CN110248674B - 针对vegf的合成抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供针对VEGF的新的合成抗体及其用途。
Description
技术领域
在整个本申请中，在括号内提及各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用以它们的整体并入本文。
背景技术
年龄相关的黄斑变性(AMD)是60岁及以上的人群中视力损失和失明的主要原因。AMD被诊断为干性(非新生血管性)或湿性(新生血管性)AMD。约 85～90％的AMD患者被诊断为干性AMD。这是疾病的早期阶段，可以由黄斑组织的老化和变薄引起，导致以黄斑中称为脉络膜疣的黄斑为特征的色素沉积。干性黄斑变性可能会出现逐渐的中央视力损失，但通常不会像湿性AMD 那样严重。
在相当大比例的病例中，干性AMD发展为更晚期的和破坏性的疾病形式，湿性AMD，导致严重的视力损失。湿性AMD的特征在于脉络膜新生血管形成的过程，其涉及在视网膜下方形成新血管(血管生成)，导致血液和液体的泄漏。这种泄漏对光敏视网膜细胞造成永久性损伤，导致视力损失。血管内皮生长因子(VEGF)似乎在脉络膜新生血管形成的发病机理中起关键作用。
湿性AMD的治疗方法包括激光光凝术、
(Valeant PharmaceuticalsInternational)的光动力激光治疗和抗VEGF药物。抗VEGF药物的发现彻底改变了病症的治疗。当前，被批准或常用的四种抗VEGF药剂包括哌加他尼(pegaptanib)(
Valeant Pharmaceuticals International)、雷珠单抗(
Novartis andRoche)，阿柏西普(aflibercept)或VEGF Trap-Eye(
Bayer and RegeneronPharmaceuticals)和贝伐珠单抗 (
Roche)。
抗VEGF治疗可以用于治疗湿性AMD。然而，当前的治疗涉及每个月向患眼给予抗VEGF药物的频繁注射持续三个月，然后监视治疗以给予进一步的注射。注射的频繁施用导致患者眼睛的并发症，例如黄斑水肿和应激。如果黄斑水肿延续，最终可形成视网膜变薄、瘢痕或视网膜裂孔。因而急需用于治疗与异常的血管新生相关的疾病如湿性AMD的改进的药物和方法。
发明内容
本发明包括新的抗VEGF抗体；以及包含编码这类新的抗VEGF抗体的序列的多核苷酸，以及包含它们的组合物，包括药物组合物，及其用途。
本发明还提供了在抑制或治疗疾病例如湿性年龄相关黄斑变性(AMD)、糖尿病性斑丘疹病、增殖型糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞(RVO)黄斑水肿、虹膜新生血管形成、病理性近视引起的脉络膜新生血管形成、成熟视网膜病(retinopathy of maturity)、新生血管性青光眼和癌症的方法中使用所述新的抗VEGF抗体、包含编码这类新的抗VEGF抗体的序列的多核苷酸、以及组合物，包括药物组合物。
附图说明
图1.基于牛血清白蛋白(BSA)作为参考标准物，使用Bradford蛋白测定法在595nm下的吸光度测定Fab蛋白浓度的标准曲线，显示50μg/mL到 500μg/mL BSA的线性。
图2.使用固定化人VEGF(hVEGF)121同种型以及辣根过氧化物酶 (HRP)-缀合的抗κ轻链抗体来检测与固定化hVEGF结合的可溶抗VEGF Fab，并产生具有450nM处的吸光度的比色产物，以ELISA形式用于定量具有抗 VEGF活性的Fab相对于已知浓度的抗VEGF Fab(
Novartis and Roche)的量的标准曲线。
图3.确定雷珠单抗和Fab克隆#201(Fab 201)对于hVEGF-121的半最大抑制浓度(IC50)的竞争性结合测定。Fab在两个独立的实验中与x轴上报告的各种浓度的hVEGF-121孵育。各Fab的未结合的部分用hVEGF-121包被的平板捕获，用抗K轻链-HRP缀合抗体进行定量，如y轴所示。100pM的各Fab用 hVEGF-121的连续稀释物孵育。用固定化hVEGF-121捕获未结合的Fab，使用抗K轻链HRP-缀合抗体进行检测。使用Prism软件用5参数不对称模型拟合数据，使用由该数据计算的IC50估计的Kd在表3中示出。
图4A-B .用重组hVEGF 121同种型筛选初始合成的抗体片段(Fab)噬菌体展示文库获得的Fab的CDR序列(A)，以Fab-ELISA形式、利用固定化hVEGF 和来自该初始噬菌体展示文库的选定的可溶Fab的连续稀释物的结合亲和力分析(B)。根据Kabat相应于CDR的氨基酸序列是加下划线的(A)，Fab-ELISA 的滴定如下进行：浓度递增的Fab在包被有2μg/mLhVEGF-121的孔中进行孵育。使用抗K轻链HRP-缀合抗体检测结合的Fab(B)。由50％最大效应浓度 (EC50)估计解离常数(Kd)，在折线图下方的表格中报告。
图5.柱形图，其显示在竞争性Fab-ELISA形式下，VEGF的天然受体FLT 作为竞争物，在存在(+)或缺乏(-)FLT的情况下选定的Fab与固定化hVEGF结合的抑制，一致的是，6种Fab与FLT具有在hVEGF上重叠的结合位点。微量滴定板的孔用2μg/mL的hVEGF包被。洗涤的孔与PBT中的500nM FLT(R&D systems，目录编号321-FL-250)(+)或单独的PBT(-)预孵育1小时。然后将亚饱和数量的Fab添加到FLT-或FLT+孔中，孵育平板15分钟并洗涤。添加到孔中的Fab的身份在y轴上表示。然后使用抗K轻链HRP抗体检测结合的Fab。扣除背景的OD450nm测量值在y轴上报告。
图6A-C .(A)基于FF0124-1 Fab序列的文库选择中得到的Fab的CDR序列。 10nM的hVEGF与Fab-噬菌体预孵育时，通过在竞争性-噬菌体-ELISA中观察到的残余结合对Fab进行排序。(B和C)具有嵌图(panel)A中列出的序列的不同克隆的竞争性噬菌体-ELISA结果。在与1nM(B)或10nM(C)hVEGF预孵育之后 Fab-噬菌体与固定化hVEGF的残余结合按照没有hVEGF预孵育时结合的百分比来显示。(*)在这一组克隆中CDR-H3(由Kabat定义)也具有“HAWYYGWAFDY”序列。(**)在这一组克隆中CDR-H3(由Kabat定义)也具有“HAWYYGWALDY”和“HAWYYGWAFDY”序列。显示了亲本Fab FF0124-1 的序列和竞争性噬菌体ELISA用于对比。根据Kabat相应于CDR的氨基酸序列是加下划线的。与亲本Fab(FF0124-1)不同的氨基酸序列以粗体突出显示。
图7A-B .(A)基于FF0158-C4 Fab序列的文库选择中得到的Fab的CDR序列，摇瓶中的产量，以及通过单点竞争性ELISA和/或竞争性ELISA的亲和力测量 (Kd数据和拟合在B中显示)。根据Kabat相应于CDR的氨基酸序列是加下划线的。与亲本Fab(FF0158-C4)不同的氨基酸序列以粗体突出显示。
图8.基于FF0188-H5Fab序列的文库选择中得到的Fab的CDR序列，摇瓶中的产量，通过单点竞争性ELISA和/或竞争性ELISA的亲和力测量和熔解温度(Tm)。根据Kabat相应于CDR的氨基酸序列是加下划线的。与亲本 Fab(FF0188-H5)不同的氨基酸序列以粗体突出显示。
图9A-C .显示了Fab CDR序列、产品产率和hVEGF结合动力学参数。 (A)CDR序列、摇瓶中的产量、通过SPR测量的hVEGF-121结合解离率的表格以及在B中显示的熔解温度(Tm)数据。根据Kabat相应于CDR的氨基酸序列是加下划线的。与亲本Fab(FF0117-A5)不同的氨基酸序列以粗体突出显示。(B) 热转变分析。(C)Fab FF03046-2的全长序列的实例。
图10.抗VEGF Fabs FF03046-1、FF03046-2和雷珠单抗(
Novartisand Roche)对hVEGF依赖性人血管内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制，其中使用重组的人VEGF165同种型来刺激HUVEC细胞的增殖。将2×105个细胞/ml的对数期Huvec细胞添加到与260pM的rhVEGF-165预孵育的Fab的连续稀释物中。然后将细胞在37℃下孵育3天。通过刃天青染色评估活细胞的数量。
图11.竞争性Fab-ELISA。如附图的图例中描述的，5pM的hVEGF-165 与抗VEGF抗体的连续稀释物孵育。如
ELISA人VEGF免疫分析 (R&D目录编号：SVE00)提供的，在结合溶液中预形成的hVEGF-165/抗VEGF 抗体复合物以及任何未结合的hVEGF-165转移到包被有特异于人VEGF的单克隆抗体的96孔聚苯乙烯微量培养板中。如
分析试剂盒中提供的，使用与辣根过氧化酶缀合的多克隆抗hVEGF抗体和四甲基联苯胺作为色原检测与平板结合的hVEGF-165，来定量与平板结合的hVEGF-165。使用Prism 软件用5参数不对称模型拟合数据，由该数据计算的Kd在附图底部的表格中显示。
图12.FF03092-1的DNA和蛋白质序列，抗VEGF Fc-Fab融合物。
图13.FF03077-4的DNA和蛋白质序列，抗VEGF Fc-scFv融合物。单链核酸序列：scFv融合物序列是加下划线的；Fc序列为斜体；Fc和scFv之间的接头是粗体加下划线的。根据
定义的相应于CDR的DNA编码序列和氨基酸序列以粗体显示；scFv中根据Kabat定义的相应于Fab FF03046-2的 CDR序列的DNA编码序列和氨基酸序列是加双下划线的。
图14.竞争性ELISA。如附图的图例中描述的，5pM的hVEGF-165与抗 VEGF抗体的连续稀释物孵育。如
ELISA人VEGF免疫分析(R&D 目录编号：SVE00)提供的，在结合溶液中预形成的hVEGF-165/抗VEGF抗体复合物以及任何未结合的hVEGF-165转移到包被有特异于人VEGF的单克隆抗体的96孔聚苯乙烯微量培养板中。如
分析试剂盒中提供的，使用与辣根过氧化酶缀合的多克隆抗hVEGF抗体和四甲基联苯胺作为色原检测与平板结合的hVEGF-165，来定量与平板结合的hVEGF-165。使用Prism 软件用5参数不对称模型拟合数据，由该数据计算的Kd在附图底部的表格中显示。
图15.FF03092-3的DNA和蛋白质序列，抗VEGF全长成熟的IgG1。
图16.抗VEGF Fab#216的DNA和蛋白质序列，来自实施例3的可选择实施方案编码序列由双下划线指示。
图17.抗VEGF Fab 201的表达质粒的示意图。
图18.抗VEGF Fab 216的表达质粒的示意图。
图19.确定Lucentis(雷珠单抗，Novartis and Roche)和Fab克隆#216(Fab 216)对于hVEGF-121的半最大抑制浓度(IC50)的竞争性结合测定。Fab在两个独立的实验中与x轴上报告的各种浓度的hVEGF-121(Peprotech，Cat-100-20A) 孵育。各Fab的未结合的部分用hVEGF-121包被的平板捕获，用抗K轻链-HRP 缀合抗体进行定量，如y轴所示。100pM的各Fab#216与hVEGF-121的连续稀释物孵育。用固定化hVEGF-121捕获未结合的Fab，使用抗K轻链HRP-缀合抗体进行检测。使用Prism软件用5参数不对称模型拟合数据，使用由该数据计算的IC50估计的Kd在附图底部的表格中示出。
图20.竞争性-ELISA。10pM的hVEGF-165与抗VEGF抗体Fab 216的连续稀释物孵育。如
ELISA人VEGF免疫分析(R&D目录编号：SVE00)提供的，在结合溶液中预形成的hVEGF-165/抗VEGF抗体复合物以及任何未结合的hVEGF-165转移到包被有特异于人VEGF的单克隆抗体的96孔聚苯乙烯微量培养板中。如
分析试剂盒中提供的，使用与辣根过氧化酶缀合的多克隆抗hVEGF抗体和四甲基联苯胺作为色原检测与平板结合的hVEGF-165，来定量与平板结合的hVEGF-165。使用Prism软件用5参数不对称模型拟合数据，使用由该数据计算的IC50估计Kd，在附图底部的表格中示出。
图21.抗VEGF Fab的发酵数据和表达产量。
图22.药物产品Fab 201在4℃下的稳定性。
图23.Fab 201与
(雷珠单抗)的免疫球蛋白重链可变区的比对。比对的免疫球蛋白重链可变区序列的上方或下方的线分别指示Kabat和
方法定义的Fab201的CDR的位置，在SEQ ID NO：16中给出。
(雷珠单抗)的序列获自GenBank登录号APZ76728.1和APZ76729.1。
图24.Fab 201与
(雷珠单抗)的免疫球蛋白κ轻链可变区的比对。比对的κ轻链可变区序列的上方或下方的线分别指示Kabat和
方法定义的Fab 201的CDR的位置，在SEQ ID NO：16中给出。
(雷珠单抗)的序列获自GenBank登录号APZ76728.1和APZ76729.1。
具体实施方式
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明相关实施方案所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
必须注意的是，如在本文和附随的权利要求中使用的，单数形式“一”(“a”，“an”)和“该”(“the”)包括复数的指代物，除非上下文明显地另外指示。因而，例如，“一抗体”包括多个这样的抗体。并且，如本文使用的，“和/或”是指并且涵盖一种或多种列出项目的任何和所有可能的组合，以及当以可选择(“或”) 来解释时组合的缺省。
如本文使用的，“至少一个”意图指“一个或多个”所列的元素。
如本文使用的，术语“基本上没有”包括没有给定物质或细胞类型，或几乎没有该给定物质或细胞类型，例如，具有小于约1％的给定物质或细胞类型。
如本文使用的，除非具体地或上下文另外指示，术语血管内皮生长因子“VEGF”是指VEGF家族的任何天然的、变体的或合成的VEGF多肽或其片段，所述VEGF家族包含七个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、 VEGF-E、VEGF-G和PLGF，其中所有成员具有由半胱氨酸结基序组成的共同的VEGF同源结构域，所述半胱氨酸结基序在每个单体内保守的中央四链β-折叠的一端具有参与分子间和分子内的二硫键的八个不变的半胱氨酸残基，其以反平行的并排方向二聚化，并参与血管生成(在Hoeben，A.,等人 (2004)Vascular endothelialgrowth factor and angiogenesis.Pharmacol.Rev.56， 549-580中综述；具有分子间和分子内二硫键的半胱氨酸结基序的3D结构参见Hoeben等人(2004)的图1)。VEGF家族内的每个成员由不同的基因编码；然而，由于选择性剪接或蛋白水解作用，每个成员可以包括许多不同的同种型。
在优选的实施方案中，VEGF是在促进或维持血管生成方面起作用的VEGF-A及其同种型。例如，VEGF-A基因，在文献中也称为VEGF而不提及“-A”，其初级转录本的选择性剪接产生编码不同的VEGF-A同种型的不同的VEGF-A mRNA，通常简称为后接数字的VEGF，具有促血管生成或抗血管生成性质的不同同种型取决于VEGF-A基因的选择性剪接的外显子8a或8b的存在。特别令人感兴趣的是由选择性剪接的外显子8a的翻译获得的VEGF-A 同种型，其一般是促血管生成性的，相比之下，具有外显子8b的那些一般是抗血管生成性的。在人类中，来自选择性剪接、含有外显子8a的VEGF-A同种型包括：VEGF-A121(经常也称为VEGF121)、VEGF-A145(经常也称为VEGF145)、 VEGF-A148(经常也称为VEGF148)、VEGF-A165(经常也称为VEGF165)、 VEGF-A183(经常也称为VEGF183)、VEGF-A189(经常也称为VEGF189)和 VEGFA206(经常也称为VEGF206)(Nowak，D.G.,等人(2008)Expression of pro- and anti-angiogenicisoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growthfactors.J.Cell Sci.121，3487-3495)。VEGF-A的每个同种型中VEGF 之后的数字是指分泌后信号序列裂解之后的氨基酸的数目；这一数字可以是下标或是同一行的，例如，分别为VEGF121或VEGF121。在啮齿动物例如小鼠中，这些VEGF同种型的直系同源物少含有一个氨基酸。VEGF通常是同型二聚化的糖蛋白，它们的同种型在它们结合肝素的能力方面有所不同。更大的高碱性VEGF189和VEGF206同种型在细胞外基质(ECM)中与细胞表面含有肝素的蛋白多糖紧密结合；而酸性的VEGF121同种型缺乏结合肝素的能力，是游离弥散的。VEGF165同种型具有中间性质，其大部分结合肝素和ECM。除了通过选择性剪接产生的VEGF同种型之外，ECM结合的VEGF同种型可能经历蛋白水解作用，产生具有高度促有丝分裂活性的生物活性片段，例如， VEGF110或VEGF100，来自人VEGF-A同种型的VEGF165或VEGF189的蛋白水解作用(Ferrara，N.,Gerber，H.-P.,和LeCouter，J.(2003)The biology of VEGF and itsreceptors.Nature Medicine 9，669-676；也参见上文的Floeben，A.,等人(2004))。除了VEGF100之外，衍生自VEGF基因家族的VEGF蛋白质的任何片段，无论是通过天然的蛋白水解还是人造的，可以被认为是VEGF，只要可以针对它产生抗体即可，并且该VEGF蛋白质片段在促进或维持血管生成、黄斑变性、肿瘤或人类疾病方面有作用。
除了从受试者或培养的细胞分离VEGF蛋白之外，VEGF蛋白可以通过重组DNA方法产生。例如，任何VEGF同种型的VEGF蛋白或片段或变体可以在细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞中产生，或可以在无细胞翻译提取物或偶联转录-翻译提取物中体外产生，这是本领域已知的。在细菌细胞中生产的情况下，不同于从哺乳动物细胞分离的VEGF蛋白，细菌中生产得到的重组VEGF蛋白可以具有相同的一级氨基酸序列，但可能缺乏翻译后修饰例如糖基化。尽管如此，除了从天然来源分离的VEGF之外，本公开内容涵盖细菌细胞中生产的、体外生产的，例如使用体外无细胞翻译系统或偶联的转录-翻译系统生产的，或通过重组方法生产的VEGF。VEGF抗原可以是天然发生的、重组的或合成的VEGF分子。VEGF抗原可以存在于完整的VEGF 蛋白、VEGF同种型、VEGF的片段或具有来自VEGF的一部分的序列的肽之上。
如本文使用的，“野生型VEGF序列”一般是指天然发生的VEGF同种型中存在的、或在哺乳动物细胞中初级VEGF基因转录本的加工之后从VEGF mRNA的翻译得到的、或从任何VEGF cDNA的翻译得到的一级氨基酸序列。例如可以通过从来自哺乳动物细胞例如小鼠或人类细胞的多聚核糖体VEGF mRNA的逆转录获得VEGF cDNA。
如本文使用的，“抗体”包括单克隆抗体(例如，全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体(例如，具有相同特异性的超过一个抗原结合位点的抗体，以允许与超过一个抗原缔合，取决于价数以及对例如二价的IgG 抗体与它的单价Fab抗体片段对比而观察到的亲合力提高)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们展现了期望的生物学活性即可)，并还可以包括某些抗体片段(如本文更详细地描述的)。抗体可以是人类的、人源化的、亲和成熟的和/或合成的。抗体可以通过本领域已知的任何方法，例如，在动物中、在组织或细胞培养物中体内地，或通过酶学或化学合成方法在体外蛋白质合成系统等中生产。可以在抗体生产中使用重组DNA方法，所产生的抗体可以认为是重组抗体。重组抗体可以没有动物产物地生产，例如，在细菌中生产。抗体或其片段可以展示在噬菌体的表面上。
“抗体片段”(“antibody fragment”或“antibody fragments”)仅是抗体的一部分，其中该部分保持至少一种、优选地许多或所有的与存在于完整抗体中时该部分通常相关的功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子，包括单链Fv(scFv)抗体分子；由具有相同特异性的多拷贝的相同抗体片段形成的多价抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
合成的人类抗VEGF抗体包括“亲和成熟的”抗体，其包括处在其一个或多个高变区或互补决定区(CDR)中的一个或多个改变，与不具有那些改变的亲本抗体相比，产生抗体对VEGF的亲和力方面的改进。抗体的可变区中存在的CDR可以通过Kabat方法或IMGT方法来定义(Martin，A.C.R.(1996) Accessing the Kabat Antibody Sequence Database byComputer PROTEINS: Structure，Function and Genetics 25:130-133；Johnson，G.和Wu，T.T.(2004) The Kabat Database and a Bioinformatics Example.Methods inMolecular Biology 248:11-25；Kabat，E.A.,Wu，T.T.,Perry，H.,Gottesman，K.,和Foeller， C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication No.91–3242，Bethesda，MD.；MacCallum，R.M.,Martin，A.C.R. 和Thornton，J.T.(1996)Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding sitetopography.J.Mol.Biol.262，732-745；Lefranc，M.-P.,Pommié， C.,Ruiz，M.,Giudicelli，V.,Foulquier，E.,Truong，L.,Thouvenin-Contet，V. 和Lefranc，G.(2003)IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domainsand Ig superfamily V-like domains.Dev.Comp. Immunol.27:55-77；和Lefranc，M.-P.(2005)IMGT，the international ImMunoGeneTics information
Nucleic AcidsRes.33:D593-D597； Lefranc，M.-P.等人(2009)
the internationalImMunoGeneTics information
Nucleic Acids Res.37:D1006-D1012)。抗体的特异性可以由CDR的集合来定义或描述，CDR可以由许多方法包括Kabat或
方法来定义。
抗体的抗原结合区可以包括由轻链可变区和重链可变区的CDR形成的抗原结合位点。
失调或疾病是将会受益于本发明的抗VEGF抗体/组合物或方法的治疗的病症。这包括慢性的和急性的失调或疾病，包括使得哺乳动物易患所讨论失调的那些病理学病症。本文要治疗的失调的非限制性实例包括细胞增殖性失调。所述细胞增殖性失调可以包括疾病，例如，湿性年龄相关黄斑变性、糖尿病性斑丘疹病、增殖型糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞(RVO)黄斑水肿、虹膜新生血管形成、病理性近视引起的脉络膜新生血管形成、成熟视网膜病、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、视网膜新血管形成、平坦部玻璃体切割术(pars plana vitrectomy，PPV)、糖尿病性黄斑水肿(DME)或癌症。
如本文使用的，“治疗”是指使用疗法来改善疾病或失调、或所述疾病或失调的一种或多种生物学表现；直接或间接地干扰(a)引起或导致所述疾病或失调的生物学级联中的一个或多个点，或(b)所述疾病或失调的一种或多种生物学表现；减轻与疾病或失调相关的症状、作用或副作用的一种或多种、或者所述症状或失调或其治疗的一种或多种；或减慢所述疾病或失调、或所述疾病或失调的一种或多种生物学表现的发展。治疗包括引发临床上显著的响应。期望的治疗效果包括阻止疾病的发作或复发，缓解症状，消除疾病的任何直接或间接的病理结果，阻止转移，降低疾病进展的速率，改善或减缓疾病状态，缓解症状或改善预后。在某些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或失调的发展。例如，眼部病症的治疗可以改善所述病症的症状、降低病症的严重度，改变病症发展的进程，和/或改善基础病症。治疗还可以包括改善受疾病或失调影响的受试者的生活质量(例如，当受试者用本文所述发明的组合物免疫时，受癌症影响的受试者可以接受更低剂量的引起副作用的抗癌药物)。在整个说明书中，提供了本发明的组合物和使用它的方法，并被选用来提供对有需要的受试者的适合的治疗。
“受试者”可以是指脊椎动物，优选地哺乳动物，和更优选地人类。哺乳动物包括但不限于农畜(例如牛、绵羊和山羊)、运动动物、宠物(例如，猫、狗和马)、灵长类(例如，猴、大猩猩和黑猩猩)、小鼠和大鼠。
如本文使用的，“有效量”是指在必需的剂量和时间段下有效实现期望的治疗或预防结果的量。
为了可以更全面地理解本文所述的发明，阐述了以下说明。
本发明的组合物及其制备方法
本发明包括新的抗VEGF抗体；以及包含编码这类新的抗VEGF抗体的序列的多核苷酸，以及包含它们的组合物，包括药物组合物。术语“药物制剂”、“药物组合物”和“剂型”在本文中可互换地使用，是指含有适合于向受试者施用的形式的本发明活性成分的组合物。
如本文使用的，组合物包含结合VEGF的一种或多种本发明的抗体，和/ 或包含编码结合VEGF的一种或多种抗体的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可以进一步包含适合的载体，例如，药学上可接受的载体，包括缓冲液，这些是本领域公知的。
仅举例来说，抗体是可以呈Y形的蛋白质，其可以通过连接两条免疫球蛋白轻链和两条免疫球蛋白重链产生，其中一条轻链与一条重链结合形成蛋白质的一条臂。两个臂通过一条重链与另一条重链的缔合来连接。一般地，抗体的每一条臂识别相同的抗原，并通过缔合的轻链和重链的可变区形成的抗原结合位点与抗原上的表位结合。与表位结合的轻链和重链的可变区的部分被称为高变区或“互补决定区(CDR)”。抗体对特定抗原的特异性取决于高变区或CDR的氨基酸序列，其在不同结合特异性的抗体之间显示了最大的变异性。其余的非高变区或非CDR被称为框架区(FR)。例如，每条轻链和每条重链可以存在从可变区的氨基末端到羧基末端的三个CDR，称为CDR1-3，它们由四个FR即，FR1-4分隔。为了区分轻链CDR和重链CDR，轻链CDR1-3 命名为CDRL1-CDRL3，或可选地，CDR-L1到CDR-L3。类似地，重链CDR1-3 命名为CDRH1-CDRH3或CDR-H1到CDR-H3。轻链可变区中的四个FR命名为FRL1-FRL4或FR-L1到FR-L4。进一步的，重链可变区中的四个FR命名为 FRH1-FRH4或FR-H1到FR-H4。因而，典型的可变区由从轻链的氨基末端到羧基末端按照顺序FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4相连形成。类似地，重链按照顺序FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 形成。轻链可变区之后是κ或λ轻链恒定区，其使轻链完整。而重链可变区在它的C-末端与恒定区、CH1、CH2和CH3以及CH1与CH2之间具有半胱氨酸残基的绞链区连接，所述铰链区参与与第二重链的铰链区的链间交联。重链恒定区的序列决定免疫球蛋白的类别(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，在每种类别中确定亚类(例如，对于IgG类别，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类)。
免疫球蛋白轻链和重链的互补决定区(CDR)或高变区可以根据Elvin A. Kabat及同事(Kabat，E.A.,Wu，T.T.,Perry，H.ML，Gottesman，K.S.和Foeller， C.(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，Volumes 1-3.第5版. NIH PublicationNo.91-3242(ISBN:094137565X，9780941375658)的序列比较来限定，取决于与每个CDR的关系，非CDR序列设计为具体的FR。可选地，鉴定免疫球蛋白中的CDR的另一种方法由Marie-Paule Lefranc和同事开发，来产生鉴定CDR的
图表和方法(Lefranc，M.-P.,等人(1999)IMGT， the international ImMunoGeneTics database.Nucl.Acids Res.27，209-212； Lefranc，M.-P.,等人(2015)
the international
information system 25years on.Nucl.Acids Res.43，D413-D422)。鉴定CDR的 Kabat方法和IMGT方法都在本文中使用。两种方法或产生相同的CDR序列或 CDR序列之间的重叠，或产生一个CDR序列以其整体含有在通过其它方法对相应CDR确定的CDR序列之内。在由两种方法鉴定的CDR序列未能产生相同的长度或重叠时，框架区(默认是可变区中所述CDR之外或CDR之间的区域) 在大小上是不同的，或者类似地将具有重叠序列。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的抗VEGF抗体或其部分或变体，其具有包含以下高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的重链可变域：包含氨基酸位置31的组氨酸到氨基酸位置35的组氨酸(SEQ ID NO：1)的CDRH1，包含氨基酸位置50的酪氨酸到氨基酸位置66的甘氨酸(SEQ ID NO：1)的 CDRH2，和包含氨基酸位置99的组氨酸到氨基酸位置109的酪氨酸(SEQ ID NO：1)的CDRH3。
本发明的抗VEGF抗体的变体可以包括包含氨基酸序列的抗体，其中一个或多个氨基酸残基相对于本文公开的任一种Y变体的氨基酸序列(例如，参见实施例3和图9C和16)是不同的，例如，由于在框架区中插入、缺失和/或取代的氨基酸残基的改变，但是没有氨基酸残基在所述CDR区中插入、缺失和 /或取代(例如，由Kabat编号或IMGT编号所定义的；或任何其它CDR鉴定系统，例如Chothia命名法)。变体包括抗体片段，例如Fab片段和单链Fv(scFv) 片段。变体可以进一步包括融合蛋白，例如，图12和13中的。本文公开的变体和抗体可以通过重组DNA方法生产。
本发明的分离的抗体的部分包括有用的免疫功能性片段，或提供了结合抗原或抗原上的表位的特异性(例如，识别并结合VEGF)，例如重链和/或轻链的CDR区、可变域，或结合VEGF的抗体链的一部分。本领域技术人员清楚的是，本发明的抗体可以是骆驼化的(camelized)。
例如，分离的抗体或其部分或变体是一种抗体，其已经从它的产生环境中分离和/或回收。所述产生环境可以是基于细胞的，例如，细胞，或可以是无细胞的，例如，体外翻译或偶联的转录-翻译无细胞系统。在优选的实施方案中，所述抗体将纯化至(a)根据例如Lowry方法测定的约95重量％的抗体，最优选超过约99重量％的抗体，或(b)在还原或非还原条件下SDS-PAGE的匀质性。如本文使用的，当在数字指称例如温度、时间、数量、浓度之类之前使用时，包括范围，术语“约”是指近似值，其可以变化(+)或(-)10％、5％或1％。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的抗VEGF抗体或其部分或变体，其具有包含以下高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变域：包含氨基酸位置24的精氨酸到氨基酸位置34的丙氨酸(SEQ ID NO：3)的CDRL1，包含氨基酸位置50的赖氨酸到氨基酸位置56的丙氨酸(SEQ ID NO：3)的 CDRL2，和包含氨基酸位置89的谷氨酰胺到氨基酸位置97的苏氨酸(SEQ ID NO：3)的CDRL3。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体或其部分可以进一步包含重链可变域，所述重链可变域包含图16中以粗体显示的根据IMGT编号定义的以下CDR氨基酸序列：包含氨基酸序列GFDLDHYS的CDRH1，包含氨基酸序列IYPSYGYT的CDRH2和包含氨基酸序列ARHAWYYGWGLDY的 CDRH3；以及轻链可变域，所述轻链可变域包含图16中以粗体显示的根据IMGT编号定义的以下CDR氨基酸序列：包含氨基酸序列QAAYGR的CDRL1，包含氨基酸序列KAS的CDRL2和包含氨基酸序列QQRGWYLFT的CDRL3。
其它实施方案提供了抗VEGF抗体或其部分，其进一步包含重链可变域，所述重链可变域包含以下CDR氨基酸序列：包含氨基酸位置31的组氨酸到氨基酸位置35的组氨酸(SEQ ID NO：1)的CDRH1，包含氨基酸位置50的酪氨酸到氨基酸位置66的甘氨酸(SEQ IDNO：1)的CDRH2，和包含氨基酸位置 99的组氨酸到氨基酸位置109的酪氨酸(SEQ ID NO：1)的CDRH3。
本发明提供了人源化的抗VEGF抗体或其部分。本发明的抗VEGF抗体抑制体内VEGF诱导的血管生成。
并且，本发明提供了合成的人源化抗VEGF抗体或其部分或变体。在一个实施方案中，它包含具有以下高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变域：包含氨基酸位置24的精氨酸到氨基酸位置34的丙氨酸(SEQ ID NO： 3)的CDRL1或其部分，包含氨基酸位置50的赖氨酸到氨基酸位置56的丙氨酸 (SEQ ID NO：3)的CDRL2或其部分，和包含氨基酸位置89的谷氨酰胺到氨基酸位置97的苏氨酸(SEQ ID NO：3)的CDRL3或其部分；以及具有以下高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的重链可变域：包含氨基酸位置31的组氨酸到氨基酸位置35的组氨酸(SEQ ID NO：1)的CDRH1或其部分，包含氨基酸位置50的酪氨酸到氨基酸位置66的甘氨酸(SEQ ID NO：1)的CDRH2或其部分，和包含氨基酸位置99的组氨酸到氨基酸位置109的酪氨酸(SEQ ID NO： 1)的CDRH3或其部分。
本发明的抗VEGF抗体的实例包括但不限于，分别如SEQ ID NO：21-28 所示的变体201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、 214、215、216、217、218、219和220。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括重链框架区(FR)1FRH1，氨基序列包含氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸(SEQ ID NO：1)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括重链框架区 (FR)2FRH2，氨基序列包含氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸 (SEQ ID NO：1)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括重链框架区(FR)3FRH3，氨基序列包含氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸 (SEQ ID NO：1)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括重链框架区 (FR)4FRH4，氨基序列包含氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包含以下重链框架区(FR)氨基酸序列：包含氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH1，包含氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH2，包含氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置 98的精氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH3，和包含氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH4。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括轻链框架区 (FR)1FRH1，氨基序列包含氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括轻链框架区 (FR)2FRH2，氨基序列包含氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸 (SEQ ID NO：3)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括轻链框架区 (FR)3FRH3，氨基序列包含氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包括轻链框架区(FR)4FRH4，氨基序列包含氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：4)。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体可以进一步包含以下轻链框架区(FR)氨基酸序列：包含氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL1，包含氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49 的酪氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL2，包含氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL3，和包含氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL4。
在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体或其部分或变体可以进一步包含：(c)具有以下框架区氨基酸序列的轻链可变域：包含氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL1或其部分，包含氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL2或其部分，包含氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ ID NO： 3)的FRL3或其部分，和包含氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL4或其部分；和(d)具有以下框架区氨基酸序列的重链可变域：包含氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH1或其部分，包含氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH2或其部分，包含氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH 3或其部分，和包含氨基酸位置110 的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH4或其部分。
本发明还涵盖分离的抗VEGF抗体和多核苷酸实施方案。本发明还涵盖基本上纯的抗体和多核苷酸实施方案。
本发明的抗VEGF抗体可以是单克隆的(例如，全长的或完整的单克隆抗体)。在本发明的实施方案中，本发明的抗VEGF抗体是全长抗体。进一步地，在一个实例中，所述全长抗体包括包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO：1中所示的重链。在另一实施方案中，所述全长抗体包括包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO：1中所示的重链，包含氨基酸位置24的天冬氨酸到氨基酸位置237的半胱氨酸(SEQ ID NO：17)的轻链以及包含氨基酸位置24的谷氨酸到氨基酸位置251的苏氨酸(SEQ ID NO：18)的重链(例如重链Fab 216；图16)，或包含氨基酸位置24的天冬氨酸到氨基酸位置237的半胱氨酸(SEQ ID NO：76)的轻链(例如，轻链Fab 216；图16)以及包含氨基酸位置24的谷氨酸到氨基酸位置251的苏氨酸(SEQ ID NO：78)的重链(例如，重链Fab 216；图16)。
还涵盖在本发明范围内的是本文提供的抗VEGF抗体的Fab、Fab'、 Fab'-SH和F(ab')2片段。这些抗体片段可以通过传统的方法例如酶消化来产生，或可以通过重组技术以及通过使用化学方法产生。例如，Fab'-SH，在例如两条重链之间的链间交联中起作用的半胱氨酸处具有还原的-SH基团的Fab'，可以通过重组技术、或通过化学方法通过还原F(ab')2抗体片段的二硫键来产生。这样的抗体片段可以是嵌合的或人源化的。Fab和scFv可以通过化学的或遗传学的交联来工程化形成二聚体、三聚体或四聚体，与亲本IgG相比改进存留和内在化性质。这些片段对于下文阐述的诊断和治疗目的是有用的。
Fv片段含有完整的抗原识别和结合位点。在单链Fv种类中，单个的重链可变域和单个的轻链可变域可以通过肽接头共价连接，从而所述轻链和重链可以在“二聚的”结构中缔合。正是在这种结构中，每个可变域的三个CDR相互作用来在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。合在一起，六个CDR 为抗体赋予了抗原结合特异性。然而，尽管比完整结合位点有更低的亲和力，既便单个可变区(或仅包含三个特异于抗原的CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力。
Fab片段含有单个抗原结合位点以及残余的“Fc”片段。Fab片段还含有轻链的恒定域以及重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段涵盖在本文中且不同于 Fab片段，在重链CH1结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。F(ab')2抗体片段涵盖在本文中且是在之间具有铰链半胱氨酸的一对Fab'片段。抗体片段的其它化学偶联是已知的并涵盖在本文中。
取决于它们的重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。例如，本发明的抗体可以是任何免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG 和IgM。此外，在这些类别之内，它们可以进一步分为亚类(同种型)，包括任何的，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定域可以分别为α、δ、ε、γ和μ的任一项。
单克隆抗体是从基本上同质的抗体群体获得的，即，除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。因而，修饰语“单克隆”表明抗体的特征是其不是离散抗体的混合物。
本发明的抗VEGF单克隆抗体可以通过由Kohler等，Nature，256:495 (1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备。
另外，本发明的抗VEGF抗体可以通过利用组合文库来筛选具有期望的活性的合成的抗体克隆来制造。原则上，通过筛选含有噬菌体的噬菌体文库选择合成的抗体克隆，所述噬菌体展示与噬菌体衣壳蛋白融合的抗体可变区 (Fv)的各种片段。例如，这类噬菌体文库可以通过针对期望的抗原进行亲和层析来淘选。表达能结合期望抗原的Fv片段的克隆吸附到抗原上，因而与文库中的非结合克隆分离。结合的克隆然后可以从抗原上洗脱，可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环来进一步富集。任何本发明的抗VEGF抗体可以如 Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda Md.(1991),vols.1-3中描述的通过设计适合的抗原筛选过程来选择感兴趣的噬菌体克隆，随后使用来自所述感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和适合的恒定区(Fc)构建全长抗VEGF抗体来获得。
本发明的嵌合抗体是包含人类和非人类部分的免疫球蛋白分子。嵌合抗体的抗原组合区(可变区)可以来自非人类来源(例如，鼠类)，为所述免疫球蛋白赋予生物效应物功能的嵌合抗体的恒定区可以来自人类来源。所述嵌合抗体应当具有所述非人类的抗体分子的抗原结合特异性，以及所述人类的抗体分子赋予的效应物功能。
一般地，用于产生嵌合抗体的过程可能涉及以下步骤：
a)鉴定并克隆编码抗体分子的抗原结合部分的正确基因区段(segment)；这种基因区段(称为重链的VDJ，可变多样性和连接区，或轻链的VJ，可变连接区，或简称为V区或可变区)可以是cDNA或基因组形式；
b)克隆编码恒定区或其期望部分的基因区段；
c)将所述可变区与所述恒定区连接，从而以可以转录和翻译的形式编码完整的嵌合抗体；
d)将这一构建体连接到含有可选择标记物和基因控制区例如启动子、增强子和poly(A)添加信号的载体中；
e)在细菌中扩增该构建体；
f)将该DNA导入真核细胞中(转染)，最常见的是哺乳动物淋巴细胞；
g)选择表达所述可选择标记物的细胞；
h)筛选表达所述期望的嵌合抗体的细胞；和
k)试验所述抗体的适当的结合特异性和效应物功能。
本发明涵盖多种类型的载体。术语载体是任何分子或实体，其用于将蛋白质编码信息传递到宿主细胞中，包括但不限于质粒、噬菌体、病毒、粘粒和噬菌粒。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为重组表达载体或表达载体。一般地，用于重组DNA技术的表达载体可以是质粒的形式。
已经通过这些方案操纵了几种不同抗原结合特异性的抗体来产生嵌合蛋白[例如，抗-TNP:Boulianne等人，Nature 312:643(1984)；和抗肿瘤抗原： Sahagan等人，J.Immunol.137:1066(1986)]。同样地，通过将新的序列连接到编码抗原结合区的那些上，已经实现了几种不同的效应物功能。这些中的一些包括酶[Neuberger等人，Nature 312:604(1984)]，来自另一个种类的免疫球蛋白恒定区和另一个免疫球蛋白链的恒定区[Sharon等人，Nature 309:364(1984)；Tan等人，J. Immunol.135:3565-3567(1985)]。此外，已经描述了修饰抗体分子的过程以及使用同源重组以靶向基因修饰来生产嵌合抗体分子的过程(Fell等人，Proc. Natl. Acad.Sci.USA 86:8507-8511(1989))。
抗体的抗原结合结构域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，可变区各自来自轻链(VL)和重链(VH)，这两条链都呈现三个高变环或互补决定区 (CDR)。可变域可以功能性地展示在噬菌体上，作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的柔性肽共价连接，或作为Fab片段，其中它们各自融合到恒定域并且非共价地相互作用。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH 和VL结构域，其中这些结构域以单个多肽链存在。通常，scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望的结构。如本文使用的，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
“高变区”是抗体可变域的区域，其在序列上是高变的和/或形成结构上限定的环。一般地，抗体可以包含六个高变区。这些包括可变重链(VH)中的三个区域，其被称为H1、H2、H3。另外，有三个处于可变轻链(VL)中，其被称为L1、L2、L3。多种高变区的描述都在使用中并涵盖在本文中。例如， Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性并可以使用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
VH和VL基因的所有组成成分(repertoires)可以通过聚合酶链式反应 (PCR)独立地克隆。然后所述克隆可以在噬菌体文库中随机地重组，并寻找抗原结合性克隆。来自被免疫的来源的文库提供了针对免疫原高亲和力的抗体，而不需要构建杂交瘤。可选地，初始的所有组成成分可以克隆，以提供针对大范围的非自身及自身抗原的人类的抗体的单一来源，而不需任何免疫。最后，还可以通过利用含有随机序列的PCR引物从干细胞中克隆未重排的V- 基因区段来合成地制造初始文库，以编码高度可变的CDR3区和实现体外重排。
丝状噬菌体可以用于展示抗体片段。所述抗体片段然后可以作为单链Fv 片段来展示。VH和VL结构域可以通过柔性的多肽间隔区连接到同一多肽链上，或作为Fab片段，其中一条链融合到所述丝状噬菌体的pIII上，另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，在此Fab-衣壳蛋白结构的组装体通过某些野生型衣壳蛋白的变位变成展示在噬菌体表面上。
一般地，编码抗体基因片段的核酸从收获自人或动物的免疫细胞中获得。如果期望的是偏向有利于抗VEGF克隆的文库，受试者用VEGF免疫来产生抗体应答，回收脾脏细胞和/或循环B细胞其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在优选的实施方案中，通过在带有功能性人免疫球蛋白基因阵列(并缺乏功能性内源抗体生产系统)的转基因小鼠中产生抗VEGF抗体应答以使 VEGF免疫产生生产针对VEGF的人源化抗体的B细胞，来获得偏向有利于抗 VEGF克隆的人源化抗体基因片段文库。生产人源化抗体的转基因小鼠的产生在下文中描述。
核酸(本文也称为多核苷酸)是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和它们的类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸部分打断。多核苷酸可以进一步在合成之后修饰，包括例如，经由与标签的结合。
与本发明的肽或多肽序列相关的氨基酸序列同一性百分比是指在对齐序列以及如有必要包括缺口以获得最大序列同一性百分比之后，在候选序列中与本发明的特定肽或多肽序列中的氨基酸残基享有同一性的氨基酸残基的百分比。
在另一实施方案中，本发明包括具有至少91％的同一性百分比的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明包括具有约92-98％的范围的同一性百分比的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明包括具有至少99％的同一性百分比的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的氨基酸序列仅包含本发明中提供的完整序列的一部分，例如缺失。这样的缺失可以是内部的或在末端。在一个实施方案中，本发明的氨基酸序列包含其它氨基酸，其中所述其它氨基酸插入在本发明的氨基酸序列之内或附着到末端。在一个实施方案中，本发明包括氨基酸取代，其中所述取代不干扰对VEGF的结合或中和VEGF的功能。这样的取代常常是保守性氨基酸取代，其中取代氨基酸具有功能上等效的物理化学性质，例如，脂肪族的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、含有羟基或硫/硒的(丝氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)、环状的(脯氨酸)、芳香族的(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性的(组氨酸、赖氨酸、精氨酸)以及酸性的和它们的酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸可以从感兴趣的细胞中回收并扩增。例如，初始文库(天然的或合成的)产生的抗体可以是中度亲和力的(Kd -1约106到107M-1)，但是亲和成熟也可以通过构建次级文库并从中选择来进行体外模拟。另外，例如使用带有跨越感兴趣的CDR的随机序列的引物进行PCR，在选定的单独Fv克隆中随机地突变一个或多个CDR，并筛选更高亲和力的克隆，可以进行亲和成熟。另一种有效的方法是，将通过带有获自未免疫供体的天然发生的V结构域变体的所有组成成分的噬菌体展示所选择的VH或VL结构域重组，以及在几轮链混洗中筛选更高亲和力。这种技术容许产生具有10-9M范围的Kd的更高亲和力的抗体和抗体片段。
例如，本发明的抗VEGF抗体、其部分或变体可以以不超过约50nM的K(d)值结合人VEGF。在另一实施方案中，本发明的抗VEGF抗体、其部分或变体以不超过约10nM的K(d)值结合人VEGF。在又一实施方案中，所述抗VEGF 抗体、其部分或变体以不超过约2.5nM的K(d)值结合人VEGF。又在进一步的实施方案中，所述抗VEGF抗体、其部分或变体以不超过约0.5nM的K(d)值结合人VEGF。在其它实施方案中，所述抗VEGF抗体、其部分或变体以不超过约0.15nM的K(d)值结合人VEGF。在又一其它实施方案中，所述抗VEGF抗体、其部分或变体以5pM到150pM之间的K(d)值结合人VEGF。在进一步的实施方案中，所述抗VEGF抗体、其部分或变体以约0.15nM的K(d)值结合人VEGF。在另一进一步的实施方案中，所述抗VEGF抗体、其部分或变体以 90pM±20pM的K(d)值结合人VEGF。在更进一步的实施方案中，所述抗VEGF 抗体、其部分或变体以约25pM的K(d)值结合人VEGF。在一个实施方案中，所述抗VEGF抗体、其部分或变体以约10pM的K(d)值结合人VEGF。在又一实施方案中，与雷珠单抗(
Novartisand Roche)或贝伐珠单抗(
Roche)相比，本发明的抗VEGF抗体、其部分或变体对于人VEGF具有更高的亲和力，具有比雷珠单抗或贝伐珠单抗的K(d)值低超过3倍的K(d)值。在再进一步的实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF具有比雷珠单抗 (
Novartis and Roche)低超过4倍的相对K(d)值。在另一实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF具有比雷珠单抗(
Novartis and Roche)低超过10倍的相对K(d)值。在另一实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF具有比雷珠单抗(
Novartis and Roche)低超过50 倍的相对K(d)值。在另一实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF 具有比雷珠单抗(
Novartis and Roche)低约55倍的相对K(d)值。在又一个实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF具有比贝伐珠单抗 (
Roche)低超过10倍的相对K(d)值。在另一实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF具有比贝伐珠单抗(
Roche)低超过50倍的相对K(d)值。在另一实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF 具有比贝伐珠单抗(
Roche)低超过100倍的相对K(d)值。在另一实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于人VEGF具有比贝伐珠单抗(
Roche)低约110倍的相对K(d)值。
在再进一步的实施方案中，所述抗体或其部分或变体对于抑制VEGF诱导的内皮细胞体外增殖具有不超过约200pM的IC50值。进一步的，在其它实施方案中，所述抗体或其部分或变体在抑制VEGF诱导的内皮细胞体外增殖方面比雷珠单抗(
Novartis andRoche)更有效。在进一步的实施方案中，所述抑制VEGF诱导的内皮细胞体外增殖的相对IC50值比雷珠单抗 (
Novartis and Roche)低约1.5倍。
在一个实施方案中，本发明提供了具有提高的稳定性的抗体。在一个实施方案中，所述抗VEGF抗体或其部分或变体具有比雷珠单抗(
Novartis and Roche)更高的稳定性。在另一实施方案中，所述抗VEGF抗体或其部分或变体具有比雷珠单抗(
Novartis and Roche)更高的保存期限。
在一个实施方案中，本发明提供了具有比雷珠单抗(
Novartis andRoche)提高的热稳定性的抗体。例如，本发明的人源化抗VEGF抗体的熔解温度可以比雷珠单抗(
Novartis and Roche)的熔解温度高约1.5℃。
在一个实施方案中，本发明的抗VEGF抗体或其部分或变体不结合BSA 或Fc。
在构建编码本发明的针对VEGF的抗体的DNA分子之后，该DNA分子在表达载体例如质粒中与表达控制序列可操作地连接，其中所述控制序列由所述载体转化的宿主细胞识别。一般地，质粒载体含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制和控制序列。载体通常带有复制位点，以及编码能够在转化的细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。用于在原核和真核宿主细胞中表达的适合的载体是本领域已知的，一些在本文中进一步描述。可以使用真核生物例如酵母或来自多细胞有机体如哺乳动物的细胞。
宿主细胞用上文描述的本发明的表达或克隆载体转染和优选地转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而视情况修改的常规营养培养基中培养。
转染是指宿主细胞接受表达载体，无论是否实际表达任何编码序列。许多转染方法是本领域普通技术人员已知的，例如，CaPO4沉淀和电穿孔。当这种载体运作的任何迹象在宿主细胞内发生时，一般认为是成功的转染。转染的方法是本领域公知的。
转化意味着将DNA导入生物体中使得DNA是可复制的，作为染色体外的元件或通过染色体整合。取决于使用的宿主细胞，利用适合于这种细胞的标准技术进行转化。转化方法是本领域公知的，一些在本文中进一步描述。
用于产生本发明的针对VEGF的抗体的原核宿主细胞可以如上文 Sambrook等人中一般性地描述的来培养。
哺乳动物宿主细胞可以用于生产针对VEGF的抗体，并可以在多种培养基中培养，这是本领域公知的，其中的一些在本文中描述。
本公开内容中提及的宿主细胞包括体外培养的细胞以及处于宿主动物内的细胞。本发明的针对VEGF的抗体的纯化可以使用本领域公知的方法实现，其中一些在本文中描述。纯化的抗体可以附着到适合的基质，例如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸系共聚物、羟基甲基丙烯酸酯凝胶、聚丙烯酸与聚甲基丙烯酸的共聚物、尼龙、中性和离子载体，等等，用于噬菌体展示的克隆的亲和层析分离。
噬菌体文库样品可以在适合于至少一部分噬菌体颗粒与固相结合的条件下与固定化VEGF接触。通常，选择包括pH、离子强度和温度等条件来模拟生理条件。可以洗涤与固相结合的噬菌体，然后洗脱。噬菌体可以在单轮选择中富集；如果被富集，可以在细菌培养物中生长并进行进一轮的选择。即使对VEGF的亲和力稍有不同，有可能在不同亲和力的噬菌体抗体之间选择。
抗VEGF mAb针对目标抗原的反应性可以通过许多公知的手段来建立，包括Western印迹、免疫沉淀、ELISA和FACS分析，视情况使用VEGF蛋白、肽、表达VEGF的细胞或其提取物。这样的分析的实例在下文实施例1中呈现。
本发明的抗体或其片段可以是对于它结合的细胞是细胞抑制性的。如本文使用的，“细胞抑制性的”是指抗体可以抑制VEGF阳性细胞生长，但不必然地杀死VEGF阳性细胞。
编码本发明的Fv克隆的DNA可以与编码重链和/或轻链恒定区的已知 DNA序列组合，以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。要理解的是，任何同种型的恒定区可以用于这个目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD 和IgE恒定区，这类恒定区可以获自任何人类或动物物种。在优选的实施方案中，将衍生自人类可变DNA的Fv克隆融合到人类恒定区DNA，来形成所有的人类的完全或部分长度的重链和/或轻链的编码序列。
抗体片段
本发明涵盖抗体片段。与完整抗体相比抗体片段较小的大小具有某些优点。例如，与完整抗体相比，片段可以容许更快速的清除，可以产生对感兴趣的位点的改进的接近。
例如，在一个实施方案中，所述抗体片段是Fab，其包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：3的从位置1的天冬氨酸开始到位置107的赖氨酸结束的氨基酸序列，所述重链可变域包含SEQ ID NO：1 的从位置1的谷氨酸开始到位置120的丝氨酸结束的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述Fab片段连接到包含SEQ ID NO：5所示氨基酸的Fc区。
在又一实施方案中，所述抗体的变体是包含本发明的抗体的抗原结合区的重组蛋白。例如，所述变体可以是scFv，其包含SEQ ID NO：9的从位置241 的天冬氨酸开始到位置483的丝氨酸结束的氨基酸序列。在本发明的进一步的实施方案中，所述scFv与Fc区连接。仅仅举例来说，连接到Fc区的所述scFv 可以包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸。
存在着各种技术用于产生抗体片段。抗体或片段可以通过重组手段生产。例如，这些片段可以通过重组宿主细胞直接生产。Fab、Fv和ScFv抗体片段都能够在例如大肠杆菌(E.coli)中表达和分泌，因而容许相对容易的产生大量的这些片段。可以从本文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可选地， Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，并化学地偶联形成F(ab')2片段。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。生产抗体片段的其它技术对于熟练技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，可选的抗体是单链Fv片段(scFv)。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺乏恒定区的唯一种类；因而，它们适合于体内使用期间的降低的非特异性结合。在sFv 的氨基或羧基末端，可以构建sFv融合蛋白来产生效应物蛋白的融合物。
合成的人类抗VEGF抗体
本发明进一步提供了结合VEGF的抗体(例如，多克隆的、单克隆的、嵌合的、合成的和人源化的抗体)。最优选的抗体将选择性地结合VEGF并且不结合(或仅微弱结合)非VEGF蛋白。最优选的抗体将特异性结合VEGF。术语“特异性结合”意图指该抗体占优势地结合VEGF。特别预期的抗VEGF抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体以及含有这些抗体的抗原结合结构域和/或一个或多个补体决定区的其片段(例如，重组蛋白)。这些抗体可以来自任何来源，例如，大鼠、狗、猫、猪、马、小鼠或人类。
在一个实施方案中，本发明的抗VEGF抗体可以是抗VEGF中和抗体。在一个实施方案中，本发明的抗VEGF抗体特异性结合VEGF蛋白，以及例如抑制VEGF诱导的体内血管生成。本领域技术人员将理解的是，本发明的抗体针对的VEGF蛋白的区域或表位可以随预期的应用而变化。
例如，旨在用于检测存活癌细胞或眼部细胞(ocular cell)上膜结合的 VEGF的免疫分析的抗体应当针对膜结合的VEGF上可接近的表位。不同的 VEGF同种型可能具有不同的细胞膜结合潜力。例如，更大的高碱性VEGF189和VEGF206同种型(VEGF-A的同种型)在细胞外基质(ECM)中与细胞表面含肝素的蛋白多糖紧密结合，因而发现与细胞紧密结合；而酸性VEGF121同种型 (VEGF-A121)缺乏结合肝素的能力并且是游离弥散的。VEGF165同种型 (VEGF-A165)具有中间性质，其大部分结合肝素和ECM。这类抗体的实例在后续的实施例中描述。识别其它表位的抗体可对于鉴定损伤细胞或垂死细胞内的VEGF、对于检测分泌的VEGF蛋白或其片段是有用的。
本发明的抗VEGF抗体可以在诊断分析、成像方法、眼病治疗、视力损伤治疗、预防失明以及癌症管理中的治疗方法方面是特别有用的。本发明提供了对于检测VEGF蛋白和诊断癌症有用的各种免疫学分析。这样的分析一般包括能够识别和结合VEGF蛋白的一种或多种抗VEGF抗体，包括本领域公知的各种免疫学分析形式，包括但不限于各种形式的沉淀、凝集、补体固定、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶联免疫荧光法分析(ELIFA)(H.Liu等人Cancer Research 58:4055-4060(1998))、和免疫组织化学分析等。
在一个实施方案中，本发明的抗VEGF抗体以及其片段(例如，Fv、Fab'、 F(ab')2)和其变体(例如，scFv)治疗性地用于治疗疾病，所述疾病选自视网膜失调、年龄相关的黄斑变性(AMD)、黄斑变性、湿性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病、糖尿病性斑丘疹病、增殖型糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞(RVO)黄斑水肿、继发于视网膜静脉闭塞(RVO)的黄斑水肿、虹膜新生血管形成、病理性近视引起的脉络膜新生血管形成、黄斑水肿、早产儿视网膜病(ROP)、成熟视网膜病、平坦部玻璃体切割术(PPV)、新生血管性青光眼、糖尿病性黄斑水肿(DME)以及与血管生成相关的眼病。本发明的抗 VEGF抗体以及其片段和其变体可以用于预防或停止前述疾病或病症的发展。
本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有效量可以根据一些因素而变化，例如，个体的疾病状况、年龄、性别和体重，所述物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望的反应的能力。治疗有效量还是其中所述物质 /分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或不利作用被治疗有益效果超过的量。预防有效量是指在必需的剂量和时间段下有效实现期望的预防结果的量。一般地而不是必然地，由于在疾病之前或较早阶段在受试者中使用预防剂量，预防有效量可以低于治疗有效量。
在一个实施方案中，本发明的抗VEGF抗体以及其片段(例如，Fv、Fab'、 F(ab')2)用于检测癌症的存在。本发明的抗VEGF抗体以及其片段可以用于检测表达VEGF、响应VEGF、或参与VEGF依赖性血管生成的眼部细胞或内皮细胞的存在。在各种生物样品，包括血清、玻璃体液、眼睛、前列腺和其它组织活检标本，其它组织例如骨、尿液等中这种VEGF阳性(+)细胞的存在可以用VEGF抗体检测。此外，抗VEGF抗体可以用于各种成像方法，例如，使用碘111(或其它同位素)缀合抗体的免疫闪烁成像。
抗VEGF抗体还可以用于纯化VEGF蛋白和肽的方法中，以及用于分离 VEGF同源物和相关分子的方法中。例如，在一个实施方案中，纯化VEGF 蛋白的方法包括在允许已经偶联至固体基质的抗VEGF抗体结合VEGF的条件下孵育该抗VEGF抗体和含有VEGF的溶胞产物或其它溶液；洗涤所述固体基质来除去混杂物；以及从偶联的抗体上洗脱VEGF。另外，抗VEGF抗体可以用于利用细胞分选和纯化技术分离VEGF阳性细胞。
在一个实施方案中，特异性识别并结合VEGF的分离的人源化抗VEGF 抗体或其部分或变体包含轻链可变域，所述轻链可变域包含以下如表5a或5c 所示的变体201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、 214、215、216、217、218、219或220的高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列。在另一实施方案中，特异性识别并结合VEGF的分离的人源化抗VEGF 抗体或其部分或变体包含重链可变域，所述重链可变域包含以下如表5b或5d 所示的变体201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、 214、215、216、217、218、219或220的高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列。
在一个实施方案中，特异性识别并结合VEGF的分离的人源化抗VEGF 抗体或其部分或变体包含变体201、202、203、204、205、206、207、208、 209、212、213、214、215、216、217、218、219或220的、包含如表5a和5c 所提供的氨基酸序列的轻链的任一个。在另一实施方案中，特异性识别并结合VEGF的分离的人源化抗VEGF抗体或其部分或变体包含变体201、202、203、 204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、 219或220的、包含如表5b和5d所提供的氨基酸序列的重链的任一个。
在一个实施方案中，特异性识别并结合VEGF的分离的人源化抗VEGF 抗体或其部分或变体包括：包含以下如表5a所示的变体201、202、203、204、 205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219或 220的高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变域，以及相应的包含以下如表5b所示的变体201、202、203、204、205、206、207、208、209、 212、213、214、215、216、217、218、219或220的高变区或互补决定区(CDR) 氨基酸序列的重链可变域。
在一个实施方案中，特异性识别并结合VEGF的分离的人源化抗VEGF 抗体或其部分或变体包括：包含以下如表5c所示的变体201、202、203、204、 205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219或 220的高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变域，以及相应的包含以下如表5d所示的变体201、202、203、204、205、206、207、208、209、 212、213、214、215、216、217、218、219或220的高变区或互补决定区(CDR) 氨基酸序列的重链可变域。
人源化抗体和人类的抗体
本发明涵盖新的人源化抗VEGF抗体。人源化抗体是含有衍生自非人类免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。例如，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，在其中来自受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)例如非人灵长类、小鼠、大鼠或兔的、具有期望的特异性、亲合性和接受力(capacity) 的高变区的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基可以被相应的非人残基替代。进一步地，人源化抗体可以包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基以进一步改进抗体性能。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的恒定区。嵌合抗体可以具有重链和/或轻链的一部分，其相同于或同源于衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列，而链的其余部分相同于或同源于衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列，以及这样的抗体的片段，只要它们展现了期望的生物学活性即可。
生产本发明的全人源化抗VEGF单克隆抗体的方法包括噬菌体展示和转基因方法。例如，本发明的全人源化抗VEGF单克隆抗体可以使用克隆技术、采用大的人类Ig基因组合文库(即，噬菌体展示)来产生。本发明的全人源化抗VEGF单克隆抗体还可以使用工程化以含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。
双特异性抗体
双特异性抗体是抗VEGF单克隆的，优选地是本发明的人类的或人源化的抗体，具有对至少两种不同抗原的结合特异性。在当前的情况下，结合特异性之一是针对VEGF，另一个是针对任何其它抗原。示例性双特异性抗体可以结合VEGF蛋白的两个不同的表位。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有对两种不同抗原的结合特异性，所述抗原之一是本发明的抗体结合的抗原。例如，所述双特异性抗体可以包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含CDRH1(例如，氨基酸位置31到氨基酸位置35的组氨酸(SEQ ID NO：1))或其部分，CDRH2(例如，氨基酸位置50的酪氨酸到氨基酸位置66的甘氨酸(SEQ ID NO：1))或其部分， CDRH3(例如，氨基酸位置99的组氨酸到氨基酸位置109的酪氨酸(SEQ IDNO：1))或其部分，CDRL1(例如，氨基酸位置24的精氨酸到氨基酸位置34 的丙氨酸(SEQ IDNO：3))或其部分，CDRL2(例如，氨基酸位置50的赖氨酸到氨基酸位置56的丙氨酸(SEQ IDNO：3))或其部分，或CDRL3(例如，氨基酸位置89的谷氨酰胺到氨基酸位置97的苏氨酸(SEQID NO：3))或其部分，或其组合的氨基酸序列。
双特异性抗体也可以用于将细胞毒性试剂定位到表达VEGF的细胞。这些抗体具有VEGF结合臂以及结合细胞毒性试剂(例如，皂草素、抗干扰素α、长春花属生物碱(vincaalkaloids)、蓖麻蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)来制备。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。具有超过两种价态的抗体是预期的。例如可以制备三特异性抗体。
抗体变体
在某些实施方案中，本文描述的抗VEGF抗体的氨基酸序列修饰是预期的。例如，通过向抗体核酸中引入合适的核苷酸改变或通过肽合成，可以制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修改包括，例如，缺失、和/或插入和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。进行缺失、插入和取代的任何组合来得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有期望的特性。
进一步地，预期的Fc区变体可以通过在本发明的免疫球蛋白多肽的Fc 区中引入一个或多个氨基酸修饰来获得。Fc区变体可以包含人类Fc区序列 (例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上，包括铰链半胱氨酸的位置上包含氨基酸修饰(例如，取代)。根据这种描述和本领域的教导，预期的是在某些实施方案中，本发明的方法中使用的抗体可以包含相较于野生型对应物抗体的一个或多个改变，例如在Fc区中。
核酸、载体、宿主细胞以及重组方法
本发明的另一个方面提供了编码抗VEGF抗体及其片段的各种核酸分子，优选地是分离的形式，包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交物、和相关的分子，与抗VEGF抗体编码序列或其部分互补的核酸分子，以及与抗VEGF抗体编码核酸杂交的那些。特别优选的核酸分子将具有基本上相同于或互补于本文公开的人或鼠DNA序列的核苷酸序列。特别预期的是基因组DNA、cDNA、核酶和反义分子，以及基于可替换的主链或包括可替换的碱基的核酸，无论是来自天然来源的还是合成的。
本发明进一步提供了本发明的抗VEGF抗体编码核酸分子(anti-VEGF antibody-encoding nucleic acid molecule)的片段。如本文使用的，抗VEGF抗体编码核酸分子的片段是指完整抗VEGF抗体编码序列的一小部分。所述片段的大小将由它的预期用途决定。
在一个实施方案中，本发明提供了编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白重链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的分离的核酸。在本发明的实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，其中所述抗体的抗原结合部分的免疫球蛋白重链或其部分包括：包含从位置 91的胞嘧啶开始到位置105的胞嘧啶结束(SEQ IDNO：1)的核酸序列的免疫球蛋白重链CDRH1或其部分，包含从位置148的胸腺嘧啶开始到位置198的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列的重链CDRH2或其部分，以及包含从位置295的胞嘧啶开始到位置327的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列的重链CDRH3或其部分；和/或其中所述抗体的抗原结合部分的免疫球蛋白轻链或其部分包括：包含从位置70的胞嘧啶开始到位置102的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列的轻链CDRL1或其部分，包含从位置148的腺嘌呤开始到位置168的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列的轻链CDRL2或其部分，和包含从位置265的胞嘧啶开始到位置291的鸟嘌呤结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列的轻链CDRL3或其部分。
例如，当核酸分子基本上从编码VEGF抗体以外的多肽的污染核酸分子中分离时，编码本发明的抗VEGF抗体的核酸分子可以被认为是分离的。熟练的技术人员可以容易地采用核酸分离过程来获得分离的VEGF抗体编码核酸分子。虽然实现高纯度是期望的，分离的核酸不必是纯的或达到绝对纯度以成为分离的核酸。
在另一实施方案中，上文的(a)或(b)中提供的核酸序列的任一个可以用编码相同氨基酸序列的等价核酸序列替换。在又一其它实施方案中，所述抗体进一步包含人类的或人源化的恒定区。例如，所述人类的或人源化的恒定区可以是IgG1恒定区。在另一个实例中，所述人类的或人源化的恒定区是 IgG4恒定区。
在本发明的一个实施方案中，所述分离的核酸包含SEQ ID NO：16中所示的序列。
在又一实施方案中，所述分离的核酸序列编码特异性结合构件，其是包含SEQ IDNO：9所示的位置721的鸟嘌呤开始到位置1449的胸腺嘧啶的核酸序列或其部分的单链Fv分子。在再另一个其他的实施方案中，所述特异性结合构件是包含SEQ ID NO：1和3中所示的核酸序列或其部分的Fab。在进一步的实施方案中，所述抗体的重链包含FR氨基酸序列，所述FR氨基酸序列包含SEQ ID NO：16中所示的位置70的鸟嘌呤开始到位置711的胸腺嘧啶的氨基酸序列以及SEQ ID NO：16中位置897的鸟嘌呤开始到位置1580的腺嘌呤的核酸序列或其部分。在另一实施方案中，所述特异性结合构件是Fab，所述Fab包含SEQ ID NO：16中所示的位置1的腺嘌呤开始到位置711的胸腺嘧啶的核酸序列以及SEQ ID NO：16中位置828的腺嘌呤开始到位置1580的腺嘌呤的核酸序列或其部分。
在又一实施方案中，所述特异性结合构件是包含SEQ ID NO：16中所示核酸序列或其部分的Fab。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白重链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白重链框架区 (FR)1FRH1，其包含编码氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸 (SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置1的鸟嘌呤开始到位置90的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白重链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白重链框架区 (FR)2FRH2，其包含编码氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸 (SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置106的胸腺嘧啶开始到位置147的腺嘌呤结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白重链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白重链框架区 (FR)3FRH3，其包含编码氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸 (SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置199的胞嘧啶开始到位置294的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白重链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白重链框架区 (FR)4FRH4，其包含编码氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸 (SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置328的胸腺嘧啶开始到位置360的鸟嘌呤结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白重链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含重链框架区FRH1，其包含编码氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置1的鸟嘌呤开始到位置90的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列，重链框架区FRH2，其包含编码氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置106的胸腺嘧啶开始到位置147的腺嘌呤结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列，重链框架区FRH3，其包含编码氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸(SEQ ID NO：1) 的氨基酸序列的、从位置199的胞嘧啶开始到位置294的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列，以及重链框架区FRH4，其包含编码氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置328 的胸腺嘧啶开始到位置360的鸟嘌呤结束(SEQ ID NO：1)的核酸序列，其中编码所述重链框架区FRH1到FRH4以及重链互补决定区CDRH1到CDRH3的核酸序列以FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的顺序连接。
在一个实施方案中，所述分离的核酸包含编码氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的、从位置1的鸟嘌呤开始到位置360的鸟嘌呤结束(SEQ ID NO：1)的重链可变区的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白轻链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白轻链框架区1 FRL1，其包含编码氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的、从位置1的鸟嘌呤开始到位置69的胞嘧啶结束 (SEQ ID NO：3)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白轻链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白轻链框架区2 FRL2，其包含编码氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的、从位置103的胸腺嘧啶开始到位置147的胞嘧啶结束 (SEQ ID NO：3)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白轻链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白轻链框架区3 FRL3，其包含编码氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的、从位置169的鸟嘌呤开始到位置264的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白轻链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含免疫球蛋白轻链框架区4 FRL4，其包含编码氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的、从位置292的胸腺嘧啶开始到位置321的腺嘌呤结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列。
在一个实施方案中，所述特异性结合构件包含抗体的抗原结合部分，编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白轻链或其部分、免疫球蛋白轻链或其部分、或两者的所述分离的核酸另外包含轻链框架区FRL1，其包含编码氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸(SEQ ID NO：3) 的氨基酸序列的、从位置1的鸟嘌呤开始到位置69的胞嘧啶结束(SEQ ID NO： 3)的核酸序列，轻链框架FRL2，其包含编码氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的、从位置103的胸腺嘧啶开始到位置147的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列，轻链框架FRL3，其包含编码氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ ID NO：3) 的氨基酸序列的、从位置169的鸟嘌呤开始到位置264的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列，轻链框架FRL4，其包含编码氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的、从位置292 的胸腺嘧啶开始到位置321的腺嘌呤结束(SEQ ID NO：3)的核酸序列，其中，编码轻链框架区FRL1到FRL4以及轻链互补决定区CDRL1到CDRL3的核酸序列以FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的顺序连接。
在一个实施方案中，权利要求4或68的分离的核酸，其中编码每个CDR 和每个FR氨基酸序列的核酸由IMGT方法定义，如下：
包含从位置76的鸟嘌呤开始到位置99的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：79) 的核酸序列的、IMGT定义的CDRH1；包含从位置151的腺嘌呤开始到位置 174的胸腺嘧啶结束(SEQ IDNO：79)的核酸序列的、IMGT定义的CDRH2；包含从位置289的鸟嘌呤开始到位置327的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：79)的核酸序列的、IMGT定义的CDRH3；包含从位置79的胞嘧啶开始到位置96的胞嘧啶结束(SEQ ID NO)的核酸序列的、IMGT定义的CDRL1；包含从位置148 的腺嘌呤开始到位置156的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：77)的核酸序列的、IMGT 定义的CDRL2；包含从位置265的胞嘧啶开始到位置291的鸟嘌呤结束(SEQ ID NO：77)的核酸序列的、IMGT定义的CDRL3；包含编码氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置25的丝氨酸(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列的、从位置1 的鸟嘌呤开始到位置75的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：79)的核酸序列的IMGT 定义的FRH1；包含编码氨基酸位置34的异亮氨酸到氨基酸位置50的酪氨酸 (SEQ IDNO：79)的氨基酸序列的、从位置100的腺嘌呤开始到位置150的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：79)的核酸序列的、IMGT定义的FRH2；包含编码氨基酸位置59的酪氨酸到氨基酸位置96的半胱氨酸(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列的、从位置175的胸腺嘧啶开始到位置288的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO： 79)的核酸序列的、IMGT定义的FRH3；包含编码氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列的、从位置328的胸腺嘧啶开始到位置360的鸟嘌呤结束(SEQ ID NO：79)的核酸序列的、IMGT 定义的FRH4；包含编码氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置26的丝氨酸 (SEQ ID NO：77)的氨基酸序列的、从位置1的鸟嘌呤开始到位置78的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：77)的核酸序列的、IMGT定义的FRL1；包含编码氨基酸位置33的缬氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸(SEQ ID NO：77)的氨基酸序列的的、从位置97的鸟嘌呤开始到位置147的胞嘧啶结束(SEQ ID NO：77)的核酸序列的、IMGT定义的FRL2；包含编码氨基酸位置53的谷氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ ID NO：77)的氨基酸序列的、从位置157的鸟嘌呤开始到位置264的胸腺嘧啶结束(SEQ ID NO：77)的核酸序列的、IMGT定义的FRL3；和/或包含编码氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸 (SEQ ID NO：77)的氨基酸序列的、从位置292的胸腺嘧啶开始到位置321的腺嘌呤结束(SEQ ID NO：77)的核酸序列的、IMGT定义的FRL4。
在一个实施方案中，所述分离的核酸包含编码氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的、从位置1的鸟嘌呤开始到位置 321的腺嘌呤结束(SEQID NO：3)的、轻链可变区的核酸序列。
在本发明的其它实施方案中，所述核酸编码作为抗体的特异性结合构件。
在又一实施方案中，所述抗体的重链包含从氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的FF03046-2 VH结构域、和氨基酸位置121的丙氨酸到氨基酸位置218的缬氨酸(SEQ ID NO：1)的人IgG1恒定区的 CH1结构域，以及其中所述抗体的轻链包含氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的FF03046-2 VL结构域、和氨基酸位置 180的精氨酸到氨基酸位置214的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的人κ轻链恒定区。
在又一实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的FF03046-2 VH结构域、氨基酸位置121 的丙氨酸到氨基酸位置218的缬氨酸(SEQ ID NO：1)的人IgG1恒定区的CH1 结构域、和氨基酸位置219的谷氨酸到氨基酸位置228的苏氨酸(SEQ ID NO： 1)的人IgG1恒定区的铰链区的一部分，以及其中所述抗体的轻链包含氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的FF03046-2 VL结构域、和氨基酸位置108的精氨酸到氨基酸位置214的半胱氨酸(SEQ IDNO： 3)的人κ轻链恒定区。
并且，本发明提供了如下的实施方案，其中所述抗体的重链包含氨基酸位置261的谷氨酸到氨基酸位置380的丝氨酸(SEQ ID NO：16)的FF03046-2 VH结构域、和氨基酸位置381的丙氨酸到氨基酸位置478的缬氨酸(SEQ ID NO：16)的人IgG1恒定区的CH1结构域，以及其中所述抗体的轻链包含氨基酸位置24的天冬氨酸到氨基酸位置130的赖氨酸(SEQ IDNO：16)的 FF03046-2 VL结构域、和氨基酸位置131的精氨酸到氨基酸位置237的半胱氨酸(SEQ ID NO：16)的人κ轻链恒定区。
本发明提供了如下的实施方案，其中所述抗体的重链包含氨基酸位置 261的谷氨酸到氨基酸位置380的丝氨酸(SEQ ID NO：16)的FF03046-2 VH结构域，氨基酸位置381的丙氨酸到氨基酸位置478的缬氨酸(SEQ ID NO：16) 的人IgG1恒定区的CH1结构域、和氨基酸位置479的谷氨酸到氨基酸位置488 的苏氨酸(SEQ ID NO：16)的人IgG1恒定区的铰链区的一部分，以及其中所述抗体的轻链包含氨基酸位置24的天冬氨酸到氨基酸位置130的赖氨酸(SEQ ID NO：16)的FF03046-2 VL结构域、和氨基酸位置131的精氨酸到氨基酸位置237的半胱氨酸(SEQ ID NO：16)的人κ轻链恒定区。
本发明提供了具有SEQ ID NO：16中提供的序列的分离的核酸。
在一个实施方案中，组成型启动子用于控制本发明的抗体、其部分或变体的表达。在独立的实施方案中，可调节的或可诱导的启动子用于表达本发明的抗体、其部分或变体。在一个实施方案中，所述可调节的或可诱导的启动子是pho A启动子。本发明提供了分离的核酸，其中所述pho A启动子包含 SEQ ID NO：15中提供的核酸序列或其部分。
本发明提供了分离的核酸序列，其中所述核酸的转录的终止处在转录终止子的控制下。在一个实施方案中，所述转录终止子是核糖体RNA基因终止子。在一个实施方案中，所述核糖体RNA基因终止子包含SEQ ID NO：19中提供的核酸序列或其部分。
本发明提供了分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列是在载体中的。在一个实施方案中，所述载体包含复制起点。在另一实施方案中，所述载体包含colE1复制起点。
在一个实施方案中，所述载体包含可选择标记物或筛选标记物。在一个实施方案中，所述可选择标记物或筛选标记物选自由药物可选择标记物、荧光蛋白、细胞表面标记物、酶、发光蛋白、代谢标记物、生长因子和抗性因子组成的组。在一个实施方案中，所述载体是SEQ ID NO：20中提供的四环素抗性基因缺失的pBR322。
本发明提供了分离的核酸，其中编码本发明的抗体的核酸不结合BSA或 Fc。
对于本发明的抗体的重组生产，可以分离编码它的核酸，并插入可复制的载体中用于进一步的克隆(DNA的扩增)或用于表达。利用常规程序容易地分离编码抗体的DNA并测序(例如，利用能与编码所述抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。许多载体是可获得的。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。一般地，优选的宿主细胞是原核或是真核的(一般为哺乳动物)来源。要理解的是，任何同种型的恒定区可以用于这个目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，这类恒定区可以获自任何人类或动物物种。
编码本发明的抗VEGF抗体的分离的核酸可以具有沉默突变或多个沉默突变(silent mutation or mutations)。此外，本发明的分离的核酸可以具有错义突变或多个错义突变(missense mutation or mutations)，其中所述核苷酸取代产生氨基酸的同一性的改变，但是不会由于所述取代导致翻译终止密码子的特化而产生提前截短的多肽。本发明的分离的核酸可以具有框内(inframe)缺失或插入，其中所述缺失或插入以3个碱基或碱基对的倍数存在。
还提供的是重组DNA分子(rDNA)，其含有本文描述的抗VEGF抗体编码序列或其片段。如本文使用的，rDNA分子是经历了体外分子操纵的DNA分子。产生rDNA分子的方法是本领域公知的，例如，参见Sambrook等人， Molecular Cloning(1989)。在本发明的优选的rDNA分子中，编码抗VEGF抗体或其片段的抗VEGF抗体编码DNA序列与一个或多个表达控制序列和/或载体序列可操作地连接。所述rDNA分子可以编码完整VEGF抗体，或可以编码VEGF抗体的片段。
如本领域公知的，与所述VEGF抗体编码序列可操作地连接的载体和/或表达控制序列的选择直接取决于期望的功能性质，例如，蛋白质表达和要转化的宿主细胞。本发明预期的载体至少能够指导所述rDNA分子中包括的 VEGF抗体编码序列的复制或插入宿主染色体中，优选地指导表达。
用于调节可操作地连接的蛋白质编码序列的表达的表达控制元件是本领域已知的，包括但不限于，诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子、转录终止子和其它调节元件。例如，本发明的核酸的转录可以处在核糖体RNA终止子的控制下。在一个实施方案中，所述核糖体RNA终止子包含 SEQ ID NO：19中提供的核酸序列或其部分。
在一个实施方案中，含有抗VEGF抗体编码核酸分子的载体将包括用其转化的原核复制子，即，具有指导原核宿主细胞如细菌宿主细胞中重组DNA 分子的自主复制和染色体内维持的能力的DNA序列。这样的复制子是本领域公知的。此外，包括原核复制子的载体还可以包括其表达赋予可检测的或可选择的标记物如药物抗性的基因。典型的细菌药物抗性基因是赋予对氨苄青霉素或四环素的抗性的那些。
与真核细胞相容的表达载体，优选地与脊椎动物细胞相容的那些，也可以用于插入本发明的抗VEGF抗体编码序列以及表达抗VEGF抗体。真核细胞表达载体是本领域公知的，可以从一些商业来源获得。一般地，提供的这类载体含有用于插入期望的DNA区段的方便的限制位点。这样的载体可以提供启动子/增强子组合，用于抗VEGF抗体的组成型或可调节表达。此外，这样的载体可以包括在真核细胞中有效的转录终止子。
用于构建本发明的rDNA分子的真核细胞表达载体可以进一步包括在真核细胞中有效的可选择标记物，优选地药物抗性选择标记物。
根据本发明的实践，所述载体可以是含有本发明的抗VEGF抗体编码序列或其部分的质粒、粘粒、病毒载体或噬菌体载体。此外，本发明预期包含转染入适合的真核宿主细胞的质粒、粘粒、病毒载体或噬菌体载体的宿主- 载体系统。适合的真核宿主细胞的实例包括酵母细胞、植物细胞或动物细胞，例如哺乳动物细胞。所述宿主-载体系统对于生产抗VEGF抗体或其部分或变体是有用的。可选地，所述宿主细胞可以是原核的，例如本发明中提供的细菌细胞。
出于本发明的目的，可以使用现有的和本领域已知的许多载体。载体成分一般包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点 (RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。例如，所述核酸可以在pho A启动子的控制下表达。在一个实施方案中，所述pho A启动子包含SEQ ID NO：15中提供的核酸序列或其部分。pho A启动子可以在低磷酸盐条件(例如，低于0.05mM的磷酸盐浓度)下诱导以转录下游的核酸序列(例如，本发明的核酸序列)。
本发明的表达载体可以包含两个或更多个启动子-顺反子对，编码多肽成分的每一种。可选地，所述表达载体可以包含具有超过一个顺反子的一个启动子以编码超过一个多肽成分。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5') 的非翻译调节序列。原核启动子一般分为两种类型，诱导型和组成型的。诱导型启动子是响应于培养条件的改变如营养物的存在或缺乏或温度的变化而启动处于它控制下的顺反子的转录水平提高的启动子。
在本发明的一个实施方案中，诱导型启动子例如pho A启动子位于编码免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链或其部分或变体两者的核酸的上游并与之可操作地连接。低磷酸盐条件对pho A启动子的诱导引起下游核酸序列的转录和RNA转录本的产生，这在pho A启动子位于编码免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链两者的核酸的上游并与之可操作地连接的情况下，引起双顺反子mRNA的产生。在一个实施方案中，双顺反子mRNA的翻译引起免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的产生，如克隆#201的情况。
包含Fab 201编码序列(SEQ ID NO：16)并可以用于Fab 201的细菌表达的变体克隆#201(图17)根据布达佩斯条约的规定于2017年9月5日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.,Manassas，VA 20110-2209，并已给予ATCC保藏编号PTA-124435。
由各种潜在的宿主细胞识别的多种启动子是公知的。在某些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然的目标多肽启动子相比，它们一般允许被表达目标基因的更多转录和更高产量。除了来自宿主细胞或非宿主细胞的天然发生的启动子之外，病毒启动子和人造启动子是本领域已知的。在真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中，启动子与转录增强子组合使用。
转化的宿主细胞
本发明进一步了用编码抗VEGF抗体或其片段的核酸分子转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核的或真核的。对于表达抗VEGF抗体有用的真核细胞没有限制，只要所述细胞系与细胞培养方法相容，并与表达载体的增殖和抗VEGF抗体基因的表达相容。优选的真核宿主细胞包括但不限于酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，例如，来自小鼠、大鼠、猴或人类细胞系的那些。优选的脊椎动物细胞系包括但不限于CHO和HEK293。最优选的脊椎动物细胞系是批准用于生物学的制造或生产的那些。优选的原核宿主是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B.subtili)。
用本发明的rDNA分子转化、转染或转导合适的细胞宿主通过公知的方法来实现，其一般取决于所使用的载体的类型和采用的宿主系统。对于原核宿主细胞的转化，一般采用电穿孔和盐-热激处理方法，参见，例如，Cohen 等人，Proc Acad Sci USA(1972)69:2110；和Maniatis等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor， NY(1982)。此外，原核宿主细胞可以用包含编码本发明的抗VEGF抗体的核酸的噬菌体感染或转导。对于用含有rDNA的载体转染脊椎动物细胞，一般采用电穿孔、阳离子脂质和盐处理方法，参见，例如，Graham等人，Virol(1973) 52:456；Wigler等人，Proc Natl Acad Sci USA(1979)76:1373-76。此外，脊椎动物细胞可以用包含编码本发明的抗VEGF抗体的核酸的真核病毒颗粒感染或转导。这样的病毒颗粒可以是DNA或RNA病毒颗粒，可以包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒颗粒。
成功地转化、转染或转导的细胞，即，含有本发明的rDNA分子的细胞，可以通过公知的技术来鉴定。例如，由本发明的rDNA的导入产生的细胞可以进行克隆来产生单一的集落。可以收获来自这些集落的细胞、裂解、并使用例如Southern，J Mol Biol(1975)98:503，或Berent等人，Biotech(1985)3:208 描述的方法检查它们的DNA内容物中rDNA的存在，或通过免疫学方法分析细胞产生的蛋白质。可选地，可以通过本领域已知的高敏感性方法分析姐妹细胞(sister cells)中外源核酸的存在。所述转化、转染或转导的细胞还可以在标记物(药物可选择标记物、成像标记物或可检测标记物)的基础上进行分离或鉴定，所述标记物存在于导入所述细胞的同一核酸上，或存在于共同导入所述细胞的独立的核酸上。
适合于表达本发明的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如，革兰氏阴性或格兰氏阳性生物。有用细菌的实例包括埃希氏菌 (Escherichia)(例如，大肠杆菌)、芽胞杆菌属(Bacilli)(例如，枯草芽孢杆菌(B. subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。
抗体生产
制备抗体的各种方法是本领域公知的。例如，宿主细胞可以用上文描述的表达载体转化，并在对于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而视情况修改的常规营养培养基中培养。
转化意味着将DNA导入原核宿主中使得DNA是可复制的，作为染色体外的元件或通过染色体整合。取决于使用的宿主细胞，利用适合于这种细胞的标准技术进行转化。
用于生产本发明的多肽的原核细胞在本领域已知的、适合于选定宿主细胞的培养的培养基中生长。适合的培养基的实例包括添加必需的营养补充剂的Luria肉汤(LB)。
抗体纯化
可以采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下过程是适合的纯化过程的示范：在免疫亲和或离子交换柱上分级、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、反相HPLC、在二氧化硅或在阳离子交换树脂例如DEAE上层析、以及利用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
免疫缀合物
本发明还提供了免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，包含与细胞毒性或治疗试剂例如，化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性试剂(即，放射缀合物)缀合的任意的本发明的抗VEGF(包括，例如，本文描述的其部分或变体)。例如，所述治疗试剂包括但不限于抗肿瘤药物、细胞因子、第二抗体、或抗体的部分(例如，Fc)。进一步地，本发明提供了如下的实施方案，其中本发明的抗体与将前体药物转化为细胞毒性药物的酶连接。根据本发明的实践，所述抗体的部分可以选自由scFv、Fv、Fab、Fab' 和F(ab')2片段组成的组。
生长抑制试剂是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。生长抑制试剂的实例包括，阻断细胞周期发展的试剂，例如，标准的M-期阻断剂，其包括长春花类(vincas)(长春花新碱(vincristine)和长春花碱(vinblastine))、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，例如多柔比星、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷和博来霉素。其它适合的试剂包括，例如，DNA烷化剂，例如，他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、甲二氯二乙胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷(ara-C)。
本发明的抗体或其片段可以用可检测标记物来标记，从而产生免疫缀合物，例如，诊断性免疫缀合物。
所述免疫缀合物可以用于将第二分子靶向VEGF阳性细胞(Vitetta，E.S. 等人，1993，Immunotoxin therapy，DeVita，Jr.,V.T.等人编，Cancer:Principles and Practiceof Oncology，第4版，J.B.Lippincott Co.,Philadelphia，2624-2636)。
细胞毒性试剂的实例包括但不限于篦麻毒素(ricin)、篦麻毒素A-链、多柔比星、道诺霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春花新碱、长春花碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素(abrin)、相思豆毒素(abrin)A链、塑莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白(crotin)、加利车霉素、肥皂草抑制剂、美登素类和糖皮质激素，和其它化学治疗剂，以及放射性同位素，例如212Bi、131I、131In、90Y和186Re。适合的可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。抗体还可以缀合至能够将前体药物转化成它的活性形式的抗癌前体药物激活酶。
另外，包含本发明的任何单克隆抗体或重组抗体的抗原结合区的本发明的重组蛋白可以用于治疗癌症。在这样的情况下，重组蛋白的抗原结合区与具有治疗活性的第二蛋白质的至少功能活性部分连接。所述第二蛋白质可以包括但不限于酶、淋巴因子、制瘤素(oncostatin)或毒素。适合的毒素包括上文描述的那些。
将治疗试剂缀合或连接到的技术是公知的(参见，例如，Arnon等人， "MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编)，pp.243-56 (Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery"，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(编)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review"，Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编)，pp.475-506(1985)；和Thorpe等人，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"，Immunol.Rev.,62:119-58(1982))。本文进一步描述了VEGF抗体作用治疗试剂的用途。
分离其它抗VEGF抗体编码核酸分子的方法
本文描述的抗VEGF抗体编码核酸分子允许分离本发明的抗VEGF抗体的抗VEGF抗体同源物、选择性剪切的同种型、等位变体和突变体形式以及它们的编码序列和基因序列。
例如，可以合成本文描述的抗VEGF抗体编码序列的一部分，并用作探针来回收编码来自人类以外的生物体的抗VEGF抗体蛋白质家族的成员的 DNA，本文描述的人VEGF蛋白的等位变体，以及含有抗VEGF抗体基因的基因组序列。可以制备含有大约16-21个核苷酸(编码约5-7个氨基酸段 (stretch))的寡聚物(或寡核苷酸)，并用于筛选基因组DNA或cDNA文库，在严格条件或足够严格以除去过度水平的假阳性的条件下来获得杂交。特别感兴趣的寡聚物是编码本发明的抗VEGF抗体的高变区或互补决定区(CDR)的氨基酸序列的那些。所述寡聚物可以从本文描述的CDR序列或这样的CDR序列的一部分来制备。所述寡聚物可以由编码本文描述的CDR或其部分的氨基酸序列来制备，从而所述寡聚物或其互补物的翻译编码本文描述的CDR或其部分。
此外，可以制备寡核苷酸引物对用于聚合酶链式反应(PCR)，来选择性扩增/克隆抗VEGF抗体编码核酸分子或其片段。使用这类PCR引物的PCR变性/退火/延伸循环是本领域公知的，可以容易地适应于分离其它抗VEGF抗体编码核酸分子。
抗VEGF抗体编码序列的非人同源物、抗VEGF抗体编码序列的天然发生的等位变体、以及基因组的抗VEGF抗体编码序列，将在本文描述的抗体的CDR部分中与人源化抗VEGF抗体序列享有高度的同源性。一般地，这样的核酸分子将在严格条件下与人VEGF序列杂交。这样的序列一般将含有与人源化抗VEGF抗体编码序列至少70％的同源性、优选地至少80％、最优选地至少90％的同源性。
严格条件是：(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如，50℃下0.015M NaCl/0.0015M硝酸钠/0.1％SDS，或(2)在杂交过程中使用变性剂如甲酰胺，例如，50％(体积/体积)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，含750mM NaCl、75mM柠檬酸钠，42℃。
另一个实例是使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、 50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液，超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖、42℃，在0.2×SSC和0.1％SDS 中42℃洗涤。熟练的技术人员可以容易地确定和适当改变严格条件以获得清晰和可检测的杂交信号。
通过诱变CDR编码区或FR编码区并表征产生的抗体结合VEGF的能力，可以获得其它抗VEGF抗体编码核酸分子。对于FR编码区，除了编码参与链内二硫键形成的半胱氨酸、以及紧跟CDRH3的FRH4的氨基末端处保守的色氨酸的那些之外，邻近于CDR编码区的核苷酸可以是优选的诱变位点。
鉴定竞争性抑制抗体的分析
本发明的另一个方面涉及可以用于检测和鉴定其它抗VEGF抗体的分析和方法，所述其它抗VEGF抗体与由本发明的抗体识别和结合的表位相同的或重叠的表位结合。具体地，结合VEGF的抗VEGF抗体和其它试剂以及细胞成分可以通过抗VEGF抗体结合VEGF的能力和/或抑制/刺激VEGF活性的能力来鉴定。VEGF结合活性的分析可需要VEGF蛋白或其片段或其肽适用于高通量筛选方法。
可选地，对于VEGF蛋白的关键位置(任何本发明的抗体识别的)有免疫反应性的抗体可以从抗体文库中选择，例如，初始合成的Fab噬菌体展示文库。在初步筛选之后，可以进行CDR序列的聚焦诱变，使用有限的VEGF蛋白或VEGF蛋白的部分进行其它轮次的筛选，来选出具有期望的活性的改进的抗VEGF抗体(例如，VEGF的高亲和力抗体)。可以使用选定的噬菌体中存在的选定Fab序列进行其它轮次的诱变和筛选，直到得到期望的结果。
本发明的诊断用途
存在着多种本发明的诊断用途。例如，本发明提供了诊断受试者例如动物或人类受试者中与眼部VEGF过度产生相关的黄斑变性或视力损伤或损失 (实际的或潜在的)、或与VEGF蛋白的存在相关的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用本发明的抗体的任一种或组合定量地测定样品(例如，细胞或生物液体样品)中VEGF蛋白的量。然后这样测定的量可以与来自正常受试者的样品中的量进行比较。样品中可测量地不同的量(即，试验样品中VEGF的量超过来自正常样品的量)的存在表明黄斑变性或视力损伤或损失的存在或提高的风险、或癌症的存在。当试验样品中VEGF的量超过来自正常样品的量时，VEGF由细胞过量表达。
在另一实施方案中，诊断涉及利用本发明的核酸定量地测定来自所述受试者的样品中编码VEGF蛋白的RNA的量。如此测定的量可以与来自正常受试者的样品中的RNA的量进行比较。再一次地，可测量的不同量的存在指示黄斑变性或视力损伤或损失的存在或提高的风险、或癌症的存在。
进一步地，本发明提供了诊断受试者中赘生性或前赘生性病症的方法。这种方法包括从所述受试者获得组织的样品，使用上述方法检测VEGF的量和/或分布的差异，不同的可测量差异是这种赘生性或前赘生性病症的指示。
根据本发明的实践，本发明的抗体可以针对本发明的任意单克隆抗体所针对的表位。进一步地，所述组织切片可以来自膀胱、前列腺、骨、淋巴组织、胰腺、其它器官或肌肉。
进一步地，本发明提供了诊断与受试者的眼中过量VEGF的存在相关的黄斑变性或视力损伤或损失的方法。这种方法包括从所述受试者获得眼部组织或细胞的样品，使用上文的方法检测所述组织或细胞中VEGF的量的差异，不同的可测量的差异是与受试者的眼中过量VEGF的存在相关的黄斑变性或视力损伤或损失的指示。
本发明还提供了检测和定量地测定生物液体样品中VEGF的浓度的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在允许单克隆抗体附着到固相支持物的表面的条件下用与VEGF形成(优选地特异性形成)复合物的过量的本发明的一种或多种单克隆抗体接触固相支持物。所产生的单克隆抗体附着的固相支持物然后与生物液体样品接触，从而所述生物液体中的VEGF结合所述抗体并形成VEGF-抗体复合物。所述复合物可以直接或间接地用可检测标记物来标记。可选地，可以在形成所述复合物之前标记VEGF或所述抗体。然后可以检测和定量地测定所述复合物，从而检测和定量地测定所述生物液体样品中 VEGF的浓度。相对于正常对照的生物液体在所述样品中VEGF的高浓度是赘生性或前赘生性病症的指示。可选地，相对于正常对照的生物液体在所述样品中VEGF的高浓度是黄斑变性或视觉损伤或损失的存在或提高的风险的指示。在后者的情况下，所述生物液体获自眼睛。
根据本发明的实践，所述生物液体包括但不限于玻璃体液、组织提取物、尿液、血液、血清和痰。进一步地，可检测的标记物包括但不限于酶、生物素、荧光团、发色团、重金属、顺磁性同位素、或放射性同位素。
进一步地，本发明提供了诊断试剂盒，其包含识别并结合VEGF的本发明的抗体(抗VEGF抗体)；以及可检测标记与所述抗VEGF抗体的特异性结合伴侣(partner)的缀合物。根据本发明的实践，所述标记包括但不限于酶、放射性标记、发色团和荧光剂。
监视与VEGF相关的疾病进程的方法
另外，本发明提供了通过在各个时间点测量来自所述受试者的样品中 VEGF的量来监测受试者中黄斑变性或视力损伤、或癌症(例如，前列腺、前列腺癌的骨转移、膀胱、胰腺癌)或与VEGF相关的失调的进程。这是为了确定所述样品中VEGF量的改变，以确定所述改变是量上的小改变还是大改变，即，VEGF的过量表达。在一个实施方案中，所述方法包括定量地测定来自所述受试者的第一样品中VEGF蛋白的存在，并将如此测定的量与来自所述受试者的第二样品中存在的量进行比较，这些样品是在不同的时间点采集的，所测定的量的差异是黄斑变性或视力损伤或癌症的进程的指示。
在另一实施方案中，通过定量地测定来自所述受试者的第一样品中 VEGF RNA的存在，并将如此测定的量与来自所述受试者的第二样品中存在的量进行比较来进行监测，这些样品是在不同的时间点采集的，所测定的量的差异是黄斑变性或视力损伤或癌症(例如，前列腺、前列腺癌的骨转移、膀胱和胰腺癌)的进程的指示。
所述样品可以来自动物或人类。进一步地，所述样品可以是细胞样品。例如，使用本发明的方法，器官组织如眼组织或细胞、前列腺组织、膀胱组织、胰腺组织、神经内分泌组织和骨(癌可转移的任何组织，例如，淋巴结、肺、肝脏、胰腺)可以评估黄斑变性或视力损伤或损失的存在或提高的风险、或癌症或转移性病变的存在。可选地，所述样品可以是生物液体，例如，眼睛的细胞外液、玻璃体液、尿液、血清或血浆。
根据本发明的实践，检测可以通过涉及组织学、印迹、ELISA和ELIFA 的免疫学检测手段来实现。当所述样品是组织或细胞样品时，它可以进行福尔马林固定、石蜡包埋或冷冻的。
本发明另外提供了测定来自要试验的眼或赘生性组织的组织切片中 VEGF的数量和分布、相对于来自正常组织的组织切片中VEGF的量和分布的差异的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用与VEGF特异性形成复合物的本发明的单克隆抗体接触要试验的组织和正常组织两者，从而检测 VEGF的量和分布方面的差异。
癌症治疗和与VEGF相关的失调例如黄斑变性或与VEGF相关的眼病/失调的治疗
本发明提供了本发明的抗VEGF抗体，其可以例如全身地使用来治疗与 VEGF相关的疾病，例如，湿性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性斑丘疹病、增殖型糖尿病性视网膜病、视网膜静脉阻塞(RVO)中的黄斑水肿、虹膜新血管形成、病理性近视引起的脉络膜新生血管形成、成熟视网膜病、新生血管性青光眼和/或癌症。
靶向疾病细胞而不是周围的未患病细胞和组织的抗体是优选的。因而，本发明提供了治疗易患或患有表达VEGF抗原的疾病的患者的方法，包括向所述患者施用有效量的特异性结合VEGF蛋白的本发明的抗体。在另一个方法中，本发明提供了抑制表达VEGF的肿瘤细胞的生长的方法，包括以有效抑制所述肿瘤细胞的生长的量向患者施用特异性结合VEGF的抗体。本发明的VEGF mAb还可以用于选择性抑制表达VEGF抗原的细胞的生长或杀死表达VEGF抗原的细胞的方法，包括以足够抑制所述细胞生长或杀死所述细胞的量使本发明的VEGF抗体免疫缀合物或免疫毒素与所述细胞反应。
例如，未缀合的本发明的抗VEGF抗体(包括单克隆的、多克隆的、嵌合的、人源化的、完全人类的以及其片段(例如，重组蛋白))可以通过可包括补体介导的细胞溶解、抗体依赖性细胞的细胞毒性、改变VEGF的生理学功能、和/或抑制配体结合或信号转导途径的机制导入患者中，从而所述抗体结合疾病细胞上的VEGF并介导这种细胞(包括其破坏)以及肿瘤的生长抑制。除了未缀合的本发明的抗VEGF抗体、其片段和重组蛋白之外，与毒性试剂例如篦麻毒素缀合的抗VEGF抗体也可以治疗地用来将所述毒性试剂直接递送到带有VEGF的肿瘤细胞，从而破坏肿瘤。
例如，临床上应用本发明的单克隆抗体的一种方式是以未修饰的形式施用它们，使用显示了细胞抑制/杀伤活性(例如，ADCC和CDC活性)的本发明的单克隆抗体。在一个实施方案中，为了检测ADCC和CDC活性，可以试验本发明的抗VEGF抗体在4小时孵育期内对培养的51Cr标记的肿瘤靶细胞的裂解。靶细胞可以用51Cr标记，然后暴露于效应细胞(以通过使用淋巴细胞分离介质纯化的人类淋巴细胞的形式)和抗体的组合数小时(例如，4小时)，抗体以例如0.1μg/ml到10μg/ml间变化的浓度添加。可以测量51Cr从靶细胞的释放作为肿瘤细胞裂解(细胞毒性)的证据。可以测量可释放的51Cr的总量，ADCC 可以计算为与单独孵育靶细胞相比，用单克隆抗体加效应细胞观察到的靶细胞的杀伤百分比。
在本发明的方法的实践中，能够抑制在细胞表面表达VEGF的患病细胞生长的抗VEGF抗体以治疗有效量施用给患有本文描述的疾病的患者，所述患者的患病细胞表达或过量表达VEGF。本发明的抗VEGF mAb治疗方法可以提供在体内的显著的患病细胞生长抑制。本发明的抗体治疗方法可以与化学治疗、放射和/或其它治疗方案组合。
可以评估患者的患病细胞中VEGF过量表达的存在和水平，优选地使用患病组织的免疫组织化学评估、定量性VEGF成像、或能可靠地指示VEGF 表达的存在和程度的其它技术。为此细胞活检物或外科样本的免疫组织化学分析可以是优选的。患病组织的免疫组织化学分析的方法是本领域公知的。
本发明的方法预期施用单独的本发明的抗VEGF抗体，以及不同的单个抗VEGF抗体，例如识别不同表位的那些的组合或“混合物(cocktail)”。组合的这些mAb可以展现协同的治疗效果。此外，抗VEGF mAb的施用可以与包括但不限于各种细胞毒性试剂等其它治疗试剂组合。抗VEGF mAb可以以它们的未缀合形式施用，或可以有与它们缀合的治疗试剂。
在本发明的方法的实践中使用的抗VEGF单克隆抗体可以配制在包含适合于期望的递送方法的载体的药物组合物中。适合的载体包括任何材料，所述材料在与抗VEGF mAb组合时保持抗体的抗病功能并且与受试者的免疫系统是非反应性的。实例包括但不限于任意的多种标准药物载体，例如无菌的磷酸盐缓冲盐水溶液等。
本发明提供了各种方法，局部的或全身性的，用于将本发明的抗VEGF 抗体制剂施用到疾病部位。作为本领域中的标准操作，本发明的组合物可以以任何药学上可接受的形式施用给受试者。
潜在有效的施用途径包括但不限于，注射，例如，眼球内注射、静脉内、肌肉内、腹膜内、口服、吸入和皮下方法，以及通过可植入的泵、连续输注、基因治疗、脂质体、栓剂、局部接触、泡囊、胶囊、可生物降解的聚合物、水凝胶和控释贴片。配混有载体的本发明的组合物可以作为向疾病部位例如眼睛直接施用的无菌溶液进行包装。
根据本发明，施用本发明的组合物可以包括治疗有效量的本发明的组合物与一种或多种本发明的其它组合物的共同施用，例如，相伴地或顺序地。施用还可以包括试剂的连续释放(时间释放)，例如，所述试剂可以包埋在时间释放胶囊或其它连续释放材料中。
一般地，治疗可以涉及以有效剂量通过可接受的施用途径的方式施用本发明的抗VEGF抗体。剂量将取决于本领域技术人员一般理解的各种因素，包括但不限于疾病的类型以及疾病的严重度、级别或阶段，使用的本发明的抗VEGF抗体的结合亲和力和半衰期，患者中VEGF表达的程度，期望的稳态抗体浓度水平，治疗的频率，以及当使用时，与本发明的治疗方法组合的化学治疗剂的影响。典型的每日剂量可以从约0.1到100mg/kg。限定适当剂量的基础决定性因素是在特定的场景下治疗有效所必需的特定抗体的量。为实现疾病抑制或缓解，可需要重复的施用。
结合亲和力一般是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与它的结合伴侣 (例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文描述的那些。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的，其任意者可用于本发明的目的。
VEGF mAb的直接施用也是可行的，并可在某些场景下具有优势。例如，对于治疗黄斑变性，本发明的VEGF抗体可以直接注射到眼睛的黄斑区域。
本发明进一步提供了抑制在其细胞表面表达多种VEGF抗原的细胞的细胞活性(例如，细胞增殖、活化或增生)的方法。这种方法包括使本发明的免疫缀合物(例如，异源的或同质的混合物)与细胞反应，从而所述细胞表面上的VEGF抗原与所述免疫缀合物形成复合物。细胞表面上VEGF抗原的数量越大，形成的VEGF-抗体复合物的数量越大。VEGF-抗体复合物的量越大，细胞活性被抑制得越大。当细胞活性的抑制引起细胞抑制或死亡时，患有疾病例如赘生性或前赘生性病症的受试者可以根据这种方法治疗。
本发明进一步提供了通过阻断VEGF与它的受体或VEGF伴侣结合来抑制VEGF的生物学活性的方法。所述方法包括在允许VEGF-免疫缀合物或 VEGF-抗体复合物的条件下使一定数量的VEGF与本发明的抗体或免疫缀合物接触，从而阻断VEGF结合它的受体或VEGF伴侣并抑制VEGF的活性。
在另一实施方案中，本发明提供通过使本发明的任一免疫缀合物或免疫缀合物的组合以足够抑制细胞的量与所述细胞反应，来选择性抑制表达VEGF抗原的细胞的方法。这样的量包括杀死细胞的量或足以抑制细胞生长或增殖的量。如上文讨论的，剂量和给药方案将取决于与VEGF相关的要治疗的疾病或失调的性质，其群体，抗体所针对的位点，以及患者。
药物组合物
本发明提供了包含任意的本发明的新的抗VEGF抗体的组合物。用语“药学上可接受的载体”是指本领域技术人员已知的适合于特定施用方式的任何载体。此外，本发明的新的抗VEGF抗体可以配制为组合物中单独的药学活性成分，或可以与其它活性成分组合。
本文的组合物可以包含一种或多种本发明的新的抗VEGF抗体。在一个实施方案中，本发明的新的抗VEGF抗体配制成适合的药物制品，例如，在用于胃肠外施用的无菌溶液或悬浮液中。
在所述组合物中，一种或多种本发明的新的抗VEGF抗体的有效浓度可以与适合的药物载体混合。在所述组合物中本发明的抗VEGF抗体的量或浓度在施用时有效用于一定量的递送，所述量治疗、预防或改善要治疗的疾病或失调的一种或多种症状。
在一个实施方案中，治疗有效剂量可以产生约0.1ng/ml到约50-100μg/ml 的活性成分的血清浓度。在另一实施方案中，所述药物组合物可以提供每天每公斤体重约0.001mg到约2000mg化合物的剂量。制备药物剂量单位形式，可以提供每剂量单位形式约0.01mg、0.1mg或1mg到约500mg、1000mg或 2000mg的活性成分，在一个实施方案中约.5mg到约500mg的活性成分，或基本成分的组合。
在一个实施方案中，所述组合物包含抗VEGF抗体或其部分或变体、聚山梨酯20、蔗糖、氯化钠和缓冲液。在一个实施方案中，所述组合物包含磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲液具有5.0到6.0之间的pH。在另一实施方案中，所述组合物包含缓冲液(例如，组氨酸缓冲液)。在一个实施方案中，所述组氨酸缓冲液具有约5.0到6.5之间的pH(优选地约pH 6.0)。在另一实施方案中，所述组合物包含柠檬酸盐缓冲液。在另一实施方案中，所述组合物包含柠檬酸钠缓冲液。在一个实施方案中，所述柠檬酸钠缓冲液具有约5.0到6.5之间的pH(优选地约pH 6.0)。
在一个实施方案中，所述组合物包含浓度约2mg/ml到约100mg/ml的抗 VEGF抗体或其部分或变体。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度0.1％到0.04％的聚山梨酯20。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度1％到20％的蔗糖。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度10mM到80mM的氯化钠。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度10mM到100mM的磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度5mM到50mM的组氨酸缓冲液。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度5mM到20mM的柠檬酸钠缓冲液。
在一个实施方案中，所述组合物包含浓度约5mg/ml的抗VEGF抗体或其部分或变体、0.03％聚山梨酯20、5％蔗糖、40mM氯化钠和10mM磷酸盐缓冲液(pH 5.8)。在另一实施方案中，所述组合物包含浓度约5mg/ml的抗VEGF 抗体或其部分或变体、0.03％聚山梨酯20、5％蔗糖、40mM氯化钠和10mM 组氨酸缓冲液(pH 5.8)。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度约5mg/ml 的抗VEGF抗体或其部分或变体、0.03％聚山梨酯20、5％蔗糖、40mM氯化钠和10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)。
所述活性成分或试剂(即，本发明的新的抗VEGF抗体)可以立刻施用，或分成多个更小的剂量以一定时间间隔施用。要理解的是，治疗的精确剂量和持续时间是要治疗的疾病的函数，可以利用已知的试验方案，或根据体内或体外试验数据外推来经验性地确定。注意到，浓度和剂量值也可以随要减轻的状况的严重度而变化。要进一步理解的是，对于任何特定的受试者，应当根据个人需要和施用或指导所述组合物施用的人员的专业判断来随时间调整具体给药方案，在此阐述的浓度范围仅是示例性的，不意图限制要求保护的组合物的范围或实践。
在混合或添加活性试剂时，产生的混合物可以是溶液、悬浮液或乳剂等。产生的混合物的形式取决于多种因素，包括预期的施用方式以及活性试剂在选定的载体或运载体中的溶解度。
所述药物组合物以单位剂型提供给人类和动物施用，例如，含有适量的本发明的组合物或活性试剂的无菌的胃肠外溶液或悬浮液、以及可注射的溶液或悬浮液。注射剂、溶液和乳剂还含有一种或多种赋形剂。适合的赋形剂是，例如，聚山梨酯20、蔗糖、氯化钠、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。
液体的药学上可施用的组合物可以，例如，通过将上文限定的活性试剂和任选的药物佐剂溶解、分散或混合于载体或赋形剂如水、盐水、葡萄糖水、甘油、乙二醇、乙醇等中，从而形成溶液或悬浮液来制备。如果希望，要施用的药物组合物还可以含有微量的无毒辅助物质，例如，湿润剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲液等，例如，乙酸盐、柠檬酸钠、环状糊精衍生物、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯，以及其它这类试剂。
涵盖在本发明内的还有冻干粉，其可以重构用于作为溶液、乳剂和其它混合物来施用。用注射用水重构这种冻干粉提供了用于胃肠外施用的制剂。对于重构，冻干粉添加到无菌水或其它适合的载体中。精确的量取决于选定的化合物。这样的量可以经验性地确定。这些溶液，特别是那些用于眼科的溶液，可以用适当的盐配制为约0.01％至10％(体积％)的等渗溶液，，pH约5 至7。
试剂盒
根据本发明的另一方面，提供了试剂盒。根据本发明的试剂盒包括包含本发明的组合物的包装物。
用语“包装物”是指任何含有本文呈现的化合物或组合物的容器。在优选的实施方案，所述包装物可以是盒子或外包装。用于包装药物产品的包装材料是本领域技术人员公知的。药物包装材料的实例包括但不限于，泡罩包装 (blister pack)、瓶、管、吸入器、泵、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶，和适合于选定的制剂以及施用和治疗的预期方式的任何包装材料。
所述试剂盒还可以含有不容纳在所述包装物内、但附着在包装物之外的物品，例如，移液管。
试剂盒任选地可以含有用于向患有需要治疗的病症的受试者施用本发明的活性试剂或组合物的说明。试剂盒还可以包含对管理机构例如美国食品药品管理局对本文化合物的批准使用的说明。试剂盒任选地可以含有本化合物的标签或产品插页。所述包装物和/或任何产品插页本身可以是管理机构批准的。所述试剂盒可以包括包装物中处于固相或处于液相(例如，提供的缓冲液)中的活性试剂。所述试剂盒还可以包括缓冲液，其用于制备用于实施所述方法的溶液，以及用于将液体从一个容器转移到另一个容器的移液管。
所述试剂盒任选地还可以含有如本文描述的用于组合治疗的一种或多种其它组合物。在某些实施方案中，所述包装物是用于静脉内施用的容器。在其它实施方案中，化合物以可注射的方式提供。
本发明不受本文公开的实施方案的范围的限制，这些实施方案旨在作为本发明的各个方面的单一说明，并且任何在功能上等同的实施方案都在本发明的范围内。除了本文描述的那些之外，本发明的模型和方法的各种修改对于本领域技术人员而言将从前述说明和教导变得显而易见，并且类似地旨在落入本发明的范围内。在不脱离本发明的真实范围和精神的情况下，可以实施这些修改或其他实施方案。
实施例
实施例1：
针对VEGF的新的合成抗体的鉴定和分子表征
总体过程涉及利用噬菌体展示技术选择Fab，选择克隆，随后几轮亲和成熟用于选择具有最高结合亲和力的克隆。将获得的序列克隆入基于Pho A 的载体中，随后是在大肠杆菌中表达、蛋白质纯化和亲和力测定。详细的方案如下。
1.噬菌体展示技术
合成噬菌体文库的构建基于天然发生的抗体的结构和功能表征、噬菌体衣壳蛋白结构和组装、噬菌体生物学以及宿主细胞生物学。基于这样的知识，产生了在噬菌体表面展示合成的Fab抗体片段的传染性噬菌体。对于任何单一的Fab噬菌体展示文库，嵌合的Fab-噬菌体衣壳蛋白融合蛋白的合成的Fab 抗体片段部分可以具有特定的人类框架区(FR)或人类共有序列FR，具有各种序列或随机序列的互补决定区(CDR)环可以与之连接。由于CDR在结合抗原中起到关键作用，针对抗原例如VEGF筛选噬菌体，来鉴定结合VEGF的合成的Fab噬菌体，由此选出具有在结合VEGF中起作用的CDR的噬菌体。选定的 Fab噬菌体对VEGF结合的改进会需要选定CDR的定点诱变(directed mutagensis)以及进一步轮次的噬菌体选择。可选地，可以对FR序列进行定点诱变，除了参与链间二硫化物形成的半胱氨酸以及高度保守的氨基酸例如人类IgG1的重链FRH4的恒定的色氨酸之外，特别是对于邻近于CDR序列的氨基酸残基进行。
框架区或FR残基是与本文定义的高变区残基不同的那些可变域残基。由于高变残基或CDR序列的指定在用于鉴定CDR的Kabat方法或
方法之间可以不同，框架区的序列可以是不同的。具体地，Kabat命名法和
命名法之间的FR序列可以是相同的、重叠的、或在一个或另一个之内包含的。
受体人类框架区(对于CDR序列)包含衍生自人免疫球蛋白框架区、或衍生自人类共有框架区的VL或VH框架区的氨基酸序列。例如，使用Kabat命名法，重链可变区的人类框架区序列是：包含氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH1，包含氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH2，包含氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH3，和包含氨基酸位置110 的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的FRH4。
衍生自人免疫球蛋白框架或人类共有框架的受体人类框架区可以包含其相同的氨基酸序列，或可以含有氨基酸序列改变。优选地，存在或进行不超过5个、优选地4个以下、或3个以下的氨基酸改变。
例如，使用Kabat命名法，轻链可变区的人类框架区序列是：包含氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL1，包含氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL2，包含氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ ID NO：3)的 FRL3，和包含氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的FRL4。
在通过
方法对同样的Fab重链序列(SEQ ID NO：1)鉴定的框架区序列的情况下，
定义的重链可变区的框架区序列是：包含氨基酸位置 1的谷氨酸到氨基酸位置25的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的、IMGT定义的FRH1；包含氨基酸位置34的异亮氨酸到氨基酸位置50的酪氨酸(SEQ ID NO：1)的、 IMGT定义的FRH2；包含氨基酸位置59氨基酸位置酪氨酸到氨基酸位置96的半胱氨酸(SEQ ID NO：1)的、IMGT定义的FRH3，和包含氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸(SEQ ID NO：1)的、IMGT定义的FRH4。在通过
方法对同样的Fab轻链序列(SEQ ID NO：3)鉴定的框架区序列情况下；
定义的轻链可变区的框架区序列是：包含氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置26的丝氨酸(SEQ ID NO：3)的、IMGT定义的FRL1；包含氨基酸位置33的缬氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸(SEQ ID NO：3)的、IMGT 定义的FRL2；包含氨基酸位置53的谷氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸(SEQ IDNO：3)的、IMGT定义的FRL3；和包含氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸(SEQ ID NO：3)的、IMGT定义的FRL4。
在所述可变区中，FR和CDR的排布是：重链可变区为 FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4，轻链可变区为 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4。
在丝状噬菌体载体系统(例如M13噬菌体)、一种噬菌粒中构建Fab噬菌体展示文库，其含有抗体轻链的编码序列和融合到衣壳蛋白的Fab抗体片段重链的编码序列。一旦构建了文库，将它转化到大肠杆菌中，噬菌粒复制(利用dsDNA起点，例如colE1)并表达抗体轻链和抗体重链-衣壳蛋白融合蛋白。用辅助噬菌体(KO7)共感染，使用ssDNA起点，噬菌粒以单链DNA复制，包装到用来自噬菌粒的重链-衣壳融合蛋白和来自辅助噬菌体的野生型衣壳蛋白修饰的病毒粒中。通过该噬菌粒中的M13/f1噬菌体起点，辅助噬菌体提供了野生型衣壳蛋白合成以及复制/包装所需的遗传信息。
噬菌粒病毒粒从宿主细胞中排出，每个噬菌体颗粒展示唯一的抗体/Fab，其编码序列封装在所述噬菌体颗粒内。用VEGF蛋白攻击这些噬菌体颗粒，选择VEGF结合，通过感染它的细菌宿主细胞进行扩增，允许进一步的Fab 表征和Fab核酸序列的分离。
噬菌粒克隆进一步进行亲和成熟，其包括进一步调整抗原结合区中的氨基酸组合，制备文库，随后是噬菌体展示文库，筛选、富集并验证。几轮的亲和成熟可能是必需的，以得到具有期望亲和力的克隆。
从数十亿的Fab池中，在第一轮筛选了具有对期望的抗原蛋白的最高亲和力的少数结合体(～100个)。在随后的选择轮次中以抗原导向的方式进行克隆的进一步富集，从这100个中，我们找到了具有良好亲和力的最佳结合体 (～10个)。具有最佳亲和力(nM)的最好的克隆然后亚克隆到表达载体中，进行表达以筛选出具有最佳产量的克隆。选择具有良好亲和力和产量的克隆，基于应用，所述亲和力必须进一步改进至pM范围。
所有的Fab构建体的基础载体骨架是相同的。改变仅在CDR中。有3个这样的CDR区。L链CDR-L1、L2和L3，以及H链CDR-H1、H2和H3。改变这些 CDR之一或组合，以得到文库中数十亿的可能性。
2.基于Pho A的载体中Fab的克隆
2140bp的DNA构建体进行基因合成，这个构建体包含phoA启动子的序列、克隆#121的Fab编码序列(Fab-A5)和rrnB终止子。在EcoRI/NotI位点将构建体克隆到修饰的pBR322载体中以产生克隆#121。随后通过删除1454bp大小的tetR抗性基因修改克隆#121，产生克隆#131。
与第8位到第203位的氨基酸区域相应的Fab-F8.y的DNA序列进行基因合成，利用标准的克隆技术将该DNA片段置换到克隆#131中，产生克隆#201。要注意的是，除了在成熟κ轻链恒定区中的氨基酸123处的单个氨基酸改变，由克隆#201产生的Fab 201在氨基酸序列上与Fab FF03046-2是相同的，其中 Fab FF03046-2中的谷氨酸(参见图9C)改变为克隆#201中的丝氨酸(参见图16)。来自克隆#201的Fab变体#216具有成熟的κ轻链恒定区的氨基酸123处同样的丝氨酸(参见图16)，与例如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17中提供的、具有氨基末端分泌信号延伸的未加工的、翻译的κ轻链的氨基酸146相应。注意的是，Fab 216的可选的编码序列在图16中提供。抗VEGF Fab 201和抗VEGF Fab 216的表达质粒的示意图在图17和18中提供。
3.重组Fab的转化与表达
重组Fab的转化在大肠杆菌Dh5α和BL21中进行。
甘油原液复活(Glycerol Stock Revival)
-80℃的甘油小瓶在冰上解冻10分钟。50μL 100mg/ml的羧苄青霉素或 100mg/ml的氨苄青霉素添加到50ml的Luria肉汤(LB)中。取7μL解冻的甘油原液培养物，接种在具有抗生素的50ml LB肉汤中。该培养物在37℃和210rpm 下在温箱摇床上生长过夜。
质粒分离
取5ml过夜生长的培养物，使用Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit(目录编号：27104)分离质粒。
感受态细胞制备：
来自冷冻原液的细菌与足够的抗生素(羧苄青霉素/氨苄青霉素)一起铺板。挑取单一菌落，细胞在具有抗生素的LB中生长直到600nm下的OD达到 0.4-0.6。培养物在4℃下以4000g旋转沉降。将沉淀重悬在4℃下1/20体积的 TSB中。细胞在冰上孵育10分钟，添加10％无菌甘油终浓度。细胞等分到单独的试管中(100μL的细胞)，在液氮或干冰中冷冻。试管保存在-80℃下。
转化
稀释的DNA与10μl的1×KCM在1.5mL试管中混合。试管在冰上冷却2-5 分钟，之后添加同体积的感受态细胞(10μL)。试管进一步在冰上孵育20分钟，然后在室温下孵育10分钟。添加200μL具有分解代谢抑制剂的Super Optimal Broth(SOC)或LB培养基(ThermoFisher)，通过在37℃下摇动1小时容许细胞恢复。取100-200μL上述培养物，在37℃下在具有足够抗生素(羧苄青霉素/氨苄青霉素)的LB琼脂平板上生长过夜。
来自转化体的主细胞库制备
制备预接种物(LB培养基,pH 7.0,10mL+10μl羧苄青霉素，来自 100mg/ml原液)。培养物在37℃/210rpm下生长过夜。1mL过夜生长的培养物在100mL新鲜的LB培养基(100mLLB培养基,pH 7.0+100μl羧苄青霉素，来自100mg/ml原液)中传代培养。培养物在37℃/210rpm下生长直到OD600达到0.4至0.6之间。培养物在无菌条件下在4000rpm下旋转。在无菌条件下，沉淀重悬在60:40比例的(生长培养物：甘油)6mL无菌LB培养基pH 7.0+4mL 50％无菌甘油中。制备多个甘油原液，首先保存在-20℃，然后转移到-80℃。周期性地复苏甘油原液。
预接种物制备：
从LB琼脂平板上挑取大肠杆菌BL21中新转化的201的单一菌落。大肠杆菌BL21-201接种在含有羧苄青霉素抗生素(10μL)的LB肉汤(10mL)中。该培养物在37℃和210rpm下在轨道摇床上保持16小时。16小时后检查培养物在 600nM下的OD。
基本培养基中的生长和诱导：
制备500mL的生长和生产培养基。培养基pH调节到7.0。在接种之前，添加500μL羧苄青霉素(来自100mg/mL原液)、500μL硫胺素HCL(来自1M无菌原液)、2.5mL无菌葡萄糖(来自40％无菌原液)和320μL磷酸钾(来自1M KH2PO4)。用8％的过夜生长的培养物(预接种物)接种该生长培养基。同时地检查生长培养基中的培养物的初始OD(600nm)、葡萄糖浓度和磷酸盐浓度。培养烧瓶保持在37℃、210rpm的轨道摇床中，直到OD达到2-2.5之间。检查OD(600nM)以估计生长培养基中培养物的葡萄糖浓度和磷酸盐浓度。培养物在400rpm、+25℃下旋转15分钟。将细胞沉淀在无菌条件下洗涤并以4000rpm 旋转15分钟。细胞沉淀重悬在具有低磷酸盐浓度(0.064mM工作浓度)的 500mL生产培养基中。将生产用培养烧瓶保持在30℃、210rpm下20小时。同时地，分析生产培养基中培养物的OD(600nm)、WCW、DCW、葡萄糖和磷酸盐浓度。表达的培养物在+4℃下4300g旋转30分钟。
Fab的纯化
从100ml培养物提取蛋白质之后的过程
使用含有140mM氯化钠和1mM苯基甲烷磺酰氟(PMSF)的20mM磷酸盐缓冲液进行细菌沉淀裂解。对于来自100ml培养物的20g沉淀，使用4L裂解缓冲液。使用2L裂解缓冲液进行沉淀洗涤，其中悬浮沉淀并在4,300g、4℃下离心15分钟。沉淀然后悬浮在4℃下的2L裂解缓冲液中，在65℃水浴下预热5 分钟。在短暂混合步骤之后，以0.1％的比例添加Triton X100并混合5分钟。悬浮液然后转移到水浴中，在65℃维持40分钟，之后在冰上冷却溶胞产物。
通过在4,300g下离心溶胞产物10分钟来进行沉淀的澄清，并在4℃下 17,000g持续30分钟进一步澄清上清液。最终的上清液通过0.45μm PES膜滤器进行过滤。滤液通过Capto L(GE)亲和层析纯化，其中fab用含有2％蔗糖、pH 2.0的0.2M甘氨酸-HCl缓冲液洗脱。洗脱的fab立即用pH 8.8的1.5M Tris-Cl缓冲液中和。中和的fab用pH 6.0的20mM磷酸盐缓冲液交换，随后通过Cellufme ET Clean L树脂脱除内毒素。通过Bradford测定法定量地、以及使用银染色通过还原和非还原SDS-PAGE定性地分析纯化的级分，使用ELISA分析活性蛋白。使用Thermo Scientific Pierce LAL试剂盒分析内毒素的水平。
用于通过Bradford法定量的BSA标准曲线(图1)如下进行。连续稀释BSA 样品，以获得50μg/ml至500μg/ml的浓度范围。简要地说，对于所述分析，10μL 的每种标准物与工作Bradford试剂混合，在室温下孵育5分钟，在多板读取器上在595nM下测量吸光度。
表1：用于绘制图1中标准曲线的表格
| BSA浓度μg/mL | OD595 |
| 50 | 0.07 |
| 100 | 0.14 |
| 250 | 0.26 |
| 375 | 0.39 |
| 500 | 0.53 |
纯化的Fab的产量定量和活性测定
用于来自摇瓶中表达的克隆的Fab与纯化之后的Fab的产量定量。制备 Lucentis的标准曲线，用于测定细胞溶胞产物中Fab的浓度以及柱层析(蛋白质纯化)之后的洗脱物中的Fab浓度。
定量性ELISA方案
制备缓冲液(洗涤缓冲液(PT)、稀释缓冲液(PBT)和封闭缓冲液)。VEGF-121(分离VEGF-A121)以50ng/100μl每孔的终浓度用于包被Nunc 96孔 MaxiSorp平板，PBS中持续2小时，轻微摇动。从包被的平板中除去hVEGF。添加200μL的封闭缓冲液，在室温下轻微摇动孵育平板1小时。通过倾倒在滤纸上除去封闭缓冲液，用200μl洗涤缓冲液洗涤板3次。从20μg/mL的储备溶液中，将
(雷珠单抗；Novartis和Roche)在稀释缓冲液中稀释至500ng/ml。使用500ng/ml稀释的
进行一系列
连续稀释，以获得200ng/ml，100ng/ml，...，0.39ng/ml的稀释的
100μl连续稀释的
一式三份加入孔中，在RT下轻微摇动将平板孵育1小时。倒出平板的孔中的溶液，用200μl洗涤缓冲液洗涤平板3次。加入100μl抗κ轻链抗体-HRP缀合物(在稀释缓冲液中1：5000)并在室温下孵育1小时。平板用洗涤缓冲液洗涤3次并用PBS洗涤2次，并倾倒在滤纸上以完全除去缓冲液。向各孔中加入100μl TMB底物，使比色反应显影5分钟。加入100μl 1N硫酸终止反应。在多模平板读数器中在450nm下读板。对于未知样品，进行几次稀释，并使用标准曲线外推该值(图2和表2)。
表2：用于绘制图2中的标准曲线(定量性ELISA)的值
| 浓度ng/ml | OD-450nm |
| 0 | 0 |
| 0.244 | 0.09 |
| 0.488 | 0.18 |
| 0.976 | 0.38 |
| 1.952 | 0.69 |
| 3.904 | 1.41 |
| 7.808 | 2.75 |
亲和力分析
亲和力分析的步骤如下。制备缓冲液(洗涤缓冲液(PBST)、稀释缓冲液 (PBT)、封闭缓冲液和终止缓冲液)。将Nunc 384孔板的孔用PBS中的hVEGF 以终浓度为50ng/25μl每孔在150rpm、室温下包被2小时。两小时之后，从包被的平板上除去hVEGF。加入75μl封闭缓冲液并以200rpm、室温下温和摇动孵育1小时。除去封闭缓冲液，用75μl PBST洗涤板6次，并在薄纸巾上轻拍干燥。与此同时，在不粘平板/Eppendorf中，制备PBT中的hVEGF起始浓度2X(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM...)，使得VEGF X的终浓度是50nM、 25nM、12.5nM、6.25nM...。在PBT中制备200pM Lucentis(2X)Fab，使得最终X浓度是100pM。将50μL 100pMhVEGF(2X)(100nM、50nM、25nM、12.5nM、 6.25nM...)与50μl 200pM Lucentis(2x)混合，使得最终浓度X为(50nM、25nM、 12.5nM、6.25nM......)，并以200rpm、室温下轻微摇动孵育1小时。Fab分子也遵循类似的步骤。25μL这种连续稀释的hVEGF/Fab混合物添加到平板中，在200rpm、室温下轻微摇动孵育30分钟。除去未固定在平板上的一抗，用 75μL的PBST洗涤平板6次，在薄纸巾上轻拍干燥。添加25μL抗κ轻链 HRP(PBT中1:5000)，在200rpm室温下轻微摇动孵育45分钟。除去未固定在平板上的二抗，用每孔中75μL的PBST洗涤平板6次，用PBS洗涤2次，在薄纸巾上轻拍干燥。添加25μL的TMB底物，在200rpm、室温下轻微摇动孵育5 分钟。向板中加入2 5μl 1N硫酸以终止反应。在多模平板读数器中在450nm 处读取平板(参见图3和表3)。
表3
Fab ID 雷珠单抗 Fab 201
Kd(pM) 475±36 110±14
利用hVEGF-165
ELISA人类VEGF免疫分析试剂盒(R&D Systems，Inc.)的竞争性-ELISA
简要地说，如附图的图例中描述的，10pM的hVEGF-165与抗VEGF抗体的连续稀释物孵育。如
ELISA人VEGF免疫分析(R&D Systems， Inc.；目录编号：SVE00)提供的，在结合溶液中预形成的hVEGF-165/抗VEGF 抗体复合物以及任何未结合的hVEGF-165转移到包被有特异于人VEGF的单克隆抗体的96孔聚苯乙烯微量培养板中。如
分析试剂盒中提供的，使用与辣根过氧化酶缀合的多克隆抗hVEGF抗体和四甲基联苯胺作为色原检测与平板结合的hVEGF-165，来定量与平板结合的hVEGF-165。使用Prism 软件用5参数不对称模型拟合数据，从数据中计算Kd。
以下是启动子-phoA、Fab-F8.y和终止子-rrnB的编码序列。
启动子-phoA
GACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCG ATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTT ATTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTG TCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTAACTAGT ACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATGTAGAGGTTGAGGTGATTTT(SEQ ID NO:15)
Fab-F8.y的编码序列
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACA AATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGT GGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTA GCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCAT CCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGAT TTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCA GCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCA AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAG GCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCC CTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAA AAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGC TCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCT TATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACT GCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTG GGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGC CTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCC TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(SEQ ID NO:16)
终止子-rrnB
CGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACATCCATGCGTTAACGCGAGAGTAGGGA ACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGGAAGACTGGGCCTTTCGTT TTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCG GATTTGAACGTTGTGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCAT AAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTT (SEQ ID NO:19)
pBR322(GenBank登录号No:J01749.1)从核苷酸位置1353到4361的核酸序列，其中pBR322的四环素抗性基因已删除
GAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGC AGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGA TCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAG CAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGT CTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTG GAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGAT GCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGA CCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCA CAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCT CTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGG CATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAG CCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCA GACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGC GCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTC ACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAG CGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACC ATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCG CTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGC GGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAAC GCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAG GCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAA TCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCG TTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGA TACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGT AGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACC CCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACC CGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAG AGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGC TACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGG AAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGT TTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATC CTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGG ATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAA ATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACC AATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATA GTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGG CCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAG CAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATC CGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAG TTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCG TCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATG ATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA GAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCT CTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAA GTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACAC GGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACG TTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGT AACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTG GGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACAC GGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGG GTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATA GGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTAT TATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAG AATTC
实施例2
第一代抗VEGF Fab选择—初始抗体文库选择以及选定的Fab的交叉-物种反应性和特异性。
针对来自Preprotech的重组人类血管内皮生长因子(hVEGF)121(目录编号100-20A)选择抗体片段(Fab)噬菌体文库F(H.Persson，等人，J Mol Biol， vol.425，no.4，pp.803-811，2013)。针对与来自Preprotech的小鼠 VEGF(mVEGF)(目录编号450-32)的结合和对hVEGF的结合、以及针对与抗体可结晶片段(Fc)和对牛血清白蛋白(BSA)的结合的缺失，来筛选Fab。选出总共7个Fab，它们中的6个(称为FF0124-1、FF0124-3、FF0124-4、FF0124-5、 FF0124-6和FF0124-7)与hVEGF和mVEGF都结合，并且不结合Fc和BSA。这些Fab对hVEGF的亲和力通过Fab-ELISA(图4)来评估。
Fab阻断hVEGF结合hVEGF受体FLT的能力以及亲和力排序。
FLT是VEGF的天然受体之一。当与FLT预孵育时，6个Fab较少地结合 hVEGF(图5)，这表明6个Fab与FLT有处在hVEGF上的重叠结合位点，以及它们有潜能抑制FLT与hVEGF的结合。基于FF0124-1、FF0124-3、FF0124-4、 FF0124-6和FF0124-7序列，五个Fab用作模板来构建文库。针对与hVEGF的更高亲和力选择这些文库。
第二代抗VEGF Fab选择—第一代抗VEGF抗体的亲和成熟。
下一代文库基于Fab FF0124-1、FF0124-3、FF0124-4、FF0124-6和FF0124-7。每个文库的多样性在1×109至4×109的范围内。如早先描述的将五个文库集中(总共1010种多样性)并生产。然后选择集中的Fab噬菌体文库，根据它们的估计的亲和力排序的选定克隆的序列在图6中报告。基于10nM单点竞争性ELISA，Fab FF0158-C4、FF0158-F11和FF0158-C11以最低的亲和力结合hVEGF。如早先描述的，在细菌中作为可溶蛋白生产这些。在溶液中对hVEGF的亲和力通过竞争性Fab-ELISA来测量(图7)。
FF0158-C4和C11的生产的产量比通常观察到的低5至10倍。为了鉴定哪个氨基酸位置导致生产产量的这种降低，我们用高产量Fab、抗麦芽糖结合蛋白(MBP)抗体的CDR序列替换了FF0158-C4和FF0158-C11 CDR序列的每一个。CDR-H1和CDR-H2当突变回抗MBP FabCDR的相应序列时都将 FF0158-C4生产的产量恢复到正常水平。
第三代抗VEGF Fab-第二代抗VEGF抗体的亲和成熟和产量改进
由于CDR-H1或CDR-H2的突变可以改进FF0158-C4的生产产量，我们产生了多样性集中于CDR-H1和CDR-H2的两个不同的文库。使用处于重链与 pIII编码序列之间pTac启动子和amber终止从抗MBP Fab噬菌粒构建文库。在这种形式下，当在Amber抑制型细菌菌株中表达时，Fab展示在噬菌体上，当在非Amber抑制型细菌菌株中表达时以可溶形式分泌。针对亲和力选择噬菌体展示的Fab，针对蛋白质产量筛选分泌的Fab。
为了产生展示Fab的噬菌体颗粒，将通过SR320电穿孔之后产生的噬菌体感染到amber终止型抑制菌株OmnimaxTM(Thermo Fisher Scientific)中。针对与 hVEGF-121的结合选择9×109多样性的文库，针对小规模细菌培养中生产产量的改进来筛选克隆。有趣地，具有最大产量改进的两个Fab(Fab FF0188-H5/FF01088-B10和FF0188-F12)带有重链CDR-H1中苯丙氨酸到组氨酸的氨基酸突变(按照
编号定义的)。在位置31处(FabFF0188-A9和 FF0188-A2))的苯丙氨酸残基不产生大的产量改进(分别为2倍和3倍改进)，如图7所示。所有三个Fab FF0158-C4、FF0188-F12和FF0188-H5的热稳定性是相同的：74.5℃。
第四代抗VEGF Fab-第三代抗VEGF抗体的亲和成熟和产量改进
为了亲和力改进所述产量改进的抗VEGF Fab FF0188-H5，我们使用 FF0188 H5序列作为模板设计了新的文库。多样化的CDR中的终止密码子添加到模板中，以限制两个文库中亲本序列的数量。
文库的多样性是6×109。在amber抑制型菌株OmnimaxTM中扩增噬菌体文库，以能够产生噬菌体展示的Fab。然后针对hVEGF-121选择文库，通过单点竞争性噬菌体-ELISA筛选64个选定克隆。在1nM hVEGF竞争之后显示最低的残余结合的20个克隆进行测序和表征(图8显示了9个独特克隆的序列和进一步的表征)。FF0117-A5具有5.4mg每升的产量，对hVEGF的80+/-40pM 的亲和力，77℃的Tm。FF0117-A5就亲和力和热稳定性而言优于雷珠单抗：竞争性Fab-ELISA中FF0117-A5的亲和力比雷珠单抗高4-15倍，而FF0117-A5 的Tm高3.5℃。
第五代抗VEGF Fab-第四代抗VEGF抗体的亲和成熟
为了进一步亲和力改进抗VEGF Fab FF0117-A5，我们用FF0117-A5的序列作为模板设计了新的文库：对FF0117-A5进行突变以在CDR-L1和CDR-L2 中导入终止密码子，并修饰编码Fab的HC的C-末端的序列，以容许单价的展示而不是二价的展示。文库多样性是6×109。1010个噬菌体颗粒用于感染 500mL的amber抑制型菌株OmnimaxTM培养物，来产生Fab展示噬菌体颗粒。
选择文库FF01159-1，将显示对hVEGF的结合的Fab-噬菌体克隆进行测序，并作为可溶Fab来生产(图9)。由于文库FF01159-1设计为具有靠近 CDR-L2(Kabat)末端的一个残基的缺失，选出的Fab FF03033-4和FF03033-8 进行突变以在缺失位置处重新导入先前缺失的酪氨酸残基。产生的Fab命名为FF03046-1和FF03046-2。Fab FF03046-2 CDR序列、热稳定性、产品产率和对hVEGF的结合亲和力在图9中显示。FF03046-2 Fab阻断hVEGF依赖性人血管内皮细胞(HUVEC)增殖的能力在图10中报告。在HUVEC增殖分析中使用260pM的hVEGF-165。FF03046-2的EC50(200pM+/-10pM)低于分析中使用的hVEGF-165的浓度，表明FF03046-2的EC50实际上可能被这一HUVEC分析低估了。还测量了溶液中FF03046-2 Fab对hVEGF的亲和力。使用hVEGF-165 并用Quantikine分析进行检测。这允许我们将hVEGF的工作浓度降低到 5pM(图11)。在这项分析中，FF03046-2对hVEGF-165的亲和力远低于雷珠单抗(90pM+/-20pM对比390pM+/-50pM)。
抗VEGF scFv和Fab的C-末端Fc融合
然后我们将FF03046-2的scFv或Fab版本融合到人Fc的C-末端。我们预计融合蛋白具有更慢的清除、更高的亲和力，因为它们用与Fc的C-末端融合的每一个Fab/scFv夹持单个VEGF分子的能力。这有利于多特异性实体的产生，因为Fc的N-末端可以与scFv或Fab融合以结合其它目标蛋白质。
Fab和scFv Fc融合物的序列分别在图12和13中显示。与其它抗VEGF蛋白相比Fab和scFv融合物对hVEGF-165的亲和力在图14中显示。FF03077-4和 FF03092-1对hVEGF的亲和力类似于Fab FF03046-2的亲和力。Fab FF0346-2 的全长IgG版本(FF03092-3)的序列在图15中显示。
合起来，FF03092-1、FF03077-4和FF03046-2是三种不同的抗VEGF实体，它们可以具有不同的药物动力学特征，其可以转变为不同的体内效力。为了进一步改进FF03046-2的溶解度和生产产量，设计了几个变体(例如，实施例3 中显示的序列)以试验生产产量、溶解度和hVEGF结合亲和力。
实施例3：
Y变体的序列
变体201
变体202
变体203
变体204
变体205
变体206
变体207
变体208
变体209
变体212
变体213
变体214
变体215
变体216
变体217
变体218
变体219
变体220
上文Y变体的核酸序列编码的免疫球蛋白轻链和重链片段在图4、6-9和 12-16中显示，CDR由Kabat或
命名法定义。
如下文表4中所示，基于克隆#201产生的Fab的Fab变体显示了对 VEGF-165的多样的结合亲和力。变体中的两种(SI.No.3和9)显示了与克隆 #201的起始Fab相比对人类VEGF-165同种型的更高的亲和力，表明可以获得 Fab对VEGF的Kd方面的进一步改进，这两种变体具有约12pM和14pM的Kd 值。
衍生自克隆#201的诱变的Fab变体216具有重链CDR1序列(按照
方法定义的)中苯丙氨酸到天冬氨酸残基的单个氨基酸改变，从而来自克隆 #201的Fab 201的CDR-H1的GFDLFHYS变为Fab变体216的CDR-H1的 GFDLDHYS。如图19和20以及表4中显示，与亲本Fab 201相比，Fab 216中苯丙氨酸到天冬氨酸改变的存在稍微降低了它对VEGF的结合亲和力(Kd为 Fab 216的大约35±4pM，对比Fab 201的25±2pM，参见表4))，但是如Fab 201 一样，Fab 216的解离常数Kd比Lucentis的Kd小约5-16倍(参见图19和20)。
表4：克隆#201变体的Kd值
Y变体的序列比对在下文表5a-d中显示。
表5a
变体201-220的轻链的多序列比对在右手列中显示。(根据
定义的CDR序列是加下划线的)
表5b
变体201-220的重链的多序列比对在右手列中显示。(根据
定义的CDR序列是加下划线的)
表5c
变体201-220的轻链的多序列比对在右手列中显示。(根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的)
表5d
重链的多序列比对
(根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的)
实施例4：
制剂1包含以下赋形剂。0.03％的聚山梨酯20、5％的蔗糖、40mM的氯化钠、10mM的磷酸盐缓冲液，pH 5.8。在可选的实施方案中，可以使用范围约0.1％至0.04％的聚山梨酯20。进一步地，可以使用范围约1％至约20％的蔗糖。可以使用范围约10mM至约80mM的氯化钠。可以使用范围约10mM至约 100mM的磷酸盐缓冲液。同时，pH可以在约5至6的范围内。
制剂2包含以下赋形剂。0.03％的聚山梨酯20、0.05％的蔗糖、40mM的氯化钠、10mM的组氨酸缓冲液，pH 5.5。在可选的实施方案中，可以使用范围约1％至约20％的聚山梨酯20。进一步地，可以使用范围约1至约20％的蔗糖。可以使用范围约10mM至约80mM的氯化钠。可以使用范围约5mM至约50mM的组氨酸缓冲液。同时，pH可以在约5至5.5的范围内。
制剂3包含以下赋形剂。0.03％的聚山梨酯20、0.05％的蔗糖、40mM的氯化钠、10mM的柠檬酸钠缓冲液，pH 5。在可选的实施方案中，可以使用范围约0.1％至0.04％的聚山梨酯20。进一步地，可以使用范围约1％至约20％的蔗糖。可以使用范围约10mM至约80mM的氯化钠。可以使用范围约5mM 至约20mM的柠檬酸钠缓冲液。同时，pH可以在约5至5.5的范围内。
实施例5：
变体201生物化学说明
变体201是包含图23和24中显示的人类抗VEGF可变域的Fab抗体，起初作为融合蛋白(SEQ ID NO：16)产生，之后加工除去23氨基末端分泌信号，从而产生成熟的Fab 201抗体片段，具有图23中提供的重链可变区-CH1结构域和部分铰链区，以及图24中提供的κ轻链可变区-κ轻链恒定区。与其它已知的抗VEGF抗体如Lucentis相比，变体201的可变域含有多个突变(图23和24)，特别是在Kabat命名法或者
命名法定义的CDR中。这些突变为变体201 赋予了对VEGF的更强的结合(图3)。
实施例6：
针对VEGF的合成抗体的上游加工信息
通过KCM方法抗VEGF Fab-201构建体在大肠杆菌BL21中的转化
抗VEGF Fab DNA构建体与10μL的1×KCM混合，在冰上预冷2-5分钟，之后添加同体积的感受态细胞(10μL)。试管进一步在冰上孵育20分钟，然后在室温下孵育10分钟。添加200μL具有分解代谢抑制剂的Super Optimal Broth(SOC)，细胞在37℃下在轨道摇床中孵育1小时。100μL的上述培养物平铺在具有足够的抗生素(羧苄青霉素)的LB琼脂平板中，在37℃下孵育平板14 小时。
抗VEGF Fab-201在摇瓶培养中的表达
预接种物制备：
将来自大肠杆菌BL21-201的冷冻工作细胞库的10μL接种在10ml含有羧苄青霉素抗生素(10μL来自100mg/ml原液)的无菌LB肉汤中。在37℃和 210rpm下在轨道摇床上孵育该培养物16小时(过夜)。
基本培养基中的生长和诱导：
制备表5中提及的用于生长和生产的基本盐培养基。培养基的pH调节到 7.0±0.3。生长和生产培养基在121℃和15psi下高压灭菌15分钟。
在接种之前，添加500μL羧苄青霉素(来自100mg/ml原液)、500μL硫胺素 HCL(来自1M无菌原液)、2.5mL无菌葡萄糖(来自40％无菌原液)和320μL磷酸钾(来自1M KH2PO4)。将8％的过夜生长的培养物(预接种物)转移到生长培养基中。测量生长培养基中的起始OD(600nM)、葡萄糖浓度和磷酸盐浓度。
培养烧瓶在37℃、210rpm下孵育7-8小时(直到OD达到2-2.5之间)。检查8 小时生长之后生长培养基中的OD(600nm)、葡萄糖浓度和磷酸盐浓度。在 4000rpm、+30℃下旋转培养物15分钟。用基本培养基(没有磷酸盐)洗涤细胞沉淀，再次在4000rpm下旋转15分钟。慢慢地倒出上清液。在具有低磷酸盐浓度的500mL生产培养基中悬浮细胞沉淀。培养烧瓶在30℃、210rpm下孵育 16小时。检查收获的培养物的OD(600nM)、葡萄糖浓度和磷酸盐浓度。表达的培养物在4300G、+4℃下旋转30分钟。通过SDS-PAGE检查抗VEGF Fab表达，通过ELISA定量表达水平。
抗VEGF Fab-201在2.5L发酵盐培养基中的表达
在2.5L发酵器中的表达：
使用3.7L发酵器中的发酵过程大规模生产抗VEGF抗体。
预接种物制备：
对于每个2.5L发酵，将20μL的大肠杆菌BL21-201冷冻工作细胞库接种到含有羧苄青霉素抗生素(250μL来自100mg/ml原液)的250ml无菌LB肉汤中。培养烧瓶在37℃和210rpm下在轨道摇床上孵育16小时(过夜)。
基本盐培养基中的高细胞密度发酵：
制备用于2.5L发酵培养的基本盐培养基。通过氢氧化铵(25％)调整培养基的pH到7.0±0.3。该基本盐培养基在3.7L发酵器中在121℃和15psi下灭菌20 分钟。
在接种之前，添加2.5mL羧苄青霉素(来自100mg/ml原液)、2.5mL硫胺素 HCL(来自1M无菌原液)、2.5mL痕量元素、300μl L-61防沫剂和100mL无菌葡萄糖溶液(含有40g葡萄糖)。在接种物转移之前校准并设置DO水平为100％。在DO校准之后，将10％(250mL)过夜生长的培养物(接种物)转移到发酵器培养基中。检查发酵培养基中的培养物的初始OD(600nm)、葡萄糖浓度和磷酸盐浓度。
在37℃、3lpm空气流动下进行发酵，通过氢氧化铵(25％)将pH控制在 7.0±0.3。发酵器的背压维持在0.5巴表压，搅动速率设置为500rpm。通过将搅动从500rpm提高到1200rpm(以逐步的方式提高搅动)和通过保持发酵器中的背压，将最小DO水平维持在30％。培养物OD(600nm)在12小时内达到18±2，此时开始基于计算机的给料以实现高细胞密度培养。浓缩料含有葡萄糖(450 g)、25ml的1M硫酸镁、25ml的20×盐培养基、和50ml的1M磷酸钾。将浓缩料添加到发酵器中，以1ml/分钟的流速开始持续18小时。当发酵器培养达到 OD(600nm)约120±10时，平行测量磷酸盐浓度。在21±2小时时，发酵培养物中的磷酸盐浓度低于0.05mM，此时将发酵温度逐渐从37℃变为30℃。当发酵培养物中的磷酸盐浓度低于0.05mM时，开始诱导。在30℃和1200rpm下进行后诱导10小时。添加纯氧维持高细胞密度培养的最小溶解氧水平(30％)。空气和纯氧的混合物在30℃下以4lpm的流量泵送，以将溶解氧维持在设置点。在诱导之后测量发酵培养物的OD(600nM)、葡萄糖浓度和磷酸盐浓度。培养物在4300G、+4℃下旋转30分钟，丢弃上清液。进行抗VEGF Fab-201纯化，通过SDS-PAGE检查表达并通过ELISA定量。
发酵数据和表达产量在图21中显示。
实施例7：
针对VEGF的合成抗体的下游加工信息
细胞沉淀悬浮和裂解：
大肠杆菌细胞沉淀的裂解使用裂解缓冲液(裂解缓冲液—200mM磷酸盐缓冲液、pH7.4、400mM氯化钠、10mM苯基甲烷磺酰氟(PMSF)、2mM EDTA、 5％蔗糖、1％Triton X-100)进行。约446克湿重的细胞沉淀在室温下悬浮在 4.0L裂解缓冲液中(约1：10比例)，大力混合细胞沉淀直到获得匀质的细胞悬浮液。因为沉淀取自-80℃以及在室温下进行裂解，由于极端的温度差异和伴随盐浓度的高缓冲液强度引起对细菌细胞壁形成渗透冲击，使其高度多孔而供分子从周质区域自由流出。这种方法不足以释放蛋白质，需要用高压均质器进一步处理。
如此获得的细胞糊在800巴压力在4℃温度下连续三次穿过GEA均质器。在每次穿过后进行显微镜检查以确保发生了大致完全的细胞裂解。
加热和离心：
将均质化的溶胞产物在65℃水浴中加热1小时，然后在冰上冷却20分钟。冷却的溶胞产物通过4℃下17,000g离心30分钟来澄清。进一步的，澄清的溶胞产物通过切向流过滤使用10KDa浓缩溶胞产物初始体积的6倍。
步骤1通过Capto-L纯化：
20ml体积的GE Capto L装填在XK16/20柱中，用含有0.4M氯化钠的0.2M 磷酸钠pH7.4平衡。浓缩的溶胞产物以4mL/分钟的流速加载，用平衡缓冲液洗涤。使用含有0.2M甘氨酸-Cl/2％蔗糖、pH 2.0的缓冲液洗脱Saksin Fab-201，收集的洗脱物立即用pH 8.8的1.5MTris-Cl中和。
步骤2通过Q-Sepharose纯化：
来自capto-L层析的第一洗脱物相对于pH 7.3的20mM磷酸钠缓冲液透析，使用10mL阴离子交换树脂GE Q琼脂糖以除去内毒素和HCDNA。作为流通物收集纯化的fab。
步骤3通过SP-Sepharose纯化：
来自Q-Sepharose的流通物加载到装填于XK26/20中的15mL阳离子交换 GE SPSepharose树脂上。以稍微提高的电导率洗涤树脂，包括Fab的结合蛋白的洗脱通过14-16mS/cm电导率下的梯度洗脱进行。紧密结合的蛋白质用缓冲的1M氯化钠洗脱。相对于pH5.6的20mM PB透析药物物质，最后无菌过滤 (0.22μm)。
实施例8：
配制的Fab 201作为药物的稳定性
药物物质Fab 201进行制剂(药物产品)以提高稳定性特性以便于湿性 AMD的玻璃体内注射。以5至10mg/ml的浓度范围配制药物产品DP_201。除了API之外，所述制剂含有在pH5.8的10mM磷酸盐缓冲液/40mM NaCl/0.03％聚山梨酯20/5％蔗糖溶液中。制剂的渗透性约276mOsm，与人类玻璃体内液相当。
根据定量ELISA和SDS PAGE分析稳定性。数据表明，该药物产品在4℃下稳定8个月(240天)，如图22中描述的。
实施例9：
兔眼睛中的抗血管生成长期研究
进行该研究来评价Saksin Lifesciences Pvt.Ltd.,TICEL Bio-Park Facility，Taramani，Chennai，India发现的抗VEGF(血管内皮生长因子)Fab(抗原结合片段)蛋白(试验分子#201)与商业上可获得的Lucentis相比在VEGF诱导的视网膜渗漏模型兔(DutchBelted，3-4个月龄雄性，体重1.0-1.3kg)中的效力和持续性。该研究在PharmOptima，LLC，Portage MI，USA进行。在第0天通过玻璃体内施用(IVT)用试验分子#201(50μL制剂缓冲液中的150μg)、 Lucentis(50μL制剂缓冲液中的150μg)或运载体(50μL制剂缓冲液)处理各组的兔子。每个组的动物在第7、21或37天通过IVT接受VEGF攻击以确定效力是否随着时间而持续。
在IVT施用(试验分子#201、Lucentis、载体或VEGF)之前，用异氟烷蒸气麻醉兔子以实现效果。在注射之前，用眼科Betadine溶液润湿每只眼睛并冲洗。将普罗阿卡因(0.5％)施用于眼表面，用眼窥器将眼睛保持打开，并用测径器在距离角膜缘(limbus)～4.0mm标记睫状体平坦部(pars plana)。然后将试验分子通过睫状体平坦部以一定角度递送到玻璃体中部以避开晶状体。
在VEGF攻击后第3天对所有动物进行荧光素血管造影(FA)。用丙美卡因麻醉眼睛，用托吡卡胺和EyePrim扩张瞳孔。用异氟烷蒸气麻醉动物以起作用，并且在兔耳静脉中施用0.1mL的10％眼用荧光素钠并使其在成像前循环至少2分钟。使用下面给出的标准评分系统对图像进行分级(表6)：
表6.荧光素成像的评分系统
| 评分 | 说明 |
| 0 | 主血管非常直，微血管一定曲率 |
| 1 | 主血管的曲率提高，和/或血管扩张 |
| 2 | 主血管之间的渗漏 |
| 3 | 主血管和微血管之间的渗漏。微血管仍然可见。 |
| 4 | 主血管和微血管之间的渗漏。微血管不可见。 |
在终末FA后，通过静脉内巴比妥酸盐过量使动物安乐死。收取眼睛并收集玻璃体、房水和视网膜。将所有样品储存在-80℃下用于进一步分析。
对两只眼睛的评分进行Kruskal-Wallis单因素ANOVA，以发现各组之间的显著差异。显示显著差异的数据进行Dunn检验以确定各组之间的显著差异。
在试验分子#201施用后1周，VEGF攻击导致运载体注射组中预期量的渗漏，以及来自Lucentis和试验分子#201的完全保护。在试验分子#201施用后3周，VEGF攻击导致运载体处理组中预期量的渗漏，并且在试验分子# 201处理的兔子中比用Lucentis处理的兔子具有显著更大的保护作用。在试验分子#201施用后5周，VEGF攻击导致运载体注射组中预期量的渗漏，但是没有来自Lucentis和试验分子#201的保护(表7)。
表7.在试验分子施用1、3和5周后VEGF攻击的兔的荧光素成像评分
| 处理 | 1周 | 3周 | 5周 |
| 试验分子#201 | 0.17±0.39<sup>a</sup> | 1.25±0.89<sup>a</sup> | 3.25±0.45<sup>a</sup> |
| Lucentis | 0.00±0.00<sup>a</sup> | 2.88±0.35<sup>b</sup> | 3.08±0.51<sup>a</sup> |
| 运载体 | 3.50±0.47<sup>b</sup> | 3.67±0.49<sup>c</sup> | 3.50±0.52<sup>a</sup> |
值表示为平均值±SD。任何单个列中显示类似的上标的值是统计学上相同的(Dunn检验)。
结论
根据该研究，可以断定在试验分子#201施用后3周的VEGF攻击之后，在 VEGF诱导的视网膜渗漏模型兔子中，试验分子#201的效力的持续性显著大于Lucentis的效力持续性。这种效力的分子基础可以归因于图23和24中所示的与Lucentis相比Fab 201的CDR中的差异。
序列表
<110> 萨辛生命科学有限公司(Saksin Lifesciences Pvt. Ltd.)
<120> 针对VEGF的抗体及其用途
<130> 30867.1USP1
<160> 94
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的人源化抗VEGF Fab抗体片段的Ig重链，Fab FF03046-2，包含具有优化的人类框架以及针对小鼠和人VEGF的亲和成熟CDR-H1、-H2和-H3的可变区以及具有CH1结构域的恒定区
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(684)
<223> Fab FF03046-2抗体的Ig重链片段的编码序列包含具有优化的人类框架以及针对小鼠和人VEGF的亲和成熟CDR-H1、-H2和-H3的可变区以及具有CH1结构域的恒定区和
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(360)
<223> Fab FF03046-2抗体重链的可变区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (76)..(99)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (91)..(105)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(198)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (151)..(174)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (289)..(327)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (295)..(327)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (361)..(684)
<223> 包含CH1结构域和部分铰链区的Fab FF03046-2抗体重链恒定区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (361)..(654)
<223> Fab FF03046-2抗体重链恒定区的CH1结构域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (655)..(684)
<223> Fab FF03046-2抗体重链恒定区的部分铰链区的编码序列
<400> 1
gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca ggg ggc 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc ttc gat tta ttt cat tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
20 25 30
tct ata cac tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt 144
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca tac att tac ccg tct tat ggc tat act tat tat gcc gat agc gtc 192
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgt ttc act ata agc gca gac aca tcc aaa aac aca gcc tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
cta caa atg aac agc tta aga gct gag gac act gcc gtc tat tat tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gct cgc cat gcg tgg tat tat ggg tgg ggt ttg gac tac tgg ggt caa 336
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg gct agc acc aag ggc cca tcg gtc 384
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 432
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 480
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 528
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc 576
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 624
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 672
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
aaa act cac aca 684
Lys Thr His Thr
225
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr
225
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的人源化抗VEGF Fab抗体片段的Ig重链，Fab FF03046-2，包含具有优化的人类框架以及针对小鼠和人VEGF的亲和成熟CDR-L1、-L2和-L3的可变区以及κ轻链恒定区
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(642)
<223> 包含具有优化的人类框架以及针对小鼠和人VEGF的亲和成熟CDR-L1、-L2和-L3的可变区以及κ轻链恒定区的Fab FF03046-2抗体的免疫球蛋白κ轻链的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> Fab FF03046-2抗体κ轻链的可变区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (70)..(102)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (79)..(96)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(168)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(156)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (265)..(291)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (265)..(291)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (322)..(642)
<223> Fab FF03046-2抗体κ轻链的恒定区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (367)..(369)
<223> 编码Fab FF03046-2抗体的κ轻链恒定区的氨基酸位置123的氨基酸谷氨酸的GAG密码子，其与编码克隆#201中的丝氨酸的TCA密码子不同
<400> 3
gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc agt cag gcc gcc tac ggc cgc 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gct ccg aag ctt ctg att 144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga gtc cct tct cgc ttc tct ggt 192
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag ccg 240
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag caa cgt ggc tgg tat ctg ttc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag atc aaa cgt acg gtg gct gca 336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 576
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
ttc aac agg gga gag tgt 642
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于形成人源化抗VEGF Fc-Fab融合物的合成的人源化抗体FF03092-1重链，其包含融合至人源化Fab片段的氨基末端人源化的免疫球蛋白Fc片段
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1404)
<223> 用于形成人源化抗VEGF Fc-Fab融合物的合成的人源化抗体FF03092-1重链，其包含融合至人源化Fab片段的氨基末端人源化的免疫球蛋白Fc片段
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(666)
<223> 合成的人源化抗VEGF抗体FF03092-1的Fc片段的编码序列，人源化的抗VEGF Fc-Fab融合物包含融合至人源化Fab片段的氨基末端人源化的免疫球蛋白Fc片段
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(15)
<223> 依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-1的Fc片段的铰链区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(345)
<223> 依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-1的Fc片段的CH2结构域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (346)..(666)
<223> 依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-1的Fc片段的CH3结构域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (667)..(720)
<223> 合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-1的Fc片段和Fab重链之间的接头的编码序列，人源化的抗VEGF Fc-Fab融合物包含融合至人源化Fab片段的氨基末端人源化的免疫球蛋白Fc片段
<220>
<221> misc_特征
<222> (721)..(1404)
<223> 合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-1的Fab重链的编码序列，人源化的抗VEGFFc-Fab融合物包含融合至人源化Fab片段的氨基末端人源化的免疫球蛋白Fc片段
<220>
<221> misc_特征
<222> (721)..(1080)
<223> 依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-1的Fab重链的可变区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (796)..(819)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (811)..(825)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (868)..(918)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (871)..(894)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1009)..(1047)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1015)..(1047)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1081)..(1374)
<223> 用于依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-1的Fab重链的恒定区的CH1结构域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1375)..(1404)
<223> 用于铰链区的部分的编码序列，其包含参与FF03092-1抗体中的轻链的链内二硫键交联的氨基酸位置463(核苷酸位置1387-1389处的TGC)处的半胱氨酸
<400> 5
tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc 48
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct 96
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc 144
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 192
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc 240
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc 288
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 336
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca 384
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc 432
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg 480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac 528
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg 576
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac 624
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
aac cac tac acg cag aag agc ctc tcg ctg agc cct gga aaa ggt ggc 672
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
210 215 220
gga gga tct ggc ggc gga gga agc ggt gga ggc gga agc gga ggc gga 720
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
gaa gtg cag ctg gtg gaa tca ggc ggt gga ctg gtg cag cct ggc gga 768
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
245 250 255
agc tta aga ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc gac ctg ttc cac tac 816
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
260 265 270
tct atc cac tgg gtc cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 864
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
275 280 285
gcc tac atc tac ccc agc tac ggc tac acc tac tac gcc gac agc gtg 912
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
290 295 300
aag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aag aac acc gcc tac 960
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
305 310 315 320
ctg cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 1008
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
325 330 335
gcc aga cac gcc tgg tac tac ggc tgg ggc ctg gat tat tgg ggc cag 1056
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
ggc acc ctg gtc acc gtg tct agc gcc tct aca aag ggc ccc agc gtg 1104
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
355 360 365
ttc cct ctg gcc cct agc agc aag agc aca tct ggc gga aca gcc gcc 1152
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
370 375 380
ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttt ccc gag ccc gtg acc gtg tcc 1200
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
385 390 395 400
tgg aac tct ggt gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttt cca gct gtg 1248
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
405 410 415
ctg cag agc agc ggc ctg tac agc ctg tcc agc gtg gtc aca gtg cca 1296
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
420 425 430
agc agc agc ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag 1344
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
435 440 445
ccc agc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag agc tgc gac 1392
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
450 455 460
aag acc cac acc 1404
Lys Thr His Thr
465
<210> 6
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
260 265 270
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
275 280 285
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
290 295 300
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
305 310 315 320
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
325 330 335
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
355 360 365
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
370 375 380
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
385 390 395 400
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
405 410 415
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
420 425 430
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
435 440 445
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
450 455 460
Lys Thr His Thr
465
<210> 7
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于形成人源化抗VEGF Fc-Fab融合物的合成的人源化的抗体FF03092-1κ轻链，其包含融合至人源化的Fab片段的氨基末端人源化的免疫球蛋白Fc片段
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(642)
<223> 合成的人源化的抗体FF03092-1κ轻链的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> 合成的人源化的抗体FF03092-1κ轻链可变域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (70)..(102)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (79)..(96)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(168)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(156)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (265)..(291)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (265)..(291)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (322)..(642)
<223> 合成的人源化的抗体FF03092-1κ轻链恒定域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (640)..(642)
<223> 用于参与Ig重链的链内二硫键交联的氨基酸位置214处的半胱氨酸的密码子
<400> 7
gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc agt cag gcc gcc tac ggc cgc 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gct ccg aag ctt ctg att 144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga gtc cct tct cgc ttc tct ggt 192
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag ccg 240
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag caa cgt ggc tgg tat ctg ttc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag atc aaa cgt acg gtg gct gca 336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gaa aaa cat aaa gtc tac 576
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
ttc aac agg gga gag tgt 642
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含与针对人和小鼠VEGF的人源化抗VEGF单链Fv(scFv)融合的氨基末端人源化的Fc片段的合成的人源化的抗体FF03077-4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1449)
<223> 包含与针对人和小鼠VEGF的人源化抗VEGF单链Fv(scFv)融合的氨基末端人源化的Fc片段的合成的人源化的抗体FF03077-4
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(666)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF抗体FF03077-4的Fc片段的编码序列，其包含融合至针对人和小鼠VEGF的人源化的抗VEGF单链Fv(scFv)的氨基末端人源化的Fc片段
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(15)
<223> 用于依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03077-4的Fc片段的铰链区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(345)
<223> 用于依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03077-4的Fc片段的CH2结构域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (346)..(666)
<223> 用于依照IMGT定义的合成的人源化的抗VEGF抗体FF03077-4的Fc片段的CH3结构域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (667)..(720)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF抗体FF03077-4的Fc片段和scFv之间的接头的编码序列，其包含融合至针对人和小鼠VEGF的人源化的抗VEGF单链Fv(scFv)的氨基末端人源化的Fc片段
<220>
<221> misc_特征
<222> (721)..(1449)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF抗体FF03077-4的scFv的编码序列，其包含融合至针对人和小鼠VEGF的人源化的抗VEGF单链Fv(scFv)的氨基末端人源化的Fc片段
<220>
<221> misc_特征
<222> (790)..(822)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (799)..(816)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (868)..(876)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (868)..(888)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (985)..(1011)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (985)..(1011)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1162)..(1188)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1180)..(1194)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1237)..(1287)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1240)..(1263)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1378)..(1416)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1384)..(1416)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<400> 9
tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc 48
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct 96
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc 144
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 192
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc 240
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc 288
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 336
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca 384
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc 432
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg 480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac 528
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg 576
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac 624
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
aac cac tac acg cag aag agc ctc tcg ctg agc cct gga aaa ggt ggc 672
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
210 215 220
gga gga tct ggc ggc gga gga agc ggt gga ggc gga agc gga ggc ggc 720
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
gat atc cag atg aca cag agc cct agc agc ctg agc gcc agc gtg ggc 768
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
245 250 255
gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc agc cag gcc gcc tat ggc aga 816
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
260 265 270
gtg gcc tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc cct aag ctg ctg atc 864
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
275 280 285
tac aag gcc agc gag ctg tat gcc ggc gtg ccc agc aga ttc agc ggc 912
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
290 295 300
agc aga tcc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg cag ccc 960
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
305 310 315 320
gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag cgg ggc tgg tat ctg ttc 1008
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
325 330 335
acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag ggc aca aca gcc gcc 1056
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Thr Ala Ala
340 345 350
agc ggc tct agc ggc gga tct tct agc gga gcc gag gtg cag ctg gtg 1104
Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val
355 360 365
gaa tca ggc ggt gga ctg gtg cag cct ggc gga agc ctg aga ctg tct 1152
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
370 375 380
tgc gcc gcc tct ggc ttc gac ctg ttc cac tac agc atc cac tgg gtc 1200
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val
385 390 395 400
cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg gcc tac atc tac ccc 1248
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro
405 410 415
agc tac ggc tac acc tat tac gcc gac agc gtg aag ggc cgg ttc acc 1296
Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
420 425 430
atc agc gcc gac acc agc aag aac acc gcc tac ctg cag atg aac agc 1344
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
435 440 445
ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt gcc aga cac gcc tgg 1392
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp
450 455 460
tac tac ggc tgg ggc ctg gat tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc 1440
Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
gtg tcc tct 1449
Val Ser Ser
<210> 10
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
245 250 255
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
260 265 270
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
275 280 285
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
290 295 300
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
305 310 315 320
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
325 330 335
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Thr Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val
355 360 365
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
370 375 380
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val
385 390 395 400
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro
405 410 415
Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
420 425 430
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
435 440 445
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp
450 455 460
Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser
<210> 11
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的人源化的抗VEGF全长成熟IgG1抗体FF03092-3，重链包含优化的人类框架和针对小鼠和人VEGF的亲和成熟的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1350)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF全长成熟IgG1抗体FF03092-3的IgG1重链的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(360)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF全长成熟IgG1抗体FF03092-3的IgG1重链可变域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (76)..(99)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (91)..(105)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(198)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (151)..(174)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (289)..(327)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (295)..(327)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (361)..(1350)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF全长成熟IgG1抗体FF03092-3的IgG1重链恒定域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (361)..(654)
<223> 用于基于IMGT的FF03092-3抗体IgG1重链恒定区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (655)..(699)
<223> 用于基于IMGT的FF03092-3抗体IgG1重链恒定区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (667)..(669)
<223> 用于在FF03092-3抗体中与免疫球蛋白轻链形成二硫桥的全长成熟IgG1重链的氨基酸位置223处的半胱氨酸的密码子
<220>
<221> misc_特征
<222> (700)..(1029)
<223> 用于基于IMGT的FF03092-3抗体IgG1重链恒定区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1030)..(1350)
<223> 用于基于IMGT的FF03092-3抗体IgG1重链恒定区的编码序列
<400> 11
gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca ggg ggc 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc ttc gat tta ttt cat tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
20 25 30
tct ata cac tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt 144
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca tac att tac ccg tct tat ggc tat act tat tat gcc gat agc gtc 192
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgt ttc act ata agc gca gac aca tcc aaa aac aca gcc tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
cta caa atg aac agc tta aga gct gag gac act gcc gtc tat tat tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gct cgc cat gcg tgg tat tat ggg tgg ggt ttg gac tac tgg ggt caa 336
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg gct agc acc aag ggc cca tcg gtc 384
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 432
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 480
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 528
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc 576
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 624
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 672
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 720
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 768
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 816
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 864
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 912
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 960
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 1008
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1056
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg 1104
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1152
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1200
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1248
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1296
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1344
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
ggt aaa 1350
Gly Lys
450
<210> 12
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 13
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的人源化全长成熟IgG1抗体FF03092-3，κ轻链包含优化的人类框架和针对小鼠和人VEGF的亲和成熟的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(642)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-3的免疫球蛋白κ轻链的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> 合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-3的免疫球蛋白κ轻链的可变域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (70)..(102)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (79)..(96)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(168)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(156)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (265)..(291)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (265)..(291)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (322)..(642)
<223> 合成的人源化的抗VEGF抗体FF03092-3的免疫球蛋白κ轻链的恒定域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (640)..(642)
<223> 用于FF03092-3抗体中与免疫球蛋白重链形成二硫键的κ轻链氨基酸214处的半胱氨酸残基的密码子
<400> 13
gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc agt cag gcc gcc tac ggc cgc 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gct ccg aag ctt ctg att 144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga gtc cct tct cgc ttc tct ggt 192
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag ccg 240
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag caa cgt ggc tgg tat ctg ttc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag atc aaa cgt acg gtg gct gca 336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 576
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
ttc aac agg gga gag tgt 642
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 268
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 启动子
<222> (1)..(217)
<223> 大肠杆菌Pho A启动子
<400> 15
gaccaacagc ggttgattga tcaggtagag ggggcgctgt acgaggtaaa gcccgatgcc 60
agcattcctg acgacgatac ggagctgctg cgcgattacg taaagaagtt attgaagcat 120
cctcgtcagt aaaaagttaa tcttttcaac agctgtcata aagttgtcac ggccgagact 180
tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt atttgtaact agtacgcaag ttcacgtaaa 240
aagggtatgt agaggttgag gtgatttt 268
<210> 16
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于在表达质粒克隆#201中使用的针对小鼠和人VEGF的合成的人源化的Fab抗VEGF抗体的编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(714)
<223> 衍生自FF03046-2抗体的抗VEGF的κ轻链包含编码MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA的氨基末端序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> 翻译起始密码子, AUG
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(69)
<223> 用于在Ig轻链分泌过程中裂解的分泌信号的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (70)..(390)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF抗体的免疫球蛋白κ轻链的可变区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (70)..(711)
<223> 用于缺乏分泌信号的合成的人源化的抗VEGF Fab抗体的成熟Ig κ轻链的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (139)..(171)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (148)..(165)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (217)..(237)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (217)..(225)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (334)..(360)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (334)..(360)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-L3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (391)..(711)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF抗体的免疫球蛋白κ轻链的恒定区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (436)..(438)
<223> 编码克隆#201亲代中κ轻链恒定区的氨基酸位置146处氨基酸丝氨酸的TCA密码子，其与编码亲代Fab FF03046-2的κ轻链中谷氨酸的GAG密码子不同
<220>
<221> misc_特征
<222> (709)..(711)
<223> 用于κ轻链恒定区末端的参与与重链形成二硫键的半胱氨酸残基的密码子
<220>
<221> misc_特征
<222> (712)..(714)
<223> 翻译终止密码子
<220>
<221> misc_特征
<222> (715)..(827)
<223> 轻链和重链编码序列之间的非编码间隔区
<220>
<221> CDS
<222> (828)..(1583)
<223> 衍生自FF03046-2抗体的抗VEGF Fab抗体重链，其包含编码MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA
的氨基末端序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (828)..(830)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF Fab抗体的免疫球蛋白重链片段的翻译起始密码子
<220>
<221> misc_特征
<222> (828)..(896)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF Fab抗体的Ig重链片段的分泌期间裂解的分泌信号的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (897)..(1580)
<223> 用于缺乏分泌信号的合成的人源化的抗VEGF Fab抗体的成熟Ig重链片段的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (897)..(1256)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF Fab抗体的Ig重链可变区的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (972)..(995)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (987)..(1001)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H1的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1044)..(1094)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1047)..(1070)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H2的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1185)..(1223)
<223> 依照IMGT定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1191)..(1223)
<223> 依照Kabat定义的互补决定区CDR-H3的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1257)..(1550)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF Fab抗体的Ig重链恒定区的CH1结构域的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1281)..(1583)
<223> 翻译终止密码子
<220>
<221> misc_特征
<222> (1551)..(1580)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF Fab抗体的的免疫球蛋白重链片段的铰链区的部分的编码序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1563)..(1565)
<223> 用于合成的人源化的抗VEGF Fab抗体中铰链区中参与与轻链形成链内二硫键的半胱氨酸残基的密码子
<400> 16
atg aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt tct 48
Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser
1 5 10 15
att gct aca aat gcc tat gca gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc 96
Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
20 25 30
tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc 144
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
35 40 45
agt cag gcc gcc tac ggc cgc gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga 192
Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
aaa gct ccg aag ctt ctg att tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga 240
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly
65 70 75 80
gtc cct tct cgc ttc tct ggt agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg 288
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
acc atc agc agt ctg cag ccg gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag 336
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
caa cgt ggc tgg tat ctg ttc acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag 384
Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct 432
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
gat tca cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat 480
Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc 528
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag 576
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac 624
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
tac gaa aaa cat aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg 672
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa 714
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
tactcgaggc tgagcaaagc agactactaa taacataaag tctacgccgg acgcatcgtg 774
gccctagtac gcaagttcac gtaaaaaggg taactagagg ttgaggtgat ttt atg 830
Met
aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt tct att 878
Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile
240 245 250
gct aca aac gcg tac gct gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc 926
Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
255 260 265 270
ctg gtg cag cca ggg ggc tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc 974
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
275 280 285
ttc gat tta ttt cat tat tct ata cac tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt 1022
Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
290 295 300
aag ggc ctg gaa tgg gtt gca tac att tac ccg tct tat ggc tat act 1070
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr
305 310 315
tat tat gcc gat agc gtc aag ggc cgt ttc act ata agc gca gac aca 1118
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr
320 325 330
tcc aaa aac aca gcc tac cta caa atg aac agc tta aga gct gag gac 1166
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
335 340 345 350
act gcc gtc tat tat tgt gct cgc cat gcg tgg tat tat ggg tgg ggt 1214
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly
355 360 365
ttg gac tac tgg ggt caa gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg gcc tcc 1262
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
370 375 380
acc aag ggt cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc 1310
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
385 390 395
tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc 1358
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
400 405 410
gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg 1406
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
415 420 425 430
cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc 1454
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
435 440 445
agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc 1502
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
450 455 460
tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtc gac aag aaa gtt 1550
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
465 470 475
gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca taa 1583
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
480 485
<210> 17
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser
1 5 10 15
Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
35 40 45
Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 18
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser
1 5 10 15
Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr
65 70 75 80
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
85 90 95
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp
115 120 125
Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
245 250
<210> 19
<211> 274
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 终止子
<222> (1)..(274)
<223> rrnB 终止子
<400> 19
cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaacat ccatgcgtta acgcgagagt agggaactgc 60
caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc ggaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 120
tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgt 180
gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaac 240
taagcagaag gccatcctga cggatggcct tttt 274
<210> 20
<211> 3012
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3009)
<223> 相应于pBR332(GenBank登录号No：J01749.1)从核苷酸位置1353至4361的载体序列，其中pBR322的四环素抗性基因已被删除
<220>
<221> misc_特征
<222> (1944)..(2801)
<223> 具有核苷酸位置2801处的翻译起始点和核苷酸位置1944处的翻译终止点的β-内酰胺酶编码序列
<400> 20
gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg 60
cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct 120
gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc 180
gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac 240
atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg 300
caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac 360
atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat 420
ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt 480
aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa 540
tcccccttac acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg 600
ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga 660
acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct 720
cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 780
agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 840
tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 900
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 960
ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 1020
gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 1080
atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 1140
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1200
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 1260
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 1320
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 1380
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1440
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1500
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1560
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1620
aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1680
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 1740
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 1800
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 1860
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 1920
gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 1980
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 2040
gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 2100
ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 2160
actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 2220
ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 2280
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 2340
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 2400
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 2460
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 2520
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 2580
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 2640
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 2700
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 2760
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 2820
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 2880
aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 2940
gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 3000
cttcaagaat tc 3012
<210> 21
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体201序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 21
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 22
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体202序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 22
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact cgacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 23
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体203序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 23
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgatct ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
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<210> 24
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 24
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<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体205序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 25
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<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体206序列
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<222> (1)..(1583)
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<210> 27
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<212> DNA
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<220>
<223> 实施例3的变体207序列
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ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
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aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
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tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
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<210> 28
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体208序列
<220>
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<400> 28
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<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体209序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体212序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 30
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gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
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aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataga ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
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aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
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cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 31
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体213序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 31
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
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cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
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aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt atgatataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 32
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体214序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 32
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatg attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 33
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体215序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 33
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
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aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttgatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 34
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体216序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 34
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttagatcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 35
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体217序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 35
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gacgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 36
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体218序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 36
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgccgacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 37
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体219序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 37
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg accgcgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 38
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例3的变体220序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1583)
<400> 38
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60
gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gcgacgtagc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720
aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780
gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840
tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900
ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960
gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020
gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080
atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140
aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200
attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260
ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380
actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560
cttgtgacaa aactcacaca taa 1583
<210> 39
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4和7的FF0124-1 F2078序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(63)
<400> 39
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
35 40 45
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
50 55 60
<210> 40
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4和7的FF0124-2 F2083序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(67)
<400> 40
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Ser Gly Pro Leu Phe Thr Asp Leu Tyr Tyr Ser Ser
20 25 30
Met His Ser Ile Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
35 40 45
Val Lys Gly Tyr Tyr Trp Trp His Ser Pro Phe Trp Ala Tyr Ser Gly
50 55 60
Leu Asp Tyr
65
<210> 41
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4和7的FF0124-3 F2086序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Thr Asp Leu Ser Tyr Ser
20 25 30
Ser Ile His Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
35 40 45
Ser Val Lys Gly Ser Phe Gly Trp Pro Trp Gly Trp Ala Met Asp Tyr
50 55 60
<210> 42
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4和7的FF0124-4 F2088序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(63)
<400> 42
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ser Leu Ile Thr Asp Leu
20 25 30
Tyr Ser Tyr Ser Ile His Ser Ile Tyr Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr
35 40 45
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Gly Gly Trp Tyr Ala Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 43
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4和7的FF0124-5 F2091序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(74)
<400> 43
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Phe Trp Ala Gly Tyr Gly Leu Ile Thr Asp Ile Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Met His Ser Ile Tyr Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr
35 40 45
Ala Asp Ser Val Lys Gly His Ser Val Tyr Tyr Trp Tyr Gly Ser Tyr
50 55 60
Trp Tyr Tyr Pro Ser Ser Ala Met Asp Tyr
65 70
<210> 44
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4和7的FF0124-6 F2094序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 44
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Ser Gly His Tyr His Tyr Pro Phe Thr Asp Ile Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Ser Met His Ser Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr
35 40 45
Ala Asp Ser Val Lys Gly Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Trp Ala Phe Asp Tyr
50 55 60
<210> 45
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4和7的FF0124-7 F2116序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(63)
<400> 45
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln His Tyr Gly Pro Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Ser Tyr
20 25 30
Met His Ser Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser
35 40 45
Val Lys Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Gly Trp Tyr Gly Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 46
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-C4序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 46
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 47
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-F11序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 47
Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Arg Trp Ala Phe Asp Tyr
35 40 45
<210> 48
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-C11序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 48
Gln Gln Gly Gly Trp Tyr Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 49
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-F2序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 49
Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 50
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-E2序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 50
Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Phe Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 51
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-C3序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 51
Gln Gln Arg Asp Trp Arg Leu Phe Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 52
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-B10序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 52
Gln Gln Gly Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 53
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0158-C2序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 53
Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Phe Phe Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 54
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图6的FF0128-1序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(45)
<400> 54
Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile
1 5 10 15
His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20 25 30
Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 55
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-A3序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 55
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Phe Gly Trp Ala Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 56
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-A5序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 56
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 57
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-A8序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 57
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 58
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-A10序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 58
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 59
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-A11序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 59
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Trp Gly Trp Ala Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 60
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-A12序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 60
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Phe Arg Trp Ala Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 61
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-B5序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 61
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Phe Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
35 40 45
<210> 62
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-B9序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 62
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 63
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0117-B11序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 63
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 64
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的FF0188-H5 (2)序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 64
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 65
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03033-1序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 65
Arg Ala Ser Gln Tyr Met Asn Ser Asn Val Ala Ala Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Val Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His
20 25 30
Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
35 40 45
Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 66
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03033-2序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 66
Arg Ala Ser Gln Val Ala Phe Tyr Asn Val Ala Asp Ala Ser Ile Leu
1 5 10 15
Asn Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His
20 25 30
Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
35 40 45
Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 67
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03033-3序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 67
Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Tyr Asn Val Ala Gln Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His
20 25 30
Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
35 40 45
Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 68
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03033-4序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 68
Arg Ala Ser Gln Glu Gly Trp Asp Arg Val Ala Ser Ala Ser Gln Leu
1 5 10 15
Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His
20 25 30
Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
35 40 45
Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 69
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03033-5序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 69
Arg Ala Ser Gln Gly Val Gly Glu Arg Val Ala Asn Ala Ser His Leu
1 5 10 15
Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His
20 25 30
Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
35 40 45
Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 70
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03033-6序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 70
Arg Ala Ser Gln Pro Arg Glu Asp Arg Val Ala Arg Ala Ser Thr Leu
1 5 10 15
Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His
20 25 30
Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
35 40 45
Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 71
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03033-8序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(64)
<400> 71
Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Lys Ala Ser Glu Leu
1 5 10 15
Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His
20 25 30
Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
35 40 45
Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr
50 55 60
<210> 72
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF03046-2序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(65)
<400> 72
Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Lys Ala Ser Glu Leu
1 5 10 15
Tyr Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe
20 25 30
His Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr
35 40 45
Ala Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp
50 55 60
Tyr
65
<210> 73
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图9A的FF0117-A5 (2)序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(65)
<400> 73
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe
20 25 30
His Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr
35 40 45
Ala Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp
50 55 60
Tyr
65
<210> 74
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图13的单链核酸序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1449)
<400> 74
tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 60
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 120
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 180
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 240
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 300
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 360
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 420
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 480
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 540
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 600
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc gctgagccct 660
ggaaaaggtg gcggaggatc tggcggcgga ggaagcggtg gaggcggaag cggaggcggc 720
gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 780
atcacctgta gagccagcca ggccgcctat ggcagagtgg cctggtatca gcagaagccc 840
ggcaaggccc ctaagctgct gatctacaag gccagcgagc tgtatgccgg cgtgcccagc 900
agattcagcg gcagcagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 960
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cggggctggt atctgttcac cttcggccag 1020
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcacaaca gccgccagcg gctctagcgg cggatcttct 1080
agcggagccg aggtgcagct ggtggaatca ggcggtggac tggtgcagcc tggcggaagc 1140
ctgagactgt cttgcgccgc ctctggcttc gacctgttcc actacagcat ccactgggtc 1200
cgacaggccc ctggcaaggg actggaatgg gtggcctaca tctaccccag ctacggctac 1260
acctattacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gcgccgacac cagcaagaac 1320
accgcctacc tgcagatgaa cagcctgaga gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtgcc 1380
agacacgcct ggtactacgg ctggggcctg gattactggg gccagggaac cctggtcacc 1440
gtgtcctct 1449
<210> 75
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图13的单链核酸序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(483)
<400> 75
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
245 250 255
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
260 265 270
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
275 280 285
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
290 295 300
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
305 310 315 320
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
325 330 335
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Thr Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val
355 360 365
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
370 375 380
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val
385 390 395 400
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro
405 410 415
Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
420 425 430
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
435 440 445
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp
450 455 460
Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图16的轻链(hK)核酸序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(214)
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 77
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图16的轻链(hK)核酸序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(642)
<400> 77
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca ggccgcctac ggccgcgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttacaaa gcatccgaac tctacgccgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cgtggctggt atctgttcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgattcac agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 78
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图16的重链核酸序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(228)
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Asp His Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr
225
<210> 79
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图16的重链核酸序列
<400> 79
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt cgatttagat cattattcta tacactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatac atttacccgt cttatggcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgccatgcg 300
tggtattatg ggtggggttt ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca caca 684
<210> 80
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图23的Lucentis(雷珠单抗)重链序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(231)
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Leu
225 230
<210> 81
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图23的Fab 201重链序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(228)
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr
225
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24的Lucentis(雷珠单抗)轻链
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(214)
<400> 82
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 83
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24的Fab 201轻链序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(214)
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 84
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0158-C4 (2)序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 84
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 85
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0187-B3序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 85
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 86
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0187-C1序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 86
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 87
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0187-A12序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 87
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 88
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0187-H3序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 88
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 89
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0188-H5序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 89
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 90
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0188-B10序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 90
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 91
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0188-F12序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 91
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Tyr His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 92
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0188-B6序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 92
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 93
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0188-A2序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 93
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
<210> 94
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的FF0188-A9序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(47)
<400> 94
Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr
1 5 10 15
Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
35 40 45
Claims (27)
1.一种特异性识别并结合VEGF的抗VEGF抗体或其部分，其包含含有由Kabat法定义的以下高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的重链可变域和轻链可变域：对于所述重链可变域，包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置31的组氨酸到氨基酸位置35的组氨酸的CDRH1，包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置50的酪氨酸到氨基酸位置66的甘氨酸的CDRH2，和包含SEQID NO：1中的氨基酸位置99的组氨酸到氨基酸位置109的酪氨酸的CDRH3；对于所述轻链可变域，包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置24的精氨酸到氨基酸位置34的丙氨酸的CDRL1，包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置50的赖氨酸到氨基酸位置56的丙氨酸的CDRL2，和包含SEQID NO：3中的氨基酸位置89的谷氨酰胺到氨基酸位置97的苏氨酸的CDRL3，其中所述部分选自由Fab、Fab’、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组。
2.一种特异性识别并结合VEGF的抗VEGF抗体或其部分，其包含
a.重链可变域，其包含由IMGT法定义的以下CDR氨基酸序列：包含氨基酸序列GFDLDHYS的CDRH1，包含氨基酸序列IYPSYGYT的CDRH2，和包含氨基酸序列ARHAWYYGWGLDY的CDRH3；和
b.轻链可变域，其包含由IMGT定义的以下CDR氨基酸序列：包含氨基酸序列QAAYGR的CDRL1，包含氨基酸序列KAS的CDRL2，和包含氨基酸序列QQRGWYLFT的CDRL3，
其中所述部分选自由Fab、Fab’、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组。
3.一种特异性识别并结合VEGF的人类抗VEGF抗体或其部分，其包含
a)具有由Kabat法定义的以下高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变域：包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置24的精氨酸到氨基酸位置34的丙氨酸的CDRL1，包含SEQ IDNO：3中的氨基酸位置50的赖氨酸到氨基酸位置56的丙氨酸的CDRL2，和SEQ ID NO：3中的包含氨基酸位置89的谷氨酰胺到氨基酸位置97的苏氨酸的CDRL3；和
b)具有由Kabat法定义的以下高变区或互补决定区(CDR)氨基酸序列的重链可变域：包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置31的组氨酸到氨基酸位置35的组氨酸的CDRH1，包含SEQ IDNO：1中的氨基酸位置50的酪氨酸到氨基酸位置66的甘氨酸的CDRH2，和包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置99的组氨酸到氨基酸位置109的酪氨酸的CDRH3，
其中所述部分选自由Fab、Fab’、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组。
4.根据权利要求2所述的抗VEGF抗体或其部分，其进一步包含：
c)具有由以下框架区氨基酸序列的轻链可变域：包含SEQ ID NO：76中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置26的丝氨酸的FRL1氨基酸序列，包含SEQ ID NO：76中的氨基酸位置33的缬氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸的FRL2氨基酸序列，包含SEQ ID NO：76中的氨基酸位置53的谷氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸的FRL3氨基酸序列，和包含SEQ ID NO：76中的氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的FRL4氨基酸序列；和
d)具有由以下框架区氨基酸序列的重链可变域：包含SEQ ID NO：78中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置25的丝氨酸的FRH1氨基酸序列，包含SEQ ID NO：78中的氨基酸位置34的异亮氨酸到氨基酸位置50的酪氨酸的FRH2氨基酸序列，包含SEQ ID NO：78中的氨基酸位置59的酪氨酸到氨基酸位置96的半胱氨酸的FRH3氨基酸序列，和包含SEQ ID NO：78中的氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的FRH4氨基酸序列，
所述框架区由IMGT法定义。
5.根据权利要求1所述的抗VEGF抗体，其进一步包含重链框架区(FR)1，FRH1，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸；进一步包含重链框架区(FR)2，FRH2，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸；进一步包含重链框架区(FR)3，FRH3，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸；进一步包含重链框架区(FR)4，FRH4，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸；或其进一步包含以下重链框架区(FR)氨基酸序列：包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸的FRH1，包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸的FRH2，包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸的FRH3，和包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的FRH4，其中所述框架区由Kabat法定义。
6.根据权利要求3所述的人类抗VEGF抗体，其进一步包含重链框架区(FR)1，FRH1，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸；进一步包含重链框架区(FR)2，FRH2，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸；进一步包含重链框架区(FR)3，FRH3，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸；进一步包含重链框架区(FR)4，FRH4，其氨基序列包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸；或
其进一步包含以下重链框架区(FR)氨基酸序列：包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸的FRH1，包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸的FRH2，包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸的FRH3，和包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的FRH4，其中所述框架区由Kabat法定义。
7.根据权利要求1所述的抗VEGF抗体，其进一步包含轻链框架区(FR)1，FRL1，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸；
进一步包含轻链框架区(FR)2，FRL2，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸；
进一步包含轻链框架区(FR)3，FRL3，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸；
进一步包含轻链框架区(FR)4，FRL4，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸；或
其进一步包含以下轻链框架区(FR)氨基酸序列：包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸的FRL1，包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸的FRL2，包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸的FRL3，和包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的FRL4，其中所述框架区由Kabat法定义。
8.根据权利要求3所述的人类抗VEGF抗体，其进一步包含轻链框架区(FR)1，FRL1，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸；
进一步包含轻链框架区(FR)2，FRL2，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸；
进一步包含轻链框架区(FR)3，FRL3，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸；
进一步包含轻链框架区(FR)4，FRL4，其氨基序列包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸；或
其进一步包含以下轻链框架区(FR)氨基酸序列：包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸的FRL1，包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸的FRL2，包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸的FRL3，和包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的FRL4，其中所述框架区由Kabat法定义。
9.一种核酸，其编码结合人VEGF的特异性结合构件的免疫球蛋白重链或其片段、免疫球蛋白轻链或其片段、或两者，所述特异性结合构件包含与人类VEGF结合的抗体的抗原结合部分，
a)其中所述抗体的抗原结合部分的免疫球蛋白重链或其片段包括：包含SEQ ID NO：1中的从位置91的胞嘧啶开始到位置105的胞嘧啶结束的核酸序列的免疫球蛋白重链CDRH1，包含SEQ ID NO：1中的从位置148的胸腺嘧啶开始到位置198的胞嘧啶结束的核酸序列的重链CDRH2，以及包含SEQ ID NO：1中的从位置295的胞嘧啶开始到位置327的胞嘧啶结束的核酸序列的重链CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3由Kabat法定义，其中免疫球蛋白重链或其片段是选自抗VEGF抗体片段的重链组分，该抗VEGF抗体的片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组；
b)其中所述抗体的抗原结合部分的免疫球蛋白轻链或其片段包括：包含SEQ ID NO：3中的从位置70的胞嘧啶开始到位置102的胞嘧啶结束的核酸序列的轻链CDRL1，包含SEQ IDNO：3中的从位置148的腺嘌呤开始到位置168的胞嘧啶结束的核酸序列的轻链CDRL2，和包含SEQ ID NO：3中的从位置265的胞嘧啶开始到位置291的鸟嘌呤结束的核酸序列的轻链CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3由Kabat法定义，其中免疫球蛋白轻链或其片段是选自抗VEGF抗体片段的轻链组分，该抗VEGF抗体的片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组；或
c)其中所述抗体的抗原结合部分的免疫球蛋白重链包括：包含SEQ ID NO：1中的从位置91的胞嘧啶开始到位置105的胞嘧啶结束的核酸序列的免疫球蛋白重链CDRH1，包含SEQID NO：1中的从位置148的胸腺嘧啶开始到位置198的胞嘧啶结束的核酸序列的重链CDRH2，以及包含SEQ ID NO：1中的从位置295的胞嘧啶开始到位置327的胞嘧啶结束的核酸序列的重链CDRH3，和所述抗体的抗原结合部分的免疫球蛋白轻链包括：包含SEQ ID NO：3中的从位置70的胞嘧啶开始到位置102的胞嘧啶结束的核酸序列的轻链CDRL1，包含SEQ ID NO：3中的从位置148的腺嘌呤开始到位置168的胞嘧啶结束的核酸序列的轻链CDRL2，和包含SEQID NO：3中的从位置265的胞嘧啶开始到位置291的鸟嘌呤结束的核酸序列的轻链CDRL3，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRH1、CDRH2和CDRH3由Kabat法定义，其中免疫球蛋白重链或其片段是选自抗VEGF抗体片段的重链组分，该抗VEGF抗体的片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组，其中免疫球蛋白轻链或其片段是选自抗VEGF抗体片段的轻链组分，该抗VEGF抗体的片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组。
10.根据权利要求9所述的核酸，其中如(a)、(b)或(c)中提供的核酸序列的任一个可以用编码相同氨基酸序列的等价核酸序列替换。
11.根据权利要求10所述的核酸，其中所述抗体进一步包含人类的或人源化的恒定区。
12.根据权利要求11所述的核酸，其中所述人类的或人源化的恒定区是IgG1恒定区。
13.根据权利要求11所述的核酸，其中所述人类的或人源化的恒定区是IgG4恒定区。
14.根据权利要求9所述的核酸，其中所述特异性结合构件是单链Fv分子，所述单链Fv分子是包含SEQ ID NO：9所示的位置721的鸟嘌呤开始到位置1449的胸腺嘧啶的核酸序列或其部分，其中所述部分提供与人类VEGF结合的特异性。
15.根据权利要求9所述的核酸，其中所述特异性结合构件是包含SEQ ID NO：1和3中所示的核酸序列或其部分的Fab，其中所述部分提供与人类VEGF结合的特异性。
16.根据权利要求9所述的核酸，其中所述抗体的所述抗原结合部分的所述免疫球蛋白重链另外包含免疫球蛋白重链框架区1，FRH1，其包含SEQ ID NO：1中的从位置1的鸟嘌呤开始到位置90的胸腺嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸的氨基酸序列；
免疫球蛋白重链框架区2，FRH2，其包含SEQ ID NO：1中的从位置106的胸腺嘧啶开始到位置147的腺嘌呤结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸的氨基酸序列；
免疫球蛋白重链框架区3，FRH3，其包含SEQ ID NO：1中的从位置199的胞嘧啶开始到位置294的胞嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸的氨基酸序列；
免疫球蛋白重链框架区4，FRH4，其包含SEQ ID NO：1中的从位置328的胸腺嘧啶开始到位置360的鸟嘌呤结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的氨基酸序列；或
重链框架区FRH1，其包含SEQ ID NO：1中的从位置1的鸟嘌呤开始到位置90的胸腺嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置30的苯丙氨酸的氨基酸序列；重链框架区FRH2，其包含SEQ ID NO：1中的从位置106的胸腺嘧啶开始到位置147的腺嘌呤结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置36的色氨酸到氨基酸位置49的丙氨酸的氨基酸序列；重链框架区FRH3，其包含SEQ IDNO：1中的从位置199的胞嘧啶开始到位置294的胞嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置67的精氨酸到氨基酸位置98的精氨酸的氨基酸序列；以及重链框架区FRH4，其包含SEQ ID NO：1中的从位置328的胸腺嘧啶开始到位置360的鸟嘌呤结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸位置110的色氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的氨基酸序列，其中，编码所述重链框架区FRH1到FRH4以及重链互补决定区CDRH1到CDRH3的核酸序列以FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的顺序连接，和其中所述免疫球蛋白重链框架区由Kabat法定义。
17.根据权利要求16所述的核酸，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO：1中的从位置1的鸟嘌呤开始到位置360的鸟嘌呤结束的重链可变区的核酸序列，所述核酸序列编码SEQID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的氨基酸序列。
18.根据权利要求9所述的核酸，其中所述抗体的所述抗原结合部分的所述免疫球蛋白轻链或其片段另外包含免疫球蛋白轻链框架区1，FRL1，其包含SEQ ID NO：3中的从位置1的鸟嘌呤开始到位置69的胞嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸的氨基酸序列；
免疫球蛋白轻链框架区2，FRL2，其包含SEQ ID NO：3中的从位置103的胸腺嘧啶开始到位置147的胞嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸的氨基酸序列；
免疫球蛋白轻链框架区3，FRL3，其包含SEQ ID NO：3中的从位置169的鸟嘌呤开始到位置264的胸腺嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸的氨基酸序列；
免疫球蛋白轻链框架区4，FRL4，其包含SEQ ID NO：3中的从位置292的胸腺嘧啶开始到位置321的腺嘌呤结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的氨基酸序列；或
轻链框架区FRL1，其包含SEQ ID NO：3中的从位置1的鸟嘌呤开始到位置69的胞嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置23的半胱氨酸的氨基酸序列；轻链框架FRL2，其包含SEQ ID NO：3中的从位置103的胸腺嘧啶开始到位置147的胞嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置35的色氨酸到氨基酸位置49的酪氨酸的氨基酸序列；轻链框架FRL3，其包含SEQ ID NO：3中的从位置169的鸟嘌呤开始到位置264的胸腺嘧啶结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置57的甘氨酸到氨基酸位置88的半胱氨酸的氨基酸序列；轻链框架FRL4，其包含SEQ ID NO：3中的从位置292的胸腺嘧啶开始到位置321的腺嘌呤结束的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO：3中的氨基酸位置98的苯丙氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的氨基酸序列，其中，编码轻链框架区FRL1到FRL4以及轻链互补决定区CDRL1到CDRL3的核酸序列以FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的顺序连接。
19.根据权利要求18所述的核酸，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO：3中的从位置1的鸟嘌呤开始到位置321的腺嘌呤结束的轻链可变区的核酸序列，所述核酸序列编码SEQID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的氨基酸序列。
20.根据权利要求9、14、15、16、17、18或19所述的核酸，其中所述核酸具有沉默突变或多个沉默突变，所述沉默突变或多个沉默突变不改变所编码的氨基酸的特性。
21.根据权利要求9所述的核酸，其中所述特异性结合构件是抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的FF03046-2 VH结构域、和SEQ ID NO：1中的氨基酸位置121的丙氨酸到氨基酸位置218的缬氨酸的人类IgG1恒定区的CH1结构域，以及其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的FF03046-2 VL结构域、和SEQ ID NO：3中的氨基酸位置108的精氨酸到氨基酸位置214的半胱氨酸的人类κ轻链恒定区。
22.根据权利要求9所述的核酸，其中所述特异性结合构件是抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1的谷氨酸到氨基酸位置120的丝氨酸的FF03046-2 VH结构域、SEQ ID NO：1中的氨基酸位置121的丙氨酸到氨基酸位置218的缬氨酸的人类IgG1恒定区的CH1结构域、和SEQ ID NO：1中的氨基酸位置219的谷氨酸到氨基酸位置228的苏氨酸的人类IgG1恒定区的绞链区的一部分，以及其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO：3中的氨基酸位置1的天冬氨酸到氨基酸位置107的赖氨酸的FF03046-2 VL结构域、和SEQ ID NO：3中的氨基酸位置108的精氨酸到氨基酸位置214的半胱氨酸的人类κ轻链恒定区。
23.根据权利要求9所述的核酸，其中所述抗体不结合BSA或Fc。
24.一种宿主细胞，其是用根据权利要求9所述的核酸转化的。
25.一种生产识别并结合VEGF的特异性结合构件的方法，其包括：在用于生产所述特异性结合构件的条件下培养根据权利要求24所述的宿主细胞，并分离和/或纯化所述特异性结合构件，其中所述宿主细胞包含编码所述抗体的抗原结合部分的重链或其部分的核苷酸序列，和编码所述抗体的抗原结合部分的轻链或其部分的核苷酸序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中识别并结合VEGF的所述特异性结合构件是scFv抗体分子或Fab抗体分子。
27.根据权利要求25所述的方法，其中识别并结合VEGF的所述特异性结合构件是全长抗体。
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