JP6979941B2 - Peg化分析物特異的結合剤を用いた粒子に基づくイムノアッセイ - Google Patents
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Description
生化学的および生物学的試料において、関心対象の分析物の検出および定量化のため、多くの方法および系が開発されてきている。微量の微生物、薬剤、ホルモン、ウイルス、抗体、核酸および他のタンパク質を測定可能な方法および系は、研究者および臨床医にとって非常に価値がある。
当該技術分野のかなりのものが、結合反応、例えば抗原−抗体反応、核酸ハイブリダイゼーション技術、およびタンパク質−リガンド系に基づいて開発されてきている。多くの生化学的および生物学的結合系において、高い度合いの特異性によって、研究および診断において、多くの価値あるアッセイ法および系が導かれてきている。典型的には、関心対象の分析物の存在は、1またはそれより多い分析物特異的結合剤に付着した、観察可能な「標識」の存在または非存在によって示される。
したがって、粒子に基づくアッセイ法を改善するための新規構造および方法を設計する必要がある。非常に多数の検出アッセイにおいて、限定要因である微粒子への非特異的結合および微粒子のクラスター形成を回避することへの強い要望がある。
微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、前記微粒子が、結合対の第一のパートナーでコーティングされ、a)コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合し、ここで、結合対の前記の第二のパートナーが、12〜30のエチレングリコール単位(PEG 12〜30)を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、分析物特異的結合剤を通じて、コーティングされた微粒子に分析物が結合し、b)結合対を通じて結合している分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そしてc)微粒子に結合した分析物を測定する工程を含む、前記方法を開示する。
「結合対」は、本明細書において、高アフィニティで、すなわち1ナノモルアフィニティまたはそれより優れたアフィニティで、互いに結合する2つのパートナーからなる。結合対に関する態様は、例えば、受容体およびリガンド、ハプテンおよび抗ハプテン抗体、ならびに天然存在高アフィニティ結合対に基づく結合対からなる結合対である。
本発明記載の方法に適した結合対の1つのタイプは、ハプテンおよび抗ハプテン抗体結合対である。ハプテンは、100〜2000ダルトン、好ましくは150〜1000ダルトンの分子量の有機分子である。こうした小分子は、これをキャリアー分子にカップリングさせることで免疫原性を与えられることも可能であり、そして標準法にしたがって、抗ハプテン抗体を生成することも可能である。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド配糖体、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニンおよびステロイドアルカロイド、カルデノリドおよびカルデノリド配糖体を含む群より選択可能である。これらの物質クラスの代表は、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ギトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン、およびストロファンチンである。別の適切なハプテンは、例えばフルオレセインである。
1つの態様において、本発明にしたがった結合対は、10kDまたはそれより多い分子量を有するこうした結合対の第一のパートナー、および1kDまたはそれより少ない分子量を有するこうした結合対の第二のパートナーからなる。上に示すように、1つの態様において、10kDまたはそれより多い分子量を有する、結合対の第一のパートナーは、本開示にしたがった方法で用いられる微粒子に結合する(該微粒子をコーティングする)。
用語「分子インプリンティングポリマー」は、本明細書において、その後、抽出される分子の存在下で形成され、後に相補的空洞(インプリント)を残すポリマーを指す。典型的には、分子インプリンティングポリマーは、元来の分子に対する特定の化学的アフィニティを示す。分子インプリンティングポリマーは、当業者に知られる任意の適切なポリマー性単位で構成されることも可能である。その産生のための技術には、バルク、沈殿物、エマルジョン、懸濁物、分散物、ゲル化、多工程膨張重合および階層的インプリンティング法などの重合技術が含まれる。
認識されるであろうように、式Iの(n)は、エチレングリコール単位の数に関する。好ましくは、nは12〜30である。
典型的なサンドイッチアッセイ形式には、結合対の第一のパートナーでコーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、分析物を含むと推測されるかまたは含む試料、ここで、結合対の前記の第二のパートナーは、12〜30のエチレングリコール単位(PEG 12〜30)を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合している、および検出可能に標識された第二の分析物特異的結合剤を混合する工程が含まれる。当業者には明らかであるように、これらの構成要素は、微粒子に、分析物を通じて検出可能に標識された分析物特異的結合剤、結合対の第二のパートナー(に結合した)分析物特異的結合剤および結合対の第一のパートナーが結合するために十分な期間、混合され、そしてインキュベーションされる。1つの態様において、洗浄工程を伴わないサンドイッチアッセイでは、こうした混合/インキュベーションは、単一の反応容器中で行われる。4つの成分(それぞれ、コーティングされた微粒子、試料、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および検出可能に標識された分析物特異的結合剤)を添加し、そして混合する順序は重要ではない。1つの態様において、洗浄工程を伴うサンドイッチアッセイでは、結合対の第一のメンバーでコーティングされた微粒子、試料、および結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤の添加および混合は、単一反応容器で行われる。この最初の(分析物捕捉)工程後、検出可能に標識された分析物特異的結合剤を添加する前に、分析物が結合している微粒子を洗浄する。最初の3つの成分(それぞれ、コーティングされた微粒子、試料および結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤)を添加し、そして混合する順序は重要ではない。
典型的な競合アッセイ形式には、結合対の第一のパートナーでコーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、分析物を含むと推測されるかまたは含む試料、ここで、結合対の前記の第二のパートナーは、12〜30のエチレングリコール単位(PEG 12〜30)を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合している、および検出可能に標識されるある量の分析物を混合する工程が含まれる。当業者には明らかであるように、これらの構成要素は、試料中の分析物による競合後、結合対の第二のパートナー(に結合した)分析物特異的結合剤を通じて、微粒子に結合可能である検出可能に標識された分析物の分画、および微粒子にコーティングされた結合対の第一のパートナーが結合するために十分な期間、混合され、そしてインキュベーションされる。
間接的に検出可能な標識は、例えばハプテンでの標識、および直接検出可能な標識を所持する抗ハプテン抗体によるこうしたハプテン化化合物の検出、または酵素での標識、および適切な色素基質の変換を生じる対応する酵素活性によるこうした酵素の検出を指す。多様な酵素−基質標識が入手可能であるか、または開示されている(例えばUS 4,275,149を参照されたい)。該酵素は、一般的に色素原基質の化学的改変を触媒し、多様な技術を用いてこれを測定可能である。例えば、酵素は、基質中の色変化を触媒可能であり、これは分光光度的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光または化学発光を改変してもよい。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起され、そして次いで、(例えば化学発光計を用いて)測定可能な光を放出可能であるか、またはエネルギーを蛍光アクセプターに供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ(例えばホタル(firefly)ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ; US 4,737,456)、ルシフェリン、2,3−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、(3−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ(例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環オキシダーゼ(例えばユリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素をポリペプチドにコンジュゲート化させる技術は、O’Sullivanら ”Methods for the Preparation of Enzyme−Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”, Methods in Enzym.中(J. Langone & IT Van Vunakis監修), Academic Press, ニューヨーク, 73(1981) 147−166に記載される。
組換えDNA技術
Sambrook, J.ら, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるように、標準法を用いて、DNAを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学試薬を用いた。
Geneart GmbH(ドイツ・レーゲンスブルク)で、化学合成によって、望ましい遺伝子セグメントを調製した。増殖/増幅のため、合成された遺伝子断片を、大腸菌(E. coli)プラスミド内にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって検証した。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、またはPCRを通じて、短い合成DNA断片を組み立てた。metabion GmbH(ドイツ・プラネック−マルティンスリート)によって、それぞれのオリゴヌクレオチドを調製した。
望ましい遺伝子/タンパク質(例えば全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはN末端にオリゴグリシンを含有するFc鎖)を発現するため、以下の機能的要素を含む転写ユニットを用いる:
−イントロンAを含むヒト・サイトメガロウイルス(P−CMV)由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’非翻訳領域(5’UTR)、
−ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−発現させようとする遺伝子/タンパク質(例えば全長抗体重鎖)、および
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
−大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、および
−大腸菌において、アンピシリン耐性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算されたモル消光係数を用いて、または比色BCA法を用いて、280nmの光学密度(OD)を決定することによって、精製ポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
活性化ビオチン化試薬の合成
広く用いられるリンカー、ビオチン−DDSのような現状技術の活性化ビオチン含有リンカー(ビオチン化試薬)の合成は、EP 632 810に開示される。
ジオキサン中の1M HCl中で、室温で1時間攪拌することによって、1の脱保護を行った。蒸発後、透明な溶液が得られるまで、残渣をメタノール中で還流し、そしてフラスコを4℃で一晩維持した。ろ過後、溶液をヘキサンで抽出し、メタノール性層を蒸発させ、そして乾燥させて、油またはワックスとしての対応するPEGn−ジオール 2を得た(コンシステンシーは、PEGの長さ/単位数(n)に応じる)。
ジメチルホルムアミド中のトリエチルアミン(4当量)と、対応するN−ヒドロキシスクシンイミドエステル 8(1.05当量)を、室温で一晩カップリングすることによって、ビオチンを導入した。
最後に、塩化メチレン中、N−ヒドロキシスクシンイミド(1.1当量)およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(1.1当量)との反応によって、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル10を形成した。反応完了後、塩化メチレンで反応混合物を希釈し、そして水で洗浄した。蒸発および乾燥によって、エチレンオキシド単位の数に応じて、それぞれ、油、ワックスまたは固体としての純粋なビオチン−PEGn−NHS 10を得た。
実施例2
抗体への、ビオチンおよびルテニウム部分それぞれのカップリング
当業者にはよく知られている現状技術の方法にしたがって、抗体を得て、そして精製した。
HCVコア抗原の免疫学的検出に対するビオチン化試薬中のリンカーの影響
多様なリンカーを含むビオチン化試薬の使用によって、1つの、そして同じ抗HCV(捕捉)抗体をビオチンにコンジュゲート化した。異なるビオチン−リンカー−抗体コンジュゲートの性能を、自動化cobas(登録商標)e601分析装置(Roche Diagnostics GmbH)上で評価した。
異なるHCV捕捉抗体コンジュゲートの比較
トロポニンT(TnT)の免疫学的検出に対するビオチン化試薬におけるリンカーの影響
多様なリンカーを含むビオチン化試薬の使用によって、1つの、そして同じ抗トロポニンT(抗TnT)(捕捉)抗体をビオチンにコンジュゲート化した。ElecsysトロポニンT hsアッセイキットに関する指示にしたがった実験プロトコルに基づいて、異なるビオチン−リンカー−抗体コンジュゲートの性能を、自動化cobas(登録商標)e601分析装置(Roche Diagnostics GmbH)上で評価した。
表2
実験トロポニンTアッセイで得た結果
HCVコア抗原プロトタイプアッセイに対するビオチン化試薬におけるリンカーの長さの変動
リンカーの最適な長さを決定するため、異なるビオチン−PEG(n)−NHS誘導体を、HCV捕捉抗体でコンジュゲート化し、そして実施例3に記載するようなHCVコア抗原実験アッセイにおいて測定した。各ビオチン化試薬に関して、モノビオチン化および多重ビオチン化コンジュゲート両方を生成し、そして結果を表3に示す。
HCVコア抗原実験アッセイの性能に関するPEG−リンカーの長さの影響
Claims (15)
- 微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、該微粒子が、結合対の第一のパートナーでコーティングされ
a)コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合し、
ここで、結合対の該第二のパートナーが、12〜30のエチレングリコール単位(PEG 12〜30)を含むリンカーを通じて、該分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、該分析物特異的結合剤並びに該結合対の第一及び第二のパートナーを通じて、該コーティングされた微粒子に分析物が結合する
b)結合対を通じて結合している分析物を含む該微粒子および該分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そして
c)微粒子に結合した分析物を測定する
工程を含む、前記方法。 - 前記微粒子が直径50nm〜20μmである、請求項1記載の方法。
- 前記微粒子が常磁性であり、そして工程1(b)の分離が磁力による、請求項1または2記載の方法。
- 前記分析物特異的結合剤が少なくとも50アミノ酸のポリペプチドである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記分析物特異的結合剤が最大10,000アミノ酸のポリペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 前記分析物特異的結合剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記分析物を競合アッセイ形式で測定する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記分析物をサンドイッチアッセイ形式で測定する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 微粒子に結合した分析物の前記測定が、電気化学発光標識の使用に基づく、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 結合対の前記の第一のパートナーが、それぞれ、アビジンおよび/またはストレプトアビジン、およびFimGより選択され、そして結合対の前記の第二のパートナーが、それぞれ、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、およびDsFより選択される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 結合対の前記の第一のパートナーがアビジンおよび/またはストレプトアビジンであり、そして結合対の前記の第二のパートナーがビオチンである、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 結合対の第二のパートナーに結合した前記のコンジュゲート化特異的結合剤が、組成物中に含まれ、前記組成物中、結合対の第二のパートナーと分析物特異的結合剤との間の平均モル比が1.1またはそれより大きい、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 別個の容器中に、または単一の容器単位の分離された区画中に、少なくとも、結合対の第一のパートナーでコーティングされた微粒子、および該結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法において用いるためのキットであって、ここで結合対の該第二のパートナーが12〜30のエチレングリコール単位(PEG 12〜30)を含むリンカーを通じて該分析物特異的結合剤に結合している、前記キット。
- 結合対の前記の第一のパートナーがアビジンまたはストレプトアビジンであり、そして結合対の前記の第二のパートナーがビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンより選択される、請求項13のキット。
- 別個の容器中に、または単一の容器単位の分離された区画中に、検出可能に標識された第二の分析物特異的結合剤をさらに含む、請求項13または14記載のキット。
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