KR20230060509A - 넥틴-4 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 넥틴-4에 결합하는 항체 및 이의 항체 단편을 제공한다. 이러한 항체 및 항체 단편은 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 암의 치료에 유용하다.

Description

넥틴-4 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
이 국제 특허 출원은 2020년 9월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/074,864 및 2021년 3월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/166,622에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고, 이로써 그 전체가 참고로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2021년 9월 3일에 생성된 상기 ASCII 사본은 "122863_5003_WO_Sequence_Listing.TXT"로 명명되며 크기는 48KB이다.
기술분야
본 발명은 넥틴-4에 결합하는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 이들 항체를 포함하는 치료 및 진단 조성물, 및 암의 치료 및/또는 진단을 위한 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
인간 넥틴 계열은 9개의 상동체(넥틴-1 내지 넥틴-4 및 넥틴-유사-1 내지 -5)를 포함한다(참조: Duraivelan et al., Sci Rep, 10:9434, 2020). 넥틴 단백질(넥틴-1, 넥틴-2, 넥틴-3 및 넥틴-4)은 동질적으로 또는 이질적으로 트랜스 상호작용하여 상피 세포에서 부착 접합부에서 세포-세포 부착을 매개하는 칼슘 독립적 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 세포 부착 분자이다. 정상 상피에서, 부착 접합부는 종양 형성 중에 종종 손실되는 특성인 세포 극성을 정의한다.
넥틴-1, -2, -3 및 -4는 단일 통과 유형 I 당단백질로 발현되며, N-말단 Ig 유사 가변 도메인(D1) 다음에 2개의 Ig 유사 불변 도메인(D2 및 D3)으로 배열된 3개의 탠덤 면역글로불린 유사 도메인/루프를 갖는 세포외 도메인(ECD)으로 구성되는 공통 도메인 조직을 특징으로 한다. 넥틴은 V-도메인 대 V-도메인 결합 상호작용을 통해 서로 상호작용하여 세포-세포 부착을 지원하는 트랜스-헤테로-상호작용 네트워크를 생성한다. 넥틴-3/넥틴-1, 넥틴-3/넥틴-2, 넥틴-1/넥틴-4 사이의 이종성 상호작용이 보고되었다(참조: Harrison et al., Nat Struct Mol Biol, 19(9):906-915, 2012). 세포-세포 부착에서의 그들의 역할 외에도, 넥틴은 바이러스 진입 및 면역 조절에서 다양한 범위의 생리학적 세포 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다.
넥틴("연결하다"를 의미하는 라틴어 "necto"에서 유래)은 ECD의 Ig 유사 V-도메인을 통해 다른 세포 표면 분자의 넥틴과 상호작용한다. 넥틴은 먼저 결합하여 동일한 세포에서 시스-이량체를 형성한 다음, 인접한 세포 상에서 넥틴 또는 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)의 다른 구성원과 동호성 또는 이호성 트랜스-이량체를 형성함으로써 세포-세포 부착을 촉진시키는 기능을 한다(참조: Miyoshi et al., Am J Nephrol, 27:590, 2007). 이호성 트랜스-이량체는 동호성 트랜스-이량체보다 더 강한 세포-세포 상호작용을 형성하는 것으로 보고되었다. 결합의 특이성은 각 넥틴에 따라 다르다(예를 들어, 넥틴-4는 자체 및 넥틴-1에 결합한다).
추가의 세포 표면 분자와 상호작용하는 넥틴 계열 구성원의 능력은 그들의 상호작용 네트워크를 상당히 확장시킨다. 넥틴 계열의 여러 구성원은 IgSF의 다른 구성원과의 이호성 트랜스-상호작용의 결과로서 면역 조절 기능을 발휘할 수 있다. 이러한 상호작용은 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 수지상 세포(DC) 및 T 림프구를 포함하는 다양한 면역 세포 유형의 기능에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 공지된 넥틴 계열 파트너 IgSF 구성원 중 일부뿐만 아니라 일부 넥틴은 공통의 결합 파트너를 인식하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 넥틴-2 및 PVR은 모두 CD226, TIGIT 및 넥틴-3을 인식한다(참조: Duraivelan et al., Sci Rep, 10:9434, 2020).
넥틴-4는 다양한 상피 세포 암, 예를 들어, 유방암(breast cancer)(Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007), 폐암(lung cancer)(Takano et al., Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009), 난소암(ovarian cancer)(Derycke et al., Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010), 췌장암(pancreatic cancer)(Nishiwada et al., J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015), 담낭암(gallbladder cancer)(Zhang et al., Cancer Lett, 375:179-189, 2016), 및 위암(gastric cancer)(Zhang et al., Hum Pathol, 72:107-116, 2018)에서 상향조절되는 것으로 보고되었다. 이러한 암은 종종 넥틴-4 유전자좌의 복사 수 증가 또는 초점 증폭을 갖는다(Pavlova et al., Elife, 2:e00358, 2013).
최근에, 증거가 축적되어 넥틴이 종양 형성에 기여하고 전이를 촉진하는 기능을 한다는 것을 보여준다. 특히, 넥틴-4는 암 세포 부착, 이동, 증식 및 상피-중간엽 전이에 연루되어 있다. 유방암, 췌장암 및 폐암에서, 넥틴-4의 과발현 또는 환자 혈청에서 검출 또는 가용성 넥틴-4는 종양 진행 및/또는 불량한 생존과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007, Takano et al., Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009, Derycke et al., Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010, Nishiwada et al., J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015, and Lattanzio et al., Oncogenesis, 3:e118, 2014).
단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 항체 기반 면역요법에 사용될 수 있는 효과적이고 안전하며 특이적인 항-넥틴-4 항체(anti-Nectin-4 antibody)를 제공하기 위한 미충족 요구가 있다.
요약
본 개시내용은, 예를 들어, 암 세포 표면에 존재하는 넥틴-4를 포함하는 넥틴-4에 결합하는 항-넥틴-4 항체 및 이의 단편을 제공함으로써 상기 필요성을 해결한다. 이들 항체 및 이의 단편은 독특한 CDR 서열의 세트, 넥틴-4에 대한 특이성을 특징으로 하며, 단일 요법으로 또는 다른 항암제와의 병용 요법으로서 암 면역 요법에 유용하다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 인간 넥틴-4에 결합하는 항체, 및 종양 미세환경에 국한된 세포의 넥틴-4-매개 활성을 조절(예를 들어, 길항)하는 그들의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로부터 선택된 중쇄(HC) 가변 영역의 3개의 CDR 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16으로부터 선택된 경쇄(LC) 가변 영역의 3개의 CDR, 또는 항체 또는 이의 단편이 넥틴-4에 대한 결합을 유지하는 한 서열번호 1-16 중 어느 하나의 CDR에 대해 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 6개의 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 세트를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 17, CDR2: 서열번호 18, 및 CDR3: 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 20, CDR2: 서열번호 21, 및 CDR3: 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 23, CDR2: 서열번호 24, 및 CDR3: 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 26, CDR2: 서열번호 27, 및 CDR3: 서열번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 29, CDR2: 서열번호 30, 및 CDR3: 서열번호 31을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 38, CDR2: 서열번호 39, 및 CDR3: 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 41, CDR2: 서열번호 42, 및 CDR3: 서열번호 43을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 44, CDR2: 서열번호 45, 및 CDR3: 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 48, 및 CDR3: 서열번호 49를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, 및 CDR3: 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 53, 및 CDR3: 서열번호 54를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 55, CDR2: 서열번호 56, 및 CDR3: 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, 및 CDR3: 서열번호 59를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, 및 CDR3: 서열번호 60을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 중쇄 서열, 또는 항체 또는 이의 단편이 넥틴-4에 대한 결합을 유지하는 한, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 대해 적어도 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
다른 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 경쇄 서열, 또는 항체 또는 이의 단편이 넥틴-4에 대한 결합을 유지하는 한, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 대해 적어도 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
다른 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 하기 조합으로부터 선택된, 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(b) 서열번호 3을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 4를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(c) 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 6을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(d) 서열번호 7을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 8을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(e) 서열번호 9를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 10을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(f) 서열번호 11을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 12를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(g) 서열번호 13을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 14를 포함하는 가변 경쇄 서열; 및
(h) 서열번호 15를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 16을 포함하는 가변 경쇄 서열.
일부 구현예에서, 세포독성제(cytotoxic agent)에 공유 부착된 넥틴-4에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체가 제공되며, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기 조합으로부터 선택된, 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(b) 서열번호 3을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 4를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(c) 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 6을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(d) 서열번호 7을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 8을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(e) 서열번호 9를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 10을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(f) 서열번호 11을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 12를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(g) 서열번호 13을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 14를 포함하는 가변 경쇄 서열; 및
(h) 서열번호 15를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 16을 포함하는 가변 경쇄 서열.
일부 구현예에서, 세포독성제에 공유 부착된 넥틴-4에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체가 제공되며, 여기서 상기 항체는 (a) CDR1: 서열번호 17, CDR2: 서열번호 18, 및 CDR3: 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 20, CDR2: 서열번호 21, 및 CDR3: 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역; (b) CDR1: 서열번호 23, CDR2: 서열번호 24, 및 CDR3: 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 26, CDR2: 서열번호 27, 및 CDR3: 서열번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역; (c) CDR1: 서열번호 29, CDR2: 서열번호 30, 및 CDR3: 서열번호 31을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역; (d) CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37; 및/또는 CDR1: 서열번호 38, CDR2: 서열번호 39, 및 CDR3: 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 (e) CDR1: 서열번호 41, CDR2: 서열번호 42, 및 CDR3: 서열번호 43을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 44, CDR2: 서열번호 45, 및 CDR3: 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 (f) CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 48, 및 CDR3: 서열번호 49를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, 및 CDR3: 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 (g) CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 53, 및 CDR3: 서열번호 54를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 55, CDR2: 서열번호 56, 및 CDR3: 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 (h) CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, 및 CDR3: 서열번호 59를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, 및 CDR3: 서열번호 60을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 및 이의 항체 단편은 표 1에 개시된 하나 이상의 중쇄 가변 영역 CDR 및/또는 표 2에 개시된 하나 이상의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 단독으로 또는 조합하여 하기 구조적 및 기능적 특징 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 인간 넥틴-4에 특이적이고, (b) 인간 넥틴-1, 인간 넥틴-2 또는 인간 넥틴-3에 결합하지 않고, (c) 넥틴-4의 N-말단 Ig 유사 V 도메인의 에피토프에 결합하고, (d) 넥틴-4에 결합 후 넥틴-4 양성 세포의 표면으로부터 내재화되고, (e) 시노몰구스 넥틴-4와 교차 반응하고, (f) 래트 및/또는 뮤린 넥틴-4와 교차 반응하고, (g) 인간 넥틴-4/넥틴-1 결합 상호작용을 방해하고, (h) 인간 넥틴-4/TIGIT 결합 상호작용을 방해하고, (i) 인간 종양 세포에서 넥틴-4의 세포 표면 단백질 발현 수준을 감소시키거나, (j) 넥틴-4의 내인성 수준을 발현하는 인간 세포의 ADCC를 지시한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 넥틴-4의 내인성 수준을 발현하는 인간 세포 및/또는 넥틴-4를 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 넥틴-1, 넥틴-2 또는 넥틴-3의 세포외 도메인에 대한 결합(예: 특이적 결합)을 입증하지 않는다.
일부 구현예에서, 넥틴-4 항체 또는 항체 단편은 100nM 미만의 친화도로 인간 넥틴-4에 결합한다
일부 구현예에서, 넥틴-4 항체 또는 항체 단편은 넥틴-4의 N-말단 Ig-유사 V 도메인의 에피토프에 결합한다. 대안적인 구현예에서, 넥틴-4 항체 또는 항체 단편은 넥틴-4의 Ig-유사 C 도메인의 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 종양 세포의 표면에서 발생할 때 인간 넥틴-4에 특이적으로 결합하고 넥틴-4의 내재화를 유도한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 종양 세포의 표면에서 발생할 때 인간 넥틴-4에 특이적으로 결합하고 종양 세포의 ADCC-매개 사멸을 지시한다.
일부 구현예에서, 넥틴-4 항체 또는 항체 단편은 EC50 < 5nM로 시노몰구스 원숭이 넥틴-4와 교차 반응성 결합을 갖는다. 다른 구현예에서, 넥틴-4 항체 또는 항체 단편은 인간 및 시노몰구스 넥틴-4에 결합하고 동등하거나 더 낮은 결합 친화도로 래트 및/또는 뮤린 넥틴-4와 교차 반응성 결합을 갖는다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 인간 넥틴-4/넥틴-1 결합 상호작용을 부분적으로 차단함을 포함하여 차단한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 인간 넥틴-4/TIGIT(Ig 및 TIIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체) 결합 상호작용을 부분적으로 차단함을 포함하여 차단한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예: 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)에 접합된 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 면역접합체에 통합된다.
일부 구현예에서, 넥틴-4 항체는 모노클로날 항체이다. 본 개시내용은 비인간 부모(예: 마우스) 항-넥틴-4 항체 및 이의 항체 단편 및 이의 사용 방법을 제공한다. 숙련가는 개시된 항체가 인간 치료 항체 또는 단편으로서 사용하기 위한 키메라 항체 또는 인간화로의 전환과 같은 의도된 용도를 위해 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 대안적인 구현예에서, 넥틴-4 항체는 이중특이적 항체이다.
일반적으로, 인간화 넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 본원에 개시된 개시된 부모 뮤린 항-넥틴-4 항체, 및 적합한 인간 컨센서스 면역글로불린 서열로부터 유래된 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크(FR) 영역의 것들에 상응한다. 인간화 항체 또는 이의 단편은 임의로 인간 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 N4_mAb 6 항체(서열번호 11에 제공된 VH 서열 및 서열번호 12에 제공된 VL 서열로부터 유래된 CDR 영역 포함), N4_mAb 7 항체(서열번호 13에 제공된 VH 서열 및 서열번호 14에 제공된 VL 서열로부터 유래된 CDR 영역 포함) 및 N4_mAb 8 항체(서열번호 15에 제공된 VH 서열 및 서열번호 16에 제공된 VL 서열로부터 유래된 CDR 영역 포함)의 임의의 인간화 버전을 포함한다.
일부 구현예에서, 넥틴-4 항체 또는 항체 단편은 재조합 항체(예: 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체)이고, 모두 본원에 개시된 단일 항-넥틴-4 항체의 VH 또는 VL 도메인으로부터 유래된 6개의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 결합제는 "N4_mAb 1"로 지정된 항-넥틴-4 항체의 6개 CDR 영역 모두를 포함할 수 있다. 대표적인 예에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 본원에서 "N4_mAb 1"로 지칭되는 뮤린 항-인간 넥틴-4 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 가변 경쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타내는 서열번호 17-19 및 서열번호 20-22의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 넥틴-4 항체는 전장 항체(full-length antibody)이다. 일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 항체 단편이다. 추가의 구현예에서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 단일 쇄 항체, 미니바디(minibody) 및 디아바디(diabody)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
넥틴-4 항체 및 이의 항체 단편은 암의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 암의 치료를 위한 방법은 넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 조성물 또는 제형을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 단독으로(예: 단일 요법으로) 또는 다른 면역 치료제 및/또는 화학 요법과 함께 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 넥틴-4를 발현하는 암 세포의 사멸을 매개하는데 적합한 ADC를 제조하는데 사용된다.
본 개시내용의 다음의 상세한 설명뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 개시내용을 설명하기 위한 목적으로, 현재 바람직한 구현예가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 개시내용은 도시된 정확한 배열, 실시예 및 도구에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 뮤린 항-넥틴-4 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열 및 그들 각각의 CDR 서열(카바트 넘버링)을 제공한다. 서열 식별자가 제공되고, CDR은 가변 도메인 서열에서 밑줄이 그어져 있다.
도 2는 ELISA에 의해 측정된 재조합 넥틴-4(세포외 도메인)에 대한 키메라 넥틴-4 항체의 결합을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 넥틴-4-발현 세포에 대한 넥틴-4 항체의 결합을 나타낸다. 도 3a는 인간 넥틴-4를 이소적으로 발현하는 CHO-넥틴-4 세포에 대한 키메라 넥틴-4 항체의 결합을 나타낸다. 도 3b는 SKBR3 세포에 대한 키메라 넥틴-4 항체의 결합을 나타낸다. SKBR3은 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 인간 유방암 세포주이다.
도 4a 및 4b는 넥틴-4 항체가 넥틴-4-의존성 항체 세포내이입을 유도한다는 것을 입증한다. 도 4a는 인간 넥틴-4를 이소적으로 발현하는 CHO-넥틴-4 세포에서 키메라 넥틴-4 항체의 세포내이입(간접적인 세포 사멸을 통해 나타남)을 나타낸다. 도 4b는 SKBR3 세포에 대한 키메라 넥틴-4 항체의 세포내이입을 나타낸다. SKBR3은 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 인간 유방암 세포주이다.
도 5a 및 5b는 T47D 세포에서 넥틴-4 항체 내재화의 동역학 및 일치 막 넥틴-4 수준을 보여준다. T47D는 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 인간 유방암 세포주이다. 도 5a는 넥틴-4 항체의 내재화 동역학을 나타낸다. 도 5b는 내재화를 위한 동일한 시점에서 측정된 막 넥틴-4 단백질의 상대적 수준을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유도하는 넥틴-4 항체의 능력을 나타낸다. 도 6a는 T47D에서 넥틴-4 항체의 ADCC 활성을 나타내고, 도 6b는 SKBR3 세포에서 ADCC 활성을 나타낸다. T47D와 SKBR3은 모두 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 인간 유방암 세포주이다.
본 개시내용이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 기술 및 과학 용어가 아래에 구체적으로 정의되어 있다. 이 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 다음 약어가 사용될 것이다:
mAb 또는 Mab 또는 MAb - 모노클로날 항체.
CDR - 상보성 결정 영역.
VH 또는 VH - 중쇄 가변 영역.
VL 또는 VL - 경쇄 가변 영역.
FR - 항체 프레임워크 영역.
용어 "넥틴-4"(N4) 또는 "넥틴-4 단백질"은 인간 넥틴-4, 특히 천연 서열 폴리펩티드, 이소형, 키메라 폴리펩티드, 모든 상동체, 단편 및 넥틴-4의 전구체를 포함한다. 인간, 시노몰구스, 래트 및 뮤린 넥틴-4에 대한 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_112178.2(인간)(서열번호 61), XP_005541277.1(시노몰구스 원숭이(서열번호 62), NP_001102546.1(래트)(서열번호 63) 및 NP_082169.2(마우스)(서열번호 64)에 제공된다. 넥틴-4의 오르토로그는 각각 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스에서 인간 단백질과 >99%, 약 94% 및 약 92% 상동성을 공유한다.
용어 "넥틴-1" 또는 "넥틴-1 단백질"은 인간 넥틴-1(N1), 특히 천연 서열 폴리펩티드, 이소형, 키메라 폴리펩티드, 모든 상동체, 단편 및 넥틴-1의 전구체를 포함한다. 인간 넥틴-1에 대한 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열 NP_002846.3(인간) 서열번호 65에 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "TIGIT"는 PVR/CD 155, 넥틴-2/CD112 및 넥틴-4에 결합하는 면역글로불린 단백질의 PVR(폴리오바이러스 수용체) 계열의 구성원인 "Ig 및 TIIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체"를 지칭한다(참조: Reches et al., J Immunotherapy Cancer, 8:e000266, 2020). TIGIT는 또한 TIGIT, WUCAM, Vstm3 및 Vsig9로서 지칭된다. 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 TIGIT에 대한 언급은 인간 TIGIT를 지칭한다.
용어 "면역글로불린 수퍼패밀리"(IgSF)는 하나 이상의 면역글로불린 유사(Ig 유사) 도메인을 함유하는 단백질의 수퍼패밀리를 지칭한다. 대부분의 IgSF 단백질은 세포 표면에 국한되거나 분비되고, 세포의 인식, 결합 또는 부착 과정에서 기능한다. 인간 게놈에서 인코딩(encoding)된 약 500개의 비항체, 비-T 세포 수용체(TCR) IgSF 단백질이 있다. 대부분의 IgSF 구성원은 유형 I 막관통 단백질이고, 이는 전형적으로 가변(V) 도메인 또는 불변(C) 도메인 중 하나 이상의 Ig 유사 도메인을 함유하는 세포외 도메인, 단일 막관통 도메인 및 세포질 꼬리로 구성된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
IgG와 같은 예시적인 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
초가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역에서 약 아미노산 잔기 24-34(LCDR1; "L"은 경쇄를 나타냄), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역에서 대략 약 31-35B(HCDR1; "H"는 중쇄를 나타냄), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로부터의 아미노산 잔기(참조: Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 초가변 루프(예: 경쇄 가변 영역에서 잔기 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2) 및 91-96(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역에서 26-32(HCDR1), 53-55(HCDR2) 및 96-101(HCDR3)을 형성하는 잔기를 포함한다(참조: Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917).
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 예를 들어, 집단을 포함하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 예를 들어, 천연 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 중에 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 따라서, 변형제 "모노클로날"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자도입 동물을 이용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 이루어질 수 있고, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 재조합 항체, 뿐만 아니라 그들이 목적하는 생물학적 특성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 지칭한다. 또한, 상보성 결정 영역(CDR) 그래프팅을 수행하여 친화도 또는 특이성을 포함하는 항체 분자의 특정 특성을 변경할 수 있다. 전형적으로 가변 도메인은 설치류와 같은 실험 동물의 항체("부모 항체")로부터 수득되고, 불변 도메인 서열은 인간 항체에서 수득되므로 생성되는 키메라 항체는 인간 대상체에서 이펙터 기능을 지시할 수 있고, 그것이 유래되는 부모(예: 마우스) 항체보다 불리한 면역 반응을 유발할 가능성이 적을 것이다.
용어 "인간화 항체"는 가변 영역에 하나 이상의 인간 프레임워크 영역을 중쇄 및/또는 경쇄의 비인간(예: 마우스, 래트 또는 햄스터) 상보성 결정 영역(CDR)과 함께 포함하도록 조작된 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 CDR 영역을 제외하고 완전히 인간인 서열을 포함한다. 인간화 항체는 전형적으로 비인간화 항체에 비해 인간에 대해 덜 면역원성이며, 따라서 특정 상황에서 치료 이점을 제공한다. 당업자는 인간화 항체를 알고 있을 것이며, 또한 그들의 생성에 적합한 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 문헌(Hwang, W. Y. K., et al., Methods 36:35, 2005; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033, 1989; Jones et al., Nature, 321:522-25, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-27, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-36, 1988; Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-37, 1989; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370; and Selick et al., WO 90/07861)을 참조하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 당업자에게 공지된 인간 항체를 제조하는 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다. 인간 항체는 문헌[Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al, J. Immunol, 147(I):86-95 (1991)]에 기재된 방법으로 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 공격에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만 내인성 유전자좌가 비활성화된 유전자도입 동물, 예를 들어, 면역화된 HuMab 마우스(참조: HuMab 마우스에 관한 Nils Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187), 제노마우스(참조: 예를 들어, XENOMOUSETM 기술에 관한 US Pat. 6,075,181 및 6,150,584) 또는 Trianni 마우스(참조: 예를 들어, WO 2013/063391, WO 2017/035252 및 WO 2017/136734)에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 포함된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5개의 주요 항체 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 다수는 하위 부류(이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나눌 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
항체 또는 유사한 용어의 항체의 "항원-결합 도메인"(또는 간단히 "결합 도메인")이라는 용어는 항원 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다.
항체의 "가변 도메인"(V 도메인)은 결합을 매개하고 특정 항체의 항원 특이성을 부여한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 "초가변 영역" 또는 각각 9-12개 아미노산 길이인 CDR로서 본원에서 지칭되는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 비교적 불변 스트레치로 구성된다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템 사이에서 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 서열의 개시내용은 연관된 CDR의 개시내용을 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 각각의 가변 중쇄 영역의 개시내용은 vhCDR(예: vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시내용이며, 각각의 가변 경쇄 영역의 개시내용은 vlCDR(예: vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 개시내용이다.
본원에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 주로 특정 항원 인식의 매개를 담당하는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내의 짧은 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 각각의 VL 및 각각의 VH 내에 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3으로 칭명됨)이 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, CDR 및 프레임워크 영역은 카바트 넘버링 체계에 따라 주석이 달린다(참조: Kabat E. A., et al., 1991, Sequences of proteins of Immunological interest, In: NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Bethesda, Md).
다른 구현예에서, 항체의 CDR은 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: MacCallum RM et al, (1996) J Mol Biol 262: 732-745)에 따라 또는 각각 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132- 136 and Lefranc M-P et al, (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212)에 기재된 바와 같은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001))을 참조한다. 다른 구현예에서, 항체의 CDR은 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 초티아(Chothia) 구조 루프 사이의 절충을 나타내는 AbM 초가변 영역을 지칭하며 전체가 본원에 참조로 포함된 옥스포드 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용된다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 문헌(참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), Vols. 1-3)에서와 같은 하위그룹이다. 하나의 구현예에서, VL의 경우, 하위그룹은 문헌(참조: Kabat et al., 상기)에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 하나의 구현예에서, VH의 경우, 하위그룹은 문헌(참조: Kabat et al., 상기)에서와 같이 하위그룹 III이다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 216-238(EU 넘버링) 또는 226-251(카바트 넘버링)로부터의 스트레칭으로 정의된다. 힌지는 3개의 별개의 영역, 즉 상부, 중간(예: 코어) 및 하부 힌지로 더 분할될 수 있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기재된 바와 같이, EU 인덱스라고도 하는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
항체 Fc 영역과 특정 Fc 수용체의 상호작용으로부터 유래하는 용어 "이펙터 기능"은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, FcyR-매개 이펙터 기능, 예를 들어, ADCC 및 항체 의존성 세포 매개 식균 작용(ADCP), 및 세포 표면 수용체의 하향 조절을 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 항원 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구한다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 참조 항체와 비교하여 항원의 아미노산 잔기의 중첩 세트와 접촉하거나 경쟁 검정에서 이의 항원에 대한 참조 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다. 항원과 접촉하는 항체의 아미노산 잔기는, 예를 들어, 항원과의 복합체에서 항체의 결정 구조를 결정하거나 수소/중수소 교환을 수행함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원이 5Å 이내에 있는 항체의 잔기는 항원과 접촉하는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 경쟁 검정에서 참조 항체의 이의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 이의 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab)2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자(예: scFv)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 칭명되는 두 개의 동일한 항원 결합 단편, 및 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔류 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 중쇄(H)의 가변 영역 도메인(VH)과 하나의 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 경쇄(L)로 구성된다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 이황화물 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 큰 단일 F(ab)2 단편을 산출한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에 추가의 몇몇 잔기를 가짐으로써 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
"Fv"는 단단한 비공유 회합으로 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이들 두 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)를 유발한다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일 쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 검토를 위해, 문헌[Plukthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
항체 또는 유사한 용어의 항체 "항원-결합 도메인"(또는 간단히 "결합 도메인")이라는 용어는 항원 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 VH-VL 단위는 폴리에피토프 특이성을 갖는다(예를 들어, 하나의 생물학적 분자 상의 두 개의 상이한 에피토프 또는 다른 생물학적 분자 상의 각 에피토프에 결합할 수 있다). 이러한 다중특이적 항체는 전장 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
"이중 특이성(dual specificity)" 또는 "이중특이성(bispecificity)"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 그러나, 이중특이적 항체와 대조적으로, 이중 특이적 항체는 아미노산 서열이 동일한 2개의 항원 결합 암을 갖고, 각 Fab 암은 두 개의 항원을 인식할 수 있다. 이중 특이성은 항체가 단일 Fab 또는 IgG 분자로서 두 개의 상이한 항원과 높은 친화도로 상호작용할 수 있도록 한다. 하나의 구현예에 따르면, IgG1 형태의 다중특이적 항체는 5μM 내지 0.001pM, 3μM 내지 0.001pM, 1μM 내지 0.001pM, 0.5μM 내지 0.001pM 또는 0.1μM 내지 0.001pM의 친화도로 각각의 에피토프에 결합한다. "단일특이적"은 하나의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 다중 특이적 항체는 전체 면역글로불린 분자와 유사한 구조를 가질 수 있으며, Fc 영역, 예를 들어, IgG Fc 영역을 포함할 수 있다. 이러한 구조는 IgG-Fv, IgG-(scFv)2, DVD-Ig, (scFv)2-(scFv)2-Fc 및 (scFv)2-Fc-(scFv)2를 포함할 수 있다. IgG-(scFv)2의 경우, scFv는 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 종종 인간 또는 인간화 항체를 지칭한다. 본 개시내용에서, 결합 특이성 중 하나는 넥틴-4에 대해 지시될 수 있고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 예를 들어, 세포 표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유닛, 조직 특이적 항원, 바이러스 유래 단백질, 바이러스 인코딩된 외피 단백질, 박테리아 유래 단백질 또는 박테리아 표면 단백질 등에 대한 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "디아바디"는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 2가 항체를 지칭하고, 여기서 각각의 폴리펩티드 쇄는 동일한 펩티드 쇄에서 VH 및 VL 도메인의 분자내 회합을 허용하기에 너무 짧은 링커(예: 5개의 아미노산으로 구성된 링커)에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 이 구성은 동종이량체 구조를 형성하기 위해 각 도메인이 또 다른 폴리펩티드 쇄 상의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 강제한다. 따라서, 용어 "트리아바디"는 3개의 펩티드 쇄를 포함하는 3가 항체를 지칭하며, 이들 각각은 동일한 펩티드 쇄 내에서 VH 및 VL 도메인의 분자내 회합을 허용하기에 과도하게 짧은 링커(예: 1 내지 2개의 아미노산으로 구성된 링커)에 의해 결합된 하나의 VH 도메인 및 하나의 VL 도메인을 함유한다.
본원에 개시된 다양한 항체를 기재하기 위해 사용되는 용어 "단리된 항체"는 그것이 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 식별되고 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 또는 항체 단편의 생산, 정제 및/또는 저장 동안 발생하는 하나 이상의 동시 번역 또는 번역 후 변형을 갖는 항체 또는 항체 단편의 변이체를 포함할 수 있다. 자연 환경의 오염 성분은 전형적으로 폴리펩티드의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 항체는, 예를 들어, 전기영동(예: SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예: 이온 교환 또는 역상 HPLC) 접근법에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌(Flatman et al., J. Chromatogr . B 848:79-87, 2007)을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적"이라는 용어는 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어, 과량의 비표지된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 표지된 표적의 프로브에 대한 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우 특이적 결합이 나타난다. 본원에서 사용되는 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적"이라는 용어는, 예를 들어, 표적에 대해 10-4M 이하, 또는 10-5M 이하, 또는 10-6M 이하, 또는 10-7M 이하, 또는 10-8M 이하, 또는 10-9M 이하, 또는 10-10M 이하, 또는 10-11M 이하, 대안적으로 10-12M 이하의 Kd 또는 10-4M 내지 10-6M 또는 10-6M 내지 10-10M 또는 10-7M 내지 10-9M 범위의 Kd를 갖는 범위로 나타날 수 있다. 숙련가에 의해 인지되는 바와 같이, 친화도 및 KD 값은 반비례 관계이다. 항원에 대한 높은 친화도는 낮은 KD 값에 의해 측정된다. 하나의 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 넥틴-4 또는 넥틴-4 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "넥틴-4에 특이적으로 결합한다"는 정상 또는 악성 세포의 표면에서 발생할 때 내인성 인간 넥틴-4를 인식하고 결합하지만, 인간 넥틴-1, 넥틴-2 또는 넥틴-3 또는 임의의 다른 인간 넥틴 계열 상동체에 대해서는 그렇지 않은 항체 또는 항원 결합 단편의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]로 정의되는 해리 상수 Kd에 의해 제공되며, 여기서 [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 결합되지 않은 항체의 몰 농도이며, [Ag]는 결합되지 않은 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 방법은 문헌(참조: Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), and Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983))에서 찾을 수 있고, 이 참조문헌은 전체로 본원에 참조로 포함된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 당업계에 익히 공지된 하나의 표준 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 스크리닝(예를 들어, BIAcore™ SPR 분석 장치를 사용한 분석에 의해)의 사용이다.
"에피토프"는 항체와 이의 항원(들) 사이의 상호작용 부위 또는 부위들을 나타내는 용어이다. 기재된 바와 같이(Janeway, C, Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3- 8. New York, Garland Publishing, Inc.): "항체는 일반적으로 큰 분자, 예를 들어, 단백질..의 표면 상의 작은 영역만을 인식한다. [특정 에피토프]는 단백질 접힘에 의해 함께 모인 [항원] 폴리펩티드 쇄의 상이한 부분으로부터의 아미노산으로 구성될 가능성이 있다. 이러한 종류의 항원 결정인자는 인식된 구조가 항원의 아미노산 서열에서 불연속적이지만 3차원 구조로 함께 모이는 단백질의 세그먼트로 구성되기 때문에 구조적 또는 불연속적 에피토프로 공지되어 있다. 대조적으로, 폴리펩티드 쇄의 단일 세그먼트로 구성된 에피토프는 연속 또는 선형 에피토프라고 한다"(참조: Janeway, C. Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3-8. New York, Garland Publishing, Inc.).
본원에 사용된 용어 "KD"는 kd 대 ka의 비율(즉, kd/ka)로부터 수득되는 평형 해리 상수를 지칭하며, 몰 농도(M)로서 표시된다. 항체의 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 바람직하게는 Fortebio Octet RED 장치를 사용하는 생물층 간섭계(BLI) 분석, 바람직하게는 BIACORE® 표면 플라즈몬 공명 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명, 또는 유세포 계측법 및 스캐차드 분석을 포함한다.
제제 및 특정 활성(예: 세포에 대한 결합, 효소 활성의 억제, 면역 세포의 활성화 또는 억제)과 관련하여 "EC50"은 이러한 활성에 대해 이의 최대 반응 또는 효과의 50%를 생산하는 제제의 효율적인 농도를 지칭한다. 제제 및 특정 활성에 관한 "EC100"은 이러한 활성에 대해 이의 실질적으로 최대 반응을 생산하는 제제의 효율적인 농도를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항체-약물 접합체"(ADC)는 합성 링커를 통해 세포독성제(페이로드로서 공지됨)에 공유 결합된 재조합 모노클로날 항체로 구성되는 면역접합체를 지칭한다. 면역접합체(항체-약물 접합체, ADC)는 매우 강력한 항체 기반 암 치료제의 한 부류이다. ADC는 합성 링커를 통해 세포독성제(페이로드로서 공지됨)에 공유 결합된 재조합 모노클로날 항체로 구성된다. ADC는 모노클로날 항체의 특이성과 소분자 화학요법 약물의 효능을 결합하고, 종양 세포에 직접 매우 세포독성 소분자 약물 모이어티의 표적화 전달을 촉진한다.
본원에 사용된 용어 "세포내이입"은 진핵 세포가 원형질막의 세그먼트, 세포-표면 수용체 및 세포외액으로부터의 성분을 내재화하는 과정을 지칭한다. 세포내이입 메커니즘은 수용체 매개 세포내이입을 포함한다. 용어 "수용체-매개 세포내이입"은 리간드가 이의 표적에 결합시 막 함입 및 핀칭을 유발하고 내재화되어 세포질로 전달되거나 적절한 세포내 구획으로 전달되는 생물학적 메커니즘을 지칭한다.
용어 "방관자 효과(bystander effect)"는 항체 약물 접합체에 의해 표적화된 종양 세포에 인접한 건강한 세포의 표적 세포 매개 사멸을 지칭한다. 방관자 효과는 일반적으로 항원 양성 표적 세포에서 인접한 항원 음성 건강한 세포로 확산될 수 있는 소수성 세포독성 약물의 세포 유출로 인해 발생한다. 방관자 효과의 존재 또는 부재는 면역접합체를 생산하는 데 사용되는 링커 및 접합 화학의 측면에 기인할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체-기반 면역요법" 및 "면역요법"은 넥틴-4 발현 세포에 대한 직접 또는 간접 효과를 매개하기 위한 항-넥틴-4 항체, 이중특이적 분자, 항원-결합 도메인, 또는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편 또는 CDR을 포함하는 융합 단백질의 표적화 특이성에 의존하는 임의의 형태의 요법을 광범위하게 지칭하기 위해 사용된다. 상기 용어는 네이키드 항체, 이중특이적 항체(T 세포 관여, NK 세포 관여 및 기타 면역 세포/이펙터 세포 관여 형식 포함) 항체 약물 접합체를 사용하는 치료 방법, 넥틴-4 특이적 키메라 항원 수용체 및 넥틴-4 특이적 결합제를 포함하는 종양 용해 바이러스를 포함하도록 조작된 T 세포(CAR-T) 또는 NK 세포(CAR-NK)를 사용하는 세포 요법, 및 항-넥틴-4 항체의 항원 결합 서열을 전달함으로써 유전자 요법을 포함하고 생체내에서 상응하는 항체 단편을 발현하는 것을 의미한다.
넥틴 단백질 계열
넥틴 계열의 구성원은 단일 통과 유형 I 당단백질로서 표현되며, 엑토도메인에서 3개의 Ig-유사 도메인(두 개의 IgC 도메인이 뒤따르는 막 원위 IgV 도메인) 막 관통 영역 및 어댑터 단백질 아파딘을 통해 액틴 세포골격에 결합하는 세포질 도메인(참조: Samanta et al., Cell Mol Life Sci, 72(4):645-658, 2015)으로 구성된 공통 도메인 구성을 특징으로 한다.
많은 바이러스는 IgSF 구성원 단백질을 이용하여 바이러스 향성, 부착 및 숙주 세포로의 후속 진입을 촉진한다. 넥틴 계열의 여러 구성원은 세포 부착 분자로서의 생리적 기능을 찾기 전에 바이러스 수용체로서 식별되었다. 초기에, 넥틴 계열의 구성원은 여러 그룹에 의해 독립적으로 바이러스 진입 수용체로서 식별되었고 관찰된 기능을 기반으로 이름이 지정되었다. 넥틴-1, -2 및 -3은 원래 폴리오바이러스 수용체(PVR, necl-5, CD155)와 상동성인 분자로 기재되었으며, 그 결과 폴리오바이러스 수용체 관련(PRR) 단백질(넥틴1/PRR1/CD111, 넥틴2/PRR2/CD112 및 넥틴3/PRR3))로 명명되었고(참조: Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001), 이후 각각 명칭 CD111, CD112 및 CD113으로 지정되었다. 이어서, 넥틴-4는 홍역 바이러스 헤마글루티닌(MV-H)을 인식하고 홍역 바이러스 진입을 위한 상피 세포 수용체 역할을 하는 것으로 입증되었다(참조: Samanta et al., Cell Mol Life Sci, 72(4):645-658, 2015).
넥틴-4(폴리오바이러스-수용체-유사 4, PVRL4로도 공지됨)는 넥틴-1에 대한 새로운 리간드로서 2001년에 처음 기재되었다. 보다 구체적으로, 그것은 V-도메인 상호작용을 통해 넥틴-1과 트랜스-상호작용하지만 넥틴-2, 넥틴-3 또는 PVR과는 그렇지 않은 넥틴 계열의 아파틴 관련 구성원으로 기재되었다(참조: Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001).
넥틴은 먼저 세포 표면에 호모 시스-이량체를 형성한 다음 동호성 및 이호성 방식 둘 다로 인접한 세포 상에 트랜스-이량체를 형성함으로써 세포 부착 분자로서 기능한다. 결합의 특이성은 각 넥틴마다 다르다. 넥틴-4는 그 자신과 넥틴-1에 결합한다(참조: Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001, Fabre et al., J Biol Chem, 277(30):27006-27013, 2002). 세포-세포 접촉은 인접한 세포 상의 넥틴 사이의 상호작용에 의해 개시되는 것으로 생각된다. 이어서, 캐드헤린-카테닌 복합체는 넥틴 기반 세포간 부착 부위에 모집되고, 인접한 세포 상의 캐드헤린의 트랜스-상호작용이 발생하여 부착 접합을 형성한다(참조: Boylan et al., Oncotarget, 8(6):9717-9738, 2017).
넥틴 단백질의 엑토도메인은 30 내지 55%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 넥틴은 세포질 도메인의 결합 모티프를 통해 액틴 세포골격 아파딘(F-액틴 결합 단백질)에 연결되며 상피 및 내피 접합부의 구성에 참여한다. 복합체에서, 다른 세포 부착 분자(CAM) 및 신호 전달 분자와의 상호작용은 이동, 증식, 생존, 분화, 분극화 및 바이러스의 진입과 같은 여러 가지 다양한 생리학적 세포 활성을 조절한다.
포유동물에서 추가의 세포 표면 분자와 상호작용하는 넥틴 계열 구성원의 능력은 그들의 상호작용 네트워크를 상당히 확장시킨다. 넥틴은 다른 세포 표면 막 수용체, 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 섬유아세포 성장 인자 수용체, 혈관 내피 성장 인자 수용체, 프로락틴 수용체, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4, 및 인테그린, 예를 들어, 인테그린 αvβ3 및 인테그린 α6β4와 시스-상호작용하고, 세포-세포 부착뿐만 아니라 세포 이동, 증식, 분화 및 생존을 조절한다(참조: Kedashiro et al., Sci Rep, 9:18997, 2019).
넥틴 계열의 여러 구성원은 면역글로불린 수퍼패밀리의 다른 구성원과 이호성 트랜스 상호작용의 결과로 면역조절 기능을 발휘할 수 있다. 이러한 상호작용은 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 수지상 세포(DC) 및 T 림프구를 포함하는 다양한 면역 세포 유형의 기능에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 공지된 넥틴 계열 상호작용자 중 일부는 IgSF 구성원일 뿐만 아니라 일부 넥틴은 일반적인 결합 파트너를 인식하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 넥틴-2 및 PVR은 모두 CD226, TIGIT 및 넥틴-3을 인식한다(참조: Duraivelan et al., Sci Rep, 10:9434, 2020).
단백질을 기능적으로 관련된 계열로 분류하기 위한 알고리즘을 사용한 생물정보학 분석은 5개의 추가 IgSF 구성원인 CD96(TACTILE), CD226(DNAM-1), TIGIT(WUCAM, VSTM3), CRTAM 및 CD200이 기능적이고 진화적으로 넥틴 및 넥틴 유사 단백질과 관련이 있으며 넥틴 계열의 구성원에 대한 결합 파트너를 나타낼 수 있음을 예측했다(참조: Rubinstein et al., Structure, 21(5):766-776, 2013). 지금까지 CD200을 제외하고 이들 단백질 모두는 넥틴-/넥틴-유사 계열의 구성원에 결합하는 것으로 보고되었다(Rubenstein, et al).
넥틴 -4
넥틴-4는 관련 서열을 식별하기 위해 공지된 넥틴 단백질 엑토도메인으로부터의 서열을 사용하는 생물정보학 검색을 통해 처음 식별되었다(Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001). 인간 넥틴-4는 인간 기관으로부터 클로닝되었으며, 정상적인 인간 조직에서 제한된 발현 패턴을 갖는 항원으로 기재되었다.
레이몬드(Reymond)와 동료들은 다음과 같은 그들의 발견에 기초하여 넥틴-4를 넥틴-1에 대한 새로운 리간드로 식별했다(참조: Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001): i) 가용성 키메라 재조합 넥틴-4 엑토도메인(넥틴-4-Fc)은 넥틴-1을 발현하는 세포와 상호작용하지만 PVR/CD155, 넥틴-2 또는 넥틴-3을 발현하는 세포와는 상호작용하지 않으며, 반대로 넥틴-1Fc는 넥틴-4를 발현하는 세포에 결합하고; ii) 넥틴-1-Fc는 COS 세포에서 발현된 넥틴-4를 침전시키고; iii) 넥틴-4-Fc와 넥틴-1-Fc 가용성 재조합 단백질 사이에서 상호적인 시험관내 물리적 상호작용이 관찰되었다(Reymond, N et al.). 넥틴-4-Fc/넥틴-4-Fc 상호작용이 또한 검출되어 넥틴-4가 동호성 및 이호성 특성을 모두 가지고 있음을 나타낸다.
인간 넥틴-4 유전자는 510개의 아미노산을 함유하는 55.5kDa 단백질인 넥틴-4 부착 수용체를 인코딩하는 9개의 엑손을 함유한다. 단백질 지식 데이터베이스 UniProtKb에 따르면, 넥틴-4(Q96NY8)는 N-말단 신호 펩티드(1-31개 아미노산), 3개의 면역글로불린 유사 하위 도메인(V-type1 32-144개 아미노산, C2-type1 148-237개 아미노산, C2-type2 248-331개 아미노산)을 갖는 세포외 도메인(32-349개 아미노산), 막관통 도메인(350-370개 아미노산) 및 세포질 도메인(371-510개 아미노산)을 함유한다.
넥틴-4의 V-유사 도메인은 넥틴-1과의 트랜스-상호작용을 매개하기에 충분하고, 막 근위 넥틴-4 C-유사 도메인은 트랜스-상호작용의 친화도를 증가시키는데 기여하는 것으로 보고되었다(참조: Fabre et al., J Biol Chem, 277(30):27006-27013, 2002). 넥틴-4 및 넥틴-3은 넥틴-1 V-유사 도메인에서 공통 결합 영역을 공유한다(참조: Harrison et al., Nat Struct Mol Biol, 19(9):906-915, 2012).
넥틴-4/넥틴-1 트랜스-상호작용은 에피토프가 넥틴-1의 V-유사 도메인에 국한된 항-넥틴-1 모노클로날 항체(R1.302)에 의해 차단된다는 것도 보고되었다(참조: Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001). 후속 간행물은 넥틴-4의 Ig 유사 V 도메인에 특이적인 모노클로날 항체가 인간 넥틴-4(NIH:OVCAR5)를 넥틴-1에 과발현하도록 조작된 난소암 세포주의 부착을 차단한다는 것을 확립했다(참조: Boylan et al., Oncotarget, 8(6):9717-9738, 2017).
암 면역 요법을 위한 넥틴-4 표적화
넥틴-4는 방광암에서 높은 수준의 mRNA 발현으로 인해 억제 빼기 혼성화를 사용하여 잠재적인 ADC 표적으로 식별되었다(참조: Challita-Eid et al., Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016). 넥틴-4는 원래 인간 태반에서 내피 세포에 의한 넥틴-4의 제한된 발현(참조: Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001), 정상적인 성인 조직에서의 발현 부족, 유방암, 난소암, 췌장암 및 폐암을 포함하는 다양한 암 조직에서의 재발현(참조: Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007, Takano et al., Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009, Derycke et al., Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010, Pavlova et al., Elife, 2:e00358, 2013, Nishiwada et al., J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015, Challita-Eid et al., Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016)을 보고하는 초기 간행물 때문에 종양 특이적 항원(TSA)으로 기재되었다.
인간 넥틴-4의 세포외 도메인에 대해 지시된 뮤린 항체(murine antibody)(M22-244b3) 및 정상 인간 조직 시험편의 패널(36개의 인간 기관을 나타냄)을 사용하는 면역조직화학(IHC) 연구 결과는 이전에 보고된 것보다 낮은 내지 중간 수준으로 정상 조직에서 더 광범위한 발현을 증명했으며(참조: Challita-Eid et al.), 표적 항-넥틴-4 독성을 유발할 위험이 증가할 수 있는 정상 조직을 식별한다. 인간 피부 각질 세포, 피부 부속기(땀샘 및 모낭, 및 방광, 위, 유방, 식도 및 침샘(관)의 상피)에서 낮은 수준의 약한 내지 중간 정도의 균질한 염색이 보고되었고(참조: Challita-Eid et al., Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001, Brancati et al., Am J Hum Gen, 87:265-273, 2010), 넥틴-4가 TSA보다 종양 관련 항원(TAA)에 더 가깝다는 것을 시사한다.
넥틴-4는 여러 암, 특히 요로상피암, 폐암, 췌장암, 유방암 및 난소암에서 과발현된다(참조: Challita-Eid et al., Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016, Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007, Takano et al., Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009, Derycke et al., Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010). 7개의 상이한 징후(예: 방광암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 두경부암 및 식도암)을 나타내는 34개 종양을 나타내는 인간 암 종양 마이크로어레이(TMA)에서 넥틴-4 발현의 광범위한 면역조직화학은 평가된 암 징후 전반에 걸쳐 TMA 시험편의 69%가 넥틴-4에 대해 양성이었음을 확립하였다. 넥틴-4의 전반적인 발현에 대한 가장 높은 빈도는 방광, 유방 및 췌장 종양에서 관찰되었다. 난소암, 폐암, 두경부암 및 식도암 샘플에서, 중간 내지 강한 염색을 갖는 넥틴-4-양성 샘플의 유병률은 일반적으로 더 낮았다(참조: Chalittta-Eid et al.). 암에서 관찰되는 더 높은 넥틴-4 발현 수준은 이론적으로 항-넥틴-4 표적화 ADC 및 항체 기반 면역요법에 대해 허용 가능한 안전성 프로필을 특징으로 하는 치료 창을 제공한다(참조: Challita-Eid et al., Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016, and Shim et al., Biomolecules, 10(3):360, 2020).
상피암 진행의 초기 단계는 세포외 매트릭스 고정의 부재하에 생존하고 증식하는 능력을 부여하는 유전적 변화를 특징으로 한다. 고정의 손실을 견디는 암 세포의 능력은 암 세포의 생존과 종양 형성의 병리학적 진행(예: 기저 기질의 침입, 혈관으로의 혈관 외 유출 및 원위 부위로서의 전이성 파생물)에 중요하다(참조: Pavlova et al., Elife, 2:e00358, 2013). 넥틴-4는 TL-HMEC(SV40 Large T 항원으로 형질도입된 hTERT-불멸화 인간 유방 상피 세포)에서 매트릭스 고정과 무관하게 세포 증식을 가능하게 하는 유전자에 대한 기능 스크리닝의 획득에서 식별되었다(참조: Pavlova et al., Elife, 2:e00358, 2013).
문헌(참조: Pavlova et al.)은 넥틴-4가 현탁액 중 다세포 클러스터로 TL-HMEC의 급속한 회합을 유도하고, 넥틴-4의 세포외 도메인에 지시된 항체를 사용하여 관찰된 클러스터 형성을 방해할 수 있음을 추가로 보고했다. 세포 클러스터링은 항-넥틴-4 항체의 존재하에 완전히 제거되었다. 유사하게, 넥틴-1의 세포외 영역을 표적으로 하는 항체는 또한 넥틴-4-유도 세포 클러스터링을 억제했다.
문헌(참조: Pavlova et al.)은 넥틴-4가 인접한 세포에 넥틴-1 수용체를 결합하여 매트릭스 부착 독립적 방식으로 인테그린 β4/SHP-2/c-Src 활성화를 유발하는 상호작용인 종양 세포 서로의 클러스터링을 촉진한다는 것을 추가로 입증했다. 문헌(참조: Pavlov et al.)은 넥틴-4/넥틴-1 상호작용을 통한 종양 특이적 세포-세포 접촉 및 신호 전달이 세포-매트릭스 신호 전달을 위한 대용물을 제공하고 아노이키스(즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 인접 세포에 대한 부착 손실시 세포에서 아폽토시스의 유도) 회피를 가능하게 하는 생존 이점을 부여하는 모델을 제안했다.
난소암 진행의 기초가 되는 세포 기능(즉, 세포 부착, 회전 타원체 형성, 이동 및 증식)에서 넥틴-4의 생물학적 중요성을 결정하기 위해 수행된 연구 결과는 넥틴-4의 IgV-유사 도메인에 대한 mAb가 넥틴-1에 대한 난소암 세포 부착을 거의 완전히 차단했음을 입증하는 시험관내 데이터를 보고한다(참조: Boylan et al., Oncotarget, 8(6):9717-9738, 2017). 문헌(참조: Boylan et al.)은 파블로바(Pavlova)가 유방암의 마우스 이종이식편 모델에서 동일한 항-넥틴-4 항체를 사용했으며, 대조군 IgG로 처리된 종양과 비교하여 생체내에서 종양 세포 부착의 파괴 및 감소된 종양 성장을 관찰하였음을 언급하고, 조합된 결과에 기초하여 넥틴-4 세포 부착을 차단하는 것이 암 면역요법에 사용되는 항-넥틴-4 항체의 치료 효능의 중요한 구성 요소일 수 있다고 추측한다(Boylan et al.).
넥틴-4 발현 종양의 치료를 위한 단일요법으로서 항-넥틴-4 ADC의 사용을 평가하는 전임상 연구의 결과를 보고하는 간행물은 항-넥틴-4 항체 기반 면역치료제의 임상 개발을 입증했다. 예를 들어, AGS-22M6E ADC 단일요법은 인간 방광암, 췌장암, 유방암 및 폐암의 4마리 마우스 이종이식편 모델에서 종양의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다. 문헌(참조: M-Rabet et al.)의 후속 간행물은 상이한 항-넥틴-4 항체를 사용하여 제조된 ADC(N41 mAb-vcMMAE)(WO 2017/042210)가 면역손상된 NSG 마우스에서 발달된 TNBC의 3가지 모델에서 원발성 종양, 전이성 병변 및 국소 재발에 대해 시험관내 및 생체내에서 완전하고 지속적인 반응을 유도했다는 관찰에 기초하여 원발성 및 전이성 삼중 음성 유방암(TNBC)의 치료 표적으로 넥틴-4를 확인했다(참조: M-Rabet et al., Annals of Oncology, 28(4):769-776, 2017).
넥틴 -4/ TIGIT
TIGIT는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하며, 폴리오바이러스 수용체(PVR 또는 CD155 또는 Necl-5), PVRL2(CD112 또는 넥틴-2), CD113(넥틴-3)을 포함한 인간 넥틴 계열의 구성원과 상호작용하는 것으로 공지되어 있다(참조: Stanietsky et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 106:17585-63, 2009, Yu et al., Nat Immunol , 10:48-57, 2009, Boles et al., Eur J Immunol, 39:695-703, 2009).
TIGIT는 기억 T 세포 및 조절 T 세포(Yu et al. (2009))를 포함한 대부분의 NK 세포 및 다중 T 세포 서브세트에 의해 CD8+ 종양 침윤성 림프구(TIL)(Reches et al., J Immunotherapy Cancer)에서 발현된다. PVR 또는 넥틴-2와의 상호작용 후 TIGIT는 T 세포 또는 NK 세포 이펙터 기능의 활성화를 억제한다. T 세포 활성화의 TIGIT의 억제는 면역조절 수지상 세포의 생성에 기인한다(참조: Yu, X., et al. Nat. Immunol. (10) 48-57 (2009)). PVR은 TIGIT, TACTILE 및 DNAM-1에 대한 공통 리간드이다. DNAM-1(CD226)은 PVR 결합에 대해 TIGIT 둘 다와 경쟁하는 공동자극 카운터 수용체이다. 그러나, PVR/수용체 상호작용의 결합 친화도는 매우 상이하며, TIGIT가 DNAM-1 또는 TACTILE보다 PVR에 대해 더 큰 친화도를 갖는다(참조: Yu et al., 2009). PVR 리간드 결합에 대한 TIGIT 우세는 이펙터 세포 공동자극보다 이펙터 세포 억제를 선호한다. TIGIT는 항종양 반응을 제한하는 데 있어 겉으로 중심적인 역할로 인해 암 요법을 위한 특히 매력적인 표적으로 부상했다.
넥틴-4는 TIGIT의 기능적 리간드로서 최근에 식별되었으며, 공개된 데이터는 넥틴-4/TIGIT 상호작용이 자연 살해 세포 활성을 억제함을 입증한다(참조: Reches et al., J Immunotherapy Cancer, 8:e000266, 2020). 간행물(참조: Reches et al.)은 또한 넥틴-4/TIGIT 상호작용을 차단할 수 있는 항체가 시험관내 및 생체내에서 종양 세포 사멸을 향상시킨다고 보고하고(참조: Reches et al., 및 WO 2019/215782), 항-넥틴-4 항체를 사용하여 넥틴-4/TIGIT 상호작용을 차단하면 종양에 대한 면역 반응의 특이적이고 유의한 유도를 유도할 수 있음을 추측한다.
항- 넥틴 -4 항체
개시된 항-넥틴-4 항체(N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8)는 인간 넥틴-4에 특이적으로 결합하고 넥틴-4/넥틴-1 및/또는 넥틴-4/TIGIT 결합 상호작용을 방해한다. 이들 항체 및 이의 단편은 넥틴-4에 대한 고유한 세트의 CDR 서열 특이성을 특징으로 하며, 단일 요법으로 또는 다른 항암제와 함께 암 면역요법에 유용하다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 인간 넥틴-4에 결합하는 항체, 및 종양 미세환경에 국한된 세포의 넥틴-4-매개 활성을 조절하기 위한 그들의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 개시된 항체는 인간 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 모노클로날, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 이의 항원 결합 부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 단독으로 또는 조합하여 다음의 구조적 및 기능적 특징 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 인간 넥틴-4에 특이적이고; (b) 인간 넥틴-1, 인간 넥틴-2 또는 인간 넥틴-3에 결합하지 않고; (c) 넥틴-4의 N-말단 Ig-유사 V 도메인에서 에피토프에 결합하고; (d) 결합 후 넥틴-4 양성 세포의 표면으로부터 내재화되고; (e) 시노몰구스 넥틴-4와 교차 반응하고; (f) 래트 및/또는 뮤린 넥틴-4와 교차 반응하며; (g) 인간 넥틴-4/넥틴-1 결합 상호작용을 감소시킴을 포함하여 방해하고; (h) 인간 넥틴-4/TIGIT 결합 상호작용을 감소시킴을 포함하여 방해하고; (i) 인간 종양 세포에서 넥틴-4의 세포 표면 단백질 발현 수준을 감소시키거나; (j) 넥틴-4의 내인성 수준을 발현하는 인간 세포의 ADCC를 지시한다.
최대 결합 능력, EC50, 세포 표면 내재화 및 세포독성의 시험관내 평가에 기초하여, 개시된 항-넥틴-4 항체 및 이의 단편은 암의 치료를 위한 ADC 기반 표적화 항체 또는 항체 단편으로 사용하기 위한 적합성에 대해 평가될 수 있다. 다른 구현예에서, 개시된 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 항체-의존성 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성(CDC)을 유도하고/하거나 넥틴-4/넥틴-1 또는 넥틴-4/TIGIT 축에서 발암성 수용체 신호를 차단하거나, 분비된 넥틴-4를 중화시키기 위해 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 표 1에 개시된 CDR의 세트(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)를 갖는 VH를 포함한다. 예를 들어, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 표 1에 개시된 하나 이상의 항-넥틴-4 항체의 CDR(예: N4_mAb1의 CDR)에 상응하는 CDR의 세트를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 표 2에 개시된 바와 같은 CDR의 세트(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)를 갖는 VL을 포함한다. 예를 들어, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 표 2에 개시된 하나 이상의 항-넥틴-4 항체의 CDR(예: N4_mAb 2의 CDR)에 상응하는 CDR의 세트를 포함할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 표 1에 개시된 CDR의 세트(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)를 갖는 VH 및 표 2에 개시된 CDR의 세트(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)를 갖는 VL을 포함한다. 한 구현예에서, 항체는 인간 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 모노클로날, 키메라, 이중특이적, 인간화 또는 인간 항체, 또는 이의 항원 결합 부분일 수 있다. 하나의 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 키메라 또는 인간화 항체로서 포맷된 N4_mAb 1, N4_mAb 2, N4_mAb 3, N4_mAb 4, N4_mAb 5, N4_mAb 6, N4_mAb 7 또는 N4_mAb 8 항체의 6개 CDR 영역 모두를 포함한다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
하나의 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH를 포함한다:
(i) CDR1: 서열번호 17, CDR2: 서열번호 18, CDR3: 서열번호 19;
(ii) CDR1: 서열번호 23, CDR2: 서열번호 24, CDR3: 서열번호 25;
(iii) CDR1: 서열번호 29, CDR2: 서열번호 30, CDR3: 서열번호 31;
(iv) CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, CDR3: 서열번호 37;
(v) CDR1: 서열번호 41, CDR2: 서열번호 42, CDR3: 서열번호 43;
(vi) CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 48, CDR3: 서열번호 49;
(vii) CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 53, CDR3: 서열번호 54; 및
(viii) CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, CDR3: 서열번호 59.
하나의 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VL을 포함한다:
(i) CDR1: 서열번호 20, CDR2: 서열번호 21, CDR3: 서열번호 22;
(ii) CDR1: 서열번호 26, CDR2: 서열번호 27, CDR3: 서열번호 28;
(iii) CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, CDR3: 서열번호 34;
(iv) CDR1: 서열번호 38, CDR2: 서열번호 39, CDR3: 서열번호 40;
(v) CDR1: 서열번호 44, CDR2: 서열번호 45, CDR3: 서열번호 46;
(vi) CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 52;
(vii) CDR1: 서열번호 55, CDR2: 서열번호 56, CDR3: 서열번호 52 및
(viii) CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 60.
또 다른 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 다음을 포함한다:
(a) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH:
(i) CDR1: 서열번호 17, CDR2: 서열번호 18, CDR3: 서열번호 19;
(ii) CDR1: 서열번호 23, CDR2: 서열번호 24, CDR3: 서열번호 25;
(iii) CDR1: 서열번호 29, CDR2: 서열번호 30, CDR3: 서열번호 31;
(iv) CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, CDR3: 서열번호 37;
(v) CDR1: 서열번호 41, CDR2: 서열번호 42, CDR3: 서열번호 43;
(vi) CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 48, CDR3: 서열번호 49;
(vii) CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 53, CDR3: 서열번호 54; 및
(viii) CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, CDR3: 서열번호 59, 및
(b) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VL:
(i) CDR1: 서열번호 20, CDR2: 서열번호 21, CDR3: 서열번호 22;
(ii) CDR1: 서열번호 26, CDR2: 서열번호 27, CDR3: 서열번호 28;
(iii) CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, CDR3: 서열번호 34;
(iv) CDR1: 서열번호 38, CDR2: 서열번호 39, CDR3: 서열번호 40;
(v) CDR1: 서열번호 44, CDR2: 서열번호 45, CDR3: 서열번호 46;
(vi) CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 52;
(vii) CDR1: 서열번호 55, CDR2: 서열번호 56, CDR3: 서열번호 52 및
(viii) CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 60.
한 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH: CDR1: 서열번호 17, CDR2: 서열번호 18, CDR3: 서열번호 19, VL: CDR1: 서열번호 20, CDR2: 서열번호 21, CDR3: 서열번호 22;
(ii) VH: CDR1: 서열번호 23, CDR2: 서열번호 24, CDR3: 서열번호 25, VL: CDR1: 서열번호 26, CDR2: 서열번호 27, CDR3: 서열번호 28;
(iii) VH: CDR1: 서열번호 29, CDR2: 서열번호 30, CDR3: 서열번호 31, VL: CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, CDR3: 서열번호 34;
(iv) VH: CDR1: 서열번호 35 CDR2: 서열번호 36, CDR3: 서열번호 37, VL: CDR1: 서열번호 38, CDR2: 서열번호 39, CDR3: 서열번호 40;
(v) VH: CDR1: 서열번호 41, CDR2: 서열번호 42, CDR3: 서열번호 43, VL: CDR1: 서열번호 44, CDR2: 서열번호 45, CDR3: 서열번호 46;
(vi) VH: CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 48, CDR3: 서열번호 49, VL: CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 52;
(vii) VH: CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 53, CDR3: 서열번호 54, VL: CDR1: 서열번호 55, CDR2: 서열번호 56, CDR3: 서열번호 52;
(viii) VH: CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, CDR3: 서열번호 59, 및 VL: CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 60.
한 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 중쇄 서열; 및/또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 경쇄 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 하기 조합으로부터 선택된 한 쌍의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함한다: 서열번호 1을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2를 포함하는 가변 경쇄 서열; 서열번호 3을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 4를 포함하는 가변 경쇄 서열; 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 6을 포함하는 가변 경쇄 서열; 서열번호 7을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 8을 포함하는 가변 경쇄 서열; 서열번호 9를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 10을 포함하는 가변 경쇄 서열; 서열번호 11을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 12를 포함하는 가변 경쇄 서열; 서열번호 13을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 14를 포함하는 가변 경쇄 서열; 서열번호 15를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 16을 포함하는 가변 경쇄 서열. 당업자는 또한 가변 경쇄 및 가변 중쇄가 독립적으로 선택되거나 혼합되고 매칭되어 상기 식별된 쌍과 구별되는 가변 중쇄와 가변 경쇄의 조합을 포함하는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편을 제조할 수 있음을 이해할 것이다.
대안적인 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 하기 조합으로부터 선택된 한 쌍의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함한다: 서열번호 1과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 서열번호 3과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 4와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 서열번호 5와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 6과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 서열번호 7과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 8과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 서열번호 9와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 10과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 서열번호 11과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 12와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 서열번호 13과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 14와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 서열번호 15와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 16과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열. 유리하게는, 이러한 항체 또는 이의 단편은 넥틴-4에 대한 결합 특이성을 보유한다. 당업자는 또한 가변 경쇄 및 가변 중쇄가 독립적으로 선택되거나 혼합되고 매칭되어 상기 식별된 쌍과 구별되는 가변 중쇄와 가변 경쇄의 조합을 포함하는 항-넥틴-4 항체를 제조할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체(dAb) 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 단편, 단일 쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니항체, 및 적어도 폴리펩티드에 넥틴-4 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-넥틴-4 항체의 가변 영역 도메인은 C-말단 아미노산에서 적어도 하나의 다른 항체 도메인 또는 이의 단편에 공유적으로 부착될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 가변 영역 도메인에 존재하는 VH 도메인은 면역글로불린 CH1 도메인 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 유사하게, VL 도메인은 CK 도메인 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 항체는 항원 결합 도메인이 C-말단에서 각각 CH1 및 CK 도메인에 공유 결합된 관련 VH 및 VL 도메인을 함유하는 Fab 단편일 수 있다. CH1 도메인은, 예를 들어, Fab 단편에서 발견되는 힌지 영역 또는 힌지 영역 도메인의 일부를 제공하거나 추가 도메인, 예를 들어, 항체 CH2 및 CH3 도메인을 제공하기 위해 추가의 아미노산으로 확장될 수 있다.
따라서, 하나의 구현예에서, 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다. 항체 단편은 본원에 기재된 항체의 적어도 하나의 가변 영역 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 가변 영역 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있고 일반적으로 인간 넥틴-4에 대한 결합을 담당하는 적어도 하나의 CDR 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3을 포함할 것이고, 이는 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 프레임 내에 있다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 인간 항체이다. 대안적인 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 뮤린 항체이다. 일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 키메라 항체, 이중특이적 항체 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 단독으로 또는 조합하여 하기 구조적 및 기능적 특징 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 인간 넥틴-4에 특이적이고, (b) 인간 넥틴-1, 인간 넥틴-2 또는 인간 넥틴-3에 결합하지 않고, (c) 넥틴-4의 N 말단 Ig-유사 V 도메인의 에피토프에 결합하고, (d) 결합 후 넥틴-4 양성 세포의 표면으로부터 내재화되고, (e) 시노몰구스 넥틴-4와 교차 반응하고; (f) 래트 및/또는 뮤린 넥틴-4와 교차 반응하고, (g) 인간 넥틴-4/넥틴-1 결합 상호작용을 감소시킴을 포함하여 방해하고, (h) 인간 넥틴-4/TIGIT 결합 상호작용을 감소시킴을 포함하여 방해하고, (i) 인간 종양 세포에서 넥틴-4의 세포 표면 단백질 발현 수준을 감소시키거나, (j) 넥틴-4의 내인성 수준을 발현하는 인간 세포의 ADCC를 지시한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 당업자는 보존적 아미노산 치환이 하나의 아미노산을, 예를 들어, 유사한 측쇄와 같은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것임을 인지할 것이다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에, 예를 들어, 문헌(참조: Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Publication Company, 4th Ed. (1987))에 기재되어 있다.
"보존적 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형에는 아미노산 치환, 첨가 및 결실이 포함된다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 잘 정의되어 있으며, 산성 측쇄(예: 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예: 리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 하전되지 않은 극성 측쇄(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄(예: 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예: 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄 (예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 황 함유 측쇄(시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 대해 이전에 기재된 바와 같이(참조: MacLennan et al. (1998) Acta Physiol Scand Suppl 643: 55-67; Sasaki et al. (1998) Adv Biophys 35: 1-24), 폴리펩티드 중 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있다. 본 개시내용의 항체에 대한 아미노산 치환은 공지된 방법, 예를 들어, PCR 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다(미국 특허 제4,683,195호).
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15의 가변 중쇄 서열을 포함하는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 추가의 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 추가의 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 (카바트의 넘버링 시스템에 기초하여)에서 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 제시된 항-넥틴-4 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, 프레임워크 영역에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하고(카바트의 넘버링 시스템을 기반으로 함), 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 가변 경쇄 서열을 포함하는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 더욱 추가의 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16(카바트의 넘버링 시스템에 기초함) 내의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 제시된 항-넥틴-4 경쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, 프레임워크 영역에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(카바트의 넘버링 시스템에 기초함)을 포함하며, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
결합 특성
개시된 항체(N4_mAb 1, N4_mAb 2, N4_mAb 3, N4_mAb 4, N4_mAb 5, N4_mAb 6, N4_mAb 7 및 N4_mAb 8) 및 이의 항체 단편은 정상 또는 악성 세포의 표면에서 발생할 때 인간 넥틴-4에 특이적으로 결합하지만 인간 넥틴-1, 넥틴-2 또는 넥틴-3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
항체는 전형적으로 10-7 내지 10-11M 이하의 해리 상수(KD)에 의해 반영되는 높은 친화도로 그들의 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10-6M보다 큰 임의의 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본원에 사용된 바와 같이, 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 10-7M 이하, 바람직하게는 10-8M 이하, 더욱 더 바람직하게는 5 x 10-9M 이하, 가장 바람직하게는 10-8M 내지 10-10M 이하를 가짐을 의미하는 고친화도로 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 결합하지만, 관련 되지 않은 항원에 높은 친화도로 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 개시된 항체는 높은 친화도로 인간 넥틴-4 ECD에 결합하고, KD는 1.72 x 10-8M 내지 3.75 x 10-10M 범위의 SPR에 의해 결정된다. N4_mAb 6, N_mAb 7 및 N4_mAb 8은 4 x 10-10M 미만의 KD를 갖는 가장 높은 친화도 그룹을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "교차-반응한다"는 상이한 종으로부터의 넥틴-4에 결합하는 본원에 기재된 항-인간 넥틴-4 특이적 항체의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체는 또한 다른 종(예: 시노몰구스 또는 래트, 또는 마우스 넥틴-4)으로부터의 넥틴-4에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 교차 반응성은 결합 검정(예: SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출하거나, 넥틴-4를 생리학적으로 발현하는 세포에 결합하거나, 또는 그렇지 않으면 이와 기능적으로 상호작용함으로써 측정될 수 있다. 교차 반응성을 결정하기 위한 방법은, 예를 들어, BIACORE® 2000 SPR 기기(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하는 BIACORE® 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석 또는 유세포 계측 기술에 의해 본원에 기재된 바와 같은 표준 결합 검정을 포함한다.
개시된 인간 넥틴-4 항체, N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8은 모두 주목할만한 친화도로 시노몰구스 원숭이의 넥틴-4에 결합한다. 래트 넥틴-4에 대한 그들의 결합 친화도는 다양하며, N4_mAb 5, N4_mAb 6, N4_mAb 7 및 N4_mAb 8이 가장 강하다. 그들은 마우스 넥틴-4에 대한 결합이 약하거나 없음을 보여준다.
키메라 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들어, 문헌(참조: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예: 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예를 들어, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 부류 또는 하위부류로부터 변경된 "부류 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항체 단편을 포함한다.
항체는 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 갖는 키메라 항체 또는 이의 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 컨센서스 인간 IgG1 불변 영역 서열(Uniprot P01857)을 사용하는 반면, 경쇄 불변 영역은 컨센서스 인간 카파 불변 영역 서열(UniProt P01834)을 사용한다. 인간 IgG1은 키메라 항체 생성을 위한 가장 일반적인 아형 중 하나이고 이펙터 기능을 제공할 수 있기 때문에 선택될 수 있다. 인간 카파 불변 영역은 모든 부모 뮤린 항체가 마우스 카파 경쇄이기 때문에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 부모 비인간 항체의 특이성과 친화도를 보유하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어, CDR(또는 이의 일부)이 비인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 이의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 인간 불변 영역의 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예: HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어, 항체 결합 특이성 또는 친화도를 회복하거나 또는 개선시킨다.
인간화 항체 및 그들을 제조하는 방법은, 예를 들어, 문헌(참조: Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))에서 검토되었고, 예를 들어, 문헌(참조: Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989); U.S. Pat. No. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역(SDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, Mol . Immunol. 28:489-498 (1991)("재포장"을 기재함); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 기재함); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "가이드된 선택" 접근법을 기재함))에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적 적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Sims et al. J. Immunol . 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); and Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유도된 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
넥틴 -4 내재화 및 용량 의존적 세포독성
넥틴-4에 특이적인 개시된 항체는 넥틴-4의 유도성 내재화를 포함하는 내재화를 매개할 수 있으며, 이는 ADC-접합된 2차 항체가 존재할 때 용량 의존적 세포독성을 유발한다. 넥틴-4를 과발현하는 CHO 세포주에서, 세포 사멸에 대해 관찰된 EC50은 0.21nM 내지 0.63nM 범위이고, 암 세포주 SKBR3에서 세포 사멸에 대한 EC50은 0.61nM 내지 2.14nM 범위였다.
항체 기반 면역요법
종양-항원-표적화 항체를 사용하는 항체-기반 면역요법의 목표는 정상 조직을 손상시키지 않으면서 암 세포를 제거하는 것이다. 따라서, 종양학에서 항체 기반 면역요법의 효능과 안전성은 대부분 의도된 작용 기전, 면역계의 관련 이펙터 기능 및 종양 특이적 또는 종양 관련 표적 항원의 특성에 따라 달라진다.
항체-약물 접합체(ADC)는 매우 강력한 항체 기반 암 치료제의 부류이다. ADC는 합성 링커를 통해 세포독성제(페이로드로서 공지됨)에 공유 결합된 재조합 모노클로날 항체로 구성된다. ADC는 모노클로날 항체의 특이성과 소분자 화학요법 약물의 효능을 결합하고 종양 세포에 직접 매우 세포독성 소분자 약물 모이어티의 표적 전달을 촉진한다. ADC의 표적화 특성은 제한된 전신 노출과 결합된 약물 효능 증가를 허용한다. 함께, 이들 특징은 더 적은 부작용과 더 넓은 치료 창을 갖는 바람직한 특성을 갖는 ADC를 제공한다(참조: Peters et al., Biosci Rep, 35(4):e00225, 2015).
일반적으로, ADC가 암 세포 표면 상의 항원에 결합하면, 그것은 내부화되어 분해를 위해 엔도좀/리소좀 경로를 따라 전송된다. 리소좀에서, 페이로드는 리소좀 효소에 의한 링커의 특이적 절단 또는 항체의 일반적인 분해를 통해 방출된다. 이어서, 방출된 세포독성 화합물은 리소좀을 떠나 필요한 임계 수준까지 축적되고 궁극적으로 표적화 암 세포의 사망을 유발한다. 이상적인 ADC는 mAb의 선택성과 사멸 능력을 보유하면서 종양 세포를 사멸시키기에 충분히 많은 양으로 세포독성 약물을 방출할 수 있는 것이다.
ADC 표적으로 사용하기에 적합한 세포 표면 항원은 두 가지 중요한 특성을 특징으로 한다: (i) 표적 세포에 의한 높은 발현 수준 및 정상 조직에서의 발현이 제한되거나 없음 및 (ii) 항체 결합에 반응하는 내재화(예: 효율적인 내재화). 넥틴-4는 여러 암, 특히 방광암, 폐암, 췌장암, 두경부암, 식도암, 유방암 및 난소암에서 과발현된다(참조: Challita-Eid et al., Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016, Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007, Takano et al., Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009, Derycke et al., Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010). 넥틴-4에 특이적인 모노클로날 항체가 넥틴-4의 유도성 및 효율적인 내재화를 매개할 수 있다는 것도 공지되어 있다(참조: Doronina et al., Nat Biotechnol, 21:778-784, 2003, (M-Rabet et al., Annals of Oncology, 28(4):769-776, 2017, WO2012/047724, US 8,637,642 WO2004/016799, US 7,968,090, WO2017/042210, US 10,675,048). 따라서, 개시된 항-넥틴-4 항체(N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8)는 암 치료를 위한 항체 기반 면역요법의 개발을 위한 ADC 기반 표적화 항체로서 사용하기에 적합하다.
항체-약물 접합체의 생성은 임의의 적합한 페이로드 약물, 합성 링커 및 접합 화학을 사용하여 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 당업자는 ADC를 알고 있을 것이며, 또한 ADC의 개발이 표적 항원 생물학, 항체의 특이성, 세포독성 및 페이로드 약물의 작용 기전, 링커의 안정성 및 절단, 링커 부착 부위, 및 접합 화학에 의해 생성된 ADC 이질성 수준을 포함하는 여러 인자의 평가를 필요로 한다는 것을 알고 있을 것이다. 항체당 부착된 세포독성 분자의 수와 관련하여 이질성은 보다 신속하게 제거될 가능성이 있고 독성에 기여하는 비효능 종(약물 페이로드 없음) 및 항체당 4개 이상의 약물 모이어티(고부하)를 갖는 종을 함유하는 약물 생성물의 생산을 초래할 수 있다. 또한, 비효능 종(세포독성 페이로드가 없는 항체)의 존재는 ADC 표적 항원에 대한 결합을 경쟁함으로써 효능을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일관된 약물:항체 비율(DAR)을 특징으로 하는 항체의 균질한 혼합물을 갖는 ADC 약물 생성물을 생산하는 것이 바람직하다.
현재 임상 평가 중인 대부분의 ADC 후보는 세포독성 페이로드로서 세 가지 주요 약물 부류, 즉 메이탄시노이드, 아우리스타틴 및 PBD 이량체 중 하나를 사용하지만; 다른 부류의 페이로드, 예를 들어, 칼리케아미신(겜투주맙 오조가마이신 및 이노투주맙 오조가미신의 경우), 듀오카마이신, 엑사테칸 또는 SN-38이 또한 사용된다(참조: Shim et al., Biomolecules, 10(3):360, 2020). 일반적으로 말해서, 세포독성 약물은 튜불린 억제제(아우리스타틴 및 메이탄시노이드)로서 또는 듀오카마이신(DNA 알킬화), 칼리케아미신(DNA 이중 가닥 절단), 캄프토테신 유사체(토포이소머라제 억제제), 예를 들어, SN-38 및 엑사테칸, 또는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체(DNA 가닥 가교결합)를 포함하는 DNA 구조의 교란 물질로서 작용한다(참조: Shim et al.).
링커의 주요 기능 중 하나는 혈액 순환에서 ADC 안정성을 유지하면서 표적 세포에 의한 내재화시 독소 방출을 허용하는 것이다. 적합한 링커를 식별하는 동안 고려해야 할 중요한 매개변수는 링커의 절단 가능성 및 접합 화학의 세부 사항(즉, 연결의 위치 및 특성)을 포함한다.
광범위하게 말하면, 링커는 2개의 광범위한 범주: 절단 가능 및 절단 불가능으로 분류된다. 절단 가능한 링커는 혈류에서 정상적인 생리학적 조건과 암 세포의 세포질에 존재하는 세포내 상태 사이의 차이를 이용한다(참조: Peters et al., Biosci Rep, 35(4):e00225, 2015). ADC-항원 복합체가 내재화된 후 미세 환경의 변화는 링커의 절단을 유발하고 세포 독성 페이로드를 방출하여 표적 항원을 발현하는 암 세포에 대한 독성을 효과적으로 표적화한다. 광범위하게 말하면 절단 가능한 링커의 세 가지 유형, 하이드라존, 디설파이드 및 펩티드 링커가 있다. 대조적으로, 절단 불가능한 링커는 ADC-항원 내재화 후 리소좀 분해 과정에만 의존한다. 리소좀 내의 ADC-항원 복합체 프로테아제 효소의 내재화 후 항체의 단백질 구조를 분해하여 링커에 부착된 단일 아미노산(전형적으로 시스테인 또는 리신)과 활성 약물로서 세포질로 방출되는 세포독성제를 남긴다. 링커 화학이 ADC의 특이성, 효능, 활성 및 안전성의 중요한 결정 요인이라는 것은 익히 공지되어 있다.
당업자는 TSA- 또는 TAA-특이적 항체에 대한 링커-페이로드의 접합에 사용하기에 적합한 단백질의 화학적 변형을 위한 많은 기술이 있음을 인지할 것이다. 같은 사람은 접합 화학의 상이한 방법이 약물 부착의 수와 위치에 대해 상이한 수준의 제어를 제공하고 생성되는 항-넥틴-4 ADC의 약동학, 독성 및 치료 창에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 항체-약물 접합체는 통상적인 기술에 따라 약물을 항체에 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)].
당업자는 통상적인 접합 기술(천연 아미노산 서열 조성의 결과로서 항체에 존재하는 표면 노출된 리신 또는 시스테인 잔기에 대한 접합을 포함함) 이외에, 항-넥틴-4 특이적 면역접합체를 제조하는데 사용될 수 있는 부위 특이적 약물 접합의 다수의 다른 방법이 있다는 것을 이해할 것이다.
부위 특이적 접합 화학 방법은 항체의 결합 친화도를 변경하지 않고 비교적 균일한 ADC 생성물을 생성하기 위한 것이다. 일반적으로 말하면, 세 가지 전략이 항체에 대한 부위 특이적 접합에 주로 사용된다: 조작된 시스테인의 사용, 비천연 아미노산의 통합 및 부위 특이적 방식으로 단백질의 번역 후 변형을 생성하는 박테리아 효소(예: 트랜스글루타미나제, 글리코트랜스퍼라제, 소르타제 또는 포르밀 글리신 생성 효소)에 특이적으로 반응하도록 설계된 항체의 반응 부위를 사용하는 효소 접합. 항체에 치료 모이어티를 부위 특이적으로 접합시키기 위한 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 7,723,485; 8,937,161; 9,000,130; 9,884,127; 9,717,803; 10,639,291; 10,357,472; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0283259; US 2017/0362334; US 2018/0140714; 및 국제 공개 번호 WO 2013/092983; WO 2013/092998; WO 2014/072482; WO 2014/202773; WO 2014/202775; WO 2015/155753; WO 2015/191883; WO 2016/102632; WO 2017/059158; WO 2018/140590 및 WO 2018/185526에 기재된 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
ADC는 일반적으로 "방관자 효과"로서 지칭되는 메커니즘에 의해 표면에서 표적 항원의 발현에 관계없이 표적 항원 양성 세포 뿐만 아니라 주변의 다른 세포를 사멸시키도록 설계될 수 있다(참조: Kovtun et al., Cancer Res, 66(6):3214-21, 2006). 방관자 효과가 ADC의 절대 표적 특이성의 개념을 약화시키지만, 표적 항원의 균질한 발현이 결여된 고형 종양을 치료할 때 유리할 수 있다. 엔포르투맙 베도틴은 혼합 세포 검정에서 넥틴-4-양성 세포로부터 세포 투과성 MMAE를 방출하여 넥틴-4-음성 암 세포를 사멸시킴으로써 방관자 효과를 발휘하는 것으로 공지되어 있다(참조: Liu et al., Abstract 5581, Poster presented at the American Association of Cancer Research Virtual Meeting II, 2020). 엔포르투맙 베도틴의 방관자 효과의 문서화는 넥틴-4의 이질적인 발현을 특징으로 하는 종양의 치료를 위해 단독으로 또는 다른 체크포인트 억제제와 함께 넥틴-4 지시된 ADC의 향후 임상 연구를 지원한다.
엔포르투맙 베도틴
엔포르투맙 베도틴-ejfv(PADCEV®)는 최초이자 유일한 FDA 승인된 넥틴-4 지시된 ADC이다. 엔포르투맙 베도틴(AGS-22M6E)은 프로테아제 절단 가능한 링커(말레이미도카프로일 발린-시트룰린)에 의해 소분자 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE, 미세소관 교란제)(참조: 예를 들어, WO 2012/047724, US 8,637,642, US 9,078,931, US 9,962,454)에 접합된 완전 인간 IgG1-카파 항-넥틴-4 항체(AGS-22C3)로 구성된다. ADC는 세포 표면에 발현된 넥틴-4에 결합하고, 전체 복합체가 내재화된다. MMAE는 복합체로부터 절단되어 세포내 미세소관 네트워크의 파괴를 초래하여 세포 주기 정지 및 아폽토시스 세포 사멸을 초래한다.
엔포르투맙을 생성하는데 사용된 부모 항체(AGS-22M6)는 인간 넥틴-4의 세포외 도메인(ECD)으로 XENOMOUSE® 균주(Amgen/Abgenix)를 면역화하여 생성되었다. AGS-22M6은 인간 PC3(전립선암) 숙주 세포의 표면에서 발현된 형질감염된 인간, 원숭이 및 래트 넥틴-4에 결합한다(참조: Challita-Eid et al., Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016). AGS-22M6은 넥틴-4의 첫 번째 Ig 유사 도메인에서 인식하고 에피토프화하고, 시험관내에서 넥틴-4/넥틴-1 트랜스-상호작용을 차단하지만 세포 생존력에 임의의 영향을 미치는 것으로 보고되지 않았다(참조: Challita-Eid et al.). 참고로, 부모 항체는 임의의 전임상 모델에서 항종양 활성을 매개하지 않으며, 엔포르투맙 베도틴 효능은 결합된 세포독성 페이로드 및 넥틴-4 발현과 상관관계가 있다.
엔포르투맙 베도틴은 면역 체크포인트 억제제(즉, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)/프로그래밍된 사멸-리간드 1(PD-L1) 요법) 및 국소 진행성 및 전이성 환경에서 신보조제 또는 보조제 치료로서 백금 기반 화학요법으로 사전 치료를 받은 국소 진행성 및 전이성 요로상피암 환자에게 사용하도록 2019년 12월 미국 식품의약국에 의해 처음 승인되었다. 방광암의 90% 이상을 차지하는 요로상피암은 방광과 주변 장기를 둘러싸고 있는 세포에서 시작된다. 백금 함유 화학 요법, PD-1 및 PD-L1 억제제는 미국에서 여섯 번째로 가장 흔한 암인 방광암 환자를 위한 표준 치료이다.
공개된 보고서는 넥틴-4를 발현하는 암 세포(즉, 방광 암종 세포주 T24-넥틴-4)에 대한 엔포르투맙 베도틴의 결합 이후에, 엔포르투맙 베도틴/넥틴-4 복합체가 세포내 리소좀 구획에서 내재화되고 이화된다는 것을 나타낸다(참조: Doronina et al., Nat Biotechnol, 21:778-784, 2003). 세포질로의 MMAE의 생성되는 세포내 방출은 G2/M 단계에서 성장 정지를 유도한 다음 아폽토시스 세포 사멸을 유도하는 것으로 공지되어 있다(참조: Francisco, JA et al, Blood, 102:1458 2003). 예상된 바와 같이, 더 높은 수준의 세포독성 세포 사멸은 더 높은 수준의 세포내 MMAE의 방출과 상관관계가 있었다. ADC를 제조하는 데 사용된 접합되지 않은 부모 항체(AGS-22M6)에 대한 세포독성 활성은 보고되지 않았다.
비임상 개발 동안 엔포르투맙 베도틴은 넥틴-4 발현 세포주 및 동물 모델에서 항종양 활성을 입증했다. 엔포르투맙 베도틴은 인간 방광암, 췌장암, 유방암 및 폐암의 마우스 이종이식편 모델에서 넥틴-4 발현 종양의 성장을 억제한다. 엔포르투맙 베도틴 치료는 4가지 종양 유형 모두의 성장을 유의하게 억제했으며, 방광 및 유방 이종이식편의 종양 퇴행을 초래했다(참조: Challita-Eid et al., Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016). 방광암 이종이식편 모델(누드 마우스에 이식된 T-24 세포)에서 엔포르투맙 베도틴 ADC 기반 면역요법의 효과는 표적화된 아우리스타틴 전달, 세포 주기 정지, 및 방관자 세포 사멸, 아데노신 트리포스페이트 및 HMGB1의 세포외 방출을 포함하는 면역원성 세포 사멸(ICD), 면역 세포 모집 및 항원 제시 세포의 활성화를 포함하는 아폽토시스를 넘어 확장된 것으로 보고되었다(참조: Liu et al., Abstract 5581, Poster presented at the American Association of Cancer Research Virtual Meeting II, 2020).
FDA는 다기관 II상 EV-201 시험(ClinicalTrials.gov identifier NCT03219333)에서 관찰된 반응률 및 반응의 내구성을 기반으로 엔포르투맙 베도틴의 가속 승인을 승인했다. EV-201 시험은 PD-1 또는 PD-L1 억제제 및 백금 기반 화학 요법으로 사전 치료를 받은 125명의 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암 환자가 등록되었다. 환자는 질환 진행 또는 허용 가능하지 않은 독성까지 28일 주기의 1, 8 및 15일째에 엔포르투맙 베도틴-ejfv 1.25mg/kg을 투여받았다. 특정량의 종양 수축을 보인 환자의 백분율을 반영한 전체 반응률은 44%였으며, 12%는 완전 반응을, 32%는 부분 반응을 보였다. 평균 반응 기간은 7.6개월이었다(참조: Rosenberg et al., J Clin Oncol, 37(29):2592-2600, 2019).
EV-201 연구는 또한 사전 항-PD-1/L1 요법을 받았고 유사한 이점이 관찰될 것인지를 결정하기 위해 사전 백금 치료 없이는 시스플라틴이 부적격한 환자의 두 번째 코호트(코호트 2)를 롤링한다. 엔포르투맙 베도틴은 호르몬 수용체-양성/HER-음성 유방암, 삼중-음성 유방암, 비편평 비소세포 폐암, 두경부암, 위암 및 식도암을 포함한 2상 EV-202 시험(ClinicalTrials.gov identifier NCT04225117)에서 다른 고형 종양에서도 평가되고 있다.
또한, 사전 백금 및 항-PD-1/L1 요법을 받은 환자에서 엔포르투맙 베도틴 단독요법을 단일 약제 화학요법과 비교하는 III상 시험(EV-301; ClinicalTrials.gov identifier NCT03474107)은 이 환자 집단에서 엔포르투맙 베도틴의 생존 이점을 확립할 수 있었다. 엔포르투맙 베도틴은 또한 항-PD-1 및/또는 백금 기반 요법(EV-103; ClinicalTrials.gov identifier: NCT03288545)과 함께 I/II상 시험에서 연구되고 있는 1차 환경을 포함하여 요로상피 암종 환자의 더 광범위한 집단에서 평가되고 있다.
항체 생산 방법
항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 수용자는 가용성 재조합 넥틴-4(N4) 단백질 또는 이의 담체 단백질과 접합된 N4 펩티드의 단편으로 면역화될 수 있다. 임의의 적합한 면역화 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 보조제, 다른 면역 자극제, 반복 부스터 면역화 및 하나 이상의 면역화 경로의 사용을 포함할 수 있다.
인간 넥틴-4의 임의의 적합한 공급원은 본원에 개시된 조성물 및 방법의 비-인간 또는 인간 항-넥틴-4 항체의 생성을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다.
넥틴-4 항원의 상이한 형태가 생물학적으로 활성인 항-넥틴-4 항체의 식별을 위한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 유도성 넥틴-4 항원은 단독으로 또는 하나 이상의 면역원성 증강제와 함께 단일 에피토프, 다중 에피토프 또는 전체 단백질일 수 있다. 일부 측면에서, 유도성 항원은 단리된 가용성 전장 단백질, 또는 전장 서열 미만을 포함하는(예를 들어, 인간 넥틴-4의 V-유사 도메인 또는 인간 넥틴-4의 C-유사 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 펩티드로 면역화하는) 가용성 단백질이다. 본원에서 사용되는 용어 "일부"는, 적절한 경우, 관심 항원의 면역원성 에피토프를 구성하는 최소 수의 아미노산 또는 핵산을 지칭한다. 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 플라스미드, 및 비바이러스 벡터, 예를 들어, 양이온성 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 관심 세포의 형질전환에 적합한 임의의 유전자 벡터가 사용될 수 있다.
마우스, 설치류, 영장류, 인간 등과 같은 다양한 포유류 숙주로부터 모노클로날 항체(mAb)를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하는 기술에 대한 설명은, 예를 들어, 문헌[참조: Sties et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lance Medical Publication, Los Altos, CA, 및 그 안에 인용된 참고문헌; Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2nd ed.) Academic Press, New York, NY]에서 찾을 수 있다. 전형적으로, 목적하는 항원으로 면역화된 동물의 비장 세포는 일반적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 불멸화된다. 문헌(Kohler and Milstein (196) Eur. J. Immunol. 6:511-519)을 참조한다. 대안적인 불멸화 방법은 엡스타인 바 바이러스, 종양유전자 또는 레트로바이러스, 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용한 형질전환을 포함한다. 예를 들어, 문헌(Doyle et al. (eds. 1994 and periodic supplements) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY)을 참조한다. 단일 불멸화 세포로부터 발생하는 콜로니는 항원에 대한 목적하는 특이성 및 친화도의 항체 생산에 대해 스크리닝되며, 이러한 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강 내로의 주사를 포함하는 다양한 기술에 의해 향상될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 문헌(참조: Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281)에 의해 요약된 일반적인 프로토콜에 따라 인간 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 DNA 서열을 단리할 수 있다. 따라서, 항체는 당업자에게 친숙한 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다.
다른 적합한 기술은 파지, 효모, 바이러스 또는 유사한 벡터에서 항체 라이브러리의 선택을 포함한다. 예를 들어, 문헌(Huse et al. 상기; 및 Ward et al. (1989) Nature 341:544-546)을 참조한다. 본원에 개시된 폴리펩티드 및 항체는 키메라 또는 인간화 항체를 포함하여 변형을 포함하거나 포함하지 않고 사용될 수 있다. 흔히 폴리펩티드 및 항체는 검출 가능한 신호를 제공하는 물질을 공유적으로 또는 비공유적으로 결합함으로써 표지될 것이다. 매우 다양한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌 모두에 광범위하게 보고되어 있다. 적합한 표지는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조 인자, 억제제, 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 자성 입자 등을 포함한다. 이러한 표지의 사용을 교시하는 특허는 미국 특허 번호 3,817,837; 3,850,752; 3,9396,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241을 포함한다. 또한, 재조합 면역글로불린이 생산될 수 있고(참조: Cabilly U.S. Patent No. 4,816,567; and Queen et al. (1989) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86: 10029-10023); 또는 유전자도입 마우스에서 제조된다(참조: Nils Lonberg et al. (1994), Nature 368:856-859; and Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156; TRANSGENIC ANIMALS AND METHODS OF USE (WO 2012/62118), Medarex, Trianni, Abgenix, Ablexis, OminiAb, Harbour and other technologies).
일부 구현예에서, 넥틴-4 및/또는 넥틴 계열의 다른 관련 구성원에 결합하는 생산된 항체의 능력은 표준 결합 검정, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR), FoteBio(BLI), ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광, 유세포 계측 분석, 주화성 검정 및 세포 이동 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 측면에서, 생산된 항체는 또한 넥틴-4가 넥틴-1 또는 TIGIT에 결합하는 것을 차단/억제하거나 넥틴-4 발현 세포에 넥틴-4 결합시 효율적으로 내재화되는 능력에 대해 평가될 수 있다.
하이브리도마 또는 숙주 세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 전형적인 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마2 또는 감마4 중쇄에 기초하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다(참조: 예를 들어, Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 감마3에 권장된다(참조: 예를 들어, Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분 아가로스이지만 다른 매트릭스가 이용 가능하다. 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어, 이온 교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예: 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 회수될 항체에 의존하여 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 전형적으로 낮은 염 농도에서(예를 들어, 약 0-0.25M 염으로부터) 수행되는 약 2.5-4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
또한, 본원에 정의된 바와 같이, 낮은, 중등도 및 높은 엄격성 조건하에 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부(예: 가변 영역을 인코딩하는 부분)로 혼성화되는 핵산이 포함된다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 전형적으로 적어도 15개(예: 20개, 25개, 30개 또는 50개)의 뉴클레오티드 길이이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 항-넥틴-4 폴리펩티드(예: 중쇄 또는 경쇄 가변 영역) 또는 이의 보체를 인코딩하는 핵산의 일부 또는 모두의 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일하다. 본원에 기재된 유형의 혼성화 핵산은, 예를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
다른 구현예는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편을 인코딩하는 서열, 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 전장 모노클로날 항체, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 키메라, 인간화, 이중특이적, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하는 항-넥틴-4 항체의 임의의 목적하는 형태를 인코딩할 수 있다.
일부 구현예는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 인코딩한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(b) 서열번호 3을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 4를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(c) 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 6을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(d) 서열번호 7을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 8을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(e) 서열번호 9를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 10을 포함하는 가변 경쇄 서열;
(f) 서열번호 11을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 12를 포함하는 가변 경쇄 서열;
(g) 서열번호 13을 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 14를 포함하는 가변 경쇄 서열; 또는
(h) 서열번호 15를 포함하는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 16을 포함하는 가변 경쇄 서열.
또 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 인코딩한다:
(a) 서열번호 1과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 2 와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
(b) 서열번호 3과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 4 와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
(c) 서열번호 5와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 6 과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
(d) 서열번호 7과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 8 과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
(e) 서열번호 9와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 10 과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
(f) 서열번호 11과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 12와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
(g) 서열번호 13과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 14와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 또는
(h) 서열번호 15와 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 16과 90%, 95% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열.
항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(들)는 당업계에 공지된 바와 같이 하나 이상의 조절 또는 제어 서열에 융합될 수 있고, 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포에 함유될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 분자는 불변 도메인, 예를 들어, 인간 불변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 독립적으로 융합되어 무손상 항체의 생산을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부는 함께 융합되어 단일 쇄 항체의 생산을 위한 주형을 제공할 수 있다.
재조합 생산을 위해, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제 가능한 벡터에 삽입된다. 재조합 항체를 발현하기 위한 많은 적합한 벡터가 이용 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제의 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 또한 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있으며, 여기서 항체 또는 단편은 이종성 폴리펩티드, 예를 들어, 신호 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단에서 특정 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와 융합된다. 선택된 이종성 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 항-넥틴-4 항체 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 원핵생물 신호 서열로 치환될 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 지단백질, 열-안정성 엔테로톡신 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비를 위해, 천연 신호 서열은, 예를 들어, 효모 인버타제 알파-인자(사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 산 포스파타제, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 또는 WO90/13646에 기재된 신호로부터 수득된 리더 서열로 치환될 수 있다. 포유류 세포에서, 포유류 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 헤르페스 gD 신호가 사용될 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임에서 항-넥틴-4 항체를 인코딩하는 DNA에 결찰된다.
발현 및 클로닝 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하는 것이며, 복제의 기원 또는 자율적으로 복제하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 익히 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기원은 대부분의 그람 음성 박테리아인 2-υ에 적합한다. 플라스미드 기원은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 및 BPV)이 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다. 일반적으로, 복제 성분의 기원은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기원은 전형적으로 초기 프로모터를 함유하기 때문에만 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 발현의 식별을 용이하게 하기 위해 선택 가능한 마커를 인코딩하는 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 가능한 마커 유전자는 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하하거나, 대안적으로 보체 영양 요구성 결핍이거나, 또는 다른 대안에서 복합 배지에 존재하지 않는 특정 영양소, 예를 들어, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 인코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
항체 조성물 및 치료 방법
본 개시내용은 또한, 예를 들어, 상피 세포-유래 원발성 또는 전이성 암을 포함하는 암 환자의 치료에 사용하기 위한, 예를 들어, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 종양 세포를 사멸시키기 위해 암 환자에게 투여된다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 넥틴-4를 발현하거나 과발현하는 암 세포의 존재를 특징으로 하는 고형 종양 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 개시된 조성물은 유방암, 폐암, 난소암, 췌장암, 위암, 담낭암 또는 요로상피암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 암의 치료는 종종 2, 3, 4개 또는 심지어 그 이상의 암 약물/요법의 조합 작용이 단일요법 접근법의 영향보다 상당히 더 강한 상승 효과를 생성하기 때문에 조합 전략이 특히 바람직한 분야를 나타낸다. 본원에 제공된 제제 및 조성물(예: 약제학적 조성물)은 단독으로 또는 통상적인 치료 섭생, 예를 들어, 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 동계, 동종이계 또는 비관련)과 조합하여 사용될 수 있다. 제제 및 조성물은 또한 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 면역 체크포인트 억제제, 공동자극 분자, 키나제 억제제, 혈관신생 억제제, 소분자 표적화 요법 약물 및 다중 에피토프 전략 중 하나 이상과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 암 치료는 다양한 다른 약물과 효과적으로 조합될 수 있다.
하나의 치료 방법에서, 항-넥틴-4 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 항-넥틴-4 항체 또는 항체 단편에 접합되거나 접합되지 않은 치료제 또는 독성 제제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-넥틴-4 항체는 세포독성 페이로드를 갖는 ADC를 넥틴-4를 발현하고/하거나 과발현하는 종양에 표적화하는 데 사용된다.
개시된 넥틴-4 항체는 단독으로 또는 암 치료에 유용한 다른 조성물과 함께 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 개시된 항체는 단독으로 또는 암 치료에 유용한 다른 항체를 포함하는 다른 면역치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서 다른 면역치료제는 인간 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), PD-L1 및 PD-L2, 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), NKG2A, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, GITR, VISTA, CD137, TIGIT 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역 체크포인트 분자에 대한 항체이다. 대안적인 구현예에서, 제2 면역치료제는 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)에 대한 항체이다. 각각의 조합은 본 개시내용의 별개의 구현예를 나타낸다.
본원에서 논의된 치료제의 조합은 이중특이적 또는 다중특이적 결합제 또는 융합 단백질의 성분으로서 또는 약제학적으로 허용되는 담체 중의 단일 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 치료제의 조합은 약제학적으로 허용되는 담체 중의 각 제제와 별개의 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 치료제의 조합은 순차적으로 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed ., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995]에 개시된 것들과 같은 통상적인 기술에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제와 제형화될 수 있다. 일부 측면에서, 약제학적 조성물은 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예: 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
전형적으로, 주사에 의한 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 약제는 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 또는 단위 투여 형태, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰와 같은 밀폐된 용기에 무수 동결건조 분말 또는 무수 농축액으로서 함께 혼합된다. 약제가 주입으로 투여되는 경우, 멸균 약제 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약제가 주사로 투여되는 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있어 성분이 투여 전에 혼합될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 활성 화합물은 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같은 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)을 참조한다.
대안적인 구현예에서, 종래의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법은 포유류 세포 또는 표적 조직에서 본원에 기재된 바와 같이 항체 또는 이의 유도체를 인코딩하는 핵산을 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 항체를 인코딩하는 핵산을 시험관내 세포에 투여하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 유도체를 인코딩하는 핵산은 생체내 또는 생체외 유전자 요법 용도를 위해 투여된다. 다른 구현예에서, 세포 기반 또는 동물 모델에서 항체의 활성을 연구하기 위해 유전자 전달 기술이 사용된다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산 및 리포좀과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로 전달된 후 에피좀 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 이러한 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다.
본 개시내용의 조작된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 미세주입, 바이오리스틱, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 폴리양이온 또는 지질: 핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제-강화 흡수를 포함한다. 리포펙션 방법 및 리포펙션 시약은 당업계에 익히 공지되어 있다(예: Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024의 것들을 포함한다. 전달은 세포(생체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)으로 일 수 있다. 면역지질 복합체와 같은 표적화 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
본원에 기재된 항체를 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특정 세포로 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 트래피킹하기 위한 고도로 진화된 프로세스를 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나(생체내), 그들은 시험관내에서 세포를 치료하는 데 사용될 수 있으며, 변형된 세포는 환자에게 투여된다(생체외). 본 개시내용의 폴리펩티드의 전달을 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 현재 표적 세포 및 조직에서 가장 효율적이고 다양한 유전자 전달 방법이다. 숙주 게놈에의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하여 종종 삽입된 도입유전자의 장기간 발현을 초래한다. 또한, 높은 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
약제학적 조성물 중 활성 성분의 투여량 수준은 대상체에게 독성을 나타내지 않으면서 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 개시내용의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 화합물과 조합하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 익히 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. "유효량"은 단독으로 또는 추가 용량과 함께 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 상태의 치료의 경우에, 목적하는 반응은 바람직하게는 질환 경과의 억제와 관련된다. 이는 질환의 진행을 늦추는 것, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다.
비치료적 용도
가용성(sN4) 및 막관통 넥틴-4 이소형 둘 다 설치류 및 인간에서 기재되었다(참조: Reymond et al., J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001). 가용성 넥틴-4는 메탈로프로테이나제 ADAM17/TACE 가용성 N4(참조: Fabre-Lafay et al., J Biol Chem, 289(20):19543-19550, 2005) 및 ADAM10(참조: Buchanan et al. al., J Biol Chem, 292(15):6339-6351, 2017)에 의해 세포 표면에서 단백질 분해로 생성되며, 유방암, 난소암 및 폐암 환자의 혈청에서 검출될 수 있다(참조: Buchanan et al., Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007, Takano et al., Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009).
여러 임상 조사는 넥틴-4가 종양 바이오마커로서 작용할 수 있으며, 암 조직에서 이의 과발현은 환자의 암 진행 및 불량한 생존과 상당히 연관되어 있음을 나타냈다(참조: Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007, Siddharth et al., Int J Biochem Cell Biol, 102:151-160, 2018, Nishiwada et al., J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015, Zhang et al., Oncology Lett 18:1163-1170, 2019, Derycke et al., Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010, Deng et al., Cancer Cell Int, 19:106, 2019).
넥틴-4의 막성 및 가용성 형태 모두의 비정상적인 발현이 인간 유방암 조직 및 그들의 혈청에서 보고되었으며(참조: Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007), 넥틴-4는 유용한 조직학적 및 혈청학적 종양 관련 마커 및 유방암에 대한 예후 예측인자로서 제안되었다(참조: Fabre-Lafay et al., BMC Cancer, 7:73, 2007, M-Rabet et al., Annals of Oncology, 28(4):769-776, 2017, Siddharth et al., Int J Biochem Cell Biol, 102:151-160, 2018). 인간 췌장 암종에서, 넥틴-4의 과발현은 암 세포의 증식을 상당히 촉진하고, 종양내 혈관신생에 기여한다(참조: Nishiwada et al., J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015). 정상 위 조직과 비교하여 인간 위암 조직에서 더 높은 넥틴-4 발현이 발견되며, 넥틴-4의 발현 수준은 암 세포 분화, 림프절 전이, 진행된 TNM 단계 및 환자의 불량한 예후와 유의하게 관련이 있음이 입증되었다(참조: Zhang et al., Hum Pathol, 72:107-116, 2018). 넥틴-4는 또한 식도암과 결장직장암에서 과발현되는 것으로 보고되었다(참조: Deng et al., Cancer Cell Int, 19:106, 2019, Zhang et al., Oncology Lett 18:1163-1170, 2019).
넥틴-4의 검출은 종양 진행의 유용한 예후 예측인자일 수 있다. 이러한 방법은 대상체의 생물학적 샘플을 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편과 접촉시키는 단계 및 항체 넥틴-4의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. "생물학적 샘플"은 개체, 세포주, 조직 배양, 또는 넥틴-4를 잠재적으로 발현하는 세포의 기타 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 의도한다. 면역조직화학적 분석을 위한 조직 생검 및 인간 대상체의 혈청 또는 혈장에서 가용성 단백질의 검출을 위한 체액을 수득하기 위한 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다.
항-넥틴-4 항체 또는 항체 단편은 또한 넥틴-4 단백질을 검출하고/하거나 정량화하기 위한 진단 검정, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 넥틴-4 발현을 검출하는 데 유용하다. 항-넥틴-4 항체는, 예를 들어, 제공된 치료 및/또는 예방 섭생의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서, 예를 들어, 질환의 발달 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 진단 목적을 위해 검출 가능한 모이어티로 항체를 표지하는 것이 유리할 것이다. 방사성 동위 원소, 형광 표지, 효소 기질 표지 등을 포함하여 수많은 검출 가능한 표지가 이용 가능하다. 표지는 다양한 공지된 기술을 사용하여 항체와 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있으며, 상기 언급된 세 가지 광범위한 범주의 표지 중 임의의 것은 아비딘과 접합될 수 있으며, 그 반대도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접적 접합을 달성하기 위해, 항체는 작은 합텐(예: 디곡신)과 접합될 수 있으며, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체(예: 항-디곡신 항체)와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
예시적인 방사성 동위원소 표지는 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I를 포함한다. 항체는, 예를 들어, 문헌(참조: Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs.)에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 방사성은, 예를 들어, 섬광 계수에 의해 측정될 수 있다.
예시적인 형광 표지는 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트)로부터 유래된 표지를 포함하거나 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린, 및 텍사스 레드가 이용 가능하다. 형광 표지는, 예를 들어, 문헌(참조: Current Protocols in Immunology)에 개시된 것들과 같은 공지된 기술을 통해 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량화될 수 있다. 당업계에 공지된 잘 특성화된 다양한 효소-기질 표지가 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,275,149호). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 변경은 분광광도계적으로 측정될 수 있는 기질에서의 색상 변화일 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술이 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 이어서, 예를 들어, 화학광도계를 사용하여 측정될 수 있는 광을 방출하거나 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있다.
효소 표지의 예는 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(예: 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이딕 옥시다제(예: 유리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은, 예를 들어, 문헌[참조: O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어, 다음을 포함한다: 기질로서 수소 퍼옥시다제를 갖는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)(여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체, 예를 들어, 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB)를 산화시킨다); 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리성 포스파타제(AP); 및 발색 기질, 예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제를 갖는 β-D-갈락토시다제(β-D-Gal).
또 다른 구현예에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편은 표지되지 않고 사용되며, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 항체 단편에 결합하는 표지된 항체로 검출된다.
본원에 기재된 항체 및 이의 항체 단편은 임의의 공지된 검정 방법, 예를 들어, 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접적 샌드위치 검정 및 면역침전 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]을 참조한다.
확인된 모든 특허 및 간행물은, 예를 들어, 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 기재하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 참조로 명시적으로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용을 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떤 것도 발명자들이 사전 개시내용 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 관한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며 이러한 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 임의의 승인을 구성하지 않는다.
이미 나타내지 않은 범위 내에서, 본원에 기재되고 예시된 다양한 구현예 중 어느 하나가 본원에 개시된 임의의 다른 구현예에 제시된 특징을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 개시내용의 넓은 범위는 하기 실시예를 참조하여 가장 잘 이해되며, 이는 개시내용을 특정 구현예로 제한하려는 의도는 아니다. 본원에 기재된 특정 구현예는 단지 예로서 제공되며, 본 개시내용은 이러한 청구범위가 허여하는 등가물의 전체 범위와 함께 첨부된 청구범위의 조건에 의해 제한되어야 한다.
실시예
일반적인 방법
면역침전, 크로마토그래피 및 전기영동을 포함한 단백질 정제를 위한 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]을 참조한다. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산 및 단백질의 글리코실화가 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391]을 참조한다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생산, 정제 및 단편화가 기재되어 있다(참조: Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane, 상기).
항-넥틴-4 항체를 함유하는 하이브리도마 또는 세포 배양 상청액은 제조업체의 절차에 따라 HiTrap 단백질 G 컬럼(GE, 카탈로그 번호 17040401)을 통해 정제했다. 요약하면, 상청액을 5 CV의 경우 DPBS(Gibco, 카탈로그 번호 14190-136)로 평형화하고, 주위 온도 및 3분 체류 시간에서 주사기/주입 펌프(Legato 200, KDS)를 통해 로딩했다. 컬럼을 5 CV의 DPBS로 세척하고, 4 CV의 pH 2.8 용출 완충액(Fisher Scientific, 카탈로그 번호 PI21004)으로 용출을 수행했다. 용출액을 분획화하고, 분획을 1M Tris-HCL, pH 8.5(Fisher Scientific, 카탈로그 번호 50-843-270)로 중화시키고, A280(DropSense96, Trinean)으로 검정했다. 피크 분획을 풀링하고, 완충액을 DPBS로 교환했다. 원심 필터(EMD Millipore, 카탈로그 번호 UFC803024)를 DPBS에서 4,000 xg으로 2분 동안 평형화했다. 정제된 샘플을 로딩하고 DPBS를 첨가하고, 총 DPBS 용적이 ≥ 6 DV에 도달할 때까지 샘플을 5 내지 10분 동안 4,000 xg에서 회전시켰다. 최종 풀은 A280에 의해 분석하였다.
분자 생물학의 표준 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발(Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현(Vol. 3) 및 생물정보학(Vol. 4)을 기재하는 문헌[Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif. Standard methods also appear in Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.]을 참조한다.
인간 넥틴-4를 발현하는 안정한 세포주는 선택된 숙주 세포(즉, CHO-K1)를 전기천공 기반 형질감염을 사용하여 호모 사피엔스(Homo sapiens) 넥틴-4(NCBI 수탁 번호 NM_030916.2)를 발현하는 pcDNA3.1 기반 플라스미드로 형질감염시킴으로써 생성되었다. 제네티신은 통합 세포를 선택하는 데 사용되었다. 7 내지 10일의 제네티신 선택 후, 안정한 클론은 PE-접합된 항-넥틴-4 항체(R&D Systems, cat # FAB2659P)를 사용하여 FACS로 단리시켰다. 확장 후, 안정한 클론은 유세포 계측법에 의해 넥틴-4 발현에 대해 추가로 확인하였다.
하이브리도마 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 서열은 하기 기재된 바와 같이 결정되었다. 총 RNA는 Qiagen(Germantown, MD, USA)의 RNeasy Plus Mini Kit를 사용하여 1-2x106 하이브리도마 세포로부터 추출되었다. CDNA는 Takara(Mountainview, CA, USA)의 SMARTer RACE 5'/3' 키트를 사용하여 5' RACE 반응을 수행함으로써 생성되었다. PCR은 NEB(Ipswich, MA, USA)의 Q5 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하여 적합한 면역글로불린의 3' 마우스 불변 영역에 대한 유전자 특이적 프라이머와 함께 Takara Universal Primer Mix를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 증폭시켰다. 중쇄 및 경쇄에 대한 증폭된 가변 영역을 2% 아가로스 겔 상에서 실행하고, 적절한 밴드를 절제한 다음, Qiagen의 미니 용출 겔 추출 키트(Mini Elute Gel Extraction Kit)를 사용하여 겔 정제했다. 정제된 PCR 산물은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)의 제로 블런트 PCR 클로닝 키트(Zero Blunt PCR Cloning Kit)를 사용하여 클로닝하고, Takara의 Stellar 적격 이. 콜리(Stellar Competent E. Coli) 세포로 형질전환시키고, LB 한천 + 50 ug/ml 칸나마이신 플레이트에 플레이팅했다. 직접 콜로니 생거 서열분석은 GeneWiz(South Plainfield, NJ, USA)에 의해 수행되었다. 생성되는 뉴클레오티드 서열은 IMGT V-QUEST를 사용하여 분석하여 생산적인 재배열을 식별하고, 번역된 단백질 서열을 분석했다. CDR 결정은 카바트 넘버링에 기초하였다.
선택된 VH 또는 VL 쇄를 PCR 증폭시키고, 인간 IgG1(Uniprot P01857) 또는 인간 카파 경쇄(UniProt P01834)의 불변 영역을 포함하는 pcDNA3.4 기반 발현 벡터로 클로닝했다. 공급자의 Expi293 발현 시스템 프로토콜에 따라 쌍을 이룬 중쇄- 및 경쇄-발현 플라스미드를 Expi293 세포(Thermo Fisher Scientific)로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후 배양 상청액을 원심분리로 수집하였다. 키메라 항체는 단백질 A 컬럼 및 PBS pH 7.2로 교환된 완충액을 사용하여 1단계 친화도 정제로 정제했다.
형광 활성화 세포 분류 검출 시스템(FACS®)을 포함하는 유세포 계측법을 위한 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌(Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.)을 참조한다. 예를 들어, 진단 시약으로 사용하기 위한, 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩티드 및 항체를 포함하는 핵산을 변형시키기에 적합한 형광 시약이 이용 가능하다(참조: Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.).
리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌(Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York)을 참조한다. 특정 작용 메카니즘을 갖는 항체의 특성화에 적합한 항체 기능적 특성화의 표준 방법도 또한 당업자에게 익히 공지되어 있다.
본원에서 "양성 대조군 1"(PC1)로 지칭된, 완전 인간 항-넥틴-4 항체 엔포르투맙(AGS-22M6)에 기초한 인하우스 넥틴-4-특이적 항체는 WO 2012/047724에 공개된 공개적으로 이용 가능한 정보(VH, 서열번호 7; 및 VL, 서열번호 8)에 기초하여 제조하였다. PC1 항체를 사용하여 실시예에 사용된 형질감염체 및 종양 세포주에 의한 넥틴-4 발현을 확인하고 본원에 개시된 항-넥틴-4 특이적 항체를 평가하고 특성화하는 데 사용되는 결합 및 기능적 검정을 확립했다. 본원에서 "양성 대조군 2"(PC2)로 지칭된 두 번째 인하우스 넥틴-4 항체는 WO 2019/215728에 공개된 공개적으로 이용 가능한 정보(VH, 서열번호 37; 및 VL, 서열번호 38)에 기초하여 제조하였다. PC2 항체는 TIGIT와 넥틴-4 사이의 차단 상호작용의 검정에서 대조군으로 사용되었다.
예를 들어, 항원성 단편, 리더 서열, 단백질 접힘, 기능적 도메인, CDR 주석, 글리코실화 부위 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용 가능하다.
실시예 1: 항- 넥틴 -4 항체의 생성
마우스 항-넥틴-4 항체는 Balb/c 마우스를 재조합 인간 넥틴-4 단백질로 면역화함으로써 생성되었다.
면역화: Balb/c 마우스를 재조합 인간 넥틴-4 단백질로 복강내(IP) 및 피하(SC) 면역화하였다. 면역 반응은 후안와 출혈에 의해 모니터링하였다. 혈장은 ELISA, 유세포 계측법(FACS) 또는 이미징(아래 기재되는 바와 같음)으로 스크리닝하고, 항-넥틴-4 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용했다. 비장과 림프절을 희생시키고 제거하기 전에 마우스를 면역원으로 복강내 또는 정맥내 부스팅하였다.
항- 넥틴 -4 항체를 생산하는 마우스의 선택: 넥틴-4-에 결합된 항체를 생산하는 마우스를 선택하기 위해, 면역화된 마우스의 혈청을 넥틴-4를 발현하지 않는 부모 CHO 세포주에 대해서가 아니라 재조합 넥틴-4 단백질 또는 넥틴-4를 발현하는 세포주(CHO-넥틴-4) 또는 넥틴-4를 발현하는 내인성 세포주(T-47D, ATCC에서 구입)에 대한 결합에 대해 ELISA, FACS 또는 이미징으로 스크리닝하였다. ELISA의 경우, 간단히 말해서, 재조합 인간 넥틴-4로 코팅된 ELISA 플레이트를 면역화된 마우스의 혈청 희석액과 실온에서 1시간 동안 배양하고, 검정 플레이트를 세척하고, HRP 표지된 항-마우스 IgG 항체로 특이적 항체 결합을 검출시켰다. ELISA 판독기(Biotek)를 사용하여 플레이트를 판독했다. FACS의 경우, 간단히 말해서, CHO-넥틴-4 세포 또는 부모 CHO 세포 또는 넥틴-4를 발현하는 내인성 세포(T-47D)를 면역화된 마우스의 혈청 희석액과 함께 배양했다. 세포를 세척하고, 특이적 항체 결합은 Alexa 647 표지된 염소 항 마우스 IgG 항체(Invitrogen, 카탈로그 번호: A21235, 로트 번호: 2161043)로 검출시켰다. 유세포 계측 기기(Intellicyte, IQue plus, Sartorius)에서 유세포 계측 분석을 수행했다. 또한, 마우스 혈청은 이미징으로 시험했다. 간략하게, CHO-넥틴-4 또는 T-47D 세포를 면역화된 마우스의 혈청 희석액과 함께 배양했다. 세포를 세척하고, 파라포름알데히드로 고정시키고, 세척하고, 2차 Alexa488 염소 항-마우스 항체 및 Hoechst(Invitrogen)로 특이적 항체 결합을 검출시켰다. 플레이트를 스캐닝하고, 이미징 기계(Cytation 5, Biotek)에서 분석했다. 하이브리도마 상청액을 상기 기재된 바와 같이 ELISA, 이미징 및 FACS에 의해 넥틴-4 특이적 결합에 대해 시험하였다.
넥틴 -4에 대한 mAb를 생산하는 하이브리도마의 생성: 본 개시내용의 마우스 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 비장세포 및 림프절 세포를 면역화된 마우스로부터 단리시키고 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합시켰다. 생성되는 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝하였다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포, 림프절 세포의 단일 세포 현탁액을 동일한 수의 Sp2/0 비분비 마우스 IgG 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 전기융합으로 융합시켰다. 세포를 평저 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅한 후, 선택 배지(HAT 배지)에서 2주 배양한 다음, 하이브리도마 배양 배지로 전환시켰다. 세포 플레이팅 약 10 내지 14일 후, 개별 웰로부터의 상청액을 상기 기재된 바와 같이 ELISA, 이미징 또는 FACS로 스크리닝하였다. 항체 분비 하이브리도마를 24-웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 여전히 항-넥틴-4에 대해 양성인 경우, 양성 하이브리도마를 단일 세포 분류기를 사용하여 분류하여 서브클로닝하였다. 그런 다음, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 정제 및 특성화에 사용될 소량의 항체를 생성했다.
실시예 2: 항 - 넥틴 -4-특이적 항체의 결합
개시된 항-넥틴-4 항체의 결합 특이성은 ELISA로 평가하였다. 간략하게, 인간 재조합 넥틴-4 단백질을 ELISA 플레이트에 직접 코팅하였다. 그런 다음, 정제된 항체를 플레이트에 첨가한 다음, 염소-항-마우스 IgG-HRP로 검출시켰다. ABTS 기질을 첨가한 후, ELISA 플레이트 판독기(Bioteck)를 사용하여 ELISA 플레이트를 판독하였다. 도 2에 도시된 대조군: PC1은 참조 항체(넥틴-4 특이적 재조합 항체인 것으로 공지되어 있으며, Novarock Biotherapeutics에서 제조됨, 로트 번호: 03042020KD)를 지칭하고; 음성 대조군은 인간 IgG1(Dendritics, 카탈로그 번호: DDXCH01P-100, 로트 번호: DDXCH01-028)이다.
도 2는 개시된 8개의 넥틴-4-특이적 항체의 결합 활성을 나타낸다. N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8은 용량 의존적 방식으로 인간 넥틴-4 단백질에 결합한다. 추가로, 양성 대조군은 또한 용량 의존적 방식으로 인간 넥틴-4 단백질에 결합한다. 인간 IgG1은 인간 넥틴-4 단백질에 결합하지 않는다.
8개의 항-넥틴-4 항체, N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8 및 양성 대조군 항체의 ELISA 결합 EC50 값은 하기 표 3에 열거되었다.
[표 3]
Figure pct00003
도 2 및 표 3의 결과는 항-인간 넥틴-4-특이적 항체가 ELISA에 의해 낮은 EC50 값으로 인간 넥틴-4에 결합함을 특징으로 한다는 것을 나타낸다.
개시된 항-넥틴-4 항체의 결합 특이성을 또한 FACS로 평가하였다. 간략하게, CHO-넥틴-4 세포(대 부모 CHO 세포) 또는 넥틴-4를 발현하는 내인성 세포주(T-47D)를 정제된 재조합 항체의 희석액과 함께 배양하였다. 세포를 세척하고, Alexa 647 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체로 특이적 항체 결합을 검출하였다. 유세포 계측 기기(Intellicyte, IQue plus, Sartorius)에서 유세포 계측 분석을 수행했다.
도 3a 및 3b는 개시된 넥틴-4-특이적 항체의 결합 활성을 나타낸다. 도 3a는 항-넥틴-4 항체, N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8이 용량 의존적 방식으로 인간 CHO-넥틴-4 세포에 결합하고; 양성 대조군은 또한 용량 의존적 방식으로 CHO-넥틴-4 세포에 결합함을 보여준다. 음성 대조군 인간 IgG1은 CHO-넥틴-4-세포에 결합하지 않는다. 도 3b는 항-넥틴-4 항체, N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8 이 용량 의존적 방식으로 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 세포주 SKBR3에 결합함을 보여준다. 양성 대조군은 또한 용량 의존적 방식으로 SKBR3 세포에 결합한다.
표 4는 개시된 8개의 넥틴-4 항체의 결합 EC50 값을 나타낸다. N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8 항체는 FACS에 의해 CHO-넥틴-4 세포 및 SKBR3 세포에 결합한다.
[표 4]
Figure pct00004
도 3a 및 3b 및 표 4로부터의 결과는 항-인간 넥틴-4-특이적 항체가 FACS에 의해 낮은 EC50 값으로 CHO-넥틴-4 세포 및 SKBR3 세포에 결합함을 나타낸다.
재조합 인간 넥틴-4에 대한 개시된 항-넥틴-4-특이적 항체의 결합 동역학은 BIAcore 3000 시스템을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정되었다. 간략하게, CM5 칩은 유동 세포 4의 적용 마법사에 따라 항-인간 IgG 항체(GE, 카탈로그 번호 BR-1000-12, 로트 10283568)와 아민 커플링 화학을 통해 고정시켰다. 유동 세포 3은 체계적인 기기 소음 및 드리프트를 감산하기 위한 참조 세포로서 작용하도록 변형되지 않고 잔류되었다. 이중 블랭크(Fc3 및 블랭크 분석물 완충액)로 Fc4-3 검출을 실행한다. 항체 샘플을 HBS-EP에서 1ug/mL로 희석하고 1분 동안 10ul/분의 유속으로 주입하였다. 분석물 재조합 인간 넥틴4-His 단백질은 10 내지 0.156nM로 희석시키고(1:4 희석, HBS-EP 완충액에서 5포인트에서 0nM까지), 2분 동안 50uL/분으로 주입한 다음, 6분 동안 해리시켰다. 모든 분석은 배경을 줄이기 위해 이중 블랭크, Fc3 및 블랭크 분석물 완충액으로 수행하였다. BIAevaluation 소프트웨어(버전 4.1.1)를 사용하여 겉보기 결합 동역학을 결정하기 위해 글로벌 적합성을 갖는 질량 전달 모델과 1:1 결합으로 데이터를 분석했다.
개시된 항-넥틴-4 항체에 대한 결합 KD 값은 표 5에 제공된다. 결과는 항-넥틴-4-특이적 항체가 1.72E-08 내지 3.75E-10M 범위의 KD 값으로 인간 재조합 넥틴-4에 결합한다는 것을 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00005
실시예 3: 넥틴 -4 발현 세포에 대한 넥틴 -1 결합의 차단
넥틴-4 발현 세포(인간 넥틴-4로 형질감염된 CHO 세포)에 대한 넥틴-1 결합을 차단하는 개시된 넥틴-4-특이적 항체의 능력을 FACS에 의해 결정하였다. 간략하게, CHO-넥틴-4 세포를 개시된 넥틴-4 정제된 재조합 항체의 희석액과 함께 배양하였다. 그런 다음, His 태그를 갖는 비오티닐화된 인간 넥틴-1(ACROBiosystems, 카탈로그 번호: PV1-H5223, 로트: 733-38GS1-47, 0.75ug/ml)을 플레이트에 첨가하였다. 30분 배양 후, 세포를 세척한 다음, 스트렙타비딘 Alexa 647(1:1000)을 샘플에 첨가했다. 30분 배양 후, 샘플을 유세포 계측 기기(Intellicyte, IQue plus, Sartorius)에서 넥틴-1 차단 활성에 대해 분석했다. 이 차단 검정에 사용된 양성 대조군 항체는 참조 항체(재조합 넥틴-4 특이적 항체인 것으로 공지됨, Novarock Biotherapeutics에 의해 제조됨, 로트: 03042020KD)이다.
표 6의 데이터는 개시된 항-넥틴-4 항체(N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8)가 낮은 EC50 값(0.12-130nM)으로 넥틴-4-CHO 세포에 대한 인간 넥틴-1 결합을 차단한다는 것을 보여준다. 양성 대조군은 또한 CHO-넥틴-4 세포에 대한 인간 넥틴-1 결합을 차단하였다(EC50 0.16nM).
[표 6]
Figure pct00006
실시예 4: 넥틴 -4 발현 세포에 대한 TIGIT 결합의 차단
CHO-넥틴-4 세포에 대한 TIGIT 결합을 차단하는 개시된 넥틴-4-특이적 항체의 능력을 FACS로 평가하였다. 간략하게, CHO-넥틴-4 세포를 개시된 정제된 재조합 항체의 희석액과 함께 배양하였다. 이어서, 비오티닐화된 인간 TIGIT 단백질(SinoBiologic, 카탈로그: 10917-H08H-B, 로트: LC13AP0902)을 플레이트에 첨가하였다. 30분 배양 후, 세포를 세척한 다음, 스트렙타비딘 Alexa 647(1:1000)을 샘플에 첨가했다. 30분 배양 후, 샘플을 유세포 계측 기기(Intellicyte, IQue plus, Sartorius)에서 TIGIT 차단 활성에 대해 분석했다. 이 차단 검정에 사용된 양성 대조군 항체는 공지된 차단 활성을 갖는 넥틴-4 항체인 PC2이다.
표 7의 데이터는 개시된 항-넥틴-4 항체(N4_mAb 1 내지 N4_mAb 8)가 CHO-넥틴-4 세포(0.13-3.11nM 범위의 EC50)에 대한 인간 TIGIT 결합을 차단하였음을 보여준다. 양성 대조군은 또한 CHO-넥틴-4 세포에 대한 인간 TIGIT 결합을 차단하였다(EC50 0.85nM).
[표 7]
Figure pct00007
실시예 5: 넥틴 계열 단백질에 대한 항체 결합 특이성
개시된 항-넥틴-4 항체(N4-mAb 1 내지 N4-mAb 8)를 ELISA 또는 Gator 결합 검정에 의해 인간 넥틴 계열 단백질, 즉 넥틴-1(ACROBiosystems, 카탈로그 번호: PV1-H5223, 로트 번호: 733-38GS1-47), 넥틴 2(ACROBiosystems, 카탈로그 번호: PV2-H52E2, 로트 번호: 1982-61MS1-FD) 및 넥틴 3(ACROBiosystems, 카탈로그 번호: PV3-H52E4, 로트 번호: 1984-61MS1-AC)에 대한 결합에 대해 시험하였다. 넥틴-4 항체 중 어느 것도 넥틴-1, 넥틴-2 또는 넥틴-3에 결합하지 않는다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 6: 넥틴 -4 항체 결합 도메인 결정
인간 넥틴-4(서열번호 61)의 세포외 부분은 3개의 도메인을 갖는다: 하나의 Ig-유사 V형 도메인(아미노산 32 내지 144) 및 2개의 Ig-유사 C형 도메인(각각 아미노산 148 내지 237, 및 248 내지 331). 넥틴-4 항체의 결합 도메인을 결정하기 위해, 3개의 pcDNA3.1 기반 발현 플라스미드를 제조했다: 하나는 전장 인간 넥틴-4를 인코딩하고, 하나는 아미노산 148 내지 331에 결실을 갖는 변이체를 인코딩하고(ΔC 도메인), 하나는 아미노산 32 내지 147에 결실을 갖는 변이체를 발현한다(ΔV 도메인). 플라스미드는 TransIT-293 형질감염 시약(Mirus Bio)을 사용하여 인간 293T 세포(ATCC)로 형질감염시켰고, 일시적으로 발현된 넥틴-4 변이체에 대한 개시된 항체의 결합 친화도는 유세포 계측법에 의해 측정하였다.
표 8은 항체의 결합 강도를 보여준다: "+++"는 5nM 미만의 EC50을 나타내고, "-"는 EC50이 최고 시험된 항체 농도(133nM) 이상임을 나타낸다. N4_mAb 4를 제외한 모든 항체는 전장 인간 넥틴-4에 대한 결합과 유사한 친화도로 Ig-유사 C형 도메인이 결여된 변이체에 결합한다. 그러나, 이들 항체는 Ig-유사 V형 도메인이 결여된 변이체에 대한 결합을 손실하고, 이는 각각의 결합 에피토프가 Ig-유사 V 도메인 내에 있음을 시사한다. N4_mAb 4는 Ig-유사 C형 도메인(아미노산 148-331) 내의 결합 에피토프로 독특하다.
[표 8]
Figure pct00008
실시예 7: 교차-종 넥틴 -4 결합
시노몰구스 원숭이(서열번호 62), 래트(서열번호 63) 또는 마우스(서열번호 64)로부터의 넥틴-4 단백질을 인코딩하는 CDNA를 pcDNA3.1 기반 포유류 발현 플라스미드로 개별적으로 클로닝하였다. 각각의 플라스미드를 실시예 6에 기재된 유사한 방식으로 인간 293T 세포로 형질감염시켰다. 293T 세포 표면 상에서 일시적으로 발현된 종-특이적 넥틴-4에 대한 개시된 인간 넥틴-4 항체의 결합 EC50은 유세포 계측법으로 측정하였다.
결합 강도는 표 9에 보고되어 있고, 4개의 범주로 그룹화되며, 5nM 미만의 EC50 값을 갖는 가장 강한 결합은 "+++"로 정의되고, 5nM 내지 25nM의 결합 EC50 값은 "++"로 정의되고, 25nM 내지 133nM의 결합 EC50 값은 "+"로 표시되고, 약 133nM의 결합 EC50은 "-"로 표시되었다. 모든 항체는 시노몰구스 원숭이의 넥틴-4에 결합하고, 설치류 종의 넥틴-4에 대한 다양한 친화도를 나타낸다.
[표 9]
Figure pct00009
실시예 8: 항- 넥틴 -4-매개 세포독성
넥틴-4 양성 세포에 결합된 개시된 넥틴4-특이적 항체의 세포내이입은 항-인간 IgG Fc-MMAF 항체와 함께 표적 결합된 항체의 공동-내재화를 사용한 세포독성- 기반 세포내이입 검정에 의해 측정되었다
CHO-넥틴4 및 SKBR3 세포주를 성장 배지(각각 F12K + 10% FBS 및 맥코이(McCoy)의 5a 배지 + 10% FBS)에서 배양하였다. 세포를 수확하고, 각각의 성장 배지에 재현탁시키고 검정 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 밤새 배양하였다. 항-넥틴4 항체를 MMAF-접합된 Fab 항-hFc 단편(Moradec, Cat# AH-202AF-50)과 함께 30분 동안 배양한 다음, 세포 플레이트에 첨가하고 추가로 96시간 동안 배양하였다. 세포 역가 글로(Promega, Cat# G7570)를 첨가하여 각 웰에서 세포 생존력을 평가했다. 신호는 Neo2 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 정량화하였다.
표 10 및 도 4a에서 입증된 바와 같이, 항-넥틴-4 항체의 리드 패널은 0.21 내지 0.63nM 범위의 EC50 값으로 CHO-넥틴-4 세포에서 세포내이입 유래 세포 독성을 유도하였다. 유사하게, 표 10 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 항-넥틴-4 항체의 패널은 0.61 내지 2.14nM 범위의 EC50 값으로 SKBR3 세포에서 세포내이입 유래 세포독성을 유도하였다.
리드 패널 항체는 또한 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 유방 종양 세포주 T47D에서 세포내이입-유래 세포 세포독성을 나타내었다(데이터는 제시되지 않음).
[표 10]
Figure pct00010
실시예 9: 항체 내재화의 동역학 및 넥틴-4 단백질 수준
선택된 항-넥틴-4 항체의 내재화의 동역학 및 넥틴-4 단백질 수준은 T47D 세포에서 측정하였다. 간략하게, 표시된 항체는 표지 키트(Thermo Fisher, cat# A20181)를 사용하여 Alexa Flour 488에 의해 표지되었다. 표지된 항체를 0, 1, 4 및 24시간 동안 37℃에서 T47D 세포와 함께 배양하였다. 각 시점에서, 세포를 4℃로 옮기고, 막 넥틴-4 단백질에 대한 결합을 위해 표지되지 않은 항체를 첨가했다. 그런 다음, 세포를 고정시키고, Alexa Flour 647-표지된 2차 항체를 첨가했다. 그런 다음, 플레이트를 두 염료(녹색 및 적색)에 대해 Cytation 5(BioTek)로 이미지화했다.
도 5a는 선택된 항-넥틴-4 항체의 내재화 동역학을 보여준다. 4개 항체 모두 0시간에서 24시간까지 시간 의존적 내재화를 나타냈다. 동일한 시점에서 막 넥틴-4의 수준을 정량화하고 결과를 도 5b에 나타낸다. 항체 중, N4_mAb 2는 더 빠른 내재화를 나타내었지만 막 넥틴-4 고갈도 유발했다. 다른 3개의 항체는 세포 표면 넥틴-4 단백질 수준에 유의한 영향을 나타내지 않았다.
실시예 10: 넥틴 -4를 내생적으로 발현하는 종양 세포에서 항체 의존적 세포 세포독성( ADCC )
항-넥틴-4 항체의 ADCC 활성은 생물발광 검정으로 측정하였다. 간략하게, 항-넥틴-4 항체를 RPMI+ 4% 낮은 IgG FBS를 함유하는 검정 완충액에서 연속 희석하고, 개별 표적 세포주(T47D 또는 SKBR3) 및 ADCC 이펙터 세포의 혼합물에 첨가하였다. ADCC 이펙터 세포는 결합된 넥틴-4 항체의 Fc 부분의 인식시 활성화된 CD16a를 발현하는 Jurkat 세포이다. 이펙터 세포의 활성화는 제조업자의 지시(Promega, cat# E6130)에 따라 Promega 생물발광 검정을 사용하여 검출하였다.
도 6a에 도시된 바와 같이, ADCC 활성은 T47D 세포 상에서 N4_mAb 4에 대해서만 관찰되었다. PC1을 포함한 다른 항체 중 어느 것도 ADCC 활성을 나타내지 않았다. SKBR3 세포 상에서, N4_mAb 4는 또한 강한 ADCC 활성을 나타낸 반면, N4 mAb 2는 매우 경미한 활성을 나타냈으며, 다른 모든 항체는 ADCC 활성을 나타내지 않았다(도 6b).
달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 특성, 예를 들어, 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해 되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치적 매개변수는 본 개시내용에 의해 수득하고자 하는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 등가 원칙의 적용을 청구범위의 범위로 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치적 매개변수는 적어도 보고된 유효 숫자의 수에 비추어 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 개시내용의 광범위한 범위를 설명하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오류를 본질적으로 함유한다.
본 개시내용을 기재하는 맥락에서(특히 다음 청구범위의 맥락에서) 사용되는 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 지시대상은 본원에서 달리 명시되지 않았거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 기능하도록 의도된다. 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 각 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어(예: "~와 같은")의 사용은 단지 개시내용을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구된 개시내용의 범위에 대한 제한을 부과하지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 본 개시내용의 실행에 필수적인 임의의 비청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 개시내용의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 발견된 다른 요소와 임의의 조합으로 지칭되고 청구될 수 있다. 편의상 및/또는 특허성 때문에 그룹의 하나 이상의 구성원이 그룹에 포함되거나 그룹에서 결실될 수 있을 것으로 예상된다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생하면, 명세서는 변형된 그룹을 함유하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠시(Markush) 그룹의 서면 설명을 충족한다.
본 개시내용을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최선의 방식을 포함하여, 본 개시내용의 특정 구현예가 본원에 기재되어 있다. 물론, 이러한 기재된 구현예에 대한 변형은 상기한 설명의 판독시 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자는 숙련가가 이러한 변형을 적절하게 사용할 것으로 기대하고, 본 발명자는 본 개시내용이 본원에 구체적으로 기재된 것과는 다르게 실시되기를 의도한다. 따라서, 이 개시내용은 이용 가능한 법률이 허용하는 바에 따라 여기에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 이의 모든 가능한 변형에서 상기한 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 나타내지 않거나 달리 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 본 개시내용에 포함된다.
본원에 개시된 특정 구현예는 "~로 이루어진" 또는 "본질적으로 ~로 이루어진" 언어를 사용하는 청구범위에서 추가로 제한될 수 있다. 보정에 따라 출원되거나 추가되었는지 여부에 관계없이 청구범위에 사용될 때, 전환 용어 "~로 이루어진"은 청구범위에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 전환 용어 "본질적으로 로ㄹh이루어진"은 청구범위의 범위를 명시된 물질 또는 단계와 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 그렇게 청구된 본 개시내용의 구현예들은 본원에서 본질적으로 또는 명시적으로 기재되고 가능해진다.
본원에 개시된 개시내용의 구현예는 본 개시내용의 원리를 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 따라서, 제한이 아니라 예로서, 본원의 교시에 따라 본 개시내용의 대안적인 구성이 이용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 정확히 도시되고 기재된 것으로 제한되지 않는다.
본 개시내용은 다양한 특정 물질, 절차 및 실시예를 참조하여 본원에 기재되고 예시되었지만, 본 개시내용은 그 목적을 위해 선택된 물질 및 절차의 특정 조합으로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 세부사항의 다양한 변형이 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이 암시될 수 있다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되며, 본 개시내용의 진정한 범위 및 사상은 다음 청구범위에 의해 나타내어지는 것으로 의도된다. 본 출원에서 언급된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NovaRock Biotherapeutics, Ltd. <120> NECTIN-4 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 122863-5003-WO <150> 63/074,864 <151> 2020-09-04 <150> 63/166,622 <151> 2021-03-26 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 1_VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 1_VL <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr 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Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 7_VH <400> 54 Gly Val Tyr Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 7_VL <400> 55 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 7_VL <400> 56 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 8_VH <400> 57 Ser Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 8_VH <400> 58 Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 8_VH <400> 59 Gly Ile Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence_N4_mAb 8_VL <400> 60 His Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 61 <211> 510 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Phe 195 200 205 His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val 210 215 220 Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile Leu 225 230 235 240 His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln 245 250 255 Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu Ser 260 265 270 Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro 275 280 285 Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro 290 295 300 Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu 305 310 315 320 Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro Gln 325 330 335 Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val 340 345 350 Val Gly Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val 355 360 365 Val Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln 370 375 380 Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg 385 390 395 400 Leu His Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val 405 410 415 Gly Leu Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu 435 440 445 Thr Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Ser Gly Arg Ala Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln 465 470 475 480 Ala Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro 485 490 495 Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val 500 505 510 <210> 62 <211> 510 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 62 Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Cys Pro Ala Gly 20 25 30 Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala 35 40 45 Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly Gln 50 55 60 Val Ala Trp Ala Arg Ala Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala 65 70 75 80 Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu Gly 85 90 95 Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser Val 100 105 110 Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg 115 120 125 Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu Arg 130 135 140 Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Glu 145 150 155 160 Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser 165 170 175 Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr Ser 180 185 190 Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe 195 200 205 His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val 210 215 220 Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile Leu 225 230 235 240 His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln 245 250 255 Asn Leu Trp His Val Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu Ser 260 265 270 Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro 275 280 285 Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro 290 295 300 Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu 305 310 315 320 Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro Gln 325 330 335 Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val 340 345 350 Val Gly Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val 355 360 365 Val Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln 370 375 380 Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg 385 390 395 400 Leu His Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val 405 410 415 Gly Leu Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu 435 440 445 Thr Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Ser Gly Arg Thr Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln 465 470 475 480 Ala Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro 485 490 495 Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val 500 505 510 <210> 63 <211> 508 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 63 Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Tyr Ser Ala Gly Glu 20 25 30 Leu Glu Thr Ser Asp Leu Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala Lys 35 40 45 Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Pro Asp Glu Gln Val Gly Gln Val 50 55 60 Ala Trp Ala Arg Val Asp Pro Asn Glu Gly Thr Arg Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu Asp Arg 85 90 95 Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ile Leu 100 105 110 Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg Val 115 120 125 Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Met Arg Leu Arg Val 130 135 140 Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Pro Leu Glu Glu 145 150 155 160 Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser Pro 165 170 175 Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Gln Ser Ser 180 185 190 Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe His 195 200 205 Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val Val 210 215 220 Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Thr Leu Gln 225 230 235 240 Val Ala Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln Asn 245 250 255 Leu Trp His Val Gly Arg Glu Gly Ala Thr Leu Lys Cys Leu Ser Glu 260 265 270 Gly Gln Pro Pro Pro Lys Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro Leu 275 280 285 Pro Ser Gly Val Arg Val Lys Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro Leu 290 295 300 Thr Thr Glu His Ser Gly Val Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu Leu 305 310 315 320 Ser Ser Arg Ala Ser Gln Val Thr Val Glu Val Leu Asp Pro Glu Asp 325 330 335 Pro Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val Val Gly 340 345 350 Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Leu 355 360 365 Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln Lys Tyr 370 375 380 Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg Leu His 385 390 395 400 Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val Gly Leu 405 410 415 Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Thr 435 440 445 Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly Ser Gly 450 455 460 Arg Thr Glu Glu Glu Asp Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln Ala Met 465 470 475 480 Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro Thr Gly 485 490 495 Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val 500 505 <210> 64 <211> 508 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 64 Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu 1 5 10 15 Arg Leu Leu Phe Leu Ala Ser Phe Thr Gly Gln Tyr Ser Ala Gly Glu 20 25 30 Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala Lys 35 40 45 Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Pro Asp Glu Gln Val Gly Gln Val 50 55 60 Ala Trp Ala Arg Val Asp Pro Asn Glu Gly Ile Arg Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Asn Pro Ala Tyr Glu Asp Arg 85 90 95 Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asp Pro Leu Asp Gly Ser Val Leu 100 105 110 Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg Val 115 120 125 Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Met Arg Leu Arg Val 130 135 140 Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Pro Leu Glu Glu 145 150 155 160 Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser Pro 165 170 175 Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Gln Ser Ser 180 185 190 Arg Ser Phe Thr His Pro Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe His 195 200 205 Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val Val 210 215 220 Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Arg Arg Ile Thr His Thr Leu Gln 225 230 235 240 Val Ala Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln Asn 245 250 255 Leu Trp Gln Val Gly Arg Glu Gly Ala Thr Leu Lys Cys Leu Ser Glu 260 265 270 Gly Gln Pro Pro Pro Lys Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro Leu 275 280 285 Pro Ser Gly Val Arg Val Lys Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro Leu 290 295 300 Thr Thr Glu His Ser Gly Val Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu Leu 305 310 315 320 Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Glu Val Leu Asp Pro Glu Asp 325 330 335 Pro Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Ile Ile Val Gly 340 345 350 Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Leu 355 360 365 Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln Lys Tyr 370 375 380 Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg Leu His 385 390 395 400 Ser His His Ser Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val Gly Leu 405 410 415 Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Thr 435 440 445 Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly Ser Gly 450 455 460 Arg Thr Glu Glu Asp Asp Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln Ala Met 465 470 475 480 Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro Thr Gly 485 490 495 Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val 500 505 <210> 65 <211> 517 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Val His Ser Gln Val 20 25 30 Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val 35 40 45 Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Ser Val Lys Ile Thr Gln 50 55 60 Val Thr Trp Gln Lys Ser Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala Ile 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Ser Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg 85 90 95 Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser 100 105 110 Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe Ala Thr 115 120 125 Phe Pro Thr Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala 130 135 140 Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys 145 150 155 160 Lys Gly Gln Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn 165 170 175 Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu 180 185 190 Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile 195 200 205 Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu 210 215 220 Ala Cys Ile Val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr 225 230 235 240 Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly 245 250 255 Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp 260 265 270 Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser 275 280 285 Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly 290 295 300 Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn 305 310 315 320 Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe 325 330 335 Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val 340 345 350 Pro Thr Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu 355 360 365 Ile Val Val Gly Gly Ile Val Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr 370 375 380 Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Thr Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr 385 390 395 400 Ser Lys Ala Gly Ile Pro Gln His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu 405 410 415 Gln Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly 420 425 430 Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Glu Arg Lys Val Gly Gly Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala 450 455 460 Lys Arg Pro Tyr Phe Thr Val Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly 465 470 475 480 Tyr Gly Asp Arg Thr Leu Gly Tyr Gln Tyr Asp Pro Glu Gln Leu Asp 485 490 495 Leu Ala Glu Asn Met Val Ser Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys 500 505 510 Lys Glu Trp Tyr Val 515

Claims (21)

  1. 가변 중쇄(VH) 영역 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항-넥틴-4 항체(anti-Nectin-4 antibody)로서, 상기 VH 영역 및 VL 영역이 다음으로부터 선택된 CDR의 세트를 포함하는, 항-넥틴-4- 항체:
    (a) VH: CDR1: 서열번호 17, CDR2: 서열번호 18, CDR3: 서열번호 19;
    VL: CDR1: 서열번호 20, CDR2: 서열번호 21, CDR3: 서열번호 22;
    (b) VH: CDR1: 서열번호 23, CDR2: 서열번호 24, CDR3: 서열번호 25;
    VL: CDR1: 서열번호 26, CDR2: 서열번호 27, CDR3: 서열번호 28;
    (c) VH: CDR1: 서열번호 29, CDR2: 서열번호 30, CDR3: 서열번호 31;
    VL: CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, CDR3: 서열번호 34;
    (d) VH: CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, CDR3: 서열번호 37;
    VL: CDR1: 서열번호 38, CDR2: 서열번호 39, CDR3: 서열번호 40;
    (e) VH: CDR1: 서열번호 41, CDR2: 서열번호 42, CDR3: 서열번호 43;
    VL: CDR1: 서열번호 44, CDR2: 서열번호 45, CDR3: 서열번호 46;
    (f) VH: CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 48, CDR3: 서열번호 49;
    VL: CDR1: 서열번호 50, CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 52;
    (g) VH: CDR1: 서열번호 47, CDR2: 서열번호 53, CDR3: 서열번호 54;
    VL: CDR1: 서열번호 55, CDR2: 서열번호 56, CDR3: 서열번호 52; 또는
    (h) VH: CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, CDR3: 서열번호 59;
    VL: CDR1: 서열번호 50 CDR2: 서열번호 51, CDR3: 서열번호 60.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는, 항-넥틴-4 항체:
    (a) 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열번호 5에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 6에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
    (d) 서열번호 7에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열번호 9에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
    (f) 서열번호 11에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
    (g) 서열번호 13에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
    (h) 서열번호 15에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 뮤린 항체(murine antibody)인, 항-넥틴-4 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체인, 항-넥틴-4 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체인, 항-넥틴-4 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 세포독성제(cytotoxic agent)에 접합되는, 항-넥틴-4 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체가 전장 항체(full-length antibody)인, 항-넥틴-4 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인, 항-넥틴-4 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 단일 쇄 항체, 미니바디(minibody) 및 디아바디(diabody)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항-넥틴-4 항체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 넥틴-4에 결합하는, 항-넥틴-4 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 넥틴-1에 대한 넥틴-4의 결합을 억제함으로써 면역계를 조절하는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, TIGIT에 대한 넥틴-4의 결합을 억제함으로써 면역계를 조절하는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  15. 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제11항에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 대상체에서 암을 진단하는 방법으로서, 상기 방법이 생물학적 샘플을 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-넥틴-4 항체를 인코딩(encoding)하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 서열번호 1 내지 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector).
  20. 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 제19항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제1항에 따른 항-넥틴-4 항체를 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 제20항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
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