BR112013005151A2 - moléculas de ligação a vegf - Google Patents

Abstract

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A VEGF. Moléculas de ligação a VEGF, de preferência domínios variáveis únicos de imunoglobulina de ligação a VEGF como VHHs e anticorpos de domínio, composições farmacêuticas que as contenham e seu uso no tratamento de doenças que estejam associadas aos efeitos mediados por VEGF sobre a angiogênese. Ácidos nucléicos que codificam moléculas de ligação a VEGF, células hospedeiras e métodos para sua preparação.

Description

i 1/108 , Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A VEGF".

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção se refere ao campo de terapia humana, em particular terapia de câncer, e a agentes e composições utilizáveis nessa terapia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Conforme descrito em, por exemplo, US 2008/0014196 e WOZ2008101985, a angiogênese está implicada na patogênese de inúmeros distúrbios, incluindo tumores sólidos e metástases, assim como doenças Y 10 oculares. Um dos fatores pró-angiogênicos mais importantes é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), também chamado de VEGF-A ou co fator de permeabilidade vascular (VPF). O VEGF pertence a uma família de genes que inclui o fator de crescimento de placenta (PIGF), VEGF-B, VEGF- : C, VEGF-D, VEGF-E e VEGF-F. O splicing alternativo de MRNA de um úni- cogenede VEGF humano resulta em pelo menos seis isoformas (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF 183, VEGF 189, e VEGF206), o VEGF165 sendo | a isoforma mais abundante. Foram identificados dois receptores de VEGF do tipo tirosina quinase (VEGFR) que interagem com VEGF, isto é, VEGFR-1 (também co- —nhecido como FIt-1) e VEGFR-2 (também conhecido como KDR ou FIK-1). VEGFR-1 tem a maior afinidade por VEGF, ao passo que VEGFR- 2 tem uma afinidade ligeiramente menor por VEGF. Ferrara (Endocrine Rev. 2004, 25: 581-611) apresentam uma descrição detalhada de VEGF, a interação com seus receptores e sua função em processos normais e patológicos po- dem ser encontradas em Hoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-580. Relatou-se que VEGF é um regulador chave tanto de angiogê- nese normal, quanto anormal (Ferrara e Davis-Smyth, Endocrine Rev. 1997, 18: 4-25; Ferrara J. Mol Med. 1999, 77: 527-543). Em comparação com ou- tros fatores de crescimento que contribuem para os processos de formação vascular, o VEGF é único em sua elevada especificidade para células endo- teliais dentro do sistema vascular. O mRNA de VEGF está superexpressado na maioria dos tumo-

p 2/108 be res humanos.

No caso de crescimento tumoral, a angiogênese parece ser crucial para a transição de hiperplasia para neoplasia, e para fornecer nutri- ção para o crescimento e metástase do tumor (Folkman et al., 1989, Nature 339 -58), o que permite que as células tumorais adquiram uma vantagem de crescimento em comparação com células normais.

Consequentemente, te- rapias antiangiogênese se tornaram uma importante opção de tratamento para vários tipos de tumores.

Essas terapias focalizaram no bloqueio da via de VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May; 3(5): 391-400. O VEGF também está envolvido em doenças oculares.

A con- " 10 centração de VEGF em fluidos oculares está altamente correlacionada com a presença de proliferação ativa de vasos sanguíneos em pacientes com o retinopatias diabéticas e outras relacionadas a isquemia.

Além disso, estu- : dos recentes demonstraram a localização de VEGF em membranas neovas- f culares coroideias em pacientes afetados por degeneração macular relacio- nadaàidade (AMD). A regulação para cima de VEGF também foi observada em vários distúrbios inflamatórios.

O VEGF foi implicado na patogênese de RA, uma doença inflamatória em que a angiogênese desempenha um papel significativo.

A elucidação do VEGF e seu papel na angiogênese e diferentes processos proporcionou um novo alvo em potencial de intervenção terapêu- tica.

A função do VEGF foi inibida por pequenas moléculas que bloqueiam ou impedem a ativação de tirosina quinases de receptor de VEGF (Schlaeppi e Wood, 1999, Cancer Metastasis Rev., 18: 473-481) e, consequentemente, interferem com a via de transdução de sinal de receptor de VEGF.

Conjuga- dos citotóxicos contendo toxinas bacterianas ou vegetais podem inibir o efei- to estimulador do VEGF sobre a angiogênese tumoral.

Conjugados de VEGF-toxina DT385 (domínios de toxina diftérica fusionados ou quimica- mente conjugados a VEGF165), por exemplo, inibem eficientemente o cres- cimento tumoral in vivo.

A inibição do crescimento tumoral também pode ser conseguida por distribuição de um mutante FIk-1 ou receptores de VEGF solúveis por um retrovírus.

Foram desenvolvidos anticorpos neutralizadores de VEGF, como

: 3/108 ” A4.6.1 e MV833, para bloquear o VEGF de se ligar a seus receptores, que demonstraram atividade antitumoral pré-clínica (Kim et al. Nature 1993, 362: 841-844; Folkman Nat. Med. 1995, 1: 27-31; Presta et al. Cancer Res. 1997, 57: 4593-4599; Kanai et al. Int. J. Cancer 1998, 77: 933-936; Ferrara e Alita- lo Nat Med. 1999, 5: 1359-1364; 320, 340). Para uma revisão dos ensaios de abordagem terapêutica anti-VEGF, veja Campochiaro e Hackett (Onco- gene 2003, 22: 6537-6548).

A maior parte da experiência clínica foi obtida com A4.6.1, tam- bém chamado de bevacizumab (Avastin&; Genentech, San Francisco, CA). " 10 O WOZ2008101985 descreve domínios variáveis únicos de imu- noglobulina de camelideos (VHHs ou "Nanobodies&", conforme aqui defini- - do) que se ligam a VEGF e seu uso no tratamento de condições e doenças caracterizadas por angiogênese ou neovascularização excessiva e/ou pato- ' lógica. É um objetivo da presente invenção apresentar novas moléculas de ligação a VEGF aperfeiçoadas.

É um objetivo adicional da invenção apresentar métodos para a prevenção, tratamento, alívio e/ou diagnóstico dessas doenças, distúrbios ou condições, envolvendo o uso e/ou administração desses agentes e composi- ções. Em particular, é um objetivo da invenção apresentar agentes farmaco- logicamente ativos, composições e/ou métodos que apresentam vantagens em comparação com os agentes, composições e/ou métodos atualmente usados e/ou conhecidos na técnica. Essas vantagens incluem propriedades terapêuticas e/ou farmacológicas aperfeiçoadas e/ou outras propriedades vantajosas, por exemplo, para fins de fabricação, particularmente em compa- ração com anticorpos anti-VEGF convencionais, como aqueles acima descri- tos, ou seus fragmentos.

Mais particularmente, é um objetivo da invenção apresentar no- vas moléculas de ligação a VEGF, e, especificamente, moléculas de ligação aVEGF que se ligam a VEGF de mamíferos e, especificamente, VEGF hu- mano, em que essas moléculas ou polipeptídios são adequados para os fins terapêuticos e diagnósticos aqui descritos. É um objetivo adicional da inven-

. ção apresentar domínios variáveis únicos de imunoglobulina que se ligam especificamente a VEGF.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO De acordo com um primeiro aspecto, apresentam-se moléculas deligaçãoaVEGF, de preferência domínios variáveis únicos de imunoglobu- lina de ligação a VEGF como VHHs e anticorpos de domínio.

Em outro aspecto, a invenção se refere a ácidos nucleicos que codificam moléculas de ligação a VEGF, assim como a células hospedeiras contendo esses ácidos nucleicos.

7 10 A invenção também se refere a um produto ou composição con- tendo ou compreendendo pelo menos uma molécula de ligação a VEGF da o invenção e, opcionalmente, um ou mais componentes adicionais dessas composições. ' A invenção também se refere a métodos para a preparação ou geração das moléculas de ligação a VEGF, ácidos nucleicos, células hospe- deiras, produtos e composições aqui descritos.

A invenção também se refere a aplicações e usos das moléculas de ligação a VEGF, ácidos nucleicos, células hospedeiras, produtos e com- posições aqui descritos, assim como a métodos para a prevenção e/ou tra- tamento de doenças associadas a efeitos mediados por VEGF sobre a angi- ogênese.

Esses e outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção ficarão claros com a descrição adicional abaixo.

DEFINIÇÕES A menos que indicado ou definido de outra forma, todos os ter- mos usados têm seu significado usual na técnica, que ficará claro para aque- les versados na técnica. Faz-se referência, por exemplo, aos manuais pa- drões, como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2º Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), e Roitt et al., "Immunology" (2º Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), assim como os fundamentos da técnica aqui citados. Além disso, a menos que indicado

. de outra forma, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não sejam especificamente descritos em detalhes podem ser realizados e foram realizados de maneira conhecida, como ficará claro para aqueles versados na técnica. Mais uma vez, faz-se referência, por exemplo, aos manuais pa- drões, aos fundamentos genéricos da da técnica acima mencionados e às referências adicionais aí citadas.

A menos que indicado de outra forma, os termos "imunoglobuli- na" e "sequência de imunoglobulina" - quer aqui usados para se referirem a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo de 4 cadeias convencio- " 10 nal- são usados como termos genéricos para incluir tanto o anticorpo de tamanho completo, as suas cadeias individuais, quanto todas as suas par- o tes, domínios ou fragmentos (incluindo, mas não limitados a, domínios ou fragmentos de ligação a antígeno como domínios VHH ou domínios VH/VL, ft respectivamente). além disso, o termo "sequência", conforme aqui usado | (por exemplo, em termos como "sequência de imunoglobulina", "sequência de anticorpo", "sequência de domínio variável (única)", "sequência de VHH" ou "sequência de proteína"), deve ser genericamente entendido como inclu- | indo tanto a sequência de aminácidos relevante, quanto as sequências de ácido nucleico ou sequências de nucleotídeos que os codificam, a menos queo contexto requeira uma interpretação mais limitada.

O termo "domínio" (de um polipeptídio ou proteína), conforme aqui usado, refere-se a uma estrutura de proteína dobrada que tem a capa- cidade de reter sua estrutura terciária independentemente do restante da proteína. Genericamente, os domínios são responsáveis por propriedades funcionais distintas das proteínas e, em muitos casos, podem ser adiciona- dos, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função para o restante da proteína e/ou do domínio.

O termo "domínio de imunoglobulina", conforme aqui usado, re- fere-se a uma região globular de uma cadeia de anticorpo (como, por exem- plo, uma cadeia de um anticorpo de 4 cadeias convencional ou de um anti- corpo de cadeia pesada), ou a um polipeptídio que consista essencialmente nessa região globular. Domínios de imunoglobulina se caracterizam pelo fato

. de que retêm a característica dobrada de imunogiobulina de moléculas de anticorpo, que consistem em um sanduíche de 2 camadas de cerca de 7 fitas beta antiparalelas dispostas em duas folhas beta, opcionalmente estabi- lizadas por uma ligação dissulfeto conservada.

O termo "domínio variável de imunoglobulina", conforme aqui usado, significa um domínio de imunoglobulina consistindo essencialmente em quatro "regiões de armação" que são chamadas na técnica e abaixo de "região de armação 1" ou "FR1"; de "região de armação 2" or"FR2"; de "re- gião de armação 3" ou "FR3"; e de "região de armação 4" ou "FR4", respec- , 10 tivamente; essas regiões de armação sendo interrompidas por três "regiões determinantes de complementariedade" ou "CDRs", que são chamadas na P técnica e abaixo de "região determinante de complementariedade 1" ou "C- DR1"; de "região determinante de complementariedade 2" ou "CDR2"; e de bi "região determinante de complementariedade 3" ou "CDR3", respectivamen- te. Assim, a estrutura ou sequência genérica de um domínio variável de imu- noglobulina pode ser indicado da seguinte maneira: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FRA4. É(são) o(s) domínio(s) variável(eis) de imuno- globulina que confere(m) especificidade a um anticorpo para o antígeno ao portar(em) o sítio de ligação a antígeno.

O termo "domínio variável único de imunoglobulina", conforme aqui usado, significa um domínio variável de imunoglobulina que é capaz de se ligar especificamente a um epítopo do antígeno sem pareamento com um domínio de imunoglobulina variável adicional. Um exemplo de domínios vari- áveis únicos de imunoglobulina no significado da presente invenção são "an- ticorpos de domínio", como os domínios variáveis únicos de imunoglobulina VH e VL (domínios VH e domínios VL). Outro exemplo de domínios variáveis únicos de imunoglobulina são "domínios VHH" (ou simplesmente "VHHs") de camelídeos, conforme definido a seguir.

Em vista da definição acima, o domínio de ligação a antígeno de um anticorpo de 4 cadeias convencional (como uma molécula de IgG, IgM, IgA, I1gD ou IgE; conhecida na técnica) ou de um fragmento Fab, um frag- mento F(ab')2, um fragmento Fv como um fragmento Fv ou um scFv ligado

. por dissulfeto ou um diacorpo (todos conhecidos na técnica) derivados des- ses anticorpo de 4 cadeias convencional normalmente não seria considerado como um domínio variável único de imunoglobulina, pois, nesses casos, a ligação ao respectivo epítopo de um antigeno normalmente não ocorreria por um (único) domínio de imunoglobulina, mas por um par de domínios de imu- noglobulina (em associação), como domínios variáveis de cadeia leve e pe- | sada, isto é, por um par VH-VL de domínios de imunoglobulina, que se ligam conjuntamente a um epítopo do respectivo antígeno. "Domínios VHH", também conhecidos como VHHs, domínios : 10 VHH, fragmentos de anticorpo VHH e anticorpos VHH, foram originalmente descritos como o domínio (variável) de imunoglobulina de ligação a antígeno . i de "anticorpos de cadeia pesada" (isto é, de "anticorpos desprovidos de ca- 7 deias leves"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson i G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). O termo "domínio VHH" foi escolhido para distinguir esses domínios variáveis dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (que são aqui chamados de "domínios V4" ou "do- ' mínios VH") e dos domínios variáveis de cadeia leve que estão presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (que são aqui chamados de "do- mínios V," ou "domínios VL"). Domínios VHH podem se ligar especificamen- te a um epítopo sem um domínio de ligação a antígeno adicional (em oposi- ção aos domínios VH ou VL em um anticorpo de 4 cadeias convencional, caso em que o epítopo é reconhecido por um domínio VL juntamente com um domínio VH). Domínios VHH são unidades de reconhecimento de antí- geno pequenas, robustas e eficientes, formadas por um único domínio de imunoglobulina.

No contexto da presente invenção, os termos domínio VHH, VHH, domínio VAH, fragmento de anticorpo VHH, anticorpo VHH, assim co- mo "Nanobody&" e "domínio NanobodyO" ("Nanobody" é uma marca regis- trada da companhia Ablynx N.V.; Ghent; Bélgica) são usados de maneira itnercambuável e são representativos de domínios variáveis únicos de imu-

. noglobulina (com a estrutura FR1I-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e que se ligam especificamente a um epítopo sem requerer a presença de um se- gundo domínio variável de imunoglobulina), e que se distinguem de domí- nios VH pelos chamados "resíduos distintivos", conforme definido, por e- xemplo,noWOZ2009/109635, Fig. 1. Os resíduos de aminoácidos de um domínio variável único de imunoglobulina, por exemplo, um VHH, são numerados de acordo com a numeração genérica para domínios V"y dada por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", Serviços Norte-americanos de Saúde : 10 Pública, NIH Bethesda, MD, Publicação nº 91), conforme aplicado a domí- nios VHH de camelídeos, como mostrado, por exemplo, na Figura 2 de Rie- - chmann e Muyldermans, J. Immunol. Métodos 231, 25-38 (1999). De acordo ' com essa numeração, Í - FR1 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 1- 30, - CDR1 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições | 31-35, - FR2 compreende os aminoácidos nas posições 36-49, : - CDR2 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 50-65, - FR3 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 66- 94, - CDR3 compreende os resíduos de amincácidos nas posições 95-102, e - FR4 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 103-113.

Entretanto, deve-se notar que - conforme se sabe na técnica pa- ra domínios Vy e para domínios VHH - o número total de resíduos de amino- ácidos em cada uma das CDRs pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos de aminoácidos indicados pela numeração de Ka- bat (isto é, uma ou mais posições de acordo com a numeração de Kabat po- dem não estar ocupadas na sequência real, ou a sequência real pode conter

AEE AI IEEE A EO AA NA NM M— os — MA RIM NAAS 9/108 . mais resíduos de aminoácidos do que o número permitido pela numeração de Kabat). Isso significa que, genericamente, a numeração de acordo com Kabat pode ou não corresponder à numeração real dos resíduos de aminoá- cidos na sequência real.

Métodos alternativos para a numeração dos resíduos de amino- ácidos de domínios Vy, esses métodos também podendo ser aplicados de maneira análoga a domínios VHH, são conhecidos na técnica. Entretanto, nas presentes descrição, reivindicações e figuras, será seguida a numeração de acordo com Kabat e aplicada a domínios VHH conforme acima descrito, a menos que indicado de outra forma. O número total de resíduos de aminoácidos em um domínio . i VHH normalmente estará na faixa de 110 a 120, frequentemente entre 112 e .

115. Entretanto, deve-se notar que sequências menores e maiores também ' podem ser adequadas para as finalidades aqui descritas.

Métodos de obtenção de VHHs que se liguem a um antígeno ou epítopo específico foram descritos anteriormente, por exemplo, nos WO2006/040153 e WO2006/122786. Conforme aí também descrito em deta- lhes, domínios VHH derivados de camelideos podem ser "humanizados" (a- - qui também chamado de "de sequência otimizada", a "otimização de se- —quência" podendo, além da humanização, englobar uma modificação adicio- nal da sequência por uma ou mais mutações que fornecem o VHH com pro- priedades aperfeiçoadas, como a remoção de sítios de modificação pós- tradução em potencial) por substituição de um ou mais resíduos de aminoá- cidos na sequência de aminoácidos da sequência de VHH original por um ou mais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem na(s) posição(ões) corres- pondente(s) em um domínio VH de um anticorpo de 4 cadeias convencional de um ser humano. Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências de região de armação completamente humanas, e, em uma mo- dalidade ainda mais específica, pode conter sequências de região de arma- —ção humanas derivadas de DP-29, DP-47, DP-51, ou de suas partes, opcio- nalmente combinadas com sequências de JH, como JH5. Anticorpos de domínio, também conhecidos como "Dab'"s e

. "dAbs" (os termos "Anticorpos de domínio" e "dAbs" sendo usados como marcas registradas pelo grupo de companhias GlaxoSmithKline group) foram descritos em, por exemplo, Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoi- re of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia co- li"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy", TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003) e WO2003/002609.

Anticorpos de domínio correspondem essencialmente aos domí- nios VH ou VL de anticorpos de mamíferos não camlídeos, em particular an- ' 10 ticorpos de 4 cadeias humanos. Para se ligar a um epítopo como um único domínio de ligação a antígeno, isto é, sem ser pareado com um domínio VL . ! ou VH, respectivamente, é requerida a seleção específica dessas proprieda- 7 des de ligação a antígeno, por exemplo, com o uso de bibliotecas de se- | 7 quências de domínio VH ou VL únicas humanas.

Anticorpos de domínio têm, como VHHs, um peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa e, caso derivados de se- quências completamente humanas, não requerem humanização para, por exemplo, uso terapêutico em seres humanos. Como no caso de domínios - VHH, eles também são bem expressados em sistema de expressão procari- ótica, proporcionando uma redução significativa nos custos globais de fabri- cação.

Além disso, também ficará claro para aqueles versados na técni- ca que é possível "enxertar" uma ou mais das CDR's acima mencionadas em outros "suportes", incluindo, mas não limitados a, suportes humanos ou suportes não imunoglobulina. Suportes e técnicas adequados para essa en- xertia de CDR são conhecidos na técnica.

Os termos "epítopo" e "determinante antigênico", que podem ser usados de maneira intercambiável, referem-se à parte de uma macromolécu- la, como um polipeptídio, que é reconhecida por moléculas de ligação a an- tígeno, como anticorpos convencionais ou os polipeptídios da invenção, e mais particularmente pelo sítio de ligação a antígeno das ditas moléculas. Epítopos definem o sítio de ligação mínimo para uma imunoglobulina e, por-

. tanto, representam o alvo de especificidade de uma imunoglobulina.

Diz-se que um polipeptídio (como uma imunogliobulina, um anti- corpo, um domínio variável único de imunoglobulina da invenção ou, generi- camente, uma molécula de ligação a antígeno ou seu fragmento) que pode "seligara" ou "se ligar especificamente a", que "tem afinidade por" e/ou que "tem especificidade para" um certo epítopo, antígeno ou proteína (ou para pelo menos uma parte, fragmento ou epítopo dela) é "contra" ou "dirigido contra" o dito epítopo, antígeno ou proteína ou é uma molécula "de ligação" com relação a esse epítopo, antígeno ou proteína. Nesse contexto, uma mo- í 10 lécula de ligação a VEGF também pode ser chamada de "neutralizadora de VEGF". . Genericamente, o termo "especificidade" se refere ao número de : diferentes tipos de antígenos ou epítopos aos quais uma molécula de ligação ' a antígeno ou proteína de ligação a antígeno particular (como um domínio variável único de imunoglobulina da invenção) pode ser ligar. A especificida- de de uma molécula de ligação a antígeno pode ser determinada com base em sua afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de À equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação a R antígeno (KD), é uma medida da força de ligação entre um epítopo e um sí- tiode ligação a antígeno na proteína de ligação a antígeno: quanto menor o valor de KD, mais forte a força de ligação entre um epítopo e a molécula de ligação a antígeno (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), que é 1/KD). Como ficará claro para aqueles versados na técnica (por exemplo, com base na presente exposição a seguir), a afinidade pode ser determinada de maneira já conhecida, de- pendendo do antígeno de interesse específico. A avidez é a medida da força de ligação entre uma molécula de ligação a antígeno (como uma imunoglo- bulina, um anticorpo, um domínio variável único de imunoglobulina ou poli- peptídios que a contenham) e o antígeno pertinente. A avidez está relacio- nada tanto à afinidade entre um epítopo e seu sítio de ligação a antígeno na molécula de ligação a antígeno, quanto ao número de sítios de ligação perti- nentes presentes na molécula de ligação a antígeno.

. A parte de uma molécula de ligação a antígeno que reconhece o epíitopo é chamada de parátopo.

A menos que indicado de outra forma, o termo "molécula de li- gação a VEGF" inclui anticorpos anti-VEGF, fragmentos de anticorpos anti- VEGF, "moléculas do tipo anticorpo anti-VEGF" e conjugados com qualquer um desses. Os anticorpos incluem, mas não se limitam a, anticorpos mono- clonais e monoclonais quimerizados. O termo "anticorpo" engloba imunoglo- bulinas completas, como anticorpos monoclonais produzidos por expressão recombinante em células hospedeiras, assim como fragmentos de anticor- ' 10 pos de ligaçãoaVEGF ou "moléculas do tipo anticorpo", incluindo anticorpos de cadeia única e anticorpos lineares, os chamados "SMIPs" ("|Imunofarma- - cêuticos Modulares Pequenos") conforme, per exemplo, descrito no WO02/056910. Moléculas do tipo anticorpo anti-VEGF incluem domínios va- ' riáveis únicos de imunoglobulina, conforme aqui definido. Outros exemplos de moléculas do tipo anticorpo são anticorpos da superfamília das imunoglo- bulinas (I9SF), ou moléculas enxertadas com CDR.

"Molécula de ligação a VEGF" se refere tanto a moléculas de |li- gação a VEGF monovalentes (isto é, moléculas que se ligam a um epítopo - de VEGF), quanto a moléculas de ligação bi- ou multivalentes (isto é, molé- culasde ligação que se ligam a mais de um epítopo, por exemplo, moléculas "biparatópicas" conforme aqui definido mais abaixo). Moléculas de ligação a VEGF contendo mais de um domínio variável único de imunoglobulina de ligação a VEGF também são chamadas de moléculas de ligação a VEGF "formatadas", e podem, além dos domínios variáveis únicos de imunoglobu- linadeligaçãoa VEGF, compreender ligantes e/ou frações com funções efe- toras, por exemplo, frações extensoras de meia-vida, como domínios variá- veis únicos de imunoglobulina de ligaçãoa albumina, e/ou um parceiro de fusão, como albumina sérica e/ou um polímero fixado, como PEG.

O termo "molécula de ligação a VEGF biparatópica" ou "domínio variável único de imunoglobulina biparatópico", conforme aqui usado, deve significa uma molécula de ligação a VEGF compreendendo um primeiro do- mínio variável único de imunoglobulina e um segundo domínio variável único

. de imunoglobulina conforme aqui definido, em que as duas moléculas se ligam a dois epítopos diferentes, isto é, não superpostos do antígeno VEGF Os polipeptídios biparatópicos de acordo com a invenção são compostos por domínios variáveis únicos de imunoglobulina que têm diferentes especifici- — dades com relação ao epítopo.

A parte de uma molécula de ligação a anti- geno (como um anticorpo ou um domínio variável único de imunoglobulina da invenção) que reconhece o epítopo é chamada de parátopo.

Uma molécula de ligação a VEGF formatada também pode, em- bora menos preferivelmente, compreender dois domínios variáveis únicos de ' 10 —imunoglobulina de ligação a VEGF idênticos ou dois domínios variáveis úni- cos de imunoglobulina diferentes que reconheçam os mesmos epítopos ou ' B i superpostos.

Nesse caso, os dois domínios variáveis únicos de imunogiobu- lina podem se ligar ao mesmo epítopo ou a um superposto em cada um dos 1 dois monômeros que formam o dímero de VEGF.

Tipicamente, as moléculas de ligação a VEGF da invenção se |li- gam com uma constante de dissociação (Kp) de 10E-5 a 10E-14 moles/litro (M) ou menos e, de preferência, de 10E-7 a 10E-14 moles/litro (M) ou me- nos, mais preferivelmente de 10E-8 a 10E-14 moles/litro, e ainda mais prefe- | ' rivelmente de 10E-11 a 10E-13 (conforme medido em um Biacore ou em um ensaio KinExA), e/ou com uma constante de associação (Ka) de pelo menos 10E7 ME-1, de preferência de pelo menos 10E8 ME-1, mais preferivelmente de pelo menos 10E9 ME-1, como pelo menos 10E11 ME-1. Qualquer valor de Kp maior que 10E-4 M é genericamente considerado como indicativo de ligação não específica.

De preferência, um polipeptídio da invenção se ligará ao antígeno desejado, isto é, a VEGF, com uma Kp menor que 500 nM, de preferência menor que 200 nM, mais preferivelmente menor que 10 nM, co- mo menor que 500 pM.

A ligação específica de uma proteína de ligação a antígeno a um antígeno ou epítopo pode ser determinada de qualquer ma- neira adequada já conhecida, incluindo, por exemplo, os ensaios aqui descri- tos, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, como radioi- munoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaios de competição em sanduíche, e suas diferentes variantes já conhecidas na técnica.

. Os resíduos de aminoácidos serão indicados de acordo com o código de aminoácidos de três letras ou de uma letra padrão, conforme ge- nericamente conhecido e aceito na técnica. Quando se comparam duas se- quências de aminoácidos, o termo "diferença de aminoácidos" se refere a inserções, deleções ou substituições do número indicado de resíduos de aminoácidos em uma posição da sequência de referência, em comparação com uma segunda sequência. No caso de substituição(ões), essa(s) substi- tuição(ões) será(ão), de preferência, uma substituição(ões) conservadora(s), o que significa que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo , 10 de aminoácido de estrutura química similar e que tem pouca ou essencial- mente nenhuma influência sobre a função, atividade ou outras propriedades | ' biológicas do polipeptídio. Essas substituições de aminoácidos conservado- ] ras são bem conhecidas na técnica, por exemplo, pelo WOS98/49185, em que . substituições de aminoácidos conservadoras são, de preferência, substitui- ções em que um aminoácido nos seguintes grupos (i) - (v) é substituído por outro resíduo de aminoácido no mesmo grupo: (i) pequenos resíduos alifáti- cos, não polares ou levemente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (ii) resíduos polares, negativamente carregados e suas amidas (sem carga): Asp, Asn, ' Glu e Gln; (iii) resíduos polares, positivamente carregados: His, Arg e Lys; (iv) grandes resíduos alifáticos, não polares: Met, Leu, Ile, Val e Cys; e (v) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. Substituições de aminoácidos conser- vadoras particularmente preferidas são as seguintes: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gln ou em His; Asp em Glu; Cys em Ser; Glhn em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gin; Ile em Leu ou emVal;Leuem|lleouem Val; Lys em Arg, em Gln ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em lle; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser;Trp em Tyr; Tyr em Trp ou em Phe; Val em Ile ou em Leu.

Uma molécula de polipeptídio ou ácido nucleico é considerada como estando "(em forma) essencialmente isolada" - por exemplo, quando comparada a sua fonte biológica nativa e/ou ao meio de reação ou meio de cultivo do qual foi obtida - quando tiver sido separada de pelo menos um ou- tro componente com o qual normalmente esteja associada na dita fonte ou

. meio, como outra proteína/polipeptídio, outro ácido nucleico, outro compo- nente biológico ou macromolécula ou pelo menos um contaminante, impure- za ou componente menor. Em particular, uma molécula de polipeptídio ou ácido nucleico é considerada "essencialmente isolada" quando tiver sido pu- rificada pelomenos 2 vezes, em particular pelo menos 10 vezes, mais parti- cularmente pelo menos 100 vezes, e até 1.000 vezes ou mais. Uma molécu- la de polipeptídio ou ácido nucleico que esteja "em forma essencialmente isolada" é, de preferência, essencialmente homogênea, conforme determi- nado usando-se uma técnica adequada, como uma técnica cromatográfica ' 10 adequada, como eletroforese em gel de poliacrilamida.

"Identidade de sequência" entre duas sequências de moléculas . À de ligação a VEGF indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências. Pode ser calculada ou determinada conforme descrito ] no parágrafo f) nas páginas 49 e 50 de WOO08/020079. "Identidade de se- quência" indica a porcentagem de amioácidos que são idênticos ou que re- presentam substituições de aminoácidos conservadoras.

Métodos alternativos para a numeração dos resíduos de amino- | ácidos de domínios Vy, esses métodos também podendo ser aplicados de . maneira análoga a domínios VHH, são conhecidos na técnica. Entretanto, na presente descrição, reivindicações e figuras, será seguida a numeração de acordo com Kabat e aplicada aos domínios VHH conforme acima descritos, a menos que indicado de outra forma. Uma molécula de ligação a VEGF "maturada para afinidade", em particular um VHH ou um anticorpo de domínio, tem uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs que resultem em melhor afinidade por VEGF, em comparação com a respectiva molécula de ligação a VEGF de origem. Molé- culas de ligação a VEGF maturadas para afinidade da invenção podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, conforme des- crito por Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, ou Barbas, et al, 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; e Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226(3):

. 889 896; KS Johnson e RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996. Para a presente invenção, "sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: x": incluem, se não declarado de outra forma, uma sequência de a- —minoácidos que seja 100% idêntica à sequência mostrada na respectiva SEQ ID NO: x; a) sequências de aminoácidos que tenham pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com a sequência mostrada na respectiva SEQ ID NO: x; Ú 10 b) sequências de aminoácidos que tenham 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácidos com a sequência mostrada na respectiva SEQ ID NO: x. . Os termos "câncer" e "canceroso" se referem ou descrevem a 7 condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por cres- cimento/proliferação celular desregulada.

Exemplos de cânceres a serem tratados com uma molécula de ligação a VEGF da invenção incluem, mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia.

Exem- | plos mais particulares desses cânceres, conforme sugerido para tratamento com antagonistas de VEGF no US 2008/0014196, incluem câncer de células ' escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de —célulasnão pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer da próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático, câncer gástrico, melanoma e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço.

A desregulação da angiogênese pode levar a muitos distúrbios que podem ser tratados por composições e méto- dos da invenção.

Esses distúrbios incluem tanto condições não neoplásticas, — quanto neoplásticas.

As neoplasias incluem, mas não se limitam a, aquelas acima descritas.

Distúrbios não neoplásticos incluem, mas não se limitam a, con-

. forme sugerido para tratamento com antagonistas de VEGF no US 2008/0014196, hipertrofia indesejável ou aberrante, artrite, artrite reumatóide (RA), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, aterosclerose, placas ateros- cleróticas, retinopatias diabética e outras proliferativas, incluindo retinopatia de prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degenera- ção macular relacionada à idade, edema macular diabético, neovasculariza- ção corneana, neovascularização de enxerto corneano, rejeição de enxerto corneano, neovascularização retiniana/coróide, neovascularização do ângulo (rubeose), doença neovascular ocular, reestenose vascular, más formações ' 10 — arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tireóide (incluindo doença de Grave), transplante corneano e de outros ' tecidos, inflamação crônica, inflamação do pulmão, lesão pulmonar agu- da/ARDS, sépsis, hipertensão pulmonar primária, efusões pulmonares ma- ' lignas, edema cerebral (por exemplo, associado a acidente vascular cerebral agudo/lesão encefálica fechada / trauma), inflamação sinovial, formação de pannus em RA, miosite ossificante, formação óssea hipertrófica, osteoartrite (OA), ascite refratária, doença ovariana policística, endometriose, 3º espa- ' çamento de doenças fluidas (pancreatite, síndrome de compartimento, R queimaduras, doença do itnestino), fibróides uterinos, trabalho de parto pre- —maturo, inflamação crônica como IBD (doença de Crohn e colite ulcerativa), rejeição de aloenxerto renal, doença intestinal inflamatória, síndrome nefróti- ca, crescimento de massa tissular indesejável ou aberrante (não cancerosa), articulações hemofílicas, cicatriezes hipertróficas, inibição do crescimento do cabelo, síndrome de Osier-Weber, fibroplasias retrolentais de granuloma —piogênico, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovite, dermatite, pré-eclâmpsia, ascite, efusão pericárdica (como a associada a pericardite) e efusão pleural.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma — molécula de ligação a VEGF compreendendo pelo menos um domínio variá- vel com quatro regiões de armação e três regiões determinantes de com- plementariedade CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, em que a dita

. CDR3 tem a sequência de aminoácidos Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, em que: Xaa na posição 5 é Gly ou Ala; Xaa na posição 7 é Ser ou Gly; Xaa na posição 12 é Gly, Ala ou Pro; Xaa na posição 13 é Asp ou Gly; Xaa na posição 16 é Asp ou Glu; e em que a dita molécula de ligação a VEGF é capaz de bloquear a interação de VEGF1I65 recombinante humano com o VEGFR-2 recombi- nante humano com uma taxa de inibição de 2 60%. mi De acordo com modalidades preferidas, Xaa na posição 5 é Gly, Xaa na posição 7 é Ser, Xaa na posição 12 é Ala, e Xaa na posição 13 é ' Asp.

Em particular, a dita CDR3 tem uma sequência selecionada de: SEQ ID NO: 2 SRAYGSSRLRLGDTYDY, SEQ ID NO: 3 SRAYGSSRLRLADTYDY; | SEQ ID NO: 4 SRAYGSSRLRLADTYEY; . SEQ ID NO: 5 SRAYGSGRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 6 SRAYASSRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 7 SRAYGSSRLRLPDTYDY; SEQ ID NO: 8 SRAYGSSRLRLPGTYDY.

De acordo com certas modalidades, uma molécula de ligação a VEGF compreende um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina cadaum contendo: a. uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada de um primeiro grupo de sequências mostradas nas SEQ ID NO: 2 a 8; b. uma CDR1 e uma CDR2 com sequências de aminoácidos que estejam contidas, conforme indicado na Tabela 3, em uma sequência sele- cionadade um segundo grupo de sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 9 a 46, em que a dita segunda sequência contém a res- pectiva CDR3 selecionada de acordo com a).

. De acordo com modalidades preferidas, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina são VHHs.

De acordo com modalidades específicas, os VHHs têm sequên- cias de aminoácidos selecionadas de sequências mostradas nas SEQ ID NOs:9-46. De acordo com outra modalidade específica, os VHHs têm se- quências de aminoácidos selecionadas de SEQ ID NOs: 15, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 25. | A invenção também se refere a moléculas de ligação a VEGF Ú 10 que tenham sido obtidos por maturação para afinidade e/ou otimização de sequência de um VHH acima definido, por exemplo, de um VHH que tenha . sido obtido por otimização de sequência de um VHH com uma sequência de | aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18. São exemplos VHHs com se- quências de aminoácidos selecionadas de sequências mostradas nas SEQ IDNOs: 47-57. De acordo com certas modalidades, uma molécula de ligação a VEGF da invenção pode ser formatada, conforme aqui definido, por exem- plo, pode ser biparatópica ou compreender dois domínios variáveis únicos l de imunoglobulina idênticos.

Essas moléculas de ligação a VEGF podem compreender dois ou mais VHHs, que são: a) VHHs idênticos que sejam capazes de bloquear a interação entre VEGF humano recombinante e o VEGFR-2 humano recombinante com uma taxa de inibição de = 60% ou b) VHHs diferentes que se liguem a epítopos não superpostos deVEGF,em que pelo menos um VHH é capaz de bloquear a interação en- tre VEGF humano recombinante e o VEGFR-2 humano recombinante com uma taxa de inibição de 2 60%, e em que pelo menos um VHH é capaz de bloquear a dita interação com uma taxa de inibição de < 60%. A porcentagem de bloqueio da dita interação a uma taxa de ini- biçãode2>60% ou s60%, respectivamente, refere-se a uma taxa de inibição conforme determinada por um Ensaio Homogêneo de Proximidade Lumines- cente Amplificada (AlphaScreen”), um ELISA de competição, um ensaio à

. base de ressonância de plasmon (SPR) (Biacoreº) conforme usado nos E- xemplos.

A seguir, a capacidade de VHHs de acordo com a) também é chamada de "bloqueio de receptor", ao passo que a capacidade de VHHs de —acordocomb) também é chamada de "bloqueio de não receptor".

De preferência, os VHHs de bloqueio de receptor têm uma taxa de inibição de 2 80%, mais preferivelmente > 90%; os VHHs mais preferidos sendo bloqueadores completos de receptor, isto é, têm uma taxa de inibição de 100%.

' 10 Uma ligação a VEGF pode conter dois ou mais VHHs a idênti- : cos) selecionados de VHHs com as sequências de aminoácidos mostradas . nas SEQ ID NOs: 9 — 46 ou VHHs que tenham sido obtidos por maturação para afinidade e/ou otimização de sequência desse VHH. O VHH pode ser ' selecionado de VHHs com os aminoácidos mostrados na SEQ ID NO: 18 ou SEQIDNO: 47-57. | De acordo com modalidades preferidas, uma molécula de liga- ção a VEGF formatada compreende dois VHHs, cada um com a sequência i de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57. . Em moléculas de ligação a VEGF formatadas compreendendo doisVHHs diferentes: a) os ditos um ou mais VHHs com uma taxa de inibição de > 60% são selecionados de: i. VHHs com uma sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 9 — 46 ou ii. VHHs que tenham sido obtidos por maturação para afinidade e/ou otimização de sequência desses VHHs, e em que b) os ditos um ou mais VHHs com uma taxa de inibição de < 60% são selecionados de: i. SEQ ID NOs: 58 — 124 ou ii. VHHs que tenham sido obtidos por maturação para afinidade e/ou otimização de sequência desses VHH.

De acordo com modalidades preferidas, dois VHHs estão conti-

. dos em polipeptídios com as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 128 — 168, separados por sequências de ligante conforme in- dicado na Tabela 15. Em uma molécula de ligação a VEGF preferida, VHH a) i. tem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18, e VHH b) i. tem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 64.

Em outras moléculas de ligação a VEGF preferidas, VHHs de acordo com a) ii. são selecionados de VHHs com uma sequência de amino- ácidos mostrada na SEQ ID NOs: 47 — 57, e VHHs de acordo com b) ii. são Ú 10 selecionados de VHHs com uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NOs: 125 — 127. Í É particularmente preferida uma molécula de ligação a VEGF bi- . paratópica compreendendo dois VHHs, um deles com os aminoácidos mos- ' trados na SEQ ID NO: 57, e um deles com os aminoácidos mostrados na SEQIDNO: 127.

As moléculas de ligação a VEGF com propriedades aperfeiçoa- das em vista da aplicação terapêutica, por exemplo, afinidade aumentada ou ' imunogenicidade diminuída, pode ser obtidas a partir de moléculas de liga- ' ção a VEGF individuais da invenção por técnicas conhecidas, como matura- ção para afinidade (por exemplo, partindo de sequências de imunoglobulinas sintéticas, aleatórias ou de ocorrência natural), enxerto de CDR, humaniza- ção, combinação de fragmentos derivados de diferentes sequências de imu- noglobulinas, montagem por PCR usando primers superpostos e técnicas similares para manipulação de sequências de imunoglobulinas bem conhe- cidas por aqueles versados na técnica, ou qualquer combinação adequada de qualquer uma das precedentes, também chamadas de "otimização de sequência", conforme aqui descrito. Faz-se referência, por exemplo, a ma- nuais padrões, assim como à descrição e Exemplos a seguir.

Caso apropriado, uma molécula de ligação a VEGF da invenção com afinidade aumentada pode ser obtida por maturação para afinidade de outra molécula de ligação a VEGF, esta representando, com relação à molé- cula maturada para afinidade, a molécula de ligação a VEGF "de origem".

22/108 | | . Domínios variáveis únicos de imunoglobulina, por exemplo, V- | HHs e anticorpos de domínio, de acordo com as modalidades preferidas da | invenção, têm inúmeras características estruturais e propriedades funcionais | únicas que os tornam altamente vantajosos para uso em terapia como molé- | culasde ligação a antígeno funcionais.

Em particular, e sem nos limitarmos a | isso, domínios VHH (que tenham sido "projetados" pela natureza para se ligarem funcionalmente a um antígeno sem pareamento com um domínio variável de cadeia leve) podem funcionar como unidades estruturais de liga- ção a antígeno funcionais, relativamente pequenas e únicas. ' 10 Devido a suas propriedades únicas, domínios variáveis únicos de imunoglobulina, conforme aqui definido, como VHHs ou VHs (ou VLs) - . isoladamente ou como parte de um polipeptídio maier, por exemplo, uma : molécula biparatópica - apresentam inúmeras vantagens significativas: . . apenas um único domínio é requerido para se ligar a um anti- genocom alta afinidade e com alta seletividade, de modo que não há neces- sidade de se ter dois domínios separados presentes, nem assegurar que esses dois domínios estejam presentes na conformação e configuração es- Ú paciais corretas (isto é, mediante o uso de ligantes especialmente projeta- : dos, como com scFv's); 20 . domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem ser ex- pressados a partir de uma única molécula de ácido nucleico e não requerem nenhuma modificação pós-tradução (como glicosilação); . domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem ser facil- mente manipulados em formatos multivalentes e multiespecíficos (conforme adicionalmente discutido aqui); . domínios variáveis únicos de imunoglobulina têm elevada es- pecificidade e afinidade por seu alvo, baixa toxicidade inerente e podem ser | administrados mediante vias alternativas além de infusão ou injeção; . domínios variáveis únicos de imunoglobulina são altamente es- táveis ao calor, pH, proteases e outros agentes ou condições desnaturantes e, portanto, podem ser preparados, armazenados ou transportados sem o uso de equipamentos de refrigeração;

. . domínios variáveis únicos de imunoglobulina são fáceis de pre- parar e relativamente baratos, tanto em pequena escala, quanto em escala de fabricação. Por exemplo, domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem ser produzidos usando fermentação microbiana (por exemplo, con- forme adicionalmente descrito abaixo) e não requerem o uso de sistemas de expressão em mamíferos como, por exemplo, anticorpos convencionais; . domínios variáveis únicos de imunoglobulina são relativamente pequenos (aproximadamente 15 kDa, ou 10 vezes menores que uma IgG convencional) em comparação com anticorpos de 4 cadeias convencionais e Í 10 seus fragmentos de ligação a antígeno e, consequentemente, mostram mai- or penetração em tecidos (incluindo, mas não limitados a, tumores sóidos e outros tecidos densos) e podem ser administrados em doses mais elevadas do que esses anticorpos de 4 cadeias convencionais e seus fragmentos de ' ligação a antígeno; 15 . VHHs têm as chamadas "propriedades de ligação a cavidade" específicas (entre outras, devido a sua alça CDR3 estendida, em compara- ção com domínios VH de anticorpos de 4 cadeias) e também podem, conse- i quentemente, acessar alvos e epítopos não acessíveis a anticorpos de 4 : cadeias convencionais e seus fragmentos de ligação a antígeno; 20 . VHHs têm a vantagem particular de que são altamente solúveis e muito estáveis e não têm a tendência a agregar (como os domínios de li- gação a antígeno derivados de camundongo descritos por Ward et al., Natu- re 341: 544-546 (1989)).

Os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção não estão limitados com relação à fonte biológica específica da qual foram obtidos ou a um método de preparação específico. Por exemplo, a obtenção de VHHs pode incluir as seguintes etapas: (1) isolamento do domínio VHH de um anticorpo de cadeia pe- sada de ocorrência natural; ou triagem de uma biblioteca compreendendo — anticorpos de cadeia pesada ou VHHs e isolamento de VHHs deles; (2) expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifique um VHH com a sequência de ocorrência natural;

F 24/108 . (3) "humanização" (conforme aqui descrito) de um VHH, opcio- nalmente após maturação para afinidade, com uma sequência de ocorrência natural ou expressão de um ácido nucleico que codifique esse VHH humani- zado; (4) "camelização" (conforme descrito abaixo) de um domínio pe- sado variável único de imunoglobulina de um anticorpo de ocorrência natural de uma espécie animal, em particular uma espécie de mamífero, como de um ser humano, ou expressão de uma molécula de ácido nucleico que codi- fique esse domínio camelilzado; ] 10 (5) "camelização" de um VH, ou expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifique esse VH camelizado; o (6) uso de técnicas para preparação sintética ou semi-sintética ' de proteínas, polipeptídios ou outras sequências de aminoácidos; f (7) preparação de uma molécula de ácido nucleico que codifique um domínio VHH usando técnicas para síntese de ácidos nucleicos, seguido por expressão do ácido nucleico assim obtido; (8) submissão de anticorpos de cadeia pesada ou VHHs a matu- ração para afinidade, a mutagênese (por exemplo, mutagênese aleatória ou ' mutagênese direcionada a sítio) e/ou qualquer outra técnica para aumentar a afinidade e/ou especificidade do VHH; e/ou (9) combinações ou seleções das etapas precedentes.

Métodos e técnicas adequados para realizar as etapas acima descritas são conhecidos na técnica e serão aparentes para aqueles versa- dos. A título de exemplo, métodos de obtenção de domínios VHH que se ligam a um antígeno ou epítopo específico foram descritos em WO2006/040153 e WO2006/1227886.

De acordo com modalidades específicas, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção ou presentes nos polipeptídios da in- venção são domínios VHH com uma sequência de aminoácidos que corres- — ponde essencialmente à sequência de aminoácidos de um domínio VHH de ocorrência natural, mas que tenha sido "humanizado" ou "tido a sequência otimizada" (opcionalmente após maturação para afinidade), isto é, por subs-

LA . tituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoáci- | dos da dita sequência de VHH de ocorrência natural por um ou mais dos resíduos de aminoácidos que ocorram na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio pesado variável de um anticorpo de 4 cadeias convencional deum ser humano. Isso pode ser realizado usando métodos conhecidos na técnica, que podem ser rotineiramente usados por aqueles versados na téc- nica. Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais se- quências de região de armação completamente humanas, e, em uma moda- ] 10 lidade ainda mais específica, pode conter sequências de região de armação humanas derivadas das sequências Vh3 de linhagem germinativa humana o DP-29, DP-47, DP-51, ou suas partes, ou ser altamente homólogo a elas, opcionalmente combinado com sequências JH, como JH5. Assim, um proto- colo de humanização pode compreender a substituição de qualquer um dos resíduos VHH pelos resíduos de armação 1, 2 e 3 (FRI, FR2 e FR3) corres- pondentes de genes VH de linhagem germinantiva, como DP 47, DP 29 e DP 51, isoladamente ou em combinação. Regiões de armação (FR) adequa- das dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção podem ser selecionadas daquelas expostas, por exemplo, no WO 2006/004678 e, | 20 especificamente, incluem as chamadas classes "KERE" e "GLEW". São e- xemplos os domínios variáveis únicos de imunoglobulina com a sequência de aminoácidos G-L-E-W em cerca das posições 44 a 47, e suas respectivas contrapartes humanizadas. Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências de região de armação completamente humanas.

Em VHHs da invenção que começam com EVQ, o E N-terminal pode ser substituído por um D (que é frequentemente um resultado da otimi- zação de sequência) ou pode estar faltando (como para expressão do VHH em E.coli). Para moléculas de ligação a VEGF formatadas, isso normalmen- te se aplica apenas ao VHH que está situado N-terminalmente.

Uma substituição humanizadora preferida, mas não limitativa, para domínios VHH pertencentes ao grupos 103 P,R,S e/ou ao grupo GLEW (conforme definido abaixo) é a de 108Q por 108L. Métodos para a humani-

y 26/108 . zação de domínios variáveis únicos de imunoglobulina são conhecidos na técnica.

De acordo com outra modalidade, o domínio variável único de imunoglobulina é um anticorpo de domínio, conforme aqui definido.

Em ainda outra modalidade, os representantes da classe de do- mínios variáveis únicos de imunoglobulina de ligação a VEGF da invenção têm sequências de aminoácidos que correspondem à sequência de aminoá- cidos de um domínio VH de ocorrência natural que tenha sido "camelizado”", isto é, por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequên- ' 10 ciade aminoácidos de uma cadeia pesada variável de ocorrência natural de : um anticorpo de 4 cadeias convencional por um ou mais resíduos de amino- . ácidos que ocorram na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada. Isso pode ser realizado de maneira f conhecida, que ficará clara para aqueles versados na técnica, e se faz refe- rência, além disso, ao WO 94/04678. Essa camelização pode ocorrer, de preferência, em posições de aminoácidos que estejam presentes na interfa- ce VH-VL e nos chamados resíduos Camelidae Hallmark (veja, por exemplo, também o WO 94/04678). Uma descrição detalhada dessas técnicas de - "humanização" e "camelização" e sequências de região de armação preferi- das consistentes com elas também podem ser obtidas, por exemplo, nas pp.

46 e pp. 98 do WO 2006/040153 e pp. 107 do WO 2006/122786.

As moléculas de ligação a VEGF da invenção, por exemplo, do- mínios variáveis únicos de imunoglobulina, têm especificidade para VEGF pelo fato de compreenderem um ou mais domínios variáveis únicos de imu- —noglobulina que se ligam especificamente a um ou mais epíitopos dentro da molécula de VEGF.

A ligação específica de uma molécula de ligação a VEGF a seu antígeno VEGF pode ser determinada de qualquer maneira adequada já co- nhecida, incluindo, por exemplo, os ensaios aqui descritos, análise de Scat- — chard e/ou ensaios de ligação competitiva, como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA e ELISA) e ensaios de competição em sandu- íche e suas diferentes variantes conhecidas na técnica.

, Com relação ao antígeno VEGF, uma molécula de ligação a VEGF da invenção, por exemplo, um domínio variável único de imunoglobu- lina, não está limitada com relação à espécie. Assim, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção se ligam, de preferência, a VEGF hu- mano, se destinados a finalidades terapêuticas em seres humanos. Entre- tanto, domínios variáveis únicos de imunoglobulina que se ligam a VEGF de outras espécies de mamíferos também estão dentro do âmbito da invenção. Um domínio variável único de imunoglobulina da invenção que se liga a uma forma de espécie de VEGF pode ter reação cruzada com VEGF, que tenha , 10 uma sequência diferente da humana, de uma ou mais outras espécies. Por exemplo, domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção que se o ligam a VEGF humano podem exibir reatividade cruzada com VEGF de uma ou mais outras espécies de primatas e/ou com VEGF de uma ou mais espé- fi cies de animais que sejam usados em modelos animais para doenças, por exemplo, macaco, camundongo, rato, coelho, porco, cão e, em particular, em modelos animais para doenças e distúrbios associados a efeitos media- dos por VEGF sobre a angiogênese (como as espécies e os modelos ani- mais aqui mencionados). Domínios variáveis únicos de imunoglobulina da BR invenção que mostram essa reatividade cruzada são vantajosos em pesqui- sace/ou desenvolvimento de fármacos, pois permitem que os domínios variá- veis únicos de imunoglobulina da invenção sejam testados em modelos de doenças reconhecidos, como macacos, em particular Cynomolgus ou Rhe- sus, ou camundongos e ratos.

De preferência, em vista da reatividade cruzada com uma ou mais moléculas de VEGF de espécies diferentes da humana que se desti- nem a uso como um modelo animal durante o desenvolvimento de um anta- gonista de VEGF terapêutico, uma molécula de ligação a VEGF reconhece um epítopo em uma região do VEGF de interesse que tenha elevado grau de identidade com VEGF humano. Um domínio variável único de imunoglobulina da invenção reco- nhece um epítopo que esteja, total ou parcialmente, localizado em uma regi- ão do VEGF que seja relevante para ligação a seu receptor, em particular a |

. VEGFR-2, que tenha sido mostrada como sendo o receptor cuja ativação está causalmente envolvida na neovascularização de tumores De acordo com aspectos preferidos, domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção bloqueiam a ativação do receptor de VEGF, em particular a ativa- çãodeWVEGFR-2, pelo menos parcialmente, de preferência substancialmen- te e, o mais preferivelmente, totalmente.

Conforme acima descrito, a capacidade de uma molécula de |li- gação a VEGF de bloquear a interação entre VEGF e seus receptores, em particular o VEGFR-2, pode ser determinada por um Ensaio Homogêneo de : 10 Proximidade Luminescente Amplificada (AlphaScreenº), um ELISA de com- petição ou um ensaio à base de ressonância de plasmon (SPR) (Biacore?), De preferência, um domínio variável único de imunoglobulina da . invenção se liga a VEGF com uma afinidade menor que 500 nM, de prefe- rência menor que 200 nM, mais preferivelmente menor que 10 nM, como menor que 500 pM (conforme determinado por análise de Ressonância de Plasmon de Superfície, conforme descrito no Exemplo 5.7). De preferência, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina : da invenção têm valores de ICs55, conforme medido em um ensaio de ELISA de competição, conforme descrito no Exemplo 5.1, na faixa de 10º a 107º moles/litro ou menos, mais preferivelmente na faixa de 10º a 107º moles/litro ou menos e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 10º a 10º moles/litro ou menos. De acordo com uma modalidade não limitativa, mas preferida, da invenção, domínios variáveis únicos de imunoglobulina de ligação a VEGF da invenção se ligam a VEGF com uma constante de dissociação (Kp) de 10 S a 10º? moles/litto (M) ou menos e, de preferência, de 107 a 10º? mo- les/litro (M) ou menos e, mais preferivelmente, de 10º a 10? moles/litro (M), e/ou com uma constante de associação (Ka) de pelo menos 10” M”, de pre- ferência pelo menos 10º M, mais preferivelmente pelo menos 10º M”, como pelo menos 10"? M'; e, em particular, com uma Kp menor que 500 nM, de preferência menor que 200 nM, mais preferivelmente menor que 10 nM, co-

. mo menor que 500 pM.

Os valores de Kp e Ka do domínio variável único de imunoglobulina da invenção contra VEGF podem ser determinados Moléculas de ligação a VEGF biparatópicas compreendendo dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina consistem ou compreendem essencialmente (i) um primeiro domínio variável único de i- munoglobulina que se liga especificamente a um primeiro epitopo de VEGF e (ii) um segundo domínio variável único de imunoglobulina que se liga es- pecificamente a um segundo epítopo de VEGF, em que o primeiro epítopo de VEGF e o segundo epítopo de VEGF não são epítopos idênticos.

Em ou- ' 10 tras palavras, esse polipeptídio da invenção compreende ou consiste essen- cialmente em dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina que ] estão dirigidos contra pelo menos dois epitopos não superpostos presentes em VEGF, em que os ditos domínios variáveis únicos de imunoglobulina es- . tão ligados entre si de modo que sejam capazes de se ligar simultaneamente aVEGF.

Nesse sentido, o polipeptídio da invenção também pode ser consi- | derado como um construto de imunoglobulina "bivalente" ou "multivalente", e | particularmente como um "construto de domínio variável único de imunoglo- i bulina multivalente", pelo fato de o polipeptídio conter pelo menos dois sítios ' de ligação para VEGF. (Esses construtos também são chamados de molécu- lasdeligaçãoaVEGF "formatadas", por exemplo, VHHs "formatados"). Essa molécula de ligação a VEGF da invenção inclui (pelo me- nos) dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-VEGF, em que (os) dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina estão, de preferência, dirigidos contra epítopos não superpostos dentro da molécula de VEGF.

As- sim, esses dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina terão uma es- pecificidade para antígeno diferente e, consequentemente, diferentes se- quências de CDR.

Por essa razão, esses polipeptídios da invenção também serão aqui chamados de "polipeptídios biparatópicos", ou "construtos de an- ticorpo de domínio biparatópicos" (se os domínios variáveis únicos de imu- —noglobulina consistirem ou consistirem essencialmente em anticorpos de domínio), ou "construtos de VHH biparatópicos" (se os domínios variáveis únicos de imunoglobulina consistirem ou consistirem essencialmente em

. VHHs), respectivamente, pois os dois domínios variáveis únicos de imuno- globulina incluirão dois parátopos diferentes.

Se um polipeptídio da invenção for uma molécula biparatópica conforme aqui definida, pelo menos um dos componentes de domínio variá- vel único de imunoglobulina se liga a um epitopo de modo que a interação entre VEGF humano recombinante e VEGFR-2 humano recombinante seja bloqueada a uma taxa de inibição de > 80%. Conforme demonstrado em ex- perimentos da invenção, certas moléculas formatadas contêm dois VHHs que bloqueiam ambos o receptor de VEGFR2 a uma taxa de inibição de = ' 10 80%. Certos VHHs da invenção bloqueiam o VEGFR-2 a uma taxa de inibi- : ção de 100%, isto é, são bloqueadores completos. p Em ambos os casos, sequências e frações adicionais podem es- tar presentes dentro das moléculas de ligação a VEGF da invenção, por e- * xemplo, N-terminalmente, C-terminalmente, ou localizadas entre os dois do- mínios variáveis únicos de imunoglobulina, por exemplo, sequências de |li- gante e sequências que proporcionem funções efetoras, conforme aqui ex- posto em maiores detalhes. De acordo com modalidade, embora menos preferida, uma mo- lécula de ligação a VEGF da invenção pode incluir mais de dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-VEGF, isto é, três, quatro ou mesmo mais VHHs anti-VEGF. Nesse caso, pelo menos dois dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-VEGF estão dirigidos contra epítopos não su- perpostos dentro da molécula de VEGF, em que qualquer domínio variável | único de imunoglobulina adicional pode se ligar a qualquer um dos dois epí- topos não superpostos e/ou a um epítopo adicional presente na molécula de VEGF.

De acordo com a invenção, os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem ser, independentemente entre si, VHHs ou anticorpos de domínio, e/ou qualquer outro tipo de domínio variável único de —imunoglobulina, como domínios VL, conforme aqui definido, contanto que esses domínios variáveis únicos de imunoglobulina se liguem ao antígeno, isto é, VEGF.

De acordo com uma modalidade preferida, o primeiro e o segun- do domínios variáveis únicos de imunoglobulina consistem essencialmente em sequências de VHH ou sequências de anticorpo de domínio, conforme aqui definido. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, o primeiro e o segundo domínios variáveis únicos de imunoglobulina consis- tem essencialmente em sequências de VHH.

De acordo com certas modalidades da invenção, os pelo menos dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina presentes em uma molé- cula de ligação a VEGF da invenção podem estar conectados entre si dire- B 10 tamente (isto é, sem o uso de um ligante) ou mediante um ligante. O ligante é, de preferência, um peptídio de ligante e será selecionado para permitir a diferentes a cada um de seus pelo menos dois epítopos não superpostos de | . VEGF, dentro de uma e mesma molécula de VEGF ou dentro de duas molé- culas diferentes.

Ligantes adequados dependerão, entre outros fatores, dos epí- topos e, especificamente, da distância entre os epítopos no VEGF aos quais os domínios variáveis únicos de imunoglobulina se ligam e estarão claros : para aqueles versados na técnica com base na presente exposição, opcio- — nalmente após algum grau limitado de experimentação rotineira.

Da mesma forma, quando os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina que se ligam a VEGF são VHHs ou anticorpos de domínio, eles podem estar ilgados entre si mediante um terceiro VHH ou anticorpo, respectivamente (nessas moléculas de ligação a VEGF, os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem estar ligados diretamente ao dito terceiro domínio variável único de imunoglobulina ou mediante ligantes adequados). Esse terceiro VHH ou anticorpo de domínio pode, por exemplo, ser um VHH ou anticorpo de domínio que proporcione uma meia-vida aumentada. Por exemplo, este último VHH ou anticorpo de domínio pode ser um anticorpo de domínio ou VHH que seja capaz de se ligar a uma proteína sérica (humana), como albumina sérica (humana) ou transferrina (humana).

. Alternativamente, os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina que se ligam a VEGF podem estar ligados em série (direta- mente ou mediante um ligante adequado), e o terceiro VHH ou anticorpo de domínio (que pode proporcionar uma meia-vida aumentada) pode estar co- —nectado diretamente ou mediante um ligante a uma dessas duas ou mais sequências de imunoglobulinas acima mencionadas.

Ligantes adequados são aqui descritos com relação a polipepti- dios específicos da invenção e podem - por exemplo, e sem limitação - com- preender uma sequência de aminoácidos, essa sequência de aminoácidos , 10 possuindo, de preferência, um comprimento de 9 ou mais aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 17 aminoácidos, como de cerca de 20 a 40 ami- o | noácidos. Entretanto, o limite superior não é crítico, mas é escolhido por ra- zões de conveniência, em vista, por exemplo, da produção biofarmacêutica ' desses polipeptídios.

A sequência do ligante pode ser uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência de ocorrência não natural. Se usado para fins te- rapêuticos, o ligante é, de preferência, não imunogênico no sujeito ao qual | i se administra a molécula de ligação a VEGF da invenção. . Um grupo útil de sequências de ligante são ligantes derivados da região de articulação de anticorpos de cadeia pesada conforme descrito no WOS96/34103 e WOS94/04678.

Outros exemplos são sequências de ligante de poli-alanina, co- mo Ala - Ala - Ala.

Exemplos preferidos adicionais de sequências de ligante são |i- gantes Gly/Ser de diferentes comprimentos, como ligantes (gly.sery)z, inclu- indo (glyaser)s, (glyaser)a, (glyaser), (glysser), glys, e (glyssera)s.

Alguns exemplos não limitativos de ligantes estão contidos nas moléculas de ligação a VEGF da invenção mostradas na Tabela 15 (SEQ ID NOs 128 - 168), por exemplo, os ligantes:

GGGGSGSEGSCEGESGCSES GGGESGSGGSGGGGS (35GS; SEQ ID NO: 169); GGGGSGGGS (9GS; SEQ ID NO: 170);

- GGGESGSEGESGEGESGEGESGSGESCSSGESGGGGSGEGG GS (40GS; SEQ ID NO: 171). Se uma molécula de ligação a VEGF formatada da invenção for modificada pela fixação de um polímero, por exemplo, de uma fração polieti- lenoglicol PEG (polietileno glicol), a sequência de ligante inclui, de preferên- cia, um resíduo de aminoácido, como uma cisteína ou uma lisina, que permi- ta essa modificação, por exemplo, PEGilação, na região de ligante. Exemplos de ligantes utilizáveis para PEGilação são: GGGGCGGGS ("GS9,C5", SEQ ID NO: 172); : 10 GGGGCEGGEGSCSSEGSCEEGESSGGGS ("GS25,C5, SEQ ID : NO:173); . GGGSCGGEGESCEEGCCEGEGSGEGGESECES ("GS27,C14", - SEQ ID NO:174); . GGGEGSCSEGSCSEGGCEGEGSSGSEGSCSGGESGGGES ("GS35,C15", SEQID NO:175) e

GGGGCEGGGESGEGESGEGESCEGGESCEGESGGGGES ("GS35,C5", SEQ ID NO:176). Além disso, o ligante também pode ser uma fração poli(etileno . glicol), conforme mostrado, por exemplo, no WO2004/081026.

Em outra modalidade, os pelo menos dois domínios variáveis ú- nicos de imunoglobulina de ligação a VEGF estão ligados entre si mediante outra fração (opcionalmente mediante um ou dois ligantes), como outro poli- peptídio que, em uma modalidade preferida, mas não limitativa, pode ser um domínio variável único de imunoglobulina adicional, conforme acima descri- to. Essa fração pode ser essencialmente inativa ou pode ter um efeito bioló- gico, como melhorar as propriedades desejadas do polipeptídio ou pode con- ferir uma ou mais propriedades desejadas adicionais ao polipeptídio. Por exemplo, e sem limitação, a fração pode melhorar a meia-vida da proteína ou polipeptídio, e/ou pode reduzir sua imunogenicidade ou melhorar outra propriedade desejada.

De acordo com uma modalidade preferida, uma molécula de |i- gação a VEGF da invenção inclui, particularmente quando destinada a uso

- ou usada como um agente terapêutico, uma fração que estende a meia-vida | do polipeptídio da invenção no soro ou outros fluidos corporais de um paci- | ente. O termo "meia-vida" é definido como o tempo que leva para a concen- tração sérica do polipeptídio (modificado) reduzir em 50%, in vivo, por exem- plo, devido à degradação do polipeptídio e/ou depuração e/ou sequestração por mecanismos naturais.

Mais especificamente, essa fração extensora de meia-vida pode ser covalentemente ligada ou fusionada a um domínio variável único de imu- noglobulina e pode ser, sem limitação, uma parte Fc, uma fração albumina, : 10 um fragmento de uma fração albumina, uma fração de ligação a albumina, como um domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina, uma fra- o ção de ligação a transferrina, como um domínio variável único de imunoglo- bulina anti-transferrina, uma molécula de polioxialquileno, como uma molé- . cula de polietileno glicol, um peptídio de ligação a albumina ou um derivado de hidroxietil amido (HES). Em outra modalidade, a molécula de ligação a VEGF da inven- ção compreende uma fração que se liga a um antígeno encontrado no san- gue, como albumina sérica, imunoglobulinas séricas, proteína de ligação a . tiroxina, fibrinogênio ou transferrina, conferindo, dessa forma, uma meia-vida aumentada in vivo ao polipeptídio da invenção resultante. De acordo com uma modalidade especificamente preferida, essa fração é uma imunoglobu- lina de ligação a albumina e, especificamente preferida, um domínio variável único de imunoglobulina de ligação a albumina, como um domínio VHH de ligação a albumina. Se destinado a uso em seres humanos, esse domínio variável único de imunoglobulina de ligação a albumina se liga, de preferência, a al- bumina sérica humana e é, de preferência, um domínio VHH de ligação a albumina humanizado.

Domínios variáveis únicos de imunoglobulina que se ligam a al- —bumina sérica humana são conhecidos na técnica e são descritos em maio- res detalhes, por exemplo, no WO2006/122786. Especificamente, VHHs de ligação a albumina utilizáveis são ALB 1 e sua contraparte humanizada, ALB

- 8 (WOZ2009/095489). Entretanto, outros domínios VHH de ligação a albumi- na mencionados na publicação de patente acima também podem ser usa- dos.

Um domínio VHH de ligação a albumina especificamente utilizá- veléoALB8,que consiste em ou contém a sequência de aminoácidos mos- trada na SEQ ID NO: 177. De acordo com uma modalidade adicional da invenção, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina, de preferência em VHHs, po- dem ser fusionados a uma molécula de albumina sérica, conforme descrito i 10 por exemplo, no WOO01/79271 e WO03/59934. Conforme descrito, por e- | xemplo, no WO01/79271, a proteína de fusão pode ser obtida por tecnologia | : recombinante convencional: uma molécula de DNA que codifique albumina - sérica, ou seu fragmento, é unida ao DNA que codifica a molécula de ligação - a VEGF, o construto obtido é inserido em um plasmídio adequado para ex- pressão na célula hospedeira selecionada, por exemplo, uma célula de leve- dura como Pichia pastoris ou uma célula bacteriana, e a célula hospeeira é, então, transfectada com a sequência de nucleotídeos fusionada e cultivada sob condições adequadas.

A sequência de uma HSA utilizável é mostrada : na SEQ ID NO: 178: De acordo com outra modalidade, a modificação extensora de meia-vida de um polipeptídio da invenção (essa modificação também redu- zindo a imunogenicidade do polipeptídio) compreende a fixação de um polí- mero farmacologicamente aceitável adequado, como poli(etileno glicol) (PEG) de cadeia linear ou ramificada ou seus derivados (como metoxipo- lifetileno glicol) ou mPEG). Genericamente, qualquer forma adequada de PEGilação pode ser usada, como a PEGilação usada na técnica para anti- corpos e fragmentos de anticorpos (incluindo, mas não limitados a, anticor- pos de domínio e scFv's); faz-se referência, por exemplo, a: Chapman, Nat.

Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese e Harris, Adv.

Drug Deliv.

Rev. 54,453-456 (2003); Harris e Chess, Nat.

Rev.

Drug.

Discov. 2 (2003); e WO2004/060965. Vários reagentes para PEGilação de polipeptídios também são

N comercialmente disponíveis, por exemplo, na Nektar Therapeutics, EUA, ou NOF Corporation, Japão, como o Sunbright& Série EA, Série SH, Série MA, Série CA e Série ME, como o Sunbrightê ME-100MA, Sunbrightê ME- 200MA e Sunbright& ME-400MA.

De preferência, usa-se PEGilação direcionada a sítio, em parti- cular mediante um resíduo cisteina (veja, por exemplo, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). Por exemplo, para essa finalidade, o PEG pode ser fixado a um resíduo cisteina que ocorra naturalmente em um poli- peptídio da invenção, um polipeptídio da invenção pode ser modificado para introduzir adequadamente um ou mais resíduos cisteína para fixação do PEG, ou uma sequência de aminoácidos compreendendo um ou mais resí- | : | duos cisteína para fixação do PEG pode ser fusionada à terminação N e/ou 7 C de um polipeptídio da invenção, todos usando técnicas de manipulação de : proteínas conhecidas por aqueles versados na técnica. De preferência, para os polipeptídios da invenção, usa-se um PEG com um peso molecular de mais de 5 kDa, como mais de 10 kDa e menos de 200 kDa, como menos de 100 kDa; por exemplo, na faixa de 20 kDa a 80 kDa.

Com relação à PEGilação, deve-se notar que, genericamente, a invenção também engloba qualquer molécula de ligação a VEGF biparatópi- ca que tenha sido PEGilada em uma ou mais posições de aminoácidos, de preferência de modo que a dita PEGilação (1) aumente a meia-vida in vivo; (2) reduza a imunogenicidade; (3) confira uma ou mais propriedades benéfi- cas adicionaidas conhecidas para a PEGilação; (4) não afete essencialmen- tea afinidade do polipeptídio por VEGF (por exemplo, não reduza a dita afi- nidade em mais de 50% e, mais preferivelmente, em mais de 10%, conforme determinado por um ensaio adequado descrito na técnica); e/ou (4) não afe- te nenhuma das outras propriedades desejadas das moléculas de ligação a VEGF da invenção. Grupos PEG adequados e métodos para sua fixação, específica ou não especificamente, ficarão claros para aqueles versados na técnica. Vários reagentes para PEGilação de polipeptídios também são co- mercialmente disponíveis, por exemplo, na Nektar Therapeutics, EUA, ou

- NOF Corporation, Japão, como o Sunbright& Série EA, Série SH, Série MA, Série CA e Série ME, como o Sunbrightê ME-100MA, Sunbrightê ME- 200MA e Sunbright& ME-400MA. De acordo com uma modalidade particularmente preferida da in- venção, um polipeptídio PEGilado da invenção inclui uma fração PEG de PEG linear com um peso molecular de 40 kDa ou 60 kDa, em que a fração PEG é fixada ao polipeptídio em uma região de ligante e, especificamente, em um resíduo Cys na posição 5 de um peptídio de ligante GS9 conforme mostrado na SEQ ID NO: 172, na posição 14 de um peptídio de ligante GS27 conforme mostrado na SEQ ID NO:174, ou na posição 15 de um pep- | : tídio de ligante GS35 conforme mostrado na SEQ ID NO:175, ou na posição : 5 de um peptídio de ligante 35GS conforme mostrado na SEQ ID NO: 176. - Uma molécula de ligação a VEGF da invenção pode ser PEGila- . da com um dos reagentes de PEG conforme acima mencionados, como "“Sunbrightê ME-400MA", conforme mostrado na seguinte fórmula química: o O, oso-pnena onanameáca( o : Em outro aspecto, a invenção se refere a moléculas de ácido nucleico que codificam moléculas de ligação a VEGF da invenção. Essas moléculas de ácido nucleico também serão aqui chamadas de "ácidos nucle- icosda invenção" e também podem estar na forma de um construto genéti- co, conforme aqui definido. Um ácido nucleico da invenção pode ser DNA genômico, cDNA ou DNA sintético (como DNA com um uso de códon que tenha sido especificamente adaptado para expressão na célula hospedeira ou organismo hospedeiro desejado). De acordo com uma modalidade da invenção, o ácido nucleico da invenção está em forma essencialmente isola- da, conforme acima definido.

O ácido nucleico da invenção também pode estar na forma de, pode estar presente em e/ou pode ser parte de um vetor como, por exemplo, um plasmídiio, cosmídio ou YAC. O vetor pode ser particularmente um vetor de expressão, isto é, um vetor que pode garantir a expressão da molécula

. de ligação a VEGF in vitro e/ou in vivo (isto é, em uma célula hospedeira, organismo hospedeiro e/ou sistema de expressão adequado). Esse vetor de expressão compreende genericamente pelo menos um ácido nucleico da invenção que esteja operacionalmente ligado a um ou mais elementos regu- ladores adequados, como promotores, intensifigcadores, terminadores e ou- | tros. Esses elementos e sua seleção em vista da expressão de uma sequên- cia específica em um hospedeiro específico são conhecido comum para a- queles versados na técnica. Exemplos específicos de elementos reguladores e outros elementos utilizáveis ou necessários para a expressão de molécu- lasde ligaçãoa VEGF da invenção, como promotores, intensificadores, ter- : minadores, fatores de integração, marcadores de seleção, sequências líde- res, genes repórteres e outros são apresentados, por exemplo, nas pp. 131 a 133 do WO2006/040153. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados ou obti- dos de maneira já conhecida (por exemplo, por síntese automatizada de DNA e/ou tecnologia de DNA recombinante), com base na informação das sequências de aminoácidos para os polipeptídios da invenção dada aqui, e/ou podem ser isolados de uma fonte natural adequada. : Em outro aspecto, a invenção se refere a células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar uma ou mais moléculas de ligação a VEGF da invenção; e/ou que contêm um ácido nucleico da inven- ção. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, as ditas cé- lulas hospedeiras são células bacterianas; outras células utilizáveis são célu- las de levedura, células de fungos ou células de mamíferos.

Células bacterianas adequadas incluem células de cepas bacte- rianas gram-negativas, como cepas de Escherichia coli, Proteus e Pseudo- monas, e cepas bacterianas gram-positivas, como cepas de Bacillus, Strep- tomyces, Staphylococcus e Lactococcus. Células fúngicas adequadas inclu- em células de espécies de Trichoderma, Neurospora e Aspergillus. Células delevedura adequadas incluem células de espécies de Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por exemplo, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris e Pichia

. methanolica) e Hansenula.

Células de mamíferos adequadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS e outras. Entretanto, células de anfíbios, células de insetos, células vegetais e quaisquer outras células usadas na técnica para a expressão de proteínas heterólogas também po- dem ser usadas.

A invenção também apresenta métodos de fabricação de uma molécula de ligação a VEGF da invenção, esses métodos compreendendo genericamente as etapas de: Ú 10 - cultivo de células hospedeiras compreendendo um ácido nucle- ico capaz de codificar uma molécula de ligação a VEGF sob condições que : | permitam a expressão da molécula de ligação a VEGF da invenção; e - recuperação ou isolamento do polipeptídio expressado pelas - células hospedeiras da cultura; e - opcionalmente, purificação e/ou modificação e/ou formulação adicional da molécula de ligação a VEGF da invenção.

Para produção em escala industrial, os organismos hospedeiros preferidos incluem cepas de E. coli, Pichia pastoris e S. cerevisiae, que são adequadas para expressão, produção e fermentação em grande escala e, em particular, para expressão, produção e fermentação farmacêutica em grande escala.

A escolha do sistema de expressão específico depende, em par- te, das exigências de certas modificações pós-tradução, mais especifica- mente glicosilação. A produção de uma molécula de ligação a VEGF da in- venção para a qual a glicosilação seja desejada ou requerida necessitaria do uso de hospedeiros de expressão mamíferos que tivessem a capacidade de glicosilar a proteína expressada. Com relação a isso, ficará claro para aque- les versados na técnica que o padrão de glicosilação obtido (isto é, o tipo, número e posição dos resíduos fixados) dependerá da célula ou linhagem celularque é usada para a expressão.

Moléculas de ligação a VEGF da invenção podem ser produzi- das em uma célula conforme acima exposto intracelularmente (por exemplo,

- no citosol, no periplasma ou em corpúsculos de inclusão) e, então, isoladas das células hospedeiras e, opcionalmente, adicionalmente purificadas; ou podem ser produzidas extracelularmente (por exemplo, no meio em que as células hospedeiras são cultivadas) e, então, isoladas do meio de cultura e, — opcionalmente, adicionalmente purificadas.

Métodos e reagentes usados para a produção recombinante de polipeptídios, como vetores de expressão adequados específicos, métodos de transformação ou transfecção, marcadores de seleção, métodos de indu- ção da expressão de proteína, condições de cultura e outros, são conheci- dos na técnica. Da mesma forma, técnicas de isolamento e purificação de : proteínas utilizáveis em um método de fabricação de um polipeptídio da in- venção são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. - | Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um peptídio - com uma sequência de aminoácidos de uma CDR3 contida em uma VHH | antiVEGF com uma sequência de aminoácidos selecionada das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 9 a 57 ou SEQ ID NOs: 58 - 127, respectiva- mente, e uma molécula de ácido nucleico que a codifique. Esses peptídios correspondem a CDR3s derivadas das VHHs da invenção. Eles, em particular as moléculas de ácido nucleico que os codifi- cam, são utilizáveis para enxertia de CDR para substituir uma CDR3 em uma cadeia de imunoglobulina, ou para inserção em uma armação não imu- noglobulina, por exemplo, um inibidor de protease, proteína de ligação a DNA, citocromo b562, uma proteína de feixe de hélice, um peptídio com pon- te de dissulfeto, uma lipocalina ou uma anticalina, conferindo, assim, propri- edades de ligação a alvo a essa armação. O método de enxertia de CDR é bem conhecido na técnica e foi amplamente usado, por exemplo, para a hu- manização de anticorpos (que normalmente compreende a enxertia das CDRs de um anticorpo de roedor em armações Fv de um anticorpo huma- no). Para se obter uma armação de imunoglobulina ou não imuno- globulina contendo uma CDR3 da invenção, o DNA que codifica essa molé- cula pode ser obtido de acordo com métodos padronizados de biologia mo-

. lecular, por exemplo, por síntese de genes, por anelamento de oligonucleotí- deos ou por meio de superposição de fragmentos de PCR, conforme descri- to, por exemplo, por Daugherty et al., 1991, Nuclei Acids Research, Vol. 19, 9, 2471 — 2476. Um método para a inserção de uma CDR3 de VHH em uma armação não imunoglobulina foi descrito por Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13, 1882 — 1891.

A invenção também se refere a um produto ou composição con- tendo ou compreendendo pelo menos uma molécula de ligação a VEGF da invenção e, opcionalmente, um ou mais componentes adicionais dessas Ú 10 composições já conhecidos, isto é, dependendo do uso desejado da compo- sição.

| Para uso farmacêutico, uma molécula de ligação a VEGF da in- venção pode ser formulada como uma preparação ou composição farmacêu- . tica compreendendo pelo menos uma molécula de ligação a VEGF da inven- çãoe pelo menos um veículo, diluente ou excipiente e/ou adjuvante farma- ceuticamente aceitável e, opcionalmente, um ou mais polipeptídios e/ou compostos farmaceuticamente ativos adicionais. Por meio de exemplos não limitativos, essa formulação pode estar em uma forma adequada para admi- nistração oral, para administração parenteral (como por injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea ou infusão intravenosa), para administração tópica, para administração por inalação, por um emplastro cutâneo, por um implante, por um supositório e outras. Essas formas de administração ade- quadas - que podem ser sólidas, semi-sólidas ou líquidas, dependendo do modo de administração - assim como métodos e veículos para uso na sua preparação ficarão claros para aqueles versados na técnica e são adicio- nalmente descritos aqui.

Assim, em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que contenha pelo menos uma molécula de liga- ção a VEGF, em particular um domínio variável único de imunoglobulina, da invenção e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente adequado (isto é, adequado para uso farmacêutico) e, opcionalmente, uma ou mais substân- cias ativas adicionais.

. As moléculas de ligação a VEGF da invenção podem ser formu- ladas e administradas de qualquer maneira adequada já conhecida: faz-se referência, em particular para os domínios variáveis únicos de imunoglobuli- na, por exemplo, a WO0O4/041862, WO04/041863, WO0O4/041865, WOO4/041867 e WOO08/020079, assim como a manuais padrões, como o Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21º Edição, Lippincott Williams e Wilkins (2005); ou o Handbook of Therapeutic Antibodi- es (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (veja, por exemplo, as páginas i 10 252-255).

. Por exemplo, um domínio variável único de imunoglobulina da | invenção pode ser formulado e administrado de qualquer maneira já conhe- cida para anticorpos e fragmentos de anticorpos convencionais (incluindo | . ScFv's e diacorpos) e outras proteínas farmaceuticamente ativas. Essas | formulações e métodos para sua preparação ficarão claros para aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, preparações adequadas para administração parenteral (por exemplo, administração intravenosa, intraperi- toneal, subcutânea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial ou intratecal) ou para administração tópica (isto é, transdérmica ou intradérmica).

Preparações para administração parenteral podem ser, por e- xemplo, soluções, suspensões, dispersões ou emulsões estéreis que sejam adequadas para infusão ou injeção. Veículos ou diluentes adequados para essas preparações incluem, por exemplo, sem limitação, água estéril e tam- pões e soluções aquosas farmaceuticamente aceitáveis, como salina fisioló- gicatamponada com fosfato, soluções de Ringer, solução de dextrose e so- lução de Hank; óleos miscíveis com água; glicerol; etanol; glicóis, como pro- pileno gl icol, assim como óleos minerais e óleos vegetais, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, assim como suas misturas adequadas. Normal- mente, preferem-se soluções ou suspensões aquosas.

Assim, a molécula de ligação a VEGF da invenção pode ser ad- ministrada sistemicamente, por exemplo, oralmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, como um diluente inerte ou um veí-

. culo comestível assimilável. Para administração terapêutica oral, a molécula de ligação a VEGF da invenção pode ser combinada com um ou mais exci- pientes e usada na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e outros. Essas composições e preparações devem conter pelo menos 0,1% da molécula de ligação a VEGF da invenção. Suas porcentagem nas composições e prepa- rações podem, evidentemente, variar e podem estar convenientemente entre cerca de 2 e cerca de 60% do peso de uma dada forma de dosagem unitá- ria. A quantidade da molécula de ligação a VEGF da invenção nessas com- Ú 10 posições terapeuticamente utilizáveis é suficiente para que se obtenha um : nível de dosagem eficaz.

. Os comprimidos, pílulas, cápsulas e outros também podem con- ter aglutinantes, excipientes, agentes desintegradores, lubrificantes e agen- . tes adoçantes ou de sabor, por exemplo, aqueles mencionados nas páginas 143-144 do WOO8/020079. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido, como um óleo vegetal ou um polietileno glicol. Vários outros materiais po- Ú dem estar presentes como revestimentos ou para de outra forma modificar a : forma física da forma de dosagem unitária sólida. Por exemplo, comprimi- dos,pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e outros. Um xarope ou elixir pode conter as moléculas de ligação a VEGF da invenção, sacarose ou frutose como um agente adoçante, metil e propilparabens como preservativos, um corante e agente de sabor, como | sabor de cereja ou laranjá. Evidentemente, qualquer material usado na pre- —paração de qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não tóxico nas quantidades empregadas. Além disso, as moléculas de ligação a VEGF da invenção podem ser incorporadas em preparações e dispositivos de liberação prolongada.

Preparações e formulações para administração oral também po- dem receber um revestimento entérico que permita que os construtos da invenção resistam ao ambiente gástrico e passem para os intestinos. Mais genericamente, preparações e formulações para administração oral podem

. ser adequadamente formuladas para distribuição a qualquer parte desejada do trato gastrointestinal.

Além disso, supositórios adequados podem ser u- sados para distribuição ao trato gastrointestinal.

As moléculas de ligação a VEGF da invenção também podem ser administradas por via intravenosa ou intraperitoneal mediante infusão ou injeção, conforme adicionalmente descrito nas páginas 144 e 145 do WOO08/020079. Para administração tópica das moléculas de ligação a VEGF da invenção, em geral é desejável administrá-las à pele como composições ou i 10 formulações, em combinação com um veículo dermatologicamente aceitável, : que pode ser um sólido ou um líquido, conforme adicionalmente descrito na : página 145 do WOO08/020079. - Genericamente, a concentração das moléculas de ligação a - VEGF da invenção em uma composição líquida, como uma loção, será de cercade0,1-25% em peso, de preferência de cerca de 0,5 - 10% em peso.

A concentração em uma composição semi-sólida ousólida, como um gel ou um pó, será de cerca de 0,1 - 5% em peso, de preferência de cerca de 0,5 - | 2,5% em peso. : A quantidade de moléculas de ligação a VEGF da invenção re- querida para uso em tratamento variará não apenas com a molécula de liga- ção a VEGF particular selecionada, mas também com a via de administra- ção, a natureza da condição que está sendo tratada e a idade e condição do paciente e ficará, por fim, a critério do médico ou clínico encarregado.

Da mesma forma, a dosagem das moléculas de ligação a VEGF da invenção variadependendo da célula, tumor, tecido, enxerto ou órgão alvo.

A dose desejada pode ser convenientemente apresentada como uma dose única ou como doses divididas administradas a intervalos apropri- ados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais subdoses por dia.

À própria subdose pode ser adicionalmente dividida, por exemplo, em inúme- ras administrações distintas frouxamente espaçadas; como múltiplas inala- ções de um insuflador ou por aplicação de uma pluralidade de gotas ao olho.

Um regime de administração pode incluir tratamento diário a

. longo prazo. "Longo prazo" significa pelo menos duas semanas e, de prefe- rência, várias semanadas, meses ou anos de duração.

Modificações neces- sárias nessa faixa de dosagem podem ser determinadas por aqueles versa- dos na técnica usando apenas experimentação de rotina, dados os presen- tes ensinamentos.

Veja Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA.

A dosagem também pode ser ajus- tada pelo médico individual no caso de qualquer complicação.

De acordo com uma modalidade adicional, a invenção se refere ao uso de moléculas de ligação a VEGF, por exemplo, domínios variáveis Í 10 únicos de imunoglobulina, para finalidades terapêuticas, como: - para a prevenção, tratamento e/ou alívio de um distúrbio, do- : ença ou condição, particularmente em um ser humano, que esteja associada | a efeitos mediados por VEGF sobre a angiogênese ou que possa ser preve- nida, tratada ou aliviada por modulação da via de sinalização Notch com uma molécula de ligação a VEGF, | - em um método de tratamento de um paciente necessitado des- sa terapia, esse método compreendendo a administração, a um sujeito ne- i cessitado, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos uma É molécula de ligação a VEGF da invenção, por exemplo, um domínio variável —únicodeimunoglobulina, ou uma composição farmacêutica que a contenha; - para a preparação de um medicamento para a prevenção, tra- tamento ou alívio de distúrbios, doenças ou condições associadas a efeitos mediados por VEGF sobre a angiogênese; - como um ingrediente ativo em uma composição farmacêutica oumedicamento usado para as finalidades acima.

De acordo com um aspecto específico, o dito distúrbio, doença ou condição é um câncer ou doença cancerosa, conforme aqui definido.

De acordo com outro aspecto, a doença é uma doença ocular associada a efeitos mediados por VEGF sobre a angiogênese ou que possa sertratada ou aliviada pela modulação da via de sinalização Notch com uma molécula de ligação a VEGF.

Dependendo da doença cancerosa a ser tratada, uma molécula

" de ligação a VEGF da invenção pode ser usada isoladamente ou em combi- nação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, em particular sele- cionados de agentes quimioterápicos como agentes causadores de lesão em DNA ou compostos terapeuticamente ativos que inibam a angiogênese, vias detransdução de sinal ou barreiras mitóticas em células cancerosas.

O agente terapêutico adicional pode ser administrado simultane- amente com, opcionalmente como um componente da mesma preparação farmacêutica, ou antes ou depois da administração da molécula de ligação a VEGF.

i 10 Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser, sem limitação (e, no caso dos receptores, incluindo os respectivos ligantes), | um ou mais inibidores selecionados do grupo de inibidores de EGFR, VEG- - FR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK e PI3 quinase, FGFR, PDGFR, - Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R ou IR.

Exemplos adicionais de agentes terapêuticos adicionais são ini- bidores de CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, FIt3, HSP920, anta- gonistas Hedgehog, inibidores de JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB;, o pro- teossomo, Rho, um inibidor da sinalização wnt ou um inibidor da via de ubi- : quitinação ou outro inibidor da via de sinalização Notch.

Exemplos para inibidores de Aurora são, sem limitação, PHA- 739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.

Um exemplo de inibidor de PLK é o GSK-461364.

Exemplos para inibidores de raf são BAY-73-4506 (também um inibidor de VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (também, além disso, um inibidor de VEGFR), sorafenib (também, além disso, um inibidor de VEGFR) e XL

281.

Exemplos para inibidores de KSP são ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731 e SB-

743921.

Exemplos para inibidores de src e/ou bcr-abl são dasatinib, AZD- 0530, bosutinib, XL 228 (também um inibidor de IGF-1R), nilotinib (também

- um inibidor de PDGFR e cKit), imatinib (também um inibidor de cKit) e NS-

187. Um exemplo para um inibidor de PDK1 é o BX-517. Um exemplo para um inibidor de Rho é o BA-210. Exemplos para inibidores de PI3 quinase são PX-866, BEZ-235 (também um inibidor de mTor), XL 418 (também um inibidor de AKt), XL-147 e XL 765 (também um inibidor de mTor). Exemplos para inibidores de cMet ou HGF são XL-184 (também um inibidor de VEGFR, cKit, FItã), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (também i 10 um inibidor de VEGFR), MGCD-265 (também um inibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 e AV-299. . Um exemplo para um inibidor de c-Myc é o CX-3543. - Exemplos para inibidores de FIt3 são AC-220 (também um inibi- - dor de cKit e PDGFR), KW 2449, lestaurtinib (também um inibidor de VEG- FR, PDGFR, PKC), TG-101348 (também um inibidor de JAK2), XL-999 (também um inibidor de cKit, FGFR, PDGFR e VEGFR), sunitinib (também um inibidor de PDOGFR, VEGFR e cKit), e tandutinib (também um inibidor de i PDGFR, e cKit). Exemplos para inibidores de HSP90 são tanespimicina, alvespi- micina,IPI-504 e CNF 2024. Exemplos para inibidores de JAK/STAT são CYT-997 (que tam- bém interage com tubulina), TG 101348 (também um inibidor de FIt3) e XL-

019. Exemplos para inibidores de Mek são ARRY-142886, PD- 325901,AZD-8330 e XL 518. Exemplos para inibidores de mTor são temsirolimus, AP-23573 (que também age como um inibidor de VEGF), everolimus (um inibidor de VEGF, além disso), XL-765 (também um inibidor de PI3 quinase) e BEZ-235 (também um inibidor de PI3 quinase). Exemplos para inibidores de Akt são perifosina, GSK-690693, RX-0201 e triciribina. Exemplos para inibidores de cKit são AB-1010, OSI-930 (tam-

. bém age como um inibidor de VEGFR), AC-220 (também um inibidor de FIt3 e PDGFR), tandutinib (também um inibidor de FIt3 e PDGFR), axitinib (tam- bém um inibidor de VEGFR e PDGFR), XL-999 (também um inibidor de FIt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinib (também um inibidor de FIt3, POGFR, VEGFR), e XL-820 (também age como um inibidor de VEGFR- e PDGFR), imatinib (também um inibidor de bcr-abl), nilotinib (também um inibidor de bcr-abl e PDGFR). Exemplos para antagonistas Hedgehog são IPI-609 e CUR-

61414. Exemplos para inibidores de CDK são seliciclib, AT-7519, P-276, | ZK-CDK (também inibe VEGFR2 e PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, . PHA-690509 e AG 024322. Exemplos para inibidores de proteossomo são bortezomib, car- . filzomib e NPI-O0052 (também um inibidor de NFkappaB). Um exemplo para um inibidor da via NFkappaB é o NPI-0052. Um exemplo para um inibidor da via de ubiquitinação é o HBX- |

41108. | Em modalidades preferidas, o agente terapêutico adicional é um | ' agente antiangiogênico. | Exemplos para agentes antiangiogênicos são inibidores de FG- | FR, PDGFR e VEGFR ou dos respectivos ligantes (por exemplo, inibidores de VEGF como pegaptanib ou o anticorpo anti- VEGF bevacizumab), inibido- res de EGFL7, como MAb anti-EGFL7, inibidores de angiopoietina1/2 como AMG386, e talidomidas, esses agentes sendo selecionados de, sem limita- | ção, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK- | CDK (também um inibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC- | KDR, IMC-18F1, IMIDs (fármacos imunomoduladores), o derivado de talido- mida CC-4047, lenalidomida, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanib, ce- diranib, XL-999 (também um inibidor de cKit e FIt3), 133, CP 868596, IMC 3G3,R-1530 (também um inibidor de FIt3), sunitinib (também um inibidor de cKit e FIt3), axitinib (também um inibidor de cKit), lestaurtinib (também um | inibidor de FIt3 e PKC), vatalanib, tandutinib (também um inibidor de FIt3 e |

. cKit), pazopanib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-O0005, AG- 13736, E-7080, CHIR 258, sorafenib tosylate (também um inibidor de Raf), RAF-265 (também um inibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OS1-930, AEE-788 (também um inibidor de EGFR e Her2), BAY-57-9352 (também um inibidor de Raf), BAY-73-4506 (também um inibidor de Raf), XL 880 (também um inibidor de cMet), XL-647 (também um inibidor de EGFR e EphB4), XL 820 (também um inibidor de cKit) e nilotinib (também um inibidor de cKit e brc-abl). O agente terapêutico adicional também pode ser selecionado de | inibidores de EGFR, pode ser um inibidor de EGFR de molécula pequena ou | um anticorpo anti-EGFR.

Exemplos para anticorpos anti-EGFR, sem limita- . ção, são cetuximab, panitumumab, matuzumab; um exemplo para um inibi- : dor de EGFR de molécula pequena é o gefitinib.

Outro exemplo para um . modulador de EGFR é a toxina de fusão de EGF.

Dentre os inibidores de EGFR e Her2 utilizáveis para combina- ção com a molécula de ligação a VEGF da invenção estão lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuximab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (também um inibidor de VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS- 599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, | AEE-788 (também um inibidor de VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Ze- mab.

Outros agentes que podem ser vantajosamente combinados em uma terapia com a molécula de ligação a VEGF da invenção são tositumu- mab e ibritumomab tiuxetan (dois anticorpos anti-CD20 radiomarcados), a- | lemtuzumab (um anticorpo anti-CD52), denosumab, (um inibidor do ligante | de fator de diferenciação de osteoclastos), galiximab (um antagonista de | CD80), ofatumumab (um inibidor de CD20), zanolimumab (um antagonista de CD4), SGN40 (um modulador do receptor de ligante de CD40), rituximab (um inibidor de CD20), mapatumumab (um agonista do receptor de TRAIL- 1), REGN421(SAR153192) ou OMP-21M18 (inibidores de DIl4). Outros fármacos quimioterápicos que podem ser usados em combinação com as moléculas de ligação a VEGF da presente invenção são

- selecionados de, mas não limitados a, hormônios, análogos hormonais e anti-hormônios (por exemplo, tamoxifen, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciprote- rona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreotida, arzoxifeno, pasireotida, vapreotida), inibi- dores de aromatase (por exemplo, anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo, acetato de goserelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelin, histrelina, triptorelina), antimetabólitos (por exemplo, antifolatos como metotrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina como 5 fluorouracila, capecitabina, deci- tabina, nelarabina e gemcitabina, análogos de purina e adenosina como : mercaptopurina tioguanina, cladribina e pentostatina, citarabina, fludarabina); antibióticos antitumorais (por exemplo, antraciclinas como doxorrubicina, . daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina, mitomicina-C, bleomicina dacti- nomiíicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados de platina (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, lobaplatina, satraplatina); agentes de alquilação (por exemplo, estramustina, meciloreta- mina, melfalan, clorambucil, busulfan, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfami- da, hidroxiureia, temozolomida, nitrosoureias como carmustina e lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por exemplo, alcalóides da vinca como vin- blastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina e vincristina; e taxanos como pacli- taxel, docetaxel e suas formulações, larotaxel; simotaxel, e epotilonas como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); inibidores da topoisomerase (por exem- plo, epipodofilotoxinas como etoposida e etopofos, teniposida, amsacrina, topotecano, irinotecano) e quimioterápicos diversos como amifostina, ana- grelida, interferona alfa, procarbazina, mitotano, e porfímero, bexaroteno, | celecoxib.

A eficácia de moléculas de ligação a VEGF da invenção ou poli- peptídios, e de composições que os compreendam, pode ser testada usan- — do-se qualquer ensaio in vitro adequado, ensaio baseado em células, ensaio in vivo e/ou modelo animal conhecido, ou qualquer combinação desses, de- pendendo da doença ou distúrbio específico de interesse. Ensaios adequa- |

. dos e modelos animais ficarão claros para aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, os ensaios aqui descritos e usados nos Exemplos a- baixo, por exemplo, um ensaio de proliferação.

Os dados obtidos nos experimentos da invenção confirmam que asmoléculas de ligação a VEGF da invenção têm propriedades que são su- periores às de moléculas de ligação a VEGF da técnica anterior.

Entre essas propriedades estão a inibição completa da interação VEGF165-VEGFR2 e uma baixa ICso, conforme pode ser visto, por exemplo, nos dados de ELISA da Figura 1 e Tabela 5, assim como os valores de ICs9 (nM) para VHHs no É 10 ensaio AlphaScreen conforme mostrado nas Figuras 3, 17, 18 e Tabela 7; e : a afinidade Kp (nM) de VHHs purificados em VEGF humano recombinante e : VEGF de camundongo nas Tabelas 9, 10 e Figuras 5-1 e 5-2. Da mesma forma, conforme mostrado na Tabela 13, ligantes de VEGF da invenção têm . alta potência, isto é, na faixa subnanomolar, no ensaio de proliferação HU- VEC.

Isso indica que moléculas de ligação a VEGF da invenção são candi- datos promissores para ter eficácia terapêutica em doenças e distúrbios as- sociados a efeitos mediados por VEGF sobre a angiogênese, como câncer. i De acordo com outra modalidade da invenção, apresenta-se um método de diagnóstico de uma doença por: a) contato de uma amostra com uma molécula de ligação a VEGF da invenção conforme acima definida, e b) detecção da ligação da dita molécula de ligação a VEGF à di- ta amostra, e c) comparação da ligação detectada na etapa (b) com um pa- —drão, em que uma diferença na ligação com relação à dita amostra é diag- nóstica de uma doença ou distúrbio associado a efeitos mediados por VEGF sobre a angiogênese.

Para esse e outros usos, pode ser útil modificar adicionalmente uma molécula de ligação a VEGF da invenção, como por introdução de um — grupo funcional que seja uma parte de um par de ligação específico, como o par de ligação biotina-(estrept)avidina.

Esse grupo funcional pode ser usado para ligar a molécula de ligação a VEGF da invenção a outra proteína, poli-

: peptídio ou composto químico que esteja ligado à outra metade do par de ligação, isto é, mediante formação do par de ligação.

Por exemplo, uma mo- lécula de ligação a VEGF da invenção pode ser conjugada a biotina, e ligada a outra proteína, polipeptídio, composto ou veículo conjugado a avidina ou estreptavidina.

Por exemplo, essa molécula de ligação a VEGF conjugada da invenção pode ser usada como um repórter, por exemplo, em um sistema diagnóstico, em que um agente produtor de sinal detectável é conjugado a avidina ou estreptavidina.

Breve Descrição das Figuras: i 10 Figura 1: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação | hVEGF165/hVEGFR?2-Fc (ELISA) : Figura 2: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação hVEGF165/hVEGFR1-Fc (ELISA) - Figura 3: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação hVEGF1I65/h0VEGFR2-Fc (AlphaScreen) Figura 4: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação hVEGF165/hVEGFR1-Fc (AlphaScreen) ' Figuras 5-1 e 5-2: Ligação de VHHs monovalentes a VEGF hu- mano e de camundongo recombinante (ELISA) Figura 6: Ligação de VHHs monovalentes a VEGF121 humano | Figuras 7-1 a 7-4: VHHs purificados não se ligam a VEGFB, | VEGFC, VEGFD e PIGF Figuras 8-1 e 8-2: VHHs formatados bloqueiam a interação hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA) Figuras 9-1 e 9-2: VHHs formatados bloqueiam a interação hVEGF165/hVEGFR1-Fc (ELISA) Figura 10: VHHs formatados bloqueiam a interação hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen) Figura 11: VHHs formatados bloqueiam a interação —hVEGF1I65/PVEGFR1-Fc (AlphaScreen) Figura 12: VHHs formatados bloqueiam a interação mMVEGF164/mVEGFR2-Fc (AlphaScreen)

Figuras 13-1 e 13-2: VHHs formatados se ligam a VEGF de ca- mundongo e humano Figuras 14-1 a 14-8: VHHs formatados não se ligam a VEGFB, VEGFC, VEGFD e PIGF Figura 15: VHHs formatados se ligam a VEGF121 Figura 16: Alinhamento de sequência de VHH VEGFBII23B04 com a sequência de consenso de linhagem germinativa VH3/JH humana Figura 17: Variantes de VHH de VEGFBII23B04 bloqueiam a in- teração hvEGF165/hPVEGFR2-Fc (AlphaScreen) ] 10 Figura 18: Clones de sequência otimizada de VEGFBII23B04 bloqueiam a interação hvVEGF165/hPVEGFR2-Fc (AlphaScreen) : Figura 19: Alinhamento de sequência de VHH VEGFBIISBO5S com a sequência de consenso de linhagem germinativa VH3/JH humana - Materiais e métodos: a) Produção e teste de funcionalidade de VEGF 109 Um cDNA que codifica o domínio de ligação a receptor do fator de crescimento endotelial vascular humano isoforma VEGF165 (GenBank: ' AAMO3108.1; resíduos AA 27 - 135) é clonado no vetor pET28a (Novagen, Madison, WI) e superexpressado em E.coli (BL21 Star DE3) como uma pro- teíina insolúvel com etiqueta His. A expressão é induzida pela adição de IPTG a 1 mM e deixada continuar durante 4 horas a 37ºC. As células são colhidas por centrifugação e lisadas por sonicação da pelota de células. Os corpúsculos de inclusão são isolados por centrifugação. Após uma etapa de lavagem com Triton X 100 a 1% (Sigma-Aldrich), as proteínas são solubili- zadas usando cloridrato de guanidina a 7,5 M e novamente dobradas por | rodadas consecutivas de diálise durante uma noite usando tampões com concentrações descrescentes de ureia de 6 M até O M. A proteína redobrada | é purificada por cromatografia de troca de íons usando uma coluna Mo- | noQ5/50GL (Amersham BioSciences), seguido por filtração em gel com uma ! coluna Superdex75 10/300 GL (Amersheim BioSciences). A pureza e a ho- | mogeneidade da proteína são confirmadas por SDS-PAGE e Westen blot.

Além disso, a atividade de ligação a VEGFR1, VEGFR2 e Bevacizumab é monitorizada por ELISA.

Com essa finalidade, 1 ug/ml. de VEGF109 huma- no recombinante é imobilizado durante uma noite a 4ºC em uma placa Ma- xiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloquea- dos com uma solução de caseína (1%). Diluições seriadas de VEGFRI1, VEGFR2 ou Bevacizumab são adicionadas à placa revestida com VEGF109, e a ligação é detectada usando-se IgG anti-humano de cabra conjugado a fosfatase alcalina (AP), específico para Fc (Jackson Immuno Research La- boratories Inc., West Grove, PA, EUA) e uma reação enzimática subsequen- te na presença do substrato PNPP (p-nitrofenilfosfato) (Sigma-Aldrich). : 10 VEGF109 podia se ligar a VEGFR1, VEGFR2 e Bevacizumab, indicando que : o VEGF109 produzido é ativo. : b) Conjugação de VEGF165 a KLH e teste de funcionalidade do - VEGF165 conjugado a KLH - VEGF165 humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) é conjugado a hemocianina de lapa de cultura marinha (mMcKLH) usando o Kit Imject Inmunogen EDC com mcKLH (Pierce, Rockford, IL, EU- A) de acordo com as instruções do fabricante.

Uma conjugação eficiente do ' polipeptídio a mcKLH é confirmada por SDS-PAGE.

A funcionalidade da pro- teína conjugada é verificada por ELISA: 2 ug/ml. de VEGF165 conjugado a KLH são imobilizados durante uma noite a 4ºC em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1%). Diluições seriadas de VEGFR1 ou VEGFR2 são adicionadas, e a ligação é detectada usando um IgG anti-humano de cabra conjugado a peroxidase de raiz-forte (HRP), específico para Fc (Jack- —sonImmuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA) e uma rea- ção enzimática subsequente na presença do substrato TMB (3,3',5,5'- tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA). A proteína conjugada a KLH ainda podia interagir com VEGFR1, VEGFR2 e Bevacizumab, confir- mando que os epítopos relevantes em VEGF 165 ainda estão acessíveis.

Exemplo 1 A imunização com diferentes formatos de VEGF induz uma resposta imune humoral em lhama

. 1.1 Imunizações Após aprovação do Comitê de Ética da faculdade de Medicina Veterinária (Universidade de Ghent, Bélgica), 4 lhamas (designadas por nº 264, 265, 266, 267) são imunizadas de acordo com protocolos padronizados coms6 injeções intramusculares (100 ou 50 ug/dose a intervalos semanais) de VEGF109 humano recombinante. A primeira injeção, no dia 0, é formula- da em Adjuvante de Freund Completo (Difco, Detroit, MI, EUA), ao passo que as injeções subsequentes são formuladas em Adjuvante de Freund In- completo (Difco, Detroit, MI, EUA). Além disso, quatro lhamas (designadas pornº234,235,280 e 281) são imunizadas de acordo com o seguinte proto- : colo: 5 injeções intramusculares com VEGH165 humano conjugado a KLH (100 ou 50 ug/dose a intervalos bissemanais) seguidas por 4 injeções intra- musculares de VEGF109 humano (primeira dose de 100 ug seguida, 2 se- - manas depois, por três de 50 ug/dose a intervalos semanais).

1.2 Avaliação das respostas imunes induzidas por VEGF em lhama Para monitorizar os títulos séricos específicos para VEGF, esta- belece-se um ensaio ELISA em que 2 ug/ml. de VEGF165 ou VEGF109 hu- mano recombinante é imobilizado durante uma noite a 4ºC em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são blo- queados com uma solução de caseína (1%). Após adição de diluições séri- cas, o IgG total ligado é detectado usando imunoglobulina anti-lhama de ca- bra conjugada a peroxidase de raiz-forte (HRP) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, EUA), e uma reação enzimática subsequente na presença dosubstrato TMB (3,3',5,5'-tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA). Para as lhamas 264, 265, 266 e 267, realiza-se um ELISA adicional, em que as respostas específicas para isotipo contra VEGF165 e VEGF109 são ava- liadas. As respostas específicas para isotipo são detectadas usando mAbs de camundongo que reconhecem especificamente I9G1 de lhama conven- cionale as lgG2elgG3 apenas de cadeia pesada de lhama [Daley et al. (2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386], seguido por um conjugado de anti-camundongo de coelho-HRP (DAKO). Os ELISAs são revelados usando

- TMB como substrato cromogênico, e a absorbância é medida a 450 nm. Os títulos séricos para cada lhama são apresentados na Tabela 1. Tabela 1: Resposta sérica específica mediada por anticorpo con- tra VEGF165 e VEGF 109 ELISA (revestido em fase sólida com proteína recombinante |] JeGrIsShumeno recombinante | VEGFIO9 humano recombinante | pe fe efe ea elela mm + VEGF109 . + VEGF109 : VEGF165-KLH — ee ERR ee

E | [265 fveceroo ma ds + + bo [4 + + | [266 [veces [ma fe dé fu ds 1 + fu | [267 veces lna de DD de bl | |. n/d, não determinado Exemplo 2 Clonagem de repertórios de fragmentos de anticorpo ape- nas de cadeia pesada e preparação de fago Após a injeção final de imunógeno, tecidos imunes como a fonte de células B que produzem os anticorpos de cadeia pesada são coletados das lhamas imunizadas. Tipicamente, duas amostras de sangue de 150 mL, coletadas 4 e 8 dias após a última injeção de antígeno, e uma biópsia de linfonodo, coletada 4 dias após a última injeção de antígeno são coletadas poranimal. Das amostras de sangue, células mononucleares de sangue pe- riférico (PBMCs) são preparadas usando Ficoll-Hypaque de acordo com as

: instruções do fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). Das PBMCs e da biópsia de linfonodo, extrai-se o RNA total, que é usado como material de partida para RT-PCR para amplificar os segmentos de DNA que codificam VHH, conforme descrito em WO05/044858. Para cada lhama imunizada, uma biblioteca é construída por reunião do RNA total iso- lado de todos os tecidos imunes coletados desse animal.

Em resumo, o re- pertório de VHH amplificado por PCR é clonado mediante sítios de restrição específicos em um vetor projetado para facilitar a exposição de fagos da bi- blioteca de VHH.

O vetor é derivado de puUC119 e contém o promotor LacZ, ' 10 uma sequência de codificação de proteina M13 fago glll, um gene de resis- : tência para ampíicilina ou carbenicilina, um sítio de clonagem múltipla e uma : sequência líder glll-pelB híbrida (pAXO50). Em quadro com a sequência de - codificação de VHH, o vetor codifica uma etiqueta c-myc C-terminal e uma . etiqueta His6. Os fagos são preparados de acordo com protocolos padroni- zadose armazenados após esterilização com filtro a 4ºC para uso adicional.

Exemplo 3 Seleção de VHHs específicos para VEGF mediante exposi- ção de fagos Bibliotecas de fagos de VHH são usadas em diferentes estraté- giasde seleção aplicando uma multiplicidade de condições de seleção.

As variáveis incluem i) o formato da proteina VEGF (rhVEGF165, rhnVEGF109 ou rmVEGF164), ii) o método de apresentação de antígeno (fase sólida: di- retamente revestido ou mediante uma etiqueta de biotina em placas revesti- das com Neutravidina; fase de solução: incubação em solução, seguida por capturaem placas revestidas com Neutravidina), iii) a concentração de antí- geno e iv) o método de eluição (tripsina ou eluição completitiva usando VEGFR2). Todas as seleções são realizadas em placas Maxisorp de 96 po- ços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). As seleções são realizadas da seguinte maneira: Bibliotecas de fagos são incubadas à TA com concentrações variáveis de antígeno VEGF, em solução ou imobilizado em um suporte sólido.

Após 2 h de incubação e ampla lavagem, os fagos ligados são eluídos.

No caso de se usar tripsina bp para eluição dos fagos, a atividade de protease é imediatamente neutraliza- da por adição do inibidor de protease AEBSF a 0,8 mM.

Produções de fagos que mostram enriquecimento com relação ao fundo são usadas para infectar E. coli.

Células de E. coli infectadas são usadas para preparar fagos para a próxima rodada de seleção (resgate de fagos) ou plaqueadas em placas de ágar (LB+amp+glicose?”) para análise de clones individuais de VHH.

Para a triagem de uma produção de seleção quanto a ligantes específicos, colônias únicas são tomadas das placas de ágar e cultivadas em placas de 96 poços de 1 mL.

A expressão de VHH controlada por lacZ é induzida por adição de : 10 IPTG(0,1-1mM final). Extratos periplasmáticos (em um volume de — 80 uL) | são preparados de acordo com métodos padronizados. ' Exemplo 4 Identificação de VHHs de ligação a VEGF e de bloqueio de . receptor de VEGF Os extratos periplasmáticos são testados quanto à ligação a VEGF165 humano por ELISA.

Em resumo, 2 ug/ml. de VEGF165 humano recombinante são imobilizados durante uma noite a 4ºC em uma placa Ma- xiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloquea- dos com uma solução de caseína (1%). Após adição de uma diluição tipica- mentede 10 vezes de extratos periplasmáticos, a ligação de VHH é detecta- da usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anti- camundongo-HRP (DAKO). Clones que mostrem sinais de ELISA > 3 vezes acima do fundo são considerados como VHHs de ligação a VEGF.

Além disso, os extratos periplasmáticos são triados em um en- saio AlphaScreen de VEGF165 humano/VEGFR2 humano (Ensaio Homogê- neo de Proximidade Luminescente Amplificada) para avaliar a capacidade de bloqueio dos VHHs.

VEGF165 humano é biotinilado usando Sulfo-NHS- LC-Biotina (Pierce, Rockford, IL, EUA). Uma quimera de VEGFR2 huma- no/Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) é capturado usando um VHH —anti-Fc humano que é acoplado a glóbulos receptores de acordo com as ins- truções do fabricante (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). Para avaliar a ca- pacidade de neutralização dos VHHs, os extratos periplasmáticos são diluí-

. dos a 1/25 em tampão PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sigma-Aldrich) e pré-incubados com VEGF165 humano biotinilado a 0,4 nM durante 15 minu- tos à temperatura ambiente (TA). A essa mistura, adicionam-se os glóbulos receptores (10 ug/ml) e VEGFR2-huFc a 0,4 nM, que são adicionalmente —incubados durante 1 hora à TA no escuro.

Subsequentemente, adicionam-se glóbulos doadores (10 ug/mL), seguido por incubação de 1 hora à TA no es- curo.

A fluorescência é medida por leitura das placas no leitor de placas En- vision Multi Label (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) usando um compri- mento de onda de excitação de 680 nm e um comprimento de onda de e- Ú 10 missão entre 520 nm e 620nm.

O extrato periplasmático contendo VHH irre- D levante é usado como controle negativo.

Extratos periplasmáticos contendo | . VHHs anti-VEGF165 que são capazes de diminuir o sinal de fluorescência | em mais de 60% com relação ao sinal do controle negativo são identificados | . como um acerto.

Todos os acertos identificados no AlphaScreen são confir- —mados por um ELISA de competição.

Com essa finalidade, 1 ug/mL de qui- mera de VEGFR2 humano (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) é revesti- do em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Di- luições de cinco vezes dos extratos periplasmáticos são incubadas na pre- | sença de uma concentração fixa (4 nM) de VEGF165 humano biotinilado em tampão PBS contendo 0,1% de caseina e 0,05% de Tween 20 (Sigma- Aldrich). A ligação desses complexos de VHH/bio-VEGF165 à placa revesti- da com quimera de VEGFR2 humano é detectada usando extravidina conju- gada a peroxidase de raiz-forte (HRP) (Sigma, St Louis, MO, EUA). As IDs | da sequência de VHH e as correspondentes sequências de AA dos VHHS | de ligaçãoaVEGF (sem bloqueio de receptor) e de VHHs inibidores (com | bloqueio de receptor) estão relacionados na Tabela 2 e na Tabela 3, respec- | tivamente.

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; As taxas de dissociação de VHHs inibidores são analisadas em Biacore (instrumento Biacore T100, GE Healthcare). Usa-se tampão HBS- EP+ como tampão de operação, e os experimentos são realizados a 25ºC.

VEGF165 humano recombinante é irreversivelmente capturado em um chip sensor CM5 mediante acoplamento de amina (usando EDC e NHS) até um nível alvo de +/- 1.500 RU.

Após imobilização, as superfícies são desativa- das com 10 min de injeção de etanolamina a 1 M, pH 8,5. Uma superfície de referência é ativada e desativada respectivamente com EDC/NHS e etano- lamina.

Extratos periplasmáticos de VHHs são injetados a uma diluição de 10 vezes em tampão de operação durante 2 min a 45 ul/min e deixados se . dissociarem durante 10 ou 15 min.

Entre diferentes amostras, as superfícies : são regeneradas com tampão de regeneração.

Os dados são duplamente referenciados por subtração das curvas no canal de referência e de uma in- . jeção de tampão de operação em branco.

A dissociação das curvas proces- | sadas é avaliada por ajuste de um modelo de decaimento em duas fases no | software Biacore T100 Evaluation v2.0.1. Os valores para kg-rápido, kg-lento | e % de rápido estão relacionados na Tabela 4. ! Tabela 4: Determinação da taxa de dissociação de VHHs de | : bloqueio de receptor com Biacore | Eden À O . — ]k(rápido) |ka(lento) |) células B equência única | Representativo rápido | ligação (RU 1 2 vecremsnos 130002 [sooeos [te js = | 1 ds veremssO [mmos laoomos 12 178 = | 1 — vecremmos|jasomoa [atcmos 13 las — | 1h veses soon jasomos ttz fas | 1h ls [verme seo lagos ts arm | 1 8 > vecremAAS 150502 [a2omos|1s av = = 14 8 >> jveGFBMABOS 380502 anos 23 168 = & o jo —— jvecramsnos [a7o5or [asomos 20 ar = |

2 bh ao It pe LI faia 6. | so 1 |14 VEGFBII23F11 |2,70E-02 | 1,30E-04 | 22 134 PE EE o 16 >> [vEGFBIZSEOS 150602 [690605 16 las =— 1 x ——— jvecresticor ame 1sceoalas | = a os verao 14oEO? Tan dao jato — | 1 do — jvecremicos tasca janomaa ao 152 = | : 1 js > jvecremeos toco 12000416 5 — | 1 ds > Ívecremoro 120502 [osneos o [asa = | 1h lr jvecrenenos 190602 2aoeca|ts ist = : 4 as => vecramenos asoeca 15060426 | m = | 1 do ivecremenos 160502 340504 os dra = om — jvecramenn oweos soomcajas too — 1 Rr — jvecramono taco jason jim dao — 1 8 verao ato 11060 123 ja | 1 jvecramanos [areoa [asas 20 ns = | ho das — jvereeero joe asomos tar as — | 1 6 => lvecremanto 1aoo2 160 ao os — = do Se —— Jveeramsenlasoeo 140 las |%6 =) n/d, não determinado Exemplo 5 Caracterização de VHHs purificados Três VHHs inibidores anti-VEGF são selecionados para caracte- rização adicional como proteína purificada: VEGFBII23B04, VEGFBII24C4 e

VEGFBII23A6. Esses VHHs são expressados em E. coli TG1 como proteí- nas c-myc com etiqueta His6. A expressão é induzida pela adição de IPTG a 1 MM, e se deixa continuar durante 4 horas a 37ºC. Após centrifugação das culturas celulares, os extratos periplasmáticos são preparados por congela- — mento-descongelamento das pelotas. Esses extratos sãousados como mate- rial de partida para purificação de VHH mediante IMAC e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As preparações finais de VHH mostram 95% de pureza, conforme avaliado por SDS-PAGE.

5.1 Avaliação de VHHs de bloqueio de VEGF165/VEGFR2 hu- É 10 manoem ELISA de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR2 humano-Fc | . A capacidade de bloqueio dos VHHs é avaliado em um ELISA de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR2 humano-Fc. Em resumo, 1 - | ug/mL de quimera VEGFR2-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) é - revestido em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alema- nha). Séries de diluições (faixa de concentração de 1 mM - 64 pM) dos V- HHs purificados em tampão PBS contendo 0,1% de caseína e 0,05% de Tween 20 (Sigma) são incubadas na presença de 4 nM de VEGF165 biotini- í lado. A ligação residual de bio-VEGF165 a VEGFR2 é detectada usando i extravidina conjugada a peroxidase de raiz-forte (HRP) (Sigma, St Louis, MO, EUA) eTMB como substrato. Como controles, tomam-se Bevacizumab (AvastinO) e Ranibizumab (Lucentis&). As curvas de inibição de dose são mostradas na Figura 1; os valores de IC55 correspondentes e a % de inibição estão resumidos na na Tabela 5. Tabela 5: Valores de ICs9o (NM) e % de inibição para VHHs mo- —novalentes em ELISA de competição de hvVEGF165/hVEGFR2-Fc [veses a a [ESSO A PPA MP

5.2 Avaliação de VHHs de bloqueio de VEGF165/VEGFR2 hu- mano em ELISA de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR1 humano-Fc VHHs também são avaliados em um ELISA de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR1 humano-Fc. Em resumo, 2 ug/ml. de quimera VEGFR1-Fc(R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) são revestidos em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Séries de dilui- ções (faixa de concentração de 1 mM - 64 pM) dos VHHs purificados em tampão PBS contendo 0,1% de caseína e 0,05% de Tween 20 (Sigma) são incubadas na presença de 0,5 nM de VEGF165 biotinilado. A ligação residu- alde bio-VEGF165 a VEGFR1 é detectada usando extravidina conjugada a ' . peroxidase de raiz-forte (HRP) (Sigma, St Louis, MO, EUA) e TMB como : substrato. Como controles, tomam-se Bevacizumab, Ranibizumab e um VHH 7 irrelevante (2E6). As curvas de inibição de dose são mostradas na Figura 2; . os valores de ICso correspondentes e a % de inibição estão resumidos na na Tabela6. Tabela 6: Valores de ICs5o (nM) e % de inibição de VHHs mono- valentes em ELISA de competição de hvVEGF165/hVEGFR1-Fe | ! vesrerasea Cú

FESTA DN PR [PESC [E PN [Beraizamao Tg |

5.3 Avaliação dos VHHs anti-VEGF165 no AlphaScreen de blo- queio de VEGF165 humano/VEGFR2 humano-Fc A capacidade de bloqueio dos VHHs também é avaliada em um AlphaScreen de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR2 humano-Fc. Re- sumidamente, diluições seriadas de VHHs purificados (faixa de concentra- ção: 200 nM — 0,7 pM) em tampão PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sig- ma) são adicionadas a 4 pM de bio-VEGF165 e incubadas durante 15 min. — Subsequentemente, VEGFR2-Fc (0.4 nM) e glóbulos receptores revestidos com VHH anti-Fc (20 ug/mL) são adicionados, e essa mistura é incubada durante 1 hora no escuro.

Finalmente, glóbulos doadores de estreptavidina (20 ug/mL) são adicionados e, após 1 hora de incubação no escuro, a fluo- rescência é medida no leitor de microplatas Envision.

As curvas de dose- resposta são mostradas na Figura 3. Os valores de ICso para VHHs que blo- queiam a interação VEGF165 humano - VEGFR2 humano-Fc são resumi- dos na Tabela 7. | Tabela 7: Valores de ICs9o (pM) e % de inibição para VHHs em AlphaScreen de competição de hvVEGF165/hVEGFR2-Fc ' | : [Ranibimamao da de ' 5.4 Avaliação dos VHHs anti-VEGF165 no AlphaScreen de blo- queiodeWVEGF165humano/VEGFR1 humano-Fc A capacidade de bloqueio dos VHHs também é avaliada em um : AlphaScreen de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR1 humano-Fc.

Re- sumidamente, diluições seriadas de VHHs purificados (faixa de concentra- ção: 500 nM — 1,8 pM) ) em tampão PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sigma) são adicionadas a 0,4 nM de bio-VEGF165 e incubadas durante 15 min.

Subsequentemente, VEGFR1-Fc (1 nM) e glóbulos receptores revesti- dos com VHH anti-Fc (20 ug/mL) são adicionados, e essa mistura é incuba- da durante 1 hora no escuro.

Finalmente, glóbulos doadores de estreptavidi- na (20 ug/mL) são adicionados e, após 1 hora de incubação no escuro, a fluorescência é medida no leitor de microplatas Envision.

As curvas de dose- resposta são mostradas na Figura 4. Os valores de ICs9 e % de inibição para VHHs que bloqueiam a interação VEGF165 humano — VEGFR1 humano-Fc são resumidos na Tabela 8. Tabela 8: Valores de ICso (nM) para VHHs em AlphaScreen de competição de hvVEGF165/hVEGFR1-Fc [veses CR

[ESTO VEGFBI24CO4 02 Ranibizumab 38 79 |

5.5 Determinação da afinidade da interação VEGF165 humano-

VHH A cinética de ligação de VHH VEGFBII23B04 com hvVEGF165 é analisada por SPR em um instrumento Biacore T100. VEGF165 humano — recombinante é imobilizado diretamente em um chip CM5 mediante acopla- mento de amina (usando EDC e NHS). VHHs são analisados a diferentes l concentrações entre 10 e 360 nM. As amostras são injetadas durante 2 min . e deixadas dissociar até 20 min a uma taxa de fluxo de 45 ulL/min. Entre as | ' injeções de amostras, a superfície do chip é regenerada com HCI a 100 mM. HBS-EP+ (tampão Hepes pH 7,4 + EDTA) é usado como tampão de opera- ' ção. As curvas de ligação são ajustadas usando-se um modelo de Reação de Dois Estados pelo Software Biacore T100 Evaluation v2.0.1. As afinida- des calculadas dos VHHs anti-VEGF estão relacionadas na Tabela 9. Tabela 9: Afinidade Kp (nM) de VHHs purificados para VEGF165 humano recombinante o egg O" |vecremaseso |- — lateos faeo |. —Jassos/24ema [oz | |vecreae? |- = fazesos [aew | [s7emlicem or | [vecreizaços? |: Tazesos Timm |. —Jassor/osmos log | &) Curva de ligação heterogênea resultando em nenhum ajuste a 1:1, as curvas são ajustadas usando um modelo de Reação de Dois Estados pelo Software Biacore T100 Evaluation v2.0.1

5.6 Ligação a VEGF164 de camundongo A reatividade cruzada com VEGF164 de camundongo é deter- minada usando-se um ELISA de ligação. Em resumo, VEGF164 de camun- dongo recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MS, EUA) é revestido du- rante uma noite a 4ºC a 1 pg/ml. em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1% em PBS). VHHs são aplicados como séries de diluições (fai- xa de concentração: 500 nM — 32 pM) em tampão PBS contendo 0,1% de caseina e 0.05% de Tween 20 (Sigma) e a ligação é detectada usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anti-camundongo- —HRP (DAKO) e uma reação enzimática subsequente na presença do subs- trato TMB (3,3',5,5'-tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA) (Figu- ras 5-1 e 5-2). Um mAb reativo com VEGF164 de camundongo é incluído como controle positivo.

Como referência, a ligação a VEGF165 humano também é medida.

Os valores de ECs55 são resumidos na Tabela 10. | 10 Tabela 10: Valores de ECso (pM) para VHHs em um ELISA de !i- . gação de VEGF165 humano recombinante e VEGF 164 de camundongo : |vecraizaas — — lay === | ã& "| vecraiacos — lag = q “| ESSES Pr FM NB, nenhuma ligação i 5.7 Ligação a VEGF121 A ligação a VEGF121 humano recombinante é avaliada median- te um ELISA de ligação em fase sóida.

Resumidamente, VEGF121 humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MS, EUA) é revestido durante uma noite a 4ºC a 1 uguml em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wi- esbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseií- na (1% em PBS). VHHs são aplicados como séries de diluições (faixa de concentração: 500 nM — 32 pM) em tampão PBS contendo 0,1% de caseína € 0,05% de Tween 20 (Sigma), e a ligação é detectada usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anti-camundongo-HRP (DAKO) e uma reação enzimática subsequente na presença do substrato TMB (3,3',5,5"-tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA) (Figura 6). Como controle positivo, tomam-se diluições seriadas do VEGFR2. Os valores de ECso são resumidos na Tabela 11. Tabela 11: Valores de ECso (pM) para VHHs monovalentes em um ELISA de ligação de VEGF 121 humano recombinante | ID do VHH o VEGFBII23B04 510 VEGFBIZ3A06

5.8 Ligação aos membros da família VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD e PIGF A ligação a VEGFB, VEGFC, VEGFD e PIGF é avaliada median- : 5 te um ELISA de ligação em fase sóida. Em resumo, VEGFB, VEGFC, VEGFD e PIGF (R&D Systems, Minneapolis, MS, EUA) são revestidos du- : rante uma noite a 4ºC a 1 uguml em uma placa MaxiSorp de 96 poços | (Nune, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseina (1% em PBS). VHHs são aplicados como séries de diluições (fai- f 10 xade concentração: 500 nM — 32 pM), e a ligação é detectada usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anti-camundongo-AP (Sigma, St Louis, MO, EUA). Como controle positivos, diluições seriadas dos receptores apropriados são tomadas e detectadas com IgG anti-humana de cabra conjugada a peroxidase de raiz-forte (HRP), anticorpos específico pa- - 15 raFc (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA) e uma reação enzimática subsequente na presença do substrato TMB (3,3',5,5'-tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA). As curvas de do- se-resposta de VHHs e controles são mostradas nas Figuras 7-1 a 7-4. Os resultados mostram que não há nenhuma ligação detectável dos VHHs sele- cionadosaVEGFB,VEGFC, VEGFD ou PIGF.

5.9 Ligação a epítopo Experimentos de ligação a epitopo baseados em Biacore são realizados para investigar que ligantes de VEGF se ligam a um epítopo simi- lar ou superposto a VEGFBII23B04. Para isso, VEGFBII23B04 é imobilizado em um chip sensor CM5. Para cada amostra, VEGF165 humano é passado sobre a superfície do chip e capturado reversivelmente por VEGFBII23B4. VHHs purificados (100 nM) ou extratos periplasmáticos (diluídos a 1/10) são, então, injetados com um tempo de contato de superfície de 240 segundos e

PM. . 8a OS MO O O ——————————————————AAAA A sas O A A A a AA o AA A A AO aaa A 84/108 uma taxa de fluxo de 10 pyL/minuto.

Entre diferentes amostras, a superfície é regenerada com tampão de regeneração (HCl a 100 mM). As curvas proces- sadas são avaliadas com o software Biacore T100 Evaluation.

Os VHHs po- diam ser divididos em dois grupos: grupo um, que dava uma ligação adicio- nalaVEGF165 capturado por VEGFBII23B04, e um segundo grupo, que não é capaz de se ligar simultaneamente a VEGF 165 capturado por VEGF- BII23B04. A Tabela 12-A resume os epítopos de ligação dos VHHs testados.

A mesma configuração de ensaio é usada para avaliar se VEG- FR1, VEGFR2, Ranibizumab e Bevacizumab são capazes de se ligar a i 10 VEGF-165 humano simultaneamente com VEGFBII23B04. A Tabela 12-B . apresenta as respostas de ligação adicional a VEGF165 capturado por : VEGFBII23B04. Apenas VEGFR?2 não é capaz de se ligar a VEGF165 captu- rado por VEGFBII23B04, ressaltando a capacidade de bloqueio de VEGFBI- | - 123B04 para a interação VEGF-VEGFR?2. Além disso, esses dados mostram queoepítopo VEGFBII23B04 é diferente do epitopo de Bevacizumab e Ra- nibizumab.

Tabela 12-A: Ligação a epítopo de VHHs anti-VEGF — ligação simultânea com VEGFBII23B04 Nenhuma ou] 1CO2 1E07 4608 8EO7 BFO7 12A07 12801 86C11 86FI1 86GOB - Dr dação B6G10 86G11 87B07 88AO1 B8BA0O2 B86BO2 SSEO2 8SGO3 B8SGOS 8BG11 por 23804” Tgação 3DI2 5802 S5B03 5B05 6GOM2 7D0O8 8DO9 &8FOS 10CO7 10E07 por 23B04 * indicando epítopos iguais ou superpostos Tabela 12-B: Ligação a epítopo de VEGFBII23B04 — ligação de inibidores de referência ou repcetores cognatos em VEGF165 capturado por VEGFBII23B04 ! | o veres lo mr | | 2 veses [ow |. | | | |

4 o enem [nom fãs so VEGFRI o 6 VEGFR2 100 nM - |

5.10 Caracterização dos VHHs anti-VEGF no ensaio de prolife- ração de HUVEC A potência dos VHHs selecionados é avaliada emum ensaio de proliferação. Em resumo, células HUVEC primárias (Technoclone) são pri- —vadas de suplementos durante uma noite e, então, 4.000 células/poço são : semeadas em quadruplicata em placas de cultura de tecido de 96 poços. As células são estimuladas na ausência ou presença de VHHs com 33 ng/mL de VEGF. As taxas de proliferação são medidas por incorporação de [?H] | . timidina no dia 4. Os resultados do ensaio de proliferação de HUVEC são mostrados na Tabela. | - Tabela 13: Valores de ICso (nM) e % de inibição de VEGFBI- 123B04, VEGFBII23A06 e VEGFBII24CO04 monovalente em ensaio de prolife- | ração de HUVEC por VEGF O | eevedama ag

5.11 Caracterização dos VHHs anti-VEGF no ensaio de fosfori- laçãode Erkem HUVEC A potência dos VHHs selecionados é avaliada no ensaio de fos- forilação de Erk em HUVEC. Em resumo, células HUVE primárias são priva- das de soro durante uma noite e, então, estimuladas na ausência ou presen- ça de VHHs com 10 ng/mL de VEGF durante 5 min. As células são fixadas com formaldeído a 4% em PBS, e os níveis de fosforilação ERK são medi- dos por ELISA usando anticorpos específicos para fosfoERK (anti- phosphoMAP Quinase pERK1&2, M8159, Sigma) e conjugado de imunoglo- bulina anti-camundongo de coelho policlonal-HRP (PO161, Dako). Conforme

A ,ÀÂA.º AO A““O DUNN A | 86/108 | mostrado na Tabela 14, VEGFBII23B04 e Bevacizumab inibem a fosforilação de Erk induzida por VEGF em pelo menos 90%, com ICsos < InM. | Tabela 14: Valores de ICso (nM) e % de inibição de VEGFBI- ! 123B04 monovalente em ensaio de fosforilação de Erk em HUVEC por VEGF ' [veses fo [Bevecizamao — úúúÚdas o Exemplo 6 : Geração de VHHs de bloqueio anti-VEGF multivalentes VHH VEGFBII23B04 é geneticamente fusionado a VEGFBI- . 123B04, resultando em um VHH homodimérico (sequência de AA, veja Tabe- . la 15), ou diferentes VHHs de ligação a VEGF, resultando em VHHs hetero- | diméricos.

Para gerar os VHHs heterodiméricos, um painel de 10 VHHs de ' ligação a VEGF únicos são ligados mediante um ligante flexível de 9 ou 40 Gly-Ser em duas orientações diferentes a VEGFBII23B04 (sequências de AA, veja Tabela 15). VEGFBII23B04 homodimérico (VEGFBII010) e os 40 VHHs bivalentes heterodiméricos são expressados em E. coli TG1 como i 15 proteinas c-myc, com etiqueta His6. A expressão é induzida pela adição de 1 : mM de IPTG e deixada continuar durante 4 horas a 37ºC.

Após centrifuga- ção das culturas celulares,os extratos periplasmáticos são preparados por congelamento-descongelamento das pelotas.

Esses extratos são usados como material de partida, e os VHHs são purificados mediante IMAC e des- salinização, resultando em 90% de pureza, conforme determinado por SDS- PAGE.

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ESSO PM Tabela 18: Valores de ICso (DM) e % de inibição de VHHs forma- tados em ELISA de competição de VEGF165/hVEGFR1-Fc | FESTA Pr oo veres ag Ro : veses ja fe ! | [Rambizamao Ts TR Tabela 19: Valores de IC5o (DM) e % de inibição para VHHs for- - matados em AlphaScreen de competição de hVEGF165/hVEGFR2-Fe o vero |

FESTA A MD veses da ho | veses da hm | Ranibizamao Je Tabela 20: Valores de IC5o (PM) e % de inibição de VHHs forma- tados em AlphaScreen de competição de VEGF165/hVEGFR1-Fe Fvesreneer e | [ves e

E———>, A ——— 98/108 | vecrergas | VEGFBIIO25 rá | 82 | [una Ta E Além disso, VHHs formatados também são testados quanto a sua capacidade de bloquear a interação MVEGF164/mMVEGFR2-huFc.

Em resumo, diluições seriadas de VHHs purificados (faixa de concentração: 4 UM — 14,5 pM) em tampão PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sigma) são adicionadas a0,1nM de mVEGF164 biotinilado e incubadas durante 15 min.

Subsequentemente, VEGFR2 de camundongo-huFc (0,1 nM) e glóbulos re- - ceptores revestidos com VHH anti-huFc (20 ug/mL) são adicionados, e essa ' mistura é incubada durante 1 hora.

Finalmente, glóbulos doadores de estrep- : tavidina (20 pug/mL) são adicionados e, após 1 hora de incubação, a fluores- ' 10 cência é medida no leitor de microplatas Envision.

As curvas de dose- resposta são mostradas na Figura 12. Os valores de ICs9 para VHHs que bloqueiam a interação VEGF 164 de camundongo/VEGFR2-hFC são resumi- : dos na Tabela 21. Tabela 21: Valores de ICs5o (pM) e % de inibição para VHHs for- - 15 matados em AlphaScreen de competição de MVEGF164/mVEGFR2-hFc veres TESS? PMN [Raritizameo Os VHHs formatados também são testados em ELISA quanto a sua capacidade de se ligar a mVEGF164 e VEGF165 humano (Exemplo 5.6; Figuras 13-1 e 13-2; Tabela 22); VEGF121 (Exemplo 5.7; Figura 15; Tabela 23) e aos membros da família VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD e PIGF (E- xemplo 5.8; Figuras 14-1 a 14-8). A cinética de ligação para VEGF165 hu- mano é analisada conforme descrito no Exemplo 5.5. Os valores de Kp valu- es estão relacionados na Tabela 24. Tabela 22 Valores de EC5o (pM) para VHHs formatados em um

2 MO««s.222 OssOS.€<“€ 0.2 O pop A A o a a a AA A AAA a 99/108 ELISA de ligação de VEGF165 humano recombinante e VEGF 164 de ca- mundongo rhvVEGF165 IMVEGF164 [vereroto Faa jvesearo Cd da |vecrenaes |

FEST ED [vegreres JB Tabela 23: Valores de ECso (pM) para VHHs formatados em um - ELISA de ligação de VEGF 121 humano recombinante | o Je : jvessen da | . ] 5 Tabela 24: Afinidade Ko (nM) de VHHs formatados purificados para VEGF165 humano recombinante |vecrenoarm —J126os — jato [23602 j1seoa jlom =— > vecrencas” — jaoeos — Jaseos [24m02r Joreoa foso => |veGRBNÇ2Aº — f30m0s — 1360, jose [ossos [om =— >= & Kp= kai/Kat"(Ka2/(Ka2+Ka2)) &) As curvas são ajustadas usando um modelo de Reação em Dois Estados pelo Software Biacore T100 Evaluation v2.0.1 Os VHHs VEGFBII010, VEGFBIIO022, VEGFBII024 e VEGFBI- 1025 também são testados no ensaio de proliferação de HUVEC e de fosfori-

—————————————————————"——F.. 100/108 lação de Erk mediadas por VEGF.

A potência dos VHHs formatados selecionados é avaliada em um ensaio de proliferação. Em resumo, células HUVEC primárias (Techno- clone) são privadas de suplementos durante uma noite e, então, 4.000 célu- las/poço são semeadas em quadruplicata em placas de cultura de tecido de 96 poços. As células são estimuladas na ausência ou presença de VHHs com 33 ng/mL de VEGF. As taxas de proliferação são medidas por incorpo- ração de [?H] Timidina no dia 4. Os resultados mostrados na Tabela 25 de- monstram que os VHHs formatados e Bevacizumab inibem a proliferação de HUVEC induzida por VEGF em mais de 90%, com ICsos < 1nM. Tabela 25: Valores de ICso (nM) e % de inibição de VHHs forma- : tados em ensaio de proliferação de HUVEC por VEGF | : |veseemoro Ts | jvesssror dao BB |veeerees O age veres o de | |vecrenas far A potência dos VHHs formatados selecionados é avaliada no ensaio de fosforilação de Erk em HUVEC. Em resumo, células HUVE primá- riassão privadas de soro durante uma noite e, então, estimuladas na ausên- cia ou presença de VHHs com 10 ng/mL de VEGF durante 5 min. As células são fixadas com formaldeído a 4% em PBS, e os níveis de fosforilação ERK são medidos por ELISA usando anticorpos específicos para fosfoERK (anti- PhosphoMAP Quinase pERK18&2, M8159, Sigma) e conjugado de imunoglo- — bulina anticcamundongo de coelho policlonal-HRP (PO161, Dako). Conforme mostrado na Tabela 26, os VHHs formatados e Bevacizumab inibem a fosfo- rilação de Erk induzida por VEGF em mais de 90%, com ICsos < 1nM.

Tabela 26: Valores de IC5o (nM) e % de inibição de VHHs forma- tados em ensaio de fosforilação de Erk em HUVEC por VEGF

NS 101/108 VEGFBII021 021 103 | Lveseemza ha a ESTA 7 PR PESTE 7 PR [Bevaczamao Tg TR Exemplo 8 Otimização de sequência

8.1 Otimização de sequência de VEGFBII23B04 A sequência de aminoácidos de VEGFBII23B04 é alinhada à se- | —quência de linhagem germinativa humana VH3-23/JH5, veja a Figura 16 ' (SEQ ID NO: 179). O alinhamento mostra que VEGFBII23B04 contém 19 mutações de armação com relação à sequência de linhagem germinativa de referência. : Resíduos não humanos nas posições 14, 16, 23, 24, 41, 71, 82, 83 e 108 são selecionados para substituição por suas contrapartes de linhagem ger- - minativa humana. Gera-se um conjunto de 8 variantes de VEGFBII23B04 portando diferentes combinações de resíduos humanos nessas posições (as sequências de AA estão relacionadas na Tabela 27). Constrói-se uma vari- ante adicional, em que o sítio de isomerização em potencial na posição —D59S60 (região CDR2, veja Figura 16, indicado como resíduos em itálico e negrito) é removido por introdução de uma mutação S60A.

102/108 | í õ pp ——».——-»-€1iÀà»caocpqouososspspsbsbbEEEEEEAEEAAAANA AAA

Ó E Se $ s> — 3 ê , i 8 S> Ss x Eu — 8º E O s ; 11 1. 7 1 - g& : : 5. E 2 . Ss 3 & xt " : É o EE 5 : 1; : ã oo o | O Õ o : | $ | : e | o 2 : É | É & sb o i õ + 3 : | - Xh + o É Sh Eos - E 7 o& FÊ, & Ta = S E 62 — E. 8 EZ2., Ã. T Ss ES2 ss is S . : : : : 28 ERA Õ É e | : 33 58 í 2 LzTu ; Ir o 29 S : ; 3 228 E . > é | o Z : : z ã : | NS & f É é : f 3 À : - .S . : ! ã = 2X . E z : ; L 3 = oo — ES o on BS É o 8 & &o 3875 8 2 Sed, to 8 o“ OS SEE + so ns úos à 55, ss SB 3 8 é ds. > É o SE 3. : oe dos Ho” S se 388, 23 : S 4? 2228 É r | : : 28 >> Í 3º as | : 8 e >= E .. & T | : E uz À 8 >Tr= PE a 5 SE a o gê SE q 32) Es so ro

AA A o 103/108 E: 3 E: 3 õ E Fr Fr nr R | da | 3 3 os o 8 os o GG os > 2> s> > 2> o o o fo P o > O a> O > O S> O > >= MUWw >= Mw >= CU >= Mw >= Mw <<) > sRE << ) > <C o) > SEE CXrí XE É EE É EE EE o oa 6 oa 6 oa ooo ooo 95 3? 2o 92 32 = >= O => = O = O >> R% e% >> >> ES >= E > E z2< ZzZ> Z2< 2> zSs S5 | $2 | <6 | SE | 2 zu zo Zu zo zo oo O |U oo ou Ou xXx vao É rr xao xo 23 E 97 eos es | E É E? EÊiÇ E Lo C€2o C Z rx o< Xv ZE —Z 52 | 32 | 3e | 32º | de 8 o 98 9 ez ão X<ão Fla) ÃO OO D=wm D=m Q>=m BT 2D>=m << VA << <xV << = << V O « — — e) ã ú ui uu x x x x x - o oO oO O oO Q a a o o õ 3 3 õ ã E 2 E 3 É ÉZ É Z EL EL ss E Ex Zu“ su u Zu Zu = = = = = 2 2 2 2 2 no oo oo no nO o 2X Ox o 2X OX o 2X“ À OO O 80 O RO O 8O O 80 OQ Ro o OQ NA Q7 nQ0O Dogs Sã seg Dez ww OoO> ru a U ru r< > EK iu 200 200 2700 200 d2OO 380 F38o F38É9 3809 3% LOoOrr WLorr vorr Dorr vorr 8 | s8| s&| s$| ;s£ mm nm m ms

ES ES ES ES ES O O O x O O mw us? uz uz uz me? >r >= >= >—- >=

Essas variantes são caracterizadas como proteínas purificadas no AlphaScreen de VEGF165/VEGFR2 (Exemplo 5.3, Figura 17). A temperatura de fusão (Tm) de cada clone é determinada em um ensaio de deslocamento térmico, que se baseiam no aumento do sinal de fluorescência por incorpora- ção de Sypro Orange (Invitrogen) (Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), pp. 289-298). Todas as variantes apresentaram IC; comparável quando comparadas a VEGFBII23B04 e valores de Tm que são similares ou mais ele- vados, quando comparados ao VEGFBII23B04 de origem. A Tabela 28 resu- meos valores de !lCs,e os valores de Tn a pH 7 para os 9 clones testados. Tabela 28: Valores de ICso (pM),% de inibição e temperatura de fusão (a pH 7) de variantes de sequência otimizada de VEGFBII23B04 % de inibição : Ivecreminos — fas o dg [ESTES PP º MEN o veces rs o ds |vecremissos ao o ds | EN |vecremaçoo as o dn | |vecremiaDo fe o [vecramiaoos aro da ESSES Pr PR Em um segundo ciclo, mutações toleradas do esforço de huma- nização (VEGFBII111G06) e mutações para evitar modificação pós-tradução em potencial em sítios selecionados (a D16G, a substituição S60A e uma mutação E1D) são combinadas, resultando em um clone de sequência tomi- zada derivado de VEGFBII23B04: VEGFBIIO037. Antecipa-se uma variante de sequência otimizada extra (VEGFBII038) que contém as mesmas substi- tuições que VEGFBII0037, com exceção da mutação I82M, pois essa muta- ção pode estar associada a uma pequena queda de potência. As sequências de ambos os clones de sequência otimizada estão relacionadas na Tabela

29. VEGFBII0O037 e VEGFBII0038 são caracterizados no AlphaScreen de

R———— A — 105/108 bloqueio VEGF165/VEGFR2 (Exemplo 5.3, Figura 18), a temperatura de fu- são é determinada no ensaio de deslocamento térmico conforme acima des- crito, e a afinidade de ligação a VEGF 165 é determinada em Biacore (Exem- plo 5.5). Uma revisão das características dos 2 VHHs de sequência otimiza- daé apresentada na Tabela 30. Tabela 29: Sequências de AA das variantes de sequência otimi- zada de VHH VEGFBII23B04 VHH ID/ DVQLV | SYSMG |WFRQ |AISKGG | RFTISRD | SRAYGS | WGEQGT ESGG APGKE | YKYDAV | NAKNTVY | SRLRLA | LVIVSS VEGFBII037 | GLVQP REFVV | SLEG LQOMNSL | DTYEY

GGSL RPEDTAV E 56 RLSCA YYCAS

ASGRT - FS DVQLV | SYSMG | WFRQ | AISKGG | RFTISRD | SRAYGS | WGQAGT ESGG APGKE | YKYDAV | NAKNTVY | SRLRLA | LVTIVSS VEGFBII038 | GLVQP REFVV | sLEG LOQINSLR | DIYEY

GGSL PEDTAVY : ST RLSCA YCAS

ASGRT - FS Tabela 30: Valores de ICso (PM), % de inibição, temperatura de fusão(apH7)e afinidade (DM) dos clones de sequência otimizada VEGFBI- 1037 e VEGFBI/038 1D do VH TnCO)apH7 GFBI3BOA se bo 6 bo | GFBNOS? Bo bo eo bh GFBIOSS Bo ho ho 6 |

8.2 Otimização de sequência de VEGFBIISBOS A sequência de aminoácidos de VEGFBIISBOS é alinhada à se- quência de linhagem germinativa humana VH3-23/JH5, veja a Figura 19 (SEQ ID:NO: 179). O alinhamento mostra que VEGFBIISBOS contém 15 mutações de armação com relação à sequência de linhagem germinativa de referência. Os resíduos não humanos nas posições 23, 60, 83, 105, 108 são seleciona-

—————————A€—— OO A o a a AA AAA A 106/108 dos para substituição por suas contrapartes de linhagem germinativa humana, ao passo que a histidina na posição 44 é selecionada para substituição por glutamina. Constrói-se uma variante de humanização portadoras das 6 muta- ções descritas (a sequência de AA está relacionada na Tabela 31).

Tabela 31: Sequências de AA das variantes de sequência otimi- zada de VHH VEGFBIISBOS (FR, armação; CDR, região determinante de complementariedade) mto Je Jane fase Jes Je cemmva | | wvros [RSS | Nsama |. wa fãs AATAREAa PGGSLRL | SMA | PGKOR DS LQMNSL Não GTLV SCAASG|I ELVA |çq RAEDTAV TVSS

RFM YYCNT - Vs FBIN20E10! | pecsLRL | SMA | PGKHR ds LQMNSLK não GTQV SCVASGI ELVA | AEDTAVY TVSS

RFI YCNT Constrói-se uma variante adicional, em que o sítio de oxidação - 10 em potencial na posição M30 (região CDR1, veja a Figura 19, indicada como resíduo em itálico e negrito) é removido por introdução de uma mutação M30I. ' Ambas as variantes são testadas quanto a sua capacidade de se ligar a NVEGF165 usando o ProteOn. Em resumo, um chip sensor GLC ProteOn é revestido com VEGF165 humano. Extratos periplasmáticos das variantes são diluídos a 1/10 e injetados através do chip revestido com VEGF165 humano. As taxas de dissociação são calculadas e comparadas com as taxas de dis- sociação do VEGFBIISBOS de origem. As taxas de dissociação das 2 varian- tes estão na mesma faixa que as taxas de dissociação do VEGFBIISBOS de origem, indicando que todas as mutações são toleradas (Tabela 32). Tabela 32: Taxas de dissociação das variantes de sequência o- timizada de VEGFBIISBOS

.2.2D“<*SS<———€——2 = OOOAOOSS.CC-—< AO O AO A A ar 107/108 Em um segundo ciclo, mutações do esforço de humanização e a substituição M30!l são combinadas, resultando em um clone de sequência otimizada de VEGFBIISBOS, designado por VEGFBII032. A sequência está relacionada na Tabela 33. A afinidade de VEGFBII032 é determinada por Biacore (veja o Exemplo 5.5), e a temperatura de fusão é determinada no ensaio de deslocamento térmico conforme acima descrito. Uma revisão das características do VHH de sequência otimizada VEGFBII032 é apresentada na Tabela 34. Tabela 33: Sequência de AA do clone de sequência otimizada VEGFBIIO32 (FR, armação; CDR, região determinante de complementarie- dade) Ns (ideno [PM fone ma one fres = Jonra [eme | by wvRoa | RSSG | RFTISRONSK VEGFBIO32/ | os, PeKar |STTA | NTVYLOMNS | FSSR | WGOGTL 127 RESCAA ELVA os Age TA PNP |VIVSS

SGIRFI Tabela 34: Temperatura de fusão (a pH 7) e afinidade (nM) do " clone de sequência otimizada VEGFBI1032 Ivecrenssos A potência dos clones de sequência otimizada VEGFBII037 e VEGFBII038 é avaliada em um ensaio de proliferação. Em resumo, células HUVEC primárias (Technoclone) são privadas de suplementos durante uma noite e, então, 4.000 células/poço são semeadas em quadruplicata em pla- cas de cultura de tecido de 96 poços. As células são estimuladas na ausên- ciaou presença de VHHs com 33 ng/mL de VEGF. As taxas de proliferação são medidas por incorporação de [?H] Timidina no dia 4. Os resultados mos- trados na Tabela 35, demonstram que a atividade (potência e grau de inibi- ção) do VHH de origem VEGFBII23B04 é conservada no clone de sequência otimizada VEGFBII038. Tabela 35: Valores de IC59 (nM) e % de inibição dos clones de sequência otimizada VEGFBII037 e VEGFBII038 em ensaio de proliferação de HUVEC por VEGF

[1D do VHH 1Cso (NM % de inibição | veceiaasaa bas BR essas he RR vecraras Beacamao ba Ro

Claims (6)

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação a VEGF compreendendo pelo menos um domínio variável com quatro regiões de armação e três regiões determinan- tes de complementariedade CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, em que aditaCDR3 tem a sequência de aminoácidos Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr conforme mostrada na SEQ ID NO: 1, em que: Xaa na posição 5 é Gly ou Ala; Xaa na posição 7 é Ser ou Gly; Xaa na posição 12 é Gly, Ala ou Pro; Xaa na posição 13 é Asp ou Gly; Xaa na posição 16 é Asp ou Glu; e i em que a dita molécula de ligação a VEGF é capaz de bloquear a interação de VEGF165 recombinante humano com o VEGF-2 recombinan- te humano com uma taxa de inibição de 260%.

2. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita CDR3 tem uma sequência selecionada de: SEQ ID NO: 2 SRAYGSSRLRLGDTYDY, . SEQ ID NO: 3 SRAYGSSRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 4 SRAYGSSRLRLADTYEY; SEQ ID NO: 5 SRAYGSGRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 6 SRAYASSRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 7 SRAYGSSRLRLPDTYDY; SEQ ID NO: 8 SRAYGSSRLRLPGTYDY.

3. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 2, que compreende um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobuli- na, cada um contendo: a) uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada de um primeiro grupo de sequências mostradas em SEQ ID NOs: 2 a 8; b) uma CDR1 e uma CDR2 com sequências de aminoácidos que estejam contidas, conforme indicado na Tabela 3, em uma sequência sele- cionada de um segundo grupo de sequências mostradas em SEQ ID NOs: 9

E — 2/4 a 46, em que a dita segunda sequência contém a respectiva CDR3 na dita sequência selecionada de acordo com a).

4. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 3, em que os ditos um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina são VHHs.

5. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 4, em que os ditos um ou mais VHHs têm sequências de aminoácidos sele- cionadas das sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 9 -

46.

6. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 5, que compreende um ou mais VHHs com sequências de aminoácidos se- lecionadas de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 25. É

7. Molécula de ligação a VEGF que foi obtida por maturação por afinidade e/ou otimização de sequência de um VHH definido de acordo com areivindicação6.

8. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 7, que foi obtida por otimização de sequência de um VHH com uma sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18. BR 9. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 8,comuma sequência de aminoácidos selecionada das sequências mostra- das em SEQ ID NOs: 47 — 57.

10. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 4, compreendendo dois ou mais VHHs, que são: a) VHHs idênticos que sejam capazes de bloquear a interação entre VEGF humano recombinante e o VEGF-2 humano recombinante com uma taxa de inibição de 2 60%, ou b) VHHs diferentes que se ligam a epítopos não superpostos de VEGF, em que pelo menos um VHH é capaz de bloquear a interação entre VEGF humano recombinante e o VEGF-2 humano recombinante com uma taxade inibição de > 60%, e em que pelo menos um VHH é capaz de blo- quear a dita interação com uma taxa de inibição de < 60%.

11. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação

10, em que os ditos VHHs idênticos a) são selecionados de VHHs com as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 9 — 46 ou VHHs que tenham sido obtidos por maturação por afinidade e/ou otimização de sequência desse VHH.

12. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 11, em que o dito VHH é selecionado de VHHs com os aminoácidos mostra- dos na SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NOs: 47 — 57.

13. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 12, compreendendo dois VHHs cada um com a sequência de aminoácidos —mostradana SEQ ID NO: 57.

14. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 13, em que: . a) os ditos um ou mais VHHs com uma taxa de inibição de > 60% são selecionados de: i. VHHs com uma sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 9 — 46 ou ii. VHHs que tenham sido obtidos por maturação por afinidade e/ou otimização de sequência of such VHHs, e em que: : b) os ditos um ou mais VHHs com uma taxa de inibição de < 60% são selecionados de: i. SEQ ID NOs: 58 — 124 ou ii. VHHs que tenham sido obtidos por maturação por afinidade e/ou otimização de sequência desse VHH.

15. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 14, em que dois VHHs estão contidos em polipeptídios com as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 128 — 168, separados por se- quências de ligante conforme indicado na Tabela 13.

16. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 15, em que o dito VHH a) i. tem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQIDNO:18,eodito VHH b)i. tem uma sequência de aminoácidos mos- trada na SEQ ID NO: 64.

17. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação

SS O OSS 4/4 16, em que os ditos VHHs de acordo com a) ii) são selecionados de VHHs com uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NOs: 47 — 57, e em que os ditos VHHs de acordo com b) ii) são selecionados de VHHs com uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NOs: 125 — 127.

18. Molécula de ligação a VEGF, de acordo com a reivindicação 17, compreendendo dois VHHs, um dos quais com os aminoácidos mostra- dos na SEQ ID NO: 57, e um dos quais com os aminoácidos mostrados na SEQ ID NO: 127.

19. Molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de |i- gaçãoaVEGF como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 18 ou um vetor que a contenha.

20. Célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico : como definida na reivindicação 19.

21. Composição farmacêutica contendo pelo menos uma molé- culadeligaçãoaVEGF como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 18 como o ingrediente ativo.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação ' 21, para o tratamento de uma doença que esteja associada a efeitos media- : dos por VEGF sobre a angiogênese.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, para o tratamento de câncer e doenças cancerosas.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, para o tratamento de doenças oculares.

o. O 5—“ sas o RR A O A a 1/33 Fig. 1 Tv TO nNoOo«X O ST oO aoao o o = cMmmnm 86000

SS MOU HC >>> o o + om o pen Ss o bx er o " hu oo : o? eZ= o =D * . oC 2 = «o o Ss o bu o ll. [- o ES 2 o 2º bas bas o o Wu 05Sp OQ

Fig. 2

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Fig. 4 o uu e 22 Eve > sr o Emos 320ÍITO

JE ANN 7 o+ eum: oO pn o o ba o o + - o bas sw " o o — | rmH S = + o o =. m = | - o É | e o + 25 | las) ce o ' o — o J— bo. o - bles Fo o o o o o o o o o o o o o vo o vo bas ba sdo “jeuis

5/33 | | Fig. 5-1 Ligação a MVEGF 164 :

2.5 * VEGFBII23B4

2.0 = VEGBII24C4 + VEGFBII23A6 + mAb B204.1 ' e 1.5 cs 210 Í pat

0.5 ,

0.0 1 Pa df O 10-11 10-1º 10º 108 107 106 105 [Ligante], M

Fig. 5-2 Ligação a hvEGF121

2.5 * VEGFBII23B4 " = VEGBII24C4 º * + VEGFBII23A6 + VEGFR2 LL) e 15 cs x AP

Q ES a. * Fo agia

0.5 ; oo E op 0 10-11 10-1º 10-º 10º 107 106 105 [Ligante], M

.-- dessa eee er O A ——— 71/33 Fig. 6

SN

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SSSS dal : E ao : e o o + = ha . : O | Ú : : : | o e. : | o já : Ss | :

S = | = | +“. Y Tm S A | o “ : | | x Ê : | Hu 057 OJ

Fig. 7-1 Ligação a VEGFB |

1.5 * VEGFBII23B4 + = VEGBI/I24C4 Fo »* VEGFBII23A6

1.0 i . + VEGF-R1 J E Í + E aa o j Y ; o Í o j

0.5 "

0.0 : FOOD OT DITA] 0 10-11 101º 10-º 108 107 10% 105 [Ligante], M a 9/33 Fig. 7-2 Ligação a VEGFC |

1.5 * VEGFBII23B4 À = VEGBII24C4 1 É 4 VEGFBII23A6

1.0 O + VEGF-R2 i E * f= é Ss ; 2 Í o Í o : *

0.5 Í

É =———Õ Âs

0.0 PDA DI 0 10-11 101º 10º 108 107 1086 10º [Ligante], M

Cr 10/33 Fig. 7-3 Ligação a VEGFC -

1.5 * VEGFBII23B4 = VEGBII24C4 ' + + VEGFBII23A6

1.0 Í + VEGF-R3

E Í 7 c Í Ss i Ss i

T Í o j OQ :

0.5 í * + +

0.0 - pt = 0 10-11 10-10 10-º 108 107 106 105 [Ligante], M

Fig. 7-4 | Ligação a PIGF -

1.5 + * VEGFBII23B4 e a Ps = VEGBII24C4 + No + VEGFBII23A6

1.0 Í + + VEGF-R1 E i - E Í o H 8 í o Í Õ i

0.5 Í +

0.0 É Pt O 10-11 10-1º 10º 108 107 106 105 [Ligante], M

Fig. 8-1 : 1.5 ' * VEGFBII010 + Avastin : 1.0 * Irrelevante 2E6 do ERA o

C o a

0.5 o

0.0 POD oO OA 010-1210-1110-1º 10-º 108 107 10-86 105 [Competidor], M

Fig. 8-2

1.5 o Lucentis + Avastin * Irrelevante 2E6 : o “ + VEGFBII021

1.01 E A ooo . 2º VEGFBII022 - E NR. = VEGFBII023 3 : * VEGFBIIO024 S = VEGFBII025 õ À

0.5 À WW à

0.0 . 0 10-1210-1110-1º 10-º 10-º 107 106 105 [Inibidor], M

| 14/33 Fig. 9-1

1.5 * VEGFBII010 o Lucentis : 1.0 + Avastin E - 6 a * Irrelevante 2E6 i 8

Y o o o

0.5 o o LD) o

0.0 foco Emp— 01011 101º 10º 10º 107 1086 105 [Competidor], M

Fig. 9-2

1.5 : o Lucentis + Avastin e = Í a to * Irrelevante 2E6 10) EAR, 7 " + VEGFBII021 | E e » VEGFBII022 S VW = VEGFBII023 | 3 * VEGFBIIO24 2 = VEGFBII025

0.5 db

AN

0.0 e + 0 10-1210-1110-1º10-º 10-85 107 106 105 [Inibidor], M

Fig. 10 O coraovvo

TT UQNQNQANQAO 2 go22eeo É iImmMDOO | un Ss Sonuuuu | O 8ESMOOOO WwW 5 Sw >IAED>>>> e o eoxN<umr em ” " Ss - x rr u o : + : A À re

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Fig. 11 o T+ OQNTIO = ce INI 2 HOODOSO m.2ºc2mmmanDAM|a LES SNUuLLL O FFOOSOS0O wW S o wow >3EÉ>>>>> | o e o xx oe.» us <<. oO | rr - oi Do o DC n - o co : e AS En, É sl x . a) Í õ [ae o — º AA / = ã Da 23 ' ” : Das « o x A AAA Tr Ê ra o MÓ oo fp ç a S Lã Ss p/ Ash 1 5 o - lee 2 z —o— 2 Inlela! | Fo o o o o o o o o o o o o o o o o o co o T ce 2 sdo “Jeuis

Fig. 12 an + — Oo à ss Los, 2 =MÕOm OS En WUZ$OO > Sww EE SÍI>> + Dx Od<) o pH - o Da o pel E x oe o : — et 2 : 2 3 2 = e E

E

O soe o bas z o - 2 Fo o o o o o oO =) o o o o o o o o o oO o o o o eo bas ba sdo “jeuis

Fig. 13-1 | Ligação a VEGF 164

* VEGFBII010 + VEGFBII021 4 : * VEGFBII022 ] = VEGFBII023 v* VEGFBII024 : E 3 v x VEGFBIIO25 8 x Oo v o 1 o 010-1210-1110-1º 10º 10º 107 106 105 [Inibidor], M

| | 20/33 | Fig. 13-2 | Ligação à hVEGF165 -

2.5 * VEGFBII010 + VEGFBII021

2.0 4 VEGFBII022 . = VEGFBI/023 * VEGFBII024 : E 1.5 =» VEGFBII025 Ss <ç Oo 410

0.5 x

0.0 010-1240-1110-10 10-º 10-8 107 10-86 105 [Inibidor], M

CC 21/33 Fig. 14-1 Ligação a VEGF 165 4 Pa | 3 r e VEGFBII010 Í = VEGFR1 = E Íí E ú o i 32 Í

O Í 8 j 1 .

Á o amiaià FRA o AAA 0 10-12 10-11 10º 10º 10% 107 10% 105 [Inibidor], M

Fig. 14-2 Ligação a VEGFC 3 : e VEGFBII010 | 2 -»- VEGFR2 ' E c 8 r 8 ; õ F 8 ; 1 Í

Á

PÁ , E 0 10-12 1011 10º 10º 108 107 108 105 [Inibidor], M

Fig. 14-3 VEGF-D

2.0

1.5 —- VEGFBII010 | * VEGFR3

E c

1.0 , | i

0.5 j 2

0.0 PIOOOO AAA 0 102 1071 107º 10º 10% 107 108 105 [Inibidor], M

Fig. 14-4 Ligação a PIGF 4

AR 3 * e VEGFBII010 . i + VEGFR1 E í - cs í Ss j 3 2 í 2 i o Í * 1 Í odt= 0102 1071 107º 10º 10% 107 106 10% [Inibidor], M

Fig. 14-5 Ligação a VEGFB 4 3 + VEGFBII021 A * VEGFBII022 ' * = VEGFBII023 E / * VEGFBII024 ' 82 Há * VEGFBII0O25 õ Í + VEGFR1 = ;

É 1 j

É o Pg ppp O 101310 1210-1110-1º 10º 10º 107 10 105 [Inibidor], M

Fig. 14-6 Ligação a VEGFC 3 + + VEGFBII021 i » VEGFBII022 ? i = VEGFBII023 E i * VEGFBII024 8 i x VEGFBII025 8 i + VEGFR2 + 1 i —. —— A Lts postato qa 0 10310 210-111010 10º 108 107 10 105 [Inibidor], M

Fig. 14-7 Ligação a VEGFB + VEGFBII021 » VEGFBII022 Ú = VEGFBII023 E * VEGFBII024 ' 3, x VEGFBIIO25 o + VEGFR3 a

A 0 10 310-210-/110-º 10º 108 107 108 10º [Inibidor], M

Fig. 14-8 Ligação a VEGFB

A 3 É + VEGFBII021 í 2º VEGFBII022 N " / = VEGFBII023 E + * VEGFBII024 . 3, j x» VEGFBIIO25 8 i + VEGFR1 1 Í

Á o a np . + 0 10310210/1110-º 10º 108 107 10 105 [Inibidor], M

Fig. 15 OoONTFIO

TAQNAQ c2oD2o mmnMm uu UuLuL

OOOO wW UwW UW LU >>>> - o e.-<.»>». o =

E o rr Do ç « o | - BR x º o úS o rr q = o E mà 6 Z r 23 S o E f) el? & o => E - - o - ss o tº

É a rr - o o UU 0Sp OA

Fig. 16 Un. UU. o É : or: eTR: 3 :3o “E 8: 8 8º ineo cE, :$” : Rial di A .U. o—-uUu. s |! En o—-u. mr. H Db! MCÊB: cmo Sia “mm [e o: | [ao CER 24908 álB CRS s3i 228: god "Ci NT: : O Cê . o. : EK “1a un. .un . V :Ólal o” o .” o. O .- ' * AIJE| UM E oO. qo: — . Ss o. “o. o. . o ns). .HyH. oa - q. mH—O. oq. .H - (oo 19:20 :8: 6: Ss : 28 :B: (dx o SE! .—)> . om Se: :QS: :6: “ áIal mm . - Alo! . . bx) x x o o o 88 88 BR

ES EN ES x—H x-—H -H *H=H OH = OH *+ 1H TIE + na—mo 498 328 fog dos g5BB <5E Es

Fig. 17 80000: oe 23B4 x Controleneg. z a VEGFBII111DOS v VEGFBIN111GOS 600004 E E, E e VEGFBIII2DI É HO « be = VEGFBII113A08 : Pã o VEGFBINNI3EO3 & À nm VEGFBIN14CO9 — 40000 x à VEGFBINN14DO02 - FF e VEGFBIIN114DO3 o € VEGFBIINMBSE1IO 20000: |

YW o -— | O 101410210/210111040 10º 108 107 105 [Competidor], (M)

Fig. 18 60000 : " º VEGFBII23B4 i = VEGFBII0037 40000 e VEGFBIID038 7 o õ

É

DÓ 20000 t 0 FPoO——O————O————O—O+———AAOA— A O 10510410-12401240 1140: 10º 108 107 105 105 [Competidor], (M)

Fig. 19 od”:

Sá: cas

E” E E IE e al, Aco oocBe: Es :8: 3-8: a OoO-=—un. mn” .- . on mr -Hº. . H/1OIl mCcEeZ Ss o 6 . E de 15 920 on: ga 1 ã STR: cas É . :8: :6e 4 a: dr ou: - “DD. un.

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