CN115605185A

CN115605185A - 螯合剂用于防止胃肠外蛋白质溶液中形成可见颗粒的用途

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Publication number: CN115605185A
Application number: CN202180035456.XA
Authority: CN
Inventors: K·格雷戈里扎; A·阿尔门丁格; S·K·K·拉乌里
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2023-01-13
Also published as: EP4153130A1; WO2021233853A1; JP2023525898A; US20230233684A1

Abstract

本发明提供防止水性蛋白质配制物中形成可见颗粒的方法，特别是某些螯合剂的用途，以及利用所述方法得到的药物产品和组合物。

Description

螯合剂用于防止胃肠外蛋白质溶液中形成可见颗粒的用途

本发明涉及水性蛋白质组合物领域，特别是用于胃肠外应用的药物抗体配制物，其可稳定地阻止形成可见颗粒。

背景技术

在保质期内形成可见颗粒是与用于胃肠外使用的生物制药药物产品相关的主要问题之一。尽管临床后果的全部程度仍不清楚，但颗粒的存在通常被认为是对患者的潜在安全风险，因此其是胃肠外产品召回事件的最常见原因之一。(Doessegger等人2012)

生物制药配制物中形成颗粒的最常见根本原因之一是聚山梨醇酯(PS)(诸如PS20)的降解，通常将其添加到配制物中以保护蛋白质免受界面应力的影响。聚山梨醇酯可描述为脂肪酸偏酯与乙氧基化山梨醇或异山梨醇的异质混合物。(Hewitt等人2008；Lippold等人2017；Kishore等人2011b)

通过氧化以及化学或酶水解的聚山梨醇酯降解是众所周知的并且已被彻底研究。据报道，后一种机制主要由宿主细胞蛋白驱动，诸如与目标蛋白共纯化的溶酶体磷脂酶A2(LPLA2)，且其可催化聚山梨醇酯中酯键的裂解。(Labrenz2014；Dixit等人2016)

最近有报道称，这些酶对单酯或更高级种类的聚山梨醇酯具有不同的特异性，从而导致不同的PS降解模式(Graf等人2020；Hall等人2016)。PS20的水解降解不仅会导致表面活性剂功能的丧失(Kishore等人2011a)，而且还会导致游离脂肪酸(FFA)(诸如月桂酸或肉豆蔻酸)的释放，它们微溶于水溶液并且当FFA浓度超过溶解度极限时，会形成可见颗粒或亚可见颗粒。FFA在溶液中的溶解度取决于多种不同的因素，包括温度、pH或残留完整聚山梨醇酯的浓度(Doshi等人，2015)。先前已显示微量的金属离子(如Al³⁺)与水解PS降解产生的FFA相互作用，导致FFA-金属配合物最终从水性配制物中沉淀出来并充当可见颗粒的成核种子(Allmendinger等人，2021)。

然而，生物制药产品中FFA颗粒形成的发生通常是不可预测的，这导致了其他成核因子可能参与颗粒形成的假设。因此仍然需要提供防止在胃肠外的水性蛋白质配制物(诸如例如抗体的水性制剂(或组合物))中形成可见颗粒的解决方案。

本发明为这个问题提供了解决方案。更具体地，本发明通过添加赋形剂(螯合剂)提供针对低于溶解度极限下FFA颗粒形成的缓解方案，该赋形剂可以络合多价阳离子并防止它们与由聚山梨醇酯降解产生的脂肪酸相互作用。

螯合剂(诸如EDTA或DTPA)已常用于生物制药配制物中，以防止蛋白质或聚山梨醇酯的氧化降解(Yarbrough等人2019；Doyle Drbohlav等人2019；Kranz等人2019；Doshi等人2021；Gopalrathnam等人2018)。氧化可以通过过渡金属的存在来促进，这些过渡金属可以来自不锈钢制造设备(Zhou等人2011)，也可以通过原料引入，例如组氨酸(欧洲药品质量理事会(European Directorate for the Quality of Medicines))。

发明内容

在一个实施例中，本发明提供了一种稳定的水性组合物，其包含蛋白质和药用赋形剂，该药用赋形剂诸如例如缓冲液、包括抗氧化剂的稳定剂，且进一步包含至少一种螯合剂。

在一个实施例中，本发明提供了螯合剂用以防止在水性蛋白质配制物中形成可见颗粒的用途。

在一个实施例中，本发明提供了螯合剂在水性蛋白质配制物中用以防止包含浓度低于其溶解度水平的游离脂肪酸的形成可见颗粒的用途。

在另一个实施例中，本发明提供了一种在容器或小瓶中的药物剂型，其包含如本文定义的制剂，例如水性抗体组合物。

附图说明

图1：月桂酸盐颗粒随时间变化的流体动力学半径(rH)相对于Al浓度。

图2：月桂酸盐颗粒的S形拟合随时间变化的A)DLS强度和B)拐点相对于Al浓度。

图3：月桂酸盐颗粒随时间变化的A)流体动力学颗粒尺寸和B)散射强度相对于金属阳离子类型和浓度。

图4：在(A)EDTA和(B)DTPA(C)GLDA和(D)PDTA存在下，月桂酸盐颗粒随时间变化的流体动力学颗粒半径相对于螯合剂与铝的比例。

图5：在(A)EDTA和(B)DTPA(C)GLDA和(D)PDTA存在下，月桂酸盐颗粒随时间变化的散射强度相对于螯合剂与铝的比例。

图6：月桂酸盐颗粒随时间变化的(A)散射强度和(B)流体动力学颗粒半径相对于DTPA与Fe比例。

图7：月桂酸盐颗粒随时间变化的(A)散射强度和(B)流体动力学颗粒半径相对于DTPA与Al比例。

具体实施方式

由于表面活性剂降解，尤其是聚山梨醇酯(PS20和/或PS80)降解，形成由游离脂肪酸(FFA)组成的可见颗粒，这是生物制药行业面临的主要挑战，因为在胃肠外蛋白质配制物(诸如例如，治疗性抗体的胃肠外制剂)中的表面活性剂的选择有限。通过各种方式减少甚至消除聚山梨醇酯的降解，从而释放FFA是关键，因为FFA会沉淀而形成可见颗粒，这反过来可能会影响胃肠外药物产品的质量。

市售的聚山梨醇酯(PS20和80)是化学成分多样的混合物，主要含有山梨醇酐POE脂肪酸酯。PS80的主要种类含有一个山梨醇酐头部基团，其中从其延伸出4条聚氧乙烯(POE)链。理论上，总共有20个POE单元附接至每个头部基团，但实际上，最终可能或多或少。通常情况下，POE单元的数量呈类高斯分布，导致异质混合物。在附接至山梨醇酐头部基团的四个POE基团中，其中1至3个在其末端酯化为脂肪酸(FA)，其也可以以伯醇终止。在PS80中发现的FA有14到18个碳长，并且在链上最多可以有3个双键。最丰富的FA是油酸(≥58％，18个碳，1个双键)，其次是亚油酸(18％，18个碳，2个双键)。单个山梨醇酐头部基团上的FA取代的数量可以在0到4范围内。PS80还具有带有0到2个FA取代的异山梨醇头部基团。还存在大量未附接至头部基团的POE-FA。所有这些成分都会导致不同的异质混合物，其在制造商之间可能有很大差异。(Journal of Pharmaceutical Sciences 109(2020)633-639)。例如，存在于PS20中的其他脂肪酸包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸。

PS20和80具有不同的等级。根据本发明，测试了以下等级：

-高纯度(HP)PS20

-超精制(SR)PS20

-高纯度(HP)PS80

-超精制(SR)PS80

-纯油酸(POA)PS80

所有等级均购自总部位于英格兰Snaith的特种化学品公司Croda(以下简称“Croda”)。与HP PS20和HP PS80合成工艺相比，SR等级通过专有的快速色谱工艺进一步纯化，该工艺可以从PS原料中去除额外的极性和氧化杂质(诸如醛和过氧化物)(Doshi等人，2020a)。中国药典(ChP)委员会最近推出了纯油酸等级，规定注射产品的油酸酯含量≥98.0％。尽管这种高油酸等级不再是胃肠外产品用途的强制性要求，但与HP/SR PS20和HP/SR PS80相比，它在水解降解时形成亚可见颗粒和可见颗粒的倾向较低，因此最近获得了越来越多的普及。(Doshi等人，2021)。

表1a：PS20和PS80的美国/欧洲/中国(Ch)药典规范

根据本发明，研究了多价阳离子作为成核因子用于可见颗粒形成的作用，并在用游离脂肪酸溶液以及用不同酶酶促水解的部分降解的聚山梨醇酯的掺入研究中得到证实。金属杂质(即铝、钙、镁、铁、锌)可以通过制造过程(过程可浸出物)(Zhou等人，2011)或初级包装容器(玻璃可浸出物)引入生物制药配制物。(Ditter等人，2018)。已知其中一些金属杂质(例如铁)可促进聚山梨醇酯的氧化降解。(Kranz等人，2019；Doyle Drbohlav等人，2019)

因此，在一个实施例中，本发明提供了一种稳定的水性组合物，其包含蛋白质和药用赋形剂，该药用赋形剂诸如例如缓冲液、包括抗氧化剂的稳定剂，且进一步包含至少一种螯合剂。在一个实施例中，所述稳定的水性组合物(或制剂)用于胃肠外使用。

在另一个实施例中，本发明提供了一种稳定的水性组合物，其包含蛋白质和药用赋形剂，该药用赋形剂诸如例如缓冲液、包括抗氧化剂的稳定剂，且进一步包含游离脂肪酸、无机金属离子和至少一种螯合剂。在一个实施例中，所述稳定的水性组合物(或制剂)用于胃肠外使用。在另一个实施例中，游离脂肪酸如本文所定义。在又一个实施例中，所述游离脂肪酸由PS20或PS80的水解降解产生。在又一个实施例中，所述游离脂肪酸以低于其溶解度浓度的浓度存在于所述稳定的水性组合物中，并且螯合剂的浓度与无机金属离子的浓度至少相同(即等摩尔)。在该实施例中，无机金属离子可以是选自铝、钙、镁、铁和/或锌的多价离子中的一种或几种离子，优选地为铝或铁。

在一个实施例中，所述“螯合剂”选自以下项的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA或喷替酸)、乙二醇-双(β-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、N-羧甲基-N'-(2-羟乙基)-N,N'-亚乙基二甘氨酸(HEDTA)、乙二胺-N,N'-双(2-二羟基苯乙酸)(EDDHA)、1,3-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸(PDTA)、N,N-双(羧甲基)-L-谷氨酸四钠(GLDA)、柠檬酸、丙二酸酯、酒石酸、抗坏血酸、水杨酸、天冬氨酸、谷氨酸。在另一个实施例中，所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。在另一个实施例中，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸(DTPA或喷替酸)。在又一个实施例中，仅使用一种螯合剂。

在一个实施例中，所述螯合剂以从0.0005％(w/v)至2.0％(w/v)或从0.001％(w/v)至0.1％(w/v)的浓度存在。在另一个实施例中，如果螯合剂为EDTA，它以0.005％(w/v)的相对量存在。在另一个实施例中，如果螯合剂为DTPA，它以0.05mM的量存在。在又一个实施例中，螯合剂以至少与根据本发明的组合物中的金属杂质或无机金属离子相同(即等摩尔)的量存在。

在另一个实施方案中，提供了如上定义的组合物，其中所述组合物的pH在5至7的范围内。在一个方面，pH为约5.5或约6。

在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中蛋白质为抗体。在一个方面，抗体为单克隆抗体。在另一个方面，抗体是人或人源化单克隆、单特异性或双特异性抗体。

在又一个实施例中，根据本发明的抗体为具有INN帕妥珠单抗的抗体。帕妥珠单抗是可商购的，例如以商品名

商购。例如，帕妥珠单抗也公开在EP 2 238 172B1中。因此，在另一个实施例中，“帕妥珠单抗”(或“rhuMAb 2C4”)是指包含分别如EP 2 238172 B1中所公开的SEQ ID No.3和4中的可变轻链氨基酸序列与可变重链氨基酸序列的抗体。在帕妥珠单抗是完整抗体的情况下，它包含分别在EP 2 238 172 B1中所公开的SEQ IDNo.15和16中的轻链氨基酸序列与重链氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明提供如上文所定义的组合物，该组合物由以下组分组成：配制物A：在10mM His/HisHCl(pH 5.0)、10mM蛋氨酸、240mM蔗糖、0.05％(w/v)PS20中的10mg/mL API；配制物B：在20mM His(pH 6)、240mM海藻糖、0.02％(w/v)PS20中的25mg/mLAPI；配制物C：在20mM L-His/His乙酸盐缓冲液(pH 5.5)、220mM蔗糖、10mM L-蛋氨酸、0.04％(w/v)PS20中的50mg/mL API；配制物D：在20mM L-His/His乙酸盐缓冲液(pH5.5)、130mM盐酸精氨酸、10mM L-蛋氨酸、0.04％(w/v)PS20中的180mg/mL API；配制物E：在20mMHis/Asp(pH 6.0)、150mM精氨酸、40mM Met、0.05％(w/v)PS80中的175mg/mL API。如本文所用，术语“API”是指活性药物成分并且是药物制剂领域的技术人员所周知的。在一个实施例中，API是如本文所定义的蛋白质或抗体。

在另一个实施例中，本发明提供了以如实例5(表7)中指定的配制物01、02、03、04或05命名的组合物中的任一者。

在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含在20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 6.0)、120mM蔗糖、0.2mg/mL HP PS20、10mM蛋氨酸和0.05mM DTPA中的30mg/mL帕妥珠单抗。

在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含在20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 6.0)、120mM蔗糖、0.2mg/mL HP PS20、10mM蛋氨酸和0.05mM EDTA中的30mg/mL帕妥珠单抗。

在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含在20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 6.0)、120mM蔗糖、0.2mg/mL纯油酸(POA)PS80、10mM蛋氨酸和0.05mM DTPA中的30mg/mL帕妥珠单抗。

在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含在20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 6.0)、120mM蔗糖、0.2mg/mL纯油酸(POA)PS80、10mM蛋氨酸和0.05mM EDTA中的30mg/mL帕妥珠单抗。

在另一个实施例中，本发明提供如本文所定义的螯合剂用于制备药物，尤其是用于制备稳定的胃肠外蛋白质，更具体地胃肠外抗体制剂的用途。在一个实施例中，胃肠外制剂为水性制剂。在另一个实施例中，胃肠外制剂用于皮下(sc)应用。在另一个实施例中，胃肠外制剂用于静脉内(iv)应用。

在另一个实施例中，本发明提供了如本文所定义的螯合剂用以防止胃肠外蛋白质，尤其是抗体制剂中形成可见颗粒的用途。在一个方面，胃肠外制剂为水性制剂。在另一方面，胃肠外制剂用于皮下(sc)应用。在另一方面，胃肠外制剂用于静脉内(iv)应用。在另一个方面，本发明提供如本文所定义的螯合剂用以防止胃肠外蛋白质制剂中形成可见颗粒(包含浓度低于其溶解度水平的游离脂肪酸)的用途。

术语“胃肠外”具有其通常含义。在一个方面，胃肠外是指用于皮下(sc)注射和/或用于静脉内注射。

由于存在如本文所定义的螯合剂，本发明的胃肠外蛋白质制剂是“稳定的”。术语“稳定”是指所述制剂在其许可的保质期结束之前保持不含，或基本上不含，或几乎不含可见颗粒。在一个方面，本发明的制剂可稳定长达30个月、或长达24个月、或长达18个月、或长达12个月。胃肠外蛋白质制剂的稳定性可受技术人员熟知的参数(诸如例如光(UV辐射)、温度和/或摇动)影响。因此，在一个方面，术语“稳定”包括通常推荐用于储存包含本发明的胃肠外蛋白质或抗体制剂的产品的条件，例如，如由欧洲药品管理局(EMA)发布的产品特性概要(SmPC)或该给定产品的包装插页中描述的。在一个实施例中，术语“稳定”包括在2℃至8℃之间的温度且基本上避光下的30个月的时期。

通常可以使用如欧洲或美国药典中描述的方法检测可见颗粒的存在(参见Ph.Eur10.0；第2.9.20章；和首次补充USP 37–NF 32<790>)。在本发明的一个实施例中，术语“不含”可见颗粒是指，利用Seidenader V 90-T仪器(Seidenader Maschinenbau GmbH，MarktSchwaben，DE)，在使用所附工作实施例中描述的方法的胃肠外蛋白质制剂中没有检测到可见颗粒。术语“基本上不含”可见颗粒是指使用所附工作实施例中描述的方法和条件，利用Seidenader V 90-T仪器(Seidenader Maschinenbau GmbH，Markt Schwaben，DE)，在胃肠外蛋白质制剂中可以检测到1至5个可见颗粒。术语“几乎不含”可见颗粒是指使用如欧洲药典(参见Ph.Eur 10.0；第2.9.20章)中描述的黑和白面板(此处为“E/P框”或“E/P”)可以检测0至4个可见颗粒。

术语“可见颗粒”是指包含一种或几种游离脂肪酸或聚集蛋白质与游离脂肪酸的混合物的颗粒。在一个方面，可见颗粒具有至少80μm或至少100μm的粒度，并且可以被视为例如在胃肠外蛋白质制剂中的浊度或沉淀。在一个实施例中，可见颗粒形成有至少一种多价阳离子和从胃肠外蛋白质制剂中存在的表面活性剂(诸如例如PS20和PS80)裂解的游离脂肪酸。如本文所用，术语“多价阳离子”是指一种或几种金属杂质，其通过制造过程或初级包装容器引入胃肠外蛋白质制剂。在一个实施例中，此类多价阳离子是选自铝、钙、镁、铁、锌的阳离子。如本文所用，术语“脂肪酸”具有有机化学技术人员已知的其普通含义。在一个实施例中，术语脂肪酸是指存在于PS20或PS80中或从PS20或PS80裂解的任何脂肪酸。在另一个实施例中，术语“脂肪酸”是指月桂酸、或肉豆蔻酸、或棕榈酸、或硬脂酸或油酸。根据本发明，所述脂肪酸可以以低于其溶解度浓度(或“溶解度水平”)的浓度存在于水性蛋白质制剂中，并与本文定义的作为成核因子的多价阳离子一起形成可见颗粒。如本文所定义的脂肪酸的溶解度浓度对于技术人员来说是众所周知的并且可以例如在(Doshi等人2015；Doshi等人2020b；Glücklich等人2020)中找到。在一个实施例中，术语“低于其溶解度浓度”是指低于如本文所定义的脂肪酸在水溶液或缓冲液中在0℃至30℃之间的任何温度下的溶解度浓度。在另一实施例中，术语“低于其溶解度浓度”是指低于如本文所定义的脂肪酸在水溶液或缓冲液中在2℃至8℃的温度下的溶解度浓度。在另一实施例中，术语“低于其溶解度浓度”是指低于如本文所定义的脂肪酸在水溶液或缓冲液中在约5℃的温度下的溶解度浓度。

因此，在另一实施例中，本发明提供了如本文所定义的螯合剂在制备药物中的用途，特别是用于制备水性胃肠外蛋白质，更具体地胃肠外抗体制剂，其特征在于在其许可的保质期的整个时间内保持不含，或几乎不含或基本上不含包含由PS20或PS80降解产生的游离脂肪酸和任选的一种或几种多价阳离子的可见颗粒，但至少长达30个月；或长达24个月；或长达18个月；或长达12个月，并在推荐用于储存此类制剂的条件下。

在另一实施例中，本发明提供了一种药物剂型，其包含如本文所定义的蛋白质制剂，例如在容器(诸如例如小瓶或注射器)中的水性抗体制剂。

在另一实施例中，本发明提供了一种药物剂型，该药物剂型包含使用如本文所定义的螯合剂在容器(诸如例如小瓶或注射器)中获得的蛋白质制剂。

术语“赋形剂”是指药物组合物或制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。赋形剂包括但不限于缓冲液、稳定剂(包括抗氧化剂)或防腐剂。

术语“缓冲液”是有机化学或药物科学领域的技术人员所熟知的，例如药物制剂开发。本文所用的缓冲液是乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、组氨酸、磷酸盐、Tris、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸缓冲液体系。而且，在该实施方案中，所述缓冲液的组氨酸浓度为5-50mM。优选的缓冲液为游离组氨酸碱基和组氨酸-HCl或乙酸盐或琥珀酸盐和/或天冬氨酸。而且，在该实施方案中，所述缓冲液的组氨酸浓度为5-50mM。

术语“稳定剂”是有机化学或药物科学领域的技术人员所熟知的，例如药物制剂开发。根据本发明，稳定剂选自由糖、糖醇、糖衍生物或氨基酸组成的组。在一个方面，稳定剂是(1)蔗糖、海藻糖、环糊精、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、或/和(2)蛋氨酸、和/或(3)精氨酸、或赖氨酸。在又一个方面，所述稳定剂的浓度分别是(1)500mM以下或(2)5-25mM，或/和(3)350mM以下

本文所用的术语“蛋白质”是指任何治疗相关的多肽。在一个实施方案中，术语蛋白质是指抗体。在另一个实施方案中，术语蛋白质是指免疫缀合物。

术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体类别或结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。在一个实施方案中，任何这些抗体是人的或人源化的。在一个方面，抗体选自以下：阿仑单抗(alemtuzumab)

阿特珠单抗(atezolizumab)

贝伐单抗(bevacizumab)

西妥昔单抗(cetuximab)

帕尼单抗(panitumumab)

帕妥珠单抗(pertuzumab)(

2C4)、曲妥珠单抗(trastuzumab)

托西莫单抗(tositumomab)

阿昔单抗(abciximab)

阿达木单抗(adalimumab)

阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、托珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)

巴维妥昔单抗(bavituximab)、贝利木单抗(belimumab)

briankinumab、卡那单抗(canakinumab)

西利珠单抗(cedelizumab)、培戈-赛妥珠单抗(certolizumab pegol)

cidfusituzumab、cidtuzumab、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克瑞组单抗(crenezumab)、达利珠单抗(daclizumab)

达洛珠单抗(dalotuzumab)、地诺单抗(denosumab)

依库珠单抗(eculizumab)

依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、艾米希组单抗(emicizumab)

泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、戈利木单抗(golimumab)

伊匹单抗(ipilimumab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、英夫利昔单抗(infliximab)

拉贝妥珠单抗(labetuzumab)、来瑞组单抗(lebrikizumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、纳武单抗(mogamulizumab)、莫维组单抗(motavizumab)、motovizumab、muronomab、那他珠单抗(natalizumab)

耐昔妥珠单抗(necitumumab)

尼妥珠单抗(nimotuzumab)

nolovizumab、numavizumab、奥洛组单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)

奥那妥组单抗(onartuzumab)(也称为MetMAb)、帕利珠单抗(palivizumab)

帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、帕博利珠单抗(pembrolizumab)

培克珠单抗(pexelizumab)、普立昔单抗(priliximab)、ralivizumab、兰尼单抗(ranibizumab)

reslivizumab、瑞替珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗妥木单抗(robatumumab)、隆利组单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西鲁库单抗(sarilumab)、苏金单抗(secukinumab)、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、西法木单抗(sifalimumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)

西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他度组单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非组单抗(tefibazumab)、托西珠单抗(tocilizumab)

托利珠单抗(toralizumab)、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)

维多珠单抗(vedolizumab)

维西珠单抗(visilizumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)。

“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。

抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在某些方面，抗体为IgG1同种型。在某些方面，抗体为IgG1同种型，其包含P329G、L234A和L235A突变以降低Fc区效应子功能。在其他方面，抗体为IgG2同种型。在某些方面，抗体为IgG4同种型，其在铰链区包含S228P突变以改善IgG4抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为a、d、e、g和m。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。

“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。

如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：

(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；以及

(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。

除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。

“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。

“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许含有在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的额外的组分的制剂。

“药用载体”是指药物组合物或制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于本文所定义的赋形剂。

A.嵌合抗体和人源化抗体

在某些方面，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些方面，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些方面，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法，例如在Almagro and Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如：Riechmann等人，

Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(记载了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载了“表面重塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(记载了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83:252-260(2000)(记载了FR改组的“引导选择”方法)。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

B.人抗体

在某些方面，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol.20:450-459(2008)中。

可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物得到人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.

Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述

技术的美国专利号5,770,429；描述K-M

技术的美国专利号7,041,870，以及描述

技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。

人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。

人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。

C.抗体衍生物

在某些方面，本文提供的抗体可被进一步修饰以包含本领域已知的并且容易获得的附加非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。

D.免疫缀合物

本发明还提供了包含本文抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种治疗剂如细胞毒剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素缀合(化学结合)。

一方面，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用连接基将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review 68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和连接基的实例。

在另一个方面，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。

在另一个方面，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，《科学》(Science)238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO 94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接基”。例如，可以使用对酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、对光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

E.多特异性抗体

在某些方面，本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体。“多特异性抗体”是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利4,676,980，以及Brennan等人，Science，229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.，152:5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。

本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双作用FAb”或“DAF”，其包含结合两种不同抗原或相同抗原的两种不同表位的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820和WO 2015/095539)。

多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在一方面，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。

多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。

F.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。对于这些方法，提供了编码抗体的一种或多种分离的核酸。

在天然抗体或天然抗体片段的情况下，需要两种核酸，一种用于轻链或其片段，一种用于重链或其片段。此类核酸编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或不同的表达载体上。

在具有异源二聚重链的某些双特异性抗体的情况下，需要四种核酸，一种用于第一轻链，一种用于包含第一异单体(heteromonomeric)Fc区多肽的第一重链，一种用于第二轻链，并且一种用于包含第二异单体Fc区多肽的第二重链。四种核酸可包含在一种或多种核酸分子或表达载体中。此类核酸编码构成抗体的第一VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第一异单体Fc区的第一VH的氨基酸序列和/或构成抗体的第二VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第二异单体Fc区的第二VH的氨基酸序列(例如抗体的第一轻链和/或第二轻链和/或第一重链和/或第二重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即一个载体可以包含这些核酸中的多于一种。这些双特异性抗体的示例是CrossMab(参见例如Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191)。例如，该异单体重链中的一条包含所谓的“杵突变(knob mutation)”(T366W，以及任选地S354C或Y349C中的一者)，并且该异单体重链中的另一条包含所谓的“臼突变(hole mutation)”(T366S、L368A和Y407V，以及任选地Y349C或S354C)(参见例如Carter，P.等人，Immunotechnol。2(1996)73)，根据EU索引编号。

对于抗体重组生产，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或通过重组方法产生或通过化学合成获得此类核酸。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523(还参见Charlton,K.A.,在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.主编，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。

除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，该真核微生物包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。

用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。

植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。

脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293T细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。

现在将通过以下非限制性实用示例来进一步说明本发明。

实例

材料和方法

游离脂肪酸在缓冲水溶液中的溶解度

游离脂肪酸储备溶液按照Doshi等人(Doshi等人2015)之前的描述制备，并稍作修改。简而言之，月桂酸(“LA”，Sigma-Aldrich/Merck，Darmstadt，DE)和肉豆蔻酸(“MA”，Sigma-Aldrich/Merck，Darmstadt，DE)悬浮在PS20HP(Croda，Edison，NJ，USA)中并在60℃搅拌(150rpm)30分钟，直到两种FFA完全溶解。用-预热(60℃)的注射用水(WFI)将溶液按1:5稀释，并立即通过0.22μm PVDF Steriflip过滤器(Merck Millipore，Darmstadt，DE)过滤。如Honemann等人(Honemann等人，2019)所述，通过LC-MS验证FFA储备溶液中LA和MA的浓度。

将LA/MA/PS20储备溶液掺入到20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中(1:500稀释，n＝3)，并在MaxQ^TM 4000台式轨道摇床(Thermo Scientific^TM，Waltham，MA，USA)上在25℃均质化1小时。样品在5℃储存，并在0、1、7和28天后使用根据Ph.Eur 2.9.20(欧洲药品质量管理局)的黑/白面板以及Seidenader V 90-T仪器(Seidenader Maschinenbau GmbH，Markt Schwaben，DE)分析可见颗粒。在目视检查之前将所有样品平衡至环境温度(1小时)。每个容器中可见颗粒的数量通过Seidenader在E/P框中定义为“许多颗粒(>7)”、“少量颗粒(5-7)”或“几乎不含颗粒(0-4)”和“许多颗粒(>10)”、“少量颗粒(6-10)”、“基本上不含颗粒(1-5)”或“不含颗粒(0)”。

表1列出了FFA储备溶液和样品的组成。

表1 LA/MA/PS20储备溶液和样品的组成

用游离脂肪酸和铝进行掺入研究

从20mM乙酸组氨酸(pH 5.5)中的氯化铝六水合物制备100ppm铝储备溶液。铝的实际浓度通过电感耦合(inductively-coupled)等离子体质谱(ICP-MS)确定。然后将该储备溶液稀释至10ppm Al³⁺，并通过0.22μm孔隙率滤筒(Sterivex-GV，Millipore)进行无菌过滤(sterile-filtered)。在层流空气流下无菌地制备进一步的稀释液(10ppb-250ppb Al³⁺)，并分配到20mL I型硼硅酸盐玻璃小瓶(Schott，Mainz，DE)中。

向含有不同量的铝(0-250ppb)的样品中掺入不同的FFA储备溶液(LAMA-2、LAMA-6、LAMA-7、LAMA-8和LAMA-10)。向含有250ppb铝的样品中额外地掺入乙二胺四乙酸(EDTA)以达到0.005％(w/v)的目标浓度。所有小瓶均用20mm聚四氟乙烯注射塞(D777-1，Daikyo)和铝质钳口盖密封，并在MaxQ^TM 4000台式轨道摇床(Thermo Scientific^TM，Waltham，MA，USA)上在25℃均质化1小时。

掺入LAMA-6、LAMA-7和LAMA-8的稀释液导致LA和MA浓度低于其溶解度极限，而掺入LAMA-2后的FFA浓度高于其溶解度极限并用作阳性对照。LAMA-10仅包含聚山梨醇酯20，并用于制备阴性对照。所有样品均重复三次制备。

样品在5℃储存，并如上所述使用黑/白面板和Seidenader V 90-T仪器(Seidenader Maschinenbau GmbH，Markt Schwaben，DE)评估可见颗粒的形成长达28天。

部分降解的PS20的溶解度

PS20被对单酯和更高级的酯具有不同特异性的固定化酶(米黑毛霉菌脂肪酶(MML)和南极假丝酵母脂肪酶(CAL))酶解(Graf等人2020)。为每种酶制备了一组具有六种不同降解水平(10％、15％、20％、30％、40％和60％降解)的聚山梨醇酯(表2)。

将PS20储备溶液(50mg/mL)掺入到20mM组氨酸缓冲液(pH 5.5)中(1:125稀释，n＝3)，并在MaxQ^TM 4000台式轨道摇床(Thermo Scientific^TM，Waltham，MA，USA)上在25℃均质化1小时。样品在5℃储存，并在0、1、7和28天后使用根据Ph.Eur 2.9.20(欧洲药品质量理事会)的黑/白面板分析可见颗粒。在目视检查之前将所有样品平衡至环境温度(1小时)。将每个容器的可见颗粒的数量定义为“许多颗粒(>7)”、“少量颗粒(5-7)”或“几乎不含颗粒(0-4)”。

表2：酶降解聚山梨醇酯

用部分降解的聚山梨醇酯20和铝的掺入研究

如上所述制备包含在20mM乙酸组氨酸(pH 5.5)中的经稀释铝溶液，并装入到20mLI型硼硅酸盐玻璃小瓶(Schott，Mainz，DE)中。用不同的PS20储备溶液(PS20-Std、MML-10、MML-15、MML-40、CAL-10、CAL-15)掺入含有不同量的铝(0-250ppb)的样品。此外，含有250ppb铝的样品在掺入部分降解的PS20之前补充了0.005％(w/v)乙二胺四乙酸(EDTA)或0.05mM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。将小瓶用20mm聚四氟乙烯注射塞(D777-1，Daikyo)和铝质钳口盖密封，并在MaxQ^TM 4000台式轨道摇床(Thermo Scientific^TM，Waltham，MA，USA)上在25℃均质化1小时。

用MML-10/-15和CAL-10/-15制备的样品导致FFA浓度低于其溶解度极限，而掺入MML-40(阳性对照)导致FFA浓度高于溶解度极限。PS20-Std仅包含未降解的聚山梨醇酯20，并用于制备阴性对照。所有样品均重复三次制备。

将样品储存在5℃，并使用根据Ph.Eur 2.9.20.(欧洲药品质量理事会)的黑/白面板通过目视检查评估颗粒形成长达28天。

实例1：游离脂肪酸在组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的溶解度。

将月桂酸(LA)和肉豆蔻酸(MA)的游离脂肪酸(FFA)储备溶液掺入到20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)(n＝3)中。在2℃-8℃孵育0天、1天、7天和28天后，使用(A)Seidenader和(B)E/P框分析样品中可见颗粒的存在。每个容器中颗粒的数量通过Seidenader在E/P框中分类为“许多颗粒(>7，xxx)”、“少量颗粒(5-7，xx)”或“几乎不含颗粒(0-4，/)”和“许多颗粒(>10，xxx)”、“少量颗粒(6-10，xx)”、“基本上不含颗粒(1-5，x)”或“不含颗粒(0，/)”。d＝检查日，d0＝掺入后。结果汇总于表3中。

表3：游离脂肪酸在组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的溶解度。

实例2：可见颗粒的形成

在将FFA储备溶液掺入到含有从0ppb至250ppb(n＝3)范围内的不同量的铝的水性缓冲溶液(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5))中后。含有最高量的铝(250ppb)的样品额外地与螯合剂(EDTA)一起配制。在2℃-8℃储存0天、1天、7天和28天后，使用(A)Seidenader和(B)E/P框分析样品中可见颗粒的存在。每个容器中颗粒的累计含量通过Seidenader在E/P框中分类为“许多颗粒(>7，xxx)”、“少量颗粒(5-7，xx)”或“几乎不含颗粒(0-4，/)”和“许多颗粒(>10，xxx)”、“少量颗粒(6-10，xx)”、“基本上不含颗粒(1-5，x)”或“不含颗粒(0，/)”。将不含FFA或不含盐的样品用作阴性对照，而将含有高于溶解度极限(*)的FFA的样品用作阳性对照。d＝检查日。d0＝掺入后。nd＝未测定。结果汇总于表4中。

表4：可见颗粒的形成

实例3：部分降解的聚山梨醇酯20在组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的溶解度。

将先前被MML或CAL降解(降解水平0％-60％)的聚山梨醇酯20(PS20)掺入到20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)(n＝3)中至最终PS20浓度为0.04％(w/v)。在2℃-8℃储存0天、1天、7天和28天后，目视检查样品(E/P框)中可见颗粒的存在。每个容器中颗粒的累计含量在E/P框中被分类为“许多颗粒(>7，xxx)”、“少量颗粒(5-7，xxx)”或“几乎不含颗粒(0–4，/)”。d＝检查日。d0＝掺入后，MML＝米黑毛霉菌脂肪酶，CAL＝南极假丝酵母脂肪酶。结果汇总于表5中。

表5：部分降解的聚山梨醇酯20在组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的溶解度。

实例4：可见颗粒的形成

在将部分降解的聚山梨醇酯20掺入到含有从0ppb至250ppb(n＝3)范围内的不同量的铝的水性缓冲溶液(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5))中后。含有最高量的铝(250ppb)的样品额外地与螯合剂(EDTA或DTPA)一起配制。在2℃-8℃孵育0天、1天、7天和28天后，目视检查样品(E/P框)中可见颗粒的存在。每个容器中颗粒的累计含量被分类为“许多颗粒(>7，xxx)”、“少量颗粒(5-7，xxx)”或“几乎不含颗粒(0–4，/)”。将具有100％完整PS20或不含盐的样品用作阴性对照，而将含有高于溶解度极限(*)的60％降解的PS(MML)的样品用作阳性对照。d＝检查日。d0＝掺入后，nd＝未测定，MML＝米黑毛霉菌脂肪酶，CAL＝南极假丝酵母脂肪酶。结果汇总于表6中。

表6：可见颗粒的形成

结果

通过将FFA储备溶液掺入到组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中以达到月桂酸0μg/mL-30μg/mL和肉豆蔻酸0μg/mL-12μg/mL的目标浓度来评估月桂酸和肉豆蔻酸的溶解度极限(参见实例1)。样品在2℃-8℃下孵育，并在0、7、14和28天后使用Seidenader(表3A)和E/P框(表3B)检查可见颗粒。在含有至少20/8μg/mL月桂酸/肉豆蔻酸的样品中1天后已经观察到许多可见颗粒(在Seidenader中>10，在E/P框中>7)的形成，而较低浓度的FFA导致较少的颗粒总数和延迟的颗粒发生。由于Seidenader机器的目视检查是在1.5倍放大率下进行的，因此与E/P框分析相比，每个容器的颗粒总数更高。将溶解度极限定义为月桂酸和肉豆蔻酸的浓度，超过该浓度时，对于三个重复的所有三个小瓶，在28天后观察到许多可见颗粒(Seidenader>10，E/P框>7)。如表3所示，在至少含有12.5μg/mL月桂酸和5μg/mL肉豆蔻酸的样品中，游离脂肪酸的浓度超过了溶解度极限，且FFA被粉碎为可见颗粒。总之，所有月桂酸和肉豆蔻酸浓度较低的样品都被认为低于溶解度极限。

随后，将FFA储备溶液掺入到含有从0ppb至250ppb范围内的不同量的铝的水性缓冲溶液(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5))中(实例2)。因此，样品中脂肪酸的最终浓度低于先前测定的溶解度极限(10/4、7.5/3、5/2、0/0μg/mL月桂酸/肉豆蔻酸)，但一个含有25/10μg/mL月桂酸/肉豆蔻酸的用作阳性对照的样品除外。含有最高含量的铝(250ppb)的样品额外地与0.005％(w/v)的EDTA一起掺入。所有样品在2℃-8℃下孵育长达28天，并使用Seidenader(表4A)和E/P框(表4B)检查可见颗粒。如表4所示，铝的存在导致FFA颗粒的形成，甚至低于FFA的溶解度极限。可见颗粒形成的程度以及发生取决于铝的浓度，并且令人惊讶地还与FFA的浓度成反比。含有最高浓度的铝的样品显示出最早的颗粒发生以及最高数量的颗粒。对于含有FFA的量下降的样品，这种效果更加明显。如Seidenader结果所示，即使是10ppb的痕量铝也足以络合游离脂肪酸并形成可见颗粒。仅含有脂肪酸(低于溶解度极限)但不含铝(反之亦然)的样品在2℃-8℃下孵育长达28天，未形成大量的可见颗粒(在Seidenader中≤10，在E/P框中≤7)。

通过向含有最高浓度的铝(250ppb)且FFA水平低于溶解度极限的样品添加0.005％(w/v)EDTA可以抑制可见FFA颗粒的形成。

转向从水性(胃肠外)蛋白质或抗体配制物中的聚山梨醇酯中释放FFA的更具体问题，先前已公开聚山梨醇酯的水解降解主要由与活性药物成分(API)共纯化的宿主细胞蛋白(HCP)的存在驱动并能催化聚山梨醇酯中酯键的水解。(Labrenz 2014；Dixit等人2016)。众所周知，不同的酶对聚山梨醇酯的单酯或聚酯成分具有不同的特异性，从而导致不同的聚山梨醇酯降解模式(McShan等人2016)。

在实例3中，聚山梨醇酯被预先固定在珠粒上的两种不同酶人工降解，以允许精确控制降解水平。MML优先降解更高级的酯，而CAL均匀降解单酯以及更高级的酯(Graf等人2020)。

用MML或CAL降解的部分水解的聚山梨醇酯的溶解度极限是通过将PS20储备溶液掺入到的组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中至总浓度为0.4mg/mL来测定的。样品在2℃-8℃孵育，并在长达28天的时间内目视检查(E/P框)可见颗粒的存在。在掺入通过40％和60％的MML降解的聚山梨醇酯后，立即观察到许多可见颗粒的形成(在E/P框中>7)。相比之下，CAL样品在初始时间点(d0)没有观察到可见颗粒，即使在最高降解水平(60％)也是如此。在2℃-8℃孵育后，对于MML和CAL样品，分别在20％或30％聚山梨醇酯降解时观察到可见颗粒。

每个聚山梨醇酯降解系列的溶解度极限被定义为临界降解度，在此临界降解度之上，对于三个重复的所有三个小瓶，在28天后观察到许多可见颗粒(E/P框>7)。

聚山梨醇酯降解度较低的样品(MML<20％和CAL<30％)被定义为低于溶解度极限。

在下一步中，将部分降解的PS20溶液掺入到含有从0ppb至250ppb范围内的不同量的铝的水性缓冲溶液(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5))中(实例4)。因此，聚山梨醇酯降解物的最终浓度低于先前测定的溶解度极限(10％和15％)，但一个含有用40％ MML降解的聚山梨醇酯的用作阳性对照的样品除外。含有最高含量的铝(250ppb)的样品额外地与0.05mM的DTPA或0.005％(w/v)的EDTA一起掺入。所有样品在2℃-8℃孵育长达28天并进行目视检查(E/P框)。如表6所示，铝的存在导致FFA颗粒的形成，甚至低于临界聚山梨醇酯降解水平。同样，可见颗粒形成的程度以及颗粒发生取决于铝的浓度，并且令人惊讶地还与PS20降解度和降解模式成反比。含有最高浓度的铝的样品显示出最早的颗粒发生以及最高数量的颗粒。对于较低的聚山梨醇酯降解度(10％)，这种效果稍微更明显。有趣的是，当存在铝时，与相应的MML样品相比，即使在铝含量非常低(10ppb)和更早(7天后)的情况下，CAL样品也显示出可见颗粒的形成。

在2℃-8℃孵育长达28天后，在掺入了未降解的聚山梨醇酯或不含铝的样品中没有形成可见颗粒。

因此，通过将0.05mM DTPA或0.005％(w/v)EDTA添加到含有最高浓度的铝(250ppb)和部分降解的低于溶解度极限的聚山梨醇酯的样品中，成功地防止了可见FFA颗粒的形成。

实例5：具有和不具有螯合剂的帕妥珠单抗配制物中的颗粒的形成

帕妥珠单抗(mAb1)在20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 6.0)、120mM蔗糖、补充以0.2mg/mL HP PS20或纯油酸(POA)PS80、0或10mM蛋氨酸和0或0.05mM螯合剂(DTPA或EDTA)中配制为30mg/mL，如表7所示。将配制的药物产品装入到20cc硼硅酸盐小瓶(14.0mL)中并在2℃-8℃储存。制备了每种配制物的30个小瓶。

表7：不同mAb1配制物的样品组成

在2℃-8℃孵育6个月后，对每种配制物的30个小瓶进行目视检查(Seidender或E/P)。从2℃-8℃储存(冷样品溶液)取出后1小时内或在环境温度平衡4小时后检查小瓶。

结果：

表8和表9分别总结了在2℃-8℃储存6个月后使用E/P方法或Sidenader的目视检查结果。与平衡至环境温度后的样品相比，冷样品溶液的总颗粒数总体较高，这表明颗粒主要由在较低温度下溶解度较低的游离脂肪酸或脂肪酸盐组成。比较平衡后不同配制物中的颗粒，所有五种配制物中含有颗粒的容器数量非常相似(30个容器中的1-3个容器)。颗粒总数和

表8:6个月(2℃-8℃)后的目视检查(EP)

表9：6个月(2℃-8℃)后的增强目视检查(Seidenader)

实例6：用不同的PS20和PS80等级和DTPA进行掺入研究

方法

酶降解PS20和PS80的制备

使用固定化酶(米黑毛霉菌脂肪酶(MML)、南极假丝酵母脂肪酶(CAL)和南极假丝酵母脂肪酶B(CALB))将超精制(SR)PS20和PS80、高纯度(HP)PS20和PS80以及纯油酸(POA)PS80酶水解10％(Graf等人2020)。这些酶对单酯(mono-)和更高级的酯具有不同的特异性，而MML主要降解PS中的更高级的酯，CAL靶向单酯和更高级的酯以及CALB优先降解单酯。

用部分降解的聚山梨醇酯(PS20和PS80)和铝的掺入研究

如上所述制备包含在20mM乙酸组氨酸(pH 5.5)中的经稀释铝溶液，并装入到20mLI型硼硅酸盐玻璃小瓶(Schott，Mainz，DE)中。将含有0ppb或250ppb铝(Al³⁺)的样品掺入不同的PS储备溶液(HP PS20、SR PS20、HP PS80、SR PS80、POA PS80；降解水平为0或10％)。此外，含有250ppb铝的样品在掺入部分降解的PS之前补充了0.05mM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。将小瓶用20mm聚四氟乙烯注射塞(D777-1，Daikyo)和铝质钳口盖密封，并在MaxQ^TM4000台式轨道摇床(Thermo Scientific^TM，Waltham，MA，USA)上在25℃均质化1小时。

用部分降解的PS20或PS80制备的样品导致FFA的浓度低于溶解度极限。将不同等级的未降解的聚山梨醇酯20和80用作阴性对照。所有样品均重复三次制备。

样品在5℃储存，并使用根据Ph.Eur 2.9.20的黑/白面板和如上所述的增强目视检查(Seidenader V 90-T仪器)通过目视检查评估颗粒的形成长达22天。

结果

使用具有不同底物特异性的不同酶将不同等级的PS20(SR、HP)和PS80(SR、HP、POA)部分降解10％。将PS储备溶液(0％或10％降解)掺入到不含(0ppb)或250ppb铝或250ppb铝和额外地50μM DTPA的水性缓冲溶液中。将小瓶在2℃-8℃孵育，并通过目视检查(E/P)和增强目视检查(Seidenader)监测可见颗粒的形成。如表10所示(通过E/P的可见颗粒)，在含有10％降解的PS20或PS80但不含铝的样品中，在研究过程中未观察到可见颗粒。在含有部分降解的PS20和铝的样品中形成了许多可见颗粒，与用于降解的酶无关，而对于含有部分降解的PS80和铝的样品，观察到的可见颗粒明显更少或没有。对于所有等级的PS，在螯合剂(DTPA)存在下均未观察到颗粒。有趣的是，含有250ppb铝的未降解的HP PS20和HPPS80对照形成可见颗粒，而所有其他对照均不含颗粒。这一观察结果可用以下事实来解释：与相应的SR等级相比，HP等级PS在原材料中含有显著更高水平的游离脂肪酸(Doshi等人，2020a)。尽管这些水平远低于FFA溶解度水平，但它们可能对FFA金属成核足够高。

表10：将PS储备溶液(降解水平为0％或10％)掺入到不含或250ppb铝(n＝3)的水性缓冲溶液(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5))中后可见颗粒形成(E/P)。含有250ppb铝的样品额外地与螯合剂(DTPA)一起配制。在2℃-8℃储存0至22天后，使用E/P框分析样品中可见颗粒的存在。每个容器(20mL)中颗粒的累计含量被分类为“许多颗粒(>7，xxx)”、“少量颗粒(5-7，xxx)”或“几乎不含颗粒(0–4，/)”。将含有非降解的PS无盐的样品用作阴性对照。结果报告为3个容器中的平均颗粒数。d＝检查日，CALB＝南极假丝酵母脂肪酶B，MML＝毛霉米黑脂肪酶，CAL＝南极假丝酵母脂肪酶，DTPA＝二乙烯三胺五乙酸。

表11示出了针对HP PS20、SR PS20、HP PS80、SR PS80和POA PS80的相应增强目视检查结果。在不存在铝的情况下包含部分降解的PS的对照保持不含或基本上不含颗粒，而含有部分降解的PS和铝的所有样品瞬间形成许多可见颗粒。在DTPA的存在下，颗粒的形成显着减轻，与PS的等级或用于降解的酶无关。同样，在包含未降解的HP PS20和HP PS80以及铝的样品中，形成了许多颗粒，而在其他未降解的对照(含铝)中观察到的颗粒较少或没有。

表11：将PS储备溶液(降解水平为0％或10％)掺入到不含或250ppb铝(n＝3)的水性缓冲溶液(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液(pH 5.5))中后可见颗粒形成(Seidenader)。含有250ppb铝的样品额外地与螯合剂(DTPA)一起配制。在2℃-8℃储存0至22天后，使用Seidenader仪器分析样品中可见颗粒的存在。每个容器中颗粒的累积含量被分类为“许多颗粒(>10，xxx)”、“少量颗粒(6-10，xx)”、“基本上不含颗粒(1-5，x)”或“不含颗粒(0，/)”。将含有非降解的PS或无盐的样品用作阴性对照。d＝检查日，CALB＝南极假丝酵母脂肪酶B，MML＝毛霉米黑脂肪酶，CAL＝南极假丝酵母脂肪酶，DTPA＝二乙烯三胺五乙酸

实例7：筛选金属盐和螯合剂

方法

通过动态光散射(DLS)进行FFA颗粒成核

DLS实验在DynaPro(R)读板器(Wyatt，Santa Barbara，CA)上进行。在开始测量前5小时，将DLS读板器用氮气冲洗，并在整个测量期间冷却至5℃。200μL样品溶液，其包含在20mM L-组氨酸缓冲液(pH 6.0)中的20μg月桂酸(LA)，补充以6％v/v DMSO，以及不同数量的金属离子(Al³⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺)，在黑色玻璃底96孔板(Greiner Bio-OneGmbH，Frickenhausen，Germany)的比色皿中混合。使用633nm激光和158°处的反向散射检测系统在40至70小时内测量FFA成核和颗粒生长。通过将累积量拟合拟合到获得的自相关函数来测定流体动力学颗粒半径(rH)。累积量拟合的下边界和上边界分别设置为10μs和1000μs的滞后时间τ。在每个测量序列之前调整激光功率并在整个测量过程中保持恒定。为了收集最大量的散射光，所有测量的衰减水平都设置为零。

铝(Al)浓度对颗粒动力学的影响

20mM组氨酸缓冲液(pH 6.0)中的Al样品溶液(100x)由无菌50ppm Al储备溶液(20mM甘氨酸(pH 2.5))制备，并以0ppb、20ppb、40ppb、60ppb和100ppb铝的目标浓度掺入到DLS测定缓冲液中。如上所述，在40小时内测量颗粒成核和生长。

通过将S形玻尔兹曼函数拟合到生长曲线来分析FFA颗粒的散射激光强度随时间的变化进行定量分析。

其中A表示初始值，且B表示最终值x₀，为S形曲线的中心或拐点，且dx为时间常数。

二价阳离子和三价阳离子与月桂酸的相互作用

在Milli-Q水(pH 2.5)中制备4mM铝(Al)、铁(Fe)、锌(Zn)、镁(Mg)、钙(Ca)和镍(Ni)储备溶液(由它们各自的盐)，并储存在2℃-8℃直至使用。在Milli-Q水(pH 2.5)中新鲜制备稀释的样品溶液(100x)。将DLS测定缓冲液添加到盐样品溶液中，以达到0、1、3、10和30μM的金属离子目标浓度。如上所述，在70小时内测量粒度(rH)和强度。

螯合剂存在下的FFA金属成核

二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,3-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸(PDTA)和N,N-双(羧甲基)-L-谷氨酸四钠(GLDA)储备溶液在20mM组氨酸缓冲液(pH5.5)中制备，并在DLS测定缓冲液中稀释至所需浓度。对于Al成核研究，使用2μM的金属离子目标浓度。DTPA、EDTA、GLDA和PDTA的最终浓度为0、0.5、1.0、1.5、2和20μM，导致螯合剂与Al的摩尔比分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0和10。对于Fe成核研究，Fe的目标浓度为4μM。DTPA的最终浓度为0、0.04、0.4、2.0、4.0或40μM，导致摩尔比(DTPA:Fe)分别为0、0.01、0.1、0.5、1.0和10。如上所述，DLS测量在5℃进行了50小时。

DTPA防止FFA金属在存在真正的玻璃可浸出物时成核

根据Allmendinger等人公开的过程制备代表性的玻璃可浸出溶液(Allmendinger等人2021)。简而言之，将6mL的甘氨酸溶液(pH 10)装入用D777-1血清塞(DAIKYO SeikoLtd.，Tokyo，Japan)加塞并经过一个高压灭菌循环(121℃，20分钟)的6mL

小瓶(Schott AG，Müllheim，Germany和Schott North America Inc.，NY，USA)中。稀释后样品中的玻璃可浸出物含量为37ppb Al、43ppb B、430ppb Si、0ppb Na、K Ca，对应于1.4μMAl、4.0μM B和15.3μM Si。DTPA的浓度为0、0.04、0.4、2.0、4.0或40μM，导致摩尔比(DTPA:Al)为0、0.03、0.3、1.5、2.9和29或0。分别为0.002、0.02、0.1、0.2和1.9(DTPA比玻璃可浸出物)。如上所述，DLS测量在5℃进行了50小时。

结果

金属阳离子与月桂酸的相互作用

为了评估在DP制造或储存过程中可能引入的其他二价和三价金属杂质的风险，建立了基于DLS的替代测定。DLS可用于捕获在0.3nm至10μm尺寸范围内形成和生长的颗粒(Panchal等人，2014)，因此适用于检测早期成核事件(FFA-金属相互作用)。由于蛋白质和聚山梨醇酯胶束会干扰测定，因此在含有月桂酸(低于溶解度极限)和DMSO(6％v/v)(以增加LA溶解度)的水溶液中进行测量，月桂酸是水解PS20的主要降解产物。在第一个实验中，使用不同的Al浓度来触发FFA络合和随后的颗粒形成。如图1所示，在所有含有Al的配制物中都形成了纳米颗粒，而在没有Al或FFA的对照中没有观察到颗粒(数据未显示)。含铝样品的粒度随着时间的推移而增加，因此尺寸等级随着铝浓度的增高而增加。

如图2B所示，含铝样品的散射强度最初高于不含铝的对照样品(5000kCnt/s)。对于具有40ppb Al的样品，随着时间的推移观察到强度略有增加，而具有60ppb-100ppb Al的样品示出强度急剧增加，可以拟合S形曲线以确定拐点(图2B)。由于强度范围和因此S形拟合的斜率对于含有高Al水平的样品显著增加，因此无法使用t_onset来评估颗粒生长动力学(数据未显示)。相反，使用S形曲线的拐点，因为它与强度范围无关。

如图2B所示，S形曲线拟合的拐点随着Al浓度的增加呈指数衰减，表明络合作用和颗粒生长的事件可以随着痕量Al(40ppb-60ppb)的增加而显著加速，而Al的进一步增加(超过80ppb)不会导致拐点进一步移动。这些结果表明，尽管在较高Al浓度的情况下会形成较大的颗粒，但在80ppb浓度以上时，颗粒生长动力学不会受到影响。对于非常低的浓度(20ppb)，拐点计算为大约65小时，因此在本实验中未捕获。

在第二项研究中，筛选了不同的二价阳离子(Ca、Mg、Zn、Ni)和三价(Al、Fe)阳离子，以确定它们与月桂酸相互作用并形成FFA盐颗粒的倾向。为了更好地比较，使用了等摩尔量的从0μM至30μM金属离子。表12提供了相应ppb浓度的转换。

表12：金属离子浓度的换算。

在70小时内评估了粒度(r_H)和强度相对于金属阳离子类型和浓度的变化。如图3所示，仅观察到针对三价金属离子(Fe、Al)的颗粒的形成和生长，而二价阳离子(Ca、Mg、Ni、Zn)的存在不会导致FFA盐颗粒的形成或生长。有趣的是，Al和Fe的表现完全不同。虽然增加Al浓度(0-10μM)会导致更大颗粒的形成和更快的颗粒生长，但添加等量的Fe会导致立即形成颗粒(r_H为50nm至60nm)但不会随着时间的推移进一步增加粒度。然而，散射强度随着Al和Fe含量的增加而增加，这表明尽管FFA-Fe颗粒不随时间生长，但颗粒的数量仍在增加。

对于这两种三价阳离子，最高浓度(30μM)会导致非常大的颗粒的形成。由于粒度接近DLS的检测上限，因此无法观察到粒度进一步增加。此外，这些大颗粒似乎随着时间的推移而沉淀，如散射强度的逐渐降低所示(图3B)。

基于这些结果，可以得出结论，在所研究的浓度范围内，二价阳离子的存在对FFA盐颗粒形成的风险较低，而三价阳离子，如Al³⁺和Fe³⁺，即使在非常低的浓度也可以与带负电的FFA相互作用。

螯合剂对FFA金属成核的保护作用

为了评估螯合剂的保护作用，将DTPA、EDTA、GLDA和PDTA掺入到含有不同浓度的月桂酸和4uM Al的溶液中，浓度范围为从0μM至40μM，对应的摩尔比(螯合剂比Al)为0-10。

如图4和图5所示，螯合剂浓度的增加导致散射强度和粒度的总体下降，以及随着时间的推移颗粒生长速度减慢。在至少1:1(螯合剂比Al)的摩尔比下，所有螯合剂的颗粒形成和生长都得到有效抑制。螯合剂之间效率的细微差异可归因于化学结构。EDTA、GLDA和PDTA是四乙酸，可以作为六齿螯合剂络合多价离子，而DTPA是具有八个配位键形成位点(五个羧酸氧原子和三个氮原子)的喷替酸。当降低pH值时，羧酸盐供体基团变得越来越质子化(Eivazihollagh等人2017)，导致螯合剂种类较少，因此金属络合较弱。由于DTPA比EDTA、GLDA和PDTA具有更多的供体原子，因此它可以在微酸性pH值有效地络合多价阳离子。

DTPA的保护作用也在月桂酸和4μM Fe的存在下进行了评估(图6)。在DLS测定中，与Al相比，FFA金属与Fe的成核导致立即形成纳米颗粒，但随着时间的推移没有显著的颗粒生长。添加等摩尔量的DTPA导致完全抑制颗粒的形成和生长，与Al类似。在DTPA与Fe的比率为0.5时，散射强度显著降低，但颗粒半径仅略有变化，这表明主要是颗粒数量减少。

将DTPA添加到包含月桂酸和从Exp51硼硅酸盐玻璃小瓶中提取的真实玻璃可浸出物的样品中，在螯合剂与Al的摩尔比至少为1.5的情况下也能有效地减少颗粒形成(图7)。

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Claims

1.一种稳定的水性组合物，其包含蛋白质和药用赋形剂，所述药用赋形剂为诸如例如缓冲剂、包括抗氧化剂的稳定剂，且进一步包含至少一种螯合剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述螯合剂选自以下项的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二醇-双(β-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、N-羧甲基-N'-(2-羟乙基)-N,N'-亚乙基二甘氨酸(HEDTA)、乙二胺-N,N'-双(2-二羟基苯乙酸)(EDDHA)、1,3-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸(PDTA)、N,N-双(羧甲基)-L-谷氨酸四钠(GLDA)、柠檬酸、丙二酸、酒石酸、抗坏血酸、水杨酸、天冬氨酸、谷氨酸。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂以从0.0005％(w/v)至2.0％(w/v)的浓度存在。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质为抗体或单克隆抗体。

6.螯合剂用于制备药物，特别是用于制备稳定的胃肠外蛋白质或稳定的胃肠外抗体制剂的用途。

7.螯合剂用于制备胃肠外蛋白质或抗体制剂的用途，其特征在于所述胃肠外蛋白质或抗体制剂在其许可的保质期的整个时间内保持不含可见颗粒。

8.螯合剂用以防止胃肠外蛋白质或抗体制剂中形成可见颗粒的用途。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的螯合剂的用途，其中所述螯合剂选自以下项：乙二醇-双(β-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、N-羧甲基-N'-(2-羟乙基)-N,N'-亚乙基二甘氨酸(HEDTA)、乙二胺-N,N'-双(2-二羟基苯乙酸)(EDDHA)、1,3-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸(PDTA)、N,N-双(羧甲基)-L-谷氨酸四钠(GLDA)、柠檬酸、丙二酸、酒石酸、抗坏血酸、水杨酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA或喷替酸)，并以从0.0005％至2.0％范围内的浓度存在。

10.根据权利要求9所述的螯合剂的用途，其中所述螯合剂为EDTA或DTPA。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的螯合剂的用途，其中所述可见颗粒包含至少一种多价阳离子和从存在于胃肠外蛋白质制剂中的表面活性剂诸如例如PS20和PS80裂解的游离脂肪酸。

12.一种药物剂型，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的制剂，或使用根据权利要求6至11中任一项所述的螯合剂获得的制剂，其在容器中。

13.基本上如本文所述的新型组合物、方法和用途。