JP7068323B2 - 少なくとも2種のペグ化された分析物特異的結合剤を使用する免疫アッセイ - Google Patents
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Description
当分野のかなり多数のものが、結合反応、例えば、抗原-抗体反応、核酸ハイブリッド化技法およびタンパク質-リガンド系に基づいて開発されている。多数の生化学的および生物的結合システムにおける高度な特異性により、研究および診断において、多数の価値あるアッセイ方法およびシステムがもたらされてきた。通常、目的の分析物の存在は、1つまたは複数の分析物特異的結合剤に結合した観察可能な「標識」の存在または不在により示される。
したがって、粒子をベースとするアッセイ法、特に様々な変形体で現れる分析物を検出するアッセイ方法の改善ための新規な構造および方法を設計することが必要とされている。多数の検出アッセイにおける限定因子となる、微粒子への非特異的結合および微粒子のクラスター形成を回避することが強く必要とされている。
「結合対」は、本明細書で使用する場合、高い親和性で、すなわち1ナノモル親和性またはそれより良好な親和性で、互いに結合する2つのパートナーからなる。結合対に関する実施形態は、例えば、受容体およびリガンド、ハプテンおよび抗ハプテン抗体、ならびに天然の高い親和性結合対に基づく結合対からなる結合対である。
本発明による方法に好適な1つのタイプの結合対は、ハプテンおよび抗ハプテン抗体の結合対である。ハプテンは、100~2000ダルトン、好ましくは150~1000ダルトンの分子量を有する有機分子である。このような低分子は、これを担体分子にカップリングさせることにより免疫原性が付与され得、抗ハプテン抗体は、標準的手順に従い、生成され得る。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド-グリコシド、ブファジエノリド、ステロイド-サポゲニンおよびステロイドアルカロイド、カルデノリドおよびカルデノリド-グリコシドを含む群から選択され得る。これらの物質の代表例は、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ギトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシンおよびストロファンチンである。別の好適なハプテンは、例えばフルオレセインである。
一実施形態では、結合対は、ビオチンとストレプトアビジンからなる。
配列番号1
MSTNPKPQKK NKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG RRQPIPKARR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA LLSCLTVPAS A
一実施形態では、分析物は、配列番号1の変異体であり、前記変異体は、配列番号1の少なくとも10個、一実施形態では、少なくとも20個の連続アミノ酸の部分配列を含み、前記部分配列にわたり90%の配列同一性を有する。例えば、50個のアミノ酸を含む部分配列では、45個のアミノ酸が、配列番号1と同一であり、5個が他のアミノ酸により置き換えられている。一実施形態では、置換アミノ酸残基は、例示すると、バリンをイソロイシンにより置き換えた、または酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸(グルタミン酸/アスパラギン酸)により置き換えた、保存的交換により置き換えられている。
用語「少なくとも2種の分析物特異的結合剤」は、少なくとも2種の分子であって、それぞれが、目的の分析物に特異的に結合するが、分析物に対して異なる親和性を有する、少なくとも2種の分子を指す。一実施形態では、前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤は、2種の異なる抗体とすることができ、その各々は、分析物上の異なるエピトープを認識する。一実施形態では、前記エピトープは、個別のエピトープであり、すなわち、それらのアミノ酸配列またはそれらの認識される結合部位は重ならず、したがって、少なくとも2種の抗体は、その個々のエピトープへの結合に競合せず、したがって、それらは、並行して同時に、分析物に結合(attached)され得るか、またはこれに結合(bound)され得る。抗体が目的の分析物である場合、少なくとも2種の分析物特異的結合剤は、それぞれが、ポリペプチドに基づく抗原である。そのような場合、抗原は、分析物抗体が、少なくとも2種の抗原の両方に結合するが(分析物特異的結合剤として働く)、異なる親和性で結合する程度に、それらのポリペプチド配列が異なる。以下でさらに提示される「分析物特異的結合剤」に関する定義は、変更すべきところは変更して、「少なくとも2種の分析物特異的結合剤」の各々に当てはまる。
「アプタマー」は、分析物特異的結合剤の文脈で使用される場合、当業者に公知の、分析物に結合可能な、短鎖核酸分子、例えばRNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNAもしくはANA分子、または任意の他の好適な核酸フォーマットとすることができる。
「ペプチド」は、分析物特異的結合剤の文脈で使用される場合、2~49個のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはそれらの混合物のストレッチを含む、または代替としてこれらからなっていてもよい。ペプチドは、線状、分岐状、環状、またはそれらの混合物とすることができる。ペプチド分析物特異的結合剤はまた、本明細書の上で定義された足場構造に結合していてもよい。
用語「分子インプリントポリマー」とは、本明細書で使用する場合、抽出されて、その後に、相補性空隙(インプリント)を後に残す分子の存在下で形成されたポリマーを指す。通常、分子インプリントポリマーは、元の分子に対してある特定の化学的親和性を示す。分子インプリントポリマーは、当業者に公知の任意の好適なポリマー単位を含んでもよい。それらの生成のための技法には、バルク、沈殿、エマルション、懸濁、分散、ゲル化、多段階膨潤重合および階層インプリンティング法(hierarchical imprinting method)等の重合技法が含まれる。
本発明の方法は、幅広いフォーマットにおいて構築され得る。このようなフォーマットには、例えばサンドイッチアッセイ等の当分野で公知のフォーマットが含まれる。(例えば、以下の参照文献:Nonradioactive Labeling and Detection of Molecules、Kessler,C.(編)、Springer-Verlag:Berlin 1992年;The Immunoassay Handbook、Wild,D.(編)、Stackton Press:New York 1994年;Keller,G.H.and Manak,M.M.DNA Probes、第2版.、MacMillan Publishers Ltd.:London、1993年;Tietz Textbook of Clinical Chemistry 第2版、Burtisら(編)、W.B.Saunders and Co.:Philadelphia、1994年を参照されたい)。
典型的なサンドイッチアッセイフォーマットには、結合対の第1のパートナーによりコーティングされた微粒子と、各々が結合対の第2のパートナーに結合している少なくとも2種の分析物特異的結合剤と、分析物を含むことが疑われるまたは含む試料であって、結合対の前記第2のパートナーが、12~30個のエチレングリコール単位(PEG12~30)を含むリンカーを介して前記分析物特異的結合剤の各々に結合されている、試料と、検出可能に標識化されたさらなる分析物特異的結合剤とを混合するステップを含む。当業者に明白な通り、これらの構成成分が混合されて、分析物により検出可能に標識化された分析物特異的結合剤、(結合対の第2のパートナーおよび結合対の第1のパートナーに結合した)分析物特異的結合剤を微粒子に結合させるのに十分なある期間、インキュベートされる。一実施形態では、洗浄工程、このような混合/インキュベートを含まないサンドイッチアッセイが、単一反応容器中で行われる。4つの成分(それぞれ、コーティングされた微粒子、試料、各々が結合対の第2のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および検出可能に標識化した分析物特異的結合剤)を添加および混合する順序は、重要ではない。一実施形態では、洗浄工程、結合対の第1のメンバーによりコーティングされた微粒子、試料、および結合対の第2のパートナーに結合した分析物特異的結合剤の添加および混合を含むサンドイッチアッセイは、単一反応容器で行われる。この第1の(分析物捕捉)工程の後、分析物が、ここで結合した微粒子が洗浄された後に、検出可能に標識化した分析物特異的結合剤を加える。第1の3つの成分(それぞれ、コーティングされた微粒子、試料および結合対の第2のパートナーに結合した分析物特異的結合剤)を添加および混合する順序は、重要ではない。
間接的に検出可能に標識化されるとは、例えば、ハプテンによる標的化、および直接的に検出可能な標識を担持する抗ハプテン抗体によってこのようなハプテン化された化合物の検出を指すか、または酵素を用いる標識化、および適切な色素基質の転化をもたらす、その対応する酵素活性によるこのような酵素の検出を指す。様々な酵素-基質標識が入手可能であり、開示されている(例えば、US4,275,149を参照されたい)。酵素は、一般に、様々な技法を使用して測定され得る、発色性基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の色調変化を触媒することがあり、これは、分光測光法により測定され得る。代替的に、酵素は、基質の蛍光または化学発光法を改変することがある。化学発光性基質は、化学反応により電子的に励起された状態になり、次に、測定可能な(例えば、化学蛍光光度計を使用)光を発光することができるか、またはエネルギーを蛍光受容体に与える。酵素による標識の例には、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ;US4,737,456)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ(ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)等)、アルカリホスファターゼ(AP)、(3-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環式オキシダーゼ(ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ等)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。ポリペプチドに酵素をコンジュゲートする技法は、O’SullivanらのMethods in Enzymにおける、「Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay」(J.Langone&IT Van Vunakisによる編集)、Academic Press、New York、73巻(1981年)147~166頁に記載されている。
本発明の知見を要約すれば、以下の実施形態が特に想定される。
1.微粒子をベースとする分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定する方法であって、前記微粒子が、結合対の第1のパートナーによりコーティングされており、
a)コーティングされた微粒子と、各々が結合対の第2のパートナーに結合している少なくとも2種の分析物特異的結合剤と、分析物を含むことが疑われるまたは含む試料とを混合するステップであって、
結合対の前記第2のパートナーが、12~30個のエチレングリコール単位(PEG12~30)を含むリンカーを介して前記分析物特異的結合剤の各々に結合されており、それにより分析物を、前記分析物特異的結合剤を介してコーティングされた微粒子に結合させる、ステップ、
b)結合対を介して結合した分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離するステップ、および
c)微粒子に結合した分析物を測定するステップ
を含む方法。
2.前記微粒子が、50nm~20μmの直径である、実施形態1による方法。
3.前記微粒子が強磁性であり、ステップ1(b)における分離が、磁力によるものである、実施形態1または2による方法。
4.前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤が、少なくとも50個のアミノ酸のポリペプチドである、実施形態1から3のいずれかによる方法。
5.前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤が、最大でも10,000個のアミノ酸のポリペプチドである、実施形態1から4のいずれかによる方法。
6.前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤が、抗体またはその抗原結合性断片である、実施形態1から5のいずれかによる方法。
7.前記分析物が、サンドイッチアッセイフォーマットで測定される、実施形態1から6のいずれかによる方法。
8.微粒子に結合した分析物の前記測定するステップが、電気化学発光性標識の使用に基づく、実施形態1から7のいずれかによる方法。
9.結合対の前記第1のパートナーが、それぞれ、アジビンおよび/またはストレプトアビジン、ならびにFimGから選択され、結合対の前記第2のパートナーが、それぞれ、ビオチンまたはビオチンアナログ(アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン等)、およびDsFから選択される、実施形態1から8のいずれかによる方法。
10.結合対の前記第1のパートナーが、アジビンおよび/またはストレプトアビジンであり、結合対の前記第2のパートナーがビオチンである、実施形態1から9のいずれかによる方法。
11.その各々が結合対の第2のパートナーに結合した前記分析物特異的結合剤の各々が組成物中に含まれており、前記組成物において、分析物特異的結合剤に結合した結合対の第2のパートナー間の平均モル比が、1.1またはそれより高い、実施形態1から10のいずれかによる方法。
12.前記分析物が、いくつかの変異体を含む、実施形態1から11のいずれかによる方法。
13.前記いくつかの変異体が、様々な遺伝子型、アイソザイム、アイソフォーム、血清型、または前記分析物の変異体である、実施形態1から12のいずれかによる方法。
14.前記分析物が、ペプチド、タンパク質、薬物分子、ホルモンまたはビタミンである、実施形態1から13のいずれかによる方法。
15.前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤の各々が、前記分析物のエピトープに結合する、実施形態1から14のいずれかによる方法。
16.前記エピトープが個別のエピトープである、実施形態1から15のいずれかによる方法。
17.前記分析物が感染因子の抗原である、実施形態1から16のいずれかによる方法。
18.前記分析物がウイルス抗原である、実施形態1から17のいずれかによる方法。
19.前記分析物が、肝炎ウイルス抗原またはヒトレトロウイルス抗原である、実施形態18による方法。
20.前記分析物が、C型肝炎ウイルスまたはB型肝炎ウイルスまたはHIV抗原である、実施形態18から19のいずれかによる方法。
21.前記分析物がC型肝炎ウイルスコア抗原である、実施形態19から20のいずれかによる方法。
22.前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置140~172内、一実施形態ではアミノ酸の位置157~169内のエピトープに結合する抗体であり、前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置20~80内、一実施形態では、アミノ酸の位置65~71内、一実施形態では、アミノ酸の位置32~36内、一実施形態では、アミノ酸の位置37~46内のエピトープに結合する抗体である、実施形態21による方法。
23.前記分析物が感染因子に対する抗体である、実施形態1から14のいずれかによる方法。
24.個別の容器中、または単一容器ユニットの個別のコンパートメント中に、少なくとも、結合対の第1のパートナーによりコーティングされた微粒子、および前記結合対の第2のパートナーに結合している少なくとも2種の分析物特異的結合剤を含むキットであって、結合対の前記第2のパートナーが、12~30個のエチレングリコール単位(PEG12~30)を含むリンカーを介して前記分析物特異的結合剤の各々に結合されている、キット。
25.結合対の前記第1のパートナーが、アジビンまたはストレプトアビジンであり、前記結合対の前記第2のパートナーが、ビオチンまたはビオチンアナログ(アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン等)から選択される、実施形態24のキット。
26.個別の容器、または単一の容器ユニットの個別のコンパートメント中に、検出可能に標識化されたさらなる分析物特異的結合剤をさらに含む、実施形態24から25のいずれかによるキット。
27.前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤が、ウイルス抗原特異的結合剤であり、一実施形態ではウイルス抗原-特異的抗体である、実施形態24~26のうちのいずれかによるキット。
28.前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置140~172内、一実施形態ではアミノ酸の位置157~169内のエピトープに結合する抗体であり、前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置20~80内、一実施形態では、アミノ酸の位置65~71内、一実施形態では、アミノ酸の位置32~36内、一実施形態では、アミノ酸の位置37~46内のエピトープに結合する抗体である、実施形態24から27のいずれかによるキット。
29.検出可能に標識化された前記さらなる分析物特異的結合剤が、配列番号1のアミノ酸の位置100~120内のエピトープに結合する抗体である、実施形態26~28のいずれかによるキット。
方法
モノクローナル抗体
適切な動物の免疫付与に必要な組換えHCVコア抗原は、大腸菌(E.coli)発現プラスミドに所望の抗原アミノ酸配列をコードするDNA断片を挿入し、次いでタンパク質を過剰発現して精製することによる、当分野で公知の標準的技法を使用して得た。これらの標準分子生物学的方法は、例えば、Sambrook、J.ら、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989年に記載されている。
タンパク質決定
精製ポリペプチドのタンパク質濃度は、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光度を使用して、または比色定量BCA法を使用して、280nmにおける光学密度(OD)を決定することにより決定した。
活性化ビオチン化試薬の合成
幅広く使用されるリンカービオチン-DDSのような最先端の活性化ビオチンを含むリンカー(ビオチン化試薬)の合成は、EP632810に開示されている。
1の脱保護は、室温で1時間、ジオキサン中の1M HCl中で攪拌することにより行った。溶媒蒸発後、残留物を濁りのない溶液が得られるまで、メタノール中で還流し、フラスコを4℃で一晩、維持した。濾過後、この溶液をヘキサンにより抽出し、メタノール層を蒸発させて乾燥すると、油状物またはワックスとして、対応するPEGn-ジオール2を得た(粘度は、PEG単位(n)の長さ/数に依存する)。
ビオチンは、ジメチルホルムアミド中、室温で一晩、対応するN-ヒドロキシスクシンイミドエステル8(1.05当量)とトリエチルアミン(4当量)とをカップリングすることにより導入した。
最後に、塩化メチレン中、N-ヒドロキシスクシンイミド(1.1当量)およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(1.1当量)と反応させることにより、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル10が形成した。反応の完了後、反応混合物を塩化メチレンにより希釈し、水により洗浄した。溶媒蒸発および乾燥により、それぞれ、エチレンオキシド単位の数に応じて、油状物、ワックスまたは固体として、純粋なビオチン-PEGn-NHS10となった。
抗体の標識化
それぞれ、ビオチンおよびルテニウム部分の抗体へのカップリング:
当業者が十分に精通している最新技術に従って、抗体を得て精製した。
プロトタイプElecsys HCVコア抗原アッセイ
Elecsys HCVコア抗原プロトタイプアッセイの測定は、自動化cobas(登録商標)e601分析器(Roche Diagnostics GmbH)で、サンドイッチアッセイフォーマットで行った。この分析器でのシグナル検出は、電気化学化学ルミネッセンスに基づく。このサンドイッチアッセイにおいて、1つまたは複数の捕捉抗体-ビオチン-コンジュゲート(すなわち分析物特異的結合剤)を、ストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズの表面に固定化する。検出-抗体(さらなる分析物特異的結合剤)は、シグナル伝達部分として、錯体形成したルテニウムカチオンを有する。分析物の存在下で、ルテニウム錯体を固相に架橋して、分析器の測定細胞に含まれる白金電極において励起後、620nmの光を発光させる。シグナル出力は、任意の光単位である。測定は、いくつかの供給元から購入した、HCVコア抗原陽性および陰性ヒト血清ならびに血漿の試料で行った。
Claims (15)
- 微粒子をベースとする分析物特異的結合アッセイにおける分析物の測定のための方法であって、前記微粒子が、結合対の第1のパートナーによりコーティングされており、
a)コーティングされた微粒子と、各々が結合対の第2のパートナーに結合している少なくとも2種の分析物特異的結合剤と、分析物を含むことが疑われるまたは含む試料とを混合するステップであって、ここで前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤はそれぞれが同じ分析物に特異的に結合するものであり、
結合対の前記第2のパートナーが、12~30個のエチレングリコール単位(PEG12~30)を含むリンカーを介して前記分析物特異的結合剤の各々に結合されており、それにより分析物を、前記分析物特異的結合剤を介してコーティングされた微粒子に結合させる、ステップ、
b)結合対を介して結合した分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離するステップ、および
c)微粒子に結合した分析物を測定するステップ
を含む方法。 - 前記微粒子に結合した分析物を測定するステップが、電気化学発光性標識の使用に基づく、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物がいくつかの変異体を含む、請求項1から2のいずれかに記載の方法。
- 前記いくつかの変異体が、様々な遺伝子型、アイソザイム、アイソフォーム、血清型、または前記分析物の変異体である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記分析物が感染性因子の抗原である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記分析物がウイルス抗原である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記分析物が、肝炎ウイルス抗原またはヒトレトロウイルス抗原である、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記分析物が、C型肝炎ウイルスまたはB型肝炎ウイルスまたはHIV抗原である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記分析物がC型肝炎ウイルスコア抗原である、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置140~172内のエピトープに結合する抗体であり、前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置20~80内のエピトープに結合する抗体である、請求項1から9に記載のいずれかに記載の方法。
- 個別の容器中、または単一容器ユニットの個別のコンパートメント中に、少なくとも、結合対の第1のパートナーによりコーティングされた微粒子、およびそれぞれが前記結合対の第2のパートナーに結合している少なくとも2種の分析物特異的結合剤を含むキットであって、ここで前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤はそれぞれが同じ分析物に特異的に結合するものであり、結合対の前記第2のパートナーが、12~30個のエチレングリコール単位(PEG12~30)を含むリンカーを介して前記分析物特異的結合剤の各々に結合されている、キット。
- 結合対の前記第1のパートナーが、アジビンまたはストレプトアビジンであり、前記結合対の前記第2のパートナーが、ビオチン、アミノビオチン、イミノビオチンおよびデスチオビオチンから選択される、請求項11に記載のキット。
- 前記少なくとも2種の分析物特異的結合剤が、ウイルス抗原特異的結合剤である、請求項11または12に記載のキット。
- 前記少なくとも2種のウイルス抗原特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置140~172内のエピトープに結合する抗体であり、前記少なくとも2種のウイルス抗原特異的結合剤の1つが、配列番号1のアミノ酸の位置20~80内のエピトープに結合する抗体である、請求項13に記載のキット。
- 個別の容器中、または単一の容器ユニットの個別のコンパートメント中に、検出可能に標識されたさらなる分析物特異的結合剤をさらに含み、検出可能に標識された前記さらなる分析物特異的結合剤が、配列番号1のアミノ酸の位置100~120内のエピトープに結合する抗体である、請求項11から14のいずれかに記載のキット。
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