KR20190052168A - Vegf에 대한 합성 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VEGF에 대한 신규한 합성 항체 및 이의 용도를 제공한다.

Description

VEGF에 대한 합성 항체 및 이들의 용도 {SYNTHETIC ANTIBODIES AGAINST VEGF AND THEIR USES}
이 출원서 전체에 걸쳐, 다양한 간행물은 괄호 안에 언급된다. 이러한 간행물의 개시 내용은 전체적으로 본원에 참고문헌으로 포함된다.
나이-관련 황반 변성 (AMD)은 60대 이상의 사람들에서 시력 상실 및 실명의 주요 원인이다. AMD는 건성 (비-혈관신생) 또는 습성 (혈관신생) AMD로 진단된다. AMD 환자의 약 85 내지 95 퍼센트는 건성 AMD로 진단된다. 이는 황반 조직의 노화 및 얇아짐으로 발생할 수 있는 질환의 초기 단계로, 황반에 드루젠 (drusen)이라고 불리는 황색 반점을 특징으로 하는 색소 침착을 야기한다. 점진적인 중심 시력 손실은 건성 황반 변성과 함께 발생할 수 있지만, 일반적으로 습성 AMD만큼 심각하지는 않다.
상당한 비율의 경우, 건성 AMD는 보다 진행된 해로운 형태의 질환인 습성 AMD로 진행되어 심각한 시력 상실을 야기한다. 습성 AMD는 망막 아래의 새로운 혈관의 형성 (혈관형성)으로 혈액과 체액이 누출이 발생하는 맥락막 혈관신생 과정을 특징으로 한다. 이러한 누출은 광-민감성 망막세포에 대한 영구적인 손상을 야기하며, 시력 상실을 유발한다. 혈관 내피 성장인자 (VEGF)는 맥락막 혈관신생의 발병 기전에 중추적인 역할을 하는 것으로 보인다.
습성 AMD에 대한 치료법은 레이저 광응고화, 비쥬다인® (Valeant Pharmaceuticals International)을 이용한 광역학 레이저 요법 및 항-VEGF 약물을 포함한다. 항-VEGF 제제의 발견은 이 질환의 치료에 혁신을 가져왔다. 현재 승인되거나 흔히 사용되는 4 종의 항-VEGF 제제는 페갑타닙 (마쿠젠®, Valeant Pharmaceuticals International), 라니비주맙 (루센티스®, Novartis 및 Roche), 애플레버셉트 또는 VEGF 트랩-아이 (아일리아®, Bayer 및 Regeneron Pharmaceuticals) 및 베바시주맙 (아바스틴®, Roche)을 포함한다.
항-VEGF 요법은 습성 AMD를 치료하는데 사용될 수 있다. 그러나, 현재 치료법은 3개월 동안 한 달에 한 번씩 감염된 눈에 항-VEGF 약물을 자주 주사한 다음, 추가 주사를 위한 치료를 모니터링한다. 주사제의 빈번한 투여는 환자의 안구에서 황반 부종 및 스트레스와 같은 합병증이 유발된다. 황반 부종이 길어지면, 망막이 얇아져, 결국 흉터 또는 망막원공이 형성될 수 있다. 이와 같이, 습식 AMD와 같은 비정상적인 혈관형성과 관련된 질환을 치료하기 위한 개선된 약물 및 방법이 절실히 필요하다.
본 발명은 신규한 항-VEGF 항체; 및 이러한 신규한 항-VEGF 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 포함한, 조성물 및 이의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 신규한 항-VEGF 항체, 이러한 신규한 항-VEGF 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학 조성물을 포함한, 조성물을 습성 나이 관련 황반변성 (AMD), 당뇨병성 황반병증, 증식당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 (RVO)에서의 황반부종, 홍채 혈관신생, 병적 근시로 인한 맥락막 혈관신생, 성인 (maturity)의 망막증, 혈관신생성녹내장 및 암과 같은 질환을 억제 또는 치료하는 방법에 사용하는 것을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1. BSA 50 ㎍/mL부터 500 ㎍/mL까지 선형을 나타내는 브래드포드 단백질 분석을 이용하여 대비 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA) 및 595 nm의 흡광도를 기초로 한 Fab 단백질 농도를 결정하기 위한 표준 곡선.
도 2. 고정된 인간 VEGF (hVEGF) 121 이소폼 및 고정된 hVEGF에 결합한 가용성 항-VEGF Fab를 검출하고 450 nm의 흡광도를 갖는 비색 (colormetric) 생성물을 생성하기 위한 겨자무과산화효소 (HRP)-결합 항-카파 경쇄 항체를 포함하는 ELISA 포맷에서 알려진 농도의 항-VEGF Fab (루센티스®, Novartis 및 Roche)와 비교하여, 항-VEGF 활성을 이용한 Fab의 양을 정량하기 위한 표준 곡선.
도 3. hVEGF-121에 대한 Fab 클론 #201 (Fab 201) 및 라니비주맙의 최대 억제 농도의 반 값 (IC50)을 측정하기 위한 경쟁적 결합 분석. Fabs는 x축에 기록된 hVEGF-121의 다양한 농도로 2번의 개별적인 실험에서 배양되었다. y축에 나타난 바와 같이, 각 Fab의 비결합 분획을 hVEGF-121 코팅 플레이트로 포획하고 항-카파-경쇄-HRP-결합 항체로 정량화하였다. 100pM의 각 Fab는 hVEGF-121의 계열 희석액과 함께 배양되었다. 비결합 Fab는 고정된 hVEGF-121로 포획하고 항-카파-경쇄-HRP-결합 항체로 검출하였다. 프리즘 소프트웨어 (Prism software)를 이용하여 5 파라미터 비대칭 모델로 맞춰진 데이터로부터 계산된 IC50으로 평가된 Kd이 표 4에 나타나 있다.
도 4a-b. (A) 재조합 hVEGF 121 이소폼을 갖는 나이브 (naive) 합성 항체 단편 (Fab) 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 수득된 Fab의 CDR 서열, (B) Fab-ELISA 포맷에서 고정된 hVEGF 및 상기 나이브 파지 디스플레이 라이브러리 유래의 가용성의 선별된 Fab의 계열 희석액을 이용한 결합 친화도 분석. (A) 카밧에 따른 CDR에 상응하는 아미노산 서열은 밑줄로 표시되고, Fab-ELISA에 의한 적정은 다음과 같이 수행된다: (B) 증가하는 농도의 Fab를 2ug/mL의 hVEGF-121로 코팅된 웰 상에서 배양하였다. 결합된 Fab는 항-카파-경쇄-HRP-결합 항체로 검출하였다. 해리 상수 (Kd)는 50% 유효 최대 농도 (EC50)로부터 평가되었고 라인 그래프 아래의 표에 기록되었다.
도 5. 경쟁적 Fab-ELISA 포맷에서, 경쟁자로서 VEGF 천연 수용체인, FLT의 존재 (+) 또는 부재 (-)에서 고정된 hVEGF에 대한 선별된 Fab의 결합 억제를 나타내는, hVEGF 상의 중복되는 결합 부위를 갖는 FLT 및 6개의 Fab와 일치하는 막대 그래프. 미량정량 플레이트의 웰은 2ug/mL의 hVEGF로 코팅되었다. 세척된 웰을 PBT (+)에 용해한 500nM의 FLT (R&D systems, 카탈로그 번호 321-FL-250) 또는 PBT 단독 (-)과 함께 1시간 동안 사전-배양하였다. 포화량보다 적은 양(sub-saturating amount)의 Fabs를 상기 FLT- 또는 FLT+ 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 15분 동안 배양하고 세척하였다. 웰에 첨가된 Fab의 동정은 y축 상에서 확인된다. 결합 Fab는 항-카파-경쇄-HRP 항체로 검출되었다. 백그라운드에서 OD 450nm 측정값을 뺀 값이 y축에 기록된다.
도 6a-c. (A) FF0124-1 Fab 서열에 기초한 라이브러리의 선별로부터 비롯된 Fab의 CDR 서열. Fab는 10nM의 hVEGF가 Fab-파지로 사전배양되었을 때 경쟁-파지-ELISA에서 관찰된 잔류 결합 (residual binding)에 의해 순위가 매겨진다 (B 및 C). 패널 A에 열거된 서열을 갖는 상이한 클론에 대한 경쟁적 파지-ELISA 결과. 1nM (B) 또는 10nM (C)의 hVEGF와의 사전배양 후 고정된 hVEGF에 대한 Fab-파지에 대한 잔류 결합은 hVEGF 사전배양이 없는 결합의 백분율로 나타내었다. (*) CDR-H3 (카밧으로 정의됨)는 또한 클론의 그룹에서 "HAWYYGWAFDY" 서열을 가졌다. (**) CDR-H3 (카밧으로 정의됨)는 또한 클론의 그룹에서 "HAWYYGWALDY" 및 "HAWYYGWAFDY" 서열을 가졌다. 비교를 위해 모 Fab인 FF0124-1에 대한 서열 및 경쟁적 파지 ELISA를 도시하였다. 카밧에 따른 CDR에 상응하는 아미노산 서열은 밑줄로 표시되었다. 모 Fab (FF0124-1)와 상이한 아미노산 서열은 굵은 글자로 강조 표시하였다.
도 7a-b. (A) FF0158-C4 Fab 서열에 기초한 라이브러리의 선별로부터 비롯된 Fab의 CDR 서열, 진탕 플라스크 (shake flask)에서의 수율 및 단일 포인트 경쟁 ELISA 및/또는 경쟁 ELISA에 의한 친화도 측정 (Kd - B에 도시된 데이터 및 피트(fit)). 카밧에 따른 CDR에 상응하는 아미노산 서열은 밑줄로 표시하였다. 모 Fab (FF0158-C4)와 상이한 아미노산 서열은 굵은 글자로 강조 표시하였다.
도 8. FF0188-H5 Fab 서열에 기초한 라이브러리의 선별로부터 비롯된 Fab의 CDR 서열, 진탕 플라스크 (shake flask)에서의 생산 수율 및 단일 포인트 경쟁 ELISA 및/또는 경쟁 ELISA에 의한 친화도 측정 및 용융 온도 (Tm). 카밧에 따른 CDR에 상응하는 아미노산 서열은 밑줄로 표시하였다. 모 Fab (FF0188-H5)와 상이한 아미노산 서열은 굵은 글자로 강조 표시하였다.
도 9a-c. Fab CDR 서열, 생산 수율 및 hVEGF 결합 동적 파라미터가 도시되어 있다. (A) CDR 서열, 진탕 플라스크에서의 수율, SPR로 측정된 hVEGF-121 결합 해리 속도 (binding off rate) 및 B에 도시된 데이터인 용융 온도 (Tm)를 포함한 표. 카밧에 따른 CDR에 상응하는 아미노산 서열은 밑줄로 표시하였다. 모 Fab (FF0117-A5)와 상이한 아미노산 서열은 굵은 글자로 강조 표시하였다. (B) 열이동분석. (C) Fab FF03046-2에 대한 전장 서열의 예.
도 10. 재조합 인간 VEGF 165 이소폼이 HUVEC 세포 증식을 자극하기 위해 사용된, 항-VEGF Fab인, FF03046-1, FF03046-2 및 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche)에 의한 hVEGF-의존 인간 혈관내피세포 (HUVEC) 증식의 억제. 2x105 세포/ml의 로그기 Huvec 세포를 260pM의 rhVEGF-165와 함께 사전배양한 Fab의 계열 희석액에 첨가하였다. 그 다음, 전에 세포를 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 살아있는 세포의 수를 레자주린 염색으로 평가하였다.
도 11. 경쟁 Fab-ELISA. 5pM의 hVEGF-165를 도면 설명에 기재된 바와 같이 항-VEGF 항체의 계열 희석액과 함께 배양하였다. 결합 용액 상의 임의의 비결합 hVEGF-165와 함께 사전에 형성된 hVEGF-165/항-VEGF 항체 복합체를, 퀀티킨® ELISA 인간 VEGF 면역분석 (R&D 카탈로그 번호: SVE00)에 제공된 바와 같은, 인간 VEGF에 특이적인 모노클로날 항체로 코팅된 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트로 옮긴다. 퀀티킨® 분석 키트에 제공된 바와 같은 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 정량하기 위한 크로마젠 (chromagen)으로 테트라메틸벤지딘 및 겨자무과산화효소에 결합된 폴리클로날 항-hVEGF 항체를 이용하여 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 검출한다. 프리즘 소프트웨어 (Prism software)를 이용하여 5 파라미터 비대칭 모델로 맞춰진 데이터로부터 계산된 Kd가 본 도면의 하단 표에 나타나 있다.
도 12. 항-VEGF Fc-Fab 융합체인, FF03092-1의 DNA 및 단백질 서열.
도 13. 항-VEGF Fc-scFv 융합체인, FF03077-4의 DNA 및 단백질 서열. 단일 사슬 핵산 서열: scFv 융합체 서열은 밑줄로 표시하였고; Fc 서열은 이탤릭체로 표시하였으며; Fc와 scFv 사이의 링커는 밑줄 및 굵은 글자로 표시하였고; IMGT®에 따라 정의된 CDR에 상응하는 DNA 코딩 서열과 아미노산 서열은 굵은 글자로 표시하였으며; scFv에서 카밧에 따라 정의된 Fab FF03046-2의 CDR 서열에 상응하는 DNA 코딩 서열 및 아미노산 서열은 이중 밑줄로 표시하였다.
도 14. 경쟁 ELISA. 5pM의 hVEGF-165를 도면 설명에 기재된 바와 같이 항-VEGF 항체의 계열 희석액과 함께 배양하였다. 결합 용액 상의 임의의 비결합 hVEGF-165와 함께 사전에 형성된 hVEGF-165/항-VEGF 항체 복합체를, 퀀티킨® ELISA 인간 VEGF 면역분석 (R&D 카탈로그 번호: SVE00)에 제공된 바와 같은, 인간 VEGF에 특이적인 모노클로날 항체로 코팅된 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트로 옮긴다. 퀀티킨® 분석 키트에 제공된 바와 같은 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 정량하기 위한 크로마젠 (chromagen)으로 테트라메틸벤지딘 및 겨자무과산화효소에 결합된 폴리클로날 항-hVEGF 항체를 이용하여 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 검출한다. 프리즘 소프트웨어 (Prism software)를 이용하여 5 파라미터 비대칭 모델로 맞춰진 데이터로부터 계산된 Kd가 본 도면의 하단 표에 나타나 있다.
도 15. 항-VEGF 전장 성숙 IgG1인, FF03092-3의 DNA 및 단백질 서열.
도 16. 이중 밑줄로 나타낸 실시예 3의 대체가능한 구현 코딩 서열을 갖는 항-VEGF Fab #216의 DNA 및 단백질 서열.
도 17. 항-VEGF Fab 201에 대한 발현 플라스미드의 개략적 표현.
도 18. 항-VEGF Fab 216에 대한 발현 플라스미드의 개략적 표현.
도 19. hVEGF-121에 대한 Fab 클론 #216 (Fab 216) 및 루센티스 (라니비주맙, Novartis 및 Roche)의 최대 억제 농도의 반 값 (IC50)을 측정하기 위한 경쟁적 결합 분석. Fab는 x축에 기록된 hVEGF-121 (Peprotech, Cat-100-20A)의 다양한 농도로 2번의 개별적인 실험에서 배양되었다. y축에 나타난 바와 같이, 각 Fab의 비결합 분획을 hVEGF-121 코팅 플레이트로 포획하고 항-카파-경쇄-HRP-결합 항체로 정량화하였다. 100pM의 각 Fab #216는 hVEGF-121의 계열 희석액과 함께 배양되었다. 비결합 Fab는 고정된 hVEGF-121로 포획하고 항-카파-경쇄-HRP-결합 항체로 검출하였다. 프리즘 소프트웨어 (Prism software)를 이용하여 5 파라미터 비대칭 모델로 맞춰진 데이터로부터 계산된 IC50으로부터 평가된 Kd가 본 도면의 하단 표에 나타나 있다.
도 20. 경쟁-ELISA. 10pM의 hVEGF-165를 항-VEGF 항체인, Fab 216의 계열 희석액과 함께 배양하였다. 결합 용액 상의 임의의 비결합 hVEGF-165와 함께 사전에 형성된 hVEGF-165/항-VEGF 항체 복합체를, 퀀티킨® ELISA 인간 VEGF 면역분석 (R&D 카탈로그 번호: SVE00)에 제공된 바와 같은, 인간 VEGF에 특이적인 모노클로날 항체로 코팅된 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트로 옮긴다. 퀀티킨® 분석 키트에 제공된 바와 같은 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 정량하기 위한 크로마젠 (chromagen)으로 테트라메틸벤지딘 및 겨자무과산화효소에 결합된 폴리클로날 항-hVEGF 항체를 이용하여 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 검출한다. 프리즘 소프트웨어 (Prism software)를 이용하여 5 파라미터 비대칭 모델로 맞춰진 데이터로부터 계산된 IC50을 이용하여 평가된 Kd는 본 도면의 하단 표에 나타나 있다.
도 21. 항-VEGF에 대한 발효 데이터 및 발현 수율.
도 22. 4℃에서의 의약품 Fab 201의 안정성.
도 23. Fab 201과 루센티스® (라니비주맙)의 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 정렬. 정렬된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열의 위와 아래의 라인은 각각 카밧 및 IMGT® 방법으로 정의된 바와 같은, 서열번호 16에 기재된 Fab 201의 CDR의 위치를 나타낸다. 루센티스® (라니비주맙)의 서열은 GenBank 등록번호 APZ76728.1 및 APZ76729.1로부터 수득된다.
도 24. Fab 201과 루센티스® (라니비주맙)의 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역의 정렬. 정렬된 카파 경쇄 가변 영역 서열의 위와 아래의 라인은 각각 카밧 및 IMGT® 방법으로 정의된 바와 같은, 서열번호 16에 기재된 Fab 201의 CDR의 위치를 나타낸다. 루센티스® (라니비주맙)의 서열은 GenBank 등록번호 APZ76728.1 및 APZ76729.1로부터 수득된다.
서열목록
본 특허출원서에서의 서열 서열목록
최적화된 인간 프레임워크 및 마우스와 인간 VEGF에 대해 친화도 성숙된 CDR-H1, -H2 & -H3를 갖는 가변 및 CH1 도메인을 갖는 불변 영역을 포함하는 Fab FF03046-2 항체의 Ig 중쇄 단편을 코딩하는 핵산 서열 서열번호 1
서열번호 1로 코딩되는 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 서열번호2
최적화된 인간 프레임워크 및 마우스와 인간 VEGF에 대해 친화도 성숙된 CDR-L1, L2 및 L3를 갖는 가변 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는, 합성 인간화 항-VEGF Fab 항체 단편인, Fab FF03046-2의 Ig 경쇄를 코딩하는 핵산 서열 서열번호 3
서열번호 3으로 코딩되는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 서열번호 4
인간화 Fab 단편에 융합된 아미노 말단 인간화 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 인간화 항-VEGF Fc-Fab 융합체를 형성하기 위해 사용된 합성 인간화 항체 FF03092-1 중쇄 융합체를 코딩하는 핵산 서열 서열번호 5
서열번호 5로 코딩되는 합성 인간화 항체 FF03092-1 중쇄 융합체의 아미노산 서열 서열번호 6
인간화 Fab 단편에 융합된 아미노 ::말단 인간화 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 인간화 항-VEGF Fc-Fab 융합체를 형성하기 위해 사용된 합성 인간화 항체 FF03092-1 카파 경쇄를 코딩하는 핵산 서열 서열번호 7
서열번호 7로 코딩되는 합성 인간화 항체 FF03092-1 카파 경쇄의 아미노산 서열 서열번호 8
인간 및 마우스 VEGF에 대한 인간화 항-VEGF 단일 사슬 Fv (scFv)에 융합된 아미노-말단 인간화 Fc 단편을 포함하는 합성 인간화 항체 FF03077-4를 코딩하는 핵산 서열 서열번호 9
인간 및 마우스 VEGF에 대한 인간화 항-VEGF 단일 사슬 Fv (scFv)에 융합된 아미노-말단 인간화 Fc 단편을 포함하는, 서열번호 9로 코딩되는 합성 인간화 항체 FF03077-4의 아미노산 서열 서열번호 10
마우스 및 인간 VEGF에 대한 최적화된 인간 프레임워크 및 친화도 성숙된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는, 합성 인간화 항-VEGF 전장의 성숙 IgG1 항체인, FF03092-3 중쇄를 코딩하는 핵산 서열 서열번호 11
마우스 및 인간 VEGF에 대한 최적화된 인간 프레임워크 및 친화도 성숙된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는, 서열번호 11로 코딩되는, 합성 인간화 항-VEGF 전장 성숙 IgG1 항체인, FF03092-3 중쇄의 아미노산 서열 서열번호 12
마우스 및 인간 VEGF에 대한 최적화된 인간 프레임워크 및 친화도 성숙된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는, 합성 인간화 항-VEGF 전장 성숙 IgG1 항체인, FF03092-3 카파 경쇄의 핵산 서열 서열번호 13
마우스 및 인간 VEGF에 대한 최적화된 인간 프레임워크 및 친화도 성숙된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는, 서열번호 13으로 코딩되는, 합성 인간화 전장 성숙 IgG1 항체인, FF03092-3 카파 경쇄의 아미노산 서열 서열번호 14
E. coli Pho A 프로모터의 핵산 서열 서열번호 15
발현 플라스미드 클론 #201에 존재하는 마우스 및 인간 VEGF에 대한 비-코딩의 인터시스트론 사이 영역(intercistronic region)과 함께 아미노-말단 분비 신호를 갖는 합성 인간화 Fab 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산 서열 서열번호 16
발현 플라스미드 클론 #201에 의해 코딩되는 아미노-말단 분비 신호와 함께 마우스 및 인간 VEGF에 대한 합성 인간화 항-VEGF Fab 항체의 Ig 카파 경쇄의 아미노산 서열 서열번호 17
발현 플라스미드 클론 #201에 의해 코딩되는 아미노-말단 분비 신호와 함께 마우스 및 인간 VEGF에 대한 합성 인간화 항-VEGF Fab 항체의 Ig 중쇄 단편의 아미노산 서열 서열번호 18
발현 플라스미드 클론 #201의 Ig 코딩 서열의 전사를 종결하기 위해 사용된 리보솜 RNA 유전자 종결자의 핵산 서열 서열번호 19
발현 플라스미드 클론 #201을 구성하는데 사용되는, pBR322의 테트라사이클린 내성 유전자가 결실된 뉴클레오타이드 위치 1353부터 4361까지의 pBR322 (GenBank 등록번호: J01749.1)의 핵산 서열 서열번호 20
변이체 201 서열번호 21
변이체 202 서열번호 22
변이체 203 서열번호 23
변이체 204 서열번호 24
변이체 205 서열번호 25
변이체 206 서열번호 26
변이체 207 서열번호 27
변이체 208 서열번호 28
변이체 209 서열번호 29
변이체 212 서열번호 30
변이체 213 서열번호 31
변이체 214 서열번호 32
변이체 215 서열번호 33
변이체 216 서열번호 34
변이체 217 서열번호 35
변이체 218 서열번호 36
변이체 219 서열번호 37
변이체 220 서열번호 38
FF0124-1 F2078
도 4		 서열번호 39
FF0124-2 F2083
도 4		 서열번호 40
FF0124-3 F2086
도 4		 서열번호 41
FF0124-4 F2088
도 4		 서열번호 42
FF0124-5 F2091
도 4		 서열번호 43
FF0124-6 F2094
도 4		 서열번호 44
FF0124-7 F2116
도 4		 서열번호 45
FF0158-C4
도 6		 서열번호 46
FF0158-F11
도 6		 서열번호 47
FF0158-C11
도 6		 서열번호 48
FF0158-F2
도 6		 서열번호 49
FF0158-E2
도 6		 서열번호 50
FF0158-C3
도 6		 서열번호 51
FF0158-B10
도 6		 서열번호 52
FF0158-C2
도 6		 서열번호 53
FF0128-1
도 6		 서열번호 54
FF0158-C4 (2)
도 7		 서열번호 84
FF0187-B3
도 7		 서열번호 85
FF0187-C1
도 7		 서열번호 86
FF0187-A12
도 7		 서열번호 87
FF0187-H3
도 7		 서열번호 88
FF0188-H5
도 7		 서열번호 89
FF0188-B10
도 7		 서열번호 90
FF0188-F12
도 7		 서열번호 91
FF0188-B6
도 7		 서열번호 92
FF0188-A2
도 7		 서열번호 93
FF0188-A9
도 7		 서열번호 94
FF0117-A3
도 8		 서열번호 55
FF0117-A5
도 8		 서열번호 56
FF0117-A8
도 8		 서열번호 57
FF0117-A10
도 8		 서열번호 58
FF0117-A11
도 8		 서열번호 59
FF0117-A12
도 8		 서열번호 60
FF0117-B5
도 8		 서열번호 61
FF0117-B9
도 8		 서열번호 62
FF0117-B11
도 8		 서열번호 63
FF0188-H5(2)
도 8		 서열번호 64
FF03033-1
도 9A		 서열번호 65
FF03033-2
도 9A		 서열번호 66
FF03033-3
도 9A		 서열번호 67
FF03033-4
도 9A		 서열번호 68
FF03033-5
도 9A		 서열번호 69
FF03033-6
도 9A		 서열번호 70
FF03033-8
도 9A		 서열번호 71
FF03046-2
도 9A		 서열번호 72
FF0117-A5 (2)
도 9A		 서열번호 73
FF03077-4 항-VEGF Fc-scFv 융합
단일 사슬 핵산 서열:
도 13		 서열번호 74
FF03077-4 항-VEGF Fc-scFv 융합
단일 사슬 아미노산 서열:
도 13		 서열번호 75
항-VEGF Fab 216
경쇄 (hK) 아미노산 서열:
도 16		 서열번호 76
항-VEGF Fab 216
경쇄 (hK) 핵산 서열:
도 16		 서열번호 77
항-VEGF Fab 216
중쇄 아미노산 서열:
도 16		 서열번호 78
항-VEGF Fab 216
중쇄 핵산 서열:
도 16		 서열번호 79
루센티스 (라니비주맙) 중쇄
(GenBank 등록번호: APZ76728.1)
도 23		 서열번호 80
Fab 201 중쇄
도 23		 서열번호 81
루센티스 (라니비주맙) 경쇄
도 24
(GenBank 등록번호: APZ76729.1)		 서열번호 82
Fab 201 경쇄
도 24		 서열번호 83
발명의 상세한 설명
정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 관련 실시예가 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나 (a)", "또는", 및 "그 (the)"는 문맥상 다르게 명시하지 않는 한 복수의 대상을 포함함을 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어, "항체"는 복수의 상기 항체를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 "및/또는"은 열거된 항목들 중 하나 이상의 임의의 가능한 모든 조합뿐만 아니라, 대안 ("또는")으로 해석될 때 결여된 조합을 지칭하고 포함한다.
본원에 사용된, "적어도 하나"는 열거된 요소의 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된, 용어 "실질적으로 없는"은 주어진 물질 또는 세포 종류가 없거나 또는 그 물질 또는 세포 종류가 거의 없는 것, 예를 들어, 주어진 물질 또는 세포 종류가 약 1% 미만인 것을 포함한다.
본원에 사용된, 용어 혈관 내피 성장인자 "VEGF"는 구체적으로 또는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-G 및 PLGF의 7종의 멤버를 포함하는 VEGF 패밀리의 임의의 천연, 변이체 또는 합성 VEGF 폴리펩타이드, 또는 이의 단편을 지칭하며, 모든 멤버는 각각의 단량체 내에 보존된 중심 4가닥의 β-시트의 일측 단부에 분자 사이 및 분자 내 이황화 결합에 관련된 8개의 불변 시스테인 잔지를 갖는 시스테인 매듭 (knot) 모티프로 구성되는 공통의 VEGF 상동 도메인을 가지며, 역평행의 나란한 (side-by-side) 배향으로 이합체화되고, 혈관생성에 참여한다 (문헌 [Hoeben, A., et al. (2004) Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol . Rev. 56, 549-580]에서 검토됨; 분자 사이 및 분자 내 이황화 결합을 갖는 시스테인 매듭 모티프의 3D 구조에 대한 문헌 [Hoeben et al. (2004)]의 도 1을 참조한다). VEGF 패밀리 내의 각 멤버는 별개의 유전자에 의해 코딩된다; 그러나 각 멤버는 선택적인 스플라이싱 또는 단백질분해로 인해 다수의 상이한 이소폼을 포함할 수 있다.
바람직한 실시예에서, VEGF는 혈관형성을 촉진하거나 유지하는데 역할을 하는 VEGF-A 및 이의 이소폼이다. 예를 들어, "-A"에 대한 언급 없이 VEGF로서 문헌에 언급될 수도 있는 VEGF-A 유전자의 1차 전사체의 선택적인 스플라이싱은, 종종 VEGF 다음에 단순히 숫자가 표시되는 상이한 VEGF-A 이소폼을 코딩하는 상이한 VEGF-A mRNA를 생산하고, VEGF-A 유전자의 선택적으로 스플라이싱된 엑손 8a 또는 8b의 존재에 따라 혈관형성촉진 (pro-angiogenic) 또는 항-혈관형성 특성을 갖는 상이한 이소폼을 나타낸다. 특별한 관심의 대상은 선택적 스플라이싱된 엑손 8a의 번역으로부터 수득되는 VEGF-A 이소폼이며, 이는 엑손 8b를 갖는 것과는 대조적으로 일반적으로 혈관형성촉진성이다. 인간에서, 선택적인 스플라이싱으로부터의 엑손 8a-함유 VEGF-A 이소폼은: VEGF-A121 (보통 VEGF121로도 지칭됨), VEGF-A145 (보통 VEGF145로도 지칭됨), VEGF-A148 (보통 VEGF148로도 지칭됨), VEGF-A165 (보통 VEGF165로도 지칭됨), VEGF-A183 (보통 VEGF183으로도 지칭됨), VEGF-A189 (also, often called VEGF189) and VEGF-A206 (보통 VEGF206으로도 지칭됨)을 포함한다 (문헌 [Nowak, D. G., et al. (2008) Expression of pro- and anti-angiogenic isoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growth factors. J. Cell Sci . 121, 3487-3495]). VEGF-A의 각 이소폼에서 VEGF 다음의 수는 신호 서열 절단 후 분비 후의 아미노산 수를 지칭한다; 이 숫자는 각각 VEGF121 또는 VEGF121과 같이 첨자 또는 인라인일 수 있다. 마우스와 같은 설치류에서, 이들 VEGF 이소폼의 오르소로그 (ortholog)는 하나의 아미노산을 덜 함유한다. VEGF는 보통 헤파린에 결합하는 능력이 상이한 이의 이소폼을 갖는 동종이량체 (homodimeric) 당단백질이다. 더 큰 고도의 염기성 VEGF189 및 VEGF206 이소폼은 세포외기질 매트릭스 (ECM)의 세포-표면 헤파린 함유 프로테오글리칸에 단단히 결합하지만; 산성 VEGF121 이소폼은 헤파린에 결합하는 능력이 결여되어 자유롭게 확산가능하다. VEGF165 이소폼은 헤파린과 EMC에 결합하는 상당한 분획을 갖는 중간 특성을 나타낸다. 선택적인 스플라이싱에 의해 생성된 VEGF 이소폼 이외에도, ECM-결합 VEGF는 인간 VEGF-A 이소폼의 VEGF165 또는 VEGF189의 단백질분해로부터 VEGF110 또는 VEGF100과 같은 고도의 유사분열촉진 활성을 갖는 생물 활성 단편을 생성하는 단백질분해를 거칠 수 있다 (문헌 [Ferrara, N., Gerber, H.-P., and LeCouter, J. (2003) The biology of VEGF and its receptors. Nature Medicine 9, 669-676]; 또한 상기 문헌 [Hoeben, A., et al. (2004)]을 참조한다). VEGF100 이외에도, 천연 단백질분해 또는 인공의 유전자의 VEGF 패밀리로부터 유래된 VEGF 단백질의 임의의 단편이, 항체가 이에 대해 유발되거나 이에 지시되는 한, VEGF로 간주될 수 있고, VEGF 단백질 단편은 혈관형성, 황반 변성, 종양 또는 인간 질환을 촉진 또는 유지하는데 역할을 한다.
개체 또는 배양된 세포로부터 VEGF 단백질을 분리하는 것 외에도, VEGF 단백질을 재조합 DNA 방법으로 생산할 수 있다. 예를 들어, 임의의 VEGF 이소폼 또는 단편 또는 변이체에 대한 VEGF 단백질은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 박테리아, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 생산되거나 또는 생체 외 (in vitro)에서 무세포 번역 추출액 또는 결합된 전사-번역 추출액에서 생산될 수 있다. 박테리아 세포에서 생산하는 경우, 박테리아에서 생산된 재조합 VEGF 단백질은 동일한 최초 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 포유동물 세포로부터 분리된 VEGF 단백질과 달리 글리코실화와 같은 번역 후 변형이 결여될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 천연의 기원으로부터 분리된 VEGF 이외에도, 박테리아 세포에서 생산된 VEGF, 생체 외 (in vitro)에서 무세포 번역 시스템 또는 결합된 전사-번역 시스템을 이용하는 것과 같이 생체 외 (in vitro)에서 생산된 VEGF, 또는 재조합 방법으로 생산된 VEGF를 포함한다. VEGF 항원은 자연 발생, 재조합 또는 합성 VEGF 분자일 수 있다. 상기 VEGF 항원은 손상되지 않은 VEGF 단백질, VEGF 이소폼, VEGF의 단편 또는 VEGF의 일부로부터 유래된 서열을 갖는 펩타이드에 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "야생형 VEGF 서열"은 일반적으로 자연 발생 VEGF 이소폼에서 발견되거나 또는 포유동물 세포에서 최초 VEGF 유전자 전사체의 가공 후의 VEGF mRNA 번역으로부터 유래되거나 또는 임의의 VEGF cDNA의 번역으로부터 유래되는 최초의 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 VEGF cDNA는, 예를 들어, 마우스 또는 인간 세포와 같은 포유동물 세포로부터의 폴리좀 VEGF mRNA의 전사체의 역전사에 의해 수득될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 손상되지 않은 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가항체 (예를 들어, 결합가 및 예를 들어 2가 IgG 항체 대 이의 1가 Fab 항체 단편에 대해 관찰된 증가된 결합력에 따라 하나 이상의 항원과 결합할 수 있도록 동일한 특이성의 하나 이상의 항원 결합 부위를 갖는 항체), 다중특이성 항체 (예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이성 항체)을 포함하고 또한 (본원에 상세히 기술된 바와 같이) 특정 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화, 친화도 성숙된 및/또는 합성된 것일 수 있다. 항체는 예를 들어, 동물에서의 생체 내 (in vivo), 조직 또는 세포 배양에서, 또는 생체 외 (in vitro) 단백질 합성 시스템에서 효소 및/또는 화학적 합성 방법과 같은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 생산될 수 있다. 재조합 DNA 방법은 항체의 생산에 사용될 수 있고, 생성된 항체는 재조합 항체로 간주될 수 있다. 재조합 항체는 박테리아에서의 생산과 같이 동물성 생성물 없이 생산될 수 있다. 항체 또는 이의 단편이 박테리오파지의 표면 상에 나타날 수 있다.
"항체 단편" 또는 "항체 단편"은 항체의 단지 일부이며, 이 부분은, 손상되지 않은 항체에 존재할 때, 적어도, 바람직하게 통상적으로 그 일부와 관련된 기능의 다수 또는 모두를 보유한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 Fv (scFv) 항체 분자를 포함하는 단일-사슬 항체 분자; 동일한 특이성을 갖는 동일한 항체 단편의 다중 복제물로부터 형성된 다가항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
합성 인간 항-VEGF 항체는 하나 이상의 이의 초가변영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)에 하나 이상의 변화를 포함하는 "친화도 성숙된" 항체를 포함하며, 이는 이러한 변화를 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항체의 VEGF에 대한 친화성의 향상을 야기한다. 항체의 가변 영역에서 발견되는 CDR은 카밧 방법 또는 IMGT 방법에 의해 정의될 수 있다 (문헌 [Martin, A. C. R. (1996) Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics 25: 130-133; Johnson, G. and Wu, T. T. (2004) The Kabat Database and a Bioinformatics Example. Methods in Molecular Biology 248: 11-25; Kabat, E. A.,Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K., and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD.; MacCallum, R. M., Martin, A. C. R. and Thornton, J. T. (1996) Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography. J. Mol . Biol. 262, 732-745; Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G. (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev . Comp. Immunol . 27: 55-77; 및 Lefranc, M.-P. (2005) IMGT, the international ImMunoGeneTics information system®. Nucleic Acids Res. 33: D593-D597; Lefranc, M.-P. et al. (2009) IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®. Nucleic Acids Res. 37: D1006-D1012]). 항체의 특이성은 카밧 또는 IMGT® 방법을 포함하는 수많은 방법에 의해 정의될 수 있는 CDR 세트로 정의되거나 기재될 수 있다.
항체의 항원-결합 영역은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 CDR로 형성된 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.
질병 또는 질환은 본 발명의 항-VEGF 항체/조성물 또는 방법으로 치료하여 이점을 얻을 수 있는 상태이다. 이는 포유동물이 문제의 질병에 쉽게 걸리게 하는 병리학적 상태를 포함한 만성 또는 급성 질병 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료되는 질병의 비제한적인 예로 세포 증식성 질병을 포함한다. 세포 증식성 질병은 습성 나이 관련 황반변성, 당뇨병성 황반병증, 증식당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 (RVO)에서의 황반부종, 홍채 혈관신생, 병적 근시로 인한 맥락막 혈관신생, 성인 (maturity)의 망막증, 혈관신생성녹내장, 당뇨망막병증, 망막 혈관신생, 유리체절제술(PPV), 당뇨병성 황반부종 (DME) 또는 암과 같은 질환을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하는(treating)"은 질환 또는 질병 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 생물학적 징후를 개선하기 위한; (a) 상기 질환 또는 질병을 유발하거나 그 원인이 되는 생물학적 캐스케이드의 하나 이상의 지점 또는 (b) 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 생물학적 징후를 직접 또는 간접적으로 방해하기 위한; 하나 이상의 증상, 상기 질환 또는 질병 또는 이의 하나 이상의 증상 또는 질병 또는 치료와 관련된 하나 이상의 증상, 효과 또는 부작용을 완화하기 위한; 또는 상기 질환 또는 질병 또는 이들 질환 또는 질병의 하나 이상의 생물학적 징후의 진행을 늦추기 위한 치료법을 사용하는 것을 의미한다. 치료는 임상적으로 중요한 반응을 유발하는 것을 포함한다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 경감 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질병의 발달을 지연시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 안구 질환의 치료는 질환의 증상 개선, 질환의 중증도 감소, 질환의 진행 과정 변경 및/또는 기본적인 질환의 개선일 수 있다. 치료는 또한 질환 또는 질병을 앓고 있는 개체의 삶의 질을 개선시키는 것을 포함할 수 있다 (예를 들어, 암을 앓고 있는 개체는 본원에 기재된 조성물로 면역화되는 경우, 부작용을 일으키는 항-암 약물의 저용량을 받을 수 있다). 명세서에 걸쳐, 본 발명의 조성물 및 이의 사용을 위한 방법이 제공되며, 이를 필요로 하는 개체를 위해 적합한 치료를 제공하도록 선택된다.
"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농경용 가축(예를 들어, 암소, 양, 및 염소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 원숭이, 고릴라 및 침팬지), 마우스 및 래트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된, "유효량"은 원하는 치료 또는 예방의 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 필요한 시간의 기간 동안의, 효과적인 양을 지칭한다.
본원에 기술된 본 발명이 보다 완전하게 이해될 수 있도록 하기의 설명이 제시된다.
본 발명의 조성물 및 이를 제조하는 방법
본 발명은 신규한 항-VEGF 항체; 및 이러한 신규 항-VEGF 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는, 약학 조성물을 포함한, 조성물을 포함한다. 용어 "약학 제형", "약학 조성물" 및 "제형 (dosage form)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 개체에게 투여하기 적합한 형태로 본 발명의 유효성분(들)을 함유하는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 VEGF에 결합하는 본 발명의 하나 이상의 항체, 및/또는 VEGF에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 조성물은 버퍼를 포함한, 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 약학적으로 허용가능한 부형제와 같은 적합한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
단지 예시로서, 항체는 2개의 면역글로불린 경쇄와 2개의 면역글로불린 중쇄를 연결시킴으로써 생성될 수 있는 Y 형태를 취할 수 있는 단백질이며, 상기 하나의 경쇄는 단백질의 하나의 암(arm)을 형성하기 위해 하나의 중쇄와 결합된다. 2개의 암은 하나의 중쇄와 나머지 중쇄의 결합을 통해 연결된다. 전형적으로, 항체의 각 암은 동일한 항원을 인식하고 결합된 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 의해 형성된 항원 결합 부위를 통해 항원 상의 에피토프에 결합한다. 에피토프에 결합하는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 부분은 초가변 영역 또는 "상보성 결정 영역 (CDR)"으로 불린다. 특정 항원에 대한 항체의 특이성은 상이한 결합 특이성의 항체 사이에 가장 큰 가변성을 나타내는 초가변 영역 또는 CDR의 아미노산 서열에 의존한다. 나머지 비-초가변 영역 또는 비-CDR의 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 예를 들어, 각각의 경쇄 및 각각의 중쇄에 대해 CDR1-3로 불리는 가변 영역의 아미노부터 카르복실 말단까지의 3개의 CDR이 존재할 수 있으며, 이는 4개의 FR, 즉 FR1-4에 의해 구분된다. 중쇄 CDR로부터 경쇄 CDR을 구분하기 위해, 경쇄 CDR1-3은 CDRL1-CDRL3, 또는 CDR-L1 내지 CDR-L3으로 표시된다. 유사하게, 중쇄 CDR1-3은 CDRH1-CDRH3 또는 CDR-H1 내지 CDR-H3으로 표시된다. 경쇄 가변 영역에서 4개의 FR은 FRL1-FRL4 또는 FR-L1 내지 FR-L4로 표시된다. 또한, 중쇄 가변 영역에서 4개의 FR은 FRH1-FRH4 또는 FR-H1 내지 FR-H4로 표시된다. 따라서, 전형적인 가변 영역은 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4의 순서로 경쇄에 대한 아미노부터 카르복실 말단까지 결합시킴으로써 형성된다. 유사하게, 중쇄는 FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4의 순서로 형성된다. 경쇄 가변 영역은 경쇄를 완성시키는 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역이 이어진다. 반면, 중쇄 가변 영역은 이의 C-말단에서 두 번째 중쇄의 힌지 영역과의 사슬 간 교차연관에 참여하는 시스테인 잔기(들)을 갖는 CH1과 CH2 사이의 힌지 영역과 함께 불변 영역, CH1, CH2 및 CH3에 연결된다. 중쇄 불변 영역의 서열은 면역글로불린의 클래스 (IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM)를 결정하고 각 클래스 내에서 서브클래스 (예를 들어, IgG 클래스, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스)를 결정한다.
면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역은 엘빈 에이. 카밧 및 그의 동료들에 의한 서열 비교 (문헌 [Kabat, E.A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S. and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Volumes 1-3. 5th edition. NIH Publication No. 91-3242 (ISBN: 094137565X, 9780941375658])에 기초하여, 각 CDR에 대한 관계에 따라 특정 FR로 설계된 비-CDR 서열과 함께 정의될 수 있다. 다르게는, 면역글로불린에서 CDR의 확인을 위한 다른 방법은 마리-폴 르프랑 및 그의 동료들에 의해 개발되어 IMGT® 차트 및 CDR을 확인하기 위한 방법을 생성하였다 (문헌 [Lefranc, M.-P., et al. (1999) IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucl . Acids Res. 27, 209-212; Lefranc, M.-P., et al. (2015) IMGT®, the international ImMunoGeneTics® information system 25 years on. Nucl . Acids Res. 43, D413-D422]). CDR을 확인하기 위한 카밧 및 IMGT 방법 모두 본원에서 사용된다. 이 두 방법은 모두, 동일한 CDR 서열 생성하거나 또는 CDR 서열 사이에서 중복되거나 다른 방법으로 상응하는 CDR에 대해 결정된 CDR 서열을 갖는 이의 전체에 하나의 CDR이 포함된다. 두 방법 모두로 확인된 CDR 서열이 동일한 길이를 생성하지 못하거나 중복되는 경우, 프레임워크 영역 (자동적으로, 가변 영역에서 CDR 사이 또는 CDR 외부 영역)이 크기가 동일하지 않거나 유사하게 중복 서열을 가질 것이다.
일실시예에서, 본 발명은 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 갖는 분리된 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체를 제공한다: 아미노산 위치 31의 히스티딘부터 아미노산 위치 35의 히스티딘 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH1, 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH2 및 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH3.
본 발명의 항-VEGF 항체의 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 본원에 기재된 임의의 Y 변이체 (예를 들어, 실시예 3 및 도 9C와 16 참조)의 아미노산 서열과 대해 상이한, 예를 들어, 프레임워크 영역 내로 삽입, 결실 및/또는 치환되는 아미노산 잔기로 인해 변화하지만, CDR 영역 (예를 들어, 카밧 번호매김 또는 IMGT 번호매김; 또는 코티아 (Chothia) 명명법과 같은 다른 임의의 CDR 확인 시스템에 의해 정의됨) 내로 삽입, 결실 및/또는 치환되는 아미노산 잔기로 인한 변화는 아닌, 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 변이체는 Fab 단편 및 단일 사슬 Fv (scFv) 단편과 같은 항체 단편을 포함한다. 변이체는, 예를 들어, 도 12 및 13과 같은 융합 단백질을 추가로 포함한다. 변이체 및 본원에 기재된 항체는 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 분리된 항체의 일부는 유용한 면역학적으로 기능적인 단편을 포함하거나 CDR 영역, 경쇄 및/중쇄의 가변 도메인 또는 VEGF에 결합하는 항체의 일부와 같이, 항원 또는 항원의 에피토프에 결합하는 특이성(예를 들어, VEGF를 인식하고 결합함)을 제공한다. 당업자에게 본 발명의 항체가 낙타화될 수 있다는 것은 자명할 것이다.
예를 들어, 분리된 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 이의 생산 환경으로부터 분리되거나/분리되고 회수되는 것이다. 상기 생산 환경은 세포-기반, 예를 들어, 세포일 수 있고, 무세포, 예를 들어, 생체 외 (in vitro) 번역 또는 전사-번역 무세포 시스템과 결합된 것일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 (a) 예를 들어, 로우리 (Lowry) 방법으로 정의된 바와 같은 항체의 약 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 약 99 중량% 초과로, (b) 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 동질성으로 정제될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 예를 들어 온도, 시간, 양, 농도, 및 범위를 포함하는 것과 같이 숫자 지정 전에 사용될 때, (+) 또는 (-) 10 %, 5 % 또는 1 % 만큼 변할 수 있는 근사치를 나타낸다.
다른 일실시예에서, 본 발명은 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 분리된 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체를 제공한다: 아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알라닌 (서열번호 3)까지 포함하는 CDRL1, 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌 (서열번호 3)까지 포함하는 CDRL2, 및 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌 (서열번호 3)까지 포함하는 CDRL3.
다른 추가의 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 일부는 도 16에 굵은 글자로 표시된 IMGT 번호매김에 따라 정의된 다음의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인: 아미노산 서열 GFDLDHYS를 포함하는 CDRH1, 아미노산 서열 IYPSYGYT를 포함하는 CDRH2 및 아미노산 서열 ARHAWYYGWGLDY를 포함하는 CDRH3; 및 도 16에 굵은 글자로 표시된 IMGT 번호매김에 따라 정의된 다음의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인: 아미노산 서열 QAAYGR을 포함하는 CDRL1, 아미노산 서열 KAS를 포함하는 CDRL2 및 아미노산 서열 QQRGWYLFT를 포함하는 CDRL3.
추가의 일실시예는 다음의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함하는 항-VEGF 항체 또는 이의 일부를 제공한다: 아미노산 위치 31의 히스티딘부터 아미노산 위치 35의 히스티딘 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH1, 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH2 및 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH3.
본 발명은 인간화 항-VEGF 항체 또는 이의 일부를 제공한다. 본 발명의 항-VEGF 항체는 생체 내 (in vivo)에서 VEGF-유도 혈관형성을 억제한다.
또한, 본 발명은 합성 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체를 제공한다. 일실시예에서, 이는 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알라닌 (서열번호 3)까지 포함하는 CDRL1 또는 이의 일부, 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌 (서열번호 3)까지 포함하는 CDRL2 또는 이의 일부, 및 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌 (서열번호 3)까지 포함하는 CDRL3 또는 이의 일부; 및 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 31의 히스티딘부터 아미노산 위치 35의 히스티딘 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH1 또는 이의 일부, 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH2 또는 이의 일부 및 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 1)까지 포함하는 CDRH3 또는 이의 일부;를 포함한다.
본 발명의 항-VEGF 항체의 예로, 서열번호 21 내지 28에 각각 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 및 220을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 1인, 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노산 서열, FRH1을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 2인, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노산 서열, FRH2를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 3인, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노산 서열, FRH3를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 4인, 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노산 서열, FRH4를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 다음의 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다: 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지 포한하는 FRH1, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH2, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH3 및 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH4.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 1인, 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노산 서열, FRL1을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 2인, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노산 서열, FRL2를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 3인, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노산 서열, FRL3를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 4인, 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노산 서열, FRL4를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체는 다음의 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다: 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL1, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL2, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL3 및 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL4.
또 다른 추가의 일실시예에서, 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 (c) 다음의 프레임워크 영역 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL1 또는 이의 일부, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL2 또는 이의 일부, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL3 또는 이의 일부, 및 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL4 또는 이의 일부; 및 (d) 다음의 프레임워크 영역 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH1 또는 이의 일부, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH2 또는 이의 일부, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH3 또는 이의 일부, 및 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH4 또는 이의 일부;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 분리된 항-VEGF 항체 및 폴리뉴클레오타이드 실시예를 포함한다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 항체 및 폴리뉴클레오타이드 실시예를 포함한다.
본 발명의 항-VEGF 항체는 모노클로날 (예를 들어, 전장 또는 손상되지 않은 모노클로날 항체)일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 전장 항체이다. 또한, 일례에서, 상기 전장 항체는 서열번호 3에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 1에 나타난 중쇄를 포함한다. 다른 일실시예에서, 상기 전장 항체는 서열번호 3에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 1에 나타난 중쇄, 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 237의 시스테인 (서열번호 17)까지 포함하는 경쇄 및 아미노산 위치 24의 글루탐산부터 아미노산 위치 251의 트레오닌 (서열번호 18)까지 포함하는 중쇄 (예를 들어, 중쇄 Fab 216; 도 16), 또는 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 237의 시스테인 (서열번호 76)까지 포함하는 경쇄 (예를 들어, 경쇄 Fab 216; 도 16) 및 아미노산 위치 24의 글루탐산부터 아미노산 위치 251의 트레오닌 (서열번호 78)까지 포함하는 중쇄 (예를 들어, 중쇄 Fab 216; 도 16)를 포함한다.
또한 본 발명의 범위 내에 본원에서 제공되는 항-VEGF 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 이들 항체 단편은 효소 분해와 같은 전통적인 수단에 의해 생성될 수 있고, 또는 재조합 기술뿐만 아니라 화학적 방법의 사용을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 중쇄 사이의 사슬간 교차 결합에서 역할을 하는 시스테인에서와 같은 감소된 -SH기를 갖는 Fab'인, Fab'-SH는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있거나, F(ab')2 항체 단편의 이황화 결합을 감소시킴으로써 화학적 방법에 의해 생산될 수 있다. 그러한 항체 단편은 키메라 또는 인간화된 것일 수 있다. Fab 및 scFv 단편은 모체 IgG와 비교하여 보유 및 내재화 특성을 개선하기 위해 화학적 또는 유전적 가교결합에 의해 다이머, 트라이머 또는 테트라머를 형성하도록 조작될 수 있다. 이들 단편은 하기에 기재된 진단 및 치료 목적에 유용하다.
Fv 단편은 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유한다. 단일 사슬 Fv 종에서, 단일 중쇄 및 단일 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 "다이머 (dimeric)" 구조에 연관될 수 있도록 펩타이드 링커에 의해 공유결합될 수 있다. VH-VL 다이머의 표면 상의 항원-결합 부위를 정의하기 위해 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하는 것이 이 구성에 있다. 전체로서, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도를 나타내더라도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 나타낼 수 있다.
Fab 단편은 단일 항원-결합 부위, 및 잔여 "Fc" 단편을 함유한다. 상기 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 본원에 포함되며, 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 약간의 잔기를 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 항체 단편은 본원에 포한되며, 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한 쌍의 Fab' 단편이다. 항체 단편의 다른 화학 결합은 공지되어 있으며, 본원에 포함된다.
중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 더욱이, 이들 클래스 내에서, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 중 어느 것을 포함하는 서브클래스 (이소타입)으로 추가로 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 중 어느 것일 수 있다.
모노클로날 항체는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득되며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별적 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 특성이 개별 항체의 혼합물이 아님을 나타낸다.
본 발명의 항-VEGF 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다.
추가로, 본 발명의 항-VEGF 항체는 원하는 하나의 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위한 조합 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 피막 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 나타내는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어 상기 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 그 다음 결합 클론은 항원으로부터 용출되고, 항원 흡착/용출의 추가 사이클로 더욱 농축될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-VEGF 항체는 목적하는 파지 클론을 선택하기 위한 적절한 항원 스크리닝 과정을 설계한 다음 목적하는 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항-VEGF 항체 클론을 구축함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 키메라 항체는 인간 및 비-인간 부분을 포함하는 면역글로불린 분자이다. 키메라 항체의 항원 결합 영역 (가변 영역)은 비-인간 기원 (예를 들어, 뮤린)으로부터 유래될 수 있고 면역글로불린에 효과기 (effector) 기능을 부여하는 키메라 항체의 불변 영역은 인간 기원으로부터 유래될 수 있다. 키메라 항체는 비-인간 항체 분자의 항원 결합 특이성 및 인간 항체 분자에 의해 부여되는 효과기 기능을 가져야 한다.
일반적으로, 키메라 항체를 생산하는데 사용되는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
a) 항체 분자의 항원 결합 부분을 코딩하는 정확한 유전자 분절을 확인 및 클로닝 하는 단계; 이 유전자 분절 (VDJ, 중쇄에 대한 가변, 다양성 및 연결 영역 또는 VJ, 경쇄에 대한 가변, 연결 영역 또는 단순히 V 또는 가변 영역)은 cDNA 또는 유전체 형태일 수 있다;
b) 불변 영역 또는 이의 원하는 부분을 코딩하는 유전자 분절을 클로닝하는 단계;
c) 완전 키메라 항체가 전사되고 번역될 수 있는 형태로 코딩되도록 가변 영역과 불변 영역을 연결시키는 단계;
d) 이 컨스트럭트를 선택가능한 마커 및 프로모터, 인핸서, 및 폴리(A) 추가 신호와 같은 유전자 제어 영역을 함유하는 벡터에 연결시키는 단계;
e) 이 컨스트럭트를 박테리아에서 증폭하는 단계;
f) 이 DNA를 진핵 세포 (트랜스펙션) 대부분 포유동물 림프구에 도입하는 단계;
g) 상기 선택가능한 마커를 발현하는 세포를 선별하는 단계;
h) 원하는 키메라 항체를 발현하는 세포를 스크리닝하는 단계; 및
k) 적합한 결합 특이성 및 효과기 기능에 대해 항체를 시험하는 단계.
본 발명은 다수의 종류의 벡터를 포함한다. 용어 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스, 코스미드, 및 파지미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 숙주 세포 내로 단백질 코딩 정보를 전달하는데 사용되는 임의의 분자 또는 개체 (entity)이다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 재조합 발현 벡터 또는 발현 벡터로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용하기 위한 발현 벡터는 플라스미드 형태일 수 있다.
몇 가지 별개의 항원 결합 특이성의 항체는 이러한 프로토콜에 의해 제작되어 키메라 단백질을 생산한다 [예를 들어, 항-TNP: 문헌 [Boulianne et al., Nature 312:643 (1984)]; 및 항-종양 항원: 문헌 [Sahagan et al., J. Immunol . 137:1066 (1986)]]. 마찬가지로, 여러 가지 다양한 효과기 기능은 항원 결합 영역을 코딩하는 것에 신규한 서열을 연결시킴으로써 달성된다. 이들 중 일부는 효소 [문헌 [Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)]], 다른 하나의 종의 면역글로불린 불변 영역 및 다른 하나의 면역글로불린 사슬의 불변 영역[문헌 [Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Tan et al., J. Immunol . 135:3565-3567 (1985)]]을 포함한다. 또한, 유전자 변형을 표적하기 위해 항체 분자를 변형하고 상동성 재조합을 이용한 키메라 항체 분자를 생산하는 방법이 기술되어 있다 (문헌 [Fell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8507-8511 (1989)]).
항체의 항원-결합 도메인은 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 하나씩, 약 110개의 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성되며, 상기 2개의 가변 영역은 모두 3개의 초가변 루프 또는 상동성-결정 영역 (CDR)이 존재한다. 가변 도메인은 VH와 VL이 짧고, 유연한 (flexible) 펩타이드를 통해 공유 결합된 단일-사슬 Fv (scFv) 단편, 또는 그들이 각각 불변 도메인에 융합되어 비-공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로, 파지 상에 기능적으로 나타날 수 있다. "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, 상기 scFv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 VH 및 VL 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 총칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭된다.
"초가변 영역"은 서열 내 초가변이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역이다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함할 수 있다. 이들은 H1, H2, H3로 지정된 가변 중쇄 (VH)의 3개의 영역을 포함한다. 추가로, L1, L2, L3로 지정된, 가변 경쇄 (VL)에 3개가 있다. 많은 초가변 영역 설명이 사용되며 본원에 포함된다. 예를 들어, 카밧 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 다양성을 기초하며, 이것이 사용될 수 있다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]).
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소연쇄반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝될 수 있다. 그런 다음 클론을 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합하고 항원-결합 클론을 찾을 수 있다. 면역화된 기원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구성할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 다르게는, 나이브 레퍼토리는 어떠한 면역도 없이 광범위한 비-자가 및 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 기원을 제공하기 위해 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V 유전자 분절을 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 영역을 코딩하는 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 생체 외 (in vitro)에서 재배열함으로써 합성적으로 제조될 수도 있다.
사상 파지는 항체 단편을 나타내는데 사용될 수 있다. 이때 상기 항체 단편은 단일 사슬 Fv 단편으로 나타낼 수 있다. VH 및 VL 도메인은 유연한 폴리펩타이드 스페이서 (spacer)에 의해 동일한 폴리펩타이드 사슬 상에 연결되거나, 또는 Fab-피막 단백질 구조의 조합이 야생형 피막 단백질의 일부를 치환함으로써 파지 표면 상에 나타나게 되는 경우, 하나의 사슬이 사상 파지의 pIII에 융합되고 다른 하나는 박테리아 숙주 세포 주변 세포질로 분비되는, Fab 단편으로서 연결될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확한 면역 세포로부터 수득된다. 항-VEGF 클론을 선호하는 편향된 라이브러리가 필요한 경우, 개체는 항체 반응을 생성하기 위해 VEGF로 면역화되고, 비장세포 및/또는 순환 B 세포 다른 말초혈액 림프구 (PBL)가 라이브러리 구축을 위해 회수된다. 바람직한 실시예에서, 항-VEGF 클론을 선호하는 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 VEGF 면역화가 VEGF에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포가 능력을 발휘하게 하여 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 전달하는 유전자이식 마우스 (기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결여됨)에서 항-VEGF 항체 반응을 생성함으로써 수득된다. 인간 항체-생산 유전자이식 마우스의 생성은 하기에 기술된다.
핵산 (본원에서 폴리뉴클레오타이드로도 지칭됨)은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 표지와의 접합에 의한 것을 포함하여 합성 후에 추가로 변형될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 관련된 아미노산 서열 동일성 백분율은 서열을 정렬한 후 본 발명의 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일성을 공유하는 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율을 의미하며, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 백분율을 수득하기 위해 갭(gap)을 포함한다.
다른 일실시예에서, 본 발명은 적어도 91%의 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 구현한다. 또 다른 일실시예에서, 본 발명은 약 92-98% 범위의 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 구현한다. 또 다른 일실시예에서, 본 발명은 적어도 99%의 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 구현한다. 일실시예에서, 본 발명의 아미노산 서열은 단지 본 발명에 제공된 바와 같은 전체 서열의 일부, 예를 들어 결실을 포함한다. 이러한 결실은 내부 또는 말단에 있을 수 있다. 일실시예에서, 본 발명의 아미노산은 부가적인 아미노산이 본 발명의 아미노산 서열 내로 삽입되거나 말단에 결합된, 부가적인 아미노산을 포함한다. 일실시예에서, 본 발명은 치환이 VEGF에 대한 결합을 방해하지 않거나 VEGF 기능을 중화하는 것을 방해하지 않는 아미노산 치환을 구현한다. 이러한 치환은 보통, 아미노산을 치환하는 것이 지방족 (글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신), 하이드록실 또는 황/셀레늄-함유 (세린, 시스테인, 셀레노시스테인, 트레오닌, 메티오닌), 고리형 (프롤린), 방향성 (페닐알라닌, 티로신, 트립토판), 염기성 (히스티딘, 리신, 아르기닌) 및 산성과 이의 아미드 (아스파르트산염, 글루탐산염, 아스파라긴, 및 글루타민)와 같은 기능적으로 등가의 생리화학적 특성을 갖는, 보존적 아미노산 치환이다.
항체 가변 유전자 분절을 코딩하는 핵산 (VH 및 VL 분절을 포함함)은 관심있는 세포로부터 회수되어 증폭될 수 있다. 예를 들어, (천연 또는 합성) 나이브 라이브러리에 의해 생산된 항체는 중간 친화도 (106 내지 107 M-1의 Kd - 1)일 수 있지만, 또한 친화도 성숙이 2차 라이브러리를 구성하고 이로부터 재선별함으로써 생체 외(in vitro)에서 모방될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이 시킴으로써, 예를 들어 선택된 개별 클론에서 관심있는 CDR을 스패닝하는 무작위 서열을 수반하는 프라이머로 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. 다른 효과적인 접근법은 비면역화 공여자로부터 수득된 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선별된 VH 또는 VL 도메인을 재결합시키고 사슬 리셔플링 (reshuffling)의 여러 라운드에서 더 높은 친화도를 위해 스크리닝하는 것이다. 이 기술은 약 10-9 M 범위의 Kd를 갖는 더 높은 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산하도록 한다.
예를 들어, 본 발명의 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 약 50 nM 이하의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합할 수 있다. 다른 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 약 10 nM 이하의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 또 다른 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 약 2.5 nM 이하의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 또 다른 추가의 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 약 0.5 nM 이하의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 부가적인 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 약 0.15 nM 이하의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 또 다른 부가적인 실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 5 pM 내지 150 pM의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 추가의 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 0.15 nM의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 다른 추가의 일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 90 pM ± 20 pM의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 또 다른 추가의 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 약 25 pM의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 일실시예에서, 상기 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 약 10 pM의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합한다. 또 다른 일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체, 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 또는 베바시주맙보다 3배 이상 낮은 K(d) 값으로 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 또는 베바시주맙 (아바스틴®; Roche) 보다 인간 VEGF에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 또 다른 추가의 일실시예에서, 상기 항체, 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 4배 이상 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다. 다른 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 10배 이상 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다. 다른 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 50배 이상 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다. 다른 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 약 55배 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다. 다른 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 베바시주맙 (아바스틴®; Roche) 보다 10배 이상 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다. 또 다른 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 베바시주맙 (아바스틴®; Roche) 보다 50배 이상 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다. 다른 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 베바시주맙 (아바스틴®; Roche) 보다 100배 이상 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다. 또 다른 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 베바시주맙 (아바스틴®; Roche) 보다 약 110배 낮은, 인간 VEGF에 대한 상대적 K(d) 값을 갖는다.
다른 추가의 일실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 생체 외 (in vitro)에서 VEGF-유도성 내피세포의 증식을 억제하기 위한 약 200 pM 이하의 IC50 값을 갖는다. 또한, 부가적인 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 생체 외 (in vitro)에서 VEGF-유도성 내피세포의 증식을 억제하는데 더 효과적이다. 추가의 일실시예에서 생체 외 (in vitro)에서 VEGF-유도성 내피세포의 증식을 억제하기 위한 상대적 IC50 값은 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 약 1.5배 낮다.
일실시예에서, 본 발명은 증가된 안정성을 갖는 항체를 제공한다. 일실시예에서, 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 더 높은 안정성을 갖는다. 다른 일실시예에서, 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 더 긴 저장 수명을 갖는다.
일실시예에서, 본 발명은 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 증가된 열 안정성을 갖는 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 인간화 항-VEGF 항체의 용융 온도는 라니비주맙 (루센티스®; Novartis 및 Roche) 보다 약 1.5℃ 더 높을 수 있다.
일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 BSA 또는 Fc에 결합하지 않는다.
본 발명의 VEGF 항체에 대한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 구성 후, DNA 분자는 플라스미드와 같은 발현 벡터의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되며, 제어 서열은 벡터로 형질전환된 숙주세포에 의해 인식된다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 숙주세포와 양립가능한 종으로부터 유래된 복제 및 제어 서열을 함유한다. 벡터는 통상적으로 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 단백질을 코딩하는 서열뿐만 아니라 복제 위치를 전달한다. 원핵 및 진핵 숙주세포에서의 발현을 위한 적합한 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있으며 일부는 본원에 추가로 기술된다. 효모와 같은 진핵생물 또는 포유동물과 같은 다세포 생물로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다.
숙주세포를 형질감염, 바람직하게는 본 발명의 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고 프로모터 유도, 형질전환체 선별, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
형질감염은 코딩 서열이 실제로 발현되는지 여부와 관계없이 숙주세포에 의한 발현 벡터의 흡수를 지칭한다. 다수의 형질감염 방법, 예를 들어 CaPO4 침전 및 전기천공법이 당업자에게 공지되어 있다. 성공적인 형질감염은 일반적으로 이러한 벡터의 작동에 대한 어떠한 표시가 숙주세포 내에서 발생할 때 인식된다. 형질감염을 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
형질전환은 DNA가 생물에 도입되어 DNA가 염색체 외의 요소 (extrachromosomal element)로서 또는 염색체 구성 부분(chromosomal integrant)에 의해 복제가능하다는 것을 의미한다. 사용된 숙주세포에 따라, 형질전환은 그러한 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 형질전환을 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 일부는 본원에 추가로 기술된다.
본 발명의 VEGF에 대한 항체를 생산하는데 사용되는 숙주세포는 상기 문헌 [Sambrook et al.]에 일반적으로 기재된 바와 같이 배양될 수 있다.
포유동물 숙주세포는 VEGF에 대한 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있고, 다양한 배지에서 배양될 수 있으며, 이는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 일부는 본원에 추가로 기술된다.
본원에서 언급된 숙주세포는 숙주동물 내에 존재하는 세포뿐만 아니라 생체 외(in vitro) 배양에서의 세포를 포함한다. 본 발명의 VEGF에 대한 항체의 정제는 당해 기술분야에 인지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 이들 중 일부는 본원에 기술된다. 파지 디스플레이 클론의 정제된 항체는 친화성 크로마토그래피 분리에 사용하기 위해 아가로스 비드, 아크릴아미드 비드, 글라스 비드, 셀룰로오스, 바양한 아크릴 공중합체, 하이드록실 메타크릴레이트 겔, 폴리아크릴 및 폴리메타크릴 공중합체, 나일론, 중성 및 이온성 담체 등과 같은 적합한 매트릭스에 부착될 수 있다.
파지 라이브러리 샘플은 파지 입자의 적어도 일부가 고체 상과 결합하는데 적합한 조건 하에 고정된 VEGF와 접촉될 수 있다. 통상적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함한, 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체 상에 결합한 파지는 세척 후 용출될 수 있다. 파지는 1회의 선별로 농축될 수 있고; 농축된 경우, 박테리아 배지에서 배양될 수 있고, 추가의 선별이 이루어질 수 있다. VEGF에 대해 약간 다른 친화도를 가진 경우에도, 상이한 친화도의 파지 항체들 사이에서 선별하는 것이 가능하다.
표적 항원에 대한 항-VEGF mAb의 반응성은 VEGF 단백질, 펩타이드, VEGF-발현 세포 또는 이의 추출물을 적절하게 사용하여 웨스턴 블랏, 면역침전, ELISA, 및 FACS 분석을 포함한, 다수의 공지된 방법으로 확립될 수 있다. 이러한 분석의 예는 하기 실시예 1에 제시되어 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 그것이 결합하는 세포에 대해 세포증식 억제성일 수 있다. 본원에 사용된 "세포증식 억제성 (cytostatic)"은 항체가 VEGF-양성 세포의 성장을 억제할 수 있지만, VEGF-양성 세포를 필수적으로 죽이는 것은 아님을 의미한다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 전장 또는 부분 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성하기 위해 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지된 DNA 서열과 결합될 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이소타입의 불변 영역은 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 그러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 바람직한 일실시예에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 모든 인간, 전장 또는 부분 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열을 형성하기 위해 인간 불변 영역 DNA에 융합된다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 전체 항체와 비교하여 더 작은 크기의 항체 단편은 특정한 이점을 갖는다. 예를 들어, 단편은 보다 신속한 클리어런스 (clearance)를 허용할 수 있고, 전체 항체와 비교하였을 때 관심있는 부위에 대한 개선된 접근성을 야기할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 항체 단편은 서열번호 3의 위치 1의 아스파르트산에서 시작하여 위치 107의 리신으로 끝나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 1의 위치 1의 글루탐산에서 시작하여 위치 120의 세린으로 끝나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab이다.
다른 일실시예에서, 상기 Fab는 서열번호 5에 나타난 아미노산을 포함하는 Fc 영역에 결합된다.
또 다른 일실시예에서, 상기 항체의 변이체는 본 발명의 항체의 항원-결합 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예를 들어, 상기 변이체는 서열번호 9의 위치 241의 아스파르트산에서 시작하여 위치 483의 세린으로 끝나는 아미노산 서열을 포함하는 scFv일 수 있다. 추가의 다른 일실시예에서, 상기 scFv는 Fc 영역에 연결된다. 단지 예시로서, Fc 영역에 연결된 scFv는 서열번호 9에 나타난 아미노산을 포함할 수 있다.
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 있다. 상기 항체 또는 단편은 재조합 수단으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편은 재조합 숙주세포로 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 예를 들어, E. coli에서 발현되고 이로부터 분비되어 다량의 이들 단편을 비교적 용이하게 생산될 수 있다. 항체 단편은 본원에 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 다르게는, Fab'-SH 단편이 E. coli로부터 직접 회수되고 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다. 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주세포 배양으로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시예에서, 선택된 항체는 단일 사실 Fv 단편 (scFv)이다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 손상되지 않은 결합 부위를 갖는 유일한 종이다; 따라서, 그들은 생체 내 (in vivo)에서 사용하는 동안 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 생성하도록 구성될 수 있다.
합성 인간 항-VEGF 항체
본 발명은 VEGF에 결합하는 항체 (예를 들어, 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 합성 및 인간화 항체)를 추가로 제공한다. 가장 바람직한 항체는 VEGF에 선택적으로 결합하고 비-VEGF 단백질에 결합하지 않을 것이다 (또는 약하게 결합할 것이다). 가장 바람직한 항체는 VEGF에 특이적으로 결합할 것이다. 용어 "특이적으로 결합하는"은 항체가 VEGF에 우세하게 결합하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 특히 고려되는 항-VEGF 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체뿐만 아니라 이들 항체의 항원 결합 도메인 및/또는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 함유하는 이의 단편 (예를 들어, 재조합 단백질)을 포함한다. 이들 항체는 임의의 기원, 예를 들어, 래트, 개, 고양이, 돼지, 말, 마우스 또는 인간으로부터 유래될 수 있다.
일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 항-VEGF 중화 항체일 수 있다. 일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 단백질에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 생체 내(in vivo)에서 VEGF-유도 혈관형성을 억제한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 항체가 지시되는 VEGF 단백질의 영역 또는 에피토프는 의도된 용도에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 생존한 암세포 또는 안구 세포에서 멤브레인-결합된 VEGF의 검출을 위한 면역분석법에 사용하기 위해 의도된 항체는 멤브레인-결합된 VEGF에서 접근 가능한 에피토프로 지시되어야 한다. 상이한 VEGF 이소폼은 세포 멤브레인 결합에 대해 상이한 잠재력을 가질 수 있다. 예를 들어, 더 큰 염기성 VEGF189 및 VEGF206 이소폼 (VEGF-A의 이소폼)은 세포외기질 (ECM)의 세포-표면 헤파린-함유 프로테오글리칸에 단단하게 결합하여 세포에 단단하게 결합되는 것으로 확인되었다; 반면, 산성 VEGF121 이소폼 (VEGF-A121)은 헤파린에 결합하는 능력이 결여되어 자유롭게 확산된다. VEGF165 이소폼(VEGF-A165)은 헤파린과 ECM에 결합된 중요한 단편 (fraction)을 갖는 중간 특성을 갖는다. 이러한 항체의 예는 하기 실시예에 기재된다. 다른 에피토프를 인식하는 항체는 분비된 VEGF 단백질 또는 이의 단편을 검출하기 위해, 손상되거나 죽어가는 세포 내에서 VEGF를 확인하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 항-VEGF 항체는 진단 분석, 이미지화 방법론, 안 질환의 치료, 시력 손상의 치료, 실명의 예방 및 암 관리에서의 치료 방법에 특히 유용할 수 있다. 본 발명은 VEGF 단백질의 검출 및 암의 진단에 유용한 다양한 면역학적 분석을 제공한다. 이러한 분석은 일반적으로 VEGF를 인식하고 결합할 수 있는 하나 이상의 항-VEGF 항체를 포함하고, 다양한 종류의 침전, 응집, 보체 결합, 방사면역검정 (RIA), 효소결합면역흡착측정법 (ELISA), 효소결합면역형광측정법 (ELIFA) (문헌 [H. Liu et al. Cancer Research 58: 4055-4060 (1998)]), 면역조직화학적분석 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는, 당해 기술분야에 잘 알려진 다양한 면역학적 분석 포맷을 포함한다.
일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체 및 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab', F(ab')2) 및 이의 변이체 (예를 들어, scFv)는 망막 질환, 나이 관련 황반변성 (AMD), 황반변성, 습성 나이 관련 황반변성, 당뇨망막병증, 당뇨병성 황반병증, 증식당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 (RVO)에서의 황반부종, 망막정맥폐쇄 (RVO)에 대한 2차적인 황반부종, 홍채 혈관신생, 망막 혈관신생, 병적 근시로 인한 맥락막 혈관신생, 황반부종, 미숙아 망막증 (ROP), 성인 (maturity)의 망막증, 유리체절제술(PPV), 혈관신생성녹내장, 당뇨병성 황반부종 (DME) 및 혈관형성과 관련된 안구 질환으로부터 선택된 질환을 치료학적으로 치료하는데 사용된다. 본 발명의 항-VEGF 항체 및 이의 단편 및 이의 변이체는 전술한 질환 또는 상태의 진행을 예방하거나 중지시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 치료학적 유효량은 개개인의 질병 상태, 나이, 성별, 및 체중과 같은 인자, 및 개인에게 원하는 반응을 유도하는 이들 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과보다 적은 것이다. 예방적 유효량은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다. 예방적 투여량은 질병 초기 단계 또는 그 전의 개체에서 사용되기 때문에, 전형적으로 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 수 있지만, 반드시 적을 필요는 없다.
일실시예에서, 본 발명의 항-VEGF 항체 및 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab', F(ab')2)는 암의 존재를 검출하기 위해 사용된다. 본 발명의 항-VEGF 항체 및 이의 단편은 VEGF 발현하는, VEGF에 반응하는, 또는 VEGF-의존성 혈관형성에 참여하는 안구세포 또는 내피세포의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 혈청, 유리체액, 안구, 전립선 및 기타 조직 생검 표본, 뼈와 같은 다른 조직, 소변 등을 포함한, 다양한 생물학적 샘플 내의 이러한 VEGF 양성 (+) 세포의 존재는 VEGF 항체로 검출될 수 있다. 또한, 항-VEGF 항체는 인듐-111 (또는 다른 동위원소) 결합 항체를 이용한 면역영상과 같은 다양한 이미지화 방법론에 사용될 수 있다.
항-VEGF 항체는 또한 VEGF 단백질 및 펩타이드를 정제하고 VEGF 동족체 및 관련 분자를 분리하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일실시예에서, VEGF 단백질을 정제하는 방법은 고체 매트릭스에 결합되어 있는 항-VEGF 항체를 VEGF를 함유하는 용해물 또는 다른 용액과, 항-VEGF 항체가 VEGF에 결합할 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계; 고체 매트릭스를 세척하여 불순물을 제거하는 단계; 및 결합된 항체로부터 VEGF를 용출하는 단계를 포함한다. 또한, 항-VEGF 항체는 세포 분류 및 정제 기술을 이용하여 VEGF 양성 세포를 분리하는데 사용될 수 있다.
일실시예에서, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 표 6 및 9에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 일실시예에서, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 표 7, 8, 10 및 11에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일실시예에서, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 표 6 및 9에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 임의의 경쇄를 포함한다. 다른 일실시예에서, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 표 7, 8, 10 및 11에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 임의의 중쇄를 포함한다.
일실시예에서, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는: 표 6에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 표 7 및 8에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 상응하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일실시예에서, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 표 9에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 표 10 및 11에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 상응하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
인간화 및 인간 항체
본 발명은 신규한 인간화 항-VEGF 항체를 포함한다. 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 예를 들어, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 유래의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 수용력 (capacity)을 갖는 비인간 영장류, 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역 유래의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부의 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 항체의 성능을 추가로 개선하기 위해 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 수 있다. 키메라 항체는 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄의 일부를 가질 수 있는 반면, 사슬(들)의 나머지 부분은, 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성일 뿐만 아니라, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 그러한 항체의 단편이다.
본 발명의 완전 인간 항-VEGF 모노클로날 항체를 생산하는 방법은 파지 디스플레이 및 형질전환 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 완전 인간 항-VEGF 모노클로날 항체는 대형 인간 Ig 유전자 조합 라이브러리 (즉, 파지 디스플레이)를 사용하는 클로닝 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명의 완전 인간 항-VEGF 모노클로날 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자를 포함하도록 조작된 형질전환 마우스를 사용하여 생산될 수 있다.
이중특이성 항체
이중특이성 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는, 본 발명의 항-VEGF 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 본 발명의 경우, 결합 특이성 중 하나는 VEGF에 대한 것이고, 나머지 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 예시적인 이중특이성 항체는 VEGF 단백질의 2종의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 이중특이성 항체는 2종의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지며, 항원 중 하나는 본 발명의 항체가 결합하는 것이다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 CDRH1 (예를 들어, 아미노산 위치 31부터 아미노산 위치 35의 히스티딘 (서열번호 1)) 또는 이의 일부, CDRH2 (예를 들어, 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신 (서열번호 1)) 또는 이의 일부, CDRH3 (예를 들어, 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 1)) 또는 이의 일부, CDRL1 (예를 들어, 아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알리닌 (서열번호 3)) 또는 이의 일부, CDRL2 (예를 들어, 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌 (서열번호 3)) 또는 이의 일부, 또는 CDRL3 (예를 들어, 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌 (서열번호 3)) 또는 이의 일부, 또는 이들의 조합에 대한 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한 이중특이성 항체는 VEGF를 발현하는 세포에 대한 세포독성 제제를 국소화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는 VEGF-결합 암(arm)과 세포독성 제제에 결합하는 암(arm) (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-.알파., 빈카알카로이드, 리신 (ricin), A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)을 보유한다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이성 항체)으로 제조될 수 있다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 2 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다.
항체 변이체
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항-VEGF 항체의 아미노산 변형(들)이 고려된다. 상기 항체의 아미노산 서열 변이는 예를 들어, 항체 핵산으로의 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입하거나, 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 컨스트럭트가 원하는 특성을 갖는다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 컨스트럭트에 도달하게 하도록 한다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 폴리펩타이드의 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 수득될 수 있는 Fc 영역 변이체를 고려한다. 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 아미노산 위치를 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 설명 및 교시에 따라, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 야생형 등가물 항체와 비교하여, 예를 들어 Fc 영역에서 하나 이상의 변경을 포함할 수 있다.
핵산, 벡터, 숙주세포 및 재조합 방법
본 발명의 또 다른 측면은 항-VEGF 항체 및 이의 단편을 코딩하는 다양한 핵산 분자, 바람직하게는 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 및 관련된 분자를 포함하는 분리된 형태, 항-VEGF 항체-코딩 서열 또는 이의 일부를 보완하는 핵산 분자, 및 항-VEGF 항체-코딩 핵산에 혼성화되는 핵산 분자를 제공한다. 특히 바람직한 핵산 분자는 본원에 기술된 인간 또는 뮤린 DNA 서열과 실질적으로 동일하거나 이를 보완하는 뉴클레오타이드 서열을 가질 것이다. 구체적으로 유전체 DNA, cDNA, 리보자임, 및 안티센스 분자뿐만 아니라 천연 기원으로부터 유래되거나 합성된, 대체 백본을 기반으로 한 핵산 또는 대체 염기를 포함하는 핵산이 고려된다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항-VEGF 항체-코딩 핵산 분자의 단편을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항-VEGF 항체-코딩 핵산 분자의 단편은 전체 항-VEGF 항체-코딩 서열의 작은 일부분을 지칭한다. 상기 단편의 크기는 의도한 용도에 따라 결정될 것이다.
일실시예에서, 본 발명은 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부 둘 다를 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 특이적 결합 멤버는 항체의 항원-결합 부분을 포함하며, 상기 항체의 항원-결합 부분의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 위치 91의 사이토신에서 시작하여 위치 105의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDRH1 또는 이의 일부, 위치 148의 티민에서 시작하여 위치 198의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH2 또는 이의 일부, 및 위치 295의 사이토신에서 시작하여 위치 327의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH3 또는 이의 일부를 포함하고; 그리고/또는 상기 항체의 항원-결합 부분의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부는 위치 70의 사이토신에서 시작하여 위치 102의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL1 또는 이의 일부, 위치148의 사이토신에서 시작하여 위치 168의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL2 또는 이의 일부, 위치 265의 사이토신에서 시작하여 위치 291의 구아닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL3 또는 이의 일부를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 항-VEGF 항체를 코딩하는 핵산 분자는 상기 핵산 분자가 VEGF 항체 이외의 폴리펩타이드를 코딩하는 오염 핵산 분자로부터 실질적으로 분리될 때 분리된 것으로 간주될 수 있다. 당업자는 분리된 VEGF 항체-코딩 핵산 분자를 수득하기 위해 핵산 분리 방법을 용이하게 적용할 수 있다. 고도의 순도를 달성하는 것이 바람직하지만, 분리된 핵산이 되기 위해, 분리된 핵산을 순수하게 하거나 절대적인 순도를 달성할 필요는 없다.
다른 일실시예에서, 상기 (a) 또는 (b)에 제공된 바와 같은 임의의 핵산 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 등가의 핵산 서열로 대체될 수 있다. 다른 추가의 다른 일실시예에서, 상기 항체는 인간 또는 인간화 불변 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 인간 또는 인간화 불변 영역은 IgG1 불변 영역일 수 있다. 또 다른 일례에서, 상기 인간 또는 인간화 불변 영역은 IgG4 불변 영역이다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 분리된 핵산은 서열번호 16에 나타난 서열을 포함한다.
다른 일실시예에서, 상기 분리된 핵산 서열은 서열번호 9에 나타난 바와 같이 위치 721의 구아닌에서 시작하여 위치 1449의 티민으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 단일 사슬 Fv 분자 또는 이의 일부인 특이적 결합 멤버를 코딩한다. 또 다른 추가의 일실시예에서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 1 및 3에 나타난 핵산 서열을 포함하는 Fab 또는 이의 일부(들)이다. 추가의 일실시예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 16에 나타난 바와 같은 위치 70의 구아닌에서 시작하여 위치 711의 티민까지의 아미노산 서열 및 서열번호 16에서 위치 897의 구아닌에서 시작하여 위치 1580의 아데닌까지의 핵산 서열을 포함하는 FR 아미노산 서열 또는 이의 일부(들)을 포함한다. 다른 일실시예에서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 16에 나타난 바와 같은 위치 1의 아데닌에서 시작하여 위치 711의 티민까지의 핵산 서열 및 서열번호 16에서 위치 828의 아데닌에서 시작하여 위치 1580의 아데닌까지의 핵산 서열을 포함하는 Fab 또는 이의 일부(들)이다. 다른 일실시예에서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 16에 나타난 바와 같은 위치 1의 아데닌에서 시작하여 위치 711의 티민까지의 핵산 서열 및 서열번호 16에서 위치 828의 아데닌에서 시작하여 위치 1580의 아데닌까지의 핵산 서열을 포함하는 Fab 또는 이의 일부(들)이다.
또 다른 일실시예에서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 16에 나타난 핵산 서열을 포함하는 Fab 또는 이의 일부이다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부를 모두 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 90의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 1인, FRH1을 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부를 모두 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 106의 티민에서 시작하여 위치 147의 아데닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 2인, FRH2를 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부를 모두 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 199의 사이토신에서 시작하여 위치 294의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 3인, FRH3를 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부를 모두 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 4인, FRH4를 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부를 모두 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 90의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 중쇄 프레임워크 영역 FRH1, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 106의 티민에서 시작하여 위치 147의 아데닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 FRH2, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 199의 사이토신에서 시작하여 위치 294의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 FRH3, 및 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 FRH4를 추가로 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역 FRH1 내지 FRH4 및 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1 내지 CDRH3는 FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4의 순서로 연결된다.
일실시예에서, 상기 분리된 핵산은 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)로 끝나는 중쇄 가변 영역에 대한 핵산 서열을 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부 모두를 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 69의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 1인 FRL1을 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부 모두를 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 103의 티민에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 2인 FRL2를 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부 모두를 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 169의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 3인 FRL3를 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부 모두를 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 4인 FRL4를 추가로 포함한다.
일실시예에서, 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부 모두를 코딩하는 분리된 핵산인, 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 상기 특이적 결합 멤버는 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 69의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 영역 FRL1, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 103의 티민에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 FRL2, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 169의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 FRL3, 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 FRL4를 추가로 포함하며, 상기 경쇄 프레임워크 영역 FRL1 내지 FRL4 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1 내지 CDRL3를 코딩하는 핵산 서열은 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4의 순서로 연결된다.
일실시예에서, 제4항 또는 제68항의 분리된 핵산에서, 각 CDR 및 각 FR 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 IMGT 방법으로 정의되며 다음과 같다:
위치 76의 구아닌에서 시작하여 위치 99의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRH1; 위치 151의 아데닌에서 시작하여 위치 174의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRH2; 위치 289의 구아닌에서 시작하여 위치 327의 사이토신 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRH3; 위치 79의 사이토신에서 시작하여 위치 96의 사이토신 (서열번호 )으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRL1; 위치 148의 아데닌에서 시작하여 위치 156의 사이토신 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRL2; 위치 265의 사이토신에서 시작하여 위치 291의 구아닌 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRL3; 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 25의 세린 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 75의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH1; 아미노산 위치 34의 이소류신부터 아미노산 위치 50의 티로신 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 100의 아데닌에서 시작하여 위치 150의 사이토신 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH2; 아미노산 위치 59의 티로신부터 아미노산 위치 96의 시스테인 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 175의 티민에서 시작하여 위치 288의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH3; 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH4; 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 26의 세린 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 78의 티민 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL1; 아미노산 위치 33의 발린부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 97의 구아닌에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL2; 아미노산 위치 53의 글루탐산부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 157의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL3; 및/또는 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL4.
일실시예에서, 분리된 핵산은 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 경쇄 가변 영역에 대한 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 일실시예에서, 상기 핵산은 항체인 특이적 결합 멤버를 코딩한다.
다른 일실시예에서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 FF03046-2 VH 도메인 및 아미노산 위치 121의 알라닌부터 아미노산 위치 218의 발린 (서열번호 1)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 108의 아르기닌부터 아미노산 위치 214의 시스테인 (서열번호 3)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또 다른 일실시예에서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 FF03046-2 VH 도메인, 아미노산 위치 121의 알라닌부터 아미노산 위치 218의 발린 (서열번호 1)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인, 및 아미노산 위치 219의 글루탐산부터 아미노산 위치 228의 트레오닌 (서열번호 1)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 힌지 영역의 부분을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 108의 아르기닌부터 아미노산 위치 214의 시스테인 (서열번호 3)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 항체의 중쇄가 아미노산 위치 261의 글루탐산부터 아미노산 위치 380의 세린 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VH 도메인 및 아미노산 위치 381의 알라닌부터 아미노산 위치 478의 발린 (서열번호 16)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 130의 리신 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 131의 아르기닌부터 아미노산 위치 237의 시스테인 (서열번호 16)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 일실시예를 제공한다.
본 발명은 상기 항체의 중쇄가 아미노산 위치 261의 글루탐산부터 아미노산 위치 380의 세린 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VH 도메인, 아미노산 위치 381의 알라닌부터 아미노산 위치 478의 발린 (서열번호 16)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인, 및 아미노산 위치 479의 글루탐산부터 아미노산 위치 488의 트레오닌 (서열번호 16)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 힌지 영역의 일부를 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 130의 리신 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 131의 아르기닌부터 아미노산 위치 237의 시스테인 (서열번호 16)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 일실시예를 제공한다.
본 발명은 서열번호 16에 제공되는 바와 같은 서열을 갖는 분리된 핵산을 제공한다.
일실시예에서, 구성 프로모터 (constitutive promoter)는 본 발명의 항체, 이의 일부 또는 변이체의 발현을 제어하는데 사용된다. 별도의 일실시예에서, 조절가능한 (regulatible) 또는 유도성 (inducible) 프로모터는 본 발명의 항체, 이의 일부 또는 변이체를 발현하는데 사용된다. 일실시예에서, 조절가능한 또는 유도성 프로모터는 pho A 프로모터이다. 본 발명은 상기 pho A 프로모터가 서열번호 15에 제공되는 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 일부를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 핵산의 전사의 종결이 전사 종결자의 제어 하에 있는, 분리된 핵산 서열을 제공한다. 일실시예에서, 상기 전사 종결자는 리보솜 RNA 유전자 종결자이다. 일실시예에서, 상기 리보솜 RNA 유전자 종결자는 서열번호 19에 제공되는 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 일부를 포함한다.
본 발명은 상기 분리된 핵산 서열이 벡터 내에 있는, 분리된 핵산 서열을 제공한다. 일실시예에서, 상기 벡터는 복제 기점을 포함한다. 다른 일실시예에서, 상기 벡터는 복제의 colE1 기점을 포함한다.
일실시예에서, 상기 벡터는 선택가능한 마커 또는 스크리닝 마커를 포함한다. 일실시예에서, 상기 선택가능한 마커 또는 스크리닝 마커는 약물 선택가능한 마커, 형광 단백질, 세포 표면 마커, 효소, 발광 단백질, 대사 마커, 성장인자 및 내성인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일실시예에서, 상기 벡터는 서열번호 20에 제공된 바와 같은 테트라사이클린 내성 유전자가 결실된 pBR322이다.
본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산이 BSA 또는 Fc에 결합하지 않는, 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 분리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제 가능한 벡터에 삽입할 수 있다. 상기 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용)하여 용이하게 분리 및 시퀀싱될 수 있다. 많은 벡터들이 이용 가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용될 숙주세포에 따라 달라진다. 일반적으로, 바람직한 숙주세포는 원핵 또는 진핵 (일반적으로 포유동물) 기원이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한, 임의의 이소타입의 불변 영역은 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 그러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 항-VEGF 항체를 코딩하는 분리된 핵산은 하나의 침묵 돌연변이 또는 돌연변이들을 가질 수 있다. 추가로, 본 발명의 분리된 핵산은 하나의 미스센스 돌연변이 또는 돌연변이들을 가질 수 있고, 이때 뉴클레오타이드 치환은 아미노산의 동일성은 변화시키지만, 번역 종결 코돈의 특성화 (specification)를 초래하는 치환으로 인한 미성숙 절단 폴리펩티드를 야기하지는 않는다. 본 발명의 분리된 핵산은 프레임내(inframe) 결실 또는 삽입을 가질 수 있고, 여기서 상기 결실 또는 삽입은 3개의 염기 또는 염기쌍의 배수로 발생한다.
또한 본원에 기재된 바와 같은 항-VEGF 항체-코딩 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자 (rDNA) 또는 이의 단편도 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, rDNA 분자는 생체 외(in vitro)에서 분자 조작이 이루어진 DNA 분자이다. rDNA 분자를 생성하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning (1989)]을 참조한다. 본 발명의 바람직한 rDNA 분자에서, 항-VEGF 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 코딩하는 항-VEGF 항체는 하나 이상의 발현 제어 서열 및/또는 벡터 서열에 작동가능하게 연결된다. rDNA 분자는 전체 VEGF 항체를 코딩하거나, VEGF 항체의 단편을 코딩할 수 있다.
VEGF 항체-코딩 서열이 작동가능하게 연결된 벡터 및/또는 발현 제어 서열의 선택은 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 원하는 기능적 특성, 예를 들어 단백질 발현, 그리고 형질전환될 숙주세포에 직접적으로 의존한다. 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 적어도 rDNA 분자에 포함된 VEGF 항체-코딩 서열의 숙주 염색체 내로의 복제 또는 삽입, 바람직하게는 발현을 유도할 수 있다.
작동가능하게 연결된 단배질 코딩 서열의 발현을 조절하기 위해 사용되는 발현 제어 요소는 당해 기술분야에 공지되어 있으며 유도성 프로모터, 구성 프로모터, 분비 신호, 인핸서, 전사 종결자 및 기타 다른 조절 요소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 핵산의 전사는 리보솜 RNA 종결자의 제어 하에 있을 수 있다. 일실시예에서, 리보솜 RNA 종결자는 서열번호 19에 제공된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 일부를 포함한다.
일실시예에서, 항-VEGF 항체-코딩 핵산 분자를 함유하는 벡터는 원핵생물 레플리콘, 즉, 재조합 DNA 분자의 자동복제 및 유지를, 이로 형질전환된 박테리아 숙주세포와 같은 원생생물 숙주세포에서 염색체 내로 유도하는 능력을 갖는 DNA 서열을 포함할 것이다. 이러한 레플리콘은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 추가로, 원핵생물 레플리콘을 포함하는 벡터는 그의 발현이 약물 내성과 같은 검출가능하거나 선택가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수도 있다. 전형적인 박테리아 약물 내성 유전자는 암피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 것이다.
진핵 세포와 양립 가능한 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 양립가능한 발현 벡터는 항-VEGF 항체-코딩 서열을 삽입하고 본 발명의 항-VEGF 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 원핵 세포 발현 벡터는 당해 기술분야에 잘 알려져 잇으며 여러 상업적 출처로부터 입수가능하다. 전형적으로, 이러한 벡터는 원하는 DNA 분절의 삽입을 위한 편리한 제한효소 부위를 함유하여 제공된다. 이러한 벡터는 항-VEGF 항체의 구성적 또는 조절가능한 발현을 위한 프로모터/인핸서 조합을 제공할 수 있다. 또한, 그러한 벡터는 진핵 세포에서 효과적인 전사 종결자를 포함할 수 있다.
본 발명의 rDNA 분자를 구성하는데 사용되는 진핵 세포 발현 벡터는 진핵 세포에서 효과적인 선택가능한 마커, 바람직하게는 약물 내성 선택 마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시에 따르면, 벡터는 본 발명의 항-VEGF 항체-코딩 서열 또는 이의 일부를 함유하는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 벡터 또는 파지 벡터일 수 있다. 또한, 본 발명은 적합한 진핵 숙주세포 내로 형질감염된 플라스미드, 코스미드, 바이러스 벡터 또는 파지 벡터를 포함하는 숙주-벡터 시스템을 예상한다. 적합한 진핵 숙주세포의 예는 효모 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포와 같은 동물 세포를 포함한다. 숙주-벡터 시스템은 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체의 생산에 유용하다. 다르게는, 숙주세포는 본원에 제공된 바와 같이 박테리아 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다.
당해 기술분야에 공지된 이용가능한 많은 벡터가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 벡터 구성은 일반적으로 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 복제의 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RSB), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열. 예를 들어, 핵산은 pho A 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다. 일실시예에서, 상기 pho A 프로모터는 서열번호 15에 제공된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 일부를 포함한다. pho A 프로모터는 낮은 포스페이트 조건 (예를 들어,0.05 mM 이하의 포스페이트 농도)하에 다운스트림 핵산 서열 (예를 들어, 본 발명의 핵산 서열)을 전사하도록 유도될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩타이드 구성을 코딩하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 다르게는, 상기 발현 벡터는 1개를 초과하는 폴리펩타이드 구성을 코딩하기 위해 1개를 초과하는 시스트론을 갖는 하나의 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 그 발현을 조절하는 시스트론에 대해 업스트림 (5')에 위치하는 비번역 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 전형적으로 유도성 및 구성적인 2가지 클래스로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, ㅇ예를 들어, 영양분의 유무 또는 온도의 변화에 반응하여 이의 제어 하에 시스트론의 증가된 전사 수준을 개시하는 프로모터이다.
본 발명의 일실시예에서, pho A와 같은 유도성 프로모터는 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄 둘 다 또는 이들의 일부 또는 변이체를 코딩하는 핵산에 업스트림에 위치하여 작동적으로 연결된다. 낮은 포스페이트 조건에 의한 pho A 프로모터의 유도는 다운스트림 핵산 서열의 전사, RNA 전사체의 생성을 야기하며, pho A 프로모터가 업스트림에 위치하며 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄를 모두 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 경우, 이중시스트론 (bicistronic) mRNA의 생성을 초래한다. 일실시예에서, 이중시스트론 mRNA의 번역은 클론 #201의 경우에서와 같이, 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 모두를 생성한다.
Fab 201 코딩 서열 (서열번호 16)을 포함하고 Fab 201의 박테리아 발현에 사용될 수 있는 변이체 클론 #201은 2017년 09월 05일자로 VA 20110-2209, 매너서스, 유니버시티 블러바드 10801의 아메리칸 컬쳐 타입 컬렉션 (ATCC)에 부다페스트 조약의 조항에 의거하여 기탁되었고, ATCC 기탁번호는 아직 부여되지 않았다.
다양한 잠재적 숙주세포에 의해 인식되는 수많은 프로모터가 잘 알려져 있다. 일부 실시예에서, 이종 프로모터는, 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교하여 발현된 표적 유전자의 발현 및 수율을 더 높이기 때문에 사용된다. 숙주세포 또는 비-숙주세포로부터의 자연 발생 프로모터 이외에, 바이러스성 프로모터 및 인공 프로모터가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 진핵 세포 (예를 들어 효모, 곤충 또는 포유동물 세포)에서, 프로모터는 전사 인핸서와 조합하여 사용된다.
형질전환된 숙주세포
본 발명은 또한 항-VEGF 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 숙주세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 항-VEGF 항체의 발현에 유용한 진핵 세포는 세포주가 세포 배양방법과 양립가능하고 발현 벡터의 증식 및 항-VEGF 항체 유전자의 발현과 양립가능한 한, 제한되지 않는다. 바람직한 진핵 숙주세포는 효모, 곤충 및 포유동물 세포, 바람직하게는 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간 세포주로부터의 세포와 같은 척추동물 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 척추동물 세포주는 CHO 및 HEK293를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 가장 바람직한 척추동물 세포주는 생물학적 제제의 제조 또는 생산에 대해 승인된 것이다. 바람직한 원핵 숙주는 E. coli. 또는 B. subtili이다.
본 발명의 rDNA 분자로 적절한 세포 숙주의 형질전환, 형질감염 또는 형질도입은 사용된 벡터의 종류 및 적용된 숙주 시스템에 따라 전형적으로 달라지는 잘 알려진 방법에 의해 이루어진다. 원핵 숙주세포의 형질전환과 관련하여, 전기천공 및 염-열 충격 처리 방법이 전형적으로 적용되며, 예를 들어, 문헌 [Cohen et al., Proc Acad Sci USA (1972) 69:2110]; 및 문헌 [aniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]을 참조한다. 또한, 원핵 숙주세포는 본 발명의 항-VEGF 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 파지로 감염 또는 형질도입될 수 있다. rDNA를 함유하는 벡터를 갖는 척추동물 세포의 형질감염과 관련하여, 전기천공, 양이온성 지질 또는 염 처리 방법이 전형적으로 적용되며, 예를 들어 문헌 [Graham et al., Virol (1973) 52:456]; 문헌 [Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76:1373-76]을 참조한다. 또한, 척추동물 세포는 항-VEGF 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 진핵생물 바이러스 입자로 감염 또는 형질도입될 수 있다. 이러한 바이러스성 입자는 DNA 또는 RNA 바이러스성 입자일 수 있고, 아데노바이러스, 아데노바이러스-관련 바이러스, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 입자를 포함할 수 있디만. 이에 한정되지 않는다.
성공적인 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 세포, 즉, 본 발명의 rDNA 분자를 함유하는 세포는 잘 알려진 기술로 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 rDNA의 도입으로 인해 생성된 세포는 클로닝되어 단일 콜로니를 생산할 수 있다. 이들 콜로니로부터의 세포를 수확하고, 용해시키고 이들 DNA 함량을 문헌 [Southern, J Mol Biol (1975) 98:503], 또는 문헌 [Berent et al., Biotech (1985) 3:208]에 기술된 바와 같은 방법 또는 면역학적 방법을 통해 분석된 세포로부터 생산된 단백질을 이용하여 rDNA의 존재에 대해 검사하였다. 다르게는, 딸 세포가 분석될 수 있고, 외래의 핵산의 존재에 대해 당해 기술분야에 공지된 고도로 민감한 방법으로 분석될 수 있다. 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 세포는 또한 세포 내로 도입된 동일한 핵산 또는 세포 내로 공동-도입된 별도의 핵산에 존재하는 마커 (약물 선택가능한 마커, 이미지화 마커 또는 검출가능한 마커)에 기초하여 분리되거나 확인될 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하기에 적합한 원핵 숙주세포는 그람-음성 또는 그람-양성 생물체와 같은 원시세균 및 진정세균을 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 Escherichia (예를 들어, E. coli), Bacilli (예를 들어, B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas 종 (예를 들어, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, 또는 Paracoccus를 포함한다.
항체 생산
항체의 다양한 제조방법이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 숙주세포는 전술한 발현 벡터로 형질전환될 수 있고 프로모터 유도, 형질전환체 선별, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.
형질전환은 원핵 숙주 내로 DNA를 도입하여 해당 DNA가 염색체 외의 요소로서 또는 염색체 구성 부분에 의해 복제가능하도록 하는 것을 의미한다. 사용된 숙주세포에 따라, 형질전환은 그러한 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다.
본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당해 기술분야에 공지되고 선별된 숙주세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 LB (Luria broth)와 필요한 영양 보충물을 포함한다.
항체 정제
당해 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 적용될 수 있다. 다음의 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼 상에서의 분별, SDS-PAGE, 암모늄 설페이트 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지에서의 크로마토그래피, 및 예를 들어, Sephadex G-75를 이용한 겔 여과.
면역접합체
본 발명은 또한 세포독성 또는 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물, 또는 동물 기원의 효소학적으로 활성인 독소 또는 이의 단편)와 같은 세포독성제 또는 치료제, 또는 방사성 제제 (즉, 방사성접합체)에 결합된 본 발명의 임의의 항-VEGF (예를 들어, 본원에 기재된 이의 일부분 또는 변이체를 포함함)를 포함하는, 면역접합체 ("항체-약물 접합체" 또는 "ADC"와 상호교환적으로 지칭됨)를 제공한다. 예를 들어, 상기 치료제는 항-종양 약물, 사이토카인, 2차 항체, 또는 항체의 일부분 (예를 들어, Fc)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체가 약물전구체 (prodrug)를 세포독성 약물로 전환시키는 효소에 연결되는 실시예를 제공한다. 본 발명의 실시에 따라, 항체의 일부분은 scFv, Fv, Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
성장 억제제는 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 성장 억제제의 예는 빙카 (빈크리스틴 또는 빈블라스틴), 탁산 (taxane), 및 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드, 및 블레오마이신과 같은 국소이성질화효소 II 억제제를 포함하는 고전적인 M-상 차단제 (M-phase blocker)와 같은 세포 주기 진행을 차단하는 제제를 포함한다. 추가의 적합한 제제는 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C와 같은 DNA 알킬화제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 검출가능한 마커로 표지되어, 면역접합체, 예를 들어, 진단 면역접합체를 생성할 수 있다.
면역접합체는 2차 분자를 VEGF 양성 세포로 표적화하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, in DeVita, Jr.], 문헌 [V.T. et al., eds, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636]).
세포독성제의 예로는 리신 (ricin), 리신 A-사슬, 독소루비신, 다우노루비신, 택솔, 브로민화 에티듐, 마이토마이신, 에토포사이드, 테니포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신 (sarcin), 게로닌, 미토겔린, 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신, 에노마이신(enomycin), 쿠리신(curicin), 크로틴(crotin), 칼리케마이신(calicheamicin), 사포나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 메이탄시노이드(maytansinoid) 및 글루코코르티코이드 및 기타 다른 화학요법제뿐만 아니라 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re와 같은 방사성 동위원소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 검출가능한 마커는 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항체는 또한 약물 전구체를 이의 활성 형태로 전환시킬 수 있는 항암 약물 전구체 활성화 효소에 결합될 수 있다.
또한, 본 발명의 임의의 모노클로날 항체 또는 재조합 항체의 항원-결합 영역을 포함하는 본 발명의 재조합 단백질은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 재조합 단백질의 항원-결합 영역은 치료학적 활성을 갖는 제2 단백질의 적어도 기능적으로 활성일 부분에 연결된다. 상기 제2 단백질은 효솨, 림포카인, 온코스타틴 또는 독소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 독소는 전술한 것을 포함한다.
치료체를 항체에 결합 또는 연결하기 위한 기술은 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev., 62:119-58 (1982)]을 참조한다). 치료제로서의 VEGF 항체의 용도는 본원에 추가로 기술된다.
다른 항- VEGF 항체-코딩 핵산 분자의 분리방법
본원에 기재된 항-VEGF 항체-코딩 핵산 분자는 본 발명의 항-VEGF 항체 동족체, 또는 본 발명의 항-VEGF 항체의 슬라이스된 이소폼, 대립형질 변이체 (allelic variant), 및 돌연변이 형태뿐만 아니라 이의 코딩 및 유전자 서열의 분리를 가능하게 한다.
예를 들어, 본원에 기재된 항-VEGF 항체-코딩 서열의 일부분은 합성되어 인간 이외의 다른 생물체 유래 단백질, 본원에 기재된 인간 VEGF 단백질의 대립형질 변이체, 및 항-VEGF 항체 유전자를 함유하는 유전체 서열로부터의 항-VEGF 항체 패밀리의 멤버를 코딩하는 DNA를 검출하기 위한 프로브로 사용될 수 있다. 약 16-21개의 뉴클레오타이드 (5-7개의 아미노산 스트레치를 코딩함)를 함유하는 올리고머 (또는 올리고뉴클레오타이드)는 제조되어 엄격한 조건 또는 과도한 수준의 가양성(false positives)을 제거하기에 충분히 엄격한 조건 하에서 혼성화를 수득하기 위한 유전체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 특별히 관심있는 올리고머는 본 발명의 항-VEGF 항체의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열을 코딩하는 것이다. 상기 올리고머는 본원에 기재된 CDR 서열 또는 이러한 CDR 서열의 일부분으로부터 제조될 수 있다. 상기 올리고머는 본원에 기재된 CDR 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 리코딩하여, 해당 올리고머 또는 이의 보체가 본원에 기재된 CDR 또는 이의 일부분을 코딩하도록 제조될 수 있다.
또한, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 항-VEGF 항체-코딩 핵산 분자, 또는 이의 단편을 선택적으로 증폭/클로닝하기 위한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. 이러한 PCR 프라이머를 사용하기 위한 PCR 변성/어닐링/신장 사이클은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 다른 항-VEGF 항체-코딩 핵산 분자를 분리하는데 사용하기 위해 용이하게 변형될 수 있다.
항-VEGF 항체-코딩 서열, 항-VEGF 항체-코딩 서열의 자연 발생 대립형질 변이체 및 유전체 항-VEGF 항체-코딩 서열의 비-인간 동족체는 본원에 기재된 항체의 CDR 부분에서 인간 항-VEGF 서열과 고도의 상동성을 공유할 것이다. 일반적으로, 이러한 핵산 분자는 엄격한 조건 하에서 인간 VEGF 서열에 혼성화될 것이다. 이러한 서열은 전형적으로 인간 항-VEGF 항체-코딩 서열에 대해 적어도 70%의 상동성, 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 상동성을 함유한다.
엄격한 조건은 (1) 세척을 위해, 예를 들어, 50 ℃에서 0.015M NaCl/0.0015M 질산나트륨/0.1% SDS와 같이 낮은 이온 강도와 높은 온도를 적용하거나, 또는 (2) 혼성화하는 동안 포름아미드, 예를 들어, 42 ℃, pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 나트륨을 갖는 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산 나트륨 버퍼를 포함하는 50% (vol/vol) 포름아미드와 같은 변성제를 적용하는 것이다.
또 다른 일례는 42 ℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 황산의 사용이며, 42 ℃에서 0.2 x SSC 및 0.1% SDS에 세척한다. 당업자는 명확하고 검출가능한 혼성화 신호를 적절하게 얻기 위해 엄격한 조건을 용이하게 결정하고 변경할 수 있다.
다른 항-VEGF-항체 코딩 핵산 분자는 CDR-코딩 영역 또는 FR-코딩 영역의 돌연변이 유발 및 VEGF에 결합하는 능력에 대해 생성된 항체의 특성화를 통해 수득될 수 있다. FR-코딩 영역에 대해, CDR-코딩 영역에 인접한 뉴클레오타이드는 가닥 내에서 이황화 결합 형성에 참여하는 시스테인을 코딩하는 부분 및 바로 CDRH3가 이어지는, FRH4의 아미노 말단의 보존적 트립토판을 코딩하는 부분을 제외한다면 바람직한 부위일 수 있다.
경쟁적 억제 항체의 확인을 위한 분석
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 항체에 의해 인식되고 결합되는 VEGF에 대해 동일하거나 중복되는 에피토프에 결합하는 추가의 항-VEGF 항체를 검출하고 확인하는데 사용할 수 있는 분석 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, VEGF에 결합하는 항-VEGF 항체 및 다른 제제 및 세포 구성 성분은 항-VEGF 항체가 VEGF에 결합하는 능력 및/또는 VEGF 활성을 억제/자극하는 능력으로 확인될 수 있다. VEGF-결합 활성에 대한 분석은 VEGF 단백질 또는 이의 단편 또는 이의 펩타이드를 필요로 할 수 있으며 고속대량스크리닝방법에 사용하기에 적합하다.
다르게는, VEGF 단백질의 중요 위치와 면역반응성인 항체 (본 발명의 임의의 항체에 의해 인식됨)는 나이브 합성 Fab 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 항체 라이브러리로부터 선별될 수 있다. 초기 스크리닝 후, CDR 서열의 초점 돌연변이 유발 (focused mutagenesis)이 수행될 수 있고, 스크리닝의 추가 라운드가 제한된 VEGF 단백질 또는 VEGF 단백질의 일부를 이용하여 수행되어 원하는 활성을 갖는 향상된 항-VEGF 항체(예를 들어, VEGF에 대해 고친화성 항체)가 선별된다. 돌연변이 유발 및 스크리닝의 추가 라운드는 원하는 결과에 도달할 때까지 선별된 파지에 존재하는 선별된 Fab 서열을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 진단 용도
본 발명의 다중 진단 용도가 있다. 예를 들어, 본 발명은 개체, 예를 들어 동물 또는 인간 개체에서, 안구에서의 VEGF의 과도한 생산과 (실제 또는 잠재적) 관련된 황반변성 또는 시력 손상 또는 상실, 또는 VEGF 단백질의 존재와 관련된 암을 진단하는 방법을 제공한다. 일실시예에서, 상기 방법은 본 발명의 항체의 임의의 하나 또는 조합을 사용하여 샘플 (예를 들어, 세포 또는 생물학적 체액 샘플)에서 VEGF 단백질의 수를 정량적으로 측정하는 것을 포함한다. 그와 같이 결정된 수는 정상 개체로부터의 샘플에서의 양과 비교될 수 있다. 샘플에서 측정가능하게 상이한 양 (즉, 테스트 샘플에서의 VEGF 수가 정상 샘플로부터의 수를 초과함)의 존재는 황반변성 또는 시력 손상 또는 손실의 존재 또는 증가된 위험 또는 암의 존재를 나타낸다. VEGF는 테스트 샘플에서 VEGF의 수가 정상 샘플로부터의 수를 초과할 때, 세포에 의해 과발현된다.
다른 일실시예에서, 진단은 본 발명의 핵산을 이용하여 VEGF 단백질을 코딩하는 RNA의 양을 개체의 샘플에서 정량적으로 결정하는 것을 포함한다. 그렇게 결정된 양은 정상 개체로부터의 샘플에서의 RNA 양과 비교될 수 있다. 다시 한번, 측정가능한 상이한 양의 존재는 황반 변성 또는 시력 손상 또는 손실의 존재 또는 증가된 위험 또는 암의 존재를 나타낸다.
또한, 본 발명은 개체에서 신생물 또는 종양 전의 상태를 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 조직의 샘플을 수득하고, 상기 방법을 이용하여 그러한 신생물 또는 종양 전의 상태를 나타내는 분명한 측정가능한 차이인, VEGF의 양 및/또는 분포의 차이를 검촐하는 것을 포함한다.
본 발명의 실시에 따르면, 본 발명의 임의의 모노클로날 항체가 지시되는 에피토프에 관한 것일 수 있다. 또한, 조직 절편은 방광, 전립선, 뼈, 림프조직, 췌장, 기타 다른 기관 또는 근육으로부터 유래될 수 있다.
또한, 본 발명은 개체의 안구에서 과량의 VEGF의 존재와 관련된 황반변성 또는 시력 손상 또는 상실을 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 안구 조직 또는 세포의 샘플을 수득하고, 상기 방법을 이용하여 개체의 안구에서 과도한 VEGF의 존재와 관련된 황반변성 또는 시력 손상 또는 상실을 나타내는 분명한 측정가능한 차이인, 조직 또는 세포에서의 VEGF 양의 차이를 검출하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 체액 샘플에서 VEGF의 농도를 검출하고 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다. 일실시예에서, 상기 방법은 모노클로날 항체가 고체 지지체의 표면에 부착되는 것을 허용하는 조건 하에서 고체 지지체를 VEGF와 복합체를 형성하는 (바람직하게는 특이적으로 형성하는) 본 발명의 과량의 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 결과적으로 상기 모노클로날 항체가 부착된 고체 지지체는 생물학적 체액과 접촉되고, 상기 생물학적 체액에서의 VEGF가 항체에 결합하여 VEGF-항체 복합체를 형성하도록 한다. 상기 복합체는 검출가능한 마커로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 다르게는, VEGF 또는 항체 중 하나가 복합체를 형성하기 전에 표지될 수 있다. 그 다음 복합체를 검출하고 정량적으로 측정하여 생물학적 체액 샘플에서 VEGF의 농도를 검출하고 정량적으로 측정할 수 있다. 정상 대조군의 생물학적 체액과 비교하여 샘플에서 고농도의 VEGF는 신생물 또는 종양 전의 상태를 나타낸다. 다르게는, 정상 대조군의 생물학적 체액과 비교하여 샘플에서 고농도의 VEGF는 황반변성 또는 시력 손상 또는 상실의 존재 또는 증가된 위험을 나타낸다. 후자의 경우, 생물학적 체액은 안구로부터 수득된다.
본 발명의 실시에 따르면, 생물학적 체액은 유리체액, 조직 추출물, 소변, 혈액, 혈청 및 점액 (phlegm)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 검출가능한 마커는 효소, 비오틴, 형광단, 발색단, 중금속, 상자성 동위원소 ( paramagnetic isotope), 또는 방사성 동위원소를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 VEGF를 인식하고 결합하는 본 발명의 항체 (항-VEGF 항체); 및 검출가능한 표지와 항-VEGF 항체의 특이적 결합 파트너의 접합체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 실시에 따르면, 상기 표지는 효소, 식별용 방사성 동위원소, 발색단 및 형광물질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
VEGF와 관련된 질환의 진행을 모니터링하는 방법
추가적으로, 본 발명은 개체에서, 다양한 시점에서 상기 개체로부터 유래한 샘플에서의 VEGF 양을 측정함으로써, 황반변성 또는 시력 손상, 또는 암 (예를 들어, 전립선, 전립선 암의 골 전이, 방광, 췌장암) 또는 VEGF와 관련된 질환의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 이는 샘플에서의 VEGF 양의 변화를 측정하기 위해, 예를 들어, 상기 변화가 적은 양의 변화인지 또는 많은 양의 변화, 즉 VEGF의 과발현인지의 여부를 결정하기 위한 목적으로 수행된다. 일실시예에서, 상기 방법은 개체로부터의 첫 번째 샘플에서 VEGF 단백질의 존재를 정량적으로 측정하고 이와 같이 측정된 양을 상기 개체로부터의 두 번째 샘플에 존재하는 양과 비교하는 것을 포함하는데, 이러한 샘플들은 상이한 시점에서 채취되고, 측정된 양의 차이는 황반변성 또는 시력 손상 또는 암의 진행을 나타낸다.
또 다른 실시예에서, 모니터링은 VEGF RNA의 존재를 개체로부터의 첫 번째 샘플에서 정량적으로 측정하고 이와 같이 측정된 양을 상기 개체로부터의 두 번째 샘플에 존재하는 양과 비교함으로써 이루어지며, 상기 샘플들은 상이한 시점에서 채취되고, 측정된 양의 차이는 황반변성 또는 시력 손상 또는 암 (예를 들어, 전립선, 전립선 암의 골 전이, 방광 및 췌장암)의 진행을 나타낸다.
샘플은 동물 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 추가로, 샘플은 세포 샘플일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여, 안구 조직 또는 세포, 전립선 조직, 방광 조직, 췌장 조직, 신경내분비 조직, 및 뼈 (암종이 전이될 수 있는 임의의 조직, 예를 들어, 절 (node), 폐, 간 췌장)와 같은 기관 조직은 황반변성 또는 시력 손상 또는 상실의 존재 또는 증가된 위험, 또는 암 또는 전이성 병변의 존재에 대해 평가될 수 있다. 다르게는, 샘플은 생물학적 체액, 예를 들어, 안구의 세포외 액, 유리체액, 소변, 혈청 또는 혈장일 수 있다.
본 발명의 실시에 따라, 검출은 조직학, 블랏팅, ELISA, 및 ELIFA를 포함하는 면역 검출 방법으로 이루어질 수 있다. 샘플이 조직 또는 세포 샘플일 때, 포르말린-고정, 파라핀-포매 또는 동결될 수 있다.
본 발명은 추가로 정상조직으로부터의 조직 절편에서 VEGF의 양 및 분포와 비교하여 테스트할 안구 또는 신생물성 조직으로부터의 조직 절편에서 VEGF의 양 및 분포의 차이를 측정하는 방법을 제공한다. 일실시예에서, 상기 방법은 테스트할 조직과 정상 조직 모두를 VEGF와 특이적으로 복합체를 형성하는 본 발명의 모노클로날 항체와 접촉시켜, VEGF의 양과 분포의 차이를 검출하는 것을 포함한다.
암 치료 및 황반변성과 같은 VEGF와 관련된 질환 또는 VEGF와 관련된 안구 질환/질병의 치료
본 발명은 습성 나이 관련 황반변성, 당뇨병성 황반병증, 증식당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 (RVO)에서의 황반부종, 홍채 혈관신생, 병적 근시로 인한 맥락막 혈관신생, 성인 (maturity)의 망막증, 혈관신생성녹내장 및/또는 암과 같은 VEGF 관련 질환을, 예를 들어, 전신적으로치료하기 위해 사용될 수 있는 본 발명의 항-VEGF 항체를 제공한다.
질환 세포를 표적하지만 주위의 비-질환성 세포 및 조직은 표적하지 않는 항체가 바람직하다. 따라서, 본 발명은 VEGF 단백질에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, VEGF 항원을 발현하는 질환에 민감하거나 또는 이러한 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 하나의 접근법에서, 본 발명은 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 양으로 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, VEGF를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 VEGF mAb는 또한, 본 발명의 VEGF 항체 면역접합체 또는 면역독소를 세포의 성장을 억제하거나 세포를 죽이기에 충분한 양으로 세포와 반응시키는 것을 포함하는, VEGF 항원을 발현하는 세포의 성장을 선택적으로 억제하거나 세포를 죽이는 방법에 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 비접합 항-VEGF 항체 (모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이의 단편 (예를 들어, 재조합 단백질)을 포함함)은 환자에게 도입되어 항체가 질환 세포 상의 VEGF에 결합하고 그러한 세포, 및 종양의 성장 억제 (이의 파괴를 포함함)를 보체-매개 세포용해, 항체-의존성 세포독성작용을 포함할 수 있는 메카니즘에 의해 매개하고, VEGF의 생리적 기능을 변경 및/또는 리간드 결합 또는 신호 변환 경로를 억제한다. 비접합 항-VEGF 항체, 이의 단편, 및 본 발명의 재조합 단백질 외에도, 리신 (ricin)과 같은 독성 제제에 접합된 항-VEGF 항체는 또한 독성 제제를 VEGF-보유 종양 세포에 직접 전달하여 이 종양을 파괴시킬 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체를 임상적으로 적용하는 하나의 방법은 세포 억제/사멸 활성 (예를 들어, ADCC 및 CDC 활성)을 나타내는 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하여, 이들을 비변형 형태로 투여하는 것이다. 일실시예에서, ADCC 및 CDC 활성을 검출하기 위해, 본 발명의 항-VEGF 항체는 4시간의 배양 기간 동안 배양된 51Cr-표지 종양 표적 세포를 용해하는 것에 대해 테스트될 수 있다. 표적 세포는 51Cr로 표지될 수 있고 그런 다음 몇 시간 (예를 들어, 4시간) 동안 효과기 세포 (림프구-분리 배지의 사용으로 정제된 인간 림프구의 형태)와 항체의 조합에 노출시킬 수 있으며, 첨가되는 농도는 예를 들어, 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml에서 변화된다. 표적 세포로부터의 51Cr의 방출은 종양-세포 용해의 증거 (세포독성)로 측정될 수 있다. 방출될 수 있는 51Cr의 총량을 측정할 수 있고 ADCCsms 단독으로 배양된 표적 세포와 비교하여 모노클로날 항체와 효과기 세포로 관찰된 표적 세포의 사멸 백분율로 계산될 수 있다.
본 발명의 방법의 실시에서, 세포 표면 상에 VEGF를 발현하는 질환 세포의 성장을 억제할 수 있는 항-VEGF 항체는 치료학적 유효량으로 본원에 기재된 질환을 앓는, 질환 세포가 VEGF를 발현하거나 과발현하는 환자에게 투여된다. 본 발명의 항-VEGF mAb 치료법은 생체 내 (in vivo)에서 질환 세포의 현저한 성장 억제를 제공할 수 있다. 본 발명의 항체 치료법은 화학요법, 방사선, 및/또는 다른 치료 요법과 함께 조합될 수 있다.
환자는, 바람직하게는 질환 조직의 면역조직화학적 평가, 정량적 VEGF 이미지화, 또는 VEGF 발현 수준 및 존재를 확실하게 나타낼 수 있는 다른 기술을 이용하여, 질환 세포에서 VEGF 과발현 수준 및 존재에 대해 평가될 수 있다. 이러한 목적을 위해 세포 생검 또는 외과적 표본의 면역조직화학적 분석이 선호될 수 있다. 질환 세포의 면역조직화학적 분석을 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법은 상이한 항원을 인식하는 것과 같은 상이한 개별적 항-VEGF 항체의 조합 또는 "칵테일"뿐만 아니라, 본 발명의 단일 항-VEGF 항체의 투여를 고려한다. 이러한 mAb는 조합으로 상승 치료효과를 나타낼 수 있다. 또한, 항-VEGF mAb의 투여는, 다양한 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 치료제와 조합될 수 있다. 항-VEGF mAb는 이들의 비결합 형태로 투여될 수 있고, 또는 이들에 결합된 치료제를 가질 수 있다.
본 발명의 방법의 실시에 사용되는 항-VEGF 모노클로날 항체는 원하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 항-VEGF mAb와 조합될 때 항체의 항-질환 기능을 보유하고 개체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로는 멸균 포스페이트 완충 식염수 용액 등과 같은 임의의 여러 표준 약학적 담체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 질환 부위에 본 발명의 항-VEGF 항체 제형을 국소 또는 전신 투여하기 위한 다양한 방법을 제공한다. 당해 기술분야에서 표준관행인 바와 같이, 본 발명의 조성물은 개체에 임의의 약학적으로 허용가능한 형태로 투여될 수 있다.
잠재적으로 효과적인 투여 경로는 안구 내 주사, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 경구, 흡입 및 피하 방법과 같은 주사뿐만 아니라, 이식 가능한 펌프, 지속주입, 유전자 치료, 리포좀, 좌제, 국소적 접촉, 소낭 (vesicle), 캡슐, 생분해성 고분자, 하이드로겔, 및 방출조절패치를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 담체와 혼합된 본 발명의 조성물은 질환 부위, 예를 들어, 안구에 직접 투여되는 멸균 용액으로 패키징될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물의 투여는 공동 투여, 예를 들어, 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량을 본 발명의 하나 이상의 부가적인 조성물과 함께 공동-투여, 예를 들어, 동반 또는 순서대로 공동-투여하는 것을 포함할 수 있다. 투여는 또한 제제(들)의 지속적 방출 (지효성)을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 제제(들)은 지효성 캡슐 또는 다른 지속적 방출 물질에 내장될 수 있다.
일반적으로, 치료는 유효 투여량으로 허용가능한 투여 경로에 의해 본 발명의 항-VEGF 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 투여량은 질환의 종류에 제한 없이, 질환의 중증도, 등급, 또는 단계, 본 발명에 사용된 항-VEGF 항체의 결합 친화도 및 반감기, 환자에서 VEGF 발현 수준, 원하는 정상 상태의 항체 농도 수준, 치료 빈도, 및 사용되는 경우, 본 발명의 치료방법과 조합하여 사용되는 화학요법제의 영향을 포함하는, 당업자가 일반적으로 인식하는 다양한 요소에 따라 달라질 것이다. 통상적인 일일 투여량은 약 0.1 내지 100 mg/kg의 범위일 수 있다. 적절한 투여량을 정의하는 1차 결정 요인은 특정 상황에서 치료학적으로 유효해야 하는데 필요한 특정 항체의 양이다. 질환 억제 또는 퇴행을 달성하기 위해 반복 투여가 요구될 수 있다.
결합 친화도는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함한, 당해 기술분야에 공지된 통상의 방법으로 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
VEGF mAb의 직접 투여도 가능하며 특정 상황에서 이점을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 황반 변성 치료를 위해, 본 발명의 VEGF 항체는 안구의 황반부에 직접 주사될 수 있다.
본 발명은 또한 세포 표면에 다수의 VEGF 항원을 발현하는 세포의 세포 활성 (예를 들어, 세포 증식, 활성화 또는 전파)을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 표면 상의 VEGF 항원이 면역접합체와 복합체를 형성하도록, 본 발명의 면역접합체 (예를 들어, 이종 또는 동종의 혼합물)를 세포와 반응시키는 것을 포함한다. 세포 표면에 VEGF 항원이 많을수록, 더 많은 수의 VEGF-항체 복합체가 형성되다. VEGF-항체 복합체의 수가 많을수록, 억제되는 세포 활성이 커진다. 신생물 또는 종양 전 상태와 같은 질환을 갖는 환자는 세포 활성의 억제가 세포 억제 또는 죽음으로 유도되는 경우, 이 방법에 따라 치료될 수 있다.
본 발명은 또한 VEGF가 이의 수용체 또는 VEGF 파트너와 결합하는 것을 차단함으로써 VEGF의 생물학적 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 VEGF-면역접합체 또는 VEGF-항체 복합체를 허용하는 조건 하에서 본 발명의 항체 또는 면역접합체와 상당량의 VEGF를 접촉시킴으로써 VEGF가 이의 수용체 또는 VEGF-파트너와 결합하는 것을 차단하고 VEGF의 활성을 억제하는 것을 포함한다.
다른 일실시예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 하나의 면역접합체 또는 조합을 세포를 억제하는데 충분한 양으로 세포와 반응시킴으로써 VEGF 항원을 발현하는 세포를 선택적으로 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 양은 세포를 죽이기 위한 양 또는 세포 성장 또는 증식을 억제하기에 충분한 양을 포함한다. 전술한 바와 같이, 투여량 및 투여량 투약 계획은 VEGF, 이의 집단, 항체가 지시되는 부위, 및 환자와 관련하여, 치료할 질환 또는 질병의 특성에 따라 달라질 것이다.
약학 조성물
본 발명은 본 발명의 임의의 신규한 항-VEGF 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 특정 투여 방식에 적합한 것으로 공지된 임의의 담체를 지칭한다. 또한, 본 발명의 신규한 항-VEGF 항체는 조성물에서 유일한 약학적 유효 성분으로 제형화될 수 있거나 다른 유효 성분과 조합될 수 있다.
본원에서 조성물은 본 발명의 하나 이상의 신규한 항-VEGF 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 신규한 항-VEGF 항체는, 일실시예에서, 비경구 투여를 위한 멸균 용액 또는 현탁액과 같은 적합한 약학 제제로 제형화된다.
상기 조성물에서, 본 발명의 하나 이상의 신규한 항-VEGF 항체의 유효 농도는 적합한 약학적 담체와 혼합될 수 있다. 상기 조성물에서 본 발명의 항-VEGF 항체의 양 또는 농도는, 투여 시 치료할 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 또는 개선시키는 양을 전달하는데 효과적이다.
일실시예에서, 치료학적으로 유효한 투여량은 약 0.1 ng/ml 내지 약 50-100 μg/ml의 유효 성분의 혈청 농도를 생성할 수 있다. 약학 조성물은, 다른 일실시예에서, 하루에 체중 1 킬로그램 당 약 0.001 mg 내지 약 2000 mg의 화합물의 투여량을 제공할 수 있다. 약학적 투여 단위 형태가 제조되어 약 0.01 mg, 0.1 mg 또는 1 mg 내지 약 500 mg, 1000 mg 또는 2000 mg를 제공할 수 있고, 일실시예에서 단위 투여 형태 당 약 .5 mg 내지 약 500 mg의 유효 성분 또는 필수 성분의 조합을 제공할 수 있다.
일실시예에서, 상기 조성물은 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 단편, 폴리소르베이트 20, 수크로스, 염화나트륨, 및 버퍼를 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 포스페이트 버퍼를 포함한다. 일실시예에서, 상기 포스페이트 버퍼는 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는다. 다른 일실시예에서, 상기 조성물은 버퍼 (예를 들어, 히스티딘 버퍼)를 포함한다. 일실시예에서, 상기 히스티딘 버터는 약 5.0 내지 6.5의 pH (바람직하게는 약 pH 6.0)를 갖는다. 다른 일실시예에서, 상기 조성물은 시트레이트 버퍼를 포함한다. 또 다른 일실시예에서, 상기 조성물은 시트르산나트륨 버퍼를 포함한다. 일실시예에서, 상기 시트르산나트륨 버퍼는 약 5.0 내지 6.5의 pH (바람직하게는 약 pH 6.0)를 갖는다.
일실시예에서, 상기 조성물은 약 2mg/ml 내지 약 100mg/ml의 농도로 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체를 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 0.1% 내지 0.04% 농도의 폴리소르베이트 20을 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 1% 내지 20% 농도의 수크로스를 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 10 mM 내지 80 mM 농도의 염화나트륨을 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 10 mM 내지 100 mM 농도의 포스페이트 버퍼를 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 5 mM 내지 50 mM 농도의 히스티딘 버퍼를 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 5 mM 내지 20 mM 농도의 시트르산나트륨 버퍼를 포함한다.
일실시예에서, 상기 조성물은 약 5mg/ml 농도의 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체, 0.03% 폴리소르베이트 20, 5% 수크로스, 40 mM 염화나트륨, 및 10 mM 포스페이트 버퍼 (pH 5.8)를 포함한다. 다른 일실시예에서, 상기 조성물은 약 5mg/ml 농도의 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체, 0.03% 폴리소르베이트 20, 5% 수크로스, 40 mM 염화나트륨, 및 10 mM 히스티딘 버퍼 (pH 5.8)를 포함한다. 일실시예에서, 상기 조성물은 약 5 mg/ml 농도의 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체, 0.03% 폴리소르베이트 20, 5% 수크로스, 40 mM 염화나트륨, 및 10 mM 시트르산나트륨 버퍼 (pH 5.0)를 포함한다.
상기 유효 성분 또는 활성제 (즉, 본 발명의 신규한 항-VEGF 항체)는 한 번에 투여되거나, 시간 간격을 두고 투여될 수 있도록 다수의 더 적은 투여량으로 나누어질 수 있다. 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료될 질환의 작용이며 공지된 시험 프로토콜을 경험적으로 사용하거나 생체 내 (in vivo) 또는 생체 외 (in vitro)에서의 테스트 데이터로부터 추정하여 결정될 수 있음이 이해될 것이다. 농도 및 투여량 값은 또한 경감되는 증상의 중증도에 따라 달라질 수 있음을 유념해야 한다. 임의의 특정 개체에 대하여, 특정 투여량 요법은 개인의 요구 및 조성물의 투여를 관리하고 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야 하고, 본원에 기재된 농도 범위는 단순히 예시일 뿐 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하는 의도가 아님을 이해할 것이다.
활성제의 혼합 또는 첨가 시, 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 유화액 등일 수 있다. 형성된 혼합물의 형태는 의도된 투여 방식 및 선택된 담체 또는 비히클에서의 활성제의 용해도를 포함한, 많은 요소에 따라 달라진다.
약학 조성물은 본 발명의 조성물 또는 활성제의 적절한 양을 함유하는 주사가능한 용액 또는 현탁액, 및 살균 비경구 용액 또는 현탁액과 같은 단위 투여 형태로 인간 및 동물에게 투여하기 위해 제공된다. 주사제, 용액 및 유화액은 또한 하나 이상의 부형제를 함유한다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 폴리소르베이트 20, 수크로스, 염화나트륨, 포스페이트 버퍼, 히스티딘 버퍼, 시트르산나트륨 버퍼, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다.
예를 들어, 액상의 약학적으로 투여 가능한 조성물은, 예를 들어, 물, 식염수, 수용성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등과 같은 담체 또는 부형제에 상기에 정의된 바와 같은 활성제 및 선택적인 약학적 아쥬반트 (adjuvant)를 용해, 분산하거나, 다르게는 혼합하여 제조됨으로써 용액 또는 현탁액을 형성할 수 있다. 원한다면, 투여될 약학 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 용해제, pH 완충제 등과 같은 소량의 비독성 보조물질, 예를 들어, 아세테이트, 시트르산나트륨, 트리에탄올아민 올레이트 및 기타 상기와 같은 제제를 포함할 수 있다.
동결건조된 분말도 본 발명에 포함되며, 이는 용액, 유화제 및 기타 다른 혼합물로 투여하기 위해 재구성될 수 있다. 주사용 물을 사용한 이러한 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여에 사용하기 위한 제형을 제공한다. 재구성을 위해, 동결건조된 분말이 멸균수 또는 다른 적합한 담체에 첨가된다. 정확한 양은 선택된 화합물에 따라 다르다. 이러한 양은 경험적으로 결정될 수 있다. 이들 용액, 특히 안과용으로 의도되 용액은 적절한 염과 함께 pH 약 5 내지 7, 약 0.01% 내지 10% (vol %)의 등장성 용액으로 제형화될 수 있다.
키트
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 키트가 제공된다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 조성물을 포함하는 패키지(들)을 포함한다.
구 "패키지"는 본원에 제시된 화합물 또는 조성물을 함유하는 임의의 용기를 의미한다. 바람직한 실시예에서, 상기 패키지는 박스 또는 포장재료일 수 있다. 약학적 산물을 패키징하는데 사용하기 위한 패키징 재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 약학적 패키징 물질의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 컨테이너, 주사기, 병, 및 선택된 제형과 의도된 투여 방식 및 치료법에 적합한 임의의 패키징 물질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
키트는 또한 패키지 내에 함유되어 있지 않지만, 패키지 외부에 부착되는 아이템, 예를 들어, 피펫도 포함할 수 있다.
키트는 치료가 필요한 상태의 개체에게 본 발명의 활성제 또는 조성물을 투여하기 위한 지침을 선택적으로 함유할 수 있다. 키트는 미국식품의약관리국 (United States Food and Drug Administration)과 같은 규제 당국이 승인한 본원 화합물의 사용 지침을 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 본 화합물에 대한 라벨 또는 제품 삽입물을 함유할 수 있다. 상기 패키지(들) 및/또는 제품 삽입물(들)은 그들 자체가 규제 당국에 의해 승인될 수 있다. 상기 키트는 패키지 내애 고체 상 또는 액체 상 (예를 들어 제공된 버퍼)의 활성제를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 상기 방법을 수행하기 위한 용액을 제조하기 위한 버퍼, 및 하나의 컨테이너에서 다른 컨테이너로 액체를 전달하기 위한 피펫을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 선택적으로 본원에 기재된 병용 요법에 사용하기 위한 하나 이상의 다른 조성물도 함유할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 패키지(들)는 정맥내 투여를 위한 컨테이너이다. 다른 실시예에서, 화합물은 주사가능한 수단으로 제공된다.
본 발명은 본원에 개시된 실시예에 의해 그 범위가 한정되지 않으며, 이들은 본 발명의 개별적인 측면의 단일 예로서 의도되고, 기능적으로 등가인 임의의 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 기술된 것 이외에도, 본 발명의 모델 및 방법에 대한 다양한 변형은 전술한 설명 및 교시로부터 당업자에게 명백할 것이며, 유사하게 본 발명의 범위 내에 속한다. 그러한 변형 또는 다른 실시예는 본 발명의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시될 수 있다.
실시예
VEGF에 대한 신규 합성 항체의 확인 및 분자적 특성 규명
전체 과정은 파지 디스플레이 기술을 이용한 Fab의 선별, 클론의 선별 및 가장 높은 결합 친화도를 갖는 클론을 선별하기 위한 친화도 성숙의 다수의 라운드를 포함한다. 수득된 서열은 Pho A-기반 벡터에서 클로닝된 후, E. coli에서 발현, 단백질 정제 및 친화도 결정을 한다. 상세한 프로토콜은 다음과 같다.
1. 파지 디스플레이 기술
합성 파지 라이브러리의 구축은 자연 발생 항체의 구조적 및 기능적 특성화, 박테리오파지 피막 단백질 구조 및 조합, 박테리오파지 생물학 및 숙주세포 생물학을 기반으로 한다. 이러한 지식에 기초하여, 파지 표면 상의 합성 Fab 항체 단편을 나타내는 감염성 박테리오파지가 생성된다. 임의의 단일 Fab 파지 디스플레이 라이브러리에 대해, 키메라 Fab-파지 피막 단백질 융합 단백질의 합성 Fab 항체 단편 부분은 다양한 서열의 상보성 경정 영역 (CDR) 루프 또는 무작위 서열이 재연결될 수 있는 특이적 인간 프레임워크 영역 (FR) 또는 인간 공통 서열 FR을 가질 수 있다. CDR이 항원에 결합하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 파지는 VEGF에 결합하는 합성 Fab 파자를 확인하기 위해 VEGF와 같은 항원에 대해 스크리닝하여 VEGF에 결합하는 역할을 하는 CDR을 갖는 파지를 선별한다. 선별된 Fab 파지에 의한 VEGF-결합의 향상은 선별된 CDR의 유도된 돌연변이 유발 및 추가의 파지 선별 라운드를 필요로 할 수 있다. 다르게는, FR 서열에 대해 유도된 돌연변이 유발은 특히 서열 내 이황화 형성에 참여하는 시스테인 및 예를 들어, 인간 IgG1의 중쇄 FRH4의 불변 트립토판과 같은 고도의 보존된 아미노산 서열을 제외한, CDR 서열에 인접한 아미노산 잔기에 대해 수행될 수 있다.
프레임워크 영역 또는 FR 잔기는 본원에서 정의되는 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 초가변 잔기 또는 CDR 서열의 지정이 CDR을 확인하기 위한 카밧 또는 IMGT® 방법 사이에 차이가 있을 수 있기 때문에, 프레임워크 영역의 서열이 달라질 수 있다. 특히, 카밧 명명법과 IMGT® 명명법 간의 FR 서열은 동일하거나, 중복되거나, 또는 하나 또는 나머지 하나에 포함될 수 있다.
수용자 (acceptor) 인간 프레임워크 영역 (CDR 서열에 대한)은 인간 면역 글로불린 프레임워크 영역, 또는 인간 공통 프레임워크 영역으로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 카밧 명명법을 이용하여, 중쇄 가변 영역의 인간 프레임워크 영역 서열은: 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH1, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH2, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH3 및 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 FRH4이다.
인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 (consensus) 프레임워크로부터 유래된 수용체 인간 프레임워크 영역은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 또는 3개 이하의 아미노산 변화가 존재하거나 생성된다.
예를 들어, 카밧 명명법을 사용한, 상기 경쇄 가변 영역의 인간 프레임워크 영역 서열은: 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL1, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL2, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL3 및 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 FRL4이다.
동일한 Fab 중쇄 서열 (서열번호 1)에 대해 IMGT® 방법으로 확인된 프레임워크 서열의 경우, 중쇄 가변 영역의 IMGT®-정의 프레임워크 영역 서열은: 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 25의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH1; 아미노산 위치 34의 이소류신부터 아미노산 위치 50의 티로신 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH2; 아미노산 위치 59의 티로신부터 아미노산 위치 96의 시스테인 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH3, 및 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH4이다. 동일한 Fab 경쇄 서열 (서열번호 3)에 대해 IMGT® 방법으로 확인된 프레임워크 서열의 경우, 경쇄 가변 영역의 IMGT®-정의 프레임워크 영역 서열은: 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 26의 세린 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL1; 아미노산 위치 33의 발린부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL2; 아미노산 위치 53의 글루탐산부터 아미노산 위치 53의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL3; 및 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL4이다.
상기 가변 영역에서, FR 및 CDR의 배열은: 중쇄 가변 영역에 대해 FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4이고 경쇄 가변 영역에 대해 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4이다.
Fab 파지 디스플레이 라이브러리는 항체 경쇄를 코딩하는 서열 및 피막 단백질에 융합된 Fab 항체 단편 중쇄에 대한 코딩 서열을 함유하는 사상파지 벡터 시스템 (예를 들어 M13 박테리오파지)인, 파지미드에서 구축된다. 라이브러리가 구축되면, E. coli로 형질전환되고 파지미드가 복제되어 (colE1와 같은 dsDNA 기원을 이용함) 항체 경쇄 및 중쇄-피막 단백질 융합 단백질을 발현한다. ssDNA 기원을 사용하는, 헬퍼 파지 (K07)로의 공동-감염에서, 파지미드는 파지미드로부터의 중쇄-피막 융합 단백질 및 헬퍼 파지로부터의 야생형 피막 단백질로 장식된 비리온으로 패키징된 단일 가닥 DNA로 복제한다. 헬퍼 파지는 야생형 피막 단백질 합성 및 파지미드 내의 M13/f1 파지 기원을 통한 복제/패키징에 필요한 유전적 정보를 제공한다.
파지미드 비리온은 숙주세포로부터 돌출되고, 각 파지 입자는 그의 코딩 서열이 파지 입자 내로 캡슐화된 특유의 항체/Fab를 나타낸다. 이러한 파지 입자는 VEGF 단백질로 자극되고, VEGF 결합에 대해 선별되며, 이의 박테리아 숙주 세포를 감염시킴으로써 증폭되고, 추가의 Fab 특성화 및 Fab 핵산 서열의 분리를 가능하게 한다.
파지미드 클론은 항원 결합 영역에서 아미노산 조합을 더 미세하게 조정하고, 라이브러리를 제조한 다음, 파지-디스플레이 라이브러리, 스크리닝, 농축 및 검증을 추가로 포함하는, 친화도 성숙이 추가로 이루어진다. 친화도 성숙의 다수의 라운드는 원하는 친화도를 갖는 클론을 만들기 위해 필수적일 수 있다.
수식업 개의 Fab 풀에서, 원하는 항원 단백질에 가장 높은 친화도를 나타내는 소수 (~100)의 결합제를 라운드 1에서 스크리닝된다. 클론의 추가 농축은 이후 선별 라운드에서 항원-유도 방식으로 수행되며, 본 발명자들은 100부터 우수한 친화도 (~10)를 나타내는 최상의 결합제를 찾는다. 가장 우수한 친화도 (nM)를 갖는 최사의 클론을 발현 벡터에 서브-클로닝하고 발현시켜 최상의 수율을 갖는 클론을 스크리닝하였다. 우수한 친화도 및 수율을 갖는 클론을 선별하고, 적용에 기초하여 친화성은 pM 범위로 추가 향상시켜야 한다.
기본 벡터 백본은 모든 Fab 컨스트럭트에 대해 동일하다. 변화는 오직 CDR 내에 있다. 3개의 이러한 CDR 영역이 있다. L 사슬 - CDR-L1, L2 및 L3 그리고 H 사슬 - CDR-H1, H2 및 H3. 이러한 CDR 중 하나 또는 조합이 라이브러리에 수십억가지 가능성을 제시하도록 변경된다.
2. Pho A-기반 벡터에서의 Fab 클로닝
2140bp의 DNA 컨스트럭트는 유전자 합성되었고, 이 컨스트럭트는 phoA 프로모터, 클론 #121 (Fab-A5)의 Fab 코딩 서열 및 rrnB 종결자 서열로 구성된다. 상기 컨스트럭트는 클론 #121를 생성하기 위해 EcoRI/ NotI 부위에서 변형된 pBR322 벡터에 클로닝하였다. 이어서 클론 #131을 생성하기 위해, 클론 #121을 1454 bp 크기의 tetR　내성 유전자를 결실시킴으로써 변형시켰다.
8번째부터 203번째 위치까지의 아미노산 영역에 상응하는 Fab-F8.y의 DNA 서열이 유전자 합성되었고 이 DNA 단편은 표준 클로닝기술을 사용하여 클론 #131으로 대체하여 클론 #201을 제조하였다. 클론 #201로부터 생성된 Fab 201은 성숙 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 123에서 단일 아미노산 변화를 제외하고 Fab FF03046-2에 대한 아미노산 서열에서 동일하고, 이때 Fab FF03046-2에서 글루탐산은 클론 #201에서 세린으로 변경되는 것을 유념한다 (도 16 참조). 클론 #201로부터 유래된 Fab 변이체 #216은 예를 들어, 아미노 말단 분비 신호 연장을 갖는 서열번호 16 또는 서열번호 17에 제공된 바와 같은 미가공의 번역된 카파 경쇄의 아미노산 146에 상응하는, 성숙 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 123에 동일한 세린을 갖는다 (도 16 참조). Fab 216에 대한 대안적인 코딩 서열이 도 16에 제공되어 있음을 유념한다. 항-VEGF Fab 201 및 항-VEGF Fab 216에 대한 발현 플라스미드의 도식적 표현은 도 17 및 18에 제공된다.
3. 재조합 Fab의 형질전환 & 발현
재조합 Fab의 형질전환은 E. coli Dh5α & BL21에서 수행되었다.
글리세롤 스톡 회복
-80 ℃의 글리세롤 바이알은 얼음에서 10분 동안 해동된다. 100mg/ml으로부터 50μl 카르베니실린 또는 암피실린 100mg/ml이 50 ml의 LB (Luria Broth)에 첨가된다. 7 μl의 해동된 글리세롤 스톡 배지를 취하여 항생제를 포함하는 50 ml LB 브로스에 접종하였다. 배양물을 밤새 37 ℃, 210 rpm으로 배양기 진탕기에서 성장시켰다.
플라스미드 분리
밤새 성장시킨 배양물의 5ml를 취하고 Qiagen QIAprep Spin Miniprep 키트 (카탈로그 번호: 27104)를 이용하여 플라스미드를 분리한다.
항체 반응 능력이 있는 세포 준비:
동결된 스톡으로부터의 박테리아를 적절한 항생제 (카르베니실린/암피실린)와 함께 도말되었다. 단일 콜로니를 골라 세포를 항생제를 포함하는 LB에서 600 nm의 OD가 0.4-0.6에 이를 때 까지 성장시킨다. 배양은 4℃에서 4000g로 10분 동안 스핀 다운된다. 펠릿을 4℃에서 TBS의 1/20 부피로 재현탁한다. 세포를 얼음 위에서 10분 동안 배양하고 10% 멸균 글리세롤 최종 농도를 첨가한다. 세포를 개별 튜브에 분주 (100ul의 세포)하고 액체 질소 또는 드라이 아이스로 동결시킨다. 튜브를 -80℃에서 저장한다.
형질전환
희석된 DNA를 1.5mL 튜브의 1X KCM 10μl와 혼합한다. 튜브를 같은 부피의 항체 반응 능력이 있는 세포 (10ul)를 첨가하기 전에 2-5분 동안 얼음 위에서 차갑게 한다. 튜브를 얼음 위에서 20분 동안 추가로 배양한 다음, 실온에서 10분 동안 배양한다. 분해대사물억제를 갖는 슈퍼 옵티멀 브로스 (SOC) 또는 LB 배지 (ThermoFisher) 200 ul을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 진탕배양하여 세포를 회복시킨다. 상기 배양물 100-200ul을 취하여 밤새 37℃에서 적절한 항생제 (카르베니실린/암피실린)을 포함하는 LB 한천 플레이트에서 성장시킨다.
형질전환체로부터 마스터 세포 은행 (Master cell Bank) 제조
사전 접종물 (Pre-Inoculum)을 준비한다 (LB 배지 pH 7.0, 10 mL + 100 mg/ml 스톡으로부터의 10μl 카르베니실린). 배양물은 밤새 37℃/210 rpm으로 성장시킨다. 밤새 성장시킨 배양물 1 mL를 100 mL의 신선한 LB 배지 (100 mL LB 배지, pH 7.0 + 100 mg/ml 스톡으로부터의 100 μl 카르베니실린)에서 계대배양하였다. 배양물은 37℃/210 rpm으로 OD600이 0.4 내지 0.6에 이를때 까지 성장시킨다. 배양물은 멸균 조건 하에 4000 rpm으로 회전시킨다. 펠릿은 6 mL 멸균 LB 배지 pH 7.0 + 4 mL, 50 % 멸균 글리세롤에 60 : 40 (성장시킨 배양물:글리세롤)의 비율로 재현탁한다. 다수의 글리세롤 스톡을 준비하고 처음에는 -20℃에서 저장하고 나중에는 -80℃로 옮긴다. 글리세롤 스톡은 주기적으로 회복된다.
사전 접종 준비:
LB 한천 플레이트로부터 E. coli BL21에서 새롭게 형질전환된 201의 단일 콜로니를 선정하였다. E. coli BL21-201을 카르베니실린 항생제 (10 μl)를 함유하는 LB broth (10 mL)에 접종하였다. 배양물은 궤도 진탕기에서 16 시간 동안 37℃에서 210 rpm으로 유지하였다. 600 nm에서 배양물의 OD는 16시간 후에 확인하였다.
최소 배지에서의 성장 및 유도:
500 mL의 성장 및 생산 배지를 준비하였다. 배지 pH는 7.0으로 조정하였다. 접종하기 전에, 500 μL 카르베니실린 (100 mg/mL 스톡 유래), 500 μL 티아민 HCL (1M 멸균 스톡 유래), 2.5 mL 멸균 글루코스 (40% 멸균 스톡 유래) 및 320 μL 인산칼륨 (1M KH2PO4 유래)을 첨가하였다. 성장 배지는 8%의 밤새 성장시킨 배양물 (사전 접종물)과 함께 접종되었다. 성장 배지에서 시작 OD (600 nm), 배양물의 글루코스 농도 및 포스페이트 농도를 동시에 확인하였다. 배양 플라스크를 OD가 2-2.5 사이에 도달할 때까지 37 ℃에서 210 rpm으로 궤도 진탕기에 유지하였다. OD (600 nm)를 확인하여 성장 배지의 배양물에서 글루코스 농도와 포스페이트 농도를 평가하였다. 배양물을 + 25 ℃에서 4000 rpm으로 15분 동안 회전시켰다. 세포 펠릿을 멸균 조건에서 세척하였고 15분 동안 4000 rpm으로 회전시켰다. 세포 펠릿을 낮은 포스페이트 농도 (0.064 mM 작업 농도)를 갖는 500 mL 생성물 배지에 재현탁시켰다. 생산 배양 플라스크를 30 ℃에서 210rpm으로 20 시간 동안 유지시켰다. 동시에, 생산 배지에서 배양물의 OD (600nm), WCW, DCW, 글루코스 및 포스페이트 농도를 분석하였다. 발현된 배양물은 + 4 ℃에서 4300g로 30 분 동안 회전시켰다.
Fab의 정제
100 ml 배양물에서 단백질을 추출하는 과정
박테리아 펠릿 용해는 140 mM 염화나트륨 및 1 mM 페닐 메탄 설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 함유하는 20 mM 포스페이트 버퍼를 사용하여 수행하였다. 100 ml 배양물로부터 20 g 펠릿에 대해, 4 L의 용해 버퍼를 사용하였다. 펠릿 세척은 2 L의 용해 버퍼를 사용하여 수행하였고, 펠렛을 현탁하여 4,300 g에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심분리 하였다. 펠릿을 2 L의 용해 버퍼에 4 ℃에서 현탁시키고 65 도의 수조에서 5 분간 예열하였다. 짧은 혼합 단계 후, Triton X 100을 0.1 %의 비율로 첨가하고 5 분 동안 혼합하였다. 그 다음, 현탁액을 65 ℃에서 40 분 동안 유지된 수조로 옮기고, 이어서 얼음 위에서 용해물을 냉각을 수행하였다.
펠릿의 정화는 용해물을 4,300 g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 4℃에서 17,000 g으로 30분 동안 추가 정화함으로써 수행되었다. 최종 상층액을 0.45 μm PES 멤브레인 필터를 통해 여과시켰다. 여과액을 Capto L (GE) 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하고, 이때 fab는 2% 수크로스를 함유하는 pH 2.0의 0.2 M 글리신-HCl 버퍼로 용출시켰다. 용출된 fab는 즉시 pH 8.8의 1.5 M Tris-Cl 버퍼로 중화시켰다. 중화된 fab를 pH 6.0의 20 mM 포스페이트 버퍼로 교환한 후 셀루파인 ET 클린 L 수지 (Cellufine ET Clean L resin)를 통해 내독소를 제거하였다. 정제된 분획물을 브래드포드 분석으로 정량적으로 분석하고 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 SDS-PAGE로 정량적으로 분석하였으며, 활성 단백질을 ELISA를 이용하여 분석하였다. 내독소의 수준은 Thermo Scientific Pierce LAL 키트를 이용하여 분석하였다.
브래드포드 방법을 통한 정량화를 위한 BSA 표준 곡선 (도 1)이 다음과 같이 수행되었다. BSA 샘플을 50 ug/ ml 내지 500 ug/ml 범위의 농도로 만들기 위해 계열 희석하였다. 요약하면, 이 분석을 위해, 10 ul의 각각의 표준을 작동 (working) 브래드포드 시약과 혼합하고, 실온에서 5분 동안 배양하여 다중 플레이트 판독기의 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1의 플롯팅 표준 곡선에 대해 사용된 표
농도 BSA ug/ml 595에서의 OD
50 0.07
100 0.14
250 0.26
375 0.39
500 0.53
정제된 Fab에 대한 수율 정량 및 활성 측정진탕 플라스크 및 정제 후 발현된 클론으로부터의 Fab의 수율을 정량하기 위해, 루센티스의 표준 곡선을 준비하였고 세포 용해물 및 Fb의 컬럼 크로마토그래피 (단백질 정제) 후 용출액에서 Fab의 농도를 측정하기 위해 사용하였다.
정량적 ELISA 프로토콜
버퍼를 준비하였다 (세척 버퍼 (PT), 희석 버퍼 (PBT) 및 차단 버퍼). VEGF-121 (인간 VEGF-A121)을 가볍게 흔들어 주면서 PBS에서 2 시간 동안 웰 당 50 ng/100 ul의 최종 농도로 Nunc 96 웰 MaxiSorp 플레이트를 코팅하는데 사용하였다. hVEGF를 코팅된 플레이트로부터 제거하였다. 200 ul의 차단 버퍼를 첨가하였고, 플레이트를 가벼운 진탕으로 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 차단 버퍼를 여과지에 쏟아 제거하였다. 플레이트를 200 ul 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 20 ug/ml의 스톡 용액으로부터, 루센티스® (라니비주맙; Novartis 및 Roche)를 희석 버퍼에서 500 ng/ml로 희석시켰다. 500 ng/ml의 희석된 루센티스®를 사용하여, 루센티스®의 일련의 계열 희석을 수행하여 200 ng/ml, 100 ng/ml, ..., 0.39 ng/ml으로 희석된 루센티스®를 수득하였다. 100 ul의 계열 희석된 루센티스®를 세 번씩 웰에 첨가하고, 플레이트를 가벼운 진탕으로 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트의 웰의 용액을 버리고, 플레이트를 200 ul의 세척 버퍼로 3X 세척하였다. 100 ul의 항-카파 경쇄 항체-HRP 접합체 (희석 버퍼에서 1:5000)를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 3X PBS로 2x 세척하였고 여과지에 쏟아 버퍼를 완전히 제거하였다. 100 ul의 TMB 기질을 각 웰에 첨가하였고, 비색 반응을 5분 동안 진행시켰다. 100 ul의 1N 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 450 nm에서 다중모드 플레이트 판독기에서 판독하였다. 알려지지 않은 샘플의 경우, 여러 희석액이 만들어지고 그 값은 표준 곡선을 이용하여 추정된다 (도 2 및 표 3을 참조한다).
도 2의 플롯팅 표준 곡선 (정량적 ELISA)에 대해 사용된 값
농도 ng /ml OD-450nm
0 0
0.244 0.09
0.488 0.18
0.976 0.38
1.952 0.69
3.904 1.41
7.808 2.75
친화도 분석친화도 분석의 단계는 다음과 같다. 버퍼를 준비하였다 (세척 버퍼 (PBST), 희석 버퍼 (PBT), 차단 버퍼 및 정지 버퍼). Nunc 384 웰 플레이트의 웰을 PBS에 용해된 hVEGF로 웰 당 50 ng/25 ul의 최종 농도로 RT, 150 rpm으로 2시간 동안 코팅하였다. 2시간 후, hVEGF를 코팅 플레이트로부터 제거하였다. 75ul의 차단 버퍼를 첨가하고 가벼운 진탕으로 RT, 200 rpm에서 1시간 동안 배양하였다. 차단 버퍼를 제거하였고 플레이트를 75 ul의 PBST로 6X 세척하였으며 티슈 타월에 두드려 건조하였다. 한편, 비-스틱 플레이트/에펜도르프 (Eppendorf)에서 hVEGF 시작 농도 2X (100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM ...)를 PBT에 준비하여 VEGF의 최종 농도 X가 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM ...이 되도록 하였다). 200 pM 루센티스 (2X) Fab를 PBT에 준비하여 최종 농도 X가 100 pM이 되도록 하였다. 50 ul의 100 pM hVEGF (2X) (100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM ...)를 50 ul의 200 pM 루센티스 (2x)와 혼합하여 최종 농도 X가 (50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 ...)이 되도록 하였고 가볍게 진탕하면서 RT, 200 rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 비슷한 단계가 Fab 분자에 대해서도 수행되었다. 25 ul의 이러한 계열 희선된 hVEGF/Fab 혼합물을 플레이트에 첨가하여 가볍게 진탕하면서 RT, 200 rpm으로 30분 동안 배양하였다. 플레이트에 고정되지 않은 1차 항체를 제거하고 플레이트를 75 ul의 PBST로 6X 세척하였고 티슈 타월에 두드려 건조하였다. 25 ul 항-카파 경쇄 HRP (PBT에서 1:5000)를 첨가하였고 가볍게 진탕하면서 RT, 200 rpm으로 45분 동안 배양하였다. 플레이트 상에 고정되지 않은 2차 항체를 제거하고 플레이트를 각 웰에서 75 ul의 PBST로 6X, PBS로 2X 세척하여 티슈 타월에 두드려 건조하였다. 25 ul의 TMB 기질을 첨가하고 가볍게 진탕하면서 RT, 200 rpm으로 5분 동안 배양하였다. 25ul 1N 황산을 플레이트에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 다중모드 플레이트 판독기에서 450 nm으로 판독하였다 (도 3 및 표 4를 참조한다).
Fab ID 라니비주맙 Fab 201
Kd (pM) 475 ± 36 110±14
hVEGF -165 퀀티킨 ® ELISA 인간 VEGF 면역분석 키트 (R&D Systems, Inc.)를 이용한 경쟁-ELISA 요약하면, 10 pM의 hVEGF-165를 항-VEGF 항체의 계열 희석액과 함께 도면 설명에 기재된 바와 같이 배양하였다. 결합 용액에서 비결합 hVEGF-165와 함께 사전에 형성된 hVEGF-165/항-VEGF 항체 복합체를 퀀티킨® ELISA 인간 VEGF 면역분석 키트 (R&D Systems, Inc.; Catalog Number: SVE00))에 제공된 바와 같은, 인간 VEGF에 특이적인 모노클로날 항체로 코팅된 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트로 옮겼다. 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 퀀티킨® 분석 키트에 제공된 바와 같은 플레이트에 결합된 hVEGF-165를 정량하기 위한 크로마젠 (chromagen)으로 테트라메틸벤지딘 및 겨자무과산화효소에 결합된 폴리클로날 항-hVEGF 항체를 이용하여 검출한다. Kd는 프리즘 소프트웨어 (Prism software)를 이용하여 5 파라미터 비대칭 모델로 맞춰진 데이터로부터 계산되었다.
다음은 프로모터-phoA, Fab-F8.y 및 종결자-rrnB의 코딩 서열이다.
프로모터-phoA
GACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTATTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATGTAGAGGTTGAGGTGATTTT (서열번호 15)
Fab-F8.y의 코딩 서열
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 16)
종결자-rrnB
CGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACATCCATGCGTTAACGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGGAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGTGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTT (서열번호 19)
pBR322의 테트라사이클린 내성 유전자가 결실된 뉴클레오타이드 위치 1353부터 4361까지의 pBR322의 핵산 서열 (GenBank 등록번호: J01749.1)
GAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTC
1세대 항- VEGF Fab 선별 - 순수 항체 라이브러리 선별 및 선택된 Fab의 교차종 반응성 및 특이성.
항체 단편 (Fab) 파지 라이브러리 F (문헌 [H. Persson, Et. al., J Mol Biol, vol. 425, no. 4, pp. 803-811, 2013.])가 프레프로테크 (Preprotech)로부터 입수한 재조합 인간 혈관 내피 성장인자 (hVEGF) 121 (카탈로그 번호 100-20A)에 대해 선별되었다. Fab는 프레프로테크 (Preprotech)로부터 입수한 마우스 VEGF (mVEGF) (카탈로그 번호 450-32) 및 hVEGF에 대한 결합과 항체 결정화 단편 (Fc) 및 소 혈청 알부민 (BSA)에 대한 결합 부재에 대해 스크리닝하였다. 총 7개의 Fab가 선별되었고, 이들 중 6개 (FF0124-1, FF0124-3, FF0124-4, FF0124-5, FF0124-6 및 FF0124-7로 지칭됨)는 hVEGF와 mVEGF에 결합하지만, Fc와 BSA에는 결합하지 않았다. 이들 Fab의 hVEGF에 대한 친화도는 Fab-ELISA로 평가되었다 (도 4).
hVEGF 수용체, FLT에 대한 hVEGF 결합을 차단하는 Fab의 능력 및 친화성 랭킹 (affinity ranking).
FLT는 VEGF 천연 수용체 중 하나이다. 상기 6개의 Fab는 FLT와 사전배양되었을 때, hVEGF에 덜 결합하는데 (도 5), 이는 6개의 Fab와 FLT가 hVEGF 상의 중복된 결합 부위를 가지며, 이들이 hVEGF에 대한 FLT 결합을 억제하는 잠재력을 갖는다는 것을 나타낸다. 5개의 Fab는 FF0124-1, FF0124-3, FF0124-4, FF0124-6 및 FF0124-7　서열에 기초한 라이브러리를 만들기 위한 주형으로 사용되었다. 이들 라이브러리는 hVEGF에 대한 더 높은 친화성에 대해 선별되었다.
2세대 항-VEGF Fab 선별 - 1세대 항-VEGF 항체의 친화성 성숙.
다음 세대 라이브러리는 Fab FF0124-1, FF0124-3, FF0124-4, FF0124-6 및 FF0124-7를 기초로 하였다. 각 라이브러리의 다양성은 1x109에서 4x109까지의 범위였다. 상기 5개의 라이브러리를 모으고 (총 다양성 1010) 이전에 기술된 바와 같이 생산하였다. 모은 Fab-파지 라이브러리를 선별한 다음, 이들의 평가된 친화성으로 순위가 매겨진 선별된 클론의 서열을 도 6에 기록하였다. 10nM 단일 포인트 경쟁 ELISA에 기초하여, Fab FF0158-C4, FF0158-F11 및 FF0158-C11은 가장 낮은 친화도로 hVEGF에 결합한다. 이들은 이전에 기술된 바와 같이 가용성 단백질로서 박테리아에서 생산되었다. 용액에서 hVEGF에 대한 친화도는 경쟁 Fab-ELISA로 측정되었다 (도 7).
FF0158-C4 및 C11의 생산 수율은 보통 관찰된 것보다 5 내지 10배 낮았다. 어떤 아미노산 위치가 이러한 생산 수율의 저하를 초래하는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 각각의 FF0158-C4 및 FF0158-C11 CDR 서열을 고수율 Fab인 항-말토스-결합-단백질 (MBP)-항체의 CDR 서열로 대체하였다. 항-MBP Fab CDR 각각의 서열로 다시 돌연변이 되었을 때, CDR-H1 및 CDR-H2 둘 다 정상 수준으로 FF0158-C4 생산 수율을 회복하였다.
3세대 항-VEGF Fab - 2세대 항-VEGF 항체의 친화성 성숙 및 수율 향상
CDR-H1 또는 CDR-H2의 성숙이 FF0158-C4의 생산 수율을 향상시킬 수 있으므로, 본 발명자들은 CDR-H1 및 CDR-H2에 중점을 둔 다양성을 가진 2개의 상이한 라이브러리를 생성하였다. 상기 라이브러리는 중쇄와 pIII 코딩 서열 사이에 앰버 종결 (amber stop) 및 pTac 프로모터를 갖는 항-MBP Fab 파지미드로부터 구축되었다. 이 포맷에서, Fab는 앰버 억제자 박테리아 균주에서 발현될 때 파지 상에 나타나고 비-앰버 억제자 박테리아 균주에서 발현될 때 가용성 형태로 분비된다. Fab가 나타난 파지가 친화성을 위해 선별되고, 분비된 Fab는 단백질 수율을 위해 스크리닝되었다.
파지 입자를 나타내는 Fab를 생성하기 위해, SR320로 전기천공한 후 생성된 파지를 앰버 종결 억제자 균주, OmnimaxTM (Thermo Fisher Scientific)에 감염시켰다. 9x109　다양성을 갖는 라이브러리를 hVEGF-121에 대한 결합에 대해 선별하였고, 클론을 소규모 박테리아 배양에서 생산 수율 향상을 위해 스크리닝하였다. 흥미롭게도, 가장 높은 수율 향상을 보인 상기 2개의 Fab (Fabs FF0188-H5/FF01088-B10 및 FF0188-F12)는 중쇄 CDR-H1 (카밧® 번호매김에서 정의됨)에서 페닐알라닌을 히스티딘으로 아미노산 돌연변이 시켰다. 위치 31의 페닐알라닌 잔기 (Fab FF0188-A9 및 FF0188-A2)는 도 7에 나타난 바와 같이 큰 수율 향상 (각각 2배 및 3배 향상)을 야기하지 않았다. 열안정성은 3개의 모든 Fab에 대해 동일하다: FF0158-C4, FF0188-F12 및 FF0188-H5: 74.5℃.
4세대 항-VEGF Fab - 3세대 항-VEGF 항체의 친화성 성숙 및 수율 향상
수율이 향상된 항-VEGF Fab FF0188-H5의 친화성을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 주형으로 FF0188-H5 서열을 갖는 신규한 라이브러리를 설계하였다. 다양한 CDR에서 종결 코돈을 주형에 추가하여 2개의 라이브러리에서 모 (parental) 서열의 수를 제한하였다.
라이브러리의 다양성은 6x109였다. 파지 라이브러리는 앰버 억제자 균주 OmnimaxTM에서 증폭되어 Fab를 나타내는 파지를 생산할 수 있게 되었다. hVEGF-121에 대해 라이브러리를 선별한 다음, 64개의 선택된 클론을 단일 포인트 경쟁 파지-ELISA로 스크리닝하였다. 1nM hVEGF 경쟁 후 가장 낮은 잔류 결합 (residual binding)을 나타낸 20개의 클론을 시퀀싱하고 특성화하였다 (도 8은 9개의 특유의 클론의 서열 및 추가 특성화를 보여준다). FF0117-A5는 리터 당 5.4 mg의 수율, hVEGF에 대해 80+/-40 pM의 친화도, 77℃의 Tm을 나타낸다. FF0117-A5는 친화도 및 열 안정성면에서 라니비주맙 (ranibizumab)보다 우수하다: 경쟁 Fab-ELISA에서 FF0117-A5의 친화도는 라니비주맙보다 4 내지 15배 높고, FF0117-A5의 Tm은 3.5℃ 더 높다.
5세대 항-VEGF Fab - 4세대 항-VEGF 항체의 친화도 성숙
항-VEGF Fab FF0117-A5의 친화도를 추가로 향상시키기 위해, 본 발명자들은 주형으로 FF0117-A5 서열을 갖는 신규한 라이브러리를 설계하였다: FF0117-A5를 돌연변이시켜 CDR-L1과 CDR-L2에 종결 코돈을 도입하고, Fab의 HC의 C-말단을 코딩하는 서열을 변형하여 2가 디스플레이 대신 1가 디스플레이가 되도록 하였다. 이 라이브러리의 다양성은 6x109였다. 1010개의 파지 입자는 500 mL의 앰버-억제자 균주 OmnimaxTM 배양물을 감염시켜 Fab 디스플레이 파지 입자를 제조하기 위해 사용되었다.
라이브러리 FF01159-1이 선별되었고, hVEGF에 결합하는 Fab-파지 클론을 시퀀싱하여 가용성 Fab로 생산하였다 (도 9). 라이브러리 FF01159-1는 CDR-L2 (카밧)의 말단 근처의 하나의 잔기의 결실로 설계되었기 때문에, 선별된 Fabs FF03033-4 및 FF03033-8은 돌연변이 되어 이전에 결실된 티로신 잔기를 결실된 위치에 다시 도입하였다. 그 결과 형성된 Fab는 FF03046-1 및 FF03046-2로 명명되었다. Fab FF03046-2 CDR 서열, 열 안정성, 생산 수율 및 hVEGF에 대한 결합 친화도는 도 9에 나타내었다. hVEGF-의존성 인간 혈관 내피세포 (HUVEC) 증식을 차단하는 FF03046-2 Fab의 능력은 도 10에 기록되었다. 260 pM의 hVEGF-165는 HUVEC 증식 분석에 사용되었다. FF03046-2 (200 pM+/-10 pM)의 EC50은 상기 분석에 사용된 hVEGF-165의 농도보다 낮으며, 이는 FF03046-2의 EC50이 HUVEC 분석으로 실질적으로 저평가될 수 있음을 의미한다. hVEGF에 대한 FF03046-2 Fab의 친화도는 또한 용액에서도 측정되었다. hVEGF-165를 사용하였고 퀀티킨 분석 (Quantikine assay)으로 검출하였다. 이를 통해 hVEGF의 작업 농도를 5 pM 농도로 낮출 수 있었다 (도 11). 이 분석에서, hVEGF-165에 대한 FF03046-2의 친화도는 라니비주맙보다 훨씬 낮다 (90 pM +/-　20 pM　대 390 pM +/- 50 pM).
항-VEGF scFv 및 Fab의 C-말단 Fc 융합.
본 발명자들은 FF03046-2의 scFv 버전 또는 Fab 버전을 인간 Fc의 C-말단 상에 융합하였다. 본 발명자들은 Fc의 C-말단에 융합된 Fab/scFv의 각각 하나를 갖는 VEGF 단일 분자를 클램핑하는 능력으로 인해, 융합 단백질이 더 느린 클리어런스와 더 높은 친화도를 가질 것으로 예상하였다. Fc의 N-말단이 scFv 또는 Fab와 융합되어 관심있는 다른 단백질과 결합할 수 있기 때문에 다중특이성 개체(entities)의 생성이 용이해진다.
Fab 및 scFv Fc 융합체의 서열은 각각 도 12 및 13에 나타내었다. 다른 항-VEGF 단백질과 비교하여 hVEGF-165에 대한 Fab 및 scFv 융합체의 친화도는 도 14에 나타내었다. hVEGF에 대한 FF03077-4 및 FF03092-1의 친화도는 Fab FF03046-2 중 하나와 유사하다. Fab FF0346-2 (FF03092-3)의 전장 IgG 버전의 서열은 도 15에 나타내었다.
종합하면, FF03092-1, FF03077-4, 및 FF03046-2는 생체 내(in vivo)에서 상이한 효능으로 변환될 수 있는 상이한 약동학 프로파일을 가질 수 있는 3개의 상이한 항-VEGF 개체이다. FF03046-2의 용해도 및 생산 수율을 추가로 향상시키기 위해, 몇 가지 변이체 (예를 들어, 실시예 3에 나타낸 서열)를 설계하여 생산 수율, 용해도 및 hVEGF 결합 친화도에 대해 시험하였다.
Y 변이체의 서열
변이체 201
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 21)
변이체 202
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCGACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 22)
변이체 203
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGATCTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 23)
변이체 204
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCAGACGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 24)
변이체 205
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변이체 206
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변이체 207
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변이체 208
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변이체 209
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변이체 212
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변이체 213
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변이체 214
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변이체 215
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변이체 216
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTAGATCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 34)
변이체 217
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGACGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 35)
변이체 218
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCGACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 36)
변이체 219
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGACCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 37)
변이체 220
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCGACGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA (서열번호 38)
상기 Y 변이체의 핵산 서열로 코딩되는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 단편은 카밧 또는 IMGT® 명명법으로 정의된 바와 같은 CDR과 함께, 도 4, 6-9 및 12-16에 도시되었다.
클론 #201에 의해 생산된 Fab를 기반으로 한 Fab 변이체는 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 VEGF-165에 대한 다양한 결합 친화도를 나타냈다. 변이체 중 2개 (Sl. No. 3 and 9)는 클론 #201의 시작 Fab (starting Fab)보다 인간 VEGF-165 이소폼에 대해 더 높은 친화도를 나타내는데, 이는 이들 2개의 변이체가 약 12 pM 및 14 pM의 Kd 값을 가지므로, VEGF에 대한 Fab의 Kd의 추가 향상이 수득될 수 있음을 나타낸다.
클론 #201 유래의 Fab 201의 CDR-H1인 GFDLFHYS가 Fab 변이체 216의 CDR-H1인 GFDLDHYS가 되도록, 클론 #201의 돌연변이 유발로부터 유래된 Fab 변이체 216은 중쇄 CDR 서열 (IMGT® 방법으로 정의됨)에서 페닐알라닌에서 아스파르트산 잔기로의 단일 아미노산 변화를 갖는다. 도 19 및 20, 그리고 표 5에 나타난 바와 같이, Fab 216에서 페닐알라닌에서 아스파르트산으로의 변화의 존재는, 모 (parental) Fab 201과 비교하여, VEGF에 대한 이의 결합 친화도를 약간 감소시키지만 (Fab 216에 대해 약 35±4 pM의 Kd 대 Fab 216에 대해 25±2 pM; 표 5를 참조한다), Fab 201과 같이, Fab 216의 해리 상수 Kd는 루센티스 (Lucentis) Kd 보다 약 5-16배 정도 낮다 (도 19 및 20을 참조한다).
클론 #201 변이체의 Kd 값
퀀티킨 키트(VEGF-165)-10pM VEGF
Y 변이체 Kd(pM)
201 25±2
205 62
206 14
209 28
212 1276
213 91
215 27
216 35±4
219 12
220 26
루센티스 591±60
Y 변이체에 대한 서열 정렬은 하기 표 6-11에 나타내었다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
제형 1은 다음의 부형제를 포함한다. 0.03%의 폴리소르베이트 20, 5%의 수크로스, 40 mM의 염화나트륨, 10 mM의 포스페이트 버퍼, 및 pH 5.8. 또 다른 실시예에서, 폴리소르베이트 20은 약 0.1% 내지 0.04%의 범위에서 사용될 수 있다. 또한, 수크로스는 약 1% 내지 약 20%의 범위에서 사용될 수 있다. 염화나트륨은 약 10 내지 약 80 mM의 범위에서 사용될 수 있다. 포스페이트 버퍼는 약 10 내지 약 100 mM의 범위에서 사용될 수 있다. 또한, pH는 약 5 내지 6의 범위일 수 있다.
제형 2는 다음의 부형제를 포함한다. 0.03%의 폴리소르베이트 20, 0.05%의 수크로스, 40 mM의 염화나트륨, 10 mM의 히스티딘 버퍼, 및 pH 5.5. 또 다른 실시예에서, 폴리소르베이트 20은 약 1% 내지 약 20%의 범위에서 사용될 수 있다. 또한, 수크로스는 약 1% 내지 약 20%의 범위에서 사용될 수 있다. 염화나트륨은 약 10 내지 약 80 mM의 범위에서 사용될 수 있다. 히스티딘 버퍼는 약 5 내지 약 50 mM의 범위에서 사용될 수 있다. 또한, pH는 약 5 내지 5.5의 범위일 수 있다.
제형 3은 다음의 부형제를 포함한다. 0.03%의 폴리소르베이트 20, 0.05%의 수크로스, 40 mM의 염화나트륨, 10 mM의 시트르산 나트륨 버퍼, 및 pH 5. 또 다른 실시예에서, 폴리소르베이트 20은 약 0.1% 내지 0.04%의 범위에서 사용될 수 있다. 또한, 수크로스는 약 1% 내지 약 20%의 범위에서 사용될 수 있다. 염화나트륨은 약 10 내지 약 80 mM의 범위에서 사용될 수 있다. 시트르산 나트륨 버퍼는 약 5 내지 약 20 mM의 범위에서 사용될 수 있다. 또한, pH는 약 5 내지 5.5의 범위일 수 있다.
변이체 201 생화학적 설명
변이체 201은 도 23 및 24에 도시된 인간 항-VEGF 가변 도메인을 포함하는 Fab 항체이며, 도 23에 제공된 힌지 영역의 일부와 중쇄 가변 영역-CH1 도메인 및 도 24에 제공된 카파 경쇄 가변 영역-카파 경쇄 불변 영역을 갖는, 성숙한 Fab 201 항체 단편을 생산하기 위한 23개의 아미노-말단 분비 신호를 제거하기 위해 가공되기 전에 초기에 융합 단백질 (서열번호 16)로 생산된다. 루센티스와 같은 다른 공지된 항-VEGF와 비교하여, 변이체 201의 가변 도메인은 특히 카밧 명명법 또는 IMGT® 명명법으로 정의된 바와 같은 CDR에서 다중 돌연변이 (도 23 및 24)를 함유한다. 이들 돌연변이는 VEGF에 대한 변이체 201의 강력한 결합을 부여한다 (도 3).
VEGF에 대한 합성 항체에 대한 업스트림 공정 정보
KCM 방법에 의한 E. coli BL21에서의 항- VEGF Fab -201 컨스트럭트의 형질전환
항-VEGF Fab DNA 컨스트럭트를 10 μl의 1X KCM과 혼합하고 같은 부피의 활성화세포 (10 ul)를 첨가하기 전에 2-5분 동안 얼음 위에서 사전냉각시켰다. 튜브를 얼음 위에서 20분 동안 추가로 배양한다음, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 200 ul의 분해대사물억제를 갖는 슈퍼 옵티멀 브로스 (SOC)를 첨가하고 세포를 궤도 진탕기에서 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 100 μl의 상기 배양물을 적합한 항생제 (카르베니실린)를 포함하는 LB 한천 플레이트에 도말하였고, 14 시간 동안 37℃에서 플레이트를 배양하였다.
진탕 플라스크 배양에서의 항-VEGF Fab-201의 발현
사전 접종물 준비:
카르베니실린 항생제 (100 mg/ml 스톡으로부터 10 μl)를 함유하는 10 ml 멸균 LB 브로스에 E.coli BL21-201의 동결된 작업 세포 은행 (working cell bank)으로부터의 10 μl를 접종하였다. 궤도 진탕기에서 배양물을 37℃에서 210 rpm으로 16 시간 (밤새) 배양하였다.
최소 배지에서의 성장 및 유도:
표 5에 언급한 바와 같이 성장 및 생산을 위한 최소 염 배지를 제조하였다. 배지의 pH를 7.0±0.3으로 조정하였다. 성장 및 생산 배지는 121℃, 15 psi에서 15분 동안 오토클레이브 하였다.
접종 전, 500 μL 카르베니실린 (100 mg/mL 스톡 유래), 500 μL 티민 HCL (1 M 멸균 스톡 유래), 2.5 mL 멸균 글루코스 (40% 멸균 스톡 유래) 및 320 μL 인산 칼륨 (1M KH2PO4 유래)을 첨가하였다. 8%의 밤새 성장시킨 배양물 (사전 접종물)을 성장 배지에 옮겼다. 시작 OD (600 nm), 배양물의 글루코스 농도 및 포스페이트 농도를 성장 배지에서 측정하였다.
배양 플라스크를 37℃, 210 rpm으로 7-8시간 동안 배양하였다 (OD가 2-2.5 사이에 도달할 때까지). OD (600nm), 배양물의 글루코스 농도 및 포스페이트 농도를 성장 8시간 후 성장 배지에서 확인하였다. 배양물을 4000 rpm, +30 ℃에서 15분 동안 회전시켰다. 세포 펠릿을 최소 배지 (포스페이트 미포함)로 세척하고 이를 다시 4000 rpm으로 15분 동안 회전시켰다. 상층액을 천천히 흘려 보냈다. 세포 펠릿을 낮은 포스페이트 농도를 갖는 500 mL 생산 배지에 현탁시켰다. 배양 플라스크를 30 ℃, 210 rpm에서 16시간 동안 배양하였다. 수확 배양물의 OD (600 nm), 글루코스 농도 및 포스페이트 농도를 확인하였다. 발현된 배양물을 4300 G, +4 ℃에서 30분 동안 회전시켰다.항-VEGF Fab 발현을 SDS-PAGE로 확인하고, 발현 수준을 ELISA로 정량하였다.
2.5 L 발효 염 배지에서의 항-VEGF Fab-201의 발현
2.5 L 발효조에서의 발현:
항-VEGF 항체를 3.7 L 발효조에서 발효 공정을 이용하여 대규모 생산하였다.
접종물 준비:
각각의 2.5 L 발효에 대해, 카르베니실린 항생제 (100 mg/ml 스톡으로부터의 250 μl)를 함유하는 250 ml 멸균 LB 브로스에서 E. coli BL21-201의 동결 작업 세포 은행의 20 μl를 접종하였다. 배양 플라스크를 궤도 진탕기에서 37℃, 210 rpm으로 16시간 동안 (밤새) 배양하였다.
최소 염분 배지에서 높은 세포 밀도 발효:
2.5 L 발표 배양을 위한 최소 염 배지를 준비하였다. 수산화암모늄 (25%)으로 배지 pH를 7.0±0.3로 조정하였다. 최소 염 배지를 3.7 L 발효조에서 121 ℃, 15 psi로 20분 동안 멸균시켰다.
접종 전에, 2.5 mL 카르베니실린 (100 mg/mL 스톡 유래), 2.5 mL 티민 HCL (1 M 멸균 스톡 유래), 2.5 mL 미량원소, 300 μl L-61 지포제, 및 100 mL 멸균 글루코스 용액 (40 g의 글루코스 함유)을 첨가하였다. 접종물 이동 전에, DO 수준을 100%로 보정 및 설정하였다. Do 보정 후, 밤새 성장시킨 배양물 (접종물)의 10% (250 mL)를 발효조 배지에 옮겼다. 발효 배지에서 배양물의 초기 OD (600 nm), 글루코스 농도 및 포스페이트 농도를 확인하였다.
발효는 37℃에서 3 lpm의 기류로 수행되었고 수산화암모늄 (25%)으로 pH 7.0±0.3으로 조절되었다. 발효조의 배압은 0.5 bar 게이지로 유지되었고 교반 속도는 500 rpm으로 설정되었다. 발효하는 동안 교반 속도를 500 rpm에서 1200 rpm으로 증가시키고 (교반은 점진적으로 증가됨), 발효조에서 배압을 유지함으로써 최소 DO 수준을 30%로 유지하였다. 배양물 OD (600 nm)가 12 시간 후에 18±2에 도달하였고, 이 시점에서 컴퓨터-기반 급여를 시작하여 높은 세포 밀도 배양을 달성하였다. 농축된 먹이는 글루코스 (450 g), 25 ml의 1 M 황산 마그네슘, 25 ml의 20X 염 배지 및 50 ml의 1M 인산칼륨을 함유한다. 농축된 먹이는 발효조에 첨가되고 18시간 동안 유속 1 ml/분으로 시작하였다. 발효조 배양물이 약 120±10 OD (600 nm)에 도달할 때, 포스페이트 농도가 동시에 측정되었다. 21±2 시간에서, 발효 배양물의 포스페이트 농도는 0.05 mM 미만이었고, 이 시점에서 발효 온도는 37℃에서 30℃로 점진적으로 변화시켰다. 발효 배양물에서 포스페이트 농도가 0.05 mM 미만이었을 때, 유도가 시작되었다. 후기 유도는 30℃에서 1200 rpm으로 10시간 동안 수행하였다. 최소 용존 산소 수준 (30%)은 높은 세포 밀도 배양을 위해 순수 산소의 첨가로 유지되었다. 공기와 순수 산소의 혼합물을 30℃에서 4 lpm의 유량으로 펌핑하여 용존 산소 설정값을 유지하였다. 발효 배양물의 OD (600 nm), 글루코스 농도 및 포스페이트 농도는 유도 후에 측정되었다. 4300 G, +4℃에서 30분 동안 배양물을 회전시키고 상층액을 제거하였다. 항-VEGF Fab-201 정제를 수행하였고 발현은 SDS-PAGE로 확인하였고 ELISA로 정량하였다.
발효 데이터와 발현 수율은 도 21에 도시되어 있다.
VEGF에 대한 합성 항체에 대한 다운스트림 공정 정보
세포 펠릿 현탁 및 용해:
E. coli 세포 펠릿의 용해는 용해 버퍼 (용해 버퍼- 200mM 포스페이트 버퍼, pH 7.4, 400mM 염화나트륨, 10mM 페닐 메탄 설포닐 플루오라이드 (PMSF), 2mM EDTA, 5% 수크로스, 1% Triton X-100)를 사용하여 수행하였다. 약 446 그램의 습윤 중량의 세포 펠릿을 실온에서 4.0 L의 용해 버퍼에 현탁시키고 세포 펠릿을 균질한 세포 현탁액이 수득될 때까지 강하게 혼합하였다. 펠릿을 -80℃에서 채취하고 용해를 실온에서 수행하기 때문에, 극한의 온도 차이로 인해 염 농도와 결합된 높은 완충 강도가 박테리아 세포벽에 삼투 충격의 형성을 야기하여, 주변세포질 영역으로부터 분자의 자유 흐름을 위한 고도의 다공성을 만든다. 이 방법은 단백질을 방출하기에 충분하지 않으며 고압 균질기로 추가 처리가 필요하다.
이렇게 수득된 세포 페이스트를 4℃ 온도에서 800 bar 압력으로 3회 연속 통과를 위해 GEA-균질기를 통해 통과시켰다. 현미경 검사는 완전한 용해가 발생하였을 쯤에 확인하기 위해 각각의 통과 후에 수행하였다.
가열 및 원심분리:
균질화된 용해물을 수조에서 65℃로 1시간 동안 가열한 다음, 얼음 위에서 20분 동안 냉각시켰다. 냉각된 용해물을 4℃에서 17,000g로 30분 동안 원심분리하여 정화시켰다. 또한, 정화된 용해물을 접선유동여과에 의해 10KDa을 이용하여 용해물의 초기 부피의 6배를 농축시켰다.
1 단계 Capto-L에 의한 정제:
XK16/20 컬럼에 20 ml 부피의 GE Capto L이 충진되고, 0.4M 염화나트륨을 함유하는, pH 7.4, 0.2 M 인산나트륨으로 평형화시켰다. 농축된 용해물을 유속 4 mL/분으로 로딩하고 평형 버퍼로 세척하였다. 삭신 Fab-201를 pH 2.0, 0.2 M 글리신-Cl/2% 수크로스를 함유하는 버퍼를 이용하여 용출하고, 수집된 용출액은 pH 8.8, 5 M Tris-Cl로 즉시 중화되었다.
2 단계 Q- Sepharose에 의한 정제:
capto-L 크로마토그래피로부터의 첫 번째 용출액을 pH 7.3에서 20mM 인산나트륨 버퍼에 대해 투석하고, 내독소 및 HCDNA를 제거하기 위해 10 mL의 음이온 교환 수지 GE Q sepharose를 사용하여 정제하였다. 정제된 fab를 유액 (flowthrough)으로 수집하였다.
3 단계 SP-Sepharose에 의한 정제:
Q-sepharose로부터의 유액을 XK26/20에 충진된 15 mL의 양이온 교환 GE SP sepharose 수지 상에 로딩하였다. 수지를 약간 증가된 전도도로 세척하고, Fab를 포함하는 결합 단백질의 용출을 14-16 mS/cm의 전도도에서 구배 용출에 의해 수행하였다. 단단히 결합된 단백질을 버퍼를 포함하는 1 M 염화나트륨으로 용출시켰다. 약물 물질은 20 mM PB pH-5.6에 대해 투석되었고 최종적으로 멸균 (0.22 μm) 여과시켰다.
약물로 제형화된 Fab 201의 안정성
약물 물질 Fab 201를 습성 AMD에 대해 유리체 내 주사를 용이하게 하기 위해 안정성 특성을 증가시키기 위한 제형 (약물 제품)으로 제형화하였다. 약물 제품 DP_201를 5 내지 10 mg/ml 범위의 농도로 제형화하였다. API 이외에도, 상기 제형은 pH 5.8의 10 mM 포스페이트 버퍼/ 40 mM NaCl/ 0.03% 폴리소르베이트 20/ 5% 수크로스 용액에 함유된다. 상기 제형의 삼투압은 인간 유리액 내와 유사한 약 276 mOsm이다.
안정성을 정량적 ELISA 및 SDS PAGE와 관련하여 분석하였다. 데이터는, 약물 제품이 도 22에 도시된 바와 같이 4℃에서 8 개월 (240일) 동안 안정함을 제시한다.
토끼 눈에서 항-혈관형성 장기간 연구
시판중인 루센티스와 비교하여 VEGF 유도성 망막 누출 토끼 모델 (네덜란드, 3-4 개월된 수컷, 체중 - 1.0-1.3 kg)에서 인도 첸나이 타라마이 티셀 바이오-파크 기관 삭신 라이프사이언스 피브이티 엘티디가 발견한 항 VEGF (혈관 내피 성장 인자) Fab (단편 항원 결합) 단백질 (테스트 분자 #201)의 효능 및 지속가능성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 상기 연구는 미국 미시간주 포티지 팜옵티마 엘엘씨에서 수행하였다. 토끼 그룹은 0일째에 유리체강내 투여 (IVT)로 테스트 분자 #201 (50 μL의 제형 버퍼에서 150 μg), 루센티스 (50 μL의 제형 버퍼에서 150 μg), 또는 비히클 (50 μL의 제형 버퍼)를 처리하였다. 그 다음 각 그룹으로부터의 동물을 IVT로 7일, 21일 또는 37일째에 VEGF 자극하여 효능이 시간이 흐르면서 지속되었는지 결정하였다.
IVT 투여 전에 (테스트 분자 #201, 루센티스, 비히클 또는 VEGF), 토끼를 아이소플루레인 증기로 마취시켜 효과를 나타내도록 하였다. 주사 전에, 두 눈을 안과용 베타딘 용액으로 촉촉하게 적시고 씻어냈다. 프로파라케인 (0.5%)을 안구 표면에 적용한 후, 눈은 검안경을 이용하여 개방하였고 유리체 (pars plana)는 캘리스퍼로 각막윤부 (limbus)로부터 ~4.0 mm에 표시되었다. 그 다음, 테스트 분자는 렌즈를 피하기 위해 특정 각도로 유리체를 통해 중간 유리질 (mid vitreous)로 전달되었다.
VEGF 자극 후, 3일째에 모든 동물에서 플루오레세인 혈관 조영 (FA)을 수행하였다. 눈을 프로파라케인으로 마취하고 동공을 트로피카마이드와 EyePrim으로 확장하였다. 동물을 아이소플루레인 증기로 마취시켜 효과를 나타나게 하고, 0.1 mL의 10% 안과용 플루오레세인 나트륨을 토끼 귀 정맥에 투여하여 이미지화하기 전에 적어도 2분 동안 순환하도록 하였다. 이미지는 아래 주어진 표준 점수 시스템을 이용하여 등급을 매겼다 (표 12):
플루오레세인 이미지화에 대한 스코어 시스템
점수 설명
0 주요 혈관이 매우 곧고, 더 작은 혈관은 약간의 비틀림을 나타냄
1 주요 혈관의 증가된 비틀림 그리고 또는 혈관 확장
2 주요 혈관 사이의 누출
3 주요 혈관 및 작은 혈관 사이의 누출. 작은 혈관은 여전히 육안으로 확인됨.
4 주요 혈관 및 작은 혈관 사이의 누출. 작은 혈관은 여전히 육안으로 확인되지 않음.
FA 말기에 이어서, 바르비투르를 정맥 내로 과량투여하여 안락사시켰다. 눈을 수득하고 유리체강내, 수용성 체액 및 망막을 수집하였다. 모든 샘플은 추가 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 양쪽 눈의 점수는 크러스칼-윌리스 순위 일원 변량 분석을 적용하였고, 그룹 간의 현저한 차이를 발견하였다. 현저한 차이를 데이터는 그룹 간의 현저한 차이를 결정하기 위한 던 테스트 (Dunn's test)를 적용하였다.테스트 분자 #201 투여 후 1주일에 VEGF 자극은 비히클이 주사된 그룹에서 예상된 양의 누출을 나타냈고, 루센티스와 테스트 분자 #201은 모두 완전한 보호를 나타냈다. 테스트 분자 #201 투여 후 3주일에 VEGF 자극은 비히들이 처리된 그룹에서 예상된 양의 누출을 나타냈고, 루센티스로 처리된 토끼보다 테스트 분자 #201로 처리된 토끼에서 현저하게 더 큰 보호가 나타났다. 테스트 분자 #201 투여 후 5주일에 VEGF 자극은 비히들이 처리된 그룹에서 예상된 양의 누출을 나타냈지만, 루센티스와 테스트 분자 #201은 모두 보호를 나타내지 않았다 (표 13).
테스트 분자 투여 후 1, 3 및 5주일에 VEGF 자극된 토끼의 플루오로세인 이미지화 점수
처리 1주 3주 5주
테스트 분자 #201 0.17 ± 0.39a 1.25 ± 0.89a 3.25 ± 0.45a
루센티스 0.00 ± 0.00a 2.88 ± 0.35b 3.08 ± 0.51a
비히클 3.50 ± 0.47b 3.67 ± 0.49c 3.50 ± 0.52a
값은 평균 ± SD로 표현하였다. 단일 열에 있는 유사한 위첨자를 나타내는 값은 통계적으로 동일하다 (던 테스트).
결론
상기 연구로부터, VEGF-유도 망막 누출 토끼 모델에서 테스트 분자 #201 투여 후 3주일에 VEGF 자극 후, 테스트 분자 #201의 효능의 지속성은 루센티스보다 현저하게 더 크다는 결론을 내릴 수 있다. 이 효능에 대한 분자적 근거는 도 23 및 24에 도시된 바와 같이 루센티스와 비교하여 Fab 201의 CDR 차이에 기인한 것일 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Saksin Lifesciences Pvt. Ltd. <120> Antibodies against VEGF and their uses thereof <130> 30867.1USP1 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig heavy chain of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody fragment, Fab FF03046-2, comprising a variable region with an optimized human framework & affinity matured CDR-H1, -H2 and -H3 against mouse & human VEGF & a constant region with a CH1 domain <220> <221> CDS <222> (1)..(684) <223> Coding sequence for Ig heavy chain fragment of Fab FF03046-2 antibody comprising a variable region with an optimized human framework and affinity matured CDR-H1, -H2 & -H3 against mouse and human VEGF and a constant region with a CH1 domain and a <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> Coding sequence of variable region of Fab FF03046-2 antibody heavy chain <220> <221> misc_feature <222> (76)..(99) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (91)..(105) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (148)..(198) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (151)..(174) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (289)..(327) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (295)..(327) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (361)..(684) <223> Coding sequence of Fab FF03046-2 antibody heavy chain constant region comprising a CH1 domain and part of a hinge region <220> <221> misc_feature <222> (361)..(654) <223> Coding sequence of CH1 domain of Fab FF03046-2 antibody heavy chain constant region <220> <221> misc_feature <222> (655)..(684) <223> Coding sequence for portion of the hinge region of Fab FF03046-2 antibody heavy chain constant region <400> 1 gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca ggg ggc 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc ttc gat tta ttt cat tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 20 25 30 tct ata cac tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt 144 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tac att tac ccg tct tat ggc tat act tat tat gcc gat agc gtc 192 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgt ttc act ata agc gca gac aca tcc aaa aac aca gcc tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 cta caa atg aac agc tta aga gct gag gac act gcc gtc tat tat tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct cgc cat gcg tgg tat tat ggg tgg ggt ttg gac tac tgg ggt caa 336 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg gct agc acc aag ggc cca tcg gtc 384 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 432 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 480 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 528 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc 576 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 624 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 672 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 aaa act cac aca 684 Lys Thr His Thr 225 <210> 2 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr 225 <210> 3 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig light chain of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody fragment, Fab FF03046-2, comprising a variable region with an optimized human framework and affinity matured CDR-L1, L2 and L3 against mouse and human VEGF and a kappa light chain constant <220> <221> CDS <222> (1)..(642) <223> Coding sequence for immunoglobulin kappa light chain of Fab FF03046-2 antibody comprising a variable region with an optimized human framework and affinity matured CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 against mouse and human VEGF and a kappa light chain constant <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> coding sequence of variable region of Fab FF03046-2 antibody kappa light chain <220> <221> misc_feature <222> (70)..(102) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (79)..(96) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (148)..(168) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (148)..(156) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (265)..(291) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (265)..(291) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (322)..(642) <223> coding sequence of constant region of Fab FF03046-2 antibody kappa light chain <220> <221> misc_feature <222> (367)..(369) <223> GAG codon encoding amino acid glutamic acid at amino acid position 123 of kappa light chain constant region of Fab FF03046-2, which differs from TCA codon encoding serine in Clone #201 <400> 3 gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc agt cag gcc gcc tac ggc cgc 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gct ccg aag ctt ctg att 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga gtc cct tct cgc ttc tct ggt 192 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag ccg 240 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag caa cgt ggc tgg tat ctg ttc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag atc aaa cgt acg gtg gct gca 336 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 576 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 ttc aac agg gga gag tgt 642 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic humanized antibody FF03092-1 heavy chain used to form a humanized anti-VEGF Fc-Fab fusion comprising an amino terminal humanized immunoglobulin Fc fragment fused to a humanized Fab fragment <220> <221> CDS <222> (1)..(1404) <223> Synthetic humanized antibody FF03092-1 heavy chain fusion used to form a humanized anti-VEGF Fc-Fab fusion comprising an amino terminal humanized immunoglobulin Fc fragment fused to a humanized Fab fragment <220> <221> misc_feature <222> (1)..(666) <223> coding sequence for Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, a humanized anti-VEGF Fc-Fab fusion comprising an amino terminal humanized immunoglobulin Fc fragment fused to a humanized Fab fragment <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> coding sequence for the hinge region of the Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (16)..(345) <223> coding sequence for the CH2 domain of the Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (346)..(666) <223> coding sequence for the CH3 domain of the Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (667)..(720) <223> coding sequence for a linker between Fc fragment and Fab heavy chain of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, a humanized anti-VEGF Fc-Fab fusion comprising an amino terminal humanized immunoglobulin Fc fragment fused to a humanized Fab <220> <221> misc_feature <222> (721)..(1404) <223> coding sequence for Fab heavy chain of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, a humanized anti-VEGF Fc-Fab fusion comprising an amino terminal humanized immunoglobulin Fc fragment fused to a humanized Fab fragment <220> <221> misc_feature <222> (721)..(1080) <223> coding sequence for variable region of Fab heavy chain of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (796)..(819) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (811)..(825) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (868)..(918) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (871)..(894) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1009)..(1047) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1015)..(1047) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (1081)..(1374) <223> coding sequence for CH1 domain of the constant region of Fab heavy chain of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03092-1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1375)..(1404) <223> coding sequence for portion of the hinge region comprising a cysteine at amino acid position 463 (TGC at nucleotide position 1387-1389) that participates in interstrand disulfide crosslink with the light chain in FF03092-1 antibody, as defined iby IMGT <400> 5 tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc 48 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct 96 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc 144 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 192 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc 240 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc 288 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 336 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca 384 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc 432 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg 480 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac 528 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg 576 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac 624 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 aac cac tac acg cag aag agc ctc tcg ctg agc cct gga aaa ggt ggc 672 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 210 215 220 gga gga tct ggc ggc gga gga agc ggt gga ggc gga agc gga ggc gga 720 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 gaa gtg cag ctg gtg gaa tca ggc ggt gga ctg gtg cag cct ggc gga 768 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 245 250 255 agc tta aga ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc gac ctg ttc cac tac 816 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 260 265 270 tct atc cac tgg gtc cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 864 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 275 280 285 gcc tac atc tac ccc agc tac ggc tac acc tac tac gcc gac agc gtg 912 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 290 295 300 aag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aag aac acc gcc tac 960 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 305 310 315 320 ctg cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 1008 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 325 330 335 gcc aga cac gcc tgg tac tac ggc tgg ggc ctg gat tat tgg ggc cag 1056 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 340 345 350 ggc acc ctg gtc acc gtg tct agc gcc tct aca aag ggc ccc agc gtg 1104 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 355 360 365 ttc cct ctg gcc cct agc agc aag agc aca tct ggc gga aca gcc gcc 1152 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 370 375 380 ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttt ccc gag ccc gtg acc gtg tcc 1200 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 385 390 395 400 tgg aac tct ggt gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttt cca gct gtg 1248 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 405 410 415 ctg cag agc agc ggc ctg tac agc ctg tcc agc gtg gtc aca gtg cca 1296 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 420 425 430 agc agc agc ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag 1344 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 435 440 445 ccc agc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag agc tgc gac 1392 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 450 455 460 aag acc cac acc 1404 Lys Thr His Thr 465 <210> 6 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 245 250 255 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 260 265 270 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 275 280 285 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 290 295 300 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 305 310 315 320 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 325 330 335 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 340 345 350 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 355 360 365 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 370 375 380 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 385 390 395 400 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 405 410 415 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 420 425 430 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 435 440 445 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 450 455 460 Lys Thr His Thr 465 <210> 7 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic humanized antibody FF03092-1 kappa light chain used to form a humanized anti-VEGF Fc-Fab fusion comprising an amino terminal humanized immunoglobulin Fc fragment fused to a humanized Fab fragment <220> <221> CDS <222> (1)..(642) <223> coding sequence for synthetic humanized antibody FF03092-1 kappa light chain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> coding sequence for synthetic humanized antibody FF03092-1 kappa light chain variable domain <220> <221> misc_feature <222> (70)..(102) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (79)..(96) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (148)..(168) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (148)..(156) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (265)..(291) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (265)..(291) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (322)..(642) <223> coding sequence for synthetic humanized antibody FF03092-1 kappa light chain constant domain <220> <221> misc_feature <222> (640)..(642) <223> codon for cysteine at amino acid position 214 which participates in interstrand disulfide crosslink formation with Ig heavy chain <400> 7 gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc agt cag gcc gcc tac ggc cgc 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gct ccg aag ctt ctg att 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga gtc cct tct cgc ttc tct ggt 192 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag ccg 240 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag caa cgt ggc tgg tat ctg ttc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag atc aaa cgt acg gtg gct gca 336 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gaa aaa cat aaa gtc tac 576 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 ttc aac agg gga gag tgt 642 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 9 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic humanized antibody FF03077-4 comprising an amino-terminal humanized Fc fragment fused to a humanized anti-VEGF single chain Fv (scFv) directed against human and mouse VEGF <220> <221> CDS <222> (1)..(1449) <223> Synthetic humanized antibody FF03077-4 comprising an amino-terminal humanized Fc fragment fused to a humanized anti-VEGF single chain Fv (scFv) directed against human and mouse VEGF <220> <221> misc_feature <222> (1)..(666) <223> coding sequence for Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03077-4, comprising an amino-terminal humanized Fc fragment fused to a humanized anti-VEGF single chain Fv (scFv) directed against human and mouse VEGF <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> coding sequence for the hinge region of the Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03077-4, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (16)..(345) <223> coding sequencefor the CH2 domain of the Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03077-4, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (346)..(666) <223> coding sequencefor the CH3 domain of the Fc fragment of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03077-4, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (667)..(720) <223> coding sequence for a linker between Fc fragment and scFv of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03077-4, comprising an amino-terminal humanized Fc fragment fused to a humanized anti-VEGF single chain Fv (scFv) directed against human and mouse <220> <221> misc_feature <222> (721)..(1449) <223> coding sequence for scFv of synthetic humanized anti-VEGF antibody FF03077-4, comprising an amino-terminal humanized Fc fragment fused to a humanized anti-VEGF single chain Fv (scFv) directed against human and mouse VEGF <220> <221> misc_feature <222> (790)..(822) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (799)..(816) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (868)..(876) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (868)..(888) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (985)..(1011) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (985)..(1011) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (1162)..(1188) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1180)..(1194) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (1237)..(1287) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (1240)..(1263) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1378)..(1416) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1384)..(1416) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with Kabat <400> 9 tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc 48 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct 96 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc 144 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 192 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc 240 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc 288 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 336 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca 384 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc 432 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg 480 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac 528 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg 576 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac 624 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 aac cac tac acg cag aag agc ctc tcg ctg agc cct gga aaa ggt ggc 672 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 210 215 220 gga gga tct ggc ggc gga gga agc ggt gga ggc gga agc gga ggc ggc 720 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 gat atc cag atg aca cag agc cct agc agc ctg agc gcc agc gtg ggc 768 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 245 250 255 gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc agc cag gcc gcc tat ggc aga 816 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 260 265 270 gtg gcc tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc cct aag ctg ctg atc 864 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 275 280 285 tac aag gcc agc gag ctg tat gcc ggc gtg ccc agc aga ttc agc ggc 912 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 290 295 300 agc aga tcc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg cag ccc 960 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 305 310 315 320 gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag cgg ggc tgg tat ctg ttc 1008 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 325 330 335 acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag ggc aca aca gcc gcc 1056 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Thr Ala Ala 340 345 350 agc ggc tct agc ggc gga tct tct agc gga gcc gag gtg cag ctg gtg 1104 Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val 355 360 365 gaa tca ggc ggt gga ctg gtg cag cct ggc gga agc ctg aga ctg tct 1152 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 370 375 380 tgc gcc gcc tct ggc ttc gac ctg ttc cac tac agc atc cac tgg gtc 1200 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val 385 390 395 400 cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg gcc tac atc tac ccc 1248 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro 405 410 415 agc tac ggc tac acc tat tac gcc gac agc gtg aag ggc cgg ttc acc 1296 Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 420 425 430 atc agc gcc gac acc agc aag aac acc gcc tac ctg cag atg aac agc 1344 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 435 440 445 ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt gcc aga cac gcc tgg 1392 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp 450 455 460 tac tac ggc tgg ggc ctg gat tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc 1440 Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 gtg tcc tct 1449 Val Ser Ser <210> 10 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 245 250 255 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 260 265 270 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 275 280 285 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 290 295 300 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 325 330 335 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Thr Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val 355 360 365 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 370 375 380 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val 385 390 395 400 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro 405 410 415 Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 420 425 430 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 435 440 445 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp 450 455 460 Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 11 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic humanized anti-VEGF full length mature IgG1 antibody, FF03092-3, heavy chain comprising an optimized human framework and affinity matured CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 directed against mouse and human VEGF <220> <221> CDS <222> (1)..(1350) <223> Coding sequence for IgG1 heavy chain of a synthetic humanized anti-VEGF full length mature antibody, FF03092-3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> Coding sequence for IgG1 heavy chain variable domain of a synthetic humanized anti-VEGF full length mature antibody, FF03092-3 <220> <221> misc_feature <222> (76)..(99) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (91)..(105) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (148)..(198) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (151)..(174) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (289)..(327) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (295)..(327) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (361)..(1350) <223> Coding sequence for IgG1 heavy chain constant domain of a synthetic humanized anti-VEGF full length mature antibody, FF03092-3 <220> <221> misc_feature <222> (361)..(654) <223> Coding sequence for CH1 domain of FF03092-3 antibody IgG1 heavy chain constant region based on IMGT <220> <221> misc_feature <222> (655)..(699) <223> Coding sequence for the hinge region of FF03092-3 antibody IgG1 heavy chain constant region, based on IMGT <220> <221> misc_feature <222> (667)..(669) <223> codon for cysteine at amino acid position 223 of full length mature IgG1 heavy chain which forms a disulfide bridge with an immunoglobulin light chain in FF03092-3 antibody <220> <221> misc_feature <222> (700)..(1029) <223> Coding sequence for CH2 domain of FF03092-3 antibody IgG1 heavy chain constant region based on IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1030)..(1350) <223> Coding sequence for CH3 domain of FF03092-3 antibody IgG1 heavy chain constant region based on IMGT <400> 11 gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca ggg ggc 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc ttc gat tta ttt cat tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 20 25 30 tct ata cac tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt 144 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tac att tac ccg tct tat ggc tat act tat tat gcc gat agc gtc 192 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgt ttc act ata agc gca gac aca tcc aaa aac aca gcc tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 cta caa atg aac agc tta aga gct gag gac act gcc gtc tat tat tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct cgc cat gcg tgg tat tat ggg tgg ggt ttg gac tac tgg ggt caa 336 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg gct agc acc aag ggc cca tcg gtc 384 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 432 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 480 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 528 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc 576 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 624 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 672 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 720 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 768 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 816 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 864 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 912 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 960 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 1008 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1056 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg 1104 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1152 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1200 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1248 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1296 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1344 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 ggt aaa 1350 Gly Lys 450 <210> 12 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 13 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic humanized full length mature IgG1 antibody, FF03092-3, kappa light chain comprising an optimized human framework and affinity matured CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 directed against mouse and human VEGF <220> <221> CDS <222> (1)..(642) <223> Coding sequence for immunoglobulin kappa light chain of a synthetic humanized anti-VEGF antibody, FF03092-3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> coding sequence of variable domain of immunoglobulin kappa light chain of a synthetic humanized anti-VEGF antibody, FF03092-3 <220> <221> misc_feature <222> (70)..(102) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (79)..(96) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (148)..(168) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (148)..(156) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (265)..(291) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (265)..(291) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (322)..(642) <223> coding sequence of constant domain of immunoglobulin kappa light chain of a synthetic humanized anti-VEGF antibody, FF03092-3 <220> <221> misc_feature <222> (640)..(642) <223> codon for cysteine residue at amino acid 214 of kappa light chain which forms a disulfide bond with the immunoglobulin heavy chain in FF03092-3 antibody <400> 13 gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc agt cag gcc gcc tac ggc cgc 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gct ccg aag ctt ctg att 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga gtc cct tct cgc ttc tct ggt 192 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag ccg 240 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag caa cgt ggc tgg tat ctg ttc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag atc aaa cgt acg gtg gct gca 336 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 576 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 ttc aac agg gga gag tgt 642 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 14 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 15 <211> 268 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> promoter <222> (1)..(217) <223> E. coli Pho A promoter <400> 15 gaccaacagc ggttgattga tcaggtagag ggggcgctgt acgaggtaaa gcccgatgcc 60 agcattcctg acgacgatac ggagctgctg cgcgattacg taaagaagtt attgaagcat 120 cctcgtcagt aaaaagttaa tcttttcaac agctgtcata aagttgtcac ggccgagact 180 tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt atttgtaact agtacgcaag ttcacgtaaa 240 aagggtatgt agaggttgag gtgatttt 268 <210> 16 <211> 1583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for synthetic humanized Fab anti-VEGF antibody fragment directed against mouse and human VEGF used in expression plasmid Clone #201 <220> <221> CDS <222> (1)..(714) <223> anti-VEGF kappa light chain derived from FF03046-2 antibody comprising amino terminal sequence coding for MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> translation start codon, AUG <220> <221> misc_feature <222> (1)..(69) <223> coding sequence for secretory signal cleaved during secretion of Ig light chain <220> <221> misc_feature <222> (70)..(390) <223> coding sequence for variable region of an immunoglobulin kappa light chain of a synthetic humanized anti-VEGF antibody <220> <221> misc_feature <222> (70)..(711) <223> coding sequence for the mature Ig kappa light chain of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody lacking the secretory signal <220> <221> misc_feature <222> (139)..(171) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (148)..(165) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (217)..(237) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (217)..(225) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (334)..(360) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (334)..(360) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-L3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (391)..(711) <223> coding sequence for constant region of an immunoglobulin kappa light chain of a synthetic humanized anti-VEGF antibody <220> <221> misc_feature <222> (436)..(438) <223> TCA codon encoding amino acid serine at amino acid position 146 of kappa light chain constant region in Clone #201 parent, which differs from GAG codon encoding glutamic acid in kappa light chain of parent Fab FF03046-2 <220> <221> misc_feature <222> (709)..(711) <223> codon for cysteine residue at the end of kappa light chain constant region that participates in disulfide bond formation with a heavy chain <220> <221> misc_feature <222> (712)..(714) <223> translational termination codon <220> <221> misc_feature <222> (715)..(827) <223> non coding spacer region between the light chain and heavy chain coding sequences <220> <221> CDS <222> (828)..(1583) <223> anti-VEGF Fab antibody heavy chain derived from FF03046-2 antibody comprising amino terminal sequence coding for MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA <220> <221> misc_feature <222> (828)..(830) <223> translational start codon for an immunoglobulin heavy chain fragment of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody <220> <221> misc_feature <222> (828)..(896) <223> coding sequence for secretory signal cleaved during secretion of Ig heavy chain fragment of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody <220> <221> misc_feature <222> (897)..(1580) <223> coding sequence for the mature Ig heavy chain fragment of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody lacking the secretory signal <220> <221> misc_feature <222> (897)..(1256) <223> coding sequence for Ig heavy chain variable region of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody <220> <221> misc_feature <222> (972)..(995) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (987)..(1001) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H1, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (1044)..(1094) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (1047)..(1070) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H2, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1185)..(1223) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with IMGT <220> <221> misc_feature <222> (1191)..(1223) <223> coding sequence of complementarity determining region, CDR-H3, as defined in accordance with Kabat <220> <221> misc_feature <222> (1257)..(1550) <223> coding sequence for CH1 domain of Ig heavy chain constant region of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody <220> <221> misc_feature <222> (1281)..(1583) <223> translational stop codon <220> <221> misc_feature <222> (1551)..(1580) <223> coding sequence for part of the hinge region of an immunoglobulin heavy chain fragment of a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody <220> <221> misc_feature <222> (1563)..(1565) <223> codon for cysteine residue within the hinge region which participates in interstrand disulfide bond formation with a light chain in a synthetic humanized anti-VEGF Fab antibody <400> 16 atg aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt tct 48 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 att gct aca aat gcc tat gca gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc 96 Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 20 25 30 tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc 144 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 35 40 45 agt cag gcc gcc tac ggc cgc gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga 192 Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 aaa gct ccg aag ctt ctg att tac aaa gca tcc gaa ctc tac gcc gga 240 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly 65 70 75 80 gtc cct tct cgc ttc tct ggt agc cgt tcc ggg acg gat ttc act ctg 288 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 acc atc agc agt ctg cag ccg gaa gac ttc gca act tat tac tgt cag 336 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 caa cgt ggc tgg tat ctg ttc acg ttc gga cag ggt acc aag gtg gag 384 Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct 432 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 gat tca cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat 480 Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160 aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc 528 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag 576 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 180 185 190 gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac 624 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205 tac gaa aaa cat aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg 672 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa 714 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 tactcgaggc tgagcaaagc agactactaa taacataaag tctacgccgg acgcatcgtg 774 gccctagtac gcaagttcac gtaaaaaggg taactagagg ttgaggtgat ttt atg 830 Met aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt tct att 878 Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile 240 245 250 gct aca aac gcg tac gct gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc 926 Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 255 260 265 270 ctg gtg cag cca ggg ggc tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc 974 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 275 280 285 ttc gat tta ttt cat tat tct ata cac tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt 1022 Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 290 295 300 aag ggc ctg gaa tgg gtt gca tac att tac ccg tct tat ggc tat act 1070 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr 305 310 315 tat tat gcc gat agc gtc aag ggc cgt ttc act ata agc gca gac aca 1118 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr 320 325 330 tcc aaa aac aca gcc tac cta caa atg aac agc tta aga gct gag gac 1166 Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 335 340 345 350 act gcc gtc tat tat tgt gct cgc cat gcg tgg tat tat ggg tgg ggt 1214 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly 355 360 365 ttg gac tac tgg ggt caa gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg gcc tcc 1262 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 370 375 380 acc aag ggt cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc 1310 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 385 390 395 tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc 1358 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 400 405 410 gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg 1406 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 415 420 425 430 cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc 1454 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 435 440 445 agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc 1502 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 450 455 460 tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtc gac aag aaa gtt 1550 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 465 470 475 gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca taa 1583 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 480 485 <210> 17 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 20 25 30 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 35 40 45 Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 180 185 190 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 18 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 35 40 45 Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp 115 120 125 Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 225 230 235 240 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 245 250 <210> 19 <211> 274 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> terminator <222> (1)..(274) <223> rrnB terminator <400> 19 cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaacat ccatgcgtta acgcgagagt agggaactgc 60 caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc ggaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 120 tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgt 180 gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaac 240 taagcagaag gccatcctga cggatggcct tttt 274 <210> 20 <211> 3012 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3009) <223> vector sequences corresponding to pBR322 (GenBank Accession No: J01749.1) from nucleotide position 1353 to 4361 in which the tetracycline resistance gene of pBR322 has been deleted <220> <221> misc_feature <222> (1944)..(2801) <223> beta-lactamase coding sequences with start of translation at nucleotide position 2801 and end of translation at nucleotide position 1944 <400> 20 gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg 60 cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct 120 gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc 180 gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac 240 atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg 300 caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac 360 atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat 420 ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt 480 aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa 540 tcccccttac acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg 600 ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga 660 acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct 720 cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 780 agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 840 tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 900 cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 960 ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 1020 gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 1080 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 1140 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1200 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 1260 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 1320 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 1380 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1440 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1500 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1560 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1620 aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1680 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 1740 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 1800 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 1860 atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 1920 gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 1980 tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 2040 gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 2100 ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 2160 actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 2220 ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 2280 tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 2340 cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 2400 ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 2460 ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 2520 tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 2580 agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 2640 atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 2700 gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 2760 aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 2820 tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 2880 aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 2940 gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 3000 cttcaagaat tc 3012 <210> 21 <211> 1583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant 201 Sequence of Example 3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1583) <400> 21 atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60 gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180 cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240 gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300 ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360 ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720 aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780 gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840 tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900 ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960 gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020 gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080 atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140 aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200 attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260 ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320 cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380 actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440 tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500 tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560 cttgtgacaa aactcacaca taa 1583 <210> 22 <211> 1583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant 202 Sequence of Example 3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1583) <400> 22 atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60 gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180 cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact cgacgccgga 240 gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300 ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360 ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720 aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780 gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840 tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900 ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960 gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020 gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact 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acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080 atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140 aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200 attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260 ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320 cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380 actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440 tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500 tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560 cttgtgacaa aactcacaca taa 1583 <210> 24 <211> 1583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Sequence of Example 3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1583) <400> 24 atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60 gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180 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ttttttctat tgctacaaat 60 gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gccgcgtagc ctggtatcaa 180 cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240 gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300 ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360 ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720 aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780 gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840 tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 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gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840 tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900 ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960 gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020 gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080 atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140 aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200 attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260 ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320 cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380 actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440 tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500 tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560 cttgtgacaa aactcacaca taa 1583 <210> 37 <211> 1583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant 219 Sequence of Example 3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1583) <400> 37 atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60 gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg accgcgtagc ctggtatcaa 180 cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240 gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300 ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360 ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720 aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat cgtggcccta 780 gtacgcaagt tcacgtaaaa agggtaacta gaggttgagg tgattttatg aaaaagaata 840 tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg tacgctgagg 900 ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 960 gtgcagcttc tggcttcgat ttatttcatt attctataca ctgggtgcgt caggccccgg 1020 gtaagggcct ggaatgggtt gcatacattt acccgtctta tggctatact tattatgccg 1080 atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac 1140 aaatgaacag cttaagagct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc catgcgtggt 1200 attatgggtg gggtttggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcggcct 1260 ccaccaaggg tccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 1320 cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 1380 actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 1440 tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 1500 tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat 1560 cttgtgacaa aactcacaca taa 1583 <210> 38 <211> 1583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant 220 Sequence of Example 3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1583) <400> 38 atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60 gcctatgcag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 120 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gccgcctacg gcgacgtagc ctggtatcaa 180 cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttacaaag catccgaact ctacgccgga 240 gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300 ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac gtggctggta tctgttcacg 360 ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgattcaca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgaa aaacataaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaatactcg 720 aggctgagca aagcagacta ctaataacat aaagtctacg ccggacgcat 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Artificial Sequence <220> <223> FF0124-1 F2078 of Figures 4 and 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(63) <400> 39 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu 1 5 10 15 Tyr Ser Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 35 40 45 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 50 55 60 <210> 40 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0124-2 F2083 Sequence of Figures 4 and 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(67) <400> 40 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu 1 5 10 15 Tyr Ser Gln Gln Ser Gly Pro Leu Phe Thr Asp Leu Tyr Tyr Ser Ser 20 25 30 Met His Ser Ile Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 35 40 45 Val Lys Gly Tyr Tyr Trp Trp His Ser Pro Phe Trp Ala Tyr Ser Gly 50 55 60 Leu Asp Tyr 65 <210> 41 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0124-3 F2086 Sequence of Figures 4 and 7 <220> <221> 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MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <400> 48 Gln Gln Gly Gly Trp Tyr Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile 1 5 10 15 His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 20 25 30 Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 49 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0158-F2 Sequence of Figure 6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <400> 49 Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile 1 5 10 15 His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 20 25 30 Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 50 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0158-E2 Sequence of FIgure 6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <400> 50 Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile 1 5 10 15 His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 20 25 30 Lys Gly His Ala Trp Tyr Phe Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 51 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0158-C3 Sequence of Figure 6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <400> 51 Gln Gln Arg Asp Trp Arg Leu Phe Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile 1 5 10 15 His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 20 25 30 Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 52 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0158-B10 Sequence of Figure 6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <400> 52 Gln Gln Gly Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile 1 5 10 15 His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 20 25 30 Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 53 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0158-C2 Sequence of Figure 6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <400> 53 Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile 1 5 10 15 His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 20 25 30 Lys Gly His Ala Trp Phe Phe Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 54 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0128-1 Sequence of Figure 6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <400> 54 Gln Gln Gly Gly Trp Trp Leu Ile Thr Asn Leu Tyr Tyr Tyr Ser Ile 1 5 10 15 His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 20 25 30 Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 55 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-A3 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 55 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Phe Gly Trp Ala Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 56 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-A5 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 56 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 57 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-A8 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 57 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 58 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-A10 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 58 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 59 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-A11 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 59 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Trp Gly Trp Ala Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 60 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-A12 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 60 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Phe Arg Trp Ala Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 61 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-B5 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 61 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Phe Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 35 40 45 <210> 62 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-B9 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 62 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 63 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-B11 Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 63 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 64 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0188-H5 (2) Sequence of Figure 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 64 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 65 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03033-1 Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(64) <400> 65 Arg Ala Ser Gln Tyr Met Asn Ser Asn Val Ala Ala Ala Ser Val Leu 1 5 10 15 Val Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His 20 25 30 Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 50 55 60 <210> 66 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03033-2 Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(64) <400> 66 Arg Ala Ser Gln Val Ala Phe Tyr Asn Val Ala Asp Ala Ser Ile Leu 1 5 10 15 Asn Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His 20 25 30 Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 50 55 60 <210> 67 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03033-3 Sequence of Figrure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(64) <400> 67 Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Tyr Asn Val Ala Gln Ala Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His 20 25 30 Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 50 55 60 <210> 68 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03033-4 Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(64) <400> 68 Arg Ala Ser Gln Glu Gly Trp Asp Arg Val Ala Ser Ala Ser Gln Leu 1 5 10 15 Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His 20 25 30 Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 50 55 60 <210> 69 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03033-5 Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(64) <400> 69 Arg Ala Ser Gln Gly Val Gly Glu Arg Val Ala Asn Ala Ser His Leu 1 5 10 15 Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His 20 25 30 Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 50 55 60 <210> 70 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03033-6 Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(64) <400> 70 Arg Ala Ser Gln Pro Arg Glu Asp Arg Val Ala Arg Ala Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His 20 25 30 Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 50 55 60 <210> 71 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03033-8 Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(64) <400> 71 Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Lys Ala Ser Glu Leu 1 5 10 15 Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His 20 25 30 Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr 50 55 60 <210> 72 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF03046-2 Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(65) <400> 72 Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg Val Ala Lys Ala Ser Glu Leu 1 5 10 15 Tyr Ala Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe 20 25 30 His Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr 35 40 45 Ala Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp 50 55 60 Tyr 65 <210> 73 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0117-A5 (2) Sequence of Figure 9A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(65) <400> 73 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu 1 5 10 15 Tyr Ser Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe 20 25 30 His Tyr Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr 35 40 45 Ala Asp Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp 50 55 60 Tyr 65 <210> 74 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single chain nucleic acid sequence of Figure 13 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1449) <400> 74 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 60 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 120 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 180 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 240 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 300 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 360 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 420 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 480 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 540 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 600 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc gctgagccct 660 ggaaaaggtg gcggaggatc tggcggcgga ggaagcggtg gaggcggaag cggaggcggc 720 gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 780 atcacctgta gagccagcca ggccgcctat ggcagagtgg cctggtatca gcagaagccc 840 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacaag gccagcgagc tgtatgccgg cgtgcccagc 900 agattcagcg gcagcagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 960 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cggggctggt atctgttcac cttcggccag 1020 ggcaccaagg tggaaatcaa gggcacaaca gccgccagcg gctctagcgg cggatcttct 1080 agcggagccg aggtgcagct ggtggaatca ggcggtggac tggtgcagcc tggcggaagc 1140 ctgagactgt cttgcgccgc ctctggcttc gacctgttcc actacagcat ccactgggtc 1200 cgacaggccc ctggcaaggg actggaatgg gtggcctaca tctaccccag ctacggctac 1260 acctattacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gcgccgacac cagcaagaac 1320 accgcctacc tgcagatgaa cagcctgaga gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtgcc 1380 agacacgcct ggtactacgg ctggggcctg gattactggg gccagggaac cctggtcacc 1440 gtgtcctct 1449 <210> 75 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single chain amino acid sequence of Figure 13 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(483) <400> 75 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 245 250 255 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 260 265 270 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 275 280 285 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 290 295 300 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 325 330 335 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Thr Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val 355 360 365 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 370 375 380 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr Ser Ile His Trp Val 385 390 395 400 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro 405 410 415 Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 420 425 430 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 435 440 445 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ala Trp 450 455 460 Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 76 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain (hK) amino acid sequence of Figure 16 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(214) <400> 76 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 77 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain (hK) nucleic acid sequence of Figure 16 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(642) <400> 77 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggccgcctac ggccgcgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaagcttct gatttacaaa gcatccgaac tctacgccgg agtcccttct 180 cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cgtggctggt atctgttcac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgattcac agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 78 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain amino acid sequence of Figure 16 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(228) <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Asp His Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr 225 <210> 79 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain Nucleic acid sequence of Figure 16 <400> 79 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt cgatttagat cattattcta tacactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatac atttacccgt cttatggcta tacttattat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgccatgcg 300 tggtattatg ggtggggttt ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca caca 684 <210> 80 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lucentis (Ranibizumab) Heavy Chain Sequence of Figure 23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(231) <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 225 230 <210> 81 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab 201 Heavy Chain Sequence of Figure 23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(228) <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Trp Tyr Tyr Gly Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr 225 <210> 82 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lucentis (Ranibizumab) Light Chain of Figure 24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(214) <400> 82 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 83 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab 201 Light Chain Sequence of Figure 24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(214) <400> 83 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ala Tyr Gly Arg 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 84 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0158-C4 (2) Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 84 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 85 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0187-B3 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 85 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 86 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0187-C1 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 86 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 87 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0187-A12 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 87 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 88 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0187-H3 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 88 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 89 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0188-H5 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 89 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 90 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0188-B10 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 90 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 91 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0188-F12 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 91 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Tyr His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 92 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0188-B6 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 92 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Trp Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 93 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0188-A2 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 93 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe Phe Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45 <210> 94 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FF0188-A9 Sequence of Figure 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(47) <400> 94 Gln Gln Arg Gly Trp Tyr Leu Phe Thr Gly Phe Asp Leu Phe His Tyr 1 5 10 15 Ser Ile His Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 20 25 30 Ser Val Lys Gly His Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr 35 40 45

Claims (143)

  1. 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체:
    아미노산 위치 31의 히스티딘부터 아미노산 위치 35의 히스티딘(서열번호 1)까지 포함하는 CDRH1, 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신(서열번호 1)까지 포함하는 CDRH2, 및 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신(서열번호 1)까지 포함하는 CDRH3.
  2. 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체:
    아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알라닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL1, 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL2, 및 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL3.
  3. a. 다음의 도 9C에 도시된 바와 같거나, 또는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및
    b. 다음의 도 9C에 도시된 바와 같거나, 또는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는,
    VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  4. a. 다음의 도 16에 도시된 바와 같은 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및
    b. 다음의 도 16에 도시된 바와 같은 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는,
    VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 다음의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함하는, 항-VEGF 항체 또는 이의 단편:
    아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알라닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL1, 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL2, 및 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL3.
  6. a. 도 16에 굵은 글자로 나타낸 IMGT 번호매김(IMGT numbering)에 따라 정의된 다음의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인: 아미노산 서열 GFDLDHYS를 포함하는 CDRH1, 아미노산 서열 IYPSYGYT를 포함하는 CDRH2 및 아미노산 서열 ARHAWYYGWGLDY를 포함하는 CDRH3; 및
    b. 도 16에 굵은 글자로 나타낸 IMGT 번호매김에 따라 정의된 다음의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인: 아미노산 서열 QAAYGR을 포함하는 CDRL1, 아미노산 서열 KAS를 포함하는 CDRL2 및 아미노산 서열 QQRGWYLFT를 포함하는 CDRL3를 포함하는,
    VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  7. a) 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알라닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL1 또는 이의 단편, 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL2 또는 이의 단편, 및 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌(서열번호 3)까지 포함하는 CDRL3 또는 이의 단편; 및
    b) 다음의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 31의 히스티딘부터 아미노산 위치 35의 히스티딘(서열번호 1)까지 포함하는 CDRH1 또는 이의 단편, 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신(서열번호 1)까지 포함하는 CDRH2 또는 이의 단편 및 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신(서열번호 1)까지 포함하는 CDRH3 또는 이의 단편을 포함하는,
    VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 합성 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 단편 또는 변이체.
  8. 제6항에 있어서,
    c) 다음의 프레임워크 영역(framework region) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인: FRL1 또는 이의 단편, FRL2 또는 이의 단편, FRL3 또는 이의 단편, 및 FRL4 또는 이의 단편; 및
    d) 다음의 프레임워크 영역 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인: FRH1 또는 이의 단편, FRH2 또는 이의 단편, FRH3 또는 이의 단편, 및 FRH4 또는 이의 단편을 추가로 포함하는, 항-VEGF 항체 또는 이의 단편 또는 변이체.
  9. 제1항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노 서열, 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 1인, FRH1을 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  10. 제1항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노 서열, 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 2인, FRH2를 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  11. 제1항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노 서열, 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 3인, FRH3를 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  12. 제1항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 아미노 서열, 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 4인, FRH4를 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  13. 제1항 또는 제7항에 있어서, 다음의 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 아미노산 서열을 추가로 포함하는 항-VEGF 항체: 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌(서열번호 1)까지 포함하는 FRH1, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌(서열번호 1)까지 포함하는 FRH2, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌(서열번호 1)까지 포함하는 FRH3 및 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린(서열번호 1)까지 포함하는 FRH4.
  14. 제2항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노 서열, 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 1, FRL1을 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  15. 제2항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노 서열, 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 2, FRL2를 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  16. 제2항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노 서열, 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 3, FRL3를 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  17. 제2항 또는 제7항에 있어서, 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 아미노 서열, 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 4, FRL4를 추가로 포함하는 항-VEGF 항체.
  18. 제2항 또는 제7항에 있어서, 다음의 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 아미노산 서열을 추가로 포함하는 항-VEGF 항체: 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인(서열번호 3)까지 포함하는 FRL1, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신(서열번호 3)까지 포함하는 FRL2, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인(서열번호 3)까지 포함하는 FRL3 및 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신(서열번호 3)까지 포함하는 FRL4.
  19. 제7항에 있어서,
    c) 다음의 프레임워크 영역 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인(서열번호 3)까지 포함하는 FRL1 또는 이의 일부, 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신(서열번호 3)까지 포함하는 FRL2 또는 이의 일부, 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인(서열번호 3)까지 포함하는 FRL3 또는 이의 일부, 및 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신(서열번호 3)까지 포함하는 FRL4 또는 이의 일부; 및
    d) 다음의 프레임워크 영역 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인: 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌(서열번호 1)까지 포함하는 FRH1 또는 이의 일부, 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌(서열번호 1)까지 포함하는 FRH2 또는 이의 일부, 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌(서열번호 1)까지 포함하는 FRH3 또는 이의 단편, 및 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린(서열번호 1)까지 포함하는 FRH4 또는 이의 단편을 추가로 포함하는, 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  20. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 전장 항체인 항-VEGF 항체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 전장 항체는 서열번호 3에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 1에 나타난 중쇄, 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 237의 시스테인(서열번호 17)까지 포함하는 경쇄 및 아미노산 위치 24의 글루탐산부터 아미노산 위치 251의 트레오닌(서열번호 18)까지 포함하는 중쇄, 또는 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 237의 시스테인(서열번호 76)까지 포함하는 경쇄 및 아미노산 위치 24의 글루탐산부터 아미노산 위치 251의 트레오닌(서열번호 78)까지 포함하는 중쇄를 포함하는 항-VEGF 항체.
  22. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 인간 또는 인간화 IgG인 항-VEGF 항체.
  23. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체의 일부는 항체 단편인 항-VEGF 항체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab인 항-VEGF 항체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 Fab는 서열번호 3의 위치 1의 아스파르트산에서 시작하여 위치 107의 리신으로 끝나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 1의 위치 1의 글루탐산에서 시작하여 위치 120의 세린으로 끝나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-VEGF 항체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 Fab는 Fc 영역과 연결되는 항-VEGF 항체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 Fc 영역과 연결된 Fab는 서열번호 5에 나타난 아미노산 또는 이의 일부를 포함하는 항-VEGF 항체.
  28. 제23항에 있어서, 상기 항체 단편은 F(ab')2인 항-VEGF 항체.
  29. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 변이체는 scFv인 항-VEGF 항체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 9의 위치 241의 아스파르트산에서 시작하여 위치 483의 세린으로 아미노산 서열을 포함하는 항-VEGF 항체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 scFv는 Fc 영역과 연결되는 항-VEGF 항체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 Fc 영역과 연결된 scFv는 서열번호 9에 나타난 아미노산 또는 이의 일부를 포함하는 항-VEGF 항체.
  33. 제23항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fv인 항-VEGF 항체.
  34. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체의 변이체는 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 항체의 항원-결합 영역을 포함하는, VEGF를 인식하고 결합하는 재조합 단백질인 항-VEGF 항체.
  35. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3의 아미노산 서열에 대한 변경을 포함하는 항-VEGF 항체.
  36. 제35항에 있어서, 상기 변경은 아미노산(들)의 삽입 또는 결실인 항-VEGF 항체.
  37. 제36항에 있어서, 상기 삽입 또는 결실은 10개 이하의 아미노산인 항-VEGF 항체.
  38. 제35항에 있어서, 상기 변경은 아미노산 치환인 항-VEGF 항체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 3개 이하의 아미노산에 영향을 미치는 항-VEGF 항체.
  40. 제38항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환인 항-VEGF 항체.
  41. 제35항에 있어서, 상기 변경은 상기 항체가 VEGF 또는 이의 일부에 결합하는 것을 억제하지 않는 항-VEGF 항체.
  42. 제9항, 제10항, 제11항, 제12항, 제13항, 제14항, 제15항, 제16항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 항체의 변이체는 FRH1, FRH2, FRH3, FRH4, FRL1, FRL2, FRL3, 또는 FRL4의 아미노산 서열에 대한 변경을 갖는 항체인 항-VEGF 항체.
  43. 제42항에 있어서, 상기 변경은 아미노산(들)의 삽입 또는 결실인 항-VEGF 항체.
  44. 제42항에 있어서, 상기 변경은 아미노산 치환인 항-VEGF 항체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환인 항-VEGF 항체.
  46. 제42항에 있어서, 상기 변경은 상기 항체가 VEGF 또는 이의 일부에 결합하는 것을 억제하지 않는 항-VEGF 항체.
  47. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 항체의 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 Fv 단편.
  48. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 약 50 nM 이하의 K(d) 값으로 인간 VEGF에 결합하는 항-VEGF 항체.
  49. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 일부 또는 변이체는 생체 외(in vitro)에서 내피세포의 VEGF-유도 증식을 억제하는 것에 대해 약 200 pM 이하의 EC50 값을 갖는 항-VEGF 항체.
  50. 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체로서, 상기 항원 중 하나는 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 또는 제7항의 항체가 결합하거나 또는 경쟁하는 것인 이중특이성 항체.
  51. 제50항에 있어서, 상기 항체는 제1항의 CDRH1 또는 이의 일부, 제1항의 CDRH2 또는 이의 일부, 제1항의 CDRH3 또는 이의 일부, 제2항의 CDRL1 또는 이의 일부, 제2항의 CDRL2 또는 이의 일부, 또는 제2항의 CDRL3 또는 이의 일부에 대한 아미노산 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이성 항체.
  52. 제51항에 있어서, 상기 항체는 Fc 영역을 추가적으로 포함하는 이중특이성 항체.
  53. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 합성 항체, 단일 사슬 항체 또는 이들의 항원-결합 단편인 항-VEGF 항체.
  54. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 일부는 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, 및 F(v)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1항, 제2항 또는 제7항의 항체의 항원 결합 단편인 항-VEGF 항체.
  55. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제7항, 제8항, 제9항, 제10항, 제11항, 제12항, 제13항, 제14항, 제15항, 제16항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 카밧 방법(Kabat method)으로 정의된 바와 같은 상기 각 CDR 및/또는 각 FR 아미노산 서열은 IMGT 방법으로 정의된 바와 같은 CDR 또는 FR의 상응하는 아미노산 서열로 치환되고, 상기 치환은 다음 중 어느 하나인 항체:
    a) 아미노산 위치 31의 히스티딘부터 아미노산 위치 35의 히스티딘 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 CDRH1은 아미노산 위치 26의 글리신 (서열번호 1)부터 아미노산 위치 33의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRH1으로 대체되고;
    b) 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 CDRH2는 아미노산 위치 51의 이소류신 (서열번호 1)부터 아미노산 위치 58의 트레오닌 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRH2로 대체되며;
    c) 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 CDRH3는 아미노산 위치 97의 알라닌부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRH3로 대체되고;
    d) 아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알라닌 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 CDRL1은 아미노산 위치 27의 글루타민부터 아미노산 위치 32의 아르기닌 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRL1으로 대체되며;
    e) 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 CDRL2는 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 52의 세린 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRL2로 대체되고;
    f) 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 CDRL3는 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRL3로 대체되며;
    g) 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 FRH1은 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 25의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH1으로 대체되고;
    h) 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 FRH2는 아미노산 위치 34의 이소류신부터 아미노산 위치 50의 티로신 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH2로 대체되며;
    i) 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 FRH3는 아미노산 위치 59의 티로신부터 아미노산 위치 96의 시스테인 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH3로 대체되고;
    j) 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 FRH4는 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH4로 대체되며;
    k) 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 FRL1은 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 26의 세린 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL1으로 대체되고;
    l) 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 FRL2는 아미노산 위치 33의 발린부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL2로 대체되며;
    m) 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 FRL3는 아미노산 위치 53의 글루탐산부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL3로 대체되고; 그리고
    n) 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 FRL4는 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL4로 대체된다.
  56. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제9항, 제10항, 제11항, 제12항, 제13항, 제14항, 제15항, 제16항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 카밧 방법(Kabat method)으로 정의된 바와 같은 상기 각 CDR 및/또는 각 FR 아미노산 서열은 IMGT 방법으로 정의된 바와 같은 CDR 또는 FR의 상응하는 아미노산 서열로 치환되고, 상기 치환은 다음 중 어느 하나인 항체:
    a) 아미노산 위치 31의 히스티딘부터 아미노산 위치 35의 히스티딘 (서열번호 78)까지 포함하는 카밧-정의 CDRH1은 아미노산 위치 26의 글리신 (서열번호 78)부터 아미노산 위치 33의 세린 (서열번호 78)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRH1으로 대체되고;
    b) 아미노산 위치 50의 티로신부터 아미노산 위치 66의 글리신 (서열번호 78)까지 포함하는 카밧-정의 CDRH2는 아미노산 위치 51의 이소류신 (서열번호 78)부터 아미노산 위치 58의 트레오닌 (서열번호 78)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRH2로 대체되며;
    c) 아미노산 위치 99의 히스티딘부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 78)까지 포함하는 카밧-정의 CDRH3는 아미노산 위치 97의 알라닌부터 아미노산 위치 109의 티로신 (서열번호 78)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRH3로 대체되고;
    d) 아미노산 위치 24의 아르기닌부터 아미노산 위치 34의 알라닌 (서열번호 76)까지 포함하는 카밧-정의 CDRL1은 아미노산 위치 27의 글루타민부터 아미노산 위치 32의 아르기닌 (서열번호 76)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRL1으로 대체되며;
    e) 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 56의 알라닌 (서열번호 76)까지 포함하는 카밧-정의 CDRL2는 아미노산 위치 50의 리신부터 아미노산 위치 52의 세린 (서열번호 76)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRL2로 대체되고;
    f) 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌 (서열번호 76)까지 포함하는 카밧-정의 CDRL3는 아미노산 위치 89의 글루타민부터 아미노산 위치 97의 트레오닌 (서열번호 76)까지 포함하는 IMGT-정의 CDRL3로 대체되며;
    g) 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 78)까지 포함하는 카밧-정의 FRH1은 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 25의 세린 (서열번호 78)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH1으로 대체되고;
    h) 아미노산 위치 36의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 78)까지 포함하는 카밧-정의 FRH2는 아미노산 위치 34의 이소류신부터 아미노산 위치 50의 티로신 (서열번호 78)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH2로 대체되며;
    i) 아미노산 위치 67의 아르기닌부터 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 78)까지 포함하는 카밧-정의 FRH3는 아미노산 위치 59의 티로신부터 아미노산 위치 96의 시스테인 (서열번호 78)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH3로 대체되고;
    j) 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 78)까지 포함하는 카밧-정의 FRH4는 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 78)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH4로 대체되며;
    j) 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 FRH4는 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH4로 대체되며;
    k) 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 76)까지 포함하는 카밧-정의 FRL1은 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 26의 세린 (서열번호 76)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL1으로 대체되고;
    j) 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 카밧-정의 FRH4는 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지 포함하는 IMGT-정의 FRH4로 대체되며;
    k) 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지 포함하는 카밧-정의 FRL1은 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 26의 세린 (서열번호 3)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL1으로 대체되고;
    l) 아미노산 위치 35의 트립토판부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 76)까지 포함하는 카밧-정의 FRL2는 아미노산 위치 33의 발린부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 76)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL2로 대체되며;
    m) 아미노산 위치 57의 글리신부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 76)까지 포함하는 카밧-정의 FRL3는 아미노산 위치 53의 글루탐산부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 76)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL3로 대체되고; 그리고
    n) 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호76)까지 포함하는 카밧-정의 FRL4는 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 76)까지 포함하는 IMGT-정의 FRL4로 대체된다.
  57. 치료제와 결합된 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체를 포함하는 면역접합체.
  58. 제57항에 있어서, 상기 치료제는 리신(ricin), 독소루비신, 다우노루비신, 택솔, 에티듐, 마이토마이신, 에토포사이드, 테니포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디하이드록시안트라퀴논, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 (PE) A, PE40, 리신, 아브린, 글루코코르티코이드 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 세포독성제인 면역접합체.
  59. 제56항에 있어서, 상기 항체의 일부는 scFv, Fv, Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역접합체.
  60. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 항-VEGF 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  61. 제60항의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  62. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  63. 제62항의 핵산을 포함하는 벡터.
  64. 제63항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  65. 제64항의 숙주세포를 배양하여 상기 핵산이 발현되어 상기 항체를 생산하도록하는 것을 포함하는 항-VEGF 항체의 생산방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 숙주세포 배양으로부터 항-VEGF 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 생산방법.
  67. 인간 VEGF에 결합하는 특이적 결합 멤버(member)의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부, 또는 상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부와 상기 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부를 모두 코딩하는 분리된 핵산으로, 상기 특이적 결합 멤버는 항체의 항원-결합 일부를 포함하고,
    a) 상기 항체의 항원-결합 일부의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 위치 91의 사이토신에서 시작하여 위치 105의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDRH1 또는 이의 일부, 위치 148의 티민에서 시작하여 위치 198의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH2 또는 이의 일부, 및 위치 295의 사이토신에서 시작하여 위치 327의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH3 또는 이의 일부를 포함하며; 그리고/또는
    b) 상기 항체의 항원-결합 일부의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부는 위치 70의 사이토신에서 시작하여 위치 102의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL1 또는 이의 일부, 위치 148의 아데닌에서 시작하여 위치 168의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL2 또는 이의 일부, 및 위치 265의 사이토신에서 시작하여 위치 291의 구아닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL3 또는 이의 일부를 포함한다.
  68. 도 16에 나타난 경쇄 핵산 서열 및 도 16에 나타난 중쇄 핵산 서열을 포함하는 제4항의 Fab 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  69. 제67항에 있어서, (a) 또는 (b)에 제공된 바와 같은 핵산 서열 중 어느 하나는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 등가의 핵산 서열로 대체될 수 있는 분리된 핵산.
  70. 제69항에 있어서, 상기 항체는 인간 또는 인간화 불변 영역을 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  71. 제70항에 있어서, 상기 인간 또는 인간화 불변 영역은 IgG1 불변 영역인 분리된 핵산.
  72. 제70항에 있어서, 상기 인간 또는 인간화 불변 영역은 IgG4 불변 영역인 분리된 핵산.
  73. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 9에 나타난 바와 같은 위치 721의 구아닌에서 시작하여 위치 1449의 티민으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 단일 사슬 Fv 분자 또는 이의 일부인 분리된 핵산.
  74. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 1 및 3에 나타난 핵산 서열을 포함하는 Fab 또는 이의 일부인 분리된 핵산.
  75. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 16에 나타난 바와 같은 위치 70의 구아닌에서 시작하여 위치 711의 티민으로 끝나는 핵산 서열 및 서열번호 16에서 위치 897의 구아닌에서 시작하여 위치 1580의 아데닌까지의 핵산 서열을 포함하는 Fab 또는 이의 일부(들)인 분리된 핵산.
  76. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 16에 나타난 바와 같은 위치 1의 아데닌에서 시작하여 위치 711의 티민까지의 핵산 서열 및 서열번호 16에서 위치 828의 아데닌에서 시작하여 위치 1580의 아데닌까지의 핵산 서열을 포함하는 Fab 및 이의 일부(들)인 분리된 핵산.
  77. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 16에 나타난 핵산 서열들을 포함하는 Fab 또는 이의 일부인 분리된 핵산.
  78. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부분의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 90의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 1인, FRH1을 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  79. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부분의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 36의 트립토판에서 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 106의 티민에서 시작하여 위치 147의 아데닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 2인, FRH2를 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  80. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부분의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 67의 아르기닌에서 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 199의 사이토신에서 시작하여 위치 294의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 3인, FRH3을 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  81. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부분의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 110의 트립토판에서 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 4인, FRH4를 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  82. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부분의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 1의 글루탐산에서 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 90의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 FRH1, 아미노산 위치 36의 트립토판에서 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 106의 티민에서 시작하여 위치 147의 아데닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 FRH2, 아미노산 위치 67의 아르기닌에서 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 199의 사이토신에서 시작하여 위치 294의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 FRH3, 및 아미노산 위치 110의 트립토판에서 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 FRH4를 추가로 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역 FRH1 내지 FRH4, 및 상기 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1 내지 CDRH3을 코딩하는 핵산 서열은 FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4의 순서로 결합되는 분리된 핵산.
  83. 제82항에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 위치 1의 글루탐산에서 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)으로 끝나는 중쇄 가변 영역의 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  84. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부위의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 1의 아스파르트산에서 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 69의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 1인 FRL1을 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  85. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부위의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 35의 트립토한에서 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 103의 티민에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 2인 FRL2를 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  86. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부위의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 57의 글리신에서 아미노산 위치 88의 시스테인까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 169의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 3인, FRL3을 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  87. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부위의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 98의 페닐알라닌에서 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역 4인 FRL4를 추가로 포함하는 분리된 핵산.
  88. 제67항에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 부위의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 일부는 아미노산 위치 1의 아스파르트산에서 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 69의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 영역 FRL1, 아미노산 위치 35의 트립토판에서 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 103의 티민에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 FRL2, 아미노산 위치 57의 글리신에서 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 169의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 FRL3, 아미노산 위치 98의 페닐알라닌에서 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 FRL4를 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역 FRL1 내지 FRL4 및 상기 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1 내지 CDRL3을 코딩하는 핵산 서열은 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4의 순서로 결합되는 분리된 핵산.
  89. 제88항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 1의 아스파르트산에서 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 경쇄 가변 영역의 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  90. 제67항, 제78항, 제79항, 제80항, 제81항, 제82항, 제83항, 제84항, 제85항, 제86항, 제87항, 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 분리된 핵산은 하나의 잠재성 돌연변이 또는 잠재성 돌연변이들을 갖는 분리된 핵산.
  91. 제67항, 제78항, 제79항, 제80항, 제81항, 제82항, 제83항, 제84항, 제85항, 제86항, 제87항, 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 분리된 핵산은 인프레임(inframe) 결실 또는 삽입을 가지며, 상기 결실 또는 삽입은 3개의 염기 또는 염기쌍의 배수로 발생하는 분리된 핵산.
  92. 제91항에 있어서, 상기 인프레임 결실 또는 삽입은 상보성 결정 영역 (CDR)에서 발생하고 길이가 30개의 염기 또는 염기쌍 이하인 분리된 핵산.
  93. 제91항에 있어서, 상기 인프레임 결실 또는 삽입은 상보성 결정 영역 (CDR)에서 발생하고 길이가 15개의 염기 또는 염기쌍 이하인 분리된 핵산.
  94. 제91항에 있어서, 상기 인프레임 결실 또는 삽입은 상보성 결정 영역 (CDR)에서 발생하고 길이가 6개의 염기 또는 염기쌍인 분리된 핵산.
  95. 제91항에 있어서, 상기 인프레임 결실 또는 삽입은 상보성 결정 영역 (CDR)에서 발생하고 길이가 3개의 염기 또는 염기쌍인 분리된 핵산.
  96. 제67항, 제78항, 제79항, 제80항, 제81항, 제82항, 제83항, 제84항, 제85항, 제86항, 제87항, 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 분리된 핵산은 3개의 염기의 배수로 프레임워크 서열의 인프레임 결실 또는 삽입을 가지는 분리된 핵산.
  97. 제96항에 있어서, 상기 인프레임 결실 또는 삽입은 길이가 30개의 염기 또는 염기쌍 이하인 분리된 핵산.
  98. 제67항, 제78항, 제79항, 제80항, 제81항, 제82항, 제83항, 제84항, 제85항, 제86항, 제87항, 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 분리된 핵산은 하나의 미스센스 돌연변이 또는 미스센스 돌연변이들을 갖는 분리된 핵산.
  99. 제98항에 있어서, 상기 미스센스 돌연변이(들)은 CDR 서열에서 발생하고 상기 CDR 서열의 3개까지의 아미노산을 변경시키는 분리된 핵산.
  100. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 항체이고, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 FF03046-2 VH 도메인 및 아미노산 위치 121의 알라닌부터 아미노산 위치 218의 발린 (서열번호 1)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인을 포함하며, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 108의 아르기닌부터 아미노산 위치 214의 시스테인 (서열번호 3)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 분리된 핵산.
  101. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 항체이고, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 FF03046-2 VH 도메인, 아미노산 위치 121의 알라닌부터 아미노산 위치 218의 발린 (서열번호 1)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인, 및 아미노산 위치 219의 글루탐산부터 아미노산 위치 228의 트레오닌 (서열번호 1)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 힌지 영역의 부분을 포함하며, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 108의 아르기닌부터 아미노산 위치 214의 시스테인 (서열번호 3)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 분리된 핵산.
  102. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 항체이고, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 위치 261의 글루탐산부터 아미노산 위치 380의 세린 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VH 도메인 및 아미노산 위치 981의 알라닌부터 아미노산 위치 478의 발린 (서열번호 16)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인을 포함하며, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 130의 리신 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 131의 아르기닌부터 아미노산 위치 237의 시스테인 (서열번호 16)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 분리된 핵산.
  103. 제67항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버는 항체이고, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 위치 261의 글루탐산부터 아미노산 위치 380의 세린 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VH 도메인, 아미노산 위치 381의 알라닌부터 아미노산 위치 478의 발린 (서열번호 16)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 도메인, 및 아미노산 위치 479의 글루탐산부터 아미노산 위치 488의 트레오닌 (서열번호 16)까지의 인간 IgG1 불변 영역의 힌지 영역의 부분을 포함하며, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 위치 24의 아스파르트산부터 아미노산 위치 130의 리신 (서열번호 16)까지의 FF03046-2 VL 도메인 및 아미노산 위치 131의 아르기닌부터 아미노산 위치 237의 시스테인 (서열번호 16)까지의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 분리된 핵산.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 서열번호 16에 제공된 바와 같은 분리된 핵산.
  105. 제104항에 있어서, 상기 핵산은 구성 프로모터 (constitutive promoter)의 제어 하에 발현되는 분리된 핵산.
  106. 제104항에 있어서, 상기 핵산은 조절가능한 프로모터 (regulatible promoter) 또는 유도성 프로모터 (inducible promoter)의 제어 하에 발현되는 분리된 핵산.
  107. 제106항에 있어서, 상기 조절가능한 프로모터 또는 유도성 프로모터는 pho A 프로모터인 분리된 핵산.
  108. 제107항에 있어서, 상기 pho A 프로모터는 서열번호 15에 제공된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 일부를 포함하는 분리된 핵산.
  109. 제104항에 있어서, 상기 핵산의 전사의 종결은 전사 종결자의 제어 하에 있는 분리된 핵산.
  110. 제109항에 있어서, 상기 전사 종결자는 리보솜 RNA 유전자 종결자인 분리된 핵산.
  111. 제110항에 있어서, 상기 리보솜 RNA 유전자 종결자는 서열번호 19에 제공된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 일부를 포함하는 분리된 핵산.
  112. 제104항에 있어서, 상기 핵산은 벡터 내에 있는 분리된 핵산.
  113. 제112항에 있어서, 상기 벡터는 복제의 colE1 기점을 포함하는 분리된 핵산.
  114. 제113항에 있어서, 상기 벡터는 선택가능한 마커 또는 스크리닝 마커를 포함하는 분리된 핵산.
  115. 제114항에 있어서, 상기 선택가능한 마커 또는 스크리닝 마커는 약물 선택가능한 마커, 형광 단백질, 세포 표면 마커, 효소, 발광 단백질, 대사 마커, 성장인자 및 내성인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 핵산.
  116. 제112항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 20에 제공되는 바와 같은 테트라사이클린 내성 유전자가 결실된 pBR322인 분리된 핵산.
  117. 제67항에 있어서, 상기 항체는 BSA 또는 Fc에 결합하지 않는 분리된 핵산.
  118. 제67항, 제78항, 제79항, 제80항, 제81항, 제82항, 제83항, 제84항, 제85항, 제86항, 제87항, 제88항 또는 제89항에 있어서, 카밧 방법으로 정의된 바와 같은 각 CDR 및 각 FR 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 IMGT 방법으로 정의된 바와 같은 CDR 또는 FR의 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산으로 치환되고, 상기 핵산 치환은 다음과 같은 분리된 핵산:
    a) 위치 91의 사이토신에서 시작하여 위치 105의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 CDRH1은 위치 76의 구아닌에서 시작하여 위치 99의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 CDRH1의 IMGT-등가물로 대체되고;
    b) 위치 148의 티민에서 시작하여 위치 198의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 CDRH2는 위치 151의 아데닌에서 시작하여 위치 174의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 CDRH2의 IMGT-등가물로 대체되며;
    c) 위치 295의 사이토신에서 시작하여 위치 327의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 CDRH3는 위치 289의 구아닌에서 시작하여 위치 327의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 CDRH3의 IMGT-등가물로 대체되고;
    d) 위치 70의 사이토신에서 시작하여 위치 102의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 CDRL1은 위치 76의 사이토신에서 시작하여 위치 96의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 CDRL1의 IMGT-등가물로 대체되며;
    e) 위치 148의 아데닌에서 시작하여 위치 168의 사이토신 (서열번호 3)까지의 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 CDRL2는 위치 148의 아데닌에서 시작하여 위치 156의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 CDRL2의 IMGT-등가물로 대체되고;
    f) 위치 265의 사이토신에서 시작하여 위치 291의 구아닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 CDRL3는 위치 265의 사이토신에서 시작하여 위치 291의 구아닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 CDRL3의 IMGT-등가물로 대체되며;
    g) 아미노산 위치 1의 글루탐산에서 아미노산 위치 30의 페닐알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 90의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRH1은 아미노산 위치 1의 글루탐산에서 아미노산 위치 25의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 75의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRH1의 IMGT-등가물로 대체되고;
    h) 아미노산 위치 36의 트립토판에서 아미노산 위치 49의 알라닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 106의 티민에서 시작하여 위치 147의 아데닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRH2는 아미노산 위치 34의 이소류신에서 아미노산 위치 50의 티로신 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 100의 아데닌에서 시작하여 위치 150의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRH2의 IMGT-등가물로 대체되며;
    i) 아미노산 위치 67의 아르기닌에서 아미노산 위치 98의 아르기닌 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 199의 사이토신에서 시작하여 위치 294의 사이토신 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRH3는 아미노산 위치 59의 티로신에서 아미노산 위치 96의 시스테인 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 175의 티민에서 시작하여 위치 288의 티민 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRH3의 IMGT-등가물로 대체되고;
    j) 아미노산 위치 110의 트립토판에서 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRH4는 아미노산 위치 110의 트립토판에서 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 1)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 1)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRH4의 IMGT-등가물로 대체되며;
    k) 아미노산 위치 1의 아스파르트산에서 아미노산 위치 23의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 69의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRL1은 아미노산 위치 1의 아스파르트산에서 아미노산 위치 26의 세린 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 78의 티민 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRL1의 IMGT-등가물로 대체되고;
    l) 아미노산 위치 35의 트립토판에서 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 103의 티민에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRL2는 아미노산 위치 33의 발린에서 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 97의 구아닌에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRL2의 IMGT-등가물로 대체되며;
    m) 아미노산 위치 57의 글리신에서 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 169의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRL3는 아미노산 위치 53의 글루탐산에서 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 157의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRL3의 IMGT-등가물로 대체되고; 그리고
    n) 아미노산 위치 98의 페닐알라닌에서 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 카밧-정의 FRL4는 아미노산 위치 98의 페닐알라닌에서 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 3)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 3)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 FRL4의 IMGT-등가물로 대체된다.
  119. 제4항 또는 제68항에 있어서, 각 CDR 및 각 FR 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 IMGT 방법으로 정의되며 다음과 같은 분리된 핵산:
    a) 위치 76의 구아닌에서 시작하여 위치 99의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRH1;
    b) 위치 151의 아데닌에서 시작하여 위치 174의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRH2;
    c) 위치 289의 구아닌에서 시작하여 위치 327의 사이토신 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRH3;
    d) 위치 79의 사이토신에서 시작하여 위치 96의 사이토신 (서열번호 )으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRL1 위치 148의 아데닌에서 시작하여 위치 156의 사이토신 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRL2;
    e) 위치 265의 사이토신에서 시작하여 위치 291의 구아닌 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 CDRL3;
    f) 아미노산 위치 1의 글루탐산부터 아미노산 위치 25의 세린 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 75의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH1;
    g) 아미노산 위치 34의 이소류신부터 아미노산 위치 50의 티로신 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 100의 아데닌에서 시작하여 위치 150의 사이토신 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH2;
    h) 아미노산 위치 59의 티로신부터 아미노산 위치 96의 시스테인 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 175의 티민에서 시작하여 위치 288의 티민 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH3;
    i) 아미노산 위치 110의 트립토판부터 아미노산 위치 120의 세린 (서열번호 79)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 328의 티민에서 시작하여 위치 360의 구아닌 (서열번호 79)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRH4;
    j) 아미노산 위치 1의 아스파르트산부터 아미노산 위치 26의 세린 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 1의 구아닌에서 시작하여 위치 78의 티민 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL1;
    k) 아미노산 위치 33의 발린부터 아미노산 위치 49의 티로신 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 97의 구아닌에서 시작하여 위치 147의 사이토신 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL2;
    l) 아미노산 위치 53의 글루탐산부터 아미노산 위치 88의 시스테인 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 157의 구아닌에서 시작하여 위치 264의 티민 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL3; 및
    m) 아미노산 위치 98의 페닐알라닌부터 아미노산 위치 107의 리신 (서열번호 77)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 위치 292의 티민에서 시작하여 위치 321의 아데닌 (서열번호 77)으로 끝나는 핵산 서열을 포함하는 IMGT-정의 FRL4.
  120. 제67항 또는 제68항에 따른 핵산으로 형질전환된 숙주세포.
  121. VEGF를 인식하고 결합하는 특이적 결합 멤버를 생산하는 방법으로,
    상기 특이적 결합 멤버의 생산을 위한 조건 하에 제120항에 따른 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    상기 특이적 결합 멤버를 분리 및/또는 정제하는 단계를 포함하고,
    상기 숙주세포는 상기 항체의 항원-결합 부분의 중쇄 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 경쇄 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, VEGF를 인식하고 결합하는 특이적 결합 멤버를 생산하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, VEGF를 인식하고 결합하는 특이적 결합 멤버는 scFv 항체 분자 또는 Fab 항체 분자인 방법.
  123. 제121항에 있어서, VEGF를 인식하고 결합하는 특이적 결합 멤버는 전장 항체인 방법.
  124. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 항-VEGF 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 VEGF-유도 혈관형성을 억제하는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 포유동물은 뮤린 (murine), 고양이 (feline), 개 (canine), 돼지 (porcine), 염소 (caprine), 양 (ovine), 소 (bovine), 토끼 (leporine), 말 (equine), 원숭이 (simian) 및 인간 개체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  126. 제124항에 있어서, 상기 포유동물은 망막 질환, 습성 나이 관련 황반변성, 당뇨병성 황반병증, 증식당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 (RVO)에서의 황반부종, 홍채 혈관신생, 병적 근시로 인한 맥락막 혈관신생, 미숙아 망막증 (ROP), 성인 (maturity)의 망막증, 혈관신생성녹내장, 및 암으로부터 선택되는 질환을 갖는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 망막 질환은 야간 시력 저하 (야맹증), 불빛이 밝은 곳에서 어두운 곳으로 조정하는 것에 대한 문제, 갑작스러운 또는 이유가 밝혀지지 않은 시력 상실, 주변시 상실, 특정 시야에서의 시력 상실, 안구의 급속한 불수의 진동현상 (안구진탕증), 빛에 대한 비정상적인 민감도 또는 과민증 (광선공포증) 또는 이들의 조합과 연관되는 것인 방법.
  128. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 인간화 항-VEGF 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에 투여함을 포함하는, 포유동물에서 황반변성을 억제하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 황반변성은 습성 황반변성인 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 습성 황반변성은 나이와 관련된 것인 방법.
  131. 제128항에 있어서, 상기 황반변성은 나이와 관련된 것인 방법.
  132. 제128항에 있어서, 상기 황변 변성은 혈관신생 (neovascularization) 또는 혈관형성 (angiogenesis)과 연관되는 것인 방법.
  133. 제128항에 있어서, 상기 투여는 유리체 내 투여인 방법.
  134. 제133항에 있어서, 상기 투여는 혈관신생 또는 혈관형성을 억제, 방지 또는 역전시키는 것인 방법.
  135. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항의 항-VEGF 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 세포 증식성 질환을 억제하는 방법.
  136. 제128항 또는 제135항에 있어서, 상기 포유동물은 뮤린 (murine), 고양이 (feline), 개 (canine), 돼지 (porcine), 염소 (caprine), 토끼 (leporine), 양 (ovine), 소 (bovine), 말 (equine), 원숭이 (simian) 및 인간 개체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  137. 제135항에 있어서, 상기 세포 증식성 질환은 습성 나이 관련 황반변성, 당뇨병성 황반병증, 증식당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 (RVO)에서의 황반부종, 홍채 혈관신생, 병적 근시로 인한 맥락막 혈관신생, 성인 (maturity)의 망막증, 혈관신생성녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막혈관신생, 유리체절제술(PPV), 당뇨병성 황반부종 (DME) 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  138. 다음의 표 6 및 9에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  139. 다음의 표 7, 8, 10 및 11에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  140. 표 6 및 9에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 경쇄 중 어느 것을 포함하는, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  141. 표 7, 8, 10 및 11에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 중쇄 중 어느 것을 포함하는, VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 일부 또는 변이체.
  142. a. 다음의 표 6에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및
    b. 다음의 표 7 및 8에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는,
    VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 부분 또는 변이체.
  143. a. 다음의 표 9에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및
    b. 다음의 표 10 및 11에 나타난 바와 같은 변이체 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 또는 220의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는,
    VEGF를 특이적으로 인식하고 결합하는 분리된 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 부분 또는 변이체.
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