JP4460155B2 - マウス抗体のヒト化 - Google Patents

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明はマウス抗体のヒト化に関する。
【０００２】
（発明の背景）
通常、抗体は、ジスルフィド結合により相互に結合した２つの重鎖及びジスルフィド結合により各重鎖に結合した２つの軽鎖からなる。各重鎖の１端から可変ドメインが始まり、その後に数個の不変ドメインがある。同様に、各軽鎖はその一端に可変ドメインを有するが、その他端には１個の不変ドメインしかない。軽鎖には、ラムダ（λ）鎖及びカッパ（κ）鎖と呼ばれる２種の鎖がある。λまたはκ軽鎖を有する抗体の間に機能的な差違はない。しかしながら、２種の軽鎖の比率は種毎に異なる。マウスにおけるκ：λ比は２０：１であり、ヒトにおけるκ：λ比は２：１である。
【０００３】
軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、軽鎖の不変ドメイン及び重鎖の第１不変ドメインのように一列に並んでいる。軽鎖及び重鎖の不変ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していない。
【０００４】
複数の可変ドメインが抗体の抗原結合サイトを形成する。各軽鎖及び重鎖ドメインの一般的構造は、３つの相補性決定部（ＣＤＲ）により結合される４つのフレームワーク部からなり、前記部の配列は比較的保存される。４つのフレームワーク部はβ−シートコンフォメーションを使用し、ＣＤＲはβ−シート構造を接続するループを形成する（場合により、その一部を形成する）。ＣＤＲはフレームワーク部により非常に接近して保持され、他のドメインからのＣＤＲと共に抗原結合サイトの形成に寄与する。
【０００５】
腫瘍細胞の細胞表面抗原は抗体誘導ガン治療に対する一般的な標的であるが、充実性腫瘍の治療のための主要な制限の１つは、腫瘍抗原が血流中を循環する抗体に接近しにくいことである。腫瘍細胞の濃密充填及び腫瘍コア中の高い間質圧が手強い物理的バリアーとなっている。
【０００６】
抗体の充実性腫瘍への侵入不足の問題を解決するために、腫瘍細胞それ自体よりも腫瘍の血管を覆う内皮細胞を攻撃する。成熟腫瘍血管構造を特異的に、すなわち健康な組織を破壊することなく標的することは困難であるが、有望な方法では血管化を抑制することを目的とする。
【０００７】
血管形成とも称される血管化は、主要細胞から分泌されるサイトカインにより誘発され、細胞接着分子（ＣＡＭ）及びプロテアーゼにより調節される血管細胞遊走及び侵入プロセスに依存する。これらの分子は、現在血管形成阻害剤に対する潜在的標的と見做されている。これに関して、血管インテグリンα_ｖβ_３が血管形成性血管のマーカーとして最近同定された。Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，「血管形成に対するインテグリンα_ｖβ_３の要件(Requirement of ingegrin α_ｖβ_３ for angiogenesis)」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，５６９−５７１（１９９４）参照。更に、インテグリンα_ｖβ_３に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）ＬＭ６０９は血管形成を抑制し得たことが判明し、このことからインテグリンα_ｖβ_３が血管形成において重要な役割を有することが示される。
【０００８】
更に、ＬＭ６０９が刺激されて血管形成を受けた血管細胞のアポトーシスを選択的に促進することも立証された。Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，「インテグリンα_ｖβ_３は血管形成性血管のアポトーシスを誘発することにより腫瘍退宿を促進する(Integrin α_ｖβ_３ antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels)」，Ｃｅｌｌ，７９，１１５７−１１６４（１９９４）参照。これらの知見から、インテグリンα_ｖβ_３は標的であり得、ＬＭ６０９はガン診断及び治療のための道具であり得ることが示唆される。
【０００９】
実際、ＬＭ６０９は、ニワトリ胚の絨毛尿膜に移植した組織学的に異なるヒト腫瘍の増殖を防止し、該腫瘍の退縮をも誘発した。Ｃｅｌｌ，７９，１１５７−１１６４参照。腫瘍増殖のより臨床的に適切なモデルを用いると、ＬＭ６０９はＳＣＩＤマウス／ヒトキメラモデルにおいてヒト乳ガンの増殖を阻止した。重大なことに、ＬＭ６０９は腫瘍増殖を阻止しただけでなく、試験した乳ガンの転移をも抑制した。Ｂｒｏｏｋｓら，「抗−インテグリンα_ｖβ_３はヒト乳ガン増殖及びヒト皮膚における血管形成を阻止する(Anti-integrin α_ｖβ_３ blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin)」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，９６，１８１５−１８２２（１９９５）参照。
【００１０】
Ｂｒｏｏｋｓらの結果は、血管形成が乳ガン細胞の転移蔓延の原因になることを示唆した以前の研究と一致している。Ｗｅｉｄｎｅｒ，Ｎ．ら，「腫瘍起因性血管形成及び転移：湿潤性乳ガンにおける関係(Tumor angiogenesis and metastasis : Correlation in invasive breast carcinoma)」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２４，１−８（１９９１）及びＷｅｉｄｎｅｒ，Ｎ．ら，「腫瘍起因性血管形成：早期乳ガンにおける新規な有意且つ独立した予後インジケーター(Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma)」，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８４，１８７５−１８８７（１９９２）参照。
【００１１】
過去数年間の間に、血管形成の２つのサイトカイン依存経路があること及びこれらの経路は異なる血管インテグリンへの依存性により規定されることの証拠が提出された。Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．，ら，「異なるＡＶインテグリンによる２つの血管形成経路の定義(Definition of two angiogenic pathways by distinct AV integrins)」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１５００−１５０２（１９９５）参照。Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒらの研究結果は、抗−α_ｖβ_３抗体ＬＭ８０９はｂＦＧＦ及びＴＮＦ_αに応答して血管形成を阻止したが、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ_αまたはホルボールエステルＰＭＡにより誘発される血管形成に対する影響は少ないことを示す。対照的に、抗−α_ｖβ_３抗体Ｐ１Ｆ６抗体は、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ_α及びホルボールエステルＰＭＡにより誘発される血管形成を阻止するが、ｂＦＧＦまたはＴＮＦ_αにより誘発される血管形成に対する影響は少ない。
【００１２】
よって、抗−α_ｖβ_３抗体に対して低感受性を示す腫瘍はα_ｖβ_５依存的に血管形成を促進するサイトカインを分泌することが考えられる。これらを考慮すると、抗−α_ｖβ_３抗体及びα_ｖβ_５抗体はガンの診断及び治療用の有望な道具である。
【００１３】
しかしながら、ＬＭ６０９のようなマウスモノクローナル抗体はヒトにおいてかなり免疫原性であり、よってガン治療のための使用可能性が限定され、特に反復投与を必要とするときにはそうである。マウスモノクローナル抗体の免疫原性を低減するために、マウスモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインをヒト不変Ｉｇドメインに融合したキメラモノクローナル抗体を作成した。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，「キメラヒト抗体分子：ヒト不変領域ドメインを有するマウス抗原結合ドメイン(Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains)」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８４１−６８５５（１９８４）及びＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．ら，「機能性キメラマウス／ヒト抗体の作成(Production of a functional chimaeric mouse/human antibody)」，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６７３−６４６（１９８４）参照。この方法は、通常抗体の「ヒト化」と呼ばれている。
【００１４】
通常、キメラモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体の結合特異性を維持し、ヒトエフェクター細胞と改良された相互作用を示す。これにより、腫瘍細胞をモノクローナル抗体を用いて除去する方法の１つであると見做される改良された抗体依存性細胞性細胞傷害が生ずる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，「インビトロ抗体：作成及び使用方法(In vitro antibodies; Strategies for production and application)」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２３９−２６５（１９９２）参照。幾つかのキメラモノクローナル抗体はヒトにおいて低免疫原性であることが判明したが、マウス可変Ｉｇドメインのためになお有意なヒト抗−マウス応答が生じ得る。Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら，「キメラ抗体の免疫原性(The immunogenicity of chimeric antibodies)」，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０，２１５３−２１５７（１９８９）。従って、治療目的のためには、可変及び不変Ｉｇドメインを改変することによりマウスモノクローナル抗体を完全にヒト化することが必要である。
【００１５】
完全ヒト化は、マウスの重鎖及び軽鎖可変Ｉｇドメイン由来の６つのＣＤＲをヒト可変Ｉｇドメインの適当なフレームワーク部に導入することにより実現可能である。このＣＤＲグラフティング方法（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら，「治療用の再成形ヒト抗体(Reshaping human antibodies for therapy)」，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３（１９８８））は、抗原との主接触物であるＣＤＲループを支持するための足場として作用する４つのフレームワーク部（ＦＲ１−ＦＲ４）を有する可変Ｉｇドメインの保存構造の利点を有する。Ｗａｌｄｍａｎｎらの米国特許第５，５０２，１６７号明細書は、ヒトＴ細胞抗体にグラフトした、ＬＣＤＲ３を介してＣＤＲループＬＣＤＲ１及びラットＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体であるＹＴＨ６５５（５）６由来のＨＣＤＲ３を介してＨＣＤＲ１を有する「ヒト化抗体」を開示している。
【００１６】
しかしながら、ＣＤＲグラフティング方法の欠点は、フレームワーク部のアミノ酸が抗原結合に寄与し得、ＣＤＲループのアミノ酸も２つの可変Ｉｇドメインの結合に影響を及ぼし得ることである。ヒト化モノクローナル抗体のアフィニティーを維持するために、ＣＤＲグラフティング方法では、抗原結合サイトのコンピューターモデリングを利用するヒトフレームワーク部及び単一アミノ酸の部位特異的組換えを使用している（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら，「血小板インテグリンｇｐｌ１ｂ／ｌ１ａに特異的なヒト化抗体(A humanized antibody specific for the platelet integrin gpl1b/l1a)」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６（１９９４））。合理的設計によるマウスモノクローナル抗体のヒト化の成功例は多数報告されている。これらの中には、潜在的な臨床用途を有するヒトインテグリンに対するモノクローナル抗体が幾つかある。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６；Ｈｓｉａｏ，Ｋ．Ｃ．ら，「抗−ＣＤ１８抗体６０．３のヒト化：Ｌ２ループの重要性(Humanization of 60.3, an anti-CD18 antibody;Importance of the L2 Loop)」，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，７，８１５−８２２（１９９４）、及びＰｏｕｌ，Ｍ．Ａ．ら，「Ｔ細胞活性化のヒト化抗−β_１インテグリン鎖ｍＡｂにより抑制(Inhibition of T cell activation with a humanized anti-beta 1 integrin chain mAb)」，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，１０１−１１６（１９９５）参照。
【００１７】
ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスは、マウスモノクローナル抗体のヒト化のための有望な代替物を提供する。例えば、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら，「ミニ座トランスジェニックマウスの新規株由来の高アビディティを有するヒトＩｇＧκモノクローナル抗体(High-avidity human IgGk monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice)」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，８４５−８５１（１９９６）参照。免疫化に応答して、これらのマウスは慣用のハイブリドーマ方法により入手できるヒトモノクローナル抗体を発現する。
【００１８】
タンパク質エンジニアリングにおける合理的設計方法は、主にファージディスプレーライブラリーに基づくインビトロ選択方法により攻撃した。Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．及びＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，「タンパク質及びペプチドライブラリーからのインビトロ選別(In vitro selection from protein and peptide libraries)」，ＴＩＢＴＥＣＨ，１２，１７３−１８４（１９９４）参照。特に、ファージディスプレーライブラリー由来の抗体のインビトロ選択及び作成は強力な道具となった。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．及びＢａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，「組合せライブラリー由来のヒト抗体(Human antibodies from combinatorial libraries)」，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５７，１９１−２８０（１９９４）及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，「ファージディスプレー法による抗体の作成(Making antibodies by phage display technology)」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，４３３−４５５（１９９４）参照。
【００１９】
ヒト抗体遺伝子のレパトアを作成するための技術の開発及びフィラメント状バクテリオファージの表面上でのコード化抗体断片の表示により、ヒト抗体を直接作成するための手段が提供された。ファージ方法により作成した抗体は、バクテリアにおいて抗原結合断片（通常、ＦｖまたはＦａｂ断片）として産生され、よってエフェクター機能を欠いている。エフェクター機能は２つの方法の１つにより導入され得る。断片は、哺乳動物細胞において発現するための完全抗体に、またはエフェクター機能をトリガーし得る第２結合サイトを有する二重特異性抗体断片に改変され得る。
【００２０】
通常、抗体のＦｄ断片（Ｖ_Ｈ−Ｃ_ＨＩ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ）はＰＣＲにより別々にクローン化され、組合せファージディスプレーライブラリーにランダムに組換えられ、その後前記ライブラリーは特定抗原への結合のために選択され得る。Ｆａｂ断片はファージ表面上で発現され、すなわち該断片をコードする遺伝子に物理的に結合する。よって、Ｆａｂを抗原結合により選択すると、Ｆａｂコーディング配列をも選択される。前記Ｆａｂコーディング配列はその後増幅され得る。パンニングと言われる手順である抗原結合及び再増幅を繰り返すことにより、抗原に対して特異的なＦａｂが富化し、最後に単離される。
【００２１】
１９９４年に、「誘導選択(guided selection)」と呼ばれる抗体のヒト化方法が公知となった。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化ためのファージディスプレー法の力を利用する。Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．ら，「抗原の単一エピトープに対するファージディスプレーレパトアからのヒト抗体の選択のガイド(Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen)」，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，８９９−９０３（１９９４）参照。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片はヒト軽鎖ライブラリーと組合せて表示され得、次いで生じたハイブリッドＦａｂライブラリーは抗原を用いて選択され得る。こうして、マウスＦｄ断片は選択をガイドするための鋳型を提供する。
【００２２】
その後、選択したヒト軽鎖はヒトＦｄ断片ライブラリーと組合わされる。生じたライブラリーを選択すると、完全なヒトＦａｂが生ずる。
【００２３】
マウスモノクローナル抗体の完全ヒト化のために、本発明はＣＤＲグラフティング及び誘導選択の独自の組合せを使用する。生じた抗−インテグリン抗体はガンの診断及び治療のために有用である。
【００２４】
（発明の要旨）
マウスモノクローナル抗体は、誘導選択及びＣＤＲグラフティングの組合せによりヒト化される。本明細書及び添付の請求の範囲中に使用される用語「ヒト化」は、マウスモノクローナル抗体の少なくとも１つの鎖がヒトモノクローナル抗体の部分を含むことを意味する。
【００２５】
ヒト化マウスモノクローナル抗体は、各鎖が可変ドメインを含み且つ対応するマウスの重鎖及び軽鎖抗体の相補性決定部（ＣＤＲ）アミノ酸配列である少なくとも１つのＣＤＲアミノ酸配列を有するヒト抗体重鎖または軽鎖のライブラリーを構築し、次いでこうして構築したライブラリーを、予備選択した抗原を結合する抗体由来の相補鎖と組合せることにより作成される。この方法では、構築されたライブラリー中に存在するヒト鎖と相補鎖が一緒になって、ヒト化鎖対のライブラリーにおいて重鎖と軽鎖の対を形成する。その後、特定のヒト化重鎖と軽鎖の対を上記した相補鎖を用いてヒト化対ライブラリーから選択する。
【００２６】
特定実施態様では、マウスモノクローナル抗体は、各軽鎖が少なくともその可変ドメイン及び少なくとも１つのマウス軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を含むヒト軽鎖ライブラリー、及び各重鎖が少なくともその可変ドメイン及び少なくとも１つのマウス重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を含むヒト重鎖ライブラリーを構築することによりヒト化され得る。重鎖のサイズは、通常約２００以下のアミノ酸残基である。
【００２７】
マウスＣＤＲを有するヒト軽鎖を、予備選択した抗原を結合する抗体由来の重鎖を用いて構築したヒト軽鎖ライブラリーから選択する。構築した重鎖ライブラリーを、マウスＣＤＲを有する選択したヒト軽鎖と組合せると、各々が少なくとも１つのマウスＣＤＲを有する重鎖と軽鎖の対のヒト化ライブラリーが作成される。その後、マウスＣＤＲを有する重鎖と軽鎖の対は、マウスＣＤＲを有する選択したヒト軽鎖を用いて上記したヒト化ライブラリーから選択される。上記したライブラリーの構築の順序は臨界的でなあ。
【００２８】
好ましくは、モノクローナル抗体の軽鎖相補性決定部３（ＬＣＤＲ３）ループのみをヒト軽鎖にグラフトする。同様に、ＨＣＤＲ３ループのみをヒト重鎖（ＨＣ）断片にグラフトすることが好ましい。グラフト化マウスＣＤＲを有するヒト軽鎖またはヒト重鎖は、鋳型としてキメラマウス／ヒト相補鎖を使用することにより選択することが好ましい。
【００２９】
ヒト軽鎖上へのＣＤＲグラフティングでは、ヒト軽鎖をクローン化し、次いでクローンを無作為に組換えて、組合せファージディスプレーライブラリーのようなライブラリーを形成する。同一の方法が、ヒト重鎖上にグラフト化するためにも使用され得る。
【好ましい実施態様の説明】
本発明は多くの異なる形態の実施態様が許容するが、本発明の好ましい実施態様を以下に述べる。但し、本開示は本発明の原理の例示とみなされるべきであり、本発明を例示した特定実施態様に限定することを意図しないことは理解されるべきである。
【００３０】
マウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９のｃＤＮＡクローニング
ＬＭ６０９ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣ名称ＨＢ９５３７）から出発して、ＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して１０８ＬＭ６０９ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製した。基本的にＡ．Ｓ．Ｋａｎｇらにより「ファージ１におけるコンビネーション免疫グロブリンライブラリー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ２，１１９（１９９１））の中で述べられているように、Ｆｄ断片及びκ鎖コード配列の逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施した。
【００３１】
Ｆｄ断片及びΚ鎖をコードするＰＣＲ産物をそれぞれＸｈｏＩ／ＳｐｅＩとＳａｃＩ／ＸｂａＩで切断し、適切に消化したファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈに連続的に連結した。連結産物を電気形質転換により大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入し、その後の段階はＣ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩらにより「ファージ表面でのコンビネーション抗体ライブラリーの構築：遺伝子ＩＩＩ部位」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，７９７８−７９８２）に述べられているようにして、表面にＦａｂを示すファージを作製した。固定化したインテグリンα_Ｖβ_３に対するパニングによってファージを選択した。２回のパニング操作後、単一クローンをＬＭ６０９ Ｆａｂ断片の発現に関して分析した。ＩＰＴＧ誘導培養からの上清を、アルカリホスファターゼに複合したヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）を二次抗体として使用して、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により固定化インテグリンα_Ｖβ_３への結合に関して検査した。陽性クローンの各々のＦｄ断片の配列及び各々のκ鎖コード配列をＤＮＡの塩基配列決定によって決定した。
【００３２】
ヒト軽鎖及びＦｄ断片配列の増幅
ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を使用して５名のドナーの骨髄（Ｐｏｉｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）から全ＲＮＡを調製し、塩化リチウム沈降反応によってさらに精製した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照。オリゴ（ｄＴ）プライミングによる第一鎖ｃＤＮＡ合成キット用のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成した。生じた５つの第一鎖ｃＤＮＡを別々のＰＣＲ増幅に供した。
【００３３】
第一鎖ｃＤＮＡの各々のＶ_λ配列を、４個のセンスプライマーと２個のアンチセンスプライマー（下記のリスト参照）を組み合わせた８種類の別々の反応で増幅した。９個のセンスプライマーと１個のアンチセンスプライマー（下記のリスト参照）を組み合わせた９種類の別々の反応においてＶＫ配列を増幅した。下線を付したＣＤＲループを含めて、Ｖ_λとＶ_αのアミノ酸配列をそれぞれ図２ａと２ｂに示す（それぞれ配列番号４４と配列番号４５も参照）。
【００３４】
４個のセンスプライマーと１個のアンチセンスプライマー（下記のリスト参照）を組み合わせた４種類の反応においてＶ_Ｈ配列（配列番号５６参照）を増幅した。増幅はすべて、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して標準ＰＣＲ条件下で実施した。センスプライマーは種々のＶ_ｇ、Ｖ_λ及びＶ_Ｈ族のＮ末端アミノ酸をコードする配列ハイブリッド形成するが、アンチセンスプライマーはそれぞれ、高度に保存されるＶ_ｇ、Ｖ_λあるいはＶ_ＨのＣ末端アミノ酸をコードする配列にハイブリッド形成する。
【００３５】
ヒト抗体配列の増幅に使用したプライマーのリストを次のものを含む：
Ｖ_ｇセンスプライマー：
ＨＳＣＫ１−Ｆ 配列番号３ ＨＳＣＬａｍ６ 配列番号１４
ＨＳＣＫ２４−Ｆ 配列番号４
ＨＳＣＫ３−Ｆ 配列番号５ ＨＳＣＬａｍ７０ 配列番号１５
ＨＳＣＫ５−５ 配列番号６
Ｖ_ｇアンチセンスプライマー：
ＢＫＦＲ３ＵＮ 配列番号７ ＨＳＣＬａｍ７８ 配列番号１６
ＢＫ２ＦＲ３ＵＮ 配列番号８ ＨＳＣＬａｍ９ 配列番号１７
Ｖ_λセンスプライマー：
ＨＳＣＬａｍ１ａ 配列番号９ Ｖ_λアンチセンスプライマー：
ＨＳＣＬａｍ１ｂ 配列番号１０ ＢＬＦＲ３ＵＮ 配列番号１８
ＨＳＣＬａｍ２ 配列番号１１
ＨＳＣＬａｍ３ 配列番号１２ Ｖ_Ｈセンスプライマー：
ＨＳＣＬａｍ４ 配列番号１３ ＨＦＶＨ１−Ｆ 配列番号１９
ＨＦＶＨ２−Ｆ 配列番号２０
ＨＦＶＨ３５−Ｆ 配列番号２１
ＨＦＶＨ４−Ｆ 配列番号２２
Ｖ_Ｈアンチセンスプライマー：
ＢＦＲ３ＵＮ 配列番号２３
【００３６】
ＬＭ６０９のＶ_ＨをヒトＣ_Ｈ１に融合することによるキメラマウス／ヒトＦｄ断片の構築
ＬＭ６０９ Ｆａｂ配列を含むファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈをテンプレートとして使用して、ＰＣＲプライマー対、ＰＥＬＳＥＱ（配列番号２４）／ＢＦＲ３ＵＮ（配列番号２５）によってＬＭ６０９のＶ_ＨのＮ末端ＦＲ１からＦＲ３までの断片をコードする配列を増幅した。センスプライマーＰＥＬＳＥＱは、ｐＣｏｍｂ３ＨにおいてＦｄ断片をコードする配列の上流のｐｅｌＢリーダー配列にハイブリッド形成する。アンチセンスプライマーＢＦＲ３ＵＮは、高度に保存され、ＬＭ６０９のＶ_Ｈの対応するアミノ酸配列（配列番号２７）と１個のアミノ酸が異なる、Ｖ_ＨのＦＲ３の８個のＣ末端アミノ酸をコードする配列（配列番号２６）にハイブリッド形成する。
【００３７】
オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＭｃＡｒｎ Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．とＲｅａｄｉｎｇｔｏｎ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．（１９９１）ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＯＦ ＤＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＣＲ ＩＮ ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編集、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，ｐ．２１７−２４７参照）により、ＰＥＬＳＥＱ／ＢＦＲ３ＵＮ産物を、Ｖ_ＨのＦＲ４に結合したＬＭ６０９のＨＣＤＲ３（配列番号１）及びヒト抗ｇｐ１２０抗体ｂ８のＣ_Ｈ１ドメイン全体をコードするＰＣＲフラグメントに融合した。このフラグメントはあらかじめＰＣＲプライマー対、ＣＲ５０１（配列番号２８）／ＣＲ３０１（配列番号２９）によって増幅しておいたものである。センスプライマーＣＲ５０１は、ＦＲ３の９個のＣ末端アミノ酸、ＬＭ６０９のＨＣＤＲ３（配列番号１）を形成する８個のアミノ酸、及びｂ８のＦＲ４の６個のＮ末端アミノ酸の合成リンクをコードする。ｂ８のＦＲ４は、Ｃ末端のアミノ酸を除いてＬＭ６０９のＶ_ＨのＦＲ４と同じであるため、ここでは好ましい選択である。Ｃ末端アミノ酸は、ＬＭ６０９についてはＡ、ｂ８についてはＳである。ＣＲ５０１とＢＦＲ３ＵＮの２４ｂｐがオーバーラップすることから、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって対応するＰＣＲ産物を融合させた。
【００３８】
センスプライマーＣＲ３０１はＣ_Ｈ１のＣ末端をコードする配列にハイブリッド形成し、そのＰＣＲ産物をｐＣｏｍｂ３Ｈ上の遺伝子ＩＩＩ ＯＲＦに連結することを可能にするＳｐｅＩ部位を導入する。このオーバーラップ伸長ＰＣＲの産物をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩで切断し、適切に消化されたファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈに連結して、正しい配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００３９】
ＬＭ６０９のＬＣＤＲ３を含有するヒト軽鎖によるＬＭ６０９軽鎖の置換
オーバーラップ伸長ＰＣＲを使って、Ｖ_κとＶ_λのＮ末端ＦＲ１〜ＦＲ３断片をコードする増幅ヒト配列を、ヒトＶ_κまたはＶ_λのＦＲ４およびヒトＣ_κまたはＣ_λドメインに結合したＬＭ６０９のＬＣＤＲ３（配列番号２）をコードするＰＣＲ断片に融合した。ｐＣｏｍｂ３中の抗ｇｐ１２０抗体ｂ１１の配列をテンプレートとして使用し、ＰＣＲプライマー対ＣＲ５０３（配列番号３０）／Ｔ７Ｂ（配列番号３１）およびＣＲ５０８（配列番号３２）／Ｔ７Ｂによって、２つのκ断片を生成させた。
【００４０】
センスプライマーＣＲ５０３とＣＲ５０８は、ヒトＶ_κのＦＲ３の８個のＣ末端アミノ酸（配列番号３３または配列番号３４）、ＬＭ６０９のＬＣＤＲ３を形成する９個のアミノ酸（配列番号２）およびｂ１１のＦＲ４の７個のＮ末端アミノ酸の合成リンクをコードする。ｂ１１のＦＲ４が好ましい選択肢である。なぜならこれは、ＬＭ６０９ではＧとＴであるのに対してｂ１１ではＱとＡである三番目のＮ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸を除けば、ＬＭ６０９のＶ_ＫのＦＲ４と同一だからである。ＣＲ５０３とＢＫＦＲ３ＵＮおよびＣＲ５０８とＢＫ２ＦＲ３ＵＮの間の２３ｂｐのオーバーラップにより、オーバーラップ伸長ＰＣＲで対応するＰＣＲ産物を融合することができた。
【００４１】
バックワードプライマーＴ７Ｂは、軽鎖コード配列の下流にあるｐＣｏｍｂ３配列にハイブリッド形成する。ヒト骨髄由来のＣＬｅｘｔプライムド第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲプライマー対ＣＲ５１０（配列番号３５）／ＣＬｅｘｔ（配列番号３６）によって、λ断片を生成させた。
【００４２】
センスプライマーＣＲ５１０はヒトＶ_λのＦＲ３の７個のＣ末端アミノ酸（配列番号３７）、ＬＭ６０９のＬＣＤＲ３を形成する９個のアミノ酸およびヒトＶ_λのＦＲ４の７個のＮ末端アミノ酸（配列番号３８）の合成リンクをコードする。ＣＲ５１０とＢＬＦＲ３ＵＮの間の２１ｂｐのオーバーラップにより、オーバーラップ伸長ＰＣＲで対応するＰＣＲ産物を融合することができた。バックワードプライマーＣＬｅｘｔはヒトＣ_λコード配列の３’末端にハイブリッド形成し、ＸｂａＩ部位を導入する。
【００４３】
生成した軽鎖コード配列をＳａｃＩ／ＸｂａＩで切断し、キメラマウス／ヒトＦｄ断片を含有する適切に消化されたファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈに連結した。その連結生成物を大腸菌ＥＲ２５３７株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社；マサチューセッツ州ビバリー）に電気形質転換することにより、１．５×１０^８個の独立した形質転換体からなる軽鎖ライブラリーを得た。ＤＮＡ配列決定により、融合断片の正しい集合が明らかになった。
【００４４】
固定化ヒトインテグリンα_ｖβ_３に対する４ラウンドのパニングを、基本的にＣ．Ｆ． Ｂａｒｂａｓ， ＩＩＩらがその論文「設計と選択による高アフィニティー自己反応性ヒト抗体：インテグリンリガンド結合部位を標的として（原題：Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ： ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， １０００３−１０００７（１９９３））に記述しているようにして、金属緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１ｍＭ ＣａＣｌ_２；１ｍＭ ＭｎＣｌ_２）２５μｌ中のタンパク質２００ｎｇをコーティングに、またＴＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を洗浄に、またＴＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌトリプシンを溶出に使って行なった。洗浄段階は、第一ラウンドでの５回から第二ラウンドでは１０回に、また第三および第四ラウンドでは１５回に増やした。各ラウンドのアウトプットファージプールをファージＥＬＩＳＡによってモニターした。
【００４５】
第四ラウンド後に、各単クローンからファージを生成させ、ファージＥＬＩＳＡにより、固定化インテグリンα_ｖβ_３への結合について試験した。ｐＣｏｍｂ３Ｈ中の軽鎖コード配列の上流にあるｏｍｐＡリーダー配列にハイブリッド形成するプライマーＯＭＰＳＥＱ（配列番号３９）を使ったＤＮＡ配列決定によって、陽性クローンの軽鎖コード配列を分析した。
【００４６】
ＬＭ６０９の重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含有するヒトＦｄ断片によるＬＭ６０９ Ｆｄ断片の置換
３つのＰＣＲ断片をオーバーラップ伸長ＰＣＲにより１段階で融合した。軽鎖パニングで得られた選択ファージミドをテンプレートとして、断片１をＰＣＲプライマー対ＲＳＣ−Ｆ（配列番号４０）／ｌｅａｄ−Ｂ（配列番号４１）で増幅した。センスプライマーＲＳＣ−Ｆは軽鎖コード配列の上流にある配列にハイブリッド形成し、一方、アンチセンスプライマーｌｅａｄ−ＢはＦｄ断片コード配列の上流にある配列にハイブリッド形成する。ＶＨのＦＲ１〜ＦＲ３断片をコードする増幅されたヒト配列（上記参照）を断片２として使用した。
【００４７】
断片３は、ハイブリッドマウス／ヒトＦｄ断片（上記参照）をテンプレートとして、ＰＣＲプライマー対ＣＲ５０１／ＨＩｇＧ１−Ｂ（配列番号４２）で増幅した。アンチセンスプライマーＨｇＧ１−ＢはＣ_Ｈ１コード配列の３’末端にハイブリッド形成する。ｌｅａｄ−ＢとＨＦＶＨ−Ｆプライマーの間の２１ｂｐのオーバーラップおよびＢＦＲ３ＵＮとＣＲ５０１の間の２４ｂｐのオーバーラップを利用して、ＰＣＲプライマー対ＲＳＣ−Ｆ／ＦＳＣ−Ｂ（配列番号４３）で、これら３つの断片を融合し、増幅した。アンチセンスプライマーＲＳＣ−ＢはＨＩｇＧ１−Ｂとオーバーラップする。ＲＳＣ−ＦとＲＳＣ−Ｂは２つの非対称的ＳｆｉＩ部位を導入する。
【００４８】
高い複雑性を維持するために、軽鎖パニングで選択された各ファージミド（断片１）と、５つの第一鎖ｃＤＮＡ源に由来する５つのＶ_Ｈ断片プールのそれぞれ（断片２）について、個別のＰＣＲ反応を行なった。選択されたヒト軽鎖がヒトＦｄ断片に連結されているものをコードする生成断片をＳｆｉＩで切断し、適切に消化されたファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈに連結して、３×１０^７個の独立した形質転換体からなるライブラリーを生成させた。
【００４９】
ＤＮＡ配列決定により、融合したＤＮＡ断片の正しい集合が明らかになった。固定化ヒトインテグリンα_ｖβ_３に対する４ラウンドのパニングを、ちょうど軽鎖パニングについて記述したように行なった。各ラウンドのアウトプットファージプールをファージＥＬＩＳＡによってモニターした。第四ラウンド後に、軽鎖およびＦｄ断片コード配列を、選択されたファージミドから、ＳｆｉＩ消化によって単離し、互換発現ベクターｐＰｈｏＡ−Ｈ６ＨＡにサブクローニングした。
【００５０】
リン酸欠乏培地で生育した個々のクローンの溶解液を、アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２（Ｐｉｅｒｃｅ社）を二次抗体とするＥＬＩＳＡによって、固定化インテグリンα_ｖβ_３への結合について分析した。陽性クローンの軽鎖およびＦｄ断片コード配列を、それぞれプライマーＯＭＰＳＥＱおよびＰＥＬＳＥＱを使ったＤＮＡ配列決定によって分析した。
【００５１】
結果
ＬＭ６０９のｃＤＮＡクローニング
ＬＭ６０９発現ハイブリドーマ細胞から出発して、λ鎖Ｆｄ断片と全κ鎖をコードするｃＤＮＡをＰＣＲによってクローニングした。それらのＰＣＲ産物をｐＣｏｍｂ３に由来するファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈにクローニングし、Ｍ１３繊維状ファージの表面へのＦａｂの発現が容易になるように操作した。ＬＭ６０９ Ｆａｂをディプレイするファージを、インテグリンα_ｖβ_３に対するパニングによって選択し、対応するｃＤＮＡを配列を決定した。大腸菌から精製された可溶性ＬＭ６０９ ＦａｂをＥＬＩＳＡによって分析したところ、インテグリンα_ｖβ_３に特異的に結合することがわかった。
【００５２】
誘導的選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）とＣＤＲ移植の組合せによるＬＭ６０９の逐次的ヒト化法を図１に図解する。ヒト軽鎖選択については、２つの適合するヒト定常ドメインＣ_κとＣ_Ｈ１の相互作用によって第一選択段階のハイブリッドＦａｂを安定化するために、マウスＦｄ断片をヒトＣ_Ｈ１に連結されたマウスＶ_ＨからなるキメラＦｄ断片で置換する。ハイブリッドＦａｂの安定化はその抗原結合部位を安定化することにもなる。
【００５３】
誘導的選択は、ＬＭ６０９の移植ＬＣＤＲ３ループを含有するヒトκおよびλ軽鎖ライブラリーでＬＭ６０９のκ軽鎖を置換することによって開始される。次に、ハイブリッドＦａｂをディスプレイする対応ファージライブラリーを、固定化インテグリンα_ｖβ_３に対する４ラウンドのパニングによって選択する。アウトプット数はラウンドごとに増加しないものの、各ラウンドで得られたアウトプットファージプールをファージＥＬＩＳＡによってインテグリンα_ｖβ_３への結合について分析すると、見出されるシグナルが増える。第四ラウンド後に、各クローンからファージを調製し、ファージＥＬＩＳＡにより、インテグリンα_ｖβ_３への結合について試験する。
【００５４】
これらのクローンの大半は、バックグラウンドを超える何らかの結合を示すシグナルを与えるが、この場合は６つのクローンが極めて強いシグナルを与えた（図３ａ〜３ｅを参照されたい）。これらのクローンのＤＮＡ配列により、３つの異なる軽鎖配列が明らかになった。６つの陽性クローン中５つに見出された２つの軽鎖配列は４つのアミノ酸しか相違せず、すなわち９６％同一だった。第三の軽鎖配列は他の２つの配列と約８０％の同一性を有する。しかしこの配列は、そのそれぞれを異なるＶ_κファミリーの生殖系列と整列させることができる２つの部分を持ったことから、これはおそらく、増幅抗体配列中にしばしば出現することが報告されている人為産物、ＰＣＲクロスオーバーから生じたと思われる。
【００５５】
図３ａ〜３ｅについて述べると、６つのヒトＶ_κの分析により、高度に関連するκ鎖配列のグループ２つが明らかになった。また、Ｖ_κとＶ_λの集合に或る役割を果たすと考えられる、選択された６つのヒトＶ_κのＣＤＲ１ループはすべて、ＬＭ６０９ Ｖ_κの対応する領域に似ている。これは、ＬＭ６０９のテンプレートＶ_λが、ＬＭ６０９抗原、ヒトインテグリンα_ｖβ_３と共に、ＬＭ６０９κ鎖に関連するヒトκ鎖に、選択したことを示している。反復配列が見出されなかったという事実は、選択されたヒトκ鎖のすべてで同一なＬＭ６０９の移植されたＬＣＤＲ３ループが、ＬＭ６０９κ鎖の抗原結合への寄与の主たる原因であることを示しているのかもしれない。
【００５６】
この推測は２つのさらなる観察によって支持される。第一に、最初のヒト化法はヒトκ鎖ライブラリーに基づくものだった。４ラウンドのパニングにより、ＬＭ６０９κ鎖に関連する配列を持つ反復ヒトκ鎖が選択された。しかし対応するハイブリッドＦａｂはヒトインテグリンα_ｖβ_３に弱く結合するに過ぎないようだった。そこで、ＬＭ６０９のＬＣＤＲ３ループをヒトκ鎖ライブラリーに移植したところ、ＥＬＩＳＡから大雑把に見積もっただけではあるが、対応する選択されたハイブリッドＦａｂのヒトインテグリンα_ｖβ_３への結合が改善された。
【００５７】
第二に、選択されたファージを、固定化ヒトインテグリンα_ｖβ_３に対するさらに２ラウンドのパニングで選択した。再び、選択されたファージミドに由来する可溶性のものを、ＥＬＩＳＡによって固定化ヒトインテグリンα_ｖβ_３への結合について分析した。今度は、分析した２０クローンが全て特異的に結合することがわかった。しかし１６個のクローンを配列決定したが反復配列は見出されなかった。したがって、ＬＭ６０９のＬＣＤＲ３ループを含有する多くの異なるヒトκ鎖配列が、ヒトインテグリンα_ｖβ_３への結合に大きな相違を伴わずにＬＭ６０９κ鎖を置換できるようである。この発見は、ヒト化ＬＭ６０９の治療への応用にとって重要であると考えられる。
【００５８】
アロタイプ的配列変異性ゆえに、ヒト化抗体は、反復注射後に患者の免疫系によって中和されうる。この問題は、同じ抗原結合性を持つがアミノ酸配列が異なるヒト化抗体を反復投与に使用することによって回避される。
【００５９】
元のＬＭ６０９軽鎖と同様に、選択された軽鎖はそれぞれκ軽鎖である。さらに、データベーススクリーニングにより、それらがＶ_κ６ファミリーに属する同じ生殖系列、すなわちＤＰＫ−２６に由来することが明らかになった。Ｖ_κ６ファミリーはヒト抗体には頻繁には見出されないので、これはこれらの配列への強い選択を物語っている。この強い選択の一つの明白な理由は、元のマウス軽鎖に対する選択されたヒト軽鎖の比較的高い配列類似性である。
【００６０】
比較のために図４を参照すると、未選抜ライブラリーから４個のクローンを無作為に選び、その軽鎖の配列決定を行った。比較のために使用した３個の選択されたヒト軽鎖は、元のマウスＬＣＤＲ１の長さである１１個のＬＣＤＲ１アミノ酸からなっていたが、選抜されなかった４個のヒト軽鎖のうち、１個だけは、元のマウス配列を有する同じＬＣＤＲ１の長さを有していた（図４参照）。
【００６１】
さらに、選択されたヒト軽鎖のＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２はともに、対応するマウス配列と非常に類似している。元のマウス軽鎖配列の構造領域２のＣ末端アミノ酸は、図４において括弧で示されているリジン（Ｌｙｓ）であるが、このアミノ酸はこの位置では異常なアミノ酸である。従って、このＣ末端アミノ酸は抗原結合部位の形成に関与していると考えられる。驚くべきことに、選択されたヒト軽鎖配列のすべてがこの位置にリジンを含有しているが、選抜されなかった配列すべては、代わりにチロシン（Ｔｙｒ）を含有している。実際、Ｖ_ｇ６ファミリーは、その位置にリジンを含有する唯一のヒトＶ_ｇファミリーである。
【００６２】
まとめると、上記の事実により、マウスのＶ_Ｈテンプレートと、偏ったヒトＶ_ｇ配列について選択された抗原とは元のマウスＶ_ｇ配列と関連していることが明らかにされる。軽鎖の選択から得られた３個のクローンは、上記の６個のクローンよりも弱いインテグリンα_Ｖβ_３を明らかにしているが、バックグラウンドを越える有意な結合を依然として有しており、これらのクローンもまたＤＮＡ配列決定によって分析された。これらの分析により、３個の関連しないＶ_λ配列が、選択されたＶ_ｇ配列とともに（ただし、ＰＣＲの交差的人工物から生じた１個を除く）、ＬＭ６０９の重鎖のヒト化におけるテンプレートとして使用されることが明らかにされた。
【００６３】
上記のヒト化方法に基づいて、抗ヒトインテグリンα_Ｖβ_３モノクローナル抗体ＬＭ６０９のヒト化体を５個作製した。この５個の改変体が、α_Ｖβ_３に結合する１４個のヒト化クローンを配列分析することによって明らかにされた。図８ａおよび図８ｂを参照すると、マウスＶ_Ｌのアミノ酸配列（配列番号４５）が、改変体Ａならびに結合体（または群）のＢ、Ｃ、ＤおよびＥのアミノ酸配列と比較されている。
【００６４】
同様に、図８ｃ〜図８ｅは、マウスＶ_Ｈのアミノ酸配列（配列番号５６）が、５個の改変体（または群）Ａ〜Ｅのアミノ酸配列と比較されている。これらの改変体のうち、クローン７、８および２２（Ｂ群）；クローン４、３１および３６（Ｃ群）；クローン２４、３４および４０（Ｄ群）；ならびにクローン２（Ｅ群）により示される４個はアミノ酸配列が非常に関連している。図８ａおよび図８ｂにおける配列群ＢＣＤＥは、同一なＶ_Ｌドメイン（配列番号４９）を有する４個の改変体を表している。すべてが生殖系列ＤＰ−６５またはそれに非常に関連するＤＰ−７８に由来するそれらのＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列（配列番号５０〜５３）は、各改変体について少なくとも９０％の同一性を有する。
【００６５】
対照的に、改変体５は、クローン１０、１１および３７（Ａ）を含み、異なる生殖系列ファミリーに由来するＶ_Ｈドメイン（配列番号５４）を有するヒト化改変体を表す。このヒト化改変体もまた、異なるＶ_Ｌドメイン（配列番号５５）を含有する。しかし、このドメインは９５％の同一性を有し、同じ生殖系列に由来する。生殖系列は、ｔｈｅ ＭＲＣ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇから得られるＨｕｍａｎ Ｖ Ｇｅｎｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅｓのＶＢＡＳＥディレクトリーによって提供されるＤＮＡＰＬＯＴソフトウエアを使用する核酸の配列比較によって決定された。
【００６６】
ＬＭ６０９のＬＣＤＲ３（配列番号２）配列およびＨＣＤＲ３（配列番号１）配列などの元の相補性決定領域配列を保存することにより、開示されたヒト化方法によってエピトープの保存が確実にされる。エピトープの保存は、抗体のヒト化において、特にＬＭ６０９の場合には重要な要求である。機能を阻止する抗ヒトインテグリンα_Ｖβ_３のマウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９は、α_Ｖポリペプチド鎖およびβ_３ポリペプチド鎖の両方を含むまだ同定されていない非線形エピトープに結合する。重要なことは、このエピトープに結合することによって、ＬＭ６０９は、α_Ｖβ_３を発現する血管細胞におけるアポトーシスを誘導する。これは、多数の抗ヒトインテグリンα_Ｖβ_３マウスモノクローナル抗体における特徴的な特徴である。ＬＭ６０９は、関連するヒトインテグリンα_ＩＩｂβ_３を認識しない。血小板において発現されるヒトα_ＩＩｂβ_３との何らかの交差反応性は、ガン治療における手段としてのＬＭ６０９の使用を妨げる。
【００６７】
ＬＭ６０９の５個のヒト化改変体（クローン２、４、７、１１および２４）は、固定化された、従って変性した可能性があるヒトインテグリンα_Ｖβ_３に対する結合によって選択されたが、細胞表面に発現する無傷のヒトインテグリンα_Ｖβ_３に対する結合について試験された。これに関して、トランスフェクションしていないＣＳ−１ハムスター細胞、およびヒトβ_３ｃＤＮＡまたはβ_５ｃＤＮＡのいずれかでトランスフェクションされたＣＳ−１ハムスター細胞に対するヒト化ＬＭ６０９の結合をフローサイトメトリーによって分析した。マウスＬＭ６０９と同様に、しかし対照抗体とは対照的に、ＬＭ６０９の５個のヒト化改変体はすべて、ヒトβ_３ｃＤＮＡでトランスフェクションされたＣＳ−１ハムスター細胞に対する特異的な結合が明らかにされた（図５ａ〜５ｆ参照）。
【００６８】
ヒト化ＬＭ６０９とヒトインテグリンα_ＩＩｂβ_３との交差反応性の可能性をＥＬＩＳＡによって分析した。既知の交差反応性を有する抗体Ｆａｂ−９は、固定化されたヒトインテグリンα_Ｖβ_３およびα_ＩＩｂβ_３の両方に結合したが、交差反応性は、マウスＬＭ６０９またはその５個のヒト化改変体のいずれに対しても検出されなかった（図６参照）。
【００６９】
従って、これらのすべての事実は、ＬＭ６０９のヒト化プロセスによるエピトープ保存に有利であることを示している。
【００７０】
親和性の成熟は、治療的に適用するために抗体を操作する際には非常に問題となる工程である。標的親和性を増大させることによって、治療に効果的であるように達しなければならない抗体のインビボ濃度は低下させられる。抗体療法の費用を低下させることに加えて、低い効果的なインビボ濃度は、免疫応答の機会を減らすのに役立つ。
【００７１】
抗体の親和性成熟に関するＣＤＲウォーキング法が、別途記載されているが、関連分野においては知られている。ヒト化ＬＭ６０９の親和性成熟に関して、ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ３の段階的な最適化が選ばれた（図７参照）。両方のＣＤＲにおけるランダム化領域は、ヒトの抗体配列において最も大きな変化が明らかにされた４アミノ酸の範囲に限定した。Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ.ら（１９９１）、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、米国保健省、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照のこと。ＮＮＫドーピング（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．他（１９９４）、ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＮＥＵＴＲＡＬＩＺＩＮＧ ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＴＯ ＨＩＶ−１ ＴＯ ＥＮＨＡＮＣＥ ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＡＮＤ ＢＲＯＡＤＥＮ ＳＴＲＡＩＮ ＣＲＯＳＳ−ＲＥＡＣＴＩＶＩＴＹ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１、３８０９〜３８１３）を使用することにより、４つのコドンのランダム化は３２または１ｘ１０^６の異なるヌクレオチド配列が生じる。これに基づき、そしてポアソン分布を（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．およびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）、ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＦＲＯＭ ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＮＤ ＰＥＰＴＩＤＥ ＬＩＢＲＡＲＩＥＳ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２，１７３〜１８４）を仮定すると、５ｘ１０^６の独立した形質転換体が、９９％の信頼性を有する完全なライブラリーには必要である。ＬＭ６０９の５個のヒト化改変体のそれぞれについて、独立的なＬＣＤＲ３ランダム化ライブラリーを作製した。各ライブラリーにおける独立的な形質転換体の数は５ｘ１０^６を十分に越えている（下記の実験手順を参照のこと）。１０個の完全に異なるＬＣＤＲ３配列が、５個の各ライブラリーの２クローンをＤＮＡ配列決定することによって分析したときに得られた。同一の軽鎖と、生殖系列ＤＰ−６５に由来する非常に関連する重鎖とを含有するヒト化ＬＭ６０９に基づく３個のライブラリー（クローン２、４および２４）をまとめた。それらの元となる生殖系列配列に対応して、３個の残るライブラリーを、ＤＰＫ−２６ｒａｎＬＣＤＲ３／ＤＰ−１０、ＤＰＫ−２６ｒａｎＬＣＤＲ３／ＤＰ−６５およびＤＰＫ−２６ｒａｎＬＣＤＲ３／ＤＰ−７８と名付けた。これらの３個のライブラリーを平行して選抜した。
【００７２】
より大きな親和性のＬＣＤＲ３変異体の選抜を改善するために、固相オフレイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選抜（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ら（１９９５）、ＣＤＲ ＷＡＬＫＩＮＧ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＭＡＴＵＲＡＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＰＲＯＴＥＩＮ ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩ−ＨＩＶ−１ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＮＴＯ ＴＨＥ ＰＩＣＯＭＯＬＡＲ ＲＡＮＧＥ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３）を使用した。５回の連続した選抜において、２０μｇのＬＭ６０９のＩｇＧを、２００ｎｇまたは５０ｎｇの固定化したヒトインテグリンα_Ｖβ_３とともにウエルに加え、その後、ファージのインキュベーションおよび洗浄を行った。室温で２４時間後、ウエルを再度洗浄して、結合したファージをトリプシンにより溶出した。このオフレイト選抜工程を次節で説明する。
【００７３】
タンパク質の相互作用は、熱力学的パラメーターおよび運動論的パラメーターによって特徴づけられる。親和性定数（Ｋ_ａ＝ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）は平衡定数であるが、会合速度定数（ｋ_ｏｎ）および解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）は、平衡を過ぎたインビボのプロセスに対する関連がより大きい。Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．（１９９１）、ＯＵＴ ＯＦ ＥＱＵＩＬＩＢＲＩＵＭ、Ｎａｔｕｒｅ、３５３、４７３〜４７４を参照のこと。実際、インビボで生じるためには、大きな親和性（すなわち、大きなＫ_ａ値）を有する相互作用は、迅速な会合（すなわち、大きなｋ_ｏｎ値）に依然として依存する。抗体は、抗原クリアランスに十分な時間を許容するために、大きな親和性の結合に関する熱力学的な選択と同時に、迅速に標的抗原に結合することに基づく速度論的選択に対する対象である。Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）、ＫＩＮＥＴＩＣ ＭＡＴＵＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＡＮ ＩＭＭＵＮＥ ＲＥＳＰＯＮＣＥ、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、５３０〜５３２を参照のこと。Ｋ_ａ値が１０^９Ｍ^−１の範囲にある代表的な抗体／抗原相互作用は、ｋ_ｏｎ値が１０^５Ｍ^−１ｓ^−１〜１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の範囲にある場合には迅速に会合し、そしてｋ_ｏｆｆ値が１０^−３ｓ^−１〜１０^−４ｓ^−１の範囲にある場合にはゆっくりと解離する。親和性成熟（すなわち、ｋ_ｏｆｆを減少させること）に関するオフレイト選抜には、ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋ_ｏｆｆによって示される抗体／抗原相互作用の半減期の考慮が必要である。ｋ_ｏｆｆ＝１ｘ１０^−４ｓ^−１である抗体／抗原相互作用は、半減期が約２時間である。解離定数が１０分の１である場合、すなわち、ｋ_ｏｆｆ＝１ｘ１０^−５ｓ^−１である場合、半減期は１０倍になる：すなわち、約２０時間になる。このような長い半減期は、本発明者らの親和性成熟プロトコルにおけるオフレイト選抜を制限する。妥当な時間範囲を使用して、解離定数が１ｘ１０^−６ｓ^−１未満である抗体は、多数の選抜サイクルの後でも濃縮することができない。しかし、類似するプロトコルを使用して、ｋ_ｏｆｆ値が１０^−６ｓ^−１の範囲にあるｇｐ１２０に対する抗体が選抜された。対応する親和性定数は１０^１１Ｍ^−１の範囲であり、元の抗体の４００倍を越える改善であった。
【００７４】
３個の独立的に選択されたライブラリーのそれぞれから得られた８個のクローンをＤＮＡ配列決定により分析した。ＬＣＤＲ３の配列を下記の表１に示す。元の配列と非常に関連しているコンセンサス配列に対する厳しい選抜を行った。２４個の分析したクローンはすべて、ランダム化領域の９１位にセリン（Ｓｅｒ）を含有し、そしてその９２位グルタミン（Ｇｌｎ）を含有する。元のＬＣＤＲ３における対応するアミノ酸は、それぞれ、セリン（Ｓｅｒ）およびアスパラギン（Ａｓｎ）である。驚くべきことに、ＮＮＫの遺伝コードの３つのセリンコドンのすべて（ＴＣＴ、ＴＣＧおよびＡＣＴ）が９１位に見出される。９４位は、元のＬＣＤＲ３においてはトリプトファン（Ｔｒｐ）であるが、２４クローン中、２２クローンにおいて再度選抜された。２クローンは、代わりにヒスチジン（Ｈｉｓ）を含有する。９３位のみにおいて、より大きな変化が明らかにされる。元のセリン（Ｓｅｒ）は、芳香族アミノ酸または疎水性アミノ酸により置換されている：フェニルアラニン（Ｐｈｅ−１３／２４）、トリプトファン（Ｔｒｐ−６／２４）、バリン（Ｖａｌ−３／２４）、チロシン（Ｔｙｒ−１／２４）またはヒスチジン（Ｈｉｓ−１／２４）のいずれかである。重鎖配列の分析により、これらの３つの独立的に選択されたライブラリーの間での公差反応は起こっていないことが明らかにされた。ライブラリーＤＰＫ−２６ｒａｎＬＣＤＲ３／ＤＰ−６５から選択された８個のクローンはすべて、生殖系列ＤＰ−６５に由来する配列をコードする３つの非常に関連する重鎖のプールを含有していたが、これらは同一であり、ヒト化ＬＭ６０９クローン２４に由来した。
【００７５】
保存されたＬＣＤＲ３配列により、ヒトインテグリンα_Ｖβ_３に対する非常に明確なエピトープに有利であることが示される。細胞表面での天然のヒトインテグリンα_Ｖβ_３に対する結合はまだ明らかにする必要があるが、変性したヒトインテグリンα_Ｖβ_３へのエピトープ変化は可能性がないと考えられる。選択されたファージプールを、ファージＥＬＩＳＡにより、そしてＬＭ６０９のＩｇＧとの競合においてヒトインテグリンα_Ｖβ_３に対する結合について分析した。これらの分析により、ＬＭ６０９ならびにヒト化ＬＭ６０９と比較して、選択されたクローンの著しくより小さい解離定数が示唆される。３位における元のセリンが芳香族残基により置換されることによって、全体的な親和性に対する強い影響を伴う新しい疎水性相互作用が生じ得る。
【００７６】
【表１】

【００７７】
実験過程
材料
ハイブリドーマ培養物から精製されたＬＭ６０９ ＩｇＧは、Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈにより提供された。ヒト・インテグリンα_Ｖβ_３及びヒト・インテグリンα_ＩＩｂβ_３は、ＨＩＧＨ−ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＳＥＬＦ−ＲＥＡＣＴＩＶＥ ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＢＹ ＤＥＳＩＧＮ ＡＮＤ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ：ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＴＨＥ ＩＮＴＥＧＲＩＮ ＬＩＧＡＮＤ ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ，Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０００３−１０００７に記載された起源由来であった。トランスフェクトされていないＣＳ−１ハムスター細胞、及びヒトβ_３又はβ_５ｃＤＮＡのいずれかでトランスフェクトされたＣＳ−１ハムスター細胞は、Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈより入手され（Ｆｉｌａｒｄｏ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５） ＲＥＱＵＩＲＥＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＮＰＸＹ ＭＯＴＩＦ ＩＮ ＴＨＥ ＩＮＴＥＧＲＩＮ ＳＵＢＵＮＩＴ ＣＹＴＯＰＬＡＳＭＩＣ ＴＡＩＬ ＦＯＲ ＭＥＬＡＮＯＭＡ ＣＥＬＬ ＭＩＧＲＡＴＩＯＮ ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＡＮＤ ＩＮ ＶＩＶＯ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０，４４１−４５０）、５％ウシ胎仔血清（ＣＦＳ）が追加されたＲＰＭＩ培地中で７％ＣＯ_２中３７℃で維持された。
【００７８】
可溶性ヒト化ＬＭ６０９ Ｆａｂの大腸菌発現
ファージ・ライブラリーの増幅の後、選択されたヒト化ＬＭ６０９ファージミド・プールのＳｆｉＩ挿入物を、α_ｖβ_３に結合するものを検出するため、大腸菌発現ベクターｐＰｈｏＡ−Ｈ６ＨＡ（Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．（１９９７） ＰＨＡＧＥ ＤＩＳＰＬＡＹ ＯＦ ＣＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＬＩＢＲＡＲＩＥＳ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．８，５０３−５０８を参照）へとクローニングした。１４個のクローンの配列決定により、クローン２、４、７、１１、及び２４により表される、５種の異なるヒト化ＬＭ６０９が明らかとなった。これらのクローンのｃＤＮＡをＳａｃＩ／ＳｐｅＩ消化により切断し、ＳａｃＩ／ＮｈｅＩ切断されたｐＣｏｍｂ３Ｈに連結し、それによりｐＣｏｍｂ３Ｈの遺伝子ＩＩＩコーディングｃＤＮＡを除去し、可溶性Ｆａｂの産生を可能にした（Ｒａｄｅｒ，Ｃ．（１９９７） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．８，５０３−５０８を参照）。連結産物を大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅへと電気的に形質転換した。記載に従い（Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１） ＡＳＳＥＭＢＬＹ ＯＦ ＣＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＬＩＢＲＡＲＩＥＳ ＯＮ ＰＨＡＧＥ ＳＵＲＦＡＣＥＳ：ＴＨＥ ＧＥＮＥ ＩＩＩ ＳＩＴＥ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，７９７８−７９８２）、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加により、Ｆａｂ産生を誘導した。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ
３７℃で９０分間、ヒト・インテグリンα_Ｖβ_３及びα_ＩＩｂβ_３を、１ウェル当たり６０ｎｇ／２５μｌ金属緩衝液（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１ｍＭ ＣａＣｌ_２；１ｍＭ ＭｎＣｌ_２）の濃度で、９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）にコーティングした。３７℃で１時間の１５０μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳによるブロッキングの後、可溶性ＬＭ６０９又はヒト化ＬＭ６０９ Ｆａｂを発現する大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの一晩培養物由来の２５μｌの粗上清を、ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ヒト・インテグリンα_Ｖβ_３及びα_ＩＩｂβ_３でコーティングされたウェル、そしてコーティングされていないがブロッキングはされているウェルへの各上清の結合を、三重で分析した。陽性対照として２５μｌの５０ｎｇ／μｌの精製されたＦａｂ−９なるヒト・インテグリンα_Ｖβ_３及びα_ＩＩｂβ_３の両方に結合する抗体（Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０００３−１０００７）、陰性対照として２５μｌの単純な細菌培養培地を使用した。水道水で十分に洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２又はヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２の１：２，０００希釈物（それぞれＰｉｅｒｃｅ ＃３１３２４又は３１３１２）を含む２５μｌの１％ＢＳＡ／ＴＢＳをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。再び水道水で十分に洗浄した後、５０μｌのアルカリホスファターゼ基質（５ｍｇのリン酸ｐ−ニトロフェニル二ナトリウム６水和物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ ＃１０４−１０５）が溶解した５ｍｌの１０％ジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ ＮａＮ_３、ｐＨ９．８）をウェルに添加した。室温で１５分間のインキュベーションの後、プレートをＥＬＩＳＡ読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で分析した。
【００８０】
フローサイトメトリー
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ装置を使用してフローサイトメトリーを実施した。各決定のため、５×１０^３個の、トランスフェクトされていないハムスターＣＳ−１細胞、又はヒトβ_３もしくはβ_５のいずれかを発現するハムスターＣＳ−１細胞を分析した。可溶性ヒト化ＬＭ６０９ Ｆａｂを発現する大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの粗溶解物、又は陰性対照としての無関係なヒトＦａｂを用いて、間接的な免疫蛍光染色を達成した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＃１０９−０９６−０９７）の１：１００希釈物を検出に使用した。
【００８１】
ＬＣＤＲ３ライブラリーの構築
ｐＰｈｏＡ−Ｈ６ＨＡ中のヒト化ＬＭ６０９クローン２、４、７、１１、及び２４を、記載に従い（Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，ｅｔ ａｌ．（１９９４） ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＮＥＵＴＲＡＬＩＺＩＮＧ ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＴＯ ＨＩＶ−１ ＴＯ ＥＮＨＡＮＣＥ ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＡＮＤ ＢＲＯＡＤＥＮ ＳＴＲＡＩＮ ＣＲＯＳＳ−ＲＥＡＣＴＩＶＩＴＹ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３８０９−３８１３）、オーバーラップ伸長ＰＣＲ突然変異導入のためのテンプレートとして、別々に使用した。この操作に必要な２個の断片は、それぞれ、ＰＣＲプライマーＯＭＰＳＥＱ（配列番号３９）／ＣＲ３２０（配列番号４６）、及びＣＲ５２０（配列番号４７）／ＤＰＳＥＱ（配列番号４８）を用いて得た。ランダム化されたＬＣＤＲ３を有する得られた５個のｃＤＮＡをＳｆｉＩで切断し、適切に消化されたファージミド・ベクターｐＣｏｍｂ３Ｈへと連結し、大腸菌株ＥＲ２５３７へと電気的に形質転換した。５個のライブラリーのそれぞれ２個のクローンをＤＮＡ配列決定により分析したところ、正確な編成、そして１０個の異なるＬＣＤＲ３配列が明らかとなった。選択の前に、クローン２、４、及び２４に基づくライブラリー（Ｖ_Ｌ生殖系ＤＰ−２６；Ｖ_Ｈ生殖系ＤＰ−６５）を組み合わせ、６×１０^７個の独立した形質転換体の混合物を得た。クローン１１に基づくライブラリー（Ｖ_Ｌ生殖系ＤＰ−２６；Ｖ_Ｈ生殖系ＤＰ−７８）は、それぞれ３×１０^７個及び４×１０^７個の独立した形質転換体の混合物と共に別に維持した。
【００８２】
ＬＣＤＲ３ライブラリーの選択
３個のＬＣＤＲ３ライブラリーを、固定化インテグリンα_Ｖβ_３に対する６サイクルの増幅により別々に選択した。増幅は、ＬＭ６０９ヒト化に関する上記の記載と実質的に同様にして実施した。コーティングのためのヒト・インテグリンα_Ｖβ_３の濃度は第１サイクルから第４サイクルにおいては２００ｎｇ／２５μｌ、第５及び第６サイクルにおいては５０ｎｇ／２５μｌであった。また、通常通り第１サイクルから第４サイクルにおいては１０^１２個の範囲であった、ファージの入力数を、第５サイクルでは１０倍、第６サイクルでは１００倍減少させた。選択の第２サイクルから第６サイクルにおいて、５回から１０回の洗浄工程により未結合のファージを除去した後、２０μｇのＬＭ６０９ ＩｇＧを含む５０μｌの金属緩衝液（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１ｍＭ ＣａＣｌ_２；１ｍＭ ＭｎＣｌ_２）をウェルに添加した。次に、プレートを室温で２４時間インキュベートした後（オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選択）、記載に従いさらに５回の洗浄工程及びトリプシン溶出を行った。第６サイクルの後、単一クローンからファージを産生させ、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヒツジ抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＃２７−９４１１−０１）を二次抗体として用いたファージＥＬＩＳＡにより、固定化ヒト・インテグリンα_Ｖβ_３への結合に関して試験した。陽性クローンの軽鎖コーディング配列及び重鎖コーディング配列を、それぞれプライマーＯＭＰＳＥＱ（配列番号３９）及びＰＥＬＳＥＱ（配列番号２４）を用いたＤＮＡ配列決定により分析した。
【００８３】
ＣＤＲランダム化によるＬＭ６０９の最適化
ヒト化に加え、２つの点で、第一には、α_Ｖβ_３への親和性を増加させることにより、第二には、種間交差反応性を広域化することにより、ＬＭ６０９を最適化することができる。操作されたＬＭ６０９の増加した親和性は、可能性のある癌治療の効力を増加させ、コストを減少させる。
【００８４】
元のマウス・モノクローナル抗体ＬＭ６０９は、既に、広域の種間交差反応性を有している。それは、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、及びニワトリのα_Ｖβ_３に結合するが、マウスα_Ｖβ_３には結合しない。ヒト癌のマウス・モデルにおいてＬＭ６０９が宿主α_Ｖβ_３を認識しないという事実は、ＬＭ６０９の治療への応用可能性にとって大きな問題である。ヒト及びマウス両方のα_Ｖβ_３に結合する操作されたＬＭ６０９は、臨床試験に向けた重要な道具となるであろう。モノクローナル抗体の親和性の改良のためのインビトロの方法には、チェーン・シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＢＹ−ＰＡＳＳＩＮＧ ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ：ＢＵＩＬＤＩＮＧ ＨＩＧＨ ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＢＹ ＣＨＡＩＮ ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３）が含まれる。α_Ｖβ_３への結合は、ＣＤＲウォーキング（ＣＤＲ ｗａｌｋｉｎｇ）と呼ばれる手法である、二次ＣＤＲランダム化によりさらに改良されうる（Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４） ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＮＥＵＴＲＡＬＩＺＩＮＧ ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＴＯ ＨＩＶ−１ ＴＯ ＥＮＨＡＮＣＥ ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＡＮＤ ＢＲＯＡＤＥＮ ＳＴＲＡＩＮ ＣＲＯＳＳ−ＲＥＡＣＴＩＶＩＴＹ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３８０９−３８１３を参照）。ＬＭ６０９のヒト化及び親和性改良のためのインビトロ戦法は、同時に、マウスα_Ｖβ_３との交差反応性を生じる可能性が高い。マウスα_Ｖβ_３認識のための特異的な選択は、マウスα_Ｖβ_３が未だ精製されていないという事実により複雑になっている。しかし、いくつかのマウス細胞系、例えばＮＩＨ／３Ｔ３は、α_Ｖβ_３を発現することが知られており、従ってスクリーニング過程に含ませることが可能である。
【００８５】
以上の考察及び添付の実施例は例示のために提示されるものであり、本発明を制限するものと見なされるべきではない。本発明の精神及び範囲内でさらにその他の改変が可能であり、当業者は容易にそれらを考えつくことであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒト化Ｆａｂ断片を作製するためのＣＤＲ移植と誘導選択の結合手法における各段階の配列を示す図式的例示である。
【図２】 図２ａと２ｂはそれぞれ、マウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９のＶ_λとＶ_Ｋアミノ酸配列を示す。それぞれベクタークローニング部位、ＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ）とＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩ）によってコードされる、ＶＡのＮ末端の２個のアミノ酸（Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ）とＶ_ＫのＮ末端の２個のアミノ酸（Ｇｌｕ）（Ｌｅｕ）は人為的である。ＣＤＲループに下線を付している。
【図３ａ】 マウスＬＶ６０９ Ｖ_Ｋ（各配列群の一番上の列）及び６個の選択ヒトＶ_Ｋ（Ｎｏ．１−６）のアミノ酸配列アラインメントを示す。フレームワーク領域（ＦＲ１−３）とＣＤＲ（ＣＤＲ１−２）ループを分けている。（−）のラインは同じアミノ酸を表す。ＦＲ３のＬＣＤＲ３移植部分により、ＣＤＲ３全体とＦＲ４全体がマウスＬＭ６０９ Ｖと選択ヒトＶ_Ｋにおいて同一であることに留意しなければならない。
【図３ｂ】 マウスＬＶ６０９ Ｖ_Ｋ（各配列群の一番上の列）及び６個の選択ヒトＶ_Ｋ（Ｎｏ．１−６）のアミノ酸配列アラインメントを示す。フレームワーク領域（ＦＲ１−３）とＣＤＲ（ＣＤＲ１−２）ループを分けている。（−）のラインは同じアミノ酸を表す。ＦＲ３のＬＣＤＲ３移植部分により、ＣＤＲ３全体とＦＲ４全体がマウスＬＭ６０９ Ｖと選択ヒトＶ_Ｋにおいて同一であることに留意しなければならない。
【図３ｃ】 マウスＬＶ６０９ Ｖ_Ｋ（各配列群の一番上の列）及び６個の選択ヒトＶ_Ｋ（Ｎｏ．１−６）のアミノ酸配列アラインメントを示す。フレームワーク領域（ＦＲ１−３）とＣＤＲ（ＣＤＲ１−２）ループを分けている。（−）のラインは同じアミノ酸を表す。ＦＲ３のＬＣＤＲ３移植部分により、ＣＤＲ３全体とＦＲ４全体がマウスＬＭ６０９ Ｖと選択ヒトＶ_Ｋにおいて同一であることに留意しなければならない。
【図３ｄ】 マウスＬＶ６０９ Ｖ_Ｋ（各配列群の一番上の列）及び６個の選択ヒトＶ_Ｋ（Ｎｏ．１−６）のアミノ酸配列アラインメントを示す。フレームワーク領域（ＦＲ１−３）とＣＤＲ（ＣＤＲ１−２）ループを分けている。（−）のラインは同じアミノ酸を表す。ＦＲ３のＬＣＤＲ３移植部分により、ＣＤＲ３全体とＦＲ４全体がマウスＬＭ６０９ Ｖと選択ヒトＶ_Ｋにおいて同一であることに留意しなければならない。
【図３ｅ】 マウスＬＶ６０９ Ｖ_Ｋ（各配列群の一番上の列）及び６個の選択ヒトＶ_Ｋ（Ｎｏ．１−６）のアミノ酸配列アラインメントを示す。フレームワーク領域（ＦＲ１−３）とＣＤＲ（ＣＤＲ１−２）ループを分けている。（−）のラインは同じアミノ酸を表す。ＦＲ３のＬＣＤＲ３移植部分により、ＣＤＲ３全体とＦＲ４全体がマウスＬＭ６０９ Ｖと選択ヒトＶ_Ｋにおいて同一であることに留意しなければならない。
【図４】 ３個の選択ヒト断片配列及び４個の非選択ヒト断片配列と、マウスＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２ループのオリジナル配列との比較を示す。
【図５】 図５ａから図５ｆまでは、それぞれヒト化ＬＭ６０９クローン２、４、７、１１、２４及び対照抗体による細胞表面のヒトインテグリンα_Ｖβ_３の結合を示す折れ線グラフである。ラインＡはトランスフェクトしていないＣＳ−１ハムスター細胞を表す；ラインＢはヒトβ_３ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＳ−１ハムスター細胞を表す（図５ｆでは基本的にラインＡと同じライン）；そしてラインＣはヒトβ３ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＳ−１ハムスター細胞を表す。
【図６】 それぞれＬＭ６０９抗体とクローン２、４、７、１１、２４及び対照抗体の交差反応性を示す棒グラフである。柱は３回の平均を表し、左の柱はヒトインテグリンα_Ｖβ_３への結合、中央の柱はヒトインテグリンα_１１ｂβ_３への結合、そして右の柱はバックグラウンド結合を表す。誤差バーは標準偏差を示す。
【図７】 至適化した軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）における４個のアミノ酸の伸長の図式的例示である。
【図８ａ】 Ａ群（クローン１０、１１及び３７）と、結合したＢ群（クローン７、８及び２２）、Ｃ群（クローン４、３１及び３６）、Ｄ群（クローン２４、３４、３５及び４０）及びＥ群（クローン２）によって表される５つのバージョンのヒト化クローンのアミノ酸配列と比較した、マウス抗体のＶＬアミノ酸配列の断片化した例示である。
【図８ｂ】 Ａ群（クローン１０、１１及び３７）と、結合したＢ群（クローン７、８及び２２）、Ｃ群（クローン４、３１及び３６）、Ｄ群（クローン２４、３４、３５及び４０）及びＥ群（クローン２）によって表される５つのバージョンのヒト化クローンのアミノ酸配列と比較した、マウス抗体のＶＬアミノ酸配列の断片化した例示である。
【図８ｃ】 Ａ群（クローン１０、１１及び３７）、Ｂ群（クローン７、８及び２２）、Ｃ群（クローン４、３１及び３６）、Ｄ群（クローン２４、３４、３５及び４０）及びＥ群（クローン２）によって表される５つのバージョンのヒト化クローンのアミノ酸配列と比較した、マウス抗体のＶ_Ｈアミノ酸配列の断片化した例示である。
【図８ｄ】 Ａ群（クローン１０、１１及び３７）、Ｂ群（クローン７、８及び２２）、Ｃ群（クローン４、３１及び３６）、Ｄ群（クローン２４、３４、３５及び４０）及びＥ群（クローン２）によって表される５つのバージョンのヒト化クローンのアミノ酸配列と比較した、マウス抗体のＶ_Ｈアミノ酸配列の断片化した例示である。
【図８ｅ】 Ａ群（クローン１０、１１及び３７）、Ｂ群（クローン７、８及び２２）、Ｃ群（クローン４、３１及び３６）、Ｄ群（クローン２４、３４、３５及び４０）及びＥ群（クローン２）によって表される５つのバージョンのヒト化クローンのアミノ酸配列と比較した、マウス抗体のＶ_Ｈアミノ酸配列の断片化した例示である。
【配列表】

Claims (10)

1. ヒト化マウスモノクローナル抗体の作成方法であって、
   （ａ）抗体重鎖又は抗体軽鎖からなる第一のヒト化抗体の重鎖又は軽鎖ライブラリーであって、該第一のヒト化抗体の軽鎖又は重鎖ライブラリーの各鎖が３つの相補性決定部（ＣＤＲ）ループを有し、それぞれの軽鎖及び重鎖の相補性決定部３（ＣＤＲ３）ループが、マウス抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ３ループに対応するアミノ酸配列からなり、ヒト不変フレームワーク領域に隣接し、それぞれの軽鎖又は重鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループは、マウス抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループに対応するアミノ酸配列からなってもよい、ヒト化抗体の重鎖または軽鎖ライブラリーを構築するステップ、
   （ｂ）抗体重鎖又は抗体軽鎖からなる第二のヒト化抗体の重鎖又は軽鎖ライブラリーであって、該第二のヒト化抗体の軽鎖又は重鎖ライブラリーの各鎖が３つの相補性決定部（ＣＤＲ）ループを有し、それぞれの軽鎖及び重鎖の相補性決定部３（ＣＤＲ３）ループが、マウス抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ３ループに対応するアミノ酸配列からなり、ヒト不変フレームワーク領域に隣接し、それぞれの軽鎖又は重鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループは、マウス抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループに対応するアミノ酸配列からなってもよい、ヒト化抗体の重鎖または軽鎖ライブラリーを構築するステップであって、該第二のヒト化抗体の重鎖又は軽鎖ライブラリーの鎖が、前記第一のヒト化抗体の重鎖又は軽鎖ライブラリーの鎖に相補的であり、一つのライブラリーは軽鎖ライブラリーであって、他方のライブラリーは重鎖ライブラリーである第二のヒト化抗体の重鎖又は軽鎖ライブラリーを構築するステップ、
   （ｃ）ステップ（ａ）の前記第一のヒト化抗体の重鎖又は軽鎖のライブラリーからの鎖を予め選択された抗原に結合する抗体由来のキメラマウス／ヒト鎖である相補的な鎖と組合せることによって、重鎖と軽鎖の対のライブラリーを形成するステップ、
   （ｄ）ステップ（ｃ）におけるライブラリーから、前記予め選択された抗原に結合する重鎖と軽鎖の対を選択し、抗原に結合する重鎖と軽鎖の対から、ステップ（ａ）における該抗原に結合する鎖を単離するステップ、
   （ｅ）ステップ（ｄ）における第一の単離された鎖がステップ（ｂ）のライブラリーの相補的な第二の鎖とともに結合して重鎖と軽鎖のヒト化した対のライブラリーを形成するように、ステップ（ｄ）で単離された抗原結合鎖とステップ（ｂ）のライブラリーからの鎖を結合させることにより、ヒト化された対のライブラリーを作成するステップ、
   （ｆ）ステップ（ｅ）におけるヒト化した対のライブラリーから、前記予め選択された抗原に結合するヒト化した重鎖と軽鎖の対を選択するステップ、及び
   （ｇ）ステップ（ｆ）において選択されたヒト化された重鎖および軽鎖の対の２つを組合せ、完全な抗体を形成するステップ、
   からなり、前記予め選択された抗原は前記マウスモノクローナル抗体によって認識される抗原と同じである方法。
2. 第一のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖のライブラリーが軽鎖のみを含み、相補鎖は重鎖であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 第一のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖のライブラリーが重鎖のみを含み、相補鎖は軽鎖であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
4. 重鎖がＦｄ断片であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ヒト化マウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の対の製造方法であって、
   （ａ）軽鎖ライブラリーの各軽鎖が３つの相補性決定部（ＣＤＲ）ループを有し、各軽鎖における相補性決定部３（ＣＤＲ３）ループが対応するマウス抗体の軽鎖ＣＤＲ３ループのアミノ酸配列からなり、ヒト不変フレームワーク領域に隣接し、各軽鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループが、マウス抗体の軽鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループに対応するアミノ酸配列からなってもよい、ヒト化軽鎖ライブラリーを構築するステップ、
   （ｂ）ステップ（ａ）における軽鎖ライブラリーから軽鎖を選択するステップであって、該選択はステップ（ａ）のライブラリーからの軽鎖と、予め選択された抗原に結合する抗体からのキメラマウス／ヒト鎖である重鎖を結合させ、重鎖と軽鎖の対のライブラリーを形成し、該対のライブラリーを前記予め選択された抗原への結合によりスクリーニングし、該予め選択された抗原に結合する軽鎖を単離することを含むステップ、
   （ｃ）ヒト化重鎖ライブラリーを構築するステップであって、ヒト化重鎖のライブラリーの各重鎖が３つのＣＤＲループを有し、各重鎖の相補性決定部３（ＣＤＲ３）ループが対応するマウス抗体の重鎖のＣＤＲ３ループのアミノ酸配列からなり、ヒト不変フレームワーク領域に隣接し、各重鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループが、マウス抗体の重鎖のＣＤＲ１ループ及びＣＤＲ２ループに対応するアミノ酸配列からなってもよい、ヒト化重鎖ライブラリーを構築するステップ、
   （ｄ）ステップ（ｃ）における重鎖ライブラリーからの重鎖と、ステップ（ｂ）で選択された軽鎖を結合し、第二のヒト化マウスモノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の対のライブラリーを作成するステップ、及び
   （ｅ）ステップ（ｄ）のライブラリーを前記予め選択された抗原への結合と、前記予め選択された抗原に結合するヒト化マウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の対の単離によりスクリーニングし、ステップ（ｄ）のライブラリーから抗原結合ヒト化マウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の対を単離するステップ、
   からなり、前記予め選択された抗原は前記マウスモノクローナル抗体によって認識される抗原と同じである方法。
6. 更に、選択した重鎖と軽鎖の対を結合し完全な抗体を得ることを含むことを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ステップ（ｂ）の重鎖がＦｄ断片であることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
8. Ｆｄがキメラマウス／ヒト重鎖断片又は鋳型マウス重鎖断片であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。
9. 各軽鎖及び重鎖におけるＣＤＲ３ループがＡＴＣＣ番号ＨＢ９５３７で寄託されたハイブリドーマ細胞株により産生される抗体ＬＭ６０９由来のＣＤＲ３ループであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
10. 重鎖Ｆｄが鋳型マウス重鎖断片であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。

Images