CN116903747A - 人源化的结合her2的抗体或her2抗原结合片段及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明将异种生物来源的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段的框架区进行了人源化改造，获得了一种人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，并证明了其具备特异性结合HER2的能力。本发明还公开了编码所述人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞，以及抗HER2CAR、包含所述抗HER2CAR的T细胞、NK细胞和巨噬细胞、CIK及其它免疫效应细胞。本发明还公开了用于产生抗体或抗原结合片段的方法，以及上述物质在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是在制备抗HER2阳性表达的肿瘤药物中的应用。

Description

人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段及应用。
背景技术
恶性肿瘤已成为人类健康的第一杀手，其病死率已升至各类疾病之首。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球癌症数据显示，全球185个国家共36种癌种，2020年全球新发癌症1929万例，死亡996万例。我国新发癌症457万例，死亡300万例。由于我国是世界第一人口大国，癌症新发人数远超世界其他国家，成为全球新发癌症人数最高的国家。此外，随着全球人口老龄化程度的不断加剧，预计2040年相比2020年，癌症负担将增加47％，届时全新新发癌症病例数将达到2840万。目前肿瘤治疗已取得了较大进展，特别是肿瘤免疫治疗如PD-1/PD-L1免疫检测点抑制剂的广泛应用，改变了现有肿瘤治疗的模式。然而，即便是对免疫治疗相对敏感的非小细胞肺癌，在不加选择的情况下总体有效率也只有20％左右，因此研发更为有效的免疫疗法势在必行。
人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER2，ERBB2)是一种由ErbB基因编码的酪氨酸激酶受体膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体家族成员。人类该基因定位于染色体17q21，属于原癌基因。其编码产物HER2蛋白为185kD的跨膜精蛋白，简称p185，由1255个氨基酸组成，720-987位属于酪氨酸激酶区。HER2表达异常时，正常细胞和组织易于发生癌变，导致肿瘤形成。已知在人类多种肿瘤中，包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等，都发现有HER2原癌基因扩增或者蛋白过表达现象。Ji-Hua Shi等人2019年报导了HER2在H4IIE，HepG2，JM1细胞系，以及82％(14/17)HCC肝癌患者样本中过表达。近年来，靶向HER2的抗体药物已经成为HER2阳性0实体肿瘤治疗新热点。曲妥珠单抗在临床上治疗HER2高表达乳腺癌、胃癌等具有较好的治疗效果。同时研究证明其对肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)亚群的生存和功能维持起到重要的作用。鉴于曲妥珠单抗在胃癌、乳腺癌治疗中的显著效果，表面抗原HER2可作为CAR-T细胞治疗实体瘤的一个潜在靶点。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法是一种过继T细胞疗法，首先从患者血液中分离T细胞，然后通过基因工程手段使T细胞可以识别肿瘤细胞上的抗原并杀死肿瘤细胞，被认为是一种安全可靠的免疫疗法。目前CAR-T疗法已在血液系统肿瘤治疗中取得巨大成功，靶向CD19的CAR-T对耐药性B细胞恶性血液瘤展示出持久的缓解效果，对于复发和难治的急性B淋巴细胞白血病患者治愈率达80％～90％；截至目前已有5款靶向CD19、2款靶向BCMA的CAR-T产品在全球批准上市，分别用于治疗B细胞型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和复发或难治性多发性骨髓瘤。
CAR-T疗法在血液系统肿瘤治疗中的成功也为实体瘤的治疗带来了希望，目前已发现一系列实体瘤CAR-T细胞靶抗原，并用于早期临床试验，如间皮素(mesothelin，MSLN)、EGFR或EGFRvIII、EpCAM、MUC1、CEA、PSMA等。Hendrik Setia Budi等人报导了特异性靶向HER2的CAR-T在多种实体瘤中的应用，治疗中枢神经系统肿瘤(NCT03500991)，脑部肿瘤(NCT03696030)，肺癌(NCT03198052)，乳腺癌(NCT04650451)，腹膜癌转移(NCT04684459)，胰腺癌(NCT03267173)等的临床试验正在进行中。
CAR-T疗法在血液系统肿瘤中取得的成功为实体肿瘤的临床治疗带来了新的希望，但却面临着诸多挑战。目前研究者在临床试验中出现的不良反应与潜在的风险除了细胞因子释放综合征(CRS)等，另一个影响CAR-T疗效的主要原因就是CAR-T的在体内的维持时间短，患者易复发。而在临床中影响CAR-T细胞持久性的因素之一是T细胞介导的抗转基因排斥反应(Antitransgene rejection responses)，这将导致CAR-T阳性细胞的减少。Jennifer N等人曾报道，人源化scFv片段可以消除抗转基因排斥反应，并降低脱靶毒性和神经毒性的风险，提高CAR-T的持久性和安全性。单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
4D5为抗HER2的小鼠来源单克隆抗体，1991年H M Shepard等人报导了将HER2原癌基因推向临床的文章，提出HER2原癌基因编码185-kDa跨膜蛋白(p185HER2)，与表皮生长因子(EGF)受体具有广泛的同源性。临床和实验证据支持HER2原癌基因在人乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌进展中的作用。这些数据也支持了存在于过表达肿瘤细胞表面的p185HER2可能是受体靶向治疗的良好靶标的假设。抗p185HER2鼠单克隆抗体(muMAb)4D5是用过表达p185HER2的细胞免疫小鼠免疫后衍生的100多种单克隆抗体之一。第一个用于治疗实体瘤的靶向HER2的单克隆抗体曲妥珠单抗(Herceptin)，也是来源于4D5单抗。
Yu Cao等人设计了4D5来源的靶向HER2的CAR-T细胞，抗HER2的scFv来自4D5。但鼠源的HER2抗体血清半衰期短，容易复发耐药，不能彻底杀灭肿瘤细胞。
一定程度上，人源化抗体相比于鼠源抗体有更多优势。鼠源抗体，指恒定区和可变区序列均来自小鼠基因的单克隆抗体，其鼠源成分达到100％；鼠源单抗制备仰赖杂交瘤技术，即将小鼠暴露于特定抗原之下，随后筛选并提取其体内产生抗体的B淋巴细胞；而后将该类细胞与不能产生抗体的小鼠骨髓瘤细胞融合，继而筛选出不会凋亡，能无限增殖，亦能分泌特定抗体的鼠杂交融合细胞。缺点第一是具有较强的免疫原性，易引发HAMA反应(即鼠源抗体本身被人体免疫系统视为抗原，引起不必要的免疫反应)，轻则加速抗体被人体内被清除、缩短半衰期进而影响疗效，重则引发严重免疫疾病；第二鼠源抗体的可变区难以与人类抗原交互，更难诱发ADCC作用，因此无法有效杀灭目标；第三鼠源抗体的恒定区与人类恒定区序列不同，引发的后继免疫反应因而更弱。因此本发明需要对鼠源抗体进行人源化改造。
人源化抗体，指以鼠源抗体等异种来源抗体为框架，在此基础上增添来自人类基因序列部分的抗体。将鼠源抗体人源化，其优点是第一、有效地减弱了人抗鼠抗体排异反应，降低免疫原性的同时也降低了毒副作用；第二、其不易被免疫系统自识别的特性极大地增加了抗体在体内留存时间，延长了体内半衰期；第三、拥有人源恒定区的抗体较鼠源抗体能够起到更全面的免疫作用。但也有缺点，人源化抗体较鼠源性抗体在体外的结合活性可能减弱，不易观测其免疫效力；且制备周期较长、技术复杂性相对较高，生产时间较长。
在CAR-T疗法中可以放大人源化抗体的特点及优势：
第一，人源化抗体疗效比较稳健，目前临床试验中构建CAR的胞外scFv多为鼠源性单抗，但CAR结构中鼠源scFv特定结合抗原的免疫表位引起的HLA抗原T细胞介导的免疫反应，一方面会阻碍CAR与靶抗原之间的相互作用以抑制CAR-T细胞的功能，一方面也会影响细胞的活化、扩增、甚至导致CAR-T细胞在患者体内的失活；而人源化scFv可通过降低CAR的免疫原性发挥疗效稳定性更高。
第二，人源化抗体可有效延长复发时间，经CAR-T治疗后，CAR-T的耗尽、肿瘤微环境的改变等因素都可能导致疾病复发，鼠源抗体高免疫原性激发的HAMA会缩短其在人体内的半衰期，从而可能会缩短疾病复发时间。
第三，人源化scFv构建CAR-T可多次治疗，而鼠源抗体二次治疗效果弱，如以HER2为靶点的肿瘤，首次采用鼠源CAR-T治疗并复发后，再次使用鼠源CAR-T疗效减弱，高免疫原性可能会引发体内产生抗鼠源抗原抗体，表现为耐药性，此时二次治疗采用人源化scFv构建CAR-T可能可以缓解复发肿瘤。
第四，相比鼠源CAR-T，人源化CAR-T具有更低的耐药性，鼠源CAR-T在目前阶段仍可以被免疫系统识别出来，并触发免疫系统介导的排斥反应，这使得在反复用药时身体会产生大量针对CAR-T细胞的抗体，并使其药效严重减弱。而人源化CAR-T(人源化scFv)由于序列与人体自身的受体更接近，在回输进入人体之后不易被免疫系统识别。本发明对鼠源抗HER2抗体4D5框架区域进行了人源化改造，并将改造后的人源scFv序列构建到CAR结构中，进行慢病毒包装，从外周血单个核细胞中分选出T细胞，使用包含CAR的慢病毒转染T细胞，并对人源化改造后的不同CAR-T细胞的杀伤活性进行了体外初步表征。
发明内容
为了避免鼠源等异种生物来源的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段在疾病治疗过程中对人体带来的危害，本发明将其框架区进行了人源化改造，获得了一种人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，具体方案如下：
一种人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，其包含：
a1)氨基酸序列为SEQ ID NO:32的1LAS-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:42的1LAS-VL；或
a2)氨基酸序列为SEQ ID NO:33的2SA5-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:43的2SA5-VL；或
a3)氨基酸序列为SEQ ID NO:34的3LA7-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:44的3LA7-VL；或
a4)氨基酸序列为SEQ ID NO:35的4FY3-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:45的4FY3-VL；或
a5)氨基酸序列为SEQ ID NO:36的5OB6-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:46的5OB6-VL；或
a6)氨基酸序列为SEQ ID NO:37的6HQQ-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:47的6HQQ-VL；或
a7)氨基酸序列为SEQ ID NO:38的7QCA-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:48的7QCA-VL；或
a8)氨基酸序列为SEQ ID NO:39的9WUF-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:49的9WUF-VL；或
a9)氨基酸序列为SEQ ID NO:40的10PS-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:50的10PS-VL；或
所述人源化的结合HER2的抗体是多克隆抗体或抗HER2单克隆抗体；
所述人源化的HER2抗原结合片段是：
b1)scFv；或
b2)二硫键连接的Fv；或
b3)Fab片段；或
b4)F(ab’)片段；或
b5)一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；或
b6)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；或
b7)由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段。
4D5-VH和4D5-VL通过连接子(Linker)连接组成4D5 scFv；1LAS-VH和1LAS-VL通过连接子(Linker)连接组成1LAS；2SA5-VH和2SA5-VL通过Linker连接组成2SA5；3LA7-VH和3LA7-VL通过Linker连接组成3LA7；4FY3-VH和4FY3-VL通过Linker连接组成4FY3；5OB6-VH和5OB6-VL通过Linker连接组成5OB6；6HQQ-VH和6HQQ-VL通过Linker连接组成6HQQ；7QCA-VH和7QCA-VL通过Linker连接组成7QCA；9WUF-VH和9WUF-VL通过Linker连接组成9WUF；10PS-VH和10PS-VL通过Linker连接组成10PS。
在一些实施方案中，所述连接子为不超过20个氨基酸残基的多肽片段；所述连接子包含(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(G)n、(GS)n、(EAAAK)n、或(XP)n，n为自然数。
在一些实施方案中，所述人源化的HER2抗原结合片段是人源化抗HER2 scFv，所述人源化的HER2抗原结合片段包含：
c1)氨基酸序列为SEQ ID NO:12的1LAS；或
c2)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的2SA5；或
c3)氨基酸序列为SEQ ID NO:14的3LA7；或
c4)氨基酸序列为SEQ ID NO:15的4FY3；或
c5)氨基酸序列为SEQ ID NO:16的5OB6；或
c6)氨基酸序列为SEQ ID NO:17的6HQQ；或
c7)氨基酸序列为SEQ ID NO:18的7QCA；或
c8)氨基酸序列为SEQ ID NO:19的9WUF；或
c9)氨基酸序列为SEQ ID NO:20的10PS。
在一些实施方案中，所述人源化抗HER2 scFv为7QCA。
第二方面，本发明还提供一种核酸，其编码上述的人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述核酸包含：
d1)编码1LAS的核苷酸序列SEQ ID NO:2；或
d2)编码2SA5的核苷酸序列SEQ ID NO:3；或
d3)编码3LA7的核苷酸序列SEQ ID NO:4；或
d4)编码4FY3的核苷酸序列SEQ ID NO:5；或
d5)编码5OB6的核苷酸序列SEQ ID NO:6；或
d6)编码6HQQ的核苷酸序列SEQ ID NO:7；或
d7)编码7QCA的核苷酸序列SEQ ID NO:8；或
d8)编码9WUF的核苷酸序列SEQ ID NO:9；或
d9)编码10PS的核苷酸序列SEQ ID NO:10。
第三方面，本发明还提供一种载体，其包含上述的核酸。在一些实施方案中，所述载体为重组慢病毒载体；所述重组慢病毒载体含有所述人源化抗HER2 scFv的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体包括将4D5 scFv、1LAS scFv、2SA5 scFv、3LA7 scFv、4FY3scFv、5OB6 scFv、6HQQ scFv、7QCA scFv、9WUF scFv、10PS scFv分别转入慢病毒骨架质粒载体而得到的目的质粒——PUT4D5、PUT1LA、PUT2SA、PUT3LA、PUT4FY、PUT5OB、PUT6HQ、PUT7QC、PUT9WU、PUT10P中的一种或多种。
第四方面，本发明还提供一种宿主细胞，其包含前面所述的核酸或者前面所述的载体。
第五方面，本发明还提供用于产生抗体或抗原结合片段的方法，其培养根据第四方面所述的宿主细胞并从培养物回收所述抗体或抗原结合片段。
第六方面，本发明还提供一种抗HER2 CAR，其包含抗HER2 scFv；所述抗HER2 scFv为第一方面所述人源化的HER2抗原结合片段；所述人源化的HER2抗原结合片段是scFv。
在一些实施方案中，所述抗HER2 CAR的结构为CD8 leader-抗HER2 scFv-CD8Hinge-CD8 TM-共刺激结构域-胞内信号肽，包括依次串联的CD8 leader膜受体信号肽、抗HER2 scFv、CD8 Hinge嵌合受体铰链区、CD8 TM嵌合受体跨膜区、共刺激结构域和胞内信号肽。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括但不限于选自CD28、OX40和4-1BB中的一种或多种。进一步地，所述胞内信号肽为CD3ζ。
在一些实施方案中，所述CAR结构包括但不局限于CD8 leader-抗HER2scFv-CD8Hinge-CD8 TM-共刺激结构域-胞内信号肽结构。
第七方面，抗HER2 CAR-T或抗HER2 CAR-NK或抗HER2 CAR-M，其特征在于，其上修饰有嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为根据权利要求8所述的抗HER2 CAR。
在一些实施方案中，所述抗HER2 CAR-T中的T细胞包括但不限于αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞、MAIT细胞、CIK细胞中的一种或多种。
第八方面，本发明还提供根据前面所述的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，或根据前面所述的核酸，或根据前面所述的载体，或根据前面所述的宿主细胞，或根据前面所述的抗HER2 CAR，或根据前面所述的抗HER2CAR-T或抗HER2 CAR-NK或抗HER2 CAR-M在制备抗肿瘤药物中的应用。
在一些实施方案中，所述肿瘤为HER2阳性表达的肿瘤。
在一些实施方案中，所述实体肿瘤为乳腺癌、肝癌、前列腺癌。
如本文所用，术语“抗HER2 CAR-T”中的T细胞除非在具体实施时特别指明为某一类的T细胞外，应理解为是广义上的T细胞，即包括但不限于αβT细胞和/或γδT细胞，还包括一些非典型T细胞，例如自然杀伤T(NKT)细胞、粘膜相关不变T(MucosalAssociatedInvariant T,MAIT)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller，CIK)等。这些非典型T细胞也作为T淋巴细胞的效应类型。T细胞的来源也不限于外周血，包括脐带血、干细胞、IPSC、细胞系等分化诱导转化而来的细胞，及其T细胞分化而成的其他的细胞类型。αβT和γδT细胞是根据TCR类型不同对典型T细胞的分类。
如本文所用，术语“宿主细胞”应从广义上来理解，可以是原核细胞或真核细胞；可以是本领域已知的任何适宜宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
如本文所用，术语“单链可变片段”(single-chain fragment variable，scFv)由轻链的可变区(VL)、重链的可变区(VH)以及linker组成，重链和轻链可变区均包括3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)和4个框架区(FR1、FR2、FR3、FR4)。可与抗原结合。
如本文所用，术语“框架区”、“FR区”为相同的含义，均指根据Kabat的定义，在物种内不同免疫球蛋白之间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链的可变区的那些部分(不属于CDRs)。因此，人源化FR区是与天然发现于人抗体中的FR区基本上相同(至少85％或更多相同)的区域。
如本文所用，术语“人源化免疫球蛋白”指这样的免疫球蛋白，其包含人源化FR区和至少一个源自非人抗体的CDR，并且其中存在的每个恒定区都与人免疫球蛋白区域基本上相同(至少85％，优选至少90-95％相同)。因此，除了CDR之外人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白的一种或多种序列的对应区域基本上相同。例如，由小鼠的可变区和人来源的恒定区构成的嵌合性抗体并不包括在人源化免疫球蛋白之中。
本发明从鼠源4D5单克隆抗体中获得VH和VL序列，得到scFv单链抗体，并将其应用于CAR结构中，制备抗HER2 CAR-T。为了提高CAR-T细胞的持久性，减少HAMA反应(人抗鼠抗体反应，human anti-mouse antibody reaction；HAMA reaction)，本发明对鼠源4D5 scFv的框架区域进行了人源化改造，共设计了9条人源化的scFv。首先我们通过实验验证了这9条人源化之后的抗HER2 scFv与HER2抗原的结合活性；然后将这9个scFv应用于CAR结构中，进行慢病毒包装制备；再将制备得到的慢病毒转导293T细胞通过qPCR检测慢病毒滴度，流式检测T细胞表面表达的抗HER2-scFv与HER2抗原的结合。最后，我们用带有CAR的慢病毒转导人原代T细胞，制备抗HER2 CAR-T细胞，检测转导效率，并验证抗HER2 CAR-T在体外对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤能力。
本发明还提供人源化抗HER2 CAR中相关元件的编码序列以及CAR-T细胞的制备方法。同时本发明为基于HER2靶点的研究包括抗体药物、抗体偶联药物、多特异性抗体及CAR-T细胞治疗的开发提供了研发基础。
本发明将CAR结构中抗HER2 scFv的框架区进行了人源化改造，并应用于CAR-T细胞免疫治疗中，以解决CAR-T细胞免疫治疗中CAR-T细胞体内持久性差，易耗竭死亡的难题。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是9条人源化抗HER2 scFv序列与原序列4D5 scFv的序列比对。
图2是ELISA检测9种人源化抗HER2 scFv与HER2蛋白的结合。
图3是流式检测9种人源化抗HER2 scFv与细胞表面HER2抗原的结合。
图4是9种人源化抗HER2 CAR结构。
图5是HER2-His抗原检测293T细胞表面CAR-scFv表达率。
图6是CAR-T细胞WPRE拷贝数。
图7是9种人源化CAR慢病毒滴度IU/mL。
图8是人源化抗HER2 CAR-T细胞的杀伤效率比较。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
附表：
表1、11种抗HER2 scFv的核苷酸序列和氨基酸序列编号对应表
表2、抗HER2 CAR各元件的核苷酸序列和氨基酸序列编号对应表
名称 核苷酸序列编号 氨基酸序列编号
CD8 leader SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:26
CD8 Hinge SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:27
CD8 TM跨膜区 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:28
41BB共刺激域 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:29
CD3ζ SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:30
表3、11种scFv对应不同的CAR质粒编号
scFv 对应CAR质粒编号
4D5 scFv PUT4D5
1LAS scFv PUT1LA
2SA5 scFv PUT2SA
3LA7 scFv PUT3LA
4FY3 scFv PUT4FY
5OB6 scFv PUT5OB
6HQQ scFv PUT6HQ
7QCA scFv PUT7QC
9WUF scFv PUT9WU
10PS scFv PUT10P
表4、11种抗HER2 scfv-VH的氨基酸序列对应编号
表5、11种抗HER2 scfv-VL的氨基酸序列对应编号
名称 氨基酸序列编号
4D5-VL SEQ ID NO:41
1LAS-VL SEQ ID NO:42
2SA5-VL SEQ ID NO:43
3LA7-VL SEQ ID NO:44
4FY3-VL SEQ ID NO:45
5OB6-VL SEQ ID NO:46
6HQQ-VL SEQ ID NO:47
7QCA-VL SEQ ID NO:48
9WUF-VL SEQ ID NO:49
10PS-VL SEQ ID NO:50
实施例1：抗HER2 scFv的人源化改造及鉴定，得到9个人源化scFv
大肠杆菌TOP10(E.coli TOP10，来自厂商天根)；TMB来自eBioscience；96孔ELISA板来自Costar公司(货号3590)。无内毒素质粒中抽试剂盒，Endotoxin-free plasmid DNApurification(Nucleobond Xtra midi EF/maxi EF)。HER2抗原蛋白购自ACRO(CD0-H52H3)。HRP标记抗Fc抗体来自Bethyl；TMB来自eBioscience；Protein A蛋白纯化预装柱来自Yeasen(翌圣)。DMEM来自Gibco；Mouse anti-human IgG-Fc(HRP)来自Bethyl；PE anti-human Fc antibody来自Biolegend；K562-HER2(表示过表达HER2的K562细胞)来自优卡迪；Raji细胞系来自ATCC。2YT培养基配方：胰蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L；烧杯中放部分双蒸水，将上述比例蛋白胨、酵母粉、氯化钠称量好倒入，搅拌至重复溶解，清澈。将称好的琼脂粉放入锥形瓶，倒入培养液，封口膜封口后用高压灭菌器121摄氏度灭菌20分钟。待冷却至56摄氏度加入相应抗生素。氨苄青霉素配制(Ampicillin，来自生工生物，货号A610028-0025)：100mg/ml，100mg氨苄青霉素溶于1m无菌水中，0.22um微孔滤膜过滤灭菌，贮存于4℃备用。
借助Schrodinger中的bioluminate中的CDR Grafting工具及相关机器学习预测方法(Marks,Claire et al.“Humanization of antibodies using a machine learningapproach on large-scale repertoire data.”Bioinformatics(Oxford,England),vol.37,22 4041–4047.10Jun.2021,
doi:10.1093/bioinformatics/btab434)，我们对鼠源HER2抗体(亲本抗HER2抗体克隆号4D5)进行了FR区(框架区)的人源化改造，最终设计出9条scFv抗体候选序列，以降低鼠源抗体的免疫原性，对应的scFv分别命名为：1LAS scFv、2SA5 scFv、3LA7 scFv、4FY3scFv、5OB6 scFv、6HQQ scFv、7QCA scFv、9WUF scFv、10PS scFv。
图1为亲本鼠源HER2抗体(4D5)scFv序列与9条人源化scFv的序列比对结果。9条人源化抗HER2 scFv的核苷酸序列和氨基酸序列见表1(如
SEQ ID NO:2所示1LAS的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示2SA5的核苷酸序列，如SEQ ID NO:14所示3LA7的氨基酸序列，如SEQ ID NO:15所示4FY3的氨基酸序列等)。在这些序列中，连接子(Linker)是可以做适当调整的，起主要作用的是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，相应的序列见表4和表5。为免过于重复，本实施例及后续实施例仅以表1为例对本发明进行进一步说明，应理解的是表4和表5中的序列添加适当Linker后也具有类似表1中的序列的功能。表1中11种scFv的核苷酸序列均包含连接子(5’-GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT-3’，SEQ ID NO:51)。在表1中，SEQ ID NO:51的5’端连接的序列即对应的VL的核苷酸序列；SEQ ID NO:51的3’端连接的序列即对应的VH的核苷酸序列。
将以上9个人源化scFv的序列(1LAS scFv、2SA5 scFv、3LA7 scFv、4FY3 scFv、5OB6 scFv、6HQQ scFv、7QCA scFv、9WUF scFv、10PS scFv)送擎科进行基因合成，合成scFv-Fc重组质粒，用于表达scFv-Fc重组单链抗体。这9种重组蛋白的质粒合成成功后，使用哺乳动物真核表达细胞进行抗HER2-scFv重组抗体的可溶性表达。步骤如下：
一、质粒中抽，使用无内毒素质粒中抽试剂盒(Endotoxin-free plasmid DNApurification，来自Nucleobond Xtra midi EF/maxi EF)进行质粒大量抽提。取5ul送生工生物工程测序鉴定序列是否正确。
二、通过氯化钙将人源化scFv-Fc质粒分别转染293T细胞：1)将中抽得到的9个scFv-Fc质粒分别转染293T细胞，293T细胞1x107细胞/皿，80％细胞汇合度，转染前换培养基(DMEM+4％ FBS)，目的质粒22ug/皿，水、氯化钙、质粒的总体积为500ul/皿，HBS 500ul/皿，转染试剂经震荡充分混匀后加入10ml细胞培养液，每种质粒均转染10皿细胞，共转染10皿细胞。
2)质粒转染细胞8h后换培养基(DMEM+4％ FBS),每隔24h补培养基10ml，补两次，最后每皿细胞共30ml培养上清，收培养上清，0.45um滤膜过滤，除去细胞。
三、人源化抗HER2 scFv-Fc抗体的纯化：1样品纯化(使用AKTA系统):1)准备和清洗。2)平衡：用5倍柱体积的结合缓冲液(0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH7.0)平衡层析柱，保护蛋白。3)上样：把样品加到层析柱中(已经平衡好)，流速1ml/min，放收集管，管中预先放入PH8.5 Tris-HCL，中和至pH 4)洗杂：用10倍柱体积的洗杂Buffer(0.15M NaCl,20mMNa2HPO4,pH7.0)进行清洗，去除非特异性吸附结合的杂蛋白。5)洗脱：用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，用盐酸调pH)，采用两个pH(pH 5.0和pH
3.0)洗脱。pH 5.0洗脱第一次，PH 3.0洗脱第二次。6)蛋白超滤：将洗脱出来的蛋白使用50KD超滤管进行超滤，收集超滤的蛋白测定浓度，采用BCA法(Bicinchoninic AcidAssay)检测蛋白浓度。
四、BCA法进行蛋白浓度定量：1)蛋白标准品的准备，溶解蛋白标准品(5mg/mlBSA)，取10μl稀释至100μl，使終浓度为0.5mg/ml。2)BCA工作液配制，5ml BCA试剂A加100μlBCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。3)蛋白浓度测定，可以直接加到孔里面，a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，可以直接加在孔里面，不需要浪费管子稀释，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中。将样品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。c.每孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20分钟。d.用酶标仪测定A562的吸光度。e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出纯化后的蛋白浓度。最后用PBS将蛋白浓度最终调整为1mg/ml，冻存于-20℃。
五、酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定这9种不同的人源化抗HER2 scFv与HER2抗原的特异性结合。
1)以1ug/ml的浓度包被HER2-His抗原于96孔ELISA板，封口膜封板，4℃过夜。2)ELISA板包被抗原过夜后，0.05％ Tween20的中性磷酸盐缓冲液(PBST)洗一次，脱脂奶粉封闭1h，期间稀释一抗。3)将一抗使用2％脱脂牛奶进行3.3倍梯度稀释，起始浓度为5ug/ml，共计12个一抗浓度。4)ELISA板封闭结束后，加一抗，100ul/孔，一抗加完孵育1小时。5)0.05％PBST洗6次。6)使用2％脱脂牛奶按1：1000比例加二抗——鼠抗人IgG-Fc(HRP)，100ul/孔，孵育1h。7)0.05％ PBST洗6次。8)100ul/孔TMB显色加100ul，显色10分钟，颜色过深可终止。9)硫酸(2M)每孔100ul，终止显色反应。10)酶标仪进行光度测量(450nm)。这里的一抗为这9种不同的人源化抗HER2 scFv。
六、流式检测这9种不同的人源化抗HER2 scFv重组抗体与细胞表面HER2抗原的结合，检测步骤：1.用预冷的1×PBS稀释抗体至终浓度5ug/ml，终体积200ul。2.用培养基将K562-HER2细胞的密度调为1×106cells/ml，每管加入1ml细胞悬液(视细胞量而定)，4℃离心弃上清。3.用1mL预冷的1×PBS，1500rpm 5min洗涤一次。4.各加200uL稀释好的一抗(抗HER2 scFv-Fc)重悬细胞，置于冰上60min。5.离心弃上清，用1mL预冷的1×PBS，1200rpm5min洗涤一次。6.用预冷的含5％BSA的1×PBS按稀释二抗(抗Fc)，每管加1ul二抗[抗Fc(PE)]重悬细胞，置于冰上30min。8.用1mL预冷的1×PBS，1500rpm 5min洗涤一次。9.用200ul预冷1×PBS重悬细胞，上机检测。
我们使用293T细胞来表达人源化HER2抗体，表达上清经AKTA蛋白之后，我们进行BCA浓度测定，根据检测结果把10个抗体浓度统一调整为1mg/ml之后，通过ELISA和流式细胞仪检测人源化之后的抗体与细胞表面的抗原是否仍具备结合活性。
ELISA检测人源化的10个抗HER2 scFv-Fc与HER2抗原的结合，OD450nm结果如图2所示，显示人源化的抗HER2 scFv仍然以高活性特异性结合HER2-His抗原(图2)，NO Ab为不加一抗的阴性对照孔。与其他几条人源化序列相比，7QCA-scFv表现出较高的结合活性，甚至高于4D5-scFv，表明将亲本4D5-scFv的FR区人源化后得到的7QCA-scFv对HER2抗原的结合活性没有显著影响，甚至有所提升。
再经流式鉴定人源化的9个抗HER2 scFv抗体与细胞表面的HER2抗原的结合，阳性细胞群比例均大于90％，显示这9个人源化抗体能够与细胞表面的HER2抗原结合(图3)。其中7QCA-scFv表现出较其他8条序列高的细胞结合活性，达到甚至略高于亲本4D5-scFv，表明7QCA-scFv的人源化对细胞表面的HER2抗原(如K562-HER2细胞表面的HER2抗原)结合活性没有显著影响。
下面的实施例将从CAR及CAR-T方面，证明采用本发明人源化的9个抗HER2 scFv制备的嵌合抗原受体(抗HER2 CAR)以及修饰有该嵌合抗原受体的T细胞(抗HER2 CAR-T)的制备过程，对HER2阳性表达的靶细胞的LDH杀伤作用。然而这并不意味着本发明人源化的HER2抗体只能用于制备嵌合抗原受体以及修饰有该嵌合抗原受体的T细胞，其本身作为结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，以及编码它的核酸，含有该核酸的载体，以及含有该核酸或载体的宿主细胞，都具有非常大的生物学价值。限于篇幅，这里重点例举了HER2 CAR及CAR-T方面的研究数据。
实施例2：抗HER2 CAR的构建及慢病毒的包装
慢病毒骨架质粒载体为PUT4D5，来自优卡迪；pPac-R、pPac-GP和pEnv-G均来自优卡迪；DMEM培养基来自Gibco；TOP10感受态来自天根生物有限公司。
实施例1的结果显示根据原鼠源HER2抗体(4D5)序列人源化改造的9个scFv(1LAS、2SA5、3LA7、4FY3、5OB6、6HQQ、7QCA、9WUF、10PS)能够结合HER2抗原以及抗原阳性细胞，接下来我们将4D5和这个9个抗HER2scFv分别应用到CAR结构中，用于识别靶向HER2抗原，相对应的CAR质粒编号分别为：PUT4D5、PUT1LA、PUT2SA、PUT3LA、PUT4FY、PUT5OB、PUT6HQ、PUT7QC、PUT9WU、PUT10P。10种CAR结构及相关元件如图4所示，具体对应关系如表3。
将实施例1得到的9条人源化抗HER2 scFv通过无缝克隆重组进慢病毒骨架质粒载体PUT4D5(来自优卡迪)中得到目的质粒，目的质粒转化TOP10大肠杆菌感受态，隔天挑单克隆测序鉴定后扩大培养，按实施例1所述方法进行质粒中抽，质粒抽提结束后，使用目的质粒以及慢病毒包装质粒pPac-R(来自优卡迪)、慢病毒包装质粒pPac-GP(来自优卡迪)和慢病毒包装质粒pEnv-G(来自优卡迪)对293T细胞进行转染。
用10cm培养皿对待转染的293T细胞进行铺板，待细胞密度达到70％左右，进行慢病毒包装，步骤如下：取出对数扩增期293T细胞观察细胞状态，弃细胞培养液上清，加入新鲜DMEM基本培养基。每种CAR质粒均转染10皿293T细胞，若细胞状态良好，细胞汇合度80％-90％之间，则弃去培养基重新缓慢加入4％ DMEM完全培养基9mL。在15mL离心管中加入2500ul CaCl2、3种包装质粒(80ug pPac-R、100g pPac-GP、60g pEnv-G)和220ug目的质粒HER2CAR，随即补加细菌内毒素检查用水至5000ul，加入5000ul HBS，添加完毕后持续震荡20s左右。培养箱中取出293T细胞，每皿细胞加入混合的转染试剂1mL，轻轻摇晃混合均匀，放置培养箱中。转染6h后弃去培养上清，加入10mL 4％ DMEM完全培养基。转染24h后继续补加10mL 4％ DMEM完全培养基。在培养的24小时、48小时以及72小时收集病毒上清于4℃进行保存，待病毒上清收集完毕，使用0.45um滤器对病毒上清进行过滤，滤去细胞的残渣之后加入聚乙二醇8000(PEG8000)对病毒进行浓缩，4℃孵育12小时，之后离心3000rpm，15分钟，离心后弃去上清，并加入适量的无菌PBS溶解病毒沉淀，将溶解的病毒进行分装并保存于-80℃冰箱，得到重组慢病毒载体。该重组慢病毒载体含有抗HER2 CAR的编码核酸片段。
抗HER2 CAR-T中CAR的构建如图4。抗HER2 CAR的编码片段为CD8leader-抗HER2scFv-CD8 Hinge-CD8 TM-41BB共刺激结构域-CD3ζ胞内信号肽的编码片段，表2示出了各片段分别的氨基酸序列和核苷酸序列(如SEQ IDNO:21所示CD8 Leader的核苷酸序列)。
实施例3：慢病毒转导293T细胞检测滴度、初步验证结合
293T细胞购自ATCC，APC-anti His二抗购自Biolegend。
慢病毒载体是CAR-T细胞制备过程中的关键原材料，其质量控制直接影响CAR-T细胞的转导效率及增殖、杀伤活性。CAR-T细胞生产环节中包括以携带目的基因的慢病毒载体侵染T细胞，其中慢病毒的滴度对侵染是否成功非常关键。
慢病毒载体生物滴度的测定：(1)293T细胞铺板：取出培养好的293T细胞，观察细胞状态，记录细胞代次。置于生物安全柜中，弃去原有的培养液上清，沿壁加入2mL/皿的1×PBS缓冲液，倾斜45°，当PBS缓冲液浸润整个细胞表面后弃上清。加入2mL/皿胰酶，同样倾斜45°，使得胰酶能够浸润整个细胞表面，室温下静置30s后弃去胰酶，显微镜下观察细胞，此时细胞已变圆，加入3mL完全培养基，将细胞重悬于15mL离心管中。1000rpm离心5min，弃上清。加入2mL新鲜完全培养基重悬细胞，并取细胞悬液20μL加入到970μL PBS中，同时加入10μL台盼蓝染色剂，50倍稀释，使用细胞计数板显微镜下计数，计算细胞密度。根据总细胞量接种于24孔板中，每孔细胞量1×105个细胞，按照计算用量铺板即可。(2)采用qPCR法进行生物滴度的测定时病毒稀释并感染：每种病毒载体原液分别加入10ul、5ul、2.5ul至3个孔中，混合均匀，于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养48小时。轻轻吸取上清弃去并加入500ulPBS，轻轻将细胞吹起并收集至1.5mL EP管中。采用来自GENEray的基因组DNA提取试剂盒进行如下操作：3000rpm离心5min，弃上清，加入10μL Proteinase K(蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂)溶液和400μL裂解液ACL solution，用力振荡混匀1min后置于55℃，孵育60min。取出降至室温后加300ulExt solution和300ul AB solution，用力混匀，12000rpm离心5min。取下层液500ul至GenClean Column中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。加500ul Wash solution，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。重复洗涤一次。继续12000rpm离心2min去除残留的废液。最后加入50ul Elution buffer，室温放置10min，12000rpm离心1min，离心管中即抽提获得的DNA溶液。配制实时定量qPCR反应体系，使用如上的反应体系，设置qPCR扩增程序为两步法，预变性95℃、35s；然后进行变性95℃、25s，退火延伸60℃、36s的40个循环。PCR法滴度(integration units per mL，IU/mL)计算公式：滴度(IU/ml)＝(C×N×D×1000)/V，其中C代表平均每基因组中整合病毒拷贝数量；N代表感染时细胞数目；D指病毒载体稀释倍数；V代表所加稀释病毒体积数。
流式细胞仪检测293T细胞的CAR表达率：将24孔板的细胞置于显微镜下观察细胞状态及密度，如果各个孔中的细胞状态良好，则将每个孔中的培养上清弃去，加入500μLPBS进行吹打细胞，将细胞从孔板中取下来，置于1.5mL离心管中，1000rpm离心5min后，弃去上清收集沉淀。加入HER2-His抗原进行避光孵育45min。等到孵育结束后，1000rpm离心5min后弃去上清，加1ul APC-anti His二抗避光孵育20分钟，最后加入PBS后洗涤两遍，然后上机检测。
检测得到10个慢病毒载体的滴度如图7。HER2-His抗原检测得到10个慢病毒载体转导293T细胞的CAR表达率如图5，结果显示构建有人源化抗HER2scFv的CAR被表达在293T细胞表面，且能够与HER2蛋白结合。
实施例4：慢病毒转导原代人T细胞，制备抗HER2 CAR-T细胞并表征
CD4/CD8磁珠，CD3抗体，CD28抗体均来自美天旎；IL-2来自Peprotech；A-IMV培养基来自Gibco；FITC-Protein L蛋白来自Biolegend。
使用CD4和CD8磁珠从人外周血单个核细胞中分离CD4+CD8+T细胞，放入包被有CD3抗体CD28抗体的T25瓶中激活24h，T细胞完全激活后按MOI＝100加入实施例2制备好的重组慢病毒载体，感染48h后，PBS洗2次，更换新的完全培养基重悬，然后使用流式细胞仪通过FITC-Protein L蛋白检测慢病毒转染T细胞的转染效率。Protein L是一种免疫球蛋白结合蛋白，可与免疫球蛋白轻链特异性结合。
使用试剂盒提取细胞基因组DNA，按照实施例3中所诉方法通过qPCR检测CAR-T拷贝数。慢病毒转染原代T细胞后，在第14天(D14)检测扩增拷贝数和感染效率。CAR拷贝数结果如图6所示。把T细胞与ProteinL-FITC共孵育后通过流式细胞仪检测感染效率，感染效率如图5所示。
实施例5：抗HER2 CAR-T细胞靶细胞的LDH杀伤
LDH杀伤试剂盒来自CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay，Promega，货号REF：G1782；A-IMV培养基来自Gibco；K562(HER2阴性)细胞来自上海中国科学院细胞库；高表达HER2的肝癌细胞株HEPG2来自优卡迪。
乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测效应细胞(这里为抗HER2 CAR-T细胞)对靶细胞的杀伤效率。按照LDH杀伤试剂盒说明书进行LDH杀伤检测。LDH杀伤结果显示这9种人源化scFv制备的抗HER2 CAR-T细胞均可特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞，而对K562细胞没有毒性。
如图8，其中PUT7QC CAR-T(7QCA scFv)细胞对HER2阳性表达的HEPG2细胞的杀伤率为27.8％，对HER2阴性表达的K562没有杀伤；PUT4D5 CAR-T(亲本4D5 scFv)细胞对HEPG2的杀伤率为21.3％，对HER2阴性表达的K562也没有杀伤。PUT7QC CAR-T(7QCA scFv)细胞表现出比PUT4D5 CAR-T(亲本4D5 scFv)细胞更好的杀伤能力。结合实施例1中的结果，发现PUT7QC CAR-T(7QCA scFv)细胞中的人源化序列7QCA scFv具有比鼠源亲本4D5 scFv序列更好的结合HER2抗原的能力。因此，7QCA scFv序列既具备了人源化的所有优点，又不存在常规人源化抗体较鼠源性抗体在体外的结合活性减弱，不易观测其免疫效力的缺点，这体现出7QCA scFv具有比常规人源化抗体更好的技术效果，超出本领域技术人员的预期。
临床开发中的大多数CAR包含源自小鼠单克隆抗体的单链可变片段(scFv)结构域，但抗鼠免疫反应可能导致排斥反应，并且在已有报导病例证明了这种CAR特异性T细胞排斥反应。本发明通过实验验证了经过人源化的PUT7QC CAR-T(7QCA scFv)细胞表现出比PUT4D5 CAR-T(亲本4D5 scFv)细胞相当甚至更好的杀伤能力，证明其有临床抗肿瘤应用潜力。此外，CAR组件的人源化理论上可以绕过针对鼠域的免疫介导的排斥反应，从而可能改善持久性。本发明开发了一种含有CAR的人源化抗HER2 scFv结构域的抗HER2 CAR-T细胞(PUT7QC CAR-T)，目的是克服长期持续存在的潜在障碍。目前的研究有一些局限性，尽管假设人源化CAR的免疫原性降低，但本研究或其他领域内研究尚未显示支持该假设的证据，在体外和体内动物实验中都很难比较人源化抗HER2 CAR-T和鼠源CAR-T(4D5)之间的CAR-T细胞持久性和毒性。
我们将抗HER2 scFv人源化，旨在降低免疫原性，减少免疫原性激发HAMA(humananti-mouse antibody reaction，人抗鼠抗体反应)，增强CAR-T在人体循环中的持久性，进而延长CAR-T其在人体内的半衰期，提高CAR-T的持久性、安全性和有效性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，其特征在于，包含：
a1)氨基酸序列为SEQ ID NO:32的1LAS-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:42的1LAS-VL；或
a2)氨基酸序列为SEQ ID NO:33的2SA5-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:43的2SA5-VL；或
a3)氨基酸序列为SEQ ID NO:34的3LA7-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:44的3LA7-VL；或
a4)氨基酸序列为SEQ ID NO:35的4FY3-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:45的4FY3-VL；或
a5)氨基酸序列为SEQ ID NO:36的5OB6-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:46的5OB6-VL；或
a6)氨基酸序列为SEQ ID NO:37的6HQQ-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:47的6HQQ-VL；或
a7)氨基酸序列为SEQ ID NO:38的7QCA-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:48的7QCA-VL；或
a8)氨基酸序列为SEQ ID NO:39的9WUF-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:49的9WUF-VL；或
a9)氨基酸序列为SEQ ID NO:40的10PS-VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:50的10PS-VL；或
所述人源化的结合HER2的抗体是多克隆抗体或抗HER2单克隆抗体；
所述人源化的HER2抗原结合片段是：
b1)scFv；或
b2)二硫键连接的Fv；或
b3)Fab片段；或
b4)F(ab’)片段；或
b5)一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；或
b6)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；或
b7)由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段。
2.根据权利要求1所述的人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，其特征在于，所述人源化的HER2抗原结合片段是人源化抗HER2 scFv，所述人源化的HER2抗原结合片段包含：
c1)氨基酸序列为SEQ ID NO:12的1LAS；或
c2)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的2SA5；或
c3)氨基酸序列为SEQ ID NO:14的3LA7；或
c4)氨基酸序列为SEQ ID NO:15的4FY3；或
c5)氨基酸序列为SEQ ID NO:16的5OB6；或
c6)氨基酸序列为SEQ ID NO:17的6HQQ；或
c7)氨基酸序列为SEQ ID NO:18的7QCA；或
c8)氨基酸序列为SEQ ID NO:19的9WUF；或
c9)氨基酸序列为SEQ ID NO:20的10PS。
3.核酸，其特征在于，编码根据权利要求1或2所述的人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，包含：
d1)编码1LAS的核苷酸序列SEQ ID NO:2；或
d2)编码2SA5的核苷酸序列SEQ ID NO:3；或
d3)编码3LA7的核苷酸序列SEQ ID NO:4；或
d4)编码4FY3的核苷酸序列SEQ ID NO:5；或
d5)编码5OB6的核苷酸序列SEQ ID NO:6；或
d6)编码6HQQ的核苷酸序列SEQ ID NO:7；或
d7)编码7QCA的核苷酸序列SEQ ID NO:8；或
d8)编码9WUF的核苷酸序列SEQ ID NO:9；或
d9)编码10PS的核苷酸序列SEQ ID NO:10。
5.载体，其特征在于，包含根据权利要求3或4所述的核酸。
6.宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求3或4所述的核酸或者根据权利要求5所述的载体。
7.用于产生抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，培养根据权利要求6所述的宿主细胞并从培养物回收所述抗体或抗原结合片段。
8.一种抗HER2 CAR，其特征在于，包含抗HER2 scFv；所述抗HER2 scFv为根据权利要求1所述人源化的HER2抗原结合片段；所述人源化的HER2抗原结合片段是scFv。
9.抗HER2 CAR-T或抗HER2 CAR-NK或抗HER2 CAR-M，其特征在于，其上修饰有嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为根据权利要求8所述的抗HER2CAR。
10.根据权利要1所述的人源化的结合HER2的抗体或HER2抗原结合片段，或根据权利要求3所述的核酸，或根据权利要求5所述的载体，或根据权利要求6所述的宿主细胞，或根据权利要求8所述的抗HER2 CAR，或根据权利要求9所述的抗HER2 CAR-T或抗HER2 CAR-NK或抗HER2 CAR-M在制备抗肿瘤药物中的应用。
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