CN103209995B

CN103209995B - Vegf结合分子

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Publication number: CN103209995B
Application number: CN201180052278.8A
Authority: CN
Inventors: A.格希温德; E.伯格斯; J.伯克尼厄; E.德塔维尼尔; J.柯尔克曼; P.麦切尔斯
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2031-09-02
Also published as: JP5979504B2; US20220363744A1; AU2011298281A1; IL224800B; EP2727939A3; CL2013000596A1; EP2727939A2; CA2808696A1; US20180201671A1; AU2011298281B2; EA201300311A1; CN103209995A; MX353813B; KR20130101045A; US20240141030A1; EP2611830A1; EA029277B1; NZ607394A; US20200308267A1; WO2012028716A1

Abstract

本发明涉及一种VEGF结合分子，优选VEGF结合的免疫球蛋白单一可变域(如VHH及域抗体)，含有其的药物组合物及其在治疗与VEGF所介导血管发生的效应相关的疾病中的用途。编码VEGF结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。

Description

VEGF结合分子

技术领域

本发明涉及人治疗的领域，尤其是癌症治疗的领域，以及适于该治疗中的药物和组合物。

现有技术

如US2008/0014196及WO2008101985中所概述，血管生成涉及于大量疾病(包括实体瘤及转移)及眼病的发病机制中。最重要的促血管生成因子之一为血管内皮生长因子(VEGF)，亦称作VEGF-A或血管渗透因子(VPF)。VEGF属于包括胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及VEGF-F的基因家族。人VEGF的单一基因的mRNA的交替剪接产生至少六种同种型(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206)，VEGF165系最丰富的同种型。

已识别两种与VEGF相互作用的VEGF酪氨酸激酶受体(VEGFR)，即VEGFR-1(亦称作FIt-1)及VEGFR-2(亦称作KDR或FIK-1)。VEGFR-1对VEGF具有最高亲和性，而VEGFR-2对VEGF具有稍微较低亲和性。Ferrara(EndocrineRev.2004，25:581-611)提供VEGF的详细说明，与其受体的相互作用及其在正常及病理过程中的功能可参见Hoeben等人Pharmacol.Rev.2004，56:549-580。

已报导VEGF为正常及异常两种血管发生的关键调控子(Ferrara及Davis-Smyth，EndocrineRev.1997，18:4-25；FerraraJ.MoLMed.1999，77:527-543)。与促进血管形成过程的其它生长因子相比，VEGF在对血管系统内的内皮细胞的高特异性中是独特的。

VEGFmRNA由大多数人肿瘤过表达。在肿瘤生长的情形下，血管发生似乎对自增殖至赘瘤形成的转变、及为肿瘤的生长及转移提供营养至关重要(Folkman等人，1989，Nature339-58)，其容许肿瘤细胞与正常细胞相比获得生长优势。因此，抗血管发生疗法已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。所述疗法聚焦于阻断VEGF途径(Ferrara等人，NatRevDrugDiscov.2004年5月；3(5):391-400)。

VEGF亦与眼病有关。VEGF在眼液中的浓度与患有糖尿病及其它缺血相关性视网膜病变的患者中的血管的活性增殖的存在高度相关。此外，最近研究已证实VEGF在受年龄相关性黄斑变性(AMD)侵袭的患者中的脉络膜新生血管膜中的定位。亦在各种炎性病症中观察到VEGF上调。VEGF与RA(血管发生在其中起到显著作用的一种炎性疾病)的致病机理相关。

VEGF及其在血管发生及不同过程中的作用的阐明，已提供治疗性干预的潜在新目标。VEGF的功能受阻断或防止VEGF受体酪氨酸激酶活化的小分子抑制(Schlaeppi及Wood，1999，CancerMetastasisRev.，18:473-481)且因此干扰VEGF受体信号转导途径。含有细菌或植物毒素的细胞毒性缀合物(conjugate)可抑制VEGF对肿瘤血管发生的刺激效应。例如，VEGF-DT385毒素缀合物(与VEGF165融合或化学缀合的白喉毒素域)有效抑制活体内肿瘤生长。肿瘤生长抑制亦可由逆转录病毒通过递送FIk-1突变体或可溶性VEGF受体而达成。

已开发中和VEGF的抗体(例如A4.6.1及MV833)用以阻断VEGF结合其受体，且其已显示临床前抗肿瘤活性(Kim等人，Nature1993，362:841-844；FolkmanNat.Med.1995，1:27-31；Presta等人CancerRes.1997，57:4593-4599；Kanai等人，Int.J.Cancer1998，77:933-936；Ferrara及AlitaloNat.Med.1999，5:1359-1364；320，340)。关于治疗性抗VEGF方法试验的综述，参见CampochiaroandHackett(Oncogene2003，22:6537-6548)。

已利用A4.6.1(亦称作贝伐单抗)(Genentech，SanFrancisco，CA)获得大多数临床经验。

WO2008101985阐述来自骆驼的、结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域(本文所定义VHH或“”)，及其在治疗特征在于过度和/或病理性血管发生或新血管形成的病状及疾病中的用途。

本发明的一个目的是提供新颖的改进的VEGF结合分子。

本发明的另一目的是提供预防、治疗、减轻和/或诊断所述疾病、病症或病状的方法，其包括使用和/或所述药物及组合物。特别是，本发明的目的是提供与目前所用和/或本领域中已知药物、组合物和/或方法相比提供优势的所述药理活性药物、组合物和/或方法。所述优势包括例如出于制造目的、尤其与上述常规抗VEGF抗体或其片段相比改进的治疗和/或药理性质和/或其它有利性质。

更特别是，本发明的目的是提供新颖的VEGF结合分子，且特别是结合哺乳动物VEGF、尤其是人VEGF的VEGF结合分子，其中所述分子或多肽适于本文所述治疗及诊断目的。本发明的另一目的是提供特异性结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域。

发明概述

根据第一方面，提供VEGF结合分子、优选结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域(如VHH及域抗体)。

在另一方面中，本发明涉及编码VEGF结合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主细胞。

本发明还涉及含有或包含本发明的至少一种VEGF结合分子及任选所述组合物的一或多种其它组份的产物或组合物。

本发明还涉及制备或生成本文所述VEGF结合分子、核酸、宿主细胞、产物及组合物的方法。

本发明还涉及本发明所述VEGF结合分子、核酸、宿主细胞、产物及组合物的应用及用途，以及预防和/或治疗与VEGF所介导血管发生的效应相关的疾病的方法。

本发明的所述及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得明确。

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(第2版),第1-3卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；Lewin,“GenesIV”，OxfordUniversityPress,NewYork,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),GowerMedicalPublishing,London,NewYork(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别例如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。

如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层(sandwich)组成。

如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“骨架区1”或“FR1”、“骨架区2”或“FR2”、“骨架区3”或“FR3”、及“骨架区4”或“FR4”的四个“骨架区”组成的免疫球蛋白域；所述骨架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”中断。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域正是因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。

如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH域”(或简称为“VHH”)。

鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)、或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，与抗原的各别表位发生结合通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域，而是通过共同结合各别抗原的表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VHVL对。

“VHH域”，亦称为VHH、V_HH域、VHH抗体片段和VHH抗体，已最初描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC,AtarhouchT,MuyldermansS,RobinsonG,HamersC,SongaEB,BendahmanN,HamersR.:“Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflightchains”；Nature363,446-448(1993))。已经选择术语“VHH域”以将所述可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“V_H域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“V_L域”或“VL域”)进行区分。VHH域特异性结合表位而没有无其他抗原结合域(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。

在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、V_HH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及“”及“域”(“Nanobody”为AblynxN.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构且无需第二免疫球蛋白可变域的存在即可特异性结合表位)，且其由例如WO2009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmarkresidue)”与VH域区分。

如例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods231,25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的VHH域所应用的免疫球蛋白单一可变域(例如VHH)的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法来编号(“Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”,USPublicHealthServices,NIHBethesda,MD,公开案第91号)。根据该编号法，

-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，

-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，

-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，

-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，

-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，

-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且

-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。

然而应注意，如本领域中对于V_H域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。

对V_H域的氨基酸残基进行编号且还可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号。

VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。

获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于例如WO2006/040153及WO2006/122786中。亦如其中所详述，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人源化”(本文中亦称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH域可含有一个或多个完全人骨架区序列，且在一甚至更具体实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任选与JH序列(例如JH5)合并的人骨架区序列。

域抗体，亦称为“Dab”及“dAb”(术语“域抗体(DomainAntibodies)”及“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已公开于例如以下文献中：Ward,E.S.,等人:“BindingactivitiesofarepertoireofsingleimmunoglobulinvariabledomainssecretedfromEscherichiacoli”；Nature341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domainantibodies:proteinsfortherapy”；TRENDSinBiotechnology21(11):484-490(2003)；及WO2003/002609。

域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL域序列的文库对所述抗原结合性质进行具体选择。

如同VHH的域抗体的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。

此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。

可互换使用的术语“表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。

可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和性”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单一可变域，或一般而言之抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为关于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。在上下文中，VEGF结合分子也可称为“VEGF中和”分子。

一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合分子的亲和性和/或亲抗原性(avidity)确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(K_D)所表示的亲和性，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：K_D值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和性也可表示为亲和性常数(K_A)，其为1/K_D)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以以本身已知方式测定亲和性。亲抗原性为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者有关：与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。抗原结合分子识别表位的部分称为互补位。

除非另有说明，否则术语“VEGF结合分子”包括如本文定义的抗VEGF抗体、抗VEGF抗体片段、“抗VEGF抗体样分子”、及与上述任一者的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单克隆抗体。术语“抗体”涵盖通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白(如单克隆抗体)、以及结合VEGF的抗体片段或“抗体样分子”，包括单链抗体及线型抗体，例如描述于WO02/056910中的所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)；抗VEGF抗体样分子包括如本文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。

“VEGF结合分子”或是指以下两者：结合VEGF的单价分子(即与VEGF的一个表位结合的分子)，以及二价或多价结合分子(即结合一个以上表位的结合分子，例如如下文定义的“双互补位”分子)。含有一个以上结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域的VEGF结合分子亦称为“格式化(formatted)”VEGF结合分子，其在结合VEGF的组分内除结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域外也可包含连接子和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或连接聚合物(如PEG)。

如本文所用的术语“双互补位VEGF结合分子”或“双互补位免疫球蛋白单一可变域”将是指包含如本文定义的第一免疫球蛋白单一可变域及第二免疫球蛋白单一可变域的VEGF结合分子，其中两个分子结合VEGF的两个不同的(即非重叠的)表位。本发明的双互补位多肽由对于表位具有不同特异性的免疫球蛋白单一可变域构成。识别表位的抗原结合分子(例如抗体或本发明的免疫球蛋白单一可变域)的部分称为互补位。

即使是次优选的格式化VEGF结合分子，也可包含识别相同或重叠表位的两个相同的结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域或两个不同免疫球蛋白单一可变域。在此情况下，所述两个免疫球蛋白单一可变域可与形成VEGF二聚体的两个单体中的相同或重叠表位结合。

通常，本发明的VEGF结合分子将以如于Biacore或KinExA分析中测量的10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且甚至更优选10E-11至10E-13的解离常数(K_D)，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，例如至少10E11ME-1的缔合常数(K_A)结合。任何大于10E-4M的K_D值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的K_D结合所要结合的抗原(即VEGF)。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchardanalysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwichcompetitionassay))及本领域中本身已知的其不同变化形式。

氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如根据WO98/49185，其中保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。

例如相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，在其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中其通常与之相关的其他组分分离时，多肽或核酸分子视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的多肽或核酸分子优选基本上为均质的。

两个VEGF结合分子序列之间的“序列一致度”指示序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO08/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同或表达保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。

对V_H域的氨基酸残基进行编号并且也可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号。

“亲和性成熟”的VEGF结合分子，特别是VHH或域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对VEGF的亲和性相比于其各自的亲本VEGF结合分子有所增加。本发明的亲和性成熟的VEGF结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人,1992,Biotechnology10:779-783或Barbas,等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813.；Shier等人,1995,Gene169:147-155；Yelton等人,1995,Immunol.155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人,1992,J.MoI.Biol.226(3):889896；KSJohnson及REHawkins,“Affinitymaturationofantibodiesusingphagedisplay”，OxfordUniversityPress1996。

对于本发明，除非另有说明，则“SEQIDNO:x的氨基酸序列”包括：

a)与各别SEQIDNO:x中所显示的序列100%一致的氨基酸序列；

b)与各别SEQIDNO:x中所示序列具有至少80%氨基酸一致度的氨基酸序列；

c)与各别SEQIDNO:x中所示序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理症状。可用本发明的VEGF结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。如US2008/0014196中表明用VEGF拮抗剂治疗的所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌(livercancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。所述病症包括非肿瘤性症状及肿瘤性症状两者。肿瘤性病症包括但不限于上述病症。

非肿瘤性病症包括但不限于如US2008/0014196中所述用VEGF拮抗剂治疗的不欲或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增殖性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增殖(retrolentalfibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocularneovasculardisease))、血管再狭窄(vascularrestenosis)、动静脉畸形(arteriovenousmalformations，AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增殖(包括格雷夫氏病(Grave'sdisease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primarypulmonaryhypertension)、恶性肺积液(malignantpulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closedheadinjury)/外伤相关)、滑液炎症、RA中的血管翳形成(pannusformation)、骨化性肌炎(myositisossificans)、肥大性骨形成(hypertropicboneformation)、骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycysticovariandisease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第3间隔体液疾病(3rdspacingoffluiddisease)(胰腺炎、间隔综合征(compartmentsyndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn'sdisease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、发炎性肠病、肾病综合征、不欲或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilicjoint)、肥厚性瘢痕(hypertrophicscar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Webersyndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增殖(pyogenicgranulomaretrolentalfibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascularadhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardialeffusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleuraleffusion)。

发明详述

在第一方面中，本发明涉及包含至少一可变域的VEGF结合分子，该可变域具有四个骨架区及三个互补决定区(分别为CDR1、CDR2及CDR3)，其中该CDR3具有如SEQIDNO:1中所示氨基酸序列SerArgAlaTyrXaaSerXaaArgLeuArgLeuXaaXaaThrTyrXaaTyr，其中

位置5处的Xaa为Gly或Ala；

位置7处的Xaa为Ser或Gly；

位置12处的Xaa为Gly、Ala或Pro；

位置13处的Xaa为Asp或Gly；

位置16处的Xaa为Asp或Glu；且

其中该VEGF结合分子能够以≥60%的抑制率阻断人重组VEGF165与人重组VEGFR-2之间的相互作用。

根据优选的实施方案中，位置5处的Xaa为Gly、位置7处的Xaa为Ser、位置12处的Xaa为Ala、且位置13处的Xaa为Asp。

特别是，该CDR3具有选自以下的序列

SEQIDNO:2SRAYGSSRLRLGDTYDY；

SEQIDNO:3SRAYGSSRLRLADTYDY；

SEQIDNO:4SRAYGSSRLRLADTYEY；

SEQIDNO:5SRAYGSGRLRLADTYDY；

SEQIDNO:6SRAYASSRLRLADTYDY；

SEQIDNO:7SRAYGSSRLRLPDTYDY；

SEQIDNO:8SRAYGSSRLRLPGTYDY。

根据某些实施方案，VEGF结合分子包含一个或多个免疫球蛋白单一可变域，其各自含有

a.CDR3，其具有选自SEQIDNO:2至8中所示第一组序列的氨基酸序列；

b.CDR1及CDR2，其具有如表3中所指示的、包含在选自SEQIDNO:9至46中所示第二组的氨基酸序列的序列中的氨基酸序列，其中该第二序列含有根据a)选择的各别CDR3。

根据优选的实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域为VHH。

根据具体实施方案，所述VHH具有选自SEQIDNO:9-46中所示序列的氨基酸序列。

根据另一具体实施方案，所述VHH具有选自SEQIDNO:15、SEQIDNO:18及SEQIDNO:25的氨基酸序列。

本发明亦涉及通过上文所定义VHH经过亲和性成熟和/或序列优化获得的VEGF结合分子，所述VHH例如通过将具有SEQIDNO:18中所示氨基酸序列的VHH进行序列优化获得的VHH。实例为具有选自SEQIDNO:47-57中所示序列的氨基酸序列的VHH。

根据某些实施方案，可如本文所定义格式化本发明的VEGF结合分子，例如，其可为双互补位或包含两个相同的免疫球蛋白单一可变域。所述VEGF结合分子可包含两个或更多个VHH，其为

a)相同的VHH，其能够以≥60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间的相互作用，或

b)不同的VHH，其结合VEGF的非重叠表位，其中至少一个VHH能够以≥60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间的相互作用，且其中至少一个VHH能够以≤60%的抑制率阻断该相互作用。

分别以≥60%或≤60%的抑制率阻断该相互作用的百分比是指，通过如实施例中所用AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay()、竞争ELISA、基于等离子共振(SPR)的分析()测定的抑制率。

在下文中，根据a)的VHH的能力亦称作“受体阻断”，而根据b)的VHH的能力亦称作“非受体阻断”。

优选地，受体阻断的VHH具有≥80%、更优选≥90%的抑制率；最优选的VHH为完全受体阻断剂，即具有100%的抑制率。

VEGF结合可含有两个或更多个相同的VHHa)，其为选自具有SEQIDNO:9-46中所示氨基酸序列的VHH，或由该VHH经过亲和性成熟和/或序列优化获得的VHH。VHH可选自具有SEQIDNO:18或SEQIDNO:47-57中所示氨基酸的VHH。

根据优选的实施方案，格式化VEGF结合分子包含两个各自具有SEQIDNO:57中所示氨基酸序列的VHH。

在包含两个不同VHH的格式化VEGF结合分子中

a)所述一个或多个抑制率≥60%的VHH选自

i.具有选自SEQIDNO:9-46中所示氨基酸序列的氨基酸序列的VHH，或

ii.由所述VHH经过亲和性成熟和/或序列优化所获得的VHH，且其中

b)所述一个或多个抑制率≤60%的VHH选自

i.SEQIDNO:58-124，或

ii.由该VHH经过亲和性成熟和/或序列优化所获得的VHH。

根据优选的实施方案，两个VHH包含于具有SEQIDNO:128-168中所示氨基酸序列的多肽中，且由表15中所指示的连接子序列隔开。

在优选的VEGF结合分子中，VHHa)i.具有SEQIDNO:18中所示氨基酸序列且VHHb)i.具有SEQIDNO:64中所示氨基酸序列。

在其它优选的VEGF结合分子中，a)ii.的VHH选自具有SEQIDNO:47-57中所示氨基酸序列的VHH且b)ii.的VHH选自具有SEQIDNO:125-127中所示氨基酸序列的VHH。

包含两个VHH的双互补位VEGF结合分子尤其优选，其中的一者具有SEQIDNO:57中所示氨基酸，且其中的一者具有SEQIDNO:127中所示氨基酸。

在治疗应用方面具有改进性质(例如，增强亲和性或降低免疫原性)的VEGF结合分子，可自本发明各别VEGF结合分子通过本领域中已知的技术获得，例如：亲和性成熟(例如起始自合成、随机或天然免疫球蛋白序列)、CDR移植、人源化、组合源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR装配、及本领域技术人员熟知的工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或上述任一者的任一适宜组合，亦称作如本文所述的“序列优化”。参照(例如)标准手册、以及其它说明及实施例。

若适当，本发明的亲和性增强的VEGF结合分子可通过另一VEGF结合分子经过亲和性成熟获得，关于“亲和性成熟分子”，后一VEGF结合分子代表“亲本”VEGF结合分子。

根据本发明的优选的实施方案，免疫球蛋白单一可变域(例如VHH及域抗体)具有大量使其极有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地，且不对其进行限制，VHH域(其已本质上经“设计”为在不与轻链可变域配对情况下功能性地结合抗原)可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。

由于其独特性质，如本文定义的免疫球蛋白单一可变域，例如VHH或VH(或VL)，无论是单独存在还是作为较大多肽(例如双互补位分子)的一部分，均提供许多显著优点：

·仅需要单一域以高亲和性及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个各别的域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在(即通过使用特别设计的连接子，如scFv的连接子)；

·免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰(如糖基化)；

·免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步论述)；

·免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和性，具有低遗传毒性，可通过输注或注射以外的替代途径给予；

·免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备情况下制备、储存或运输；

·免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均较为容易且相对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域可使用微生物发酵(例如下文进一步公开)产生，不需要像常规抗体那样使用哺乳动物表达系统；

·相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相当小的(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示穿透入组织(包括但不限于实体瘤及其他致密组织)的穿透性(更)高，且可以以高于所述常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；

·VHH具有特定的所谓“空腔结合性质”(尤其是由于相比于4链抗体的VH域，其CDR3环更为延伸)，因此其也能够进入常规4链抗体及其抗原结合片段不能进入的靶点及表位；

·VHH具有高度可溶及极其稳定且不具有凝集趋势的特别优势(正如由Ward等人,Nature341:544-546(1989)所述的小鼠源性抗原结合域的情况一样)。

本发明的免疫球蛋白单一可变域，在获得所述免疫球蛋白单一可变域的具体生物来源或具体制备方法的方面不受限制。例如，获得VHH可包括以下步骤：

(1)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从中分离VHH；

(2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；

(3)任选在亲和性成熟之后使具有天然存在序列的VHH“人源化”(如本文所述)，或表达编码所述人源化VHH的核酸；

(4)使动物物种(特别是哺乳动物物种，例如人)的天然存在抗体的免疫球蛋白单一可变重域“骆驼化”(如下所述)，或表达编码所述骆驼化域的核酸分子；

(5)使VH“骆驼化”，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；

(6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；

(7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；

(8)使重链抗体或VHH经受亲和性成熟、诱变(例如随机诱变或定点诱变)和/或任何其他技术以增加VHH的亲和性和/或特异性；和/或

(9)组合或选择上述步骤。

适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所了解。例如，获得结合特异性抗原或表位的VHH域的方法已阐述于WO2006/040153及WO2006/122786中。

根据一个具体实施方案，存在于本发明的多肽中的本发明的免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已经“人源化”或“序列优化”(任选在亲和性成熟之后)，即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式使用。

人源化VHH可含有一个或多个完全人骨架区序列，且在一个甚至更具体的实施方案中，可含有源自人种系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或与此高度同源的人骨架区序列，其任选与JH序列(例如JH5)组合。因此，人源化方案可包含单独或组合使用种系VH基因(例如DP47、DP29及DP51)的相应骨架1、2和3(FR1、FR2和FR3)残基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的骨架区(FR)可选自那些例如WO2006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓“KERE”及“GLEW”类型。实例为：在约位置44至47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人源化对应物。人源化VHH域可含有一个或多个完整的人骨架区序列。

在以EVQ开始的本发明VHH中，N端E可由D取代(此通常系序列优化的结果)或其可缺失(就大肠杆菌中的VHH表达而言)。对于格式化VEGF结合分子而言，此通常仅适用于N端定位的VHH。

属于103P,R,S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VHH域的优选但非限制性的人源化取代为108Q至108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。

根据另一实施方案，免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。

在另一实施方案中，本发明结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域的代表性类别具有对应于天然存在VH域的氨基酸序列的已被“骆驼化”的氨基酸序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考WO94/04678。所述骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓骆驼科印记残基处(也例如参见WO94/04678)。所述“人化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选骨架区序列的详述也可参见WO2006/040153的第46页及第98页及WO2006/122786的第107页。

本发明的VEGF结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)对VEGF具有特异性在于，其包含特异性结合VEGF分子内的一个或多个表位的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。

可以以本身已知的任一适宜方式测定VEGF结合分子与其抗原VEGF的特异性结合，所述方式包括(例如)本文所述分析、Scatchard分析和/或竞争性结合分析，例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心竞争分析、及本领域中本身已知的其不同变化形式。

关于抗原VEGF，本发明的VEGF结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)并不受限于物种。因此，若意欲用于人中的治疗目的，则本发明的免疫球蛋白单一可变域优选结合人VEGF。然而，结合另一哺乳动物物种的VEGF的免疫球蛋白单一可变域亦在本发明范畴内。与一个物种形式的VEGF结合的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的各别抗原发生交叉反应。结合VEGF的一种物种形式的本发明的免疫球蛋白单一可变域可与具有与人或一或多种其它物种不同的序列的VEGF交叉反应。例如，结合人VEGF的本发明的免疫球蛋白单一可变域可与灵长类的一个或多个其它物种的VEGF和/或动物的一或多种物种的VEGF呈现交叉反应性，该动物用于疾病的动物模型(例如猴、小鼠、大鼠、兔、猪、狗)且特别是用于与VEGF所介导血管发生的效应相关的疾病及病症的动物模型(例如本文所提及物种及动物模型)。显示所述交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物研发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus))、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。

优选地，鉴于与在治疗性VEGF拮抗剂的研发期间意欲用作动物模型的除人外的物种的一个或多个VEGF分子的交叉反应性，VEGF结合分子识别与人VEGF具有高度一致性的目标VEGF的区中的表位。

本发明的免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于VEGF的区中的表位，该区涉及与其受体、特别是VEGFR-2的结合，已显示肿瘤的新血管形成与该受体VEGFR-2的活化存在因果关系。根据优选方面，本发明的免疫球蛋白单一可变域至少部分、优选的实质上且最优选完全阻断VEGF受体活化、特别是VEGFR-2活化。

如上文所述，可通过如实施例中所述AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay()、竞争ELISA、或基于等离子共振(SPR)的分析()测定VEGF结合分子阻断VEGF与其受体(特别是VEGFR-2)之间的相互作用的能力。

优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM(例如小于500pM)的亲和性(如由表面等离子共振分析所测定，如实施例5.7中所述)结合VEGF。

优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域的IC₅₀值(如实施例5.1.中所述竞争ELISA分析中所量测)的范围为10^-6至10^-10摩尔/升或更小，更优选范围为10^-8至10^-10摩尔/升或更小且甚至更优选范围为10^-9至10^-10摩尔/升或更小。

根据本发明的非限制性但优选的实施方案，本发明的结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域以10^-5至10^-12摩尔/升(M)或更小、且优选10^-7至10^-12摩尔/升(M)或更小、且更优选10^-8至10^-12摩尔/升(M)的解离常数(K_D)，和/或以至少10⁷M^-1、优选至少10⁸M^-1、更优选至少10⁹M^-1(例如至少10¹²M^-1)的缔合常数(K_A)，且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM(例如小于500pM)的K_D结合VEGF。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对VEGF的K_D及K_A值。

包含两个或更多个免疫球蛋白单一可变域的双互补位VEGF结合分子基本上由以下组成或包含以下：(i)特异性结合VEGF的第一表位的第一免疫球蛋白单一可变域，及(ii)特异性结合VEGF的第二表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中VEGF的第一表位及VEGF的第二表位为不相同表位。换言之，本发明的该多肽包含针对VEGF中存在的至少两个非重叠表位的两个或更多个免疫球蛋白单一可变域，或基本上由其组成，其中所述免疫球蛋白单一可变域以使其能够同时结合VEGF的方式彼此连接。在此意义上，亦可将本发明多肽视为“二价”或“多价”免疫球蛋白构建体，且尤其视为“多价免疫球蛋白单一可变域构建体”，其中多肽含有至少两个VEGF结合位点。(所述构建体亦称作“格式化”VEGF结合分子，例如“格式化”VHH)。

本发明的该VEGF结合分子包括(至少)两个抗VEGF免疫球蛋白单一可变域，其中(该)两个免疫球蛋白单一可变域优选针对VEGF分子内的非重叠表位。因此，该两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原特异性且因此具有不同CDR序列。出于此原因，由于两个免疫球蛋白单一可变域包括两个不同互补位，本发明的所述多肽在本文中亦分别命名为“双互补位多肽”、或“双互补位域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由域抗体组成或基本上由其组成)、或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由VHH组成或基本上由其组成)。

若本发明多肽为如本文所定义的双互补位分子，则免疫球蛋白单一可变域组份的至少一者结合表位以便以≥80%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间的相互作用。如本发明的实验中所示，某些格式化分子含有两个均以≥80%的抑制率阻断VEGFR2受体的VHH。本发明的某些VHH以100%的抑制率阻断VEGFR-2，即其为完全阻断剂。

在两种情形下，本发明的VEGF结合分子内，例如N端、C端或位于两个免疫球蛋白单一可变域之间可存在其它序列及部分，例如连接子序列及提供效应子功能的序列，本文中更详细阐释。

根据另一尽管较次优选的实施方案，本发明的VEGF结合分子包括两个以上抗VEGF免疫球蛋白单一可变域，即三个、四个或甚至更多个抗VEGFVHH。在此情形下，抗VEGF免疫球蛋白单一可变域的至少二者为针对VEGF分子内的非重叠表位，其中任一其它免疫球蛋白单一可变域可结合两个非重叠表位中的任一者和/或VEGF分子内存在的又一表位。

根据本发明，两个或更多个免疫球蛋白单一可变域可彼此独立地为如本文所定义的VHH或域抗体、和/或任一其它种类的免疫球蛋白单一可变域，例如VL域，前提为所述免疫球蛋白单一可变域可结合抗原，即VEGF。

根据优选的实施方案，第一及第二免疫球蛋白单一可变域基本上由如本文所定义VHH序列或域抗体序列组成。根据尤其优选的实施方案，第一及第二免疫球蛋白单一可变域基本上由VHH序列组成。

根据本发明的某些实施方案，本发明的VEGF结合分子中存在的至少两个免疫球蛋白单一可变域可彼此直接连接(即不使用连接子)或经由连接子连接。连接子优选为连接子肽且应经选择以便容许至少两个不同免疫球蛋白单一可变域结合同一VEGF分子内或两个不同分子内的VEGF的其至少两个非重叠表位中的一者。

适宜连接子尤其取决于表位且特别是免疫球蛋白单一可变域结合的VEGF上的表位之间的距离，且基于本文公开的内容、任选在一定有限程度的常规实验后将为本领域技术人员明了。

同时，在结合VEGF的两个或更多个免疫球蛋白单一可变域为VHH或域抗体时，其可分别经由第三VHH或抗体彼此连接(在所述VEGF结合分子中，两个或更多个免疫球蛋白单一可变域可直接或经由适宜连接子与该第三免疫球蛋白单一可变域连接)。该第三VHH或域抗体可为(例如)可延长半衰期的VHH或域抗体。例如，后一VHH或域抗体可为能够结合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白或(人)转铁蛋白)的域抗体或VHH。

或者，结合VEGF的两个或更多个免疫球蛋白单一可变域可串联连接(直接连接或经由适宜连接子连接)且第三VHH或域抗体(其可延长半衰期)可直接或经由连接子与两个或更多个上文所提及所述免疫球蛋白序列中的一者连接。

本文结合本发明的特异性多肽阐述适宜连接子且其可-例如且不限于-包含氨基酸序列，该氨基酸序列优选具有9个或更多个氨基酸、更优选至少17个氨基酸(例如约20至40个氨基酸)的长度。然而，上限并非关键，但出于方便的原因考虑到(例如)所述多肽的生物药物生产进行选择。

连接子序列可为天然存在的序列或非天然存在的序列。若用于治疗目的，则连接子优选在给予本发明的VEGF结合分子的个体中具有非免疫原性。

一组有用的连接子序列的一个有用的组系源自如WO96/34103及WO94/04678中所述的重链抗体的铰链区。

其它实例为聚-丙氨酸连接子序列，例如Ala-Ala-Ala。

连接子序列的更优选的实例为不同长度的Gly/Ser连接子，例如(gly_xser_y)_z连接子，包括(gly₄ser)₃、(gly₄ser)₄、(gly₄ser)、(gly₃ser)、gly₃及(gly₃ser₂)₃。

本发明的VEGF结合分子(SEQIDNO:128-168)中含有表15中所示的连接子的一些非限制性实例，例如连接子

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS；SEQIDNO:169);

GGGGSGGGS(9GS；SEQIDNO:170);

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS；SEQIDNO:171)。

若通过附接聚合物(例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分)修饰本发明的格式化VEGF结合分子，则连接子序列优选包括氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸，其容许在连接子区中进行该修饰(例如聚乙二醇化)。

用于聚乙二醇化的连接子的实例为：

GGGGCGGGS(“GS9,C5”，SEQIDNO:172);

GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS25,C5，SEQIDNO:173)

GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG("GS27,C14"，SEQIDNO:174),

GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS("GS35,C15"，SEQIDNO:175)，和

GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35,C5”，SEQIDNO:176)。

此外，连接子亦可为如(例如)WO04/081026中所示的聚(乙二醇)部分。

在另一实施方案中，所述至少两个结合VEGF的免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一个或两个连接子)，例如另一多肽来彼此连接，该另一多肽在一个优选但非限制性实施方案中可为如上所述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可为基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性质的生物效应或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。例如但不限于，该部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。

根据一个优选的实施方案，尤其在欲使用或用作治疗剂时，本发明的VEGF结合分子包括延长本发明的多肽在患者血清或其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”定义为(经修饰)多肽的血清浓度例如由于天然机制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合而在体内降低50%所花费的时间。

更具体地，该半衰期延长部分可共价连接至或融合至免疫球蛋白单一可变域且可为(但不限于)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或羟乙基淀粉(HES)衍生物。

在另一实施方案中，本发明的VEGF结合分子包含与存在于血液中的抗原结合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、纤维蛋白原(fibrinogen)或转铁蛋白，因而使所得本发明的多肽的体内半衰期增加。

根据一个特别优选的实施方案，该部分为白蛋白结合免疫球蛋白且尤其优选为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白结合VHH域。

若欲在人中使用，则该白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域优选结合人血清白蛋白且优选为人化白蛋白结合VHH域。

结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域在本领域中是已知的，且进一步详述于例如WO2006/122786中。特别地，适用的白蛋白结合VHH为ALB1及其人化对应物ALB8(WO2009/095489)。然而，也可使用在以上专利公开案中提及的其他白蛋白结合VHH域。

具体适用的白蛋白结合VHH域为由显示于SEQIDNO:177中的氨基酸序列组成或含有该氨基酸序列的ALB8。

根据本发明的另一实施方案，优选呈VHH形式的两个免疫球蛋白单一可变域可融合至例如公开于WO01/79271及WO03/59934中的血清白蛋白分子。如例如于WO01/79271中所述，融合蛋白可通过以下常规重组技术获得：将编码血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至编码VEGF结合分子的DNA，将所得构建体插入适于在所选宿主细胞(例如酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))或细菌细胞)中表达的质粒中，接着用融合的核苷酸序列转染该宿主细胞，并使之在合适条件下生长。适用于HSA的序列显示于SEQIDNO:178中。

根据另一实施方案，本发明的多肽的半衰期延长修饰(此修饰亦降低多肽的免疫原性)包含连接药理学上可接受的合适的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何适合形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体及抗体片段(包括但不限于域抗体及scFv片段)的聚乙二醇化；参考例如：Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv.DrugDeliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；及WO2004/060965。

用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售的，例如可从NektarTherapeutics,USA或NOFCorporation,Japan购得，所述试剂例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。

优选使用(特别是通过半胱氨酸残基的)定点聚乙二醇化(参见例如Yang等人,ProteinEngineering16,761-770(2003))。例如，出于此目的，PEG可连接至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，本发明的多肽可经修饰以便适当引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用对本领域技术人员而言本身已知的蛋白工程的技术。

优选地，对于本发明的多肽，使用PEG的分子量大于5kDa(例如大于10kDa)且小于200kDa(例如小于100kDa)，例如在20kDa至80kDa范围内。

关于聚乙二醇化应注意，一般而言，本发明也优选涵盖已在一个或多个氨基酸位置处经聚乙二醇化的任何双互补位VEGF结合分子，该聚乙二醇化：(1)增加体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供对于聚乙二醇化本身已知的一种或多种其他有益性质；(4)基本上不影响多肽对VEGF的亲和性(例如通过本领域中所述的适合分析所测定，不使该亲和性降低50%以上、且更优选不使之降低10%以上)；和/或(5)不影响本发明的VEGF结合分子的任何其他所需性质。适合的PEG组及用于特异性或非特异性与之连接的方法将为本领域技术人员所了解。用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售，例如可从NektarTherapeutics,USA或NOFCorporation,Japan购得，所述试剂例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。

根据本发明的一个尤其优选的实施方案，本发明的聚乙二醇化多肽包括一个具有40kDa或60kDa分子量的线性PEG的PEG部分，其中该PEG部分在连接区域中连接至所述多肽，且特别是在如SEQIDNO:172中所示的GS9连接肽的位置5处、在如SEQIDNO:174中所示的GS27连接肽的位置14处、或在如SEQIDNO:175中所示的GS35连接肽的位置15处、或在如SEQIDNO:176中所示的35GS连接肽的位置5处的Cys残基处连接至所述多肽。

如以下化学式中所示，本发明的VEGF结合分子可经如上提及的PEG试剂之一(例如“ME-400MA”)来聚乙二醇化：

在另一方面中，本发明涉及编码本发明的VEGF结合分子的核酸分子。所述核酸分子在本文中也称为“本发明的核酸”且也可呈如本文定义的遗传构建体形式。本发明的核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如具有已特定适于在预定宿主细胞或宿主有机体中表达的密码子用途(codonusage)的DNA)。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸呈如上定义的基本上分离的形式。

本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供VEGF结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合调控组件(例如启动子、增强子、终止子等)。所述组件及其鉴于特测序列在特定宿主中的表达的选择为本领域技术人员的常识。对本发明的VEGF结合分子的表达有用或必需的调控组件及其他组件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子(integrationfactor)、选择标记物、前导序列、报告基因(reportergene)等公开于例如WO2006/040153的第131至133页。

本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。

在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的VEGF结合分子和/或含有本发明的核酸的宿主细胞。根据一个特别优选的实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞；其他适用细胞为酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。适合真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞。适合酵母细胞包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。

适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、海拉细胞(HeLacell)、COS细胞等。然而，也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。

本发明还提供制造本发明的VEGF结合分子的方法，所述方法通常包含以下步骤：

-在允许表达本发明的VEGF结合分子的条件下培养包含能够编码VEGF结合分子的核酸的宿主细胞；及

-从培养物回收或分离由宿主细胞表达的多肽；及

-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的VEGF结合分子。

对于工业规模生产而言，优选的宿主有机体包括适于大规模表达、生产及发酵，且特别是适于大规模药物表达、生产及发酵的大肠杆菌菌株、巴斯德毕赤酵母菌株及酿酒酵母菌株。

具体表达系统的选择部分取决于某些翻译后修饰的要求，更特别是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本发明的VEGF结合分子的产生，必需使用能够使所表达蛋白糖基化的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员将了解所获得的糖基化样式(即所连接残基的种类、数目及位置)将取决于用于表达的细胞或细胞株。

本发明的VEGF结合分子可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞溶质中、在胞间质(periplasma)中或在包涵体(inclusionbody)中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。

用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。

在另一方面中，本发明涉及具有包含在抗VEGF-VHH中的CDR3氨基酸序列的肽(所述抗VEGF-VHH具有选自分别显示于SEQIDNO:9至57或SEQIDNO:58至127中的氨基酸序列)，以及编码该肽的核酸分子。

所述肽对应于源自本发明的VHH的CDR3。所述肽，特别是编码所述肽的核酸分子，适用于CDR移植以置换免疫球蛋白链中的CDR3，或适用于插入非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制剂、DNA结合蛋白、细胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、双硫桥式肽(disulfide-bridgedpeptide)、脂质运载蛋白(lipocalin)或抗运载蛋白(anticalin)中，从而赋予此支架靶结合性质。CDR移植方法在本领域中是公知的且已广泛使用，例如用于使抗体人化(此通常包含将啮齿动物抗体的CDR移植在人抗体的Fv骨架上)。

为了获得含有本发明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根据如例如由Daugherty等人,1991,NucleicAcidsResearch,第19卷,9,2471-2476所述的分子生物学标准方法，例如通过基因合成、通过寡核苷酸退火或借助于重叠PCR片段来获得编码此分子的DNA。将VHHCDR3插入非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人,2004,ProteinScience,13,1882-1891公开。

本发明还涉及一种产物或组合物，其含有或包含至少一种本发明的VEGF结合分子及任选的所述组合物的本身已知的一种或多种其他组分，即视组合物的预定用途而定。

对于药物用途而言，本发明的VEGF结合分子可调配成药物制剂或组合物，其包含至少一种本发明的VEGF结合分子及至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂及任选的一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。借助于非限制性实例，这类制剂可呈适于口服给药、肠胃外给药(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部给药或通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂等给药的形式。根据给药方式，合适的给药形式可为固体、半固体或液体，且其制备方法及载剂将为本领域技术人员所了解且进一步在本文中公开。

因此，在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其含有至少一种VEGF结合分子，特别是一种本发明的免疫球蛋白单一可变域，及至少一种适合的载剂、稀释剂或赋形剂(即适于药物用途)及任选一种或多种其他活性物质。

本发明的VEGF结合分子可以以本身已知的任何适合方式调配及给予：特别是对于免疫球蛋白单一可变域，例如参考WO04/041862、WO04/041863、WO04/041865、WO04/041867及WO08/020079，以及标准手册，例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPublishingCompany,USA(1990)；Remington,theScienceandPracticeofPharmacy,第21版,LippincottWilliamsandWilkins(2005)；或theHandbookofTherapeuticAntibodies(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。

例如，本发明的免疫球蛋白单一可变域可以以用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv片段及双特异抗体)及其他药物活性蛋白的本身已知的任何方式调配及给予。所述制剂及制备所述制剂的方法将为本领域技术人员所了解，且例如包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或局部(即经皮或皮内)给药的制剂。

用于肠胃外给药的制剂可例如为适于输注或注射的灭菌溶液、混悬液、分散液或乳液。适用于所述制剂的载剂或稀释剂，例如包括(但不限于)灭菌水及药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、葡萄糖溶液及汉克氏溶液(Hank'ssolution)；含水油(wateroil)；甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及矿物油、动物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其适合的混合物。通常将优选水性溶液或混悬液。

因此，本发明的VEGF结合分子可组合药学上可接受的载体(例如惰性稀释剂或可吸收食用载剂)而全身给予(例如口服给予)。对于口服治疗性给药而言，可将本发明的VEGF结合分子与一种或多种赋形剂组合且以可摄取片剂、口腔锭、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。所述组合物及制剂应含有至少0.1%的本发明的VEGF结合分子。其在组合物及制剂中的百分比当然可变化且宜介于既定单位剂型重量的约2%与约60%之间。本发明的VEGF结合分子在用于所述治疗的组合物中的量为获得有效剂量浓度的量。

所述片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂及甜味剂或矫味剂，例如在WO08/020079的第143-144页上所提及的。当单位剂型为胶囊剂时，其除以上类型的物质外也可含有液体载剂，例如植物油或聚乙二醇。可存在各种其他物质作为包衣或者用以修饰固体单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可由明胶、蜡、虫胶(shellac)或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有本发明的VEGF结合分子、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、色素及矫味剂(例如樱桃或橙香料)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何物质均应为药学上可接受且在所用量下基本上无毒。此外，本发明的VEGF结合分子可并入持续释放制剂及装置中。

用于口服给药的制剂及制剂也可具有将使本发明构建体抵抗胃环境且进入肠中的肠溶包衣。更一般地，用于口服给药的制剂及制剂可经适当调配以递送进入胃肠道的任何所需部分中。此外，可使用适合的栓剂以递送进入胃肠道中。

如WO08/020079第144及145页上所进一步公开，本发明的VEGF结合分子也可通过输注或注射而经静脉内或腹膜内给予。

对于本发明的VEGF结合分子的局部给药而言，如WO08/020079第145页上所进一步公开，一般需要将其与皮肤可接受的载剂(其可为固体或液体)组合而以组合物或制剂形式给予皮肤。

一般而言，本发明的VEGF结合分子在液体组合物(例如洗剂)中的浓度将为约0.1-25重量%、优选约0.5-10重量%。在半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度将为约0.1-5重量%、优选约0.5-2.5重量%。

本发明的VEGF结合分子的治疗中需要的量不仅依所选特定VEGF结合分子，而且也依给药途径、所治疗症状特性及患者年龄及症状而变化且将最终由当值医师或临床医师酌情决定。此外，本发明的VEGF结合分子的剂量视靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。

所需剂量宜呈现为单次剂量或以适当间隔给予的分次剂量，例如呈每天两次、三次、四次或四次以上的亚剂量形式。所述亚剂量自身可经进一步划分，例如分成大量单个的松散间隔的给药；例如来自吹入器(insufflator)的多次吸入或通过对眼中多次滴眼。

给药方案可包括长期每天治疗。“长期”是指持续时间至少两周且优选数周、数月或数年。该剂量范围的必要修改可由一般技术人员仅使用本文教导的常规实验来确定。参见Remington'sPharmaceuticalSciences(Martin,E.W.第4版),MackPublishingCo.,Easton,PA。若发生任何并发症，则该剂量也可由单个的医师来调整。

根据另一实施方案，本发明涉及VEGF结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)的用途，其用于治疗目的，例如

-尤其在人中用于预防、治疗和/或减轻与VEGF对血管生成的介导效应相关或可通过用VEGF结合分子调节Notch信号传导路径来预防、治疗或减轻的病症、疾病或症状，

-在一治疗需要此治疗的患者的方法中，该方法包含给予有需要的个体药物活性量的至少一种本发明的VEGF结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)或含有所述的本发明的VEGF结合分子的药物组合物；

-用于制备预防、治疗或减轻与VEGF对血管生成的介导效应相关的病症、疾病或症状的药物；

-作为用于以上目的药物组合物或药物中的活性成分。

根据一个具体的方面，该病症、疾病或症状为如本文定义的癌症或癌性疾病。

根据另一方面，疾病为与VEGF对血管生成的介导效应相关或可通过用VEGF结合分子调节Notch信号传导路径来治疗或减轻的眼病。

视欲治疗的癌性疾病而定，本发明的VEGF结合分子可单独或组合一种或多种特别是选自以下的其他治疗剂加以使用：

化学治疗剂(如DNA损伤剂)，或抑制癌细胞中血管生成、信号转导路径或有丝分裂检查点(mitoticcheckpoint)的治疗活性化合物。

其他治疗剂可任选作为同一药物制剂的组分与VEGF结合分子的给药同时给予、或在该VEGF结合分子的给药之前或之后给予。

在某些实施方案中，所述其他治疗剂可为(不限于，且在包括各别配位体的受体的情况下)一种或多种选自以下物质的抑制剂：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。

其他治疗剂的其他实例为CDK、Akt、src/bcrabl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90的抑制剂；刺猬拮抗剂(hedgehogantagonist)；JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho的抑制剂；wnt信号传导的抑制剂或遍在蛋白化(ubiquitination)路径的抑制剂或Notch信号传导路径的另一抑制剂。

Aurora抑制剂的实例为(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。

PLK抑制剂的一个实例为GSK-461364。

raf抑制剂的实例为BAY-73-4506(也为VEGFR抑制剂)、PLX4032、RAF-265(此外也为VEGFR抑制剂)、索拉非尼(sorafenib)(此外也为VEGFR抑制剂)及XL281。

KSP抑制剂的实例为伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。

src和/或bcr-abl抑制剂的实例为达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL228(也为IGF-1R抑制剂)、尼洛替尼(nilotinib)(也为PDGFR及cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(也为cKit抑制剂)及NS-187。

PDK1抑制剂的一个实例为BX-517。

Rho抑制剂的一个实例为BA-210。

PI3激酶抑制剂的实例为PX-866、BEZ-235(也为mTor抑制剂)、XL418(也为Akt抑制剂)、XL-147及XL765(也为mTor抑制剂)。

cMet或HGF的抑制剂的实例为XL-184(也为VEGFR、cKit、Flt3的抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也为VEGFR的抑制剂)、MGCD-265(也为VEGFR、Ron、Tie2的抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。

c-Myc抑制剂的一个实例为CX-3543。

Flt3抑制剂的实例为AC-220(也为cKit及PDGFR的抑制剂)、KW2449、来他替尼(lestaurtinib)(也为VEGFR、PDGFR、PKC的抑制剂)、TG-101348(也为JAK2的抑制剂)、XL-999(也为cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR的抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(也为PDGFR、VEGFR及cKit的抑制剂)及坦度替尼(tandutinib)(也为PDGFR及cKit的抑制剂)。

HSP90抑制剂的实例为坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504及CNF2024。

JAK/STAT抑制剂的实例为CYT-997(其也与微管蛋白相互作用)、TG101348(也为Flt3的抑制剂)及XL-019。

Mek抑制剂的实例为ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL518。

mTor抑制剂的实例为西罗莫司脂化物(temsirolimus)、AP-23573(其也作为VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(此外也为VEGF抑制剂)、XL-765(也为PI3激酶抑制剂)及BEZ-235(也为PI3激酶抑制剂)。

Akt抑制剂的实例为哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立滨(triciribine)。

cKit抑制剂的实例为AB-1010、OSI-930(也作为VEGFR抑制剂)、AC-220(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、坦度替尼(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、阿西替尼(也为VEGFR及PDGFR的抑制剂)、XL-999(也为Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR的抑制剂)、舒尼替尼(也为Flt3、PDGFR、VEGFR的抑制剂)、及XL-820(也作为VEGFR及PDGFR抑制剂)、伊马替尼(也为bcr-abl抑制剂)、尼洛替尼(也为bcr-abl及PDGFR的抑制剂)。

刺猬拮抗剂的实例为IPI-609及CUR-61414。

CDK抑制剂的实例为塞来昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG024322。

蛋白酶体抑制剂的实例为硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfilzomib)及NPI-0052(也为NFκB的抑制剂)。

NFκB路径抑制剂的一个实例为NPI-0052。

遍在蛋白化路径抑制剂的一个实例为HBX-41108。

在优选的实施方案中，所述其他治疗剂为抗血管生成剂。

抗血管生成剂的实例为FGFR、PDGFR及VEGFR或各别配位体的抑制剂(例如VEGF抑制剂，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗体贝伐单抗(bevacizumab))、EGFL7抑制剂(如抗EGFL7MAb)、血管生成素1/2抑制剂(如AMG386)、以及沙立度胺(thalidomide)，所述药物选自(但不限于)贝伐单抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(也为CDK的抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-K_DR、IMC-18F1、IMiD(免疫调节药物)、沙立度胺衍生物CC-4047、来那度胺(lenalidomide)、ENMD0995、IMC-D11、Ki23057、布里瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(也为cKit及Flt3的抑制剂)、1B3、CP868596、IMC3G3、R-1530(也为Flt3的抑制剂)、舒尼替尼(也为cKit及Flt3的抑制剂)、阿西替尼(也为cKit的抑制剂)、来他替尼(也为Flt3及PKC的抑制剂)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也为Flt3及cKit的抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenibtosylate)(也为Raf的抑制剂)、RAF-265(也为Raf的抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(也为EGFR及Her2的抑制剂)、BAY-57-9352(也为Raf的抑制剂)、BAY-73-4506(也为Raf的抑制剂)、XL880(也为cMet的抑制剂)、XL-647(也为EGFR及EphB4的抑制剂)、XL820(也为cKit的抑制剂)及尼洛替尼(也为cKit及brc-abl的抑制剂)。

其他治疗剂也可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体的实例(但不限于)为西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制剂的一个实例为吉非替尼(gefitinib)。EGFR调节剂的另一实例为EGF融合毒素。

尤其适用于与本发明的VEGF结合分子组合的EGFR及Her2抑制剂为拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、凡德他尼(也为VEGFR的抑制剂)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(也为VEGFR的抑制剂)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。

宜在治疗中与本发明的VEGF结合分子组合的其他药物为替坦托西莫单抗(tositumumabtiuxetan)及替坦伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(两种放射性标记的抗CD20抗体)、阿仑单抗(alemtuzumab)(一种抗CD52抗体)、地诺单抗(denosumab)(一种破骨细胞分化因子配位体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(一种CD80拮抗剂)、奥法木单抗(ofatumumab)(一种CD20抑制剂)、扎木单抗(zanolimumab)(一种CD4拮抗剂)、SGN40(一种CD40配位体受体调节剂)、利妥昔单抗(rituximab)(一种CD20抑制剂)、马帕木单抗(mapatumumab)(一种TRAIL-1受体激动剂)、REGN421(SAR153192)或OMP-21M18(Dll4抑制剂)。

可与本发明的VEGF结合分子组合使用的其他化学治疗药物选自但不限于激素、激素类似物及抗激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷诺昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、乙酸环丙孕酮(cyproteroneacetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelinacetate)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))；LHRH激动剂及拮抗剂(例如乙酸性瑞林(goserelinacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))；抗代谢物(例如抗叶酸物(如甲胺喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、及吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤及腺苷类似物(例如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)(如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊达比星(idarubicin))、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、链佐星(streptozocin))；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、沙铂(satraplatin))；烷化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、塞替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类(vincaalkaloids)，如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷类(taxanes)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)及其制剂、拉诺他赛(larotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel)；及埃博霉素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide))、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及杂项化学治疗药物，例如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素P、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、及卟菲尔钠(porfimer)、贝沙罗汀(bexarotene)、塞来考昔(celecoxib)。

可根据感兴趣的具体疾病或病症而使用本身已知的任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或动物模型或其任何组合来测试本发明的VEGF结合分子或多肽以及包含本发明的VEGF结合分子的组合物的效能。适合的分析及动物模型将为本领域技术人员所了解且例如包括本文所述且用于以下实例中的分析，例如增殖分析。

本发明实验中获得的数据证实，本发明的VEGF结合分子具有优于先前技术的VEGF结合分子的那些性质的性质。所述性质包括VEGF165-VEGFR2相互作用的竞争抑制及低IC50(如可(例如)自图1及表5的ELISA数据取得)以及如图3、17、18及表7中所示AlphaScreen分析中的VHH的IC₅₀(nM)值；及表9、10及图5-1及5-2中的纯化VHH对重组人VEGF及小鼠VEGF的亲和性K_D(nM)。同样，如表13中所示，在HUVEC增殖分析中，本发明的VEGF结合剂具有高效能，即在亚纳摩尔范围内。此指示本发明的VEGF结合分子是在与VEGF所介导血管发生的效应相关的疾病及病症(例如癌症)中具有治疗功效的有前景的候选者。

根据本发明的另一实施方案，提供诊断疾病的方法，其为通过以下方式完成：

a)样品与如上文所定义的本发明的VEGF结合分子接触，及

b)测该VEGF结合分子与该样品的结合，及

c)将步骤(b)中检测的结合与标准品相比较，其中相对于该样品的结合差别可诊断与VEGF所介导血管发生的效应相关的疾病或病症。

对于此用途及其它用途，通过(例如)引入作为特异性结合对(例如生物素-(链菌)抗生物素蛋白结合对)的一部分的官能团进一步修饰本发明的VEGF结合分子可为有用的。该官能团可用于连接本发明的VEGF结合分子与结合该结合对的另一半的另一蛋白质、多肽或化合物，即通过形成结合对连接。例如，本发明的VEGF结合分子可与生物素缀合或与另一蛋白质、多肽、化合物或载剂(其缀合于抗生物素蛋白或链菌抗生物素蛋白)。例如，本发明的该缀合VEGF结合分子可在(例如)诊断系统中用作受体，其中可检测的产生信号的试剂与抗生物素蛋白或链菌抗生物素蛋白缀合。

附图说明

图1：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)

图2：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)

图3：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

图4：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)

图5-1和5-2：单价VHH与重组人及小鼠VEGF的结合(ELISA)

图6：单价VHH与人VEGF121的结合

图7-1至7-4：纯化的VHH不结合VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF

图8-1和8-2：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)

图9-1和9-2：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)

图10：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

图11：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)

图12：格式化的VHH阻断mVEGF164/mVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

图13-1和13-2：格式化的VHH结合小鼠和人VEGF

图14-1至14-8：格式化的VHH不结合VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF

图15：格式化的VHH结合VEGF121

图16：VHHVEGFBII23B04与人VH3/JH种系共有序列的序列比对

图17：VEGFBII23B04的VHH变体阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

图18：VEGFBII23B04的序列优化的克隆阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)

图19：VHHVEGFBII5B05与人VH3/JH种系共有序列的序列比对。

材料及方法：

a)VEGF109的产生及功能性测试

将编码人血管内皮生长因子同工型VEGF165的受体结合域的cDNA(GenBank：AAM03108.1；AA残基27-135)克隆至pET28a载体(Novagen,Madison,WI)中，并在大肠杆菌(BL21StarDE3)中过度表达为标记His的不溶性蛋白。通过添加1mMIPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。离心收集细胞，并通过声波处理细胞片状沉淀物使细胞溶解。通过离心分离包涵体。在使用1%TritonX100(Sigma-Aldrich)的洗涤步骤之后，使用7.5M盐酸胍来溶解蛋白，并使用尿素浓度从6M递减至0M的缓冲液通过连续多轮过夜透析将其再折叠。通过使用MonoQ5/50GL(AmershamBioSciences)柱的离子交换色谱，随后以Superdex7510/300GL柱(AmersheimBioSciences)进行凝胶过滤来纯化所述再折叠的蛋白。蛋白纯度及均质性由SDSPAGE及蛋白印迹分析法(Westenblot)予以确认。此外，通过ELISA监测对VEGFR1、VEGFR2及贝伐单抗的结合活性。为此，在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将1μg/mL重组人VEGF109固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。将VEGFR1、VEGFR2或贝伐单抗的系列稀释液添加至涂布VEGF109的培养板中，并使用碱性磷酸酶(AP)接合的Fc特异性羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.,WestGrove,PA,USA)且接着使用底物PNPP(对硝基苯基磷酸)(Sigma-Aldrich)存在下的酶促反应来检测结合。VEGF109可结合VEGFR1、VEGFR2及贝伐单抗，表明产生的VEGF109具有活性。

b)VEGF165的KLH缀合及KLH缀合的VEGF165的功能性测试

根据制造商说明书，使用含有海水养殖钥孔血蓝蛋白(mariculturekeyholelimpethemocyanin，mcKLH)的Imject免疫原EDC试剂盒(Pierce,Rockford,IL,USA)，将重组人VEGF165(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)接合至mcKLH。通过SDS-PAGE确认多肽对mcKLH的有效接合。用ELISA检验接合蛋白的功能：在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将2μg/mLKLH接合的VEGF165固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。添加VEGFR1或VEGFR2的系列稀释液且使用辣根过氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)缀合的Fc特异性羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.,WestGrove,PA,USA)，接着使用底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下的酶促反应来检测结合。KLH缀合的蛋白仍与VEGFR1、VEGFR2及贝伐单抗相互作用，从而证实仍然可影响VEGF165上的相关表位。

实施例1

不同VEGF形式的免疫诱导美洲驼(llama)中的体液免疫反应

1.1免疫化

在兽医学院的伦理委员会(UniversityGhent,Belgium)批准之后，根据标准方案以6次肌内注射(以每周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人VEGF109来使4只美洲驼(命名为第264、265、266、267号)免疫化。第0天的首次注射液是用弗氏完全佐剂(Difco,Detroit,MI,USA)调配的，而随后注射液是用弗氏不完全佐剂(Difco,Detroit,MI,USA)调配的。此外，根据以下方案使四只美洲驼(命名为第234、235、280及281号)免疫化：5次肌内注射KLH缀合的人VEGH165(以两周一次的间隔，每次给药100或50μg)，随后4次肌内注射人VEGF109(首次给药100μg，2周后以每周一次的间隔给药3次，每次给药50μg)。

1.2美洲驼中VEGF诱导的免疫反应的评估

为了监测VEGF特异性血清效价，建立ELISA分析，其中将2μg/mL重组人VEGF165或VEGF109在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。在添加血清稀释液之后，使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗美洲驼免疫球蛋白(BethylLaboratoriesInc.,Montgomery,TX,USA)，随后在底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下进行酶促反应来检测所结合的总IgG。对于美洲驼264、265、266及267，进行另一ELISA，评估对抗VEGF165及VEGF109的同型特异性反应。依次使用特异性识别常规美洲驼IgG1及仅有重链的美洲驼IgG2及IgG3的小鼠mAb[Daley等人(2005).Clin.Diagn.Lab.Imm.12:380-386]、兔抗小鼠HRP缀合物(DAKO)来检测同型特异性反应。使用TMB作为显色底物来开发ELISA且在450nm下测量吸光度。各美洲驼的血清效价见于表1中。

表1：针对VEGF165及VEGF109的抗体介导的特异性血清反应ELISA(重组蛋白质固相涂覆)

n/d，未测定

实施例2

仅有重链的抗体片段谱系的克隆及噬菌体的制备

在末次免疫原注射之后，从免疫化的美洲驼收集作为产生重链抗体的B细胞的来源的免疫组织。通常，收集每只动物在末次抗原注射后4天及8天收集的两个150ml血液样品，以及在末次抗原注射之后4天收集的一个淋巴结活组织检查。根据制造商说明书(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA)，使用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)由血液样品制备外周血液单核细胞(PBMC)。如WO05/044858中所述，从PBMC及淋巴结活组织检查提取总RNA，其用作扩增编码VHH的DNA区段的RT-PCR的起始物质。对于各免疫化的美洲驼，通过汇集从该动物收集的所有免疫组织分离的总RNA来构建文库。简言之，经PCR扩增的VHH谱系通过特定限制位点克隆入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。该载体源自pUC119且含有LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白编码序列、氨苄西林或羧苄西林抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列(pAX050)。载体编码与VHH编码序列同框的C-末端c-myc标签及His6标签。根据标准方案制备噬菌体，且在过滤灭菌后储存在4℃以供进一步使用。

实施例3

通过噬菌体展示进行VEGF特异性VHH的选择

VHH噬菌体文库用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括i)VEGF蛋白形式(rhVEGF165、rhVEGF109或rmVEGF164)，ii)抗原呈递方法(固相：直接涂布或通过生物素标签涂布于中性链菌抗生物素蛋白涂布的培养板上；溶液相：在溶液中培养，随后在中性链菌抗生物素蛋白的涂布培养板上捕获)，iii)抗原浓度及iv)洗脱方法(胰蛋白酶洗脱或使用VEGFR2的竞争性洗脱)。所有选择均在Maxisorp96孔培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中进行。

如下进行选择：在室温将噬菌体文库与可变浓度的VEGF抗原(在溶液中或固定于固体支撑物上)一起培养。在培养2小时且充分洗涤之后，将结合的噬菌体洗脱。若胰蛋白酶用于噬菌体洗脱，则通过添加0.8mM蛋白酶抑制剂AEBSF即刻中和蛋白酶活性。将显示超过背景值的富集的噬菌体输出用于感染大肠杆菌。将感染大肠杆菌的细胞用于制备下一轮选择的噬菌体(噬菌体补救)或接种于琼脂培养板(LB+amp+葡萄糖2%)上用于分析单个的VHH克隆。为了筛选特异性结合物的选择输出，从琼脂培养板挑取单一群落且使其在1mL96深孔培养板中生长。通过添加IPTG(终浓度为0.1-1mM)来诱导受LacZ控制的VHH表达。根据标准方法制备周质提取物(体积约80μL)。

实施例4

VEGF结合和VEGF受体阻断VHH的鉴定

通过ELISA测试周质提取物对人VEGF165的结合。简言之，在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将2μg/mL重组人VEGF165固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。在添加通常稀释10倍的周质提取物之后，使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)来检测VHH结合。将显示ELISA信号高于背景值3倍以上的克隆视为VEGF结合VHH。

此外，在人VEGF165/人VEGFR2AlphaScreen分析(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)中筛选周质提取物以评估VHH的阻断能力。使用磺基-NHS-LC生物素(Pierce,Rockford,IL,USA)对人VEGF165进行生物素化。根据制造商说明书(PerkinElmer,Waltham,MA,US)，使用偶合至受体微珠的抗人FcVHH来捕获人VEGFR2/Fc嵌合体(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。为了评估VHH的中和能力，用含有0.03%吐温20(Tween20，Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液将周质提取物稀释25倍且在室温(RT)下与0.4nM生物素化的人VEGF165一起预培养15分钟。将受体微珠(10μg/ml)及0.4nMVEGFR2huFc添加至该混合物中且在室温于黑暗中再培养1小时。随后添加供体微珠(10μg/ml)，接着在室温于黑暗中培养1小时。通过使用680nm的激发波长及介于520nm与620nm之间的发射波长在Envision多标记培养板读取器(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)上读取培养板来测量荧光。将含有无关VHH的周质提取物用作阴性对照。含有能够使荧光信号相对于阴性对照信号减少60%以上的抗VEGF165VHH的周质提取物鉴别为击中物(hit)。AlphaScreen中鉴别出的所有击中物均在竞争ELISA中加以确认。为此，将1μg/mL人VEGFR2嵌合体(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在固定浓度(4nM)的生物素化的人VEGF165的存在下，在含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液中培养稀释5倍的周质提取物。使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,StLouis,MO,USA)来检测所述VHH/bio-VEGF165复合物对人VEGFR2嵌合体涂布的培养板的结合。VEGF结合(非受体阻断)VHH和抑制性(受体阻断)VHH的VHH序列ID及相应氨基酸序列分别列于表2及表3中。

在Biacore(BiacoreT100仪器，GEHealthcare)上分析抑制性VHH的解离速率。将HBS-EP+缓冲液用作操作缓冲液且在25℃进行实验。重组人VEGF165通过胺缀合(使用EDC及NHS)以不可逆方式被捕获在CM5传感器芯片上直至+/-1500RU的目标程度。在固定之后，注射10分钟1M乙醇胺(pH8.5)来使表面失活。参考表面分别用EDC/NHS及乙醇胺来活化及失活。VHH的周质提取物在操作缓冲液中稀释10倍以45μl/分钟注射2分钟且使其解离10或15分钟。在不同样品之间，用再生缓冲液使表面再生。通过减去关于参考通道的曲线及空白操作缓冲液注射而对数据进行双重参考处理。通过在BiacoreT100评估软件v2.0.1中拟合两阶段衰减模型(twophasedecaymodel)来评估经处理的曲线。快速k_d、缓慢k_d及快速%的值列于表4中。

表4：利用Biacore的受体阻断的VHH的解离速率测定

n/d，未测定

实施例5

纯化VHH的表征

选择以下三个抑制性抗VEGFVHH以纯化蛋白形式来进一步表征：VEGFBII23B04、VEGFBII24C4和VEGFBII23A6。所述VHH在大肠杆菌TG1中表达为c-myc、标记His6的蛋白。通过添加1mMIPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。所述提取物用作起始物质通过IMAC及尺寸排阻色谱法(SEC)纯化VHH。最终VHH制备物经SDS-PAGE评估显示了95%的纯度。

5.1在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断ELISA中对阻断人VEGF165/VEGFR2的VHH的评估

在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断ELISA中评估VHH的阻断能力。简言之，将1μg/mLVEGFR2-Fc嵌合体(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在4nM生物素化的VEGF165存在下培养含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围1mM-64pM)。使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,StLouis,MO,USA)及TMB作为底物来检测bio-VEGF165对VEGFR2的残余结合。贝伐单抗()及雷珠单抗(Ranibizumab，)作为对照一起进行处理。图20中显示剂量抑制曲线，表5中总结了相应的IC₅₀值和抑制%。

表5：hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争ELISA中的单价VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII23B04	2.1	100
VEGFBII23A06	3.0	100
			VEGFBII24C04	2.5	100
雷珠单抗	1.6	100
			贝伐单抗	1.7	100

5.2在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断ELISA中对阻断人VEGF165/VEGFR2的VHH的评估

也在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断ELISA中评估VHH。简言之，将2μg/mLVEGFR1-Fc嵌合体(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在0.5nM生物素化的VEGF165存在下培养含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围1mM-64pM)。使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,StLouis,MO,USA)及TMB作为底物来检测bio-VEGF165对VEGFR1的残余结合。将贝伐单抗、雷珠单抗及无关VHH(2E6)作为对照一起进行处理。图2中显示剂量抑制曲线，表6中总结了相应的IC₅₀值和抑制%。

表6：hVEGF165/hVEGFR1-Fc竞争ELISA中的单价VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII23B04	0.5	64
VEGFBII23A06	0.9	55
			VEGFBII24C04	0.8	71
雷珠单抗	1.2	91
			贝伐单抗	1.5	96

5.3在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断AlphaScreen中评估抗VEGF165VHH

也在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断AlphaScreen中评估VHH的阻断能力。简言之，将于含有0.03%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围：200nM-0.7pM)添加至4pMbio-VEGF165中且培养15分钟。随后添加VEGFR2-Fc(0.4nM)及抗FcVHH涂布的受体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养该混合物1小时。最后，添加链菌抗生物素蛋白供体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养1小时后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图3中显示剂量-反应曲线。表7中概述阻断人VEGF165与人VEGFR2-Fc相互作用的VHH的IC₅₀值。

表7：hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争AlphaScreen中的VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(pM)	抑制%
			VEGFBII23B04	160	100
VEGFBII23A06	250	100
			VEGFBII24C04	250	100
雷珠单抗	860	100

5.4在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断AlphaScreen中评估抗VEGF165VHH

亦在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断AlphaScreen中评估VHH的阻断能力。简言之，将于含有0.03%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围：500nM-1.8pM)添加至0.4nMbio-VEGF165中且培养15分钟。随后添加VEGFR1-Fc(1nM)及抗FcVHH涂布的受体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养该混合物1小时。最后，添加链菌抗生物素蛋白供体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养1小时后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图4中显示剂量-反应曲线。表8中总结了阻断人VEGF165与人VEGFR1-Fc相互作用的VHH的IC₅₀值和抑制%。

表8：hVEGF165/hVEGFR1-Fc竞争AlphaScreen中的VHH的IC₅₀(nM)值

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII23B04	0.9	41
VEGFBII23A06	0.4	46
			VEGFBII24C04	0.2	53
雷珠单抗	3.3	79

5.5人VEGF165-VHH相互作用的亲和性的测定

在BiacoreT100仪器上通过SPR分析VHHVEGFBII23B04与hVEGF165的结合动力学。通过胺偶合(使用EDC及NHS)将重组人VEGF165直接固定在CM5芯片上。在介于10与360nM之间的不同浓度下分析VHH。样品注射2分钟且使其在45μl/分钟的流速下解离多达20分钟。在样品注射之间，用100mMHCl使芯片表面再生。HBS-EP+(Hepes缓冲液(pH7.4)+EDTA)用作操作缓冲液。通过BiacoreT100评估软件v2.0.1使用两态反应模型(TwoStateReactionmodel)拟合结合曲线。计算出的抗VEGFVHH的亲和性列于表9中。

表9：重组人VEGF165的纯化VHH的亲和性K_D(nM)

(a)导致非1:1拟合的异质结合曲线，通过BiacoreT100评估软件v2.0.1使用两态反应模型来拟合曲线

5.6对小鼠VEGF164的结合

使用结合ELISA来确定对小鼠VEGF164的交叉反应性。简言之，在4℃在1μg/mL下于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将重组小鼠VEGF164(R&DSystems,Minneapolis,MS,USA)涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以于含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中之一系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)、随后在底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下进行酶促反应来检测结合(图5-1和5-2)。包括作为阳性对照的小鼠VEGF164反应性mAb。还测量对人VEGF165的结合作为参考。EC₅₀值总结于表10中。

表10：重组人VEGF165及小鼠VEGF164结合ELISA中的VHH的EC₅₀(pM)值

	rhVEGF165	rmVEGF164
			VHH ID	EC₅₀(pM)	EC₅₀(pM)
VEGFBII23B04	297	NB
			VEGFBII24C04	453	NB
VEGFBII23A06	531	NB

NB，未结合

5.7对VEGF121的结合

通过固相结合ELISA评估对重组人VEGF121的结合。简言之，在4℃在1μg/mL下于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将重组人VEGF121(R&DSystems,Minneapolis,MS,USA)涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以于含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中之一系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)、随后在底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下进行酶促反应来检测结合(图6)。将VEGFR2的系列稀释液作为阳性对照一起进行处理。EC₅₀值总结于表11中。

表11：重组人VEGF121结合ELISA中的单价VHH的EC₅₀(pM)值

VHH ID	EC₅₀(pM)
		VEGFBII23B04	510
VEGFBII24C04	792
		VEGFBII23A06	928

5.8对VEGF家族成员VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF的结合

通过固相结合ELISA评估对VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF的结合。简言之，在4℃在1μg/mL下于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(R&DSystems,Minneapolis,MS,USA)涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以一系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP缀合物(Sigma,StLouis,MO,USA)来检测结合。将适当受体的系列稀释液作为阳性对照一起进行操作，且用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG(Fc特异性抗体)(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.,WestGrove,PA,USA)、随后在底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下进行酶促反应来检测。图7-1至7-4中显示VHH及对照的剂量-反应曲线。结果显示未检测到所选VHH对VEGFB、VEGFC、VEGFD或PlGF的结合。

5.9表位重新分级(Epitopebinning)

进行基于Biacore的表位重新分级实验，以研究哪些VEGF结合物可结合与VEGFBII23B04类似或重叠的表位。为此，将VEGFBII23B04固定在CM5传感器芯片上。对于各样品，人VEGF165通过芯片表面且由VEGFBII23B4以可逆方式捕获。接着在240秒的表面接触时间并以10微升/分钟的流速注射纯化的VHH(100nM)或周质提取物(稀释10倍)。在不同样品之间，用再生缓冲液(100mMHCl)使芯片表面再生。用BiacoreT100评估软件来评估经处理的曲线。VHH可划分为两组：对捕获VEGFBII23B04的VEGF165产生额外结合的第1组，以及不能同时与捕获VEGFBII23B04结合的VEGF165的第2组。表12-A总结了所测定VHH的结合表位。

用相同的分析设置评估VEGFR1、VEGFR2、雷珠单抗及贝伐单抗是否能够与VEGFBII23B04同时结合人VEGF-165。表12-B显示对捕获VEGFBII23B04的VEGF165的额外结合反应。仅有VEGFR2是不能与捕获VEGFBII23B04的VEGF165结合的，从而强调了VEGFBII23B04对VEGF-VEGFR2相互作用的阻断能力。此外，所述数据显示VEGFBII23B04表位与贝伐单抗及雷珠单抗的表位是不同的。

表12-A：抗VEGFVHH的表位重新分级-同时与VEGFBII23B04结合

*指示相同或重叠表位

表12-B：VEGFBII23B04的表位重新分级-VEGFBII23B04捕获的VEGF165上的基准抑制剂或同源受体的结合

注射步骤	结合	[样品]	结合水平(RU)
				1	VEGF165	100nM	1727
2	VEGFBII23B04	100nM	-
				3	雷珠单抗	100nM	763
4	贝伐单抗	100nM	1349
				5	VEGFR1	100nM	1011
6	VEGFR2	100nM	-

5.10HUVEC增殖分析中抗VEGFVHH的表征

在增殖分析中评估所选VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿(supplement-starved)，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过引入[³H]-胸苷来测量增殖速率。HUVEC增殖分析结果示于表中。

表13：VEGFHUVEC增殖分析中的单价VEGFBII23B04、VEGFBII23A06及VEGFBII24C04的IC₅₀(nM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII23B04	0.36	91
贝伐单抗	0.21	92

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII23A06	4.29	73
VEGFBII24C04	3.8	79
			贝伐单抗	0.78	78

5.11HUVECErk磷酸化分析中抗VEGFVHH的表征

在HUVECErk磷酸化分析中评估所选VHH的效能。简言之，使初级HUVE细胞过夜经受血清饥饿(serum-starved)，接着用10ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激5分钟。用PBS中的4%甲醛固定细胞且使用磷酸ERK特异性抗体(抗磷酸MAP激酶pERK1及pERK2，M8159,Sigma)及多株兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP缀合物(PO161,Dako)通过ELISA来测量ERK磷酸化程度。如表14中所示，VEGFBII23B04及贝伐单抗以IC₅₀<1nM抑制VEGF诱导的Erk磷酸化至少90%。

表14：VEGFHUVECErk磷酸化分析中的单价VEGFBII23B04的IC₅₀(nM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII23B04	0.37	90
贝伐单抗	0.63	98

实施例6

多价抗VEGF阻断的VHH的产生

VHHVEGFBII23B04以基因改造方式融合至VEGFBII23B04中以产生同源二聚VHH或融合至不同VEGF结合VHH中以产生异源二聚(二价)VHH(氨基酸序列见表15)。为了产生异源二聚VHH，一组10个独特的VEGF结合VHH通过长度为9或40的Gly-Ser柔性连接子以两种不同的定向连接至VEGFBII23B04(氨基酸序列见表15)。同源二聚VEGFBII23B04(VEGFBII010)及40个异源二聚二价VHH在大肠杆菌TG1中表达为标记c-myc、His6的蛋白。通过添加1mMIPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。将所述提取物用作起始物质且通过IMAC及脱盐来纯化VHH，经SDS-PAGE评估得到90%的纯度。

分别如实施例5.3及5.4中所述在VEGFR2和VEGFR1阻断AlphaScreen分析中测试40个二价VHH的嵌板。基于抑制的效能及最大抑制水平选择了5个最佳的二价VHH(VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBI023、VEGFBI024及VEGFBII025)以用于进一步表征。所选5个二价VHH在竞争性VEGFR2及VEGFR1AlphaScreen中的筛选结果的概述显示于表16中。

表16：VEGF/VEGFR1及VEGF/VEGFR2竞争AlphaScreen分析中的5种最优选二价VHH的效能及功效

实施例7

格式化VHH的表征

分别如实施例5.1、5.2、5.3及5.4中所述在VEGFR2及VEGFR1阻断ELISA(分别参见图8-1、8-2和9，表17及表18)及AlphaScreen分析(图10及11、表19及20)中并排比较VHHVEGFBII010、VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBII023、VEGFBII024和VEGFBII025。

表17：hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争ELISA中的格式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(pM)	抑制%
			VEGFBII010	49	100
VEGFBII021	204	100
			VEGFBII022	164	100
VEGFBII023	213	100
			VEGFBII024	292	100
VEGFBII025	577	100
			贝伐单抗	315	100
雷珠单抗	349	100

表18：VEGF165/hVEGFR1-Fc竞争ELISA中的格式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(pM)	抑制%
			VEGFBII010	73.5	67
VEGFBII021	254	97
			VEGFBII022	225	89
VEGFBII023	279	91
			VEGFBII024	326	92
VEGFBII025	735	91
			贝伐单抗	484	91
雷珠单抗	594	96

表19：hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争AlphaScreen中的格式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(pM)	抑制%
			VEGFBII010	16	100
VEGFBII021	7	100
			VEGFBII022	7	100
VEGFBII023	46	100
			VEGFBII024	50	100
VEGFBII025	51	100
			雷珠单抗	600	100

表20：VEGF165/hVEGFR1-Fc竞争AlphaScreen中的格式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(pM)	抑制%
			VEGFBII010	21	70
VEGFBII021	12	100
			VEGFBII022	9	98
VEGFBII023	48	87
			VEGFBII024	69	98
VEGFBII025	71	82
			雷珠单抗	1300	87

此外，还测试了格式化的VHH阻断mVEGF164/mVEGFR2-huFc相互作用的能力。简言之，将于含有0.03%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围：4μM-14.5pM)添加至0.1nM生物素化mVEGF164中且培养15分钟。随后，添加小鼠VEGFR2-huFc(0.1nM)及抗huFcVHH涂布的受体微珠(20μg/ml)，培养该混合物1小时。最后，添加链菌抗生物素蛋白供体微珠(20μg/ml)且在培养1小时之后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图12中显示剂量-反应曲线。表21中总结了阻断小鼠VEGF164/VEGFR2-hFC相互作用的VHH的IC₅₀值。

表21：mVEGF164/mVEGFR2-hFc竞争AlphaScreen中的格式化VHH的IC₅₀(pM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII022	108	100
VEGFBII024	-	-
			mVEGF164	0.05	100
雷珠单抗	-	-

也在ELISA中测试格式化的VHH与以下结合的能力：mVEGF164及人VEGF165(实施例5.6；图13-1和13-2；表22)、VEGF121(实施例5.7；图15；表23)，以及VEGF家族成员VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(实施例5.8；图14-1至14-8)。如实施例5.5中所述分析人VEGF165的结合动力学。K_D值列于表24中。

表22：重组人VEGF165及小鼠VEGF164结合ELISA中的格式化VHH的EC₅₀(pM)值

	rhVEGF165	rmVEGF164
			VHH ID	EC₅₀(pM)	EC₅₀(pM)
VEGFBII010	428	-
			VEGFBII021	334	502
VEGFBII022	224	464
			VEGFBII023	221	-
VEGFBII024	320	-
			VEGFBII025	668	-

表23：重组人VEGF121结合ELISA中的格式化VHH的EC₅₀(pM)值

	rhVEGF121
		VHH ID	EC₅₀(pM)
VEGFBII010	920
		VEGFBII022	540
VEGFBII024	325
		VEGFBII025	475

表24：重组人VEGF165的纯化格式化VHH的亲和性K_D(nM)

VHH ID	k_a1(1/Ms)	k_d1(1/s)	k_a2(1/s)	k_d2(1/s)	K_D(nM)^(a)
						VEGFBII010^(b)	4.5E+05	1.7E-02	2.9E-02	1.3E-04	0.16
VEGFBII021^(b)	1.2E+06	1.1E-02	2.3E-02	1.9E-04	0.07
						VEGFBII022^(b)	1.2E+06	9.1E-03	1.4E-02	2.6E-04	0.14
VEGFBII023^(b)	3.0E+05	1.8E-02	2.4E-02	2.7E-04	0.69
						VEGFBII024^(b)	3.0E+05	1.3E-02	2.6E-02	2.8E-04	0.47
VEGFBII025^(b)	3.3E+05	1.7E-02	1.8E-02	3.7E-04	1.1

^(a)K_D=k_d1/k_a1*(k_d2/(k_d2+k_a2))

^(b)使用两态反应模型通过BiacoreT100评价软件2.0.1版拟合曲线。

也在VEGF介导的HUVEC增殖及Erk磷酸化分析中测试VHHVEGFBII010、VEGFBII022、VEGFBII024和VEGFBII025。

在增殖分析中评估所选形式化VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过引入[³H]-胸苷来测量增殖速率。显示于表25中的结果说明形式化VHH及贝伐单抗抑制VEGF诱导的HUVEC增殖超过90%，其IC₅₀<1nM。

表25：VEGFHUVEC增殖分析中格式化VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII010	0.22	95
VEGFBII021	0.40	98
			VEGFBII022	0.34	100
VEGFBII023	0.52	98
			VEGFBII024	0.38	96
VEGFBII025	0.41	104
			贝伐单抗	0.21	92

在HUVECErk磷酸化分析中评估所选形式化VHH的效能。简言之，使初级HUVE细胞过夜经受血清饥饿，接着用10ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激5分钟。用PBS中的4%甲醛固定细胞且使用磷酸ERK特异性抗体(抗磷酸MAP激酶pERK1及2,M8159,Sigma)及多株兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP缀合物(PO161,Dako)通过ELISA来测量ERK磷酸化程度。如表26中所示，形式化VHH及贝伐单抗抑制VEGF诱导的Erk磷酸化超过90%，其IC₅₀<1nM。

表26：VEGFHUVECErk磷酸化分析中的格式化VHH的IC₅₀(nM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII010	0.19	92
VEGFBII021	0.21	103
			VEGFBII022	0.18	94
VEGFBII023	0.25	100
			VEGFBII024	0.23	94
VEGFBII025	0.23	99
			贝伐单抗	0.63	98

实施例8

序列优化

8.1VEGFBII23B04的序列优化

将VEGFBII23B04的氨基酸序列与人种系序列VH3-23/JH5比对，参见图16(SEQIDNO:179)。

比对显示VEGFBII23B04相对于参考生殖系序列含有19个骨架突变。选择位置14、16、23、24、41、71、82、83及108处的非人残基经其人生殖系对应物取代。产生一组在所述位置上具有不同组合的人残基的8个VEGFBII23B04变异体(氨基酸序列列于表27中)。构建通过引入S60A突变来移除位置D59S60处的潜在异构化位点(CDR2区域，参见图16，指示为粗斜体残基)的另一变异体。

所述变异体以纯化蛋白形式在VEGF165/VEGFR2AlphaScreen中进行表征(实施例5.3，图17)。在热位移分析中测定各克隆的熔融温度(T_m)，该分析基于荧光信号在并入宝石橙(Invitrogen)后的增加(Ericsson等人,Anal.Biochem.357(2006),第289-298页)。所有变异体显示与VEGFBII23B04相当的IC₅₀及与亲本VEGFBII23B04相比类似或较高的T_m值。表28总结了所测试9个克隆的IC₅₀值及pH为7时的T_m值。

表28：VEGFBII23B04的序列优化变体的IC₅₀(pM)值、抑制%及熔融温度(在pH7下)

VHH ID	IC₅₀(pM)	抑制%	pH7下的T_m，(℃)
				VEGFBII23B04(wt)	169	100	63
VEGFBII111D05	209	100	68
				VEGFBII111G06	366	100	71
VEGFBII112D11	221	100	70
				VEGFBII113A08	253	100	69
VEGFBII113E03	290	100	68
				VEGFBII114C09	215	100	71
VEGFBII114D02	199	100	74
				VEGFBII114D03	227	100	64
VEGFBII118E10	189	100	62

在第二循环中，将人化成果(VEGFBII111G06)的可耐受突变与避免所选位点处的潜在翻译后修饰的突变(D16G、S60A取代及E1D突变)相组合，从而产生源自VEGFBII23B04的序列优化克隆：VEGFBII0037。预期得到含有除I82M突变外与VEGFBII0037相同的取代的一个额外的序列优化变异体(VEGFBII038)，因为此突变可能与效能的微小降低相关。两个序列优化克隆的序列列于表29中。在VEGF165/VEGFR2阻断AlphaScreen(实施例5.3，图18)中对VEGFBII0037及VEGFBII0038进行表征，在如上所述的热位移分析中测定熔融温度且在Biacore(实施例5.5)中测定结合VEGF165的亲和性。2个序列优化VHH的特征的概述于表30中。

表29：VHHVEGFBII23B04的序列优化变体的氨基酸序列

表30：序列优化克隆VEGFBII037及VEGFBII038的IC₅₀(pM)值、抑制%、熔融温度(在pH7下)及亲和性(pM)

VHH ID	IC₅₀(pM)	抑制%	pH7下的T_m(℃)	K_D(pM)
					VEGFBII23B04	152	100	63	560
VEGFBII037	300	100	72	270
					VEGFBII038	143	100	71	360

8.2VEGFBII5B05的序列优化

将VEGFBII5B05的氨基酸序列与人种系序列VH3-23/JH5进行比对；参见图19(SEQIDNO:179)。比对显示VEGFBII5B05相对于参考种系序列含有15个骨架突变。选择位置23、60、83、105、108处的非人残基经其人种系对应物取代，同时选择位置44处的组氨酸由谷氨酰胺取代。构建具有6个所述突变的一个人化变异体(氨基酸序列列于表31中)。

表31：VHHVEGFBII5B05的序列优化变体的氨基酸序列(FR，骨架区；CDR；互补决定区)

通过引入M30I突变来移除位置M30处的潜在氧化位点(CDR1区域，参见图19，指示为粗斜体残基)，从而构建另一变异体。使用ProteOn测试两个变异体结合hVEGF165的能力。简言之，用人VEGF165涂布GLCProteOn传感器芯片。将该变异体的周质提取物稀释10倍且横跨涂布有人VEGF165的芯片加以注射。计算解离速率且与亲本VEGFBII5B05的解离速率相比较。2个变异体的解离速率与亲本VEGFBII5B05的解离速率在相同范围内，表明所有突变均可耐受(表32)。

表32：序列优化变体VEGFBII5B05的解离速率

VHH ID	结合水平(RU)	k_d(1/s)
			VEGFBII5B05	242	6.15E-02
VEGFBII119G11	234	7.75E-02
			VEGFBII120E10	257	4.68E-02

在第二循环中，将人化成果的突变与M30I取代相组合，从而产生VEGFBII5B05的序列优化克隆，命名为VEGFBII032。序列列于表33中。通过Biacore测定VEGFBII032的亲和性(参见实施例5.5)且在如上所述的热位移分析中测定熔融温度。序列优化的VHHVEGFBII032的特征的概述于表34中。

表33：序列优化克隆VEGFBII032的氨基酸序列(FR，骨架区；CDR；互补决定区)

表34：序列优化克隆VEGFBII032的熔融温度(于pH7下)及亲和性(nM)

VHH ID	pH7下的T_m(℃)	K_D(nM)
			VEGFBII5B05(wt)	69	32
VEGFBII0032	71	44

在增殖分析中评估序列优化克隆VEGFBII037及VEGFBII038的效能。简言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过引入[³H]-胸苷来测量增殖速率。表35中显示的结果说明亲本VHHVEGFBII23B04的活性(效能及抑制度)保留于序列优化克隆VEGFBII038中。

表35：VEGFHUVEC增殖分析中的序列优化克隆VEGFBII037及VEGFBII038的IC₅₀(nM)值及抑制%

VHH ID	IC₅₀(nM)	抑制%
			VEGFBII23B04	0.68	92
VEGFBII037	1.54	78
			VEGFBII038	0.60	92
贝伐单抗	0.29	94

Claims

1.VEGF结合分子，其包含至少一个免疫球蛋白单一可变域，该可变域具有四个骨架区及三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区，

其中

-所述CDR1由氨基酸序列SYSMG组成；

-所述CDR2由氨基酸序列AISKGGYKYDAVSLEG组成；

-所述CDR3由氨基酸序列SRAYGSSRLRLADTYEY组成；且

其中该VEGF结合分子能够以≥60％的抑制率阻断人重组VEGF165与人重组VEGFR-2之间的相互作用。

2.权利要求1的VEGF结合分子，其由SEQIDNO:56或SEQIDNO:57组成。

3.核酸分子，其编码权利要求1或2的VEGF结合分子。

4.载体，其含有权利要求3的核酸分子。

5.宿主细胞，其含有权利要求3的核酸分子或权利要求4的载体。

6.药物组合物，其含有至少一种权利要求1或2的VEGF结合分子作为活性成分。

7.权利要求6的药物组合物，其用于治疗与VEGF所介导血管发生的效应相关的疾病。

8.权利要求6或7的药物组合物，其用于治疗癌症。

9.根据权利要求6或7的药物组合物，其用于治疗眼病。