2007, Cell Cycle 6 (8): 927-30; Shih et al., Cancer Res. 2007 Mar 1 ;67(5): 1879-82).
Dll4 (또는 Delta like 4 또는 delta-like ligand 4)는 Notch 리간드의 델타 그룹 중 하나이다. Dll4의 세포외 도메인은 N-터미널 도메인, Delta/Serrate/Lag-2(DSL) 도메인, 및 8개 상피성장인자 (EGF)-유사 반복물의 탠덤(tandem)으로 구성된다. 일반적으로 EGF 도메인은 아미노산 잔기 218-251 (EGF-1; 도메인 1), 252-282 (EGF-2; 도메인 2), 284-322 (EGF-3; 도메인 3), 324-360 (EGF-4; 도메인 4), 및 362-400 (EGF-5; 도메인 5)을 포함하는 것으로 인정되며, hDll4의 아미노산 잔기 약 173-217의 DSL 도메인과 아미노산 잔기 약 27-172의 N-터미널 도메인을 가진다(WO 2008/ 076379).
Dll4는 혈관 내피, 특히 동맥 내피에서 고도의 선택 발현을 나타내는 것으로 보고되었다(Shutter et al . (2000) Genes Develop.　14: 1313-1318). 최근의 마우스 연구에서 Dll4는 VEGF에 의해 유도되며 혈관 발아와 분지를 제어하는 네거티브 피드백 조절제인 것으로 나타났다. 이러한 역할과 일치하여, Dll4의 결실 또는 저해는 과도한 혈관형성을 일으킨다(Scehnet et al ., Blood. 2007 Jun 1; 109(11):4753-60). 이러한 억제되지 않은 혈관형성은 항VEGF 치료요법에 대해 저항성인 종양에서조차도 비생산성 맥관구조의 형성으로 인하여 종양 성장을 역설적으로 감소시킨다(Thurston et al ., Nat Rev Cancer. 2007 May;7(5):327-31; WO 2007/070671; Noguera-Troise et al ., Nature. 2006 Dec 21; 444(7122)). 또한, VEGF와 Dll4를 함께 저해하는 것은 복수의 종양 종류의 이종이식 모델에서 항VEGF만을 비교하여 우수한 항종양활성을 제공하는 것으로 나타났다(Noguera-Troise et al ., Nature. 2006 Dec　21; 444(7122):1032-7; Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7). 이러한 결과로 인하여, Dll4는 암 치료요법의 유망한 타겟으로 여겨지고 있으며, Dll4를 표적으로 하는 여러가지 생물학적 화합물들이 다음에 기술된 바와 같이 (사전)임상개발 중이다: REGN-421 (= SAR153192; Regeneron, Sanofi-Aventis; WO2008076379) 및 OPM-21M18 (OncoMed) (Hoey et al ., Cell Stem Cell. 2009 Aug　7; 5(2):168-77), 둘다 전체 사람 Dll4 항체; YW152F (Genentech), 인간화된 Dll4 항체(Ridgway et al ., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7); Dll4-Fc (Regeneron, Sanofi-Aventis), Dll4의 세포외 영역과 사람 IgG1의 Fc 영역으로 구성된 재조합 융합 단백질 (Noguera-Troise et al ., Nature. 2006 Dec 21;444(7122)).
그러나, 최신기술의 모노클로날 항체(MAbs)와 융합 단백질은 이들의 치료학적 적용 측면에서 몇가지 단점이 있다: 이들의 분해를 방지하기 위해 거의 동결온도에 저장해야만 한다. 또한, 이들은 소화관에서 빨리 분해되기 때문에 경구투여에 적합하지 않다. 암 치료요법에서 MAbs의 또다른 중요한 제한점은 불량한 이송으로, 이로 인하여 농도가 낮고 종양에서 모든 세포를 표적으로 하지 못한다.
상기한 관점에서, 본 발명의 목적은 개선된 Dll4-결합 분자를 사람의 치료에 제공하는 것이다.
이러한 Dll4-결합 분자, 또는 Dll4 길항제는 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 또는 상태의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단의 조성물에서 약리학적 활성 약제로서 유용하다. 이러한 질환의 예는 암 및, 연령관련 황반변성(AMD)과 당뇨성 망막증(DR) 같은 눈 질환이다. 본 발명의 또다른 목적은 이러한 약제 및 조성물의 사용 및/또는 투여를 포함하는, 상기 질환, 장애 또는 상태의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단을 위한 방법을 제공하는 것이다.
특히 본 발명의 목적은 현재 사용되거나/되고 종래기술에서 알려진 약제, 조성물 및/또는 방법과 비교하여 이점을 제공하는 약리학적으로 활성인 약제, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이점은, 특히 상기한 바와 같은 일반적인 항Dll4 항체 또는 이들의 절편과 비교하였을 때, 예를 들면 제조목적에서 개선된 치료학적 및/또는 약리학적 특성 및/또는 다른 유리한 특성을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 이들을 포함하는 신규한 Dll4 결합 분자 및/또는 폴리펩티드, 및 특히 포유동물에 결합하는 Dll4 결합 분자, 특별히 사람 Dll4를 제공하는 것으로, 여기에서 이러한 분자 또는 폴리펩티드는 상기한 바와 같이 치료 및 진단 목적에 적합하다. 본 발명의 다른 목적은 Dll4에 특정하게 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하는 것이다.
제1 측면에 따르면, Dll4 결합 분자, 바람직하게 VHH와 VH 같은 Dll4 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 Dll4 결합 분자를 코딩하는 핵산 및 이를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 Dll4 결합 분자 및 임의로 이러한 조성물의 추가 성분을 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 여기에서 기술된 Dll4 결합 분자, 핵산, 숙주세포, 생성물 및 조성물을 제조 또는 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 여기에서 기술된 Dll4 결합 분자, 핵산, 숙주세포, 생성물 및 조성물의 적용 및 용도뿐만 아니라 혈관형성에서 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 대한 이러한 측면과 다른 측면, 구체예, 이점 및 적용은 이하의 상세한 설명에 의해 더욱 명확해질 수 있다.
도 1: 사람, 벵골원숭이 및 게먹이원숭이 DLL4의 아미노산 서열 배열.
도 2: 사람과 마우스 DLL4 결실 돌연변이체 (윗첨자는 아미노산 도메인 범위).
도 3: hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 VHH (ELISA).
도 4: hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 VHH (AlphaScreen).
도 5: CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 VHH (FMAT).
도 6: DLL4 매개 Notch1 분해를 차단하는 정제된 VHH (리포터).
도 7: 정제된 VHH와 재조합 사람 및 마우스 DLL4의 결합 (ELISA).
도 8: 정제된 VHH와 재조합 사람 DLL1 및 사람 Jagged-1의 결합 (ELISA).
도 9: 정제된 VHH와 사람/마우스/게먹이원숭이 DLL4의 결합 (FACS).
도 10: hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 친화도 성숙 VHH (ELISA).
도 11: CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 친화도 성숙 VHH (FMAT).
도 12: 정제된 VHH와 사람/마우스 DLL4의 결합 (ELISA).
도 13: 정제된 친화도 성숙 VHH와 재조합 사람 DLL1 및 사람 Jagged-1의 결합 (ELISA).
도 14: 정제된 VHH와 사람/마우스/게먹이원숭이 DLL4의 결합 (FACS).
도 15: HUVEC 증식의 Dll4 매개 저해에 대한 VHH 효과의 평가.
정의
달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어들은 당업자들에게 명백한 당업계에서의 일반적인 의미를 가진다. 예를 들면, 다음과 같은 표준 핸드북뿐만 아니라 여기에서 인용된 일반적인 배경기술을 참조할 수 있다: Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), 및 Roitt et al ., "Immunology" (2nd　Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989). 또한, 달리 표시되지 않는 한, 상세하게 특별히 기술되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자들에게 자명하게 그 자체로 알려진 방법으로 수행될 수 있고 수행되었다. 또한, 예를 들면 표준 핸드북, 위에서 언급된 일반적 배경기술 및 거기에 인용된 추가 참고문헌을 참조할 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, "면역글로불린"이란 용어는, 여기에서 중쇄(heavy chain) 항체 또는 일반적인 4-사슬 항체를 지칭하는데 사용되던지 간에, 일반적인 용어로 사용되어 전체 크기 항체, 그의 각각의 사슬, 이들의 일부, 도메인 또는 절편을 포함한다.
달리 표시되지 않는 한, "Dll4 결합 분자"는 항Dll4 항체, 항Dll4 항체 절편, "항Dll4 항체 유사 분자" 및 이들 중에서의 컨쥬게이트물을 포함한다. 항체는, 제한적인 것은 아니나 모노클로날 및 키메라화된 모노클로날 항체를 포함한다. "항체"란 용어는 숙주세포에서 재조합 발현에 의해 생산된 모노클로날 항체와 같은 완전한 면역글로불린, Dll4 결합 항체 절편 또는 "항체 유사 분자", 예를 들면 국제 특허공개 WO　02/056910에 기술된, "SMIP(Small Modular Immuno Pharmaceuticals)"로 불리는 단일 사슬 항체 및 선형 항체를 포함한다. 항Dll4 항체 유사 분자는 여기에서 정의된 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 항체 유사 분자의 다른 예는 면역글로불린 슈퍼패밀리 항체(IgSF), 또는 CDR 이식 분자이다.
여기에서 사용된 "서열"(예를 들면, "면역글로불린 서열", "(단일) 가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 단백질 서열" 같은 용어에서)이란 용어는, 내용이 보다 제한된 설명을 필요로 하지 않는 한, 관련 아미노산 서열뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
2개의 Dll4 결합 분자 서열 간의 "서열 동일성"은 서열들 간의 일치하는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 이것은 국제 특허공개 WO　08/020079의 49 및 50페이지의 f) 단락에 기술된 바와 같이 계산하거나 측정될 수 있다("서열 유사성"은 동일하거나 보존성 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다).
여기에서 사용된 (폴리펩티드 또는 단백질의) "도메인"이란 용어는 나머지 단백질에 대하여 개별적으로 그의 삼차 구조를 유지하는 능력을 가지는 폴딩된 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 개별 작용특성을 담당하고, 많은 경우에 잔여 단백질의 작용 및/또는 도메인의 작용의 손실 없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 전이될 수 있다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 도메인"은 항체 사슬의 구형 영역(예를 들면, 일반적인 4-사슬 항체의 사슬 또는 중쇄 항체의 사슬) 또는 본질적으로 이러한 구형 영역으로 구성되는 폴리펩티드를 지칭한다. 면역글로불린 도메인은 이들이 항체 분자의 면역글로불린 폴딩 특성을 보유하는 것을 특징으로 하며, 보존된 디설파이드 결합에 의해 임의로 안정화된 2개 베타 시트 내에 배열된 약 7개 역평행(antiparallel) 베타 가닥의 2층 샌드위치로 구성된다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 가변영역"은 당업계에서와 이하에서 각각 "프레임워크(frame work) 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 지칭되는 4개의 "프레임워크 영역"으로 본질적으로 구성되는 면역글로불린 도메인을 의미하며; 프레임워크 영역은 3개의 "상보성(Complementarity) 결정" 영역 또는 CDR에 의해 간섭되며, CDR은 당업계에서와 이하에서 각각 "상보성 결정영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정영역 3" 또는 "CDR3"로 지칭된다. 그러므로, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 이것은 항원 결합 부위를 수반하여 항원에 항체에 대한 특이성을 제공하는 면역글로불린 가변 도메인이다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 추가적인 가변 면역글로불린 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명의 의미에서 면역글로불린 단일 가변 도메인의 예는 면역글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL 및 (VH 도메인과 VL 도메인) 및 이하에 정의된, 카멜리드(camelid)에서 유래한 "VHH 도메인"(또는 간단하게 "VHH")이다.
상기한 정의의 관점에서, 일반적인 4 사슬 항체(예를 들면, 당업계에서 공지된 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자)의 항원 결합 도메인, 또는 디설파이드 결합된 Fv 또는 scFv 절편 같은 Fab 절편, F(ab')2 절편, Fv 절편, 또는 일반적 4 사슬 항체에서 유도된 다이아바디(diabody)(모두 종래기술에서 알려진)의 항원 결합 도메인은 일반적으로 면역글로불린 단일 가변영역으로 여겨지지 않는데, 왜냐하면 항원의 각 에피토프에 대한 결합이 일반적으로 하나(단일)의 면역글로불린 도메인에 의해서 일어나는 것이 아니라, 경쇄 및 중쇄 가변영역 같은 한 쌍의 (결합하고 있는)면역글로불린 도메인, 즉 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하고 있는 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 발생할 수 있다.
VHH, VHH 도메인, VHH 항체 절편, 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로 기술되었다(즉, "경쇄가 없는 항체"의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). "VHH 도메인"이란 용어는 일반적인 4 사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(여기에서는 "VH 도메인"으로 지칭)과 일반적인 4 사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(여기에서는 "VL 도메인"으로 지칭)으로부터 이러한 가변 도메인을 구별하기 위해 선택된다. 일반적으로 단일 항원 결합 도메인으로서 에피토프에 결합하지 않는 VH 또는 VL 도메인과는 달리, VHH 도메인은 특정하게 에피토프에 추가의 항원 결합 도메인 없이 결합할 수 있다. VHH 도메인은 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성된, 작고, 강력하며 효율적인 항원 인식 단위이다.
본 발명의 내용 중에서, VHH 도메인, VHH, VHH 도메인, VHH 항체 절편, VHH 항체, "Nanobody®" 및 "Nanobody® 도메인" ("Nanobody"는 Ablynx N.V.(Ghent, Belgium)의 상표명)은 상호교환적으로 사용되고, 대표적인 면역글로불린 단일 가변 도메인(일반적 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 가지며; 제2 면역글로불린 가변 도메인 없이 에피토프에 특이적으로 결합한다)이며, 이들은 국제 공개특허 WO 2009/109635의 도 1에 정의된, 소위 "홀마크(hallmark) 잔기"에 의해 VH로부터 구별된다.
4 사슬 항체, 특히 사람 항체에서 유도된 "VH 도메인"과 "VL 도메인" (또는 간편하게 "VH" 또는 "VL") 각각은 "단일 사슬 항체"이며, "도메인 항체(domain antibodies)", "Dab"s, "Domain Antibodies", 및 "dAbs"로도 알려져 있으며("Domain Antibodies" 및 "dAbs"란 용어는 GlaxoSmithKline 그룹의 상표명으로 사용됨), 문헌[예를 들면, Ward, E.S., et al. "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341 : 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21 (11): 484-490 (2003); 및 국제 공개특허 WO 2003/002609]에 기술되어 있다.
단일 도메인 항체는 카멜리드가 아닌 포유동물, 특히 사람 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 가변 도메인에 해당한다. 에피토프를 단일 항원 결합 도메인으로서, 즉 VL 또는 VH 도메인 각각과 쌍을 이루지 않으면서 결합시키기 위해서, 예를 들면 사람 단일 VH 또는 VL 도메인 서열의 라이브러리를 사용하여 항원 결합 특성에 대한 특이적 선택이 필요하다.
단일 도메인 항체는 VHH처럼 대략적으로 약 13 내지 약 16 kDa의 분자량을 가지며, 전체 사람 서열에서 유도되는 경우, 예를 들면 사람에서의 치료 용도를 위해 인간화할 필요가 없다. VHH 도메인의 경우에서와 같이, 이들은 또한 원핵 발현 시스템에서도 잘 발현되어 전체 제조비용을 상당히 감소시킨다.
면역글로불린 단일 가변 헤비 도메인의 아미노산 잔기는, 예를 들면 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231 , 25-38 (1999)의 도 2에서 보이는 바와 같이 카멜리드의 VHH 도메인에 적용된, Kabat 등("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)이 제공한 VH 도메인에 대한 일반적 넘버링에 따라 숫자화된다. 이 넘버링에 따르면, 예를 들어
- FR1은 1-30 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR1은 31-35 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR2는 36-49 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR2는 50-65 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR3는 66-94 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR3는 95-102 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR4는 103-113 위치에서 아미노산 잔기를 포함한다.
예를 들면, 국제 공개특허 WO 2006/040153과 WO 2006/122786에 상세하게 기술된 바와 같이, VHH 도메인은 특별하게 프레임워크 영역 내의 아미노산의 조합에 따라 3개 그룹, 즉 (a) "GLEW-유사" 서열을 포함하는 "GLEW-그룹"; (b) KQRE 서열을 포함하는 "KERE-그룹"; 및 (c) "103 P, R, S-그룹"으로 분류할 수 있으며, 또한 특이적 "홀마크 잔기"로 특성화될 수 있다.
각각의 모(母) Dll4 결합분자와 비교하여 "친화도 성숙 Dll4 결합 분자"는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변경을 포함하여 Dll4에 대해 친화성이 개선된다. 본 발명의 친화도 성숙 Dll4 결합 분자는 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 다음 문헌에 기술된 방법으로 제조될 수 있다.: Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, 또는 Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91 : 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169: 147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.
본 발명에 있어서, "서열번호: x의 아미노산 서열"은 다른 언급이 없다면, 관련 서열에 대하여, 예를 들면 전체 면역글로불린 단일 가변 도메인 서열 또는 CDR 서열,
a) 각각의 서열번호: x에 나타낸 서열과 100% 일치하는 아미노산 서열;
b) 각각의 서열번호: x에 나타낸 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가지는 아미노산 서열;
c) 각각의 서열번호: x에 나타낸 서열과 3, 2 또는 1 아미노산 차이를 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
상호교환적으로 사용할 수 있는 "에피토프"와 "항원성 결정인자"란 용어는 일반적 항체 또는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 같은 항원 결합 분자, 더욱 구체적으로 상기 분자의 항원 결합 부위에 의해 인식되는, 폴리펩티드 같은 마크로분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 면역글로불린의 최소 결합부위를 규정하며, 따라서 면역글로불린에 특이성을 전달한다.
여기에서 사용된 "바이파라토프(biparatopic) Dll4 결합 분자" 또는 "바이파라토프 면역글로불린 단일 가변 도메인"은 여기에서 정의된 바와 같은 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인과 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Dll4 결합 분자를 의미하며, 여기에서 분자는 Dll4 항원의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 바이파라토프 폴리펩티드는 상이한 특이성을 가지는 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성된다. 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자(예를 들면, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드) 부분을 파라토프(paratope)라 한다.
임의의 에피토프, 항원 또는 단백질(또는 적어도 그의 일부, 절편 또는 에피토프)과 "결합할 수 있는" 또는 "특이적으로 결합할 수 있는", 그에 대한 "친화성을 가지는" 및/또는 "특이성을 가지는" 폴리펩티드(예를 들면, 본 발명의 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 이를 함유하는 폴리펩티드, 또는 일반적으로 이들의 항원 결합 분자 또는 절편)는 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대한" 또는 "향하여진"이라고 하거나, 이러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합" 분자이다.
일반적으로, "특이성"이란 용어는 특정한 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단백질(예를 들면, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인) 분자가 결합할 수 있는 상이한 종류의 항원 또는 에피토프의 수를 지칭한다. 항원 결합 분자의 특이성은 그의 친화도 및/또는 결합활성에 기초하여 측정할 수 있다. 항원과 항원 결합 단백질의 해리에 대한 평형상수(KD)로 표시되는 친화도는 항원 결합 단백질 상에서 에피토프와 항원 결합 부위 간의 결합강도의 척도이며: KD값이 작을수록, 에피토프와 항원 결합 분자 간의 결합강도는 더 강해진다.(선택적으로, 친화도는 또한 친화도 상수(KA)로서 표시할 수 있으며, 이것은 1/KD이다). (예를 들면, 여기에서 추가 설명에 기초하여)당업자들에게 명백한 바와 같이, 친화도는 공지된 방법 그 자체로 관심있는 특이적 항원에 따라 측정할 수 있다. 결합활성은 항원 결합 분자(예를 들면, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이것을 함유하는 폴리펩티드)와 적절한 항원 간의 결합강도의 척도이다. 결합활성은 항원 결합 분자 상에서 에피토프와 그의 항원 결합 부위 간의 친화도 및 항원 결합 분자 상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수 모두에 연관된다.
아미노산 잔기는 일반적으로 공지되어 있고 당업계에서 동의된, 표준 3 문자 또는 1 문자 아미노산 코드에 따라 표시할 수 있다. 2개 아미노산 서열을 비교할 때, "아미노산 차이"란 용어는 제2 서열과 비교하여 레퍼런스 서열의 위치에서 표시된 수의 아미노산 잔기의 도입, 결실 또는 치환을 지칭한다. 치환의 경우에, 이러한 치환은 바람직하게 보존성 아미노산 치환이며, 이것은 아미노산 잔기가 유사한 화학구조의 다른 아미노산 잔기로 대체되어 폴리펩티드의 작용, 활성 또는 기타 생물학적 특성에 영향이 거의 없거나 본질적으로 영향이 없는 것을 의미한다. 이러한 보존성 아미노산 치환은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 국제 공개특허 WO 98/49185에서는 보존성 아미노산 치환이 바람직하게 다음 그룹 (i) - (v) 내의 하나의 아미노산을 동일한 그룹 내의 다른 아미노산 잔기로 치환하는 치환이다: (i) 소형 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (ii) 극성의, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 (비전하) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (iii) 극성의, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (iv) 거대 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (v) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존성 아미노산 치환은 다음과 같다:
Ala을 Gly 또는 Ser으로 치환;
Arg을 Lys으로 치환;
Asn을 Gln 또는 His으로 치환;
Asp을 Glu으로 치환;
Cys을 Ser으로 치환;
Gln을 Asn으로 치환;
Glu을 Asp으로 치환;
Gly을 Ala 또는 Pro으로 치환;
His을 Asn 또는 Gln으로 치환;
Ile을 Leu 또는 Val으로 치환;
Leu을 Ile 또는 Val으로 치환;
Lys을 Arg, Gln 또는 Glu으로 치환;
Met을 Leu, Tyr 또는 Ile으로 치환;
Phe을 Met, Leu 또는 Tyr으로 치환;
Ser을 Thr으로 치환;
Thr을 Ser으로 치환;
Trp을 Tyr으로 치환;
Tyr을 Trp 또는 Phe으로 치환;
Val을 Ile 또는 Leu으로 치환.
핵산 또는 폴리펩티드 분자는,- 예를 들면 그의 천연 생물학적 공급원 및/또는 이것이 얻어지는 반응 매질 또는 배양배지와 비교할 때 - 이것이 통상적으로 상기 공급원 또는 배지에서 결합되어 있는 적어도 하나의 다른 성분, 예를 들면 다른 핵산, 다른 단백질/폴리펩티드, 다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 적어도 하나의 오염물질, 불순물 또는 미량 성분에서 분리되었을 때 "본질적으로 단리된 (형태인)" 것으로 여겨진다. 특히, 핵산 또는 폴리펩티드 분자는 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 적어도 100배, 및 1000배 이상으로 정제되었을 때 "본질적으로 단리"된 것으로 간주한다. "본질적으로 단리된 형태"로 있는 핵산 또는 폴리펩티드 분자는 바람직하게 적합한 기술, 예를 들면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 같은 적합한 크로마토그래피 방법을 사용하여 측정하였을 때 본질적으로 균질하다.
"암" 및 "암성(癌性)"이란 용어는 전형적으로 미조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 본 발명의 Dll4 결합 분자로 치료되는 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병이나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는, 미국 공개특허 2008/0014196에서 Dll4 길항제로의 치료에서 제안된 바와 같이, 예를 들면 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포 암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 위암, 흑색종, 및 다양한 유형의 두경부암이 다. 혈관형성의 조절이상은 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 다수의 장애를 유발할 수 있다. 이러한 장애에는 비신생물성 및 신생물성 상태 모두가 포함된다. 신생물성에는 위에서 기술된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 비신생물성 장애는, 제한적인 것은 아니나 미국 공개특허 2008/0014196에서 Dll4 길항제로의 치료에서 제안된 바와 같이, 예를 들면 원치 않는 또는 비정상적인 비대증, 관절염, 류머티스 관절염 (RA), 건선, 건선성 플라크, 사르코이드증, 죽상동맥경화증, 죽상경화판, 당뇨성 및 기타 증식성 망막병증 (미숙아 망막병증 포함), 수정체뒤 섬유증식, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관증식, 각막 이식 신생혈관 증식, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신생혈관증식, 각의 신생혈관증식 (피부 홍조), 안구 신생혈관 질환, 혈관재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과다형성 (그레이브(Grave) 질환 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압증, 악성 폐 삼출, 뇌부종 (예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련됨), 활막 염증, RA에서의 판누스(pannus) 형성, 골화 근육염, 비대성 골 형성, 골관절염 (OA), 불응성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액의 제3공간 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유증, 조산, 만성 염증, 예를 들면 IBD (크론(Crohn) 질환 및 궤양성 대장염), 신장 동종이식 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 원치 않는 또는 비정상적인 조직 덩어리 성장(비-암), 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장의 억제, 오슬러-웨버(Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 수정체뒤 섬유증식, 공피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들면, 심막염과 관련된 것), 및 흉막 삼출이다.
발명의 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정영역, CDR1, CDR2 및 CDR3 각각을 가지는 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하는 Dll4 결합 분자에 관한 것으로, 여기에서 CDR3는 이하에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가진다:
a) 서열번호: 1 내지 166 및 458,
b) 서열번호: 333 내지 353, 또는
c) 서열번호: 375 내지 395.
서열번호: 1 내지 166 및 458의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열 a)는 표 5와 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 서열의 제2 그룹으로부터 선택된 상응하는 아미노산 서열 내의 부분 서열로서 포함된다.
서열번호: 333 내지 353의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열 b)는 표 16-A와 서열번호: 354 내지 374에 나타낸 서열의 제2 그룹으로부터 선택된 상응하는 서열 내의 부분 서열로서 포함된다.
서열번호: 375 내지 395의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열 c)는 표 16-B와 서열번호: 396 내지 416에 나타낸 서열의 제2 그룹으로부터 선택된 상응하는 서열 내의 부분 서열로서 포함된다.
제2 측면에서, Dll4 결합 분자는 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각으로 구성되고, CDR3는 이하에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가진다:
a) 서열번호: 1 내지 166 및 458,
b) 서열번호: 333 내지 353, 또는
c) 서열번호: 375 내지 395.
다른 측면에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은
a) 서열번호: 1 내지 166 및 458에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR3;
b) 표 5에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 아미노산 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내의 부분 서열로서 포함된 아미노산 서열을 가지는 CDR1 및 CDR2;를 포함하고, 여기에서 서열번호 1 - 166에 대한 제1 그룹의 서열번호: x는 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하고, y = x + 166이다.
다른 측면에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은
a) 서열번호: 333 내지 353에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR3;
b) 표 16-A에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 354 내지 374에 나타낸 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내의 부분 서열로서 포함된 아미노산 서열을 가지는 CDR1 및 CDR2;를 포함하고, 여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하고, y = x + 21이다.
다른 측면에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은
a) 서열번호: 375 내지 395에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR3;
b) 표 16-B에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 396 내지 416에 나타낸 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내의 부분 서열로서 포함된 아미노산 서열을 가지는 CDR1 및 CDR2;를 가지고, 여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하고, y = x + 21이다.
바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH이다.
다른 측면에서, VHH는 표 5와 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가진다.
강화된 친화도 또는 감소된 면역원성 같은, 치료학적 적용 측면에서 개선된 특성을 가지는 Dll4 결합 분자는 본 발명의 개별적인 Dll4 결합 분자로부터 친화도 성숙(예를 들면, 합성, 무작위 또는 천연적으로 발생하는 면역글로불린 서열에서 출발), CDR 그래프팅, 인간화, 상이한 면역글로불린 서열에서 유도된 결합 절편, 오버래핑 프라이머를 사용한 PCR 어셈블리, 및 당업자들에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하는 유사한 기술; 또는 이들의 적합한 조합 등의 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 표준 핸드북 및 본 상세한 설명과 실시예를 참조할 수 있다.
바람직하게, 친화도가 증가된 본 발명의 Dll4 결합 분자는 다른 Dll4 결합 분자의 친화도 성숙에 의해 얻어지며, 후자는 친화도 성숙 분자에 대하여 "모" Dll4 결합 분자이다.
그러므로, 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 위에서 정의된 모면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변에 관한 것이다.
친화도 성숙을 위해 적합한 모Dll4 결합 분자는, 예를 들면 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 상기한 VHH이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 197에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 서열번호: 197에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH에서 유도된 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 354 내지 374에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 선택된다.
바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 358에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 358에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH의 인간화에 의해 얻어진다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 356에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 356에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 224에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 서열번호: 224에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH에서 유도된 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 369 내지 416에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 선택된다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 402에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 402에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH의 인간화에 의해 얻어진다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 416에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 416에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 407에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 413에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따른, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면 VH 및 VHH는 이들을 작용성 항원 결합 분자로서 치료요법에 사용하는데 매우 유리하게 하는 수많은 고유한 구조적 특성과 작용 특성을 가진다. 특히, 이에 제한되지 않고, (경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루지 않으면서 항원에 작용적으로 결합하도록 자연적으로 "설계된")VHH 도메인은 단일의, 비교적 작은 작용성 항원 결합 구조 단위로서 작용할 수 있다.
이들의 고유한 특성으로 인하여, 여기에서 정의된, 단독 또는 거대 폴리펩티드, 예를 들면 바이파라토프 분자의 일부로서, VHH 또는 VH (또는 VL) 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인은 수많은 이점을 제공한다:
- 높은 친화도와 고 선택성으로 항원을 결합하는데 단일 도메인만이 필요하기 때문에 2개의 별개 도메인을 제공할 필요가 없고 이러한 2개 도메인이 정확한 공간 형태와 구조로 존재하지 않을 수 있으며(즉, scFv 같이, 특별히 설계된 링커를 사용);
- 면역글로불린 단일 가변 도메인이 단일 핵산 분자로부터 발현될 수 있고 번역후 (글리코실레이션 같은)변성이 필요하지 않고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다가 및 다종(multispecific) 포맷으로 용이하게 조작될 수 있고(여기에서 상세히 언급됨);
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이들의 타겟인 낮은 고유 독성에 대하여 높은 특이성과 친화도를 가지며 주입 또는 주사 이외의 대안적 경로에 의해 투여될 수 있고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 열, pH, 프로테아제 및 다른 분해제 또는 조건에 매우 안정하여 냉각장치를 사용하지 않고 제조, 보관 또는 수송이 가능하고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 소규모 및 상업적 규모로 제조하기 용이하고 비교적 저렴하다. 예를 들면, 면역글로불린 단일 가변 도메인과 이를 함유하는 폴리펩티드는 (예를 들면, 이하에 상세히 기술한 바와 같은)미생물 발효를 사용하여 생산할 수 있고, 예를 들면 일반적인 항체를 사용하는, 포유동물 발현 시스템을 사용할 필요가 없으며;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 절편과 비교하여 상대적으로 작고(대략 15 kDa, 또는 일반적인 IgG 보다 10배 작음), 따라서 높은 조직(제한적인 것은 아니나, 예를 들면 고체 종양 및 다른 치밀 조직)침투성을 나타내며, 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 절편보다 더 많은 용량으로 투여할 수 있고;
- VHH는 특이적인 소위 "공동(cavity) 결합 특성"을 가지며(4 사슬 항체로부터의 VH 도메인과 비교하여 특히 이들의 연장된 CDR3 루프로 인하여), 따라서 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 절편이 접근할 수 없는 타겟과 에피토프에 접근할 수 있으며;
- VHH는 매우 가용성이며 안정하고 응집경향이 없는 특별한 이점을 가진다(Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989)에 기술된 마우스에서 유도된 항원 결합 도메인과 마찬가지로).
본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이들을 얻는 특정한 생물학적 공급원 또는 특이적 제조방법에 제한되지 않는다. 예를 들면, VHH는 다음 단계들을 포함하여 얻을 수 있다:
(1) 자연적으로 발생하는 중쇄 항체의 VHH 도메인을 단리하거나; 중쇄 항체 또는 VHH를 포함하는 라이브러리를 스크리닝하여 이들로부터 VHH를 단리하고;
(2) 자연적으로 발생한 서열을 가지는 VHH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(3) 임의로 친화도 성숙한 후, 자연적으로 발생한 서열을 가지는 VHH를 (여기에 기술된 바와 같이)"인간화"하거나 인간화된 VHH를 코딩하는 핵산을 발현하고;
(4) 동물 종, 특히 포유동물 종, 예를 들면 사람에서 유래한 자연적으로 발생한 항체로부터 면역글로불린 단일 가변 헤비 도메인을 (이하에 기술된 바와 같이)"카멜라이징(camelizing)"하거나 이러한 카멜라이즈된 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(5) VH를 "카멜라이징"하거나 또는 이러한 카멜라이즈된 VH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(6) 합성적 또는 반합성적으로 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하는 방법을 사용하고;
(7) VHH 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 핵산 합성 기술을 사용하여 제조한 다음, 이렇게 얻어진 핵산을 발현하고;
(8) 중쇄 항체 또는 VHH에 대하여 친화도 성숙, 돌연변이(예를 들면, 무작위 돌연변이 또는 부위 특이적 돌연변이) 및/또는 VHH의 친화도 및/또는 특이성을 증가시키기 위한 다른 방법을 수행하거나/하고;
(9) 이전 단계들을 조합 또는 선택하는 단계.
상기한 단계들을 수행하기 위한 적합한 방법과 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자들에게 자명하다.
특이적 구체예에 따르면, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 자연적으로 발생하는 VHH 도메인의 아미노산 서열에 본질적으로 상응하지만, "인간화"(임의로 친화도 성숙한 후), 즉 자연적으로 발생하는 VHH 서열의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람의 일반적 4 사슬 항체의 가변 헤비 도메인 내의 상응하는 위치에 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 "인간화된" 아미노산 서열을 가지는 VHH 도메인이다. 이것은 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있고, 이는 당업자들에 의해 일반적으로 사용될 수 있다.
인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 전체 사람 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 보다 더 특정한 구체예에서, 사람 생식세포계열 Vh3 서열 DP-29, DP-47, DP-51, 또는 그의 일부 또는 이와 매우 상동인 것으로부터 유도된 사람 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다. 따라서, 인간화 전략은 VHH 잔기를 DP 47, DP 29 및 DP 51 같은 생식세포계열 VH 유전자의 상응하는 프레임워크 1, 2 및 3(FRI, FR2 및 FR3) 잔기 단독 또는 조합으로 대체하는 것을 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 적합한 프레임워크 영역(FR)은, 예를 들면 국제 공개특허 WO 2006/004678에 열거된 것들 중에서 선택할 수 있고, 특히 "KERE" 및 "GLEW" 종류를 포함할 수 있다. 약 44 내지 47 위치에 아미노산 서열 G-L-E-W를 가지는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 각각 인간화된 이들의 대응물이 특히 바람직하다.
103 P,R,S-그룹 및/또는 GLEW-그룹에 속하는 VHH 도메인에 대한 바람직하나 비제한적인 인간화 치환(이하에 정의됨)은 108Q 내지 108L이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인을 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
다른 구체예에 따라, 면역글로불린 단일 가변 도메인는 여기에서 정의된 바와 같은 VH 도메인이다.
또다른 구체예에 따라, 본 발명의 Dll4 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 Dll4 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 종류의 대표물은 "카멜화(camelization)", 즉 일반적인 4 사슬 항체의 자연적으로 발생하는 가변 중쇄의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인 내의 상응하는 위치에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 "카멜화"된 자연적으로 발생한 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진다. 이것은 알려진 방법 자체로 수행할 수 있고, 이는 당업자들에게 명백하며, 또한 국제 공개특허 WO 94/04678을 참조할 수 있다. 이러한 카멜화는 VH-VL 경계와 소위 Camelidae Hallmark 잔기(예를 들면, 국제 공개특허 WO 94/04678 참조)에 존재하는 아미노산 위치에서 우선적으로 발생할 수 있다. 이러한 "인간화"와 "카멜화" 방법 및 이들과 일치하는 바람직한 프레임워크 영역 서열은 국제 공개특허 WO 2006/040153의 46 및 98 페이지와 국제 공개특허 WO 2006/122786의 107 페이지에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 Dll4 결합 분자, 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 이를 함유하는 폴리펩티드는 이들이 Dll4 분자 내의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다는 점에서 Dll4에 대한 특이성을 가진다.
Dll4 결합 분자와 그의 항원 Dll4의 특이적 결합은 공지되어 있는 적합한 방법, 예를 들면 여기에 기술된 에세이, 스캐쳐드(Scatchard) 분석 및/또는, 방사면역검정법(RIA), 효소면역검정법(EIA 및 ELISA) 및 샌드위치 경쟁 에세이 같은 경쟁적 결합 에세이와, 당업계에 알려진 이들의 상이한 변형으로 결정할 수 있다.
항원 Dll4와 관련하여, 본 발명의 Dll4 결합 분자, 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인은 종에 대하여 제한되지 않는다. 따라서, 사람에서의 치료를 목적으로 하는 경우, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드는 바람직하게 사람 Dll4와 결합한다. 그러나, 다른 포유동물 종에서 유래한 Dll4와 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이들을 함유하는 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 있다. 하나의 종 형태의 Dll4와 결합한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 다른 종의 Dll4와 교차반응할 수 있다. 예를 들면, 사람 Dll4와 결합한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 영장류의 하나 이상의 다른 종의 Dll4 및/또는 질환에 대한 동물 모델, 예를 들면 원숭이(특히 게먹이원숭이(Cynomolgus) 또는 벵골원숭이(Rhesus)), 마우스, 래트, 래빗, 돼지, 개 및/또는 특히 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 및 장애의 동물 모델(예를 들면, 여기에서 언급된 종 및 동물 모델)에 사용된 하나 이상의 동물 종의 Dll4과 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 이러한 교차 반응성을 나타내는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 원숭이, 특히 게먹이원숭이 또는 벵골원숭이, 또는 마우스와 래트 같은 숙지된 질환 모델에서 시험될 수 있도록 하였기 때문에 연구 및/또는 의약 개발에 유리하다.
또한, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 특이적 도메인 또는 이들이 향해져 있는, Dll4의 항원성 결정인자로 제한되거나 규정되지 않는다. 바람직하게, 치료학적 Dll4 길항제의 개발에서 동물 모델로 사용하고자 하는 사람 이외의 종에서 유래한 하나 이상의 Dll4 분자와의 교차 반응성에 비추어 Dll4 결합 분자는 사람 Dll4와 고도의 동일성을 가지는 관심있는 Dll4의 영역 내의 에피토프를 인식한다. 예를 들면, 마우스 모델을 사용하는데 있어서, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 전체적으로 또는 부분적으로 EGF-2 도메인 내에 위치한 에피토프를 인식하여 사람과 마우스 간에 높은 동일성을 나타낸다.
그러므로, 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열번호: 417의 아미노산 잔기 252-282에 해당하는 EGF-2 도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 함유된 에피토프에 결합하는 그룹에서 선택된, Dll4 결합 분자, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드가 여기에서 정의된 바와 같은 바이파라토프 분자이고 이것이 본 발명의 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하면, 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인 성분은 상기에서 정의된 EGF-2 도메인 내의 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Dll4와 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 500 pM 미만 같은 10 nM 미만의 친화도(실시예 5.7에 기술된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 분석으로 측정)로 결합한다.
바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 실시예 5.1에 기술된 경쟁 ELISA 에세이에서 측정된 바와 같이, 10-6 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위, 더욱 바람직하게 10-8 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위, 보다 더 바람직하게 10-9 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위의 IC50값을 가진다.
본 발명의 비제한적인 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 Dll4 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드는 Dll4와 10-5 내지 10-12 몰/리터 (M) 이하, 바람직하게 10-7 내지 10-12 몰/리터 (M) 이하, 더욱 바람직하게 10-8 내지 10-12 몰/리터 (M)의 해리상수(KD), 및/또는 적어도 107 M-1, 바람직하게 적어도 108 M-1, 더욱 바람직하게 적어도 109 M-1, 예를 들면 적어도 1012 M-1의 결합상수(KA); 및 특히 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 500 pM 미만 같은 10 nM 미만의 KD로 결합한다. Dll4에 대한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 KD와 KA값을 측정할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 겹치지 않는(non-overlapping) 상이한 에피토프에서 항원 Dll4에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Dll4 결합 분자에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 이러한 폴리펩티드는 (i) Dll4의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인과 (ii) Dll4의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 본질적으로 구성되거나 포함하고, 여기에서 Dll4의 제1 에피토프와 Dll4의 제2 에피토프는 동일한 에피토프가 아니다. 다시 말해서, 본 발명의 이러한 폴리펩티드는 Dll4에 존재하는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 본질적으로 구성되거나 포함하며, 여기에서 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이들이 동시에 Dll4와 결합할 수 있는 방법으로 서로에 결합된다. 이런 의미에서, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드가 Dll4에 대하여 적어도 2개의 결합부위를 포함한다는 점에서 "이가(bivalent)" 또는 "다가" 면역글로불린 구조물, 특히 "다가 면역글로불린 단일 가변 도메인 구조물"로 간주될 수 있다.
본 발명의 이러한 Dll4 결합 분자는 (적어도) 2개의 항Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기에서 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Dll4 분자 내의 상이한 에피토프에 대한 것이다. 따라서, 이들 2개 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상이한 항원 특이성을 가지게 됨에 따라 상이한 CDR 서열을 가진다. 이러한 이유로, 본 발명의 폴리펩티드는 여기에서 "바이파라토프 폴리펩티드" 또는 "바이파라토프 단일 도메인 항체 구조물"(만일 면역글로불린 단일 가변 도메인이 단일 도메인 항체로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다면) 또는 "바이파라토프 VHH 구조물"(만일 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다면)로 각각 명명되며, 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 2개의 상이한 파라토프를 포함하기 때문이다.
본 발명의 특이적 구체예에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드가 2개 이상의 항Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인, 즉 3개, 4개 또는 그 이상의 항Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 경우에, 적어도 2개의 항Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Dll4 분자 내의 상이한 에피토프에 대한 것이며, 여기에서 임의의 추가 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이러한 2개의 상이한 에피토프 및/또는 Dll4 분자 내에 존재하는 다른 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명에 따르면, 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서로에 대하여 독립적으로 VH 또는 VHH이거나/이고, 여기에서 정의된 VL 도메인 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인의 다른 종류일 수 있으나, 단 이러한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항원, 즉 Dll4와 결합한다.
바람직한 구체예에 따르면, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본질적으로 여기에서 정의된 VH 서열 또는 VHH 서열로 구성된다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본질적으로 VHH 서열로 구성된다.
본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 본 발명의 Dll4 결합 분자 내에 존재하는 적어도 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서로 직접적으로(즉, 링커를 사용하지 않고) 또는 링커에 의해 결합될 수 있다. 링커는 바람직하게 링커 펩티드이며, 적어도 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인이 하나의 동일한 Dll4 분자 내에서 또는 2개의 상이한 분자들 내에서 이들의 Dll4의 적어도 2개 상이한 에피토프 각각에 결합할 수 있도록 선택된다.
링커의 선택은 특히 에피토프, 구체적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인이 결합하는 Dll4 상의 에피토프 간 거리에 따르며, 당업자들에게는 임의로 일부 제한된 정도의 일반적 실험 후에 여기에서의 설명에 기초하여 명확해 질 수 있다. 이러한 실험의 출발점으로서, 본 발명의 이러한 폴리펩티드 내에 존재하는 2개 면역글로불린 단일 가변 도메인의 N-말단과 C-말단 간의 거리는 바람직하게 적어도 50 옹스트롱, 더욱 바람직하게 55-200 옹스트롱의 영역 내, 특히 65-150 옹스트롱의 영역 내일 것으로 일반적으로 추정할 수 있으며, 상한은 결정적인 것은 아니며, 간편성을 이유로, 예를 들면 단백질의 발현/생산을 위해 선택된다.
또한, Dll4에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VH 또는 VHH일 때, 이들은 제3의 VH 또는 VHH 각각에 의해 서로에 연결될 수 있다.(이러한 Dll4 결합 분자에서 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 제3 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접 또는 적합한 링커에 의해 연결될 수 있다). 이러한 제3의 VH 또는 VHH는, 예를 들면 증가된 반감기를 제공하는 VH 또는 VHH일 수 있다. 예를 들면 후자의 VH 또는 VHH는 (사람) 혈청 알부민 또는 (사람) 트랜스페린(transferrin) 같은 (사람) 혈청 단백질에 결합할 수 있는 VH 또는 VHH일 수 있다.
선택적으로, Dll4에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 연속적으로 (직접 또는 적합한 링커에 의해) 연결될 수 있고 (증가된 반감기를 제공할 수 있는) 제3의 VH 또는 VHH는 직접 또는 링커에 의해 2개 이상의 상기한 면역글로불린 서열 중 하나에 연결될 수 있다.
적합한 링커는 - 비제한적인 예를 들면 - 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게 9개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게 17개 이상의 아미노산, 예를 들면 약 20 - 40 아미노산 잔기의 길이를 가진다. 그러나, 상한은 결정적이지 않으며, 이러한 폴리펩티드의 바이오의약 생산 등과 관련한 간편성을 위해 선택된다.
링커 서열은 자연적으로 발생하는 서열 또는 비자연적으로 발생하는 서열일 수 있다. 치료학적 목적으로 사용될 경우, 링커는 본 발명의 폴리펩티드가 투여되는 대상 내에서 비면역원성인 것이 바람직하다.
유용한 한 그룹의 링커 서열은 국제 공개특허 WO 96/34103 및 WO 94/04678에 기술된 중쇄 항체의 힌지 영역에서 유도된 링커이다.
다른 예는 폴리-알라닌 링커 서열, 예를 들면 Ala-Ala-Ala이다.
본 발명의 폴리펩티드가 폴리머, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 PEG (폴리에틸렌 글리콜)의 결합으로 변성되면, 링커 서열은 바람직하게 아미노산 잔기, 예를 들면 시스테인 또는 리신을 포함하여 링커 영역 내에서 이러한 변성, 예를 들면 페길화(PEGylation)가 가능하다.
또한, 링커는, 예를 들면 WO 04/081026에 나타낸 바와 같은 폴리(에틸레 글리콜)잔기일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 적어도 2개 Dll4 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 성분 (임의로 1 또는 2개 링커), 예를 들면 다른 폴리펩티드로 서로 연결되며, 비제한적인 바람직한 구체예에서 이것은 상기한 바와 같은 추가의 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다. 이러한 성분은 본질적으로 불활성이거나, 폴리펩티드의 목적하는 특성을 개선하는 등의 생물학적 효과를 가지거나, 폴리펩티드에 하나 이상의 추가의 바람직한 특성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 성분은 단백질 또는 폴리펩티드의 반감기를 개선하거나/하고 그의 면역원성을 감소시키거나 다른 바람직한 특성을 개선할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 치료제로서 그의 용도를 고려하여 환자의 혈청 또는 다른 체액 내에서 본 발명의 폴리펩티드의 반감기를 연장하는 성분을 포함한다. "반감기"란 용어는 (변성된) 폴리펩티드의 혈청 농도를 생체 내에서, 예를 들면 폴리펩티드의 분해 및/또는 소거 및/또는 자연적 메카니즘에 의한 부골화(sequestration)로 인해 50%까지 감소하는데 소요되는 시간으로 정의된다.
더욱 구체적으로, 이러한 반감기 연장 성분은 폴리펩티드에 공유적으로 연결되거나 융합되고, Fc 부분, 알부민 성분, 알부민 성분의 절편, 알부민 결합성분, 예를 들면 항알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인, 트랜스페린 결합 성분, 예를 들면 항트랜스페린 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리옥시알킬렌 분자, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 분자, 알부민 결합 펩티드 또는 하이드록시에틸 전분 (HES) 유도체일 수 있으며, 제한되지는 않는다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 혈액에서 발견되는 항원에 결합하는 성분, 예를 들면 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신 결합 단백질, 피브리노겐 또는 트랜스페린을 포함하여서 생체 내에서 생성된 본 발명의 폴리펩티드에 증가된 반감기를 제공한다. 특별하게 바람직한 구체예에 따르면, 이러한 성분은 알부민 결합 면역글로불린이고, 특히 바람직하게 알부민 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면 알부민 결합 VHH 도메인이다.
사람에서 사용하기 위하여, 이러한 알부민 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 사람 혈청 알부민에 결합하며, 바람직하게 인간화된 알부민 결합 VHH 도메인일 수 있다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들면 국제 공개특허 WO 2006/122786에 상세히 기술되어 있다. 특히, 유용한 알부민 결합 VHH는 ALB 1과 그의 인간화된 대응물 ALB 8 (WO 2009/ 095489)이다. 그러나, 상기 공개특허에서 언급된 다른 알부민 결합 VHH 도메인 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 국제 공개특허 WO01/79271과 WO03/59934에 기술된 것과 같은 혈청 알부민 분자에 융합될 수 있다. 예를 들면, 국제 공개특허 WO01/79271에 기술된 바와 같이, 융합 단백질은 일반적인 재조합기술에 의해 얻어질 수 있고: 혈청 알부민, 또는 그의 절편을 코딩하는 DNA 분자는 Dll4 결합 분자를 코딩하는 DNA와 결합되고, 얻어진 구조물은 선택된 숙주세포, 예를 들면 Pichia pastoris 같은 효모 세포, 또는 박테리아 세포에서 발현하는데 적합한 플라스미드에 도입된 다음, 숙주세포를 융합된 뉴클레오티드 서열로 형질감염하여 적합한 조건 하에서 배양한다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드의 반감기를 연장하는 변성(또한 폴리펩티드의 면역원성을 감소시키는 변성)은 적합한 약리학적으로 허용가능한 폴리머, 예를 들면 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 그의 유도체(예를 들면, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG)의 결합을 포함한다. 일반적으로, 당업계에서 항체와 항체 절편(예를 들면, 제한적인 것은 아니나 단일 도메인 항체 및 scFv)에 대해 사용된 페길화(PEGylation) 같은 적합한 형태의 페길화를 사용할 수 있으며; 예를 들어, 다음 문헌을 참조할 수 있다: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); 및 WO 04/060965. 폴리펩티드의 페길화를 위한 다양한 시약들은, 예를 들면 Nektar Therapeutics(미국), 또는 NOF Corporation(일본)에서 상업적으로 입수할 수 있으며, 예를 들면 Sunbright® EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, 및 ME Series, 예를 들면 Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, 및 Sunbright® ME-400MA가 있다.
바람직하게, 부위 특이적 페길화가 특히 시스테인 잔기에 의해 사용된다(예를 들면, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003) 참조). 예를 들면, 이러한 목적을 위해 PEG를 본 발명의 폴리펩티드에서 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 결합시키고, 본 발명의 폴리펩티드는 PEG 결합을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하도록 변성되거나, PEG 결합을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 본 발명의 폴리펩티드 N-말단 및/또는 C-말단에 융합할 수 있으며, 이 모두는 당업자에게 공지된 단백질 조작 기술을 사용한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드에 있어서, PEG는 5 kDa 이상, 예를 들면 10 kDa 이상 및, 200 kDa 미만, 예를 들면 100 kDa 미만; 예를 들면 20 kDa 내지 80 kDa 범위의 분자량으로 사용된다. 페길화와 관련하여, 일반적으로 본 발명은 또한, 바람직하게 페길화가 (1) 생체내에서 반감기를 증가시키고; (2) 면역원성을 감소시키고; (3) 페길화에 대해 공지된 하나 이상의 추가적인 유리한 특성을 제공하고; (4) Dll4에 대한 폴리펩티드의 친화도에 본질적으로 영향을 주지 않으며(예를 들면, 당업계에서 기술된 적합한 에세이로 측정하였을 때, 친화도를 50% 이상, 더욱 바람직하게 10% 이상 감소시키지 않는다); 및/또는 (5) 본 발명의 Dll4 결합 분자의 다른 바람직한 특성에 영향을 주지 않는 방법으로, 하나 이상의 아미노산 위치에서 페길화된 바이파라토프 Dll4 결합 분자를 포함하는 것을 주지하여야 한다. 적합한 PEG-그룹과 이들을 특이적으로 또는 비특이적으로 결합하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 이러한 페길화를 위한 적합한 키트와 시료는, 예를 들면 Nektar (CA, USA)로부터 입수할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Dll4 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 또한 여기에서 "본 발명의 핵산"이라 지칭하였으며, 여기에서 정의된 유전자 구조물의 형태일 수 있다. 본 발명의 핵산은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA(예를 들면, 목적하는 숙주세포 또는 숙주 개체에서의 발현에 특이적으로 적응시킨 코돈 선호도(codon usage)를 가지는 DNA)이다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산은 앞서 정의된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태로 존재한다.
본 발명의 핵산은 또한 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드 또는 YAC의 형태이거나/이고, 이들 내에 존재하거나/하고 그의 일부일 수 있다. 벡터는 특히 발현벡터, 즉 시험관내 및/또는 생체내(즉, 적합한 숙주세포, 숙주 개체 및/또는 발현 시스템)에서 Dll4 결합 분자의 발현을 제공할 수 있는 벡터이다. 이러한 발현벡터는 일반적으로, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등의 하나 이상의 적합한 조절요소에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 본 발명의 핵산을 포함한다. 특이적 숙주에서 특이적 서열의 발현을 고려하여 이러한 요소와 그의 선택은 당업자들에게는 보편적인 지식이다. 본 발명의 Dll4 결합 분자를 발현하는데 유용하거나 필요한 조절요소와 다른 요소, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 삽입인자, 선택마커, 리더 서열, 리포터 유전자 등의 특이적 예는, 예를 들면 국제 공개특허 WO 2006/040153의 131 내지 133 페이지에 기술되어 있다.
본 발명의 핵산은 여기에서 제공된 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여, 공지된 방법 (예를 들면, 자동화된 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술)으로 제조하거나 얻어질 수 있거나/있고, 적합한 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Dll4 결합 분자 하나 이상을 발현하거나 발현할 수 있거나/있고; 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 특정한 바람직한 구체예에 따르면, 상기 숙주세포는 박테리아 세포이며; 다른 유용한 세포는 효모 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포이다.
적합한 박테리아 세포는 그람 음성 박테리아 균주, 예를 들면 Escherichia coli, Proteus 및 Pseudomonas, 및 그람 양성 박테리아 균주, 예를 들면 Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus 및 Lactococcus로부터 유래한 세포이다. 적합한 진균 세포는 Trichoderma, Neurospora, 및 Aspergillus 종에서 유래한 세포이다. 적합한 효모 세포는 Saccharomyces (예를 들면, Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces (예를 들면, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (예를 들면, Pichia pastoris 및 Pichia methanolica), 및 Hansenula 종에서 유래한 세포이다.
적합한 포유동물 세포는, 예를 들면 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등이다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질의 발현에 당분야에서 사용된 다른 세포들도 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 Dll4 결합 분자를 제조하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 일반적으로 다음의 단계들을 포함한다:
- Dll4 결합 분자를 코딩할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주세포를 본 발명의 Dll4 결합 분자의 발현이 가능한 조건 하에서 배양하고;
- 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 배지에서 회수 또는 단리하고;
- 임의로 본 발명의 Dll4 결합 분자를 추가로 정제 및/또는 변성 및/또는 제형화하는 단계.
산업적 규모로 생산하는데 있어서, 바람직한 숙주 개체는 대규모 발현, 생산 및 발효, 특히 대량 규모의 약학적 발현, 생산 및 발효에 적합한 E.　 coli, Pichia pastoris, 및 S. cerevisiae의 균주이다.
특이적 발현 시스템의 선택은 부분적으로 임의의 번역후 변성, 보다 구체적으로 글리코실레이션의 요건에 따른다. 글리코실레이션이 바람직하거나 필요한 본 발명의 Dll4 결합 분자의 생산은 발현된 단백질을 글리코실레이션하는 능력을 가지는 포유동물의 발현 숙주를 사용하는 것이 필요하다. 이러한 측면에서, 얻어진 글리코실레이션 패턴(즉, 결합된 잔기의 종류, 수 및 위치)이 발현에 사용된 세포 또는 세포주에 따른다는 것은 당업자들에게 자명하다.
위에서 제시된 세포에서 생산된 본 발명의 Dll4 결합 분자는 세포 내적으로(예를 들면, 세포질, 주변세포질 또는 봉입체) 생산한 다음, 숙주세포에서 단리하여, 임의로 추가 정제하거나; 이들을 세포외적으로(예를 들면, 숙주세포가 배양된 배지에서) 생산한 다음, 배양배지에서 단리하여 임의로 추가 정제할 수 있다.
적합한 특이적 발현벡터, 형질전환 또는 형질감염 방법, 선택마커, 단백질 발현의 유도방법, 배양 조건 등과 같은 폴리펩티드의 재조합 생산에 사용되는 방법과 시약은 당업계에 공지되어 있다. 마찬가지로, 본 발명의 폴리펩티드의 제조방법에 유용한 단백질 단리 및 정제방법 또한 당업자들에게 잘 알려져 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호: 1 내지 166 및 458, 서열번호:　333 내지 353, 또는 서열번호: 375 내지 395 각각에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드, 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
이 펩티드들은 본 발명의 VHH에서 유도된 CDR3에 상응한다. 이 펩티드들, 특히 이들을 코딩하는 핵산 분자들은 면역글로불린 사슬에서 CDR3를 대체하기 위한 CDR 그래프팅에 유용하거나, 비면역글로불린 스캐폴드, 예를 들면 프로테아제 저해제, DNA-결합 단백질, 시트크롬(cytochrome) b562, 나선 다발(helix-bundle) 단백질, 디설파이드 가교 펩티드, 리포칼린 또는 안티칼린으로의 도입에 유용하기 때문에 이러한 스캐폴드에 타겟 결합 특성을 제공한다. CDR-그래프팅 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 항체의 인간화(일반적으로, 로덴트 항체에서 사람 항체의 Fv 프레임워크 상에 CDR 그래프팅을 포함) 등에 널리 사용된다.
본 발명의 CDR3를 함유하는 면역글로불린 또는 비면역글로불린 스캐폴드를 얻기 위해서, 이러한 분자를 코딩하는 DNA를 분자 생물학의 표준 방법에 따라, 예를 들면 유전자 합성, 올리고뉴클레오티드 어닐링 또는 PCR 절편의 오버래핑에 의해 얻을 수 있으며, 이 방법들은, 예를 들면 문헌[Daugherty et al ., 1991, Nucleic Acids Research, Vol. 19, 9, 2471 - 2476]을 참조할 수 있다. VHH CDR3를 비면역글로불린 스캐폴드에 도입하는 방법은 문헌[Nicaise et al ., 2004, Protein Science, 13, 1882 -1891]에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 Dll4 결합 분자 및, 조성물의 목적하는 용도에 따른, 공지된 조성물의 하나 이상의 임의의 추가 성분을 함유 또는 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다.
약학적 용도에 있어서, 본 발명의 Dll4 결합 분자 또는 이를 함유하는 폴리펩티드는 적어도 하나의 본 발명의 Dll4 결합 분자 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제 및/또는 보조제, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 활성인 추가 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조제물 또는 조성물로서 제제화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 이러한 제제는 경구 투여, 비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입), 국소 투여, 흡입에 의한 투여, 피부 패취, 임플란트, 좌약 등에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 적합한 투여형태 - 투여방법에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있다 -뿐만 아니라 이들의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자들에게 자명하며, 또한 여기에 기술하였다.
그러므로, 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 Dll4 결합 분자, 특히 하나의 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 첨가제(즉, 약학적 용도에 적합한), 및 임의로 하나 이상의 추가 활성물질을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 Dll4 결합 분자는 공지된 적합한 방법으로 제제화되어 투여될 수 있으며: 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대하여, 예를 들면 다음 문헌을 참조할 수 있다: WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 및 WO 08/020079, 및 표준 핸드북, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); 또는 the Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (예를 들면 252-255쪽 참조).
예를 들면, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일반적 항체 및 항체 절편(ScFv 및 다이아바디 포함) 및 다른 약학적으로 활성인 단백질에 대하여 공지된 방법으로 제제화되어 투여할 수 있다. 이러한 제제와 이를 제조하는 방법은 당업자들에게 자명하고, 예를 들면 비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 관내(intraluminal), 동맥내 또는 척추강내) 또는 국소(즉, 경피 또는 피내) 투여에 적합한 조제물을 포함한다.
비경구 투여용 조제물은, 예를 들면 주입 또는 주사에 적합한, 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀젼일 수 있다. 이러한 조제물을 위한 적합한 담체 또는 희석제는, 예를 들면 멸균수 및 약학적으로 허용가능한 수성 완충액 및 용액, 예를 들면 생리적 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 Hank 용액; 워터 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들면 프로필렌 글리콜 또는 미네랄 오일, 동물성 오일 및 식물성 오일, 예를 들면 땅콩유, 콩기름, 및 적합한 이들의 혼합물이나, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체 같은 약학적으로 허용가능한 비히클과 함께, 예를 들면 경구로 전신 투여할 수 있다. 경구적 치료 투여를 위하여, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 하나 이상의 첨가제와 조합하여, 섭취가능한 정제(ingestible tablet), 구강정(buccal tablet), 트로키(troches), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 조성물과 조제물은 적어도 0.1%의 본 발명의 Dll4 결합 분자를 포함하여야 한다. 조성물과 조제물에서 이들의 비율은, 물론 변경할 수 있으며, 간편하게 주어진 단위 투여 형태의 약 2 내지 약 60 중량%의 범위이다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물에서 본 발명의 Dll4 결합 분자의 양은 유효 투여 농도가 얻어질 수 있는 정도이다.
정제, 알약, 캡슐 등은 또한 결합제, 첨가제, 붕해제, 윤활제 및 감미제 또는 풍미제를 포함할 수 있으며, 이들에 대하여는 국제 공개특허 WO 08/020079의 143-144쪽에 언급되어 있다. 단위 투여 형태가 캡슐일 경우, 이것은 상기한 종류의 물질 이외에 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서 또는 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 달리 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 알약 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락(shellac) 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 본 발명의 Dll4 결합 분자, 감미제로서 슈크로스 또는 프럭토스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리향 또는 오렌지향 같은 향미제를 포함할 수 있다. 임의의 단위 투여 형태를 제조하는데 사용되는 물질은 사용된 양에 있어서 당연히 약학적으로 허용가능하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 서방성 제제 및 장치와 결합될 수 있다.
경구 투여용 조제물과 제제는 또한 본 발명의 구조물이 위장의 환경을 견디고 장을 통과할 수 있는 장용 코팅정으로 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 경구 투여용 조제물과 제제는 위장관의 원하는 부위에 전달하기 위해 적합하게 제제화될 수 있다. 또한, 적합한 좌약제는 위장관으로의 전달을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 Dll4 결합 분자는 또한 국제 공개특허 WO 08/020079의 144-145쪽에 상세히 기술된 바와 같이 주입 또는 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여될 수 있다.
본 발명의 Dll4 결합 분자의 국소 투여에 있어서, 일반적으로 이들은 국제 공개특허 WO 08/020079의 145쪽에 상세히 기술된 바와 같이 피부과학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 고체 또는 액체인 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 로숀 같은 액체 조성물에서 본 발명의 Dll4 결합 분자의 농도는 약 0.1-25 wt-%, 바람직하게 약 0.5-10 wt-%이다. 겔이나 분말 같은 반고체 또는 고체 조성물에서의 농도는 약 0.1-5 wt-%, 바람직하게 약 0.5-2.5 wt-%이다.
치료에 사용하기 위해 필요한 본 발명의 Dll4 결합 분자의 양은 선택된 특정한 Dll4 결합 분자뿐만 아니라 투여경로, 치료되는 상태의 성질 및 환자의 연령과 상태에 따라 달라지며, 궁극적으로 수행 의사 또는 임상의 재량에 따른다. 또한, 본 발명의 Dll4 결합 분자의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 그래프트 또는 기관에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 단일 용량 또는, 예를 들면 1일 당 2, 3, 4 이상의 하위(sub) 용량으로서 적절한 간격으로 투여되는 분할 투여로 편리하게 제공될 수 있다. 하위 용량 자체는, 예를 들면 별개의 대략적으로 분산된 다수의 투여로 추가 분할될 수 있으며; 취입기로부터의 복수 흡입 또는 눈에 여러 방울을 적용하는 것을 예로 들 수 있다.
투약요법은 장기 치료, 1일 치료를 포함한다. "장기"란 용어는 적어도 2 주, 바람직하게 수 주, 수 개월 또는 수 년간의 기간을 의미한다. 당업자들이라면 여기에서 실시방법이 제공된 일반적인 실험만을 사용하여 투여량 범위의 필요한 변형을 결정할 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA 참조. 또한, 합병증이 있는 경우에 개별 의사는 투여량을 조절할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 Dll4 결합 분자의 용도, 예를 들면 다음과 같은 치료학적 목적을 위한 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드에 관한 것이다:
- 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관되거나 Notch 시그널링 경로를 Dll4 결합 분자로 조절하여 예방, 치료 또는 완화될 수 있는, 특히 사람의 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 및/또는 완화;
- 적어도 하나의 본 발명의 Dll4 결합 분자, 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 이를 함유하는 약학 조성물의 약학적으로 활성인 양을 상기한 요법이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기한 요법이 필요한 환자의 치료방법;
- 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 완화를 위한 의약의 제조;
- 상기한 목적으로 사용된 약학 조성물 또는 의약의 활성 성분.
특별한 측면에 따르면, 장애, 질환 또는 상태는 여기에서 정의된 바와 같은 암 또는 암성 질환이다.
다른 측면에 따르면, 질환은 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 눈 질환, 또는 Notch 시그널링 경로를 Dll4 결합 분자로 조절하여 치료되거나 완화될 수 있는 질환이다.
치료될 암성 질환에 따라, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 그 자체 또는, 특히 DNA 손상제 같은 화학요법제 또는 혈관형성, 시그널 형질도입 경로 또는 유사분열 검사점을 암 세포에서 저해하는 치료학적으로 활성인 화합물에서 선택된 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 사용할 수 있다.
추가 치료제를 임의로 동일한 약학 조제물의 성분으로서 함께 동시에, 또는 Dll4 결합 분자의 투여 전,후에 투여할 수 있다.
임의의 구체예에서, 추가 치료제는 EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, 오로라(Aurora)A, 오로라B, PLK 및 PI3 키나제, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGFR 또는 IR의 저해제로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 저해제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
추가 치료제의 또다른 예는 CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90의 저해제, 헤지호그(hedgehog) 길항제, JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, 프로테아좀(proteasome), Rho의 저해제, wnt 시그널링의 저해제 또는 유비퀴틴화 경로의 저해제 또는 Notch 시그널링 경로의 다른 저해제이다.
오로라 저해제의 예는 PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735이나, 이에 한정되지는 않는다.
PLK 저해제의 예는 GSK-461364이다.
raf 저해제의 예는 BAY-73-4506(또한 VEGFR의 저해제이기도 함), PLX 4032, RAF265(또한 VEGFR 저해제 추가), 소라페닙(sorafenib) (또한 VEGFR 저해제 추가), 및 XL 281이다.
KSP 저해제의 예는 이스피네십(ispinesib), ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, 및 SB-743921이다.
src 및/또는 bcr-abl 저해제의 예는 다사티닙(dasatinib), AZD-0530, 보수티닙(bosutinib), XL 228 (IGF-1R의 저해제이기도 함), 닐로티닙 (PDGFR 및 cKit의 저해제이기도 함), 이마티닙 (또한 cKit 저해제), 및 NS-187이다.
PDK1 저해제의 예는 BX-517이다.
Rho 저해제의 예는 BA-210이다.
PI3 kinase 저해제의 예는 PX-866, BEZ-235 (mTor의 저해제이기도 함), XL 418 (Akt의 저해제이기도 함), XL-147, 및 XL 765 (mTor의 저해제이기도 함)이다.
cMet 또는 HGF의 저해제의 예는 XL-184 (또한 VEGFR, cKit, Flt3의 저해제이기도 함), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (또한 VEGFR 저해제), MGCD-265 (또한 VEGFR, Ron, Tie2의 저해제), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, 및 AV-299이다.
c-Myc 저해제의 예는 CX-3543이다.
Flt3 저해제의 예는 AC-220 (또한 cKit 및 PDGFR의 저해제), KW 2449, 레스타우르티닙(lestaurtinib) (또한 VEGFR, PDGFR, PKC의 저해제), TG-101348 (또한 JAK2 저해제), XL-999 (또한 cKit, FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제), 서니티닙(sunitinib) (또한 PDGFR, VEGFR 및 cKit의 저해제), 및 탄두티닙(tandutinib) (또한 PDGFR, 및 cKit의 저해제)이다.
HSP90 저해제의 예는 타네스피마이신(tanespimycin), 알베스피마이신 (alvespimycin), IPI-504 및 CNF 2024이다.
JAK/STAT 저해제의 예는 CYT-997 (또한 투불린과 상호작용), TG 101348 (또한 Flt3의 저해제), 및 XL-019이다.
Mek 저해제의 예는 ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 및 XL 518이다.
mTor 저해제의 예는 템시롤리무스(temsirolimus), AP-23573 (또한 VEGF 저해제로서 작용), 에베롤리무스(everolimus)(또한 VEGF 저해제), XL-765(PI3 키나제 저해제) 및 BEZ-235(PI3 키나제 저해제이기도 함)이다.
Akt 저해제의 예는 페리포신, GSK-690693, RX-0201 및 트리시리빈 (triciribine)이다.
cKit 저해제의 예는 AB-1010, OSI-930(VEGFR 저해제로서도 작용), AC-220(Flt3 및 PDGFR의 저해제이기도 함.), 탄두티닙(Flt3 및 PDGFR의 저해제이기도 함), 악시티닙(axitinib)(VEGFR 및 PDGFR의 저해제이기도 함), XL-999 (Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR의 저해제이기도 함), 수니티닙(Flt3, PDGFR, VEGFR의 저해제이기도 함), 및 XL-820(VEGFR- 및 PDGFR 저해제로서도 작용), 이마티닙(또한 bcr-abl의 저해제), 닐로티닙(nilotinib)(또한 bcr-abl 및 PDGFR의 저해제)이다.
헤지호그 길항제의 예는 IPI-609 및 CUR-61414이다.
CDK 저해제의 예는 셀리시클립(seliciclib), AT-7519, P-276, ZK-CDK (VEGFR2 및 PDGFR을 저해하기도 함), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 및 AG 024322이다.
프로테아좀 저해제의 예는 보르테조밉(bortezomib), 카필조밉(carfilzomib), 및 NPI-0052 (또한 NFkappaB의 저해제이기도 함.)이다.
NFkappaB 경로 저해제의 예는 NPI-0052이다.
유비퀴틴화 경로 저해제의 예는 HBX-41108이다.
바람직한 구체예에서, 추가 치료제는 항혈관형성제이다.
항혈관형성제의 예는 FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제 또는 각각의 리간드(예를 들면, 페가프타닙(pegaptanib) 같은 VEGF 저해제 또는 항-VEGF 항체 베바시주맵), 및 탈리도마이드이며, 이러한 제제는 베바시주맵, 모테사닙(motesanib), CDP-791, SU-14813, 텔라티닙 (telatinib), KRN-951, ZK-CDK (CDK의 저해제이기도 함), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (면역조절제), 탈리도마이드 유도체 CC-4047, 레날리도마이드, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, 브리바닙(brivanib), 세디라닙, XL999 (cKit 및 Flt3의 저해제이기도 함), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (Flt3의 저해제이기도 함), 수니티닙(cKit 및 Flt3의 저해제이기도 함), 악시티닙(cKit의 저해제이기도 함), 레스타우르니팁 (lestaurtinib) (Flt3 및 PKC의 저해제이기도 함), 바탈라닙, 탄두티닙 (Flt3 및 cKit의 저해제이기도 함), 파조파닙 (pazopanib), GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, 소라페닙 토실레이트 (Raf의 저해제이기도 함), RAF-265 (Raf의 저해제이기도 함), 반데타닙(vandetanib), CP-547632, OSI-930, AEE-788 (EGFR 및 Her2의 저해제이기도 함), BAY-57-9352 (Raf의 저해제이기도 함), BAY-73-4506 (Raf의 저해제이기도 함), XL 880 (cMet의 저해제이기도 함), XL647 (EGFR 및 EphB4의 저해제이기도 함), XL 820 (cKit의 저해제이기도 함), 및 닐로티닙 (cKit 및 brc-abl의 저해제이기도 함)에서 선택되나, 이에 한정되지는 않는다.
추가 치료제는 또한 소분자 EGFR 저해제 또는 항EGFR 항체일 수 있는 EGFR 저해제 중에서 선택될 수 있다. 항EGFR 항체의 예는, 비제한적으로 세툭시맵, 파니투무맵, 마투주맵이며; 소분자 EGFR 저해제의 예는 제피티닙이다. 다른 EGFR 조절제의 예는 EGF 융합 독소이다.
EGFR 및 Her2 저해제 중에는 라파티닙(lapatinib), 게피티닙, 에를로티닙, 세툭시맵, 트라스투주맵, 니모투주맵, 잘루투무맵, 반데타닙(또한 VEGFR의 저해제), 페르투주맵(pertuzumab), XL647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (또한 VEGFR의 저해제), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab이 본 발명의 Dll4 결합 분자와의 조합에 유용하다.
본 발명의 Dll4 결합 분자로의 치료요법에서 유리하게 결합될 수 있는 다른 약제는 토시투무맵(tositumumab) 및 이브리투모맵 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan) (2개의 방사능표지된 항-CD20 항체), 알렘투주맵(alemtuzumab) (항-CD52 항체), 데노수맵(파골세포 분화인자 리간드 저해제), 갈릭시맵 (CD80 길항제), 오파투무맵 (ofatumumab) (CD20 저해제), 자놀리무맵(CD4 길항제), SGN40 (CD40 리간드 리셉터 조절제), 리툭시맵 (CD20 저해제) 또는 마파투무맵(mapatumumab) (TRAIL-1 리셉터 작용제)이다.
본 발명의 Dll4 결합 분자와 조합하여 사용될 수 있는 다른 화학요법제는 호르몬, 호르몬 유사체 및 항호르몬제(예: 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 풀베스트란트, 메제스트롤 아세테이트, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 사이프로테론 아세테이트, 피나스테라이드, 부세렐린 아세테이트, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 메드록시프로제스테론, 옥트레오타이드, 아르족시펜, 파시레오타이드, 바프레오타이드), 아로마타제 저해제(예: 아나스트로졸, 레트로졸, 리아로졸, 엑세메스탄, 아타메스탄, 포메스탄), LHRH 작용제 및 길항제(예: 고세렐린 아세테이트, 로이프롤라이드, 아바렐릭스, 세트로렐릭스, 데슬로렐린, 히스트렐린, 트리프토렐린), 항대사물질(예: 항엽산제, 예를 들면 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 피리미딘 유사체, 예를 들면 5 플루오로유라실, 카페시타빈, 데시타빈, 넬라라빈 및 젬시타빈, 퓨린 및 아데노신 유사체, 예를 들면 머캅토퓨린 티오구아닌, 클라드리빈 및 펜토스타틴, 사이타라빈, 플루다라빈); 항종양 항생제(예: 안트라사이클린, 예를 들면 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 이다루비신, 미토마이신-C, 블레오마이신 닥티노마이신, 플리카마이신, 미토잔트론, 픽산트론, 스트렙토조신); 백금 유도체(예: 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 로바플라틴, 사트라플라틴); 알킬화제(예: 에스트라무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 다카바진, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 하이드록시우레아, 테모졸로마이드, 니트로소우레아, 예를 들면 카무스틴 및 로무스틴, 티오테파); 항유사분열제(예: 빈카 알칼로이드, 예를 들면 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, 빈플루닌 및 빈크리스틴; 및 탁산, 예를 들면 파클리탁셀, 도세탁셀 및 이의 제형, 라로탁셀; 시모탁셀 및 에포틸론, 예를 들면 익사베필론, 파투필론, ZK-EPO); 토포이소머라제 저해제(예: 에피포도필로톡신, 예를 들면 에토포사이드 및 에토포포스, 테니포사이드, 암사크린, 토포테칸, 이리노테칸) 및 다수의 화학요법제, 예를 들면 아미포스틴, 아나그렐리드, 인터페론 알파, 프로카바진, 미토탄 및 포르피머, 벡사로텐, 셀레콕시브 중에서 선택되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 Dll4 결합 분자 또는 이를 함유하는 폴리펩티드, 이들을 포함하는 조성물의 효능은 적합한 시험관내 에세이, 세포 기반 에세이, 생체내 에세이 및/또는 공지된 동물 모델 또는 이들의 조합을 사용하여 관심있는 특정 질환 또는 장애에 따라 시험할 수 있다. 적합한 에세이와 동물 모델은 당업자들에게 자명하며, 예를 들면 여기에 기술되고 이하의 실시예에서 사용된 에세이, 예를 들면 증식 에세이가 있다.
예를 들면, 친화도 성숙 VHH가 완전하게 hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 것을 나타내는 도 10의 ELISA 데이터; hDLL4/hNotch1-Fc 경쟁 ELISA에서의 친화도 성숙 VHH에 대한 IC50 (nM)값; 및 재조합 사람 DLL4 및 마우스 DLL4에 대한 정제된 친화도 성숙 VHH의 친화도 KD (nM)에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실험에서 얻어진 데이터로부터 본 발명의 Dll4 결합 분자가 종래기술의 Dll4 결합 분자의 특성보다 우월한 특성을 가지는 것을 확인하였다. 이것은 본 발명의 Dll4 결합 분자가 암과 같은 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 및 장애에서 치료효능을 가지는 유망한 후보물질임을 나타낸다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면,
a) 샘플을 앞서 정의된 바와 같은 본 발명의 Dll4 결합 분자와 접촉하고,
b) Dll4 결합 분자와 샘플의 결합을 검출하고,
c) (b) 단계에서 검출된 결합을 표준물과 비교하고, 샘플과 관련한 결합의 차이가 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 또는 장애의 진단으로 하는, 질환의 진단방법을 제공한다.
이러한 용도와 다른 용도에 있어서, 본 발명의 Dll4 결합 분자를, 예를 들면 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합쌍 같은 특이적 결합쌍의 일부인 작용그룹을 삽입하는 등으로 추가 변성하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 작용그룹을 사용하여 본 발명의 Dll4 결합 분자를 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 결합쌍의 다른 절반에 결합된 화학적 화합물에, 즉 결합쌍의 형성에 의해 연결할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 Dll4 결합 분자는 비오틴에 컨쥬게이트되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 다른 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 이러한 컨쥬게이트된 Dll4 결합 분자는 검출가능한 시그널 생성제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트되는 진단 시스템 등에서 리포터로 사용할 수 있다.
재료 및 방법
a) 사람, 마우스 및 게먹이원숭이 Dll4를 과발현하는 CHO 및 HEK293 세포주의 생산
사람(서열번호: 417; NM_019074.2)과 마우스 Dll4 (NM_019454.3)를 코딩하는 cDNA를 Human Adult Normal Tissue Heart cDNA 라이브러리(BioChain, Hayward, CA, USA)와 Mouse Heart Tissue cDNA 라이브러리(C57/Bl6 균주로부터 단리) 각각으로부터 상응하는 서열 (표 1 참조; 서열번호:421 내지 426)의 5' 및 3' UTR에서 설계된 올리고뉴클레티드를 사용하여 증폭하였다. 앰플리콘을 포유동물 발현벡터 pCDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클론하였다.
Figure pct00001
게먹이 원숭이 Dll4 cDNA를 Cynomolgus Normal Tissue Heart cDNA 라이브러리(BioChain, Hayward, CA, USA)로부터, 근접 관련종 벵골원숭이의 Dll4 코딩 서열(Macaca mulatta Dll4, 서열번호: 418; XM_001099250.1)(표 1 참조)의 5' 및 3' UTR에서 설계된 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 최종 앰플리콘을 포유동물 발현벡터 pCDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클론하였다. 게먹이원숭이 Dll4의 아미노산 서열은 벵골원숭이에 100%, 사람에 대하여 99% 일치하는 것으로 나타났다(도 1 참조: 사람 서열과의 차이는 굵은 밑줄로 표시하였다).
사람 Dll4, 마우스 Dll4 또는 게먹이원숭이 Dll4를 과발현하는 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포를 구축하기 위하여 모(母) CHO 세포를 pCDNA3.1(+)-neo-hDll4, pcDNA3.1(+)-neo-mDll4 또는 pcDNA3.1(+)-neo-cDll4 각각으로 전기천공하였다. 사람 Dll4 및 마우스 Dll4를 과발현하는 사람 배아 신장(HEK293) 세포를 pCDNA3.1(+)-neo-hDll4 또는 mDll4 플라스미드 각각의 Fugene (Roche)으로 HEK293 모세포주에서 지질 매개성 형질감염으로 생성하였다. 모든 조건에서, 형질감염체를 1 mg/mL 게네티신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 선별하였다.
b) 모노클로날 항Dll4 IgG 및 Fab 절편의 생산
미국 공개특허 제2008/0014196호(Genentech)에서는 수많은 이종그래프트 모델에서의 종양 성장에 대한 VEGF mAb 및 Dll4 mAb의 추가 효과를 입증하기 위해 Ridgway 등(2006)이 사용한 사람/마우스 교차반응성 Dll4 mAb를 기술하였다. 이러한 항Dll4 mAb와 그의 상응하는 Fab를 정제하여 생화학적/세포적 에세이와 이종그래프트 모델에서, 그리고 파지 선택 동안의 특이적 용출에서 이 항체(절편)의 특성을 평가하였다. Dll4 mAb의 공개된 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 hIgG2aκ 프레임워크에 클론하고, HEK293 세포에서 일시적으로 발현하여 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 상징액으로부터 정제하였다. 정제된 Dll4 mAb는 ELISA와 FACS (CHO-mDll4 및 CHO-hDll4 세포 사용)에서 사람 Dll4와 마우스 Dll4에 대한 결합, Biacore에서의 양 성장인자 상동성 유전자(orthologue)에 대한 서브-나노몰(sub-nanomolar) 친화도를 나타내었다.
상응하는 Dll4 Fab 절편을 E. coli에서의 발현을 위한 역번역(back-translation)과 코돈 최적화에 기초한 유전자 어셈블리에 의해 Leto's Gene 최적화 소프트웨어(www.entechelon.com)를 사용하여 제조하였다. 가변 경쇄 (VL), 가변 중쇄 (VH), 정상(constant) 경쇄 (CL) 및 중쇄의 정상 도메인 1 (CH1)의 어셈블리에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하여 어셈블리 PCR를 수행하였다. VL+CL 및 VH+CH1을 코딩하는 cDNA 세그먼트를, LacZ 프로모터, 카나마이신에 대한 저항성 유전자, 복수 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열을 함유하는 pUC119 유도 벡터에 SfiI 및 AscI 제한부위와 KpnI 및 NotI 제한부위 각각을 사용하여 클론하였다. Fab 코딩 서열을 가지는 프레임에서, 발현벡터는 C-터미널 HA 및 His6-태그(tag)를 코딩한다. Fab 절편은 E. coli에서 His6-태그된 단백질로서 발현된 후, 배양배지에서 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)와 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제된다. 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 관련 아미노산 서열이 기술되었으며(각각 미국 공개특허 제2008/0014196호의 서열번호: 1 및 서열번호: 2);온전한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호: 419와 420에 각각 나타내었다.
c) 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 Dll4 돌연변이체의 생산
항Dll4 VHH에 의해 인식된 에피토프를 포함하는 Dll4의 세포외 도메인(ECD) 내 영역을 동정하기 위해 Dll4 ECD의 프로그레시브 결실 돌연변이를 생성하였다. 폴리His-태그에 융합된 Dll4 ECD의 결실 절편의 중첩 시리즈를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 CMV 프로모터 상부를 포함하는 포유동물 발현벡터 pSecTag2/Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조하였다(도 2 참조: 아미노산 도메인 영역은 상첨자로 표시). 재조합 단백질을 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 Freestyle 293 Expression System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 발현하고 조절된 배지를 모아서 IMAC로 정제하였다. EGF2 유사 도메인이 없는 Dll4 돌연변이체만이 상기한 인간화된 사람/마우스 교차반응성 항Dll4 mAb(캡쳐링 항사람 IgG 코팅된 Biacore 센서칩에 의해 고정화)에 대해 손상된 결합을 나타내었다. 이 IgG는 Dll4 도메인에서 특이적 결합 에피토프를 가지는 것으로 알려져 있다(Genentech의 미국 공개특허 제2008/0014196A1호).
d) Dll4 리포터 에세이 플라스미드의 생산
리포터 에세이는 Notch1의 γ-세크리타제 매개 분해와 Dll4로의 자극시 Notch1의 세포내 도메인 (NICD)의 핵 전좌(translocation)에 기초하여 기본적으로 기술(Struhl and Adachi, Cell. 1998 May 15;93(4):649-60)된 바와 같이 개발되었다. Gal4/VP16 코딩 서열을 NCID 코딩 서열에 도입하였다. Herpes 단순 바이러스성 전사 활성제 도메인 VP16에 융합된 효모 GAL4의 DNA 결합 절편으로 구성되는 강력한 하이브리드 전사 활성제 GAL4-VP16를 Notch1의 막관통영역에 대한 카복시 터미널에 도입하였다. γ-세크리타제에 의한 이 구조물의 분해로 Gal4/VP16 NICD 융합 단백질이 방출되고, 이 단백질은 이것이 결합하고 동시 형질감염된 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 전사적으로 활성화하는 핵에 전좌하며, 강력한 GAL4-UAS 프로모터 서열을 포함한다(Struhl, G. and Adachi, A., Cell, vol. 93, 649-660, 1998). 사람 Notch1-Gal4/VP16 발현 카세트를 pcDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클론하였다. pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro] 벡터(Promega, Madison, WI, USA)를 루시퍼라제 리포터 플라스미드로 사용하였다.
실시예 1
라마에서 체액성 면역반응을 유도하는 상이한 종의 Dll4 로의 면역화
1.1 면역화
Ethical Committee of the faculty of Veterinary Medicine (University Ghent, Belgium)의 승인 후에 4마리의 라마(지정번호 208, 209, 230, 231)를 재조합 사람 Dll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)의 6회 근육내 주사(주 단위로 100 또는 50 μg/투여)로 면역시켰다. Dll4 항원을 Stimune (Cedi Diagnostics BV, Lelystad, The Netherlands)에 제제화하였다. 3마리의 다른 라마(지정번호 127b, 260, 261)를 위에 기술된 바와 같이 구축된, 변성 사람 Dll4 및 마우스 Dll4를 과발현하는 CHO 세포의 4회 피하 주사로 표준방법에 따라 면역시켰다. 세포를 D-PBS에 재현탁시키고 주사 전에 빙냉하였다. 또한, 3마리의 다른 라마(지정번호 282, 283, 284)를 표준방법에 따라 변성 재조합 사람 Dll4 및 마우스 Dll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)의 4회 근육내 주사(2주 단위로 100 또는 50 μg/투여)로 면역시켰다. 0일째, 사람 Dll4의 최초 주사는 Complete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, USA)에서 제제화하였고, 사람 및 마우스 Dll4로의 후속 주사는 Incomplete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, USA)에서 제제화하였다.
1.2 라마에서의 유도된 면역반응의 평가
사람 Dll4에 대한 동물에서의 면역반응 유도를 ELISA로 평가하기 위해, 0일(면역전), 21일 및 43일(말초혈액 림프구[PBL] 수집 시간)째에 라마 208, 209, 230 및 231에서, 0일 및 51일째에 라마 127b, 260 및 261에서, 및 0일, 28일, 50일째에 라마 282, 283 및 284에서 혈청을 수집하였다. 요컨대, 2 μg/mL의 재조합 사람 Dll4 또는 마우스 Dll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 4 ℃에서 밤새 96 웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 고정시켰다. 웰을 카제인 용액(1%)으로 블로킹하였다. 혈청 희석액을 첨가한 후, 특이적으로 결합된 면역글로불린을 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)로 컨쥬게이트된 염소 항라마 면역글로불린(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)과 TMB 기질(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘) (Pierce, Rockford, IL, USA) 존재 하의 후속 효소반응을 사용하여 검출하였으며, Dll4에 대한 유의한 항체 의존성 면역반응이 유도된 것으로 나타났다. 특이적으로 결합된 면역글로불린은 일반적인 라마 IgG1 항체 또는 중쇄만의 라마 IgG2 또는 IgG3 항체(표 2-A)를 특이적으로 인식하는 항체로 검출될 수 있기 때문에 항체 반응은 일반적 항체 및 B-세포 레퍼토리를 발현하는 중쇄만의 항체에 의해 시작된다. 마우스 Dll4가 주사된 모든 라마에서 항체 반응은 일반적인 항체와 마우스 Dll4에 대해 특이적으로 B-세포를 발현하는 중쇄만의 항체로 시작된다. 또한, 세포 면역된 동물의 혈청 역가는 사람 및 마우스 Dll4를 과발현하는 HEK293 세포에서의 FACS 분석으로 확인된다(표 2-B). 각 라마에 대한 Dll4 혈청 역가반응을 표 2에 나타내었다.
Figure pct00002

Figure pct00003

실시예 2
중쇄만의 항체 절편 레퍼토리의 클로닝 및 파지 제조
최종 면역원 주사 후에, 중쇄 항체를 생산하는 B-세포의 공급원인 면역조직을 면역된 라마에서 수집하였다. 전형적으로, 최종 항원 주사 후 4일과 8일째에 수집된 2개의 150 ml 혈액샘플, 및 최종 항원 주사 후 4일째에 수집된 하나의 림프절 생검을 각 동물에서 수집하였다. 혈액샘플에서 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 Ficoll-Hypaque를 사용하여 제조업자(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)의 지시에 따라 제조하였다. PBMC와 림프절 생검으로부터, 전체 RNA를 추출하고, RT-PCR의 출발물질로 사용하여 VHH를 코딩하는 DNA 세그먼트를 WO 05/044858에 기술된 바와 같이 증폭하였다. 각각의 면역된 라마에 대하여 수집된 이 동물의 모든 면역 조직으로부터 단리된 전체 RNA를 모아서 라이브러리를 구성하였다. 요컨대, PCR로 증폭된 VHH 레퍼토리를 특이적 제한부위에 의해 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진하기 위해 설계된 벡터에 클론하였다. 이 벡터는 pUC119에서 유도되었으며 LacZ 프로모터, M13 파지 gIII 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카베니실린에 대한 저항성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열(pAX050)을 포함한다. VHH 코딩 서열을 가지는 프레임에서 벡터는 C-터미널 c-myc 태그와 His6 태그를 코딩한다. 파지는 표준방법에 따라 제조되고 추후 사용을 위해 4 ℃에서 멸균여과한 후 보관하였다.
실시예 3
파지 디스플레이에 의한 Dll4 특이적 VHH 의 선별
모든 라마에서 얻어진, 파지 라이브러리로서 클론된 VHH 레퍼토리를 상이한 선택 전략에 사용하였으며, 다양한 선택 조건을 적용하였다. 변수들은 다음과 같다: i) Dll4 단백질 포맷(사람 Dll4(Met1-Pro524) 및 마우스 Dll4 (Met1-Pro525) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)의 C-터미널로 His-태그된 재조합 발현 세포외 도메인), 또는 Dll4를 과발현하는 CHO 또는 HEK293 세포에 존재하는 전장 사람 Dll4 및 마우스 Dll4, ii) 항원 제시방법(Dll4로 직접 코팅된 플레이트 또는 비오틴-태그에 의해 Dll4로 코팅된 Neutravidin 플레이트; 용액상; Neutravidin 코팅된 플레이트에서 캡쳐링하기 전의 용액내 인큐베이션), iii) 항원 농도, 및 iv) 상이한 용출 방법(트립신에 의한 비특이성 또는 동족 리셉터 Notch1/Fc 키메라 또는 항Dll4 IgG/Fab에 의한 특이성). 모든 선별은 Maxisorp 96 웰 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 수행하였다.
다음과 같이 선별하였다: 고체상 및 용액상 선택 포맷에 대한 Dll4 항원 조제물을 상기한 바와 같이 다양한 농도로 제공하였다. 파지 라이브러리와 2시간 인큐베이션하고 충분히 세척한 후, 결합된 파지를 트립신(1 mg/mL)으로 30분 동안 용출하였다. 트립신을 파지 용출에 사용하는 경우, 프로테아제 활성을 0.8 mM 프로테아제 저해제 ABSF를 사용하여 즉시 중화하였다. 대조용으로, 선별 w/o 항원을 동시에 수행하였다. 기본값(비항원 대조용)에 대하여 농축을 나타내는 파지 결과물을 사용하여 E. coli를 감염시켰다. 감염된 E. coli 세포를 다음 선별단계(파지 복구)에서 파지를 제조하기 위해 사용하거나, 개별 VHH 클론의 분석을 위한 아가 플레이트(LB+amp+글루코스2 %)에 도포하였다. 특이적 바인더에 대한 선별 결과물을 스크린하기 위해 단일 클론을 아가 플레이트에서 추출하여 1 mL 96-딥웰 플레이트에서 배양하였다. LacZ-조절된 VHH 발현을 글루코스 부재 하에서 IPTG (최종 0.1-1mM)를 첨가하여 유발하였다. 주변세포질 추출물(~80 μL 부피)을 표준방법에 따라 제조하였다.
실시예 4
Dll4 - Notch1 AlphaScreen 및 FMAT 경쟁 에세이에서 주변세포질 추출물의 스크리닝
주변세포질 추출물을 사람 Dll4/사람 Notch1 AlphaScreen 에세이에서 스크린하여 발현된 VHH의 블로킹 능력을 평가하였다. 사람 Dll4를 비오틴(Sigma, St Louis, MO, USA)과 비오틴아미도헥사노익산 3-설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 소듐염(Sigma, St Louis, MO, USA)을 사용하여 비오틴화하였다. Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 수용체 비즈(beads)에 결합된 항Fc VHH를 사용하여 제조업체(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)의 지시에 따라 캡쳐하였다. VHH의 중화능력을 평가하기 위하여 주변세포질 추출물의 연속 희석물을 비오틴화된 사람 Dll4와 사전 인큐베이션하였다. 이 혼합물에 수용체 비즈와 스트렙타비딘 도너 비즈를 첨가하고 추가로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. Envision Multilabel Plate 판독기 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)에서 680 nm의 여기 파장과 520 nm의 방출 파장을 사용하여 플레이트들을 판독하여 형광을 측정하였다. 형광 시그널의 감소는 사람 Notch1/Fc 리셉터에 대한 비오틴화된 사람 Dll4의 결합이 주변세포질 추출물에서 발현된 VHH에 의해 블로킹된 것을 나타낸다.
선택적으로, CHO-hDll4와 CHO-mDll4 세포를 사람 Notch1/Fc FMAT (Fluoro-metric Microvolume Assay Technology) 경쟁 에세이에서 사용하였다. 재조합 사람 Notch1/Fc 키메라 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 무작위로 Alexa-647 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 표지하였다. 요약하면, 5 μL의 주변세포질 물질을 7,500 CHO-hDll4 또는 CHO-mDll4 과발현 세포 각각과 100 pM 또는 175 pM의 표지된 사람 Notch1/Fc에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션한 후 판독하였다. 비경쟁 기준선을 결정하기 위해서, 사람 Notch1/Fc~Alexa647를 가지는 세포의 적어도 30 복제를 포함하여 기준선으로부터 억제율을 계산하였다. 모든 계산은 웰 당 형광의 평균과 웰 당 카운트 수의 곱을 포함하는 FL1_전체 시그널에 기초하였다.
이 스크리닝으로부터 억제 VHH를 선별하고 서열화하였다. 서열분석에서는 40개의 상이한 B-세포 계통에 속하는 167개의 고유 VHH가 나타났다. 각각의 B-세포 계통에서 발견된 변이체의 전체 수를 표 3에 기재하였다. 주변세포질의 스크리닝 데이터 개요를 표 4에 나타내었다. 얻어진 모든 고유 VHH의 아미노산 서열을 서열목록(서열번호:167 - 332 및 459)과 표 5(CDR 및 프레임워크 영역 표시)에 나타내었다.
Figure pct00004

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Figure pct00026

Figure pct00027

실시예 5
정제된 VHH 의 특성화
실시예 4에 기술된 스크리닝에서 선별된 저해성 항Dll4 VHH를 추가로 정제하여 특성화하였다. 선별된 VHH를 E. coli TG1에서 c-myc, His6-태그된 단백질로서 발현하였다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 37 ℃에서 4시간 동안 계속하였다. 세포 배양물을 스피닝한 후, 주변세포질 추출물을 펠릿을 동결융해하여 제조하였다. 이 추출물을 출발물질로 사용하여 VHH를 IMAC와 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 정제하여 SDS-PAGE 순도 95%로 생성하였다.
5.1 ELISA에서 Dll4를 블로킹하는 VHH의 평가
VHH의 블로킹 능력을 사람 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 블로킹 ELISA에서 평가하였다. 요약하면, 1μg/mL의 사람 Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany) 내에 코팅하였다. 고정 농도의 15 nM 비오틴화 사람 Dll4를 VHH의 연속 희석물과 1시간 동안 사전 인큐베이션한 후, 혼합물을 코팅된 Notch1 리셉터에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비오틴화 사람 Dll4의 남아있는 결합을 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이트된 엑스트라비딘(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 검출하였다(도 3). 사람 Dll4를 상기한 바와 같이 비오틴화하였다. 사람 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 6에 기재하였다.
Figure pct00028

5.2. AlphaScreen에서 Dll4를 블로킹하는 VHH의 평가
요약하면, 1 nM 비오틴화 사람 Dll4를 스트렙타비딘 코팅된 도너 비즈(20 μg/mL)에 캡쳐하고, 0.4 nM의 리셉터 사람 Notch1 (Fc 융합 단백질)은 항사람 Fc VHH 코팅된 수용체 비즈(20 μg/mL)에 캡쳐하였다. 양 비즈를 경쟁 VHH의 희석 범위와 함께 인큐베이션하였다(도 4). 사람 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 7에 기재하였다.
Figure pct00029

5.3 항Dll4 VHH에 의한 CHO 세포 상에서 발현된 사람 또는 마우스 Dll4와 사람 Notch1/Fc 결합의 저해
VHH의 블로킹 능력을 실시예 4에 요약된 바와 같이 사람 및 마우스 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 경쟁 FMAT 에세이에서 평가하였다(도 5). CHO 세포에서 발현된 사람 또는 마우스 Dll4에 대한 사람 Notch1/Fc의 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 8에 기재하였다.
Figure pct00030

5.4 리포터 에세이에서 Dll4를 블로킹하는 VHH의 평가
선별된 VHH의 능력을 평가하기 위해, Notch1의 γ-세크리타제 매개 분해와 Dll4로의 자극시 Notch1의 세포내 도메인(NICD)의 분비에 기초한 리포터 에세이를 수행하였다. Notch1-GAL4/VP16 구조물을 HEK 세포에서 pGL4.31[Luc2P/Gal4 UAS/Hygro] 리포터 플라스미드로 동시형질감염하여 융합 단백질을 일시적으로 발현하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 24시간 동안 안정한 HEK293-hDll4 세포주와 동시배양하여 자극하였다. 형질감염 48시간 후에 판독하였다. 동시배양을 시작하기 1시간 전에 VHH를 HEK293-hDll4 세포와 사전 인큐베이션하고 동시배양하는 동안 포함시켰다(도 6). Notch1의 Dll4 매개 분해와 그의 NICD의 리셉터 세포 핵으로의 차후 전좌를 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 9에 기재하였다.
Figure pct00031

5.5 에피토프 비닝(binning)
VHH가, 예를 들면 벤치마크 항체가 결합될 때 Dll4에 동시에 결합할 수 있는지를 측정하기 위해 에피토프 비닝 실험을 수행하였다(Biacore T100 instrument에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 사용). 항Dll4 Fab 절편을 레퍼런스와 CM5 센서 칩의 활성 유동세포에 비가역적으로 고정시켰다. 각 샘플(사이클)에 대하여 사람 Dll4를 활성 유동세포와 레퍼런스 유동세포에 주입하고 항Dll4 Fab로 가역적으로 캡쳐하였다. VHH의 추가 결합은 고정 표면 상의 주입에 의해 평가되었다. 모든 VHH와 항-Dll4 Fab를 100 nM로 주사하였으며, 표면접촉시간은 120초이고 유속은 10 μL/분으로 하였다. 표면을 10 mM 글리신(pH 1.5)을 사용하여 재생하였다. 진행된 곡선을 Biacore T100 Evaluation 소프트웨어로 평가하였다. 표 10-A는 분석된 VHH와 대조군의 순차적 주사/재생 경로를 나타낸다. VHH DLLBII56A09 (서열번호: 300), DLLBII96C03 (서열번호: 326), DLLBII101G08 (서열번호: 197) 및 DLLBII115A05 (서열번호: 224)는 Dll4 Fab에 의해 캡쳐된 사람 Dll4에 추가적으로 결합하지 않는 것으로 나타났다. Dll4 Fab의 주사 또한 사람 Dll4를 추가적으로 결합하지 못하여 모든 에피토프가 포화되었음을 시사하였다. 그러므로, 이러한 VHH가 사람 Dll4를 결합하는데 있어서 Dll4 Fab와 오버랩핑하는 에피토프를 인식하는 것으로 결론지을 수 있다. 사람만의 VHHs DLLBII6B11 (서열번호: 174) 및 DLLBII104G01 (서열번호: 215)은 Dll4 Fab로 캡쳐된 사람 Dll4 상에서의 추가 결합을 나타내어, 사람 Dll4에 특이적인 VHH가 사람/마우스 교차반응 VHH와 상이한 에피토프를 인식하는 것을 시사하였다.
Figure pct00032

5.6 Dll4 결실 돌연변이체를 사용한 에피토프 맵핑(mapping)
Dll4 돌연변이체에 대한 VHH의 결합을 Biacore에서 평가하였다. 요약하면, VHH DLLBII101G08(서열번호:197) 및 DLLBII115A5(서열번호: 224)를 CM4 Sensorchip 상에 코팅하고 200 nM의 각 결실 돌연변이체를 칩을 통하여 주사하였다. 결합을 정성적으로 평가하였다. DLLBII56A09 (서열번호: 300), DLLBII101G08 (서열번호: 197) 및 DLLBII115A05 (서열번호: 224)의 결합은 사람 및 마우스 Dll4 돌연변이체 hDll4.1 및 mDll4.8, 각각에 대하여 관찰되지 않았으며, EGF-유사 2 도메인이 결손되었다(Table 10-B). hDll4/Dll4 IgG 경쟁 ELISA를 사용한 간접 증거가 이미 이러한 관찰을 시사하였다. 요약하면, 1 μg/mL의 Dll4 IgG를 96 웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 고정 농도의 6 nM 비오틴화 사람 Dll4를 VHH의 연속 희석물과 1시간 동안 사전 인큐베이션한 후, 혼합물을 코팅된 IgG에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비오틴화 사람 Dll4의 남아있는 결합을 호오스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 엑스트라비딘(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 검출하였다(데이터는 기재하지 않음). 사람 Dll4를 상기한 바와 같이 비오틴화하였다. 모노클로날 항Dll4 IgG(Genentech, 미국 공개특허 제2008/00 14196A1호)가 Dll4의 EGF-유사 2 도메인 내의 에피토프와 결합하는 것은 특허 문헌으로부터 알려져 있다.
Figure pct00033

5.7 hDll4 - VHH 상호작용의 친화도 측정
Dll4 - VHH 상호작용의 친화도를 결정하기 위한 운동역학적 분석을 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 Biacore T100 장치에서 수행하였다. 재조합 사람 Dll4를 CM5 칩 상에 아민 커플링(EDC 및 NHS 사용)에 의해 고정화하거나 비오틴화된 사람 Dll4를 SA칩(스트렙타비딘 표면) 상에 캡쳐하였다. 정제된 VHH 또는 Fab 절편을 2분 동안 상이한 농도(10 내지 300 nM)로 주사하고 20분 동안 45 μl/분의 유속으로 해리시켰다. 샘플 주입 사이에 표면을 10 mM 글리신 pH 1.5 및 100 mM HCl로 재생하였다. HBS-N (Hepes 완충액 pH 7.4)을 러닝(running) 완충액으로 사용하였다. 가능하면, 데이터를 결합 곡선에 대하여 1:1 상호작용 모델(Langmuir 결합)을 근사하여 평가하였다. 친화도 상수 KD를 얻어진 결합 및 해리 속도상수 (ka)와 (kd)로부터 계산하였다. 항Dll4 VHH의 친화도를 표 11에 기재하였다.
Figure pct00034
5.8 상동성유전자(orthologues) (mDll4, cDll4) 및 구성원(hJagged-1,hDLL1)에 대한 결합
마우스 Dll4에 대한 교차 반응성을 측정하기 위하여 결합 ELISA를 수행하였다. 요약하면, 재조합 마우스 Dll4 (R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)를 밤새 4 ℃에서 1 μg/mL로 96웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany) 내에 코팅하였다. 웰들을 카제인 용액(PBS 중의 1% 용액)으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석물로서 적용하고 결합을 마우스 항myc (Roche) 및 항마우스-AP 컨쥬게이트 (Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 검출하였다(도 7). 레퍼런스로 사람 Dll4와의 결합을 측정하였다. 표 12에 EC50값을 요약하였다.
Figure pct00035
VHH의 게먹이원숭이 교차 반응성을 측정하기 위하여 FACS 결합 실험을 수행하였다. 게먹이원숭이 Dll4를 발현하는 HEK293 세포(일시적 또는 안정한 형질감염)를 VHH의 적정 결합 실험에 사용하였다. 빙냉 하에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 모든 샘플을 세척하고 항-c-myc~Alexa647 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 적용하여 검출하였다. 사람과 마우스 Dll4를 과발현하는 HEK293 세포를 레퍼런스로 하였다. 평균 MCF값을 FACS 어레이에서 측정하고 EC50값의 계산에 사용하였다(도 9 참조).
상동성 리간드 사람 DLL1 및 사람 Jagged-1에 대한 결합의 부재를 고체상 결합 에세이(ELISA)에 의해 평가하였다. 요약하면, 사람 DLL1 (Alexis, San Diego, CA, USA) 및 사람 Jagged-1(Alexis, San Diego, CA, USA)을 밤새 4 ℃에서 1 μg/ mL로 96웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany) 내에 코팅하였다. 웰들을 카제인 용액(PBS 중의 1% 용액)으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석물로서 적용하고 결합을 마우스 항myc (Roche) 및 항마우스-AP 컨쥬게이트 (Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 검출하였다. 모든 항Dll4 VHH는 이러한 상동성 리간드에 대하여 비교차반응성인 것으로 간주되었다(도 8).
5.9 Dll4 매개 HUVEC 증식의 블로킹에서 VHH의 평가
선별된 VHH의 능력을 문헌[Ridgway et al ., Nature. 2006 Dec 21;444 (7122):1083-7)]에 기술된 증식 에세이의 변형된 형태로 평가하였다. 요약하면, 96 웰 조직 배양 플레이트를 코팅 완충액(PBS, 0.1% BSA) 중의 정제된 Dll4-His (RnD Systems; C-터미널 His-태그된 사람 Dll4, 아미노산 27-524, 0.75ml/well, 10 ng/ml)으로 코팅하였다. 웰을 PBS로 세척하고 4000 HUVE 세포/웰을 4회 접종하였다. 세포 증식을 [3H]-티미딘 결합에 의해 4일째에 측정하였다. 도 15에 나타낸 결과는 DLL4 VHHs DLLBII101G08, DLLBII104G01, DLLBII115A05, DLLBII56A09 및 DLL4 Fab가 투여량 의존적인 방식으로 HUVEC 증식에 대하여 DLL4에 따른 효과를 저해하는 것을 증명하고 있다. IC50값을 표 13에 요약하였다. 시험된 VHH는 10 μM에서 DLL4에 따른 효과를 완전히 저해하였다.
Figure pct00036

실시예 6
선별된 VHH 의 친화도 성숙
VHH DLLBII101G08 및 DLLBII115A05에 대하여 2 사이클의 친화도 숙성을 수행하였다.
제1 사이클에서, 아미노산 치환을 프레임워크(FW)와 상보성 결정영역(CDR)에 error-prone PCR방법을 사용하여 무작위로 도입하였다. 2 라운드 PCR에 기초한 방법(Genemorph II Random Mutagenesis 키트, Stratagene, La Jolla, CA, USA)에서 1 ng의 DLLBII101G08 또는 DLLBII115A05 cDNA 템플레이트를 사용하여 돌연변이를 수행한 다음, 0.1 ng의 제1 라운드 생성물을 사용하여 제2 error-prone PCR을 수행하였다. 폴리쉬 단계 후에, PCR 생성물을 독특한 제한부위를 통해서 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진하기 위해 설계된 벡터에 도입하였다. 용액중 선별의 다음 라운드를 비오틴화된 재조합 사람 DLL4 (biot-rhDLL4) 및 트립신 용출액의 농도를 감소하면서 사용하여 수행하였다. 또한 차가운 rhDLL4(적어도 100x 과량의 biot-rhDLL4)를 사용하는 제3 라운드의 친화도 유도 선별을 수행하였다. 교차반응성(의 보존)으로서 포괄된 마우스의 DLL4에 대한 어떠한 선별도 스크리닝 레벨에서 평가되지 않았다. 각각의 돌연변이체는 LacZ 프로모터, 암피실린에 대한 저항성 유전자, 복수 클로닝 부위 및 ompA 리더 서열 (pAX50)을 함유하는 pUC119로부터 유도된 발현벡터를 사용하는 재조합 단백질로서 생산되었다. E. coli TG1 세포를 발현벡터 라이브러리로 형질변환하여 아가 플레이트(LB + Amp + 2% 글루코스)에 도말하였다. 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 채취하여 1 mL 96 딥(deep)웰 플레이트에서 배양하였다. IPTG (1mM)을 첨가하여 VHH 발현을 유도하였다. 주변세포질 추출물(~ 80 uL)을 표준방법에 따라 제조하고 ProteOn (BioRad, Hercules, CA, USA) 오프레이트 에세이에서 재조합 사람 마우스 Dll4에 대한 결합을 위해 스크린하였다. 요약하면, GLC ProteOn Sensor 칩을 (레퍼런스 채널인 L1/L3와)"리간드 채널" L2 및 L4에 재조합 사람 Dll4로 코팅하고, "리간드 채널" L3 및 L6를 마우스 Dll4로 코팅하였다. 친화도 성숙 클론의 주변세포질 추출물을 1/10으로 희석하고, "분석물질 채널" A1-A6에 주사하였다. 평균 오프레이트를 플레이트에 존재하는, 오프레이트 향상을 계산하기 위한 레퍼런스로 작용하는 야생형 클론에 대하여 계산하였다.
제2 사이클에서, 조합 라이브러리를 사이클 1에서 확인된 가능한 위치를 동시에 무작위화하여 생성하였다. 이를 위하여 전장의 DLLBII101G8 또는 DLLBII115A05 cDNA를 오버랩 PCR에 의해 무작위화 위치에서 축퇴된 올리고뉴클레오티드(NNS)를 사용하여 합성하고 복구 PCR을 수행하였다. 조합 라이브러리를 생성하는데 사용된 프라이머의 리스트는 표 14 및 서열번호 427 내지 457에서 확인할 수 있다. 무작위화된 VHH 유전자를 파지 디스플레이 벡터(pAX50)에 상기한 바(실시예 2)와 같이 특정한 제한부위를 사용하여 도입하였다. 각각의 VHH 클론의 주변세포질 추출물을 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다.
Figure pct00037
ProteOn 오프레이트 에세이에서 재조합 사람 Dll4에 대한 결합의 스크리닝은 최대 38배(DLLBII101G08) 및 11배(DLLBII115A05) 개선된 오프레이트를 가지는 클론을 동정하였다(표 15).
Figure pct00038
최상위 DLLBII101G08 변위체와 DLLBII115A05 변이체를 C-터미널 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 가지는 프레임에서 발현벡터 pAX100에 클론하였다. 또한 재조합 마우스 Dll4에 대한 오프레이트가 개선되었다. VHH를 E. coli에서 His6 태그된 단백질로서 생산하여 IMAC 및 SEC에 의해 정제하였다. 서열을 표 16-A (LLBII101G08)와 16-B (DLLBII11A05) 각각에 나타내었다.
Figure pct00039
Figure pct00040

Figure pct00041

Figure pct00042

실시예 7
친화도 성숙된 정제 VHH 의 특성화
VHH DLLBII101G08와 DLLBII115A05의 친화도 성숙 변이체를 발현시켜서 상기한 바와 같이 정제하였다(실시예 6). VHH를 rhDLL1/rhJAG1 결합 ELISA 및 hDll4/ mDll4/ cynoDll4 FACS (실시예 5.8; 표 20; 도 12 및 13), rhDll4 - rhNotch1 경쟁 ELISA (실시예 5.1; 표 17; 도 10), 경쟁 rhNotch1 - CHO-hDll4 FMAT (실시예 5.3; 표 18; 도 11)에서 특성화하였다.
특성화 데이터를 표 21에 요약하였다. 전체적으로 친화도 성숙 VHH는 친화도와 효능에서 분명한 개선을 나타낸 반면, mDll4 및 cyno Dll4에 대한 이들의 결합은 유지되고 hDLL1 또는 hJAG1과의 결합은 관찰되지 않았다.
Figure pct00043
Figure pct00044

Figure pct00045

Figure pct00046

Figure pct00047

Figure pct00048
Figure pct00049
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<213> Lama Glama <400> 23 Ser Phe Gln Ser Gly Ala Ala Pro Gly Ala Asn Phe Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 24 Pro Ala Pro Gly Ser Ser Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 25 Pro Ser Pro Gly Ser Ser Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 26 Ser Leu Arg Gly Trp Asp Thr Thr Arg Ile Asp Tyr Glu Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 27 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 28 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 29 Pro Ala Pro Gly Ser Ser Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 30 Pro Ser Pro Gly Ser Ser Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 31 Arg Ala Ala Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 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Glama <400> 58 Asp Arg Tyr Ile Arg Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Trp Gly Ala Tyr Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 59 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 59 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Asp 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 60 Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 61 Pro Phe Asn His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 62 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser Ser Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 63 Pro Phe Ser Tyr Tyr Asn Asn Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 64 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 65 Pro Phe Ala His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 66 Pro Phe Ala Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 67 Pro His Ser Asp Tyr Asp Glu Glu Ala Pro Ser Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 68 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Val Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 69 Ser Leu Gly Ser Ser Trp Cys Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 70 Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 71 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 72 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 73 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Ala Tyr Cys Gly Val Asn Arg Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 74 Ala His Asp Asn Tyr Trp Phe Thr Asp Asp Ser Leu Gly Arg Gly Leu 1 5 10 15 Lys Tyr <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 75 Lys Thr Phe Gly Ser Asn Trp Tyr Asp Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 76 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 77 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 77 Asp Pro Phe His Asn Cys Tyr Ser Gly Ser His Tyr Ser Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 78 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 79 Pro Phe Asn Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 80 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 81 <211> 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112 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 113 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 114 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 114 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 115 Ala Gly Ala Ser Ser Trp Cys Phe Pro Pro Gly Tyr 1 5 10 <210> 116 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 116 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Ile Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 117 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 118 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 118 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Asp 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 119 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 120 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 121 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser Gly Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 122 Ser Leu Gly Ser Ser Trp Cys Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 123 Asp Pro Val His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Asp 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 124 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 125 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 125 Pro Phe Ser His Tyr Asn Asp Leu Cys Gly Val Asn Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 126 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 126 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Asn Gly Tyr Asp Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama 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<213> Lama Glama <400> 135 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 136 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 137 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Tyr Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 138 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 138 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Thr Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 139 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 139 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Tyr Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 140 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 140 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Asp Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 141 Arg Thr Ser Arg Ser Pro Arg Pro 1 5 <210> 142 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 142 Ser Asn Tyr Tyr Ser Val Tyr Asp Asp Arg Pro Val Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 143 <211> 7 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 143 Gly Ser Gly Ser Trp Gly Val 1 5 <210> 144 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 144 Asn Glu Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 145 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 145 Asn Glu Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 146 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 146 Gly Gly Arg Ser Phe Leu Pro Phe Val Pro Ala Tyr 1 5 10 <210> 147 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 147 Asn Glu Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 148 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 148 Asn Gly Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 149 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 150 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 151 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 152 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 152 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro Ile Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 153 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 153 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro Ile Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 154 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 154 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 155 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 155 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 156 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 156 Pro Ala Pro Gly Ser Ser Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 157 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 157 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 158 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 158 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 159 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 159 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro Leu Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 160 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama 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Glama <400> 226 Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser His Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 227 <211> 125 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 227 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr His 20 25 30 Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 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<213> Lama Glama <400> 237 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Pro Ile Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser 100 105 110 Trp Ala Asp Phe Gly Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 238 <211> 123 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 238 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Ser Gly Asp Arg Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser 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Cys Lys Lys 180 185 190 Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu 195 200 205 Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys 210 215 220 Leu Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240 Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile 245 250 255 Pro His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys 260 265 270 Thr Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn 275 280 285 Tyr Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn 290 295 300 Ser Gly Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly 305 310 315 320 Val Asp Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg 325 330 335 Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys 340 345 350 Pro Pro Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln 370 375 380 Gly Ala Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn 385 390 395 400 Cys Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly 405 410 415 Gly Gln Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro 420 425 430 Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg 435 440 445 Asn Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu 450 455 460 Met Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg 465 470 475 480 Thr Ser Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr 485 490 495 Cys Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr 500 505 510 Gly Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser 515 520 525 Phe Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu 530 535 540 Val Leu Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg 545 550 555 560 Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe 565 570 575 Gln Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln 580 585 590 Lys Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly 595 600 605 Lys Gln Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu 610 615 620 Gly Arg Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu 625 630 635 640 Gly Glu Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg 645 650 655 Ile Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys 660 665 670 Leu Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 418 <211> 707 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 418 Met Ala Cys Ala Cys Ala Met Leu Ala Thr Thr Ala Arg His Glu Ser 1 5 10 15 Ser Met Asn Lys Glu Tyr Met Ala Ala Ala Ser Trp Ser Ala Ser Gly 20 25 30 Trp Ala Leu Leu Leu Leu Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly 35 40 45 Ser Gly Val Phe Gln Leu Gln Leu Gln Glu Phe Val Asn Glu Arg Gly 50 55 60 Val Leu Ala Ser Gly Arg Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe 65 70 75 80 Arg Val Cys Leu Lys His Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Val Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala 100 105 110 Val Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro 115 120 125 Phe Asn Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp 130 135 140 His Ala Pro Gly Asp Asp Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala 145 150 155 160 Leu Ile Ser Lys Ile Ala Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn 165 170 175 Trp Leu Leu Asp Glu Gln Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser 180 185 190 Tyr Arg Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg 195 200 205 Leu Cys Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro 210 215 220 Asp Gly Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln 225 230 235 240 Gln Pro Ile Cys Leu Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser 245 250 255 Lys Pro Ala Glu Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys 260 265 270 Asn Glu Cys Ile Pro His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr 275 280 285 Pro Trp Gln Cys Thr Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp 290 295 300 Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala 305 310 315 320 Thr Cys Ser Asn Ser Gly Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro 325 330 335 Gly Tyr Thr Gly Val Asp Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser 340 345 350 Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr 355 360 365 His Cys Leu Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser 370 375 380 Thr Leu Ser Cys Ala Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg 385 390 395 400 Glu Arg Asn Gln Gly Ala Ser Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe 405 410 415 Thr Gly Ser Asn Cys Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro 420 425 430 Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys 435 440 445 Arg Cys Arg Pro Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Arg His Val Ser 450 455 460 Asp Cys Ala Arg Asn Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu 465 470 475 480 Glu Ser Gly Leu Met Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg 485 490 495 Cys Glu Val Arg Thr Ser Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe 500 505 510 Asn Arg Ala Thr Cys Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys 515 520 525 Asn Cys Pro Tyr Gly Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly 530 535 540 Leu Pro Pro Ser Phe Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu 545 550 555 560 Ala Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln 565 570 575 Leu Arg Leu Arg Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn 580 585 590 Leu Ser Asp Phe Gln Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys 595 600 605 Asn Thr Asn Gln Lys Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys 610 615 620 Ser Asn Cys Gly Lys Gln Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala 625 630 635 640 Pro Gly Pro Leu Gly Arg Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser 645 650 655 Asp Lys Ser Leu Gly Glu Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys 660 665 670 Pro Glu Cys Arg Ile Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr 675 680 685 Gln Ser Val Cys Leu Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala 690 695 700 Thr Glu Val 705 <210> 419 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 419 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Pro Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Trp Ile Leu Cys Ala Trp Ala Gln 115 120 125 Leu Cys Pro Thr Pro Arg Ser His Gly Thr Thr Ser Leu Ala Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 210 215 220 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 225 230 235 240 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 420 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 420 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Gly Thr 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Glu Trp Ile 100 105 110 His Leu Gly 115 <210> 421 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 421 gcgaacagag ccagattgag g 21 <210> 422 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 422 ggatgtccag gtaggctcct g 21 <210> 423 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 423 gagcgacatc cctaacaagc 20 <210> 424 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 424 cctcaactct gttcccttgg 20 <210> 425 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 425 gcgaacagag ccagattcag g 21 <210> 426 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 426 ccagacagac acccaaaggt 20 <210> 427 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 427 gaggtgcaat tggtggagtc tgggggtggt ctggttcagg ctggt 45 <210> 428 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 428 tcctgcgcag cttctggtcg taccttctcc agctacgcga tggct 45 <210> 429 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 429 ccaggcaaag aacgcgagtw cgtagccgca atccgttgga gcggt 45 <210> 430 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 430 ctgattccgt tcagggtcgt ttcaccatct ctcgtgacaa cgcg 44 <210> 431 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 431 ctgcagatga actctctgaa accggaagat acggcagtct actac 45 <210> 432 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 432 gacactcgtc tgcgtccgta cctgtacgac yattggggtc agggta 46 <210> 433 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 433 gacactcgtc tggvaccgta cctgtacgac yattggggtc agggta 46 <210> 434 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 434 gacactcgtc tgcgtccgta cgagtacgac yattggggtc agggta 46 <210> 435 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 435 gacactcgtc tggvaccgta cgagtacgac yattggggtc agggta 46 <210> 436 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 436 cagacgagtg tccggcgcac ggtttgcaca gtagtagact gccgt 45 <210> 437 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 437 cagacgagtg tctrccgcac ggtttgcaca gtagtagact gccgt 45 <210> 438 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 438 agagttcatc tgcagataga cggtgttttt cgcgttgtca cgaga 45 <210> 439 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 439 ctgaacggaa tcagsgtaat acgcagttyc accgctccaa cggat 45 <210> 440 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 440 gcgttctttg cctggagcct gacgawacca agccatcgcg tagct 45 <210> 441 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 441 agaagctgcg caggacagac ggagagagcc accagcctga accag 45 <210> 442 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 442 tgaggagacg gtgacctggg tcccctgacc ccaat 35 <210> 443 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 443 gaggtgcaat tggtggagtc tgggggtggt ctggttcagc caggt 45 <210> 444 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 444 tgaggagacg gtgacctggg tcccctgacc cc 32 <210> 445 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 445 gtgcagcttc cggctttacg wtcggctcct acgacatgtc ttggg 45 <210> 446 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 446 acgcacccca gtattcaccc tgacgcgccc aaatgtagcg atctgcagc 49 <210> 447 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 447 aggtccggaa tgggtgtcck ctatcaactc tggtggtggt agcac 45 <210> 448 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 448 tcttccggtt tcaggctgtt catctgcagg tacagcgtgt ttttg 45 <210> 449 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 449 aaaggtcgtt tcaccatctc tcgtgacaac gccaaaaaca cgctg 45 <210> 450 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 450 tgaaacgacc ttttwcgwag tcggygtagw aggtgctacc accac 45 <210> 451 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 451 tgaaaccgga agataccgcg gtatactact gcgctgcaga tcgct 45 <210> 452 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 452 ccattccgga cctttacccg gagaacgacg aacccaagac atgtc 45 <210> 453 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 453 tactggggtg cgtacghata cgactactgg ggtcagggta c 41 <210> 454 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 454 tactggggtg cgtaccagta cgactactgg ggtcagggta c 41 <210> 455 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 455 ccggaagctg cacagctcag acgcagagaa ccacctggct gaacc 45 <210> 456 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 456 acgcacccca gtagtaaccc tgacgcgccc raatgtagcg atctgcagc 49 <210> 457 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 457 acgcacccca gtaktcaccc tgacgcgccc raatgtagcg atctgcagc 49 <210> 458 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 458 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 459 <211> 120 <212> PRT <213> Lama glama <400> 459 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly Ile 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ile Thr Tyr Asp Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (27)

  1. 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정영역, CDR1, CDR2 및 이하에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열의 CDR3 각각을 가지는 적어도 가변 도메인을 포함하는 Dll4 결합 분자:
    a) 서열번호: 1 내지 166 및 458,
    b) 서열번호: 333 내지 353, 또는
    c) 서열번호: 375 내지 395.
  2. 제1항에 있어서, 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 하나 이상의 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역, CDR1, CDR2 및 이하에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열의 CDR3 각각으로 구성되는 Dll4 결합 분자:
    a) 서열번호: 1 내지 166 및 458,
    b) 서열번호: 333 내지 353, 또는
    c) 서열번호: 375 내지 395.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이
    a) 서열번호: 1 내지 166에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR3;
    b) 표 5에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 아미노산 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내의 부분 서열로서 포함된 아미노산 서열을 가지는 CDR1 및 CDR2를 포함하고,
    여기에서 서열번호 1 - 166에 대한 제1 그룹의 서열번호: x는 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하고, y = x + 166인 Dll4 결합 분자.
  4. 제2항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이
    a) 서열번호: 333 내지 353에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR3;
    b) 표 16-A에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 354 내지 374에 나타낸 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내의 부분 서열로서 포함된 아미노산 서열을 가지는 CDR1 및 CDR2를 포함하고,
    여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하고, y = x + 21인 Dll4 결합 분자.
  5. 제2항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이
    a) 서열번호: 375 내지 395에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR3;
    b) 표 16-B에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 396 내지 416에 나타낸 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내의 부분 서열로서 포함된 아미노산 서열을 가지는 CDR1 및 CDR2를 포함하고,
    여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하고, y = x + 21인 Dll4 결합 분자.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH인 Dll4 결합 분자.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 Dll4 결합 분자.
  8. 제6항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 354 내지 374에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 Dll4 결합 분자.
  9. 제6항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 396 내지 416에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 Dll4 결합 분자.
  10. 제3항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  11. 제7항에 정의된 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 VHH.
  12. 서열번호: 356 및 358에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 VHH.
  13. 제12항에서 정의된 VHH의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  14. 서열번호: 402, 407 및 416에 나타낸 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 VHH.
  15. 제14항에서 정의된 VHH의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  16. 제3항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  17. 제10항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  18. 제1항에 있어서, 서열번호: 417의 아미노산 잔기 252-282에 상응하는 EGF-2 도메인 내에 전체 또는 부분적으로 포함된 Dll4의 에피토프에 결합하는 Dll4 결합 분자.
  19. 제18항에 있어서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드인 Dll4 결합 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항의 Dll4 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터.
  21. 제20항의 핵산 분자를 포함하는 숙주세포.
  22. 적어도 하나의 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항의 Dll4 결합 분자를 활성성분으로 포함하는 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 암 및 암성 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 눈 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
  26. a) 서열번호: 1 내지 166 및 458,
    b) 서열번호: 333 내지 353, 또는
    c) 서열번호: 375 내지 395에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 서열을 포함하는 펩티드.
  27. 제26항의 펩티드를 코딩하는 핵산 분자.

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