KR101844875B1

KR101844875B1 - Ｖｅｇｆ-결합 분자

Info

Publication number: KR101844875B1
Application number: KR1020137008330A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 그쉬빈트; 에릭 보르게스; 요아힘 부크네우; 타베르니에 에블린 드; 주스트 콜크만; 파스칼 메르시어스
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2018-04-03
Also published as: IL224800B; CN103209995A; EA029277B1; CL2013000596A1; JP5979504B2; UY33588A; KR20130101045A; US20240141030A1; JP2013541939A; AR082892A1; BR112013005151A2; US20120225081A1; EP2727939A3; MX2013002379A; EA201300311A1; US20220363744A1; CA2808696C; US20160200806A1; US20200308267A1; AU2011298281A1

Abstract

VEGF-결합 분자, 바람직하게 VHH와 같은 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 도메인 항체, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 혈관신생에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 질환의 치료에서 그것의 용도. VEGF-결합 분자를 코딩하는 핵산, 숙주 세포 및 이의 제조 방법.

Description

ＶＥＧＦ-결합 분자 {VEGF-BINDING MOLECULES}

본 발명은 인간의 치료요법, 특히 암 치료요법 및 그러한 치료요법에 유용한 제제 및 조성물의 분야에 관한 것이다.

예를 들면 US2008/0014196 및 WO2008101985에 기술된 바와 같이, 혈관신생은 안질환뿐 아니라 고형 종양 및 전이를 포함하는 수많은 장애의 발병과 관련된다. 가장 중요한 향-혈관신생(pro-angiogenic) 인자 중 하나는 VEGF-A 또는 혈관투과성인자 (VPF)로 불리는 혈관내피성장인자 (VEGF)이다. VEGF는 태반성장인자 (PlGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 및 VEGF-F를 포함하는 유전자 패밀리에 속한다. 인간의 VEGF 단일 유전자 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)은 적어도 6개의 아형 (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 및 VEGF206)을 발생시키고, VEGF165는 가장 풍부한 아형이다.

2개의 VEGF 티로신 키나아제 수용체 (VEGFR)는 VEGF, 즉 VEGFR-1 (FIt-1으로 알려져 있음) 및 VEGFR-2 (KDR 또는 FIK-1으로 알려져 있음)와 상호작용한다는 것이 확인되었다. VEGFR-1은 VEGF에 대해 가장 높은 친화력을 갖는 반면, VEGFR-2는 VEGF에 대해 다소 더 낮은 친화력을 갖는다. Ferrara (Endocrine Rev. 2004, 25: 581-611)는 VEGF에 대한 상세한 설명을 제공하고, 그것의 수용체와의 상호작용 및 정상 및 병리 과정에서의 그것의 작용은 Hoeben et al ., Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-580에서 발견될 수 있다.

VEGF는 정상 및 비정상 혈관신생 둘 다의 중추적 조절자라고 보고되어 왔다 (Ferrara and Davis-Smyth, Endocrine Rev. 1997, 18: 4-25; Ferrara J. MoL Med. 1999, 77: 527-543). 혈관형성의 과정에 기여하는 다른 성장인자와 비교하는 경우, VEGF는 혈관계 내의 내피 세포에 대해 높은 특이성을 갖는 점에 있어서 독특하다.

VEGF mRNA는 대부분 인간의 종양에 의해 과발현된다. 종양 성장의 경우에서, 혈관신생은 과형성(hyperplasia)으로부터 종양형성(neoplasia)으로의 전이 및 정상 세포에 비하여 종양 세포가 성장 이점을 얻도록 하는 종양의 성장 및 전이를 위한 영양분 제공에 매우 중요한 것으로 보인다 (Folkman et al ., 1989, Nature 339 -58). 따라서, 항-혈관신생(anti-angiogenesis) 치료요법은 여러 종류의 종양에 대한 중요한 치료선택이 되어왔다. 이러한 치료요법은 VEGF 경로를 차단하는데 중점을 두어 왔다 (Ferrara et al ., Nat Rev Drug Discov. 2004 May; 3(5): 391-400.

또한, VEGF는 안질환과 관련되어 있다. 안구 유체 내 VEGF의 농도는 당뇨병 및 다른 허혈-관련 망막증 환자의 활성 혈관 증식의 존재와 매우 관련되어 있다. 또한, 최근 연구는 연령-관련 황반 변성 (AMD)에 걸린 환자에게서 맥락막 신생 혈관막 내 VEGF의 국소화를 증명하였다. 또한 VEGF의 상향-조절이 다양한 염증 장애에서 관찰되어 왔다. VEGF는 RA의 발병, 혈관신생이 중대한 역할을 하는 염증 질환과 관련되어 왔다.

VEGF 및 그것의 혈관신생에서 역할의 설명 및 기타 과정은 치료적 개입의 잠재적 새로운 타겟을 제공하여 왔다. VEGF의 기능은 VEGF 수용체 티로신 키나아제의 활성화를 차단 또는 예방하고 (Schlaeppi and Wood, 1999, Cancer Metastasis Rev., 18: 473-481) 그 결과, VEGF 수용체 신호 전달 경로를 간섭하는 작은 분자에 의해 저해되어 왔다. 박테리아 또는 식물 독소를 함유하는 세포독성 컨쥬게이트(conjugate)는 종양 혈관신생에 대한 VEGF 자극 효과를 저해할 수 있다. VEGF-DT385 독소 컨쥬게이트는 (VEGF165에 융합되거나 또는 화학적으로 컨쥬게이트된 디프테리아 독소 도메인), 예를 들면, 인 비보( in vivo ) 종양 성장을 효율적으로 저해한다. 또한 종양 성장 저해는 레트로바이러스에 의한 FIk-1 돌연변이체 또는 용해성 VEGF 수용체 전달에 의해 달성될 수 있다.

A4.6.l 및 MV833와 같은 VEGF-중화 항체는 VEGF가 그것의 수용체에 결합하는 것을 차단하기 위해 개발되어 왔고, 임상 전의 항종양 활성을 나타냈다 (Kim et al ., Nature 1993, 362: 841-844; Folkman Nat. Med. 1995, 1: 27-31; Presta et al ., Cancer Res. 1997, 57: 4593-4599; Kanai et al ., Int. J. Cancer 1998, 77: 933-936; Ferrara and Alitalo Nat. Med. 1999, 5: 1359-1364; 320, 340. 치료적 항-VEGF 접근 시도의 검토에 대해서는 Campochiaro and Hackett (Oncogene 2003, 22: 6537-6548) 참조.

대부분 임상 경험은 베바시주맙(bevacizumab)이라고도 불리는 A4.6.1에 의해 얻어졌다 (Avastin® Genentech, San Francisco, CA).

WO2008101985는 VEGF에 결합하는 카멜리드(camelides) (명세서에서 VHHs 또는 "Nanobodies®"라고 정의됨)의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 과도하고/과도하거나 병적인 혈관신생 또는 신생혈관화가 특징인 상태 및 질환의 치료에 있어서 그것의 용도를 기술한다.

본 발명의 목적은 신규의 개선된 VEGF-결합 분자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 그러한 제제 및 조성물의 사용 및/또는 투여를 수반하는 그러한 질환, 장애 또는 상태의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 현재 사용되고/사용되거나 기술분야 알려진 제제, 조성물 및/또는 방법과 비교하여 이점을 제공하는 그러한 약학적으로 활성인 제제, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이점은 특히, 상기 기술된 것과 같은 종래 항-VEGF 항체 또는 그의 단편과 비교하여 개선된 치료적이고/치료적이거나 약리적인 특질 및/또는 예를 들면, 제조를 목적으로 하는 다른 이로운 특질을 포함한다.

더 특히, 본 발명의 목적은 신규한 VEGF-결합 분자 및 구체적으로, 포유동물의 VEGF 및 특별히 인간의 VEGF에 결합하는 VEGF-결합 분자를 제공하는 것이고, 여기에서 그러한 분자 또는 폴리펩티드는 명세서에 기술된 바와 같이 치료 및 진단 목적에 적합하다. 또한 본 발명의 목적은 VEGF에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하는 것이다.

제1측면에 따르면, VEGF-결합 분자, 바람직하게 VHH와 같은 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 도메인 항체가 제공된다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 VEGF-결합 분자를 코딩(encoding)하는 핵산뿐만 아니라, 그러한 핵산을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명 VEGF-결합 분자 및 임의로 하나 이상의 그러한 조성물의 추가 성분을 함유하거나 또는 포함하는 제품 또는 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 명세서에 기술된 바와 같은 VEGF-결합 분자, 핵산, 숙주 세포, 제품 및 조성물을 제조하거나 또는 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 혈관신생에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료 방법뿐만 아니라, 명세서에 기술된 VEGF-결합 분자, 핵산, 숙주 세포, 제품 및 조성물의 적용 및 용도에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면, 구체예, 이점 및 적용은 하기의 추가적 설명에 의해 명확해질 것이다.

정의

별도의 지시 또는 정의가 없는 한, 사용된 모든 용어는 기술분야에서의 보통의 의미를 갖고, 당업자에게 명확할 것이다. 예를 들면 참고문헌은 명세서에 인용된 일반적인 배경 기술뿐만 아니라 Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), and Roitt et al., "Immunology" (2^nd　Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)와 같은 표준 편람으로 만들어지고; 또한 별도의 지시가 없는 한, 상세하게 구체적으로 기술되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명확할 것이기 때문에, 알려진 그 자체 방식으로 수행될 수 있고 수행되어왔다. 또한 예를 들면, 참고문헌은 상기 및 명세서 내에 추가로 언급되는 참고문헌에 인용된 일반적인 배경 기술에 대한 표준 편람으로 만들어진다.

별도의 지시가 없는 한, 용어 "면역글로불린" 및 "면역글로불린 서열"은 -명세서 내에서 중쇄 항체 또는 종래의 4-쇄(chain) 항체를 언급하는데 사용되는 경우든 아니든- 모든 부분, 도메인 또는 그의 단편뿐만 아니라 완전한 크기의(full-size) 항체, 그의 개별 사슬 둘 다를 포함하기 위한 일반적인 용어로서 사용된다 (각각 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인과 같은 각각의 항체-결합 도메인 또는 단편에 한하지 않고 포함함). 또한, 명세서 (예를 들면, "면역글로불린 서열", "항체 서열", "(단일) 가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어 내)에서 사용되는 것과 같은 용어 "서열"은 내용상 더욱 제한된 해석을 요구하지 않는 한, 일반적으로 관련 아미노산 서열뿐만 아니라 그것을 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

명세서에서 사용된 바와 같은 용어 (폴리펩티드 또는 단백질의) "도메인"은 나머지 단백질과 독립적으로 그것의 3차 구조를 보유하는 능력을 갖는 접힌 단백질 구조를 말한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 개별(discrete) 기능적 특질을 담당하고, 많은 경우에서 잔여 단백질 및/또는 도메인의 기능 손실 없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 전달될 수 있다.

명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "면역글로불린 도메인"은 항체 사슬 (예를 들면, 종래의 4-쇄 항체 또는 중쇄 항체의 사슬과 같은 항체 사슬)의 구형 영역 또는 근본적으로 그러한 구형 영역으로 이루어진 폴리펩티드를 말한다. 면역글로불린 도메인은 임의로 보존적 이황화 결합에 의해 안정화된, 2개의 베타-시트(sheet)에 배열된 약 7개의 역평행 베타-스트랜드(strand)의 2-층 샌드위치(sandwich)로 구성된 항체분자의 면역글로불린 폴드(fold) 특징을 보유하는 것이 특징이다.

명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "면역글로불린 가변 도메인"은 근본적으로 각각 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로서 기술분야 및 하기에 언급되는 4개의 "프레임워크(framework)"로 구성되는 면역글로불린을 의미하고; 프레임워크 영역은 기술분야 및 하기에 각각 "상보성 결정 영역 1"또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"로서 언급되는 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 차단된다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 다음과 같이 나타내어질 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 항체-결합 부위를 나름으로써 항원에 대한 항체에 특이성을 부여하는 것이 면역글로불린 가변 도메인이다.

명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 추가적인 가변 면역글로불린 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명의 의미 내에서 면역글로불린 단일 가변 도메인의 하나의 예는 면역글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL (VH 도메인 및 VL 도메인)과 같은 "도메인 항체"이다. 명세서에 정의된 바와 같이, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 다른 예는 카멜리드(camelid)의 "VHH 도메인" (또는 간단히 "VHH")이다.

상기 정의의 관점에서, 이 경우 항원의 각 에피토프에 결합하는 것은 보통 하나의 (단일) 면역글로불린 도메인에 의해 일어나지 않고, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 쌍 (연합)과 같은 한 쌍의 면역글로불린 도메인, 즉 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하기 때문에, 4-쇄 항체 (예를 들면, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 기술분야에 알려짐) 또는 이황화결합 Fv 또는 scFv 단편과 같은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 또는 종래 4-쇄 항체로부터 유도된 이중체(diabody) (모두 기술분야에 알려짐)와 같은 종래 항원-결합 도메인은 보통 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 여겨지지 않는다.

VHH, V_HH 도메인, VHH 항체 단편 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 원래 "중쇄 항체" (즉, "경쇄가 없는 항체"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers　R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993))의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로 기술되어 왔다. 용어 "VHH 도메인"은 종래 4-쇄 항체 ("V_H 도메인" 또는 "VH 도메인"으로서 명세서에 언급됨)에 존재하는 중쇄 가변 도메인 및 종래 4-쇄 항체 ("V_L 도메인" 또는 "VL 도메인"으로서 명세서에 언급됨)에 존재하는 경쇄 가변 도메인과 구별되는 이러한 가변 도메인을 위해 선택되었다. VHH 도메인은 추가적인 항원 결합 도메인 없이, 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다 (에피토프가 VH 도메인과 함께 VL 도메인에 의해 인식되는 경우인 종래 4-쇄 항체의 VH 또는 VL 도메인과 대조적임). VHH 도메인은 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성된 작고 강하며 효율적인 항원 인식 단위이다.

본 발명의 명세서에서, 용어 VHH 도메인, VHH, V_HH 도메인, VHH 항체 단편, VHH 항체뿐만 아니라 "Nanobody®" 및 "Nanobody®도메인" (Ablynx N.V.사의 상표인 "Nanobody"; Ghent; Belgium)가 상호 교환적으로 사용되고, 예를 들면 WO2009/109635의 도 1에 정의된 바와 같은 소위 "홀마크 잔기(hallmark residues)"에 의해 VH 도메인과 구별되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 갖고, 제2면역글로불린 가변 도메인의 존재를 요구하지 않는 에피토프에 특이적으로 결합함)을 대표한다.

면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면 VHH의 아미노산 잔기는, 예를 들면 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999) 제2판에서 나타낸 바와 같이 카멜리드의 VHH 도메인에 적용되는 것으로서, Kabat et al., ("Sequences of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)에서 주어진 V_H 도메인에 대한 일반적인 넘버링(numbering)에 의해 넘버링된다. 이러한 넘버링에 따라,

- FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고,

- CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하며,

- FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고,

- CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하며,

- FR3는 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고,

- CDR3는 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하며,

- FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다.

그러나, V_H 도메인 및 VHH 도메인의 경우 기술분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 각 CDR 내의 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있고 Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수와 대응하지 않을 수 있다 (즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열 내에 채워져 있지 않을 수 있거나, 또는 실제 서열은 Kabat 넘버링에 의해 부여된 수보다 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다)는 것에 유의해야 한다. 이것은 일반적으로 Kabat 넘버링이 실제 서열 내의 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 대응할 수 있거나 대응하지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

유사한 방식으로 VHH 도메인에도 적용될 수 있는, V_H 도메인의 아미노산 잔기 넘버링을 위한 선택적 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러나, 본 명세서의 청구항 및 도면에서, 상기 기술된 바와 같이 VHH 도메인에도 적용되는 Kabat 넘버링은 별도의 지시가 없는 한, 다음과 같다.

VHH 도메인 내의 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 보통 110 내지 120, 주로 112 내지 115의 범위일 것이다. 그러나, 더 짧은 서열 및 더 긴 서열 또한 명세서에 기술된 목적에 적합할 수 있다는 것에 유의해야 한다.

특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH를 얻는 방법은, 예를 들면 WO2006/040153 및 WO2006/122786에 이미 기술되어 있다. 또한, 그것들에 상세히 기술된 바와 같이, 카멜리드로부터 유래한 VHH 도메인은 본래 VHH 서열의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간의 종래 4-쇄 항체 VH 도메인 내에 대응하는 위치에 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 "인간화될(humanized)"될 수 있다 (명세서에서 용어 "서열-최적화된(sequence-optimized)"으로 언급됨, "서열-최적화"는 인간화QNs만 아니라 잠재적인 번역 후 변형 부위의 제거와 같은 개선된 특질을 갖는 VHH를 제공하는 하나 이상의 돌연변이체에 의한 서열의 추가적인 변형을 포함할 수 있다). 인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 완전한 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 더욱 더 구체적인 예에서, 임의로 JH5와 같은 JH 서열과 조합된, DP-29, DP-47, DP-51, 또는 그의 일부로부터 유래된 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다.

"Dab" 및 "dAbs" ("도메인 항체" 및 GlaxoSmithKline 그룹사의 상표로서 사용되는 용어 "dAbs")로도 알려진 도메인 항체는 예를 들면 Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); 및 WO2003/002609에 기술되어있다.

도메인 항체는 본질적으로 비-카멜리드 포유류 항체, 특히 인간 4-쇄 항체의 VH 또는 VL 도메인에 대응한다. 단일 항원 결합 도메인으로서 즉, VL 또는 VH 도메인 각각과 쌍을 이루지 않고 에피토프에 결합하기 위해서, 예를 들면 인간의 단일 VH 또는 VL 도메인 서열 라이브러리(library)를 사용함으로써 그러한 항원 결합 특질에 대한 특이적인 선택이 요구된다.

VHH와 같은 도메인 항체는 약 13 내지 약 16 kDa의 분자량을 갖고, 완전한 인간 서열로부터 유래한 경우에는 예를 들면 인간의 치료적 용도를 위한 인간화를 요구하지 않는다. 또한, 그것은 VHH 도메인의 경우와 같이 원핵생물의(prokaryotic) 발현 시스템에서도 잘 발현되고, 전체 제조 비용에 있어서 상당한 감소를 제공한다.

또한, 하나 이상의 상기 언급된 CDR을, 인간의 스캐폴드(scaffold) 또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하나 이에 한하지 않는 다른 "스캐폴드"에 "이식(graft)"할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 그러한 CDR 이식을 위한 적합한 스캐폴드 및 기술은 기술분야에 잘 알려져 있다.

상호 교환적으로 사용될 수 있는 용어 "에피토프" 및 "항원 결정요인"은 종래 항체 또는 본 발명의 폴리펩티드와 같은 항원-결합 분자 및 특히, 상기 분자의 항원-결합 부위에 의해 인식되는 폴리펩티드와 같은 고분자의 일부를 말한다. 에피토프는 면역글로불린에 대한 최소 결합 부위를 정의하는 것이므로, 면역글로불린의 특이성 타겟을 나타낸다.

특이적 에피토프, 항원 또는 단백질 (또는 적어도 하나의 그의 일부, 단편 또는 에피토프)에 "결합하거나" 또는 "특이적으로 결합할 수 있는", "친화력을 갖는/갖거나 특이성을 갖는" 폴리펩티드 (예를 들면, 면역글로불린, 항체, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 일반적으로 항원-결합 분자 또는 그의 단편)가 상기 에피토프, 항원 또는 단백질에 "쪽으로 또는 직접 향한다"고하거나 또는 그러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합"분자이다. 본 명세서에서, 또한 VEGF-결합 분자는 "VEGF-중화"로서 불릴 수 있다.

일반적으로, 용어 "특이성"은 다른 타입의 특이적 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질 (예를 들면, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인) 분자가 결합할 수 있는 항원 또는 에피토프의 수를 말한다. 항원-결합 분자의 특이성은 그것의 친화력 및/또는 결합활성을 기초로 결정될 수 있다. 항원-결합 단백질 (KD)로써 항원 분리를 위한 평형 상수에 의해 나타내는 친화력은 에피토프와 항원-결합 단백질상 항원-결합 부위 사이의 결합력을 측정한 것이다: KD값이 더 적을수록, 에피토프와 항원-결합 분자 사이의 결합력은 더 강하다 (선택적으로, 또한 친화력은 1/KD에 해당하는 친화력 상수 (KA)로서 표현될 수 있다). 당업자에게 명확할 것인 바 (예를 들면, 본 명세서의 추가적인 개시에 기초함), 친화력은 관심있는 특이적 항원에 따라 그 자체가 알려진 방식으로 결정될 것이다. 결합활성은 적절한 항원과 그것을 함유한 항원-결합 분자 (예를 들면, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드) 사이의 결합력을 측정한 것이다. 결합활성은 에피토프와 그것의 항원-결합 분자상 항원 결합 부위 사이의 친화력 및 항원-결합 분자상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수 둘 다와 관련된다.

에피토프를 인식하는 항원-결합 분자의 일부는 파라토프라고 불린다.

별도의 지시가 없는 한, 용어 "VEGF-결합 분자"는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 항체 단편, "항-VEGF 항체-유사 분자" 및 임의의 이들과의 컨쥬게이트를 포함한다. 항체는 단일클론 항체 및 키메릭(chimerized) 단일클론 항체를 포함하나, 이에 한하지 않는다. 용어 "항체"는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 생성되는 단일클론 항체와 같은 완전한 면역글로불린을 포함할 뿐만 아니라, VEGF-결합 항체 단편 또는 예를 들면, WO02/056910에 기술된 바와 같은 소위 "SMIP" ("Small Modular Immuno Pharmaceuticals"라 불리는 단일-사슬형 항체 및 선형 항체를 포함하는 "항체-유사 분자"를 포함한다. 항-VEGF 항체-유사 분자는 명세서에 정의된 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 항체-유사 분자의 다른 예는 면역글로불린 수퍼 패밀리 항체 (IgSF) 또는 CDR-이식 분자이다.

"VEGF-결합 분자"는 1가 VEGF-결합 분자 (즉, VEGF의 하나의 에피토프에 결합하는 분자)뿐만 아니라 2가 또는 다가 결합 분자 (즉, 하나 이상의 에피토프에 결합하는 결합 분자, 예를 들면 하기 명세서에 정의된 바와 같은 "바이파라토픽(biparatopic)" 분자) 둘 다를 말한다. 또한, 하나 이상의 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 VEGF-결합 분자는 "형식화된(formatted)" VEGF-결합 분자라 불리고, 그것은 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인에 추가적으로 링커(linker) 및/또는 반응기(effector) 기능을 갖는 모이어티(moieties), 예를 들면 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인과 같은 반감기연장(half-life-extending) 모이어티, 및/또는 혈청 알부민과 같은 융합 파트너 및/또는 PEG와 같은 부착된 폴리머를 포함할 수 있다.

명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "바이파라토픽 VEGF-결합 분자" 또는 "바이파라토픽 면역글로불린 단일 가변 도메인" 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 VEGF-결합 분자를 의미하고, 여기에서 2개의 분자는 VEGF 항원의 2개의 다른 즉, 비중첩 에피토프에 결합한다. 본 발명에 따른 바이파라토픽 폴리펩티드는 에피토프에 대하여 다른 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성된다. 에피토프를 인식하는 항원-결합 분자 (예를 들면, 항체 또는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 일부를 파라토프라 한다.

또한, 형식화된 VEGF-결합 분자는 비록 덜 바람직하기는 하나, 2개의 동일한 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 동일 또는 중첩 에피토프를 인식하는 2개의 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 이 겨우, 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VEGF 다이머를 형성하는 2개의 모노머 각각의 동일 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 10E-5 내지 10E-14 몰/리터 (M) 또는 그 이하, 바람직하게는 10E-7 내지 10E-14 몰/리터 (M) 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 10E-8 내지 10E-14 몰/리터, 및 더욱더 바람직하게는 10E-11 내지 10E-13의 분리상수(K_D) (Biacore 또는 KinExA 어세이로 측정됨), 및/또는 적어도 10E7 ME-1, 바람직하게는 적어도 10E8 ME-1, 더욱 바람직하게는 적어도 10E9 ME-1, 예를 들면 적어도 10E11 ME-1의 연합 상수(K_A)를 갖고 결합할 것이다. 10E-4 M보다 큰 임의의 K_D 값은 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 여겨진다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 500 nM보다 더 적은, 바람직하게는 200 nM 미만, 더욱 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면 500 pM의 K_D 값을 갖고 원하는 항원, 즉 VEGF에 결합할 것이다. 항원-결합 단백질의 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들면, 명세서에 기술된 어세이로서 Scatchard 분석 및/또는 경쟁적 결합 어세이, 예를 들면 방사면역어세이 (RIA), 효소면역어세이 (EIA), 샌드위치경쟁어세이, 및 기술분야에 그 자체가 알려진 이들의 이형을 포함하는, 그 자체가 알려진 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.

아미노산 잔기는 일반적으로 알려져 있고 기술분야에서 인정되는 것과 같은 표준 세글자 또는 한글자 아미노산 코드에 따라 나타내어질 수 있다. 2개의 아미노산 서열을 비교하는 경우, 용어 "아미노산 차이"는 제2 서열과 비교할 때 레퍼런스(reference) 서열의 위치에 나타내어진 아미노산 잔기 수의 삽입, 제거 또는 치환을 말한다. 치환의 경우, 그러한 치환은 유사한 화학적 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되고, 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특질에 거의 또는 본질적으로 영향을 미치지 않는 것을 의미하는 보존적(conservative) 아미노산 치환이 바람직할 것이다. 그러한 보존적 아미노산 치환은 예를 들면 WO98/49185와 같은 기술분야에 잘 알려져 있고, 여기에서 보존적 아미노산 치환은 바람직하게 다음의 그룹 (i) - (v) 내 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환이다: (i) 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 GIy; (ii) 극성, 음으로 대전된 잔기 및 그의 (비대전된) 아마이드: Asp, Asn, GIu 및 GIn; (iii) 극성, 양으로 대전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (iv) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, VaI 및 Cys; 및 (v) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존적 아미노산 치환은 다음과 같다:

Ala을 GIy 또는 Ser으로; Arg을 Lys으로; Asn을 GIn 또는 His으로; Asp을 GIu으로; Cys을 Ser으로; Gin을 Asn으로; GIu을 Asp으로; GIy을 Ala 또는 Pro으로; His을 Asn 또는 Gin으로; Ile을 Leu 또는 VaI으로; Leu을 Ile 또는 VaI으로; Lys을 Arg, GIn 또는 GIu으로; Met을 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe을 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser을 Thr으로; Thr을 Ser으로; Trp을 Tyr으로; Tyr을 Trp 또는 Phe으로; VaI을 Ile 또는 Leu으로 치환.

예를 들면, 그것이 얻어진 그것의 본래 생물학적 공급원 및/또는 반응 배지 또는 배양 배지와 비교할 때, 그것이 또 다른 단백질/폴리펩티드, 또 다른 핵산, 또 다른 생물학적 성분 또는 거대분자와 같이 일반적으로 상기 공급원 또는 배지와 관련된 적어도 하나의 다른 성분 또는 적어도 하나의 오염물질, 불순물 또는 미량 성분으로부터 분리된 경우, 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 "본질적으로 분리된 " 것으로 여겨진다. 특히, 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 더욱 특히 적어도 100배, 및 1000배 이상까지 정제된 경우, “본질적으로 분리된” 것이라 여겨진다. "본질적으로 분리된 형태인" 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 바람직하게 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 같은 적합한 크로마토그래피 기술과 같은 적합한 기술을 사용하여 결정되는 바와 같이 본질적으로 동종이다.

2개의 VEGF-결합 분자 서열 사이에 "서열 동일성"은 서열 사이에 동일한 아미노산의 퍼센티지를 나타낸다. 그것은 WO08/020079의 49 및 50 쪽 f) 문단에 기술된 바와 같이 계산되거나 또는 결정될 수 있다. "서열 유사성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 퍼센티지를 나타낸다.

VHH 도메인과 유사한 방식으로 적용될 수 있는 V_H 도메인의 아미노산 잔기 넘버링에 대한 선택적 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러나, 본 명세서, 청구항 및 도면에서, 별도의 지시가 없는 한 상기 기술된 바와 같은 Kabat에 따른 VHH 도메인에 대해 적용되는 넘버링에 따를 것이다.

"친화력-성숙" VEGF-결합 분자, 특히 VHH 또는 도메인 항체는 각각의 모체(parent) VEGF-결합 분자와 비교할 때 VEGF에 대한 개선된 친화력을 야기하는, 하나 이상의 CDR 내 하나 이상의 변경을 갖는다. 본 발명의 친화력-성숙 VEGF-결합 분자는 예를 들면, Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 또는 Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J.　MoI. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibody using phage display", Oxford University Press 1996에 기술된 바와 같이 기술분야에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서, "서열번호 x의 아미노산 서열"은 별도로 기술되지 않는 한 각각의 서열번호 x에 나타낸 서열과 100% 동일한 아미노산 서열;

각각의 서열번호 x에 나타낸 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;

각각의 서열번호 x에 나타낸 서열과 3, 2 또는 1개 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된(unregulated) 세포 성장/증식이 특징인 포유류의 생리학적 상태를 말하거나 기술한다. 본 발명의 VEGF-결합 분자로 치료될 수 있는 암의 예는 상피성 암, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 한하지 않는다. US　2008/0014196에서 VEGF 길항제로의 치료에 대해 시사된 바와 같이 그러한 암의 더욱 특별한 예는, 편평상피세포 암, 소세포 폐암, 비 소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 자궁내막 또는 자궁 상피암종, 침샘 상피암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 폐 상피암종, 위암, 흑색종 및 다양한 타입의 머리 및 목 암을 포함한다. 혈관신생의 조절장애는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 많은 장애를 일으킬 수 있다. 이러한 장애는 비종양 및 종양 상태를 포함한다. 종양은 상기 기술된 그것들을 포함하나 이에 한하지 않는다.

비종양성 장애는 US2008/0014196에서 VEGF 길항제로의 치료에 대해 시사하는 바와 같이, 바람직하지 않은 또는 이상(aberrant) 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건선성 플라크(plaque), 유육종증, 아테롬성 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화 플라크, 당뇨병 및 조기 망막증을 포함하는 다른 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관화, 각막 이식 신생혈관화, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신생혈관화, 앵글(angle)의 신생혈관화 (피부조홍(rubeosis)), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착증, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 맥관섬유종, 갑상선 비후 (그레이브병 포함), 각막 및 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 부상/ ARDS, 패혈증, 원발성 폐고혈압, 악성 폐삼출, 뇌수종 (예를 들면, 급성 스트로크/ 폐쇄 머리 부상/ 정신적 외상 관련), 활막 염증, RA 내 파누스(pannus) 형성, 골화 근육염, 비대성 골 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소질환, 자궁내막증, 유체의 제3 스페이싱 (3^rd spacing of fluid) 질환 (췌장염, 구획압착 증후군, 화상, 염증성 질환), 자궁 유섬유종, 조기 분만, IBD (크론병 및 궤양성 대장염)와 같은 만성 염증, 신장 동종이식 거부, 염증성 장질환, 신장 증후군, 바람직하지 않거나 이상적인 조직 대량 성장 (비-암(non-cancer)), 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장 저해, 오시에-웨버(Osier-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 경피증, 트라코마(trachoma), 혈관 유착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭삼출 (예를 들면, 심낭염과 관련된 것), 및 흉막삼출을 포함하나, 이에 한하지 않는다.

제1측면으로, 본 발명은 적어도 하나의 4개의 프레임워크 영역 및 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각을 갖는 가변 도메인을 포함하는 VEGF-결합 분자에 관한 것이고, 여기에서 상기 CDR3는 서열번호 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr을 가지며, 여기에서

위치 5의 Xaa는 Gly 또는 Ala이고;

위치 7의 Xaa는 Ser 또는 Gly이며;

위치 12의 Xaa는 Gly, Ala 또는 Pro이고;

위치 13의 Xaa는 Asp 또는 Gly이며;

위치 16의 Xaa는 Asp 또는 Glu이고;

여기에서 상기 VEGF-결합 분자는 60% 이상의 저해율로 인간 재조합 VEGF165와 인간 재조합 VEGFR-2 사이의 상호작용을 차단할 수 있다.

바람직한 구체예에 따르면, 위치 5의 Xaa는 Gly이고, 위치 7의 Xaa는 Ser이며, 위치 12의 Xaa는 Ala이고, 위치 13의 Xaa는 Asp이다.

특히, 상기 CDR3는

서열번호 2 SRAYGSSRLRLGDTYDY;

서열번호 3 SRAYGSSRLRLADTYDY;

서열번호 4 SRAYGSSRLRLADTYEY;

서열번호 5 SRAYGSGRLRLADTYDY;

서열번호 6 SRAYASSRLRLADTYDY;

서열번호 7 SRAYGSSRLRLPDTYDY;

서열번호 8 SRAYGSSRLRLPGTYDY

로부터 선택되는 서열을 갖는다.

특정한 구체예에 따르면, VEGF-결합 분자는 각각

a. 서열번호 2 내지 8에 나타낸 제1그룹의 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3;

b. 표 3에 제시된 바와 같은 서열번호 9 내지 46에 나타낸 제2그룹의 아미노산 서열로부터 선택된 서열이 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 함유하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기에서 상기 제2서열은 각각 a)에 따라 선택되는 CDR3를 함유한다.

바람직한 구체예에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH이다.

특정한 구체예에 따르면, VHH는 서열번호 9-46에 나타낸 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 특정한 구체예에 따르면, VHH는 서열번호 15, 서열번호 18 및 서열번호 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 예를 들면 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화에 의해 얻어진 VHH와 같이, 상기 정의된 VHH의 친화력 성숙 및/또는 서열 최적화에 의해 얻어진 VEGF-결합 분자에 관한 것이다. 서열번호 47-57에 나타낸 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VHH가 예이다.

특정한 구체예에 따르면, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 명세서에서 정의된 바와 같이 형식화될 수 있고, 예를 들면 바이파라토픽이거나 또는 2개의 동일한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 그러한 VEGF-결합 분자는

a) 60% 이상의 저해율로 재조합 인간 VEGF와 재조합 인간 VEGFR-2 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 동일한 VHH이거나 또는

b) 적어도 하나의 VHH는60% 이상의 저해율로 재조합 인간 VEGF와 재조합 인간 VEGFR-2 사이의 상호작용을 차단할 수 있는, VEGF의 비중첩 에피토프에 결합하는 다른 VHH인, 2개 이상의 VHH를 포함할 수 있다.

각각 60% 이상 또는 60 % 이하의 저해율에서 상기 상호작용을 차단하는 퍼센티지는 실시예에서 사용된 바와 같이 증폭 발광 근접 동종 어세이 (AlphaScreen®, 경쟁 ELISA, 플라스몬 공명 (SPR) 기초 어세이 (Biacore®에 의해 결정된 저해율을 말한다.

하기에서, a)에 따른 VHH의 능력은 또한 "수용체-차단"이라는 용어로 불리는 반면, b)에 따른 VHH의 능력은 또한 "비-수용체-차단"이라는 용어로 불린다.

수용체-차단 VHH는 바람직하게 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상의 저해율을 갖고; 가장 바람직하게 완전한 수용체 차단제인 VHH는 즉, 100 %의 저해율을 갖는다.

VEGF-결합은 a) 서열번호　9-46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH 또는 그러한 VHH의 친화력 성숙 및/또는 서열 최적화에 의해 얻어진 VHH로부터 선택되는 2개 이상의 동일한VHH를 함유할 수 있다. VHH는 서열번호 18 또는 서열번호 47-57에 나타낸 아미노산을 갖는 VHH로부터 선택될 수 있다.

바람직한 구체예에 따르면, 형식화된 VEGF-결합 분자는 서열번호 57에 나타낸 아미노산 서열을 각각 갖는 2개의 VHH를 포함한다.

2개의 다른 VHH 를 포함하는 형식화된 VEGF-결합 분자에서

a) 60% 이상의 저해율을 갖는 상기 하나 이상의 VHH는

i. 서열번호　9-46에 나타낸 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산을 갖는 VHH 또는

ii. 그러한 VHH의 친화력 성숙 및/또는 서열 최적화에 의해 얻어진 VHH로부터 선택되고, 여기에서

b) 저해율 60% 이하의 저해율을 갖는 상기 하나 이상의 VHH는

i. 서열번호 58-124 또는

ii. 그러한 VHH의 친화력 성숙 및/또는 서열 최적화에 의해 얻어진 VHH로부터 선택된다.

바람직한 구체예에 따르면, 2개 이상의 VHH는 표 15에 제시된 바와 같은 링커 서열에 의해 분리된 서열번호 128-168에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 함유된다.

바람직한 VEGF-결합 분자에서 VHH a) i.는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 VHH b) i.는 서열번호 64에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

다른 바람직한 VEGF-결합 분자에서 a) ii.에 따른 VHH는 서열번호　47-57에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH로부터 선택되고 b) ii. 에 따른 VHH는 서열번호 125-127에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VHH로부터 선택된다.

2개 중 하나는 서열번호 57에 나타낸 아미노산을 갖고 다른 하나는 서열번호 127에 나타낸 아미노산을 갖는 2개의 VHH를 포함하는 바이파라토픽 VEGF-결합 분자가 특히 바람직하다.

치료적 적용의 관점에서, 예를 들면 강화된 친화력 또는 낮은 면역원성과 같은 개선된 특질을 갖는 VEGF-결합 분자는 기술분야에 알려진 기술, 예를 들면 친화력 성숙 (예를 들면, 합성, 랜덤 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 시작됨), CDR 이식, 인간화, 다른 면역글로불린 서열로부터 유도된 단편의 조합, 중첩 프라이머를 사용하는 PCR 조립 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열 엔지니어링에 대한 유사한 기술; 또는 상기 것들의 임의의 적합한 조합, 및 또한 명세서에서 기술된 바와 같은 용어 "서열 최적화"의해 본 발명의 각 VEGF-결합 분자로부터 얻어질 수 있다. 참고문헌은 예를 들면 표준 편람뿐만 아니라 추가적인 기재 및 실시예로 만들어진다.

적절한 경우, 높은 친화력을 갖는 본 발명의 VEGF-결합 분자는 친화력-성숙 분자에 대한 "모체" VEGF-결합 분자로 이후에 나타내는 또 다른 VEGF-결합 분자의 친화력-성숙에 의해 얻어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면 VHH 및 도메인 항체는 기능적 항원-결합 분자에 의한 치료요법의 용도에서 그것을 매우 유리하게 하는 수많은 독특한 구조적 특징 및 기능적 특질을 갖는다. 또한 그에 한하지 않고, 특히 VHH 도메인 (경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원에 기능적으로 결합하도록 본래 "디자인됨")은 단일의 비교적 작은 기능적 항원-결합 구조적 유닛으로서 기능할 수 있다.

그것의 특질에 기인하여, 명세서에서 정의된 바와 같이 VHH 또는 VH (또는 VL)과 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단독으로서 또는 예를 들면 바이파라토픽 분자 와 같은 더 큰 폴리펩티드의 일부로서 수많은 중요한 이점을 제공한다:

높은 친화력 및 높은 선택성을 갖고 항원에 결합하기 위해 단지 단일 도메인이 요구되므로, 2개의 분리된 도메인 존재를 갖거나 또는 이러한 2개의 도메인이 우측 공간 형태 및 구성에 존재해야 할 (즉, scFv's와 같은 특별히 디자인된 링커의 사용을 통해) 필요가 없고;

면역글로불린 단일 가변 도메인은 단일 핵산 분자로부터 발현될 수 있으며, 임의의 번역 후 변형 (예를 들면, 글리코실화)을 요구하지 않고;

면역글로불린 단일 가변 도메인은 쉽게 다가 및 다특이적 형식으로 엔지니어링될 수 있으며 (명세서에서 추가로 논의되는 바와 같음);

면역글로불린 단일 가변 도메인은 그것의 타겟에 대한 높은 특이성 및 친화력, 및 낮은 내재적 독성을 가지고, 인퓨전(인퓨젼) 또는 주사 외에 선택적 루트를 통해 투여될 수 있으며;

면역글로불린 단일 가변 도메인은 열, pH, 프로테아제 및 다른 변성제 또는 상태에 매우 안정하고, 따라서 냉동 설비를 사용하지 않고 제조, 저장 또는 운반될 수 있으며;

면역글로불린 단일 가변 도메인은 소규모 및 대규모 제조 모두에서 대해 쉽고 상대적으로 저렴하며, 예를 들면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 미생물 발효 (예를 들면, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이) 미생물 발효를 사용하여 제조될 수 있거나, 예를 들면 종래의 항체를 갖는 포유동물의 발현 시스템의 사용을 요구하지 않고;

면역글로불린 단일 가변 도메인은 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편과 비교할 경우 상대적으로 작으며 (대략 15　kDa, 또는 IgG보다 10배 더 작음), 조직 (고형 종양 및 다른 밀집한 조직을 포함하나 이에 한하지 않음)으로의 높은 (더 높은) 침투를 보이고, 그러한 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편보다 더 높은 투여량으로 투여될 수 있으며;

VHH는 특이적인 소위 "캐비티(cavity)--결합 특질" (그 중 4-쇄 항체의 VH 도메인과 비교할 때, 그것의 연장된 CDR3 루프에 기인함)을 갖고, 그에 따라 타겟 및 에피토프에 접근할 수 있지만, 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편에는 접근할 수 없으며;

VHH는 높은 용해성 및 높은 안정성의 특정한 이점을 갖고, 집적하는 경향을 갖지 않는다 (예를 들면, Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)에 기술된 마우스-유도의 항원-결합 도메인).

본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 그것이 얻어져 왔던 특이적 생물학적 공급원 또는 특이적 제조방법에 제한되지 않는다. 예를 들면, VHH를 얻는 것은 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(1) 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인을 분리하는 단계; 또는 중쇄 항체 또는 VHH 및 그로부터 분리하는 VHH를 포함하는 라이브러리를 스크리닝(screening)하는 단계;

(2) 자연 발생 서열을 갖는 VHH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하는 단계;

(3) 임의로 친화력 성숙 후에, 자연 발생 서열을 갖는 VHH를 (명세서에서 기술된 바와 같이) "인간화"하는 단계 또는 그러한 인간화된 VHH를 코딩하는 핵산을 발현하는 단계;

(4) 동물종, 특히 포유동물, 예를 들면 인간으로부터의 자연 발생 항체의 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인을 (하기에 기술된 바와 같이) "카멜라이징(camelizing)"하는 단계, 또는 그러한 카멜라이징된 도메인을 코딩하는 핵산분자를 발현하는 단계;

(5) VH를 "카멜라이징"하는 단계, 또는 그러한 카멜라이징된　VH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하는 단계;

(6) 합성으로 또는 세미-합성으로(semi-synthetically) 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하기 위한 기술을 사용하는 단계;

(7) 핵산 합성을 위한 기술을 사용하여 VHH 도메인을 코딩하는 핵산분자를 제고하고, 이에 얻어진 핵산을 발현하는 단계;

(8) 중쇄 항체 또는 VHH를 친화력 성숙시켜, 친화력 및/또는 VHH 의 특이성을 증가시키기 위한 돌연변이 생성 (예를 들면 랜덤 돌연변이 생성 또는 부위-유도 돌연변이 생성) 및/또는 임의의 다른 기술을 사용하는 단계; 및/또는

(9) 상기 단계의 조합 또는 선택.

상기 기술된 단계를 수행하는 적합한 방법 및 기술은 기술분야에 알려져 있고 당업자에게 분명할 것이다. 예를 들면, 특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH 도메인을 얻는 방법은 WO2006/040153 및 WO2006/122786에 기술되어 있다.

특정한 구체예에 따르면, 본 발명의 또는 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 자연 발생 VHH 도메인의 아미노산 서열에 본질적으로 대응하는 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인이지만, 그것은 예를 들면 종래의 인간 4-쇄 항체의 가변 중쇄 도메인 내 대응하는 위치에 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 상기 자연 발생 VHH 서열 내 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체함으로써 "인간화" 또는 "서열-최적화" (임의로 친화력 성숙 후)되었다. 이것은 당업자에 의해 관용적으로 사용될 수 있는 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 완전한 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 더욱 더 구체적인 구체예에서, 인간 생식세포 Vh3 서열인 DP-29, DP-47, DP-51 또는 이의 일부로부터 유래된 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있거나, 또는 그에 대한 높은 상동성으로 JH5와 같은 JH 서열과 임의로 조합될 수 있다. 따라서, 인간화 프로토콜은 DP 47, DP 29및 DP 51과 같은 생식세포 VH 유전자의 대응하는 프레임워크 1, 2 및 3 (FRl, FR2 및 FR3) 잔기 단독 또는 조합에 의한 임의의 VHH 잔기 대체를 포함할 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 적합한 프레임워크 영역 (FR)은 예를 들면 WO 2006/004678에 제시된 그것으로부터 선택될 수 있고, 구체적으로, 소위 "KERE" 및 "GLEW" 클래스를 포함한다. 예를 들면, 대략 위치 44 내지 47의 아미노산 서열 G-L-E-W를 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 그것 각각의 인간화된 대응부분이다. 인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 완전한 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다.

EVQ로 시작하는 본 발명의 VHH에서, N-말단 E는 D로 대체될 수 있거나 (서열-최적화의 빈번한 결과) 또는 상실될 수 있다 (E.coli의 VHH 발현의 경우). 형식화된 VEGF-결합 분자의 경우, 이것은 보통 N-말단에 위히찬 VHH에 대해서만 적용된다.

103 P,R,S-그룹 및/또는 GLEW-그룹 (하기 정의된 바와 같음)에 속하는 VHH 도메인에 대한 인간화 치환은 108Q 내지 108L이 바람직하나, 이에 한하지 않는다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화 방법은 기술분야에 알려져 있다.

또 다른 구체예에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 명세서에 정의된 바와 같이 도메인 항체이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인의 대표적인 클래스는 중쇄 항체의 VHH 도메인 내 대응 위치에서 일어나는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의한 종래 4-쇄 항체로부터의 자연 발생 가변 중쇄 아미노산 서열에서의, 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체에 의해 "카멜라이징"된 자연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는다. 이것은 그 자체가 알려진 방식으로 수행될 수 있어 당업자에게 명확할 것이고, 추가로 WO　94/04678이 참고될 수 있다. 그러한 카멜라이징은 VH-VL 내부 및 소위 Camelidae Hallmark 잔기에 존재하는 아미노산 위치에서 바람직하게 일어날 수 있다 (예를 들면 또한 WO 94/04678 참조). 그러한 "인간화" 및 "카멜라이징" 기술 및 그와 일관된 바람직한 프레임워크 영역 서열에 대한 상세한 내용은 추가적으로 예를 들면 WO 2006/040153 46 및 98쪽 및 WO　2006/122786의 107쪽을 참조할 수 있다.

본 발명의 VEGF-결합 분자, 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VEGF 분자 내의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 VEGF에 대한 특이성을 갖는다.

그것의 항원에 대한 VEGF-결합 분자의 특이적 결합은 예를 들면, 명세서에 기술된 바와 같은 어세이로서, 방사면역어세이 (RIA), 효소면역어세이(EIA 및 ELISA) 및 샌드위치 경쟁 어세이와 같은 Scatchard 분석 및/또는 경쟁적 결합 어세이, 및 기술분야에 그 자체가 알려진 그의 다른 변형을 포함하는 그 자체가 알려진 임의의 적합한 방식에 의해 결정될 수 있다.

항원 VEGF와 관련하여, 본 발명의 VEGF-결합 분자, 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인은 종에 제한되지 않는다. 따라서, 인간의 치료적 목적을 의도하는 경우, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 인간 VEGF에 결합한다. 그러나, 또 다른 포유동물 종의 VEGF에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또한 본 발명의 범위 내이다. VEGF의 하나의 종 형태에 결합하는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 다른 종의, 인간의 것이 아닌 다른 서열을 갖는 VEGF와 교차 반응할 수 있다. 예를 들면, 인간 VEGF 에 결합하는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 영장류의 하나 이상의 다른 종의 VEGF, 및/또는 질환에 대한 예를 들면 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 개와 같은 동물 모델에서, 특히 혈관신생에 관한 VEGF-매개 효과와 관련된 질환 및 장애에 대한 동물 모델 (예를 들면 명세서에서 언급된 종 및 동물 모델)에서 사용되는 동물의 하나 이상의 종의 VEGF에서 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 원숭이, 특히 Cynomolgus 또는 Rhesus, 또는 마우스 및 랫트와 같은 승인된 질환 모델에서 테스트될 수 있게 하므로, 그러한 교차-반응성을 보이는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 연구 및/또는 의약 개발에 유용하다.

바람직하게, 치료적 VEGF 길항제를 개발하는 동안 동물 모델로서 사용되는 인간이 아닌 종의 하나 이상의 VEGF 분자와의 교차-반응성 관점에서, VEGF-결합 분자는 인간 VEGF와 높은 정도의 동일성을 갖는 관심 VEGF 영역 내 에피토프를 인식한다.

본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 그것의 수용체, 특히 그것의 활성화가 종양의 신생혈관화에 원인으로 관여되는 수용체로 보였던 VEGFR-2에 관한 VEGF의 영역 내에 전체 또는 일부가 위치한 에피토프를 인식한다. 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VEGF 수용체 활성화, 특히 VEGFR-2 활성화를, 적어도 일부, 바람직하게는 상당히, 가장 바람직하게는 완전히 차단한다.

상기 기술된 바와 같이, VEGF 및 그의 수용체, 특히 VEGFR-2 사이의 상호작용을 차단하는 VEGF-결합 분자의 능력은 실시예에 기술된 바와 같이 증폭 발광 근접 상동 어세이 (AlphaScreen®), 경쟁 ELISA, 또는 플라스몬 공명 (SPR) 기초 어세이 (Biacore®)에 의해 결정될 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 10　nM 미만, 예를 들면 500 pM의 친화력을 갖고 VEGF에 결합한다 (실시예 5.7에 기술된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정됨).

바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 실시예 5.1에 기술된 바와 같은 경쟁 ELISA 어세이에 의해 측정된 것으로서 10^-6 내지 10^-10 몰/리터 이하의 범위, 더욱 바람직하게 10^-8 내지 10^-10 몰/리터 이하의 범위 및 더욱 더 바람직하게 10^-9 내지 10^-10 몰/리터 이하의 범위의 IC₅₀ 값을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르나 이에 한하지 않고, 본 발명의 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인은 10^-5 내지 10^-12 몰/리터 (M) 이하, 바람직하게는 10^-7 내지 10^-12 몰/리터 (M) 이하, 더욱 바람직하게는 10^-8 내지 10^-12 몰/리터 (M)의 분리 상수 (K_D), 및/또는 10⁷ M^-1이상, 바람직하게는 10⁸ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 10⁹ M^-1 이상, 예를 들면 10¹² M^-1 이상의 연합 상수 (K_A); 및 특히 500 nM 미만, 바람직하게 200　nM 미만, 더욱 바람직하게 10 nM 미만, 예를 들면 500 pM 미만의 K_D를 갖고 VEGF와 결합한다. 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 VEGF에 대한 K_D 및 K_A 값이 결정될 수 있다.

2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 바이파라토픽 VEGF-결합 분자는 본질적으로 (i) VEGF의 제1에피토프에 특이적으로 결합하는 제1면역글로불린 단일 가변 도메인 및 (ii) VEGF의 제2에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성되고, 여기에서 VEGF의 제1에피토프 및 VEGF의 제2에피토프는 동일한 에피토프가 아니다. 다시 말하면, 이러한 본 발명의 폴리펩티드는 VEGF 내에 존재하는 적어도 2개의 비중첩 에피토프로 향하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되고, 여기에서 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 그러한 방식으로 서로 연결된다. 이 경우에서, 또한 본 발명의 폴리펩티드는 VEGF에 대한 적어도 2개의 결합 부위를 함유하는 폴리펩티드인 "2가" 또는 "다가" 면역글로불린 구성체, 및 특히 "다가 면역글로불린 단일 가변 도메인 구성체"로서 여겨질 수 있다 (그러한 구성체는 또한 "형식화된"VEGF 결합 분자, 예를 들면 "형식화된" VHH으로 불린다).

이러한 본 발명의 VEGF-결합 분자는 (적어도) 2개의 항-VEGF 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기에서 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 VEGF 분자 내의 비중첩 에피토프로 향한다. 따라서, 이러한 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 항원 특이성 및 그에 따른 다른 CDR 서열을 가질 것이다. 이러한 이유로, 각각 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 2개의 다른 파라토프를 포함할 것이므로 이러한 본 발명의 폴리펩티드는 "바이파라토픽 폴리펩티드", 또는 "바이파라토픽 도메인 항체 구성체" (면역글로불린 단일 가변 도메인이 도메인 항체로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된 경우), 또는 "바이파라토픽 VHH 구성체" (면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된 경우) 명세서에서 불릴 것이다.

본 발명의 폴리펩티드가 명세서에서 정의된 바와 같은 바이파라토픽 분자인 경우, 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인 구성요소는 재조합 인간 VEGF 및 재조합 인간 VEGFR-2 사이의 상호작용이 80% 이상의 저해율로 차단되는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 실험에서 나타난 바와 같이, 특정한 형식화된 분자는 둘 다 80% 이상의 저해율로 VEGFR2 수용체를 차단하는 2개의 VHH를 함유한다. 본 발명의 특정한 VHH는 100%의 저해율로 VEGFR-2를 차단하며, 즉 완전한 차단제이다.

명세서에 더욱 상세하게 제시되는 바와 같이 두 경우 모두에서, 추가적인 서열 및 모이어티가 본 발명의 VEGF-결합 분자 내, 예를 들면 N-말단, C-말단에 존재할 수 있거나, 또는 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인 사이, 예를 들면 링커 서열 및 반응기(effector) 기능을 제공하는 서열에 위치할 수 있다.

덜 바람직하더라도 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 2개 이상의 항-VEGF 면역글로불린 단일 가변 도메인, 즉 3개, 4개 또는 그 이상의 항-VEGF VHH를 포함할 수 있다. 이 경우, 적어도 2개의 항-VEGF 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VEGF 분자 내의 비중첩 에피토프를 향하고, 여기에서 임의의 추가적 면역글로불린 단일 가변 도메인은 임의의 2개의 비중첩 에피토프 및/또는 VEGF 분자에 존재하는 추가적 에피토프와 결합할 수 있다.

본 발명에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 항원, 즉 VEGF에 결합할 것이라는 전제로 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH 또는 도메인 항체, 및/또는 임의의 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인 종류, 예를 들면 명세서에서 정의된 바와 같은 VL　도메인에 서로 독립적일 수 있다.

바람직한 구체예에 따르면, 제1 및 제2면역글로불린 단일 가변 도메인은 본질적으로 명세서에 정의된 바와 같이 VHH 서열 또는 도메인 항체 서열 중 어느 하나로 구성된다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 제1 및 제2면역글로불린 단일 가변 도메인은 본질적으로 VHH 서열로 구성된다.

본 발명의 특정한 구체예에 따르면, 본 발명의 VEGF-결합 분자에 존재하는 적어도 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 직접(즉 링커를 사용하지 않고) 또는 링커를 통해 서로 연결될 수 있다. 링커는 바람직하게 링커 펩티드이고, 1개의 동일한 VEGF 분자 내, 또는 2개의 다른 분자 내 적어도 2개의 VEGF의 비중첩 에피토프 각각에 대해 적어도 2개의 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인이 결합하도록 선택될 수 있다.

적합한 링커는 그 중에서도 에피토프 및 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인이 결합하는 VEGF 상의 에피토프 사이의 거리에 의존할 것이고, 임의로 여러 제한된 정도의 관용적인 실험 후 명세서 개시에 기초하여 당업자에게 명확할 것이다.

또한, VEGF에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHHs 또는 도메인 항체일 때, 그들은 제3 VHH 또는 항체를 통해 각각 서로 연결될 수 있다 (그러한 VEGF-결합 분자에서, 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인 상기 제3 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접 또는 적합한 링커를 통해 연결될 수 있다). 그러나 제3 VHH 또는 도메인 항체는 예를 들면 증가된 반감기를 제공하는 VHH 또는 도메인 항체일 수 있다. 예를 들면, 후자의 VHH 또는 도메인 항체는 (인간) 혈청 알부민 또는 (인간) 트랜스페린과 같은 (인간) 혈청 단백질에 결합할 수 있는 도메인 항체 또는 VHH일 수 있다.

선택적으로, VEGF에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 연속적으로 연결될 수 있고 (직접 또는 적합한 링커를 통해) (증가된 반감기를 제공할 수 있는) 제3 VHH 또는 도메인 항체는 직접 또는 링커를 통해 이러한 2개 이상의 앞서 언급한 면역글로불린 서열 중 하나에 연결될 수 있다.

적합한 링커는 본 발명의 특이적 폴리펩티드와 연관되어 명세서에 기술되고, 예를 들면 바람직하게 9개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 17 아미노산, 예를 들면 약 20 내지 40 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나, 상한은 결정적이지 않으나, 예를 들면 그러한 폴리펩티드의 생물약제학적 생산의 편의를 근거로 선택된다.

링커 서열은 자연 발생 서열 또는 비-자연 발생 서열일 수 있다. 치료적 목적으로 사용되는 경우, 링커는 바람직하게 본 발명의 VEGF-결합 분자가 투여되는 대상에서 비면역원성이다.

하나의 유용한 링커 서열의 그룹은 WO96/34103 및 WO94/04678에 기술된 바와 같이 중쇄 항체의 힌지(hinge) 영역으로부터 유도된다.

다른 예는 Ala- Ala- Ala와 같은 폴리-알라닌 링커 서열이다.

링커 서열의 추가적인 바람직한 예는 (gly₄ser)₃, (gly₄ser)₄, (gly₄ser), (gly₃ser), gly₃, 및 (gly₃ser₂)₃를 포함하는 (gly_xser_y)_z 링커와 같은 다른 길이의 Gly/Ser 링커이다.

링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS; 서열번호 169);

GGGGSGGGS (9GS; 서열번호 170);

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (40GS; 서열번호 171)와 같은 링커의 일부 비 제한 예가 표 15 (서열번호 128-168)에 나타낸 본 발명의 VEGF-결합 분자에 함유된다.

본 발명의 형식화된 VEGF-결합 분자가 폴리머, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 모이어티의 부착에 의해 변형되는 경우, 링커 서열은 바람직하게 링커 영역에서 그러한 변형, 예를 들면 PEG화를 허용하는 아미노산 잔기, 예를 들면 시스테인 또는 리신을 포함한다,

PEG화에 유용한 링커의 예는 다음과 같다:

GGGGCGGGS ("GS9,C5", 서열번호 172);

Ggggcggggsggggsggggsggggs ("GS25,C5", 서열번호173)

gggsggggsggggcggggsggggsggg ("GS27,C14", 서열번호174),

ggggsggggsggggcggggsggggsggggsggggs ("GS35,C15", 서열번호175), 및

GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35,C15" 서열번호176).

또한, 링커는 예를 들면 WO2004/081026에 나타낸 바와 같이 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 적어도 2개의 VEGF-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직한 구체예이나 이에 한하지 않고, 상기 기술된 바와 같이 추가적 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있는 또 다른 모이어티를 통해 (임의로 1개 또는 2개의 링커를 통해), 예를 들면 또 다른 폴리펩티드를 통해 서로 연결된다. 그러한 모이어티는 본질적으로 비반응성이거나 또는 본 폴리펩티드의 바람직한 특질을 개선하는 것과 같은 생물적 효과를 가질 수 있거나, 또는 본 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 추가적인 바람직한 특질을 부여할 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 본 모이어티는 단백질 또는 폴리펩티드의 반감기를 개선할수 있고/ 있거나, 그것의 면역원성을 감소시키거나 또는 임의의 다른 바람직한 특질을 개선할 수 있다.

바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 특히 치료적 제제로서 사용되려하거나 사용되는 경우, 환자의 혈청 또는 다른 체액에서 본 발명 폴리펩티드의 반감기를 연장하는 모이어티를 포함한다. 용어 "반감기"는 (변형된) 폴리펩티드의 혈청 농도가, 예를 들면 폴리펩티드의 분해 및/또는 자연적 메커니즘에 의한 제거 및/또는 격리에 기인하여 인 비보(in vivo)에서 50%까지 감소하는데 걸리는 시간으로 정의된다.

더욱 특히, 그러한 반감기 연장 모이어티는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 공유적으로 연결되거나 융합될 수 있고, Fc 부분, 알부민 모이어티, 알부민 모이어티의 단편, 알부민 결합 모이어티, 예를 들면 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인, 트랜스페린 결합 모이어티, 예를 들면 항-트랜스페린 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리옥시알킬렌 분자, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 분자, 알부민 결합 펩티드 또는 하이드록시에틸 스타치(starch) (HES) 유도체일 수 있으나, 이에 한하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 항원 혈액에서 발견되는 항원, 예를 들면 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 피브리노겐 또는 트랜스페린에 결합하는 모이어티를 포함하고, 이에 따라 생성되는 본 발명의 폴리펩티드에 인 비보에서 증가된 반감기를 부여한다. 구체적으로 바람직한 구체예에 따르면, 이러한 모이어티는 알부민-결합 면역글로불린이고 특히 바람직하게는 알부민-결합 VHH 도메인과 같은 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.

인간에 사용하려는 경우, 그러한 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 인간 혈청 알부민에 결합하고 바람직하게 인간화된 알부민-결합 VHH 도메인이다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 기술분야에 알려져 있고 예를 들면 WO2006/122786에 더 상세하게 기술된다. 구체적으로, 유용한 알부민 결합 VHH는 ALB 1 및 그것의 인간화된 대응부분 ALB 8이다 (WO2009/095489). 상기 특허 문헌에 언급된 다른 알부민 결합 VHH 도메인도 사용될 수 있다.

구체적으로 유용한 알부민 결합 VHH 도메인은 서열번호 177에 나타낸 아미노산 서열로 구성되거나 그 서열을 함유하는 ALB8이다.

본 발명의 추가적인 구체예에 따르면, 바람직하게 VHH에서 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 예를 들면 WO01/79271 및 WO03/59934에 기술된 바와 같은 혈청 알부민 분자에 융합될 수 있다. 예를 들면 WO01/79271에 기술된 바와 같이, 융합 단백질은 종래의 제조합 기술에 의해 얻어질 수 있다: 혈청 알부민을 코딩하는 DNA 분자, 또는 그의 단편은 VEGF-결합 분자를 코디하는 DNA와 연결되고, 얻어진 구조는 선택된 숙주 세포, 예를 들면 Pichia pastoris와 같은 효모 세포 또는 박테리아 세포에서 발현에 적합한 플라스미드 내로 삽입되며, 숙주 세포는 융합된 뉴클레오티드 서열로 형질감염된 다음 적합한 조건하에서 배양된다. 유용한 HAS의 서열은 서열번호　178에 나타내어진다:

또 다른 구체예에 따르면, 본 발명 폴립펩티드의 반감기 연장 변형 (이러한 변형은 또한 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킴)은 적합한 약제학적으로 허용되는 폴리머, 예를 들면 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 이의 유도체 (예를 들면 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 항체 및 항체 단편 (도메인 항체 및 scFv's를 포함하나 이에 한하지 않음)에 대한 기술분야에서 사용되는 PEG화와 같은 임의의 적합한 형태의 PEG화가 사용될 수 있고; 예를 들면 Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv.　Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); 및 WO2004/060965를 참고한다.

또한 폴리펩티드의 PEG화를 위한 다양한 시약은, 예를 들면 Nektar Therapeutics사, USA, 또는 NOF Corporation, Japan의 Sunbright®EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, 및 ME Series, 또는 Sunbright®ME-100MA, Sunbright®ME-200MA, 및 Sunbright®ME-400MA로부터 상업적으로 이용가능하다.

바람직하게, 부위-유도 PEG화가 특히 시스테인-잔기를 통해 사용된다 (예를 들면 Yang et al., 단백질 Engineering 16, 761-770 (2003) 참조). 예를 들면, 이러한 목적으로, PEG는 본 발명의 폴리펩티드 내에 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 부착될 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하기 위해 변형될 수 있거나, 또는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 본 발명 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있고, 사용하는 모든 단백질 엔지니어링 기술은 당업자에게 그 자체가 알려져 있다.

바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 경우, PEG는 5 kDa을 초과하는 분자량, 예를 들면 10 kDa 내지 200 kDa, 예를 들면 100 kDa 미만; 예를 들면 20 kDa 내지 80　kDa의 범위 내에서 사용된다.

PEG화에 대해서, 또한 일반적으로 본 발명은 바람직하게는 상기 PEG화가 (1) 인 비보에서 반감기를 증가시키고; (2) 면역원성을 감소시키며; (3)　PEG화에 대한 그 자체가 알려진 하나 이상의 추가적인 이점을제공하고; (4)　VEGF에 대한 폴리펩티드의 친화력에 본질적으로 영향을 주지 않고/않거나 (예를 들면 기술분야에 기술된 적합한 어세이에 의해 결정되는 것으로서, 상기 친화력을 50 % 너머까지, 더욱 바람직하게는 10 % 너머까지 감소시키지 않는다); (5) 본 발명 VEGF-결합 분자의 임의의 다른 바람직한 특징에 영향을 주지 않는 그러한 방식으로, 하나 이상의 아미노산 위치에 PEG화된 임의의 바이파라토픽 VEGF-결합 분자를 포괄한다는 것에 주의해야 한다. 적합한 PEG-그룹 및 특이적으로 또는 비특이적으로 그들을 부착하는 방법은 당업자에게 분명할 것이다. 또한 폴리펩티드의 PEG화를 위한 다양한 시약은, 예를 들면 Nektar Therapeutics사, USA, 또는 NOF Corporation, Japan의 Sunbright®EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, 및 ME Series, 또는 Sunbright®ME-100MA, Sunbright®ME-200MA, 및 Sunbright®ME-400MA로부터 상업적으로 이용가능하다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 PEG화된 폴리펩티드는 40 kDa 또는 60 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEG의 하나의 PEG 모이어티를 포함하고, 여기에서 PEG 모이어티는 링커 영역 및 특히, 서열번호 172에 나타낸 바와 같은 GS9-링커 펩티드 위치 5, 서열번호 174에 나타낸 바와 같은 GS27-링커 펩티드 위치 14, 서열번호 175에 나타낸 바와 같은 GS35-링커 펩티드 위치 15 또는 서열번호 176에 나타낸 바와 같은 35GS-링커 펩티드 위치 5의 Cys 잔기 내 폴리펩티드에 부착된다.

본 발명의 VEGF-결합 분자는 다음 화학식에 나타낸 바와 같이 상기 언급된 바와 같은 PEG 시약 중 하나, 예를 들면 "Sunbright®ME-400MA"로 PEG화 될 수 있다:

또 다른 측면으로, 본 발명은 본 발명의 VEGF-결합 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 이러한 핵산 분자는 "본 발명의 핵산"으로서 명세서에서 언급될 것이고 또한 명세서에서 정의된 바와 같이 게놈 구성체의 형태일 것이다. 본 발명의 핵산은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA (예를 들면 목표로 하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현에 특이적으로 순응된 코돈 사용법을 갖는 DNA )일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산은 상기에 정의된 바와 같이 본질적으로 분리된 형태이다.

본 발명의 핵산은 벡터, 예를 들면 플라스미드, 코스미드 또는 YAC와 같은 벡터의 형태일 수 있거나, 벡터 내에 존재할 수 있고/거나 벡터에 일부일 수 있다. 벡터는 특히 발현 벡터, 즉 비트로 및/또는 인 비보에서 (즉 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템 내에서) VEGF-결합 분자의 발현을 위해 제공되는 벡터 일 수 있다. 그러한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 적합한 조절 구성요소, 예를 들면 프로모터, 인헨서, 터미네이터 및 이와 유사한 것과 작동적으로 연결될 수 있는 본 발명의 핵산을 적어도 하나 포함한다. 특정한 숙주에서 특정한 서열의 발현 관점에서 그러한 구성요소 및 그것의 선택은 일반적으로 당업자에게 인식되어 있다. 본 발명 VEGF-결합 분자의 발현에 유용하고 필수적인 조절 구성요소 및 다른 구성요소, 예를 들면 프로모터, 인헨서, 터미네이터, 인테그레이션(integration) 인자, 선택 마커, 리더 서열, 리포터(reporter) 유전자 및 이와 유사한 것의 특정한 예는 예를 들면 WO2006/040153의 131 내지 133쪽에 개시된다.

명세서에 주어진 본 발명의 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여 본 발명의 핵산은 그 자체가 알려지 방식 (예를 들면, 자동 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술)으로 제조되거나 얻어질 수 있고/있거나 적합한 자연의 공급원으로부터 분리될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 VEGF-결합 분자를 발현할 수 있는/있거나 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주세포에 관한 것이다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포이고; 다른 유용한 세포는 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유동물 세포이다.

적합한 박테리아 세포는 Escherichia coli , Proteus, 및 Pseudomonas의 균주와 같은 그람-음성 박테리아 균주 및 Bacillus , Streptomyces , Staphylococcus, 및 Lactococcus의 균주와 같은 그람-양성 박테리아 균주의 세포를 포함한다. 적합한 진균류 세포는 Trichoderma , Neurospora 및 Aspergillus종의 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 Saccharomyces (예를 들면 Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (예를 들면 Schizosaccharomyces pombe), Pichia (예를 들면 Pichia pastoris 및 Pichia methanolica), 및 Hansenula . 종의 세포를 포함한다.

적합한 포유동물 세포는 예를 들면 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질 발현의 기술분야에 사용되는 임의의 다른 세포도 사용될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 VEGF-결합 분자 를 제조하는 방법을 추가로 제공하고, 이러한 방법은 일반적으로 하기의 단계를 포함한다:

- 본 발명 VEGF-결합 분자를 발현하게 하는 조건 하에서 VEGF-결합 분자를 코딩할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;

- 숙주 세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 배양기로부터 회수 또는 분리하는 단계; 및

- 본 발명의 VEGF-결합 분자를 임의로 추가 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계.

산업적 규모의 생산을 위해, 바람직한 숙주 유기체는 큰 규모의 발현, 생산 및 발효, 및 특히 큰 규모의 약제학적 발현, 생산 및 발효에 적합한 E.　coli, Pichia pastoris , 및 S. cerevisiae 균주를 포함한다.

특이적 발현 시스템의 선택은 특정한 번역후 변형, 더욱 구체적으로 글리코실화에 대한 요구에 일부 의존한다. 바람직하거나 또는 요구되는 글리코실화를 위한 본 발명의 VEGF-결합 분자 생산은 발현된 단백질을 글리코실화하는 능력을 갖는 포유동물의 발현 숙주의 사용을 필요로 할 수 있다. 이러한 측면에서, 얻어지는 글리코실화 패턴 (즉, 부착되는 잔기의 종류, 수 및 위치)은 발현에 사용되는 세포 또는 세포 라인에 의존할 것이라는 것은 당업자에게 명확할 것이다.

본 발명의 VEGF-결합 분자는 상기 제시된 바와 같이 세포 내 (예를 들면 세포기질, 주변세포질 또는 봉입체 내)에서 생산된 다음 숙주 세포로부터 분리되고 임의로 추가 정제될 수 있거나; 또는 그들은 세포 외 (예를 들면, 숙주 세포가 배양된 배지)에서 생산된 다음 배양 배지로부터 분리되고 임의로 추가 정제될 수 있다.

폴리펩티드의 재조합 생산에 사용되는 방법 및 시약, 예를 들면 특정한 적합한 발현 벡터, 형질전환 또는 형질감염 방법, 선택 마커, 단백질 발현 유도 방법, 배양 조건, 및 이와 유사한 것은 기술분야에 알려져 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드 제조 방법에 유용한 단백질 분리 및 정제 기술도 당업자에게 잘 알려져 있다.

추가적인 측면으로, 본 발명은 서열번호 9 내지 57 또는 서열번호 58-127로부터 선택되는 아미노산 서열, 각각을 갖는 항-VEGF-VHH 내에 함유된 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

이러한 펩티드는 본 발명의 VHH로부터 유도된 CDR3와 대응한다. 그것, 특히 그것을 코딩하는 핵산 분자는 면역글로불린 사슬 내 CDR3를 대체하기 위한 CDR 이식, 또는 비면역글로불린 스캐폴드, 예를 들면 단백질 분해효소 저해제 또는, DNA-결합 단백질, 시토크롬 b562, 나선-번들 단백질, 이황화-결합 펩티드, 리포칼린 또는 안티칼린 내로의 CDR 삽입으로 그러한 스캐폴드에 타겟-결합 특질을 부여하는데 유용하다. CDR-이식 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고 예를 들면 인간화 항체 (보통 인간 항체의 Fv 프레임워크상에 설치류 항체의 CDR을 이식하는 것을 포함)에 널리 사용된다.

본 발명의 CDR3를 함유하는 면역글로불린 또는 비면역글로불린 스캐폴드를 얻기 위해, 그러한 분자를 코딩하는 DNA는 분자 생물학의 표준 방법, 예를 들면 유전자 합성, 올리고뉴클레오티드 어닐링(annealing) 또는 예를 들면 Daugherty et al., 1991, Nucleic acid Research, Vol. 19, 9, 2471-2476에 기술된 중첩 PCR 단편의 수단에 의해 얻어질 수 있다. VHH CDR3를 비면역글로불린 스캐폴드 내로 삽입하는 방법은 Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13, 1882 - 1891에 기술되어 있다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 VEGF-결합 분자 및 임의로 하나 이상의 이러한 그 자체가 알려진, 즉 의도된 조성물의 용도에 따른 이러한 조성물의 추가적 구성요소를 함유하거나 또는 포함하는 제품 또는 조성물에 관한 것이다.

약제학적 용도를 위해, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 적어도 하나의 본 발명의 VEGF-결합 분자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제, 및 임의로 하나 이상의 추가적 약제학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약제학적 제제 또는 조성물로서 조제될 수 있다. 비제한적 실시예의 수단에 의해, 이러한 제제는 경구 투여, 비경구 투여 (예를 들면, 정맥주사, 근육내주사 또는 피하주사 또는 정맥 인퓨전), 국소 투여, 흡입에 의한 투여, 피부 패취, 임플란트, 좌약 등에 적합한 형태일 수 있다. 투여의 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는 이러한 적합한 투여 형태뿐만 아니라 그의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자에게 명확할 것이고 명세서에서 추가로 기술된다.

따라서, 추가적인 측면으로 본 발명은 적어도 하나의 VEGF-결합 분자, 특히 하나의 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제 (즉, 약제학적 용도에 적합한 것), 및 임의로 하나 이상의 추가적 활성 물질을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 VEGF-결합 분자는 그 자체가 알려진 임의의 적합한 방식으로 조제되고 투여될 수 있다: 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대하여, 예를 들면 WO04/041862, WO04/041863, WO04/041865, WO04/041867 및 WO08/020079뿐만 아니라 표준 편람, 예를 들면 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21^th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); 또는 the Handbook of Therapeutic 항체 (S.　Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 를 참고한다 (예를 들면 252-255쪽 참조).

예를 들면, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 종래의 항체 및 항체 단편 (ScFv's 및 이중체를 포함) 및 다른 약제학적으로 활성인 단백질에 관해 그 자체가 알려진 임의의 방식으로 조제되거나 또는 투여될 수 있다. 이러한 제제 및 이를 제조하기 위한 방법은 당업자에게 분명할 것이고, 예를 들면 비경구 투여 (예를 들면, 정맥, 복강내, 피하, 근육내, 내벽, 동맥내 또는 척추강내 투여) 또는 국소 투여 (즉 경피 또는 피내 투여) 에 적합한 제제를 포함한다.

비경구 투여용 제제는 인퓨젼 또는 주사에 적합한, 예를 들면 멸균용액, 현탁액, 분산제 또는 에멀젼일 수 있다. 그러한 제제에 적합한 담체 또는 희석제는, 예를 들면 멸균수 및 약제학적으로 허용가능한 수용성 버퍼 및 용액, 예를 들면 생리학적 인-버퍼(buffered) 살린, Ringer's 용액, 덱스트로스 용액, 및 Hank's 용액; 수유(water oils); 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들면 프로필렌 글리콜 또는 광유, 동물성 기름 및 식물성 기름, 예를 들면 땅콩 기름, 대두 기름뿐만 아니라 이의 적합한 혼합물을 포함하나, 이에 한하지 않는다. 보통, 수용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다.

따라서, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 예를 들면, 경구로, 약제학적으로 허용가능한 비히클, 예를 들면 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와의 조합으로 전신적으로 투여될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 하나 이상의 부형제와 조합될 수 있고 섭취가능한 정제, 버칼정(buccal tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭서(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer), 및 이와 유사한 것과 조합의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 0.1%의 본 발명의 VEGF-결합 분자를 함유해야한다. 물론, 조성물 및 제제에서 그것의 퍼센티지는 다양할 수 있고 주어진 유닛 투여 형태의 중량의 약 2 내지 약 60% 사이의 알맞은 퍼센티지일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물에 있어서 본 발명 VEGF-결합 분자의 양은 효과적인 투여량 수준이 얻어질 정도의 양이다.

정제, 필(pill), 캡슐, 및 이와 유사한 것은 예를 들면 WO08/020079의 143-144쪽에 언급된 것과 같은 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제 및 감미제 또는 착향제를 함유할 수 있다. 유닛 투여 형태가 캡슐인 경우, 그것은 상기 타입의 물질에 추가적으로, 식물성 기름 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅으로 존재하거나 또는 아니면 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형할 수 있다. 예를 들면, 정제, 필, 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 셸락(shellac) 또는 당 및 이와 유사한 것으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 본 발명의 VEGF-결합 분자, 감미제로서 수크로스 또는 프럭토스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지향 착향제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 유닛 투여 형태의 제조에 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 허용가능하고 이용되는 양이 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 서방형 제제 및 기구에 내장될 수 있다.

경구 투여를 위한 제제 및 조제물은 또한 본 발명의 구성체가 위의 환경을 견디고 장으로 통과하도록 장용 코팅으로 제공될 수 있다. 더욱 일반적으로, 경구 투여를 위한 제제 및 조제물은 임의의 원하는 위장기관의 일부로 전달하기 위해 적합하게 조제될 수 있다. 또한, 적합한 좌제가 위장기관 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 VEGF-결합 분자는 또한 WO08/020079의 144 및 145쪽에 추가로 기술된 바와 같이 인퓨젼 또는 주사에 의해 정맥 내로 또는 복강 내로 투여될 수 있다.

본 발명의 VEGF-결합 분자를 국소 투여하기 위해, WO08/020079의 145쪽에 추가로 기술된 바와 같이, 고체 또는 액체일 수 있는 조성물 또는 조제물, 피부과적으로 허용되는 담체와의 조합으로서 피부에 그것을 투여하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다.

일반적으로, 로션과 같은 액체 조성물에서 본 발명 VEGF-결합 분자의 농도는 약 0.1-25 wt%, 바람직하게 약 0.5-10 wt%일 것이다. 젤 또는 파우더와 같은 반고체 또는 고체 조성물에서 농도는약 0.1-5 wt%, 바람직하게는 약 0.5-2.5 wt%일 것이다.

치료에 사용하기 위해 요구되는 본 발명 VEGF-결합 분자의 양은 선택된 특정한 VEGF-결합 분자에 따라 다양할 뿐 만 아니라 투여의 경로, 치료되는 상태의 본질 및 환자의 연령 및 상태에 따라 다양할 것이고, 궁극적으로는 담당 의사 또는 임상의의 재량에 달려있을 것이다. 또한, 본 발명의 VEGF-결합 분자 투여는 타겟 세포, 종양, 조직, 이식 또는 기관에 따라 다양하다.

바람직한 투여량은 단일 투여량 또는 적당한 간격, 예를 들면, as 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 서브-투여량(sub-dose)으로 투여되는 분리된 투여량으로서 알 맞게 존재할 수 있다. 서브-투여량 그 자체는 예를 들면, 수많은 개별적 적당한 공간에의 (loosely spaced) 투여; 예를 들면 취입기(insufflator)로부터 다수 흡입 또는 안구에 복수의 드롭(drop) 적용으로 추가 분리될 수 있다.

투여 식이요법은 장기의(long-term) 일일 치료를 포함할 수 있다. "장기"란 적어도 2주 및 바람직하게는 수주일, 수개월, 또는 수년의 기간을 의미한다. 이러한 투여량 범위의 필수적인 변형은 명세서에서 시사된 관용적 실험만을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA 참조. 또한, 투여량은 임의의 합병증 현상에 있어서 개개의 의사에 의해 조정될 수 있다.

추가적인 구체예에 따르면, 본 발명은 예를 들면,

- VEGF-결합 분자에 의한 Notch 신호전달 경로의 조정에 의해 예방, 치료 또는 경감될 수 있는 혈관신생에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 특히, 인간에서의 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 및/또는 경감;

- 적어도 하나의 본 발명 VEGF-결합 분자, 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물의 약제학적으로 활성인 양을 이를 필요로하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이러한 치료요법이 필요한 환자를 치료하는 방법;

- 혈관신생에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 경감용 약제의 제조;

- 상기 목적에 사용되는 약제학적 조성물 또는 약제의 활성 성분에 의한 치료적 목적을 위한 VEGF-결합 분자, 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도에 관한 것이다.

구체적인 측면에 따르면, 상기 장애, 질환 또는 상태는 명세서에서 정의된 바와 같은 암 또는 암성 질환.

또 다른 측면에 따르면, 질환은 VEGF-결합 분자에 의한 Notch 신호전달 경로의 조정에 의해 치료 또는 경감될 수 있는 혈관신생에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 안질환이다.

치료될 암성 질환에 따라, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 그것 단독 또는 특히 DNA 손상 제제와 같은 화학요법 제제 또는 암세포에서 혈관신생, 신호전달 경로 또는 유사분열 검사점을 저해하는 치료적으로 활성인 화합물로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 치료적 제제와의 조합에 사용될 수 있다.

추가적인 치료적 제제는 임의로 동일한 약제학적 제제의 성분과 동시에 또는 VEGF-결합 분자의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.

특정한 구체예에서 (또한 각각의 리간드를 포함하는 수용체의 경우에서) 추가적인 치료적 제제는, EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK 및 PI3 키나아제, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R 또는 IR의 저해제 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 저해제일 수 있으나, 이에 한하지 않는다.

또한, 추가적인 치료적 제제의 예는 CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90의 저해제, 헤지호그(hedgehog) 길항제, JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, 프로테아좀, Rho의 저해제, wnt 신호전달의 저해제 또는 유비퀴틴화(ubiquitination) 경로의 저해제 또는 Notch 신호전달 경로 또 다른 저해제이다.

Aurora 저해제의 예는 PHA-739358, AZD-1152, AT　9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735이나, 이에 한하지 않는다.

PLK 저해제의 예는 GSK-461364이다.

raf 저해제의 예는 BAY-73-4506 (또한 VEGFR 저해제), PLX　4032, RAF-265 (또한 VEGFR 저해제), 소라페닙(sorafenib) (또한 VEGFR 저해제), 및 XL 281이다.

KSP 저해제의 예는 이스피네십(ispinesib), ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK　246053A, GSK-923295, MK-0731, 및 SB-743921이다.

src 및/또는 bcr-abl 저해제의 예는 다사티닙(dasatinib), AZD-0530, 보수티닙(bosutinib), XL　228 (또한 IGF-1R 저해제), 닐로티닙(nilotinib) (또한 PDGFR 및 cKit 저해제), 이마티닙(imatinib) (또한 cKit 저해제), 및 NS-187이다.

PDK1 저해제의 예는 BX-517이다.

Rho 저해제의 예는 BA-210이다.

PI3 키나아제 저해제의 예는 PX-866, BEZ-235 (또한 mTor 저해제), XL　418 (또한 Akt 저해제), XL-147, 및 XL 765 (또한 mTor 저해제)이다.

cMet 또는 HGF의 저해제의 예는 XL-184 (또한 VEGFR, cKit, Flt3의 저해제), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (또한 VEGFR의 저해제), MGCD-265 (또한 VEGFR, Ron, Tie2의 저해제), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, 및 AV-299이다.

c-Myc 저해제의 예는 CX-3543이다.

Flt3 저해제의 예는 AC-220 (또한 cKit 및 PDGFR의 저해제), KW　2449, 레스아우르티닙(lestaurtinib) (또한 VEGFR, PDGFR, PKC의 저해제), TG-101348 (또한 JAK2의 저해제), XL-999 (또한 cKit, FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제), 수니티닙(sunitinib) (또한 PDGFR, VEGFR 및 cKit의 저해제), 및 탄두티닙(tandutinib) (또한 PDGFR, 및 cKit의 저해제)이다.

HSP90 저해제의 예는 타네스피마이신(tanespimycin), 알베스피마이신(alvespimycin), IPI-504 및 CNF 2024이다.

JAK/STAT 저해제의 예는 CYT-997 (또한 튜뷸린(tubulin)과 상호작용), TG　101348 (또한 Flt3dml 저해제), 및 XL-019이다.

Mek 저해제의 예는 ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330, 및 XL 518이다.

mTor 저해제의 예는 템시롤리무스(temsirolimus), AP-23573 (또한 VEGF 저해제로서 작용), 에베롤리무스(everolimus) (또한 VEGF 저해제), XL-765 (또한 PI3　키나아제 저해제), 및 BEZ-235 (또한 PI3 키나아제 저해제)이다.

Akt 저해제의 예는 페리포신(perifosine), GSK-690693, RX-0201, 및 트리키리빈(triciribine)이다.

cKit 저해제의 예는 AB-1010, OSI-930 (또한 VEGFR 저해제로서 작용), AC-220 (또한 Flt3 및 PDGFR의 저해제), 탄두티닙(tandutinib) (또한 Flt3 및 PDGFR의 저해제), 악시티닙(axitinib) (또한 VEGFR 및 PDGFR의 저해제), XL-999 (또한 Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR의 저해제), 수니티닙(sunitinib) (또한 Flt3, PDGFR, VEGFR의 저해제), 및 XL-820 (또한 VEGFR- 및 PDGFR 저해제로서 작용), 이마티닙(imatinib) (또한 bcr-abl 저해제), 닐로티닙(nilotinib) (또한 bcr-abl 및 PDGFR의 저해제)이다.

헤지호그 길항제의 예는 IPI-609 및 CUR-61414이다.

CDK 저해제의 예는 셀리키킵(seliciclib), AT-7519, P-276, ZK-CDK (또한 VEGFR2 및 PDGFR 저해), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509, 및 AG 024322이다.

프로테아좀 저해제의 예는 보르테조밉(bortezomib), 카르필조밉(carfilzomib), 및 NPI-0052 (또한 NFkappaB의 저해제)이다.

NFkappaB 경로 저해제의 예는 NPI-0052이다.

유비퀴닌화 경로 저해제의 예는 HBX-41108이다.

바람직한 구체예에서, 추가적인 치료적 제제는항-맥관형성 제제이다.

항-맥관형성 제제의 예는 FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제 또는 각각의 리간드 (예를 들면 페갑타닙(pegaptanib)과 같은 VEGF 저해제 또는 항-VEGF 항체 베바시주맙(bevacizumab)), 항-EGFL7 MAb 와 같은 EGFL7 저해제, AMG386와 같은 앙기오포이에틴(angiopoietin)1/2 저해제 및 탈리도마이드(thalidomide)이고, 이러한 제제는 베바시주맙(bevacizumab), 모테사닙(motesanib), CDP-791, SU-14813, 텔라티닙(telatinib), KRN-951, ZK-CDK (또한 CDK의 저해제), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (면역조절 의약), 탈리도마이드 유도체 CC-4047, 레날리도마이드(lenalidomide), ENMD　0995, IMC-D11, Ki 23057, 브리바닙(brivanib), 세디라닙(cediranib), XL-999 (또한 cKit 및 Flt3의 저해제), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (또한 Flt3의 저해제), 수니티닙(sunitinib) (또한 cKit 및 Flt3의 저해제), 악시티닙(axitinib) (또한 cKit의 저해제), 레스타우르티닙(lestaurtinib) (또한 Flt3 및 PKC의 저해제), 바칼라닙(vatalanib), 탄두티닙(tandutinib) (또한 Flt3 및 cKit의 저해제), 파보파닙(pazopanib), GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, 소라페닙 토실레이트(sorafenib tosylate) (또한 Raf의 저해제), RAF-265 (또한 Raf의 저해제), 반데타닙(vandetanib), CP-547632, OSI-930, AEE-788 (또한 EGFR 및 Her2의 저해제), BAY-57-9352 (또한 Raf의 저해제), BAY-73-4506 (또한 Raf의 저해제), XL 880 (또한 cMet의 저해제), XL-647 (또한 EGFR 및 EphB4의 저해제), XL 820 (또한 cKit의 저해제), 및 닐로티닙(nilotinib) (또한 cKit 및 brc-abl의 저해제)으로부터 선택되나, 이에 한하지 않는다.

또한 추가적인 치료적 제제는 EGFR 저해제로부터 선택될 수 있고, 그것은 작은 분자 EGFR 저해제 또는 항-EGFR 항체일 수 있다. 항-EGFR 항체의 예는, 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 마투주맙(matuzumab)이고; 작은 분자 EGFR 저해제의 예는 제피티닙(gefitinib)이나, 이에 한하지 않는다. EGFR 조절제의 또 다른 예는 EGF 융합 독소이다.

본 발명의 VEGF-결합 분자와 조합하는데 유용한 EGFR 및 Her2 저해제는 라파티닙(lapatinib), 제피티닙(gefitinib), 에르로티닙(erlotinib), 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 반데타닙(vandetanib) (또한 VEGFR의 저해제), 페르투주맙(pertuzumab), XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (또한 VEGFR의 저해제), ARRY-333786, IMC-11F8, 제맙(Zemab)이 있다.

본 발명의 VEGF-결합 분자에 의한 치료요법에 유리하게 조합될 수 있는 다른 제제는 토시투무맙(tositumumab) 및 입리투모맙 티우섹탄(ibritumomab tiuxetan) (2개의 방사선표지된 항-CD20 항체), 알렘투주맙(alemtuzumab) (항-CD52 항체), 데노수맙(denosumab), (용골세포 분별 인자 리간드 저해제), 갈릭시맙(galiximab) (CD80 길항제), 오파투무맙(ofatumumab) (CD20 저해제), 자놀리무맙(zanolimumab) (CD4 길항제), SGN40 (CD40 리간드 수용체 조절제), 리툭시맙(rituximab) (CD20 저해제), 마파투무맙(mapatumumab) (TRAIL-1 수용체 길항제), REGN421(SAR153192) 또는 OMP-21M18 (Dll4 저해제)이다.

본 발명의 VEGF-결합 분자와 조합하는데 사용될 수 있는 다른 화합요법 의약은 호르몬, 호르몬 유사 및 항호르몬 (예를 들면 타목시펜(tamoxifen), 토레미펜(toremifene), 라록시펜(raloxifene), 풀베스트란트(fulvestrant), 메게스트롤 아세테이트(megestrol 아세테이트), 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 시프로테론 아세테이트(cyproterone 아세테이트), 피나스테라이드(finasteride), 부세레린 아세테이트(buserelin 아세테이트), 플루드로코르티손(fludrocortisone), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 옥느레오타이드(octreotide), 아르족시펜(arzoxifene), 파시레오타이드(pasireotide0, 바프레오타이드(vapreotide)), 아로마타제(aromatase) 저해제 (예를 들면 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole), 리아로졸(liarozole), 엑세메스탄(exemestane), 아타메스탄(atamestane), 포르메스탄(formestane)), LHRH 작용제 및 길항제 (예를 들면 고세렐린(goserelin) 아세테이트, 루프로라이드(leuprolide), 아바렐릭스(abarelix), 세트로엘릭스(cetrorelix), 데스로렐린(deslorelin), 히스트렐린(histrelin), 트립토렐린(triptorelin)), 항대사성물질 (예를 들면 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed)와 같은 엽산길항제, 5 플루오로우라실, 카페시타빈(capecitabine), 데시타빈(decitabine), 넬라라빈(nelarabine) 및 젬시타빈(gemcitabine)과 같은 피리미딘 유사체, 메르캅토퓨린 티오구아닌, 클라드리빈(cladribine) 및 펜토스타틴(pentostatin)과 같은 퓨린 및 아데노신 유사체, 시타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine)); 항종양 항생제 (예를 들면 독소루비신, 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin)과 같은 안트라사이클린, 미토마이신-C, 블레오마이신 닥티노마이신, 필리카마이신, 미토잔트론, 픽산트론, 스트렙토조신); 플래티늄 유도체 (예를 들면 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 로바플라틴, 사트라플라틴); 알킬화 제제 (예를 들면 에스트라무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부칠, 부술판, 다카르바진, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 하이드록시우레아, 테모볼로미드, 카르므스틴 및 로무스틴과 같은 니트로소우레아, 티오테파); 항유사분열 제제 (예를 들면 빈블라스틴(vinblastine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈플루닌(vinflunine) 및 빈크리스틴(vincristine)와 같은 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid); 및 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 및 그의 제제, 라로탁셀(larotaxel)과 같은 탁산(taxanes); 시모탁셀(simotaxel), 및 익사베필론(ixabepilone), 파투필론(patupilone), ZK-EPO와 같은 에포틸론(epothilone)); 토포아이소머라제 저해제 (예를 들면 에토포시드(etoposide) 및 에토포포스(etopophos)와 같은 에피포도필로(epipodophyllo0독소, 테니포시드(teniposide0, 암사크린(amsacrine), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 및 아미포스틴(amifostine), 아나그렐라이드(anagrelide), 인터페론 알파, 프로카르바진(procarbazine), 미토탄(mitotane) 및 포르피머와 같은 기타 화학요법제, 벡사로텐(bexarotene), 셀레콕시브(celecoxib)로부터 선택되나, 이에 한하지 않는다.

본 발명의 VEGF-결합 분자 또는 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 조성물의 효율은 인 비트로 어세이, 세포-기초 어세이, 인 비보 어세이 및/또는 그 자체가 알려진 동물 모델, 또는 임의의 이의 조합에서 특정한 관심 질환 또는 장애에 따라 임의의 적합한 것을 사용하여 테스트될 수 있다. 적합한 어세이 및 동물 모델은 당업자에게 분명할 것이고, 예를 들면 명세서에서 기술된 어세이, 예를 들면 증식 어세이와 같이 하기 실시예에서 사용된 에세이를 포함한다.

본 발명의 실험에서 얻어진 데이터는 본 발명의 VEGF-결합 분자가 선행 기술의 VEGF-결합 분자의 그것에 비하여 우수한 특질을 갖는다는 것을 확인한다. 그러한 특징 중에는, 예를 들면 도 1 및 표 3의 ELISA 데이터뿐만아니라 도 3, 17, 18 및 표 7에 나타난 바와 같은 AlphaScreen 어세이에서의 VHH에 대한 IC₅₀ (nM) 값; 및 표 9, 10 및 도 5-1 및 5-2의 재조합 인간 VEGF 및 마우스 VEGF에 대한 정제된 VHH의 친화력 K_D (nM)에서 얻어질 수 있는 VEGF165-VEGFR2 상호작용의 완전한 저해 및 낮은 IC50이 있다. 또한, 표 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 VEGF 결합제는 HUVEC 증식 어세이에서 높은 역가 즉, 나노몰범위 이하의 역가를 갖는다. 이것은 본 발명의 VEGF-결합 분자가 캔디데이트(candidate)가 암과 같은 혈관신생에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 질환 및 장애에서 치료적 효율을 가질 것이라는 것을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면,

a) 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 VEGF-결합 분자와 샘플을 접촉하는 단계,

b) 상기 샘플에 대한 상기 VEGF-결합 분자의 결합을 검출하는 단계, 및

c) 표준과 단계 (b)에서 검출된 결합을 비교하는 단계를 포함하는 질환의 진단 방법이 제공되고, 여기에서 상기 샘플과 비교하여 결합의 차이는 혈관신생에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 질환 또는 장애의 진단이다.

이것 및 다른 용도를 위해, 예를 들면 특이적 결합 쌍, 예를 들면 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍의 하나의 부분인 기능적 그룹의 도입에 의해 본 발명의 VEGF- 결합 분자를 추가로 변형하는 것은 유용할 것이다. 그러한 기능적 그룹은 본 발명의 VEGF-결합 분자를 또 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 결합 쌍의 다른 절반에 결합된 화학적 화합물에, 결합 쌍의 형성을 통해서 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 VEGF-결합 분자는 비오틴에 컨쥬게이트될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘과 컨쥬게이트된 또 다른 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 신호-생성 제제가 아비딘 또는 스트렙타비딘과 컨쥬게이트되는 경우 그러한 컨쥬게이트된 본 발명의 VEGF-결합 분자는, 예를 들면 진단 시스템에 리포터로서 사용될 수 있다.

도 1: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 단가 VHH (ELISA)
도 2: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 단가 VHH (ELISA)
도 3: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 단가 VHH (AlphaScreen)
도 4: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단하는 정제된 단가 VHH (AlphaScreen)
도 5-1 및 5-2: 재조합 인간 및 마우스 VEGF에 대한 단가 VHH의 결합 (ELISA)
도 6: 인간 VEGF121에 대한 단가 VHH의 결합
도 7-1 내지 7-4: 정제된 VHH는 VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PlGF에 결합하지 않는다.
도 8-1 및 8-2: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단하는 형식화된 VHH (ELISA)
도 9-1 및 9-2: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단하는 형식화된 VHH (ELISA)
도 10: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단하는 형식화된 VHH (AlphaScreen)
도 11: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단하는 형식화된 VHH (AlphaScreen)
도 12: mVEGF164/mVEGFR2-Fc 상호작용을 차단하는 형식화된 VHH (AlphaScreen)
도 13-1 및 13-2: 형식화된 VHH는 마우스 및 인간 VEGF에 결합한다.
도 14-1 내지 14-8: 형식화된 VHH는 VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PlGF에 결합하지 않는다.
도 15: 형식화된 VHH는 VEGF121에 결합한다.
도 16: 인간 VH3/JH 생식세포 합치 서열을 갖는 VHH VEGFBII23B04의 서열 배열
도 17: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단하는 VEGFBII23B04의 VHH 변형체 (AlphaScreen)
도 18: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단하는 VEGFBII23B04의 서열-최적화된 클론 (AlphaScreen)
도 19: 인간 VH3/JH 생식세포 합치 서열을 갖는 VHH VEGFBII5B05의 서열 배열

재료 및 방법:

a) VEGF109 의 생산 및 기능성 테스트

인간 혈관 내피 성장 인자 아형 VEGF165 (GenBank: AAM03108.1; AA 잔기 27-135)의 수용체 결합 도메인을 코딩하는 cDNA를 pET28a 벡터 (Novagen, Madison, WI) 내로 클로닝하고 His-태그된 불용성 단백질에 의해 E.coli (BL21 Star DE3) 내에서 과발현한다. 1 mM의 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 37℃에서 4시간 동안 계속되도록 한다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 세포 펠릿(pellet)의 초음파 분해에 의해 세포를 용해시킨다. 봉입체를 전기영동에 의해 분리한다. 1%　Triton X 100 (Sigma-Aldrich)에 의한 세척 단계 후, 단백질을 7.5M 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 용해시키고 6M에서 0M까지 우레아 농도를 감소시켜 버퍼를 사용하는 하룻밤 연속 순회 투석에 의해 재폴딩(refolding)한다. 재폴딩된 단백질을 MonoQ5/50GL (Amersham BioSciences) 칼럼을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한 다음, Superdex75 10/300 GL 칼럼 (Amersheim BioSciences)을 사용하여 젤 여과한다. 단백질의 순도 및 균질성을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏에 의해 확인한다. 또한, VEGFR1, VEGFR2 및 베바시주맙(Bevacizumab)에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 모니터한다. 이것의 말기에, 1 ㎍/mL의 재조합 인간 VEGF109를 96-웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)내 4℃ 에서 하룻밤동안 고정한다. 웰은 카세인 용액 (1%)에 의해 차단한다. VEGFR1, VEGFR2 또는 베바시누맙을 연속 희석액을 VEGF109 코팅된 플레이트에 첨가하고 알칼린 포스파타제 (AP) 컨주게이트된 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) 및 차후의 기질 PNPP (p-니트로페닐포스페이트) (Sigma-Aldrich)의 존재하에 효소 반응을 사용하여 결합을 검출한다. VEGF109는 VEGFR1, VEGFR2 및 베바시누맙에 결합할 수 있었고, 이는 생성된 VEGF109가 활성임을 나타낸다.

b) VEGF165 의 KLH 컨쥬게이션 및 KLH - 컨쥬게이트된 VEGF165 의 기능성 테스트

재조합 인간 VEGF165 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 제조설명서에 따라 mcKLH (Pierce, Rockford, IL, USA)에 의해 Imject Immunogen EDC 키트를 사용하여 바다양식의 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin) (mcKLH)에 컨쥬게이션 한다. 폴리펩티드의 mcKLH에 대한 효율적 컨쥬게이션을 SDS-PAGE로 확인한다. 컨쥬게이트된 단백질의 기능성을 ELISA에 의해 체크한다: 2 ㎍/mL의 KLH 컨쥬게이트된 VEGF165를 96-웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 4℃로 하룻밤동안 고정한다. 웰을 카세인 용액 (1%)으로 차단한다. VEGFR1 또는 VEGFR2 연속 희석액을 첨가하고 고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제 (HRP)-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) 및 차후의 기질 TMB (3,3',5,5'-tetramentylbenzidine) (Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재하에 효소 반응을 사용하여 결합을 검출한다. KLH 컨쥬게이트된 단백질은 VEGFR1, VEGFR2 및 베바시주맙과 여전히 상호작용할 수 있었고, 이것은 VEGF165상의 대응하는 에피토프가 여전히 접근가능하다는 것을 확인한다.

실시예 1

상이한 VEGF 형식으로의 면역화는 라마에서 체액성 면역 반응을 유발한다

1.1 면역화

수의학과 교수 윤리 위원회의 승인 후(Ghent대, 벨기에), 재조합 인간 VEGF 109를 표준 프로토콜에 따라 6회 근육 내 주사(일주일 간격으로 100 또는 50 ㎍/투여)하여 면역화하였다. 0일째의 1회 주사액은 Complete Freund 보조제(Difco, Detroit, MI, USA)로 제형화하였고, 후속 주사는 Incomplete Freund 보조제(Difco, Detroit, MI, USA)로 제형화하였다. 또한, 4개의 라마(지정번호 234, 235, 280 및 281)를 다음의 프로토콜에 따라 면역화하였다: KLH-컨쥬게이션된 인간 VEGF165(2주 간격으로 100 또는 50 ㎍/투여)으로 5회 근육 내 주사 후, 인간 VEGF109로 4회 근육 내 주사(100 ㎍을 1회째 투여 후 2주 후 일주일 간격으로 3회 50 ㎍/투여)

1.2 라마에서 VEGF -유발 면역 반응의 평가

VEGF 특이적 혈청 역가를 모니터하기 위하여, 2　㎍/mL의 재조합 인간 VEGF165 Ehsms VEGF109를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 하룻밤 동안 4 ℃에서 고정화하였다. 웰을 카세인 용액(1%)로 차단하였다. 혈청 희석액을 첨가한 후, 결합된 전체 IgG를 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-라마 면역글로불린(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) 및 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘) 기질의 존재 하에서의 후속 효소 반응을 이용하여 검출하였다. 라마 264, 265, 266 및 267의 경우, VEGF165 및 VEGF109에 대한 이소타입-특이적 반응을 평가하는 추가 ELISA를 수행하였다. 이소타입-특이적 반응을 보통의 라마 IgG1 및 중쇄만의 라마 IgG2 및 IgG3를 특이적으로 인식하는 마우스 mAB를 이용하여 검출한 후[Daley et al. (2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386] 토끼 항-마우스-HRP 컨쥬게이트(DAKO)를 이용하여 검출하였다. TMD를 발색 기질로 이용하여 ELISA를 현상하고 흡광도는 450nm에서 측정하였다. 각각의 라마의 혈청 역가를 표 1에 나타냈다.

실시예 2

중쇄만의 항체 단편 레파토리의 클로닝 및 파지의 제조

최종 항원 주사 후, 중쇄 항체를 생산하는 B세포 공급원으로서의 면역 조직을 면역화된 라마로부터 수집하였다. 한 마리당 최종 항원 주사 후 4일 및 8일 째 2개의 150ml의 혈액 샘플을 수집하고, 최종 항원 주사 후 4일 째 1개의 림프절 생검을 수집하였다. 혈액 샘플로부터, 말초혈 단핵구(PBMC)를 제조설명서에 따라 Ficoll-Hypaque를 이용하여 제조하였다(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). PBMC 및 림프절 생검으로부터, WO05/044858에 기재된 바와 같이 DNA 절편을 코딩하는 VHH를 증폭하기 위한 RT-PCR용 출발물질로 사용하기 위하여 전체 RNA를 추출하였다. 각각의 면역화된 라마에 대해, 그 동물의 모든 수집된 면역 조직으로부터 분리된 전체 RNA를 풀링하여 라이브러리를 제조하였다. 간단히 말해, 특정 제한효소 사이트를 통해 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이가 용이하도록 디자인된 벡터로 클로닝하였다. 벡터를 pUC119로부터 유래한 것이고 LacZ 프로모터, M13 파지 gIII 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카베니실린 저항정 유전자, 복수의 클로닝 사이트 및 하이브리드 gIII-pelB 선구 서열(pAX050)을 함유한다. VHH 코딩 서열을 갖는 프레임에서, 벡터는 C-말단 c-myc 표지 및 His6 표지를 코딩한다. 파지를 표준 프로토콜에 따라 제조하고 이후에 사용하기 위하여 4 ℃에서 필터 멸균하였다.

실시예 3

파지 디스플레이를 통한 VEGF -특이적 VHH 의 선발

복수의 선발 조건을 적용한 상이한 선발 전략에서 VHH파지 라이브러리를 사용하였다. i) VEGF 단백질 형식(rhVEGF165, rhVEGF109 또는 rmVEGF164), ii) 항원 제시 방법(고체상: 직적 코팅 또는 Neutravidin-코팅된 플레이트 상에 비오틴-표지; 용액 중 배양 후 Neutravidin-코팅된 플레이트에서 캡쳐링), iii) 항원 농도 및 iv) 용리 방법(트립신 또는 VEGFR2를 이용한 경쟁적 용리)를 변수로 포함하였다. 모든 선발은 Maxisorp 96-웰 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 수행하였다.

선발은 다음과 같이 수행하였다: 파지 라이브러리를 가변 농도의 VEGF 항원으로, 용액 또는 고체 담지체 상에 고정시켜 상온에서 배양하였다. 배양 및 광범위한 세척 2시간 후, 결합된 파지를 용리시켰다. 파지 용리에 트립신이 사용된 경우, 프로테아제 활성을 0.8mM 프로테아제 저해제 또는 AEBSF를 첨가하여 즉시 중성화하였다. 백그라운드에 대해 부화를 나타내는 파지 산출물을 사용하여 E.　 coli를 감염시켰다. 감염된E. coli 세포를 다음번의 선발을 위한 파지를 제조하기 위하여 사용하거나(파지 레스큐), 개별 VHH 클론의 분석을 위해 아가 플레이트(LB+amp+glucose² ^%)에 플레이팅하였다. 특이적 바인더에 대한 선발 산출물을 스크리닝하기 위하여, 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 피킹하고 1mL의 96-딥웰 플레이트에서 배양하였다. LacZ-조절된 VHH 발현을 IPTG(0.1-1mM 최종)를 첨가하여 인덕션시켰다. 표준적 방법에 따라 주변세포질 추출물(~ 80 ㎕ 부피)을 제조하였다.

실시예 4

VEGF -결합 및 VEGF 수용체-차단 VHH 의 확인

주변세포질 추출물을 ELISA에 의해 인간 VEGF165에 대한 결합을 테스트하였다. 간단히 말해, 2　㎍/mL의 재조합 인간 VEGF165를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 하룻밤 동안 고정하였다. 웰을 카세인 용액(1%)으로 차단하였다. 보통 10배 희석된 주변세포질 추출물을 첨가한 후, VHH 결합을 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-HRP 컨쥬게이트 (DAKO)를 이용하여 검출하였다. 백그라운드보다 >3배의 ELISA 시그널을 나타내는 클론은 VEGF 결합 VHH로 간주하였다.

또한, 주변세포질 추출물을 인간 VEGF165/인간 VEGFR2 AlphaScreen어세이(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)으로 스크리닝하여 VHH의 차단 능력을 평가하였다. 인간 VEGF165를 Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 비오틴화하였다. 인간 VEGFR2/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 제조설명서(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)에 따라 항-인간 Fc VHH 수용체 비드에 커플링된 항-인간 Fc VHH를 이용하여 캡쳐링하였다. VHH의 중성화 능력을 평가하기 위하여, 주변세포질 추출물을 0.03 % Tween 20(Sigma-Aldrich)를 함유하는 PBS 버퍼 중 1/25로 희석하고, 상온에서 15분간 0.4nM의 비오틴화된 인간 VEGF165로 예비 배양하였다. 이 혼합물에 수용체 비드(10 ㎍/ml) 및 0.4 nM VEGFR2-huFc를 첨가하고, 상온의 암소에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 도너 비드(10 ㎍/ml)를 첨가한 후, 상온의 암소에서 1시간 동안 배양하였다. 680nm의 들뜬 파장 및 520nm 및 620nm의 방출 파장을 이용하여 Envision Multi label 플레이트 리더 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)에서 리딩(reading) 플레이트에 의해 형광을 측정하였다. 무관한 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 음성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군의 시그널 대비 60% 이상의 형광 시그널을 감소시킬 수 있는 항-VEGF165 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 히트(hit)로서 확인하였다. AlphaScreen에서 확인된 모든 히트를 경쟁 ELISA에서 확인하였다. 마지막으로, 1 ㎍/mL의 인간 VEGFR2 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 코팅하였다. 주변포질 추출물의 5배 희석액을 0.1% 카세인 및 0.05%의 Tween 20(Sigma-Aldrich)를 함유하는 PBS 버퍼 중 고정된 농도(4nM)의 비오틴화된 인간 VEGF165의 존재 하에서 배양하였다. 인간 VEGFR2 키메라가 코팅된 플레이트에의 이들 VHH/bio-VEGF165 복합체의 결합을 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이션된 엑스트비딘(Sigma, St Louis, MO, USA)을 이용하여 검출하였다. VHH 서열 번호 및 이에 상응하는 VEGF-결합(비-수용체-차단) VHHs의 아미노산 서열 및 저해성(수용체-차단) VHHs를 표 2 및 표 3에 각각 열거하였다.

저해성 VHH의 분리 분리속도를 Biacore (Biacore T100 instrument, GE Healthcare)를 통해 분석하였다. HBS-EP+ 버퍼를 런닝버퍼로 사용하였고 25℃에서 실험을 수행하였다. (EDC 및 NHS을 이용한) 아민 커플링을 통해 +/- 1500RU의 타겟 수준까지 CM5 센서 칩에 비가역적으로 캡쳐하였다. 면역화 후, 표면을 1M 에탄올아민 pH 8.5를 10분간 주사하여 불활성화시켰다. VHH의 주변세포질 추출물을 런닝 버퍼 중 10배 희석액으로 2분간 45㎕/분의 속도로 주사하고 10 또는 15분간 분리되도록 하였다. 2개의 샘플 사이에서, 표면을 재생 버퍼로 재생시켰다. 데이터를 레퍼런스 채널 및 블랭크 런닝 버퍼 주사의 곡선을 뺌으로써 2중 레퍼런스화하였다. 처리된 곡선을 Biacore T100 Evaluation 소프트웨어 v2.0.1.에서 2상 디케이(decay)모델을 핏팅함으로써 평가하였다. k_d-빠름, k_d-느림 및 % 빠름 값을 표 4에 열거하였다.

실시예 5

정제 VHH 의 특성화

3개의 저해성 항-VEGF VHH를 추가 특성화를 위하여 정제된 단백질 상태로 선발하였다: VEGFBII23B04, VEGFBII24C4 및 VEGFBII23A6. 이들 VHH를 E. coli TG1에서 c-myc, His6-태그 단백질로 발현하였다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 37℃에서 4시간 동안 더 배양하였다. 세포 배양 후, 주변세포질 추출물을 펠릿을 동결건조하여 제조하였다. 이들 추출물을 출발물질로 IMAC 및 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 VHH를 정제하였다. 최종 VHH 제조물은 SDS-PAGE를 통해 판정한 결과 95%의 순도를 나타냈다.

5.1 인간 VEGF165 /인간 VEGFR2 - Fc 차단 ELISA 에서 인간 VEGF165 / VEGFR2 차단 VHH 의 평가

VHH의 차단능력을 인간 VEGF165/인간 VEGFR2-Fc 차단 ELISA에서 평가하였다. 요약하면, 1 ㎍/mL의 VEGFR2-Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma)를 함유하는 PBS 버퍼 중 일련의 정제된 VHH의 희석액(농도 범위 1mM-64pM)을 4nM의 비오티닐화된 VEGF165의 존재 하에서 배양하였다. 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이션된 엑스트라비딘 및 TMB를 기질로 사용하여 VEGF2에 대한 생-VEGF165의 잔류하는 결합을 검출하였다. 대조군으로 Bevacizumab(Avastin®) 및 Ranibizumab(Lucentis®)으로 하였다. 투여 저해 곡선을 도 1에 나타냈고; 이에 대한 IC₅₀ 값 및 % 저해를 표 5에 요약하였다.

5.2 인간 VEGF165 /인간 VEGFR1 - Fc 차단 ELISA 에서 인간 VEGF165 / VEGFR2 차단 VHH의 평가

VHH를 인간 VEGF165/인간 VEGFR1-Fc 차단 ELISA에서도 평가하였다. 요약하면, 1 ㎍/mL의 VEGFR1-Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma)를 함유하는 PBS 버퍼 중 일련의 정제된 VHH의 희석액(농도 범위 1mM-64pM)을 4nM의 비오티닐화된 VEGF165의 존재 하에서 배양하였다. 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이션된 엑스트라비딘 및 TMB를 기질로 사용하여 VEGF1에 대한 생-VEGF165의 잔류하는 결합을 검출하였다. 대조군으로 Bevacizumab, Ranibizumab 및 무관한 VHH(2E6)로 하였다. 투여 저해 곡선을 도 2에 나타냈고; 이에 대한 IC₅₀ 값 및 % 저해를 표 6에 요약하였다.

5.3 인간 VEGF165 /인간 VEGFR2 - Fc 차단 AlphaScreen 에서 항- VEGF165 VHH 의 평가

VHH의 차단능력을 인간 VEGF165/인간 VEGFR2-Fc 차단 AlphaScreen에서도 평가하였다. 요약하면, 0.03% Tween 20(Sigma)를 함유하는 PBS 버퍼 중 일련의 정제된 VHH의 희석액(농도 범위 200nM-0.7pM)을 4pM의 생-VEGF165에 첨가하고 15분간 배양하였다. 이어서, VEGFR2-Fc(0.4nM) 및 항-Fc VHH-코팅된 수용체 비드(20 ㎍/ml)를 첨가하고 그 혼합물을 암소에서 1시간 동안 배양한 후, 흡광도를 Envison 마이크로플레이트 리더에서 측정하였다. 투여-반응 곡선을 도 3에 나타냈다. VHH 차단에 대한 IC₅₀값 및 인간 VEGF165-인간 VEGFR2-Fc 상호작용을 표 7에 요약하였다.

5.4 인간 VEGF165 /인간 VEGFR1 - Fc 차단 AlphaScreen 에서 항- VEGF165 VHH 의 평가

VHH의 차단능력을 인간 VEGF165/인간 VEGFR1-Fc 차단 AlphaScreen에서도 평가하였다. 요약하면, 0.03% Tween 20(Sigma)를 함유하는 PBS 버퍼 중 일련의 정제된 VHH의 희석액(농도 범위 500nM-1.80pM)을 4nM의 생-VEGF165에 첨가하고 15분간 배양하였다. 이어서, VEGFR1-Fc(1nM) 및 항-Fc VHH-코팅된 수용체 비드(20 ㎍/ml)를 첨가하고 그 혼합물을 암소에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 스트렙타비딘 공여체 비드(20　㎍/ml )를 첨가하고 암소에서 1시간 동안 배양한 후, 흡광도를 Envison 마이크로플레이트 리더에서 측정하였다. 투여-반응 곡선을 도 4에 나타냈다. VHH 차단에 대한 IC₅₀값 및 인간 VEGF165-인간 VEGFR1-Fc 상호작용을 표 8에 요약하였다.

5.5 인간 VEGF165 V HH 상호작용의 친화도 결정

hVEGF165를 갖는 VHH VEGFBII23B04의 결합 키네틱스를 biacore T100 기기의 SPR 에 의해 분석하였다. 재조합 인간 VEGF165를 (EDC 및 NHS를 이용한) 아민 커플링을 통해 CM5 칩에 직접 고정화하였다. VHH를 10 내지 360nM의 상이한 농도에서 분석하였다. 샘플을 2분 동안 주사하고 45 ㎕/분의 유속으로 20분까지 분리되도록 하였다. 샘플 주사 중간에, 칩 표면을 100mM HCL로 재생하였다. HBS-EP+ (Hepes buffer pH7.4 + EDTA)를 런닝버퍼로 사용하였다. 결합곡선을 biacore T100 Evaluation 소프트웨어 버전2.0.1에 의해 Two State Reaction 모델을 이용하여 피팅하였다. 항-VEGF VHH의 친화도 계산값을 표 9에 열거하였다.

5.6 마우스 VEGF164 에 대한 결합

마우스 VEGF164에 대한 교차결합을 결합 ELISA를 이용하여 결정하였다. 요약하면, 재조합 마우스 VEGF164 (R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)을 4℃에서 1 ㎍/mL로 96-웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 웰을 카세인 용액 (PBS 중 1%)으로 차단하였다. VHH를 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma)를 함유하는 PBS버퍼 중의 일련의 희석액(농도 범위: 500nM-32pM)로 적용하고, 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-HRP 컨주게이트(DAKO) 및 이어 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘) (Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재 하에서의 효소 반응을 이용하여 결합을 검출하였다(도 5-1 및 5-2). 마우스 VEGF164 반응성 mAb를 양성 대조군으로 포함시켰다. 참고로, 인간 VEGF165에 대한 결합을 또한 측정하였다. 표 10에 EC₅₀ 값을열거하였다.

5.7 VEGF121 에 대한 결합

재조합 인간 VEGF121에 대한 결합을 고체 상 결합 ELISA를 통해 평가하였다. 간단히, 재조합 인간 VEGF121 (R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany) 내 4℃에서 1 ㎍/mL로 하룻밤 동안 코팅하였다. 웰을 카세인 용액 (PBS 중 1%)으로 차단하였다. 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20 (시그마)를 함유하는 PBS 버퍼 내에서 (농도 범위: 500nM-32pM) VHH에 일련의 희석액을 적용하였고 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-HRP 컨주게이트(DAKO) 및 이어 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘) (Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재 하에서의 효소 반응을 이용하여 결합을 검출하였다 (도 6). VEGFR2의 일련의 희석액을 양성 대조군으로 포함시켰다. EC₅₀ 값을 표 11에 요약하였다.

5.8 VEGF 패밀리 구성원 VEGFB , VEGFC , VEGFD 및 PlGF 에의 결합

VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PlGF에의 결합을 고체상 결합 ELISA를 통해 측정하였다. 간단히, VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PlGF (R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany) 내 1 ㎍/mL로 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 웰을 카세인 용액 (PBS 중 1%)으로 차단하였다. VHH를 일련의 희석액 (농도 범위: 500nM-32pM)로 적용하였고 마우스 항-myc (Roche) 및 항-마우스-AP 컨쥬게이트 (Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 결합을 검출하였다. 적절한 수용체의 양성 대조군으로서 일련의 희석액을 포함시켰고 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) 및 이어서 기질 TMB (3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘) (Pierce, Rockford, IL, USA) 존재하 효소반응으로 검출하였다. VHH 및 대조군의 투여-반응 곡선을 도 7-1 내지 7-4에 나타내었다. 결과는 VEGFB, VEGFC, VEGFD 또는 PlGF에 대해 선택된 VHH의 검출될 수 있는 결합이 없음을 보여준다.

5.9 에피토프 결합

Biacore-기초 에피토프 결합 실험을 수행하여 VEGF 결합제가 VEGFBII23B04처럼 유사 또는 중첩 에피토프에 결합하는지 조사하였다. 이것이 끝날 무렵, VEGFBII23B04를 CM5 센서 칩상에 고정하였다. 각 샘플에 대하여, 인간 VEGF165를 칩 표면상에 통과시켰고 VEGFBII23B4에 의해 역으로캡쳐하였다. 그 다음, 정제된 VHH (100 nM) 또는 주변세포질 추출물 (1/10 희석된)을 240 초의 표면 접촉 시간 및 10 uL/분의 유속으로 주사하였다. 다른 샘플 간에, 표면을 재생성 버퍼 (100 mM HCl)로 재생성하였다. Biacore T100 Evaluation 소프트웨어로 진행 곡선을 평가하였다. VHH를 2개의 그룹으로 나눌 수 있었다: VEGFBII23B04 캡쳐된 VEGF165에 추가적 결합을 제공한 제1그룹 및 VEGFBII23B04 캡쳐된 VEGF165에 동시 결합할 수 없는 제2그룹. 표 12-A에 테스트된 VHH의 결합 에피토프를 요약하였다.

동일한 어세이 구성을 사용하여 VEGFR1, VEGFR2, Ranibizumab 및 Bevacizumab이 VEGFBII23B04와 함께 인간 VEGF-165에 동시에 결합할수 있는지 측정하였다. 표 12-B는 VEGFBII23B04-캡쳐된 VEGF165에 대한 추가적 결합 반응을 나타낸다. 단지 VEGFR2만 VEGFBII23B04-캡쳐된 VEGF165에 결합할 수 없었고, VEGF-VEGFR2 상호작용에 대한 VEGFBII23B04의 차단 능력이 저평가되었다. 또한, 이러한 데이터는 VEGFBII23B04 에피토프가 Bevacizumab 및 Ranibizumab 에피토프와 구별된다는 것을 보여준다.

5.10 HUVEC 증식 어세이에서 항- VEGF VHH 의 특징

선낵된 VHH의 효능을 증식 어세이로 평가하였다. 간단히, 1차 HUVEC 세포 (Technoclone)에 영양 공급을 하룻밤동안 중단한 다음, 4000 세포/웰을 96-웰 조직 배양 플레이트에 4회 접종하였다. 33ng/mL VEGF로 VHH의 부재 또는 존재하에 세포를 자극하였다. 증식률을 4일째에 [³H] 티미딘 혼성(Thymidine incorporation)에 의해 측정하였다. HUVEC 증식 어세이의 결과는 표 13에 나타내었다.

5.11 HUVEC Erk 인산화 어세이에서 항- VEGF VHH 의 특징

선택된 VHH의 효능을 HUVEC Erk 인산화 어세이로 측정하였다. 간단히, 1차 HUVE 세포에 혈청 공급을 하룻밤동안 중단한 다음, 5분 동안 10ng/mL VEGF로 VHH의 부재 또는 존재하에 자극하였다. PBS 중4%　포름알데하이드로 세포를 고정하였고 ERK 인산화 수준을 포스포ERK-특이적 항체 (항-포스포MAP 키나아제 pERK1&2, M8159, Sigma) 및 다중클론 토끼 항-마우스-면역글로불린-HRP 컨쥬게이트 (PO161, Dako)를 사용하는 ELISA 에 의해 측정하였다. 표 14에 나타난 바와 같이, VEGFBII23B04 및 Bevacizumab은 VEGF 유도 Erk 인산화를1nM 미만의 IC₅₀로 적어도 90%까지 저해하였다.

실시예 6

다가 항- VEGF 차단 VHH 의 발생

VHH VEGFBII23B04를 호모다이머 VHH (AA 서열, 표 15 참조)를 생성하는 VEGFBII23B04 또는 헤테로다이머 VHH를 생성하는 다른 VEGF 결합 VHH에 유전적으로 융합하였다. 헤테로다이머 VHH를 생성하기 위해, 10개의 독특한 VEGF 결합 VHH의 패널을 VEGFBII23B04 (AA 서열, 표 15 참조)에 대하여 2개의 다른 배향으로 9 또는 40 Gly-Ser 유연한 링커를 통해 연결하였다. 호모다이머 VEGFBII23B04 (VEGFBII010) 및 40 헤테로다이머 2가의 VHH를 c-myc, His6-태그된 단백질에 의해 E. coli TG1 내에서 발현하였다. 1　mM IPTG의 첨가에 의해 발현을 유도하였고 37℃에서 4시간 동안 계속하였다. 세포 배양액을 회전시킨 후, 주변세포질 추출물을 동결-융해(freeze-thawing) 펠릿에 의해 제조하였다. 이 추출물을 시작 물질로 사용하였고 VHH를 IMAC를 통해 정제하였으며 SDS-PAGE를 통해 측정한 바대로 90& 순도로 탈염하였다.

40개의 2가 VHH의 패널을 실시예 5.3 및 5.4에 기재된 된 바와 같이 VEGFR2 및 VEGFR1 차단 AlphaScreen 분석으로 테스트하였다. 저해능력 및 최대 저해수준을 갖는 5개의 최고 2가 VHH(VEGFBII021, VEGFBII022, VEGFBI023, VEGFBI024 및VEGFBII025)를 추가적인 특성화를 위해 선택하였다. 경쟁적 VEGFR2 및 VEGFR1 AlphaScreen에서 선택된 5개의 2가 VHH에 대한 스크리닝 결과의 개요를 표 16에 나타냈다.

실시예 7

제형화된 VHH 의 특성화

실시예 5.1, 5.2, 5.3 및 5.4에 기재된 바와 같이, VHHs VEGFBII010, VEGFBII021, VEGFBII022, VEGFBII023, VEGFBII024 및 VEGFBII025를 VEGFR2 및 VEGFR1 차단 ELISA(도 8-1 및 8-2 및 9, 표 17 및 표 18) 및 AlphaScreen 분석(도 10 및 11, 표 19 및 20).

또한, 형식화된 VHH를 mVEGF164/mVEGFR2-huFc 상호작용을 차단하는 그것의 능력에 대해 테스트하였다. 간단히, 0.03 % Tween 20 (시그마)를 함유하는 PBS 중의 정제된 VHH의 일련의 희석액 (농도 범위: 4M-14.5 pM)을 0.1 nM 비오틴화된 mVEGF164에 첨가하였고 15분 동안 배양하였다. 그 다음, 마우스 VEGFR2-huFc (0.1 nM) 및 항-huFc VHH-코팅된 수용체 비드(bead) (20 ㎍/ml)를 첨가하였고 이 혼합물을 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로, streptavidin 공여 비드 (20 ㎍/ml)를 첨가한 다음 배양 1시간 후, Envision 마이크로플레이트 리더로 형광을 측정하였다. 투여량-반응 곡선을 도 12에 나타내었다. 마우스 VEGF164/VEGFR2-hFC 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC₅₀ 값을 표 21에 요약하였다.

또한 형식화된 VHH가 mVEGF164 및 인간 VEGF165 (실시예 5.6; 도 13-1 및 13-2; 표 22); VEGF121 (실시예 5.7; 도　15; 표 23) VEGF 패밀리 구성원 VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PlGF (실시예 5.8; 도 14-1 내지 14-8) 에 결합하는 그들의 능력을 ELISA로 테스트하였다. 인간 VEGF165에 대한 결합 키네틱을 실시예 5.5에 기술된 바와 같이 분석하였다. K_D 값을 표 24에 열거하였다.

또한, VHHs VEGFBII010, VEGFBII022, VEGFBII024 및 VEGFBII025를 VEGF-매개 HUVEC 증식 및 Erk 인산화 어세이에서 테스트하였다.

선택된 형식화된 VHH의 효능을 증식 어세이로 평가하였다. 간단히, 1차 HUVEC 세포 (Technoclone)를 하룻밤동안 영양공급을 중단한 다음, 4000 세포/웰을 96-웰 조직 배양 플레이트에서 4회 접종하였다. 33ng/mL VEGF로 VHH의 부재 또는 존재하에 세포를 자극하였다. 4일째 [³H] 티미딘 혼성을 통해 증식률을 측정하였다. 형식화된 VHH 및 Bevacizumab이 1nM 미만 IC₅₀으로 90% 넘게 VEGF-유도 HUVEC 증식을 저해한다는 것을 입증하는 결과를 표 25에 나타내었다.

선택된 형식화된 VHH의 효능을 HUVEC Erk 인산화 어세이에서 측정하였다. 간단히, 1차 HUVE 세포에 하룻밤동안 혈청공급을 중단한 다음, 5분동안10ng/mL VEGF로 VHH의 부재 또는 존재하에서 세포를 자극하였다. 세포를 PBS 중 4% 포름알데하이드로 고정하였고 ERK 인산화 수준을 포스포ERK-특이적 항체 (항-phosphoMAP 키나아제 pERK1&2, M8159, Sigma) 및 다중클론 토끼 항-마우스-면역글로불린-HRP 컨쥬게이트 (PO161, Dako)를 사용하는 ELISA에 의해 측정하였다. 표 26에 나타낸 바와 같이, 형식화된 VHH 및 Bevacizumab은 VEGF 유도 Erk 인산화를 1nM 미만의 IC₅₀으로 90%를 넘게 저해하였다.

실시예 8

서열 최적화

8.1 VEGFBII23B04 의 서열 최적화

VEGFBII23B04의 아미노산 서열을 인간 생시세포 서열 VH3-23/JH5에 배열하였다, 도 16 참조 (서열번호: 179)

배열은 VEGFBII23B04가 레퍼런스 생식세포 서열에 대응하는 19개의 프레임워크 돌연변이체를 함유한다는 것을 보여준다. 위치 14, 16, 23, 24, 41, 71, 82, 83 및 108의 비-인간 잔기를 그것의 인간 생식세포 대응부분으로 치환을 위해 선택하였다. 8개 VEGFBII23B04 변형체 세트를 인간 잔기 이러한 위치에 인간 잔기의 다른 조합을 나르도록 생성하였다 (AA 서열을 표 27에 열거하였다). 1개의 추가적 변형체를 S60A 돌연변이의 도입에 의해 제거된 D59S60의 잠재적인 이성질화 부위 (CDR2 영역, 도 16 참조, 굵은 이탤릭체 잔기로 나타냄)로 구성하였다.

VEGF165/VEGFR2 AlphaScreen에서 이러한 변형체들을 정제된 단백질에 의해 특징화하였다 (실시예 5.3, 도 17). 각각의 클론의 녹는점 (T_m)을 Sypro Orange (Invitrogen)의 혼성에 따른 형광 시그날의 증가를 기초로 하는 열 이동 어세이로 결정하였다 (Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), pp289-298). 모체 VEGFBII23B04와 비교하는 경우 더 유사하거나 더 높은 VEGFBII23B04 및 T_m 값과 비교한 경우 모든 변형체는 비교가능한 IC₅₀을 나타냈다. 표 28에 9개의 테스트한 클론에서 pH 7에서의 IC₅₀ 값 및 T_m 값을 요약하였다.

2회 사이클에서, 선택된 부위 (D16G, S60A 치환 및 E1D 돌연변이)에서의 잠재적인 번역 후 변형을 피하기 위한 인간화 노력 (VEGFBII111G06) 및 돌연변이체로 부터의 내성 돌연변이체를 VEGFBII23B04로부터 유도된 서열-최적화 클론을 생성하도록 조합하였다: VEGFBII0037. 이러한 돌연변이는 효능에 있어서 작은 드롭과 관련될 수 있가 때문에, 1개의 추가 서열-최적화 변형체 (VEGFBII038)를 I82M 돌연변이를 제외하고 VEGFBII0037과 동일한 치환을 함유하는데 참여시켰다. 2개의 서열-최적화된 클론의 서열을 표 29에 열거하였다. VEGFBII0037 및 VEGFBII0038은 VEGF165/VEGFR2 차단 AlphaScreen에서 특징화 하였고 (실시예 5.3, Figure　18), 녹는점을 상기 기술된 바와 같은 열 이동 어세이로 결정하였으며 VEGF165에 결합에 대한 친화도를 Biacore에서 결정하였다 (실시예 5.5). 2 서열-최적화된 VHH의 전체적인 특징을 표　30에 나타내었다.

8.2 VEGFBII5B05 의 서열 최적화

VEGFBII5B05의 아미노산 서열을 인간 생식세포 서열 VH3-23/JH5에 대해 배열하였다 (도 19 참조, 서열번호: 179). 배열은 VEGFBII5B05가 레퍼런스 생식세포 서열에 대응되는15 프레임워크 돌연변이체를 함유한다는 것을 보여준다. 위치 23, 60, 83, 105, 108의 비-인간 잔기를 그것의 인간 생식세포 대응부분으로 치환되도록 선택한 44의 히스티딘을 글루타민으로 치환되도록 선택하였다. 1개의 인간화 변형체가 6개의 기술된 돌연변이체를 나르도록 구성하였다 (AA 서열을 표 31에 열거하였다).

위치 M30에 잠재적인 산화 부위로 구성된 1개의 추가적인 변형체 (CDR1 영역, 굵은 이탤릭체 잔기로 나타낸 도 19 참조)를 M30I 돌연변이의 도입에 의해 제거하였다. 두개의 변형체를 ProteOn을 사용하여 hVEGF165에 결합하는 그것의 능력을 측정하였다. 간단히, GLC ProteOn 센서 칩을 인간 VEGF165로 코팅하였다. 변형체의 주변세포질 추출물을 1/10로 희석하였고 인간 VEGF165로 코팅된 칩을 통과하여 주사하였다. 오프-율을 계산하였고 모체 VEGFBII5B05의 오프율과 비교하였다. 2개 변형체의 오프율은 모든 돌연변이체가 내성임을 나타내는 모체 VEGFBII5B05의 오프율 범위와 동일하였다 (표　32).

서열-최적화된 클론 VEGFBII037 및 VEGFBII038의 효능을 증식 어세이에서 측정하였다. 간단히, 1차 HUVEC 세포 (Technoclone)에 하룻밤 동안 영양 공급을 중단한 다음, 4000 셀/웰을 96-웰 조직 배양 플레이트 4회 접종하였다. 33ng/mL VEGF를 갖는 VHH의 부재 또는 존재하에 세포를 자극하였다. 4일째에 [³H] 티미딘(Thymidine) 혼성(incorporation)에 의해 증식률을 측정하였다. 결과는 표 35에 나타내었고, 모체 VHH VEGFBII23B04의 활성 (효능 및 저해 정도)이 서열 최적화된 클론 VEGFBII038에서 보존된다는 것을 입증한다.

SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> VEGF-BINDING MOLECULES <130> 12-0319-pct <160> 179 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be Gly, Ala or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa may be Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be Asp or Glu <400> 1 Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa 1 5 10 15 Tyr <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 2 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Gly Asp Thr Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 3 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 4 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 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Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Phe Ile Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 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Leu Gly Asp Thr 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asp Ser Val Ser Leu Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Ala Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Tyr Asp Ser Val Ser Leu Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Phe Ile Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Asn Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Tyr Asp Ser Val Ser Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Pro Asp Thr 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 18 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 19 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Phe Ile Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 20 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Tyr Asp Ser Val Ser Leu Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 21 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 21 Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Tyr Asp Ser Val Ser Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 22 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Ser Gly Asn Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Lys Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Gly Asp Thr 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 23 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Asp Ser Val Ser Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Arg Ala Tyr 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glama sequence <400> 56 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 57 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama glama sequence <400> 57 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly 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lama glama sequences <400> 132 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ile Phe Ser Asn Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Arg Ile Ser Ser Gly Gly Gly Phe Thr 180 185 190 Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn 195 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210 215 220 Ser Val Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys 225 230 235 240 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 245 250 255 Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg 260 265 270 Leu Ala Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 275 280 285 Ser Ser 290 <210> 166 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences <400> 166 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ala Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Phe Arg Arg Thr Pro Gly Lys Glu Asp Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Trp Thr Tyr Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Ala Gly Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ala Gln Ser Asp Arg Tyr Asn Ile Arg Ser Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe 180 185 190 Ser Ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg 195 200 205 Glu Phe Val Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val 210 215 220 Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr 225 230 235 240 Val Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 245 250 255 Tyr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala 260 265 270 Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 285 <210> 167 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences <400> 167 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Pro Pro Val Gly His Phe Ala Asn Tyr Ala Pro Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Ala Gly Arg Thr Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe 180 185 190 Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val Ala Ile Ser Lys 195 200 205 Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile 210 215 220 Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu 225 230 235 240 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Tyr 245 250 255 Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln 260 265 270 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 168 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences <400> 168 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Thr Arg Ser Ser Thr Ile Val Val Gly Val Gly Gly Met Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 165 170 175 Gln Thr Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr 180 185 190 Phe Ser Ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu 195 200 205 Arg Glu Phe Val Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser 210 215 220 Val Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn 225 230 235 240 Thr Val Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 245 250 255 Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu 260 265 270 Ala Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 275 280 285 Ser <210> 169 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 169 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 170 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 171 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 171 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 172 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 173 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 173 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 174 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 174 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 <210> 175 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 175 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 176 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker <400> 176 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 177 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama glama sequence <400> 177 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 178 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 179 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105

Claims

각각 4개의 프레임워크 영역 및 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고 60% 이상의 저해율로 인간 재조합 VEGF165와 인간 재조합 VEGFR-2의 상호작용을 차단할 수 있는 VEGF-결합 분자로서, 여기에서
- 상기 CDR1은 아미노산 서열 SYSMG (표 29에 있는 서열번호 56 또는 57의 CDR1)을 갖고;
- 상기 CDR2는 아미노산 서열 AISKGGYKYDAVSLEG (표 29에 있는 서열번호 56 또는 57의 CDR2)를 가지며;
- 상기 CDR3은 아미노산 서열 SRAYGSSRLRLADTYEY (표 29에 있는 서열번호 56 또는 57의 CDR3; 서열번호 4에 상응)을 가지는 것인, VEGF-결합 분자.
제1항에 있어서, 서열번호 56 또는 서열번호 57을 포함하는 VEGF-결합 분자.
제1항에 있어서, 서열번호 56 또는 서열번호 57로 이루어진 VEGF-결합 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 VEGF-결합 분자를 코딩하는 핵산 분자.
제4항의 핵산 분자를 함유하는 벡터.
제4항의 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
유효 성분으로서 적어도 하나의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 VEGF-결합 분자를 함유하는, 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관화, 각막 이식 신생혈관화, 각막 이식 거부, 망막 신생혈관화, 맥락막 신생혈관화, 앵글(angle)의 신생혈관화 및 안구 신생혈관 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 안질환 치료용 약제학적 조성물.
유효 성분으로서 적어도 하나의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 VEGF-결합 분자를 함유하는, 암 또는 암성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 암 또는 암성 질환은 상피성 암, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 VEGF-결합 분자의 제조방법으로서,
- 상기 VEGF-결합 분자의 발현을 허용하는 조건 하에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 VEGF-결합 분자를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
- 배양물로부터 상기 숙주 세포에 의해 발현된 상기 VEGF-결합 분자를 회수 또는 분리하는 단계를 포함하는 방법.
제10항에 있어서, VEGF-결합 분자를 추가로 정제 또는 변형 또는 제형화하는 단계를 더 포함하는 방법.
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