KR20240055852A - D3-결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

D3-결합 분자 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240055852A
KR20240055852A KR1020247012198A KR20247012198A KR20240055852A KR 20240055852 A KR20240055852 A KR 20240055852A KR 1020247012198 A KR1020247012198 A KR 1020247012198A KR 20247012198 A KR20247012198 A KR 20247012198A KR 20240055852 A KR20240055852 A KR 20240055852A
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윤잉 천
용칭 청
시아 왕
지지에 구
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우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드
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Abstract

본 개시내용에는 항-D3 항체를 비롯한 D3-결합 분자 및 이의 용도가 제공된다.

Description

D3-결합 분자 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 국제 특허 출원 제PCT/CN2021/119011호(출원일: 2021년 9월 17일)의 우선권 이익을 주장하며, 상기 기초출원의 개시내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록
본 출원은 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조에 의해 포함한다.
기술분야
본 출원은 일반적으로 델타 유사 표준 노치 리간드 3(Delta Like Canonical Notch Ligand 3)(D3)-결합 분자, 예컨대, 항-D3 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
델타 유사 표준 노치 리간드 3(D3 또는 DLL3)은 노치 리간드의 DSL 패밀리에 속하는 타입 I 막관통 단백질이다. 이는 일반적으로 세포내막, 특히 골지체에서만 독점적으로 발현된다. 추가 노치 패밀리 리간드는 델타 유사 표준 노치 리간드 1(D1), 델타 유사 표준 노치 리간드 4(D4), 재그드 표준 노치 리간드 1(Jagged Canonical Notch Ligand)(J1) 및 재그드 표준 노치 리간드 2(J2)를 포함한다. D3를 제외하고, 다른 리간드는 노치 신호전달을 활성화할 수 있다. D3는 노치와 이의 리간드 사이의 결합을 방해함으로써 노치 신 전달의 저해제로서 작용한다. D3는 소세포폐암(SCLC) 및 대세포 신경내분비 암종(LCNEC)을 포함한 폐 종양 세포 표면에서 고도로 발현된다. D3는 일반적으로 세포내막에서만 발현되지만, D3는 SCLC 및 LCNEC를 포함하여 D3를 발현하는 임의의 종양에 대한 잠재적인 치료 종양 표적이다.
폐암은 암 사망의 가장 흔한 원인이며, 전 세계적으로 매년 약 200만 명이 폐암 진단으로 진단되고; 전체 폐암 사례의 약 15%가 SCLC으로, 이는 수술, 화학요법 및 방사선 요법 등 치료 옵션이 매우 제한된 가장 공격적인 형태의 폐암이다. 2019년에, FDA는 SCLC의 1차 치료를 위해 아테졸리주맙(항-PD-L1)을 승인하였으며, 제한된 2개월 혜택으로 인해 추가 치료법 개발의 필요성이 강조되었다.
예컨대, 항체 접합체, 예컨대, ADC로서 또는 이중특이적 항체로서 사용하기 위해서 그리고 CAR-T 요법 개발을 위해서 D3-결합 분자, 예컨대, 단클론성 항체를 비롯한 새로운 D3-표적 작용제를 찾는 것이 필요하다.
본 개시내용은 개선된 효능을 갖는 D3-결합 분자를 제공하는 화합물, 방법, 조성물 및 제조품에 관한 것이다. 본 개시내용에 의해 제공되는 이점은 항체 치료제 및 진단 분야에서 광범위하게 적용 가능하며, 다양한 표적과 반응하는 항체와 같은 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.
본 개시내용은 인간 D3에 특이적으로 결합할 수 있고 시노몰거스 원숭이 및/또는 마우스 D3와 교차 반응성인 D3-결합 분자, 예컨대, 단클론성 항체를 제공한다. 이러한 D3-결합 분자는 현재 사용되고/되거나 당업계에 공지된 작용제, 조성물 및/또는 방법에 비해서 특정 이점을 제공한다. 이러한 이점은 내재화 효력, 개선된 치료 및 약리학적 특성, 증가된 특이성, 개선된 안전성 프로파일, 감소된 면역원성 및 다른 이로운 특성, 예컨대, 개선된 제조 용이성 또는 제품 비용 감소, 특히 당업계에 이미 알려진 후보 약물과 비교하여 더 높은 안정성을 포함한다.
본 개시내용에서, D3-과발현 종양을 치료하는 데 사용될 수 있는 D3에 대한 단클론성 항체와 같은 D3-결합 분자가 개발되었다.
본 개시내용은 D3-결합 분자, 이를 암호화하는 핵산 분자, D3-결합 분자의 발현에 사용되는 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 D3-결합 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 D3-결합 분자는 인간 면역 기능의 조절을 통해 다수의 암(폐암 포함)의 치료를 위한 강력한 작용제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 D3, 예컨대, 인간 D3, cyno D3 및/또는 마우스 DLL-3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH 도메인)을 포함하는 D3-결합 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하되,
CDR1은 서열번호 1, 4, 7 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고;
CDR2는 서열번호 2, 5, 8 또는 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고;
CDR3은 서열번호 3, 6 또는 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 단일 가변 도메인은 다음을 포함한다:
(A) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 2에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR3;
(B) 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR3;
(C) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR3; 또는
(D) 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 11에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR3.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 단일 가변 도메인은 다음을 포함하되:
(A) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 28 또는 56에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 CDR3;
(B) 서열번호 38에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 39에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 40에 제시된 바와 같은 CDR3; 또는
(C) 서열번호 49에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 50에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 51에 제시된 바와 같은 CDR3;
CDR 넘버링은 Contact 넘버링 시스템에 따른다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 단일 가변 도메인은 다음을 포함한다:
(A) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열;
(B) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열로서, D3에 대한 특이적 결합 친화성이 유지되는(예를 들어, 실질적으로, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 유지되는), 아미노산 서열; 또는
(C) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 아미노산의 첨가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열로서, D3에 대한 특이적 결합 친화성이 유지되는(예를 들어, 실질적으로, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 유지되는), 아미노산 서열.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자는 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)의 프레임워크 영역, 예를 들어, FRW1, FRW2, FRW3 및/또는 FRW4 내에 아미노산의 하나 이상의 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 가변 도메인의 N 말단의 FRW1 및/또는 C 말단의 FRW4는 절단되고, 예를 들어, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산(들)이 절단된다.
일부 실시형태에서, 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)은 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자는 하나 이상의 인간 IgG 불변 도메인, 예컨대, 하나 이상의 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG 불변 도메인은 인간 IgG1 불변 도메인 또는 이의 변이체이다. IgG1 불변 도메인의 아미노산 서열의 예는 서열번호 19에 제시된 바와 같다. 일부 실시형태에서, D3-결합 분자는 하나 이상의 인간 IgG1 불변 도메인의 변이체, 예를 들어, EU 넘버링에 따라서 L234A/L235A 치환을 갖는 IgG1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(a) ELISA 또는 FACS에 의해서 측정되는 경우 nM 등급의 EC50으로 인간 D3, cyno D3 및/또는 마우스 D3에 결합함;
(b) 인간 D3 발현 세포에서 용량-의존적 내재화 효력을 나타냄; 및
(c) SPR에 의해서 측정되는 경우 0.1nM 이하의 KD로 인간 D3에 결합함.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, D3-결합 분자는 이량체이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자는 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 단일 가변 도메인 및 서열번호 19에 제시된 바와 같은 IgG 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자, 예컨대, 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하는 D3-결합 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 숙주 세포에서 D3-결합 분자를 발현시키는 단계 및 숙주 세포로부터 D3-결합 분자를 단리시키는 단계를 포함하는, D3-결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 D3-관련 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에서 D3-관련 면역 반응이 조절되도록 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 D3 양성 또는 D3 과발현 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은, 예를 들어, SCLC 및 LCNEC를 비롯한 폐암이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 D3 양성 암을 진단하거나, 치료하거나, 예방하기 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 D3 양성 암을 진단하거나, 치료하거나, 예방하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자를 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 사용하는 키트 또는 장치 및 관련 방법에 관한 것이다.
전술한 내용은 요약이므로 필요에 따라 단순화, 일반화 및 세부 사항 생략을 포함하며; 결과적으로, 당업자는 이 요약이 단지 예시이며 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 결합 분자, 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 다른 주제의 다른 양상, 특징 및 이점은 본 명세서에 제시된 교시에서 명백해질 것이다. 요약은 상세한 설명에서 아래에 더 설명되는 단순화된 형태로 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 주제의 주요 특징 또는 필수적인 특징을 식별하기 위한 것이 아니며 청구된 주제의 범주를 결정하는 데 도움을 주기 위한 것도 아니다.
도 1은 ELISA에 의해서 측정된, 고정된 WT115-hPro1.ECD.his와 항체의 예시적인 결합 결과를 도시한다.
도 2a 및 도 2b는 FACS에 의해서 측정된 항체와 WT115-293F.hPro1.2E5 세포의 예시적인 결합 결과를 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 FACS에 의해서 측정된 항체와 WT115-Flpin293.cPro1.pool 세포의 예시적인 결합 결과를 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 ELISA에 의해서 측정된 고정된 WT115-MBP-mPro1.ECD.hFc에 대한 항체의 예시적인 결합 결과를 도시한다.
도 5a 및 도 5b는 WT115-293F.hPro1.2E5 세포에 의한 항체의 예시적인 내재화 결과를 도시한다.
도 6a 내지 도 6d는 ELISA에 의한, 고정된 WT115-hPro1.ECD.his에 의한 항체의 예시적인 에피토프 비닝(binning) 결과를 도시한다. 도 6a, WT1156-P3R2-1C2-uIgG1로의 비닝; 도 6b, WT1156-P3R2-1H6-uIgG1로의 비닝; 도 6c, WT1156-P8R2-1H1-uIgG1로의 비닝; 도 6d, WT115-BMK1로의 비닝.
도 7a는 ELISA에 의한, 가용성 WT115-hPro1.ECD.his 또는 절단된 단백질에 대한 항체의 예시적인 ELISA 결합 결과를 도시한다. 도 7b는 ELISA에 의한, 고정된 WT115-hPro1.ECD.his 또는 절단된 단백질에 대한 항체의 ELISA 결합을 도시한 도면. 도 7c는 절단된 단백질의 다이어그램.
도 8은 ELISA에 의해서 측정된, 인간 D1 및 인간 D4를 갖는 항체의 예시적인 크로스-패밀리 결합 결과를 도시한다.
도 9는 WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1의 예시적인 혈청 안정성 시험 결과를 도시한다.
도 10은 예시적인 면역글로불린 단일 가변 도메인 WT1156-P3R2-1C2(1C2), WT1156-P3R2-1C2-z102(1C2-z102), WT1156-P3R2-1C2-z109(1C2-z109), WT1156-P3R2-1C9(1C9), WT1156-P3R2-1H6(1H6), WT1156-P3R2-1H6-z100(1H6-z100) 및 WT1156-P8R2-1H1(1H1)의 정렬을 도시한다. CDR의 경계는 Kabat, AbM, Chothia, Contact 및 IMGT 넘버링에 표시된다.
본 개시내용은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있지만, 본 개시내용의 원리를 예시하는 구체적인 예시적인 이의 실시형태가 본 명세서에서 개시된다. 본 개시내용이 예시된 구체적인 실시형태에 의해 제한되는 것은 아님이 강조되어야 한다. 더욱이, 본 명세서에 사용된 임의의 섹션 제목은 구성 목적일 뿐이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 복수의 단백질을 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물을 포함하는 등이다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위는 종점 및 종점 사이의 모든 지점 둘 다를 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조한다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 실험실 절차 및 기술은 당업계에 널리 공지되고 통 상적으로 사용되는 것이다.
정의
본 개시내용의 이해를 돕기 위해서, 관련 용어의 정의 및 설명은 다음과 같이 제공된다.
용어 "항체(예를 들어, 항-D3 항체) 및 "항원-결합 분자"(예를 들어, D3-결합 분자)는 가장 넓은 의미로 상호 교환 가능하게 사용되고, 목적하는 생물학적 또는 결합 활성을 나타내는 항체의 임의의 형태를 포함한다. 이는 인간화 항체, 완전 인간 항체, 키메라 항체 및 단일 도메인 항체(sdAb, 전형적으로 중쇄와 유사한 단 하나의 쇄를 포함함)뿐만 아니라 예를 들어, 적어도 하나의 VHH 도메인을 포함하는 항체를 포함하여 목적하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 상기 중 임의의 것의 단편을 포괄하지만 이에 제한되지 않는다. 종래의 항체는 중쇄(들) 및 경쇄(들)를 포함한다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 및 ε으로 분류될 수 있고, 이것은 각각 항체의 아이소타입을 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 정의한다. 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함할 수 있다. 중쇄는 하나 이상의 불변 영역, 예를 들어, 3개의 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 포함할 수 있다. 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역(CDR(상보성 결정 영역)이라고 함)으로 추가로 나눌 수 있으며, 이 영역은 상대적으로 보존적인 영역(FRW(프레임워크 영역)이라고 함) 사이에 배치되어 있다. VH 및 VL은 N-말단에서 C-말단으로 FRW1, CDR1, FRW2, CDR2, FRW3, CDR3, FRW4의 순서로 3개의 CDR(상보성 결정 영역) 및 4개의 FR(프레임워크 영역)을 포함할 수 있다. 항체는 다양한 항체 아이소타입, 예를 들어, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
용어 "Fc 영역"은, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 종종 위치 Cys226(EU 번호 체계에 따라서)의 아미노산 잔기 또는 Pro230(EU 번호 체계에 따라서)로부터 이의 카복실 말단까지 연장하도록 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 번호 체계에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안 제거되거나, 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 보유한다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체(B cell receptor); BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 영역 또는 결합 도메인(예를 들어, VHH 도메인을 포함하는 항체 가변 영역 또는 도메인)과 조합되도록 요구하고, 개시된 바와 같이 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되고 인간에 의해서 조작, 변형 및/또는 변경(예를 들어, 단리, 정제, 선택, 다른 서열, 예컨대, 가변 영역 서열을 포함하거나 조합)되지 않은 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 알로타입); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 첨가 또는 결실), 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 것과 다른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 FC 영역에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동성 또는 이와 적어도 약 90%의 상동성, 예를 들어, 이와 적어도 약 95%의 상동성을 가질 수 있다. 본 명세서에 기재된 변이체 Fc 영역은 효과기 기능(예를 들어, 침묵 Fc)의 상실을 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체는 합성 항체, 단클론성 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디, 단일 쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 등 포함), 낙타화 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합 Fv(sdFv), 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 상기 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인" 또는 "VHH 도메인" 또는 "VHH" 또는 "중쇄 단독 항체 가변 도메인"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 상이한 가변 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 단일 쇄 항원 결합 도메인을 지칭한다. VHH 도메인(예를 들어, 중쇄 항체의 가변 도메인)은 적응성 면역 반응에 의해 생성된 가장 작은 알려진 항원 결합 단위를 나타낸다(Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov; 21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)). VHH 도메인은 인간 도메인일 수 있지만, 설치류, 너스상어, 낙타과 VHH 도메인과 같은 다른 종의 단일 도메인을 또한 포함한다. 낙타과 VHH는 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생성하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 구아나코를 포함한 종에서 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩타이드이다. 이러한 VHH 도메인은 당업계에서 이용 가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있으며 "단일 도메인 항체"로 간주된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, VHH는 낙타과 VHH 도메인 및 인간화 VHH 도메인을 포함한다.
용어 "인간화 항체"는 다른 포유동물 종, 예컨대, 마우스, 라마 또는 알파카의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하도록 의도되는 반면, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체에 대한 Kd 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되며, 이는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현된다. 항체의 Kd를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명을 사용하는 것이며, 바람직하게는 Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다"는 2개의 분자 사이, 예컨대, 예를 들어, 항체와 항원 사이에서의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "고 친화성"은 표적 항원에 대해 1×10-7M 이하, 보다 바람직하게는 5×10-8M 이하, 보다 더 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5×10-9M 이하, 보다 더 바람직하게는 1×10-9M 이하의 KD를 갖는 항체와 같은 D3 결합 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "EC50"은 "최대 유효 농도의 절반"으로도 지칭되며, 특정 노출 시간 후 기준선과 최대 값 사이의 중간으로 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독성 물질의 농도를 의미한다. 본 개시내용의 맥락에서, EC50은 "nM"단위로 표현된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 지칭한다. "에피토프"는 "항원 결정 인자"로도 알려져 있다. 에피토프 또는 항원 결인정자는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기를 포함하며, 일반적으로 특정 3차원 구조와 특정 전하 특성을 갖는다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 "선형" 또는 "입체적"일 수 있는 고유의 입체 배좌로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상의 연속 또는 비연속 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들어, 항체) 사이의 모든 상호작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 입체적 에피토프에서 상호작용 부위는 단백질에서 서로 떨어져 있는 아미노산 잔기에 걸쳐 있다. 항체는 당업자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 동일한 에피토프에 대한 결합의 경쟁력에 따라 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 경쟁 또는 교차 경쟁에 대한 연구를 수행하여 항원에 대한 결합을 위해 서로 경쟁하거나 교차 경쟁하는 항체를 얻을 수 있다. 교차 경쟁에 기초한 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 얻기 위한 고속대량 처리 방법은 국제 특허 출원 WO 03/48731에 설명되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, D3 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 D3 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 인간 D3 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종의 D3 단백질과 같은 다른 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 숙주 세포로의 형질전환, 형질도입 또는 형질주입에 의해 숙주 세포에서 발현되는 운반된 유전 물질 요소를 가질 수 있다. 벡터는 당업자에 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대, 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(P1-derived artificial chromosome: PAC); 파지, 예컨대, λ 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로 바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 수두 바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바 바이러스(예를 들어, SV40)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 발현 조절을 위한 다중 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 벡터가 도입될 수 있는 세포를 의미하며, 원핵 세포, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 진균 세포, 예컨대, 효모 세포 또는 아스퍼길루스(Aspergillus), 곤충 세포, 예컨대, S2 드로소필라(Drosophila) 세포 또는 Sf9 및 동물 세포, 예컨대, 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정된 바와 같이 2개 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 간의 관계를 지칭한다. "동일성 백분율"은 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오타이드 사이의 동일한 잔기의 백분율을 의미하며 비교되는 가장 작은 분자의 크기를 기준으로 계산된다. 이러한 계산을 위해서, 정렬의 간격 (존재하는 경우)은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 해결되는 것이 바람직하다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하는 데 사용할 수 있는 방법은 문헌[Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073]에 기재된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "면역원성"은 유기체에서 특정 항체 또는 감작 림프구의 형성을 자극하는 능력을 의미한다. 그것은 특정 면역세포를 활성화, 증식, 분화시켜 최종적으로 항체, 감작 림프구와 같은 면역효과 물질을 생성하도록 자극하는 항원의 특성을 지칭할 뿐만 아니라 항원으로 유기체를 자극한 후 유기체의 면역계에서 항체 또는 감작된 T 림프구가 형성될 수 있는 특정 면역 반응을 지칭하기도 한다. 면역원성은 항원의 가장 중요한 특성이다. 항원이 숙주에서 면역 반응의 생성을 성공적으로 유도할 수 있는지 여부는 항원의 특성, 숙주의 반응성 및 면역 수단을 비롯한 몇몇 인자에 좌우된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "형질주입" 또는 "형질주입하다"는 핵산이 진핵 세포, 특히 포유 동물 세포로 도입되는 과정을 지칭한다. 형질주입을 위한 프로토콜 및 기술에는 지질 형질 감염 및 전기천공과 같은 화학적 및 물리적 방법이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 형질주입 기술이 당업계에 잘 알려져 있으며 본 명세서에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197]을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "SPR" 또는 "표면 플라스몬 공명"은, 예를 들어, BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 업살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 바이오센서 매트릭스 내에서 단 백질 농도의 변화를 감지하여 실시간 바이오스펙트럼 상호작용을 분석할 수 있는 광학적 현상을 의미하고 포함한다. 추가 설명에 대해서는, 실시예 및 문헌[ U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; U., et al. (1991)　Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem.　198:268-277]을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "형광 활성화 세포 분류" 또는 "FACS"는 특수한 유형의 유세포 분석을 의미한다. 이는 각각의 세포의 특정 광 산란 및 형광 특성에 따라 생물학적 세포의 이질적인 혼합물을 두 개 이상의 용기(한 번에 하나의 세포씩)로 분류하는 방법을 제공한다(FlowMetric. "Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting". Retrieved 2017-11-09.). FACS를 수행하기위한 기기는 당업자에게 공지되어 있으며 대중에게 상업적으로 입수 가능하다. 이러한 기기의 예는 Becton Dickinson(미국 캘리포니아주 포스터시 소재)로부터의 FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort Coulter Epics Division(미국 플로리다주 하이얼리어 소재)으로부터의 Epics C 및 Cytomation(미국 콜롬비아주 콜로라도 스프링즈 소재)으로부터의 MoFlo를 포함한다.
용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물, 바람직하게는 인간을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "D3와 연관된 병태" 또는 "D3와 관련된 병태"는 D3의 발현 또는 활성(예를 들어, 인간 D3)의 증가 또는 감소(일반적으로 증가)에 의해 유발되거나, 악화되거나, 그렇지 않으면 이와 관련된 임의의 병태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "암"은 고형 종양 및 백혈병과 같은 비고형 종양을 포함하여 원발성 또는 전이 매개성 임의의 종양 또는 임의의 악성 세포 성장 또는 증식을 의미한다.
병태를 치료하는 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료된"은 일반적으로 인간 또는 동물의 치료 및 치료에 관련되며, 여기서 일부 목적하는 치료 효과가 달성되는 것으로, 예를 들어, 병태 진행의 저해는 진행률의 감소, 진행률의 중단, 병태의 회귀, 병태의 개선 및 병태의 치료를 포함한다. 예방 조치(예를 들어, 예방, 방지)로서의 치료도 포함된다. 암의 경우, "치료하는"은 종양 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이, 또는 이들의 일부 조합을 완화하거나 늦추는 것을 의미할 수 있다. 종양의 경우, "치료"는 종양의 전체 또는 일부 제거, 종양 성장 및 전이 저해 또는 둔화, 종양 발생 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료적 유효량"은 목적하는 치료 요법에 따라서 투여될 때 합리적인 유익/유해 비율에 상응하는 일부 원하는 치료 효과를 생성하기에 효과적인 활성 화합물 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투여형의 양에 관한 것이다. 예를 들어, D3-결합 분자의 "치료적 유효량"은 인간 D3 관련 질환 또는 병태의 치료에 효과적인 양 또는 농도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 이의 염이 제형의 다른 성분과 화학적으로 그리고/또는 물리적으로 상용성이고 수용자와 생리학적으로 상용성임을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"는 당업계에 널리 알려진 대상체 및 활성제와 약리학적으로 그리고/또는 생리학적으로 상용성인 담체, 안정화제 및/또는 부형제를 지칭하고(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995] 참조), pH 조정제, 계면 활성제, 보조제 및 이온 강도 향상제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조정제는 인산염 완충액을 포함하지만 이들로 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, Tween-80을 포함하지만 이들로 제한되지 않고; 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에서 무독성이다. 보통 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 담체의 예는 완충제, 예컨대, 인삼염, 시트르산염 및 다른 유기산; 산화방지제, 예컨대, 아스코르브산; 저분자량(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리바이닐피롤리돈; 아미노산 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 또는 솔비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS™를 포함한다. 용어 "담체"는 또한 치료제가 투여되는 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)(완전 또는 불완전)), 부형제 또는 비히클을 지칭할 수 있다. 이러한 담체는 멸균 액체, 예컨대, 석유, 동물, 식물성 또는 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 합성 유래의 것을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)이 정맥내로 투여되는 경우 물이 예시적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체, 특히 주사용 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 부형제(예를 들어, 약제학적 부형제)는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 바람직한 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 포함하는 경구용 조성물은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA]에 기재되어 있다. 약제학적 화합물을 포함하는 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 D3-결합제(예를 들어, 항-D3 항체)를 예를 들어, 단리된 형태 또는 정제된 형태로, 대상체(예를 들어, 환자)에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해서 적합한 양의 담체와 함께 함유할 수 있다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보조제"는 항원과 함께 유기체에 전달되거나 미리 유기체에 전달될 때 유기체 내에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키거나 유기체의 면역 반응 유형을 변경할 수 있는, 비-특이적 면역증강제를 지칭한다. 알루미늄 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄), 프로인트 보조제(예를 들어, 프로인트 완전 보조제 및 프로인트 불완전 보조제), 코리네 박테리아 파르붐, 지질다당류, 사이토카인 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 보조제가 있다. 프로인트 보조제는 현재 동물 실험에서 가장 일반적으로 사용되는 보조제이다. 수산화알루미늄 보조제가 임상 시험에서 더 일반적으로 사용된다.
D3-결합 분자
일부 양상에서, 본 개시내용은 D3-결합 분자를 제공한다. D3-결합 분자는 일반적으로 D3에 특이적으로 결합하는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 일부 상황에서, "D3-결합 분자"는 "D3 길항제" 및 "항-D3 항체"를 포함할 수 있다. "D3 길항제"는 D3 활성을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 지칭한다. "항-D3 항체"는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 단일-도메인 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. D3-결합 분자는 폴리펩타이드 또는 단백질로 제한되지 않으며 뉴클레오타이드, 하이브리드, 글루칸 및 이들의 조합과 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 예시된 바와 같이, D3-결합 분자는 항-D3 항체 또는 항-D3 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자는 D3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 VHH를 포함한다. 추가로, D3-결합 분자는 단일 도메인 항체일 수 있고 하나의 VHH를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 특정 항원(예를 들어, D3)에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, D3-결합 분자는 면역글로불린 Fc 영역, 예를 들어, IgG의 Fc 영역(예를 들어, IgG4 또는 IgG1)에 융합된 VHH를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이다. VHH를 Fc 영역에 융합함으로써, 효과기 기능을 동원하는 것이 더 효율적일 수 있다. 또한, Fc 영역에 대한 VHH의 융합은 D3-결합 분자가 이량체를 형성하는 데 도움이 될 수 있으며 생체 내에서 D3-결합 분자의 반감기 연장에도 도움이 될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 낙타과 항체로부터 유래된 VHH 분자는 알려진 가장 작은 온전한 항원-결합 도메인 중 하나이고(대략 15 kDa 또는 종래의 IgG보다 10배 더 작음), 따라서 밀도가 높은 조직으로의 전달 및 거대분자들 사이의 제한된 공간에 대한 접근에 매우 적합하다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 VHH는 당업계에 알려진 방법 및 임의의 추가 방법에 따라서 당업자에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, VHH는 낙타를 면역화하고 그로부터 하이브리도마를 얻거나, 또는 당업계에 공지된 분자 생물학 기법을 이용하여 본 개시내용의 VHH의 라이브러리를 클로닝하고 그 다음 파지 디스플레이를 사용한 후속 선별과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
예를 들어, VHH는 라마 또는 알파카를 원하는 항원으로 면역화한 후 중쇄 항체를 암호화하는 mRNA를 단리시켜 얻을 수 있다. 역전사 및 중합효소 연쇄 반응에 의해서, 수백만 개의 클론을 포함하는 단일 도메인 항체의 유전자 라이브러리가 생성된다. 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이와 같은 스크리닝 기술은 항원에 결합하는 클론을 식별하는 데 도움이 된다. 하나의 기술은(예를 들어, 인간) 항체의 라이브러리가 파지 상에서 합성되고, 라이브러리가 관심 항원 또는 이의 항체-결합 부분으로 스크리닝되고, 항원에 결합하는 파지가 단리되고, 이로부터 면역반응성 단편을 얻을 수 있는 파지 디스플레이이다. 이러한 라이브러리를 준비하고 스크리닝하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트들은 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAPTM 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612). 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 다른 방법 및 시약이 또한 존재한다(예를 들어, 문헌[Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)] 참조).
가장 강력한 클론이 확인되면, 이의의 DNA 서열은, 예를 들어, 친화성 성숙화 또는 인간화에 의해 최적화된다. 인간화는 항체에 대한 인간 유기체의 면역학적 반응을 방지할 수 있다.
따라서, VHH 도메인은 (1) 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인 단리에 의해; (2) 자연 발생 VHH 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해; (3) 자연 발생 VHH 도메인의 "인간화" 또는 이러한 인간화 VHH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (4) 임의의 동물 종, 특히 포유동물 종, 예를 들어, 인간으로부터의, 자연 발생 VH 도메인의 "낙타화"에 의해, 또는 이러한 낙타화된 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (5) 상기 문헌[Ward et al]에 기재된 바와 같은 "도메인 항체" 또는 "Dab"의 "낙타화"에 의해, 또는 이러한 낙타화 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (6) 단백질, 폴리펩타이드 또는 기타 아미노산 서열을 제조하기 위해 합성 또는 반-합성 기술을 사용하는 것; (7) 핵산 합성을 위한 기술을 사용하여 VHH를 암호화하는 핵산을 제조하고, 그 다음 얻은 핵산을 발현시키는 것; 및/또는 (8) VHH의 친화성 및/또는 특이성을 증가시키기 위해 중쇄 항체 또는 VHH에 친화성 성숙, 돌연변이 유발(예를 들어, 무작위 돌연변이 유발 또는 부위 지정 돌연변이 유발) 및/또는 임의의 다른 기술(들)을 적용하는 것; 및/또는 (9) 이들의 임의의 조합에 의해 얻을 수 있다. 상기를 수행하기 위한 적합한 방법 및 기술은 본 명세서의 개시를 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이며 예를 들어, 아래에서 보다 상세하게 설명되는 방법 및 기술을 포함한다.
단일 도메인 항체는 일반적으로 면역화된 동물에서 얻은 혈액, 림프절 또는 비장 cDNA으로부터의 가변 도메인 레퍼토리를 파지 디스플레이 벡터로 PCR 클로닝하여 생성된다. 항원-특이적 단일 도메인 항체는 일반적으로 고정된 항원, 예를 들어, 시험관의 플라스틱 표면에 코팅된 항원, 스트렙타비딘 비드에 고정된 바이오티닐화된 항원 또는 세포의 표면에 발현된 막 단백질들에 대한 파지 라이브러리를 패닝하여 선택된다. sdAb의 친화도는, 예를 들어, CDR 영역의 부위 지정 돌연변이 유발 및 증가된 엄격성 조건(고온, 높거나 낮은 염 농도, 높거나 낮은 pH, 낮은 항원 농도) 하에서 고정된 항원에 대한 추가 패닝에 의해, 시험관내에서 이 전략을 모방함으로써 종종 개선될 수 있다(Wesolowski et al., Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol (2009) 198: 157-174).
항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 VHH를 제조하는 방법은, 예를 들어, 문헌[R. van der Linden et al., Journal of Immunological Methods, 240(2000) 185-195; Li et al., J Biol Chem., 287(2012)13713-13721; Deffar et al., African Journal of Biotechnology Vol. 8(12), pp.2645, 17 June, 2009] 및 WO 94/04678에 참조에 의해 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, VHH가 실질적으로 항원 결합 및 특이성을 유지하는 한(예를 들어, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%를 실질적으로 유지함), 이것은 부분적인 FRW1 및/또는 FRW4만을 포함하거나 이들 프레임워크 영역 중 하나 또는 둘 다가가 결여되도록 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있다.
본 개시내용은 또한 D3-결합 분자의 D3-결합 도메인 중 하나 이상이(예를 들어, 차폐 모이어티를 통해서) 차폐되고/되거나(예를 들어, 절단 가능한 모이어티를 통해서) 활성화 가능한 차폐 모이어티 및/또는 절단 가능한 모이어티를 갖는 D3-결합 분자를 제공한다. SAFE 바디 차폐 기술(예를 들어, US 2019/0241886 참조) 및 Probody 차폐 기술(예를 들어, US 2015/0079088 참조)을 포함하여 D3-결합 분자(예를 들어, 항체)를 차페하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 기술은 차폐되고/되거나 활성화 가능한 D3-결합 분자(예를 들어, 항체)를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 차폐된 및/또는 활성화 가능한 D3-결합 분자(예를 들어, 항체)는 또 다른 작용제, 예컨대, 약물에 직접 또는 간접적으로 연결된 것을 비롯하여, 본 개시내용의 D3-결합 분자(예를 들어, 항체) 중 임의의 하나를 포함하는 면역접합체, 항체-약물 접합체(ADC), 차폐된 ADC 및 활성화 가능한 항체-약물 접합체(AADC)를 비롯한 접합체의 제조에 유용하다. 예를 들어, 본 개시내용의 D3-결합 분자는 하나 이상의 작용제, 예컨대, 약물에 합성 링커에 의해서 공유 결합될 수 있다.
원하는 경우, D3-결합 분자는 세포독성 활성(예를 들어, 화학요법 모이어티 또는 방사성 동위원소) 또는 면역 동원 활성과 같은 효과기 기능을 갖는 모이어티에 (직접 또는 간접적으로) 연결되거나 접합된다. (직접 또는 간접적으로) 연결되거나 접합된 모이어티는 세포독성인 약물(예를 들어, 독소, 예컨대, 아우리스타틴) 또는 비세포독성인 약물(예를 들어, 신호 전달 조절제, 예컨대, 키나제) 또는 D3-결합 분자의 하나 이상의 결합 도메인을 차폐하는 차폐 모이어티, 또는 절단 가능한 모이어티의 절단에 의해서 종양 미세환경에서 차폐된 접합체의 형태의 D3-결합 분자의 하나 이상의 결합 도메인을 탈차폐(unmasking)시킴으로써 D3-결합 분자를 활성화할 수 있는 절단 가능한 모이어티를 포함한다. 면역 동원을 촉진하는 모이어티는 선천성 면역계의 세포에 선택적으로 결합하는 바이러스 단백질과 같은 다른 항원 결합제를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, D3-결합 분자는 선택적으로 혼합물로부터 단리를 용이하게 하는 모이어티(예를 들어, 태그) 또는 리포터 활성이 있는 모이어티(예를 들어, 검출 라벨 또는 리포터 단백질)에 (직접 또는 간접적으로) 연결되거나 접합된다. 본 명세서에 기재된 D3-결합 분자의 특징은 D3-결합 분자 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 대해서도 확장된다는 것이 인식될 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 D3-결합 분자는 폴리펩타이드에 (직접적으로 또는 간접적으로) 연결되거나 접합될 수 있으며, 이는 활성화 가능한 항체의 생성을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, D3-결합 분자는 작용제에 (직접적으로 또는 간접적으로) 연결되거나 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 ADC의 항체가 차폐 모이어티 및 절단 가능 모이어티를 포함하는 경우 ADC 또는 AADC를 생성하는 약물이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 D3-결합 분자는 치료제(예를 들어, 세포독성제) 또는 진단제 또는 검출제에 (직접 또는 간접적으로) 접합되거나 재조합적으로 연결된다. 차폐되거나 활성화 가능한 접합체를 포함하는 접합되거나 재조합적으로 연결된 항체는, 예를 들어, 암 또는 종양과 같은 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다.
진단 및 검출은, 예를 들어, D3-결합 분자를 예를 들어, 효소, 예컨대, 비제한적으로 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결분자군, 예컨대, 비제한적으로 스트렙타비딘/바이오틴 또는 아비딘/바이오틴; 형광 물질, 예컨대, 비제한적으로 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대, 비제한적으로 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대, 비제한적으로 루시퍼라제, 루시페린 또는 에쿼린; 화학발광 물질, 예컨대, 비제한적으로 아크리디늄계 화합물 또는 HALOTAG; 방사성 물질, 예컨대, 비제한적으로 아이오딘(131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소(14C), 황(35S), 투라이튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga 및 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브데넘(99Mo), 제논(133Xe), 플루오린(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 또는 117Sn; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용한 양전자 방출 금속; 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하는 검출 가능한 물질에 D3-결합 분자를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
작용제가 ADC 또는 AADC의 제조를 위한 약물인 것을 포함하는, 항체 또는 작용제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB 및 SVSB(석신이미딜-(4-바이닐설폰) 벤조에이트)를 사용하여 제조될 수 있다. 본 개시내용은 작용제가 ADC 또는 AADC의 제조를 위한 약물인 것을 포함하여 항체 및 작용제의 접합체가 당업계에 개시된 것과 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다는 것을 추가로 고려한다(예를 들어, 문헌[Bioconjugate Techniques (Hermanson ed., 2d ed. 2008)] 참조).
작용제가 ADC 또는 AADC의 제조를 위한 약물인 것을 포함하여, 항체 및 작용제에 대한 통상적인 접합 전략은 Lys 잔기의 ε-아미노기 또는 Cys 잔기의 티올기를 포함하는 무작위 접합 화학을 기반으로 하였으며, 이는 이종 접합체를 초래한다. 최근 개발된 기술은 항체에 대한 부위 특이적 접합을 허용하여 균일한 로딩을 초래하고 항원 결합 또는 약동학이 변경된 접합체 하위집단을 방지한다. 이것은 반응성 티올기를 제공하고 면역글로불린 접힘 및 조립을 방해하거나 항원 결합을 변경하지 않는, 중쇄 및 경쇄 상의 위치에 시스테인 치환을 포함하는 "티오맙"의 조작을 포함한다(예를 들어, 문헌[Junutula et al., 2008, J. Immunol. Meth. 332: 41-52; 및 Junutula et al., 2008, Nature Biotechnol. 26:925-32] 참조). 또 다른 방법에서, 셀레노시스테인은 종결 코돈 UGA를 종결부터 셀레노시스테인 삽입까지 재암호화함으로써 항체 서열에 동시번역적으로 삽입되어 다른 자연 아미노산의 존재 하에서 셀레노시스테인의 친핵성 셀렌올기에서 부위 특이적 공유 접합을 허용(예를 들어, 문헌[Hofer et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:12451-56; 및 Hofer et al., 2009, Biochemistry 48(50):12047-57] 참조).
본 명세서에 기재된 D3-결합 분자는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적이거나 더 큰 다중특이적일 수 있다. 이러한 작용제는 항체를 포함할 수 있다. 이중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 표적(예를 들어, 항원) 또는 동일한 표적에 대한 2개의 상이한 에피토프(예를 들어, D3의 제1 에피토프에 대한 제1 결합 도메인 및 D3의 제2 에피토프에 대한 제2 결합 도메인을 갖는 D3에 지향되는 이중특이적 항체)에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체는 본 명세서에 기재된 항체의 서열을 기초로 작제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 마우스, 키메라, 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 항체의 결합 특이성 중 하나는 D3에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 표적(예를 들어, 항원)에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체는 하나 초과의 표적(예를 들어, 항원) 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 결합 도메인은 상이한 표적(예를 들어, D3에 결합하는 제1 결합 도메인 및 또다른 표적(예를 들어, 항원), 예컨대, 면역 관문 조절제(예를 들어, 음성 관문 조절제)에 결합하는 제2 결합 도메인)에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 분자는 동일한 표적(예를 들어, 항원) 상의 1개 초과(예를 들어, 2개 이상)의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 특이성 중 하나는 D3이고 다른 하나는 세포독성 T-림프구 항원-4(CTLA-4), CD80, CD86, 세포 예정사 1(PD-1), 세포 예정사 리간드 1(PD-L1), 세포 예정사 리간드 2(PD-L2), 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3, CD223으로도 알려져 있음), 갈렉틴-3, B 및 T 림프구 감쇠제(BTLA), T-세포막 단백질 3(TIM3), 갈렉틴-9(GAL9), B7-H1, B7-H3, B7-H4, Ig 및 ITIM 도메인이 있는 T 세포 면역수용체(TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(V-domain Ig suppressor of T-Cell activation: VISTA), 글루코코티코이드 유도 종양 괴사 인자 수용체 관련(GITR) 단백질, 헤르페스 바이러스 진입 매개체(HVEM), OX40, CD27, CD28, CD137. CGEN-15001T, CGEN-15022, CGEN-15027, CGEN-15049, CGEN-15052 및 CGEN-15092 중 하나 이상에 대한 것이다.
다중특이적 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어, 2개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현에 의한 것과 같이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Milstein and Cuello, 1983, Nature 305:537-40] 참조). 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 생성에 대한 추가 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Bispecific Antibodies (Kontermann ed., 2011)]을 참조한다.
본 개시내용은 D3에 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 비인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 흔히 "내수송" 잔기라고 하며, 이는 일반적으로 "내수송" 가변 도메인으로부터 취한다. D3에 결합하는 인간화 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Zhang et al., Molecular Immunology, 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang et al., Methods, 36(1): 35-42, 2005; Dall'Acqua et al., Methods, 36(1): 43-60, 2005; Clark, Immunology Today, 21(8): 397-402, 2000] 및 미국 특허 제6,180,370호; 제6,054,927호; 제5,869,619호; 제5,861,155호; 제5,712,120호; 및 제4,816,567).
D3-결합 분자는 다음 섹션에서 항-D3 항체로 설명될 수 있다.
기능성 특성을 갖는 항-D3 항체
예를 들어, 적어도 하나의 VHH 도메인을 포함하는 항체를 비롯한 본 개시내용의 항체는 항체의 특정 기능성 특징 또는 특성으로 특징규명된다. 일부 실시형태에서, 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(a) ELISA 또는 FACS에 의해서 측정되는 경우 nM 등급의 EC50으로 인간 D3, cyno D3 및 마우스 D3에 결합함;
(b) D3를 발현하도록 조작된 인간 세포에서 용량-의존적 내재화 효력을 나타냄; 및
(c) SPR에 의해서 측정되는 경우 0.1nM 이하의 KD로 인간 D3 ECD에 결합함.
본 개시내용의 항체는 고 친화도로 세포 표면 D3에 결합한다. D3에 대한 본 개시내용의 항체의 결합은 당업계에 널리 확립된 하나 이상의 기술, 예를 들어, ELISA를 사용하여 측정될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 결합 특이성은 또한 예를 들어, 유세포 분석법에 의해서 D3를 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체는 유세포 분석법 검정(예를 들어, FACS)에 의해서 시험될 수 있는데, 여기서 항체는 인간 D3를 발현하는 세포주, 예컨대, 세포 표면에서 D3를 발현하도록 형질주입된 CHO 세포 및 293 세포와 반응한다. 추가로 또는 대안적으로, 결합 동력학(예를 들어, Kd 값)을 포함하는 항체의 결합은 BIAcore 결합 검정으로 시험될 수 있다. 또 다른 적합한 결합 검정은, 예를 들어, 재조합 D3 단백질을 사용하는 ELISA 검정을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 1×10-7M 이하, 5×10-8M 이하, 2×10-8M 이하, 5×10-9M 이하, 4×10-9M 이하, 3×10-9M 이하, 2×10-9M 이하, 1×10-9M 이하, 5×10-10M 이하 또는 1×10-10M 이하의 KD로 세포 표면 D3(예를 들어, 인간 D3 ECD) 단백질에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 FACS로 측정할 때 약 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM 이하의 EC50으로 시노몰거스 원숭이 또는 마우스 D3에 결합한다.
VHH CDR을 포함하는 항-D3 항체
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하되, VHH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1은 서열번호 1, 4, 7 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호 2, 5, 8 또는 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 3, 6 또는 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR 넘버링은 Kabat과 AbM 넘버링의 조합에 따른다.
프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 당업계에 공지된 방법론, 예를 들어, Kabat 정의, Chothia 정의, AbM 정의, contact 정의, IMGT 정의(이들 모두는 당업계에 널리 알려짐) 및 이들의 임의의 조합을 사용하여 정확하게 식별될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May, 63(1):78-85; 및 Martin and Allen, in "Handbook of Therapeutic Antibodies", chapter 5, 2007]을 참조한다. 또한 hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs를 참조한다. 상이한 정의에 따른 넘버링 간의 일치 또는 정렬은, 예를 들어, www.imgt.org/에서 찾을 수 있다(또한 문헌[Giudicelli V et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. (1997) 25:206-11; 및 Lefranc MP et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. (2003) 27:55-77]을 참조한다).
당업자가 이해하는 바와 같이, CDR의 정확한 번호 지정 및 배치는 상이한 넘버링 시스템에 따라 다를 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 서열, 가변 경쇄 서열 및/또는 VHH 서열의 개시에는 연관된 (고유의) CDR의 개시가 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 각각의 가변 영역의 개시는 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)의 개시이다. 동일한 VH, VL 또는 VHH CDR을 갖는 2개의 항체는 동일한 접근법(예를 들어, 당업계에 공지된 Kabat, AbM, Chothia, Contact 및 IMGT 넘버링 접근법)에 의해 결정될 때 이들의 CDR이 동일하다는 것을 의미한다.
항체 서열의 가변 영역 및 CDR은 당업계에서 개발된 일반 규칙(예를 들어, Kabat, AbM, Chothia, Contact 및 IMGT 넘버링 시스템)에 따라서 또는 공지된 가변 영역의 데이터베이스에 대해 서열을 정렬함으로써 확인될 수 있다. 이러한 영역을 식별하는 방법은 문헌[Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 및 Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000]에 기재되어 있다. 항체 서열의 예시적인 데이터베이스는 문헌[Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671-D674 (2005)]에 기재된 바와 같이, www.bioinf.org.uk/abs의 "Abysis" 웹사이트(Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London(영국 런던 소재)의 A.C. Martin이 관리함) 및 www.vbase2.org의 VBASE2 웹사이트에 기재되어 있거나 이를 통해 접근될 수 있다. 바람직하게는 서열은 Kabat, IMGT 및 PDB(Protein Data Bank)의 서열 데이터를 PDB의 구조적 데이터와 통합하는 Abysis 데이터베이스를 사용하여 분석된다. 문헌[Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter　Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In:　Antibody Engineering Lab Manual 　(Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, also available on the website bioinforg.uk/abs)]을 참조한다. Abysis 데이터베이스 웹사이트는 본 명세서의 교시에 따라 사용될 수 있는 CDR을 식별하기 위해 개발된 일반 규칙을 추가적으로 포함한다. 도 10은 예시적인 면역글로불린 단일 가변 도메인의 정렬을 보여주며, CDR의 경계는 Kabat, AbM, Chothia, Contact 및 IMGT 넘버링으로 표시된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하되, VHH는 FRW1-CDR1-FRW2-CDR2-FRW3-CDR3-FRW4를 포함하고, CDR1은 서열번호 1, 4, 7 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 서열번호 2, 5, 8 또는 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 서열번호 3, 6 또는 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, D3-결합 분자에 포함된 VHH의 N 및 C 말단에서 FRW1 및 FRW4는, VHH가 항원 결합 및 특이성을 실질적으로 유지하는 한, 부분 FRW1 및/또는 FRW4만을 포함하거나 VHH가 이들 프레임워크 영역 중 하나 또는 둘 다가 결여되도록 절단될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 단일 도메인 항체)는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 단일 도메인 항체)는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 단일 도메인 항체)는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 단일 도메인 항체)는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 단일 도메인 항체)는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 단일 도메인 항체)는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 단일 도메인 항체)는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체(예컨대, 항-D3 단일 도메인 항체)는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 하기 구조를 포함하는 D3에 결합하는 단일 도메인 항체가 제공된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 여기서 (i) CDR1은 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 42, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 49, 서열번호 53 또는 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고/하거나; (ii) CDR2는 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 56, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 47, 서열번호 50 또는 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고/하거나; (iii) CDR3은 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 44, 서열번호 48 또는 서열번호 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR1은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하며; CDR3은 서열번호 3에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 IMGT 넘버링에 따르며, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Kabat 넘버링에 따르며, 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Chothia 넘버링에 따르며, 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Contact 넘버링에 따르며, 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 28 또는 56에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 AbM 넘버링에 따르며, 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR1은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하며; CDR3은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 IMGT 넘버링에 따르며, 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 33에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Kabat 넘버링에 따르며, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Chothia 넘버링에 따르며, 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Contact 넘버링에 따르며, 서열번호 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 AbM 넘버링에 따르며, 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR1은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하며; CDR3은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 IMGT 넘버링에 따르며, 서열번호 42에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 43에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 44에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Kabat 넘버링에 따르며, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Chothia 넘버링에 따르며, 서열번호 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Contact 넘버링에 따르며, 서열번호 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 AbM 넘버링에 따르며, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함하며; CDR3은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 예시적인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 IMGT 넘버링에 따르며, 서열번호 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 IMGT 넘버링을 따르며, 서열번호 33에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Kabat 넘버링에 따르며, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Kabat 넘버링을 따르며, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Chothia 넘버링에 따르며, 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Chothia 넘버링을 따르며, 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 Contact 넘버링에 따르며, 서열번호 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 Contact 넘버링을 따르며, 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 AbM 넘버링에 따르며, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 CDR3은 AbM 넘버링을 따르며, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-D3 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 WT1156-P3R2-1C2, WT1156-P3R2-1C9, WT1156-P8R2-1H1, WT1156-P3R2-1H6, WT1156-P3R2-1C2-z102, WT1156-P3R2-1C2-z109 및/또는 WT1156-P3R2-1H6-z100 중 하나 이상의 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 인간화 단일 도메인 항체이다.
본 명세서에 기재된 프레임워크 영역은 CDR 넘버링 시스템의 경계에 기초하여 결정된다. 즉, CDR이 예를 들어, IMGT, Kabat, Chothia, Contact 또는 AbM에 의해서 결정되는 경우, 프레임워크 영역은 N-말단에서 C-말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 포맷으로 가변 영역 내의 CDR을 둘러싼 아미노산 잔기이다. 예를 들어, FR1은, 예를 들어, IMGT 넘버링 시스템, Kabat 넘버링 시스템, Chothia 넘버링 시스템, Contact 넘버링 시스템 또는 AbM 넘버링 시스템에 의해서 정의된 바와 같은 CDR1 아미노산 잔기에 대해 N-말단인 아미노산 잔기로서 정의되고, FR2는, 예를 들어, IMGT 넘버링 시스템, Kabat 넘버링 시스템, Chothia 넘버링 시스템, Contact 넘버링 시스템 또는 AbM 넘버링 시스템에 의해서 정의된 바와 같은 CDR1과 CDR2 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 정의되고, FR3은, 예를 들어, IMGT 넘버링 시스템, Kabat 넘버링 시스템, Chothia 넘버링 시스템, Contact 넘버링 시스템 또는 AbM 넘버링 시스템에 의해서 정의된 바와 같은 CDR2와 CDR3 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 정의되고, FR4는, 예를 들어, IMGT 넘버링 시스템, Kabat 넘버링 시스템, Chothia 넘버링 시스템, Contact 넘버링 시스템 또는 AbM 넘버링 시스템에 의해서 정의된 바와 같은 CDR3 아미노산 잔기에 대해 C-말단인 아미노산 잔기로서 정의된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-D3 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
VHH 서열을 포함하는 항-D3 항체
일부 실시형태에서, 항-D3 항체는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하되, VHH는 다음을 포함하거나 다음으로 이루어진다:
(A) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열;
(B) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 또는
(C) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 비해서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산의 첨가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열.
두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller(문헌[Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)])의 알고리즘, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol 48:444-453 (1970))의 알고리즘, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용해 결정될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 개시내용의 단백질 서열은, 예를 들어, 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터 베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열(query sequence)"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10]의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이= 3으로 수행되어 본 개시내용의 항체 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해 Gapped BLAST는 문헌[Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 활용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때 각각의 프로그램의 기본 매개변수(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
일부 실시형태에서, VHH의 아미노산 서열은 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
일부 추가 실시형태에서, 항-D3 항체는 가변 영역 및/또는 불변 영역 내에 아미노산의 보존적 치환 또는 변형을 함유할 수 있다. 항원 결합을 제거하지 않는 특정한 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다. 예를 들어, 문헌[Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O' Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 및 Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43]을 참조한다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "보존적 치환"은 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 필수 특성에 불리하게 영향을 미치거나, 변경하지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어, 상응하는 아미노산 잔기와 물리적 또는 기능적으로 유사한 잔기(예를 들어, 공유 결합 또는 수소 결합 등을 형성하는 능력 등을 포함하여 유사한 크기, 모양, 전하, 화학적 특성을 갖는 것)로 치환되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러 한 패밀리는 알칼리성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신 등) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기는 바람직하게 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997) 참조).
일부 실시형태에서, 항-D3 항체는 적어도 하나의 VHH를 포함하고, VHH는 서열번호 12 내지 18 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체는 서열번호 12 내지 18 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VHH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-D3 항체는 인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역에 접합된 VHH를 포함하는 키메라 항체이되, VHH는 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체는 VHH 및 인간 IgG1의 Fc 영역을 포함하는 키메라 항체이다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "WT1156-P3R2-1C2-uIgG1", "WT1156-P3R2-1H6-uIgG1", "WT1156-P8R2-1H1-uIgG1" 및 "WT1156-P3R2-1C9-uIgG1"로서 예시된다. 일부 추가 실시형태에서, 항-D3 항체는 VHH 및 인간 IgG1의 Fc 영역을 포함하는 인간화 항체이다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "WT1156-P3R2-1C2-z102-uIgG1", "WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1" 및 "WT1156-P3R2-1H6-z100-uIgG1"로서 예시된다.
일부 실시형태에서, VHH 영역 내의 아미노산 중 적어도 하나의 첨가, 결실 및/또는 치환은 CDR 서열 중 어느 하나가 아닌 프레임워크(FRW) 서열에 존재한다. 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 VHH 영역의 프레임워크 서열, 예를 들어, FRW1, FRW2, FRW3 및/또는 FRW4 내에 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항원-결합 도메인이 D3에 결합할 수 있는 한 임의의 적합한 프레임워크 영역(FRW) 서열을 포함한다.
상기에 기재된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 변형이 보존적 치환인 것을 비롯하여, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역에 하나 이상의 아미노산의 변형을 함유할 수 있다. 항원 결합을 제거하지 않는 특정한 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다. 예를 들어, 문헌[Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O' Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 및 Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인 및 서열번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
D3-결합 분자의 항원-결합 도메인은 VHH 형태에 제한되지 않으며, 다양한 포맷, 예컨대, 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 단일-쇄 항체 분자(scFv)를 채택할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 도메인은 긴밀한 비공유 상호작용에 의해 서로 결합된 별도의 쇄에 VH 영역 및 VL 영역을 갖는 Fv 단편이다.
IgG 불변 도메인을 포함하는 Fc 영역
본 명세서에 제공된 항-D3 항체 및 항원-결합 단편은 하나 이상의 인간 IgG 불변 도메인을 포함하는 Fc 영역을 추가로 포함한다. 인간 IgG 불변 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 도메인, 바람직하게는 인간 IgG1 불변 도메인일 수 있다. 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 Fc 영역의 아미노산 서열의 예는 서열번호 19에 제시되어 있다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역, 예컨대, 야생형 Fc 영역 또는 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC) 또는 다른 효과기 기능을 변경하는 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, Leu234Ala/Leu235Ala 또는 LALA)을 포함하는 Fc 변이체이다.
일부 실시형태에서, Fc 변형은 LALA 돌연변이, 예를 들어, Kabat 등에서와 같은 EU 넘버링에 따른 L234A 및 L235A의 돌연변이를 포함한다. Kabat 넘버링 시스템은 가변 도메인 내의 잔기(대략 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 지칭하는 경우 일반적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 경우 일반적으로 사용된다(예를 들어, 상기 문헌[Kabat et al.]에 보고된 EU 인덱스). "Kabat에서와 같은 EU 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인에서 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
본 개시내용의 항체를 암호화하는 핵산 분자
일부 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자를 암호화하는, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자의 단일 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시내용의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다.
VHH 영역을 암호화하는 핵산은 VHH-암호화 핵산을 하나 이상의 중쇄 불변 영역(예를 들어, CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 핵산에 작동적으로 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예를 들어, 상기 문헌[Kabat et al.(1991)] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역, 예컨대, IgG1 불변 영역일 수 있다.
VHH 분절을 암호화하는 핵산이 얻어지면, 이들 핵산은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있으며, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 이러한 조작에서 VHH-암호화 핵산은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 다른 단백질을 암호화하는 또 다른 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 본 문맥에서 사용되는 바와 같은 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)으로 유지되도록 2개 이상의 핵산이 연결되는 것을 의미하도록 의도된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자의 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다:
(A) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 VHH 영역을 암호화하는 핵산 서열;
(B) (A)의 핵산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및
(C) 높은 엄격성 조건 하에서 (A)의 핵산 서열의 상보적 가닥에 혼성화하는 핵산 서열.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 서열번호 55에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-D3 단일 도메인 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.
일부 실시형태에서, 동일성 백분율은 유전자 암호의 축퇴로부터 유래되고, 암호화된 단백질 서열은 변화되지 않고 유지된다.
예시적인 높은 엄격성 조건은 5× SSPE 및 45% 폼아마이드에서 45℃에서의 혼성화 및 0.1×SSC에서 65℃에서의 최종 세척을 포함한다. 문헌[Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10]에 기재된 바와 같은 온도 및 완충액 또는 염 농도의 변화를 통해 동등한 엄격성 조건이 달성될 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다. 혼성화 조건의 변형은 프로브의 구아노신/사이토신(GC) 염기쌍의 길이 및 백분율을 기반으로 경험적으로 결정되거나 정확하게 계산될 수 있다. 혼성화 조건은 문헌[Sambrook, et al, (Eds.), Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51]에 기재된 바와 같이 계산될 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 숙주 세포는 본 개시내용의 항체를 발현하기에 적합한 임의의 세포, 예를 들어, 효모, 박테리아, 식물 및 포유동물 세포일 수 있다. 본 개시내용의 항체를 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌[R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택성 마커와 함께 사용되는, 예를 들어, 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr CHO 세포), 293F 세포, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포에 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 또한 SV40에 의해서 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양물에서의 성장을 위해서 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 마우스 골수종 세포, 예컨대, NSO(예를 들어, RCB0213, 1992, Bio/Technology 10:169) 및 SP2/0 세포(예를 들어, SP2/0-Ag14 세포, ATCC CRL 1581); 래트 골수종 세포, 예컨대, YB2/0 세포(예를 들어, YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, ATCC CRL 1662); PER.C6 세포; 및 인간 간세포주(Hep G2)가 포함된다. CHO 세포는 본 명세서에서, 예시적인 숙주 세포주인 CHO-K1, DUK-B11, CHO-DP12, CHO-DG44(Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555 (1986)) 및 Lec13과 함께 사용될 수 있는 세포주 중 하나이다. CHO-K1, DUK-B11, DG44 또는 CHO-DP12 숙주 세포의 경우에, 이들은 발현되는 단백질을 푸코실화하는 능력이 부족하도록 변경될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 숙주 세포는 CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 또는 NSO 세포 또는 림프구 세포로부터 선택된다.
이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균(eubacteria), 예를 들어, 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 예컨대, 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마세스칸스(Serratia marcescans) 및 쉐겔라(Shigella)뿐만 아니라 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스, 예컨대, 피. 애루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 사상균 또는 효모가 또한 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반 빵 효모(common baker's yeast)가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 계통, 예컨대, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위케라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라럼(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus), 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라크라사(Neurosporacrassa); 쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대, 쉬바니오마이세소시덴탈리스(Schwanniomycesoccidentalis); 및 사상균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리엄(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대, 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 일반적으로 입수 가능하고 본 명세서에서 유용하다.
항체를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체가 발현되거나 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
약제학적 조성물
일부 양상에서, 본 개시내용은, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자의 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자의 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자를 암호화하는 핵산 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자의 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자를 발현하는 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
조성물의 성분
약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 약제학적 활성 성분, 예컨대, 다른 항체 또는 약물을 비롯한 하나 이상의 추가적인 성분을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 다른 면역 자극제, 항암제, 항바이러스제 또는 백신과의 병용 요법으로 투여되어 항-D3 항체가 면역 반응을 향상시키도록 할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 매질, 비수성 매질, 항미생물제, 등장제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 킬레이팅제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 기타 당업계에 공지된 다양한 성분의 조합 등을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물의 적합한 성분은, 예를 들어, 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 당 및 사이클로덱스트린 같은 안정화제를 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는, 예를 들어, 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 머캅토 글리세롤, 티오글리콜산, 머캅토 솔비톨, 부틸 메틸 아니솔, 부틸화 하이드록시 톨루엔 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 개시된 바와 같이, 조성물은 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있고, 또한 결합 친화도의 감소를 방지하거나 줄여서 항체 안정성을 향상시키고 저장 수명을 연장시키기 위해서 하나 이상의 항산화제, 예컨대, 메티오닌을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 항산화제, 예를 들어, 메티오닌을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제와 혼합되어 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 산화되는 것을 방지하여 저장 수명을 연장하고/하거나 활성을 증가시킬 수 있는 다양한 방법을 추가로 제공한다.
추가 설명을 위해, 약제학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어, 수성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사, 링거 주사(Ringer's injection), 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사 또는 덱스트로스 및 젖산 링거 주사, 비수성 비히클, 예컨대, 식물 유래 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩, 정균 또는 정진균 농도의 항미생물제, 등장제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스, 완충제, 예컨대, 인산염 또는 시트르산염 완충제, 항산화제, 예컨대, 중황산나트륨, 국소 마취제, 예컨대, 프로카인 염산염, 현탁 및 분산제, 예컨대, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 또는 폴리바이닐피롤리돈, 유화제, 예컨대, 폴리솔베이트 80(TWEEN-80), 격리 또는 킬레이팅제, 예컨대, EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함할 수 있다. 담체로 사용되는 항미생물제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스터, 티메로살(thimerosal), 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 다중 용량 용기의 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질은, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 향상제 또는 아세트산나트륨, 솔비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올레에이트 또는 사이클로덱스트린과 같은 작용제를 포함할 수 있다.
투여, 제형 및 투여량
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비강내, 근육내, 두개내, 심장내, 뇌실내, 기관내, 협측, 직장, 복강내, 피부내, 국소, 경피 및 척추강내 또는 다르게는 이식 또는 흡입에 의한 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 경로에 의해 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 대상 조성물은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있으며; 이것은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 관장제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적절한 제형 및 투여 경로는 의도된 적용 및 치료 요법에 따라 선택될 수 있다.
장내 투여에 적합한 제형은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환제, 코팅 정제를 포함하는 정제, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이의 제어 방출 형태를 포함한다.
비경구 투여(예를 들어, 주사)에 적합한 제형은 수성 또는 비수성, 등장성, 발열원이 없는 멸균 액체(예를 들어, 용액, 현탁액)를 포함하며, 여기서 활성 성분이 (예를 들어, 리포솜 또는 기타 미립자 내에) 용해되거나 현탁되거나 다른 방식으로 제공된다. 이러한 액체는 항산화제, 완충제, 보존제, 안정화제, 정균제, 현탁화제, 증점제 및 제형을 의도된 수용자의 혈액(또는 기타 관련 체액)과 등장성으로 만드는 용질과 같은 기타 약제학적으로 허용 가능한 성분을 추가로 함유할 수 있다. 부형제의 예는, 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등을 포함한다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 등장성 담체의 예는 염화나트륨 주사액, 링거액 또는 젖산 링거 주사액을 포함한다. 유사하게, 용량, 시기 및 반복을 포함하는 특정 투여 요법은 특정 개인 및 해당 개인의 병력뿐만 아니라 약동학(예를 들어, 반감기, 제거율 등)과 같은 경험적 고려 사항에 따라 달라질 것이다.
투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있으며, 증식성 또는 종양원성 세포의 수 감소, 이러한 신생물성(neoplastic) 세포의 감소 유지, 신생물성 세포의 증식 감소, 또는 전이 진행 지연을 기초로 한다. 일부 실시형태에서, 투여량은 잠재적인 부작용 및/또는 독성을 관리하기 위해 조정 또는 약화될 수 있다. 대안적으로, 대상 치료 조성물의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다.
당업자는 적절한 투여량이 환자마다 다양할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 최적의 투여량을 결정하는 것은 일반적으로 위험 또는 유해한 부작용에 대한 치료 이점 수준의 균형을 유지하는 것을 포함한다. 선택된 투여량 수준은 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 약물, 화합물 및/또는 기타 병용되는 물질, 상태의 중증도, 환자의 종, 성별, 연령, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력에 따라 달라질 수 있다. 화합물의 양 및 투여 경로는 궁극적으로 의사, 수의사 또는 임상의의 재량에 달려 있지만 일반적으로 투여량은 작용 부위에서 실질적으로 유해하거나 유해한 부작용 없이 원하는 효과를 위한 국소 농도를 달성하도록 선택될 것이다.
일반적으로, 본 개시내용의 D3-결합 분자는 다양한 범위로 투여될 수 있다. 이것은 용량당 약 5㎍/㎏ 체중 내지 용량당 약 100㎎/㎏ 체중; 용량당 약 50㎍/㎏ 체중 내지 약 5㎎/㎏ 체중; 용량당 약 100㎍/㎏ 체중 내지 약 10㎎/㎏ 체중; 및 이들 범위 내의 임의의 값을 포함한다. 다른 범위는 용량당 약 100㎍/㎏ 체중 내지 약 20㎎/㎏ 체중 및 용량당 약 0.5㎎/㎏ 체중 내지 약 20㎎/㎏ 체중을 포함한다. 특정 실시형태에서, 투여량은 적어도 약 100㎍/㎏ 체중, 적어도 약 250㎍/㎏ 체중, 적어도 약 750㎍/㎏ 체중, 적어도 약 3㎎/㎏ 체중, 적어도 약 5㎎/㎏ 체중, 적어도 약 10㎎/㎏ 체중이다.
임의의 경우에, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상에게 필요에 따라 투여된다. 투여 빈도의 결정은 치료될 대상체의 병태, 치료될 대상체의 연령, 치료될 대상체의 중증도, 치료될 대상체의 일반적인 건강 상태 등을 고려하여 주치의와 같은 당업자에 의해 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 D3-결합 분자를 포함하는 치료 과정은 수 주 또는 수 개월의 기간에 걸쳐 선택된 약물 제품의 다중 투여를 포함할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 D3-결합 분자는 매일, 2일마다, 4일마다, 매주, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 한 번 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 투여량이 변경될 수 있거나 환자 반응 및 임상 관행에 기초하여 투여 간격이 조정될 수 있음이 이해될 것이다.
투여량 및 요법은 또한 1회 이상의 투여를 받은 개체에서 개시된 치료용 조성물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 개체에게 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 치료용 조성물의 증분 투여량이 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여량은 각각 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 점진적으로 증가 또는 감소 또는 감쇠될 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특정 질환, 장애 또는 상태의 마커를 상기에 기재된 바와 같이 따를 수 있다. 암의 경우, 이것은 촉진 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접적인 측정, x-선 또는 기타 영상 기술에 의한 종양 크기의 간접적 측정; 종양 샘플의 직접적인 종양 생검 및 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 간접 종양 마커(예를 들어, 전립선암에 대한 PSA) 또는 종양원성 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 종양과 관련된 언어, 시력, 호흡 또는 기타 장애의 개선; 식욕 증가; 또는 허용된 시험 또는 생존기간 연장에 의해 측정된 삶의 질 증가를 포함한다. 투여량이 개체, 신생물(neoplastic) 상태의 유형, 신생물 상태의 단계, 신생물 상태가 개인의 다른 위치로 전이되기 시작했는지 여부, 및 과거 및 동시 치료의 사용에 따라 다양한 것은 당업자에게 명백할 것이다.
비경구 투여(예를 들어, 정맥내 주사)와 상용성인 제형은 약 10㎍/㎖ 내지 약 100㎎/㎖의 농도로 본 명세서에 개시된 바와 같은 D3-결합 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, D3-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 부분)는 20㎍/㎖, 40㎍/㎖, 60㎍/㎖, 80㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 300㎍/㎖, 400㎍/㎖, 500㎍/㎖, 600㎍/㎖, 700㎍/㎖, 800㎍/㎖, 900㎍/㎖ 또는 1㎎/㎖를 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, D3-결합 분자(항체 또는 이의 항원 결합 부분)의 농도는 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 4㎎/㎖, 5㎎/㎖, 6㎎/㎖, 8㎎/㎖, 10㎎/㎖, 12㎎/㎖, 14㎎/㎖, 16㎎/㎖, 18㎎/㎖, 20㎎/㎖, 25㎎/㎖, 30㎎/㎖, 35㎎/㎖, 40㎎/㎖, 45㎎/㎖, 50㎎/㎖, 60㎎/㎖, 70㎎/㎖, 80㎎/㎖, 90㎎/㎖ 또는 100㎎/㎖를 포함할 것이다.
본 개시내용의 응용분야
본 개시내용의 항체, 항체 조성물 및 방법은, 예를 들어, D3의 검출 또는 면역 반응의 향상을 비롯하여, 다수의 시험관내 및 생체내 활용 및 용도를 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 다양한 상황에서 면역성을 향상시키기 위해서 배양 중인 세포에 시험관내에서 또는 생체외에서 또는 인간 대상체에게, 예를 들어 생체내 투여될 수 있다. 면역 반응은, 예를 들어, 강화, 자극 또는 상향 조절과 같이 조절될 수 있다.
예를 들어, 대상체는 면역 반응의 향상이 필요한 인간 환자를 포함한다. 이 방법은 면역 반응(예를 들어, T-세포 매개 면역 반응)을 증강시켜 치료될 수 있는 장애를 앓고 있는 인간 환자를 치료하는 데 특히 적합하다. 일부 실시형태에서, 방법은 생체내 암 치료에 특히 적합하다. 항원-특이적 면역 강화를 달성하기 위해서, 항-D3 항체를 관심 항원과 함께 투여할 수 있거나 항원이 치료될 대상체(예를 들어, 종양 보유 또는 바이러스 보유 대상체)에 이미 존재할 수 있다. D3에 대한 항체가 다른 작용제와 함께 투여되는 경우 이들 둘은 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 개시내용은 샘플에서 인간 D3 항원의 존재를 검출하는 방법 또는 인간 D3 항원의 양을 측정하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 샘플 및 대조군 샘플을 예를 들어, 항체 또는 이의 일부와 인간 D3 사이에 복합체가 형성될 수 있는 조건 하에서 인간 D3에 특이적으로 결합하는 인간 단클론성 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이어서, 복합체 형성이 검출되는데, 여기서 대조군 샘플과 비교하여 샘플 간의 복합체 형성 차이는 샘플 내에서 인간 D3 항원의 존재를 나타낸다. 더욱이, 본 개시내용의 항-D3 항체는 면역친화성 정제를 통해 인간 D3를 정제하는데 사용될 수 있다.
암을 포함하는 장애의 치료
일부 양상에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 장애 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 일부 양상에서, 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도가 본 명세서에 제공된다. 장애 또는 질환은 암일 수 있다.
악성이든 양성이든, 원발성이든 2차성이든 D3와 관련된 다양한 암은 본 개시내용에 의해 제공된 방법으로 치료 또는 예방될 수 있다. 암은 폐암(다양한 아형, 예를 들어, 소세포폐암 및 비소세포폐암 포함), 부신암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 식도암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 갑상선암, 암종, 육종, 교모세포종 및 다양한 두경부 종양을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 암은, 예를 들어, 소세포 폐암, 대세포 신경내분비 암종, 교모세포종, 유잉 육종 및 신경내분비 표현형을 갖는 암을 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체는 폐암, 예컨대, 기관지성 암종, 비소세포 폐암, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 대세포 암종 및 선암종, 예를 들어, 폐 선암종을 치료하는 데 사용될 수 있다. 폐암은 백금계 작용제(예를 들어, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 토포테칸) 및/또는 탁산(예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀 또는 카바지탁셀)에 난치성, 재발성 또는 내성일 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체에 의해 치료될 암은 또한 대세포 신경내분비 암종(LCNEC), 갑상선 수질암, 교모세포종, 신경내분비 전립선암(NEPC), 고등급 위장췌장암(GEP) 및 악성 흑색종일 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체는 신장에서 발생하는 신경내분비 종양(NET 및 pNET 둘 다), 비뇨생식기(방광, 전립선, 난소, 자궁경부, 자궁내막), 위장관(결장, 위), 갑상선(갑상선 수질암), 폐(소세포 폐암종 및 대세포 신경내분비 암종)을 치료하는 데 사용될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 항-D3 항체는 다음 하위 유형을 포함한 폐암 치료에 특히 효과적이다: 소세포폐암 및 비소세포폐암(예를 들어, 편평세포 비소세포폐암 또는 편평세포 소세포폐암) 및 대세포 신경내분비 암종.
면역 반응의 자극
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 대상체에게 본 개시내용의 D3-결합 분자, 예를 들어, 항-D3 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 투여하여 대상체에서 면역 반응이 향상되도록 하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 향상(예를 들어, 자극)시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 면역 반응을 향상(예를 들어, 자극)시키는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 일부 양상에서, 대상체에서 면역 반응을 향상(예를 들어, 자극)시키기 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-D3 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도가 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
용어 "면역 반응 향상" 또는 이의 문법적 변형은 포유동물의 면역계의 임의의 반응을 자극, 유발, 증가, 개선 또는 증강시키는 것을 의미한다. 면역 반응은 세포 반응(예를 들어, 세포-매개, 예컨대, 세포독성 T 림프구 매개) 또는 체액성 반응(예를 들어, 항체 매개 반응)일 수 있으며, 1차 또는 2차 면역 반응일 수 있다. 면역 반응 향상의 예는 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성 증가 및 세포용해성 T 세포 생성을 포함한다. 면역 반응의 향상은 세포독성 T 림프구 검정, 사이토카인의 방출(예를 들어, IL-2 생산 또는 IFN-γ 생산), 종양 퇴행, 종양 보유 동물의 생존, 항체 생산, 면역 세포 증식, 세포 표면 마커의 발현 및 세포독성을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다수의 시험관내 또는 생체내 측정법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법은 치료되지 않은 포유동물 또는 본 명세서에 개시된 방법으로 치료되지 않은 포유동물에 의한 면역 반응과 비교할 때 포유동물에 의한 면역 반응을 향상시키는 데 유용하다.
D3-결합 분자는 단일요법으로서 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 화학 요법, 방사선요법, 표적 요법 또는 세포 면역요법 등과 병용하여 사용될 수 있다.
화학요법과의 병용 사용
D3-결합 분자(예를 들어, 항-D3 항체)는, 예를 들어, 항암제, 세포독성제 또는 화학치료제를 포함하는 화학치료제와 병용하여 사용될 수 있다.
용어 "항암제" 또는 "항증식제"는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는 데 사용할 수 있는 임의의 작용제를 의미하며, 이것은 세포독성제, 세포정지제, 항혈관신생제, 용적축소제, 화학치료제, 방사선요법 및 방사선 치료제, 표적 항암제, BRM, 치료용 항체, 암 백신, 사이토카인, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 항-전이제 및 면역치료제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 상기 논의된 바와 같은 일부 실시형태에 있어서, 이러한 항암제는 접합체를 포함할 수 있고 투여 전에 개시된 항-D3 항체와 관련될 수 있음이 이해될 것이다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서 선택된 항암제는 조작된 항체의 짝을 이루지 않은 시스테인에 연결되어 본 명세서에 제시된 바와 같은 조작된 접합체를 제공할 것이다. 따라서, 이러한 조작된 접합체는 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 명시적으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 개시된 항암제는 상기에 제시된 바와 같은 상이한 치료제를 포함하는 항-D3 접합체와 병용하여 제공될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포독성제"는 세포에 독성이 있고 세포의 기능을 감소 또는 저해하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 일부 실시형태에서, 이러한 물질은 살아있는 유기체로부터 유래된 자연 발생 분자이다. 세포독성제의 예는 박테리아의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소(예를 들어, 디프테리아 독소, 슈도모나스 내독소 및 외독소 포도상구균 장독소 A), 진균(예를 들어, α-사르신(α-sarcin), 레스트릭토신(restrictocin)), 식물(예를 들어, 아브린(abrin), 리신(ricin), 모데신(modeccin), 비스큐민(viscumin), 포케위드 항바이러스 단백질(pokeweed anti-viral protein), 사포린(saporin), 젤로닌(gelonin), 모모리딘(momoridin), 트라이코산틴, 보리 독소, 아루리트 포디 단백질(Aleurites fordii proteins), 다이안틴 단백질(dianthin protein), 파이토라카 메리카나(Phytolacca mericana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모몰디카 카란티아(Momordica charantia) 저해제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 저해제, 젤로닌(gelonin), 미테겔린(mitegellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 네오마이신(neomycin) 및 트라이코테센(tricothecene)) 또는 동물(예를 들어, 세포독성 RNase, 예컨대, 세포외 췌장 RNase; DNase I, 이의 단편 및/또는 변이체 포함)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 목적을 위해, "화학치료제"는 암 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 비특이적으로 감소시키거나 저해하는 화학적 화합물(예를 들어, 세포독성제 또는 세포정지제)을 포함한다. 이러한 화학 작용제는 종종 세포 성장 또는 분열에 필요한 세포내 과정으로 유도되므로, 따라서 일반적으로 빠르게 성장하고 분열하는 암 세포에 특히 효과적이다. 예를 들어, 빈크리스틴은 미세소관을 탈중합시켜 세포가 유사분열에 들어가는 것을 저해한다. 일반적으로, 화학치료제는 암세포 또는 암이 될 가능성이 있는 세포 또는 종양원성 자손(예를 들어, TIC)을 생성할 가능성이 있는 세포를 저해하거나 저해하도록 설계된 임의의 화학 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 작용제는 종종 투여되며, 예를 들어, CHOP 또는 FOLFIRI와 같은 요법과 병용하는 것이 가장 효과적인 경우가 많다.
본 개시내용의 D3-결합 분자(예를 들어, 항-D3 항체)와 병용하여 사용될 수 있는 항암제(부위 특이적 접합체의 성분으로서 또는 비접합 상태로)의 예는 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 아세토게닌, 캄프토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 크립토피신, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘레우테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴, 스폰지스타틴, 니트로젠 머스타드, 항생제, 엔디인 항생제, 다이네미신, 비스포스포네이트, 에스페라미신, 크로모프로테인 엔디인 안티바이오틱 크로모포어, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN®, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 케라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물, 에를로티닙, 베무라페닙, 크리조티닙, 소라페닙, 이브루티닙, 엔잘루타마이드, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 안드로겐, 항-아드레날, 엽산 보충제, 예컨대, 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파마이드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트락세이트, 데포파민, 데메콜신, 다이아지쿠온, 엘포르니틴, 엘립티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 렌티난, 로니다이닌, 메이탄시노이드, 미토구아존, 미톡산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필린산, 2-에틸하이드라자이드, 프로카바진, PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유젠 소재), 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 클로란부실; GEMZAR® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE® 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11), 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오르메틸오르니틴; 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린; 옥살리플라틴; 세포증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 저해제 및 이들 중 임의의 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 또한 이 정의에는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 저해하는 아로마타제 저해제, 항-안드로겐과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제; 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-다이옥솔란 뉴클레오사이드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 예컨대, VEGF 발현 저해제 및 HER2 발현 저해제; 백신, PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포아이소머라제 1 저해제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 및 이들 중 임의의 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
방사선요법과의 병용 사용
본 개시내용은 또한 D3-결합 분자와 방사선 요법(예를 들어, 감마선 조사, X선, UV 조사, 마이크로파, 전자적 방출 등과 같은 종양 세포 내에서 DNA 손상을 국소적으로 유도할 수 있는 임의의 메커니즘)을 제공한다. 종양 세포로의 방사성 동위원소의 직접전인 전달을 사용하는 병용 요법이 또한 고려되고, 개시된 D3-결합 분자는 표적화된 항암제 또는 다른 표적화 수단과 관련하여 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선 요법은 약 1 내지 약 2주의 기간에 걸친 펄스로 투여된다. 방사선 요법은 약 6 내지 7주 동안 두경부암이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 방사선 요법은 단일 용량 또는 다중 연속 용량으로 투여될 수 있다.
진단
본 개시내용은 증식성 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 시험관내 및 생체내 방법 및 종양원성 세포를 포함하는 종양 세포를 식별하기 위해 환자로부터 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 암의 치료를 위해서 또는 암의 진행을 모니터링 하기 위해서 암을 갖는 개체를 식별하는 방법을 포함하며, 이 방법은 환자 또는 환자로부터 얻은 샘플(생체내 또는 시험관내)을 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-D3 항체와 접촉시키는 단계 및 샘플에서 결합되거나 또는 유리된 표적 분자에 대한 항체의 회합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-D3 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자를 포함할 것이다.
일부 실시형태에서, 항-D3 항체와 샘플 내 특정 세포의 회합은 샘플이 종양원성 세포를 함유하여, 암을 앓고 있는 개체가 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-D3 항체로 효과적으로 치료될 수 있음을 나타낼 수 있다.
샘플은 다수의 검정, 예를 들어, 방사면역검정, 효소 면역검정(예를 들어, ELISA), 경쟁 결합 검정, 형광 면역검정, 면역블롯 검정, 웨스턴 블롯 분석 및 유세포 분석법 검정에 의해서 분석될 수 있다. 상용성 생체내 치료 또는 진단 검정은 당업계에 인식된 영상화 또는 모니터링 기술, 예를 들어, 당업자에서 알려진 바와 같은 자기공명영상, 컴퓨터 단층촬영(예를 들어, CAT 스캔), 양전자 단층촬영(예를 들어, PET 스캔), 방사선 촬영, 초음파 등을 포함할 수 있다.
약제학적 팩 및 키트
하나 이상의 용량의 D3-결합 분자를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 및 키트가 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여량이 제공되며, 단위 투여량은 하나 이상의 추가 작용제의 존재 또는 부재 하에, 예를 들어, D3-결합 분자를 미리 결정된 양으로 함유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 단위 투여량은 주사용 1회용 사전충전형 주사기로 공급된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여량에 함유된 조성물은 식염수, 수크로스 등; 완충제, 예컨대, 인산염 등을 포함할 수 있고/있거나; 안정적이고 효과적인 pH 범위 내에서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 조성물은 적절한 액체, 예를 들어, 멸균수 또는 식염 용액의 첨가 시 재구성될 수 있는 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 수크로스 및 아르기닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질 응집을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 용기(들) 상에 또는 이와 회합된 라벨은 동봉된 조성물이 선택된 신생물 질환 상태를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다.
본 개시내용은 또한 D3-결합 분자의 단일-용량 또는 다중-용량 투여 단위 및 선택적으로 하나 이상의 항암제를 생성하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 용기와 용기 상에 또는 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있고 약제학적 유효량의 개시된 D3-결합 분자를 접합된 또는 비접합된 형태로 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용기(들)는 멸균 접근 포트(sterile access port)를 포함한다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 이러한 키트는 일반적으로 적합한 용기에 접합된 또는 비접합된 형태의 D3-결합 분자의 약제학적으로 허용 가능한 제형 및 선택적으로 동일하거나 상이한 용기에 하나 이상의 항암제를 포함할 것이다. 키트는 또한 진단 또는 병용 요법을 위해 다른 약제학적으로 허용 가능한 제형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 D3-결합 분자 이외에, 이러한 키트는 다양한 항암제, 예컨대, 화학요법 약물 또는 방사선요법 약물; 항혈관신생제; 항전이제; 표적항암제; 세포독성제; 및/또는 기타 항암제 중 임의의 하나 이상을 함유할 수 있다.
예를 들어, 키트는 추가 성분의 존재 또는 부재 하에 D3-결합 분자를 함유하는 단일 용기를 가질 수 있거나, 이들은 각각의 목적하는 작용제를 위한 별개의 용기를 가질 수 있다. 접합을 위해 조합된 치료제가 제공되는 경우, 단일 용액이 몰당량의 조합으로 또는 한 성분이 다른 성분보다 과량으로, 미리 혼합될 수 있다. 대안적으로, 키트의 접합체 및 임의의 선택적인 항암제는 환자에게 투여하기 전에 별개의 용기 내에서 별도로 유지될 수 있다. 키트는 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection: BWFI), 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS), 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 멸균된 약제학적으로 허용 가능한 완충제 또는 기타 희석제를 함유하기 위한 제2/제3 용기 수단을 또한 포함할 수 있다.
키트의 성분이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 바람직하게는 수성 용액, 예를 들어, 멸균 수용액 또는 식염수 용액이다. 그러나 키트의 성분은 건조 분말(들)로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조 분말로 제공되는 경우 적합한 용매를 첨가하여 분말을 재구성할 수 있다. 용매는 또한 다른 용기에 제공될 수 있다고 여겨진다.
상기에 간략히 제시된 바와 같이 키트 또한 D3-결합 분자 및 임의의 선택적인 성분을 환자에게 투여하기 위한 수단, 예를 들어, 하나 이상의 바늘, I.V. 백 또는 주사기 또는 심지어는 점안기(eye dropper), 피펫 또는 기타 이러한 유사한 장치를 포함할 수 있으며, 이로부터 제형은 동물에게 주사 또는 도입되거나 신체의 병든 부위에 도포될 수 있다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 바이알 등 및 상업적 판매를 위해 밀폐된 다른 성분, 예를 들어, 목적하는 바이알 및 기타 장치가 그 안에 배치되거나 보유된 주사 또는 취입 성형된 플라스틱 용기를 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다.
서열 목록 요약
본 출원에는 다수의 아미노산 서열을 포함하는 서열 목록이 첨부되어 있다. 다음 표 A 내지 F는 포함된 서열의 요약을 제공한다. 예시적인 항체는 본 개시내용에서 집합적으로 "WBPT1156 항체"라고 지칭된다.
[표 A]
[표 B]
[표 C]
[표 D]
[표 E]
[표 F]
실시예
따라서 일반적으로 기재된 본 개시내용은 예시로서 제공되고 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아닌 다음 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 아래 실험이 수행된 실험 전체 또는 유일한 실험임을 나타내려는 의도가 아니다.
실시예 1
항원, 벤치마크 항체 및 세포주의 제조
1.1 항원 생성
시노몰거스 D3(Uniprot No. A0A2K5WSR4) 및 마우스 D3(Uniprot No. O88516)의 세포외 도메인(ECD) 서열을 암호화하는 DNA 서열을 Sangon Biotech(중국 상하이 소재)에서 합성한 후, N-말단에 MBP 태그가 있고 C-말단에 AVI-His 태그 또는 인간 Fc 태그가 있는 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 인간 D3(Uniprot No. Q9NYJ7)을 AcroBiosystems(Cat. DL3-H52H4)으로부터 구입하였다.
인간 D3의 절단된 아이소폼을 암호화하는 DNA 서열(WO 2017/021349에 개시됨)을 Sangon Biotech(중국 상하이 소재)에서 합성한 후, C-말단에 MBP 태그 및 AVI-His 태그를 갖는 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
Expi293 세포(Invitrogen-A14527)에 정제된 발현 벡터를 형질주입하였다. 세포를 5일 동안 배양하고, Ni-NTA 칼럼(GE Healthcare, Cat. 175248) 또는 Protein A 칼럼(GE Healthcare, Cat. 175438)을 사용하여 단백질 정제를 위해 상청액을 수집하였다. 얻은 마우스 D3, 시노몰거스 D3 및 절단된 인간 D3를 SDS-PAGE 및 SEC로 분석한 후 -80℃에서 저장하였다.
인간 D3(ACRO DL3-H52H4)를 WT115-hPro1.ECD.His로 명명하였다. 얻은 마우스 D3를 WT115-MBP-mPro1.ECD.hFc로 명명하였다. 인간 D3 단백질은 Delta/Serrate/LAG-2(DSL) 도메인, 6개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 반복부(EGF 도메인), 및 막관통 도메인을 특징으로 한다. 인간 D3의 절단된 아이소폼을 WT115-hPro1.V1.ECD.MBP.AVI.His (DSL 도메인 + EGF1-6 도메인 + 막 근위부), WT115-hPro1.V2.ECD.MBP.AVI.His(EGF1-6 도메인 + 막 근위부), WT115-hPro1.V3.ECD.MBP.AVI.His(EGF2-6 도메인 + 막 근위부), WT115-hPro1.V4.ECD.MBP.AVI.His(EGF3-6 도메인 + 막 근위부), WT115-hPro1.V5.ECD.MBP.AVI.His(EGF4-6 도메인 + 막 근위부), WT115-hPro1.V6.ECD.MBP.AVI.His(EGF5-6 도메인 + 막 근위부), WT115-hPro1.V7.ECD.MBP.AVI.His(EGF6 도메인 + 막 근위부)로 명명하였다. 절단된 단백질의 다이어그램을 도 7c에 도시한다.
1.2 BMK 항체의 발현 벡터의 작제
2개의 항-D3 항체를 벤치마크 항체로 사용하였고, 본 명세서에서는 WT115-BMK1 및 WT115-BMK2로 지칭하였다. WT115-BMK1(US 2019/0046656에서 서열번호 212 및 서열번호 213) 및 WT115-BMK2(WO 2017/021349에서 서열번호 37 및 서열번호 38)의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열 Sangon Biotech(중국 상하이 소재)에서 합성한 후 인간 IgG1의 Fc 영역을 암호화하는 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
VH 및 VL 유전자를 함유하는 플라스미드를 Expi293 세포에 공동 형질주입시켰다. 세포를 5일 동안 배양하고, Protein A 칼럼(GE Healthcare, 175438)을 사용하여 단백질 정제를 위해 상청액을 수집하였다. 얻은 항체를 SDS-PAGE와 SEC로 분석한 후 -80℃에 저장하였다.
1.3 안정적인 세포주/세포풀의 확립
Lipofectamine 2000을 사용하여 293F 세포에 전장 인간 D3을 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터(UniProt, Q9NYJ7-1)를 형질주입시켰다. Flpin293 세포에 전장 시노몰거스 D3을 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터를 형질주입시켰다. 세포를 적절한 선택 마커를 함유하는 배지에서 배양하였다. 제한된 희석 후 인간 D3 고발현 안정 세포주(WT115-293F.hPro1.2E5)를 선택하고, 적절한 선택 항생제를 사용하여 시노몰거스 D3 고발현 안정 세포풀(WT115.Flpin293.cPro1.pool)을 선택하였다.
1.4 항체 바이오티닐화
NHS-PEO4-바이오티닐화를 위해, 1 내지 10㎎/㎖의 항체(IgG)를 20배 몰 과량의 NHS-PEO4-바이오틴 시약과 함께 25℃에서 75분 동안 금속 욕조 또는 얼음 위에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 탈염 스핀 칼럼을 사용하여 과량의 바이오틴을 제거하고, 통과액으로부터 정제된 단백질 샘플을 수집하였다. 단백질 내 바이오틴 혼입 수준을 HABA 검정에 의해 결정하였다: 바이오틴화된 샘플을 HABA/Avidin 용액으로 10배 희석시키고, A500에서 혼합 용액의 흡광도를 측정한다. 단백질 1몰당 바이오틴의 몰수를 A500 값을 기준으로 계산하였다.
실시예 2
VHH-포함 WBPT1156 항체의 생산
2.1 항-D3 VHH의 생성
낙타과 동물의 면역화 및 파지 디스플레이 기술에 의해 항-D3 VHH를 생성시켰다. 간략하면, 알파카(Vicugna pacos)를 hFc 태그된 인간 D3 ECD 단백질(ACRO, DL3-H5255)로 피하 면역화하였다. 면역화 후, VHH 단편을 디스플레이하는 파지 라이브러리 작제를 위해 말초 혈액을 수집하였다. 상응하는 표적 ECD 단백질을 사용한 바이오-패닝 후, D3에 결합하는 양성 VHH 클론을 선택하였다.
2.2 VHH 서열결정
이. 콜라이 상청액을 이용한 표적 특이적 결합 ELISA 및 FACS에 의해 선택된 양성 이. 콜라이 클론을 VHH 유전자의 뉴클레오타이드 서열결정을 위해 Biosune(중국 상하이 소재)에 보냈다. CLC Main Workbench(Qiagen, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 서열결정 결과를 분석하였다. 4개의 고유한 양성 VHH 클론의 서열은 표 A 및 B에 제시된 WT1156-P3R2-1C2, WT1156-P3R2-1C9, WT1156-P3R2-1H6 및 WT1156-P8R2-1H1이었다.
2.3 VHH를 포함하는 인간 Fc 융합 항체의 생성
4개의 고유한 양성 VHH 클론을 VHH-Fc(hIgG1) 융합 항체로 전환하였다. 간략하면, VHH 유전자를 적절한 제한 부위를 함유하는 VHH-특이적 클로닝 프라이머를 사용하여 pET-bac 벡터로부터 PCR 증폭시킨 후, 변형된 인간 hIgG1 발현 pcDNA3.3 벡터 내로의 융합에 의해서 클로닝시켜 VHH-Fc(hIgG1) 키메라의 상응하는 클론을 생성하였다. 293F 또는 Expi293 세포에 항체 발현용 벡터를 일시적으로 형질주입하였다. 항체를 함유하는 세포 배양 상청액을 수거하고, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제시켰다. 생성된 항체를 각각 "WT1156-P3R2-1C2-uIgG1", "WT1156-P3R2-1C9-uIgG1", "WT1156-P3R2-1H6-uIgG1" 및 "WT1156-P8R2-1H1-uIgG1"로 명명하였다. 얻은 항체를 SDS-PAGE와 HPLC-SEC로 분석한 후 -80℃에 저장하였다.
2.4 인간화
VHH 인간화를 "Best Fit" 접근법으로 수행하였다. 간략하면, VHH 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 V-유전자 데이터베이스에 대해 블라스팅하고, Kabat CDR 정의를 사용하여 상위 히트의 인간 CDR 서열을 VHH CDR 서열로 대체함으로써 인간화 VHH 서열을 생성하였다. 그런 다음 항체 친화성 또는 개발 가능성에 중요한 역할을 하는 프레임워크의 핵심 잔기를 모 잔기 단독으로 또는 조합하여 역돌연변이시켰다. 변이체를 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화된 후 GENEWIZ(중국 쑤저우 소재)에 의해 합성하였다. 설계된 VHH 변이체 및 모 VHH 단백질을 인간 IgG1 발현 벡터에 클로닝하여 인간 IgG1 작제물을 생성시켰다. HEK293 세포에서 항체를 생산하고 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제시켰다. 목적하는 친화성을 갖는 변이체를 최종적으로 인간화 리드로 선택하였다.
3개의 고유한 인간화 D3 항체인 WT1156-P3R2-1C2-z102-uIgG1, WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1 및 WT1156-P3R2-1H6-z100-uIgG1의 서열을 또한 표 A 및 표 B에 제시한다.
실시예 3
D3-결합 항체의 특징규명
3.1 ELISA에 의한 인간 D3 결합
플레이트를 웰당 1㎍/㎖, 100㎕의 WT115-hPro1.ECD.His로 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 항원을 스톡 용액으로부터 코팅 완충액(0.02M Na2CO3 및 0.18M NaHCO3, pH9.2)으로 희석하였다. 다음날, 플레이트를 1×PBST(0.05% tween-20 함유 PBS)를 사용하여 1회 세척하고, 1×PBS/2%BSA 200㎕를 첨가하여 차단을 수행하였다. 항체를 차단 완충액에 연속 희석하였다(20nM에서 0.00128nM까지 5배 연속 희석). 1시간 차단 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 3회 세척한 후, 항체를 플레이트에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 인간 D3에 대한 항체의 결합을 1:10000의 농도로 1xPBS/2%BSA에 희석된 HRP-표지된 2차 항체(Bethyl, A80-304P)에 의해 검출하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 6회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 분배하여 발색시킨 후, 2M HCl 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nm 및 540nm에서 흡광도를 판독하였다. 항-인간 D3 항체 WT115-BMK1 및 WT115-BMK2를 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 아이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다.
도 1 및 표 1에 제시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-uIgG1, WT1156-P3R2-1C9-uIgG1, WT1156-P3R2-1H6-uIgG1 및 WT1156-P8R2-1H1-uIgG1은, WT115-BMK1 및 WT115-BMK2와 유사하게, 고정된 인간 D3에 강하게 결합할 수 있다. WT1156 항체의 EC50은 0.013nM 내지 0.026nM 범위이다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.0094nM 및 0.011nM이다.
3.2 FACS에 의한 인간 D3 결합
WT115-293F.hPro1.2E5 세포(1×105개 세포/웰)를 다양한 농도의 항체(200nM에서 0.0128nM까지 5배 연속 희석)와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1×PBS/1%BSA로 세척한 후, 2차 항체인 R-PE-표지된 염소 항-인간 IgG(1:150, Jackson ImmunoResearch, 109-115-098)를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 어둠 속에서 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 항-인간 D3 항체 WT115-BMK1 및 WT115-BMK2를 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 아이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 세척하고, 4% 파라폼알데하이드에 재현탁시켰다. 세포의 MFI를 유세포 분석기로 측정하고 FlowJo로 분석하였다.
도 2a 및 표 1에 제시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-uIgG1, WT1156-P3R2-1C9-uIgG1, WT1156-P3R2-1H6-uIgG1 및 WT1156-P8R2-1H1-uIgG1은, WT115-BMK2와 유사하게, 인간 D3 발현 세포에 결합할 수 있다. WT1156 항체의 EC50은 0.15nM 내지 0.52nM 범위이다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.019nM 및 0.54nM이다.
도 2b에 도시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-z102-uIgG1 및 WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1은 각각 0.088nM 및 0.14nM의 EC50으로 인간 D3 발현 세포에 강하게 결합할 수 있다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.03nM 및 0.52nM이다. WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG 및 두 BMK 항체의 데이터를 또한 표 2에 요약한다.
3.3 FACS에 의한 시노몰거스 원숭이 D3 결합
WT115-Flpin293.cPro1.pool 세포(1×105개 세포/웰)를 다양한 농도의 항체(10nM에서 0.00061nM까지 4배 연속 희석)와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1×PBS/1%BSA로 세척한 후, 2차 항체인 Alexa Fluor 647-표지된 염소 항-인간 IgG(1:150, Jackson ImmunoResearch, 109-605-098)를 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 어둠 속에서 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 항-인간 D3 항체 WT115-BMK1 및 WT115-BMK2를 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 아이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 1×PBS/1%BSA로 세척하고, 4% 파라폼알데하이드에 재현탁시키고, 어두운 곳에서 4℃에서 0.5시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 그런 다음 완충액을 1×PBS/1%BSA로 변경하고, 세포를 여과하였다. 세포의 MFI를 유세포 분석기로 측정하고 FlowJo로 분석하였다.
도 3a 및 표 1에 제시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-uIgG1, WT1156-P3R2-1C9-uIgG1, WT1156-P3R2-1H6-uIgG1 및 WT1156-P8R2-1H1-uIgG1은, WT115-BMK1 및 WT115-BMK2와 유사하게, 시노몰거스 원숭이 D3 발현 세포에 결합할 수 있다. WT1156 항체의 EC50은 0.12nM 내지 0.44nM 범위이다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.019nM 및 0.20nM이다.
도 3b에 도시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-z102-uIgG1, WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1 및 WT1156-P3R2-1H6-z100-uIgG1은 각각 0.083nM, 0.096nM 및 0.42nM의 EC50으로 시노몰거스 원숭이 D3 발현 세포에 강하게 결합할 수 있다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.019nM 및 0.20nM이다. WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG 및 두 BMK의 데이터를 또한 표 2에 요약한다.
3.4 ELISA에 의한 마우스 D3 결합
플레이트를 웰당 1㎍/㎖, 100㎕의 WT115-MBP-mPro1.ECD.hFc로 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 항원을 스톡 용액으로부터 코팅 완충액으로 희석하였다. 다음날, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 1회 세척하고, 1×PBS/2%BSA 200㎕를 첨가하여 차단을 수행하였다. 항체를 차단 완충액에 연속 희석하였다(20nM에서 0.000256nM까지 5배 연속 희석). 1시간 차단 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 3회 세척한 후, 항체를 플레이트에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-인간 D3 항체 WT115-BMK1-Biotin 및 WT115-BMK2-Biotin을 양성 대조군으로서 사용하였다. WT114-BMK1-Biotin 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 고정된 마우스 D3에 대한 항체의 결합을 1:30000의 농도로 1×PBS/2%BSA에 희석된 HRP-표지된 2차 항체(Invitrogen, SNN1004)에 의해 검출하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 6회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 분배하여 발색시킨 후, 2M HCl 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nm 및 540nm에서 흡광도를 판독하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다.
도 4a에 제시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-uIgG1은, WT115-BMK1과 유사하게, 고정된 마우스 D3에 강하게 결합할 수 있다. WT1156-P3R2-1C2-uIgG1의 EC50은 0.0092nM이다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.0039nM 및 0.014nM이다.
도 4b에 도시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-z102-uIgG1 및 WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1은 각각 0.0067nM 및 0.0075nM의 EC50으로 마우스 D3 단백질에 강하게 결합할 수 있다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.0039nM 및 0.014nM이다. WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG 및 두 BMK의 데이터를 또한 표 2에 요약한다.
3.5 내재화
WT115-293F.hPro1.2E5 세포(4×104개 세포/웰)를 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 원심분리 후 배지를 플레이트로부터 제거하였다. 1× 최종 최대 농도의 1차 항체(40nM에서 0.00256nM까지 5배 연속 희석 또는 200nM에서 0.0128nM까지 5배 연속 희석) 및 pHrodo(아민 반응성, Thermo Fisher, P36011) 표지된 2차 항체(Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, 109-006-098, 비율 = 1:1 분자) 희석액을 세포 배양 배지가 포함된 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-인간 D3 항체 WT115-BMK1 및 WT115-BMK2를 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 아이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 인큐베이션 후, 세포를 시약(세포 핵-Hoechst33342, 1000ng/㎖, cytoplasm-Calcein AM, DPBS에서 1:2000 희석)으로 염색하고, 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로, Operatta CLS로 세포의 사진을 촬영하고, 항체 세포내이입을 "세포당 스팟"의 매개변수로 분석하였다.
도 5a 및 표 1에 제시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-uIgG1, WT1156-P3R2-1C9-uIgG1, WT1156-P3R2-1H6-uIgG1 및 WT1156-P8R2-1H1-uIgG1은, WT115-BMK1 및 WT115-BMK2와 유사하게, 인간 원숭이 D3 발현 세포에서 용량 의존적 내재화 효력을 나타내었다. WT1156 항체의 EC50은 0.46nM 내지 0.95nM 범위이다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 0.19nM 및 0.58nM이다.
도 5b 및 표 2에 제시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1은 12.2nM의 EC50으로 인간 D3 발현 세포에서 용량 의존적 내재화 효력을 나타내었다. WT115-BMK1 및 WT115-BMK2의 EC50은 각각 3.47nM 및 14.4nM이다.
3.6 항-D3 항체의 동력학적 결합 친화도
인간 D3 ECD 단백질에 대한 항-D3 항체의 결합 친화도를 Biacore T200을 사용한 SPR 검정에 의해 검출하였다. 시험된 각각의 항체를 항-인간 IgG Fc 항체 고정전 CM5 센서 칩GE)에 포획하였다. 상이한 농도의 WT115-hPro1.ECD.His를 180초의 회합 단계 동안 30㎕/분의 유량으로 센서 칩 상에 주입한 후 3600초의 해리를 수행하였다. 각각의 결합 주기 후에 칩을 10mM 글리신(pH 1.5)에 의해 재생시켰다.
표 3에 나타난 바와 같이, 인간 D3에 대한 실험 데이터는 정상 상태 친화도 모델에 의해 피팅되었다. 인간 D3에 대한 WT-115-BMK1의 실험 데이터는 이종 리간드 모델에 의해 피팅되었다. 다른 실험 데이터는 Langmiur 분석을 사용하여 1:1 모델로 피팅되었다. 블랭크 표면과 완충액 채널의 센서그램을 시험 센서그램에서 차감하였다. 34KDa의 분자량을 사용하여 분석물의 몰 농도를 계산하였다. 인간 D3에 대한 시험된 항체의 친화도를 표 3에 나타낸다.
3.7 경쟁 ELISA에 의한 에피토프 비닝
플레이트를 웰당 1㎍/㎖, 100㎕의 WT115-hPro1.ECD.His로 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 항원을 스톡 용액으로부터 코팅 완충액(0.02M Na2CO3 및 0.18M NaHCO3, pH9.2)으로 희석하였다. 다음날, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 1회 세척하고, 1×PBS/2%BSA 200㎕를 사용하여 차단을 수행하였다. VHH 항체를 차단 완충액에 연속 희석하고(10nM에서 0.00013nM까지 5배 연속 희석), 일정한 농도의 전체 IgG 항체(0.02nM)와 사전 혼합하였다. 1시간 차단 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 3회 세척한 후, VHH 항체/전체 IgG 항체 혼합물을 플레이트에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 인간 D3에 대한 전체 IgG 항체의 결합을 1:10000의 농도로 1×PBS/2%BSA에 희석된 HRP-표지된 2차 항체(Bethyl, A80-304P)에 의해 검출하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 6회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 분배하여 발색시킨 후, 2M HCl 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nm 및 540nm에서 흡광도를 판독하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다.
도 6a에 도시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2.uIgG1은 ELISA에 의해 시험된 인간 D3-ECD 단백질에 대한 결합에 대해 다른 3개의 WBPT1156 항체와 경쟁하지 않는다. 그리고 도 6b에 도시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1H6-uIgG1은 인간 D3-ECD 단백질에 대한 결합에 대해 WT1156-P8R2-1H1-uIgG1 및 WT1156-P3R2-1C9-uIgG1과 경쟁할 수 있다. 도 6c는 WT1156-P8R2-1H1-uIgG1이 WT1156-P3R2-1C9-uIgG1과 경쟁할 수 있음을 나타낸다. 도 6d에 도시된 바와 같이, WBPT1156 4 항체는 WT115-BMK1과 경쟁하지 않는다.
3.8 절단된 D3 단백질을 사용한 ELISA에 의한 결합
WT1156 항체의 결합 에피토프를 1.1 및 도 7c에 기재된 바와 같이, 절단된 D3 단백질을 사용하여 ELISA로 시험하였다. 플레이트를 항체 또는 항원으로 사전 코팅하여 ELISA 시험을 수행하였다. 결과를 각각 도 7a와 도 7b에 나타낸다.
사전 코팅된 항체를 사용한 ELISA의 경우, ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 웰당 2㎍/㎖, 100㎕의 항체로 사전 코팅하였다. 항체를 스톡 용액으로부터 코팅 완충액(0.02M Na2CO3 및 0.18M NaHCO3, pH9.2)으로 희석하였다. 다음날, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 1회 세척하고, 1×PBS/2%BSA 200㎕를 사용하여 차단하였다. 그런 다음 차단 완충액에 희석된 일정한 농도의 전장 DLL ECD 단백질(WT115-hPro1.ECD.His)(3㎍/㎖) 또는 절단된 D3 단백질(3㎍/㎖ 또는 6㎍/㎖)을 첨가하였다. 1시간 차단 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 3회 세척한 후, 항원을 플레이트에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 WBPT1156 항체에 대한 항원의 결합을 1:2000의 농도로 1×PBS/2%BSA에 희석된 HRP-표지된 2차 항체(GenScript, A00612)에 의해 검출하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 6회 세척하였다. 100㎕의 TMB 기질을 분배하여 발색시켰다. 2M HCl로 발색 반응을 중단시키고, 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nm 및 540nm에서 흡광도를 판독하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다. 결과를 도 7a에 나타낸다.
사전 코팅된 항원을 사용한 ELISA의 경우, ELISA 플레이트를 웰당 100㎕의 WT115-hPro1.ECD.His(2㎍/㎖) 또는 절단된 D3 단백질(2㎍/㎖ 또는 5㎍/㎖)로 밤새 4℃에서 사전 코팅하였다. 항원을 스톡 용액으로부터 코팅 완충액(0.02M Na2CO3 및 0.18M NaHCO3, pH9.2)으로 희석하였다. 다음날, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 1회 세척하고, 1×PBS/2%BSA 200㎕를 사용하여 차단을 수행하였다. 일정한 농도의 항체(2㎍/㎖)를 차단 완충액에 희석하였다. 1시간 차단 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 3회 세척한 후, 항체를 플레이트에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 인간 D3에 대한 항체의 결합을 1:10000의 농도로 1×PBS/2%BSA에 희석된 HRP-표지된 2차 항체(Bethyl, A80-304P)에 의해 검출하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 6회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 분배하여 발색시킨 후, 2M HCl 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nm 및 540nm에서 흡광도를 판독하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다. 결과를 도 7b에 나타낸다.
도 7a 및 7b에 제시된 바와 같이, WT1156-P3R2-1C2-uIgG1은 WT115-hPro1.V1.ECD.MBP.AVI.His, WT115-hPro1.V2.ECD.MBP.AVI.His에 결합하고 WT115-hPro1.V3.ECD.MBP.AVI.His에 부분적으로 결합하며 다른 아이소폼에는 결합하지 않는데, 이는 이의 결합 에피토프가 EGF1-2에 위치함을 나타낸다. WT1156-P3R2-1C9-uIgG1 및 WT1156-P3R2-1H6-uIgG1은 WT115-hPro1.ECD.His에 결합하지만 절단된 D3 아이소폼에는 결합하지 않는데, 이는 이들 두 항체의 결합 에피토프가 N-말단에 위치함을 나타낸다. WT1156-P8R2-1H1-uIgG1의 경우, 사전 코팅된 항체를 사용하여 ELISA로 시험한 경우 이것은 WT115-hPro1.ECD.His에 대한 결합을 나타내지만 절단된 D3 아이소폼에는 결합하지 않음을 나타내고(도 7a); 도 7b에 제시된 바와 같이, 사전 코팅된 항원을 사용하여 ELISA로 시험한 경우, WT1156-P8R2-1H1-uIgG1은 WT115-hPro1.V1.ECD.MBP.AVI.His 및 WT115-hPro1.V2.ECD.MBP.AVI.His에 대한 결합을 나타내지만 다른 아이소폼에는 결합을 나타내지 않았는데, 이는 이의 결합 에피토프가 N-term-DSL-EGF-1에 위치할 가능성을 나타낸다. ELISA 결합 결과는 WT115-BMK1이 DSL 도메인에 결합하고 WT115-BMK2가 EGF-3 도메인에 결합한다는 것을 나타내는데, 이는 각각 US 2019/0046656 및 WO 2017/021349에 제시된 결과와 일치한다.
3.9 항-인간 D3 항체의 크로스-패밀리 결합
플레이트를 웰당 1㎍/㎖, 100㎕의 WT115-hPro1.ECD.His, WT115-hPro2.ECD.His(인간 D1, SinoBiological, Cat: 11635-H08H) 또는 WT115-hPro3.ECDHis(인간 D4, SinoBiological, Cat: 10171-H08H)로 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 항원을 스톡 용액으로부터 코팅 완충액(0.02M Na2CO3 및 0.18M NaHCO3, pH9.2)으로 희석하였다. 다음날, 플레이트를 1×PBST(0.05% tween-20 함유 PBS)를 사용하여 1회 세척하고, 웰당 1×PBS/2%BSA 200㎕를 첨가하여 차단을 수행하였다. 차단 동안, BMK 및 WT1156 항체를 차단 완충액에서 10nM로 희석하였고, WT115-cAbs(WT115-cAb1은 SinoBiological에서 구입한 항-D1 항체임, Cat: 11635-MM07; WT115-cAb2는 SinoBiological에서 구입한 항-D4 항체임, Cat: 10171-MM15)을 1000배로 희석하였다. 1시간 차단 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 3회 세척한 후, 희석된 항체를 플레이트에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 인간 D3에 대한 항체의 결합을 1:10000으로 1×PBS/2%BSA에 희석된 염소 항-인간 IgG-Fc 단편 교차 흡수 항체 HRP(Bethyl, A80-304P) 및 마우스 IgG-Fc 단편 교차 흡착 항체 HRP(Bethyl, A90-231P)에 의해 검출하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 6회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 분배하여 발색시킨 후, 2M HCl 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nm 및 540nm에서 흡광도를 판독하였다. WT115-cAb1 및 cAb2를 각각 항-인간 D1 및 D4 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 아이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다.
도 8에 제시된 바와 같이, WBPT1156 항체는 인간 D1 또는 인간 D4에 결합하지 않는다.
3.10 인간 혈청 안정성
인간 혈청을 원심분리에 의해 건강한 공여자로부터 새로 단리시켰다. 샘플을 혈청에 희석하였고, 혈청 부피는 전체 부피의 90% 초과를 차지한다. 샘플의 5개 분취물을 37℃에서 인큐베이션시켰다. 그런 다음 샘플을 각각 0일, 1일, 4일, 7일, 14일에 수집하고, 함께 분석할 때까지 급속 냉동하였다.
샘플의 안정성을 ELISA를 사용하여 인간 D3에 대한 결합에 의해서 시험하였다. 간략하면, 플레이트를 100㎕/웰의 1㎍/㎖ WT115-hPro1.ECD.His로 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 1×PBST(0.05% tween-20 함유 PBS)를 사용하여 1회 세척하고, 웰당 1×PBS/2%BSA 200㎕를 첨가하여 차단을 수행하였다. 차단 동안, 시험 항체를 다양한 농도(3nM에서 0.00018nM까지 4배 연속 희석)로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 인간 D3에 대한 항체의 결합을 1:5000으로 1×PBS/2%BSA에 희석된 염소 항-인간 IgG-Fc 단편 교차 흡수 항체 HRP(Bethyl, A80-304P) 및 마우스 IgG-Fc 단편 교차 흡착 항체 HRP(Bethyl, A90-231P)에 의해 검출하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1×PBST를 사용하여 6회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 분배하여 발색시킨 후, 2M HCl 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nm 및 540nm에서 흡광도를 판독하였다. 인간 IgG1 아이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 37℃에서 최대 14일 동안 인간 혈청에서 인큐베이션시킨 후, 인간 D3 단백질에 대한 WT1156-P3R2-1C2-z109-uIgG1의 결합 프로파일은 변하지 않았다.
당업자는 본 개시내용이 이의 사상 또는 중심 속성으로부터 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 본 개시내용의 전술한 설명은 단지 이의 예시적인 실시형태를 개시한다는 점에서, 다른 변형이 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 개시내용은 본 명세서에서 상세히 설명되는 특정 실시형태에 제한되지 않는다. 그 보다는, 본 개시내용의 범주 및 내용을 나타내는 첨부된 청구범위를 참조해야 한다.

Claims (26)

  1. 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 D3-결합 분자로서, 상기 단일 가변 도메인은 서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 55 또는 18에 제시된 바와 같은 VHH의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, D3-결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, CDR1, CDR2 및 CDR3은 Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT 또는 이들의 임의의 조합(들)에 따르는, D3-결합 분자.
  3. 제1항에 있어서, (i) 상기 CDR1은 서열번호 1, 4, 7 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 상기 CDR2는 서열번호 2, 5, 8 또는 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; (iii) 상기 CDR3은 서열번호 3, 6 또는 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, D3-결합 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 D3-결합 분자는,
    (A) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 2에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR3;
    (B) 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR3;
    (C) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR3; 또는
    (D) 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1; 서열번호 11에 제시된 바와 같은 CDR2; 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR3
    을 포함하는, D3-결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인은,
    (A) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열;
    (B) D3에 대한 특이적 결합 친화성을 유지하는 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열; 또는
    (C) 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 아미노산의 첨가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는, D3-결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인의 프레임워크 영역, 예를 들어, FRW1, FRW2, FRW3 및/또는 FRW4 내에 아미노산의 하나 이상의 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함하는, D3-결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인은 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, D3-결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D3-결합 분자는 인간 IgG 불변 도메인을 추가로 포함하는, D3-결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인간 IgG 불변 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 도메인, 예컨대, 인간 IgG1 불변 도메인 또는 이의 변이체인, D3-결합 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, D3-결합 분자:
    (a) ELISA 또는 FACS에 의해서 측정되는 경우 nM 등급의 EC50으로 인간 D3, cyno D3 및/또는 마우스 D3에 결합함;
    (b) 인간 D3 발현 세포에서 용량-의존적 내재화 효력을 나타냄; 및
    (c) SPR에 의해서 측정되는 경우 0.1nM 이하의 KD로 인간 D3에 결합함.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D3-결합 분자는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체인, D3-결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 12 내지 18 및 55 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 단일 가변 도메인 및 서열번호 19에 제시된 바와 같은 IgG 불변 도메인을 포함하는, D3-결합 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체인, D3-결합 분자.
  14. 이종 펩타이드, 예컨대, 상이한 항원을 표적화하는 항원-결합 도메인에 융합된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자를 포함하는, 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자의 단일 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  16. 제15항의 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  17. 제16항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 D3-결합 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자의 생산 방법으로서,
    - 제15항의 숙주 세포에서 상기 D3-결합 분자를 발현시키는 단계; 및
    - 상기 숙주 세포로부터 상기 D3-결합 분자를 단리시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  20. 대상체에서 D3 관련 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 대상체에서 면역 반응이 조절되도록 상기 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자 또는 제18항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자 또는 제18항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 암은 D3 양성 또는 과발현성인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암은 폐암 및 신경내분비 암종으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암은 SCLC 또는 LCNEC인, 방법.
  24. D3 양성 암을 진단하거나, 예방하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자의 용도.
  25. D3 양성 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자.
  26. 암을 치료하거나 진단하기 위한 키트로서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 D3-결합 분자를 포함하는 용기를 포함하는, 키트.
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