JP6612324B2 - αKlothoに対して高親和性を有する抗体 - Google Patents
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Description
a.CDR−L3;X1X2X3X4PX5(配列番号1)
(ここで、X1はAまたはSであり、X2はGまたはAであり、X3はYまたはFであり、X4はSまたはAであり、X5はIまたはVである);
b.CDR−H1: X6X7X8X9X10X11(配列番号2)
(ここで、X6はIまたはVであり、X7はSまたはAであり、X8はY、FまたはSであり、X9はY、FまたはSであり、X10はSまたはAであり、かつ、X11はIまたはVである);
c.CDR−H2;X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(配列番号3)
(ここで、X12はY、FまたはSであり、X213はIまたはVであり、X14はSまたはAであり、X15はPまたはSであり、X16はSまたはAであり、X17はYまたはFであり、X18はGまたはAであり、X19はYまたはFであり、X20はTまたはSであり、かつ、X21はS、AまたはYである);および/または
d.CDR−H3:X22X23VYX24X25X26X27WX28GX29GM(配列番号4)
(ここで、X22はYまたはFであり、X23はYまたはFであり、X24はAまたはSであり、X25はSまたはAであり、X26はHまたはNであり、X27はGまたはAであり、X28はAまたはSであり、かつ、X29はYまたはFである)
のうち1以上を含んでなる、抗体および/またはその結合フラグメントである。
用語「αKlotho」または「アルファーKlotho」は、本明細書で使用する場合、用いられている文脈から決定可能なように、全長αKlothoタンパク質、エクトドメインフラグメントなどのそのフラグメントを含む、総て既知の天然αKlotho分子、ならびに前記タンパク質およびフラグメントをコードする核酸を意味する。可溶型(タンパク質分解切断された)αKlotho、ならびに血液もしくはその画分、尿または脳脊髄液などの体液中に存在する場合に「可溶性αKlotho」と呼ばれ、約130kDaの分子量を有する選択的スプライシング型αKlotho、ならびに膜係留型のαKlotho、限定されるものではないが、ヒトαKlotho、または例えばマウスおよびラットαKlothoを含む齧歯類αKlothoなどの哺乳類αKlothoが含まれる。
本開示は、例えば、腎臓病を診断するためおよび/または予後診断を行うための抗体および/またはその結合フラグメントならびに製造方法および使用方法に関する。
a.CDR−L3;X1X2X3X4PX5(配列番号1)
(ここで、X1はAまたはSであり、X2はGまたはAであり、X3はYまたはFであり、X4はSまたはAであり、X5はIまたはVである);
b.CDR−H1: X6X7X8X9X10X11(配列番号2)
(ここで、X6はIまたはVであり、X7はSまたはAであり、X8はY、FまたはSであり、X9はY、FまたはSであり、X10はSまたはAであり、かつ、X11はIまたはVである);
c.CDR−H2;X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(配列番号3)
(ここで、X12はY、FまたはSであり、X213はIまたはVであり、X14はSまたはAであり、X15はPまたはSであり、X16はSまたはAであり、X17はYまたはFであり、X18はGまたはAであり、X19はYまたはFであり、X20はTまたはSであり、かつ、X21はS、AまたはYである);および/または
d.CDR−H3:X22X23VYX24X25X26X27WX28GX29GM(配列番号4)
(ここで、X22はYまたはFであり、X23はYまたはFであり、X24はAまたはSであり、X25はSまたはAであり、X26はHまたはNであり、X27はGまたはAであり、X28はAまたはSであり、かつ、X29はYまたはFである)
を含んでなる、抗体および/またはその結合フラグメントを含む。
軽鎖可変領域:
CDR−L3:QQAGYSPIT(配列番号5)
重鎖可変領域:
CDR−H1:GFNISYYS(配列番号6)
CDR−H2:ISPSYGYT(配列番号7)
CDR−H3:ARYYVYASHGWAGYGMDY(配列番号8)
を含んでなる。
CDR−L1:QSVSSA(配列番号9)
CDR−L2:SAS(配列番号10)
を含んでなる相補性決定領域CDR−L1および/またはCDR−L2をさらに含んでなる。
CDR−L3;X1X2X3X4PX5(配列番号1)
(ここで、X1はAまたはSであり、X2はGまたはAであり、X3はYまたはFであり、X4はSまたはAであり、X5はIまたはVである);
CDR−H1: X6X7X8X9X10X11(配列番号2)
(ここで、X6はIまたはVであり、X7はSまたはAであり、X8はY、FまたはSであり、X9はY、FまたはSであり、X10はSまたはAであり、かつ、X11はIまたはVである);
CDR−H2;X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(配列番号3)
(ここで、X12はY、FまたはSであり、X213はIまたはVであり、X14はSまたはAであり、X15はPまたはSであり、X16はSまたはAであり、X17はYまたはFであり、X18はGまたはAであり、X19はYまたはFであり、X20はTまたはSであり、かつ、X21はS、AまたはYである);
CDR−H3:X22X23VYX24X25X26X27WX28GX29GM(配列番号4)
(ここで、X22はYまたはFであり、X23はYまたはFであり、X24はAまたはSであり、X25はSまたはAであり、X26はHまたはNであり、X27はGまたはAであり、X28はAまたはSであり、かつ、X29はYまたはFである)
のうち1以上を含んでなる、抗体および/またはその結合フラグメントをコードする。
本開示の別の態様は、折り畳まれたαKlothoポリペプチドのエピトープに対して特異的結合親和性を有する抗体および/またはその結合フラグメントを生産する方法である。
a.本明細書に開示される抗体および/またはその結合フラグメントをコードする核酸を宿主細胞内で発現させること、
b.前記抗体および/またはその結合フラグメントを生産するために前記宿主細胞を培養すること、および
c.前記抗体および/またはその結合フラグメントを前記宿主細胞から単離および精製すること
を含んでなる。
a)サンプルと本明細書に記載の抗体または結合フラグメントとを、抗体:αKlotho複合体を形成する条件下で接触させること、および
b)抗体:αKlotho複合体を検出すること
を含んでなる。
a)体液であるサンプルと本明細書に記載の抗体または結合フラグメントとを、抗体:可溶性αKlotho複合体を形成する条件下で接触させること、および
b)抗体:可溶性αKlotho複合体を検出および/または測定すること
を含んでなる。
a.αKlotho対象由来のサンプルにおけるレベルを場合により本明細書に開示される抗体またはアッセイを用いて測定すること、および
b.サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの低下が、前記対象がCKDまたはAKIから選択される腎臓病態を有することを示す。
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを測定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照、例えば、回復または進行しなかった対象の群から導かれた対照値と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象がAKI後の回復の高い見込みを有することを示す。
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを測定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照、例えば、長期合併症を有するまたは長期合併症の数が多い対象の群から導かれた対照値と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象が、AKI後の長期合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す。
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを測定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照(ここで、例えば、対照は、対象の群から導かれた対照値、例えば、回復しなかったまたは進行した対象の群から導かれた対照値である)と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象が、CKDから回復する高い見込みを有することを示す。
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを測定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象が、CKDに関連する腎外合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す。
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを測定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを従前の参照サンプルその他の対照と比較すること
を含んでなり、
従前の参照サンプルまたは他の対照と比較したサンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象が改善中の腎臓病態を有することを示し、従前の参照サンプルまたは他の対照と比較したサンプルにおけるαKlothoのレベルの低下が、前記対象が増悪中の腎臓病態を有することを示す。
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルまたは他の外被内に含まれる、本明細書に開示されるi)抗体および/またはその結合フラグメント、ii)核酸、iii)組成物またはiv)組換え細胞ならびに場合により参照薬剤および/またはその使用のための説明書を含んでなるキットに関する。
[1]競合的ELISAアッセイにより測定した場合に、約10nM以下の解離定数(K D )でαKlothoポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、抗体および/またはその結合フラグメント。
[2]前記αKlothoポリペプチドが折り畳まれたαKlothoポリペプチドである、上記[1]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[3]競合的ELISAアッセイにより測定した場合に約2nM以下の解離定数(K D )でαKlothoポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、上記[1]または[2]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[4]抗体またはその結合フラグメントが軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域CDR−L3を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含んでなり、前記CDRのアミノ酸配列が以下に示される配列:
a.CDR−L3;X 1 X 2 X 3 X 4 PX 5 (配列番号1)
(ここで、X 1 はAまたはSであり、X 2 はGまたはAであり、X 3 はYまたはFであり、X 4 はSまたはAであり、X 5 はIまたはVである);
b.CDR−H1:X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 (配列番号2)
(ここで、X 6 はIまたはVであり、X 7 はSまたはAであり、X 8 はY、FまたはSで
あり、X 9 はY、FまたはSであり、X 10 はSまたはAであり、かつ、X 11 はIまた
はVである);
c.CDR−H2;X 12 X 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 (配列番号3)
(ここで、X 12 はY、FまたはSであり、X 13 はIまたはVであり、X 14 はSまたはAであり、X 15 はPまたはSであり、X 16 はSまたはAであり、X 17 はYまたはFであり、X 18 はGまたはAであり、X 19 はYまたはFであり、X 20 はTまたはSであり、かつ、X 21 はS、AまたはYである);および/または
d.CDR−H3:X 22 X 23 VYX 24 X 25 X 26 X 27 WX 28 GX 29 GM(配列番号4)
(ここで、X 22 はYまたはFであり、X 23 はYまたはFであり、X 24 はAまたはSであり、X 25 はSまたはAであり、X 26 はHまたはNであり、X 27 はGまたはAであり、X 28 はAまたはSであり、かつ、X 29 はYまたはFである)
のうち1以上を含んでなる、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[5]軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域CDR−L3を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含んでなり、前記CDRのアミノ酸配列が以下に示される配列:
a.CDR−L3;X 1 X 2 X 3 X 4 PX 5 (配列番号1)
(ここで、X 1 はAまたはSであり、X 2 はGまたはAであり、X 3 はYまたはFであり、X 4 はSまたはAであり、X 5 はIまたはVである);
b.CDR−H1:X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 (配列番号2)(ここで、X 6 はIまたはVであり、X 7 はSまたはAであり、X 8 はY、FまたはSであり、X 9 はY、FまたはSであり、X 10 はSまたはAであり、かつ、X 11 はIまたはVである);
c.CDR−H2;X 12 X 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 (配列番号3)
(ここで、X 12 はY、FまたはSであり、X 13 はIまたはVであり、X 14 はSまたはAであり、X 15 はPまたはSであり、X 16 はSまたはAであり、X 17 はYまたはFであり、X 18 はGまたはAであり、X 19 はYまたはFであり、X 20 はTまたはSであり、かつ、X 21 はS、AまたはYである);および/または
d.CDR−H3:X 22 X 23 VYX 24 X 25 X 26 X 27 WX 28 GX 29 GM(配列番号4)
(ここで、X 22 はYまたはFであり、X 23 はYまたはFであり、X 24 はAまたはSであり、X 25 はSまたはAであり、X 26 はHまたはNであり、X 27 はGまたはAであり、X 28 はAまたはSであり、かつ、X 29 はYまたはFである)
のうち1以上を含んでなる、抗体および/またはその結合フラグメント。
[6]前記相補性決定領域が、配列番号5〜120から選択される、場合により以下に示されるようなアミノ酸配列:
軽鎖可変領域:CDR−L3:AGYSPI(配列番号5);
重鎖可変領域:CDR−H1:ISYYSI(配列番号6);
CDR−H2:YISPSYGYTS(配列番号7);および/または
CDR−H3:YYVYASHGWAGYGM(配列番号8)
を含んでなる、上記[4]または[5]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[7]前記軽鎖可変領域が、以下に示されるアミノ酸配列:
CDR−L1:QSVSSA(配列番号9)および/または
CDR−L2:SAS(配列番号10)
を含んでなる相補性決定領域CDR−L1および/またはCDR−L2をさらに含んでなる、上記[4]〜[6]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[8]配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含んでなる、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[9]配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んでなる、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[10]配列番号13または配列番号14に示される前記アイソタイプのアミノ酸配列を有する重鎖IgG1またはIgG4アイソタイプを含んでなり、上記[1]〜[9]のいずれに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[11]前記軽鎖相補性決定領域CDR−L3および重鎖相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3が、それぞれ配列番号1〜4と少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%の配列同一性を有する、上記[1]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[12]モノクローナル抗体、免疫グロブリン分子、Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、ジスルフィド結合scFv、一本鎖ドメイン抗体、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[13]前記αKlothoポリペプチドが、哺乳類αKlothoポリペプチドである、上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[14]前記哺乳類αKlothoポリペプチドが、ヒトαKlothoポリペプチドである、上記[13]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[15]前記哺乳類αKlothoが、齧歯類αKlothoポリペプチドである、上記[13]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[16]前記齧歯類αKlothoポリペプチドが、マウスαKlothoポリペプチドまたはラットαKlothoポリペプチドである、上記[15]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[17]前記折り畳まれたαKlothoポリペプチドが、可溶性の折り畳まれたαKlothoポリペプチドである、上記[1]〜[16]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[18]尿、血漿、および/または血清中に見出される可溶性の折り畳まれたαKlothoポリペプチドと結合する、上記[17]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[19]折り畳まれたαKlothoポリペプチドを含んでなる複合体と結合する、上記[1]〜[18]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[20]前記折り畳まれたαKlothoポリペプチドが、線維芽細胞増殖因子(FGF)受容体、場合により、FGFR1cと複合体を形成する、上記[19]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[21]検出可能なタグで標識される、上記[1]〜[20]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[22]前記検出可能なタグが、Hisタグ、HAタグ、GSTタグ、またはFLAGタグである、上記[21]に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
[23]上記[1]〜[22]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメントとαKlothoとを含んでなり、場合により、FGFR1cをさらに含んでなる、抗体複合体。
[24]FGFR1cを含んでなり、場合により、FGF23をさらに含んでなる、上記[23]に記載の抗体複合体。
[25]軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域CDR−L3を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含んでなり、前記CDRのアミノ酸配列が以下に示される配列:
a.CDR−L3;X 1 X 2 X 3 X 4 PX 5 (配列番号1)
(ここで、X 1 はAまたはSであり、X 2 はGまたはAであり、X 3 はYまたはFであり、X 4 はSまたはAであり、X 5 はIまたはVである);
b.CDR−H1:X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 (配列番号2)
(ここで、X 6 はIまたはVであり、X 7 はSまたはAであり、X 8 はY、FまたはSであり、X 9 はY、FまたはSであり、X 10 はSまたはAであり、かつ、X 11 はIまたはVである);
c.CDR−H2;X 12 X 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 (配列番号3)
(ここで、X 12 はY、FまたはSであり、X 13 はIまたはVであり、X 14 はSまたはAであり、X 15 はPまたはSであり、X 16 はSまたはAであり、X 17 はYまたはFであり、X 18 はGまたはAであり、X 19 はYまたはFであり、X 20 はTまたはSであり、かつ、X 21 はS、AまたはYである);
d.CDR−H3:X 22 X 23 VYX 24 X 25 X 26 X 27 WX 28 GX 29 GM(配列番号4)
(ここで、X 22 はYまたはFであり、X 23 はYまたはFであり、X 24 はAまたはSであり、X 25 はSまたはAであり、X 26 はHまたはNであり、X 27 はGまたはAであり、X 28 はAまたはSであり、かつ、X 29 はYまたはFである)
のうち1以上を含んでなる抗体および/またはその結合フラグメントをコードする核酸。
[26]上記[25]の核酸を含んでなるベクター。
[27]上記[25]の核酸または上記[26]に記載のベクターを含んでなる、上記[1]〜[22]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメントを産生する組換え細胞。
[28]上記[1]〜[22]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント、上記[25]に記載の核酸、上記[26]に記載のベクターまたは上記[27]に記載の細胞を含んでなる組成物。
[29]上記[1]〜[22]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメントを含んでなるイムノアッセイ。
[30]前記イムノアッセイが酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)である、上記[29]に記載のイムノアッセイ。
[31]前記ELISAがサンドイッチELISAである、上記[30]に記載のイムノアッセイ。
[32]上記[1]〜[22]のいずれかに記載のαKlothoポリペプチドのエピトープに対して特異的結合親和性を有する抗体および/またはその結合フラグメントを生産する方法であって、その工程が
a.上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメントのアミノ酸配列をコードする核酸を宿主細胞内で発現させること、
b.前記抗体および/またはその結合フラグメントを生産するために前記宿主細胞を培養すること、および
c.前記抗体および/またはその結合フラグメントを前記宿主細胞から単離および精製すること
を含んでなる、方法。
[33]
サンプル中のαKlothoポリペプチドのレベルを測定するためのアッセイであって、
a.サンプルと上記[1]〜[22]のいずれかに記載の抗体とを、抗体:αKlotho複合体を形成する条件下で接触させること、および
b.抗体:αKlotho複合体を検出すること
を含んでなる、アッセイ。
[34]可溶性αKlothoを検出および/または測定するためのアッセイであって、
a.体液であるサンプルと本明細書に記載の抗体または結合フラグメントとを、抗体:可溶性αKlotho複合体を形成する条件下で接触させること、および
b.抗体:可溶性αKlotho複合体を検出すること
を含んでなる、方法。
[35]前記抗体:αKlotho複合体が、免疫沈降、免疫ブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学および蛍光活性化細胞選別(FACS)により検出される、上記[33]または[34]に記載のアッセイ。
[36]対象において慢性腎臓病(CKD)および急性腎障害(AKI)から選択される腎臓病態を診断するためまたは検出するためのスクリーニング方法であって、
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを、場合により、上記[1]〜[22]のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、あるいは、上記[33]もしくは[34]に記載のアッセイを用いて測定すること、
b.前記サンプルにおけるαKlothoレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの低下が、前記対象がCKDまたはAKIから選択される腎臓病態を有することを示す、方法。
[37]前記CKDが、早期CKD、場合により、ステージ1、ステージ2、ステージ3、ステージ4、ステージ5またはステージ6である、上記[36]に記載の方法。
[38]前記サンプルが、新鮮組織サンプル、凍結サンプル、および軽度固定サンプルなどの固定サンプルから選択される、上記[36]または[37]に記載の方法。
[39]αKlothoのレベルが、免疫沈降により決定される、上記[36]〜[38]のいずれか一項に記載の方法。
[40]AKI後の回復の予後を診断する方法であって、
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを決定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象がAKI後の回復のより高い見込みを有することを示す、方法。
[41]AKI後の長期合併症の予後を診断する方法であって、
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを決定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象が、AKI後の長期合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す、方法。
[42]CKDの進行速度の予後を診断する方法であって、
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを決定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象が のより高い見込みを有することを示す、方法。
[43]CKDにおける腎外合併症の予後を診断する方法であって、
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを決定すること、および
b.前記サンプルにおけるαKlothoのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象が、CKDに関連する腎外合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す、方法。
[44]上記[1]〜[22]のいずれかに記載の抗体および/またはその結合フラグメント、参照薬剤および場合によりその使用のための説明書を含んでなるキット。
以下の限定されない例は、本開示の例示である。
合成抗体ライブラリーをスクリーニングし、ヒトおよび齧歯類αKlothoに対して高い親和性を有する抗原結合フラグメント(Fab)を作製した。この新規な抗体sb106を、組換えタンパク質、培養細胞、ならびにヒトおよび齧歯類由来の体液および組織を用いて特性評価した。ヒトおよび齧歯類の血清および尿中のαKlothoレベルは正確に定量することができ、血清および尿の両方で、早期ヒトCKDではαKlothoが劇的に低下していることが実証される。sb106抗体は、Klothoのα型に特異的であり、現在市販されているαKlotho検出試薬に比べて、クリーンかつ特異的な様式で患者血清サンプルからαKlothoを上手く取り出すことが最初に知られたものである。細胞において、それはαKlothoを免疫沈降させ、それを免疫細胞化学により標識することができる。動物において、この抗体は血漿からαKlothoを免疫沈降させるのに十分である。体液から少量のαKlothoを検出するsb106抗体の能力は、それをαKlothoのレベルが異常な疾患の診断に有価な試薬とする。さらに、sb106抗体は、いずれかのFGF23介在シグナル伝達経路を含む生理学的および病理学的状態の研究で、研究試薬として有価である。この抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、および質量分析に基づく技術などの様々な技術を用いる、血清などのヒトおよび齧歯類サンプル中の可溶性αKlothoに特異的なアッセイで使用することができる。
二元αKlotho−FGFR1c複合体の作製
ヒトFGFR1cのリガンド結合ドメイン(D142〜R365)は大腸菌(E.coli)で発現させ、封入体からイン・ビトロで再折り畳みし、公開されている方法[72,73]によって精製した。マウスαKlothoの細胞外ドメイン(A35〜K982)は、C末端FLAGタグを用いてHEK293細胞で発現させ、αKlothoエクトドメインとFGFR1cリガンド結合ドメインの二元複合体を記載のように[9]作製した。
Sb106を合成ヒトFabファージディスプレーライブラリー(ライブラリーF)から単離した[74]。結合選択、ファージELISAおよびFabタンパク質の精製は記載のように行った[67,75,76]。簡単に述べれば、ライブラリーF由来のファージを、キャプチャーターゲットとしての96ウェルMaxisorp Immunoplate(Fisher Scientific、ネピアン、ON、カナダ)上での、αKlotho細胞外ドメインとFGFR1cリガンド−結合ドメインの二元複合体を用いた複数回のパンニングにより循環させた。5回の選択後、96ウェル形式で増殖させた個々のクローンからファージを生産し、特異的結合クローンを検出するためにファージELISAを行った。結合を示したクローンにシーケンシングを行った。競合的結合ELISAは、sb106−ファージを、ヒトαKlothoでコーティングしたELISAプレートに結合させる前に、可溶性ヒトαKlothoの連続希釈液とともにプレインキュベートすることによって(50〜0.0005nM×1時間)行った。sb106の重鎖可変ドメインおよび軽鎖ドメインをコードする遺伝子を、それぞれ軽鎖またはIgG1重鎖の生産向けに設計したベクターにクローニングし、sb106−IgGを293F細胞(Invivogen、サンディエゴ、CA. USA)から発現させた。FabおよびIgGタンパク質をAタンパク質アフィニティーカラム(GE Healthcare、ミシソーガ、ON、カナダ)でアフィニティー精製した。
FGFR1cリガンド結合ドメインとマウスαKlothoエクトドメインの二元複合体(αKlotho−FGFR1c複合体と呼称)は、公開されているプロトコール[9]によって作製した。N末端にヘキサヒスチジンタグを有する成熟型のヒトFGF23(Y25〜I251)を大腸菌で発現させ、公開されているプロトコール[73,74,77]により精製した。
リアルタイムタンパク質−タンパク質相互作用は、25℃、HBS−EPバッファー(10mM HEPES−NaOH、pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005%(v/v)ポリソルベート20)中で、2000表面プラズモン共鳴(SPR)分光計(Biacore AB/GE Healthcare)を用いて測定した。タンパク質をそれらの遊離アミノ基を介して研究グレードのCM5バイオセンサーチップ(Biacore AB/GE Healthcare)のカルボキシメチル(CM)デキストランに共有結合させた。タンパク質を50μl/分の流速でバイオセンサーチップに注入し、各タンパク質注入(180秒)の終了時にHBS−EP バッファー(50μl/分)をチップに流し、180秒間、解離をモニタリングした。タンパク質注入間には、10mM酢酸ナトリウム、pH4.5中、または10mMリン酸ナトリウム/カリウム、pH6.5中、2.0M NaClを注入してチップ表面を再生した。データはBiaEvaluationソフトウエアバージョン4.1(Biacore AB/GE Healthcare)で処理した。各タンパク質注入に関して、対照フローチャネルに対して記録された非特異的SPR応答をサンプルフローチャネルに対して記録された応答から差し引いた。
細胞株: 天然αKlotho発現を有する正常ラット腎臓(NRK)細胞(ATCC、マナサス、VA、USA)、およびベクター単独、全長膜貫通マウスαKlotho、C末端FLAGタグを有するマウスαKlothoの細胞外ドメイン、もしくは全長マウスβKlothoでトランスフェクトされたHEK293細胞[78]。細胞を37℃、95%空気、5%CO2雰囲気で培養し、10%ウシ胎仔血清、ペニシリン(100U/ml)、およびストレプトマイシン(100mg/ml)を添加した高グルコース(450mg/dl)DMEMで継代培養した。
HEK293細胞をベクターまたは示されたαKlothoプラスミドでトランスフェクトし、ポリリシンで前処理した12ウェルカバーガラスに播種し(1.8×105細胞/ml)、一晩増殖させた。これらの細胞を洗浄し(4℃ PBS×3)、3%パラホルムアルデヒドで固定し(4℃×10分)、洗浄し(氷冷PBS×3)、1%BSAでブロッキングし(PBS 44℃×10分)、sb106−Fab(1%BSA、PBS中、5ug/ml)とともにインキュベートし、洗浄し(PBS 4℃×5)、抗FLAG−Alexa488(Cell Signaling;1%BSAを含有するPBS中に1:400希釈;1時間;20℃)とともにインキュベートし、洗浄し(PBS;4℃×4)、次いで、1滴のアンチフェードをDAPI(Invitrogen)とともに含むスライドガラス上で反転させ、暗所、室温で乾燥させた。24時間後、これらのスライドを−20℃で保存した。画像はWaveFXスピニングディスク共焦顕微鏡で得た。
ELISAは、製造者(Immuno−Biological Laboratory、日本)により説明されている通りに実施した。IP−IBアッセイでは、一般に、50μlの血清または尿をKRHバッファー[25mM Hepes−NaOH(pH7.4)、120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2、1.3mM KH2PO4]で希釈して最終容量0.5mlとし、低結合性のシリコン処理済みチューブ中、4℃で一晩、2μgのsb106−Fabとともにインキュベートした。KRHバッファーで3回前洗浄した抗FLAG抗体(50%v/v)を結合させたセファロースビーズ(50μL)を加え、インキュベートした(4℃×2時間)、洗浄し(チューブ当たりKRH−500μl 3回;22℃)。免疫複合体を2×SDSサンプルローディングバッファー(50μl;100℃×3分;4℃×3分;回転)で溶出させ、SDS−PAGEで分画し、ニトロセルロース膜に転写し、抗KL1抗体(KM2076、1:4000または3.1mg/mL、1:10000希釈)および希釈剤(Dako#S3022、カーピンテリア、CA、USA)で一晩(4℃、ロッカー)ブロットした。膜を洗浄し(3回、0.1%Tweenを含むTris緩衝生理食塩水;TBS−T)、抗ラットIgG2A(LSBio cat#LS−C59051、5%ミルク/2%ヤギ血清/TBS−T中1:20000×1時間)に曝し、洗浄した(3回、TBS−T)。化学発光については、膜をSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity基質(Thermo Scientific、ロックフォード、IL、USA)で覆い、30〜90秒間露光した。130kDバンドをスキャンし、Adobe Photoshop CS4を用い、既知量のKlothoの内部対照サンプルと密度を比較した。
組換えαKlothoエクトドメインと線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)1cのリガンド結合ドメインとの複合体に対するファージディスプレー合成Fabライブラリーの複数回のバイオパンニングの後に、いくつかの結合ファージが同定された。クローンsb106(図1A)がさらなる特性評価のために選択された。ファージELISA(図1B)で、ヒトおよびマウスの両αKlothoと結合したsb106−ファージは交差種反応性を示し、αKlotho単独またはFGFR1cとの複合体のいずれかと結合したsb106−ファージは、そのエピトープが共受容体複合体形成により隠されていないことを示唆する。sb106−ファージは、FGFR1c単独、ニュートラアビジン(NAV)またはウシ血清アルブミン(BSA)とは結合しなかった。sb106は、ヒトαKlothoと1桁のナノモル範囲(IC50=1.7nM、図1C)の親和性で結合する。sb106−Fabはまた、バイオセンサーチップ上に固定化されている二元αKlotho−FGFR1c複合体とも高い親和性で結合し(図7A)、 FGF23とαKlothoとFGFR1cの間の三元複合体の形成を妨げない(図7B)。
sb106のユニークなCDR配列を用い(図1A)、Fabおよび全長IgGタンパク質の両方を生産した(例えば、Fabは細菌細胞で、IgGタンパク質は293F細胞で生産した)。sb106は、天然条件下でαKlothoに対して高い反応性を有した。変性条件下でのマウス、ラット、およびヒト腎臓組織に対する免疫ブロットシグナルは弱かったが、αKlothoを過剰発現するトランスジェニックマウス[79]からのサンプルでは、sb106−FabはαKlothoの全長細胞外ドメインに相当するバンドを検出した(図2A)。培養細胞では、sb106−Fabは、天然αKlothoを発現するNRK細胞からの溶解液を用いた変性条件下での免疫ブロットではαKlothoを検出することができなかったが、αKlothoでトランスフェクトされた細胞HEK293からの細胞溶解液では過剰発現した抗原を検出することができた(図2B)。新たに凍結された非固定ラット副甲状腺組織(およびαKlothoを発現することが知られる他の組織)を用いた免疫組織化学では、sb106−IgGはαKlothoを検出したが、同じ組織が固定した場合には陰性であり(図2C)、これはsb106が天然の折り畳みのFGFR1−αKlotho複合体と結合することを示唆する(図1B)。新たに固定した細胞を用いた免疫細胞化学染色では、αKlothoを異種的に過剰発現するHEK293細胞では鮮明な染色が見られたが、βKlothoを過剰発現する細胞ではそうではなかった(図2D)。これらの細胞を、ポリリシンで処理した12ウェルカバーガラスに1.8×105/mlで播種し、一晩増殖させた。細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、氷上で10分間固定し(3%パラホルムアルデヒド)、冷PBSで3回洗浄し、10分間ブロッキングした(冷PBS中1%BSA)。次に、細胞をsb106−Fab(PBS中1%BSA中、5μg/ml)とともに1時間インキュベートした。細胞を冷PBSで5回洗浄し(各2分)、次いで、抗FLAG−Alexa488(Fab軽鎖のC末端にFlagエピトープタグを含む)(PBS中1%BSAで1:400)とともに1時間、光から保護しながらインキュベートした。細胞を冷PBSで4回洗浄した(各5分)。その後、カバーガラスを、1滴の退色防止剤をDAPIとともに含むスライドガラス上で反転させた。画像はスピニングディスク共焦顕微鏡で得た。αKlothoを過剰発現する細胞でさえ、長期固定はsb106による染色を大幅に低下させるか、失わせた。これらのデータは、sb106は天然の折り畳みのヒト、ラット、およびマウスαKlothoと特異的に反応するが、変性したαKlothoタンパク質とは反応しないことを示す。
可溶性αKlothoを沈降させるsb106−Fabの能力を、連続免疫沈降−免疫ブロット(IP−IB)アッセイを用いて試験した。Sb106−Fabは、全細胞溶解液および馴化細胞培養培地、ならびにαKlotho過剰発現細胞からαKlothoを取り出した(図3A)。sb106−Fabの取り出しを、HEK293細胞においてC末端FLAGタグを有する可溶性αKlothoを用い、抗FLAG抗体の場合と比較した。sb106−Fabおよび抗FLAGは、正確に同じ電気泳動移動度を有するタンパク質を沈降させた。
IP−IB法がCKD患者の一施設データベースからの血清αKlothoレベルを確実に決定できるかどうかを試験した。アッセイの直線性ならびに外挿されるy切片を試験するために組換えヒトαKlothoを既知量で添加した。一定範囲の異なる濃度の組換えαKlothoを添加した正常健康ボランティアおよびステージ5のCKD患者由来の血清でIP−IBを実施した(図4A)。外因性αKlothoの漸増接種に伴いシグナルに段階的増強が見られた。CKD患者由来の血清も、外因性αKlothoの漸増に伴ってシグナルの増強を示したが、与えられたいずれの濃度のαKlothoでも、シグナル強度は正常血清より低かった。
αKlothoに関する利用可能な市販のアッセイには、それらの間に一貫した相関が無い[46、83]。あるELISAに基づく健常者とCKD患者の研究[58]では、相反する結果が得られている。正常およびCKDのαKlothoの絶対的レベルは、3桁半ばから後半のほとんどの読み取りで0.4[47]〜2000pg/mlを越える[41]までの範囲にあった[48、50、55、58〜60、83]。このアッセイに基づけば、αKlothoレベルは低い[48、52、54、57〜60]、糸球体濾過過速度(GFR)の低下と無関係[40、41、50、51、53]またはGFRの低下につれ増加とさえ[44、47]記載されている。同様に、αKlothoレベルは、年齢とともに変化しないまたは低下すると報告されている[42、53、58、59]。これはヒトαKlothoデータの解釈をほぼ不能とし、異なる施設から得られた集合データに価値が無いことになる。
さらなるCDR配列を表2に示す。相同突然変異が各アミノ酸位に導入され、これは、各位置に関して、元のアミノ酸が保持されているか、またはそのアミノ酸に最も近い「ホモログ」(例えば、保存的アミノ酸変異)が導入されたことを意味し、新たなFab−ファージライブラリーが構築された。選択は、この新たなライブラリーを用い、抗原としてKlotho−FGFR1c複合体を用いて行った。抗原に結合したクローンを単離し、配列を決定し、表2に示す。結合親和性はSb106と同等または良好であると予想される。
ヒト試験
右心カテーテル法を受けた9名のヒト対象(49.066.2歳)を本試験に登録した。右心カテーテル法の際に、副腎および腎臓下大静脈血液サンプルを採取し、すぐに4℃での遠心分離後に血清を分離し、その後の試験のために−80℃で保存した。血清αKlothoは、本明細書に記載の免疫沈降−免疫ブロットアッセイで決定した。簡単に述べれば、0.1mlの血清を合成抗αKlotho Fab(sb106)で免疫沈降させ、免疫複合体をLaemmliサンプルバッファーで溶出させ、KM2076抗体を用いて免疫ブロットを行った。130kDの移動度に基づきオートラジオグラム上の特異的シグナルをImageJプログラム(National Institutes of Health (NIH)、ベセズダ、メリーランド州)で定量した。
αKlotho低次形態(kl/kl)マウス、kl/klマウスおよびそれらの野生型(WT)同腹子をテキサス大学サウスウェスタン医学センターの動物試験センターで維持した。この時、総てのマウスが129 S1/SVlmJ(129 SV)バックグラウンドで、6〜8週齢である。正常なSprague−Dawley(SD)ラット(体重220〜250g)をCharles River Laboratories(ウェルミントン、MA)から購入した。αKlothoクリアランス試験では、ラットに両側腎摘出術(無腎ラット)または腎臓のマニュアルマニピュレーションを伴う開腹術(偽手術ラット)を施した。ラットまたはマウスに、組換えマウスαKlothoタンパク質(rMKl)(R&D Systems、ミネアポリス、MN)の標識された全細胞外ドメインを0.1mg/kg体重の用量で1回、静脈内または腹膜内注射した。セクレターゼが血液αKlothoを調節するかどうかを調べるため、塩酸ドキシサイクリン(Sigma−Aldrich、セントルイス、MO)、25mg/kg/日のα−セクレターゼ阻害剤および/または2.5mg/kg/日のβ−セクレターゼ阻害剤III(Calbiochem、ビルリカ、MA)を正常WTマウスに2日毎日、腹膜内注射し、血清および腎臓のαKlothoを測定するために48時間目に血液および腎臓を採取した。
ラットモノクローナル抗ヒトKlotho抗体KM20761,2を免疫ブロット法および免疫電子顕微鏡に用い、合成抗αKlotho抗体sb10663を血清Klothoの免疫沈降に用いた。
正常なMunich Wistarラット(体重220〜250g)をイナクチン(100mg/kg体重)で麻酔し、標識αKlothoのボーラス(a bonus of)を頚静脈から注入した(0.1mg/kg体重)。125I標識αKlothoまたは125I標識アルブミンの注射試験では、本発明らの公開済みの方法を用い、ボーマン嚢腔および近位尿細管のフリーフロー微小穿刺による液体収集を行った。簡単に述べると、左腎を露出させ、尿収集のために左尿管にカテーテルを留置した。近位尿細管はリサミングリーン色素注射の後にそれらの特徴的な構造により特定し、ガラスキャピラリーで穿刺した。較正済みの一定ボアガラスキャピラリーで液体量を測定した。液体の放射活性はシンチレーション計数により決定し、液体量に対して正規化した。示された時点で血液を眼窩後静脈叢から抜き取り、スポット尿を採取した。採取した尿および血清中の125I標識αKlothoまたは125I標識アルブミンをシンチレーション計数により定量した。種々の器官のホモジネートを作製し、器官ホモジネートの放射活性をシンチレーション計数により測定し、器官ホモジネート中のタンパク質に対して正規化した。器官切片(10mm)に対してオートラジオグラフィーを行った。
マウス組換えKlothoタンパク質(0.1mg/kg体重)をkl/klマウスに1回腹膜内注射し、注射24時間後にマウスを犠牲にした。腎臓を採取し、大動脈灌流を介して2.5%パラホルムアルデヒドで固定し、取り出し、4%パラホルムアルデヒド(4℃で4時間)で後固定した。超薄凍結組織切片の免疫金標識を記載のように行った21。腎皮質に2.3Mスクロースを一晩浸潤させ、液体窒素中で凍結させ、70〜80nm厚の切片とし(Ultramicrotome Reichert Ultracut E;Leica Microsystems、ウェツラー、ドイツ)、ホルムバールコーティングニッケルグリッドに取り付けた。これらの切片をKM2076抗体とともにインキュベートした後、金結合Aタンパク質(10nm金粒子、Sigma−Aldrich)とともに60分間インキュベーションを行った。酢酸ウラニルで染色した後、切片をJeol 1200 EX透過型電子顕微鏡(日本電子株式会社(Jeol Ltd.)、昭島、日本)で観察した。
循環αKlothoの生産および運用における腎臓の役割を調べた。正常ラット(直接穿刺による)および右心カテーテル法を受けたヒト対象の副腎および腎臓下静脈叢におけるαKlothoタンパク質の血清レベル。総ての患者がeGFR≧60ml/分/1.73m2であった。ラットおよびヒトの両血清サンプルで、大静脈αKlothoレベルに同等の腎臓下/副腎増加が見られた。血清αKlothoレベルを、周知の腎由来ホルモンである血清エリスロポエチンに対してプロットしたところ、血清エリスロポエチンは、腎臓下/副腎下大静脈から上昇し、血清クレアチニン(SCr)は低下していたが、αKlothoは増加していたことが判明し、これは腎臓が循環中にαKlothoを分泌することを示す。
Claims (21)
- αKlothoポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体および/またはその結合フラグメントであって、下記の相補性決定領域(CDR)の配列:
CDR−L1:QSVSSA(配列番号9)
CDR−L2:SAS(配列番号10)
CDR−L3:QQAGYSPIT(配列番号5)
CDR−H1:GFNISYYS(配列番号6)
CDR−H2:ISPSYGYT(配列番号7)および
CDR−H3:ARYYVYASHGWAGYGMDY(配列番号8)
を含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる、抗体および/またはその結合フラグメント。 - 競合的ELISAアッセイにより測定した場合に、抗体および/またはその結合フラグメントが、10nM以下の解離定数(KD )でαKlothoポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、請求項1に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- 競合的ELISAアッセイにより測定した場合に、抗体および/またはその結合フラグメントが、2nM以下の解離定数(K D )でαKlothoポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、請求項1に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- 前記軽鎖可変領域が配列番号11中の前記領域に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、重鎖可変領域が配列番号12の前記領域に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- 配列番号11中に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号12中に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含んでなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- 配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含んでなり、かつ、配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- 配列番号13または配列番号14に示される前記アイソタイプのアミノ酸配列を有する重鎖IgG1またはIgG4アイソタイプを含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- モノクローナル抗体、免疫グロブリン分子、Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、ジスルフィド結合scFv、一本鎖ドメイン抗体、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- Hisタグ、HAタグ、GSTタグおよびFLAGタグからなる群から選択される検出可能なタグで標識された、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメントとαKlothoとを含んでなる、抗体複合体。
- FGFR1cおよび/またはFGF23をさらに含んでなる、請求項10に記載の抗体複合体。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメントをコードする核酸。
- 請求項12の核酸を含んでなるベクター。
- 請求項12の核酸または請求項13に記載のベクターを含んでなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメントを産生する組換え細胞。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント、請求項12に記載の核酸、請求項13に記載のベクターまたは請求項14に記載の細胞を含んでなる組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメントを含んでなるイムノアッセイであって、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)である、イムノアッセイ。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のαKlothoポリペプチドのエピトープに対して特異的結合親和性を有する抗体および/またはその結合フラグメントを生産する方法であって、下記工程:
a.請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメントのアミノ酸配列をコードする核酸を宿主細胞内で発現させること、
b.前記抗体および/またはその結合フラグメントを生産するために前記宿主細胞を培養すること、および
c.前記抗体および/またはその結合フラグメントを前記宿主細胞から単離および精製すること
を含んでなる、方法。 - サンプル中のαKlothoポリペプチドのレベルを測定するためのアッセイであって、
a.サンプルと請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体とを、抗体:αKlotho複合体を形成する条件下で接触させること、および
b.抗体:αKlotho複合体を検出すること
を含んでなる、アッセイ。 - サンプルが血液もしくはその画分、尿および脳脊髄液からなる群から選択される体液である、請求項18に記載のアッセイ。
- 対象において慢性腎臓病(CKD)および急性腎障害(AKI)から選択される腎臓病態を診断するためまたは検出するためのスクリーニング方法であって、
a.対象由来のサンプルにおけるαKlothoのレベルを、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、あるいは、請求項18もしくは19に記載のアッセイを用いて測定すること、
b.前記サンプルにおけるαKlothoレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの低下が、前記対象がCKDまたはAKIから選択される腎臓病態を有することを示し、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象がAKI後の長期合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示し、
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象がCKDから回復する高い見込みを有することを示し、および/または
対照と比較した前記サンプルにおけるαKlothoのレベルの上昇が、前記対象がCKDに関連する腎外合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す、方法。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体および/またはその結合フラグメント、参照薬剤およびその使用のための説明書を含んでなるキット。
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