JP2021533149A - タンパク質製剤のためのトリプトファン誘導体及びｌ−メチオニンの使用 - Google Patents

タンパク質製剤のためのトリプトファン誘導体及びｌ−メチオニンの使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）及び／又はＬ−メチオニンを使用してポリペプチドの酸化を防止する、酸化感受性の溶媒接触可能アミノ酸残基を含むポリペプチドを含む方法及び製剤を提供する。【選択図】図２Ａおよび図２Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月８日出願の米国仮出願第６２／７１６，２３９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
本開示は、ポリペプチド、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、及びＬ−メチオニンを含む液体製剤、並びにそれらの製造及び使用のための方法に関する。
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を含む治療用タンパク質の生物活性は、コンフォメーション及び生化学的安定性に依存する酸化とは、特に生理学的標的への結合に関与するタンパク質の領域又はエフェクタ機能に重要な領域で酸化が発生する場合、薬物動態又は生物学的活性に悪影響を及ぼす可能性があるために、治療用タンパク質の開発における多くの分解懸念の１つである。加えて酸化は、凝集に対する治療用タンパク質の感受性を変化させ、その結果、免疫原性プロファイルに影響を及ぼす可能性がある。
生物療法における酸化リスク管理のための一般的な解決策は凍結乾燥である。しかしながら、このアプローチは、製造コストを増加させ、かつ薬物の製造及び臨床使用をより複雑にする可能性があるため、常に望ましいとは限らない。酸化しやすいアミノ酸残基の変異を介したタンパク質の再設計もまた、酸化リスクを軽減するための可能なアプローチである。但し、標的突然変異は、酸化の可能性を低下させる可能性がある一方で、その標的に対するタンパク質の結合親和性を低下させて、結果としてタンパク質の効力を低下させる可能性があるため、常に実行可能な解決策であるとは限らない。したがって、製造、保管、及び使用中の治療用タンパク質の酸化を制御するための代替的又は補完的な戦略が必要とされる。
ポリペプチド製剤の例は、国際公開第ＷＯ２０１０／０３０６７０号、同第ＷＯ２０１４／１６０４９５号、同第ＷＯ２０１４／１６０４９７号、及び同第ＷＯ２０１７／１１７３０４号に開示されている。
特許出願、特許公報、非特許文献、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
上記及び他の必要性を満たすために、本明細書には、ポリペプチド（例えば、抗体などの治療用ポリペプチド）、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）、及びＬ−メチオニンを含む液体製剤が開示される。ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは、ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基（例えば、トリプトファン残基、メチオニン残基等）の酸化を低減又は防止するのに充分な量で提供される。本開示は、少なくとも部分的に、ＮＡＴの添加が酸化ストレス中に２つの例示的抗体の可変領域トリプトファン残基を保護するのに有効であった一方で、ＮＡＴの包含が酸化に対してＦｃメチオニン残基を感作したという発見に基づく。しかしながら、ＮＡＴを含む製剤へのＬ−メチオニンの添加は、両方の例示的抗体の酸化からトリプトファン及びメチオニン残基の両方を効果的に保護することが見出された（実施例１を参照）。本開示はまた、少なくとも部分的に、両方の賦形剤がインビボで充分に許容されたという発見に基づいており（実施例１を参照）、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンが生物療法製剤中の抗酸化賦形剤として安全かつ効果的であり得ることを示している。
したがって、一態様では、本明細書には、ポリペプチド、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）、及びＬ−メチオニンを含む液体製剤であって、該ＮＡＴは該ポリペプチド内の１つ以上のトリプトファン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供され、該Ｌ−メチオニンは該ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供される、液体製剤が提供される。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０１〜約２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０５〜約１．０ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０５〜約０．３ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．３ｍＭ、及び約１．０ｍＭからなる群から選択される濃度である。いくつかの実施形態では、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は、約１〜約１２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は、約５〜約２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は、約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は約０．３ｍＭであり、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は約５．０ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は約１．０ｍＭであり、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は約５．０ｍＭである。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの１つ以上のトリプトファン残基は、抗体の可変領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基はＷ１０３を含み、ここで、残基のナンバリングはＫａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体のＨＶＲ内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体のＨＶＲ−Ｈ１及び／又はＨＶＲ−Ｈ３内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、Ｗ３３、Ｗ３６、Ｗ５２ａ、Ｗ９９、Ｗ１００ａ、及び／又はＷ１００ｂを含み、ここで、残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体の可変領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基はＭ３４及び／又はＭ８２を含み、ここで、残基のナンバリングはＫａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体の定常領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基はＭ２５２及び／又はＭ４２８を含み、ここで、残基のナンバリングはＥＵナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片である。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化は、ＮＡＴを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するトリプトファン残基の酸化と比較して、低減される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化は、Ｌ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するメチオニン残基の酸化と比較して、低減される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び１つ以上のメチオニン残基の酸化は、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける、１つ以上の対応するトリプトファン残基及び１つ以上の対応するメチオニン残基の酸化と比較して、低減される。いくつかの実施形態では、酸化は、約４０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％低減される。
本発明のいくつかの実施形態では、製剤中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ以上の賦形剤を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の賦形剤は、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、及び等張化剤からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な医薬製剤である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、皮下、静脈内、又は硝子体内投与に適している。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載されるような液体製剤を含む、製品又はキットを提供する。
いくつかの態様では、本発明はＮＡＴ及びＬ−メチオニンを製剤に添加することを含む、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法を提供する。ここで、ＮＡＴはポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供され、Ｌ−メチオニンはポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、約０．０１〜約２５ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、約０．０５〜約１ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、約０．０５〜約０．３ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．３ｍＭ、及び約１．０ｍＭからなる群から選択される濃度になるように、製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、Ｌ−メチオニンは、約１〜約１２５ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、Ｌ−メチオニンは、約５〜約２５ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、Ｌ−メチオニンは、約５ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは約０．３ｍＭの濃度になるように製剤へ添加され、Ｌ−メチオニンは約５．０ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは約１．０ｍＭの濃度になるように製剤へ添加され、Ｌ−メチオニンは約５．０ｍＭの濃度になるように製剤へ添加される。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの１つ以上のトリプトファン残基は、抗体の可変領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基はＷ１０３を含み、ここで、残基のナンバリングはＫａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体のＨＶＲ内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体のＨＶＲ−Ｈ１及び／又はＨＶＲ−Ｈ３内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、Ｗ３３、Ｗ３６、Ｗ５２ａ、Ｗ９９、Ｗ１００ａ、及び／又はＷ１００ｂを含み、ここで、残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体の可変領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基はＭ３４及び／又はＭ８２を含み、ここで、残基のナンバリングはＫａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体の定常領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基はＭ２５２及び／又はＭ４２８を含み、ここで、残基のナンバリングはＥＵナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片である。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化は、ＮＡＴを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するトリプトファン残基の酸化と比較して、低減される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化は、Ｌ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するメチオニン残基の酸化と比較して、低減される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び１つ以上のメチオニン残基の酸化は、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける、１つ以上の対応するトリプトファン残基及び１つ以上の対応するメチオニン残基の酸化と比較して、低減される。いくつかの実施形態では、酸化は、約４０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％低減される。
本発明のいくつかの実施形態では、製剤中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ以上の賦形剤を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の賦形剤は、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、及び等張化剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な医薬製剤である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、皮下、静脈内、又は硝子体内投与に適している。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
上記及び本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、一部、又は全てを組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成してもよいことを理解されたい。本開示のこれらの態様及び他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。本開示のこれらの実施形態及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態によって更に説明される。
図１Ａは、２，２’−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）ストレスに対する２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）の酸化レベルへの、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）濃度の影響を示す。図１Ａは、Ｆｖトリプトファン酸化レベルへのＮＡＴ濃度の影響を示す。 図１Ｂは、２，２’−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）ストレスに対する２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）の酸化レベルへの、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）濃度の影響を示す。図１Ｂは、Ｆｃメチオニン酸化レベルへのＮＡＴ濃度の影響を示す。
図２Ａは、メチオニン若しくはＮＡＴなし、５ｍＭメチオニン、０．３ｍＭ ＮＡＴ、又は５ｍＭメチオニン及び０．３ｍＭ ＮＡＴの組合せで配合された、２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）のＡＡＰＨストレス後の酸化レベルを示す。図２Ａは、酸化感受性Ｆｖトリプトファンの酸化レベルを示す。 図２Ｂは、メチオニン若しくはＮＡＴなし、５ｍＭメチオニン、０．３ｍＭ ＮＡＴ、又は５ｍＭメチオニン及び０．３ｍＭ ＮＡＴの組合せで配合された、２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）のＡＡＰＨストレス後の酸化レベルを示す。図２Ｂは、Ｆｃメチオニンの酸化レベルを示す。
図３Ａは、高ＵＶ光ストレス後の２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）の酸化レベルへの、ＮＡＴ濃度の影響を示す。図３Ａは、ＨＶＲトリプトファン酸化レベルへのＮＡＴ濃度の影響を示す。 図３Ｂは、高ＵＶ光ストレス後の２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）の酸化レベルへの、ＮＡＴ濃度の影響を示す。図３Ｂは、Ｆｃメチオニン酸化レベルへのＮＡＴ濃度の影響を示す。
図４Ａは、メチオニン若しくはＮＡＴなし、５ｍＭメチオニン、０．３ｍＭ ＮＡＴ、又は５ｍＭメチオニン及び０．３ｍＭ ＮＡＴの組合せで配合された、２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）の高ＵＶ光ストレス後の酸化レベルを示す。図４Ａは、ＨＶＲトリプトファンの酸化レベルを示す。 図４Ｂは、メチオニン若しくはＮＡＴなし、５ｍＭメチオニン、０．３ｍＭ ＮＡＴ、又は５ｍＭメチオニン及び０．３ｍＭ ＮＡＴの組合せで配合された、２つの例示的なＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）の高ＵＶ光ストレス後の酸化レベルを示す。図４Ｂは、Ｆｃメチオニンの酸化レベルを示す。
図５は、抗酸化剤が、化学酸化リスクを軽減することを示す。
図６は、１ｍＭ ＮＡＴ及び５ｍＭメチオニンによるＷ５２の酸化からの保護を示す。
Ｉ．定義
本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物又は生体系に限定されず、言うまでもなく多様であり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、２つ以上のかかる分子の組合せを任意に含むといった具合である。
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書での「約」の値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
本明細書に記載される本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態を「含む」、態様及び実施形態「からなる」、及び態様及び実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
本明細書で使用される「及び／又は」という用語、「Ａ及び／又はＢ」などの句は、Ａ及びＢの両方と、Ａ又はＢと、Ａ（単独）と、Ｂ（単独）と、を含むことを意図する。同様に、本明細書で使用される「及び／又は」という用語、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの句は、以下の実施形態の各々を包含することを意図している：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できないほどに有毒な更なる成分を含有しない調製物を指す。かかる製剤は滅菌されている。
「滅菌」製剤は、無菌であるか、又は全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まないか、又はそれらを本質的に含まない。
「安定した」製剤とは、内部のポリペプチドが保管時にその物理的安定性及び／若しくは化学的安定性並びに／又は生物学的活性を本質的に保持する製剤である。好ましくは、製剤は、保管時に、その物理的及び化学的安定性、並びにその生物学的活性を本質的に保持する。保管期間は、一般に、製剤の意図される貯蔵寿命に基づいて選択される。ポリペプチドの安定性を測定するための様々な分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」第２４７〜３０１頁（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク市ニューヨーク、出版（１９９１年）、及びＪｏｎｅｓ，Ａ．「Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．」第１０巻第２９〜９０頁（１９９３年）に概説されている。安定性は、選択された露光量及び／又は温度で選択された期間にわたって測定され得る。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィを使用して、濁度を測定することにより、かつ／又は目視検査により）；ＲＯＳ形成の評価（例えば、光ストレスアッセイ又は２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）ストレスアッセイを使用することにより）；タンパク質の特定のアミノ酸残基の酸化（例えば、モノクローナル抗体のＴｒｐ残基及び／又はＭｅｔ残基）；カチオン交換クロマトグラフィ、画像キャピラリ等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、又はキャピラリゾーン電気泳動を使用した電荷不均一性の評定；アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元されたインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシン又はＬＹＳ−Ｃ）分析；タンパク質の生物学的活性又は標的結合機能（例えば、抗体の抗原結合機能）等の評価等を含む様々な異なる方法で質的及び／又は量的に評価され得る。不安定性は、凝集、脱アミド（例えば、Ａｓｎ脱アミド）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化及び／又はＴｒｐ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化差異等のうちのいずれか１つ以上を伴い得る。
ポリペプチドは、それが、色及び／若しくは透明度の目視検査時に、又は例えばＵＶ光散乱若しくはサイズ排除クロマトグラフィによって測定されたときに、凝集、沈殿、断片化、及び／又は変性の兆候をほとんど又は全く示さない場合、医薬製剤中で「その物理的安定性を保持する」。
ポリペプチドは、所与の時点での化学的安定性が、ポリペプチドが以下に定義されるその生物学的活性を依然として保持していると見なされるようなものである場合、医薬製剤中で「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、ポリペプチドの化学的に改変された形態を検出及び定量することによって評定され得る。化学的改変は、例えば、トリプシンペプチドマッピング、逆相高速液体クロマトグラフィ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、及び液体クロマトグラフィ質量分析（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ／ＭＳ）を用いて評価され得るポリペプチド酸化を含み得る。他のタイプの化学的改変としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィ又はｉｃＩＥＦによって評価され得るポリペプチドの電荷改変が挙げられる。
ポリペプチドは、所与の時点でのポリペプチドの生物学的活性が、例えば、モノクローナル抗体の抗原結合アッセイで決定される、医薬製剤が調製された時点で呈される生物学的活性の約２０％以内（約１０％以内等）である場合（アッセイのエラー内）、医薬製剤中で「その生物学的活性を保持する」。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「生物学的活性」とは、標的に結合するポリペプチドの能力、例えば、抗原に結合するモノクローナル抗体の能力を指す。これは、インビトロ又はインビボで測定され得る生物学的応答を更に含み得る。係る活性は、アンタゴニスト活性又はアゴニスト活性であり得る。
「酸化感受性の」ポリペプチドは、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びチロシン（Ｔｙｒ）等であるが、これらに限定されない、酸化しやすいことが見出されている１つ以上の残基（複数可）を含むポリペプチドである。例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分内のトリプトファンアミノ酸又はモノクローナル抗体のＦｃ部分内のメチオニンアミノ酸が酸化感受性であり得る。
ポリペプチドの「酸化不安定な」残基は、酸化アッセイ（例えば、ＡＡＰＨ誘導又は熱誘導酸化）において３５％を超える酸化を有する残基である。ポリペプチド中の残基の酸化パーセントは、例えば、トリプシン消化、続いて、部位特異的Ｔｒｐ酸化についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等の当該技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。
溶媒中の生体分子の「溶媒接触可能表面積」又は「ＳＡＳＡ」（ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ）とは、溶媒に露出する生体分子の表面積である。ＳＡＳＡは、測定単位（例えば、平方オングストローム）で、又は溶媒に露出する表面積の割合として表され得る。例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基のＳＡＳＡは、８０Å２、又は３０％であり得る。ＳＡＳＡは、例えば、Ｓｈｒａｋｅ−Ｒｕｐｌｅｙアルゴリズム、ＬＣＰＯ法、パワーダイアグラム法、又は分子動力学シミュレーションを用いてこれを含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。
目的の製剤に関する「等張」という用語は、ヒトの血液と本質的に同じ浸透圧を有する製剤を指す。等張製剤は、一般的に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧浸透圧計又は氷結型浸透圧計を用いて測定することができる。
本明細書で使用される場合、「緩衝液」とは、その酸−塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を指す。例えば、本開示の緩衝液は、約４．５〜約８．０の範囲のｐＨを有し得る。酢酸ヒスチジンは、ｐＨをこの範囲内で制御する緩衝液の例である。
「保存料」とは、例えば、内部の細菌作用を本質的に低減させ、それ故に多目的製剤の製造を容易にするために製剤に任意に含まれ得る化合物である。可能性のある保存料としては、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドの混合物）及びベンゼトニウムクロライドが挙げられる。他の型の保存料としては、芳香族アルコール、例えばフェノール、ブチル、及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。一実施形態では、本明細書における保存料は、ベンジルアルコールである。
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」とは、表面活性剤、好ましくは、非イオン性界面活性剤を指す。本明細書における界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシドナトリウム、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、又はステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、又はステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、又はセチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、又はイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、又はイソステアラミドプロピルジメチルアミン、メチルココイルタウリン酸ナトリウム又はメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム、並びにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州パターソン）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８等）、等が挙げられる。一実施形態では、本明細書における界面活性剤は、ポリソルベート２０である。なお別の実施形態では、本明細書における界面活性剤は、ポロキサマー１８８である。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」賦形剤又は担体には、当該技術分野で周知である、薬学的に許容される担体、安定剤、緩衝剤、酸、塩基、糖、保存料、界面活性剤、及び等張化剤などが含まれる（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」第２２版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）。薬学的に許容される賦形剤の例としては、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、酢酸、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、Ｌ−トリプトファン、及びメチオニン；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジン；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、若しくはデキストリン；金属錯体、例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトール若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が挙げられる。「薬学的に許容される」賦形剤又は担体は、対象に適度に投与されて、用いられる活性成分の有効用量を提供することができ、かつそれに曝露される対象に用いられる投薬量及び濃度で非毒性のものである。
製剤化されるポリペプチドは、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質である（例えば、夾雑タンパク質等を含まない）。「本質的に純粋な」ポリペプチドとは、組成物の総重量に基づいて少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体）を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」ポリペプチドとは、組成物の総重量に基づいて少なくとも約９９重量％のポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体）を含む組成物を意味する。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、又は介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、若しくは任意の他の操作又は修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もまたこの定義に含まれる。本明細書におけるこの定義に包含されるポリペプチドの例としては、例えば、レニン等の哺乳動物ポリペプチド；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；レプチン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；腫瘍壊死因子受容体、例えば、死受容体５及びＣＤ１２０；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂ−リンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）；増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血管内皮増殖因子ファミリタンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＰ１ＧＦ）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリタンパク質（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、及びそれらの二量体）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリ、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、及びＦＧＦ９；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子受容体、例えば、ＶＥＧＦ受容体（複数可）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４ 受容体）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＰＤＧＦＲ−α及びＰＤＧＦＲ−β）、及び線維芽細胞増殖因子受容体（複数可）；ＴＩＥリガンド（アンジオポイエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）アンジオポイエチン受容体、例えば、ＴＩＥ１及びＴＩＥ２；タンパク質Ａ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、若しくはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）、又は神経増殖因子、例えば、ＮＧＦ−ｂ；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４；インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、及びインターフェロン−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；ミッドカイン；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分等；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭ；エフリン；Ｂｖ８；デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）；Ｄｅｌ−１；ＢＭＰ９；ＢＭＰ１０；ホリスタチン；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）；Ａｌｋ１；Ｒｏｂｏ４；ＥＳＭ１；パールカン；ＥＧＦ様ドメインマルチプル７（ＥＧＦＬ７）；ＣＴＧＦ及びそのファミリのメンバー；トロンボスポンジン、例えば、トロンボスポンジン１及びトロンボスポンジン２；コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＸＶＩＩＩ；ニューロピリン、例えば、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；Ｎｏｔｃｈタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４；セマフォリン、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、及びＳｅｍａ３Ｆ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣がん抗原）；イムノアドヘシン；並びに上述のタンパク質のうちのいずれかの断片及び／又は変異形、並びに例えば、上述のポリペプチドのうちのいずれかを含む１つ以上のタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられる。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体等）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性、三重特異性等）、及び抗体断片を包含する。
「単離された」ポリペプチド（例えば、単離された抗体）とは、その天然環境の成分から特定及び分離され、かつ／又は回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、ポリペプチドの研究的、診断的、又は治療的使用を妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性又は非タンパク性溶質を含み得る。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内にインサイツでポリペプチドを含むが、これは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から成る、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結される一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含有する可変ドメインである免疫グロブリンの他の部分と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（集合的に、ＣＨ）、並びに軽鎖ＣＨＬ（又はＣＬ）ドメインを含有する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されることがある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されることがある。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の高い部分であり、抗原結合部位を含有する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で広く異なり、かつ各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、ベータ−シート構造を接続し、かついくつかの場合では、ベータ−シート構造の一部を形成するループを形成する３つのＨＶＲによって接続されたベータシート立体配置を大いに採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して互いに結び付いており、他方の鎖のＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与等の様々なエフェクタ機能を呈する。
任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの一方に割り当てられ得る。
本明細書で使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」又は「サブクラス」という用語は、それらの定常領域の化学的及び抗原的特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、γ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成はよく知られており、例えば、Ａｂｂａｓら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第４版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．、２０００年）に一般的に記載されている。抗体は、抗体と１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有会合によって形成されるより大きい融合分子の一部であり得る。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、以下に記載の抗体断片ではない、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために本明細書で同義に使用される。これらの用語は、具体的には、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が産生される。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらし、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋し得る。Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖定常ドメイン及び第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が、遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似の「二量体」構造で会合し得るように、可動性ペプチドリンカによって共有結合し得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカを更に含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関する概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、第２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る。ダイアボディについては、例えば、以下で詳しく説明されている：欧州特許出願公開第ＥＰ４０４，０９７号；国際公開第ＷＯ１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」第９巻第１２９〜１３４頁（２００３年）；及び、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９０巻第６４４４〜６４４８頁（１９９３年）。トリアボディ及びテトラボディについては、Ｈｕｄｓｏｎら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」第９巻第１２９〜１３４頁（２００３年）にもまた記載されている。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。いくつかの実施形態では、かかるモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローンのプール等の複数のクローンからの特有のクローンの選択であり得る。選択される標的に結合する配列を更に改変して、例えば、標的に対する親和性の改善、標的に結合する配列のヒト化、細胞培養におけるその製造の改善、そのインビボの免疫原性の減少、多重特異性抗体の創出等を行うことができること、及び改変された標的に結合する配列を含む抗体も本開示のモノクローナル抗体であることを理解されたい。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが典型的には他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、「Ｎａｔｕｒｅ」第２５６巻第４９５〜９７頁（１９７５年）；Ｈｏｎｇｏら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」第１４巻第３号第２５３〜２６０頁（１９９５年）、Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」第５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９８１年））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３５２巻第６２４〜６２８頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２２巻第５８１〜５９７頁（１９９２年）；Ｓｉｄｈｕら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第３３８巻第２号第２９９〜３１０頁（２００４年）；Ｌｅｅら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第３４０巻第５号第１０７３〜１０９３頁（２００４年）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第１０１巻第３４号第１２４６７〜１２４７２頁（２００４年）；及び、Ｌｅｅら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」第２８４巻第１〜２号第１１９〜１３２頁（２００４年）参照）、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を製造する技術（例えば、国際公開第ＷＯ１９９８／２４８９３号；同第ＷＯ１９９６／３４０９６号；同第ＷＯ１９９６／３３７３５；同第ＷＯ１９９１／１０７４１号；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９０巻第２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３６２巻第２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、「Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第７巻第３３頁（１９９３年）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第１０巻第７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３６８巻第８５６〜８５９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、「Ｎａｔｕｒｅ」第３６８巻第８１２〜８１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第１４巻第８４５〜８５１頁（１９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第１４巻第８２６頁（１９９６年）；並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、「Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１３巻第６５〜９３頁（１９９５年）を参照）を含む、様々な技術によって作成することができる。
本明細書のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であり、一方、鎖の残りの部分が、他の種に由来する抗体又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であり、所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む「キメラ」抗体を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第８１巻第６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。キメラ抗体には、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれ、抗体の抗原結合領域は、例えば、アカゲザルを目的の抗原で免疫することによって産生された抗体に由来する。
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基により置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾を加えて、抗体の性能を更に洗練させることができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み、超可変ループのうちの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、以下を参照：例えば、Ｊｏｎｅｓら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３２１巻第５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３３２巻第３２３〜３２９頁（１９８８年）；及び、Ｐｒｅｓｔａ、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．」第２巻第５９３〜５９６頁（１９９２年）。また、以下も参照されたい：例えば、Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ、「Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻第１０５〜１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ」第２３巻第１０３５〜１０３８頁（１９９５年）；Ｈｕｒｌｅ及びＧｒｏｓｓ、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」第５巻第４２８〜４３３頁（１９９４年）；並びに、米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号。
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生され、かつ／又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。ヒト抗体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリ等の当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２７巻第３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２２巻第５８１頁（１９９１年）。Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、第７７頁（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１４７巻第１号第８６〜９５頁（１９９１年）に記載されている方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」第５巻第３６８〜７４頁（２００１年）もまた参照のこと。ヒト抗体は、抗原投与に応答してこのような抗体を産生するよう改変されているが、その内在性遺伝子座は無能になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによって調製することが可能である（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照のこと）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成するヒト抗体に関する、Ｌｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第１０３巻第３５５７〜３５６２頁（２００６年）もまた参照のこと。
本明細書で使用されるとき、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性であり、かつ／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３が６つのＨＶＲの最も高い多様性を呈し、特にＨ３が抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられる。以下を参照：例えば、Ｘｕら、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」第１３巻第３７〜４５頁（２０００年）、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＷｕ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第２４８巻第１〜２５頁（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ、２００３年）。実際には、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３６３巻第４４６〜４４８頁（１９９３年）、Ｓｈｅｒｉｆｆら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．」第３巻第７３３〜７３６頁（１９９６年）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）である。
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている。（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ（１９９１年））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第１９６巻第９０１〜９１７頁（１９８７年））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の折衷物を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々由来の残基が以下に記載される。
ループ Kabat AbM Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(Kabatナンバリング)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35(Chothiaナンバリング)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）、並びにＶＨにおいて、２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）、及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔら（上記参照）に従って番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基ナンバリング」、「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置ナンバリング」、「残基ナンバリングはＫａｂａｔナンバリングに従う」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔら（上記参照）における抗体の編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＨＶＲの短縮、又はそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所与の抗体に対して、抗体の配列の相同領域での「標準の」Ｋａｂａｔナンバリング配列との整列によって決定され得る。
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、一般に、可変ドメイン（軽鎖の残基およそ１〜１０７及び重鎖の残基およそ１〜１１３）内の残基に言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ（１９９１年））。「ＥＵナンバリングシステム」、「ＥＵインデックス」、「残基ナンバリングはＥＵナンバリングに従う」という用語、及びそれらの変形は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を指す際に使用される（例えば、前出のＫａｂａｔらにて報告されているＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ若しくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、又は２つ若しくはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。そのような多重特異性抗体としては、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなど）、共有結合的又は非共有結合的に連結されている抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖定常領域の少なくとも一部分及び／又は軽鎖定常領域の少なくとも一部分を更に含むＶＨ／ＶＬ単位は、「ヘミマー」又は「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態では、半抗体は、単一の重鎖可変領域の少なくとも一部分及び単一の軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含む。いくつかのかかる実施形態では、２つの半抗体を含み、かつ２つの抗原に結合する二重特異性抗体は、第１の抗原又は第１のエピトープに結合するが、第２の抗原又は第２のエピトープには結合しない第１の半抗体、及び第２の抗原又は第２のエピトープに結合するが、第１の抗原又は第１のエピトープには結合しない第２の半抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体は、５Ｍ〜０．００１ｐＭ、３Ｍ〜０．００１ｐＭ、１Ｍ〜０．００１ｐＭ、０．５Ｍ〜０．００１ｐＭ、又は０．１Ｍ〜０．００１ｐＭの親和性で各抗原又はエピトープに結合するＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、ヘミマーは、第２のヘミマーとの分子内ジスルフィド結合が形成されることを可能にするのに充分な重鎖可変領域の一部分を含む。いくつかの実施形態では、ヘミマーは、例えば、相補的ホール変異又はノブ変異を含む第２のヘミマー又は半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ変異又はホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、以下で更に論じられる。
「二重特異性抗体」は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、又は２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体である。二重特異性抗体はまた、本明細書において、「二重特異性」を有するもの、又は「二重特異性」であるとも称される。別途示されない限り、二重特異性抗体によって結合される抗原が二重特異性抗体名で列記される順序は無作為である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意に重鎖定常領域の少なくとも一部分、並びに単一の軽鎖可変領域及び任意に軽鎖定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、１つよりも多くの単一の重鎖可変領域を含まず、１つよりも多くの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、第１の半抗体は、第１の抗原に結合し、第２の抗原には結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原に結合し、第１の抗原には結合しない。
本明細書で使用される場合、「ノブ・イントゥ・ホール」又は「ＫｎＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面で一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによって、インビトロ又はインビボでの対合を指向する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、又はＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０２８７００９号、同第ＵＳ２００７／０１７８５５２号、国際公開第ＷＯ９６／０２７０１１号、同第ＷＯ９８／０５０４３１号、及びＺｈｕら、（１９９７年）「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」第６巻第７８１〜７８８頁を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＫｎＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の対合が駆動される。例えば、それらのＦｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含み得るか、又は類似の若しくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含み得る。ＫｎＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインを一緒に、又は異なる標的認識配列（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、及び他のＦｃ融合物を含む）を含む任意の他のポリペプチド配列を対合することもできる。
本明細書で使用される「ノブ変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で隆起（ノブ）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ホール変異を有する（例えば、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ５，７３１，１６８号、同第ＵＳ５，８０７，７０６号、同第ＵＳ５，８２１，３３３号、同第ＵＳ７，６９５，９３６号、同第ＵＳ８，２１６，８０５号を参照のこと）。
本明細書で使用される「ホール変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で空洞（ホール）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ノブ変異を有する（例えば、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ５，７３１，１６８号、同第ＵＳ５，８０７，７０６号、同第ＵＳ５，８２１，３３３号、同第ＵＳ７，６９５，９３６号、同第ＵＳ８，２１６，８０５号を参照のこと）。
「直鎖状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａら（１９９５年、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ」第８巻第１０号第１０５７〜１０６２頁）に記載されている抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性又は単一特異性であり得る。
ＩＩ．ポリペプチド製剤及び調製
本開示の特定の態様は、ポリペプチド、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）、及びＬ−メチオニンを含む製剤に関するものである。ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは、ポリペプチドの酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び／又はチロシン残基は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び１つ以上のメチオニン残基は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のポリペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ以上の賦形剤を更に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、液体製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、医薬製剤（例えば、ヒト対象への投与に好適）である。
いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ（例えば、約０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、又は２５．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））であるか、又はＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０５〜約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０５〜約０．３ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．０５ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．１ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約０．３ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約１．０ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴの濃度は、約１ｍＭである。
いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化を、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）によって低減又は防止する。いくつかの実施形態では、活性酸素種は、一重項酸素、スーパーオキシド（Ｏ２−）、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、三酸化二水素（Ｈ２Ｏ３）、ヒドロトリオキシラジカル（ＨＯ３・）、オゾン（Ｏ３）、ヒドロキシルラジカル、及び／又はアルキルペルオキシドから選択される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体であり、ＮＡＴは、抗体中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体の軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体の軽鎖可変領域（例えば、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／又はＨＶＲ−Ｌ３）及び／又は重鎖可変領域（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／又はＨＶＲ−Ｈ３）内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体の重鎖可変領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、重鎖可変領域のフレームワーク領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、Ｗ１０３（Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／又はＨＶＲ−Ｈ３（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１及び／又はＨＶＲ−Ｈ３）内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、Ｗ３３、Ｗ３６、Ｗ５２、Ｗ５２ａ、Ｗ９９、Ｗ１００ａ、Ｗ１００ｂ、及び／又はＷ１０３（Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、Ｗ３３及び／又はＷ３６、Ｗ９９及び／又はＷ１００ａを含む。いくつかの実施形態では、本開示の製剤中にＮＡＴを含めることで、残基Ｗ３３、Ｗ３６、Ｗ５２ａ、ＷＷ９９、Ｗ１００ａ、Ｗ１１０ｂ、及び／又はＷ１０３での抗体の酸化が低減又は防止される（例えば、ＮＡＴを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するトリプトファン残基（複数可）と比較して）。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／又はＨＶＲ−Ｌ３内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、Ｗ９４、Ｗ３１及び／又はＷ９１を含む。
いくつかの実施形態では、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は、約１．０ｍＭ〜約１２５．０ｍＭ（例えば、約１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、１００．０、１０５．０、１１０．０、１１５．０、１２０．０、又は１２５．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））であるか、又はＬ−メチオニンが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は、約５．０〜約２５．０ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤中のＬ−メチオニンの濃度は、約５．０ｍＭである。
いくつかの実施形態では、Ｌ−メチオニンは、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、Ｌ−メチオニンは、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化を、活性酸素種（ＲＯＳ）によって低減又は防止する。いくつかの実施形態では、活性酸素種は、一重項酸素、スーパーオキシド（Ｏ２−）、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、三酸化二水素（Ｈ２Ｏ３）、ヒドロトリオキシラジカル（ＨＯ３・）、オゾン（Ｏ３）、ヒドロキシルラジカル、及び／又はアルキルペルオキシドから選択される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗体であり、Ｌ−メチオニンは、抗体中の１つ以上のメチオニン残基の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体の軽鎖可変領域（例えば、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／又はＨＶＲ−Ｌ３）及び／又は重鎖可変領域（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／又は、及びＨＶＲ−Ｈ３）内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体の重鎖可変領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、重鎖可変領域のフレームワーク領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、Ｍ８２（Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は、抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／又はＨＶＲ−Ｈ３（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１）内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、Ｍ３４（Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／又はＨＶＲ−Ｌ３（例えば、ＨＶＲ−Ｌ１）内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、軽鎖内、例えば部位Ｍ３０、Ｍ３３、Ｍ９２に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、重鎖内、例えば、部位Ｍ８２、Ｍ９９、Ｍ５７、Ｍ５８、Ｍ６２、Ｍ６４、及び他の部位９５〜１０２に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体の軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基は、抗体（例えば、ＩｇＧ１抗体）の重鎖定常領域内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチオニン残基はＭ２５２、Ｍ３５、及び／又はＭ４２８（ＥＵナンバリングに従う）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の製剤中にＬ−メチオニンを含めることで、残基Ｍ３４、Ｍ８２、Ｍ２５２、及び／又はＭ４２８での抗体の酸化が低減又は防止される（例えば、Ｌ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するトリプトファン残基（複数可）と比較して）。
いくつかの実施形態では、本開示の製剤中にＮＡＴを含めることで、１つ以上のメチオニン残基（例えば、位置Ｍ２５２及び／又はＭ４２８におけるＦｃ領域メチオニンなどの、上記のメチオニン残基のいずれか）での抗体の酸化が増加される。いくつかの実施形態では、製剤中にＬ−メチオニンを含めることで、抗体中の１つ以上のメチオニン残基（例えば、位置Ｍ２５２、Ｍ３５８、及び／又はＭ４２８におけるＦｃ領域メチオニンなどの、上記のメチオニン残基のいずれか）のＮＡＴ誘導及び／又は増幅酸化が低減又は防止される。いくつかの実施形態では、本開示の液体製剤は、本明細書に記載されるいずれかの濃度でのＮＡＴ、及び本明細書に記載されるいずれかの濃度でのＬ−メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約０．３ｍＭの濃度のＮａｔ、及び約５．０ｍＭの濃度のＬ−メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約１．０ｍＭの濃度のＮＡＴ、及び約５．０ｍＭの濃度のＬ−メチオニンを含む。
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される液体製剤は、ポリペプチド、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニン（ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する）を含む。ここで、ポリペプチドの酸化（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び／又は１つ以上のメチオニン残基の酸化）は、約４０％〜約１００％低減する（例えば、ＮＡＴ及び／又はＬ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける、１つ以上の対応するトリプトファン残基及び／又は１つ以上の対応するトリプトファン残基と比較して）。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び／又は１つ以上のメチオニン残基の酸化）は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値間の任意の範囲を含む）のいずれかの分だけ低減される（例えば、ＮＡＴ及び／又はＬ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける、１つ以上の対応するトリプトファン残基及び／又は１つ以上の対応するメチオニン残基と比較して）。例えば、以下の実施例１に記載の方法（及びそこに引用されている参考文献）を含む、当該技術分野で公知のポリペプチド酸化を測定する任意の好適な方法を使用することができる。
ポリペプチドにおける酸化の量は、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、又はトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドにおける酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、又はトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上、及び以下の式を使用して、ある割合として決定される。
Figure 2021533149
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される液体製剤は、ポリペプチド、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニン（ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する）を含む。ここで、ポリペプチドの約４０％以下〜約０％は酸化されている（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び／又は１つ以上のメチオニン残基で酸化されている）。いくつかの実施形態では、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％以下（これらの値間の任意の範囲を含む）のポリペプチドは、酸化されている（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び／又は１つ以上のメチオニン残基で酸化されている）。
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される液体製剤は、ポリペプチド、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニン（ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する）を含む。ここで、ポリペプチド中の少なくとも１つの酸化不安定なトリプトファン残基（例えば、本明細書に記載の抗体の１つ以上のトリプトファン残基及のいずれか）の酸化は、約４０％〜約１００％低減する（例えば、ＮＡＴを欠く製剤中のポリペプチドにおける、１つ以上の対応するトリプトファン残基（複数可）と比較して）。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なトリプトファン残基（複数可）の酸化は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値間の任意の範囲を含む）のいずれかの分だけ低減される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なトリプトファン残基の各々の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される液体製剤は、ポリペプチド、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニン（ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する）を含む。ここで、ポリペプチド中の少なくとも１つの酸化不安定なトリプトファン残基の約４０％以下〜約０％（例えば、本明細書に記載の抗体のトリプトファン残基のいずれか１つ以上）は、酸化されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なトリプトファン残基（複数可）の、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％（これらの値間の任意の範囲を含む）のいずれかしか酸化されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なトリプトファン残基の各々の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、又は０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される液体製剤は、ポリペプチド、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニン（ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する）を含む。ここで、ポリペプチド中の少なくとも１つの酸化不安定なメチオニン残基（例えば、本明細書に記載の抗体の１つ以上のメチオニン残基及のいずれか）の酸化は、約４０％〜約１００％低減する（例えば、Ｌ−メチオニンを欠く製剤中のポリペプチドにおける、１つ以上の対応するメチオニン残基（複数可）と比較して）。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なメチオニン残基（複数可）の酸化は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値間の任意の範囲を含む）のいずれかの分だけ低減される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なメチオニン残基の各々の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される液体製剤は、ポリペプチド、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニン（ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する）を含む。ここで、ポリペプチド中の少なくとも１つの酸化不安定なメチオニン残基の約４０％以下〜約０％（例えば、本明細書に記載の抗体のメチオニン残基のいずれか１つ以上）は、酸化されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なメチオニン残基の、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％（これらの値間の任意の範囲を含む）のいずれかしか酸化されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の酸化不安定なメチオニン残基の各々の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、又は０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。
いくつかの実施形態では、製剤中のポリペプチド（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、抗体）は、治療用ポリペプチドである。製剤中の例示のポリペプチド濃度としては、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ超、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、又は約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性、三重特異性等）、又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。
いくつかの実施形態では、製剤は、水性である。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ以上の賦形剤を更に含む。例えば、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、等張化剤、及びそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で公知である任意の好適な賦形剤を、本明細書に記載の製剤中で使用することができる。例えば、本開示の製剤は、モノクローナル抗体、ポリペプチド（例えば、１つ以上のトリプトファン残基で）の酸化を防止する本明細書で提供されるＮＡＴ、ポリペプチド（例えば、１つ以上のメチオニン残基で）の酸化を防止する本明細書で提供されるＬ−メチオニン、及び製剤のｐＨを所望のレベルに維持する緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製剤は、約４．５〜約９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ｐＨは、ｐＨ４．０〜８．５の範囲、ｐＨ４．０〜８．０の範囲、ｐＨ４．０〜７．５の範囲、ｐＨ４．０〜７．０の範囲、ｐＨ４．０〜６．５の範囲、ｐＨ４．０〜６．０の範囲、ｐＨ４．０〜５．５の範囲、ｐＨ４．０〜５．０の範囲、ｐＨ４．０〜４．５の範囲、ｐＨ４．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．０〜９．０の範囲、ｐＨ５．５〜９．０の範囲、ｐＨ６．０〜９．０の範囲、ｐＨ６．５〜９．０の範囲、ｐＨ７．０〜９．０の範囲、ｐＨ７．５〜９．０の範囲、ｐＨ８．０〜９．０の範囲、ｐＨ８．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．７〜６．８の範囲、ｐＨ５．８〜６．５の範囲、ｐＨ５．９〜６．５の範囲、ｐＨ６．０〜６．５の範囲、又はｐＨ６．２〜６．５の範囲である。いくつかの実施形態では、製剤は、６．２又は約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、６．０又は約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のポリペプチドを更に含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製剤は、対象への投与に好適な医薬製剤である。本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、又は「個体」とは、ヒト又は非ヒト動物を指すことができる。「非ヒト動物」とは、飼育動物、家畜、動物園の動物、競技用の動物、愛玩動物（犬、馬、猫、牛等）、及び研究で使用される動物といった、ヒトに分類されない任意の動物を指すことができる。研究用動物とは、線形動物、節足動物、脊椎動物、哺乳動物、カエル、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ又はフグ）、鳥類（例えば、ニワトリ）、イヌ、ネコ、及び非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル、カニクイザル、チンパンジー等）を指し得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象、患者、又は個体は、ヒトである。
製剤中のポリペプチド及び抗体は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて調製され得る。製剤中の抗体（例えば、完全長抗体、抗体断片、及び多重特異性抗体）は、当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され得、これらの非限定的な例示の方法は、以下の節でより詳細に説明される。本明細書における方法は、ペプチド系阻害剤等の他のポリペプチドを含む製剤の調製のための当業者によって適合され得る。治療用タンパク質の製造のため、概してよく理解され、一般的に使用される技術及び手順のためのものであり、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ、２０１２年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３年）；「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｈｏｒｓｗｉｌｌら、２００６年）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編、１９８８年）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０年）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤（例えば、液体製剤）のうちのいずれかに従って、製剤は、２つ以上のポリペプチドを含む（例えば、形成（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、２つ以上のポリペプチドの共製剤である）。例えば、いくつかの実施形態では、製剤は、２つ以上のポリペプチド、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニンを含む共製剤であり、ここで、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは、２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つの酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは、２つ以上のポリペプチドのうちの複数の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンは、２つ以上のポリペプチドのうち各々の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つは、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドのうちの複数は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片から独立して選択された抗体である。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドの各々は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片から独立して選択された抗体である。いくつかの実施形態では、製剤の１つ以上の抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、液体製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、医薬製剤（例えば、ヒト対象への投与に好適）である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、任意の経腸経路又は非経口経路を介した投与に適している。投与の「経腸経路」という用語は、胃腸管の任意の部分を介した投与を指す。経腸経路の例としては、経口、粘膜、舌下、及び直腸経路、又は胃内経路が挙げられる。投与の「非経口経路」とは、経腸経路以外の投与経路を指す。投与の非経口経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、膀胱内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、硝子体内、心臓内、気管内、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内、皮下、又は局所投与が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、皮下、静脈内、又は硝子体内投与に適している。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、皮下又は硝子体内投与に適している。
Ａ．抗体の調製
本明細書に提供される液体製剤中の抗体は、目的とする抗原に対して指向される。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害に罹患している哺乳動物への本抗体の投与により、その哺乳動物に治療的利点がもたらされ得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対して指向される抗体も企図される。
抗原がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子（例えば、受容体）又は増殖因子等のリガンドであり得る。例示の抗原としては、分子、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ＣＤ２０；ｏｘ−ＬＤＬ；ｏｘ−ＡｐｏＢ１００；レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子受容体、例えば、死受容体５及びＣＤ１２０；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；ホルモン又は増殖因子受容体；タンパク質Ａ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、若しくはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）、又は神経増殖因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、及びインターフェロン−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分等；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４受容体；並びに上述のポリペプチドのうちのいずれかの断片が挙げられる。
（ｉ）抗原の調製
任意に他の分子にコンジュゲートする可溶性抗原又はその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体等の膜貫通分子の場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。かかる細胞は、天然源（例えば、がん細胞株）由来であり得るか、又は膜貫通分子を発現するように組換え技法によって形質転換された細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。
（ｉｉ）ある特定の抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注入により動物に産生される。二官能性剤又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１が異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシン阻害剤にコンジュゲートさせることが有用であり得る。
動物は、タンパク質又はコンジュゲート（ウサギ又はマウスの場合、それぞれ１００μｇ又は５μｇ）を、例えばフロイントの完全アジュバント３容量と組み合わせて、抗原、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化され、溶液を複数の部位で皮内注射することにより、免疫化される。１ヶ月後、動物は、複数の部位での皮下注入によって完全フロイントアジュバント中のペプチド又はコンジュゲートの最初の量の１／５〜１／１０で追加免疫される。７〜１４日後、動物を採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価が水平状態になるまで動物を追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質にコンジュゲートしたもの及び／又は異なる架橋試薬によりコンジュゲートしたもので追加免疫する。コンジュゲートを、タンパク質融合物として組換え細胞培養で作製することもできる。ミョウバン等の凝集剤も免疫応答を増強するために好適に使用される。
目的のモノクローナル抗体は、ヒト−ヒトハイブリドーマについて、先ずＫｏｈｌｅｒら「Ｎａｔｕｒｅ」第２５６巻第４９５頁（１９７５年）に記載され、更に例えば、Ｈｏｎｇｏら「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」第１４巻第３号第２５３〜２６０頁（１９９５年）、Ｈａｒｌｏｗら「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」第５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９８１年）、及びＮｉ、「Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ」第２６巻第４号第２６５〜２６８頁（２００６年）に記載される、ハイブリドーマ法を用いて作成することができる。更なる方法には、例えば、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の製造について、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号に記載されている方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）については、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、「Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ」第２０巻第３号第９２７〜９３７頁（２００５年）、並びにＶｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」第２７巻第３号第１８５〜９１頁（２００５年）に記載されている。
他の様々なハイブリドーマ技術については、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／２５８８４１号；同第ＵＳ２００６／１８３８８７号（完全ヒト抗体）、同第ＵＳ２００６／０５９５７５号；同第ＵＳ２００５／２８７１４９号；同第ＵＳ２００５／１００５４６号；同第ＵＳ２００５／０２６２２９号；及び米国特許第７，０７８，４９２号及び同第７，１５３，５０７号を参照されたい。ハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を産生するための例示的なプロトコルが以下に記載される。一実施形態では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターは、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生するか、又はそれを産生することができるリンパ球を誘発するように免疫化される。抗体は、目的とするポリペプチド又はその断片、及びアジュバント、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／トレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、モンタナ州ハミルトン）の複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注入によって、動物中で育成される。目的とするポリペプチド（例えば、抗原）又はその断片は、組換え方法等の当該技術分野で周知の方法を使用して調製され得、これらの方法のうちのいくつかは、本明細書に更に記載される。免疫化動物由来の血清が抗抗原抗体についてアッセイされ、追加免疫が任意に施される。抗抗原抗体を産生する動物由来のリンパ球が単離される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。
その後、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」第５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）を参照されたい。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を示す骨髄腫細胞が使用され得る。例示的な骨髄腫細胞には、米国カリフォルニア州サンディエゴのソーク研究所細胞分布センターから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するものなどのマウス骨髄腫株、及びＳＰ−２又は Ｘ６３−Ａｇ８−６５３細胞は、米国カリフォルニア州ロックビルのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生についても説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１３３巻第３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」第５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７年））。
そのように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、好適な培養培地、例えば、融合していない親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有する培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むことになり、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。好ましくは、例えば、Ｅｖｅｎら、「Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第２４巻第３号第１０５〜１０８頁（２００６年）に記載されるウシ胎仔血清などの動物由来の血清の使用を低減するために、無血清ハイブリドーマ細胞培養法が使用される。
ハイブリドーマ細胞培養の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドについては、Ｆｒａｎｅｋ、「Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第１１１〜１２２頁（２００５年）に記載されている。具体的には、標準の培養培地は、ある特定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）、又はタンパク質加水分解物画分で富化され、アポトーシスが３〜６つのアミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドによって著しく抑制され得る。これらのペプチドは、ミリモル濃度又はそれより高い濃度で存在する。
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、本明細書に記載の抗体に結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）によって決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析によって決定され得る。例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第１０７巻第２２０頁（１９８０年）を参照されたい。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、標準の方法によって成長し得る。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ（上記参照）を参照されたい。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィ等によって、培養培地、腹水、又は血清から好適に分離される。ハイブリドーマ細胞からタンパク質を単離するための１つの手順は、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／１７６１２２号及び米国特許第６，９１９，４３６号に記載されている。この方法は、結合プロセスで離液性塩等の最小限の塩を使用することを含み、好ましくは、溶出プロセスで少量の有機溶媒を使用することも含む。
（ｉｉｉ）ある特定のライブラリスクリーニング方法
本明細書に記載の製剤及び組成物中の抗体は、コンビナトリアルライブラリを使用して、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてスクリーニングすることによって作製され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体に関してかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で公知である。かかる方法は、概して、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第１７８巻第１〜３７頁（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ、２００１年）に記載されている。例えば、目的とする抗体を生成する１つの方法は、Ｌｅｅら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」（２００４年）第３４０巻第５号第１０７３〜９３頁に記載されているファージ抗体ライブラリの使用による方法である。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合された抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を提示するファージを含有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。かかるファージライブラリは、所望の抗原に対する親和性クロマトグラフィによってパニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは、その抗原に吸着し、それ故にライブラリ中の非結合クローンから分離される。その後、結合クローンは、抗原から溶出され、更なる抗原吸着／溶出サイクルによって更に濃縮され得る。これらの抗体のうちのいずれも、目的とするファージクローンを選択するのに好適な抗原スクリーニング手順を設計し、続いて、目的とするファージクローン由来のＦｖ配列、及びＫａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１〜３２４２号、メリーランド州ベセスダ（１９９１年）第１〜３巻に記載された好適な定常領域（Ｆｃ）配列を用いて全長抗体クローンを構築することによって、得ることができる。
いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合ドメインは、約１１０個のアミノ酸を有する２つの可変（Ｖ）領域から形成され、各々が軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖由来であり、両方が３つの超可変ループ（ＨＶＲ）又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒら、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１２巻第４３３〜４５５頁（１９９４年）に記載されるように、短いフレキシブルペプチドを介してＶＨとＶＬとが共有結合した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はそれらが各々定常ドメインに融合し、非共有結合的に相互作用するＦａｂ断片としてのいずれかで、ファージ上に機能的にディスプレイすることができる。本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、集合的に「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と称される。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリは、Ｗｉｎｔｅｒら、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１２巻第４３３〜４５５頁（１９９４年）に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリにおいてランダムに組換えることができ、次いでこれらを抗原結合クローンについて検索することができる。免疫化源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体を与える。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、「ＥＭＢＯ Ｊ」第１２巻第７２５〜７３４頁（１９９３年）に記載されるように、ナイーブレパートリをクローニングすれば、いかなる免疫化も行うことなく、広範囲の非自己抗原及びまた自己抗原に対する単一のヒト抗体供給源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２７巻第３８１〜３８８頁（１９９２年）に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を遂行することによって、合成的に作製することができる。
いくつかの実施形態では、マイナーなコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって抗体断片をディスプレイするために、線維状ファージが使用される。抗体断片は、例えばＭａｒｋｓら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２２巻第５８１〜５９７頁（１９９１年）によって記載されているような、ＶＨ及びＶＬドメインが柔軟なポリペプチドスペーサによって同一のポリペプチド鎖上に連結されている一本鎖Ｆｖ断片として、又は例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第１９巻第４１３３〜４１３７頁（１９９１年）によって記載されているように、一方の鎖がｐＩＩＩに融合され、かつ野生型コートタンパク質の一部を置換することによってファージ表面にディスプレイされるＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリが存在する細菌宿主細胞ペリプラズム中に他方の鎖が分泌される、Ｆａｂ断片として、ディスプレイされ得る。
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集される免疫細胞から得られる。抗抗原クローンに好意的にバイアスされたライブラリが所望される場合、対象は、抗原で免疫化されて抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／又は循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：ＰＢＬ）が、ライブラリ構築のために回収される。一実施形態では、抗抗原クローンに好意的にバイアスされたヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、抗原免疫化により抗原に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを持つ（かつ機能的内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスに抗抗原抗体応答を生じさせることによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの生成については、以下に記載されている。
抗抗原反応性細胞集団の更なる富化は、抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞の単離に好適なスクリーニング手順を使用することによって、例えば、抗原親和性クロマトグラフィ、又は細胞の蛍光色素標識抗原への吸着、続いて、フロー活性化細胞選別（ｆｌｏｗ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）を使用した細胞分離によって得られ得る。
あるいは、免疫化されていないドナー由来の脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの使用により、可能な抗体レパートリのより良好な表示が提供され、抗原が抗原性ではない任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を使用した抗体ライブラリの構築も可能になる。インビトロ抗体遺伝子構築を組み込むライブラリの場合、幹細胞が対象から収集されて、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。目的とする免疫細胞は、様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、目的とする細胞から回収され、増幅される。再構成されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合、所望のＤＮＡは、リンパ球からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、続いて、Ｏｒｌａｎｄｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）」第８６巻第３８３３〜３８３７頁（１９８９年）に記載されているように、再配列されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’末端及び３’末端に一致するプライマを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ、それにより、発現のための多様なＶ遺伝子レパートリが作製される。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）及びＷａｒｄら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３４１巻第５４４〜５４６頁（１９８９年）に記載されるように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマ、及びＪ−セグメント内にあるフォワードプライマを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅され得る。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅するためには、バックプライマは、Ｊｏｎｅｓら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第９巻第８８〜８９頁（１９９１年）に記載されているようにリーダエクソンに基づいていてもよく、そしてＳａｓｔｒｙら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）」第８６巻第５７２８〜５７３２頁（１９８９年）に記載されているように、定常領域内のフォワードプライマであってもよい。相補性を最大限に生かすために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）又はＳａｓｔｒｙら（１９８９年）に記載されるように、縮重がプライマに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ライブラリの多様性は、例えばＭａｒｋｓら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２２巻第５８１〜５９７頁（１９９１年）の方法に記載されているように、又はＯｒｕｍら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第２１巻第４４９１〜４４９８頁（１９９３年）の方法に記載されているように、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリを標的とするＰＣＲプライマを用いることによって最大化される。増幅されたＤＮＡの発現ベクタへのクローニングの場合、希少制限部位が、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）に記載されるように、一方の端におけるタグとして、又は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３５２巻第６２４〜６２８頁（１９９１年）に記載されるように、タグ付けされたプライマでの更なるＰＣＲ増幅によってＰＣＲプライマ内に導入され得る。
合成的に再配列されたＶ遺伝子のレパートリは、インビトロでＶ遺伝子セグメントから誘導され得る。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大部分はクローン化され、配列決定され（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２７巻第７７６〜７９８頁（１９９２年）にて報告）、マッピングされている（松田ら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．」第３巻第８８〜９４頁（１９９３年）にて報告）。これらのクローンセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要な立体配座を含む）は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２７巻第３８１〜３８８頁（１９９２年）に記載されているように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマを用いて、多様なＶＨ遺伝子レパートリを生成するために使用することができる。ＶＨレパートリはまた、Ｂａｒｂａｓら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第８９巻第４４５７〜４４６１頁（１９９２年）に記載されているように、単一の長さである長いＨ３ループ内に焦点を合わせた全ての配列多様性を用いて作製することもできる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローン化及び配列決定されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｎｔｅｒ、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第２３巻第１４５６〜１４６１頁（１９９３年）にて報告）、合成軽鎖レパートリの作成に使用することができる。合成Ｖ遺伝子レパートリは、ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲、並びにＬ３及びＨ３の長さに基づいて、かなりの構造的多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子コードＤＮＡの増幅後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントが、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２７巻第３８１〜３８８頁（１９９２年）の方法に従ってインビトロで再配列され得る。
抗体断片のレパートリは、いくつかの方法でＶＨ遺伝子レパートリとＶＬ遺伝子レパートリを一緒に組み合わせることによって構築され得る。各レパートリは、異なるベクタで作製され得、これらのベクタは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅら、「Ｇｅｎｅ」第１２８巻第１１９〜１２６頁（１９９３年）に記載されるように、インビトロで組換えられ得るか、又はコンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第２１巻第２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記載のｌｏｘＰ系によりインビボで組み換えられ得る。インビボ組換えアプローチは、Ｆａｂ断片の二本鎖性質を利用して、大腸菌形質転換効率によって課せられるライブラリサイズの制限を打開する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリは、別個に、一方がファージミドに、他方がファージベクタにクローニングされる。その後、これらの２つのライブラリは、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられ、これにより、各細胞が異なる組み合わせを含むようになり、ライブラリサイズが存在する細胞の数（約１０１２個のクローン）のみによって制限されるようになる。両ベクタは、インビボ組換えシグナルを含み、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子が単一レプリコンに組換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるようになる。これらの巨大なライブラリは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ −１）を有する多数の多様な抗体を提供する。
あるいは、レパートリは、例えば、Ｂａｒｂａｓら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第８８巻第７９７８〜７９８２頁（１９９１年）に記載されているように、同じベクタ中に連続的にクローニングされてもよく、又はＰＣＲによって一緒に組み立てられ、次いで、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３５２巻第６２４〜６２８頁（１９９１年）に記載されているようにクローニングされてもよい。ＰＣＲアセンブリを使用して、ＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを、可動性ペプチドスペーサをコードするＤＮＡと連結させて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリを形成することもできる。なお別の技法では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎら、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第２０巻第３８３１〜３８３７頁（１９９２年）に記載されるように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子組み合わせ、その後、連結された遺伝子のレパートリをクローニングするために、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」が使用される。
ナイーブライブラリ（天然又は合成のいずれか）によって産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ −１）を有するものであり得るが、親和性成熟は、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）（上記参照）に記載されるように、二次ライブラリを構築し、かつそれから再選択することによってインビトロで模倣され得る。例えば、突然変異は、Ｈａｗｋｉｎｓら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２６巻第８８９〜８９６頁（１９９２年）の方法又はＧｒａｍら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ」第８９巻第３５７６〜３５８０頁（１９９２年）の方法において、エラー・プローン・ポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇら、「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」第１第１１〜１５頁（１９８９年）にて報告）を用いることによって、インビトロでランダムに導入することができる。更に、親和性成熟は、例えば、目的とするＣＤＲに及ぶランダム配列を持つプライマを用いたＰＣＲを使用して、選択された個別のＦｖクローンにおいて１つ以上のＣＤＲをランダムに変異させ、かつより高い親和性クローンについてスクリーニングすることによって行われ得る。国際公開第ＷＯ９６０７７５４号（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域における変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリを作製するための方法について記載している。別の有効なアプローチは、Ｍａｒｋｓら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第１０巻第７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されるように、免疫化されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメインバリアントのレパートリを用いてファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組換え、いくつかの鎖リシャッフリングラウンドでより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技法により、約１０−９Ｍ以下の親和性を有する抗体及び抗体断片の産生が可能になる。
ライブラリのスクリーニングは、当該技術分野で既知の様々な技法によって達成され得る。例えば、抗原は、吸着プレートに付着した宿主細胞で発現された吸着プレートのウェルを被覆するために使用され得るか、又は細胞選別で使用され得るか、又はストレプトアビジン被覆ビーズで捕捉するためにビオチンにコンジュゲートされ得るか、又はファージディスプレイライブラリをパニングするための任意の他の方法で使用され得る。
ファージライブラリ試料は、吸着剤を用いてファージ粒子の少なくとも一部分への結合に好適な条件下で固定化抗原と接触する。通常、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合したファージを洗浄し、次いで、例えばＢａｒｂａｓら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ」第８８巻第７９７８〜７９８２頁（１９９１年）に記載されているように酸によって、又は例えばＭａｒｋｓら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２２２巻第５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載されているようにアルカリによって、又は例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３５２巻第６２４〜６２８頁（１９９１年）の抗原競合法と同様の手順での抗原競合によって、溶出させる。ファージは、単一の選択ラウンドで２０〜１，０００倍濃縮され得る。更に、濃縮されたファージは、細菌培養物中で成長することができ、更なる選択ラウンドに供され得る。
選択の効率は、洗浄中の解離速度、及び単一ファージ上の複数の抗体断片が抗原と同時に会合することができるか等の多くの要因に依存する。高速解離速度（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短時間洗浄、多価ファージディスプレイ、及び固相中の抗原の高コーティング密度の使用によって保持され得る。高密度は、多価相互作用によりファージを安定化するのみならず、解離したファージの再結合も好む。遅い解離速度（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓら、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」第８巻第３０９〜３１４頁（１９９０年）及び国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号に記載されるような長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイの使用、並びにＭａｒｋｓら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第１０巻第７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されるような抗原の低コーティング密度の使用によって促進することができる。
わずかに異なる親和性しか有しなくとも、抗原に対して異なる親和性を有するファージ抗体間での選択が可能である。しかしながら、選択された抗体のランダム変異（例えば、いくつかの親和性成熟技法で行われる）により、大半が抗原に結合し、数個のみより高い親和性を有する多くの変異体が生み出される可能性がある。抗原を制限することにより、希少高親和性ファージが競合排除され得る。全てのより高い親和性の変異体を保持するために、ファージは、抗原に対して一定の標的モル親和性よりも低いモル濃度のビオチン化抗原ではなく、過剰ビオチン化抗原とインキュベートされ得る。その後、高親和性結合ファージがストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズによって捕捉され得る。かかる「平衡捕捉」により、わずか２倍高い親和性しか有しない変異体クローンのより低い親和性を有するかなりの過剰なファージからの単離を許容する感受性で、抗体がそれらの結合親和性に従って選択されることが可能になる。固相に結合しているファージの洗浄に使用される条件は、解離速度に基づいて区別するように操作される場合もある。
抗抗原クローンは、活性に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、抗原を自然に発現する生細胞に結合するか、又は浮遊抗原若しくは他の細胞構造に付着した抗原に結合する抗抗原抗体を提供する。そのような抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、以下：（１）上述のように抗抗原クローンをファージライブラリから単離し、任意に、ファージクローンの単離集団を、その集団を好適な細菌宿主で成長させることによって増幅すること、（２）それぞれ、遮断及び非遮断活性が所望される抗原及び第２のタンパク質を選択すること、（３）抗抗原ファージクローンを固定化抗原に吸着させること、（４）過剰な第２のタンパク質を使用して、第２のタンパク質の結合決定基と重複するか、又はそれと共有される抗原結合決定基を認識するいずれの望ましくないクローンも溶出すること、及び（５）工程（４）後に吸着したまま留まっているクローンを溶出することによって選択され得る。任意に、本明細書に記載の選択手技を１回以上繰り返すことによって、所望の遮断特性／非遮断特性を有するクローンが更に濃縮され得る。
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体又はファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型から目的とする重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマを使用することによって）容易に単離及び配列決定される。単離されると、ＤＮＡが発現ベクタ中に置かれ、その後、それが、宿主細胞、例えば、別様には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスタ卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞における所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説としては、Ｓｋｅｒｒａら、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第５巻第２５６頁（１９９３年）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ」第１３０巻第１５１頁（１９９２年）が挙げられる。
ＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列がＫａｂａｔら（上記参照）から得られ得る）と組み合わせられて、完全長又は部分長重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域等の任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができ、かかる定常領域を任意のヒト又は動物種から得ることができることが理解される。ある動物（ヒト等）種の可変ドメインＤＮＡから誘導され、その後、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合して、「ハイブリッド」完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列（複数可）を形成するＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト可変ＤＮＡから誘導されたＦｖクローンは、ヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長又は部分長ヒト重鎖及び／又は軽鎖のコード配列（複数可）を形成する。
ハイブリドーマに由来する抗抗原抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローンに由来する相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによっても修飾され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第８１巻第６８５１〜６８５５頁（１９８４年）の方法の通り）。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体又は断片をコードするＤＮＡは、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって更に修飾され得る。この様式で、Ｆｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚（Ｊｏｎｅｓら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３２１巻第５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３３２巻第３２３〜３２７頁（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２３９巻第１５３４〜１５３６頁（１９８８年））の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって行われる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトなヒト可変ドメインより少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部のＣＤＲ残基そして場合により一部のＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位からの残基で置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメイン（重鎖及び軽鎖の両方）の選択は、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変−ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１５１巻第２２９６頁（１９９３年）、Ｃｈｏｔｈｉａら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第１９６巻第９０１頁（１９８７年））。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用されてもよい（Ｃａｒｔｅｒら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第８９巻第４２８５頁（１９９２年）、Ｐｒｅｓｔａら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１５１巻第２６２３頁（１９９３年））。
抗体は、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが更に重要である。この目標を達成するために、本方法の一実施形態によれば、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析過程によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、市販されており、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示されたものを調べることにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際の可能性のある残基の役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このような方法で、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大等の所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基がレシピエント配列及び移入配列から選択され、組み合わせられ得る。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接かつ最も実質的に関与する。
本明細書に記載の製剤及び組成物中のヒト抗体は、上述のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築され得る。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１３３巻第３００１頁（１９８４年）、Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」第５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７年）、及びＢｏｅｒｎｅｒら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１４７巻第８６頁（１９９１年）によって説明されている。
内因性免疫グロブリン産生の不在下で免疫化時にヒト抗体の全レパートリを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが説明されている。かかる生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移行により、抗原チャレンジ時のヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９０巻第２５５１頁（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３６２巻第２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、「Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．」第７巻第３３頁（１９９３年）；及び、Ｄｕｃｈｏｓａｌら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３５５巻第２５８頁（１９９２年）を参照されたい。
遺伝子シャッフリングを使用して、非ヒト抗体、例えば、げっ歯類抗体からヒト抗体を得ることもでき、このヒト抗体は、出発非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従って、本明細書に記載のファージディスプレイ技法によって得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のいずれかが、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリで置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラ集団を作り出す。抗原の選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂの単離がもたらされ、このヒト鎖は、一次ファージディスプレイクローンにおける対応する非ヒト鎖の除去時に破壊された抗原結合部位を回復させ、すなわち、このエピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を決定（インプリント）する。残りの非ヒト鎖を置き換えるためにこのプロセスが繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開の国際出願ＰＣＴ／ＷＯ９３／０６２１３号を参照のこと）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を有しない完全なヒト抗体を提供する。
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化等の伝統的な手段又は組換え技法によって生成され得る。ある特定の状況下では、全抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片により、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。特定の抗体断片に関する概説については、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」第９巻第１２９〜１３４頁を参照されたい。
抗体断片を産生するために様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化により得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第２４巻第１０７〜１１７頁（１９９２年）及びＢｒｅｎｎａｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２２９巻第８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞から直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌で発現され、大腸菌から分泌され得るため、これらの断片の容易な大量産生が可能になる。抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され、化学的にカップリングされて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第１０巻第１６３〜１６７頁（１９９２年））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載される。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかである。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第ＷＯ９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、それ故に、それらは、インビボでの使用中の非特異的結合の低減に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかでのエフェクタタンパク質の融合をもたらすことができる。上記の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編）を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、「直鎖状抗体」でもあり得る。かかる直鎖状抗体は、単一特異性又は二重特異性であり得る。
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは、通常、異なる抗原由来である。かかる分子が通常２つの異なるエピトープ（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）のみに結合する一方で、三重特異性抗体等の更なる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この表現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製され得る（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。
二重特異性抗体の作製方法が、当該技術分野で既知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３０５巻第５３７〜５３９頁（１９８３年））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子を有する混合物を産生する可能性があり、これらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常親和性クロマトグラフィ工程によって行われるこの正しい分子の精製は、幾分厄介であり、生成物収率は低い。同様の手順が、国際公開第ＷＯ９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、「ＥＭＢＯ Ｊ．」第１０巻第３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。
異なるアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。この融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。これらの融合のうちの少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合物、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが別個の発現ベクタに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築時に使用される不均等な比率の３つのポリペプチド鎖が最適収率を提供する実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する際に優れた柔軟性が提供される。しかしながら、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合に、又はそれらの比率が特に重要でない場合に、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖をコードする配列を１つの発現ベクタに挿入することが可能である。
このアプローチの一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにある第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにあるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から成る。二重特異性分子の半分のみでの免疫グロブリン軽鎖の存在により容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造が望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見出された。このアプローチは、国際公開第ＷＯ９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１２１巻第２１０頁（１９８６年）を参照されたい。
国際公開第ＷＯ９６／２７０１１号に記載の別のアプローチに従って、抗体分子の対間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように操作され得る。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一又は同様の大きさの補償「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）で置き換えることによって第２の抗体分子の界面上に作製される。これにより、ホモ二量体等の他の望ましくない最終生成物と比べてヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。
二重特異性抗体は、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方がアビジンにカップリングし、他方がビオチンにカップリングし得る。かかる抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的とするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、かつＨＩＶ感染を治療するために（国際公開第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／２００３７３号、及び欧州特許第ＥＰ０３０８９号）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製することができる。好適な架橋剤が当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法も本文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２２９巻第８１頁（１９８５年）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２断片を生成する手技について記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在の存在下で還元されて、隣接するジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を阻止する。その後、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換される。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの一方が、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
近年の進歩により、化学的にカップリングされて二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ’−ＳＨ断片の大腸菌からの直接回収が容易になった。Ｓｈａｌａｂｙら、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」第１７５巻第２１７〜２２５頁（１９９２年）に、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から別個に分泌され、インビトロでの指向性化学カップリングに供されて、二重特異性抗体を形成する。
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養から直接作製及び単離するための様々な技法も記載されている。例えば、ロイシンジッパを使用して二重特異性抗体が産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１４８巻第５号第１５４７〜１５５３頁（１９９２年）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９０巻第６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機序を提供している。それらの断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、ある断片のＶＨドメイン及びＶＬドメインが別の断片の相補的ＶＬドメイン及びＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ」第１５２巻第５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。
２を超える結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｆｔら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１４７巻第６０頁（１９９１年）。
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
（ｖｉｉｉ）抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。本抗体のアミノ酸配列バリアントは、本抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。かかる修飾としては、例えば、本抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特性を有することを条件とする。対象の抗体のアミノ酸配列が作製されるときにアミノ酸改変がその配列に導入されてもよい。
（ｉｘ）抗体誘導体
本開示の製剤及び組成物中の抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含むように更に修飾され得る。いくつかの実施形態では、本抗体の誘導体化に好適なこれらの部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよく、分岐していてもよく、又は分岐していなくてもよい。本抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、１つより多くのポリマーが結合している場合、それらは、同じ分子又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下である療法に使用されるか等を含むが、これらに限定されない、考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
（ｘ）ベクタ、宿主細胞、及び組換え方法
抗体は、組換え方法を使用して産生され得る。抗抗原抗体の組換え産生について、本抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクタに挿入される。本抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して（例えば、本抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定され得る。多くのベクタが利用可能である。ベクタ成分には、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカ遺伝子、エンハンサエレメント、プロモータ、及び転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
（ａ）シグナル配列成分
本明細書に記載の製剤及び組成物中の抗体は、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生され得、これは、好ましくは、成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシング（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識もプロセシングもしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダの群から選択される原核シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダ、因子リーダ（サッカロマイセス及びクルイベロマイセスα因子リーダを含む）、又は酸ホスファターゼリーダ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダ、又は国際公開第ＷＯ９０／１３６４６号に記載されたシグナルによって置換されてもよい。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、並びにウイルス分泌リーダ、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
（ｂ）複製起点
発現ベクタもクローニングベクタもいずれも、ベクタが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクタにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは無関係にベクタの複製を可能にするものであり、これらとしては、複製起点又は自己複製配列が挙げられる。かかる配列は、様々な細菌、酵母、及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が大半のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド由来の複製起点が酵母に好適であり、様々なウイルス複製起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、又はＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクタに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクタに必要ではない（ＳＶ４０起点は、典型的には、初期プロモータを含むという理由だけで使用され得る）。
（ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクタ及びクローニングベクタは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、又は（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質、例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子をコードする。
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与え、それ故に選択レジメンで生き残るタンパク質を産生する。かかる優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカの別の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の抗体コード核酸を取り込むための細胞成分の特定を可能にするものである。
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することによって特定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）が使用され得る。
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳ阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することによって特定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系が、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用され得る。
あるいは、目的とする抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及び別の選択可能なマーカ、例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換又は共形質転換された宿主細胞（具体的には、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８等の選択可能なマーカ用の選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択され得る。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、「Ｎａｔｕｒｅ」第２８２巻第３９頁（１９７９年））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異菌株に対する選択マーカ、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１を提供する（Ｊｏｎｅｓ、「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、第８５巻第１２頁（１９７７年））。その後、酵母宿主細胞ゲノム中でのｔｒｐ１病変の存在により、トリプトファンの不在下での成長による形質転換の検出に有効な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２が欠損した酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドによって補完される。
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクタが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、組換え仔牛キモシンの大規模産生のための発現系としてＫ．ｌａｃｔｉｓが報告された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第８巻第１３５頁（１９９０年）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定した多コピー発現ベクタも開示されている。Ｆｌｅｅｒら、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第９巻第９６８〜９７５頁（１９９１年）。
（ｄ）プロモータ成分
発現ベクタ及びクローニングベクタは、一般に、宿主生物によって認識され、かつ抗体をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモータを含有する。原核宿主との使用に好適なプロモータとしては、ｐｈｏＡプロモータ、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ系、アルカリ性ホスファターゼプロモータ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、並びにハイブリッドプロモータ、例えば、ｔａｃプロモータが挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモータも好適である。細菌系で使用するためのプロモータは、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ：Ｓ．Ｄ．）配列も含有する。
真核生物のプロモータ配列は既知である。実質的に全ての真核遺伝子が、転写が始まる部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、ポリＡ尾部のコード配列の３’末端への付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全てが真核発現ベクタに好適に挿入される。
酵母宿主との使用に好適なプロモータ配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモータ、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、及びグルコキナーゼが挙げられる。
成長条件によって制御された転写の更なる利点を有する誘導性プロモータである他の酵母プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモータ領域である。酵母発現での使用に好適なベクタ及びプロモータは、欧州特許第７３，６５７号に更に記載されている。酵母エンハンサも酵母プロモータとともに有利に使用される。
哺乳動物宿主細胞中のベクタからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、又は異種哺乳動物プロモータ、例えば、アクチンプロモータ若しくは免疫グロブリンプロモータから、熱ショックプロモータから得られるプロモータによって制御され得るが、但し、かかるプロモータが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモータ及び後期プロモータは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモータは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクタとして用いて哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の変化形は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモータの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関して、Ｒｅｙｅｓら、「Ｎａｔｕｒｅ」第２９７巻第５９８〜６０１頁（１９８２年）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモータとして使用され得る。
（ｅ）エンハンサエレメント成分
より高次の真核生物による抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサ配列をベクタに挿入することによって増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサ配列が現在知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサが使用されるであろう。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサ（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサ、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサが挙げられる。真核プロモータの活性化のための増強要素に関しては、Ｙａｎｉｖ、「Ｎａｔｕｒｅ」第２９７巻第１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサは、抗体コード配列の５’位又は３’位でベクタにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモータから５’部位に位置する。
（ｆ）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクタは、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。かかる配列は、一般に、真核又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第ＷＯ９４／１１０２６号及びそれに開示される発現ベクタを参照されたい。
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクタ中でのＤＮＡのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又はより高次の真核生物細胞である。この目的のための好適な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物などの真核細菌、例えば：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば大腸菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、ＳｈｉｇｅｌｌａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、並びにＢ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｉ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどが挙げられる。好ましい大腸菌クローニング宿主の１つは、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）のような他の株も適している。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。
全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、特に、治療用抗体がそれ自体が腫瘍細胞破壊に有効性を示す細胞傷害剤（例えば、毒素）にコンジュゲートされている場合のように、グリコシル化及びＦｃエフェクタ機能を必要としない場合には、細菌中で製造することができる。全長抗体は、より優れた血中半減期を有する。大腸菌での産生がより迅速であり、より費用効率が高い。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ：ＴＩＲ）及びシグナル配列を説明している、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら）、米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照のこと。また、大腸菌における抗体断片の発現を記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ、２００３年）第２４５〜２５４頁も参照されたい。発現後、本抗体は、可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから単離され得、例えば、アイソタイプに応じてタンパク質Ａ又はＧカラムにより精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物が、抗体コードベクタに好適なクローニング又は発現宿主である。より下位の真核宿主微生物の中でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は一般的なパン酵母が最も一般的に使用されている。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど、ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第ＥＰ４０２，２２６号）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第ＥＰ１８３，０７０号）、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第ＥＰ２４４，２３４号）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、並びに糸状真菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのいくつかの他の属、種、及び菌株が本明細書において一般的に利用可能であり、有用である。治療用タンパク質の産生のための酵母及び糸状菌の使用を議論するレビューについては、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」第２２巻第１４０９〜１４１４頁（２００４年）を参照のこと。
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、結果として部分的又は完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらすある特定の真菌及び酵母株が選択され得る。例えば、Ｌｉら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」第２４巻第２１０〜２１５頁（２００６年）（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化経路のヒト化について説明）、及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓら（上記）を参照されたい。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及びバリアント、並びに宿主、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ由来の対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１バリアント、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、かかるウイルスは、本開示にかかる本明細書のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、ウキクサ（Ｌｅｎｉｎａｃｅａｅ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術）を参照。
脊椎動物細胞が宿主として使用され得、培養下での脊椎動物細胞の繁殖（組織培養）が日常的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、以下のものが挙げられる：ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；ヒト胎児腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローン化された２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、「Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．」第３６巻第５９頁（１９７７年））；ベビーハムスタ腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、「Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．」第２３巻第２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；犬の腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、「Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」第３８３巻第４４〜６８頁（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及び、ヒト肝がん株（ＨｅｐＧ２）。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第７７巻：第４２１６頁（１９８０年））を含むチャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ）第２５５〜２６８頁（２００３年）を参照されたい。
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現ベクタ又はクローニングベクタで形質転換され、プロモータの誘導、形質転換対の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なものとして修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
（ｈ）宿主細胞の培養
抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。市販の培地、例えば、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が、宿主細胞の培養に好適である。また、Ｈａｍら、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．」第５８巻第４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第１０２巻第２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、若しくは同第５，１２２，４６９号、国際公開第ＷＯ９０／０３４３０号、同第ＷＯ８７／００１９５号、又は米国特許再発行第３０，９８５号に記載のいずれの培地も、宿主細胞の培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量要素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も当業者に既知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で既に使用したものであり、当業者に明らかであろう。
（ｘｉ）抗体の精製
組換え技法を使用する場合、本抗体は、細胞内で産生され得るか、ペリプラズム空間で産生され得るか、又は培地に直接分泌され得る。本抗体が細胞内で産生される場合、第１の工程として、微粒子残屑（宿主細胞又は溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第１０巻第１６３〜１６７頁（１９９２年）には、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を分離する方法が記載している。要するに、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞片は遠心分離によって除去され得る。本抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清が、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して最初に濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が前述の工程のいずれかに含まれてもよく、外来性混入物の増殖を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィが典型的に好ましい精製工程のうちの１つである。タンパク質Ａの親和性リガンドとしての好適性は、本抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．」第６２巻第１〜１３頁（１９８３年））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、「ＥＭＢＯ Ｊ．」第５巻第１５６７１５７５頁（１９８６年））。タンパク質Ｌは、カッパ軽鎖に基づいて抗体を精製するために使用され得る（Ｎｉｌｓｏｎら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．」第１６４巻第１号第３３〜４０頁、１９９３年）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスにより、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短いプロセシング時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィ、ヘパリン上でのクロマトグラフィ、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
一般に、研究、試験、及び臨床で使用するための抗体を調製するための様々な方法論が当該技術分野で充分に確立されており、上述の方法論と一致しており、かつ／又は当業者によって目的とする特定の抗体に適切であると見なされる。
Ｂ．生物学的に活性な抗体の選択
上述のように産生された抗体は、治療的観点から有益な特性を有する抗体を選択するために、１つ以上の「生物学的活性」アッセイに供され得る。抗体は、それが産生される抗原に結合するその能力についてスクリーニングされ得る。例えば、抗ＤＲ５抗体（例えば、ドロジツマブ）の場合、抗体の抗原結合特性は、死受容体５（ＤＲ５）に結合する能力を検出するアッセイで評価され得る。
別の実施形態では、抗体の親和性は、例えば、飽和結合、ＥＬＩＳＡ、及び／又は競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ）によって決定され得る。
本抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイにも供され得る。かかるアッセイが当該技術分野で既知であり、本抗体の標的抗原及び意図される使用に依存する。
目的とする抗原上の特定のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、通例のクロスブロッキングアッセイ、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載の日常的な交差遮断アッセイが行われ得る。あるいは、エピトープマッピング、例えば、Ｃｈａｍｐｅら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」第２７０巻第１３８８〜１３９４頁（１９９５年）に記載されているように、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを決定するために実施することができる。
ＩＩＩ．製剤の調製方法
本開示の特定の態様は、本明細書に記載の液体製剤のいずれかを調製する方法に関する。液体製剤は、所望の純度を有するポリペプチドをＮＡＴ及びＬ−メチオニンと混合することによって調製することができる。いくつかの実施形態では、製剤化されるポリペプチドは、事前凍結乾燥に供されておらず、本明細書における目的とする製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。更なる実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、製剤中の抗体は、Ｆ（ａｂ’）２等の抗体断片であり、この場合、完全長抗体では起こり得ない問題（抗体のＦａｂへのクリッピング等）に対処しなければならない場合がある。製剤中に存在するポリペプチドの治療有効量は、例えば、所望の用量体積及び投与様式（複数可）を考慮することによって決定される。製剤中の例示のポリペプチド濃度としては、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ超、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、又は約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び／又はチロシンから選択されるアミノ酸のうちの１つ以上は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン及び１つ以上のメチオニンは、酸化感受性である。
いくつかの実施形態では、液体製剤は、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、及び／又は等張化剤などの１つ以上の賦形剤を更に含む。本開示の液体製剤は、ｐＨ緩衝溶液中で調製される。本開示の緩衝液は、約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ｐＨは、ｐＨ４．０〜８．５の範囲、ｐＨ４．０〜８．０の範囲、ｐＨ４．０〜７．５の範囲、ｐＨ４．０〜７．０の範囲、ｐＨ４．０〜６．５の範囲、ｐＨ４．０〜６．０の範囲、ｐＨ４．０〜５．５の範囲、ｐＨ４．０〜５．０の範囲、ｐＨ４．０〜４．５の範囲、ｐＨ４．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．０〜９．０の範囲、ｐＨ５．５〜９．０の範囲、ｐＨ６．０〜９．０の範囲、ｐＨ６．５〜９．０の範囲、ｐＨ７．０〜９．０の範囲、ｐＨ７．５〜９．０の範囲、ｐＨ８．０〜９．０の範囲、ｐＨ８．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．７〜６．８の範囲、ｐＨ５．８〜６．５の範囲、ｐＨ５．９〜６．５の範囲、ｐＨ６．０〜６．５の範囲、又はｐＨ６．２〜６．５の範囲である。本発明のいくつかの実施形態では、液体製剤は、６．２又は約６．２のｐＨを有する。本発明のいくつかの実施形態では、液体製剤は、６．０又は約６．０のｐＨを有する。本発明のいくつかの実施形態では、液体製剤は、５．８又は約５．８のｐＨを有する。本発明のいくつかの実施形態では、液体製剤は、５．５又は約５．５のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲内で制御する緩衝液の例としては、有機及び無機酸並びにそれらの塩が挙げられる。例えば、酢酸塩（例えば、酢酸ヒスチジン、酢酸アルギニン、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ヒスチジン、コハク酸アルギニン、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、及びそれらの組合せ。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約６００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、製剤は、ヒスチジン緩衝液（例えば、約５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度）を含む。ヒスチジン緩衝液の例としては、塩化ヒスチジン、酢酸ヒスチジン、リン酸ヒスチジン、硫酸ヒスチジン、コハク酸ヒスチジン等が挙げられる。いくつかの実施形態では、約１０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、又は約２０ｍＭ〜約２５ｍＭの製剤中のヒスチジン。更なる実施形態では、製剤中のアルギニンは、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、又は約２００ｍＭ）である。
本開示の液体製剤は、二糖（例えば、トレハロース又はスクロース）などの糖を更に含み得る。本明細書で使用される「糖」とは、単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖等を含む、一般組成物（ＣＨ２Ｏ）ｎ及びその誘導体を含む。本明細書の糖類の例として、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロース等が挙げられる。いくつかの実施形態では、製剤は、スクロースを含む。
界面活性剤は、任意に、液体製剤に添加される。例示の界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０等）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８等）が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、それが製剤化抗体の凝集を低減させ、かつ／又は製剤中の微粒子の形成を最小限に抑え、かつ／又は吸着を低減させるような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１重量／体積％〜約１．０重量／体積％超の量で製剤中に存在し得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、約０．００１重量／体積％〜約１．０重量／体積％、約０．００１重量／体積％〜約０．５重量／体積％、約０．００５重量／体積％〜約０．２重量／体積％、約０．０１重量／体積％〜約０．１重量／体積％、約０．０２重量／体積％〜約０．０６重量／体積％、又は約０．０３重量／体積％〜約０．０５重量／体積％の量で製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、０．０４重量／体積％又は約０．０４重量／体積％の量で製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、０．０２重量／体積％又は約０．０２重量／体積％の量で製剤中に存在する。一実施形態では、製剤は、界面活性剤を含まない。
一実施形態では、製剤は、上で定義された薬剤（例えば、抗体、緩衝液、糖、及び／又は界面活性剤）を含み、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、及びベンゼトニウムＣｌ等の１つ以上の保存料を本質的に含まない。別の実施形態では、保存料が製剤中に含まれてもよく、具体的には、製剤は、複数回投与量製剤である。保存料の濃度は、約０．１％〜約２％、好ましくは、約０．５％〜約１％の範囲であり得る。１つ以上の他の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１６版（Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年））に記載のものが製剤中に含まれ得るが、但し、それらが製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないことを条件とする。本明細書に記載の例示的な薬学的に許容される賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。
製剤は、金属イオンキレート剤を更に含み得る。金属イオンキレート剤は、当業者に周知であり、これらとしては、アミノポリカルボキシレート、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＤＤＳ（ジコハク酸エチレンジアミン）、ＰＤＴＡ（１，３−プロピレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＡＤＡ（ベータ−アラニン二酢酸）、ＭＧＣＡ（メチルグリシン二酢酸）等が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。更に、本明細書のいくつかの実施形態は、ホスホネート／ホスホン酸キレート剤を含む。
等張化剤は、組成物中の液体の浸透圧を調整又は維持するために存在する。タンパク質及び抗体等の大きい荷電生体分子とともに使用される場合、張性剤は、それらがアミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を低減させ得るため、「安定剤」としての役割も果たし得る。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％〜２５重量％、又はより好ましくは、１重量％〜５重量％の量で存在し得る。好ましい等張化剤としては、多価糖アルコール、好ましくは、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
本明細書に記載の製剤は、必要に応じて、治療される特定の適応症のための１つよりも多くのポリペプチド若しくは小分子薬物、好ましくは、他のポリペプチドに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含み得る。例えば、抗体が抗ＤＲ５（例えば、ドロジツマブ）である場合、それは、別の薬剤（例えば、化学療法剤及び抗腫瘍剤）と組み合わせられ得る。
いくつかの実施形態では、製剤は、インビボ投与のためのものである。いくつかの実施形態では、製剤は、滅菌である。製剤は、滅菌濾過膜を通す濾過によって滅菌にされ得る。本明細書における治療製剤は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有する静脈注射用溶液袋又はバイアル内に置かれる。投与経路は、好適な様式での長期間にわたる単回又は複数回ボーラス又は注入、例えば、皮下注射若しくは注入、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、関節内、又は硝子体内経路、局所投与、吸入、又は持続放出若しくは徐放手段等の既知の認められている方法に従うものである。
本開示の液体製剤は、保管時に安定し得る。いくつかの実施形態では、液体製剤中のポリペプチドは、約０〜約５℃（例えば、約１、２、３、又は４℃のうちのいずれか）での少なくとも約１２ヶ月間（例えば、少なくとも約１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６ヶ月間、又はそれ以上のうちのいずれか）の保管時に安定している。いくつかの実施形態では、液体製剤中のポリペプチドの物理的安定性、化学的安定性、又は生物学的活性が評価又は測定される。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、安定性及び生物学的活性を評価することができる。いくつかの実施形態では、安定性は、保管後の液体製剤中のポリペプチドの酸化によって測定される。安定性は、製剤化前後、並びに保管後の製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、及び／又は生物学的活性を評価することによって試験され得る。物性及び／又は安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィを使用して、濁度を測定することにより、かつ／又は目視検査により）；カチオン交換クロマトグラフィ、又はキャピラリゾーン電気泳動を使用した電荷不均一性の評定；アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元されたインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシン又はＬＹＳ−Ｃ）分析；タンパク質の生物学的活性又は抗体の抗原結合機能等の評価等を含む様々な異なる方法で質的及び／又は量的に評価され得る。不安定性は、凝集、脱アミド（例えば、Ａｓｎ脱アミド）、酸化（例えば、Ｔｒｐ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化差異等を生じ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質における酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、又はトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上を使用して決定される。いくつかの実施形態では、抗体における酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、又はトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上、及び以下の式を使用して、ある割合として決定される。
Figure 2021533149
本明細書ではまた、液体製剤の製造方法、又は液体製剤中のポリペプチドの酸化を防止する方法も提供され、該方法は、液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する量のＮＡＴ及びＬ−メチオニンを添加することを含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、抗体を含む。ポリペプチドの酸化を低減又は防止するＮＡＴ及びＬ−メチオニンの量は、本明細書に開示される量のいずれかであり得る。
ＩＶ．酸化を低減する方法
本開示のある特定の態様は、液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減又は防止する量のＮＡＴ及びＬ−メチオニンを添加することを含む、液体製剤中のポリペプチド（例えば、本明細書に記載のポリペプチドのいずれか）の酸化を低減する方法に関する。いくつかの実施形態では、Ｎａｔ及びＬ−メチオニンを含む液体製剤は、本明細書に記載の液体製剤のいずれかである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び／又はチロシン残基の１つ以上は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基及び１つ以上のメチオニン残基は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のポリペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ以上の賦形剤を更に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、医薬製剤（例えば、ヒト対象への投与に好適）である。
例えば、本開示の製剤は、モノクローナル抗体（例えば、抗体中の１つ以上のトリプトファン残基及び１つ以上のメチオニン残基で）の酸化を防止する、本明細書に提供されるようなモノクローナル抗体、ＮＡＴ、及びＬ−メチオニンと、製剤のｐＨを所望のレベルに維持する緩衝液と、を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、本明細書で提供されるＮＡＴの濃度のいずれかである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．３ｍＭである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１．０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基（例えば、本明細書に記載される抗体の１つ以上のトリプトファン残基のいずれか）の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化）は、約４０％〜約１００％、例えば４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値間の任意の範囲を含む）のいずれかの分だけ低減される（例えば、ＮＡＴを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するトリプトファン残基と比較して）。いくつかの実施形態では、約４０％以下〜０％、例えば約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％のいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む）のポリペプチドしか酸化されない（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基で酸化されている）。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、活性酸素種（ＲＯＳ）によるポリペプチドの酸化を防止する。
いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＬ−メチオニンの量は、本明細書で提供されるＬ−メチオニンの濃度のいずれかである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＬ−メチオニンの量は、約５．０ｍＭである。いくつかの実施形態では、Ｌ−メチオニンは、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基（例えば、本明細書に記載される抗体の１つ以上のメチオニン残基のいずれか）の酸化を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化）は、約４０％〜約１００％、例えば４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（これらの値間の任意の範囲を含む）のいずれかの分だけ低減される（例えば、Ｌ−メチオニンを欠く液体製剤中のポリペプチドにおける１つ以上の対応するメチオニン残基と比較して）。いくつかの実施形態では、約４０％以下〜０％、例えば約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％のいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む）のポリペプチドしか酸化されない（例えば、ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基で酸化されている）。いくつかの実施形態では、Ｌ−メチオニンは、活性酸素種（ＲＯＳ）によるポリペプチドの酸化を防止する。
いくつかの実施形態では、製剤中のポリペプチド（例えば、抗体）濃度は、本明細書に記載のポリペプチド濃度（例えば、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ）のいずれかである。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性、三重特異性等）、又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ以上の賦形剤を更に含む。例えば、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、等張化剤、及びそれらの任意の組合せを含む、当該技術分野で公知である任意の好適な賦形剤を、本明細書に記載の製剤中で使用することができる。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のｐＨのほぼいずれかのｐＨ（例えば、約４．５〜約７．０）を有する。
Ｖ．製剤の投与
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の製剤のいずれかの対象への投与に関する。いくつかの実施形態では、本開示の液体製剤は、対象への投与に適した薬品の調製に使用することができる（例えば、対象のがんを治療又は予防するため）。液体製剤は、ボーラスとしての静脈内投与、又はある期間にわたる連続注入による投与、筋肉内、腹腔内、脳室内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、吸入、又は硝子体内経路による投与などの既知の方法に従って、ポリペプチド（例えば、抗体）での治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することができる。いくつかの実施形態では、液体製剤は、静脈内、硝子体内、又は皮下投与によって対象へ投与される。いくつかの実施形態では、液体製剤は、硝子体内投与によって対象へ投与される。いくつかの実施形態では、液体製剤は、皮下投与によって対象へ投与される。
ポリペプチドの適切な投薬量（「治療有効量」）は、例えば、治療される状態、状態の重症度及び経過、ポリペプチドが予防目的又は治療目的のために投与されるか、以前の療法、患者の病歴及びポリペプチドへの応答、使用されるポリペプチドの種類、並びに主治医の裁量に依存する。ポリペプチドは、一度に又は一連の治療にわたって患者に好適に投与され、診断時から任意の時点で患者に投与され得る。ポリペプチドは、単一治療として、又は問題になっている状態の治療に有用な他の薬物若しくは療法とともに投与され得る。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、治療的処置及び予防的手段又は予防手段の両方を指す。治療を必要とする者としては、障害を既に有する者、並びに障害が予防されるべき者が挙げられる。本明細書で使用される場合、「障害」とは、対象を問題になっている障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性障害又は疾患を含むが、これらに限定されない、治療から利益を享受するであろう任意の状態である。
薬理学的な意味で、本開示との関連で、ポリペプチド（例えば、抗体）の「治療有効量」とは、抗体が有効である治療のための障害の予防又は治療に有効な量を指す。いくつかの実施形態では、投与されるポリペプチドの治療有効量は、１回以上の投与によるかにかかわらず、約０．１〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇ（例えば、約０．３〜約２０ｍｇ／患者体重ｋｇ、又は約０．３〜約１５ｍｇ／患者体重ｋｇ）の範囲であろう。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの治療有効量は、１日用量として、又は複数回の１日用量として投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの治療有効量は、週１回又は月１回等の１日１回よりも低い頻度で投与される。例えば、ポリペプチドは、１週間以上毎（例えば、１、２、３、若しくは４週間毎、若しくはそれ以上、又は１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月毎、若しくはそれ以上）に約１００〜約４００ｍｇ（例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００ｍｇのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））の用量で投与され得るか、又は１週間以上毎（例えば、１、２、３、若しくは４週間毎、若しくはそれ以上、又は１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月毎、もしくそれ以上）に約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、若しくは２０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。用量は、注入物等の、単回用量として、又は複数回用量（例えば、２、３、４回、又はそれ以上の用量）として投与され得る。この療法の進展は、従来の技法によって容易に監視される。
ＶＩ．製品及びキット
本開示のある特定の態様は、本開示の液体製剤のいずれかを保持する容器を含む、製品又はキットに関する。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、及びシリンジが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。例示の容器には、２〜２０ｃｃの単回使用ガラスバイアルがある。あるいは、複数回投与量製剤の場合、容器は、２〜１００ｃｃのガラスバイアルであり得る。容器は、製剤を保持し、容器上のラベル又は容器に関連するラベルは、使用に関する指示を示し得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、及び使用に関する指示を有する添付文書を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得る。いくつかの実施形態では、製品又はキットは、液体製剤の使用に関する説明書を備える添付文書を更に含む。添付文書とは、かかる治療剤製品の適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌症についての情報、及び／又はその使用に関する警告を含む、治療薬の商用のパッケージに通例含まれる説明書を指し得る。
種々の目的、例えば、液体製剤中のポリペプチドの酸化を低減するため、又はポリペプチドの酸化を低減するための液体製剤をスクリーニングするために有用なキットもまた、提供される。本開示のキット内に供給される指示は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キット内に含まれる紙シート）上の文書による指示であるが、機械可読指示（例えば、磁気又は光学記憶ディスク上で配信される指示）も許容される。
本明細書は、当業者が本開示を実践することを可能にするのに充分なものであると見なされる。本明細書に示されて説明される修正に加えて、本開示の様々な修正は、前述の説明から当業者に明らかになり、それらは添付の特許請求の範囲内のものである。
本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されることになる。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮に入れた様々な修正又は変更が当業者に提案されており、本明細書の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例１：酸化からのＮＡＴ保護の評価
以下の研究は、生物療法薬の製剤成分としてのＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）及び／又はＬ−メチオニンの抗酸化効果及び安全性を評価するために実施した。２，２’−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）、メチオニン及びトリプトファン残基の両方を酸化する能力を有する活性酸素種を生成するアゾ化合物（Ｊｉら（２００９年）「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．」第９８巻第１２号第４４８５〜４５００頁）、並びに光曝露を、それらが製造及び／又は長期保存（Ｇｒｅｗａｌら（２０１４年）「Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．」第１１巻第４号第１２５９−１２７２頁）中に抗体が曝露される可能性がある一般的な酸化経路を示すため、以下の研究の酸化モデルとして選択した。
材料及び方法
材料
ＭＡｂ１及びｍＡｂ２は、酸化感受性のトリプトファン及びメチオニン残基を持つＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Ｄｉｏｎら、原稿準備中）。ｍＡｂを、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィを含む一連のクロマトグラフィ工程によって精製し、特に明記しない限り、界面活性剤又は他の賦形剤を含まないｐＨ５．５の低イオン強度酢酸ナトリウム緩衝液中に処方した。
Ｌ−メチオニン及びＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）は味の素ノースアメリカ社（ノースカロライナ州ローリー）から購入した。２，２’−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州ラホヤ）から購入した。トリプシン（質量分析グレード）はＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から購入した。高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）グレードのアセトニトリル及び水は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニュージャージー州フェアローン）から購入した。緩衝液調製に使用した水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）から得た。
ＮＡＴ抗酸化効果の評価
酸化感受性残基の特定及びモニタリング
抗体をＡＡＰＨストレスに供した、続いてペプチドマッピングを行って、酸化に感受性なＣＤＲ及びＦｃ残基を特定した（Ｄｉｏｎら、原稿準備中）。Ｋａｂａｔナンバリングを使用して可変断片（Ｆｖ）残基を特定したが、ＥＵ命名法（Ｅｄｅｌｍａｎら（１９６９年）「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第６３巻第１号第７８〜８５頁）を使用してＦｃ残基を特定した。残基が対照と比較して５％を超えて酸化された場合、感受性であると見なされ、実験の過程を通してモニタされた。ペプチドのマッピング及び分析の情報は、Ｄｉｏｎら（原稿準備中）に報告された。手短に言えば、試料は変性され、還元され、カルボキシルメチル化され、そしてトリプシン消化に供された。ペプチドを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ高分解能質量分析計に連結したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ−Ｃｌａｓｓ ＵＨＰＬＣ上の水／アセトニトリル／ギ酸勾配を用いて、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣペプチドＣＳＨ Ｃ １８カラム上で分離した。データはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＰｅｐＦｉｎｄｅｒ（商標）及びＸｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアを用いて処理した。天然及び酸化ペプチドの最も豊富な電荷状態を用いて、モノ同位体ｍ／ｚの抽出イオンクロマトグラム上で積分を行った。酸化パーセントは、酸化ペプチドのピーク面積を、天然及び酸化ペプチドの合計ピーク面積で割ることによって計算した。主要なトリプトファン分解産物（＋１６及び＋３２、加えて、高度に酸化された部位では＋４、＋２０、及び＋４８）を合計し、トリプトファン酸化を算出した。メチオニンスルホキシド（Ｍ＋１６）のみを使用してメチオニン酸化を算出したが、メチオニンスルホン（Ｍ＋３２）はこれらの条件下では観察されなかった。２つのソフトウェアパッケージが異なる回答を提示した場合、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）データは、データを手動で確認した後に報告した。
ＡＡＰＨ化学酸化ストレスモデル
抗体を、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、２ｃｃのガラスバイアル中で調製した。ＮＡＴを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５におけるの３ｍＭ ＮＡＴのストック溶液から０．０５ｍＭ及び０．３ｍＭの最終濃度まで添加した。Ｌ−メチオニンを、特定の試料について、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中において、５０ｍＭストック溶液から５ｍＭの最終濃度まで添加した。１１ｍＭのストック溶液由来のＡＡＰＨを、１ｍＭの最終濃度まで添加した。当量の水を、対照試料のためＡＡＰＨの代わりにタンパク質アリコートへ添加した。ＡＡＰＨ又は水の添加後、試料を４０℃で１６時間インキュベートした。対照試料も直ちに−７０℃で凍結した。遊離ラジカル発生反応を、Ｌ−メチオニン対ＡＡＰＨが２０：１の比のＬ−メチオニンでクエンチし、次いで、各試料を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて製剤緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭスクロース、ｐＨ５．５）中に緩衝液交換し、ＬＣ−ＭＳペプチドマッピングによる分析のための調製において、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて最終濃度１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
露光ストレスモデル
光安定性試験は、ガラスバイアル中１０ｍｇ／ｍＬの試料を、Ａｔｌａｓ ＳｕｎＴｅｓｔ ＣＰＳ＋Ｘｅｎｏｎ Ｌｉｇｈｔ ｂｏｘ（イリノイ州シカゴ）中において、合計３００キロルクス時間の可視光及び５０ Ｗ・ｈ／ｍ２の近ＵＶ（３２０〜４００ｎｍ）光に曝露することによって実施した。ＮＡＴを、上記のストック溶液から０．０５、０．１、０．３、０．５、又は１．０ｍＭの最終濃度まで添加した。対照試料をアルミホイルで包み、実験用バイアルに沿って配置した。曝露後、ＬＣ−ＭＳペプチドマッピングによる分析に備えて、試料を−７０℃で保存した。
ＮＡＴ及びＬ−メチオニンの安全性評価
インシリコ変異原性及び発がん性予測
ＮＡＴの変異原性と発がん性の可能性は、Ｄｅｒｅｋ Ｎｅｘｕｓ（プログラムバージョン２．０．２．２０１１１１２９１３２２；Ｌｈａｓａ Ｌｉｍｉｔｅｄ（リーズ、英国））及びＬｅａｄｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ｍｏｄｅｌ Ａｐｐｌｉｅｒバージョン１．５．０；Ｌｅａｄｓｃｏｐｅ Ｉｎｃ．（オハイオ州コロンバス））のインシリコモデリングツールを用いて評価した。
インビトロ受容体結合及び機能評価
ＮＡＴの活性は、結合、細胞及び核受容体機能、並びに組織バイオアッセイで評価した。ニューロキニン−１（ＮＫ−１）受容体への結合を、受容体を内在的に発現するＵ３７３ＭＧヒト星状細胞腫細胞（Ｅｉｓｔｅｔｔｅｒら（１９９２年）、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ Ｕ３７３ＭＧ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．」、「Ｇｌｉａ」第６巻第２号第８９〜９５頁；Ｈｅｕｉｌｌｅｔら（１９９３年）「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ」第６０巻第３号第８６８〜８７６頁）において評価し、参照アゴニスト［Ｓａｒ９、Ｍｅｔ（Ｏ２）１１］−ＳＰ、又は参照アンタゴニストＬ７３３，０６０と比較した。ＮＡＴ又は参照化合物を、室温でＵ３７３ＭＧ細胞とインキュベートした。全濃度を２回アッセイした。
ＮＫ−１受容体を介して作用する物質Ｐは、ヒト及び非臨床種の両方において血管緊張を調節することが示されている（Ｃｏｇｅ及びＲｅｇｏｌｉ、（１９９４年）「｛Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ」第２６巻第６号３８５〜３９０頁；Ｓｈｉｒａｈａｓｅら、（２０００年）「Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ」第１２９巻第５号第９３７〜９４２頁）。ＮＫ−１受容体におけるＮＡＴの特異的活性の可能性を評価するため、インタクトな内皮を有するウサギ肺動脈の輪を、酸素添加（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）し予め加温した（３７℃）生理食塩水（ｍＭ）：ＮａＣｌ １１８．０、ＫＣｌ ４．７、ＭｇＳＯ４ １．２、ＣａＣｌ２ ２．５、ＫＨ２ＰＯ４ １．２、ＮａＨＣＯ３ ２５、及びグルコース１１．０（ｐＨ７．４）を満たした２０ｍＬのオルガンバス中に懸濁した。プロプラノロール（１μＭ）、ピリラミン（１μＭ）、アトロピン（１μＭ）、及びメチセルジド（１μＭ）は、それぞれ、β−アドレナリン、ヒスタミンＨ１、ムスカリン、及び５−ＨＴ２受容体をブロックするために、実験を通して存在した。組織を等尺性張力記録のため力変換器に接続し、２ｇの静止張力まで伸長し、次いで６０分間平衡させ、その間に繰り返し洗浄し、張力を再調節した。実験は、８つのオルガンバスを有する半自動単離臓器システムを用いて、多チャンネルデータ収集により行った。測定したパラメータは、各化合物の濃度によって誘起される張力の最大変化量であった。
アゴニスト活性を評価するために組織をノルエピネフリン（０．１μＭ）で収縮させ、反応性を確認するために参照アゴニスト［Ｓａｒ９、Ｍｅｔ（Ｏ２）１１］−ＳＰ（０．００１μＭ）の亜最大濃度に曝露し、対照的な緩和を得た後、洗浄した。その後、組織をノルエピネフリンで４５分毎に収縮させ、高濃度のＮＡＴ又は参照アゴニストに曝露させ、次いで洗浄した。各化合物濃度は、安定した反応が得られるまで、又は最大１５分間、組織と接触させた。アゴニスト様反応（緩和）が得られた場合、この反応におけるＮＫ１受容体の関与を確認するために、３０分前に追加した参照アンタゴニストｓｐａｎｔｉｄｅ ＩＩ（１μＭ）の存在下において、最高濃度の化合物を再度試験した。
アンタゴニスト活性を評価するために、組織をノルエピネフリン（０．１μＭ）で収縮させ、参照アゴニスト［Ｓａｒ９、Ｍｅｔ（Ｏ２）１１］−ＳＰ（０．００１μＭ）の亜最大濃度に曝露して、対照的な緩和を得た後、洗浄した。このシーケンスを、［Ｓａｒ９、Ｍｅｔ（Ｏ２）１１］−ＳＰへの曝露の３０分前に各々追加した、高濃度のＮＡＴ又は参照アンタゴニストであるｓｐａｎｔｉｄｅ ＩＩの存在下において、４５分毎に繰り返した。
ＮＡＴ／Ｌ−メチオニン製剤のインビボ忍容性
動物で実施される全ての手順は、動物福祉法、実験動物の管理及び使用に関するガイド（ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）、並びに実験動物福祉局（ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ）に準拠している。プロトコルは該当する動物実験委員会によって承認された。
単回投与ウサギ硝子体内忍容性試験
網膜障害の治療を目的とした製品を支持する急性忍容性を評価するために、オスのニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ：ＮＺＷ）ウサギに、等張性ビヒクル製剤（ｎ＝２）、又は５ｍＭ ＮＡＴ及び２５ｍＭ Ｌ−メチオニンを含むビヒクル製剤（ｎ＝３）のいずれかの単回投与を、両側からの硝子体内注射（５０ｕＬ／眼）で行った。
試験日１日目に、動物へビヒクル溶液を投与した。毒性の評価は、臨床観察、眼圧（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＩＯＰ）測定、及び眼科検査に基づいて行った。８日目の剖検では、目及び視神経を採取し、ヘマトキシリン及びエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ：Ｈ＆Ｅ）染色のために処理し、米国獣医病理学会（ＡＣＶＰ認定獣医病理学者）が顕微鏡的に分析した。
反復投与によるウサギ硝子体内毒物学試験
網膜障害の治療を目的とした製品の支持における優良試験所基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＬＰ）毒性試験を、オス及びメスＮＺＷウサギを対象に実施した。動物（ｎ＝５／性別）に、ビヒクル製剤（ｐＨ５．５で１ｍＭ ＮＡＴ、５ｍＭ Ｌ−メチオニンを含有する等張溶液）を、隔週１回（１日目、１５日目、２９日目、及び４３日目）の両側硝子体内注射（５０ｕＬ／眼）によって投与した。毒性の評価は、臨床観察、体重測定、眼科検診、眼圧測定、眼内写真、及び臨床病理学に基づいて行った。４５日目の剖検では、組織の包括的なセットを収集し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理し、ＡＣＶＰ認定の獣医病理学者が顕微鏡的に分析した。
反復投与によるカニクイザル毒物学試験−硝子体内投与
網膜障害の治療を目的とした製品を支持するＧＬＰ毒性試験を、オス及びメスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を対象に実施した。動物（ｎ＝５／性別）に、ビヒクル製剤（ｐＨ５．５で１ｍＭ ＮＡＴ、５ｍＭ Ｌ−メチオニンを含有する等張溶液）を、１０週の期間にわたって隔週１回（１日目、１５日目、２９日目、４３日目、５７日目、及び７１日目）の両側硝子体内注射（５０ｕＬ／眼）によって投与した。毒性の評価は、臨床観察、身体検査、心電図、眼科検査、スペクトラルドメイン光干渉断層撮影（ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）、眼内写真、蛍光眼底血管撮影、網膜電図検査、及び臨床病理学に基づいて行った。７２又は９９日目の剖検では、組織の包括的なセットを収集し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理し、ＡＣＶＰ認定の獣医病理学者が顕微鏡的に分析した。
反復投与によるカニクイザル試験−皮下投与
代謝疾患の治療を目的とした製品を支持するＧＬＰ毒性試験を、オス及びメスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を対象に実施した。動物（ｎ＝８／性別）に、ビヒクル製剤（ｐＨ５．８で０．３ｍＭ ＮＡＴ、５ｍＭ Ｌ−メチオニンを含有する等張溶液）を、４週間にわたって隔週１回（１日目、８日目、１５日目、２２日目、及び２９日目）で皮下（０．１ｍＬ／ｋｇ）投与した。毒性の評価は、臨床観察、身体検査、神経学的及び眼科的検査、臨床病理学的検査、及び尿検査に基づいて行った。３２又は９９日目の剖検では、組織の包括的なセットを収集し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理し、ＡＣＶＰ認定の獣医病理学者が顕微鏡的に分析した。
結果
ＡＡＰＨ遊離ラジカル化学酸化ストレス
ＡＡＰＨストレス試験は、溶液中の遊離ラジカルへの曝露時における、感受性の高いトリプトファン及びメチオニン残基に対するＮＡＴの抗酸化特性を決定するために実施した。以前に報告されたように（Ｄｉｏｎら、原稿準備中）、ｍＡｂ１のペプチドマッピングは、２つの感受性なＣＤＲトリプトファン残基、Ｗ５２ａ及びＷ１００ｂ、並びにＦｖメチオニンＨＣ Ｍ８２を示した。ｍＡｂ２については、各々が複数の感受性残基を含む２つのペプチドが特定された（ＣＤＲ Ｈ１ Ｗ３３／Ｍ３４／Ｗ３６及びＣＤＲ Ｈ３ Ｗ９９／Ｗ１００ａ、並びにＦｖ Ｗ１０３）。複数の感受性残基を有するこれらの２つのペプチドについて、各ペプチドの合計酸化値を本明細書に示す。ＦｃＲｎ受容体と相互作用するＦｃメチオニン残基２５２及び４２８もまた、過去の文献（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔら、２００９年）と一致して、両方の分子において酸化ストレスに感受性であることが見出された。抗酸化効力に対するＮＡＴ濃度の効果を決定するために、製剤中のＮＡＴ濃度を０ｍＭ〜０．３ｍＭの間で変化させ、製剤化されたｍＡｂをＡＡＰＨストレスに曝した（図１）。ＮＡＴなしでは、感受性トリプトファン残基を有するＦｖペプチドの酸化レベルは、ＡＡＰＨストレス時に１１％（ｍＡｂ１のＷ１００ｂ）、６０％（ｍＡｂ１のＷ５２ａ）、及び８７％（ｍＡｂ２のＷ９９／Ｗ１００ａ／Ｗ１０３）増加した。これらの初期開始値により、ＮＡＴの影響を試験するための広範な酸化感受性が得られた。トリプトファン残基の安定化に必要なＮＡＴの最小濃度は、残基の初期ＡＡＰＨ感受性と相関した（図１Ａ）。ｍＡｂ１ Ｗ１００ｂの酸化は０．０５ｍＭ ＮＡＴの添加により５％に低下したが、ｍＡｂ１ Ｗ５２ａは、酸化を５％に低下させるために０．３ｍＭ ＮＡＴの添加を必要とした。対照的に、ｍＡｂ２のＷ９９／Ｗ１００ａ／Ｗ１０３の酸化は、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、及び０．３ｍＭのＮＡＴの添加で、それぞれ、７７％、６２％、及び８％に低下しただけであった。ｍＡｂ２上のＷ３３／Ｍ３４／Ｗ３６を含むペプチドはＮＡＴ濃度の増加とともに概して同様に減少したが、そのペプチド中の個々のトリプトファン及びメチオニン残基に対する相対的効果は、明確には決定できなかった。ｍＡｂ１中のより感受性の低いＭ８２残基はＮＡＴの非存在下で最小限に酸化され（３％）、ＮＡＴの包含は、小さな効果を示した（０．３ｍＭ ＮＡＴで１％酸化までのわずかな減少）。
Ｆｃメチオニン酸化におけるＮＡＴ濃度の影響もまた評価した（図１Ｂ）。ＮＡＴなしでは、両ｍＡｂのＭ２５２及びＭ４２８の酸化レベルは、ＡＡＰＨ曝露後に１１％〜１６％の間であった。ＮＡＴによる酸化から大きく保護されたＣＤＲ残基とは対照的に、Ｆｃメチオニン残基の酸化は、ＮＡＴの添加により悪化した。試験した最高レベル（０．３ｍＭ ＮＡＴ）では、Ｆｃメチオニン残基の酸化は、ＮＡＴなしの対応する条件と比較して６％〜１２％増加した。
ＮＡＴはＣＤＲ及びＦｖトリプトファン残基を酸化（０．３ｍＭ ＮＡＴで１０％未満の酸化）から保護した（図１Ａ）が、Ｆｃメチオニン残基の酸化を増悪させた（図１Ｂ）ので、ＮＡＴと共製剤化したＬ−メチオニンを含む実験群を抗酸化効果試験に含めた。Ｌ−メチオニン単独（５ｍＭ）はＡＡＰＨ感受性トリプトファン残基に混合効果を及ぼし、ｍＡｂ１のわずかな改善及びｍＡｂ２酸化レベルの無影響又はわずかな悪化を示した（図２Ａ）。Ｆｃメチオニン酸化レベルはＬ−メチオニン単独の添加で両分子とも２％以下に減少した（図２Ｂ）。０．３ｍＭ ＮＡＴと５ｍＭ Ｌ−メチオニンとの組合せは、ＡＡＰＨ誘導酸化をＣＤＲトリプトファン残基では５％未満まで、Ｆｃメチオニン残基では２％未満まで効果的に減少させ、抗酸化剤賦形剤の組合せは試験した条件下で酸化レベルを制御するための最も効果的なアプローチとなった（図２Ａ〜図２Ｂ）。
露光ストレス：高強度ＵＶ
タンパク質（１０ｍｇ／ｍＬ）を、高強度ＵＶ成分（３００キロルクス時間の可視光及び５０Ｗ・ｈ／ｍ２の近ＵＶ（３２０〜４００ｎｍ）光を６時間照射）を伴う光ストレスに種々のＮＡＴ濃度（０〜１ｍＭ ＮＡＴ）で曝露して、光酸化に対する抗酸化剤としてのＮＡＴの有効性を決定した（図３Ａ〜図３Ｂ）。ＮＡＴが感光性であるという報告に基づき、ＡＡＰＨ試験と比較して、より広いＮＡＴ濃度範囲が含まれた（Ｃｈｉｎら、（２００８年）「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」第１３０巻第２２号第６９１２〜６９１３頁）。試験した条件下では、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２中のＣＤＲ及びＦｖ残基の大部分は、酸化レベルが１％以下であった。２つのペプチドのみが、試験した光条件（ｍＡｂ１ Ｗ５２ａ（３％）及びｍＡｂ２のＷ９９／Ｗ１００ａ／Ｗ１０３（６％））に感受性を示した（図３Ａ）。これらの部位の酸化は、０．１ｍＭ以上のＮＡＴの添加による影響が最小限（ｍＡｂ１ Ｗ５２ａでは１％未満の変化、ｍＡｂ２のＷ９９／Ｗ１００ａ／Ｗ１０３では１〜２％の増加）であった。抗酸化剤を含まない条件下において光酸化に非感受性であると決定された残基は、試験条件下でＮＡＴを製剤に添加した場合、光に非感受性なままであった。
Ｆｖ残基とは対照的に、Ｆｃメチオニン残基は、ＵＶ光ストレス及びＮＡＴの添加に感受性であった（図３Ｂ）。例えば、Ｆｃメチオニン残基Ｍ２５２の酸化は、ｍＡｂ１中においてＮＡＴなしで８％から１ｍＭ ＮＡＴの存在下で１９％へ、ｍＡｂ２では１６％から３１％へと増加した。これらの結果から、ＡＡＰＨストレスの場合と同様に、ＵＶ光ストレス条件下では、ＮＡＴがＦｃメチオニン残基の酸化レベルを上昇させることが示唆された。
ＮＡＴによるＦｃメチオニンの感作がＬ−メチオニンの添加により減少するかどうかを決定するために、ＵＶ光条件下におけるＮＡＴ及びＬ−メチオニンの個別及び組合せでの影響を評価した。５ｍＭ Ｌ−メチオニンの添加は、単独で、又は０．３ｍＭ ＮＡＴとの組合せで、この酸化モデルにおいてＣＤＲ及びＦｖ残基に有益な影響を与えなかった（図４Ａ）。ＵＶ光誘発性Ｆｃメチオニン酸化は、５ｍＭ Ｌ−メチオニンによって改善された（図４Ｂ）が、その効果はＡＡＰＨモデルほど有意ではなかった。Ｌ−メチオニン（５ｍＭ）とＮＡＴ（０．３ｍＭ）との組合せは、この強いＵＶ光酸化モデルにおいて、賦形剤なしの条件又はＬ−メチオニン単独のいずれかと比較して、光酸化からのＣＤＲトリプトファン又はＦｃメチオニンのわずかな保護をもたらした。
ＮＡＴ及びＬ−メチオニンの安全性評価
ＮＡＴ及びメチオニンが非経口製剤のためのＦＤＡ不活性成分リストに存在し、急性設定での危険性の同定なしに安全に使用されていることを考慮して、皮下又は硝子体内投与を意図した製剤でのそれらの使用を支持するために、簡略化した安全性リスク評価を実施した。ＮＡＴとＬ−メチオニンとの組合せのインビボ忍容性試験を、両方の新しい投与経路に対して行った。加えて、ＮＡＴがＮＫ−１受容体のアンタゴニストとして作用する可能性を文献報告が示唆したので、インシリコ毒性評価及びＮＫ−１受容体結合のインビトロ評価をＮＡＴに対し行った。
ＮＡＴのインシリコ評価
Ｄｅｒｅｋとは経験的／規則に基づくシステムであり、試験化合物（すなわち、ＮＡＴ）の構造的特徴を、そのデータベース中の毒性作用の原因と考えられる分子の部分（トキソコフォア）と比較することによって予測を導き出す。ＮＡＴの構造をＤｅｒｅｋ Ｎｅｘｕｓデータベースに送信すると、「報告なし」という結果が返った。
Ｌｅａｄｓｃｏｐｅ（登録商標）は、遺伝毒性を予測するために事前に訓練されたモデルを含む定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：ＱＳＡＲ）システムであり、該システムは、米国ＦＤＡとの共同研究により開発され、高い感度及び負の予測性を示している（Ｓｕｔｔｅｒら（２０１３年）「Ｒｅｇ．Ｔｏｘ．Ｐｈａｒｍ．」第６７巻第１号第３９〜５２頁）。Ｌｅａｄｓｃｏｐｅ（登録商標）は、合計４０のモデルで陽性結果の可能性を評価した。これらのうち、２つのモデルのみが陽性と予測され，残りの３８モデルは陰性と予測された（すなわち、毒性の予測なし）。遺伝毒性カテゴリでは、「他の細胞における姉妹染色分体交換（ｓｉｓｔｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ：ＳＣＥ）」モデルが陽性であり、予測陽性確率は０．８２９であった。対照的に、他の２つのＳＣＥモデル（ＳＣＥインビトロ及びＳＣＥインビトロＣＨＯ）は両方とも陰性であった。げっ歯類発がん性カテゴリでは、「発がん性マウスオス」モデルが０．６２２の陽性予測確率で陽性と予測された。０．４〜０．６の予測確率は、Ｌｅａｄｓｃｏｐｅ（登録商標）ツールでは限界予測と見なされる。このモデルの２回目の解析では陰性の予測値が得られ、マウスの発がん性（オス及びメス合算）に関する全体的な予測値は陰性であった。
インビトロ受容体結合及び機能評価
ＮＫ−１受容体への参照化合物（Ｓａｒ９、Ｍｅｔ（Ｏ２）１１）−ＳＰ及びＬ７３３，０６０）のアゴニスト及びアンタゴニスト結合に対するＩＣ５０は、それぞれ、４．２−１０Ｍ及び４．７−１０Ｍであった。対照的に、ＮＫ−１受容体へのＮＡＴのアゴニスト又はアンタゴニスト結合のいずれかに対するＩＣ５０値は計算できず、このアッセイで用いた条件下におけるＮＡＴの活性の欠如を示した。
インビボ忍容性評価−ウサギ及びカニクイザルの毒物学試験
最大５ｍＭのＮＡＴ及び最大２５ｍＭのＬ−メチオニンを含むビヒクル製剤は、最長６週間の単回及び反復投与の両方によるウサギの硝子体内投与で良好な忍容性を示した。０．３ｍＭ ＮＡＴ及び１ｍＭ Ｌ−メチオニンを含むビヒクル製剤の投与は、最長７週間の隔週の硝子体内投与によって、及び同様に、最長４週間の皮下投与の毎週投与によって、カニクイザルにおいて良好な忍容性を示した。いずれの種においても、ビヒクルに関連した臨床観察体重、又は身体検査、神経学的検査若しくは眼科学的検査、眼圧、ＯＣＴ、眼内写真、蛍光眼底血管撮影、網膜電図検査、血液学的検査、血液凝固及び臨床化学的パラメータ、尿検査、又は肉眼的若しくは顕微鏡的病理学的検査における変化は認められなかった。
まとめると、本明細書で提供される試験は、ＡＡＰＨ分解によって生成されるＲＯＳからＣＤＲトリプトファン残基をＮＡＴが保護するのに効果的である一方で、Ｆｃメチオニン残基を化学的及び光誘導酸化に感作させた可能性があることを実証した。ＮＡＴへのＬ−メチオニンの添加は、化学的に誘発された酸化からトリプトファン及びメチオニン残基の両方を効果的に保護し、かつ光酸化レベルは、試験された条件では抗酸化剤を使用しない製剤で見られるレベルと同等又はそれ以下であった。これらの研究は、ＮＡＴとＬ−メチオニンとの組合せが、生物治療用製造及び貯蔵の間に一般的に起こる酸化ストレスのタイプから保護することができることを実証した。重要なことに、安全性評価によって、両賦形剤とも忍容性が良好であることが確認された。したがって、本明細書に示した証拠は、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンが生物治療製剤中の抗酸化剤賦形剤として安全かつ効果的であり得、トリプトファン及び／又はメチオニン酸化の管理のための製剤開発における重要な新規の選択肢を提供することを示唆した。
実施例２．抗酸化剤はＡＡＰＨストレス試験で酸化を低減させる
二重特異性抗体である抗体Ｍａｂ３を使用して、ＮＡＴ＋メチオニンの抗酸化能を評価した。Ｍａｂ３を、１ｍｇ／ｍＬにて１ｍＭ ＡＡＰＨと、１６時間４０℃で、１ｍＭ ＮＡＴ及び５ｍＭメチオニンとともに又はこれらなしに、混合した。次いで、Ｍａｂ３の酸化を上記のように質量分析によって測定し、効力についてはＥＬＩＳＡによって測定した。結果を表１に示す。
Figure 2021533149
溶液へのＮＡＴ＋メチオニンの添加は、Ｍａｂ３の酸化を劇的に減少させた。
実施例３．抗酸化剤の添加は化学酸化リスクを軽減する
ＩｇＧ１抗体であるＭａｂ４を、１００ｍｇ／ｍＬで、２０ｍＭヒスチジンＨＣｌ、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭスクロース、０．０４％ポロキサマー１８８中に製剤化した。次いで、抗体製剤を、ＡＡＰＨの存在下において、０、５、１０ｍＭ、又は１０ｍＭ ＡＡＰＨ＋１ｍＭ ＮＡＴ＋５ｍＭメチオニンで、４０℃にて２４時間インキュベートした。次いで、試料を上記の通りにＭＳによって評価した。
結果を図５に示す。Ｆｃ Ｍ２７２のおよそ１５％の酸化が５ ｍＭ ＡＡＰＨで観察された。これは１０％のｔｒｐ酸化に相当する。１ｍＭ ＮＡＴ＋５ｍＭメチオニンの添加は、酸化をＴｒｐで約５０％、Ｆｃメチオニン２７２で約８０％低減させた。メチオニンＣＤＲの変化はいずれのレベルでも観察されなかった。ＮＡＴ＋メチオニンの添加は、ＥＬＩＳＡで測定した通り、Ａｇ４と結合するＭａｂ４の特異活性の低減を改善した。
Figure 2021533149
実施例４．光酸化リスク軽減のためのＮＡＴ／メチオニンの添加
ＮＡＴ／メチオニンが光酸化を低減できるかどうかを決定するために試験を行った。ＩｇＧ１とは異なるアイソタイプを有するＩｇＧ抗体であるＭａｂ５を、１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、２００ｍＭのアルギニンコハク酸、ｐＨ５．５中において、ＮＡＴ及びメチオニンなしで、０．３ｍＭ ＮＡＴ＋５ｍＭのメチオニン又は０．３ｍＭ ＮＡＴ＋１０ｍＭのメチオニンにより製剤化した。試料を３００，０００ルクス時間曝露させてリスクを評価した。結果を表３に示す。
Figure 2021533149
ＮＡＴ／ｍｅｔは周辺光関連酸化からＭａｂ５を保護した。
実施例５．ＮＡＴ／ｍｅｔの添加により酸化及び力価保護が得られる
抗体医薬品は、保存期間の終了時におよそ７〜８％のＭｅｔ２５１の酸化を示すことがあり、典型的には、５℃で２年以上の酸化を示すことがある。これを模倣するために、抗体を、Ｍｅｔ２５１の約１５％の酸化をもたらす５ｍＭ ＡＡＰＨで処理した。試料を、ＮＡＴ／ｍｅｔ有り又は無しで５ｍＭ ＡＡＰＨによって処理し、その後Ｗ１０４及びＭ ２５１の酸化を分析した。抗体の効力もまた測定した。表４に示すように、抗体プールへの０．３ｍＭ ＮＡＴ＋５ｍＭメチオニンの添加は、Ｗ１０４及びＭ２５１の酸化を低減させ、ＡＡＰＨストレス後の抗体の効力の低下を低減させた。
Figure 2021533149
加えて、クローンのプールは、上記のように周辺光ストレスを受けた。表５に示すように、クローンのプールは上記と同じ色の変化を経る。
Figure 2021533149
実施例６．ＮＡＴ／メチオニンは化学酸化リスクを軽減する
ＡＡＰＨストレス試験を使用して、ＮＡＴ及び／又はメチオニンによる酸化保護を評価した。二重特異性抗体であるＭａｂ６を、１ｍｇ／ｍＬで、２０ｍＭ酢酸ヒスチジン中、１ｍＭ ＡＡＰＨにより、１６時間４０℃で、ＮＡＴ及び／又はメチオニンの存在下又は非存在下においてインキュベートした。試料を上記の通り酸化について分析した。表Ｘに示すように、０．１〜０．５ｍＭのＮＡＴ濃度により酸化保護が得られ、メチオニン単独でもＡＡＰＨからいくらかの保護が得られる。
Figure 2021533149
実施例７．ＮＡＴ／メチオニンは化学的に誘導される酸化から保護する。
二重特異性抗体である抗体Ｍａｂ７を、位置Ｗ５２の化学的に誘導された酸化について、１ｍｇ／ｍＬの分子を、２０ｍＭ酢酸ヒスチジン中にて、１ｍＭ ＡＡＰＨとともに１６時間４０℃で、ＮＡＴ及びメチオニンの存在下又は非存在下においてインキュベートすることによって評価した。試料を酸化のペプチドマップにより分析した。図６に示すように、ＮＡＴ＋メチオニンの組合せは、化学的に誘導される酸化からＷ５２を保護した。

Claims (67)

  1. ポリペプチド、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン（ＮＡＴ）、及びＬ−メチオニンを含む液体製剤であって、前記ＮＡＴは前記ポリペプチド内の１つ以上のトリプトファン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供され、前記Ｌ−メチオニンは前記ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供される、液体製剤。
  2. 前記製剤中のＮＡＴの濃度が、約０．０１〜約２５ｍＭである、請求項１に記載の液体製剤。
  3. 前記製剤中のＮＡＴの濃度が、約０．０５〜約１．０ｍＭである、請求項１又は２に記載の液体製剤。
  4. 前記製剤中のＮＡＴの濃度が、約０．０５〜約０．３ｍＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体製剤。
  5. 前記製剤中のＮＡＴの前記濃度が、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．３ｍＭ、及び約１．０ｍＭからなる群から選択される濃度である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体製剤。
  6. 前記製剤中のＬ−メチオニンの濃度が、約１〜約１２５ｍＭである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体製剤。
  7. 前記製剤中のＬ−メチオニンの濃度が、約５〜約２５ｍＭである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の液体製剤。
  8. 前記製剤中のＬ−メチオニンの濃度が、約５ｍＭである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体製剤。
  9. 前記製剤中のＮＡＴの濃度が約０．３ｍＭであり、前記製剤中のＬ−メチオニンの濃度が約５．０ｍＭである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の液体製剤。
  10. 前記製剤中のＮＡＴの濃度が約１．０ｍＭであり、前記製剤中のＬ−メチオニンの濃度が約５．０ｍＭである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の液体製剤。
  11. 前記ポリペプチドが、抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の液体製剤。
  12. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、前記抗体の可変領域内に位置する、請求項１１に記載の液体製剤。
  13. 前記１つ以上のトリプトファン残基がＷ１０３を含み、残基のナンバリングがＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項１１又は１２に記載の液体製剤。
  14. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、前記抗体のＨＶＲ内に位置する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の液体製剤。
  15. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、前記抗体のＨＶＲ−Ｈ１及び／又はＨＶＲ−Ｈ３内に位置する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の液体製剤。
  16. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、Ｗ３３、Ｗ３６、Ｗ５２ａ、Ｗ９９、Ｗ１００ａ、及び／又はＷ１００ｂを含み、残基のナンバリングが、Ｋａｂａｔナンバリングに従う、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の液体製剤。
  17. 前記１つ以上のメチオニン残基が、前記抗体の可変領域内に位置する、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の液体製剤。
  18. 前記１つ以上のメチオニン残基がＭ３４及び／又はＭ８２を含み、残基のナンバリングがＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の液体製剤。
  19. 前記１つ以上のメチオニン残基が、前記抗体の定常領域内に位置する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の液体製剤。
  20. 前記１つ以上のメチオニン残基がＭ２５２及び／又はＭ４２８を含み、残基のナンバリングがＥＵナンバリングに従う、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の液体製剤。
  21. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の液体製剤。
  22. 前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片である、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の液体製剤。
  23. 前記ポリペプチド中の前記１つ以上のトリプトファン残基の前記酸化が、ＮＡＴを欠く液体製剤中の前記ポリペプチドにおける１つ以上の対応するトリプトファン残基の前記酸化と比較して、低減される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の液体製剤。
  24. 前記ポリペプチド中の前記１つ以上のメチオニン残基の前記酸化が、Ｌ−メチオニンを欠く液体製剤中の前記ポリペプチドにおける１つ以上の対応するメチオニン残基の前記酸化と比較して、低減される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の液体製剤。
  25. 前記ポリペプチド中の前記１つ以上のトリプトファン残基及び前記１つ以上のメチオニン残基の前記酸化が、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンを欠く液体製剤中の前記ポリペプチドにおける、１つ以上の対応するトリプトファン残基及び１つ以上の対応するメチオニン残基の前記酸化と比較して、低減される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の液体製剤。
  26. 前記酸化が、約４０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％低減される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の液体製剤。
  27. 前記製剤中の前記ポリペプチド濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の液体製剤。
  28. 前記製剤が、約４．５〜約７．０のｐＨを有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の液体製剤。
  29. 前記製剤が、１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の液体製剤。
  30. 前記１つ以上の賦形剤が、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、及び等張化剤からなる群から選択される、請求項２９に記載の液体製剤。
  31. 前記製剤が、対象への投与に好適な医薬製剤である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の液体製剤。
  32. 前記医薬製剤が、皮下、静脈内、又は硝子体内投与に適している、請求項３１に記載の液体製剤。
  33. 前記対象が、ヒトである、請求項３１又は３２に記載の液体製剤。
  34. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載の液体製剤を含む、製品又はキット。
  35. ＮＡＴ及びＬ−メチオニンを前記製剤に添加することを含む、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、前記ＮＡＴは前記ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供され、前記Ｌ−メチオニンは前記ポリペプチド中の１つ以上のメチオニン残基の酸化を防ぐのに充分な量で提供される、方法。
  36. 前記ＮＡＴが、約０．０１〜約２５ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＮＡＴが、約０．０５〜約１ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 前記ＮＡＴが、約０．０５〜約０．３ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＮＡＴが、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．３ｍＭ、及び約１．０ｍＭからなる群から選択される濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記Ｌ−メチオニンが、約１〜約１２５ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記Ｌ−メチオニンが、約５〜約２５ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記Ｌ−メチオニンが、約５ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ＮＡＴが約０．３ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加され、前記Ｌ−メチオニンが約５．０ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ＮＡＴが約１．０ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加され、前記Ｌ−メチオニンが約５．０ｍＭの濃度になるように前記製剤へ添加される、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ポリペプチドが、抗体である、請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、前記抗体の可変領域内に位置する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記１つ以上のトリプトファン残基がＷ１０３を含み、残基のナンバリングがＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項４５又は４６に記載の方法。
  48. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、前記抗体のＨＶＲ内に位置する、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、前記抗体のＨＶＲ−Ｈ１及び／又はＨＶＲ−Ｈ３内に位置する、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記１つ以上のトリプトファン残基が、Ｗ３３、Ｗ３６、Ｗ５２ａ、Ｗ９９、Ｗ１００ａ、及び／又はＷ１００ｂを含み、残基のナンバリングが、Ｋａｂａｔナンバリングに従う、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記１つ以上のメチオニン残基が、前記抗体の可変領域内に位置する、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記１つ以上のメチオニン残基がＭ３４及び／又はＭ８２を含み、残基のナンバリングがＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記１つ以上のメチオニン残基が、前記抗体の定常領域内に位置する、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記１つ以上のメチオニン残基がＭ２５２及び／又はＭ４２８を含み、残基のナンバリングがＥＵナンバリングに従う、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片である、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ポリペプチド中の前記１つ以上のトリプトファン残基の前記酸化が、ＮＡＴを欠く液体製剤中の前記ポリペプチドにおける１つ以上の対応するトリプトファン残基の前記酸化と比較して、低減される、請求項３５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記ポリペプチド中の前記１つ以上のメチオニン残基の前記酸化が、Ｌ−メチオニンを欠く液体製剤中の前記ポリペプチドにおける１つ以上の対応するメチオニン残基の前記酸化と比較して、低減される、請求項３５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記ポリペプチド中の前記１つ以上のトリプトファン残基及び前記１つ以上のメチオニン残基の前記酸化が、ＮＡＴ及びＬ−メチオニンを欠く液体製剤中の前記ポリペプチドにおける、１つ以上の対応するトリプトファン残基及び１つ以上の対応するメチオニン残基の前記酸化と比較して、低減される、請求項３５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記酸化が、約４０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％低減される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記製剤中の前記ポリペプチド濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記製剤が、約４．５〜約７．０のｐＨを有する、請求項３５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記製剤が、１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項３５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記１つ以上の賦形剤が、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、及び等張化剤からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記製剤が、対象への投与に好適な医薬製剤である、請求項３５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記医薬製剤が、皮下、静脈内、又は硝子体内投与に適している、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記対象が、ヒトである、請求項６５又は６６に記載の方法。
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