CN116113642A - 多特异性抗体、包含其的组合物、及其载体和用途 - Google Patents

多特异性抗体、包含其的组合物、及其载体和用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供了具有增加的体内持续性的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含一个或多个生物活性效应部分，所述生物活性效应部分与结合人血清白蛋白的抗原结合片段Fab的N‑末端和C‑末端之一或两者连接。

Description

多特异性抗体、包含其的组合物、及其载体和用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月24日提交的韩国申请号10-2020-0009565和2020年5月19日提交的美国申请号16/878,255的优先权，每篇的公开内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年1月19日，名称为2662-0001WO01_Sequence Listing_ST25.txt，大小为68KB。
技术领域
本公开涉及包含抗原结合片段和生物活性效应部分的融合构建体。更具体地，本公开涉及多特异性抗体，其包含两个或更多个生物活性效应部分，所述生物活性效应部分与结合人血清白蛋白的抗原结合片段的N-末端和C-末端之一或两者连接。
背景技术
CD40-CD40L相互作用主要作用于产生抗原特异性抗体免疫反应，而自身抗体参与各种自身免疫疾病的发病机制。为了有效治疗这些疾病，已经研究了多种能够抑制和/或遏制CD40-CD40L相互作用的CD40L-或CD40-特异性抗体。例如，抗CD40L单克隆抗体hu5c8IgG1(BG-9588，鲁普利单抗(ruplizumab)，AntovaTM，Biogen，Cambridge，Massachusetts)和IDEC-131(E6040，IDEC Pharmaceuticals，San Diego，California)已被研究用于治疗各种自身免疫疾病，包括例如系统性红斑狼疮(SLE)和特发性血小板减少性紫癜(ITP)，但由于血栓栓塞等副作用的发生，此类抗体的进一步开发已停止。因此，许多研究小组已经尝试通过Fc工程化解决血栓栓塞副作用的问题的方法，并且已经有一些报道，包括例如PEG化的抗CD40L Fab，CDP7657(达匹罗珠单抗(Dapirolizumab)pegol，Biogen)和设计与CD40L连接的TN3-HSA融合蛋白，VIB4920(VIELABIO，Gaithersburg，MD)。在这方面，其他研究小组正在开发作为靶向CD40而非CD40L的治疗剂，具有减弱的Fc功能的BI655064抗体(BoehringerIngelheim，Germany)、人IgG4型的bleselumab抗体(Kyowa Kirin PharmaceuticalDevelopment，La Jolla，CA)等等。
发明内容
本公开提供了具有延长的体内保留时间的多特异性抗体。本公开还提供了包含所述多特异性抗体的药物组合物。本公开还提供了产生所述多特异性抗体的方法。
例如，本文公开了用于抑制CD40-CD40L信号同时消除抗CD40L抗体的基于Fc的血栓栓塞副作用的新型自身免疫疾病治疗剂。为此，开发了由(抗CD40L scFv)2-(抗HSAFab)-(抗TNF-α Fv)表示的重组双特异性抗体，通过将由hu5c8(一种与CD40L结合的鲁普利单抗抗体)的可变区基因VH和VL组成的单链可变片段(scFv)连接到SL335 Fab的N-末端，能够在没有Fc区的情况下维持血清持续性。此外，本文公开了由(抗CD40L scFv)2-(抗HSAFab)-(抗TNF-α Fv)表示的多特异性抗体，通过使用肽接头将含有与TNF-α结合的赛妥珠单抗(certolizumab pegol)抗体的可变区基因的Fv或dsFv连接到双特异性抗体的SL335 Fab的C-末端，并鉴定产生的抗体蛋白的功能和特征。
本文公开了包含以下结构式的多特异性抗体：
Figure GDA0004041419740000021
其中抗原结合片段(Fab)是血清白蛋白Fab；
其中R1和R2是与Fab的N-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中R3和R4是与Fab的C-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中m是0或1或更大的整数；和
其中n是0或1或更大的整数。在一些实施方案中，R1和R2是相同或不同的单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，R3和R4是相同或不同的Fv片段或二硫化物稳定的Fv(dsFv)片段。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、和R4中的每个可以通过一个或多个接头连接到Fab。每个接头可包含1至20个氨基酸。每个接头可包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的氨基酸序列。每个接头可包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含重链可变结构域，其包含
(a)包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含WINTYSGGTKYAQKFQG(SEQ ID NO：62)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列的重链CDR3；
(b)包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含RINTYNGNTGYAQRLQG(SEQ ID NO：64)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列的重链CDR3；
(c)包含NYGIH(SEQ ID NO：65)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：66)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含DVHYYGSGSYYNAFDI(SEQ ID NO：67)的氨基酸序列的重链CDR3；
(d)包含SYAMS(SEQ ID NO：68)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含VISHDGGFQYYADSVKG(SEQ ID NO：69)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含AGWLRQYGMDV(SEQID NO：70)的氨基酸序列的重链CDR3；
(e)包含AYWIA(SEQ ID NO：71)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含MIWPPDADARYSPSFQG(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含LYSGSYSP(SEQ IDNO：73)的氨基酸序列的重链CDR3；或者
(f)包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO：76)的氨基酸序列的重链CDR3。
在一些实施方案中，Fab包含轻链可变结构域，其包含
(g)包含RASQSISRYLN(SEQ ID NO：77)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASRLES(SEQ ID NO：78)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQSDSVPVT(SEQ IDNO：79)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(h)包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO：80)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含AASSLQS(SEQ ID NO：81)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQSYSTPPYT(SEQID NO：82)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(i)包含RASQSIFNYVA(SEQ ID NO：83)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含DASNRAT(SEQ ID NO：84)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQRSKWPPTWT(SEQID NO：85)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(j)包含RASETVSSRQLA(SEQ ID NO：86)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYGSSPRT(SEQ IDNO：88)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(k)包含RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO：89)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QKYSSYPLT(SEQ IDNO：90)的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
(l)包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQID NO：93)的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，Fab包含
包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO：76)的氨基酸序列的重链CDR3，和
包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO：93)的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，Fab包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含与SEQ IDNO：94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与SEQ IDNO：100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含重链结构域和轻链结构域，所述重链结构域包含SEQID NO：45的氨基酸序列(VH-CH1结构域)，所述轻链结构域包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列(VL-CL结构域)。
在一些实施方案中，R1和R2中的每个是抗CD40L hu5c8 scFv。R1和R2中的每个可以是抗CD40L hu5c8 scFv，其包含与SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48具有至少80％同一性的氨基酸序列。R1和R2中的每个可以是抗CD40L hu5c8 scFv，其包含SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48的氨基酸序列。
在一些实施方案中，R3和R4中的每个是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-α Fv、抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)、抗IL-23Fv、抗IL-23dsFv、抗IFNAR1和/或抗IFNAR1 dsFv。R3和R4中的每个可以是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-α Fv，其包含与SEQ ID NO：49具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：50具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含与SEQ ID NO：51具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：52具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23Fv，其包含与SEQ ID NO：53具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：54具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23dsFv，其包含与SEQ ID NO：55具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：56具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗IFNAR1，其包含与SEQ IDNO：57具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：58具有80％同一性的轻链氨基酸序列；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含与SEQ ID NO：59具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：60具有80％同一性的轻链氨基酸序列。R3和R4中的每个可以是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-α Fv，其包含SEQ ID NO：49的重链和SEQ ID NO：50的轻链；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含SEQ ID NO：51的重链和SEQ ID NO：52的轻链；抗IL-23Fv，其包含SEQ ID NO：53的重链和SEQ ID NO：54的轻链；抗IL-23dsFv，其包含SEQ IDNO：55的重链和SEQ ID NO：56的轻链；抗IFNAR1，其包含SEQ ID NO：57的重链和SEQ ID NO：58的轻链；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含SEQ ID NO：59的重链和SEQ ID NO：60的轻链。
本文公开了组合物，其包含本文公开的多特异性抗体和赋形剂。本文还公开了药物组合物，其包含本文公开的多特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。
本文还公开了在有需要的受试者中治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的药物组合物。
本文进一步公开了表达载体，其包含：
(a)启动子，
(b)第一核酸分子，其编码与血清白蛋白结合的抗原结合片段(Fab)，和
(c)第二核酸分子，其编码生物活性效应部分和接头，
其中启动子、第一核酸序列和第二核酸分子可操作地连接。第二核酸分子可以编码2个或更多个生物活性效应部分和接头。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：
(a)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含WINTYSGGTKYAQKFQG(SEQ ID NO：62)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列；
(b)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含RINTYNGNTGYAQRLQG(SEQ ID NO：64)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列；
(c)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含NYGIH(SEQ ID NO：65)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：66)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含DVHYYGSGSYYNAFDI(SEQ ID NO：67)的氨基酸序列；
(d)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYAMS(SEQ ID NO：68)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含VISHDGGFQYYADSVKG(SEQ ID NO：69)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含AGWLRQYGMDV(SEQ ID NO：70)的氨基酸序列；
(e)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYWIA(SEQ ID NO：71)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含MIWPPDADARYSPSFQG(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LYSGSYSP(SEQ ID NO：73)的氨基酸序列；或者
(f)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含ETVMAGKALDY(SEQ ID NO：76)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：
(g)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISRYLN(SEQ ID NO：77)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASRLES(SEQ ID NO：78)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSDSVPVT(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列；
(h)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO：80)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO：81)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSYSTPPYT(SEQ ID NO：82)的氨基酸序列；
(i)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSIFNYVA(SEQ ID NO：83)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含DASNRAT(SEQ ID NO：84)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQRSKWPPTWT(SEQ ID NO：85)的氨基酸序列；
(j)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASETVSSRQLA(SEQ ID NO：86)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYGSSPRT(SEQ ID NO：88)的氨基酸序列；
(k)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO：89)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QKYSSYPLT(SEQ ID NO：90)的氨基酸序列；或者
(l)轻链互补决定结构域I(CDR1)，其包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO：93)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含
包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO：76)的氨基酸序列的重链CDR3，和
包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO：93)的氨基酸序列的轻链CDR3。
在其他实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链结构域和轻链结构域，所述重链结构域包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列(VH-CH1结构域)，所述轻链结构域包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列(VL-CL结构域)。
在一些实施方案中，生物活性效应部分是抗TNF-α Fv、抗TNF-αdsFv、抗IL-23Fv、抗IL-23dsFv、抗IFNAR1 Fv和/或抗IFNAR1 dsFv。第二核酸分子可以包含编码SEQ ID NO：49-60中的一个或多个的氨基酸序列的核苷酸序列。
本公开提供了包含表达载体的宿主细胞，例如动物细胞，例如CHO细胞系。
附图说明
本公开的某些实施方案的上述和其他方面、特征和优点将从以下描述结合附图变得更加明显，其中：
图1A和1B代表APB-A1的载体图和氨基酸序列。
图2A和2B代表APB-A1的HPLC分析和SDS-PAGE结果。
图3表示APB-A1的质量分析结果。
图4A和4B表示APB-A1的PI值。
图5表示APB-A1的电荷量的变化。
图6表示rhCD40L-APB-A1-HSA的同时结合。
图7表示流式细胞术分析的结果。
图8A至8D表示APB-A1的体外分析结果。
图9A至9D表示各种IC对血小板聚集的影响。
图10表示各种IC对血清素水平的影响。
图11表示使用食蟹猴测量的APB-A1浓度的PK值。
图12A和12B表示使用食蟹猴的药代动力学分析结果。
图13A至13C表示基于SAFA的双特异性抗体和哺乳动物表达载体。
图14表示APB-B1重链和轻链的氨基酸序列。
图15A至15D表示通过CaptureSelect IgG-CH1亲和色谱法纯化的双特异性抗体构建体。
图16A和16B表示APB-B1构建体，通过两步色谱法纯化。
图17表示在各种pH和缓冲条件下的热稳定性偏移测定法。
图18A至18C表示通过ELISA测定的与亲本抗体相比，三种不同抗原的APB-B1构建体结合特异性的测定结果。
图19表示通过生物层干涉法分析的，APB-B1a同时结合三种不同抗原的结果。
图20表示通过流式细胞术鉴定的，基于SAFA的构建体与D1.1细胞上的细胞膜的结合
图21表示在L929小鼠细胞中鉴定的基于SAFA的双特异性抗体对TNF-α介导的细胞毒性的抑制。
图22A至22C表示在HEK-blueTM报告细胞中鉴定的，APB-B1抑制CD40L-CD40相互作用和TNFα-TNFαR相互作用之一或两者的能力的测定。
图23，猴PK数据。使用PK ELISA测量血浆中APB-A1的浓度。数据代表进行的实验的平均值。
图24A和24B，免疫表型分型(分裂的B细胞)。在外周血的免疫表型分型中，注意到在第1天(图24A)和第11天(图24B)，与对照组相比，30、10和/或3mg/kg组中的分裂的B细胞减少。
图25，血清中抗KLH IgG的滴度。在抗KLH抗体测量中，注意到与对照组相比，10和30mg/kg组在第8天至第29天的IgG抗体滴度降低(＊P＜0.05，＊＊P＜0.01：显著不同于对照)。
图26，腋窝淋巴结Ki67阳性细胞(免疫组织化学检查)。在组织病理学和免疫组织化学检查中，观察到在第29天，在10和/或30mg/kg组中腋窝淋巴结生发中心的抗Ki67阳性细胞减少。
图27，PD研究中血清中的APB-A1浓度。在PK中，在第一次和第二次给药中，Cmax和AUC0-t值在3和30mg/kg组之间几乎与剂量成比例地增加。
具体实施方式
现在将详细参考实施方案，在附图中示出了其示例，其中相同的附图标记通篇指代相同的元件。在这点上，本发明的实施方案可以具有不同的形式并且不应被解释为限于本文所阐述的描述。因此，以下仅通过参考附图描述实施方案，以解释本说明书的各方面。如本文所用，术语″和/或″包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。如″至少一个″的表述在元件列表之前时，修饰整个元件列表，而不修饰列表中的单个元件。
本文提供了多特异性抗体，其包含以下结构式：
Figure GDA0004041419740000121
其中抗原结合片段(Fab)是血清白蛋白Fab；
其中R1和R2是与Fab的N-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中R3和R4是与Fab的C-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中m是0或1或更大的整数；和
其中n是0或1或更大的整数。
还提供了编码此类抗体的分离的核酸(多核苷酸)，例如互补DNA(cDNA)。进一步提供了载体(例如，表达载体)和细胞(例如，宿主细胞)，其包含编码此类抗体的核酸(多核苷酸)。还提供了制备此类抗体的方法。在其他方面，本文提供了用于诱导、增加或增强多特异性活性以及治疗某些病症(例如自身免疫疾病)的方法和用途。还提供了相关组合物(例如，药物组合物)、试剂盒和检测方法。
术语
如本文所用，术语″约″和″大约″当用于修饰数值或数值范围时，表示高于该值或范围5％至10％和低于该值或范围5％至10％的偏差保留在所引用值或范围的预期含义内。
如本文所用，术语″抗体″和″抗体″是本领域术语并且可以在本文中互换使用，指具有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。
抗体可以包括，例如，单克隆抗体、重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、重新表面化的抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体(intrabodies)、异源缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体，affybodies、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(anti-Id)抗体(包括，例如，抗-抗-Id抗体)、双特异性抗体和多特异性抗体。
如本文所用，术语″多特异性抗体″是本领域术语并且可用于指具有多于一个生物活性效应部分或抗原结合位点的分子，其中每个抗原结合位点特异性结合抗原。本文公开的多特异性抗体可具有2、3、4、5、6、7、8或更多个与其连接的生物活性效应部分。
抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)。在某些实施方案中，本文所述的抗体是IgG抗体，或其类别(例如，人IgG1、IgG2、或IgG4)或亚类。在一些实施方案中，抗体是人源化单克隆抗体。在其他实施方案中，抗体是人单克隆抗体，例如，是一种免疫球蛋白。
如本文所用，术语″生物效应部分″、″抗原结合结构域″、″抗原结合区″、″抗原结合位点″和类似术语是指包含氨基酸残基的多特异性抗体分子的部分，其赋予抗体分子对抗原的特异性(例如，互补决定区(CDR))。抗原结合区可以来源于任何动物物种，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人。
如本文所用，术语″可变区″或″可变结构域″可互换使用并且在本领域中是常用的。可变区通常是指抗体的一部分，通常是轻链或重链的一部分，通常在成熟重链的氨基末端约110至120个氨基酸和在成熟轻链中约90至115个氨基酸，其在抗体之间的序列差异很大，用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在称为互补决定区(CDR)的区域中，而可变结构域中较高度保守的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区是人可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿类或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定实施方案中，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿类或鼠CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语″VL″和″VL结构域″可互换使用，指抗体的轻链可变区。
术语″VH″和″VH结构域″可互换使用，指抗体的重链可变区。
术语″Kabat编号″和类似术语在本领域中是公认的，并且是指对抗体或其抗原结合部分中的重链和轻链可变区的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，抗体的CDR可以根据Kabat编号系统确定(参见，例如，Kabat EA&Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190：382-391和Kabat EA等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH出版号91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置第31至35位，其可选地可包括第35位之后的一个或两个额外的氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B)(CDR1)；氨基酸位置第50至65位(CDR2)和氨基酸位置第95至102位(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置第24至34位(CDR1)、氨基酸位置第50至56位(CDR2)和氨基酸位置第89至97位(CDR3)。在一些实施方案中，本文所述抗体的CDR已根据Kabat编号方案确定。
如本文所用，术语″恒定区″或″恒定结构域″是可互换的并且具有其在本领域中常用的含义。恒定区是抗体部分，例如，是轻链和/或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但可以表现出各种效应功能，例如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。
如本文所用，当用于提及抗体时，术语″重链″可以指任何不同的类型，例如，基于恒定结构域的氨基酸序列，alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)，其分别产生抗体的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别，包括IgG的亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。
如本文所用，术语″轻链″在用于提及抗体时可以指任何不同的类型，例如，基于恒定结构域氨基酸序列的kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体实施方案中，轻链是人轻链。
″结合亲和力″通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，″结合亲和力″是指反映结合对成员(例如，抗体和抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。可以以本领域已知的多种方式测量和/或表示亲和力，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡结合常数(KA)。KD由koff/kon的商计算得出，而KA由kon/koff的商计算得出。kon指例如抗体与抗原的结合速率常数，而koff指例如抗体与抗原的解离。可以通过本领域普通技术人员已知的技术来确定kon和koff，例如
Figure GDA0004041419740000151
或KinExA。
如本文所用，″保守氨基酸取代″是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在某些实施方案中，抗体的CDR或框架区内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似侧链的氨基酸残基取代。
如本文所用，″表位″是本领域中的术语并且是指抗体可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可以例如一起来自一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域(构象、非线性、不连续或不连续的表位)。在某些实施方案中，抗体结合的表位可以通过以下方式确定，例如，NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定法、氢/氘交换与质谱联用(例如液相色谱电喷雾质谱)、基于阵列的寡肽扫描测定法和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)。对于X射线晶体学，可以使用本领域已知的任何方法完成结晶(例如，Giegé R等人，(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur JBiochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。抗体：抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术进行研究，并且可以使用计算机软件精确确定，如X-PLOR(耶鲁大学，1992，由Molecular Simulations，Inc.发布；参见，例如Meth Enzymol(1985)volumes 114&115，Wyckoff HW等人编辑；U.S.2004/0014194)，和BUSTER(BricogneG(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423，Carter CW编辑；Roversi P等人，(2000)Acta CrystallogrD Biol Crystallogr 56(Pt 10)：1316-1323)。可以使用本领域技术人员已知的任何方法完成诱变作图研究。参见，例如，Champe M等人，(1995)J Biol Chem 270：1388-1394和Cunningham BC&Wells JA(1989)Science 244：1081-1085描述了诱变技术，包括丙氨酸扫描诱变技术。在一些实施方案中，使用丙氨酸扫描诱变研究确定抗体的表位。
如本文所用，术语″免疫特异性结合″、″免疫特异性识别″、″特异性结合″和″特异性识别″在抗体的上下文中是类似的术语，并且是指与抗原结合的分子(例如，抗原结合位点的表位、免疫复合物或结合配偶体)，因为这样的结合是本领域技术人员所理解的。例如，与抗原特异性结合的分子通常可以以较低的亲和力与其他肽或多肽结合，如通过以下方法所确定的，例如，免疫测定法、
Figure GDA0004041419740000161
KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments，Boise，ID)，或本领域已知的其他测定法。在一些实施方案中，免疫特异性结合抗原的分子以KA结合抗原，该KA是所述分子与另一抗原结合时的KA的至少2个对数、2.5个对数、3个对数、4个对数或更大。
在其他实施方案中，与抗原免疫特异性结合的分子在相似的结合条件下不与其他蛋白质发生交叉反应。在一些实施方案中，与抗原免疫特异性结合的分子不与其他蛋白质发生交叉反应。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其结合特定抗原的亲和力高于结合另一种不相关抗原的亲和力。在某些实施方案中，本文提供了一种结合特定抗原(例如，人血清白蛋白)的多特异性抗体，如通过例如放射免疫测定法、表面等离子共振或动力学排除测定法所测量的，所述多特异性抗体与特定抗原的亲和力比与另一不相关抗原的亲和力高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体与不相关蛋白质的结合程度小于所述抗体与特定抗原的结合的10％、15％或20％，如通过例如放射免疫测定法所测量的。
在一些实施方案中，本文提供了多特异性抗体，其与人抗原结合的亲和力高于与另一物种的所述抗原的亲和力。在某些实施方案中，本文提供了结合人抗原的多特异性抗体，如通过例如放射免疫测定法、表面等离子共振或动力学排除测定法所测量的，所述多特异性抗体与人抗原的亲和力比与另一物种的亲和力高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更高。在一些实施方案中，本文所述的与人抗原结合的多特异性抗体与另一物种的抗原蛋白的结合小于所述抗体与人抗原蛋白的结合的10％、15％或20％，如例如通过放射免疫测定法、表面等离子共振或动力学排除测定法所测量的。
如本文所用，术语″宿主细胞″可以是任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在实施方案中，术语″宿主细胞″是指用核酸分子转染的细胞和这种细胞的后代或潜在后代。这种细胞的后代与用核酸分子转染的亲代细胞可以不同，例如，由于在后代中可能发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
如本文所用，在向受试者施用疗法的上下文中，术语″有效量″是指实现期望的预防或治疗效果的疗法的量。
如本文所用，术语″受试者″和″患者″可互换使用。受试者可以是动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴或人)、或人。在一些实施方案中，受试者是食蟹猴。在某些实施方案中，此类术语是指非人动物(例如，非人动物，如猪、马、牛、猫或狗)。在一些实施方案中，此类术语是指宠物或农场动物。在特定实施方案中，这些术语是指人。
多特异性抗体
本文公开了包含以下结构式的多特异性抗体：
Figure GDA0004041419740000171
其中抗原结合片段(Fab)是血清白蛋白Fab；
其中R1和R2是与Fab的N-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中R3和R4是与Fab的C-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中m是0或1、2、3或更大的整数；和
其中n是0或1、2、3或更大的整数。
在一些实施方案中，R1和R2是相同或不同的单链可变片段(scFv)、或相同或不同的Fv片段、或二硫化物稳定的Fv(dsFv)片段。在一些实施方案中，R3和R4是相同或不同的scFv或Fv片段或dsFv片段。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、和R4中的每个可以通过一个或多个接头连接到Fab。每个接头可以包含但不限于1至20个氨基酸或其中的任何长度或范围，例如2、3、4等。每个接头可以包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的氨基酸序列。每个接头可包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含重链可变结构域，其包含
(a)包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含WINTYSGGTKYAQKFQG(SEQ ID NO：62)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列的重链CDR3；
(b)包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含RINTYNGNTGYAQRLQG(SEQ ID NO：64)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列的重链CDR3；
(c)包含NYGIH(SEQ ID NO：65)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：66)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含DVHYYGSGSYYNAFDI(SEQ ID NO：67)的氨基酸序列的重链CDR3；
(d)包含SYAMS(SEQ ID NO：68)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含VISHDGGFQYYADSVKG(SEQ ID NO：69)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含AGWLRQYGMDV(SEQID NO：70)的氨基酸序列的重链CDR3；
(e)包含AYWIA(SEQ ID NO：71)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含MIWPPDADARYSPSFQG(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含LYSGSYSP(SEQ IDNO：73)的氨基酸序列的重链CDR3；或者
(f)包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO：76)的氨基酸序列的重链CDR3。
在一些实施方案中，Fab包含轻链可变结构域，其包含
(g)包含RASQSISRYLN(SEQ ID NO：77)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASRLES(SEQ ID NO：78)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQSDSVPVT(SEQ IDNO：79)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(h)包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO：80)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含AASSLQS(SEQ ID NO：81)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQSYSTPPYT(SEQID NO：82)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(i)包含RASQSIFNYVA(SEQ ID NO：83)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域I(CDR1)、包含DASNRAT(SEQ ID NO：84)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQRSKWPPTWT(SEQID NO：85)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(j)包含RASETVSSRQLA(SEQ ID NO：86)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYGSSPRT(SEQ IDNO：88)的氨基酸序列的轻链CDR3；
(k)包含RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO：89)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QKYSSYPLT(SEQ IDNO：90)的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
(l)包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQID NO：93)的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，Fab包含
包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO：76)的氨基酸序列的重链CDR3，和
包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO：93)的氨基酸序列的轻链CDR3，或以上公开的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的任意组合。
在一些实施方案中，Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ IDNO：94、95、96、97、98或99具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ IDNO：100、101、102、103、104或105具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含重链可变结构域和轻链可变结构域、或本文公开的重链可变结构域和轻链可变结构域的任意组合；所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：94、95、96、97、98或99具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQIDNo：100、101、102、103、104或105具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。例如，Fab可包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：99具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID No：105具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：45(VH-CH1结构域)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID No：46(VL-CL结构域)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4中的每个可以是生物活性效应部分，例如抗CD40L hu5c8 scFv。例如，R1、R2、R3和R4中的每个可以是抗CD40L hu5c8 scFv，其包含与SEQID NO：47或SEQ ID NO：48具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。R1、R2、R3和R4中的每个可以是抗CD40L hu5c8 scFv，其包含SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48的氨基酸序列。
在一些实施方案中，R1和R2中的每个可以是生物活性效应部分，例如抗CD40Lhu5c8 scFv。例如，R1和R2中的每个可以是抗CD40L hu5c8scFv，其包含与SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。R1和R2中的每个可以是抗CD40Lhu5c8scFv，其包含SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48的氨基酸序列。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4中的每个是一种或多种生物活性效应部分，包括，例如，抗TNF-α Fv、抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)、抗IL-23Fv、抗IL-23dsFv、抗IFNAR1、和/或抗IFNAR1 dsFv。
在一些实施方案中，R3和R4中的每个是一种或多种生物活性效应部分，包括，例如抗TNF-α Fv、抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)、抗IL-23Fv、抗IL-23dsFv、抗IFNAR1和/或抗IFNAR1 dsFv。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4中的每个可以是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-α Fv，其包含与SEQ ID No：49具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID NO：50具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含与SEQ ID No：51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ IDNo：52具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23Fv，其包含与SEQ ID No：53具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID NO：54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23dsFv，其包含与SEQ ID No：55具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID NO：56具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗IFNAR1，其包含与SEQ ID No：57具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID No：58具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含与SEQ ID No：59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID No：60具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列。R1、R2、R3和R4中的每个可以是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-α Fv，其包含SEQ ID NO：49的重链和SEQ ID NO：50的轻链；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含SEQ ID NO：51的重链和SEQ ID NO：52的轻链；抗IL-23Fv，其包含SEQ ID NO：53的重链和SEQ ID NO：54的轻链；抗IL-23dsFv，其包含SEQ ID NO：55的重链和SEQ ID NO：56的轻链；抗IFNAR1，其包含SEQ ID NO：57的重链和SEQ ID NO：58的轻链；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含SEQ ID NO：59的重链和SEQ ID NO：60的轻链。
在一些实施方案中，R3和R4中的每个可以是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-α Fv，其包含与SEQ ID No：49具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQID NO：50具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含与SEQ ID No：51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID No：52具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23Fv，其包含与SEQ IDNo：53具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID NO：54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23dsFv，其包含与SEQ ID No：55具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID NO：56具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；抗IFNAR1，其包含与SEQ IDNo：57具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID No：58具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含与SEQ ID No：59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID No：60具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链氨基酸序列。R3和R4中的每个可以是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-αFv，其包含SEQ ID NO：49的重链和SEQ ID NO：50的轻链；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含SEQ ID NO：51的重链和SEQ ID NO：52的轻链；抗IL-23Fv，其包含SEQ ID NO：53的重链和SEQ ID NO：54的轻链；抗IL-23dsFv，其包含SEQ ID NO：55的重链和SEQ ID NO：56的轻链；抗IFNAR1，其包含SEQ ID NO：57的重链和SEQ ID NO：58的轻链；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含SEQ ID NO：59的重链和SEQ ID NO：60的轻链。
在一些实施方案中，本文公开的多特异性抗体包含抗HSA Fab(SL335)、各自为抗CD40L IgG(鲁普利单抗)的R1和R2、和各自为抗TNF-αIgG(阿达木单抗)和/或抗TNF-α Fab′(赛妥珠单抗)的R3和R4。在一些实施方案中，本文公开的多特异性抗体包含抗HSA Fab(SL335)、各自为抗CD40L scFv(hu5c8)的R1和R2、以及R3m和R4n中的m和n各自为0。
在某些方面，本文所述的多特异性抗体可以仅由其VL结构域描述、或仅由其VH结构域描述、或仅由其3个VL CDR描述、或仅由其3个VH CDR描述。参见，例如Rader C等人，(1998)PNAS 95：8910-8915，其通过引用整体并入本文，其描述了通过分别从人轻链或重链文库中鉴定互补轻链或重链来对小鼠抗αvβ3抗体进行人源化，从而产生与原始抗体具有一样高或更高的亲和力的人源化抗体的变体。还参见Clackson T等人，(1991)Nature 352：624-628，其通过引用整体并入本文，其描述了通过使用特定的VL结构域(或VH结构域)并筛选文库的互补可变结构域来产生结合特定抗原的抗体的方法。筛选产生了14个特定VH结构域的新配偶体和13个特定VL结构域的新配偶体，如ELISA所确定的，它们是强结合剂。还参见Kim SJ&Hong HJ，(2007)J Microbiol 45：572-577，其通过引用整体并入本文，其描述了通过使用特定VH结构域和筛选文库(例如，人VL文库)的互补VL结构域来产生结合特定抗原的抗体的方法；所选择的VL结构域反过来可用于指导选择其他互补(例如，人)的VH结构域。
在某些方面，抗体的CDR可以根据Chothia编号方案确定，该方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见，例如Chothia C&Lesk AM，(1987)，J Mol Biol 196：901-917；Al-Lazikani B等人，(1997)J Mol Biol 273：927-948；Chothia C等人，(1992)J Mol Biol227：799-817；Tramontano A等人，(1990)JMol Biol 215(1)：175-82；和美国专利号7,709,226)。通常，当使用Kabat编号规则时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号规则编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环中止于32处；如果仅存在35A，则环中止于33处；如果35A和35B都存在，则环中止于34处)。
在某些方面，本文提供了特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的多特异性抗体，其包含VL的Chothia VL CDR。在某些方面，本文提供了特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗体，其包含VH的Chothia VH CDR。在某些方面，本文提供了特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗体，其包含VL的Chothia VL CDR以及包含VH的Chothia VH CDR。在某些实施方案中，特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗体包含一个或多个CDR，其中Chothia和Kabat CDR具有相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文提供了特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗体，其包含Kabat CDR和Chothia CDR的组合。
在某些方面，可以根据Lefranc M-P,(1999)The Immunologist 7：132-136和Lefranc M-P等人(1999)Nucleic Acids Res 27：209-212中描述的IMGT编号系统确定抗体的CDR。根据IMGT编号方案，VH-CDR1在第26至第35位，VH-CDR2在第51至第57位，VH-CDR3在第93至第102位，VL-CDR1在第27至第32位，VL-CDR2在第50至第52位，VL-CDR3在第89至第97位。
在某些方面，可以根据MacCallum RM等人(1996)J Mol Biol 262：732-745确定抗体的CDR。也参见，例如，Martin A.″Protein Sequence and Structure AnalysisofAntibodyVariable Domains，″AntibodyEngineering，Kontermann和Dübel，编辑，第31章，第422-439页，Springer-Verlag，Berlin(2001)。
在某些方面，可以根据AbM编号方案确定抗体的CDR，该编号方案是指代表KabatCDR和Chothia结构环之间折衷的AbM高变区，并通过Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group，Inc.)使用。
在一些实施方案中，本文所述抗体的沿VH区一个或多个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或沿VL区一个或多个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)可以有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸位置的变化，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。例如，定义本文所述抗体的CDR的位置可以相对于本文所述多特异性抗体的CDR位置，在CDR的N-末端和/或C-末端边界偏移一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其他实施方案中，本文所述抗体的沿VH区的一个或多个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或沿VL区的一个或多个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)可以有一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸的变化(例如，更短或更长)，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。
在一些实施方案中，本文所述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3可以比本文所述的一个或多个CDR短一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其他实施方案中，本文所述的VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3可以比本文所述的一个或多个CDR长一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其他实施方案中，本文所述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的氨基末端可以比本文所述的一个或多个CDR延伸了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其他实施方案中，本文所述的VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的羧基末端可以比本文所述的一个或多个CDR延伸了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其他实施方案中，本文所述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的氨基末端可以比本文所述的一个或多个CDR缩短了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在一些实施方案中，本文所述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的羧基末端可以比本文所述的一个或多个CDR缩短了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持与抗原的免疫特异性结合即可(例如，基本上维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。本领域已知的任何方法可用于确定是否维持了与抗原的免疫特异性结合，例如本文″实施例″部分中描述的结合测定法和条件。
确定两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比也可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的具体的非限制性示例是Karlin S&Altschul SF(1990)PNAS 87：2264-2268，如Karlin S&Altschul SF(1993)PNAS 90：5873-5877中修改的算法。这种算法被并入NBLAST和XBLASTprograms of Altschul SF等人(1990)J Mol Biol 215：403中。可以使用NBLAST核苷酸程序参数集进行BLAST核苷酸搜索，例如，分数＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序参数集进行BLAST蛋白搜索，例如，分数＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用空位BLAST，如Altschul SF等人，(1997)Nuc Acids Res 25：33893402中所述。或者，PSI BLAST可用于执行迭代搜索，以检测分子(Id.)之间的远近关系。当使用BLAST、空位BLAST和PSI Blast程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见，例如，万维网ncbi.nlm.nih.gov上的国家生物技术信息中心(NCBI))。用于序列比较的数学算法的另一个具体的、非限制性的示例是Myers和Miller，1988，CABIOS 4：1117的算法。这种算法被纳入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12和空位罚分为4。
可以使用与上述技术类似的技术来确定两个序列之间的同一性百分比，有或没有允许的空位。在计算同一性百分比时，通常只计算完全匹配。
多特异性抗体可以融合或缀合(例如，共价或非共价连接)可检测的标记或物质。可检测标记或物质的示例包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，例如鲁米诺；和荧光标记，例如荧光素和罗丹明、以及生物素。此类标记的抗体可用于检测抗原蛋白。
例如，为了抑制作为自身免疫疾病或同种异体移植物排斥反应的主要途径的CD40-CD40L相互作用，已经开发了靶向CD40或CD40L的单克隆抗体，但是由于副作用的发生而停止了进一步的开发，例如，由IgG1抗体的Fc诱导的血栓栓塞。为了消除或减少副作用，开发了重组抗体(抗hu5c8scFv)2-SL335(称为APB-A1)，其通过组合Fab与抗CD40L scFv产生。SL335是一种抗原结合片段(Fab)，通过与人血清白蛋白特异性结合提高了体内持续性。参见，美国专利号9,879,077，其通过引用整体并入本文。
为了确定APB-A1的结合能力及其抑制血栓栓塞的效力，评估了结合能力和基于细胞的抑制效力。通过双层干涉法确定了APB-A1与HSA和rhCD40L的结合亲和力，结果表明，与各对照组相比，APB-A1对HSA和rhCD40L的解离常数(KD)趋于降低。在评估基于细胞的抑制效力时，当添加HSA时，hu5c8 IgG1的抑制效力没有显著差异，而APB-A1对rhCD40L抗原和D1.1细胞的结合抑制效力水平分别提高了约1.6倍和3倍。这表明由SL335和HSA的结合引起的大小变化导致与阳性对照组相似的效力水平。也就是说，即使亲和力比hu5c8 IgG1更低，但是在HSA存在下抑制效力也会增加。
为了研究是否由于去除IgG1的Fc区解决了血栓栓塞的副作用，测量并分析了APB-A1的血小板聚集和血清素分泌水平。虽然即使在400ng/ml的高浓度下，也没有观察到由APB-A1和rhCD40L形成的免疫复合物(IC)导致的血小板聚集，但在相对较低的浓度60ng/ml下，启动了响应于hu5c8 IgG1和rhCD40L的IC的聚集反应，这通过透射率和血小板的聚集率而确定。当分析致密血小板颗粒中的血清素释放水平时，确定了APB-A1 IC的血清素释放水平在统计学上显著低于hu5c8 IgG1 IC。该结果表明本公开的抗CD40L抗体甚至在体内也能有效解决血栓栓塞相关的疾患。
为了评估APB-A1的半衰期，进行了药代动力学分析。通过单次静脉内注射，将APB-A1以每只5mg/kg(第1组)或每只20mg/kg(第2组)的剂量施用于食蟹猴的两个测试组。结果，假设2组具有相等的肾清除率，确定了第2组的体内半衰期为9.59±0.79天，是第1组的1.38倍，第1组为6.94±4.6天。
在又一个实施例中，为了评估对注射破伤风类毒素(TT)时产生的抗TT IgG抗体的免疫反应，进行了药效学分析。以食蟹猴为测试动物，通过单次静脉内注射，将APB-A1以5mg/kg(第1组)或20mg/kg(第2组)的剂量施用于食蟹猴的两个测试组。结果，当APB-A1以高浓度(20mg/kg)静脉内施用时，对IgG抗体免疫反应的抑制效力远高于施用作为阳性对照组的DXT时的抑制效力，并且这种抑制效力维持长达30至40天。此外，CD40-CD40L相互作用也由记忆B细胞操作，在第27天确定了进行了TT加强(在第20天)使用APB-A1的显著抑制功效。因此，证实了本公开的APB-A1与hu5c8 IgG1相比显著改善了血栓栓塞相关的疾患。
在其他实施方案中，通过连接抗CD154(CD40配体；CD40L)单链可变片段(scFv)(VH-[肽接头]-VL)和肿瘤坏死因子-α(抗TNF-α)可变片段(Fv)或二硫化物稳定的Fv(dsFv)，分别产生了称为APB-B1a和APB-B1b的新的双特异性抗体。在使用生物层干涉法(BLI)的实验中，证实了APB-B1具有同时结合三个靶标的能力，即重组人CD40L、重组人TNF-α和人血清白蛋白(HSA)蛋白，并且与抗CD40L IgG或抗TNF-α Fab′亲本抗体具有相似水平的抗原结合亲和力。
在与此相关的其他实施方案中，在无赋形剂缓冲状态下测得的解链温度(Tm)为62℃，无论抗TNF-α Fv中是否存在链间二硫键，证实了链间二硫键对结构稳定性没有贡献。
在与此相关的其他实施方案中，基于体外细胞的测定法显示APB-B1的CD40L抑制能力与亲本抗体抗CD40L IgG1相似，而与亲本抗体抗TNF-α Fab′相比，TNF-α的抑制能力略有降低。尽管如此，APB-B1对CD40L和TNF-α均表现出抑制活性，并且比亲本抗体抗CD40LIgG1和抗TNF-αFab′中的每个的抑制活性更高。
抗体产生
本文公开的多特异性抗体可以通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法产生，例如通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有说明，本文描述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术的相关领域中的常规技术。例如，在本文引用的参考文献中描述了这些技术，并且在文献中对其进行了充分解释。参见，例如，Maniatis T等人，(1982)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人，(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Sambrook J等人，(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel FM等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987，年度更新)；Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(1987，年度更新)Gait(编辑)(1984)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein(编辑)(1991)Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，IRL Press；Birren B等人，(编辑)(1999)Genome Analysis：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体是通过任何方法制备、表达、产生或分离的抗体(例如，重组抗体)，所述方法包括例如，通过合成、DNA序列的基因工程化的创建。在某些实施方案中，此类抗体包含不是在动物或哺乳动物(例如，人)体内天然存在的抗体种系库中的序列(例如，DNA序列或氨基酸序列)。
在一些方面，本文提供了制备本文公开的多特异性抗体的方法，所述方法包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在一些方面，本文提供了一种制备多特异性抗体的方法，所述方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如，包含编码本文所述抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)抗体。在一些实施方案中，细胞是分离的细胞。在一些实施方案中，外源多核苷酸已被引入细胞中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括纯化从细胞或宿主细胞获得的抗体的步骤。
产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Short Protocols inMolecular Biology，(2002)第5版，Ausubel FM等人，编辑，John Wiley和Sons，New York中的第11章)。
可以使用本领域已知的多种技术制备多特异性抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，包括本领域已知的和例如在Harlow E&Lane D，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling GJ等人：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier，N.Y.，1981)中教导的那些技术。如本文所用，术语″单克隆抗体″不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如，单克隆抗体可以由外源表达本文所述抗体的宿主细胞重组产生。
如本文所用，″单克隆抗体″是由单细胞(例如，产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中所述抗体免疫特异性结合抗原(例如，人血清白蛋白)，如，例如，通过ELISA或本领域已知的或本文提供的实施例中的其他抗原结合或竞争性结合测定法所确定的。在特定实施方案中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如，二价)抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体可以是Fab片段或F(ab′)2片段。例如，本文所述的单克隆抗体可以通过如Kohler G&Milstein C(1975)Nature 256：495中所述的杂交瘤方法制备，或者，可以，例如，使用如本文所述的技术从噬菌体文库中分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域众所周知的(参见，例如，Short Protocols in Molecular Biology，(2002)第5版，Ausubel FM等人，同上中的第11章)。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规且众所周知的。例如，在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其他合适的宿主动物，例如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或猕猴，以诱导淋巴细胞产生或能够产生特异性结合用于免疫的抗原(例如，人血清白蛋白)的抗体。或者，可以体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding JW(编辑)，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。此外，RIMMS(重复免疫多位点)技术可用于免疫动物(Kilpatrick KE等人，(1997)Hybridoma 16：381-9，通过引用整体并入)。
在一些实施方案中，可以用抗原(例如，人血清白蛋白)免疫小鼠(或其他动物，例如大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)，一旦检测到免疫反应，例如，在小鼠血清中检测到抗原特异性抗体，则收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自美国典型培养物保藏中心
Figure GDA0004041419740000331
(Manassas，VA)的细胞系SP20，以形成杂交瘤。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。在某些实施方案中，收获免疫小鼠的淋巴结并与NS0骨髓瘤细胞融合。
将由此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，所述培养基可以含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤乌嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
具体实施方案采用骨髓瘤细胞，其有效融合、支持所选择的抗体产生细胞稳定的高水平抗体产生，并且对培养基如HAT培养基敏感。在这些骨髓瘤细胞系中，有鼠骨髓瘤细胞系，例如NS0细胞系或衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些细胞系，可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的Salk Institute Cell Distribution Center获得，以及SP-2或X63-Ag8.653细胞，可从美国马里兰州的美国典型培养物保藏中心获得。人骨髓瘤和小鼠-人异质骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor D(1984)J Immunol 133：3001-5；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。通过本领域已知的方法确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，例如免疫沉淀或通过体外结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
在鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释步骤对克隆进行亚克隆，并通过标准方法生长(Goding JW(Ed)，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，同上)。用于此目的的合适培养基包括，例如D-MEM或RPMI 1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物腹水肿瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规的免疫球蛋白纯化步骤，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法从培养基、腹水或血清中适当地分离。
本文所述的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，本文所述的Fab和F(ab′)2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生，使用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)。Fab片段对应于四聚体抗体分子的两条相同臂之一，并包含与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab′)2片段包含通过铰链区中的二硫键连接的四聚体抗体分子的两条抗原结合臂。
此外，本文所述的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，蛋白质展示在携带编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。特别是，从动物cDNA文库(例如，受影响组织的人或鼠cDNA文库)中扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起并克隆到噬菌粒载体中。载体被电穿孔到大肠杆菌中，大肠杆菌感染辅助噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可以使用抗原选择或鉴定表达与特定抗原结合的抗体的噬菌体，例如，使用标记的抗原或与固体表面或珠结合或捕获至其上的抗原。可用于制备本文所述抗体的噬菌体展示方法的示例包括在Brinkman U等人，(1995)J Immunol Methods 182：41-50；Ames RS等人，(1995)JImmunol Methods 184：177-186；Kettleborough CA等人，(1994)Eur J Immunol 24：952-958；Persic L等人，(1997)Gene 187：9-18；Burton DR&Barbas CF(1994)Advan Immunol57：191-280；PCT/GB91/001134；WO90/02809，WO91/10737，WO92/01047，WO92/18619，WO93/11236，WO95/15982，WO95/20401和WO97/13844；以及美国专利号5,698,426，5,223,409，5,403,484，5,580,717，5,427,908,5,750,753,5,821,047，5,571,698，5,427,908，5,516,637，5,780,225，5,658,727，5,733,743和5,969,108中公开的那些。
如上述参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生抗体，包括人抗体，并在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、和细菌，例如，如下所述。也可以使用本领域已知的方法利用重组生产抗体(例如Fab、Fab′和F(ab′)片段)的技术，例如在WO92/22324；Mullinax RL等人，(1992)BioTechniques 12(6)：864-9；Sawai H等人，(1995)Am J Reprod Immunol 34：26-34；和Better M等人，(1988)Science 240：1041-1043中公开的那些。
在一些方面，为了产生抗体，可以使用包含VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物从模板(例如，scFv克隆)扩增VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达VH恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达VL恒定区(例如，人kappa或lambda恒定区)的载体中。VH和VL结构域也可以克隆到一个表达必需恒定区的载体中。然后使用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染到细胞系中以产生表达抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可以包含与人抗体的恒定区融合的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如Morrison SL(1985)Science 229∶1202-7；Oi VT&Morrison SL(1986)BioTechniques 4：214-221；Gillies SD等人，(1989)J ImmunolMethods 125：191-202；和美国专利号5,807,715，4,816,567，4,816,397和6,331,415。
人源化抗体能够与预定抗原结合，并且其包含具有基本上是人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和具有基本上是非人免疫球蛋白(例如，鼠免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在特定实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类型，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用本领域已知的多种技术来产生人源化抗体，包括但不限于CDR-接枝(EP 239400；WO91/09967；和美国专利号5,225,539，5,530,10和5,585,089)，贴面或再表面化(EP 592106和EP 519596；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5)：489-498；Studnicka GM等人，(1994)Prot Engineering 7(6)：805-814；和Roguska MA等人，(1994)PNAS 91：969-973)，链改组(美国专利号5,565,332)，以及以下中公开的技术，例如，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，WO93/17105；Tan P等人(2002)JImmunol 169：1119-25；Caldas C等人(2000)Protein Eng.13(5)：353-60；Morea V等人，(2000)Methods20(3)：267-79；Baca M等人(1997)J Biol Chem 272(16)：10678-84；Roguska MA等人(1996)Protein Eng 9(10)：895904；Couto JR等人(1995)Cancer Res.55(23Supp)：5973s-5977s；Couto JR等人(1995)Cancer Res 55(8)：1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2)：409-10和Pedersen JT等人(1994)J Mol Biol 235(3)：959-73。还参见US 2005/0042664A1(2005年2月24日)，其通过引用整体并入本文。
单结构域抗体，例如缺少轻链的抗体，可以通过本领域熟知的方法产生。参见Riechmann L&Muyldermans S(1999)J Immunol 231：25-38；Nuttall SD等人(2000)CurrPharm Biotechnol 1(3)：253-263；Muyldermans S，(2001)J Biotechnol 74(4)：277-302；美国专利号6,005，079；和WO94/04678，WO94/25591和WO01/44301。
此外，与抗原免疫特异性结合的抗体又可用于使用本领域技术人员熟知的技术产生″模拟″抗原的抗独特型抗体。(参见，例如，Greenspan NS&Bona CA(1989)FASEB J 7(5)：437-444；和Nissinoff A(1991)J Immunol 147(8)：2429-2438)。
在特定实施方案中，本文所述的多特异性抗体是人抗体，其与本文所述的抗体结合感兴趣抗原(例如，人血清白蛋白)的相同表位。在特定实施方案中，本文所述的抗体是人抗体，其竞争性阻断(例如，以剂量依赖性方式)本文所述的任何一种抗体与血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的结合。可以使用本领域已知的任何方法产生人抗体。例如，可以使用转基因小鼠，其不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因。具体而言，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，可以将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞。可以单独使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因失去功能，或者在通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座的同时使其失去功能。特别是JH区的纯合缺失阻止内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子代。用选择的抗原(例如，抗原的全部或部分)以正常方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重新排列，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于用于产生人抗体的该技术的综述，参见Lonberg N&Huszar D(1995)Int Rev Immunol 13：65-93。用于产生人抗体和人单克隆抗体的技术以及产生此类抗体的方案的详细讨论，参见，例如，WO98/24893、WO96/34096和WO96/33735；和美国专利号5,413,923，5,625,126，5,633,425，5,569,825，5,661,016，5,545,806，5,814,318和5,939,598。能够产生人抗体的小鼠的示例包括XenomouseTM(Abgenix，Inc.；美国专利号6,075,181和6,150,184)、HuAb-Mouse(Mederex，Inc./Gen Pharm；美国专利号5,545,806和5,569，825)、Trans Chromo MouseTM(Kirin)和KM MouseTM(Medarex/Kirin)。
可使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库、通过本领域已知的多种方法制备与抗原特异性结合的人抗体，包括上述噬菌体展示方法。还参见美国专利号4,444,887、4,716,111和5,885,793；以及WO98/46645，WO98/50433，WO98/24893，WO98/16654，WO96/34096，WO96/33735和WO91/10741。
在一些实施方案中，可以使用小鼠-人杂交瘤产生人抗体。例如，用EB病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞可以与小鼠骨髓瘤细胞融合，产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，然后筛选这些小鼠-人杂交瘤以确定分泌免疫特异性结合靶抗原的人单克隆抗体的杂交瘤。此类方法是已知的并且在本领域中有所描述，参见，例如，Shinmoto H等人，(2004)Cytotechnology 46：19-23；Naganawa Y等人(2005)Human Antibodies 14：27-31。
多核苷酸、载体和细胞
在某些方面，本文提供了包含编码本文所述的与抗原免疫特异性结合的抗体或其片段(例如，可变轻链区和/或可变重链区)的核苷酸序列的多核苷酸和载体，例如，用于在宿主细胞(例如，大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的包含此类多核苷酸的载体。本文提供了包含编码本文提供的任何抗体的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸序列的载体，例如，在宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)中有效表达的表达载体。
如本文所用，″分离的″多核苷酸或核酸分子是与核酸分子的天然来源中(例如，在小鼠或人中)存在的其他核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，″分离的″核酸分子，例如cDNA分子，在通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。例如，语言″基本上不含″包括这样的多核苷酸或核酸分子的制剂，其具有少于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是少于约10％)的其他物质，例如，细胞物质、培养基、其他核酸分子、化学前体和/或其他化学品。在一些实施方案中，编码本文所述抗体的核酸分子是分离或纯化的。
在特定方面，本文提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码免疫特异性地结合抗原多肽(例如，人血清白蛋白)并且包含如本文所述的氨基酸序列的抗体、以及与此类抗体竞争性结合抗原多肽(例如，以剂量依赖的方式)或与此类抗体结合相同表位的抗体。
在某些方面，本文提供包含编码本文所述抗体的轻链或重链的核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可包含编码轻链的核苷酸序列，所述轻链包含本文所述抗体的VL FR和CDR。多核苷酸可包含编码重链的核苷酸序列，所述重链包含本文所述抗体的VH FR和CDR。
在具体实施方案中，本文提供包含编码多特异性抗体的核苷酸序列的多核苷酸，所述多特异性抗体包含Fab，所述Fab包含本文所述的针对人血清白蛋白的抗体的三个VH链CDR(例如包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)以及本文所述的针对人血清白蛋白的抗体的三个VH链CDR(例如包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)。
在特定实施方案中，本文提供包含编码多特异性抗体或其包含VL结构域的片段的核苷酸序列的多核苷酸。
在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸包含编码本文提供的多特异性抗体的核苷酸序列，所述多特异性抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含本文所述的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：46)，其中所述抗体免疫特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)。
在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸包含编码本文提供的抗体的核苷酸序列，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含本文所述的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO：45)，其中所述抗体免疫特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)。
在特定方面，本文提供了包含编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸，所述抗体包含轻链和重链，例如，单独的轻链和重链。关于轻链，在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码κ轻链的核苷酸序列。在其他实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码λ轻链的核苷酸序列。在又一些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文所述抗体的核苷酸序列，所述抗体包含人κ轻链或人λ轻链。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码抗体的核苷酸序列，所述抗体免疫特异性地结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)，其中抗体包含轻链，并且其中VL结构域的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO：46中列出的氨基酸序列，并且其中轻链的恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。例如，人恒定区序列可以是美国专利号5,693,780中描述的那些。
本文还提供了优化的编码多特异性抗体或其片段的多核苷酸，例如，通过密码子/RNA优化、用异源信号序列替换和消除mRNA不稳定性元件。通过引入密码子改变和/或消除mRNA中的抑制区，产生编码多特异性抗体或其片段(例如，轻链、重链、VH结构域或VL结构域)的优化核酸，以进行重组表达的方法可以通过相应地调整，例如美国专利号5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132和6,794,498中所述的优化方法进行。例如，可以突变RNA内的潜在剪接位点和不稳定元件(例如，富含A/T或A/U的元件)，而不改变由核酸序列编码的氨基酸，以增加用于重组表达的RNA的稳定性。这些改变利用了遗传密码的简并性，例如，使用相同氨基酸的替代密码子。在一些实施方案中，可能需要改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如，与原始氨基酸具有相似的化学结构和性质和/或功能的相似氨基酸。
在某些实施方案中，编码本文所述的多特异性抗体或其片段(例如，VL结构域或VH结构域)的优化的多核苷酸序列可以与编码本文所述的多特异性抗体或其片段(例如，VL结构域或VH结构域)的未优化的多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。在具体的实施方案中，编码本文所述的多特异性抗体或片段的优化的核苷酸序列可以在高严格条件下与编码本文所述的多特异性抗体或其片段的未优化的多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在一些实施方案中，编码本文所述的多特异性抗体或其片段的优化的核苷酸序列可以在高严格、中等、或低严格条件下与编码本文所述的多特异性抗体或其片段的未优化的核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。关于杂交条件的信息已经被描述了，参见例如US2005/0048549(例如，第72-73段)，其通过引用并入本文。
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述抗体和这些抗体的修饰形式的核苷酸序列可以使用本领域熟知的方法来确定，即，将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码抗体的核酸的方式组装。这种编码抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier G等人，(1994)，BioTechniques 17：242-246所述)，简而言之，包括合成包含编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸、退火和连接这些寡核苷酸、然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码本文所述的抗体或其片段的多核苷酸可以使用本领域熟知的方法(例如，PCR和其他分子克隆方法)，由来自合适来源(例如，杂交瘤)的核酸产生。例如，可以使用与已知序列的3′和5′末端杂交的合成引物，使用从产生感兴趣抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA进行PCR扩增。此类PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体轻链和/或重链的序列的核酸。此类PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体轻链可变区和/或重链可变区的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达，并进一步克隆，例如，以产生嵌合抗体和人源化抗体。
如果含有编码特定抗体或其片段的核酸的克隆不可用，但抗体分子或其片段的序列是已知的，则可以化学合成或从合适的来源(例如，抗体cDNA文库或从表达抗体的任何组织或细胞(例如为表达本文所述抗体而选择的杂交瘤细胞)产生的cDNA文库、或从其分离的核酸，例如poly A+RNA)获得编码免疫球蛋白或其片段的核酸，通过使用与序列的3′和5′末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针进行克隆来鉴定，例如，来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
可以使用常规程序容易地分离和测序本文所述的编码多特异性抗体的DNA(例如，通过使用能够特异性结合编码多特异性抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可以作为这种DNA的来源。分离后，可以DNA将放入表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞中，例如，大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHOGS SystemTM(Lonza)的CHO细胞)、或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得多特异性抗体的合成。
为了产生抗体，可以使用包含VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物扩增scFv克隆中VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区(例如，人gamma4恒定区)的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区(例如，人kappa或lambda恒定区)的载体中。在某些实施方案中，用于表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、可变结构域的克隆位点、恒定结构域和选择标志物，如新霉素。VH和VL结构域也可以克隆到一个表达必需恒定区的载体中。然后使用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
DNA也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替鼠序列，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白的编码序列。
还提供了在高严格、中等或低严格杂交条件下与编码本文所述抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。在具体实施方案中，本文所述的多核苷酸在高严格、中等或低严格杂交条件下与编码本文提供的VH结构域和/或VL结构域的多核苷酸杂交。
杂交条件已在本领域中描述并且是本领域技术人员已知的。例如，在严格条件下的杂交可以包括在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA杂交，然后在约50-65℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次；在高严格条件下的杂交可以包括在约45℃下在6xSSC中与滤膜结合的核酸杂交，然后在约68℃下在0.1xSSC/0.2％SDS中洗涤一次或多次。在其他严格杂交条件下杂交是本领域技术人员已知的并且已经描述于，参见例如，Ausubel FM等人，编辑，(1989)Current Protocols in Molecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.，New York 6.3.1-6.3.6和2.10.3页。
本文进一步公开了表达载体，其包含：
(a)启动子，
(b)第一核酸分子，其编码与血清白蛋白结合的抗原结合片段(Fab)，和
(c)第二核酸分子，其编码生物活性效应部分和接头，
其中启动子、第一核酸序列和第二核酸分子可操作地连接。所述第二核酸分子可以编码2、3、4、5、6或更多个生物活性效应部分和接头。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：
(a)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含WINTYSGGTKYAQKFQG(SEQ ID NO：62)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列；
(b)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含RINTYNGNTGYAQRLQG(SEQ ID NO：64)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列；
(c)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含NYGIH(SEQ ID NO：65)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：66)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含DVHYYGSGSYYNAFDI(SEQ ID NO：67)的氨基酸序列；
(d)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYAMS(SEQ ID NO：68)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含VISHDGGFQYYADSVKG(SEQ ID NO：69)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含AGWLRQYGMDV(SEQ ID NO：70)的氨基酸序列；
(e)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYWIA(SEQ ID NO：71)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含MIWPPDADARYSPSFQG(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LYSGSYSP(SEQ ID NO：73)的氨基酸序列；或者
(f)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含ETVMAGKALDY(SEQ ID NO：76)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：
(g)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISRYLN(SEQ ID NO：77)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASRLES(SEQ ID NO：78)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSDSVPVT(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列；
(h)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO：80)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO：81)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSYSTPPYT(SEQ ID NO：82)的氨基酸序列；
(i)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSIFNYVA(SEQ ID NO：83)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含DASNRAT(SEQ ID NO：84)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQRSKWPPTWT(SEQ ID NO：85)的氨基酸序列；
(j)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASETVSSRQLA(SEQ ID NO：86)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYGSSPRT(SEQ ID NO：88)的氨基酸序列；
(k)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO：89)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO：87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QKYSSYPLT(SEQ ID NO：90)的氨基酸序列；或者(1)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO：93)的氨基酸序列。
例如，第一核酸分子可以包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含：包含以上(a)的重链可变结构域和包含以上(g)的轻链可变结构域；包含以上(b)的重链可变结构域和包含以上(h)的轻链可变结构域；包含以上(c)的重链可变结构域和包含以上(i)的轻链可变结构域；包含以上(d)的重链可变结构域和包含以上(j)的轻链可变结构域；包含以上(e)的重链可变结构域和包含以上(k)的轻链可变结构域；包含以上(f)的重链可变结构域和包含以上(l)的轻链可变结构域；或者以上重链可变结构域和以上轻链可变结构域的任何组合。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab(SL335)的核酸序列，所述Fab(SL335)包含
包含AYSMN(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO：75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO：76)的氨基酸序列的重链CDR3，和
包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO：93)的氨基酸序列的轻链CDR3。
在其他实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：94、95、96、97、98或99具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：100、101、102、103、104或105具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：94、95、96、97、98或99具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID No：100、101、102、103、104或105具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码Fab(SL335)的核酸序列，所述Fab(SL335)包含重链结构域和轻链结构域，所述重链结构域包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列(VH-CH1结构域)，所述轻链结构域包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列(VL-CL结构域)。
在一些实施方案中，生物活性效应部分是抗TNF-α Fv、抗TNF-αdsFv、抗IL-23Fv、抗IL-23dsFv、抗IFNAR1 Fv和/或抗IFNAR1 dsFv。例如，第二核酸分子可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO：49-60中的一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二核酸分子可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO：6-15、39和40中的一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
在某些方面，本文提供表达(例如，重组表达)本文所述的特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的多特异性抗体的细胞(例如，宿主细胞)和相关的多核苷酸和表达载体。本文提供包含多核苷酸的载体(例如，表达载体)，所述多核苷酸包含编码多特异性抗体或片段的核苷酸序列，以用于在宿主细胞(例如哺乳动物细胞)中重组表达。本文还提供了包含用于重组表达本文所述多特异性抗体(例如，人或人源化抗体)的此类载体的宿主细胞。本文还提供了产生本文所述抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达此类抗体。
本文所述的特异性结合的抗体或其片段(例如本文所述抗体的重链或轻链)的重组表达包括构建含有编码抗体或片段的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码本文所述的抗体或其片段(例如，重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有抗体或抗体片段(例如，轻链或重链)的编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有抗体或抗体片段(例如，轻链或重链)的编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了可复制载体，其包含可操作地连接至启动子的编码本文所述抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变结构域或其片段、或重链或轻链CDR的核苷酸序列。此类载体可以例如包含编码抗体分子恒定区(参见例如WO86/05807和WO89/01036；和美国专利号5,122,464)和抗体可变结构域的核苷酸序列，其可以克隆到此类载体中以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。
表达载体可以通过常规技术转移到细胞(例如，宿主细胞)，然后通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗体。
多种宿主表达载体系统可用于表达所述抗体分子。这样的宿主表达系统代表了可以产生和随后纯化感兴趣的编码序列的载体，而且还代表了当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述的抗体分子的细胞。这些宿主表达系统包括但不限于微生物，例如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，其转化有含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体；酵母(例如，毕赤酵母)，其转化有含有抗体编码序列的重组酵母表达载体；昆虫细胞系统，其感染有含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)；植物细胞系统(例如，绿藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))，其感染有重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或转化有含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)；或哺乳动物细胞系统(例如，COS(例如，COS1或COS)，CHO，BHK，MDCK，HEK293，NS0，PER.C6，VERO，CRL7O3O，HsS78Bst，HeLa和NIH3T3，HEK-293T，HepG2，SP210，R1.1，B-W，L-M，BSC1，BSC40，YB/20和BMT10细胞)，其带有重组表达构建体，所述构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。在一些实施方案中，用于表达本文所述抗体(例如，包含抗体pab1949或pab2044中任一种的CDR的抗体)的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在一些实施方案中，用于表达本文所述抗体的细胞是人细胞，例如，人细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一些实施方案中，特别是，用于表达完整的重组抗体分子的细菌细胞(例如大肠杆菌)，或真核细胞(例如，哺乳动物细胞)，用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)与载体(如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)结合是有效的抗体表达系统(Foecking MK&Hofstetter H(1986)Gene 45：101-105；和Cockett Mi等人(1990)Biotechnology 8：662-667)。在某些实施方案中，本文所述的抗体由CHO细胞或NS0细胞产生。在一些实施方案中，编码本文所述抗体的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。
在细菌系统中，可以根据所表达抗体分子的预期用途有利地选择多种表达载体。例如，为了产生抗体分子的药物组合物，要产生大量这样的抗体时，指导容易纯化的高水平融合蛋白产物表达的载体可能是合乎需要的。此类载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U&Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2∶1791-1794)，其中抗体编码序列可以在lac Z编码区的框内单独连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S&InouyeM(1985)Nuc Acids Res 13：3101-3109；Van Heeke G&Schuster SM(1989)J Biol Chem24：5503-5509)；等等。例如，pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附和结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解细胞中纯化。pGEX载体设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，以便克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，Autographa californica核多角体病毒(AcNPV)可用作表达外源基因的载体。该病毒生长在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以单独克隆到病毒的非必需区域(例如多角体基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，感兴趣的抗体编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三部分组成的前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，E1或E3区)将产生重组病毒，该病毒是能存活的并且能够在受感染的宿主中表达抗体分子(例如，参见Logan J&Shenk T(1984)PNAS 81：3655-3659)。插入的抗体编码序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框的同框，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，包括天然的和合成的。通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等等，可以增强表达的效率(参见，例如Bitter G等人，(1987)Methods Enzymol 153：516-544)。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。此类蛋白质产物的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能很重要。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保正确修饰和加工所表达的外源蛋白质。为此，可以使用具有适当的初级转录本加工、糖基化和基因产物磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO，VERO，BHK，Hela，MDCK，HEK293，NIH3T3，W138，BT483，Hs578T，HTB2，BT2O和T47D，NS0(不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)，CRL7O3O，COS(例如，COS1或COS)，PER.C6，VERO，HsS78Bst，HEK-293T，HepG2，SP210，R1.1，B-W，L-M，BSC1，BSC40，YB/20，BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体(例如，包含CDR的抗体)在哺乳动物细胞如CHO细胞中产生。
在一些实施方案中，本文所述的抗体具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术来产生此类抗体。例如，抗体可以在缺乏或缺少岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一个具体的示例中，敲除α1，6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因的细胞系可用于产生岩藻糖含量降低的抗体。
Figure GDA0004041419740000491
系统(Lonza)是此类系统的一个示例，可用于产生岩藻糖含量降低的抗体。
为了重组蛋白的长期、高产量生产，可以生成稳定的表达细胞。例如，可以工程化稳定表达多特异性抗体的细胞系。在具体实施方案中，本文提供的细胞稳定表达轻链/轻链可变结构域和重链/重链可变结构域，其结合形成本文所述的抗体(例如，包含CDR的抗体)。
在某些方面，不使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以转化有受适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点，等等)控制的DNA和可选择标志物。在引入外源DNA/多核苷酸后，可以允许工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换到选择培养基。重组质粒中的可选择标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到它们的染色体中并生长形成灶，进而可以克隆并扩增为细胞系。该方法可以有利地用于工程化表达本文所述的多特异性抗体或其片段的细胞系。此类工程化细胞系可特别用于筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人，(1977)Cell 11(1)：223-232)、次黄嘌呤乌嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska EH&Szybalski W(1962)PNAS 48(12)：2026-2034)、和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy I等人(1980)Cell 22(3)：817-823)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wiglet M等人，(1980)PNAS77(6)：3567-3570；O′Hare K等人(1981)PNAS 78：1527-1531)；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan RC&Berg P(1981)PNAS 78(4)：2072-2076)；neo，赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Wu GY&Wu CH(1991)Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev PharmacolToxicol 32：573-596；Mulligan RC(1993)Science 260：926-932；and Morgan RA&Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62：191-217；Nabel GJ&Felgner PL(1993)TrendsBiotechnol 11(5)：211-215)。和hygro,赋予潮霉素的抗性(Santerre RF等人，(1984)Gene30(1-3)：147-156)。可以常规应用重组DNA技术领域公知的方法来选择所需的重组克隆，这些方法描述于，例如，Ausubel Fm等人(编辑)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler M，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；第12和13章，Dracopoli NC等人，(编辑)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY(1994)；Colbgre-GarapinF等人(1981)J Mol Biol 150：1-14，其通过引用整体并入本文。
可以通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平(关于综述，参见Bebbington CR&Hentschel CCG，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(AcademicPress，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相关，抗体的产生也会增加(Crouse GF等人，(1983)Mol Cell Biol 3∶257-66)。
可以用本文所述的两种或更多种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，而第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可以含有相同的可选择标志物，使重链和轻链多肽能够等同表达。可以用不同量的两种或更多种表达载体共转染宿主细胞。例如，宿主细胞可以转染有任一以下比例的第一表达载体和第二表达载体：1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶12，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45或1∶50。
或者，可以使用编码并能够表达重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况下，应将轻链置于重链之前以避免过量的无毒重链(Proudfoot NJ(1986)Nature 322：562-565；和
Figure GDA0004041419740000511
G(1980)PNAS 77：2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可以编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，或在2-5、5-10或10-20个范围的基因/核苷酸序列。例如，双顺反子核酸构建体可以按以下顺序包含启动子、第一基因(例如，本文所述抗体的重链)、以及第二基因和(例如，本文所述抗体的轻链)。在这种表达载体中，两个基因的转录都可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性扫描机制进行，而来自第二基因的mRNA的翻译可以通过帽非依赖性机制进行，例如，通过IRES进行。
载体可以包含编码结合血清白蛋白的抗原结合片段(Fab)的第一核酸分子，以及编码生物活性效应部分和接头的第二核酸分子。
一旦通过重组表达产生本文所述的抗体分子，可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和性，特别是在蛋白A后通过对特定抗原的亲和性、以及尺寸柱色谱法)、离心、差异溶解度、或通过用于纯化蛋白的任何其他标准技术。此外，本文所述的抗体可以与本文所述的或本领域已知的异源多肽序列融合以促进纯化。
在具体实施方案中，本文所述的抗体是分离的或纯化的。通常，分离的抗体是基本上不含与分离的抗体具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所述抗体的制剂基本上不含细胞物质和/或化学前体。术语″基本上不含细胞物质″包括这样的抗体制剂，其中抗体与重组产生所述抗体的细胞成分分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括这样的抗体制剂，其具有小于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白(在本文中也称为″污染蛋白质″)和/或抗体的变体，例如抗体的不同翻译后修饰形式。当重组产生抗体或片段时，其通常也基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体或片段时，其通常基本上不含化学前体或其他化学物质，即，其从化学前体或参与蛋白质合成的其他化学物质分离。因此，抗体或片段的此类制剂具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的除感兴趣的抗体或片段之外的化学前体或化合物。在一些实施方案中，本文所述的抗体是分离的或纯化的。
组合物
本文提供了包含本文所述的多特异性抗体的组合物，所述多特异性抗体在生理可接受的载体、赋形剂或稳定剂中具有所需的纯度(Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA)。本文还公开了包含本文所述的多特异性抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒。
本公开的药物组合物在施用于受试者后可以提供快速、持续或延迟释放的活性成分，并且可以使用本领域技术人员熟知的方法进行配制。制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软或硬明胶胶囊、无菌可注射溶液、无菌粉剂等形式。合适的载体、赋形剂和稀释剂的示例是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，制剂还可以包括填充剂、抗凝集剂、润滑剂、润湿剂、助剂、乳化剂、防腐剂等。
本文所述的药物组合物可用于增强、诱导或激活多特异性抗体的活性和治疗疾病或病症，例如自身免疫病症或疾病。
用于在体内施用的组合物可以是无菌的。这很容易通过例如，无菌过滤膜的过滤来完成。
用途和方法
本文公开了在有需要的受试者中治疗自身免疫疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的多特异性抗体或药物组合物。可以治疗的自身免疫疾病或病症包括但不限于视神经脊髓炎谱系病患、类风湿性关节炎、多发性硬化症、干燥综合征、系统性红斑狼疮、ANCA相关性血管炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病。
在一些方面，本文提供了用于调节受试者中的一种或多种免疫功能或反应的方法，包括向需要其的受试者施用本文所述的多特异性抗体或其组合物。本文公开了用于在受试者中激活、增强或诱导一种或多种免疫功能或反应的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用多特异性抗体或其组合物。在一些实施方案中，本文提供了用于预防和/或治疗需要激活或增强一种或多种免疫功能或反应的疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用本文所述的多特异性抗体或其组合物。在某些实施方案中，本文提供了治疗自身免疫疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用多特异性抗体或其组合物。
本文还公开了本文公开的多特异性抗体或组合物用于在受试者中治疗自身免疫疾病或病症；调节一种或多种免疫功能或反应；激活、增强或诱导一种或多种免疫功能或反应；或预防和/或治疗需要激活或增强一种或多种免疫功能或反应的疾病的用途。本文还公开了本文公开的多特异性抗体或组合物，用于在受试者中治疗自身免疫疾病或病症；调节一种或多种免疫功能或反应；激活、增强或诱导一种或多种免疫功能或反应；或预防和/或治疗需要激活或增强一种或多种免疫功能或反应的疾病。本文还公开了本文公开的多特异性抗体或组合物在制备用于在受试者中治疗自身免疫疾病或病症；调节一种或多种免疫功能或反应；激活、增强或诱导一种或多种免疫功能或反应；或预防和/或治疗需要激活或增强一种或多种免疫功能或反应的疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，使用本领域公知的测定法，例如，ELISPOT、ELISA和细胞增殖测定法，相对于未施用本文所述多特异性抗体的受试者的免疫功能，本文所述的多特异性抗体在受试者中至少99％、至少98％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％，或在10％至25％、25％至50％、50％至75％、或75％至95％的范围内，激活或增强或诱导一种或多种免疫功能或反应。
施用途径和剂量
本公开的药物组合物可以通过多种施用途径施用于受试者，包括口服、经皮、皮下、静脉内和肌内施用途径。
有效治疗和/或预防病症的抗体或组合物的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术确定。
在本公开中，实际施用的多特异性抗体的量是根据各种相关因素确定的，包括待治疗的疾病、选择的施用途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度、以及作为活性成分的生物活性多肽的类型。由于本发明的多特异性抗体在血液中具有非常优异的持续性，因此可以显著减少包含本发明融合蛋白的肽制剂的施用次数和频率。
组合物中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病的严重程度，并应根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。例如，有效剂量也可以根据施用方式、靶部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患者是人还是动物、施用的其他药物或治疗是预防性还是治疗性的而变化。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。优化滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。
在一些实施方案中，本文公开的多特异性抗体的剂量为0.1mg/kg至100mg/kg受试者体重、0.1mg/kg至80mg/kg受试者体重、0.1mg/kg至60mg/kg受试者体重、0.1mg/kg至50mg/kg受试者体重、0.1mg/kg至40mg/kg受试者体重、0.1mg/kg至30mg/kg受试者体重、0.1mg/kg至20mg/kg受试者体重、0.1mg/kg至10mg/kg受试者体重、1mg/kg至100mg/kg受试者体重、1mg/kg至80mg/kg受试者体重、1mg/kg至60mg/kg受试者体重、1mg/kg至50mg/kg受试者体重、1mg/kg至40mg/kg受试者体重、1mg/kg至30mg/kg受试者体重、1mg/kg至20mg/kg受试者体重、1mg/kg至10mg/kg受试者体重、5mg/kg至100mg/kg受试者体重、5mg/kg至80mg/kg受试者体重、5mg/kg至60mg/kg受试者体重、5mg/kg至50mg/kg受试者体重、5mg/kg至40mg/kg受试者体重、5mg/kg至30mg/kg受试者体重、5mg/kg至20mg/kg受试者体重、5mg/kg至10mg/kg受试者体重、或本文涵盖的任何剂量或剂量范围，例如0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg受试者体重。
在某些实施方案中，使用体外测定法帮助确定最佳剂量范围。有效剂量可以从来自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推。
通常，由于对外源多肽的免疫反应，人抗体在人体内的半衰期比来自其他物种的抗体更长。因此，较低剂量的人抗体和较低的施用频率通常是可能的。
试剂盒
本文提供了包含本文所述的一种或多种抗体或其缀合物的试剂盒。在一些实施方案中，本文提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器装有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，例如本文提供的一种或多种抗体。在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，例如本文所述的那些。可选地与此类容器相关联的可以是由管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了制造、使用或销售机构对人施用的批准。本文还提供了可用于上述方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的抗体，例如纯化的抗体。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含基本上分离的抗原(例如，人血清白蛋白)，其可用作对照。在其他实施方案中，本文所述的试剂盒还包含不与血清白蛋白抗原反应的对照抗体。在其他实施方案中，本文所述的试剂盒包含一种或多种用于检测抗体与血清白蛋白抗原结合的元件(例如，抗体可与可检测底物如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物缀合，或识别第一抗体的第二抗体可与可检测底物缀合)。在具体实施方案中，本文提供的试剂盒可以包含重组产生的或化学合成的血清白蛋白抗原。试剂盒中提供的血清白蛋白抗原也可以附着在固体支持物上。在一些实施方案中，上述试剂盒的检测工具包括附着有血清白蛋白抗原的固体支持物。这样的试剂盒还可以包含未附着的标记报告物的抗人抗体或抗小鼠/大鼠抗体。抗体与血清白蛋白抗原的结合可以通过所述标记报告物的抗体的结合来检测。
在下文中，将参考几个实施方案和附图来描述本公开。提供以下实施方案和附图仅用于说明目的，而不是用于限制由所附权利要求限定的本公开的目的。
实施例
实施例1材料和方法
1.基因克隆
1-1.APB-A1((抗CD40L scFv)2-抗HSA Fab结构)克隆
使用标准基因重组方法进行基因克隆。hu5c8 scFv(SEQ ID NO：5)通过适合哺乳动物细胞的密码子优化合成(Cosmo Genetech，Korea)。使用从Macrogen(Seoul，Korea)商购的引物进行克隆，并通过聚合酶链式反应(PCR)将合成的hu5c8 scFv通过柔性接头的方式分别与SL335重链和轻链的N-末端连接，在pcDNA3.3和pOptiVEC载体(Thermo FisherScientific)上进行初始克隆。此后，通过在ExpiCHO-STM细胞系(Thermo FisherScientific，Waltham，Massachusetts)上的蛋白质表达鉴定克隆。接下来，为了从GS无效CHO K1细胞系(Horizon Discovery，Cambridge，UK)建立生产细胞系，使用动物细胞表达载体进行克隆，即重链的pd2535nt(Horizon Discovery)和轻链的pd2539(HorizonDiscovery)。在以下条件下进行PCR：95℃ 30秒、61℃ 30秒、72℃ 1分钟、共25个循环，最后延伸5分钟，然后降温至4℃。表1显示了通过将插入在pcDNA3.3和pOptiVEC载体的APB-A1重链和轻链基因分别克隆到pd2535nt和pd2539载体来产生重组载体的引物组。此外，pGL3c(1b)(Satorius)质粒载体被用作附加载体。
表1
Figure GDA0004041419740000561
Figure GDA0004041419740000571
具体而言，如上所述进行PCR，得到长度约1,600碱基对(bp)的APB-A1重链和轻链的PCR产物。PCR产物的重链和pd2535nt载体的末端用Bbs I(Thermo Fisher Scientific)处理；PCR产物的轻链和pd2539载体的5′末端用BsrG I(Thermo Fisher Scientific)处理，PCR产物的轻链和pd2539载体的3′末端用限制性内切酶Bbs I处理，然后用T4DNA连接酶(Takara，日本)处理。随后，通过对大肠杆菌施加热激，用产生的质粒转化大肠杆菌菌株DH5-α(RBC，Canada)，然后使用中提试剂盒(Macherey NagelTM，Germany)按照制造商的方案进行纯化，并用无核酸酶的水洗脱。允许APB-A1的重链和轻链分别具有SEQ ID NO：41和SEQID NO：42的氨基酸序列，其中这些氨基酸序列N-末端的第104个氨基酸对应于甘氨酸(G)或谷氨酰胺(Q)。
1-2.APB-B1((抗CD40L scFv)2-(抗HSA Fab)-(抗TNF-α Fv))克隆
(1)合成了与人血清白蛋白结合的SL335的Fab基因、与CD40L结合的鲁普利单抗的scFv基因和生物活性效应基因。生物活性效应物可以是抗TNF-α Fv(具有SEQ ID NO：6的重链和SEQ ID NO：7的轻链的赛妥珠单抗)或抗TNF-α dsFv(具有SEQ ID NO：8的重链和SEQID NO：9的轻链的赛妥珠单抗)、抗IL-23Fv(具有SEQ ID NO：10的重链和SEQ ID NO：11的轻链的优特克单抗(ustekinumab))或抗IL-23dsFv(具有SEQ ID NO：12的重链和SEQ ID NO：13的轻链的优特克单抗)、或抗IFNAR1 Fv(具有SEQ ID NO：14的重链和SEQ ID NO：15的轻链的阿尼弗鲁单抗(anifrolumab))、或抗IFNAR1 dsFv(具有SEQ ID NO：39的重链和SEQ IDNO：40的轻链的阿尼弗鲁单抗)。表2、3和4提供了用于产生APB-B1的PCR引物组(Macrogen，Korea)。
表2
Figure GDA0004041419740000581
表3
Figure GDA0004041419740000591
表4
Figure GDA0004041419740000601
为了扩增各scFv、Fab、dsFv和Fv基因，使用Taq DNA聚合酶(Takara，Japan)使用T100TM热循环仪(Bio-Rad，Hercules，California)进行30个循环的PCR，每个循环在以下条件下进行：94℃ 1分钟、60℃ 1分钟和72℃ 1分钟。接下来，将相应的链式反应产物按(scFv)2-Fab-Fv或(scFv)2-Fab-dsFv形式组装，组装PCR在以下条件下循环进行：94℃ 1分钟、60℃1分钟和72℃ 1分30秒。通过PCR获得的重链组装产物和pD2535NT载体(HorizonDiscovery，United Kingdom)用Bbs I限制酶(Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts)处理；轻链组装产物和pd2539载体(Horizon Discovery)用Bbs I和Bsr GI限制酶(New England Biolabs，Ipswich，Massachusetts)处理。使用T4 DNA连接酶(Takara)将用相应的限制酶处理的链式反应组装产物与质粒载体彼此组装，并将组装产物放入经CaCl2处理的可溶性感受态细胞中，然后应用热激进行转化。接着，使用含有卡那霉素抗生素的培养基筛选转化的克隆。
此外，为了产生重组人CD40L(rhCD40L-his)，以与上述相同的方式进行克隆测定法。使用由Cosmo Genetech合成的重组人CD40L基因(SEQ ID NO：38)，并使用限制酶Xba I(Takara)和Not I(Takara)克隆到
Figure GDA0004041419740000613
Figure GDA0004041419740000614
载体(Thermo Fisher Scientific)。
(2)使用CHO细胞通过瞬时表达产生蛋白质。为了产生基于SAFA的双特异性抗体和重组人CD40L蛋白样品，将ExpiCHO细胞(Thermo Fisher Scientific)在37℃、140rpm、5％CO2和80％湿度的条件下在摇动孵育箱中孵育，使用ExpiCHO表达培养基(Thermo FisherScientific)。为了产生瞬时表达细胞，将细胞在浓度为6.0×106细胞/ml的条件下接种到125ml培养瓶中，使用ExpiFectamine CHO转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将质粒载体pD2535NT和pD2539(其中插入了鉴定的3条序列的基因(赛妥珠单抗、优特克单抗和阿尼弗鲁单抗)重链和轻链)以及插入重组人CD40L基因的载体
Figure GDA0004041419740000612
转染到接种的细胞中。将在摇动孵育箱中孵育16小时的细胞用ExpiCHO进料和增强剂处理，然后在相同条件下在孵育箱中孵育3天。在孵育的第3天，对ExpiCHO进料进行额外处理，并在32℃、140rpm、5％CO2且湿度不低于80％的条件下孵育。在孵育的第9天，收集培养基，然后在4,000rpm、15分钟和4℃的条件下离心，从而从培养基中分离细胞。将分离的培养基通过0.2μm过滤片过滤，从而去除杂质。
2.细胞系的产生
2-1.用于APB-A1的GS无效CHO K1细胞系
使用谷氨酰胺合成(GS)无效的CHO K1细胞系(Horizon Discovery)。使用补充有4mM L-谷氨酰胺(Gibco，Thermo Fisher Scientific)的CDfortiCHO(Thermo FisherScientific)培养基，将培养基在80％湿度、5％CO2和37℃的条件下在125rpm的摇动孵育箱中孵育。根据Horizon Discovery提供的标准方案的修改程序，使用FreestyleTMMax试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)进行转染。使用总共37.6μg质粒载体，通过共转染1∶1至1：3(pd2539：pd2535nt)比例的轻链和重链进行转染。转染2天后，取出孵育的细胞，转移到50ml锥形管(Nunc，Denmark)中离心，然后溶解在不含L-谷氨酰胺的CDfortiCHO培养基中，接着用COUNTESS II自动细胞计数器(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)鉴定细胞浓度和活力。添加50μM甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)，并进行部分选择。此后，再过2天，向添加了MSX的细胞中加入10μg/ml嘌呤霉素(Gibco)，然后孵育48小时。接着，将孵育的细胞用不含L-谷氨酰胺的培养基析出(dissolved)溶解，使得沉淀细胞浓度为0.5×106细胞/ml，然后将MSX和嘌呤霉素一起加入进行总选择。然后，保持细胞浓度不超过2.0×106细胞/ml，进行孵育直至细胞活力达到90％或更高，从而产生细胞系。
2-2.用于APB-B1的GS无效CHO-K1细胞系
在浓度为3.0×105细胞/ml的条件下制备接种到补充有4mM谷氨酰胺的CDFortiCHO(Thermo Fisher Scientific)培养基的HD-BIOP3 GS无效CHO-K1细胞(HorizonDiscovery)，在37℃、5％CO2且湿度不低于80％的条件下在摇动孵育箱中进行接种培养，持续1天。为了转染，将细胞以4.8×105细胞/ml的浓度接种，在孵育1天，最后配制浓度为1.0×106细胞/ml。使用OptiPRO SFM培养基和Freestyle max试剂(Invitrogen，Carlsbad，California)，将含有序列鉴定的、与赛妥珠单抗相关的基于SAFA的双特异性抗体的重链和轻链基因的质粒载体(pD2535NT和pD2539)转染到接种细胞中，然后在37℃、5％CO2且湿度不低于80％的条件下孵育2天。将孵育的细胞全部转移到不含L-谷氨酰胺的CD FortiCHO培养基中，然后每隔2天用50μm硫氨酸亚砜亚胺(MSX)(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)和10μg/ml嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)处理，从而去除不含载体的细胞。然后，以7至10天的间隔使用离心机除去预先存在的培养基，然后更换为含有MSX和嘌呤霉素的CDFortiCHO培养基，并进行21天的孵育，以保持细胞数量为5.0×105细胞/ml。21天后，当细胞活力为70％或更高时，进行培养以维持细胞数为3.0×105细胞/ml，当细胞活力为90％或更高时开始传代培养生产，产生传代培养0(零)原液，并持续至产生原液3。
3.蛋白质的分离、纯化和分析
3-1.APB-A1蛋白
(1)ELISA
rhCD40L，一种根据本公开制备的重组hCD40L抗原(AprilBio，Chuncheon，SouthKorea)，使用碳酸盐过夜包被缓冲液(pH 9.6)在4℃以100ng/孔的浓度包被在96孔MaxiSorp ELISA板(Nunc)上。通过在室温下用封闭缓冲液(Starting BlockTM(PBS)(ThermoFisher Scientific))处理3小时来封闭板。用洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水+0.1％tween20；0.1％PBST)洗涤后，用稀释缓冲液(0.1％PBST+0.3％BSA；0.3％PBA)连续稀释由GS无效CHOK1细胞产生的重组抗体(具有抗CD40L scFv)2-抗HSA Fab结构，称为APB-A1)的上清液，并在室温下反应1小时。缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人Fd抗体(SouthernBiotechnology，Birmingham，Alabama)用作二抗，四甲基联苯胺(TMB)底物(BD science，Franklin Lakes，New Jersey)用于发光。使用ELISA酶标仪(BMG Labtech，德国)在450nm处测量吸光度。进行PK ELISA，使得rhCD40L抗原在PBS(Roman Industries，Japan)中以1μg/ml的浓度稀释，然后在4℃以100μl的体积过夜包被在ELISA板上。次日，每孔加入封闭缓冲液(含有0.3％BSA的PBS，300μl)，25℃封闭3小时，将标准样品和QC样品转移至各孔，体积为100μl，在25℃反应1.5小时。用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤3次后，将抗人轻链山羊IgG-生物素(猴吸附；Immuno-Biological Laboratories，Japan)以100μl/孔的浓度接种到每个孔中，在25℃反应1小时。随后，洗涤4次后，Pierce高灵敏度链霉亲和素-HRP(Thermo FisherScientific)在相同体积和时间条件下反应，然后洗涤。接下来，将1-step ultra TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)以100μl的体积转移到每个孔中，并在室温下反应5分钟。接着，加入1mol/L硫酸(Wako Pure Chemical，Japan；100μl/孔)作为终止溶液，随后使用微孔板混合器以600rpm混合10秒，并在450至650nm处测量吸光度。
(2)蛋白质纯化
使用WAVE生物反应器(GE Healthcare)将表达产生的APB-A1的GS无效CHO K1细胞系在CDfortiCHO培养基中孵育11天，将所得上清液和细胞沉淀在4℃以4,000rpm离心20分钟，用0.2μm过滤器过滤培养上清液。APB-A1蛋白通过3步色谱法纯化。首先，使用CaptureSelect IgG-CH1亲和基质树脂(Life Technologies)进行亲和色谱法步骤。用5个柱体积(CV)的PBS清洗基质后，以20ml/min的流速进行样品结合。为了去除靶蛋白以外的蛋白质，使用4个CV的高盐洗涤缓冲液(PBS，500mM NaCl，pH 7.4)和2个CV的低盐洗涤缓冲液(25mM磷酸钠，pH 7.6)，以流速25ml/分钟进行洗涤步骤。将洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0，150mM氯化钠)以20ml/min的流速通过基质，收集具有UV 50mAU或更高峰值的蛋白质溶液，然后转移至250ml容器冷藏1小时。通过添加1M tris-HCl(pH 8.0)溶液中和收集的蛋白质溶液，并使用0.2μm过滤器除去杂质，从而洗脱APB-A1。接下来，使用用25mM磷酸钠(pH7.6)溶液平衡的CaptoTM SP ImpRes树脂进行阳离子交换纯化。将用无菌蒸馏水稀释4倍的亲和色谱洗脱样品以5ml/min的流速偶联到柱上，使用洗脱缓冲液(25mM磷酸钠，pH 7.6，1M氯化钠)进行30％-50％-100％的洗脱步骤。收集各步骤的洗脱液，使用0.2μm过滤器除去杂质。随后，使用基于POROS的阴离子交换50HQ树脂进行阴离子交换纯化。首先，将洗涤缓冲液(2M氯化钠)以3ml/min的流速通过以清洗树脂柱，将5CV的20mM磷酸钠(pH 6.5)溶液通过树脂柱进行平衡。为了使杂质与树脂结合，用20mM的磷酸钠，pH 6.5缓冲液对样品进行透析，并调整pH水平和盐浓度。样品以5ml/min的流速通过树脂柱，以收集蛋白质溶液，随后使用0.2μm过滤器去除杂质，对所得蛋白质进行定量和分析。
(3)蛋白质分析-SDS-PAGE
通过SDS-PAGE分析纯化的APB-A1蛋白。用于分析的样品缓冲液是LDS非还原性样品缓冲液(4x；Thermo Fisher Scientific)和通过向非还原性样品缓冲液中加入5％巯基乙醇制备的还原性样品缓冲液(4x)，将相应的样品缓冲液与样品混合，置于水浴中煮沸5分钟，然后在非还原性煮沸和还原性条件下进行分析。另外，将非还原性样品缓冲液(4x)与样品以1：4的比例混合，在不进行热处理的未煮沸的条件下进行分析。将蛋白质样品以1μg/孔的浓度加载到4至15％梯度凝胶(Bio-Rad，Hercules，C alifornia)上，然后在150V下电泳50分钟，从而进行SDS-PAGE分析。电泳后分离的凝胶用Ez-Gel染色液(DoGenBio，SouthKorea)染色1小时，然后用水脱色。
(4)蛋白质分析-高效液相色谱法(HPLC)
为了评估纯化蛋白质的大小和纯度，使用prominence HPLC(Shimadzu，Japan)和TSK gel Ultra SW聚集柱(Tosoh Bioscience，Japan)进行SE-HPLC(尺寸排阻高效液相色谱法)。样品用100mM Na2HPO4、100mM Na2SO4、和0.05％(w/v)NaN3(pH 6.7)稀释，将50μg稀释的样品通过自动样品进样器在15℃下进样，然后使用流动相(200mM磷酸盐，pH 6.7，0.05％(w/v)NaN3(流速：0.5ml/min)洗脱。在280nm波长处测量UV吸光度。
(5)蛋白质分析-质谱法
使用LC-ESI MS光谱法测量还原和非还原APB-A1的分子量，然后组合DionexUHPLC(Thermo Fisher Scientific)和Q-TOF 5600+MS/MS系统(AB SCIEX，CA，USA)进行分析。使用Acquity
Figure GDA0004041419740000651
BEH1 30 C4，1.7μm柱，使流动相[乙腈(ACN；J.T.Baker)]以300μl/min的流速通过色谱柱，以测量APB-A1的重链(H)和轻链(L)的质量。
(6)蛋白质分析-等电聚焦(IEF)
(4)为评估纯化蛋白质的等电点，使用等电聚焦凝胶(pH 3至10)测量分离蛋白质的pl值。将1μg、3μg和5μg样品以1mg/ml的密度加载到凝胶上后，在100V 1小时、200V 1小时和500V 2小时下进行等电聚焦，并进行12％三氯乙酸(TCA)染色和考马斯亮蓝(CBB)染色，然后使用ImageMasterTM 2D Platinum(GE healthcare，5.0版本)进行分析。
(7)蛋白质分析-电荷变体分析
为了分析APB-A1的电荷变体，使用Protein-Pak HiRes CM进行离子变化色谱法。通过自动样品进样器在30℃下进样20μg蛋白质样品，然后使用流动相[25mM 2-(Nmorpholino)乙磺酸(MES)，500nM NaCl，pH 6.5]洗脱，梯度为0到40％，持续30分钟。流速为0.3ml/min，在280nm波长处测量UV吸光度。
3-2.APB-B1蛋白质
(1)分离和纯化
为了纯化存在于CHO细胞培养基中的双特异性抗体蛋白质样品，使用CaptureSelect IgG-CH1亲和基质树脂(Life Technologies，Carlsbad，California)和AKTA纯150L仪器(GE Healthcare，Chicago，Illinois)以以下方式进行亲和色谱法(AC)。使磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)缓冲液通过树脂填充柱用于平衡，分离含有从瞬时表达的细胞中表达的蛋白质的培养基，然后以1.5ml/分钟的流速通过树脂柱。此后，使含有500mM NaCl的PBS，pH7.4的缓冲液通过柱以洗涤非特异性结合树脂的物质。每种材料的平衡和洗涤步骤均采用10个柱体积(CV)进行。为了从树脂中洗脱基于SAFA的双特异性抗体，使用含有150mM NaCl的20mM柠檬酸，pH 3.0缓冲液。洗脱的缓冲液用1M Tris-HCl(pH 8.0)处理以中和至具有中性pH水平，并使用微孔板分光光度计(BMG LABTECH，Germany)在A280 nm波长下测量纯化蛋白质的浓度。为了纯化双特异性抗体蛋白样品，在亲和色谱法之后，使用Qsepharose HP树脂(GE Healthcare)以以下方式进行阴离子交换色谱法(AEX)。使约10CV的20mM其中未添加NaCl的柠檬酸盐，pH 6.0缓冲液通过Qsepharose HP树脂，进行平衡后，使通过亲和色谱法初步纯化的蛋白质通过树脂，然后回收未与树脂结合的蛋白质。使用微孔板分光光度计仪器在A280nm波长下测量回收蛋白质的浓度。为了分离对应于(scFv)2-Fab-dsFv的二聚体大小的蛋白质(即含有二硫键的基于SAFA的双特异性抗体)，和对应于单体大小的蛋白质(完整形式)，通过填充CM sepharose FF树脂(GE Healthcare)进行阳离子交换色谱法(CEX)。在纯化之前，使用20mM其中未添加NaCl的柠檬酸，pH 6.0结合缓冲液透析通过亲和色谱法纯化的蛋白质来进行预处理步骤。使约10CV的结合缓冲液以1.0ml/min的流速通过树脂填充柱进行平衡，然后以相同的流速处理预处理的蛋白质并使其与树脂反应。接下来，使5Cv的结合缓冲液以相同的流速通过柱，并进一步处理3CV的添加100mM NaCl的结合缓冲液，从而洗涤并去除非特异性结合物质。接着，通过添加结合缓冲液(添加了120mM NaCl)，从树脂中洗脱以单体形式存在的双特异性抗体蛋白。在A280 nm处测量纯化蛋白质的浓度。为了纯化重组人CD40L蛋白样品，使用ProfinityTM IMAC(Bio-Rad)，HitrapQ HP，5mi(GE Healthcare)；Hitrap SP HP，5ml(GE Healthcare)树脂；和AKTA pure 150L仪器进行三步色谱法。首先，20mM磷酸钠pH 7.2缓冲液用于平衡和洗涤三种树脂。为了洗脱蛋白质样品，在亲和色谱法中使用了20mM的磷酸钠，pH 7.2缓冲液，其中含有500mM眯唑(Sigma)。在阴离子色谱法和阳离子色谱法中使用15mM磷酸钠，pH 7.4缓冲液(其中含有1MNaCl)纯化蛋白质样品。使用微孔板分光光度计在A280 nm处测量纯化蛋白质的浓度。
(2)SDS-PAGE分析
首先，用非还原性4x SDS样品缓冲液(Thermo Fisher Scientific)和含有2-巯基乙醇的还原性样品缓冲液稀释纯化的双特异性抗体蛋白样品。在非还原性条件的情况下，为了根据热处理比较蛋白质类型和大小，制备了在100℃加热5分钟的样品和未加热的样品，为了比较大小，蛋白质大小标志物(SMOBio，中国台湾)和(scFv)2-Fab蛋白样品一起处理。将制备的蛋白质样品以2μg/孔的密度加载到4-15％的15孔Miniprotein TGX预制凝胶(Bio-Rad)上，并在tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液中以150V进行电泳1小时。电泳完成后，SDS-PAGE凝胶用EZ-Gel染色液(DoGenBio，South Korea)染色1小时，在蒸馏水中脱色1天。
(3)蛋白质解链温度分析
为了评估双特异性抗体蛋白样品的热稳定性，使用疏水染料(5，000x，SYPROOrange)和Light Cycler 480II(Roche，Switzerland)以实时PCR仪器分析了蛋白质解链温度。将蛋白质样品在磷酸钠pH 7.0缓冲液中稀释为300μg/ml的浓度，然后与5x试剂和SYPROOrange染料置于ultraAmp PCR板(Sorenson Bioscience，Salt Lake City，Utah)，直至每孔的最终浓度达到5.4μg/孔。接着，将激发滤光片和发射滤光片分别设置为465nm和580nm，在20℃至85℃范围内以1℃/min的速率升温，根据温度评价蛋白质的变性。
(4)尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)
使用柱T SKgel UltraSW Aggregate 7.8x 300mm(Tosoh Bioscience，Japan)和1260infinity II LC系统(Agilent Technologies，Santa Clara，California)作为HPLC仪器分析纯化的双特异性抗体的纯度。在样品分析之前，用100mM的20mM柠檬酸(pH 5.5)缓冲液平衡柱和HPLC仪器。待分析的样品用20mM柠檬酸，pH 5.5缓冲液稀释，并将样品以高达25μg的密度加载到柱上。在流速为0.7ml/min、最大压力限制为120bar的条件下进行30分钟SE-HPLC分析，在A280nm处测定吸光度。
(5)酶联免疫吸附试验(ELISA)
为了评估纯化的双特异性抗体样品与人血清白蛋白(Sigma-Aldrich)、重组人CD40L蛋白和重组人TNF-α蛋白(BioLegend，San Diego，California)的结合反应，进行了ELISA。将人血清白蛋白、CD40L和TNF-α蛋白以1μg/mi浓度在碳酸钠pH 9.6缓冲液中稀释，然后将每100μl接种到96孔maxisorp板(Nunc，Denmark)的每个孔中，然后在4℃包被一天。完全去除未包被的蛋白质和缓冲液，然后通过向各孔加入各300μl含有3％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich)和0.1％tween-20的PBS，pH 7.4缓冲液进行封闭。封闭2小时后，通过反复进行完全去除添加的缓冲液的步骤进行洗涤，添加各300μl含有0.1％tween-20PBS(pH 7.4)的缓冲液(PBS-T)，然后去除缓冲液，共3次。去除洗涤后剩余的水后，将各抗体在含有0.3％牛血清白蛋白和0.1％tween-20的PBS pH 7.4缓冲液(0.3％PBA)中10倍系列稀释，浓度从100nM降低到1.0×10-4nM，每孔加入100μl稀释的抗体样品，使其在室温下反应2小时。以与上述相同的方式洗涤后，将HRP缀合的山羊抗人Fd抗体(SouthernBiotechnology，Birmingham，Alabama)用0.3％PBA缓冲液以1：4,000稀释，将100μl的各稀释的抗体样品加入到每个孔中，然后在室温下反应1小时。为了评估洗涤后抗体的抗原特异性结合反应，加入TMB底物(BD Bioscience，Franklin Lakes，New Jersey)并使其反应，并使用微孔板分光光度计在A450nm处测量吸光度。
(6)生物层干涉(BLI)测定法
使用Octet Red仪器(Forte Bio，Fremont，California)通过生物层干涉(BLI)评估双特异性抗体和单个的单特异性抗体对人血清白蛋白、CD40L和TNF-α的抗原亲和力。首先，使用pH 5.0的乙酸钠缓冲液，将TNF-α蛋白(30μg/ml)、CD40L蛋白(10μg/ml)和人血清白蛋白(20μg/ml)固定在胺反应性第二代(AR2G)生物传感器(Forte Bio)上，未固定的物质用1M乙醇胺(pH8.5)去除，并允许双特异性抗体在系列稀释的浓度下反应，然后测量各个抗原的结合和解离常数。此外，为了评估双特异性抗体同时与三种抗原的结合能力，使用pH 5.0的乙酸钠缓冲液将CD40L蛋白(10μg/ml)固定在AR2G生物传感器上，并按双特异性抗体(3.2μg/ml)、人血清白蛋白(13.2μg/ml)、人血清白蛋白(13.2μg/ml)和TNF-α(2μg/ml)的顺序测量结合能力。使用DataAnalysis8软件对评估结果进行分析。
(7)流式细胞仪分析
为了鉴定双特异性抗体和细胞膜CD40L的结合，使用FACSVerse仪器(BDBiosciences，Franklin Lakes，NJ)进行流式细胞术分析。在含有10％胎牛血清(ThermoFisher Scientific)的RPMI1640(Thermo Fisher Scientific)中孵育在细胞表面表达细胞膜CD40L的D1.1细胞(CRL-10915，ATCC，Manassas，Virginia)，以制备3.0×105个细胞/管，并用0.3％PBA缓冲液洗涤两次。使基于SAFA的双特异性抗体和对照抗体分别与洗涤的细胞在4℃下反应30分钟并洗涤两次，然后向其加入以1∶1,000稀释的与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的山羊抗人kappa抗体(LifeSpan BioSciences，Inc.，Seattle，Washington)，随后在4℃反应30分钟。接下来，重复洗涤步骤两次，并使用FACSVerse仪器评估抗体与细胞膜CD40L的结合反应。
实施例2：APB-A1
1-1：使用生物层干涉进行结合测定法
人血清白蛋白(HSA)(Sigma-Aldrich)与SL335之间以及rhCD40L抗原与APB-A1之间的实时结合测定法使用配备有Octet RED系统的生物层干涉进行。为了评估HSA结合亲和力，将20μg/ml的HSA和10μg/ml的rhCD40L固定在AR2G生物传感器(pH 5.0)上，使用动力学缓冲液(1M乙醇胺，pH 8.5)从生物传感器表面除去未结合的分子。为了确定APB-A1与HSA和rhCD40L的结合亲和力，在10nM至0.3125nM的浓度范围内进行实验。为了确定双特异性结合，将rhCD40L抗原固定在AR2G生物传感器上，APB-A1在确定浓度下首先反应，然后与HSA结合。使用Octet QK软件获得结合和解离动力学。计算结合速率常数，使得观察到的结合曲线拟合至1∶1结合模型。
1-2：确定APB-A1蛋白与表达CD40L的细胞结合或不结合
为了确认APB-A1蛋白与CD40L表达细胞D1.1细胞结合，由江原国立大学药学院进行流式细胞术。将D1.1细胞离心除去上清液，然后以1.0×106细胞/ml的浓度重悬于MACS缓冲液(含有0.5％BSA，2mM EDTA的1x PBS，0.22μm过滤)中。将100μl(1.0105细胞/测试)各浓度的细胞接种到1.5ml管中后，在4℃、500x g条件下离心5分钟，从而去除上清液。将APB-A1、hu5c8 IgG1和SL335在5个时间点以十分之一(1/10)连续稀释，每次从1μg/ml的量开始，用移液管将各100μl的第一稀释抗体转移到1.5ml管的细胞沉淀中，然后在4℃孵育30分钟。将MACS缓冲液以各500μl加入相应的管中，然后在4℃、500x g和5分钟的条件下通过离心洗涤。除去上清液后，通过将各50μl以1∶1000稀释的山羊抗人kappa-FITC样品加入MACS缓冲液(Lifespan Biosciences，Washington，Seattle)中溶解细胞沉淀，然后在4℃孵育30分钟，再次重复洗涤步骤。除去上清液后，通过加入200μl 0.4％多聚甲醛(含有PFA的PBS)缓冲液溶解细胞沉淀，4℃保存固定，用BD FACS verse仪器分析细胞。
1-3：体外CD40-CD40L抑制分析
为了分析APB-A1抑制CD40-CD40L相互作用的效力，使用HEKBlueTMCD40L报告细胞(InvivoGen，San Diego，California)，并使用表达mCD40L和rhCD40L的D1.1细胞作为CD40L供体。使用添加和未添加20M HSA的含有0.2％牛血清白蛋白的Dulbecco′s PBS缓冲液(Corning)，并将APB-A1、hu5c8 IgG1和SL335从浓度200nM按三分之一(1/3)开始稀释。将稀释后的样品各20μl接种到96孔细胞培养板(Corning)后，以1×104细胞/孔的等体积加入D1.1细胞，在37℃、5％CO2条件下的孵育箱中孵育3小时。接下来，以5×104细胞/孔的密度添加HEKBlueTMCD40L细胞，然后在相同条件下的孵育箱中孵育21小时。24小时后，使用多移液管(multi-pipette)将上清液各40μl从板转移到其他96孔EIA/RIA板(Corning)上。每孔加入各160μl QUANTI-BlueTM溶液(InvivoGen)，用箔包裹遮光，并保存在37℃ CO2孵育箱1小时，然后使用分光光度计测量655nm处的吸光度。将各70μl的300ng/ml rhCD40L抗原加入到含有70μl稀释样品的试管中，该稀释样品是以相同浓度通过从200nM开始将三个样品按三分之一稀释(1/3)而获得的，然后使其在37℃、CO2孵育箱中反应30分钟。接下来，将HEKBlueTMCD40L细胞稀释至终浓度为3.125×105细胞/ml后，将560μl稀释的细胞加入到含有混合了rhCD40L抗原的样品的试管中，颠倒试管，然后将细胞以200μl/孔的浓度接种到96孔细胞培养板中。以与D1.1细胞相同的方式孵育21小时，使所得细胞与底物反应，从而评估吸光度。
1-4：血小板聚集测定法
富含血小板的人血浆(PRP)从事先知情同意的正常健康志愿者获得，由韩国红十字血液中心(KRBC)(大韩民国)提供。在酸-柠檬酸盐葡萄糖溶液(0.8％柠檬酸、2.2％柠檬酸钠、2.45％葡萄糖)中抗凝处理的PRP以120x g离心10分钟以消除红细胞，然后以360x g离心15分钟得到板沉淀。血小板溶解在贫血小板血浆(PPP)中，最终浓度为5.0×108/ml，所有步骤均在室温下(23±2℃)下进行。为了评估血小板聚集，使用Chrono-log聚集计(
Figure GDA0004041419740000711
Figure GDA0004041419740000712
Havertown，Pennsylvania)进行透光聚集度法。在将免疫复合物(IC)，即，rhCD40L+hu5c8 IgG1(30μg/ml+60ng/ml)；rhCD40L+APB-A1(30μg/ml+40ng/ml)；或rhCD40L、hu5c8 IgG1和APB-A1中的每种在37℃下放置在5至10mM CaCl2中2分钟后，在次优浓度的ADP
Figure GDA0004041419740000713
Figure GDA0004041419740000714
下、在连续搅拌的条件下刺激PRP5分钟。聚集反应完成后，将血小板混合物离心，根据制造商的说明书，使用血清素EIA试剂盒(LaborDiagnostikaNord，Germany)从上清液中测量血清素的释放。
1-5：药代动力学(PK)分析和药效学(PD)分析
(1)PK分析
为了评估APB-A1的血清半衰期，对食蟹猴模型[Shin Nippon BiomedicalLaboratories(SNBL，Japan)]进行了药代动力学分析。通过单次静脉注射将APB-A1蛋白以5mg/kg(第1组)或20mg/kg(第2组)的剂量施用给每组3只食蟹猴(雄性)。施用后，从共17个时间点收集血液样品：施用前1个时间点；和施用后16个时间点：施用后0.25、1、2、6和24小时、4、7、10、13、16、19、22、25、28、34和40天。通过ELISA测量每只食蟹猴的血小板中存在的APB-A1浓度。
(2)PD分析
分析了APB-A1的抗破伤风类毒素(TT)抗体反应抑制功效(Southern Research，Birmingham，Alabama)。向食蟹猴(雌性；n＝3/组)静脉施用共4组样品：载体(阴性对照组：20mmol/L磷酸钠，pH 6.5)、地塞米松(DXT)(阳性对照组)、和APB-A1(5mg/kg和20mg/kg)。首先，为了诱导抗TT抗体反应，在第1天首次肌肉内施用TT(5Lf)，然后在第20天肌肉内第二次施用，用于加强。DXT共注射4次，每次剂量1mg/kg，即，在第一次TT注射前2天、和第一次TT注射后第1、5、8天，APB-A1注射一次，在第一次TT注射的时候(第1天)。在注射前收集待分析的血液样品，在第10、12、14、16、20、27、30和40天，通过ELISA测量抗TT IgG抗体值。为了分析二抗反应，通过免疫表型分型对多种B细胞进行了免疫表型分型。在TT注射后约2小时、TT注射后第20、27、30和40天共5次收集血液样品，将收集的血液样品储存在含有K2-EDTA的试管中，以防止未注射部分的血液凝固。使用针对标志物的抗体组进行免疫表型分型，所述标志物例如CD45、CD20、CD27、Ki67和IgD，并且四个细胞组的预定部分用于免疫表型分型，包括：CD45+/20+；CD45+/20+/Ki67+；CD45+/20-/27hi/IgD-；和CD45+20+/27+IgD-/Ki67+。
实施例3：APB-B1
1-1：用小鼠L929细胞测试抑制TNF-α介导的细胞毒性的作用
为了比较双特异性抗体和亲本抗体(赛妥珠单抗Fab′)的可溶性TNF-α蛋白抑制能力，使用在细胞表面表达TNF受体的L929小鼠细胞和重组可溶性TNF-α蛋白。将L929细胞(Korean Cell Line Bank)与含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、5％CO2且湿度不低于80％的条件下的孵育箱中孵育。将L929细胞在5.0×104细胞/孔的浓度条件下铺板在96孔细胞培养板(Corning Inc.，New York City，New York)，然后在相同条件下的孵育箱中孵育24小时。孵育24小时后，除去现有培养基，每孔中用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成1μg/ml浓度的放线菌素D(Sigma-Aldrich)处理，然后在37℃、5％CO2且湿度不低于80％的条件下的孵育箱中反应30分钟。接着，在每个孔中用根据不同浓度系列稀释的抗体处理，然后用10ng/ml浓度的重组可溶性TNF-α蛋白处理，然后在37℃、5％CO2且湿度不低于80％的条件下的孵育箱中反应24小时。反应24小时后，使用多通道移液管将10μlCCK-8(Dojindo，Japan)转移到含有相应反应物的孔中进行处理。反应2小时后，用移液管将上清液转移到另一板上，在A450 nm波长处测定吸光度。
1-2：使用CD40L HEK-blueTM报告细胞的CD40L和TNF-α的抑制
分析了双特异性抗体和亲本抗体(鲁普利单抗IgG1和赛妥珠单抗Fab′)对细胞膜CD40L和可溶性TNF-α蛋白之一或两者的同时抑制能力。为此，使用表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的CD40L HEK-BlueTM报告细胞(InvivoGen，San Diego，California)进行分析，通过与CD40L和TNF-α、细胞表面表达细胞膜CD40L的D1.1细胞和重组可溶性TNF-α蛋白反应。CD40L HEK-BlueTM细胞与含有10％胎牛血清和抗生素(Normocin、杀稻瘟菌素和Zeocin)的DMEM(Thermo Fisher Scientific)培养基在37℃、5％CO2且湿度不低于80％的孵育箱中孵育。使用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基在相同条件下在孵育箱中孵育D1.1细胞。接下来，将D1.1细胞在5.0×104细胞/孔的浓度条件下铺板到96孔细胞培养板上，或将重组可溶性TNF-α蛋白以10ng/ml的浓度铺板到96孔细胞培养板中。为了评估对两种样品的同时结合反应，将D1.1细胞和重组可溶性TNF-α蛋白一起铺板到96孔细胞培养板中。将系列稀释的样品(用人血清白蛋白预处理)在96孔细胞培养板上处理，铺板细胞和重组蛋白中的一种或两种，然后在37℃、5％CO2且湿度不低于80％的条件下的孵育箱中反应3小时。反应3小时后，在板的所有孔中以5×104细胞/孔的浓度处理CD40L HEK-BlueTM细胞，然后在相同条件下的孵育箱中反应21小时。接下来，将在37℃水浴中反应30分钟的各160μlQUANTI-Blue试剂(SEAP检测试剂，InvivoGen)接种到新的96孔细胞培养板的所有孔中，然后将在孵育箱中反应21小时的40μl反应溶液放入含有Quanti-Blue试剂的每个孔中，然后进行反应。在37℃孵育箱中反应1小时后，在655nm波长处测量吸光度。
实施例4结果
1.APB-A1的实验结果
(1)APB-A1的表达和生产
为了生产APB-A1，通过连接PCR连接hu5c8 scFv(VL+VH)-柔性接头(SEQ ID NO：3-GGGGSGGGGSGGGGS；接头1)-SL335 Fd(VH+CH1)(称为APB-A1重链)基因、hu5c8 scFv(VL+VH)-柔性接头(SEQ ID NO：4-GSTSGSGKPGSGEGSTKG；接头2)-SL335 kappa(VL+CL)(称为APB-A1L轻链)基因。分别克隆到pcDNA3.3和pOptiVEC载体后，将基因转染到ExpiCHO-STM细胞系瞬时表达，通过蛋白质印迹鉴定是否正常表达101.7kDa-APBA1(APB-A1 H链；50.7kDa-483个氨基酸和APB-A1 L链；50.9kDa-478个氨基酸)。接下来，为了在CHO细胞中稳定表达，将APB-A1H和APB-A1 L基因分别克隆到pd2535nt和pd2539载体，以产生重组载体(图1A)，经氨基酸测序确认未发现异常(图1B)。图1A代表插入pd2535nt和pd2539载体的APB-A1重链和轻链。图1B表示APB-A1 H(总共483个氨基酸)和APB-A1 L(总共478个氨基酸)的氨基酸序列，它们是具有通过接头1和接头2连接的hu5c8 scFv的SL335 H和SL335 L。使用前将重组载体转染到GS无效CHO K1细胞中，并使用MSX和嘌呤霉素筛选，从而建立稳定的CHO细胞系。为了生产用于体外和体内评估效果的APB-A1蛋白，在生物反应器中培养稳定的CHO细胞系，获得上清液，并通过总共三个步骤进行纯化，包括亲和色谱法、阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。第一步通过亲和色谱法得到APB-A1蛋白，产率大于95％，第二步和第三步使用阳离子和阴离子交换色谱步骤去除杂质和内毒素，得到APB-A1样品，产率82％。接下来，为了评估蛋白质的纯度，在天然条件下进行SE-HPLC，总共重复3次的实验结果证实了完美的APB-A1样品的纯度为95％或更高，图2A代表重复实验之一。为了鉴定通过纯化方法获得的样品的纯度和分子量，将获得的样品在还原、非还原(煮沸)和非还原(未煮沸)条件下通过SDS-PAGE进行分析(图2B)。同样地，图2A表示通过HPLC鉴定的APB-A1特征的分析结果，图2B表示通过SDS-PAGE鉴定的APB-A1特征的分析结果。在还原(R)、非还原(煮沸)(NR(B))和非还原(未煮沸)(NR(NB))条件下通过(A)HPLC和(B)SDS-PAGE鉴定从纯化的GS无效CHO K1细胞培养基的上清液中纯化的APB-A1的特征。在图2A的HPLC分析中，在阴性条件下(无DTT)通过SE-HPLC分析蛋白样品。纯度为95％或更高。在图2B所示的SDS-PAGE凝胶中，通过Ez-gel染色溶液使蛋白质条带可视化。如上所述，APB-A1 H(50.7kDa)和APB-A1 L多肽(50.9kDa)的理论分子量分别为50.7kDa和50.9kDa。在还原(R)条件下，鉴定出两条分子量大小约为50kDa的蛋白质条带，但由于APB-A1 H和L多肽的分子量彼此非常相似，因此很难准确区分两条条带(图2B的泳道R)。在非还原(煮沸)条件下，相比于在还原条件下，在较小尺寸的位置处鉴定出两条条带[图2B的泳道NR(B)]，并且蛋白质印迹证实两条条带中APB-A1 H条带的位置略高于APB-A1 L条带(数据未显示)。在非还原(未煮沸)条件下，证实鉴定出的APB-A1具有小于其理论分子量大小(101.6kDa)的分子量大小[图2B的泳道NR(NB)]。
(2)APB-A1的分子特征
为了准确测量APB-A1蛋白的质量，在还原和非还原条件下进行了Q-TOF分析。APB-A1的重链(H)和轻链(L)的测量质量分别为50.77kDa和50.98kDa(图3)。在图3中，使用质谱仪(ProteomeTech，South Korea)鉴定纯化的APB-A1蛋白的特征。在质谱分析中，蛋白质样品在还原和非还原条件下进行分析。APB-A1重链和轻链的理论分子量分别为50,777Da和50,994Da，这与本实施例的质谱分析测得的值基本相同。考虑到APB-A1没有N-连接的糖基化位点，如使用糖基化预测软件所证实的、并且通过Q-TOF分析实际上未观察到除APB-A1 H和L峰以外的任何峰，因此预测APB-A1不包含N-连接的糖基化。使用pI分析软件得到的分析结果证实，APB-A1的理论pI值为8.65，pH 3-10的等电聚焦(IEF)和毛细管等电聚焦(cIEF)的实际测量值分别为9.16和9.2(图4A和4B)。在图4A和4B中，纯化的APB-A1蛋白的pl分析由ProteomeTech进行。通过pH 3-10的等电聚焦(IEF)凝胶(示于图4A中)和毛细管等电聚焦(cIEF)(示于图4B中)鉴定的pI值分别为9.16和9.2。为了准确分析APB-A1的电荷变体，使用超高效液相色谱法(UPLC)反复进行电荷变体实验，UPLC测定法得到的峰谱显示76.3％的样品具有恒定电荷的主峰，4.6％有酸性峰，19.1％有碱性峰(图5)。
(3)APB-A1的体外功能特征
为了评估APB-A1与HSA和rhCD40L抗原的结合亲和力，使用Octet Red仪器进行了生物层干涉测量。评估结果证实APB-A1对HSA和rhCD40L抗原的解离常数KD分别为748pM和127pM。因此，证实了APB-A1-HSA的平衡解离常数(KD)大约是SL335-HSA KD的2.6倍(分别为748pM和286pM)，APB-A1-rhCD40L解离常数大约是hu5c8 IgG1-rhCD40L KD的2.6倍(分别为127pM和49.6pM)。
为了证实APB-A1与HSA和rhCD40L抗原的结合亲和力，使用Octet Red仪器再次进行了生物层干涉测量。评估结果证实APB-A1对HSA和rhCD40L抗原的平衡解离常数(KD)分别为628pM和186pM。表5中提供了两个结果的平均值。
表5
Figure GDA0004041419740000761
此外，为了确定APB-A1同时与HSA和rhCD40L抗原结合，进行了生物层干涉测量，使rhCD40L抗原固定在AR2G生物传感器上，并使APB-A1和HSA依次与其反应。结果，证实了APB-A1能够同时结合HSA和rhCD40L抗原(图6)。对于基于细胞的体外评估，使用表达mCD40L的D1.1细胞，作为初步实验，通过流式细胞术分析确定APBA1和作为对照组的hu5c8 IgG1是否与D1.1细胞表达的mCD40L结合。根据分析结果，确认了作为阴性对照组的SL335不与D1.1细胞的mCD40L结合，而APB-A1和hu5c8 IgG1结合(图7)。在图7中，使APB-A1(a)和hu5c8 IgG1(b)与表达mCD40L的D1.1细胞结合，不与D1.1细胞结合的SL335(c)用作阴性对照组。接下来，为了鉴定APB-A1抑制CD40-CD40L相互作用的效力，将HEKBlueTMCD40L报告细胞与D1.1细胞或含有或不含有HSA的rhCD40L抗原结合，然后通过向其中加入APB-A1、hu5c8 IgG1和SL335(浓度范围为0.01至22.2nM)进行反应，然后测量报告细胞的碱性磷酸酶(AP)反应(图8A至8D)。在图8A至8D中，在没有HSA的情况下，APB-A1和hu5c8 IgG1抑制CD40L-CD40相互作用的能力分别为0.9907nM和0.289nM(图8B)，在HSA存在下分别为1.031nM和0.4729nM(图8A)。在没有HSA的情况下，APB-A1和hu5c8 IgG1对可溶性CD40L和CD40之间相互作用的抑制能力的IC50值为1.031nM和0.4729nM(图8D)，在HSA存在下分别为0.6371nM和0.501nM(图8C)。在使用报告细胞和D1.1细胞组合的实验中，APB-A1表现出低的抑制效力，在没有HSA的情况下，抑制效力比hu5c8 IgG1低约3倍，而在HSA存在下，APB-A1和hu5c8 IgG1表现出基本相同的抑制效力(图8A和8B)。类似地，在使用报告细胞和rhCD40L抗原组合的实验中，在没有HSA的情况下，APB-A1的抑制效力比hu5c8 IgG1低约2.1倍，而在HSA存在下，APB-A1和hu5c8 IgG1表现出基本相同的抑制效力(图8C和8D)。同时，用作阴性对照的SL335在任何条件下均未显示出抑制效力(图8A-8D)。在使用D1.1细胞的情况下，代表CD40L-CD40相互作用抑制能力的IC50值源自图8A和8B所示的结果，在没有HSA的情况下为0.9907nM；在HSA存在的情况下为0.2988nM。作为阳性对照的hu5c8 IgG1的IC50值被确定为约0.2至0.3nM，表明HSA的存在或不存在不影响hu5c8 IgG1的IC50值(图8A和8B)。当使用rhCD40L抗原时，在不存在HSA的情况下IC50值为1.031nM，在HSA存在的情况下为0.6371nM，hu5c8 IgG1的IC50值被确定为约0.47至0.5nM，这与上述实验中的结果基本相同(图8C和8D)。
(4)APB-A1对血小板聚集作用的分析
确定了APB-A1是否引起血小板聚集，血小板聚集通常被认为是常规抗CD40L IgG抗体典型副作用。为此，制备rhCD40L hu5c8 IgG1 IC和rhCD40L+APB-A1 IC，然后使其与由ADP刺激的血小板反应，从而通过测量透射率确定血小板聚集的发生。结果表明，只有rhCD40L hu5c8 IgG1 IC强烈刺激血小板聚集(图9A至9D)。在图9A至9D中，PRP与hCD40L(30μg/ml)和不同浓度(6ng/ml、60ng/ml和600ng/ml)的hu5c8 IgG1或不同浓度(4ng/ml、40ng/ml和400ng/m1)的APB-A1，在5至10mM CaCl2存在下在37℃预培养2分钟。接下来，用低于最佳浓度的浓度的ADP进一步刺激血小板，同时不断搅拌。在样品hu5c8 IgG1+rhCD40L IC的情况下，发生了血小板聚集(图9A和9B)，但在样品rhCD40L+APB-A1的情况下血小板聚集率较低(图9C和9D)。数据代表至少6个不同供体的实验的标准偏差(SD)。为了定量分析图9A至9D表示的结果，计算血小板聚集％，计算结果表明样品rhCD40L+hu5c8 IgG1 IC在60ng/ml和600ng/ml的浓度下表现出约80％或更高的反应，而样品rhCD40L+APB-A1在400ng/ml浓度下显示低于约10％的血小板聚集(图9D)。此外，测定了血小板被激活时释放的血清素浓度，评估结果表明，血清素释放水平没有随着rhCD40L+APB-A1和其他样品组的激活而增加，而rhCD40L+hu5c8 IgG1 IC激活使血清素释放水平增加至约300pg/ml(图10)。在图10中，在重组rhCD40L+hu5c8 IgG1的情况下，释放的血清素的量增加，但在其他组中未观察到显著差异。数据代表四次或更多次独立实验的平均值±标准偏差(SD)(与IC(重组hCD40L+hu5c8IgG1)对照相比，＊＊*p＜0.001)。
(5)APB-A1的药代动力学研究
为了评估APB-A1的体内半衰期，使用食蟹猴模型(n＝3/组)进行了药代动力学测定法。通过单次静脉注射施用5mg/kg和20mg/kg两种剂量的APB-A1。在与材料和方法部分相同的时间点收集血液样品后，使用PK ELISA测量血浆中APB-A1的浓度(图11)。在图11中，将纯化的APB-A1抗体以各种浓度(5mg/kg和20mg/kg)注射到雄性食蟹猴(n＝3)。实验由SNBL进行。通过ELISA测量各点样品的APB-A1浓度，数据代表所进行实验的平均值。使用PhoenixWinNonlin软件(6.4版本；Certara LP，Princeton，NJ，USA)使用基于ELISA结果的数据计算半衰期，5mg/kg APB-A1和20mg/kg APB-A1的半衰期被分别确定为约7天和9.6天。因此，可知APB-A1的半衰期在20mg/kg的剂量下比在5mg/kg的剂量下长约1.4倍。在5mg/kg和20mg/kg的剂量下，Cmax值分别为143μg/ml和509μg/ml，肾清除(CL)率分别为4.44ml/天/kg和4.72ml/天/kg，其水平相似，与剂量无关(表6)。
表6
Figure GDA0004041419740000791
(6)APB-A1药效学测定法
为了评估APB-A1的体内效力，使用食蟹猴(n＝3/组)进行药效学研究。首先，向动物肌内注射TT两次以诱导第一和记忆抗TT抗体免疫反应，向每只动物静脉内施用载体(阴性对照，单剂量注射)、阳性对照(DXT；1mg/kg，4剂量注射)和APBA1(5mg/kg或20mg/kg，单剂量注射)，并通过ELISA测量血清中产生的抗TT IgG抗体浓度。结果，虽然单剂量TT注射诱导的第一次抗TT IgG免疫反应没有统计学意义，载体对照诱导了正常的第一次抗TT IgG免疫反应，然而，在DXT和APB-A1注射组中未观察到第一次抗TT IgG免疫反应(图12A)。在图12A和12B中，为了分析记忆抗体反应的抑制，将破伤风类毒素(TT)注射到载体、DXT和APB-A1(5mg/kg和20mg/kg)的雌性食蟹猴(n＝3)。实验由SNBL进行。(A)通过ELISA测量抗TT抗体水平。(B)在5mg/kg APB-A1和20mg/kg APB-A1组中，记忆B细胞百分比显著降低(*p＜0.03与载体对照相比，t检验)。在首次TT注射后20天，为了诱导记忆性抗TT IgG免疫反应，进行了第二次TT注射，然后测量血清中产生的抗TT IgG抗体的浓度。结果，在第二次TT注射后，载体对照组和DXT组出现了正常的抗TT IgG免疫反应，APB-A1注射组在第27天显示剂量依赖方式的抑制第二次抗TT IgG免疫反应的统计学上显著的作用。从最初的CD40-CD40L反应证实APB-A1具有抑制效力，并通过免疫表型分型比较了各组的群百分比。记忆B细胞(CD45+20+/27+IgD-/Ki67+)和B细胞的分裂群(CD45+/20+/Ki67+)在第二次TT注射后第27天显示出统计学上显著的APB-A1抑制效力(图12B)。在浆细胞(CD45+20-/27hi/IgD-)和总B细胞(CD45+/20+)的测定法中，证实组间没有差异，并且载体对照的整体抑制作用在第30天和第40天逐渐降低(数据未显示)。
2.APB-B1的实验结果
(1)基于SAFA的双特异性抗体的产生
为了产生基于SAFA的双特异性抗体，用丝氨酸(Ser)取代在重链CH1(铰链区，EPKSC-)和轻链CL(NRGEC-)之间形成链间二硫键的半胱氨酸，使用得到的SL335 Fab的突变体形式，EPKSS-和NRGES-，其中去除了两个链间二硫键。使用(GGGGS)3或GSTSGSGKPGSGEGSTKG肽接头，将结合人CD40L的scFv抗体片段[具有源自鲁普利单抗(或hu5c8)的VH和VL基因序列]融合至SL335 Fab的重链和轻链N-末端，并且使用肽接头，将结合TNF-α的Fv抗体片段(具有源自赛妥珠单抗的VH和VL基因序列)、结合IL-23的Fv抗体片段(具有源自优特克单抗的VH和VL基因序列)、和结合INFAR1的抗体片段(具有源自阿尼弗鲁单抗的VH和VL基因序列)分别融合至SL335Fab的C-末端。在Fv融合的情况下，将C-末端重链VH片段和C-末端轻链VL片段融合。为了根据在Fv的VH和VL片段之间形成的人工链间二硫键的存在与否来比较抗体功能，用VH的G44C(G542C，图14)和VL的Q100C(Q593C，图13A)取代不具有二硫键的(scFv)2-Fab-Fv形式，从而分别产生具有二硫键的(scFv)2-Fab-dsFv形式。在图13A和13B中，通过(GGGGS)3(SEQ ID NO：3)和GSTSGSGKPGSGEGSTKG肽接头连接APB-B1a(a)，(scFv)2-Fab-Fv构建体和APB-B1b(b)，(scFv)2-Fab-dsFv构建体，所述构建体具有抗CD40LscFv、抗HSA Fab和抗TNF-α Fv(有或没有二硫键)。(scFv)2-Fab-dsFv包含抗TNF-α dsFv片段的可变轻链(VL)和可变重链(VH)之间的链间二硫键(ss)，而(scFv)2-Fab-Fv不包含链间二硫键。图13C是表示DNA克隆后的重组pD2539和重组pD2535NT的图。在此，与源自赛妥珠单抗的Fv和dsFv融合的双特异性抗体分别被称为APB-B1a和APB-B1b(图13A和13B)。
在图14中，对于APB-B1b的重链和轻链之间的链间二硫键，重链中的G542C残基和轻链中的Q593C残基以粗体表示。肽接头[(GGGGS)3和GSTSGSGKPGSGEGSTKG]的残基加下划线。由此产生的基于SAFA的双特异性抗体蛋白具有高达128kDa的理论大小，并且为了利用CHO细胞表达系统，将两个多肽编码基因(N′-抗CD40L scFv-SL335 H链-抗TNF-αVH-C′和N′-抗CD40L scFv-SL335 L链-抗TNF-α VL-C′)构建的APB-B1a或APB-B1b分别克隆到作为哺乳动物表达载体的pD2535NT和pD2539载体，从而产生重组pD2535NT和重组pD2539载体(图13C)。以与上述相同的方式克隆源自优特克单抗和阿尼弗鲁单抗基因的基于SAFA的双特异性抗体，从而产生重组pD2535NT和重组pD2539载体(数据未显示)。
为了产生基于SAFA的双特异性抗体蛋白，将所生产的重组pD2535NT和重组pD2539载体、ExpiCHO细胞和HD-BIOP3 GS无效CHO-K1细胞用于瞬时表达和稳定池生产。将重组CHO细胞在烧瓶中培养7至9天，然后离心，从而获得细胞存活率为90％的培养基。关于瞬时表达中的表达量，在源自赛妥珠单抗、优特克单抗和阿尼弗鲁单抗基因的所有三种基于SAFA的双特异性抗体中，没有二硫键的(scFv)2-Fab-Fv构建体的表达量是具有二硫键的(scFv)2-Fab-dsFv构建体的1.5到3倍。在烧瓶中培养用稳定池产生的APB-B1a片段7天，产量约为150mg/L。
(2)基于SAFA的双特异性抗体的产生
为了比较通过亲和色谱法纯化的基于SAFA的双特异性抗体的大小和模式，在还原和非还原条件下进行了SDS-PAGE分析，如图15所示。在还原条件下，在60至75kDa的位置观察到蛋白质条带，这与(scFv)2-Fab-Fv和(scFv)2-Fab-dsFv片段的各重链和轻链scFv-FabH链-Fv VH和(scFv-Fab L链-Fv VL)的理论大小一致，即64kDa(图15A)，在45至60kDa的位置鉴定到(scFv)2-Fab的重链和轻链条带(图15A)。同时，在非还原(煮沸)条件下，在60至75kDa的位置观察到两条蛋白质带，其对应于在重链和轻链之间没有形成链间二硫键的(scFv)2-Fab-Fv的重链和轻链，与还原条件的情况一样；在其重链和轻链之间形成二硫键的(scFv)2-Fab-dsFv的情况下，在100至140kDa的位置观察到单个蛋白质条带，落在理论大小128kDa的范围内(图15B)。在非还原(未煮沸)条件下，在(scFv)2-Fab-Fv的情况下，在大小约为130kDa的位置观察到一条带，其对应于重链和轻链大小的总和，并且在60至75kDa范围内的位置处，意想不到地观察到离散定位的重链和轻链的两条蛋白质条带，与非还原(煮沸)条件的情况类似(图15C)。图15A、15B和15C分别代表在还原、非还原和非还原(未煮沸)条件下进行的SDS-PAGE分析的结果。将四个基于SAFA的样品，包括(1)(scFv)2-Fab，(2)赛妥珠单抗相关的BsAb(APB-B1)，(3)优特克单抗相关的BsAb，(4)阿尼弗鲁单抗相关的BsAb，以至多2μg的不同量加载到每个孔中。图15D代表纯化的(scFv)2-Fab-Fv(至多25μg)构建体的尺寸排阻HPLC分析。(scFv)2-Fab-dsFv的二聚体用箭头表示。在(scFv)2-Fab-dsFv构建体的情况下，没有看到重链和轻链的离散定位条带，而在100至140kDa范围内的位置处观察到两条条带，并且在类似于或高于245kDa的位置处鉴定到大概对应于(scFv)2-Fab-dsFv二聚体的位置的蛋白质条带。为了确定非还原(未煮沸)条件的SDS-PAGE结果，通过SE-HPLC分析了均处于天然条件下的(scFv)2-Fab-Fv和(scFv)2-Fab-dsFv蛋白，分析结果表明(scFv)2-Fab-dsFv蛋白包含少量(scFv)2-Fab-dsFv二聚体，与SDS-PAGE结果类似(箭头指示)。在(scFv)2-Fab-Fv的情况下，峰仅出现在单体位置，并且未观察到对应于重链和轻链的峰，其通过SDS-PAGE鉴定为离散定位(图15D)。因此，如在非还原(未煮沸)条件下的SDS-PAGE实验中的(scFv)2-Fab-Fv蛋白样品所示，离散定位的多肽重链和轻链被认为是由于存在于重链和轻链之间的非共价键的部分切割而观察到两条带，这是由SDS-PAGE实验中存在的SDS或实验过程中传递给蛋白质的热量引起的。
(3)基于SAFA的双特异性抗体蛋白的纯化
在纯化通过亲和色谱法分离的APB-B1a和APB-B1b蛋白之前，使用SDS-PAGE和SE-HPLC分析蛋白样品(图15A至15D)。去除在APB-Blb的二聚体位置鉴定的蛋白质(高达245kDa)(图15C和15D)，使用CM琼脂糖FF树脂进行阳离子交换色谱法。对于仅通过亲和色谱法鉴定的高纯度APB-Bla蛋白样品，使用Q琼脂糖HP进行阴离子交换色谱法。使用AKTA纯的150L系统进行各个纯化步骤，并通过SE-HPLC确定最终纯化产物。亲和色谱法后产生的未去除的二聚体位置的APB-B1b蛋白通过阳离子交换色谱法进一步去除(图16B)，并且在保留时间点鉴定到峰，这与APB-B1a的峰相似(图16A)。在图16A和16B中，在TSKgel UltraSW聚集柱(在20mM柠檬酸，pH 5.5缓冲液中)、在280nm下、在天然条件下分析基于SAFA的构建体。通过CaptureSelect IgG-CH1亲和以及Q琼脂糖HP阴离子交换色谱法纯化APB-B1a(a)。通过CaptureSelect IgG-CH1亲和以及CM琼脂糖FF阳离子交换色谱法纯化APB-B1b(b)。
(4)根据二硫键的存在比较蛋白质稳定性和蛋白质稳定性的最佳pH缓冲液
为了根据Fv的链间二硫键的存在与否比较(scFv)2-Fab-Fv和(scFv)2-Fab-dsFv的蛋白稳定性，在磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中从20℃至90℃逐渐加热处理三种源自赛妥珠单抗、优特克单抗和阿尼弗鲁单抗基因的基于SAFA的双特异性抗体，使用与疏水氨基酸偶联的SYPRO Orange染料、通过实时PCR方法测量蛋白质变性温度。结果表明，三种基于SAFA的双特异性抗体的Fv克隆不同，蛋白质变性温度不同，但证实了(scFv)2-Fab-Fv和(scFv)2-Fab-dsFv在相同温度下变性，无论是否存在二硫键(表7a)。为了检测有助于APB-B1蛋白储存稳定性的最佳缓冲液，以与上述相同的方式测量蛋白质变性温度，在3.0至11.0pH的条件下、在20℃至90℃的范围内逐渐升高的解链温度下对蛋白质进行热处理(表7b和图17)。在图17中，取纯化的APB-B1a和APB-B1b蛋白各1mg/ml，置于各种缓冲液中，在4℃孵育1天，并使用Light Cycler 480II(RT-PCR)和SYPRO Orange染料进行分析。结果，在各种pH条件下，无论Fv中是否存在二硫键，蛋白质都表现出相同的变性温度。此外，在较低的pH水平(3.0至4.0)和高pH水平(9.0至11.0)的条件下，蛋白质的变性在相对较低的温度开始。然而，在极端酸性或碱性条件下，如pH水平3.0或11.0时，蛋白质的变性在4℃的温度开始。具有最高热稳定性结构的APB-B1蛋白样品的pH水平为5.0至7.0，并且APB-B1蛋白在pH6.0的条件下，在柠檬酸、组氨酸和磷酸钠缓冲液中都表现出最高的热稳定性(Tm＝61℃)(表7b)。
表7a
Figure GDA0004041419740000831
Figure GDA0004041419740000841
表7b
Figure GDA0004041419740000842
(5)基于SAFA的双特异性抗体的抗原特异性和亲和力的测定
纯化的APB-B1a和APB-B1b双特异性抗体与三种不同抗原，即HSA、CD40L和TNF-α结合的结合亲和力通过ELISA和BLI测定(图18A至18C和表8)。在图18A至18C中，三种靶蛋白，即人血清白蛋白(图18A)、CD40L(图18B)和TNF-α(图18C)以1μg/ml的密度包被在96孔MaxiSorp板上。允许APB-B1a、APB-B1b和亲本抗体在pH7.4时与靶标结合。HRP缀合的山羊抗人Fd抗体用作二抗。使用ELISA酶标仪在450nm处分析数据。*亲本抗体：抗HSA Fab(SL335)、抗CD40L IgG(鲁普利单抗)、抗TNF-αIgG(阿达木单抗)和抗TNF-α Fab(赛妥珠单抗)。ELISA结果显示，与用作对照的SL335 Fab相比，APB-B1a或APB-B1b与人血清白蛋白的结合强度降低至约2至3倍(图18A)，并且在使用BLI评估亲和力时，测量了APBB1a、APB-B1b和SL335 Fab对人血清白蛋白的平衡解离常数(KDs)，分别为765pM、809pM和286pM(表8)。在评估APB-B1a和APB-B1b抗体的CD40L结合能力时，这两种双特异性抗体显示出比作为亲本抗体的抗人CD40LIgG1(鲁普利单抗)低约1.5倍的结合能力(图18B)，测量了APB-B1a、APB-B1b和亲本抗体的结合亲和力，KD值分别为192pM、167pM和49pM(表8)。如通过ELISA所测量的，APB-B1a和APB-B1b的TNF-α抗原亲和力比亲本抗体αFab′的TNF-α抗原亲和力低1.5至2倍(图18C)，如通过BLI所测量的，APB-B1a、APB-B1b和亲本抗体的结合亲和力分别为164pM、446pM和157pM的KD值(表8)，这与如上所述通过ELISA和BLI所评估的那些KD值的模式相似。
此外，为了鉴定APB-B1a同时结合三种抗原的能力，进行了BLI(表8)。500nM CD40L在AR2G生物传感器中反应，以固定在传感器上，25nM APB-B1a反应以与固定的CD40L结合。接下来，使人血清白蛋白以比APB-1a高多达10倍的浓度与APB-1a反应，使APB-B1a的白蛋白结合位点饱和，并允许相同浓度的人血清白蛋白与50nM TNF-α反应。结果示于图19中。在图19中，将pH 5.0，10μg/ml乙酸钠缓冲液中的重组人CD40L固定在AR2G生物传感器上。以3.2μg/ml的浓度加载APB-B1a(结合1)。以13.2μg/ml的浓度加载HSA(结合2)，以13.2μg/ml和2μg/ml的浓度加载HSA和TNF-α(结合3)。每个结合步骤进行900秒。使用Octet DataAnalysis8软件分析数据。
表8
Figure GDA0004041419740000861
在表8中，使用Octet RED仪器分析纯化的APB-B1a和APB-B1b的结合亲和力。将pH5.0乙酸钠缓冲液中含有的浓度为20μg/ml、10μg/ml和30μg/ml的相应抗原HSA、CD40L和TNF-α固定在胺反应性第二代(AR2G)生物传感器上。纯化的抗体在pH 7.4的1×动力学缓冲液中连续处理，进行两倍稀释。使用Octet Data Analysis8软件分析数据。*亲本抗体：抗HSA Fab(SL335)、抗CD40L IgG1(鲁普利单抗)和抗TNF-α Fab′(赛妥珠单抗)。
(6)基于SAFA的双特异性抗体与细胞膜CD40L蛋白的结合
FACSVerse鉴定了纯化的基于SAFA的双特异性抗体的抗CD40LscFv是否会特异性结合在细胞表面表达的细胞膜CD40L以及可溶性CD40L。结果，证实了基于SAFA的双特异性抗体能够结合细胞膜CD40L，与作为亲本抗体的抗人CD40L IgG1相似(图20)。在图20中，以3.0×105细胞/反应的浓度制备D1.1细胞，FITC缀合的山羊抗人kappa抗体用作二抗，来检测基于SL335的构建体、SL335 Fab(阴性对照组)和抗CD40L IgG(阳性对照组)。使用FASCVerse流式细胞仪测量通过细胞计数指示的结合信号。
(7)基于SAFA的双特异性抗体的基于细胞的抑制能力评估
为了确定APB-B1a和APB-B1b是否能够抑制TNF-α的生物学功能，使用表达细胞膜TNF受体并在放线菌素D存在的情况下以TNF-α依赖性方式表现出对细胞的细胞毒性的L929小鼠细胞评估体外抑制能力(图21)。在图21中，将TNF-α样品系列稀释3倍，浓度从20nM降低至0.24nM，然后在放线菌素D存在下使其与在细胞膜上表达TNF受体的L929小鼠细胞反应和TNF-α(10ng/ml)。使用抗TNF-α-Fab′(赛妥珠单抗)作为阳性对照组。使用细胞计数试剂盒8测量细胞活力。通过添加可溶性TNF-α(10ng/ml)和系列稀释的抗体，即，SL335 Fab、APB-B1a、APB-B1b和作为亲本抗体的抗TNFa Fab′来评估抑制能力。因此，在人血清白蛋白(HSA)存在下，亲本抗体的半数最大抑制浓度(IC50)值为0.6259nM，APB-B1a和APB-B1b的IC50值分别为5.3nM和12.7nM，比亲本抗体低8到20倍。然而，SL335没有表现出抑制能力(图21)。因此，证实APB-B1a和APB-B1b保持其抑制TNFα-TNFR相互作用的能力。为了确定APB-B1a和APB-B1b是否能够在人血清白蛋白存在下同时与细胞表面表达的细胞膜CD40L和可溶性TNF-α结合，从而同时抑制CD40L-CD40和TNFα-TNFR的相互作用通路，使用表达细胞膜CD40和细胞膜TNF受体的HEK-blueTM CD40L报告细胞观察了同时的抑制能力。在图22A至22C所示，CD40L或TNF-α的抗体构建体连续稀释4倍，浓度从50nM至0.0122nM。抗CD40L IgG1和抗TNF-α均用作各自靶分子的对照组。使用QUANTI-Blue试剂测量HEK-blueTM报告细胞与CD40L或TNF-α反应表达的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，并在A655 nm处测量信号。APB-B1a和APB-B1的抑制能力是通过测量HEK-blueTM报告细胞对各种相互作用的反应来确定的，包括(a)表达CD40L的D1.1细胞和表达CD40的HEK-blueTM细胞之间的相互作用(图22A)，(b)表达TNF受体的HEK-blueTM细胞和可溶性TNF-α之间的相互作用(图22B)，(c)D1.1细胞与HEK-blueTM细胞之间以及HEK-blueTM细胞与可溶性TNF-α之间的相互作用(图22C)。确定了APB-B1a和APB-B1b对细胞膜CD40L的IC50值为0.15至0.18nM，亲本抗体(鲁普利单抗，IgG1)的IC50值为0.30nM(图22A)，APB-B1a和APB-B1b对可溶性TNF-α(10ng/ml)的抑制能力为3.05nM和4.13nM，比亲本抗体(赛妥珠单抗，Fab′)低6至8倍，亲本抗体为0.56nm，与使用L929小鼠细胞的实验相似(图22B)。在同时抑制细胞膜CD40L和可溶性TNF-α抗原的测定法中，APB-B1a和APB-B1b的IC50值为1.98nM和3.79nM，这意昧着这两种抗原都完全被APB-B1a和APB-B1b抑制(100％)。然而，亲本抗体抗TNF-αFab′只能抑制TNF-α抗原，这意昧着仅实现了约60％的总反应抑制。在CD40L IgG1的情况下，虽然CD40L IgG1能够抑制CD40L，但由于报告细胞对未抑制的TNF-α具有极高的SEAP活性，抗CD40L IgG1不能抑制任何反应，这类似于SL335 Fab(阴性对照)的情况。同时，当同时处理两种亲本抗体：抗TNF-α Fab′和抗CD40LIgG1(联合治疗)时，两种靶标完全被这两种亲本抗体抑制(100％)，类似于双特异性抗体的情况，测量的IC50值为0.47nM，比APB-B1高3到8倍。因此，尽管对CD40L的抑制能力水平相似，但由于两种抗体对TNF-α的抑制能力不同，因此认为两种抗体的抑制能力低于联合治疗的情况(图22C)。
实施例5另外的药代动力学和药效学分析
(1)PK分析
为了进一步评估APB-A1的血清半衰期，再次对食蟹猴模型[(SNBL，Japan)]进行了药代动力学分析。通过单次静脉注射将APB-A1蛋白以10mg/kg(第1组)或30mg/kg(第2组)的剂量施用给每组3只食蟹猴(雄性)中的每只。施用后，从总共14个时间点收集血液样品：施用前时间点1；以及以下13个时间点：施用后0.25、1、6、12和24小时以及4、8、13、19、26、33、40和47天。通过ELISA(SNBL，Japan)测量每只食蟹猴血清中存在的APB-A1的浓度。
(2)PD分析
分析了由APB-A1的功效抑制的抗钥孔戚血蓝蛋白(KLH)的抗体反应(SNBL，日本)。将共4组样品(载体(阴性对照组：20mmol/L L-组氨酸，HCI pH 5.8，5％蔗糖)和APB-A1(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg))静脉内施用于食蟹猴(雄性；n＝5/组)，每周一次(共2剂)。首先，为了诱导抗KLH抗体反应，在第-28天施用第一次皮下注射KLH(2mg/kg)，在第1天施用第二次皮下注射(大约在测试和对照物给药结束后1小时)，用于加强。在第二次KLH注射时(第1天)和一周后(第8天)共注射2次APB-A1。在第一次KLH注射之前(第-28天)、第-21天、第-14天、第-7天、第1天(在测试和对照物给药前约30分钟)、第4天、第8天(在测试和对照物给药前约30分钟)收集血液样品和对照品剂量)、第11天、第15天、第22天和第29天收集血液样品，通过ELISA测量抗KLH IgG和抗KLH IgM抗体滴度。为了分析外周血中的免疫表型分型，总共在6个时间点收集血液样品：在第一次KLH注射前(第-28天)、和第1天(在测试和对照物给药前约30分钟)、第4天、第11天、第22天和第29天。使用针对如CD45、CD20、CD27、CD38、CD3、CD4、CD8和Ki-67的标志物的抗体组进行免疫表型分型。对于PK分析，在第1、4、8、11、15、22和29天(共7点)收集血液样品。通过ELISA测量每只食蟹猴的血清中存在的APB-A1浓度。在尸检后的第二天修剪要进行免疫组织化学检查的器官，并在大体病理学后2天在自动包埋系统中进行处理。制备三个切片作为连续切片标本。第一个切片用苏木精-伊红(HE)染色，第二个和第三个切片用于免疫组织化学(IHC)检查。对于IHC，切片标本使用免疫酶法用以下抗体染色：小鼠抗CD20抗体(L26，Leica Biosystems，德国)和小鼠抗Ki67抗体(MIB-1，Dako Denmark A/S，丹麦)。对于统计分析，通过Bartlett检验分析数据的方差同质性。当方差同质时，进行Dunnett检验对对照组和每个测试物组之间进行多重比较。当通过Bartlett检验方差异质时，进行Dunnett型检验(Miller检验)对对照组和每个测试物组之间进行多重比较。
(3)2周重复剂量的毒理学研究
为了确定APB-A1治疗自身免疫疾病的潜在毒性，当通过静脉内(缓慢推注)注射给药2次时，间隔1周给予食蟹猴。本研究评估了以下参数和终点：临床观察、体重、临床病理参数(血液学、凝血、临床化学和尿液分析)、生物分析和大体尸检结果以及器官重量。
(4)结果
(1)APB-A1的另外的PK研究
为了评估APB-A1的体内半衰期，使用食蟹猴模型(雄性，n＝3/组)进行了药代动力学测定法。通过单次静脉注射施用10mg/kg和30mg/kg两种剂量的APB-A1。在与材料和方法部分相同的时间点收集血液样品后，使用PK ELISA测量血浆中APB-A1的浓度(图23)。数据代表进行的实验的平均值。使用Phoenix WinNonlin软件(6.4版本；Certara LP，Princeton，NJ，USA)使用基于ELISA结果的数据计算半衰期，10mg/kg APB-A1和30mg/kgAPB-A1的半衰期被分别确定为约9.33±1.54和10.1±1.8天。在10mg/kg和30mg/kg的剂量下，Cmax值分别为347μg/ml和1230μg/ml，清除(CL)率分别为3.48ml/天/kg和3.44ml/天/kg，其水平相似，与剂量无关(表9)。
表9.另外的猴PK数据
Figure GDA0004041419740000901
(2)APB-A1的另外的PD研究
在任何组中没有发现任何动物死亡或因处于垂死状态而被安乐死。在任何组中，均未发现在临床体征、体重或大体病理学方面与测试物相关的变化。在外周血的免疫表型分型中，注意到与对照组相比，30、10和/或3mg/kg组中的分裂的B细胞减少(图24A和24B)。在抗KLH抗体测量中，注意到与对照组相比，10和30mg/kg组在第8天至第29天的IgG抗体滴度降低(*P＜0.05，＊＊P＜0.01：显著不同于对照)(图25)，而在IgM抗体滴度中未注意到与测试物相关的变化(数据未显示)。在组织病理学和免疫组织化学检查中，观察到在第29天，在10和/或30mg/kg组中腋窝和下颌下淋巴结生发中心的细胞性、抗CD20阳性细胞和抗Ki67阳性细胞减少(图26)和表10)。在PK中，在第一次和第二次给药中，Cmax和AUC0-t值在3和30mg/kg组之间几乎与剂量成比例地增加(图27和表11)。
表10组织病理学和免疫组织化学检查
Figure GDA0004041419740000911
-：无异常改变 ±：非常轻 +：轻 2+：中度 3+：显著
表11 PD研究中的PK结果
Figure GDA0004041419740000912
Figure GDA0004041419740000913
2周重复剂量的毒理学研究
在接受APB-A1的雄性和雌性中，没有注意到过早死亡、体重、血液学、凝血、临床化学或尿液分析方面的临床观察或变化，也没有任何大体上的发现。在高达100mg/kg/剂量的剂量水平下，通过2次静脉内(缓慢推注)注射施用APB-A1，间隔1周，食蟹猴的耐受性良好。
在本公开中，已经证实，基于由本发明人开发的具有增加的体内持续性的双特异性抗体的现有技术，可以成功地产生新形式的多特异性抗体构建体。特别地，能够与CD40L、TNF-α或其他生物活性效应物结合的多特异性抗体可有效地用作各种自身免疫疾病的治疗剂。
具体实施方案的上述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以致其他人可以通过应用本领域技术内的知识容易地针对各种应用进行修改和/或改造，而不背离本发明的一般概念。因此，基于本文所呈现的教导和指导，此类改造和修改旨在落入所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据教导和指导来解释。
本发明的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来定义。
本文描述的所有各个方面、实施方案和选项可以以任何和所有变化形式组合。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地通过引用并入本文的程度相同。
工业适用性
本公开的多特异性抗体可用于开发具有延长的体内保留时间、同时具有降低的副作用如血栓栓塞的自身免疫疾病治疗剂。
                         序列表
<110>  艾普丽尔生物有限公司
<120>  多特异性抗体、包含其的组合物、及其载体和用途
<130>  2662-0001WO01
<150>  KR 10-2020-0009565
<151>  2020-01-24
<150>  16/878,255
<151>  2020-05-19
<160>  105
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  669
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  SL335重链DNA
<400>  1
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aagtcctcc                                                             669
<210>  2
<211>  645
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  SL335轻链DNA
<400>  2
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<210>  3
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223> 接头1
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>  4
<211>  18
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223> 接头2
<400>  4
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210>  5
<211>  794
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  hu5c8 scFv DNA
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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<212>  DNA
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<210>  11
<211>  324
<212>  DNA
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<223>  抗-IL-23 Fv, VL DNA
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<400>  12
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<210>  13
<211>  324
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<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 Fv, VH DNA
<400>  14
gaagttcagc tggtacaatc aggagccgaa gtaaagaagc caggcgaatc ccttaaaatc      60
tcttgcaagg gaagcggcta catatttact aattactgga tcgcatgggt tcgacagatg     120
ccaggcaaag gtctggagtc catggggata atataccctg gagacagtga catacgctat     180
tccccaagtt tccaaggaca agtgaccatt tctgctgata aaagcatcac aacagcctac     240
cttcaatggt catctcttaa ggcctctgac accgcaatgt actactgtgc tcgccacgat     300
attgaggggt tcgattactg ggggcggggc acccttgtta cagttagcag t              351
<210>  15
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 Fv, VL DNA
<400>  15
gagattgtac ttacccagtc tcctggcact ctgagtttga gtcccggcga gcgcgctacc      60
ctgagttgcc gagcttcaca gtccgtcagc tcttcattct tcgcttggta ccagcaaaaa     120
cctgggcagg ccccaagatt gcttatatat ggagcctcct cccgagcaac aggcatcccc     180
gaccgactca gcggttctgg atctggcacc gatttcactt tgacaattac ccggcttgag     240
cccgaggact ttgccgtata ttattgtcaa caatacgata gcagcgcaat tactttcggg     300
caagggactc gacttgagat taaacgt                                         327
<210>  16
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  正向引物APB-A1 H DNA
<400>  16
gatcaactct agagccacca tggagtggtc ctgggtc                               37
<210>  17
<211>  56
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  反向引物APB-A1 H DNA
<400>  17
aggaagacgc ttttagaggc ggccgctcag gaggacttgg gctccacctt cttatc          56
<210>  18
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  正向引物APB-A1 L DNA
<400>  18
gatcaactct agagccacca tggagaccca cagccag                               37
<210>  19
<211>  59
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  反向引物APB-A1 L DNA
<400>  19
aggaagacgc ttttagaggc ggccgctcag gactcccccc ggttaaagct cttggtcac       59
<210>  20
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物1
<400>  20
gatcaactct agagccacca tggagtggtc ctgggt                                36
<210>  21
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物2
<400>  21
ggaggacttg ggctccacct tcttatcgac                                       30
<210>  22
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物3
<400>  22
gtcgataaga aggtggagcc caagtcctcc                                       30
<210>  23
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物4
<400>  23
atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca                                       30
<210>  24
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物5
<400>  24
gatcaactct agagccacca tggagaccca cagccag                               37
<210>  25
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物6
<400>  25
ggactccccc cggttaaagc tcttggtcac                                       30
<210>  26
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物7
<400>  26
gtgaccaaga gctttaaccg gggggagtcc                                       30
<210>  27
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物8
<400>  27
atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca                                       30
<210>  28
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物9
<400>  28
tttaccgggg gcctgccgaa cccagttcat                                       30
<210>  29
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物10
<400>  29
gcccccggta aatgtctgga atggatgggg                                       30
<210>  30
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物11
<400>  30
atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca                                       30
<210>  31
<211>  70
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物12
<400>  31
ttcatgcggc cgcgaagacg cttttagatc accgcttaat ctcaactttt gttccacatc      60
caaatgtcag                                                             70
<210>  32
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物13
<400>  32
ttttccgggc atctgccgta cccacccaag                                       30
<210>  33
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物14
<400>  33
atgcccggaa aatgtctcga ttggataggg ataatg                                36
<210>  34
<211>  70
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物15
<400>  34
ttcatgcggc cgcgaagacg cttttagatc accgctttat ctccaatttt gttccacacc      60
cgaatgtata                                                             70
<210>  35
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物16
<400>  35
tttgcctggc atctgtcgaa cccatgcgat                                       30
<210>  36
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物17
<400>  36
atgccaggca aatgtctgga gtccatgggg                                       30
<210>  37
<211>  70
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物18
<400>  37
tacatgcggc cgcgaagacg cttttagatc aacgtttaat ctcaagtcga gtcccacacc      60
cgaaagtaat                                                             70
<210>  38
<211>  465
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  rhCD40L-his DNA
<400>  38
ggggatcaaa atcctcaaat cgctgctcac gtaattagtg aggcatcaag taagactacc      60
agcgtacttc aatgggccga gaagggctat tacactatgt caaacaacct cgtgaccctt     120
gagaacggca agcagctcac tgtaaagcgc cagggacttt attacattta tgcacaggtc     180
acattctgct caaaccggga ggcaagttca caggctccat ttatcgctag tttgtgtttg     240
aagagcccag ggagatttga gaggatactt ctccgagccg caaacaccca ttccagtgcc     300
aagccatgcg ggcagcagag catacatttg ggtggcgtgt ttgagctgca gcctggggca     360
tctgtattcg taaatgttac cgatccttct caagtttcac atggaacagg cttcacatct     420
ttcggccttc tgaaactggg ccaccaccat catcaccacc accat                     465
<210>  39
<211>  351
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 dsFv, VH DNA
<400>  39
gaagttcagc tggtacaatc aggagccgaa gtaaagaagc caggcgaatc ccttaaaatc      60
tcttgcaagg gaagcggcta catatttact aattactgga tcgcatgggt tcgacagatg     120
ccaggcaaat gtctggagtc catggggata atataccctg gagacagtga catacgctat     180
tccccaagtt tccaaggaca agtgaccatt tctgctgata aaagcatcac aacagcctac     240
cttcaatggt catctcttaa ggcctctgac accgcaatgt actactgtgc tcgccacgat     300
attgaggggt tcgattactg ggggcggggc acccttgtta cagttagcag t              351
<210>  40
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 dsFv, VL DNA
<400>  40
gagattgtac ttacccagtc tcctggcact ctgagtttga gtcccggcga gcgcgctacc      60
ctgagttgcc gagcttcaca gtccgtcagc tcttcattct tcgcttggta ccagcaaaaa     120
cctgggcagg ccccaagatt gcttatatat ggagcctcct cccgagcaac aggcatcccc     180
gaccgactca gcggttctgg atctggcacc gatttcactt tgacaattac ccggcttgag     240
cccgaggact ttgccgtata ttattgtcaa caatacgata gcagcgcaat tactttcggg     300
tgtgggactc gacttgagat taaacgt                                         327
<210>  41
<211>  483
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  APB-A1 重链
<400>  41
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
                85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
        115                 120                 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
            180                 185                 190
Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
        195                 200                 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
    210                 215                 220
Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
                245                 250                 255
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val
            260                 265                 270
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met
        275                 280                 285
Phe Arg Ala Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
    290                 295                 300
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr
305                 310                 315                 320
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
                325                 330                 335
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
            340                 345                 350
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp
        355                 360                 365
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
    370                 375                 380
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu
385                 390                 395                 400
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
                405                 410                 415
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
            420                 425                 430
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
        435                 440                 445
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
    450                 455                 460
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
465                 470                 475                 480
Lys Ser Ser
<210>  42
<211>  478
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  APB-A1轻链
<400>  42
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
                85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
        115                 120                 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
            180                 185                 190
Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
        195                 200                 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
    210                 215                 220
Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
                245                 250                 255
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
            260                 265                 270
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
        275                 280                 285
Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
    290                 295                 300
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly
305                 310                 315                 320
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
                325                 330                 335
Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
            340                 345                 350
Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu
        355                 360                 365
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
    370                 375                 380
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
                405                 410                 415
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
            420                 425                 430
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
        435                 440                 445
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
    450                 455                 460
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
465                 470                 475
<210>  43
<211>  735
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  hu5c8 scFv DNA连接到SL335重链可变域N末端
<400>  43
gatatcgtgc tgacccagtc tcctgccaca ctgagtgtgt ctccaggcga gagagccacc      60
atctcttgca gagcttccca gagagtgtcc tcctccacct actcctacat gcactggtat     120
cagcagaagc ccggccagcc tcctaagctg ctgattaagt acgcctccaa cctggaatcc     180
ggcgtgccag ccagattttc tggctctgga tctggcaccg acttcaccct gaccatcagc     240
tctgtggaac ctgaggactt cgccacctac tactgccagc actcttggga gatcccacct     300
acctttggcg gaggcaccaa gctggaaatc aaaagaggtg gcggaggatc tggcggtggt     360
ggttcaggcg gaggcggatc tcaggttcag ttggttcagt ctggcgccga ggttgtgaaa     420
cctggcgctt ctgtgaagct gtcctgcaag gcctccggct acatcttcac cagctactac     480
atgtactggg tcaagcaggc ccctggacag ggacttgagt ggatcggcga gatcaaccct     540
tccaacggcg acaccaactt caacgagaag ttcaagtcca aggctaccct gaccgtggac     600
aagtctgcct ccaccgctta catggaactg tctagcctga gaagcgagga caccgccgtg     660
tactactgca ccagatccga cggcagaaac gacatggatt cttggggcca gggcaccctg     720
gttacagttt cttct                                                      735
<210>  44
<211>  735
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  hu5c8 scFv DNA连接到SL335的轻链可变域N末端
<400>  44
gatatcgtgc tgacccagtc tcctgccaca ctgagtgtgt ctccaggcga gagagccacc      60
atctcttgca gagcttccca gagagtgtcc tcctccacct actcctacat gcactggtat     120
cagcagaagc ccggccagcc tcctaagctg ctgattaagt acgcctccaa cctggaatcc     180
ggcgtgccag ccagattttc tggctctgga tctggcaccg acttcaccct gaccatcagc     240
tctgtggaac ctgaggactt cgccacctac tactgccagc actcttggga gatcccacct     300
acctttggcg gaggcaccaa gctggaaatc aaaagaggtg gcggaggatc tggcggtggt     360
ggttcaggcg gaggcggatc tcaggttcag ttggttcagt ctggcgccga ggttgtgaaa     420
cctggcgctt ctgtgaagct gtcctgcaag gcctccggct acatcttcac cagctactac     480
atgtactggg tcaagcaggc ccctggacag ggacttgagt ggatcggcga gatcaaccct     540
tccaacggcg acaccaactt caacgagaag ttcaagtcca aggctaccct gaccgtggac     600
aagtctgcct ccaccgctta catggaactg tctagcctga gaagcgagga caccgccgtg     660
tactactgca ccagatccga cggcagaaac gacatggatt cttggggcca gggcaccctg     720
gttacagtgt ccagt                                                      735
<210>  45
<211>  223
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SL335 重链
<400>  45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
    210                 215                 220
<210>  46
<211>  215
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SL335轻链
<400>  46
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala
                85                  90                  95
Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
        115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
    130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
                165                 170                 175
Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
            180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
        195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
    210                 215
<210>  47
<211>  245
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  hu5c8 scFv
<400>  47
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
                85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
        115                 120                 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
            180                 185                 190
Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
        195                 200                 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
    210                 215                 220
Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>  48
<211>  245
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  hu5c8 scFv连接到SL335重链可变域N末端
<400>  48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
                85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
        115                 120                 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
            180                 185                 190
Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
        195                 200                 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
    210                 215                 220
Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>  49
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-TNF-alpha Fv, VH
<400>  49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  50
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-TNF-alpha Fv, VL
<400>  50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  51
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-TNF-alpha dsFv, VH
<400>  51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  52
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-TNF-alpha dsFv, VL
<400>  52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  53
<211>  119
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IL-23 Fv, VH
<400>  53
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  54
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IL-23 Fv, VL
<400>  54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  55
<211>  119
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IL-23 dsFv, VH
<400>  55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Cys Leu Asp Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  56
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IL-23 dsFv, VL
<400>  56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  57
<211>  117
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 Fv, VH
<400>  57
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Ile Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  58
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 Fv, VL
<400>  58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Phe Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Leu Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Ala
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  59
<211>  117
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 dsFv, VH
<400>  59
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Cys Leu Glu Ser Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Ile Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  60
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-IFNAR1 dsFv, VL
<400>  60
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Phe Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Leu Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Ala
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  61
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR1
<400>  61
Ser Tyr Gly Ile Ser
1               5
<210>  62
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR2
<400>  62
Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  63
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR3
<400>  63
Leu Gly His Cys Gln Arg Gly Ile Cys Ser Asp Ala Leu Asp Thr
1               5                   10                  15
<210>  64
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR2
<400>  64
Arg Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Arg Leu Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  65
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR1
<400>  65
Asn Tyr Gly Ile His
1               5
<210>  66
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR2
<400>  66
Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  67
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR3
<400>  67
Asp Val His Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Ala Phe Asp Ile
1               5                   10                  15
<210>  68
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR1
<400>  68
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>  69
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR2
<400>  69
Val Ile Ser His Asp Gly Gly Phe Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  70
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR3
<400>  70
Ala Gly Trp Leu Arg Gln Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>  71
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR1
<400>  71
Ala Tyr Trp Ile Ala
1               5
<210>  72
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR2
<400>  72
Met Ile Trp Pro Pro Asp Ala Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  73
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR3
<400>  73
Leu Tyr Ser Gly Ser Tyr Ser Pro
1               5
<210>  74
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR1
<400>  74
Ala Tyr Ser Met Asn
1               5
<210>  75
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR2
<400>  75
Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  76
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VH CDR3
<400>  76
Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>  77
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR1
<400>  77
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  78
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR2
<400>  78
Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ser
1               5
<210>  79
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR3
<400>  79
Gln Gln Ser Asp Ser Val Pro Val Thr
1               5
<210>  80
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR1
<400>  80
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  81
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR2
<400>  81
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>  82
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR3
<400>  82
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>  83
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR1
<400>  83
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Asn Tyr Val Ala
1               5                   10
<210>  84
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR2
<400>  84
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210>  85
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR3
<400>  85
Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Thr Trp Thr
1               5                   10
<210>  86
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR1
<400>  86
Arg Ala Ser Glu Thr Val Ser Ser Arg Gln Leu Ala
1               5                   10
<210>  87
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR2
<400>  87
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  88
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR3
<400>  88
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr
1               5
<210>  89
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR1
<400>  89
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala
1               5                   10
<210>  90
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR3
<400>  90
Gln Lys Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  91
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR1
<400>  91
Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  92
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR2
<400>  92
Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr
1               5
<210>  93
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白VL CDR3
<400>  93
Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala Lys Thr
1               5                   10
<210>  94
<211>  124
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,重链可变结构域 (VH结构域)
<400>  94
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Gly His Cys Gln Arg Gly Ile Cys Ser Asp Ala Leu Asp
            100                 105                 110
Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  95
<211>  124
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,重链可变结构域 (VH结构域)
<400>  95
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Arg Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Gly His Cys Gln Arg Gly Ile Cys Ser Asp Ala Leu Asp
            100                 105                 110
Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  96
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,重链可变结构域 (VH结构域)
<400>  96
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Thr Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Val His
65                  70                  75                  80
Val Gln Met Asp Ser Leu Arg Gly Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Val His Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Ala Phe
            100                 105                 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  97
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,重链可变结构域 (VH结构域)
<400>  97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Ser Val Ile Ser His Asp Gly Gly Phe Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Gly Trp Leu Arg Gln Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  98
<211>  117
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,重链可变结构域 (VH结构域)
<400>  98
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Met Ile Trp Pro Pro Asp Ala Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp His Ser Leu Lys Thr Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Tyr Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  99
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,重链可变结构域 (VH结构域)
<400>  99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  100
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,轻链可变结构域 (VL结构域)
<400>  100
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Val Pro Val
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  101
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,轻链可变结构域 (VL结构域)
<400>  101
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  102
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,轻链可变结构域 (VL结构域)
<400>  102
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105                 110
<210>  103
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,轻链可变结构域 (VL结构域)
<400>  103
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Thr Val Ser Ser Arg
            20                  25                  30
Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  104
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,轻链可变结构域 (VL结构域)
<400>  104
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Ser Ser Tyr Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  105
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  抗-血清白蛋白,轻链可变结构域 (VL结构域)
<400>  105
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala
                85                  90                  95
Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105

Claims (34)

1.一种多特异性抗体，其具有以下结构式：
Figure FDA0003858796060000011
其中抗原结合片段(Fab)是血清白蛋白Fab；
其中R1和R2是与Fab的N-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中R3和R4是与Fab的C-末端连接的生物活性效应部分，其各自与Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域连接；
其中m是0或1或更大的整数；和
其中n是0或1或更大的整数。
2.如权利要求1所述的抗体，其中R1和R2是相同或不同的单链可变片段(scFv)。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中R3和R4是相同或不同的Fv片段或二硫化物稳定的Fv(dsFv)片段。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中R1、R2、R3、和R4中的每个通过一个或多个接头连接到Fab。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含
(a)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含WINTYSGGTKYAQKFQG(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；
(b)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含RINTYNGNTGYAQRLQG(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；
(c)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含NYGIH(SEQ ID NO:65)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含DVHYYGSGSYYNAFDI(SEQ ID NO:67)的氨基酸序列；
(d)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYAMS(SEQ ID NO:68)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含VISHDGGFQYYADSVKG(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含AGWLRQYGMDV(SEQ ID NO:70)的氨基酸序列；
(e)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYWIA(SEQ ID NO:71)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含MIWPPDADARYSPSFQG(SEQ ID NO:72)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LYSGSYSP(SEQ ID NO:73)的氨基酸序列；或者
(f)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYSMN(SEQ ID NO:74)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含ETVMAGKALDY(SEQ ID NO:76)的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含
(g)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISRYLN(SEQ ID NO:77)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASRLES(SEQ ID NO:78)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSDSVPVT(SEQ ID NO:79)的氨基酸序列；
(h)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSYSTPPYT(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列；
(i)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSIFNYVA(SEQ ID NO:83)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含DASNRAT(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQRSKWPPTWT(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列；
(j)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASETVSSRQLA(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYGSSPRT(SEQ ID NO:88)的氨基酸序列；
(k)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO:89)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QKYSSYPLT(SEQ ID NO:90)的氨基酸序列；或者
(l)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASTGAT(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述Fab包含
包含AYSMN(SEQ ID NO:74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO:76)的氨基酸序列的重链CDR3，和
包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列的轻链CDR3。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其中所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述Fab包含重链可变结构域和轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中所述Fab包含重链结构域和轻链结构域，所述重链结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列(VH-CH1结构域)，所述轻链结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列(VL-CL结构域)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体，其中每个接头包含1至20个氨基酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体，其中每个接头包含与SEQ ID NO：3或SEQID NO：4具有至少90％同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体，其中每个接头包含SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中R1和R2中的每个是抗CD40L hu5c8scFv。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中R1和R2中的每个是抗CD40L hu5c8scFv，其包含与SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48具有至少80％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的抗体，其中R1和R2中的每个是抗CD40L hu5c8scFv，其包含SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体，其中R3和R4中的每个是一种或多种生物活性效应部分，其选自抗TNF-αFv、抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)、抗IL-23Fv、抗IL-23dsFv、抗IFNAR1和抗IFNAR1 dsFv。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的抗体，其中R3和R4中的每个是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-αFv，其包含与SEQ ID NO：49具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：50具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含与SEQ ID NO:51具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23Fv，其包含与SEQ ID NO：53具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：54具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗IL-23dsFv，其包含与SEQ IDNO：55具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：56具有80％同一性的轻链氨基酸序列；抗IFNAR1，其包含与SEQ ID NO：57具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ IDNO:58具有80％同一性的轻链氨基酸序列；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含与SEQ ID NO：59具有80％同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：60具有80％同一性的轻链氨基酸序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体，其中R3和R4中的每个可以是一种或多种生物活性效应部分，包括抗TNF-αFv，其包含SEQ ID NO：49的重链和SEQ ID NO：50的轻链；抗TNF-α二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其包含SEQ ID NO:51的重链和SEQ ID NO:52的轻链；抗IL-23Fv，其包含SEQ ID NO：53的重链和SEQ ID NO：54的轻链；抗IL-23dsFv，其包含SEQ IDNO：55的重链和SEQ ID NO：56的轻链；抗IFNAR1，其包含SEQ ID NO：57的重链和SEQ ID NO:58的轻链；和/或抗IFNAR1 dsFv，其包含SEQ ID NO：59的重链和SEQ ID NO：60的轻链。
21.一种组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的多特异性抗体和赋形剂。
22.一种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的多特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。
23.一种在有需要的受试者中治疗自身免疫病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求22所述的药物组合物。
24.一种表达载体，其包含：
(a)启动子，
(b)第一核酸分子，其编码与血清白蛋白结合的抗原结合片段(Fab)，和
(c)第二核酸分子，其编码生物活性效应部分和接头，
其中所述启动子、第一核酸序列和第二核酸分子可操作地连接。
25.根据权利要求24所述的载体，其中所述第二核酸分子编码2个或更多个生物活性效应部分和接头。
26.根据权利要求24或25所述的载体，其中所述第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含
(a)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含WINTYSGGTKYAQKFQG(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；
(b)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYGIS(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含RINTYNGNTGYAQRLQG(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LGHCQRGICSDALDT(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；
(c)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含NYGIH(SEQ ID NO:65)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含DVHYYGSGSYYNAFDI(SEQ ID NO:67)的氨基酸序列；
(d)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含SYAMS(SEQ ID NO:68)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含VISHDGGFQYYADSVKG(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含AGWLRQYGMDV(SEQ ID NO:70)的氨基酸序列；
(e)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYWIA(SEQ ID NO:71)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含MIWPPDADARYSPSFQG(SEQ ID NO:72)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含LYSGSYSP(SEQ ID NO:73)的氨基酸序列；或者
(f)重链互补决定结构域1(CDR1)，其包含AYSMN(SEQ ID NO:74)的氨基酸序列，
重链CDR2，其包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列，和
重链CDR3，其包含ETVMAGKALDY(SEQ ID NO:76)的氨基酸序列。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的载体，其中所述第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含
(g)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISRYLN(SEQ ID NO:77)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASRLES(SEQ ID NO:78)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSDSVPVT(SEQ ID NO:79)的氨基酸序列；
(h)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQSYSTPPYT(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列；
(i)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSIFNYVA(SEQ ID NO:83)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含DASNRAT(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQRSKWPPTWT(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列；
(j)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASETVSSRQLA(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYGSSPRT(SEQ ID NO:88)的氨基酸序列；
(k)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO:89)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASSRAT(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QKYSSYPLT(SEQ ID NO:90)的氨基酸序列；或者
(l)轻链互补决定结构域1(CDR1)，其包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列，
轻链CDR2，其包含GASTGAT(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列，和
轻链CDR3，其包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的载体，其中所述第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含
包含AYSMN(SEQ ID NO:74)的氨基酸序列的重链互补决定结构域1(CDR1)、包含SISSSGRYIHYADSVKG(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列的重链CDR2、和包含ETVMAGKALDY(SEQID NO:76)的氨基酸序列的重链CDR3，和
包含RASQSVGSNLA(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的轻链互补决定结构域1(CDR1)、包含GASTGAT(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含QQYYSFLAKT(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列的轻链CDR3。
29.根据权利要求24-28中任一项所述的载体，其中所述第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列。
30.根据权利要求24-29中任一项所述的载体，其中所述第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的载体，其中所述第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链可变结构域和轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:94、95、96、97、98或99具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:100、101、102、103、104或105具有至少80％同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求24-31中任一项所述的载体，其中所述第一核酸分子包含编码Fab的核酸序列，所述Fab包含重链结构域和轻链结构域，所述重链结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列(VH-CH1结构域)，所述轻链结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列(VL-CL结构域)。
33.根据权利要求24-32中任一项所述的载体，其中所述生物活性效应部分是抗TNF-αFv、抗TNF-αdsFv、抗IL-23Fv、抗IL-23dsFv、抗IFNARl Fv和/或抗IFNAR1 dsFv。
34.根据权利要求23-33中任一项所述的载体，其中所述第二核酸分子包含编码SEQ IDNO：49-60中的一个或多个的氨基酸序列的核苷酸序列。
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