KR20230016212A - 항-cldn18.2 항체 및 이의 진단 용도 - Google Patents

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쉬에밍 치엔
신라이 야오
후안후안 구오
홍준 리
이 구
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Abstract

본 개시는 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 진단 용도를 제공한다.

Description

항-CLDN18.2 항체 및 이의 진단 용도
본 개시는 일반적으로 새로운 항-CLDN18.2 항체 및 이의 진단 용도에 관한 것이다.
Claudin-18 (CLDN18) 분자(젠뱅크 가입 번호: 스플라이스 변형체 1 (CLDN18A1 또는CLDN18.1): NP_057453, NM_016369, 스플라이스 변형체 2 (CLDN18A2 또는 CLDN18.2): NM_001002026, NP_001002026)는 분자량이 약 27.9/27.72kD인 통합 막횡단 단백질이다. CLDN18 단백질은 인접한 세포 사이의 막내 입자의 상호 연결된 가닥의 네트워크를 구성하는 상피와 내피의 밀착 연결부 내에 위치한다. CLDN18과 오클루딘은 밀착 연결부에서 가장 중요한 막횡단 단백질 성분이다. 그들의 강한 세포 간 접착 특성으로 인해 이러한 밀착 연결 단백질은 용질의 세포 간 수송을 방지하고 제어하기 위한 일차 장벽을 만들고, 또한 세포 극성을 유지하기 위해 막 지질 및 단백질의 측면 확산을 제한한다. 따라서 그들은 상피 조직 구조를 조직하는 데 결정적으로 관여한다.
표적치료 및 면역 요법이 지난 10년 동안 다양한 암의 전신 치료에 혁명을 일으켰지만, 진행성 및/또는 전이성 암의 관리는 여전히 큰 문제이다. 예를 들어, 위암, 췌장암, 담관암종 또는 폐암과 같은 진행성 위장암을 앓고있는 많은 환자들은 여전히 현재의 표준 치료로부터 혜택을 크게 누리지 못한다. 화학 요법은 아직도 대부분의 진행성 암 환자를 위한 주류 치료법으로 남아 있고 그들의 예후는 여전히 매우 열악하다. 광범위한 유형의 종양에서 CLDN18.2의 매우 제한된 발현 및 빈번한 자궁외 활성화를 감안할 때, CLDN18.2는 GC/GEC, 췌장암, 담관암종 및 폐암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 고형 종양을 발현하는 CLDN18.2 치료용 제제의 개발을 위한 치료 목표로서 고려된다.
CLDN18.2 발현을 갖는 환자의 스크리닝 및 선택을 가능하게 하기 위해, 높은 특이성 및 친화도를 갖는 IHC 검출 분석이 요구된다.
본 개시 전반에 걸쳐, 관사 "한", "하나" 및 "그/이"는 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 그 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 발명에서 사용된다. 예로서, "항체"는 하나의 항체 또는 하나 이상의 항체를 의미한다.
본 개시는 다른 것들 중에서도, CLDN18.1과 교차 반응하지 않고 CLDN18.2를 특이적으로 인식하는 새로운 항-CLDN18.2 항체를 제공한다. 본 개시는 이러한 항-CLDN18.2 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 예를 들어 진단 목적을 위한 이러한 항-CLDN18.2 항체의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 인간 CLDN18.1에 대한 교차 반응성이 없는 특성;
b) 면역조직화학적 분석(IHC)에 의해 측정된 위 상피 세포를 제외한 비암성 세포에 대한 교차 반응성이 없는 특성;
c) IHC에 의해 측정된 비암성 인간 폐 조직에 대한 교차 반응성이 없는 특성;
d) CLDN18.2-발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 선택적으로 CLDN18.2-발현 세포는 CLDN18.2가 변성되거나 그렇지 않으면 더 이상 그의 천연 입체 형태에 있지 않도록 전처리되는 특성;
e) 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정된 바와 같이 10nM 이하의 Kd 값에서, 또는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정된 바와 같이 20 ng/ml 이하의 EC50 값에서 인간 CLDN18.2의 첫번째 세포외 루프를 포함하는 융합 폴리펩티드에 결합할 수 있는 특성;
f) 유동 세포 분석기(FACS)에 의해 측정된 바와 같이 세포 표면 인간 CLDN 18.2에 대한 검출가능한 결합이 없음을 나타내는 특성;
g) ELISA에 의해 측정된 바와 같이 DQWSTQDLYN (서열 ID 번호:19)의 아미노산 서열 내의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 특성; 및/또는
h) ELISA에 의해 측정된 바와 같이 1nM의 항체 농도 또는 IHC에 의해 측정된 0.5ug/ml의 항체 농도에서 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플에서 인간 CLDN18.1에 대한 교차 반응성이 없는 특성 중 하나 이상을 나타낸다.
한 측면에서, 본 개시는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는
a) X 1 X 2 YX 3 H (서열 ID 번호:8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, WIYPX 4 GX 5 X 6 X 7 X 8 YX 9 EKFKG (서열 ID 번호:12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NYX 10 STFGY (서열 ID 번호:24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는
b) RSSQNIVHSNGNTYLE (서열 ID 번호:2)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, KX 11 SNRFS (서열 ID 번호:25)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 FQGSHVPFT (서열 ID 번호:6)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하고,
X1 은 R 또는 T, X2 는 N 또는 Y, X3 은 F 또는 I, X4 는 G 또는 R, X5 는 F 또는 G, X6 은 D 또는 N, X7 은 I 또는 T, X8 은 E 또는 V, X9 는 S 또는 N, X10 은 G 또는 R, X11 은 V 또는 I이다.
특정 실시예에서 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호가 1인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호가 3인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열ID번호가 5인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는
b) 서열ID번호 7을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 9를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열ID번호 11을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
b) 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 더 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열ID번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
b) 서열ID번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열ID번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열ID번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
b) 서열ID번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열ID번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 더 포함하면서도 인간 CLDN 18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고 선택적으로 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 보유한다.
특정 실시예에서 돌연변이 중 적어도 하나는 보존적 치환이거나, 또는 모든 돌연변이는 보존적 치환이다.
특정 실시예에서 돌연변이 중 적어도 하나는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR 서열 , 및/또는 하나 이상의 비-CDR 서열에 있다.
특정 실시예에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호 1또는 서열ID번호 7과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 서열 및/또는
b) 서열ID번호 3또는 서열ID번호 9와 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 서열 및/또는
c) 서열ID번호 5또는 서열ID번호 11과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 서열 및/또는
d) 서열ID번호 2와 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 서열 및/또는
e) 서열ID번호 4 또는 서열ID번호 10과 적어도 80% (예컨대　적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 서열 및/또는
f) 서열ID번호 6과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 서열을 포함하며,
그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고, 선택적으로 그의 모 항체와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시예에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 ID번호 1 또는 서열 ID 번호 7에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR1, 서열 ID번호 3 또는 서열 ID 번호 9에서 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR2, 서열 ID번호 5 또는 서열 ID 번호 11에서 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR3, 서열 ID 번호 2에서 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR1, 서열 ID 번호 4 또는 서열 ID 번호 10에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR2, 및/또는 서열 ID 번호 6에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR3을 포함하며, 그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고, 선택적으로 그의 모 항체와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시예에서 중쇄 가변 영역은 서열 ID 번호 13 또는 서열 ID 번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 서열 ID 번호 14 또는 서열 ID 번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 선택적으로 IgG의 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다. 특정 실시예에서 불변 영역은 마우스 불변 영역, 토끼 불변 영역, 인간 불변 영역 또는 임의의 다른 적합한 불변 영역을 포함한다.
특정 실시예에서 중쇄 불변 영역은 서열 ID 번호17의 아미노산 서열 또는 이의 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나 경쇄 불변 영역은 서열 ID 번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 표지된 항체, 이가 항체, 항이디오타입 항체, 융합 단백질, 이량체화 또는 중합된 항체, 또는 변형된 항체 (예를 들어, 글리코실화 항체)이다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (이가 디아바디), 다중특이적 항체, 카멜화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 또는 이가 도메인 항체이다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 모이어티에 연결된다. 특정 실시예에서 모이어티는 방사성 동위원소, 란타나이드, 화학발광 라벨, 발색 모이어티, 콜로이드 금 입자, 형광 라벨, 효소-기질 라벨, 디곡시게닌 라벨, 바이오틴/아비딘, 합텐, 검출을 위한 DNA 분자 또는 입자 라벨을 포함한다. 특정 실시예에서 모이어티는 바이오틴 또는 합텐을 포함한다.
다른 측면에서 본 개시는 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 CLDN18.2에 대한 결합에 대해 경쟁하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 측면에서 본 개시는 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다른 측면에서 본 개시는 본 발명에 제공된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 측면에서 본 개시는 본 발명에 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서 본 개시는 본 발명에 제공된 벡터가 발현되는 조건 하에서 본 발명에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서 본 개시는 인간 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계, 및 샘플 내의 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서 본 개시는 대상체에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 진단하는 방법을 제공하며, 이는
a) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계; 및
b) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 갖는 것으로 진단된다.
또 다른 측면에서 본 개시는 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료를 위한 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체의 적격성을 결정하는 방법을 제공하며, 이는
a) CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계;
b) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견되거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 적합한 것으로 결정되거나 또는
대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견되지 않거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 적합하지 않은 것으로 결정된다.
또 다른 측면에서 본 개시는 대상체에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 치료하는데 있어서 클라우딘18.2-표적제의 치료 유효성을 예측하는 방법을 제공하며, 이는
a) CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계;
b) 샘플에서 인간 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계;
c) CLDN18.2-표적제의 치료 유효성을 예측하는 단계를 포함하고,
CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 대상체를 치료하는데 효과적일 것으로 예측되거나 또는
클라우딘18.2-표적제는 CLDN18.2의 존재가 발견되지 않거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 대상체를 치료하는데 효과적이지 않을 것으로 예측된다.
또 다른 측면에서 본 개시는 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이는
a) i) CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계;
ii) 샘플에서 인간 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계;
iii) 샘플에서CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달했을 때 CLDN18.2 관련 질환 또는 병태의 치료에 적합한 것으로 대상체를 선택하는 단계를 포함하는 치료에 적합한 대상체를 선택하는 단계;
b) 치료학적 유효량의 CLDN18.2-표적제를 선택된 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서 본 개시는 암을 갖거나 암의 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이는
a) i) CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계;
ii) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계;
iii) 샘플에서 CLDN18.2의 존재가 발견되지 않을 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 CLDN18.2 관련 질환 또는 병태의 치료에 적합하지 않은 것으로 대상체를 선택하는 단계를 포함하는 대상체를 선택하는 단계; 및
b) 선택된 대상체에게 CLDN18.2-표적제 이외의 표준 치료 요법제를 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서 상기 샘플은 세포 샘플 또는 조직 샘플이다. 특정 실시예에서 상기 샘플은 고정된 조직 샘플, 선택적으로 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 조직 샘플이다. 특정 실시예에서 CLDN18.2는 세포 표면 또는 막-결합된 CLDN18.2이다.
특정 실시예에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준은 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 면역형광법(IF), 효소면역분석(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 면역블롯팅법에 의해 결정된다.
특정 실시예에서 발현 수준은 샘플에서 양성으로 염색된 세포의 백분율에 기초하여 정량화된다. 특정 실시예에서 발현 수준은 샘플에서 CLDN18.2에 대한 염색 강도에 기초하여 정량화된다.
특정 실시예에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태는 암이다. 특정 실시예에서 상기 샘플은 종양 샘플을 포함한다. 특정 실시예에서 상기 종양 샘플은 종양 조직 또는 순환 종양 세포를 포함한다. 특정 실시예에서 상기 암은 원발암 또는 전이성 암이다.
특정 실시예에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태는 암이다. 특정 실시예에서 상기 암은 원발암 또는 전이성 암이다. 특정 실시예에서 상기 암은 위암, 폐암(비-소세포폐암 또는 소세포폐암), 기관지암, 골암, 간담도암, 췌장암, 유방암, 간암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 두경부암, 척추암, 뇌암, 자궁경부암, 자궁암, 자궁내막암, 결장암, 대장암, 직장암, 항문암, 식도암, 위장암, 피부암, 전립선암, 뇌하수체암, 위암, 질암, 갑상선암, 교모세포종, 성상 세포종, 흑색종, 골수이형성증후군, 육종, 기형종, 담관암종 및/또는 선암종이다.
특정 실시예에서 상기 암은 위암, 췌장암, 담관암종 또는 폐암이다. 특정 실시예에서 상기 폐암은 비-소세포폐암 또는 소세포폐암 (NSCLC 또는 SCLC)이다.
특정 실시예에서 상기 CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2-발현 세포에 대한 세포 독성을 유도할 수 있다. 특정 실시예에서 상기 CLDN18.2-표적제는 치료적 항-CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2-결합 분자, CLDN18.2-표적 세포 요법, CLDN18.2를 표적하는 화학적 화합물, 또는 CLDN18.2를 표적하는 치료 핵산이다.
특정 실시예에서 상기 치료적 항-CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2-결합 분자는 세포독성제에 접합된다. 특정 실시예에서 상기 치료적 항-CLDN18.2 항체는 이중특이적 항체이다. 특정 실시예에서 상기 CLDN18.2-표적 세포 요법은 CLDN18.2 결합 키메라 항체 수용체(CAR)를 발현하는 CAR-T (키메라 항체 수용체 조작된 T 세포), TCR-T (유전자 변형 TCR T 세포) 또는 CAR-NK (키메라 항체 수용체 조작된 NK 세포)를 포함한다.
특정 실시예에서 상기 대상체는 항암 요법을 받고 있거나 받았거나, 또는 암 재발을 앓고 있다.
또 다른 측면에서 본 개시는 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
특정 실시예에서 상기 키트는 CLDN18.2에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 복합체를 검출하기 위한 시약 세트를 더 포함한다. 특정 실시예에서 상기 시약 세트는 항-마우스 항체를 포함한다.
도 1은 HEK293-hCLDN18.2 세포 및 HEK293-hCLDN18.1 세포에 결합하는 항-CLDN18.2 항체, 69H2F7E6 및 14G11G2D2의 FACS 분석을 보여준다. 항체 18B10D3G9F3 및 EPR19202가 양성 대조군으로 사용된다.
도 2는 HEK293, HEK293-CLDN18.1, HEK293-CLDN18.2 세포 차단 부분에서 스크리닝된 항체 69H2 및 14G11의 면역 세포 화학 (ICC) 염색을 보여준다. 항체 GC182의 염색을 대조군으로 사용하였다.
도 3은 hCLDN18.2 펩티드 (hCLDN18.2의 아미노산 잔기 28-37)에 결합하는 항-CLDN18.2 항체, 69H2F7E6, 14G11G2D2 및 GC182의 결합 프로파일 및 EC50을 도시한다.
도 4는 ELISA로 측정한 바와 같이, hCLDN18.2 (서열 ID번호: 26)의 ECL1 루프의 아미노산 서열을 포함하는 재조합된 hCLDN18.2 변형체 단백질에 결합하는 항-CLDN18.2 항체, 69H2F7E6, 14G11G2D2 및 GC182의 결합 분석표 및 EC50을 보여준다.
도 5는 ELISA로 측정한 바와 같이, hCLDN18.1 (서열 ID번호: 27)의 ECL1 루프의 아미노산 서열을 포함하는 재조합된 hCLDN18.1 변형체 단백질에 결합하는 항-CLDN18.2 항체, 69H2F7E6, 14G11G2D2 및 GC182의 결합 분석표 및 EC50을 보여준다.
도 6은 ForteBio에 의한 재조합된 hCLDN18.2 변형체 단백질을 사용한 항-CLDN18.2 항체, 69H2F7E6, 14G11G2D2, GC182의 결합 친화도 분석을 보여준다. KD, kon 및 koff가 표시된다.
도7A 및 7B는 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 정상적인 위, 폐, 장, 신장, 편도선, 갑상선, 유방 및 골격근 조직 단면에서 각각 선택된 항체14G11G2D2, 69H2F7E6 및 GC182의 면역조직화학(IHC) 분석을 보여준다. 화살표는 정상 폐 조직에서 GC182의 양성 염색을 나타낸다.
도 8은 위 및 골격근 상의 항-CLDN18.2 항체 14G11G2D2 및 EPR19202의 IHC 이미지를 보여준다. 상기 EPR19202는 위 조직과 골격근에서 양성으로 염색되었으며, 상기 14G11G2D2는 위 조직에서만 양성으로 염색되었다.
도 9는 위암, 췌장암, 담관암종 및 비-소세포 폐암 (NSCLC)의 다양한 조직에 대한 14G11G2D2 항체의 대표적인 IHC 이미지를 강한 (+++), 중도 (++), 약한 (+) 및 음성 (-) 염색 강도로 나타낸다.
도 10은 위 단면 상의 항체 14G11G2D2- 및 항체 접합체 14G11G2D2-바이오틴 사이의 IHC 염색 비교를 보여준다.
도 11은 본 출원의 모든 서열을 보여준다.
본 개시물에 대한 다음의 설명은 단지 본 개시물의 다양한 실시 예를 예시하기 위한 것이다. 이와 같이 논의된 특정 수정들은 본 개시물의 범위에 대한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 당업자에게 다양한 등가물, 변경 및 수정이 본 개시물의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음은 명백할 것이다. 또한 이러한 등가한 실시예들이 본 발명에 포함되어야 한다는 것이 이해된다. 공개, 특허 및 특허 출원을 포함하는 본 발명에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.
정의
본 발명에 사용된 바와 같이, 본 발명의 문맥에서 사용된 용어 "한", "하나", "그" 및 유사한 용어들은 (특히 청구항의 문맥에서) 본 명세서에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 특정 항원에 결합하는 임의의 면역 글로불린 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다가 항체, 이가 항체, 일가 항체, 다중특이적 항체, 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 천연 무손상 항체는 두 개의 중 (H) 쇄 및 두 개의 경 (L) 쇄를 포함한다. 포유류 중쇄는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 분류되고 각 중쇄는 가변 영역 (VH) 과 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 불변 영역으로 구성된다 (CH1, CH2, CH3, 각각); 포유류 경쇄는 λ 또는 κ 으로 분류되는 반면 각 경쇄는 가변 영역 (VL) 과 불변 영역으로 구성된다. 항체는 "Y" 형상을 가지며, Y의 줄기는 이황화물 결합을 통해 함께 결합된 두 개의 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역으로 구성된다. Y의 각각의 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 첫 번째 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역들은 항원 결합을 담당한다. 두 쇄의 가변 영역들은 일반적으로 상보성 결정 영역 (CDRs) 이라고 불리는 3개의 고 가변 루프를 함유한다 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 CDRs, 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 CDRs). 본 발명에 개시된 항체 및 항원 결합 도메인에 대한 CDR 경계는 카바트, IMGT, AbM, 초티아, 또는 알-라치카니의 관례에 의해 정의되거나　식별될 수 있다 (알-라치카니, B., 초티아, C., 레스크, A.M., J. 몰 비올, 273(4), 927 (1997); 초티아, C. 등., J. 몰 비올. 12월 5;186(3):651-63 (1985); 초티아, C.와 레스크, A.M., J. 몰 비올, 196,901 (1987); N.R.화이트레그 등, 단백질 공학, v13(12), 819-824 (2000); 초티아, C. 등, 자연. 12월 21-28;342(6252):877-83 (1989); 카바트 E.A. 등, 국립보건원, 베데스다, Md. (1991); 마리-폴 르프랑 등, 발달 및 비교 면역학, 27: 55-77 (2003); 마리-폴 르프랑 등, 면역학 연구, 1(3), (2005); 마리-폴 르프랑, B 세포의 분자 생물학 (재판), 26 장, 481-514, (2015)). 3 개의 CDRs은 프레임워크 영역(FRs)으로 알려진 플랭킹 스트레치 사이에 배치되며, 이는 CDRs 보다 더 잘 보존되고 초가변 루프를 지원하는 스캐폴드를 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 항원 결합에 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 부류에 할당된다. 항체의 5 개의 주요 부류 또는 이소타입은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤 중쇄의 존재를 특징으로 하는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이다. 수개의 주요 항체 부류는 하위부류, 예컨대 IgG1 (감마1 중쇄), IgG2 (감마2 중쇄), IgG3 (감마3 중쇄), IgG4 (감마4 중쇄), IgA1 (알파1 중쇄), 또는 IgA2 (알파2 중쇄)로 나뉘어진다. 본 개시물은 본 발명에 기재된 바와 같은 모든 항체 및 항체의 유도체를 포함하며, 이는 본 발명의 목적을 위해 용어 "항체"에 의해 포함된다. 용어 "항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 항체, 예를 들어, 항체 및 다른 제제의 접합체, 항체 단편, 또는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 하나 이상의 CDRs을 포함하는 항체의 단편으로부터 형성된 항체 단편, 또는 항원에 결합하지만 무손상 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 부분을 지칭한다. 항원 결합 단편의 예들은, 제한 없이, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (이가 디아바디), 다중특이적 항체 단편, 카멜화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 및 이가 도메인을 포함한다. 항원 결합 단편은 모 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 항원-결합 단편은 특정 항체로부터의 하나 이상의 CDRs을 포함할 수 있다.
항체와 관련하여 "Fab"는 이황화물 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 첫 번째 불변 영역에 결합된 단일 경쇄 (가변 및 불변 영역을 포함)로 구성된 항체의 일가 항원-결합 단편이다. Fab는 힌지 영역의 중쇄 사이의 이황화물 결합의 N-말단에 근접한 잔기에서 항체의 파파인 소화에 의해 수득될 수 있다.
"Fab"는 힌지 영역의 일부를 포함하는 Fab 단편이며 이는 힌지 영역의 중쇄 사이의 이황화물 결합의 C-말단에 근접한 잔기에서 항체의 파파인 소화에 의해 수득될 수 있다. 따라서 이는 힌지 영역 내의 소수의 잔기 (하나 이상의 시스테인 포함)에서 Fab와 상이하다.
"F(ab')2"는 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄의 일부를 포함하는 Fab'의 이량체이다.
항체와 관련하여 "Fc"는 이황화물 결합을 통해 제 2 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 영역에 결합된 제1 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 영역으로 구성된 항체의 부분을 지칭한다. IgG 및 IgM Fc 영역은 세 개의 중쇄 불변 영역 (각 쇄에서 제 2, 제 3 및 제 4 중쇄 불변 영역)을 함유한다. 이는 항체의 파파인 소화에 의해 수득될 수 있다. 항체의 Fc 부분은 ADCC, ADCP 및 CDC와 같은 다양한 이펙터 기능을 담당하지만 항원 결합에서는 기능하지 않는다.
항체와 관련하여 상기 "Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 지니는 항체의 가장 작은 단편을 지칭한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 영역에 결합된 단일 경쇄의 가변 영역으로 구성된다. "dsFv"는 단일 경쇄의 가변 영역과 단일 중쇄의 가변 영역 사이의 결합이 이황화물 결합인 이황화 안정화된 Fv 단편을 지칭한다.
상기 "단일쇄 Fv 항체" 또는 "scFv"는 서로 직접 연결되거나 펩티드 링커 서열을 통해 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 구성된 조작된 항체를 지칭한다 (휴스턴 JS 등. 미국국립 과학원회보, 85:5879(1988)). "scFv 이량체"는 링커를 갖는 두 개의 중쇄 가변 영역 및 두 개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 쇄를 지칭한다. 특정 실시예에서 "scFv 이량체"는 한 모이어티의 VH's가 다른 모이어티의 VL's과 배위되도록 다른 VH-VL 모이어티와 이량체화된 VH-VL (펩티드 링커에 의해 연결됨)을 포함하는 이가 디아바디 또는 이가 ScFv (BsFv)이고, 동일한 항원 (또는 에피토프) 또는 상이한 항원 (또는 에피토프)을 표적할 수 있는 두 개의 결합 부위를 형성한다. 다른 실시예에서 "scFv 이량체"는 VH1 및 VL1이 배위되도록 VL1-VH2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)와 연관된 VH1-VL2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 이중특이적 디아바디이고, VH2 및 VL2 좌표 및 각각의 배위된 쌍은 상이한 항원 특이성을 갖는다.
"단일쇄 Fv-Fc 항체" 또는 "scFv-Fc"는 항체의 Fc 영역에 연결된 scFv로 구성된 조작된 항체를 지칭한다.
"카멜화된 단일 도메인 항체", "중쇄 항체", "나노바디"또는 "HCAb"는 경쇄가 없는 두 개의 VH도메인을 포함하는 항체를 지칭한다 (리히만 L. 과 뮤일더맨스 S., 면역학적 방법의 저널, 12월 10일;231(1-2):25-38 (1999); 뮤일더맨스 S., 생명 공학 저널, 6월;74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 번호 6,005,079). 중쇄 항체는 원래 낙타과 (낙타, 단봉낙타, 및 라마)로부터 수득되었다. 경쇄가 없지만 카멜화된 항체는 진정한 항원 결합 레퍼토리를 가지고 있다 (해머스-캐스터먼 C.등, 자연, 6월 3일;363(6428):446-8 (1993); 응우옌 VK.등. "낙타과에서의 중쇄 항체; 진화적 혁신의 사례," 면역 유전학. 4월;54(1):39-47 (2002); 응우옌 VK.등. 면역학, 5월;109(1):93-101 (2003)). 중쇄 항체의 가변 도메인 (VHH 도메인)은 적응성 면역 반응에 의해 생성된 가장 작은 공지된 항원 결합 단위를 나타낸다 (코흐-놀테 F.등, 파세브 저널 11월;21(13):3490-8. 이퍼브, 2007년 6월 15일 (2007)).
"디아바디"는 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 포함하며, 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내의 VL 도메인에 연결된 VH도메인을 포함한다 (VH-VL 또는 VL-VH) (예를 들어, 홀리거 P.등, 미국국립 과학원회보, 7월 15일;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161 참조). 링커가 너무 짧기 때문에 동일한 쇄 상의 두 도메인은 짝을 이룰 수 없으며, 따라서 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 강제로 짝을 이루게 되고, 이로써 두 개의 항원 결합 부위가 생성된다. 항원-결합 부위는 동일한 또는 상이한 항원 (또는 에피토프)을 표적할 수 있다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 특정 실시예에서 둘 이상의 VH 도메인은 펩티드 링커와 공유적으로 접합되어 이가 또는 다가 도메인 항체를 형성한다. 이가 도메인 항체의 두 개의 VH 도메인은 동일하거나 상이한 항원을 표적할 수 있다.
"(dsFv)2"는 세 개의 펩티드 쇄를 포함하는 이황화-안정화된 Fv 단편을 지칭하며 두 개의 VH 모이어티는 펩티드 링커에 의해 연결되고 2개의 VL 모이어티에 대한 이황화물 브릿지에 의해 결합된다.
"이중특이적 ds 디아바디"는 두 개의 상이한 항원 (또는 에피토프)을 표적하는 디아바디를 지칭한다. VH1 및VL1사이의 이황화물 브릿지를 통해 VL1-VH2(펩티드 링커에 의해 연결됨)에 결합된 VH1-VL2(펩티드 링커에 의해 연결됨)를 포함할 수 있다.
"이중특이적 dsFv" 또는 "dsFv-dsFv"는 두 개의 상이한 항원 (또는 에피토프)을 표적하는 이황화-안정화된 Fv 단편을 지칭한다. 세 개의 펩티드 쇄: VH1-VH2 모이어티를 포함할 수 있으며 중쇄는 펩티드 링커 (예를 들어, 긴 유연한 링커)에 의해 결합되고 VL1 및 VL2 모이어티에 대한 이황화물 브릿지를 통해 각각 짝을 이룬다. 각각의 이황화물 짝을 이룬 중쇄와 경쇄는 상이한 항원 특이성을 갖는다.
본 발명에 사용된 용어 "인간화"는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 비인간 동물로부터 유래된 CDRs, 인간으로부터 유래된 FR 영역, 및 적용 가능한 경우, 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "키메라"는 한 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 일부, 및 다른 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다. 예시적인 예에서 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 마우스와 같은 비인간 종으로부터 유래된 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 "항-CLDN18.2 항체" 또는 "CLDN18.2에 대한 항체"는 CLDN18.2 (예를 들어, 인간 또는 비인간 CLDN18.2)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭하며, 예를 들어 진단 및/또는 치료적 용도를 제공하기에 충분한 친화도를 갖는다.
본 발명에 사용된 용어 "친화도"는 면역글로불린 분자 (예를 들어, 항체) 또는 이의 단편과 항원 사이의 비공유 상호작용의 강도를 지칭한다.
본 발명에 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "결합 특이성"은 두 분자 사이의 비-임의 결합 반응, 예를 들어 항체와 항원 사이의 비-임의 결합 반응을 지칭한다.
아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 관하여 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 참조 서열 내의 아미노산 (또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 (또는 핵산) 잔기의 백분율로 정의되며, 서열을 정렬하고, 필요하다면, 갭을 도입한 후에, 최대 상응성을 달성한다. 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성의 퍼센트를 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어, BLASTN, BLASTp와 같은 공개적으로 이용가능한 도구를 사용하여 달성될 수 있다 (미국 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI)의 웹 사이트에서 입수가능함, 알트슐 S.F.등, 분자 생물학 저널, 215:403-410 (1990) 참조; 스티븐 F.등, 핵산연구학술지, 25:3389-3402 (1997)), 클러스탈 W2 (유럽 생물 정보학 연구소의 웹 사이트에서 입수가능함, 히긴스 D.G.등, 효소학의 방법, 266:383-402 (1996) 참조; 라킨 M.A.등, 생물 정보학 (영국, 옥스퍼드), 23(21): 2947-8 (2007)), 및 얼라인 또는 메그얼라인 (DNASTAR) 소프트웨어. 당업자는 도구에 의해 제공되는 디폴트 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어, 적합한 알고리즘을 선택함으로써 정렬에 대해 적절하게 파라미터를 사용자 정의할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "아미노산"은 각 아미노산에 특이적인 측쇄와 함께 아민 (-NH2) 및 카르복실 (-COOH) 작용기를 함유하는 유기 화합물을 지칭한다. 아미노산의 명칭은 또한 본 개시에서 표준 단일 문자 또는 세 글자 코드로서 표현되며, 이는 다음과 같이 요약된다.
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아미노산 서열과 관련된 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 소수성 측쇄(예를 들어 Met, Ala, Val, Leu 및 Ile)를 갖는 아미노산 잔기 중, 중성 친수성 측쇄(예를 들어 Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln)를 갖는 잔기 중, 산성 측쇄(예를 들어 Asp, Glu)를 갖는 잔기 중, 염기성 측쇄(예를 들어 His, Lys 및 Arg)를 갖는 아미노산 중, 또는 방향족 측쇄(예를 들어 Trp, Tyr 및 Phe)를 갖는 잔기 중에서 보존적 치환이 이루어질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 보존적 치환은 일반적으로 단백질 입체 구조에 중요한 변화를 야기하지 않으며, 따라서 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수 있었다.
"단리된" 물질은 자연상태에서 사람의 손에 의해 변화되었다. "단리된" 조성물 또는 물질이 자연에서 발생하는 경우, 원래 환경에서 변경되었거나 제거되었거나 변경되었고 제거되었다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 실질적으로 순수한 상태로 존재하도록 이의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 충분히 분리되었다면 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "단리"된다. 단리된 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되며 단리된 핵산 분자의 서열을 지칭한다. 특정 실시예에서 "단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 전기영동 방법 (예를 들어 SDS-PAGE, 등전점전기영동, 모세관 전기영동), 또는 크로마토그래피 방법 (예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 순도를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다.
용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트 및 기니아 피그), 고양이, 토끼, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함한다. 더욱 바람직한 실시예에서, 대상체는 인간이다. 언급되는 경우를 제외하고, 용어 "환자", "대상체" 및 "개인"은 본 발명에서 상호교환가능하게 사용된다.
본 발명에 사용된 "이펙터 기능"은 C1 복합체 및 Fc 수용체와 같은 이의 이펙터에 대한 항체의 Fc 영역의 결합에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 예시적인 이펙터 기능은 C1 복합체 상의 항체와 C1q의 상호작용에 의해 유도된 보체 의존 세포독성 (CDC); 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 Fc 영역의 결합에 의해 유도된 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC); 및 항체 의존 세포매개 식균작용 (ADCP)을 포함하며, 여기서 FcγRs를 발현하는 비특이적 세포독성 세포는 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 작용을 일으킨다. 이펙터 기능은 항원의 결합 후에 작동하는 것과 항원 결합과 독립적으로 작동하는 것을 모두 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 병태의 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료법"은 병태를 예방 또는 완화시키고, 병태의 발병 또는 발전 속도를 늦추고, 병태를 발병시킬 위험을 감소시키고, 병태와 관련된 증상의 발전을 예방 또는 지연시키고, 병태와 관련된 증상을 감소 또는 종료시키고, 병태의 완전한 또는 부분적 퇴행을 발생시키는 것을 포함하고, 병태 치유, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
"위험에 처함"이란 일반 인구에 비해 질병, 특히 암을 발병시킬 확률이 정상보다 높은 것으로 확인되는 대상체, 즉 환자를 의미한다. 또한, 질환, 특히 암을 앓고 있거나 현재 가지고 있는 대상체는 질병을 발병할 위험이 증가된 대상체이며, 이와 같은 대상체는 질병을 계속 발병시킬 수 있다. 현재 암을 앓고 있거나 암에 걸린 대상체도 암 전이에 대한 증가된 위험을 갖는다. 본 발명의 문맥에서, "보호하다", "예방하다", "예방적"과 같은 용어는 대상체에서 질병의 발생 및/또는 전파의 예방 또는 치료 또는 둘 다에 관한 것이며, 특히 대상체가 질병을 발병하거나 질병의 발전을 지연시킬 기회를 최소화하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 위에서 설명한 바와 같이 종양의 위험에 처한 사람은 종양을 예방하기 위한 치료법의 후보자가 될 것이다. 면역요법은 임의의 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있으며, 여기서 작용제는 환자로부터 항원 발현 세포를 제거하기 위한 기능을 갖는다.
본 발명에 기재된 "표준치료" 치료제는 환자에게 표준 치료요법제의 투여를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "표준치료 요법"는 특정 유형의 환자, 질병 또는 임상 상황에 대해 적절하고, 수용되고, 및/또는 널리 사용되는 의사에 의해 인식되는 약물 또는 약물의 조합, 방사선 요법 (RT), 수술 또는 다른 의학적 개입을 포함하는 치료 과정이다. 상이한 유형의 암에 대한 표준 치료 요법은 당업자에 의해 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 내 21개 주요 암 센터의 연합체인 미국종합암네트워크(NCCN)는 종양학의 NCCN 임상 실습 지침 (NCCN 지침®)을 발표하여 여기서 다양한 암에 대한 표준 치료 에 대한 자세한 최신 정보를 제공한다 (NCCN 지침®, 2013 참조).
치료와 관련하여 용어 "유효한" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 상기 약리학적 유효성은 환자에서 암 퇴행을 촉진하는 약물의 능력을 지칭한다. 상기 생리학적 안전성은 약물의 투여로 인한 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성 또는 다른 역생리학적 효과(역효과)의 수준을 지칭한다.
본 개시의 항체와 같은 약물 또는 치료제의 "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 투여량"은, 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 사용될 때, 질환 또는 병태의 발병으로부터 대상체를 보호하거나, 질환/병태 증상의 중증도의 감소, 무질환/병태 증상 기간의 빈도의 증가에 의해 입증되는 질환/병태 퇴행, 또는 질병/병태 고통으로 인한 장애 또는 장애의 예방을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 질병 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 동물 모델 시스템에서 인간에서의 효능을 예측하는 방법과 같은 다양한 공지된 방법을 사용하거나, 또는 시험관내 분석에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다. 약물의 치료적 유효량은 "예방적 유효량"을 포함하며, 이는CLDN18.2-관련 질환 또는 병태가 발생할 위험, 예를 들어 암(예를 들어, 악성 전단계 질환이 있는 환자) 또는 질환/병태 재발을 앓고 있는 대상체에게 약물을 단독으로 또는 항신생물제와 함께 투여될 때, 질병/병태의 발전 또는 재발을 억제하는 임의의 양의 약물이다. 바람직한 실시예에서 예방적 유효량은 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태 (예를 들어, 암)의 발전 또는 재발을 완전히 방지한다. 질환/병태(예: 암)의 발전 또는 재발을 "억제"한다는 것은 질환/병태의 발전 또는 재발의 가능성을 줄이거나 질환/병태의 발전 또는 재발을 완전히 방지하는 것을 의미한다.
본 발명에 사용되는 용어 "벡터"는 유전자 요소에 의해 코딩된 단백질, RNA 또는 DNA를 생성하거나 유전 요소를 복제하는 등 유전 요소의 발현을 유발하기 위해 유전자 요소를 조작적으로 삽입하는 비히클을 의미한다.
본 발명에 사용된 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.
용어 "CLDN18"은 클라우딘 18을 지칭하고, CLDN18의 CLDN18.1 및 CLDN18.2와 같은 임의의 스플라이스 변형체를 포함한다. CLDN18.1 및 CLDN18.2는 제1 막횡단(TM) 영역과 루프 1을 포함하는 N-말단 부분에서 차이가 있는 반면, C-말단의 일차 단백질 서열은 동일하다.
용어 "CLDN18.2"는 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스)로부터 유래된 클라우딘-18 스플라이스 변형체 2를 지칭한다. 특정 실시예에서, CLDN18.2는 인간 CLDN18.2이다. 인간 CLDN18.2의 예시적인 서열은 인간 CLDN18.2 단백질을 포함한다 (NCBI 참고 서열 번호: NP_001002026.1, 또는 서열 ID 번호: 20). CLDN18.2의 예시적인 서열은 뮤스 근육(마우스) CLDN18.2 단백질(NCBI 참고 서열 번호: NP_001181852.1), 마필리핀원숭이 (게잡이마카크) CLDN18.2 단백질(NCBI 참고 서열 번호: XP_015300615.1)을 포함한다.
용어 "CLDN18.1"는 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스)로부터 유래된 클라우딘-18 스플라이스 변형체 1을 지칭한다. 특정 실시예에서, CLDN18.1는 인간 CLDN18.1이다. CLDN18.1의 예시적인 서열은 인간 CLDN18.1 단백질(NCBI 참고 서열 번호: NP_057453.1 또는 서열 번호: 21), 뮤스 근육 (마우스) CLDN18.2 단백질 (NCBI 참고 서열 번호: NP_001181851.1), 마필리핀원숭이 (게잡이마카크) CLDN18.2 단백질(NCBI 참고 서열 번호: XP_005545920.1)을 포함한다.
용어 "CLDN18.2" 및 "CLDN18.2"는 예시적인 서열의 변형체, 예컨대 돌연변이체, 입체 변형체, 이소폼, 대립유전자 변형체, 종 변형체 및 종 동족체, 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포괄한다.
본 발명에 사용된 "CLDN18.2-관련 질환 또는 병태"는 CLDN18.2의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소에 의해 유발되거나, 악화되거나, 또는 달리 연결된 임의의 질환 또는 병태를 지칭한다. 일부 실시예에서 CLDN18.2 관련 병태는 예를 들어 암이다.
본 발명에 사용된 "암"은 악성 세포 성장 또는 신생물, 비정상적 증식, 침윤 또는 전이를 특징으로 하는 임의의 의학적 병태를 의미하며, 백혈병과 같은 고형 종양 및 비고형암(예를 들어, 혈액학적 악성종양)을 모두 포함한다.
본 발명에 사용된 "고형 종양"은 신생물성 및/또는 악성 세포의 고형 매스를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들), 및/또는 염이 일반적으로 제형을 포함하는 다른 성분과 화학적 및/또는 물리적으로 양립가능하고, 이의 수용자와 생리학적으로 양립가능하다는 것을 나타낸다.
본 발명에 사용된 용어 "전이" 또는 "전이성 암"은 암 세포가 그의 원래 부위로부터 신체의 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발성 종양에서 악성 세포의 분리, 세포 외 매트릭스의 침윤, 체강 및 혈관으로 들어가는 내피 기저막의 침투, 그리고 혈액에 의해 수송된 후 표적 기관의 침윤에 달려 있다. 마지막으로, 표적 부위에서 새로운 종양, 즉, 이차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 전이는 종종 원발성 종양의 제거 후에도 발생하는데, 이는 종양 세포 또는 성분이 남아있고 전이성 전위를 발전시킬 수 있기 때문이다. 한 실시예에서, 본 발명에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어져 있는 전이에 관한 "원거리 전이"에 관한 것이다. 이차 또는 전이성 종양의 세포는 원래 종양에 있는 세포와 같다. 이것은 예를 들어, 위암이 간으로 전이되는 경우, 이차 종양은 비정상적인 간 세포가 아닌 비정상적인 위 세포로 구성된다. 간 종양은 간암이 아닌 전이성 위암이라고한다.
본 발명에서 값 또는 파라미터에 대한 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 지시되는 실시예들을 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 일반적으로 말해서, 용어 "약"은 지시된 값(예를 들어, 평균에 대한 95% 신뢰 구간 내)의 실험 오차 내에 있거나 지시된 값의 10% 이내 중 더 큰 값 내에 있는 변수의 지시된 값 및 변수의 모든 값을 지칭한다. 용어 "약"이 기간 (년, 월, 주, 일 등)의 문맥 내에서 사용되는 경우, 용어 "약"은 해당 기간 동안 다음 종속 기간의 양을 더하거나 빼거나(예를 들어, 약 1년은 11-13개월, 약 6 개월은 6 개월 플러스 또는 마이너스 1 주, 약 1 주일은 6-8 일을 의미함 등) 표시된 값의 10 % 이내 중 더 큰 기간을 의미한다.
항-CLDN18.2 항체
본 개시는 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
CLDN18.2는 클라우딘-18(CLDN18)의 스플라이스 변형체이다. CLDN18은 테트라스파닌 패밀리의 구성원이며 4개의 소수성 영역을 갖는다. CLDN18은 항체에 의해 선택적으로 다루어질 수 있는 몇 가지 상이한 입체형태들을 표시한다 (사힌 U 등 임상암연구, 2008, 14(23): 7624-7634 참조). CLDN18-입체형태-1은 막횡단 도메인(TM)으로서 작용하는 4개의 소수성 영역 모두를 가지며, 2개의 세포외 루프 (소수성 영역 1 및 소수성 영역 2에 의해 포괄되는 loop1; 소수성 영역 3 및 4에 의해 포괄된 loop2)가 CLDN 패밀리 구성원의 대다수에 대해 기재된 바와 같이 형성된다. 제2 입체형태(CLDN18-입체형태-2)는 PMP22에 대해 기술된 바와 같이, 제2 및 제3소수성 도메인이 원형질 막을 완전히 가로지르지 않아 제 1과 제 4 막횡단 도메인 사이의 부분(루프 D3)이 세포외가 된다는 것을 암시한다. 제3 입체형태(CLDN18-입체형태-3)는 제 1과 제 4 소수성 영역에 의해 포괄되는 두 개의 내부 소수성 영역을 갖는 큰 세포외 도메인을 나타낸다. 루프 D3 내의 고전적인 N-글리코실화 부위 때문에, CLDN18 토폴로지-2 및 CLDN18 토폴로지-3인 CLDN-18 토폴로지 변형체는 추가적인 세포외 N-글리코실화 부위를 보유한다.
CLDN18은 마우스와 인간 둘 다에 존재하는 두 개의 상이한 스플라이스 변형체를 갖는다. 스플라이스 변형체 CLDN18.1 및 CLDN18.2는 제1 TM 및 루프1을 포함하는 N-말단의 처음 21개 아미노산에서 차이가 있는 반면, C-말단의 단백질 서열은 동일하다. 이 두 이소폼은 아미노산 서열에서 92% 동일성을 공유하지만, 이들의 발현 패턴은 CLDN18.1이 정상 폐에서 우세하게 발현되고 CLDN18.2가 정상 위 조직에서 우세하게 발현되는 상호 배타적이다 (니미 T, 등 분자 및 세포 생물학, 2001, 21(21): 7380-7390 참조). 인간 CLDN18.1 및 CLDN18.2에 대한 아미노산 서열은 각각 하기에 나타내었다.
인간 클라우딘18.2 (가입 번호: NP_001002026.1) 아미노산 서열(서열 ID 번호:20):
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV
인간 클라우딘18.1 (가입 번호: NP_057453.1) 아미노산 서열(서열 ID 번호:21):
MSTTTCQVVAFLLSILGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTSVFQYEGLWRSCVRQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV
정상 조직에서, CLDN18.2의 발현은 점막 세포의 기저막으로 제한되고 치료 항체에 접근할 수 없다. 병적 상태(예: 종양 세포)에서 위 점막 세포의 극성이 교란되고 CLDN18.2가 세포 표면에 노출된다. CLDN18.2 단백질은 인간 암 세포주뿐만 아니라 위, 식도, 췌장 및 폐 종양을 포함한 여러 인간 암 유형의 원발성 병변 및 전이에서 발현되는 범암 표적이다 (사힌 우구르 등, 임상암연구 2008;14(23); 마쓰다 Y 등. 암 과학, 2007, 98(7): 1014-1019 참조). CLDN18.2의 비정상적인 이소성 발현은 또한 여러 연구에서 췌장, 난소, 담즙 및 폐 선암종에서 보고되었다 (예를 들어 카란자발라 ZE 등, 외과 병리학의 미국 저널. 2008년 2월;32(2):188-96; 미케 P 등, 국제 암 저널, 2014년 11월 1일;135(9):2206-14; 키이라 Y 등, 버초스 문헌, 2015년 3월;466(3):265-77; 코아티 등, 영국 암 저널, 2019년 7월;121(3):257-263; 도터무쉬 등, 버초스 문헌, 2019년 11월;475(5):563-571; 로데 등, 일본 임상암학회지, 2019년 9월 1일;49(9):870-876; 울 등, 국제 암 저널, 2014년 2월 1일;134(3):731-9; 에스피노자 등, 조직병리학, 2019년 3월;74(4):597-607; 시노자키 등, 버초스 문헌, 2011년 7월;459(1):73-80 참조).
한 측면에서 본 개시는 모노클로날 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명에 제공된 모노클로날 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 CLDN18.2 (예를 들어, 인간 CLDN18.2), CLDN18.2의 단편, 또는 CLDN18.2의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시예에서 CLDN18.2의 단편은 인간 CLDN18.2의 제1 세포외 루프, 또는 인간 CLDN18.2의 제1 세포외 루프 내의 서열을 포함한다. 특정 실시예에서 인간 CLDN18.2의 단편은 서열 ID 번호 26 또는 서열 ID 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서 융합 폴리펩티드는 CLDN18.2의 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 부착된 추가의 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시예에서 융합 폴리펩티드에 포함된 CLDN18.2의 단편은 루프를 형성한다.
본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 항원 결합 단편은 CLDN18.2-발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시예에서 CLDN18.2-발현 세포는 전처리된 세포이다. 세포에 대하여 본 발명에 사용된 용어 "전처리된"은 CLDN18.2와 같은 그의 표면 단백질이 변성되거나 그렇지 않으면 더 이상 그의 천연 입체형태에 있지 않도록 세포가 처리되었음을 의미한다. 예를 들어, CLDN18.2-발현 세포는 하나 이상의 화학 물질, 예를 들어 포르말린, 파라핀 또는 아세톤에 의해 또는 동결 또는 가열과 같은 물리적 개입에 의해 전처리될 수 있다. 특정 실시예에서 CLDN18.2-발현 세포는 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 세포이다.
항원에 대한 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 항원 결합 단편의 결합은 "반최대 유효 농도" (EC50) 값으로 나타낼 수 있으며, 이는 그의 최대 효과(예를 들어, 결합)의 50%가 관찰되는 항체의 농도를 지칭한다. EC50 값은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 샌드위치 측정법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 및 다른 결합 검정법에 의해 측정될 수 있다. EC50은 항체의 연속 희석이 항원에 대한 결합에 대해 테스트되고 최대 결합의 50%가 결정되는 농도에서 적절한 결합 검정으로 측정될 수 있다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CLDN18.2, 인간 CLDN18.2의 단편, 인간 CLDN18.2의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 인간 CLDN18.2-발현 세포 또는 전처리된 인간 CLDN18.2-발현 세포에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 50 ng/ml 이하(예: 40 ng/ml이하, 35 ng/ml이하, 30 ng/ml이하, 20 ng/ml이하, 18 ng/ml이하, 16 ng/ml이하, 15 ng/ml이하, 14 ng/ml이하, 13 ng/ml이하, 12 ng/ml이하)의 EC50에서 인간 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프를 포함하는 융합 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편의 인간 CLDN18.2에 대한 결합 친화도는 또한 예를 들어 K에 의해 특성화될 수 있으며, 이는 결합 속도에 대한 해리 속도의 비를 지칭한다(koff/kon). KD는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법, 마이크로스케일 열영동 방법, 및 HPLC-MS 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 임의의 종래의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SPR에 의해 측정되는 바와 같이, 10-6 M(예: 10-7 M, 10-7.5 M, 10-8 M, 또는 10-8.5 M이하) 이하의 KD에서 인간 CLDN18.2의 제1 세포외 루프를 포함하는 융합 폴리펩티드에 결합한다. KD 값이 낮을수록 친화도가 높아진다.
특정 실시예에서 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간 CLDN18.1과 교차 반응하지 않는다. 인간 CLDN18.1과 "교차 반응하지 않는" 또는 "교차 반응성이 없는" 항-CLDN18.2 항체는 인간 CLDN18.2에 대한 검출 검정 (예를 들어, IHC 분석)에서 위양성과 같은 바람직하지 않은 결과를 생성하지 않는 항체이다. 특정 실시예에서 인간 CLDN18.1에 대한 결합은 검출 분석 (예를 들어, IHC 분석, 또는 유세포 분석법)에서 검출가능하지 않다. 결합의 수준은 항체의 주어진 농도 및 항원의 주어진 농도에서 형성되는 항원-항체 복합체의 수준으로서 결정될 수 있다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간 CLDN18.1에 대한 항체 GC182의 결합보다 낮은(예: 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 낮은) 수준 또는 친화도로 인간 CLDN18.1에 결합한다.
특정 실시예에서 인간 CLDN18.1 발현 세포의 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.8%, 0.5%, 0.3% 또는 0.1% 이하가 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편에 의해 IHC 분석에서 양성으로 검출된다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 IHC 분석에서 인간 CLDN18.1에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 IHC 분석에서 비암성 인간 폐 조직 샘플에서 인간 CLDN18.1에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 1nM의 항체 농도 또는 IHC에 의해 측정된 바와 같이 0.5ug/ml의 항체 농도에서 포르말린-고정된 파라핀 포매(FFPE) 샘플에서 인간 CLDN18.1에 대한 교차 반응성을 갖지 않는다. IHC는 실시예 8 또는 9에 요약된 바와 같은 절차 및 조건에 따라 수행될 수 있다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 위 상피 세포를 제외한 비암성 세포에 대한 교차 반응성을 갖지 않는다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 폐 조직, 장 조직, 신장 조직, 편도선 조직, 갑상선 조직, 골격근 조직, 또는 유방 조직과 같은 비암성 인간 조직에 대해 교차 반응성을 갖지 않는다. 이는 본 발명에 제공된 항체를 기존의 모노클로날 항-CLDN18.2 항체와 구별한다. 예를 들어, 항체 43-14A는 인간 CLDN18.1에 결합해서 비암성 인간 폐 조직과의 교차 반응성을 나타내는 것으로 나타났고, 벤타나의 지시의 IHC 결과를 참조한다 (벤타나 CLDN18(43-14A) 분석, 참조 790-7027, 08504148001). 또 다른 예로, 항체 GC182는 또한 CLDN18.1과 교차 반응하고, 따라서 비암성 인간 폐 조직을 염색하는 것으로 밝혀졌다 (본 개시의 실시예 4 및 도 2 참조). 또 다른 예로, 항-CLDN18.2 항체 EPR19202 (제품명 ab222512로 Abcam으로부터 입수가능함)는 골격근 조직에 비특이적으로 결합하는 것으로 나타났으며, 따라서 비암성 골격근 조직과의 교차 반응성을 나타낸다.
예시적인 항-CLDN18.2 항체
특정 실시예에서 본 개시는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 인간 CLDN18.2)을 제공하며, 이는
a) X 1 X 2 YX 3 H의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (서열 ID 번호:8), WIYPX 4 GX 5 X 6 X 7 X 8 YX 9 EKFKG의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (서열 ID 번호:12), 및/또는 NYX 10 STFGY의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (서열 ID 번호:24); 및/또는
b) RSSQNIVHSNGNTYLE 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (서열 ID 번호:2), KX 11 SNRFS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (서열 ID 번호:25), 및/또는 FQGSHVPFT 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (서열 ID 번호:6)을 포함하며;
X1 은 R 또는 T, X2 는 N 또는 Y, X3 은 F 또는 I, X4 는 G 또는 R, X5 는 F 또는 G, X6 은 D 또는 N, X7 은 I 또는 T, X8 은 E 또는 V, X9 는 S 또는 N, X10 은 G 또는 R, X11 은 V 또는 I이다.
특정 실시예에서 본 개시는 CLDN18.2 (예를 들어, 인간 CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는 서열 ID 번호 1 내지 6으로 이루어진 서열의 세트로부터 선택되거나 서열 ID 번호 2, 6, 7 및 9-11으로 이루어진 서열의 세트로부터 선택된 CDRs중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원-결합 단편은 서열 ID 번호 5 또는 11의 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 중쇄 CDR3 영역은 항원-결합 부위의 중심에 위치하며, 따라서 항원과 가장 많이 접촉하고 항원에 대한 항체의 친화도에 가장 많은 자유 에너지를 제공하는 것으로 여겨진다. 또한, 중쇄 CDR3은 다중 다양화 메카니즘에 의한 길이, 아미노산 조성 및 입체 형태 측면에서 항원 결합 부위의 가장 다양한 CDR인 것으로 여겨진다 (도네가와 S. 자연. 302:575-81 (1983)). 중쇄 CDR3의 다양성은 대부분의 항체 특이성 (서 JL, 데이비스 MM, 면역력, 13:37-45 (2000))뿐만 아니라 바람직한 항원 결합 친화도를 생성하기에 충분하다 (쉬에 R, 등, 분자 생물학 저널, 263:551-67 (1996)).
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원-결합 단편은 서열ID번호 1 및 서열ID번호 7로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 서열ID번호 3 및 서열ID번호 9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열ID번호 5 및 서열ID번호 11로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열ID번호 2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열ID번호 4 및 서열ID번호 10으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 서열ID번호 6으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 CLDN18.2 (예를 들어, 인간 CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며 이는,
a) 서열ID번호가 1인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호가 3인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열ID번호가 5인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는
b) 서열ID번호 7을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 9를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열ID번호 11을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
b) 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열ID번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
b) 서열ID번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열ID번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
CDRs은 항원 결합을 담당하는 것으로 알려져 있지만, 6개의 CDR 모두가 반드시 필수 불가결하거나 변경할 수 없는 것은 아니라는 것이 밝혀졌다. 즉, 상기 제공된 1, 2, 또는 3개의 CDRs을 대체하거나 변경하거나 수정할 수 있고 (예를 들어, 서열ID번호 1 내지 6, 또는 서열ID번호 2, 6, 7 및 9-11 중 어느 하나에 상응함), CLDN18.2에 대한 특이적 결합 친화도를 실질적으로 보유할 수 있다. 이러한 변형된 또는 변형체 CDRs을 갖는 항체도 본 개시에 포함된다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열ID번호13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열ID번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
b) 서열ID번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열ID번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 사용된 항체 "14G11"은 서열 ID 번호: 13의 중쇄 가변 영역, 및 서열 ID 번호 14의 경쇄 가변 영역을 갖는 마우스 항체를 지칭한다.
본 발명에 사용된 항체 "69H2"는 서열 ID 번호: 15의 중쇄 가변 영역, 및 서열 ID 번호 16의 경쇄 가변 영역을 갖는 마우스 항체를 지칭한다.
표 1 은 항-CLDN18.2 항체 14G11 및 69H2의 CDR 서열을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 하기 표 2에 제공된다.
표 1. CLDN18.2 항체의 CDR 영역의 서열
Figure pct00002
표 2. 마우스/재조합 항체 VH/VL 영역의 서열
Figure pct00003
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 항체 및 이의 항원 결합 단편이 CLDN18.2 (예를 들어, 인간 CLDN18.2)에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 적합한 프레임워크 영역 (FR) 서열을 포함한다. 표 1에 제공된 CDR 서열은 마우스 항체로부터 수득되지만, 이들은 재조합된 기술과 같은 당업계에 공지된 적합한 방법을 사용하여 마우스, 인간, 래트, 토끼와 같은 임의의 적합한 종의 임의의 적합한 FR 서열에 이식될 수 있다. FR 서열은 CDR 영역이 가변 영역 내의 2개의 FR 영역에 의해 측면화된다는 것이 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 상기 표 1의 CDR 서열 및 상기 표 2의 가변 영역 서열에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다. 불변 영역은 선택적으로 IgG의 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, 및/또는 CH2-CH3 영역을 포함한다. 특정 실시예에서 중쇄 불변 영역은 Fc영역을 포함한다. 특정 실시예에서 경쇄 불변 영역은 Cκ 또는 Cλ를 포함한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 단편은 마우스 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 불변 영역을 더 포함한다. 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 마우스 IgG1 의 불변 영역을 포함한다. 특정 실시예에서 마우스 IgG1의 중쇄 불변 영역은 서열 ID 번호: 17, 또는 적어도 80% (예: 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 상동성 서열을 포함하고/하거나 마우스 IgG1의 경쇄 불변 영역은 서열 ID 번호: 18의 아미노산 서열 또는 적어도 80% (적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 상동성 서열을 포함한다.
본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 표지된 항체, 이가 항체, 항이디오타입 항체, 융합 단백질, 이량체화 또는 중합된 항체, 또는 변형된 항체 (예를 들어, 글리코실화 항체)일 수 있다. 재조합 항체는 동물이 아닌 재조합 방법을 사용하여 시험관내에서 제조된 항체이다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이가, 사가, 육가, 또는 다가이다. 이가 이상인 임의의 분자는 다가의 것으로 간주되며, 예를 들어, 삼가, 사가, 육가 등을 포괄한다.
일부 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 본 발명에 제공된 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 구성되는 단일 도메인 항체이다. 이러한 단일 도메인 항체에 대한 추가 정보는 당업계에서 입수가능하다 (예: 미국 특허 번호: 6,248,516 참조).
항체 변형체
본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 항체 14G11 및 69H2의 다양한 변형체도 포괄한다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열ID 번호 17 또는 18에 기재된 바와 같이, 상기 표 1에 제공된 하나 이상의 CDR 서열 중 하나 이상의 돌연변이, 상기 표 2에 제공된 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 비CDR 서열의 하나 이상 및/또는 불변 영역 (예를 들어, Fc 영역) 서열을 포함하면서도 CLDN18.2, 특히 인간 CLDN18.2, 또는 보다 구체적으로는 서열 ID 번호 19의 아미노산 서열 내 에피토프에 대한 결합 특이성을 보유한다. 이들은 항체 14G11 및 69H2의 변형체, 또는 항원 결합 단편의 변형체로서 언급된다. 특정 실시예에서 변형체는 그의 모 항체 (예를 들어, 항체 14G11 또는 69H2)와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 보유한다. 본 발명에 사용된 "돌연변이" 또는 "돌연변이된"은 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 특정 실시예에서 돌연변이(들)의 적어도 하나(또는 전부)는 보존적 치환을 포함한다.
특정 실시예에서 항체 변형체는 항체 14G11 및 69H2의 CDR 서열, FR 서열, 또는 가변 영역 서열에서 총 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함한다. 특정 실시예에서 항체 변형체는 표 1에 열거된 그(또는 그들)와 적어도 80% (예: 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 1, 2, 또는 3개의 CDR 서열을 포함하고, 그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고, 선택적으로 그의 모 항체 (예를 들어, 항체 14G11 또는 69H2)와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시예에서 항체 변형체는 서열 ID 번호 13 또는 15의 그(또는 그들)에 대해 적어도 80% (예: 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열, 및/또는 서열 ID 번호 14 또는 16의 그(또는 그들)에 대해 적어도 80%(예: 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고, 선택적으로 그의 모 항체 (예를 들어, 항체 14G11 또는 69H2)와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시예에서 총 1 내지 10개의 아미노산 잔기가 서열ID 번호 13 내지 16으로부터 선택된 서열로 돌연변이되었다. 일부 실시예에서 돌연변이는 CDR 외부의 영역(즉, FRs에서)에서 발생한다. 일부 실시예에서 하나 이상의 돌연변이는 보존적 치환이다. 일부 실시예에서 모든 돌연변이는 보존적 치환이다.
일부 실시예에서 본 개시는 항체 14G11 또는 69H2의 변형체를 제공하며, 변형체는
a) 서열ID번호 1또는 서열ID번호 7과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 서열 및/또는
b) 서열ID번호 3또는 서열ID번호 9와 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 서열 및/또는
c) 서열ID번호 5또는 서열ID번호 11과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 서열 및/또는
d) 서열ID번호 2와 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 서열 및/또는
e) 서열ID번호 4 또는 서열ID번호 10과 적어도 80% (예컨대　적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 서열 및/또는
f) 서열ID번호 6과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 서열을 포함하며,
그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고, 선택적으로 그의 모 항체 (예를 들어, 항체 14G11 또는 69H2)와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 변형체는 서열 ID 번호 1 또는 서열 ID 번호 7에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR1, 서열 ID 번호 3 또는 서열 ID 번호 9에서 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR2, 서열 ID 번호 5 또는 서열 ID 번호 11에서 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR3, 서열 ID 번호 2에서 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR1, 서열 ID 번호 4 또는 서열 ID 번호 10에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR2 및/또는 서열 ID 번호 6에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR3을 포함하고, 그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하며, 선택적으로 그의 모 항체(예를 들어, 항체 14G11 또는 69H2)와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시예에서 하나 이상의 돌연변이는 보존적 치환이다. 일부 실시예에서 모든 돌연변이는 보존적 치환이다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 변이체는 그의 모 항체의 CLDN18.2에 특이적인 결합 특이성을 보유하지만, 돌연변이(들)에 의해 부여되는 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는다. 예를 들어, 항체 변형체는 개선된 항원 결합 친화도, 개선된 글리코실화 패턴, 글리코실화의 감소된 위험, 감소된 탈아민화, 감소된 또는 고갈된 이펙터 기능(들), pH 의존적 방식으로 개선된 FcRn 수용체 결합, 증가된 약동학적 반감기, pH 민감성, 및/또는 접합에 대한 상용성(예를 들어, 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기) 등을 가질 수 있다. 이러한 변형체는 친화성 변형체, 글리코실화 변형체, 시스테인 변형체, Fc 변헝체 등으로도 알려져 있으며, 이는 하기와 같이 보다 상세히 설명된다.
a) 친화성 변형체
친화성 변형체는 상기 표 1에 제공된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열, 본 발명에 제공된 하나 이상의 프레임워크 (FR) 서열, 또는 상기 표 2에 제공된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열에서의 변형 또는 치환을 함유할 수 있다.
친화성 변형체는 모 항체의 CLDN18.2에 대한 특이적 결합 친화도를 보유하거나, 심지어 모 항체에 비해 개선된 CLDN18.2 특이적 결합 친화도를 갖는다. 이러한 목적을 달성하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 변형체 (예를 들어 Fab 또는 scFv 변형체)의 라이브러리를 파지 디스플레이 기술로 생성 및 표현시킨 다음, 인간 CLDN18.2에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 인간 CLDN18.2에 대한 항체의 결합을 가상으로 시뮬레이션하고, 결합 인터페이스를 형성하는 항체 상의 아미노산 잔기를 확인할 수 있다. 이러한 잔기는 결합 친화도의 감소를 방지하도록 돌연변이에서 회피되거나, 또는 더 강한 결합을 제공하기 위해 돌연변이를 표적화할 수 있다.
b) 글리코실화 변형체
본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 글리코실화의 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 수득될 수 있는 글리코실화 변형체를 포괄한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 글리코실화 부위를 도입 또는 제거하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 글리코실화 부위는 탄수화물 모이어티(예를 들어, 올리고당 구조)가 부착될 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기이다. 항체의 글리코실화는 일반적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭하며, 예를 들어, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌과 같은 트리펩티드 서열에서 아스파라긴 잔기를 지칭하고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. O-연결 글리코실화는 설탕 N-아세일갈락토사민, 갈락토오스, 또는 크실로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭한다. 천연 글리코실화 부위의 제거는 편리하게 달성될 수 있으며, 예를 들어, 상기 기재된 트리펩티드 서열 중 하나(예를 들어 N-연결된 글리코실화 부위) 또는 세린 또는 트레오닌 잔기(O-연결된 글리코실화 부위의 경우)가 서열 내에 존재하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 치환된다. 새로운 글리코실화 부위는 이러한 트리펩티드 서열 또는 세린 또는 트레오닌 잔기를 도입함으로써 유사한 방식으로 생성될 수 있다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 글리코실화 부위를 제거하기 위해 N297 (예를 들어, N297A, N297Q, 또는 N297G)에서의 돌연변이를 포함한다.
c) 시스테인-조작된 변형체
본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 하나 이상의 도입된 유리 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 시스테인-조작된 변형체를 포괄한다.
유리 시스테인 잔기는 이황화물 브릿지의 일부가 아닌 것이다. 시스테인-조작된 변형체는 말레이미드 또는 할로아세틸 등을 통해 예를 들어, 세포독성 및/또는 이미징 화합물, 라벨, 또는 다른 것들 중 방사성 아이소타이프, 조작된 시스테인의 부위과의 접합에 유용하다. 유리 시스테인 잔기를 도입하기 위해 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 엔지니어링하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, WO2006/034488을 참조한다.
d) Fc 변형체
본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 및 항원 결합 단편은 또한 Fc 변형체를 포함하며, 이는 예를 들어 ADCC (항체 의존성 세포 독해작용), ADCP (항체-의존성 세포성 식균 작용) 및 CDC (보체 의존 세포독성)와 같은 변경된 이펙터 기능을 제공하기 위해, 그의 Fc 영역 및/또는 힌지 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기 변형 또는 치환을 포함한다. Fc 변형체의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 왕 등, 단백질 세포 2018, 9(1): 63-73 및 강 등, 실험 및 분자 의학, (2019) 51:138참조하고, 이는 그 전체로서 본 명세서에 포함된다.
항원 결합 단편
본 발명에 제공된 것은 또한 항-CLDN18.2 항원-결합 단편이다. 일부 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 다양한 항원-결합 단편은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 그의 CDR 서열이 표 1에 제시되어 있는 예시적인 항체, 및 이들의 상이한 변형체 (예를 들어, 친화성 변형체, 글리코실화 변형체, Fc 변형체, 시스테인-조작된 변형체 등)를 포함하는 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체에 기초하여 개발될 수 있다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항원 결합 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (이가 디아바디), 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 카멜화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 또는 이가 도메인 항체이다.
이러한 항원 결합 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 사용될 수 있다. 예시적인 방법은, 무손상 항체의 효소적 소화 (예를 들어, 모리모토 등, 생화학 및 생물물리학적 방법 저널 24:107-117 (1992); 및 브레넌 등, 과하, 229:81 (1985)참조), 대장균과 같은 숙주 세포에 의한 재조합 발현(예를 들어 Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편에 대한), 상기 논의된 바와 같은 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 스크리닝 (예를 들어 ScFv에 대한), 및 F(ab')2 단편을 형성하는 두 개의 Fab'-SH 단편의 화학적 커플링(카터 등, 바이오테크놀로지 10:163-167 (1992))을 포함한다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
에피토프
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 DQWSTQDLYN(서열 ID 번호:19)의 아미노산 서열 내의 에피토프에 결합한다.
본 발명에 사용된 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특정 그룹을 지칭한다. 에피토프는 형태적 에피토프 또는 선형 에피토프일 수 있다. 본 개시의 특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체에 의해 결합된 에피토프는 선형이다. 당업자는 과도한 실험 없이, 항체가 CLDN18.2 항원 폴리펩티드에 대한 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 확인함으로써 본 개시(예를 들어 하이브리도마/마우스 항체 14G11 및 69H2)의 항체와 동일하거나 중첩되거나 인접한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 개시는 CLDN18.2의 N-말단 부분 내에 위치한 특정 에피토프에 대해 지시된 모노클로날 항체를 제공하며, 이는 CLDN18.1에 교차 반응하지 않고 CLDN18.2를 발현하는 세포를 검출하고 확인하는데 유용하다. 인간 CLDN18.1 및 CLDN18.2의 서열에 따르면, 아미노산 28-70 사이에 위치한 8개의 상이한 아미노산(즉, 제1 막횡단(TM) 영역 및 루프 l을 포함하는 N-말단 부분)이 존재하는 반면, 인간 CLDN18.1 및 CLDN18.2의 C-말단 서열은 동일하다. 인간 CLDN18.2의 N-말단에 위치한 선형 에피토프 (첫 번째 세포외 도메인에 아미노산 28-37, 즉, 서열 ID 번호: 19)가 사힌 U 등에 의해 보고되었다. (사힌 우구르 등, 임상암연구 2008;14(23) 2008년12월 1일, 참조). 그러나, 현재까지 이러한 펩티드 단편에 대한 모노클로날 항체는 보고되지 않았으며, 본 발명자들의 지식에 의하면, 본 개시는 처음으로 서열 ID 번호 19의 펩티드 단편에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서 본 개시는 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 CLDN18.2와의 결합을 위해 경쟁하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 14G11 및 69H2를 제공한다.
본 발명에 사용된 용어 "결합에 대해 경쟁하는"은 두 개의 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체)에 관하여, 하나의 항원-결합 단백질이 항원 (예를 들어, 인간 CLDN18.2)에 대한 다른 항원의 결합을 경쟁적 결합 검정에 의해 결정된 바와 같이 임의의 검출가능한 정도로 차단 또는 감소시키는 것을 의미한다. 경쟁적 결합 검정은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 및 샌드위치 경쟁 검정을 포함한다 (예를 들어, 스탈 등, 1983, 효소학의 방법 9:242-253 참조). 전형적으로, 이러한 검정은 항원을 보유하는 고체 표면 또는 항원을 담은 세포에 결합된 정제된 항원, 표지되지 않은 시험 항체 및 표지된 참조 항체의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 라벨의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통 시험 항체는 과량으로 존재한다. 두 항체가 CLDN18.2에 대한 결합에 대해 경쟁하는 경우, 입체 장애가 발생하기 위해 두 항체는 동일하거나 겹치는 에피토프에 결합하거나, 또는 다른 항체에 결합하는 에피토프가 충분히 가까운 인접 에피토프에 결합한다. 보통 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 공통 항원에 대한 시험 항체의 특이적 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% 이상 억제(예를 들어, 감소)할 것이다.
폴리뉴클레오티드 및 재조합 방법
본 개시는 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에 사용된 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 지칭한다. 별도의 표시가 없으면 특정 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 명백하게 지시된 서열뿐만 아니라 보존적으로 변형된 이의 변형체 (예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립 유전자, 오르토로그, SNPs 및 상보적 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제 3 위치가 혼합기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (배처 등, 핵산연구학술지, 19:5081 (1991); 오츠카 등, 생화학회지, 260:2605-2608 (1985); 및 로솔리니 등, 분자 및 세포 프로브, 8:91-98 (1994) 참조).
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열화된다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여). 코딩 DNA는 합성 방법에 의해도 수득될 수 있다.
본 개시는 본 발명에 제공된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)를 제공한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 운반하는 유전 요소의 발현을 가져오도록 숙주 세포를 전환, 도입 또는 감염시키는데 사용될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 및 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 P1-유래 인공 염색체 (PAC), 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스와 같은 박테리오파지를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택가능한 요소, 및 리포터 유전자를 포함하는 발현을 조절하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기원을 함유할 수 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포솜, 또는 단백질 코팅을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포 내로의 그의 진입을 보조하는 물질을 포함할 수 있다. 벡터는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터일 수 있다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 벡터는 발현 벡터이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 발현 벡터는 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, EF-1α), 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다.
벡터의 예는, 이에 제한되지는 않지만, 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순헤르페스바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바바이러스 (예를 들어, SV40), 람다 파지, 및 M13 파지, 플라스미드, 예컨대 pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등을 포함한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명에서 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모, 또는 더 높은 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 장내세균, 예컨대 대장균속, 예를 들어, 대장균, 엔테로박터, 에르비니아균속, 클렙시엘라속, 프로테우스, 살모넬라속, 예를 들어, 쥐 티푸스균, 세라티아속, 예를 들어, 적변 세균, 및 시겔라속, 뿐만 아니라 간균, 예컨대 고초균 및 바실러스 리체니포르미스, 슈도모나스속, 예컨대 녹농균, 및 스트렙토마이세스속을 포함한다.
원핵생물 이외에, 사상균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 항-CLDN18.2 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 또는 일반적인 빵 효모는 더 낮은 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 유전자, 종, 및 균주가 일반적으로 본 발명에 이용가능하고 유용하며, 예컨대 스키조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스 호스트, 예컨대 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 프라질리스(ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위커하미 (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이 (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 초파리 (ATCC 36,906), 야로위아 (EP 402,226); 피히아 파스토리스 (EP 183,070); 칸디다속; 트리코데르마 레시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사; 슈반니오미세스, 예컨대 슈반니오미세스 옥시덴탈리스; 및 사상균류, 예컨대 뉴로스포라, 페니실륨, 톨리포클라디움, 및 아스페르길루스 호스트, 예컨대 아스페르질루스 니둘란스및 흑색국균을 포함한다.
본 발명에 제공된 글리코실화 항체 또는 이의 항원 단편의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물, 예컨대 식물 및 곤충 세포와 같은 무척추동물 세포로부터 유래된다. 스포돕테라 프루기페르다(애벌레), 아에데스 아에기프티 (모기), 아에데스 알보픽투스 (모기), 노랑 초파리 (초파리), 및 누에 나방과 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변형체 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 전달감염을 위한 다양한 바이러스 균주가 공개적으로 입수가능하며, 예를 들어, 오토그라파 칼리포르니카 NPV의 L-1 변형체 및 누에 나방 NPV의 Bm-5 균주, 및 이러한 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 전달감염을 위해 본 발명에 따른 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 활용될 수 있다.
그러나 척추동물 세포에서 가장 큰 관심이 있었고, 배양(조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 전환된 원숭이 신장 CV1주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주(293 또는 293 현탁 배양물에서의 성장을 위해 서브클로닝된 세포, 그레이엄 등, 일반 바이러스학 저널, 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터난소 세포/-DHFR(CHO, 우라우브 등, 미국국립과학원회보 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 매더, 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 경부 암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 송곳니 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); 트리세포(매더 등, 뉴욕학술원 연보학회지 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 그리고 인간 간암 주를 포함한다(Hep G2). 일부 바람직한 실시예에서 숙주 세포는 포유동물 배양 세포주, 예컨대 CHO, BHK, NS0, 293 및 이들의 유도체이다.
숙주 세포는 항-CLDN18.2 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적합하도록 변형된 종래의 배양기에서 배양된다. 또 다른 실시예에서 항체는 당업계에 공지된 상동 재조합에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄의 F10 (시그마), 최소필수배지 (MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 덜베코의 수정된 독수리 미디엄 (DMEM), 시그마)와 같은 시판되는 배지는 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 햄 등, 메타암페타민 효소, 58:44 (1979), 반스 등, 분석생화학, 102:255 (1980), 미국 특허 번호: 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 참조 30,985에 기재된 임의의 배지는 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예: HEPES), 뉴클레오티드(예: 아데노신 및 티미딘), 항생제(예: 젠타마이신TM 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도에 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 공지되어 있을 수 있는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 통상 숙련된 장인에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내로, 원형질 막 주위 공간에서, 또는 배지 내로 직접 분비되어 생산될 수 있다. 항체가 세포내 생산되는 경우, 첫 번째 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 카터 등의 바이오테크놀로지 10:163-167 (1992)에서는 대장균의 원형질 막주위 공간으로 분비되는 항체를 단리하는 절차를 기술한다. 간략하게, 세포 페이스트는 약 30분에 걸쳐 초산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 먼저 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유닛을 사용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위한 전술한 단계 중 어느 하나에 포함될 수 있으며, 우발적인 오염물질의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항-CLDN18.2 항체 및 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 하이드록시라파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로스 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 염석 배출 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다.
특정 실시예에서 고체상에 고정화된 단백질 A는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 면역친화성 정제에 사용된다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타이프에 의존한다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마2, 또는 감마4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (린드마크 등, 면역학적 방법 저널 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타이프와 인간 감마3에 권장된다(거스 등, EMBO 저널, 5:1567 1575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스타이렌다이비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 ABXTM 수지(J.T.베이커, 뉴저지, 필립스버그)는 정제에 유용하다. 이온 교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스TM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피 (폴리아스파르트산 컬럼과 같은), 크로마토 초점 맞춤, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들)에 이어서, 관심있는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5-4.5 사이의 pH에서 용출 완충액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있고, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행될 수 있다.
본 개시는 본 발명에 제공된 벡터가 발현되는 조건 하에서 본 발명에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 방법을 제공한다.
접합
일부 실시예에서, 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 모이어티에 연결되거나 접합된다. 이러한 모이어티의 예는 치료제 (예: DNA-알킬레이터, 국소이성화효소 억제제 또는 튜뷸린 바인더 또는 다른 항암제), 검출가능한 라벨, 약동학적 변형 모이어티 (예: 반감기를 연장시키는 PEG와 같은 중합체), 또는 정제 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
모이어티는 직접적으로 또는 링커를 통해 또는 다른 모이어티를 통해, 예를 들어, 다른 방법들 중에서 공유 결합, 친화성 결합, 인터칼레이션, 좌표 결합, 복합체화, 회합, 혼합, 또는 부가에 의해, 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 부착될 수 있다. 특정 실시예에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통해 하나 이상의 모이어티에 연결된다. 특정 실시예에서 링커는 히드라존 링커, 이황화물 링커, 이관능성 링커, 디펩티드 링커, 글루쿠로나이드 링커, 또는 티오에테르 링커이다.
특정 실시예에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 모이어티에 연결하기 위해 이용될 수 있는 에피토프 결합 부분 외부의 특정 부위를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기, 예를 들어 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 모이어티에 대한 공유 결합을 용이하게 한다.
일부 실시예에서 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) 검출가능한 신호를 제공하기 위해; (ii) 제1 또는 제 2 라벨, 예를 들어, FRET(형광성 공명 에너지 전이법)에 의해 제공된 검출가능한 신호를 수정하기 위해 제 2 라벨과 상호작용하기 위해; (iii) 이동성, 예를 들어, 전하, 소수성, 형상, 또는 다른 물리적 파라미터에 의해 전기영동 이동성에 대한 영향을 미치기 위해, 또는 (iv) 포획 모이어티, 예를 들어, 친화도, 항체/항원, 또는 이온성 복합체화를 제공하기 위해 기능하는 하나 이상의 모이어티에 연결된다.
이러한 모이어티는 영상화, 효소 반응 등을 통해 직접 검출가능한 (방사성 동위원소, 란타나이드, 화학 발광라벨, 발색 모이어티, 효소 라벨, 콜로이드질 금 입자, 형광라벨 등) 라벨 또는 모이어티뿐만 아니라, 예를 들어 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출가능한 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 간접적으로 검출가능한 라벨의 예에는 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 디곡시게닌 라벨, 합텐, 검출을 위한 DNA 분자 및 입자 라벨(상자성 입자, 금속 입자 라벨, 자성 입자 라벨 및 중합체 입자 라벨 등)이 포함된다.
방사성 동위원소의 예에는 S, C, I, H 및 I 등이 포함된다. 항체는 면역학, 볼륨 1 및 2, 콜리겐 등, 에드 와일리-인터사이언스, 뉴욕, N.Y., 퍼브(1991)에 현재 프로토콜에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있고 예를 들어, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정 할 수 있다. 다른 방사성 핵종은 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 99Tc,90Y, 111In, 112In, 32P, 14C, 150, 13N, 18F, 86Y, 88Y, 90Y, 51Cr, 57To, 225Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 64Cu, 67Cu, 217Ci, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, 및 56Fe를 포함한다.
형광 또는 발광 라벨은 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트), 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 이소티오시안산염, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈라데히드, 플루오레스카민, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 라벨, 등발광 라벨, 방향족 아크리디늄 에스테르 라벨, 이미다졸 라벨, 아크리디듐 염 라벨, 옥살레이트 에스테르 라벨, 에쿼린 라벨, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 텍사스 레드, 단실, 리사민, 엄벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 시판되는 형광단, 예컨대 스펙트럼 오렌지® 및 스펙트럼 그린®및/또는 상기 중 어느 하나 이상의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 형광 라벨은 예를 들어, 면역학의 현재 프로토콜에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.
유용한 라벨의 또 다른 유형은 효소-기질 라벨이다. 다양한 효소-기질 라벨이 이용가능하다(미국 특허번호:4,275,149 참조). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정 할 수있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있으며, 이는 분광 광도법적으로 측정될 수 있다. 선택적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 형광의 변화를 정량화하기 위한 기술은 상기에서 설명된다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 이어서 측정될 수 있는 광을 방출하거나(예를 들어, 화학발광계를 사용하여) 형광 수용체에 에너지를 기부할 수 있다.
수많은 효소-기질 조합은 당업자에게 이용가능하고(미국 특허번호: 4,275,149 및 4,318,980참조), 예를 들어 이는 (i) 수소 퍼옥시다제를 기질로 하는 겨자무과산화효소(HRP), 여기서 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체, 예를 들어, 갈색 최종 생성물을 생성하는 3,3' 다이아미노벤지딘(DAB); 산화시 장미-적색 최종 생성물을 형성하는 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC); 청색 최종 생성물로서 침전된 4-클로로-l-나프톨(CN); 및 블루-블랙 생성물을 생성하는 p-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드/피로카테콜; 및 오르토페닐렌디아민(OPD) 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드(TMB)를 산화시키고; (ii) 알칼리성 포스파타제(AP) 및 파라-니트로페닐 포스페이트, 나프톨 AS-MX 포스페이트, 패스트 레드 TR 및 패스트 블루 BB, 나프톨 AS-BI 포스페이트, 나프톨 AS-TR 포스페이트, 5-브로모-4-클로로-3-인독실 포스페이트(BCIP), 패스트 레드 LB, 패스트 가넷 GBC, 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), 요오도니트로테트라졸륨 바이올렛(INT); 및 (iii) 발색성 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-P-D-갈락토시다제) 또는 플루오르겐 기질(예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-P-D-갈락토시다제)을 갖는 β-D-갈락토시다제 (β-D-갈락토오스) 등이다.
다른 유용한 효소 라벨은 루시페라아제 (예: 파이어플라이 루시퍼라아제 및 세균성 루시페라아제; 미국 특허번호:4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 능급산 탈수소 효소, 우레아제, 겨자무과산화효소(HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제(예: 포도당 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제, 및 포도당-6-인산탈수소효소), 헤테로시클릭 옥시다제(요산 분해 효소 및 크산틴 옥시다제 등), 락토페르옥시다아제, 마이크로페르옥시다아제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키기 위한 기술은 효소 분석의 방법(J.랑브네 & H.반 부나키스 편집됨), 학술 도서 출판사 (AP), 뉴욕, 73:147-166 (1981) 에서 오설리번 등의 효소 면역분석에 사용하기 위한 효소-항체 접합체의 제조 방법에 기재되어 있다.
CLDN18.2의 검출 및 사용 방법
본 개시는 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 CLDN18.2 (예를 들어, 인간 CLDN18.2)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 검출하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서 대상체에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태 (예를 들어, 암)를 진단하기 위한 방법이 제공되며, 이는
a) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계; 및
b) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 갖는 것으로 진단된다. 특정 실시예에서 샘플은 위 상피 조직이 아니다.
다른 측면에서 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료를 위한 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체의 적격성을 결정하기 위한 방법이 제공되며, 이는
a) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계; 및
b) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견되거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 적합한 것으로 결정되거나 또는
대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견되지 않거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 적합하지 않은 것으로 결정된다.
또 다른 측면에서 대상체에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 치료하는데 있어서 CLDN18.2-표적제의 치료 유효성을 예측하기 위한 방법이 제공되며, 이는
a) CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계;
b) 샘플에서 인간 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계; 및
c) CLDN18.2-표적제의 치료 유효성을 예측하는 단계를 포함하고,
CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 대상체를 치료하는데 효과적일 것으로 예측되거나 또는
CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2의 존재가 발견되지 않거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 대상체를 치료하는데 효과적이지 않을 것으로 예측된다.
또 다른 측면에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 이는
a) i) CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계;
ii) 샘플에서 인간 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계; 및
iii) CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 샘플 내의 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달했을 때 CLDN18.2 표적제를 사용한 치료에 적합한 것으로 대상체를 선택하는 단계를 포함하는 치료에 적합한 대상체를 선택하는 단계; 및
b) 치료학적 유효량의 CLDN18.2-표적제를 선택된 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서 암을 갖거나 암에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 이는
a) i) CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 단계;
ii) 샘플에서 인간 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계; 및
iii) CLDN18.2의 존재가 발견되지 않을 때 또는 샘플 내의 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 미만일 때 CLDN18.2 표적제를 사용한 치료에 적합하지 않은 것으로 대상체를 선택하는 단계를 포함하는 대상체를 선택하는 단계; 및
b) 선택된 대상체에게 CLDN18.2-표적제 이외의 표준 치료 요법제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, "샘플"은 본 개시에 따라 유용한 임의의 샘플, 특히 체액을 포함하는 이러한 조직 샘플, 및/또는 세포 샘플과 같은 생물학적 샘플일 수 있고/거나 펀치 생검을 포함하는 조직 생검, 및 혈액, 기관지 흡인물, 객담, 소변, 대변 또는 다른 체액을 취함과 ƒˆ은 종래의 방식으로 수득될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "샘플"은 또한 생물학적 샘플의 분획 또는 단리물, 예를 들어, 핵산 및 펩티드/단백질 단리물과 같은 처리된 샘플을 포함한다.
CLDN18.2를 함유하는 것으로 의심되는 임의의 생물학적 샘플은 본 발명에 제공된 방법에서 검출될 수 있다. 일부 실시예에서 적합한 샘플은 검출을 필요로 하는 대상체로부터 수득된 세포 샘플 또는 조직 샘플일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 위, 폐, 유방, 결장, 신장, 뼈, 뇌, 근육, 췌장, 방광, 난소, 자궁, 뿐만 아니라 심장, 배아 또는 태반 조직의 정상 및 암 조직을 포함할 수 있다. 바람직하게는 샘플은 검사될 기관의 세포 또는 조직, 예를 들어, 암에 대해 진단되어야 하는 기관을 함유한다. 예를 들어, 진단되는 암이 위암인 경우 샘플은 위암으로부터 수득된 세포 또는 조직을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서 샘플은 종양 샘플이다. 일부 실시예에서 조직 샘플은 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖는 샘플이다.
적합한 샘플은 종양 또는 암 세포를 함유하거나 종양 또는 암 세포를 함유할 것으로 예상되는 환자로부터 유래된 신체 샘플일 수 있다. 신체 샘플은 혈액과 같은 임의의 조직 샘플, 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 수득된 조직 샘플 또는 종양 또는 암 세포를 함유하는 임의의 다른 샘플일 수 있다. 용어 "원발성 종양"은 암 기원의 부위에서 성장하는 종양을 지칭한다. 용어 "전이성 종양"은 암 기원의 부위와 상이한 부위에서 성장하는 이차 종양을 지칭한다.
조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 냉동 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분; 체액, 예컨대 뇌 척수액, 양수, 복막액, 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발달 중 언제든지의 세포일 수 있고. 일부 실시예에서 샘플은 시험관내 조직 또는 세포 배양물로부터 수득된다.
본 발명에서 샘플의 예는 종양 생검, 순환 종양 세포, 혈청 또는 혈장, 복수액, 일차 세포 배양물 또는 종양으로부터 유래된 세포주 또는 종양-유사 특성을 나타내는 세포주, 뿐만 아니라 보존된 종양 샘플, 예컨대 포르말린-고정, 파라핀 포매(FFPE) 종양 샘플 또는 냉동 종양 샘플을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 실시예에서 세포 샘플은 세포 블록으로부터 생산된다. "세포 블록"은 세포학적 물질이 처리, 절편화 및 염색되고 조직학 절편으로 볼 수 있도록 준비하는 방법이다. 그것은 세포학 슬라이드로부터 얻은 것 이외에 진단 정보를 제공 할 수 있다. 특정 실시예에서 세포 블록은 잔류 삼출액, 객담, 소변 퇴적물, 위장액, 세포 긁힘, 또는 미세바늘 흡인물로부터 제조될 수 있다. 세포는 원심분리 또는 막 여과에 의해 농축되거나 패킹된다.
세포 블록 제조를 위한 다수의 방법들이 개발되었다. 대표적인 절차는 고정된 퇴적물, 박테리아 한천, 또는 막 여과 방법을 포함한다. 고정 퇴적 방법에서, 세포 퇴적물은 Bouin, 피크르산, 또는 완충된 포르말린과 같은 고정제와 혼합된 다음, 혼합물을 원심분리하여 고정된 세포를 펠릿화한다. 펠릿을 수집하여 추가 고정제가 있는 항아리에 넣어지는 조직 카세트에 넣고 조직 샘플로 처리한다. 한천 방법은 매우 유사하지만 펠렛은 반으로 절단되고 절단측은 유리 슬라이드의 녹은 한천 한 방울에 배치된다. 한천은 경화 될 수 있으며 과도한 한천은 잘린다. 선택적으로, 펠릿은 65°C에서 2% 액체 한천에 직접 현탁되고 샘플을 원심분리할 수 있다. 한천 세포 펠릿은 4°C에서 한 시간 동안 응고되도록 허용된다. 고체 한천은 원심분리 튜브로부터 제거되고 반으로 슬라이스될 수 있다. 이것은 조직 카세트에 넣고 조직 과정이 완료된다. 원심분리는 임의의 이들 절차에서 막 여과로 대체될 수 있다. 임의의 프로세스는 "셀 블록 샘플"을 생성하는데 사용될 수 있다.
특정 실시예에서 셀 블록은 로위크릴 수지, LR 화이트, LR 골드, 유니크릴 및 모노스텝을 포함하는 특성화된 수지를 사용하여 제조될 수 있다. 이 수지들은 낮은 점도를 가지며, 낮은 온도에서 자외선을 사용하여 중합될 수 있다. 포매 처리는 탈수하는 동안 샘플을 점진적으로 냉각시키고, 수지에 샘플을 옮기고, 마지막으로 적절한 UV 파장에서 낮은 온도에서 블록을 중합시키는 것에 의존한다.
세포 블록 절편은 세포형태학적 검사를 위해 헤마톡실린-에오신, 훽스트 염색 또는 DAPI로 염색될 수 있는 반면, 추가적인 절편은 항체가 세포 블록 절편에서 CLDN18.2 단백질에 결합할 수 있도록 충분한 기간 동안 및 적절한 조건 하에서 항-CLDN18.2 항체(즉, 일차 항체)에 노출시킴으로써 CLDN18.2에 대한 검사에 사용된다. 비결합 및 과량의 일차 항체는 세척 및 제거될 수 있다.
일부 실시예에서 샘플은 예를 들어, 보존제, 항응고제, 완충제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다. 특정 실시예에서 샘플은 하나 이상의 고정제에 노출되고 및/또는 함유되어 있다. 본 발명에 제공된 방법에 적합한 예시적인 고정제는 포르말린, 글루타르알데히드, 오스뮴 테트라옥사이드, 아세트산, 에탄올, 아세톤, 피크르산, 클로로포름, 중크롬산칼륨 및 수은 클로라이드 및/또는 마이크로파 가열 또는 동결에 의해 안정화되는 것을 포함한다.
일부 실시예에서 샘플은 고정된 조직 샘플을 포함한다. 일부 실시예에서 고정된 조직 샘플은 포르말린-고정된 파라핀-포매(FFPE) 조직이다. FFPE 조직 절편은 약 3-4 밀리미터, 바람직하게는 4-40 마이크로미터일 수 있으며, 이는 현미경 슬라이드 상에 장착되고 건조된다. 파라핀의 예에는 파라플라스트, 브로로이드 및 티슈메이가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. FFPE 조직 샘플과 같은 고정된 조직 샘플의 경우, 샘플은 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하기 전에 탈파라핀화될 수 있다.
일부 실시예에서 탈파라핀화된 샘플은 항원 회복을 허용하도록 더 처리될 수 있다. 항원 회복은 에피토프의 마스킹이 역전되고 에피토프-항체 결합이 복원되는 임의의 기술을 지칭한다. 고정은 조직 형태학의 보존에 필수적이지만, 이 과정은 항체 결합 및 검출에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 고정은 관심있는 에피토프가 마스킹되고 더 이상 항체에 결합 할 수 없도록 단백질 생화학을 변경할 수 있다. 에피토프의 마스킹은 에피토프 내 아미노산의 가교결합, 에피토프에서 또는 그 근처에서 관련되지 않은 펩티드의 가교결합, 에피토프의 입체형태의 변경, 또는 항원의 정전기적 전하의 변경에 의해 야기될 수 있다. 항원 회복의 필요성은 표적 항원, 사용된 항체, 조직의 유형, 및 고정 방법 및 기간을 포함하나 이에 한정되지 않는 다중 변수에 의존한다. 항원 회복의 기술은 일반적으로 프로테아제-유도된 에피토프 회복(PIER, 프로테이나제 K, 트립신 및/또는 펩신과 같은 효소를 사용함으로써) 및 열-유도된 에피토프 회복(HIER, 전자레인지, 압력솥, 식물 스티머, 오토클레이브 또는 수조를 통해)을 포함한다.
특정 실시예에서 세포 표면 또는 막-결합된 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준은 본 발명에 제공된 방법에서 검출되거나 결정된다. 문구 "세포 표면 또는 막-결합된 CLDN18.2"는 CLDN18.2가 세포의 원형질 막과 연관되고 위치하는 것을 의미하며, 여기서 적어도 일부의 CLDN18.2는 상기 세포의 세포외 공간에 노출되고, 상기 세포의 외부로부터, 예를 들어, 세포 외부의 항체에 의해 접근가능하다. 특정 실시예에서 세포외로 노출되는 CLDN18.2의 일부는 적어도 4개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 12개, 또는 적어도 20개의 아미노산 잔기를 포함한다. 위 상피 세포를 제외한 정상 조직에서, CLDN18.2는 상피와 내피의 밀착 연결부 내에 위치하며, 세포 외부로부터의 항체에 접근할 수 없는 것으로 여겨지며, 따라서 세포 표면 또는 막 결합된 CLDN18.2가 아닌 것으로 간주된다.
샘플 중의 CLDN18.2 단백질의 존재 또는 발현 수준은 본 발명에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 CLDN18.2 항원의 복합체의 존재 또는 수준에 기초하여 결정될 수 있다. 임의의 적합한 방법은 예를 들어 면역조직화학 (IHC), 면역세포화학 (ICC), 면역형광 (IF), 면역블롯팅 (예를 들어, 웨스턴 블롯팅), 유세포 분석 검정 (예를 들어, FACS™), 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 및 방사선면역검정 (RIA)과 같은 면역검정에 의해 항체-항원 복합체의 검출을 위해 사용될 수 있다. 면역학적 및 면역분석 절차에 대한 검토는 기본 및 임상 면역학을 참조한다.(Stites & Terr eds., 제7판 1991). 또한, 면역검정은 효소 면역검정(마지오, 편집, 1980) 및 할로우&레인에서 광범위하게 검토되는 여러 구성 중 임의의 것으로 수행될 수 있다. 일반적인 면역 검정에 대한 검토는 세포 생물학의 방법: 세포 생물학의 항체, 볼륨 37(아사이, 편집 1993); 기본 및 임상 면역학 (Stites & Terr, 편집, 제7판 1991)을 참조한다.
특정 실시예에서 본 발명에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출가능하게 표지되거나 (예를 들어, 일차 항체), 또는 표지되지 않지만 검출가능하게 표지되는 제 2 분자 (예를 들어, 검출가능하게 표지된 이차 항체)와 반응할 수 있다.
특정 실시예에서 샘플에서 CLDN18.2 단백질의 존재 또는 발현 수준은 IHC 또는 ICC에 따라 결정된다. IHC는 조직 절편의 세포, 예를 들어, 본 발명에 언급된 조직의 세포에서 항원 (예를 들어, 단백질)을 검출하는 과정을 지칭한다. 면역조직화학 염색은 암 종양에서 발견되는 것과 같은 비정상적인 세포의 진단에 널리 사용된다. 특정 실시예에서 본 발명에 개시된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IHC 또는 ICC에서 일차 항체로서 사용될 수 있다. 일반적으로 IHC 또는 ICC는 샘플에서 CLDN18.2 단백질 (예를 들어, 인간 CLDN18.2 단백질)의 직접 검출 또는 간접 검출을 위해 수행될 수 있고, CLDN18.2 발현은 적절한 이미징 장치를 사용하여 평가될 수 있다.
항원 (예를 들어, CLDN18.2)의 직접 검출을 허용하기 위해, 검출가능한 라벨에 링크되어 있는 본 발명에 개시된 항CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용할 수 있으며, 이는 추가의 항체 상호작용의 필요 없이 직접 시각화를 허용한다.
항원 (예를 들어, CLDN18.2)의 간접 검출을 위해, 표지되지 않은 본 발명에 개시된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용할 수 있지만, 검출가능하게 표지되는 제 2 분자 (예를 들어, 검출가능하게 표지된 이차 항체)와 반응할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비표지될 수 있고, 검출가능한 표지와 접합된 이차 항체 (예를 들어, 항-이소타입 항체)와 더 접촉하여, 항원의 간접 검출을 허용한다. 또 다른 예를 들어, 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체는 검출가능하게 표지된 아비딘과 반응할 수 있는 비오틴과 접합될 수 있거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 항체-항원 복합체의 간접 검출을 허용한다. 또 다른 예에서, 본 발명에 제공된 항-CLDN18.2 항체는 본 발명에 기재된 바와 같은 검출가능한 라벨에 연결된 항합텐 항체와 반응할 수 있는 작은 합텐과 접합될 수 있다. 예시적인 유형의 라벨이 본 발명에 상술되어 있고, 임의의 적합한 검출가능한 라벨이 사용될 수 있다.
ICC 또는 IHC 분석은 로하 등, 병리학 일상 실습에서의 통합, 정량적 면역조직화학을 위한 이미징 솔루션의 검토, 잎 조직 화학 및 세포 생물학, 볼륨47, No.3, 349-354, 2009에 기재된 바와 같은 자동화된 염색 (종래의 염색, 조직화학 기술, 면역염색제); 자동화된 현장 혼성화 시스템; 자동 슬라이드 준비(커버슬립, 슬라이드 건조) 및 통합 슬라이드 및 카세트 라벨링을 포함할 수 있는 자동화된 병리학 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
예시적인 IHC 분석은 상업적으로 입수가능한 다코 EnVision™ FLEX 검출 시스템을 채용할 수 있으며, 이는 다코 오토스테이너 기기(다코, 애질런트 테크놀로지스, 인크., 글로스트럽, 덴마크)와 함께 사용하기 위한 것이다. 이들 시약은 다른 오토스테이너를 위해 선반 밖으로 또는 오토스테이너를 사용하지 않고 수동으로 염색을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
염색 과정을 완료한 후, 샘플(예를 들어, 슬라이드)은 인간, 예를 들어, 병리학자에 의해, 또는 특이적 및 비특이적 염색 결과를 구별하도록 프로그램된 컴퓨터에 의해 CLDN18.2 염색에 대해 분석된다. 분석은 저배율, 중배율 (10-20x) 및 고배율 (40-60x)에서 현미경을 통해 샘플을 보거나 저배율, 중배율 및 고배율에서 촬영 한 슬라이드의 고해상도 이미지를 보면서 직접 수행 할 수 있다.
샘플에서 CLDN18.2 발현의 존재는 양성으로 염색된 세포, 예를 들어, 항-CLDN18.2 항체 염색에 대한 임의의 강도의 적어도 부분적인 막 염색을 갖는 세포의 존재에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시예에서 정상 샘플이 대조군 샘플로서 사용될 수 있고, 시험 샘플에서 CLDN18.2 발현의 존재는 대조군 샘플에 대하여 결정될 수 있다. 용어 "정상 샘플" 또는 "정상 조직"에서 사용되는 것과 같은 용어 "정상"은 건강한 또는 비암성 대상체로부터의 샘플 또는 조직, 또는 건강한 또는 비암성 조직으로부터의 샘플 또는 조직을 지칭한다. 바람직하게는, 시험 및 대조군 샘플은 샘플의 유형의 관점에서 필적하며, 예를 들어, 둘 다 고정된 조직 샘플이다. 시험 샘플이 대조군 샘플보다 염색 강도 또는 양성 염색된 세포의 수의 증가를 나타내면, 시험 샘플은 CLDN18.2 발현에 대해 양성으로 결정될 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2의 발현 수준은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어, 양성으로 염색된 세포의 상대적 비율 및 세포막 상의 염색 강도의 결정에 의해 정량화될 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2 발현 수준은 샘플에서 양성으로 염색된 세포(즉, CLDN18.2 양성 세포)의 백분율에 기초하여 정량화된다. CLDN18.2 양성 세포는 항-CLDN18.2 항체 염색에 대해 임의의 강도의 적어도 부분 막 염색을 갖는 세포이다. 예를 들어, 샘플에서 CLDN18.2 발현을 평가하기 위해, 관찰자는 현미경 하에서 하나 이상의 선택된 필드(들)에서 CLDN18.2+ 세포막의 수를 검사하고 CLDN18.2에 대해 양성 세포의 백분율을 계산하거나 추정할 수 있다. 샘플이 매우 이질적인 경우 샘플을 영역으로 나눌 수 있으며 각 영역은 별도로 점수가 매겨진 다음 단일 백분율 값 집합으로 결합된다.
특정 실시예에서 발현 수준은 샘플 내의 CLDN18.2 (예를 들어, 막-결합된 CLDN18.2)에 대한 염색 강도에 기초하여 정량화된다. 예를 들어, 4-포인트 HSCORE와 같은 강도 점수는 0 (염색 없음), 1+ (약한 염색), 2+ (뚜렷한 염색), 3+ (강한 염색) 및 4+ (매우 강한 / 포화 신호) 범위의 염색 강도에 기초하여 계산될 수 있으며 각 강도 (0 ~ 100 %)에서 염색된 세포의 퍼센트를 곱할 수 있다 (세부 정보를 매카트리, K.S.Jr 등, 암 연구 46(보충 8):4244s-4248s (1986)에서 참조). 다른 예로, 알프레드 점수는 비율 점수(PS) 및 강도 점수(IS)를 합산하여 총 점수(TS, 범위 0 내지 8)에 기초하여 계산될 수 있다. PS는 0 내지 5 범위의 양성 종양 세포의 비율이다(0 = 양성 세포 없음, 1 = 1/100의 세포는 양성, 2 = 1/10의 세포는 양성, 3 = 1/3의 세포는 양성, 4 = 2/3의 세포는 양성, 5 = 모든 종양 세포는 양성이다). IS는 0 내지 3 범위의 양성 종양 세포의 평균 염색 강도를 의미한다 (0 = 음성, 1 = 약함, 2 = 중간 염색, 3 = 강한 염색) (세부 정보를 알프레드 DC 등, 북미 병리학회지 11: 155-168 (1998)에서 참조).
특정 실시예에서 샘플은 독립적으로 작동하는 두 명의 관찰자에 의해 평가되고, 백분율 또는 점수는 후속적으로 통합된다. 특정 실시예에서 양성 및 음성 세포의 확인은 적절한 소프트웨어를 사용하여 수행되거나 점수가 매겨진다.
특정 실시예에서 CLDN18.2의 수준은 예를 들어, 제어 값 또는 표준 곡선으로 정규화함으로써 결정될 수 있다. 대조군 값은 음성 대조군 샘플 또는 블랭크 대조군 샘플로부터 미리 결정되거나 동시에 결정될 수 있다.
특정 실시예에서 진단 또는 임상 적용을 위해, 시험 샘플 내의 CLDN18.2의 발현 수준 (예를 들어, 세포 표면 상에 노출됨)은 임계 수준과 비교된다.
CLDN18.2 발현과 관련하여 "임계 수준" 또는 "임계 값"은, CLDN18.2 발현에 대해 세포 표면 CLDN18.2 발현에 대해 음성인 것으로부터 양성인 것을 구별할 수 있게 하는 발현 수준, 또는 CLDN18.2-관련 상태, 예를 들어, 암, 또는 대상체에서 암의 발병 또는 발병에 대한 위험에서 판결 또는 배제를 허용하는 발현 수준, 또는 암의 치료를 받고 있는 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 것을 허용하는 임계 수준이다. 특정 실시예에서 임계값은 대조군 발현 수준에 대해 결정된다.
예를 들어, 임계값은 샘플이 CLDN18.2의 양성 발현을 갖는 것으로 스코어링되는 수준 이상일 수 있고, 따라서 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 대한 적격성일 수 있다. 샘플 내의 CLDN18.2의 수준이 임계값에 도달하거나 그 이상이면, 이는 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태의 존재 및/또는 CLDN18.2-표적제에 반응할 가능성을 나타낼 수 있다.
임계 수준은 예를 들어, 샘플의 유형, 검출 방법, 진단될 질환 또는 병태, 및/또는 사용될 CLDN18.2-표적제를 포함하는 다양한 인자를 고려하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2 또는 CLDN18.2-발현 세포의 존재 및/또는 임계 수준에 비해, 예를 들어, CLDN18.2-관련 병태가 없는 대상체 (예를 들어, 비암성 대상체)에 비해 증가되는CLDN18.2 또는 CLDN18.2-발현 세포의 양은, 환자에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태 (예를 들어, 암 질환)의 존재 또는 위험 (즉, 발전에 대한 잠재성)을 나타낸다.
특정 실시예에서 임계 수준은 임의의 강도의 적어도 부분적인 막 염색을 갖는 CLDN18.2 양성 세포의 백분율 (%)이다. 특정 실시예에서 CLDN18.2 양성 세포의 백분율의 임계 수준(%)은 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 또는 70%이다.
특정 실시예에서 샘플은 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체로부터의 것이다. 본 발명에 사용된 용어 "CLDN18.2-관련 질환 또는 병태"는 위 이외의 건강한 또는 비암성 조직 또는 기관에서의 상태와 비교하여 병든 조직 또는 기관의 세포에서 증가된 CLDN18.2의 발현을 갖는 것을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 지칭한다. 증가는 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상의 증가일 수 있다. 특정 실시예에서 병든 조직 또는 기관의 세포에서 CLDN18.2의 발현은 검출 한계를 초과하고/하거나 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 충분히 높다. 일부 실시예에서 CLDN18.2의 발현의 증가는 병든 조직에서만 발견되는 반면, 정상 조직에서의 CLDN18.2의 발현은 검출할 수 없다.
일부 실시예에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태는 세포 표면 또는 막-결합된 CLDN18.2에서 증가된 발현을 특징으로 한다.
일부 실시예에서 CLDN18.2 관련 질환 또는 병태는 암이다. 일부 실시예에서 암 세포는 CLDN18.2를 발현하거나 비정상적으로 발현하는 반면, 상응하는 정상 세포는 CLDN18.2를 발현하지 않거나 더 낮은 수준에서 CLDN18.2를 발현한다. 밀착 연결 단백질로서 CLDN18.2는 종양과 같은 CLDN18.2 관련 질환에 대한 좋은 치료 표적이 될 수 있고, 따라서 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 적합한 환자를 선택하는데 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. CLDNs이 고전적 밀착 연결을 형성하기 위해 연관되는 정상적인 상피 조직 (위 상피 세포 제외)과는 달리, 종양 세포에서 발현되는 CLDNs은 종종 그러한 고전적인 밀착 연결을 형성하지 않으며, 결과적으로 종양 세포는 세포 외 항체 결합 및 면역 요법에 노출되고 접근 가능한 자유 CLDNs을 가질 가능성이 크다.
CLDN18.2는 위암, 폐암 (예: 비소세포 폐암 (NSCLC, 편평 / 비 편평), 소세포 폐암 (SCLC)), 기관지암, 골암, 간담도암, 췌장암, 유방암 (기저 유방암, 관암종 및 소엽 유방암을 포함), 간암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 두경부암, 척추암, 뇌암, 자궁경부암, 자궁암, 자궁내막암, 결장암, 두경부암, 담낭암, 대장암, 결장암, 직장암, 항문암, 식도암, 위장암, 피부암, 전립선암, 뇌하수체암, 위암, 질암, 갑상선암, 교모세포종, 성상 세포종, 흑색종, 골수이형성증후군, 육종, 기형종, 담관암종 및/또는 선암종, 및/또는 이의 전이, 특히 크루켄베르크 종양, 복막 전이, 및 림프절 전이와 같은 위암 전이와 같은 원발성 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 중요한 표적이다.
샘플은 바람직하게는 암 세포 또는 조직이고, 특히 종양원성 위, 식도, 췌장, 폐, 난소, 결장, 간, 두경부 및 담낭암 세포 또는 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시예에서 상기 암은 신장 세포암, 위 암종, 중피종, 흑색종, 자궁 경부암, 흉선 암, 골수종, 진균증, 메르켈 세포암, 간세포 암종 (HCC), 섬유 육종, 점액육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근 육종, 횡문근육종, 악성 림프종, 기저 세포 암, 한선암종, 수질 갑상선 암종, 유두 갑상선 암종, 갈색 세포종 피지선 암종, 유두 암, 유두선 암종, 수질 암종, 기관지원성암종, 간암, 담관도암종, 융모막 암종, 빌름스종양, 자궁 경부암, 고환 종양, 정상피종, 고전적 호지킨 림프종 (CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포 / 히스티오사이트가 풍부한 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 급성골수세포백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수세포 (과립구) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성다혈구증, 비만 세포 유래 종양, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 광범위 큰 B세포림프종 (DLBCL), 모세포 림프종, NK / T 세포외 림프종, 비인두 암종, HHV8 관련 원발성 삼출액 림프종, 비 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 골수이형성 증후군, 털세포백혈병, 및 골수이형성, 원발성 CNS 림프종, 척추 종양, 뇌줄기신경아교종, 성상세포종, 수모 세포종, 두개 인두종, 뇌질피복 세포증, 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경집종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막모세포종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 실시예에서 암은 CLDN18.2 발현 암이다. 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준은 암 세포가 CLDN18.2를 발현하는지 여부, 및 암이 CLDN18.2 표적제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지 여부를 나타낸다.
본 발명에 사용된 "CLDN18.2-표적제"는 세포, 조직 또는 생체에서 CLDN18.2 단백질 또는 핵산(DNA 또는 mRNA)을 표적하는 하나 이상의 제제를 지칭한다. CLDN18.2 표적제는 CLDN18.2 유전자 산물의 발현을 감소/제거하거나, CLDN18.2의 신호전달을 억제/방해하거나, CLDN18.2를 비정상적으로 발현하는 세포에 세포독성을 유도할 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2-표적제는 치료학적 항-CLDN18.2 항체, CLDN18.2-결합 분자, CLDN18.2를 표적하는 세포 요법, CLDN18.2를 표적하는 화학적 화합물, 또는 CLDN18.2를 표적하는 치료 핵산을 포함한다. 특정 실시예에서 상기 CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2-발현 세포에 대한 세포 독성을 유도할 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2-표적제는 치료적 항-CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2-결합 분자를 포함한다. 특정 실시예에서 치료적 항-CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2-결합 분자는 CLDN18.2-발현 세포에 ADCC, CDC 또는 ADCP를 유도할 수 있다. 선택적으로, 치료적 항-CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2-결합 분자는 세포독성제, 예를 들어 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성하기 위해 접합될 수 있다. 특정 실시예에서 세포독성제는 세포에 해롭거나 세포를 손상시키거나 죽일 수 있는 임의의 작용제일 수 있다. 특정 실시예에서 세포독성제는 임의로 독소, 화학 치료제 (예를 들어 DNA-알킬화제, 국소이성화효소 억제제, 튜불린-결합제, 성장 억제제, 또는 다른 항암제), 또는 방사성 동위원소이다. 다른 실시예에서 치료적 항-CLDN18.2 항체는 CLDN18.2 단백질 상의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체일 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2-표적화 세포 요법을 포함한다. 특정 실시예에서 CLDN18.2-표적화 세포 요법은 CLDN18.2 결합 키메라 항체 수용체(CAR)를 발현하는 CAR-T(키메라 항체 수용체 조작된 T 세포), TCR-T(유전자 변형된 TCR T 세포) 또는 CAR-NK(키메라 항체 수용체 조작된 NK 세포)를 포함한다. 키메라 항원 수용체(CARs)는 항체의 항원 결합 도메인을 T 세포 활성화를 위한 하나 이상의 신호전달 도메인과 결합하는 조작된 키메라 수용체이다. T 세포 및 네이처 킬러 (NK) 세포와 같은 면역 세포는 CARs 또는 유전자 변형 TCRs을 발현하도록 유전자 조작 될 수 있다 (D.리 등, 신호 전달 및 표적 치료 4, 35 (2019), S.클로이스 등, 수혈 의학 및 혈액 요법; 46:4-13(2019), 왕 W. 등, 암 편지, 472: 175-180(2020) 참조). CAR을 발현하는 T 세포는 CAR-T 세포로 지칭된다. CAR은 T 세포에서 항원 특이적 세포 면역 활성을 조정할 수 있고, CAR-T 세포가 표적화된 항원을 발현하는 세포(예를 들어, 종양 세포)를 제거하는 것을 가능하게 한다. 한 실시예에서 암 세포와 같은 세포 상에서 발현된 CLDN18.2에 본 발명에 제공된 CAR-T 세포의 결합은 상기 CAR-T 세포의 증식 및/또는 활성화를 초래하며, 여기서 상기 활성화된 CAT-T 세포는 세포독성 인자, 예를 들어, 페포린, 그랜자임, 및 과립을 방출할 수 있고, 암 세포의 세포분해 및/또는 아폽토시스를 개시할 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2를 표적하는 치료 핵산은 CLDN18.2-발현 세포 내의 CLDN18.2 유전자 서열, 또는 다른 유전자 서열에 대한 RNA 간섭(RNAi)을 조정할 수 있는 짧은 간섭 핵산(siNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자일 수 있다.
특정 실시예에서 CLDN18.2-표적제는 대상체에서 암 퇴행을 촉진한다. 바람직한 실시예에서 CLDN18.2 표적제제의 치료적 유효량은 암을 제거하는 지점까지 암 퇴행을 촉진한다. "암 퇴행 촉진"은 유효량의 약물을 단독으로 또는 항신생물제와 병용하여 투여하여, 종양 성장 또는 크기의 감소, 종양의 괴사, 하나 이상의 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 병적으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 초래하는 것을 의미한다.
특정 실시예에서 상기 대상체는 항암 요법을 받고 있거나 받았거나, 또는 암 재발을 앓고 있다. 항암-요법은 예를 들어, 화학요법제, 항암제, 방사선 요법, 면역요법, 항혈관신생제, 표적 요법, 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 완화 치료, 암 치료를 위한 수술(예를 들어, 종양 절제술), 또는 화학요법으로부터 발생하는 합병증에 대한 하나 이상의 항구토제 또는 다른 치료법을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
악화 또는 재발은 사람이 과거에 그들에게 영향을 준 상태에 의해 다시 영향을 받을 때 발생한다. 예를 들어, 환자가 암 질환으로 고통 받았다면, 상기 질병의 성공적인 치료를 받고 다시 상기 질병을 발병시킨다. 상기 새로 발병된 질환은 악화 또는 재발로 간주될 수 있다. 그러나, 본 개시에 따르면, 암 질환의 악화 또는 재발은 반드시 그렇지는 않지만, 원래의 암 질환의 부위에서 발생할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 환자가 위종양을 앓고 성공적인 치료를 받은 경우, 악화 또는 재발은 위종양의 발생 또는 위와 다른 부위에서 종양의 발생일 수 있다. 종양의 악화 또는 재발은 종양이 원래 종양의 부위뿐만 아니라 원래 종양의 부위와 다른 부위에서 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 치료를 받은 원래의 종양은 원발성 종양이고 원래 종양의 부위와 상이한 부위의 종양은 이차 또는 전이성 종양이다.
키트
특정 실시예에서 본 개시는 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시예에서 본 발명에 개시된 키트는 진단 키트이다. 키트는 생물학적 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 양의 검출에 유용할 수 있거나, 본 발명에 제공된 진단 방법에 유용할 수 있다.
특정 실시예에서 키트는 임의로 검출가능하게 표지되는 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시예에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 간접적으로 검출가능한 모이어티와 접합된다.
특정 실시예에서 키트는 CLDN18.2에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 복합체를 검출하기 위한 시약 세트를 더 포함하며, 예를 들어 IHC, ICC, 또는 ELISA와 같은 면역검정(샌드위치형 또는 경쟁적 포맷)을 포함하는 다양한 검출 검정에 유용하다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, FFPE 종양 조직 절편에서 면역조직화학을 수행하는데 유용한 시약은 IHC 분석을 수행하기 위한 명령과 함께 키트에 제공된다.
본 발명에 개시된 간접적으로 검출가능한 라벨 또는 모이어티 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 특정 실시예에서 간접적으로 검출가능한 모이어티는 비오틴을 포함한다. 이러한 실시예에서 시약 세트는 검출가능하게 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다.
특정 실시예에서 검출가능한 라벨은 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된다. 특정 실시예에서 키트는 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 검출가능한 라벨과 접합되는 이차 항체를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 항체는 일차 항체 (예를 들어, 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시예에서 이차 항체는 항-마우스 항체, 항-토끼 항체, 또는 항-인간 항체일 수 있다.
검출가능한 라벨은 사용 전에 하나 이상의 성분, 예를 들어, 완충제, 항체-효소 접합체, 효소 기질 등과의 조합을 요구할 수 있으며, 이러한 시약은 키트에 포함될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티가 효소를 포함하는 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 공동 인자(예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 고상 표면에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위한 차단 시약, 세척 시약, 효소 기질 등과 같은 다른 시약이 포함될 수 있다. 상대적 양의 다양한 시약은 분석의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변화될 수 있다. 특히, 시약은 건조 분말로서 제공될 수 있고, 통상 동결건조되며 이는 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 수 있는 부형제를 포함한다. 검출 및/또는 분석 시스템 준비에 대한 지침을 나타내는 인서트 또는 라벨로서의 설명서도 키트에 포함될 수 있다.
키트의 성분은 고체 지지체에 미리 부착될 수 있거나, 또는 키트가 사용될 때 고체 지지체의 표면에 적용될 수 있다. 고상 표면은 튜브, 비드, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로스피어, 또는 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 고정화하는데 적합한 다른 물질의 형태일 수 있다.
이러한 키트에 사용하기 위한 용기는 전형적으로 하나 이상의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 적합한 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 검출 조성물(들)이 배치될 수 있고, 바람직하게는 적절하게 분취된다. 본 발명에 개시된 키트는 전형적으로 상업적 판매를 위한 밀폐된 바이알(들)을 함유하기 위한 수단, 예를 들어, 원하는 바이알(들)이 보유되는 투입 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 것이다. 방사성 라벨, 발색성, 플루오리지닉 또는 다른 유형의 검출가능한 라벨 또는 검출 수단이 키트 내에 포함되는 경우, 라벨화제는 검출 조성물 자체와 동일한 용기 내에 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로 이러한 제 2 조성물이 배치되고 적합하게 인용될 수 있는 제 2 별개의 용기 수단 내에 배치될 수 있다. 선택적으로, 검출 시약은 단일 용기 수단으로 제조될 수 있고, 대부분의 경우, 키트는 전형적으로 상업적 판매 및/또는 편리한 포장 및 전달을 위해 밀폐된 바이알(들)을 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다.
본 발명에 기재된 검출 또는 모니터링 방법을 수행하기 위한 장치 또는 기구가 제공된다. 이러한 장치는 샘플이 입력될 수 있는 챔버 또는 튜브, 선택적으로 장치를 통해 샘플의 유동을 지시하는 밸브 또는 펌프를 포함하는 유체 처리 시스템, 선택적으로 혈액으로부터 혈장 또는 혈청을 분리하기 위한 필터, 포획제 또는 검출 시약의 첨가를 위한 혼합 챔버, 및 선택적으로 포획제 면역복합체에 결합된 검출가능한 라벨의 양을 검출하기 위한 검출 장치를 포함할 수 있다. 샘플의 유동은 수동적(예를 들어, 모세관, 수압, 또는 샘플이 적용된 후 장치의 추가 조작을 필요로 하지 않는 다른 힘에 의해) 또는 능동적(예를 들어, 기계적 펌프, 전기침투 펌프, 원심력, 또는 증가된 기압을 통해 생성된 힘의 적용에 의해), 또는 능동 및 수동적 힘의 조합에 의해 이루어질 수 있다.
실시예
본 개시가 특정 실시예들(이들 중 일부는 바람직한 실시예들)을 참조하여 특별히 도시되고 설명되었지만, 본 개시의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 그 안에서 이루어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다.
제 1예: 면역화를 위한 항원의 제조
1. 항원 펩티드의 설계
항체의 에피토프를 CLDN18.1이 아닌 CLDN18.2로 제한하기 위해, CLDN18.2(젠뱅크 가입 번호: NP_001002026)에 고유한 펩티드는 MabSpace Biosciences (쑤저우) Co., Limited.에 의해 설계되었다. 이 펩티드의 코딩 서열(서열 ID번호 19: DQWSTQDLYN)은 CLDN18.2의 아미노산 잔기 Asp28-Asn37 (D28 내지 N37)에 위치하였다.
2. 펩티드의 합성
항원 펩티드를 SANGON BIOTECH (상하이)에서 합성하여 동물 면역화에 사용하였다.
제 2예: 항체 생성
1. 예방 접종 및 하이브리도마 융합
6-8주 동안 상이한 균주의 마우스를 보조제로서 CFA와 함께 40 μg/마우스 펩티드 (KLH와 접합됨)로 면역화시키고, 각 마우스를 4주 동안 일주일에 3 번에 11 부스트 (다중 부위 피하 주사)를 받았고, 이어서 1차 면역화 후 2회, 3일 동안 일주일 간격 부스트가 뒤따랐다. 혈청 역가를 결정하기 위해, 100 μl/웰 연속 희석된 마우스 혈청을 항원 펩티드에 의해 코팅된 플레이트에 첨가한 다음, 4°C에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 완충액 세척에 의해 3회 세척한 다음, 100 μl/웰 염소 항-mIgG-HRP를4°C에서 또 다른 인큐베이션을 위해 첨가하였다. 세척 완충액으로 세척한 후, TMB를 플레이트 상에 HRP와 반응시키기 위해 첨가하였다. 그 다음 OD450 nm의 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 의해 판독하고, 역가를 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어에 의해 분석하였다. 더 높은 역가를 갖는 마우스를 다음의 융합 절차를 위해 선택하였다.
2. 융합
융합 나흘 전에, 각 마우스를 20 μg 펩티드로 복강내 부스팅하였다. 융합 당일에, 비장을 무균적으로 제거한 다음, 단일 세포 현탁액으로 처리하였다. 적혈구를 용해시켜 비장세포를 수득하였다. 생존 로그상 골수종 세포(SP2/0)를 뮤린 비장세포를 융합 배지에서 1:1 비율로 혼합한 다음, 1분 동안 전기융합시켰다. 세포를 재현탁시키고 37°C, 5% CO2 인큐베이터의 96-웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 7일 배양 후, 성장 배지를 신선한 성장 배지로 교환하였다. 하이브리도마 상청액의 스크리닝은 신선한 성장 배지 변화 후 2-3일 후에 시작되었다.
제 3예: 결합 스크리닝, 양성 하이브리도마 클론의 서브클로닝 및 소규모 항체 생산
1. ELISA 분석법에 의한 결합 스크리닝
하이브리도마 상청액을 항원 결합 스크리닝을 위해 수집하였다. 100 μl/웰 하이브리도마 상청액을 항원 펩티드에 의해 코팅된 플레이트에 첨가한 다음, 4°C에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 완충액 세척에 의해 3회 세척한 다음, 100 μl/웰 염소 항-mIgG-HRP를 4°C에서 또 다른 배양을 위해 첨가하였다. 세척 완충액으로 세척한 후, TMB를 플레이트 상에 HRP와 반응시키기 위해 첨가하였다. 그 다음 OD490 nm의 플레이트를 마이크로플레이트 판독기에 의해 판독하였다. ELISA 결합 양성 클론을 선별하고 확장하였다. 2일 후, 선택된 클론의 하이브리도마 상청액의 결합을 동일한 방법으로 시험하고, 양성 클론을 서브클로닝을 진행하였다.
2. 양성 하이브리도마 클론의 서브클로닝
원하는 결합 프로파일을 갖는 양성 하이브리도마 웰로부터의 세포를 96-웰 플레이트에서 제한된 희석을 위해 선택하였다. 희석된 세포를 7일 동안 성장시켰다. 적절한 세포 질량에 도달하면, 각 웰로부터 상청액을 수집하고, 상기와 동일한 ELISA 결합 검정을 사용하여 재스크리닝하였다.
각각의 96-웰 플레이트로부터, 가장 높은 세포 결합 활성을 갖는 클론을 웰 당 200 μl의 하이브리도마 성장 배지를 갖는 96-웰 플레이트 내로 2차 라운드 제한 희석을 위해 확장시켰다. 7일 후, 96-웰 플레이트로부터의 세포의 상청액을 동일한 ELISA 결합 검정에 의해 분석하였다. 서브클로닝은 90/96웰 이상이 양성 결합 신호를 표시할 때까지 2회 이상 수행되었다. 각 클론의 가장 높은 결합 활성을 갖는 2개의 서브클론 (즉, 69H2 및 14G11)을 정제된 항체 생산을 위해 확인, 확장 및 배양하였다. 아이소타이프는 표준 방법을 사용하여 결정하였다.
3. 소규모 항체 생산
하이브리도마 세포를 14일 동안 접종하고 배양하였다. 모노클로날 항체 (mAbs)를 하이브리도마 세포 배양물로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피(단백질 A 고성능(바이오 래드))로 정제하였다.
크로마토그래피 정제 후, 이들 mAbs를 투석에 의해 PBS로 제형화하고, 여과하는 단계를 따랐다.
제 4예: 세포 블록에 대한 항체 면역세포화학적 스크리닝
1. 세포 블록 절편 준비
HEK293-인간 CLDN18.2 세포(이하, HEK293-CLDN18.2로 지칭됨) 및 HEK293-인간 CLDN18.1 세포(이하, HEK293-CLDN18.1로 지칭됨)는 MabSpace Biosciences(쑤저우) Co.Limited에 의해 구축되었다. 간략하게, HEK293 세포(상하이 생물 과학 연구소, Cat#GNhu43)를 pcDNA3.1/hCLDN18.2 또는 pcDNA3.1/hCLDN18.1 플라스미드로 형질감염시키고, G418로 선택하여 안정한 발현 세포주 HEK293-CLDN18.2 또는 HEK293-CLDN18.1을 얻었다. HEK293-CLDN18.1 상에서 CLDN18.1의 발현, 및 HEK293-CLDN18.2 상의 CLDN18.2의 발현을 각각 양성 대조군 항체를 사용하여 FACS로 시험 및 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, HEK293-CLDN18.1 세포는 CLDN18.1에 결합하는 항체 EPR19203 (제품명 ab222513으로 Abcam으로부터 입수가능함)에 대해 양성 결합 신호를 보였고, HEK293-CLDN18.2 세포는 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체 18B10 (PCT 출원 PCT/CN2019/101563 참조)에 대해 양성 결합 신호를 보였다.
인간 CLDN18.2 (HEK293-CLDN18.2) 또는 CLDN18.1 (HEK293-CLDN18.1)의 높은 발현 수준을 갖는 HEK293 및 HEK293 세포를 수확하고 실온에서 30분 동안 4% 중성 완충 파라포름알데히드 (PFA)에 고정시켰다. 원심분리 후, 세포를 PBS에 재현탁시키고, 이어서 57°C에서 200 μl 용융 한천 내로 분산시키고, 즉시 4°C에서 응고시켰다. 한천-세포 혼합을 구배 알코올에서 탈수시키고, 자일렌에서 제거하였다. 60°C에서 파라핀 왁스에 침윤된 후, 한천-세포 혼합물을 표준 절차에 따라 파라핀 왁스에 매립하고 3 μm 두께의 절편으로 절단하고, 이를 즉시 양전하 슬라이드 상에 장착하였다.
2. 세포 블록 절편에 대한 항체 면역세포화학적 스크리닝
CLDN18.2 특이적이고 민감한 항체를 스크리닝하기 위해, 면역세포화학(ICC)을 파라핀 포매(FFPE) HEK293, HEK293-CLDN18.2 및 HEK293-CLDN18.1 세포 블록 절편을 사용하여 수행하였다. 탈파라핀화 및 재수화 후, 모든 절편을 97-99°C에서 25분 동안 EnVision™ FLEX 표적 검색 용액(다코, K8002)에서 비등시켜 항원 검색을 진행시키고, 이어서 켄칭하고, EnVision™ FLEX 퍼옥시다제-차단 시약(다코, K8002)으로 차단하고, 적절하게 희석된 항체와 함께 배양하였다. 항체 결합은 EnVision™ FLEX+, 마우스 (링커)로 시각화되었고, 이어서 EnVision FLEX /hRP 및 EnVision™ FLEX 기질 작동 용액 (다코, K8002)으로 시각화되었다. 절편은 마침내 헤마톡실린으로 대조 염색되고 영구적인 장착 매체로 장착되었다. 염색 패턴에서 유의차는 관찰되지 않았으며 항체 간의 염색 강도는 약한 것에서 강한 것까지 다양했다.
표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 항체 69H2 및 14G11의 클론은 HEK293-CLDN18.2 표면에서 강하고 특이적으로 염색되었으나 1 nM에서 HEK293 및 HEK293-CLDN18.1 상에서는 음성으로 염색되었고, 민감도를 시험하기 위해 0.5 nM로 추가로 적정되었다. 69H2F7E6, 69H2D3B1, 69H2E1D3은 모두 항체 69H2의 클론이고, 69H2와 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 공유하였다. 14G11G2D2, 14G11A4E1, 및 14G11F5E1은 모두 항체 14G11의 클론이고, 14G11과 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 공유하였다.
항-CLDN18.2 항체 GC182의 염색을 대조군으로 사용하였고, 이는 HEK293-CLDN18.2 및 HEK293-CLDN18.1 세포 둘 다에서 양성으로 염색되었다. 항체 GC182는 서열 ID번호 22의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 ID 번호 23의 경쇄 가변 영역 서열을 가지며, WO2013167259에 개시된 서열에 따라 Mabspace Bioscience에 의해 생성되었다. 표 3의 결과는 항체 GC18.2가 CLDN18.1과 교차 반응할 수 있음을 나타내었고, 따라서 CLDN18.2에 특이적이지 않았다.
GC182 중쇄 가변 영역 서열 (서열ID 번호22):
QIQLVQSGPELKKFGETVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRTGFDYWGQGTTLTVSS
GC182 경쇄 가변 영역 서열 (서열 ID 번호 23):
DIVMTQAAFSIPVTLGTSASISCRSSKNLLHSDGITYLYWYLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPNRFSGSESGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCVQVLELPFTFGGGTKLEIK
표 3 면역세포화학적 염색에 의한 세포 블록 절편에 대한 항체 스크린
Figure pct00004
Figure pct00005
제 5예: 선택된 항체의 클로닝 및 재조합 생산
재조합 항체의 생성
마우스 항-인간 CLDN18.2 항체 14G11 및 69H2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에서의 서열을 후보 하이브리도마 세포주로부터 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 수득하였다. 시퀀싱 분석 및 확인 후, 마우스 카파 불변 영역에 융합된 경쇄 가변 영역 (VL)의 서열과 마우스 IgG1 불변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역 (VH)의 서열을 포함하는 가변 영역 유전자를, 항체 생산 및 정제를 위해 재조합 발현 벡터인 pcDNA3.1(+)에 클로닝하였다.
14G11 및 69H2 항체의 중쇄 및 경쇄를 하기와 같이 각각 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역 및 카파 경쇄 불변 영역에 각각 연결하였다:
마우스 IgG1 중쇄 불변 영역 (서열ID 번호17):
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
마우스 카파 경쇄 불변 영역(서열ID 번호18):
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
재조합 항체의 발현 및 정제
ExpiCHO 세포를 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터로부터의 동량의 DNA로 ExpiCHO 형질감염 키트를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 8% CO2가 있는 37°C 인큐베이터내 125rpm에서 진탕 플라스크에서 배양하였다. 세포 배양물을 10일째에 수확하고, 수확된 항체를 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 생성된 항체를 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피 (TSK 겔 G3000SWXL, TOSOH)를 사용하여 순도 수준을 결정하기 위해 분석하였다.
제 6예: ELISA 및 FACS 분석법에 의한 hCLDN18.2 내지 hCLDN 18.1의 결합 선택성 평가
ELISA에 의한 hCLDN18.2 펩티드 (aa28-37)와의 특이적 결합
1 μg/ml의 펩티드(100μL/웰)를 고결합 투명 폴리스티렌 96 웰 플레이트에 코팅하고 차단 버퍼로 차단하였다. 이어서, 블로킹 완충액에 연속 희석된 항체 (150 내지 0.0732 ng/ml)를 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액을 사용하여 6회 세척한 다음, Ms IgG(HRP)에 100 μl/웰 염소 pAb를 첨가하여 실온에서 1.5시간 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 세척한 후, TMB를 플레이트 상에 HRP와 반응시키기 위해 첨가하였다. 그 다음 OD450nm의 플레이트를 SpectraMax i3x (분자 장치)에 의해 판독하였다. 14G11G2D2 및 69H2F7E6은 높은 친화도를 갖는 펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 반면, GC182는 선형 펩티드에서 에피토프를 인식할 수 없다.(도 3)
ELISA에 의한 재조합 hCLDN18.2 및 hCLDN18.1 단백질에 대한 재조합 항-Claduin18.2 항체의 결합 선택성 분석
인간 재조합 CLDN18.2(N-6His) 변형체 (카탈로그 번호 NC101 하에 노보단백질로부터 수득됨) 및 인간 재조합 CLDN18.1(N-8His) 변형체 (카탈로그 번호 CR54 하에 노보단백질로부터 수득됨)를 이 검정에 사용하였다. 인간 재조합 CLDN18.2 (N-6His) 변형체는 인간 CLDN 18.2의 세포외 도메인이 루프를 형성하도록 허용하도록 접히거나 연관시킬 수 있는 서열에 의해 둘러싸인 인간 CLDN 18.2의 세포외 도메인(잔기 Ala24-Ala81, 서열 ID번호 26)을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 유사하게, 인간 재조합 CLDN18.1 (N-8His) 변형체는 인간 CLDN 18.1의 세포외 도메인이 루프를 형성하도록 허용하도록 접히거나 연관시킬 수 있는 서열에 의해 둘러싸인 인간 CLDN 18.1의 세포외 도메인(잔기 Asp28-Leu76, 서열 ID번호 27)을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
1 μg/ml의 인간 재조합 CLDN18.2(N-6His) 변형체 또는 인간 재조합 CLDN18.1(N-8His) 변형체(100μL/웰)를 고결합 투명 폴리스티렌 96 웰 플레이트 상에 코팅하고 차단 완충액으로 차단하였다. 블로킹 완충액에 연속 희석된 항체 ( 100 내지 0.0244ng/ml)를 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS+0.1%) 와셔를 사용하여 6회 세척한 다음, Ms IgG (HRP)에 100 μl/웰 염소 pAb를 첨가하여 1.5 hr 동안 RT에서 배양을 위해 첨가하였다. 세척 완충액으로 세척한 후, TMB를 플레이트 상에 HRP와 반응시키기 위해 첨가하였다. 그 다음 OD450nm의 플레이트를 SpectraMax i3x (분자 장치)에 의해 판독하였다. 14G11G2D2 및 69H2F7E6 모두 각각 12.75ng/ml 및 13.87ng/ml의 EC50을 사용하여 높은 친화도를 갖는 인간 재조합 CLDN18.2(N-6His)에 특이적으로 결합할 수 있다.(도 4). 14G11G2D2 및 69H2F7E6 중 어느 것도 인간 재조합 CLDN18.1(N-8His) 단백질에 특이적인 결합을 나타내지 않았다.(도 5). 대조군으로서, GC182는 인간 재조합 CLDN18.2 (N-6His) 또는 인간 재조합 CLDN18.1 (N-8His)에 특이적인 결합을 나타내지 않았다(도4, 5). 이는 14G11G2D2 및 69H2F7E6이 CLDN18.2의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합하지만, GC182가 그러한 에피토프를 인식하지 못한다는 것을 나타낸다.
HEK293-hCLDN18.2 및 HEK293-hCLDN 18.1 세포주에 대한 FACS 분석
로그상 HEK293-hCLDN18.2 또는 HEK293-hCLDN18.1 세포를 수집하고 세척하고 재현탁시켰다. 차단 완충제에 희석된 항체(20ug/mL)를 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 차단 완충제로 2회 세척한 다음, 차단 완충액에 2차 항체(염소 항-마우스 IgG(H+L) 교차 흡착된 이차 항체, 알렉사 플루오르 488, 써모피셔)를 첨가하였다. 세포를 4°C에서 1시간 동안 배양한 다음, 차단 완충제로 두 번 세척하고, 차단 완충제에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 FACS 튜브 내로 옮기고, 세포에 대한 항체의 결합을 유세포 분석 검정 (BD Accuri C6)을 사용하여 검출하였다. 항체 18B10 및 EPR19203을 각각 HEK-hCLDN18.2 세포 및 HEK-hCLDN 18.1 세포에 대한 분석을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 항체 14G11G2D2 및 69H2F7E6 어느 것도 천연 입체형태와 세포 표면 상에서 발현된 인간 클라우딘18.2 또는 클라우딘 18.1에 결합할 수 없다.
제 7예: ForteBio에 의한 재조합 hCLDN18.2 단백질에 대한 재조합 항-클라우딘 18.2의 결합 친화도 결정
100 nM 인간 재조합 CLDN18.2(N-6His)(노보단백질, NC101) 단백질을 1Х키네틱스 완충제((PBS+0.1%BSA+0.02% 트윈20) 중의 200s 동안 예비습윤 Ni-NTA 바이오센서(폴, 18-5101) 상에 로딩하였다. 기준선(60s)으로서 1Х키네틱스 완충액에서 평형화시킨 후, 센서를 각각 1Х키네틱스 완충액과 함께 연속 희석된 항체 (50nM, 25nM)에 침지시키고, 회합(kon)을 결정하기 위해 200s 동안 배양하고, 이어서 200s 동안 1Х키네틱스 완충액(koff)에서 해리시켰다. 바이오 센서는 재생 완충액에서 5s 동안 재생되고, 중화 완충액에서 5s 동안 3회 중화된다. 모든 절차는 옥텟 레드 96(폴)로 30°C에서 수행되었다. KD 결합 친화도를 kon 대 koff의 비율을 사용하여 계산하고 분석하였다.(도 6). 69H2F7E6은 1.48nM의 KD 값을 나타내었고, 14G11G2D2는 0.213 nM의 KD 값을 나타내었다.
제 8예: 정상 조직을 이용한 항체의 특이성 검증
CLDN18.2는 고 선택적 위 계보 항원으로, 그의 발현은 위 점막의 단기간 분화된 상피 세포로 제한되는 반면, CLDN18.1 발현은 폐로 제한된다. 이를 기초로 하여, 선택된 항체는 CLDN18.1에 특이적으로 결합하는 것이 아니라 CLDN18.2에 대한 특이적 결합을 확인하기 위해 다양한 관련 정상 조직에서 분석된다. 면역조직화학(IHC)은 4% 중성 완충 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 정상 창자, 신장, 편도선, 갑상선, 골격근, 위, 폐 및 유방 절편에서 수행되었다. 탈파라핀화 및 재수화 후, 모든 절편을 97-99°C에서 25분 동안 EnVision™ FLEX 표적 검색 용액(다코, K8002)에서 비등시켜 항원 검색을 진행시키고, 이어서 켄칭하고, EnVision™ FLEX 퍼옥시다제-차단 시약(다코, K8002)으로 차단하고, 적절하게 희석된 항체와 함께 배양하였다. 항체 결합은 EnVision™ FLEX+, 마우스 (링커)로 시각화되었고, 이어서 EnVision FLEX /hRP 및 EnVision™ FLEX 기질 작동 용액 (다코, K8002)으로 시각화되었다. 절편은 마침내 헤마톡실린으로 대조 염색되고 영구적인 장착 매체로 장착되었다.
클론 14G11G2D2 및 69H2F7E6을 FFPE 정상 조직에 대한 추가 특이성 분석을 위해 선택하였다. 69H2F7E6 및 14G11G2D2 모두 염색 강도, 패턴 및 선택도에서 잘 수행되었다. 69H2F7E6 및 14G11G2D2 모두 FFPE 위 절편에서 강한 염색 강도를 보였지만 폐, 창자, 신장, 골격근, 편도선, 갑상선 및 유방 절편에서는 염색은 무시할 수 있다 (표 4 및 도 7A 및 7B참조). 모든 염색된 세포는 상피 세포이지만, 림프구, 혈관, 섬유세포, 또는 평활근 세포를 포함하는 다른 세포 유형은 아니다. 대조적으로, 항-CLDN18.2 항체 GC182는 각각 FFPE 위 및 폐 절편에서 강하고 적당한 염색 강도를 나타냈으며, CLDN18.2 및 CLDN18.1 둘 다에 결합한다는 것을 확인하였다. 비교적으로, 14G11G2D2는 69H2F7E6보다 더 잘 수행되었고 추가 IHC 시험의 후보로 선택되었다. IHC 염색의 분석 결과를 표 4및 도7A와 7B에 나타내었다.
또한, 선택된 항체의 특이성 및 민감도는 정상 조직 상의 기존의 항-CLDN18.2 항체 EPR19202 (Abcam, ab222512)와 비교되었다. IHC를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 0.374ug/ml의 농도에서 항체 EPR19202는 농도, 즉 0.15 ug/ml에서 항체 14G11G2D2보다 위 조직에서 약한 염색 강도를 나타냈으며, 이는 ERP19202가 14G11G2D2보다 덜 민감하다는 것을 나타낸다. 특히, 항체 EPR19202는 골격근에 대한 비특이적 염색을 보인 반면(도 8), 항체 14G11G2D2는 CLDN18.2에 대한 특이성을 유지하였고 CLDN18.2가 존재하지 않는 임의의 정상 조직과 교차 반응하지 않았다.
Figure pct00006
제 9예: 상이한 종양 유형의 종양 조직 샘플을 이용한 CLDN18.2 발현의 IHC 기반 평가를 위해 확인된 항체의 적용
일본 위암 환자에서 CLDN18.2의 발현률은 87%의 종양 샘플에서 검출가능한 것으로 보고되었으며, 중등도 내지 강한 CLDN18.2 발현은 52%의 종양 샘플에서 관찰되었다(로데 등, 일본 임상암학회지. 2019년 9월1일;49(9):870-876). 또한, CLDN18.2의 비정상적인 자궁외 발현은 췌장, 난소, 담즙 및 폐 선암종을 포함하는 다른 암 세포에서도 보고되었다(사힌 등 임상암연구, 2008, 14(23): 7624-7634; 카란자발라 ZE 등, 외과 병리학의 미국 저널, 2008년 2월;32(2):188-96; Micke P 등, 국제 암 저널, 2014년11월1일;135(9):2206-14; 키이라 Y 등, 버초스 문헌, 2015 년3월;466(3):265-77).
14G11G2D2를 염색 강도, 패턴 및 양성을 보장하기 위해 다양한 관련 암 조직에 대해 추가로 분석했다. 면역조직화학(IHC)은 4% 중성 완충 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 위, 췌장 및 담관암종 및 비소세포 폐암(NSCLC) 종양 절편에서 수행되었다. 탈파라핀화 및 재수화 후, 모든 절편을 97-99°C에서 25분 동안 EnVision FLEX 표적 검색 용액(다코, K8002)에서 비등시켜 항원 검색을 진행시키고, 이어서 켄칭하고, EnVision™ FLEX 퍼옥시다제-차단 시약(다코, K8002)으로 차단하고, 적절하게 희석된 14G11G2D2 항체와 함께 배양하였다. 항체 결합은 EnVision™ FLEX+, 마우스 (링커)로 시각화되었고, 이어서 EnVision FLEX /hRP 및 EnVision™ FLEX 기질 작동 용액 (다코, K8002)으로 시각화되었다. 절편은 마침내 헤마톡실린으로 대조 염색되고 영구적인 장착 매체로 장착되었다. 모든 샘플은 상이한 강도(음성 (-), 약한 (+), 중도 (++), 강한 (+++))의 막 염색을 갖는 모든 가시적 종양 세포에 대한 양성 염색된 종양 세포의 상대적 비율에 의해 분석되었다. 막 염색만이 양성으로 간주되었고, 인간 정상 위장은 각 염색에 대해 양성 대조군으로 작용하였다. 위, 췌장암, 담관암종 및 NSCLC 암 조직에서 각각 14G11G2D2에 의해 약한 내지 강한 막 신호가 생성되었고( 도 9참조), 양성 종양 세포의 비율은 서로 다른 종양에 걸쳐 개별적으로 다양하였다(표 5-1 위암에 대해, 표 5-2 췌장암에 대해, 표 5-3 담관암종에 대해 및 표 5-4 NSCLC 암 조직에 대해 참조). 위암, 췌장암종 및 NSCLC 암 조직에 걸친 CLDN18.2발현 양성 및 유병률을 표 6에 요약하였다.
표 5-1 재조합 14G11G2D2 마우스 단일클론항체를 이용한 위암 조직에서의 CLDN18.2 발현 분석
Figure pct00007
Figure pct00008
표 5-2 재조합 14G11G2D2 마우스 단일클론항체를 이용한 췌장암 조직에서의 CLDN18.2 발현 분석
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
표 5-3 재조합 14G11G2D2 마우스 모노클로날 항체를 이용한 담관암종에서의 CLDN18.2 발현의 분석
Figure pct00012
Figure pct00013
표 5-4 재조합 14G11G2D2 마우스 단일클론항체를 이용한 NSCLC 암조직에서의 CLDN18.2 발현 분석
Figure pct00014
Figure pct00015
표 6. 상이한 암 유형에서의 CLDN18.2 발현의 양성 및 유병률 분석
Figure pct00016
제 10예: CLDN18.2 비오티닐화 14G11G2D2를 사용한 위장에서의 IHC 염색 검증
비오티닐화 14G11G2D2 (14G11G2D2-비오틴)를 제조하였다. 간략하게, 비오티노마카프로에이트 NHS 에스테르 (시그마, B2643-10MG)를 원액으로서 20 mg/mL의 무수 DMF에서 제조하였다. 표지될 각 1mg의 14G11G2D2 항체에 대해 10μl 원액을 첨가하고 실온에서 1h 동안 부드럽게 혼합하였다. 저분자량의 반응 생성물은 제조자의 지시에 따라 제바™ 스핀 탈염 컬럼 (써모피셔, 89890) 상에서 생성물을 탈염시킴으로써 제거되었다.
면역조직화학(IHC)은 4% 중성 완충 포르말린-고정 파라핀-포매된 위 샘플의 슬라이드에서 수행되었다. 탈파라핀화 및 재수화 후, 모든 슬라이드를 97-99°C에서 25분 동안 EnVision™ FLEX 표적 검색 용액(다코, K8002)에서 비등시킴으로써 항원 검색을 진행시키고, 이어서 켄칭하고, 지시에 따라 IHC 비오틴 블록 키트(MaiXin, BLK-0001)로 차단하고, 37°C에서 30분 동안 3ug/mL의 사내 비오티닐화 모노클로딘 마우스 항-클라우딘 18.2 (14G11G2D2-비오틴) 항체와 함께 배양하였다. 항체 결합은 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 스트렙타비딘 (MaiXin, SP KIT-D1) 및 EnVision™ FLEX 기질 작동 용액 (다코, K8002)으로 가시화되었다. 절편은 마침내 헤마톡실린으로 대조 염색되고 영구적인 장착 매체로 장착되었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 14G11G2D2-비오틴은 강도 및 특이성에 대하여 14G11G2D2와 동일한 염색 패턴을 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> MABSPACE BIOSCIENCES (SUZHOU) CO., LIMITED <120> ANTI-CLDN18.2 ANTIBODIES AND DIAGNOSTIC USES THEREOF <130> 063694-8004WO02 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Arg Asn Tyr Phe His 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Phe Asp Ile Glu Tyr Ser Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asn Tyr Gly Ser Thr Phe Gly Tyr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Thr Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa at location 1 can be Arg or Thr, Xaa at location 2 can be Asn or Tyr. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa at location 4 can be Phe or Ile. <400> 8 Xaa Xaa Tyr Xaa His 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Trp Ile Tyr Pro Arg Gly Gly Asn Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Asn Tyr Arg Ser Thr Phe Gly Tyr 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at location 5 can be Gly or Arg. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(10) <223> Xaa at location 7 can be Phe or Gly, Xaa at location 8 can be Asp or Asn, Xaa at location 9 can be Ile or Thr, Xaa at location 10 can be Glu or Val. <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa at location 12 can be Ser or Asn. <400> 12 Trp Ile Tyr Pro Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Tyr Phe His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Phe Asp Ile Glu Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Leu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Asn Tyr Gly Ser Thr Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Val 115 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Gly Gly Asn Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Asn Tyr Arg Ser Thr Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 324 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 21 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 22 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Phe Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Ile Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Asn Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Val 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at location 3 can be Gly or Arg. <400> 24 Asn Tyr Xaa Ser Thr Phe Gly Tyr 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa at location 2 can be Val or Ile. <400> 25 Lys Xaa Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro 1 5 10 15 Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg 20 25 30 Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly 35 40 45 Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg Ala 50 55 <210> 27 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Met Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val 1 5 10 15 Phe Gln Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met 35 40 45 Leu

Claims (54)

  1. CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    a) 인간 CLDN 18.1과 교차 반응성이 없는 특성;
    b) 면역조직화학 분석법(IHC)에 의해 측정된 위 상피 세포를 제외한 비암성 세포와의 교차 반응성이 없는 특성;
    c) IHC에 의해 측정된 바와 같이 비암성 인간 폐 조직과의 교차 반응성이 없는 특성;
    d) CLDN18.2-발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 선택적으로 CLDN18.2-발현 세포는 CLDN18.2가 변성되거나 그렇지 않으면 더 이상 그의 천연 입체 형태에 있지 않도록 전처리되는 특성;
    e) 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정된 바와 같이 10nM 이하의 Kd 값에서, 또는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정된 바와 같이 20 ng/ml 이하의 EC50 값에서 인간 CLDN18.2의 첫번째 세포외 루프를 포함하는 융합 폴리펩티드에 결합할 수 있는 특성;
    f) 유동 세포 분석기(FACS)에 의해 측정된 바와 같이 세포 표면 인간 CLDN 18.2에 대한 검출가능한 결합이 없음을 나타내는 특성;
    g) ELISA에 의해 측정된 바와 같이 DQWSTQDLYN (서열 ID 번호:19)의 아미노산 서열 내의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 특성; 및/또는
    h) ELISA에 의해 측정된 바와 같이 1nM의 항체 농도 또는 IHC에 의해 측정된 0.5ug/ml의 항체 농도에서 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플에서 인간 CLDN18.1에 대한 교차 반응성이 없는 특성 중 하나 이상을 나타내는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    a) X 1 X 2 YX 3 H (서열 ID 번호:8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, WIYPX 4 GX 5 X 6 X 7 X 8 YX 9 EKFKG (서열 ID 번호:12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NYX 10 STFGY (서열 ID 번호:24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는
    b) RSSQNIVHSNGNTYLE (서열 ID 번호:2)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, KX 11 SNRFS (서열 ID 번호:25)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 FQGSHVPFT (서열 ID 번호:6)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하고,
    X1 은 R 또는 T, X2 는 N 또는 Y, X3 은 F 또는 I, X4 는 G 또는 R, X5 는 F 또는 G, X6 은 D 또는 N, X7 은 I 또는 T, X8 은 E 또는 V, X9 는 S 또는 N, X10 은 G 또는 R, X11 은 V 또는 I인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    a) 서열ID번호 1 및 서열ID번호 7로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는
    b) 서열ID번호 3 및 서열ID번호 9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는
    c) 서열ID번호 5 및 서열ID번호 11로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는
    d) 서열 ID 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는
    e) 서열 ID 번호 4 및 서열ID번호10으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는
    f) 서열 ID 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    a) 서열ID번호가 1인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호가 3인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열ID번호가 5인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는
    b) 서열ID번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열ID번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    a) 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
    b) 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 더 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열ID번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열ID번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
    b) 서열ID번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열ID번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열ID번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열ID번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열ID번호10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열ID번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열ID번호13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열ID번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    b) 서열ID번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열ID번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CLDN 18.2에 대한 결합 특이성을 보유하면서도 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 더 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 돌연변이 중 적어도 하나는 보존적 치환이거나, 또는 모든 돌연변이는 보존적 치환인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 돌연변이 중 적어도 하나는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR 서열, 및/또는 하나 이상의 비-CDR 서열에 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열ID번호 1또는 서열ID번호 7과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 서열 및/또는
    b) 서열ID번호 3또는 서열ID번호 9와 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 서열 및/또는
    c) 서열ID번호 5또는 서열ID번호 11과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 서열 및/또는
    d) 서열ID번호 2와 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 서열 및/또는
    e) 서열ID번호 4 또는 서열ID번호 10과 적어도 80% (예컨대　적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 서열 및/또는
    f) 서열ID번호 6과 적어도 80% (예컨대 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 서열을 포함하며,
    그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고, 선택적으로 그의 모 항체와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 ID번호 1 또는 서열 ID 번호 7에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR1, 서열 ID번호 3 또는 서열 ID 번호 9에서 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR2, 서열 ID번호 5 또는 서열 ID 번호 11에서 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 HCDR3, 서열 ID 번호 2에서 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR1, 서열 ID 번호 4 또는 서열 ID 번호 10에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR2, 및/또는 서열 ID 번호 6에서 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 돌연변이를 갖는 LCDR3을 포함하며 그 동안 CLDN18.2에 대한 결합 특이성을 보유하고, 선택적으로 그의 모 항체와 유사하거나 심지어 더 높은 수준에서 결합 친화도를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 ID 번호 13 또는 서열 ID 번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 서열 ID 번호 14 또는 서열 ID 번호 16와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함하며, 임의로 IgG의 중쇄 불변 영역, 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 불변 영역은 마우스 불변 영역, 토끼 불변 영역 또는 인간 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 서열 ID 번호17의 아미노산 서열 또는 이의 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나 경쇄 불변 영역은 서열 ID 번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 표지된 항체, 이가 항체, 항이디오타입 항체, 융합 단백질, 이량체화 또는 중합된 항체, 또는 변형된 항체 (예를 들어, 글리코실화 항체)인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (이가 디아바디), 다중특이적 항체, 카멜화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 또는 이가 도메인 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 모이어티에 연결되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, 상기 모이어티는 방사성 동위원소, 란타나이드, 화학발광 라벨, 발색 모이어티, 콜로이드 금 입자, 형광 라벨, 효소-기질 라벨, 디곡시게닌 라벨, 바이오틴/아비딘, 합텐, 검출을 위한 DNA 분자 또는 입자 라벨을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, 상기 모이어티는 바이오틴 또는 합텐을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 CLDN18.2에 대한 결합에 대해 경쟁하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  25. 제24항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  26. 제24항의 벡터가 발현되는 조건 하에서 제25항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 방법.
  27. 인간 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 샘플을 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 샘플 내의 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 검출하는 방법.
  28. 대상체에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 진단하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    b) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
    대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 갖는 것으로 진단되는 방법.
  29. CLDN18.2-표적제를 사용한 치료를 위한 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체의 적격성을 결정하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    b) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
    대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견되거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 적합한 것으로 결정되거나 또는
    대상체는 CLDN18.2의 존재가 발견되지 않거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 CLDN18.2-표적제를 사용한 치료에 적합하지 않은 것으로 결정되는 방법.
  30. 대상체에서 CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 치료하는데 있어서 CLDN18.2-표적제의 치료 유효성을 예측하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    b) 샘플에서 인간 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계;
    c) CLDN18.2-표적제의 치료 유효성을 예측하는 단계를 포함하고,
    CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달할 때 대상체를 치료하는데 효과적일 것으로 예측되거나 또는
    CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2의 존재가 발견되지 않거나 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 대상체를 치료하는데 효과적이지 않을 것으로 예측되는 방법.
  31. CLDN18.2-관련 질환 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    a) i) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    ii) 샘플에서 인간 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계; 및
    iii) CLDN18.2의 존재가 발견될 때 또는 샘플에서 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준에 도달했을 때 CLDN18.2 관련 질환 또는 병태의 치료에 적합한 것으로 대상체를 선택하는 단계를 포함하는 치료에 적합한 대상체를 선택하는 단계;
    b) 치료학적 유효량의 CLDN18.2-표적제를 선택된 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 암을 갖거나 암의 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    a) i) 대상체로부터 수득된 샘플을 CLDN18.2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    ii) 샘플에서 CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준을 결정하는 단계;
    iii) CLDN18.2의 존재가 발견되지 않을 때 또는 샘플 내의 CLDN18.2의 발현 수준이 임계 수준 미만일 때 CLDN18.2 표적제를 사용한 치료에 적합하지 않은 것으로 대상체를 선택하는 단계를 포함하는 대상체를 선택하는 단계;
    b) 선택된 대상체에게 CLDN18.2-표적제 이외의 표준 치료 요법제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 세포 샘플 또는 조직 샘플인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 샘플은 고정된 조직 샘플, 선택적으로 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 조직 샘플인 방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CLDN18.2는 세포 표면 또는 막-결합된 CLDN18.2인 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CLDN18.2의 존재 또는 발현 수준은 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 면역형광법(IF), 효소면역분석(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 면역블롯팅법에 의해 결정되는 방법.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준은 샘플에서 양성으로 염색된 세포의 백분율에 기초하여 정량화되는 방법.
  38. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준은 샘플에서 CLDN18.2에 대한 염색 강도에 기초하여 정량화되는 방법.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, CLDN18.2-관련 질환 또는 병태는 암인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 샘플은 종양 샘플을 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 종양 샘플은 종양 조직 또는 순환 종양 세포를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 암은 원발암 또는 전이성 암인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 위암, 폐암(비-소세포폐암 또는 소세포폐암), 기관지암, 골암, 간담도암, 췌장암, 유방암, 간암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 두경부암, 척추암, 뇌암, 자궁경부암, 자궁암, 자궁내막암, 결장암, 대장암, 직장암, 항문암, 식도암, 위장암, 피부암, 전립선암, 뇌하수체암, 위암, 질암, 갑상선암, 교모세포종, 성상 세포종, 흑색종, 골수이형성증후군, 육종, 기형종, 담관암종 및/또는 선암종인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 암은 위암, 췌장암, 담관암종 또는 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암)인 방법.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, CLDN18.2-표적제는 CLDN18.2-발현 세포에 대한 세포 독성을 유도할 수 있는 방법.
  46. 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, CLDN18.2-표적제는 치료적 항-CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2-결합 분자 (예를 들어, 세포독성제에 접합된 항-CLDN18.2 항체 또는 이중특이적 항체), CLDN18.2-표적 세포 요법제 (예를 들어, CLDN18.2-결합 CAR을 발현하는 CAR-T, TCR-T 또는 CAR-NK 세포), CLDN18.2를 표적하는 화학적 화합물, 또는 CLDN18.2를 표적하는 치료 핵산인 방법.
  47. 제27항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 항암 요법을 받고 있거나 받았거나, 또는 암 재발을 앓고 있는 방법.
  48. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
  49. 제48항에 있어서, CLDN18.2에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 복합체를 검출하기 위한 시약 세트를 더 포함하는 키트.
  50. 제49항에 있어서, 시약 세트는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 이차 항체를 포함하고, 임의로 이차 항체가 검출가능하게 표지되는 키트.
  51. 제48항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 검출가능하게 표지되는 키트.
  52. 제48항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 간접적으로 검출가능한 모이어티와 접합되는 키트.
  53. 제52항에 있어서, 간접적으로 검출가능한 모이어티는 비오틴을 포함하는 것인 키트.
  54. 53항에 있어서, 시약 세트는 검출가능하게 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 키트.
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