KR20220154097A - 다중특이적 항체, 이를 포함하는 조성물, 그의 벡터 및 용도 - Google Patents

다중특이적 항체, 이를 포함하는 조성물, 그의 벡터 및 용도 Download PDF

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KR20220154097A
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Abstract

본 발명은 증가된 생체내 지속가능성을 갖는 다중특이적 항체를 제공하며, 상기 다중특이적 항체는 인간 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편 Fab의 N-말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에 연결된 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티를 포함한다.

Description

다중특이적 항체, 이를 포함하는 조성물, 그의 벡터 및 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 1월 24일자로 출원된 한국 공개특허 제10-2020-0009565호, 및 2020년 5월 19일에 출원된 미국 공개특허 제16/878,255호에 우선권을 주장한다. 각각의 개시 내용은 그 전체가 본 문서에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 2021년 1월 19일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 2662-0001 WOO l Sequence Listing_ST25.txt이며 크기는 68KB이다.
분야
본 발명은 항원 결합 단편 및 생물활성 반응기 모이어티를 포함하는 융합 컨스트럭트에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편의 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에 연결된 2개 이상의 생물활성 반응기 모이어티를 포함하는 다중특이적 항체에 관한 것이다.
CD40-CD40L 상호작용은 본질적으로 항원-특이적 항체 면역 반응의 생성에 작용하고 자가항체는 다양한 자가면역 질환의 발병기전을 포함한다. 이러한 질병을 효과적으로 치료하기 위해 CD40-CD40L 상호작용을 억제 및/또는 억제할 수 있는 다양한 CD40L 또는 CD40 특이적 항체가 연구되었다. 예컨대, 항-CD40L 단일클론 항체인 hu5c8 IgG1(BG-9588, ruplizumab, Antova™, Biogen, Cambridge, Massachusetts) 및 IDEC-131(E6040, IDEC Pharmaceuticals, San Diego, California)은 다양한 자가면역질환 예컨대 전신성 홍반성 루푸스(SLE) 및 특발성 혈소판 감소성 자반병(FTP)을 포함하는 자가면역질환의 치료를 위해 연구되었지만 이러한 항체의 추가 개발은 혈전색전증(thromboembolism)과 같은 부작용의 발생으로 인해 중단되었다. 따라서 많은 연구 그룹에서 Fc 공학을 통해 상기 혈전색전성 부작용 문제를 해결하기 위한 접근을 시도했으며 예컨대, PEG화된 항-CD40L Fab, CDP7657(Dapirolizumab pegol, Biogen) 및 CD40L에 연결되도록 설계된 TN3-HSA 융합 단백질, VIB4920(VIELABIO, Gaithersburg, MD)을 포함하는 여러 보고가 있었다.이와 관련하여 CD40L이 아닌 CD40을 표적으로 하는 치료제로서 Fc 기능이 약화된 BI655064 항체(Boehringer Ingelheim, Germany) 및 인간 IgG4형의 블레셀루맙 항체(Kyowa Kirin Pharmaceutical Development, La Jolla, CA) 등은 다른 연구 그룹에 의해 개발되고 있다.
본 발명은 연장된 생체내(in vivo) 체류 시간을 갖는 다중특이적 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 다중특이적 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 다중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
예컨대, 항-CD40L 항체의 Fc-기반 혈전색전성 부작용을 제거하면서 CD40-CD40L 신호를 억제하기 위한 신규한 자가면역질환 치료제가 본 명세서에 개시된다.이를 위해 CD40L에 결합하는 루플리주맙 항체인 hu5c8의 가변영역 유전자 VH 및 VL로 구성된 단일쇄 가변 단편(scFv)을 SL335 Fab의 N-말단에 연결함으로써 Fc 영역 없이 혈청 지속성을 유지할 수 있는 (항-CD40L scFv)2-(항-HSA Fab)-(항-TNF-α Fv)로 표시되는 재조합 이중특이적 항체가 개발되었다. 또한, 펩타이드 링커를 이용하여 이중특이적 항체의 SL335 Fab의 C-말단에 TNF-α에 결합하는 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol) 항체의 가변 영역 유전자를 포함하는 Fv 또는 dsFv를 연결함으로써, (항-CD40L scFv)2-(항-HSA Fab)-(항-TNF-α Fv)로 표시되는 다중특이적 항체가 본 명세서에 개시되고 생산된 상기 항체 단백질의 기능 및 특성을 확인하였다.
하기 구조식을 포함하는 다중특이적 항체가 본 발명에 제공된다:
Figure pct00001
상기 항원 결합 단편(Fab)은 혈청 알부민 Fab이고;
상기 R1 및 R2는 상기 Fab의 N-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이며,
각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되고;
상기 R3 및 R4는 상기 Fab의 C-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이고,
각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되며; 상기 m은 0 또는 1 이상의 정수이고; 상기 n은 0 또는 1 이상의 정수이다.
일부 실시양태에서, 상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이한 단일쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시양태에서, 상기 R3 및 R4는 동일하거나 상이한 Fv 단편 또는 이황화-안정화된 Fv(dsFv) 단편이다.
일부 실시양태에서, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 하나 이상의 링커에 의해 상기 Fab에 연결될 수 있다. 각각의 링커는 1 내지 20개의 아미노산을 포함할 수 있다. 각각의 링커는 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대해 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 각각의 링커는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 (a) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), WINTYSGTKYAQKFQG(서열번호 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(b) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), RINTYNGNTGYAQRLQG(서열번호 64)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(c) NYGIH(서열번호 65)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISYDGSNKYYADSVKG(서열 번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 DVHYYGSGSYYNAFDI(서열번호 67)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(d) SYAMS(서열번호 68)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), VISHDGGFQYYADSVKG(서열번호 69)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 AGWLRQYGMDV(서열번호 70)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(e) AYWIA(서열번호 71)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), MIWPPDADARYSPSFQG(서열번호 72)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LYSGSYSP(서열번호 73)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는
(f) AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 (g) RASQSISRYLN(서열번호 77)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASRLES(서열번호 78)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSDSVPVT(서열번호 79)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(h) RASQSISSYLN(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), AASSLQS(서열번호 81)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSYSTPPYT(서열번호 82)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(i) RASQSIFNYVA(서열번호 83)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), DASNRAT(서열번호 84)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQRSKWPPTWT(서열번호 85)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(j) RASETVSSRQLA(서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYGSSPRT(서열번호 88)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(k) RASQSVSSSSLA(서열번호 89)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QKYSSYPLT(서열번호 90)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
(l) RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열, SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1)을 포함한다:
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105 각각에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 도메인(VH-CH1 도메인) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 도메인(VL-CL 도메인)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 R1 및 R2 각각은 항-CD40L hu5c8 scFv이다. 상기 각각의 R1 및 R2는 서열번호 47 또는 48과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv일 수 있다. 상기 각각의 R1 및 R2는 서열번호 47 또는 48의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv일 수 있다.
일부 실시양태에서, R3 및 R4 각각은 항-TNF-α Fv, 항-TNF-α 이황화-안정화 Fv(dsFv), 항-IL-23 Fv, 항-IL-23 dsFv, 항-IFNAR1 및/또는 항-IFNAR1 dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티이다.
각각의 R3 및 R4는 서열번호 49에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 50에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α Fv, 서열번호 51에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 52에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 54에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 56에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 58에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl, 및/또는 서열번호 59에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 60에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다.
각각의 R3 및 R4는 서열번호 51의 중쇄 및 서열번호 52의 경쇄를 포함하는 항-TNF-α 이황화-안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53의 중쇄 및 서열번호 54의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55의 중쇄 및 서열번호 56의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57의 중쇄 및 서열번호 58의 경쇄를 포함하는 항-IFNARl, 및/또는 서열번호 59의 중쇄 및 서열번호 60의 경쇄를 포함하는 항-IFNARl dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 다중특이적 항체 및 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 발명의 다른 일 관점에 따르면 다중특이적 항체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면 자가면역질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 자가면역질환을 치료하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명의 다른 일 관점에 따르면 하기를 포함하는 발현 벡터가 제공된다:
(a) 프로모터,
(b) 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편(Fab)을 암호화하는 제1 핵산 분자, 및
(c) 생물활성 반응기 모이어티 및 링커를 암호화하는 제2 핵산 분자,
상기 프로모터, 상기 제1 핵산 분자 및 상기 제2 핵산 분자는 작동가능하게 연결된다. 상기 제2 핵산 분자는 2개 이상의 생물활성 반응기 모이어티 및 링커를 암호화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 (a) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), WINTYSGTKYAQKFQG(서열번호 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(b) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), RINTYNGNTGYAQRLQG(서열번호 64)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(c) NYGIH(서열번호 65)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISYDGSNKYYADSVKG(서열번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 DVHYYGSGSYYNAFDI(서열번호 67)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(d) SYAMS(서열번호 68)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), VISHDGGFQYYADSVKG(서열번호 69)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 AGWLRQ Y GMD V의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(서열 번호: 70);
(e) AYWIA(서열번호 71)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), MIWPPDADARYSPSFQG(서열번호 72)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LYSGSYSP(서열번호 73)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는
(f) AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 (g) RASQSISRYLN(서열번호 77)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASRLES(서열번호 78)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSDSVPVT(서열번호 79)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(h) RASQSISSYLN(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), AASSLQS(서열번호 81)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSYSTPPYT(서열번호 82)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(i) RASQSIFNYVA(서열번호 83)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), DASNRAT(서열번호 84)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQRSKWPPTWT(서열번호 85)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(j) RASETVSSRQLA(서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호: 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYGSSPRT(서열번호 88)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(k) RASQSVSSSSLA(서열번호 89)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호: 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QKYSSYPLT(서열번호 90)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
(l) RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다:
다른 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자는 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105 각각에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 도메인(VH-CH1 도메인) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 도메인(VH-CH1 도메인)을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 생물활성 반응기 모이어티는 항-TNF-α Fv, 항-TNF-α dsFv, 항-IL-23 Fv, 항-IL-23 dsFv, 항-IFNAR1 Fv, 및/또는 항-IFNAR1 dsFv이다. 상기 제2 핵산 분자는 서열번호 49 내지 60 중 하나 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 동물 세포, 예컨대, CHO 세포주와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태의 상기 및 기타 측면, 특징 및 이점은 첨부 도면과 함께 기재된 하기의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다:
도 1a 및 1b는 APB-A1의 벡터맵 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2a 및 2b는 APB-A1에 대한 HPLC 분석 및 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 3은 APB-A1에 대한 질량 분석 결과를 나타낸다
도 4a 및 도 4b는 APB-A1의 PI 값을 나타낸다.
도 5는 APB-Al의 전하량 변화를 나타낸다.
도 6은 rhCD40L-APB-Al-HSA의 동시 결합을 나타낸다.
도 7은 유세포 분석 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8d는 APB-A1에 대한 시험관내 분석 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 9d는 혈소판 응집에 대한 다양한 IC 효과를 나타낸다.
도 10은 세로토닌 수준에 대한 다양한 IC 효과를 나타낸다.
도 11은 게잡이 원숭이(cynomolgus monkeys)를 사용하여 측정된 APB-A1 농도에 대한 PK 값을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 게잡이 원숭이를 이용한 약동학적 분석 결과이다.
도 13a 내지 13c는 SAFA-기반 이중특이적 항체 및 포유동물 발현 벡터를 나타낸다.
도 14는 APB-B1 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 15a 내지 15d는 CaptureSelect IgG-CHI 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 이중특이적 항체 컨스트럭트를 나타낸다.
도 16a 및 16B는 2-단계 크로마토그래피에 의해 정제된 APB-B 1 컨스트럭트를 나타낸다.
도 17은 다양한 pH 및 버퍼 조건하에서 열 안정성 이동 분석을 나타낸다.
도 18a 내지 18c는 ELISA에 의해 결정된, 모 항체와 비교될 3개의 상이한 항원에 대한 APB-B1 컨스트럭트의 결합 특이성의 결정 결과를 나타낸다.
도 19는 생체층 간섭계(bio-layer interferometry)에 의해 분석된, 3개의 상이한 항원에 대한 APB-B1a의 동시 결합의 결과를 나타낸다.
도 20은 유세포 분석에 의해 확인된 D1.1 세포 상의 세포막에 대한 SAFA-기반 컨스트럭트의 결합을 나타낸다.
도 21은 L929 마우스 세포에서 확인된 SAFA-기반 이중특이적 항체에 의한 TNF-α 매개 세포독성의 억제를 나타낸다.
도 22a 내지 22c는 HEK-blue™ 리포터 세포에서 확인된 CD40L-CD40 상호작용 및 TNFα-TNFaR 상호작용 중 하나 또는 모두를 억제하는 APB-B1의 용량 결정을 나타낸다.
도 23은 원숭이 PK 데이터이다. 혈장 내 APB-A1 농도는 PK ELISA를 사용하여 측정하였다. 상기 데이터는 수행된 실험의 평균을 나타낸다.
도 24a 및 24b은 면역표현형(B 세포 분열)이다. 말초혈액의 면역표현형 분석에서, 1일(도 24a) 및 11일(도 24b)에 대조군과 비교하여 30, 10, 및/또는 3 mg/kg 그룹에서 감소된 분열 B 세포가 관찰되었다.
도 25는 혈청 내 항-KLH IgG의 역가이다. 항-KLH 항체 측정에서 대조군과 비교하여 10 및 30 mg/kg 그룹에서 8일부터 29일까지 IgG 항체 역가의 감소가 관찰되었다(* P < 0.05, ** P < 0.01: 대조군과 유의하게 차이남).
도 26은 겨드랑이 림프절의 Ki67 양성 세포(면역조직화학 검사)이다.
도 27은 PD 연구에서 혈청 중 APB-A1의 농도이다. PK에서 Cmax 및 AUCO-t 값은 첫 번째 및 두 번째 투여에서 3 내지 30 mg/kg 그룹 사이에서 거의 용량 비례적으로 증가했다.
이제 실시예가 상세하게 참조될 것이고, 그 예는 첨부 도면에 예시되어 있으며, 본 명세서에서 유사한 참조 번호는 전체에 걸쳐 유사한 요소를 지칭한다. 이와 관련하여, 본 실시예는 상이한 형태를 가질 수 있으며 여기에서 설명하는 설명에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"이라는 용어는 관련된 나열된 항목 중 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. "적어도 다음 중 하나"와 같은 표현은 요소 목록 앞에 올 때 요소의 전체 목록을 수정하고 목록의 개별 요소를 수정하지 않는다.
하기 구조식을 포함하는 다중특이적 항체가 본 발명에 제공된다:
Figure pct00002
상기 항원 결합 단편(Fab)은 혈청 알부민 Fab이고;
상기 R1 및 R2는 상기 Fab의 N-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이며,
각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되고;
상기 R3 및 R4는 상기 Fab의 C-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이고,
각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되며; 상기 m은 0 또는 1 이상의 정수이고; 상기 n은 0 또는 1 이상의 정수이다.
또한 상기 항체를 암호화하는 상보적 DNA(cDNA)와 같은 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)이 제공된다. 벡터(예컨대, 발현 벡터) 및 상기 항체를 암호화하는 핵산(폴리뉴클레오티드)을 포함하는 세포(예컨대, 숙주 세포)가 추가로 제공된다. 또한 상기 항체의 제조방법이 제공된다. 다른 측면에서, 다중특이적 활성을 유도, 증가 또는 향상시키고, 자가면역 질환과 같은 특정 상태를 치료하기 위한 방법 및 용도가 본 발명에 제공된다. 관련 조성물(예: 약학적 조성물), 키트 및 검출 방법도 제공된다.
용어
본 명세서에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 수치 값 또는 수치 범위를 수정하는 데 사용될 때, 값 또는 범위에서 5% ~ 10% 초과 및 5% ~ 10% 미만의 편차가 인용된 값 또는 범위의 의도된 의미 내에 남아 있음을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체" 및 "항체"는 기술 용어이며 본 발명에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭한다.
항체는 예컨대 모노클로날 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 재표면화된 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄를 포함할 수 있다. 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 이종접합체 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv(scFv), 카멜화된 항체, 아피바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합 Fv(sdFv), 항-이디오타입(항-id) 항체(예컨대, 항-항-Id 항체 포함), 이중특이적 항체 및 다중특이성 항체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "다중특이성 항체"는 기술 분야의 용어이며 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티 또는 항원 결합 부위를 갖는 분자(들)를 지칭하는 데 사용될 수 있으며, 상기 각각의 항원 결합 부위는 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명에 개시된 상기 다중특이성 항체는 그에 연결된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상의 생물활성 반응기 모이어티를 가질 수 있다.
항체는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY), 임의의 클래스(예컨대, IgG, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2), 또는 면역글로불린 분자의 모든 서브클래스일 수 있다. (예컨대, IgG2a 또는 IgG2b). 특정 실시양태에서, 본 발명에 기재된 항체는 IgG 항체, 또는 그의 부류 (예컨대, 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4) 또는 서브클래스이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 인간 모노클로날 항체, 예컨대 면역글로불린이다.
본 명세서에 사용된 용어 "생물활성 반응기 모이어티", "항원 결합 도메인", "항원 결합 영역", "항원 결합 부위" 및 유사한 용어는 항체 분자에 항원에 대한 특이성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 다중특이적 항체 분자의 부분을 나타낸다(예: 상보성 결정 영역(CDR)). 상기 항원 결합 영역은 설치류(예: 마우스, 래트 또는 햄스터) 및 인간과 같은 모든 동물 종에서 유래할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호교환적으로 사용되며 당업계에서 일반적이다. 상기 가변 영역은 항체 사이에 서열이 광범위하게 다르며 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되고 전형적으로 성숙한 중쇄의 아미노-말단 약 110 내지 120개의 아미노산 및 성숙한 경쇄의 약 90 내지 115개의 아미노산인 일반적으로 항체의 일부, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부를 나타낸다. 상기 서열의 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 영역에 집중되는 반면 가변 도메인에서 보다 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(framework, FR)이라고 한다. 임의의 특정 기전 또는 이론에 얽매이지 않고, 경쇄 및 중쇄의 CDR이 항원과 항체의 상호작용 및 특이성에 주로 책임이 있는 것으로 여겨진다. 특정 실시양태에서, 상기 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 실시양태에서, 상기 가변 영역은 설치류 또는 마우스 CDR 및 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 가변 영역은 영장류(예컨대, 비인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 실시양태에서, 상기 가변 영역은 설치류 또는 마우스 CDR 및 영장류(예컨대, 비-인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 항체의 경쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 항체의 중쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "Kabat 지정 규칙" 및 유사 용어는 당업계에서 인지되고 있으며 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 부분에 있는 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다. 특정 측면에서, 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예컨대, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 및 Kabat EA et al., (1991) 참조) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 참조).
Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 일반적으로 아미노산 위치 31에서 35에 존재하며, 이는 선택적으로 35(Kabat 넘버링 방식에서 35A 및 35B로 지칭됨) (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3), 1개 또는 2개의 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 상기 항체의 CDR은 카바트 넘버링 방식에 따라 결정되었다.
본 명세서에 사용된 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호교환가능하고 당업계에서 공통적인 의미를 갖는다. 상기 불변 영역은 항체 부분, 예컨대 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 반응기 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 사용될 때 용어 "중쇄"는 임의의 별개의 유형, 예컨대 알파(a), 델타(d), 엡실론(e), 감마(g) 및 뮤(m)를 지칭할 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 클래스의 항체를 각각 생성하는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하며, 이는 IgG의 서브클래스, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "경쇄"는 항체와 관련하여 사용될 때 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초한 임의의 별개의 유형, 예컨대 카파(κ) 또는 람다(λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경쇄는 인간 경쇄이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예컨대, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예컨대, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예컨대, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수(KD) 및 평형 결합 상수(KA)를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. 상기 KD는 k0ff/k0n의 몫에서 계산되는 반면 KA는 k0ff/k0n의 몫에서 계산된다. 상기 k0n은 예컨대 항원에 대한 항체의 회합 속도 상수를 나타내고, k0ff는 예컨대 항원에 대한 항체의 해리를 나타낸다. 상기 k0n 및 k0ff는 BIAcore® 또는 KinExA와 같은 당업자에게 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계열에는 염기성 측쇄가 있는 아미노산(예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있다. 특정 실시양태에서, 항체의 CDR(들) 또는 프레임워크 영역(들) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "에피토프"는 당업계의 용어이며 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소 영역을 지칭한다. 에피토프는 예컨대 폴리펩타이드의 연속 아미노산(선형 또는 연속 에피토프)일 수 있거나 에피토프는 예컨대 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 2개 이상의 비연속 영역으로부터 함께 올 수 있다(형태적, 비선형, 불연속 또는 비연속 에피토프). 특정 실시양태에서, 항체가 결합하는 에피토프는 예컨대 NMR 분광법, X선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분광법과 결합된 수소/중수소 교환(예컨대, 액체 크로마토그래피 전자분무 질량 분석법), 어레이 기반 올리고펩티드 스캐닝 분석 및/또는 돌연변이유발 매핑(예: 부위 지정 돌연변이유발 매핑)에 의해 결정될 수 있다. X-선 결정학의 경우, 결정화는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성할 수 있다(예: Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990)). Eur JBiochem 189: 1-23, Chayen NE(1997) Structure 5: 1269-1274, McPherson A(1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). 항체: 항원 결정은 하기 잘 알려진 X선 회절 기술을 사용하여 연구할 수 있고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정제할 수 있다: 예컨대, X-PLOR(Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, MethEnzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al., U.S. 2004/0014194) 및 BUSTER(Bricogne G(1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G(1997)-423, ed Carter CW, Roversi P et al, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323).
돌연변이 유발 맵핑(Mutagenesis mapping) 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 기술을 포함하는 돌연변이유발 기술에 대한 설명은 하기를 참조할 수 있다(예컨대 Champe M et al, (1995) J.Biol.Chem 270: 1388-1394 및 Cunningham BC & Wells JA (1989) Science, 244: 1081-1085). 일부 실시양태에서, 상기 항체의 에피토프는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 연구를 사용하여 결정된다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역특이적으로 결합한다", "면역특이적으로 인식한다", "특이적으로 결합한다" 및 "특이적으로 인식한다"는 항체의 맥락에서 유사한 용어이고 항원(예컨대, 에피토프, 면역 복합체, 또는 항원 결합 부위의 결합 파트너)과 같은 결합은 당업자에 의해 이해된다. 예컨대, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 일반적으로 면역분석, BIAcore®, KinExA 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, ID) 또는 기타 당업계에 공지된 분석에 의해 결정된 바와 같이 더 낮은 친화도로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 항원에 면역특이적으로 결합하는 분자는 상기 분자가 다른 항원에 결합할 때 KA보다 적어도 2 logs, 2.5 logs, 3 logs, 4 logs 이상인 KA로 항원에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항원에 면역특이적으로 결합하는 분자는 유사한 결합 조건 하에 다른 단백질과 교차 반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 예컨대, 방사성면역검정, 공명에 대한 표면 플라즈마, 또는 동역학 배제 검정에 의해 측정된 다른 종보다 더 높은 친화도로 특정 항원(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합하는 다중특이적 항체가 본 문서에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 항원의 다른 종보다 더 높은 친화도로 인간 항원에 결합하는 다중특이적 항체가 본 문서에 제공된다. 특정 실시양태에서, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 예컨대, 방사성면역검정, 공명에 대한 표면 플라즈마, 또는 동역학 배제 검정에 의해 측정된 다른 종보다 더 높은 친화도로 인간 항원에 결합하는 다중특이적 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 인간 항원에 결합하는 본 발명에 기재된 상기 다중특이적 항체는 예컨대, 방사성면역검정, 공명에 대한 표면플라즈마, 또는 동역학 배제 검정에 의해 측정된 바와 같이 인간 항원 단백질에 대한 항체의 결합의 10%, 15% 또는 20% 미만으로 항원 단백질의 다른 종에 결합할 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예컨대 1차 세포, 배양 중인 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 구현예에서, 상기 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질감염된 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 이러한 세포의 자손은 핵산 분자로 형질감염된 모 세포와 동일할 수 없다. 예컨대, 돌연변이 또는 다음 세대에서 발생할 수 있는 환경적 영향 또는 핵산 분자가 숙주 세포 게놈으로 통합되기 때문이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 요법의 투여와 관련된 용어 "유효량"은 원하는 예방 또는 치료 효과를 달성하는 요법의 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "대상체" 및 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 상기 대상체는 동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 영장류가 아닌 동물(예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 등) 또는 영장류(예컨대, 원숭이 또는 인간)와 같은 포유동물, 또는 인간이다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 게잡이 원숭이이다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 비인간 동물(예컨대, 돼지, 말, 소, 고양이 또는 개와 같은 비인간 동물)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 애완동물 또는 농장 동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 인간을 지칭한다.
Multispecific Antibodies
하기 구조식을 포함하는 다중특이적 항체가 본 발명에 제공된다:
Figure pct00003
상기 항원 결합 단편(Fab)은 혈청 알부민 Fab이고;
상기 R1 및 R2는 상기 Fab의 N-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이며,
각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되고;
상기 R3 및 R4는 상기 Fab의 C-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이고,
각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되며; 상기 m은 0 또는 1 이상의 정수이고; 상기 n은 0 또는 1 이상의 정수이다.
일부 실시양태에서, 상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이한 단일쇄 가변 단편(scFv) 또는 동일하거나 상이한 Fv 단편 또는 이황화 안정화된 Fv(dsFv) 단편이다. 일부 실시양태에서, R3 및 R4는 동일하거나 상이한 scFv 또는 Fv 단편 또는 dsFv 단편이다. 일부 실시양태에서, 각각의 R1, R2, R3 및 R4 하나 이상의 링커에 의해 Fab에 연결될 수 있다. 각각의 링커는 1 내지 20개의 아미노산 또는 2, 3, 4 등과 같은 그 안의 임의의 길이 또는 범위를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 각각의 링커는 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 각각의 링커는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 (a) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), WINTYSGTKYAQKFQG(서열번호 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(b) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), RINTYNGNTGYAQRLQG(서열번호 64)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(c) NYGIH(서열번호 65)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISYDGSNKYYADSVKG(서열 번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 DVHYYGSGSYYNAFDI(서열번호 67)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(d) SYAMS(서열번호 68)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), VISHDGGFQYYADSVKG(서열번호 69)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 AGWLRQYGMDV(서열번호 70)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(e) AYWIA(서열번호 71)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), MIWPPDADARYSPSFQG(서열번호 72)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LYSGSYSP(서열번호 73)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는
(f) AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다:
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 (g) RASQSISRYLN(서열번호 77)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASRLES(서열번호 78)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSDSVPVT(서열번호 79)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(h) RASQSISSYLN(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), AASSLQS(서열번호 81)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSYSTPPYT(서열번호 82)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(i) RASQSIFNYVA(서열번호 83)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), DASNRAT(서열번호 84)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQRSKWPPTWT(서열번호 85)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(j) RASETVSSRQLA(서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYGSSPRT(서열번호 88)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(k) RASQSVSSSSLA(서열번호 89)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QKYSSYPLT(서열번호 90)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
(l) RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열, SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 또는 상기 개시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 임의의 조합을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105 각각에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 또는 본 문서에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 임의의 조합을 포함한다. 예컨대 상기 Fab는 서열번호 99에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 105에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fab는 서열번호 45(VH-CHI 도메인)에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열 및 서열번호 46(VL-CL 도메인)에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 도메인을 포함하는 중쇄 도메인을 포함한다
일부 실시양태에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4 각각은 항-CD40L hu5c8 scFv와 같은 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다. 예컨대 R1, R2, R3 및 R4 각각은 서열번호 47 또는 48에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv일 수 있다. 상기 R1, R2, R3 및 R4 각각은 서열번호 47 또는 48의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 R1 및 R2 각각은 항-CD40L hu5c8 scFv와 같은 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다. 예컨대 R1 및 R2 각각은 서열번호 47 및 48에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv일 수 있다. 상기 R1 및 R2 각각은 서열번호 47 또는 48의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4 각각은 항-TNF-α Fv, 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 항-IL-23 Fv, 항-IL-23 dsFv, 항-IFNAR1, 및/또는 항-IFNAR1 dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 상기 R3 및 R4 각각은 예컨대, 항-TNF-α Fv, 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 항-IL-23 Fv, 항-IL-23 dsFv, 항-IFNAR1, 및/또는 항-IFNAR1 dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4 각각은 서열번호 49에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 50에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α Fv, 서열번호 51에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 52에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 54에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 56에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 58에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl, 및/또는 서열번호 59에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 60에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다.
상기 R1, R2, R3 및 R4 각각은 서열번호 49의 중쇄 및 서열번호 50의 경쇄를 포함하는 항-TNF-α Fv, 서열번호 51의 중쇄 및 서열번호 52의 경쇄를 포함하는 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53의 중쇄 및 서열번호 54의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55의 중쇄 및 서열번호 56의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57의 중쇄 및 서열번호 58의 경쇄를 포함하는 항-IFNARl 및/또는 서열번호 59의 중쇄 및 서열번호 60의 경쇄를 포함하는 항-IFNARl dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 R3 및 R4 각각은 서열번호 49에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 50에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α Fv, 서열번호 51에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 52에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 54에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 56에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 58에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl, 및/또는 서열번호 59에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 60에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다.
상기 R3 및 R4 각각은 서열번호 49의 중쇄 및 서열번호 50의 경쇄를 포함하는 항-TNF-α Fv, 서열번호 51의 중쇄 및 서열번호 52의 경쇄를 포함하는 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53의 중쇄 및 서열번호 54의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55의 중쇄 및 서열번호 56의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57의 중쇄 및 서열번호 58의 경쇄를 포함하는 항-IFNARl 및/또는 서열번호 59의 중쇄 및 서열번호 60의 경쇄를 포함하는 항-IFNARl dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 상기 다중특이적 항체는 항-HSA Fab(SL335), 각각 항-CD40L IgG(루플리주맙)인 R1 및 R2, 각각 항-TNF-α IgG(adalimumab)인 R3 및 R4 및/또는 항-TNF-α Fab'(세르톨리주맙)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 상기 다중특이적 항체는 항-HSA Fab(SL335), 각각 항-CD40L scFv(hu5c8)인 R1 및 R2, 및 각각 0인 R3 m 및 R4 n의 m 및 n을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명에 기재된 상기 다중특이적 항체는 그의 VL 도메인 단독, 또는 그의 VH 도메인 단독, 또는 그의 3개의 VL CDRs 단독, 또는 그의 3개의 VH CDRs 단독으로 기재될 수 있다. 예를 들어, 인간 경쇄 또는 중쇄 라이브러리로부터 각각 상보적 경쇄 또는 중쇄를 확인함으로써 마우스 항-avP3 항체의 인간화를 설명하고, 원래 항체의 친화도와 같거나 더 높은 친화도를 갖는 인간화 항체 변이체를 생성하는 하기 문헌(Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915)를 참조할 수 있다. 상기 문헌은 그 전체가 참조로 본 문서에 포함된다. 또한 특정 VL 도메인(또는 VH 도메인) 및 상보적 가변 도메인에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 이용하여 특정 항원에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 설명하는 하기 연구 논문 전체가 참조로 본 문서에 포함된다(Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628). 상기 스크리닝은 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 강력한 결합제로 특정 VH 도메인에 대해 14개의 새로운 파트너 및 특정 VL 도메인에 대해 13개의 새로운 파트너를 생성했다. 또한 하기 연구 논문(Kim SJ & Hong HJ, (2007) J. Microbiol. 45: 572-577)을 참조하면 특정 VH 도메인을 사용하고 상보적인 VL 도메인에 대한 라이브러리(예: 인간 VL 라이브러리)를 스크리닝함으로써 특정 항원에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 설명하고 상기 선택된 VL 도메인은 차례로 추가적인 상보적(예컨대, 인간) VH 도메인의 선택을 안내하는 데 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 항체의 상기 CDRs은 면역글로불린 구조 루프의 위치를 나타내는 Chothia 넘버링 방식에 따라 결정될 수 있다(예컨대, Chothia C & Lesk AM, (1987), JMol. Biol. 196: 901-917. Al-Lazikani B et al., (1997) J.Mol.Biol 273: 927-948 Chothia C et al., (1992), J.Mol.Biol. 227: 799-817, Tramontano A et al., (1990) J.Mol.Biol, 215(1): 175-82, 및 미국 특허 제7,709,226호 참조).일반적으로 Kabat 번호 지정 규칙을 사용할 때 Chothia CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33 또는 34에 존재하고, Chothia CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52~56에 존재하며, Chothia CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95~102에 존재하는 반면, Chothia CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, Chothia CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하고 Chothia CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. 상기 Kabat 번호 지정 규칙을 사용하여 번호를 매길 때 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다르다(이는 Kabat 번호 지정 규칙이 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이다. 35A 또는 35B가 모두 존재하지 않으면 상기 루프가 32에서 종료되고, 35A만 존재하면 상기 루프가 33에서 종료된다. 35A와 35B가 모두 있는 경우 상기 루프는 34에서 종료된다).
특정 측면에서, 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 특이적으로 결합하고 VL의 Chothia VL CDRs을 포함하는 다중특이적 항체가 본 발명에서 제공된다. 특정 측면에서, 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 특이적으로 결합하고 VH의 Chothia VH CDR을 포함하는 항체가 본 발명에서 제공된다. 특정 측면에서, 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 특이적으로 결합하고 VL의 Chothia VL CDRs을 포함하며 VH의 Chothia VH CDRs을 포함하는 항체가 본 발명에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 특이적으로 결합하는 항체는 Chothia 및 Kabat CDRs은 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDRs을 포함한다. 특정 실시양태에서, 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 특이적으로 결합하고 Kabat CDRs 및 Chothia CDRs의 조합을 포함하는 항체가 본 발명에서 제공된다.
특정 측면에서, 상기 항체의 CDRs은 하기 연구 논문에 기술된 바와 같이 IMGT 번호 시스템에 따라 결정될 수 있다(Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 및 Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic. Acids. Res. 27: 209-212). IMGT 번호 체계에 따르면 VH-CDR1은 위치 26 내지 35, VH-CDR2는 위치 51 내지 57, VH-CDR3은 위치 93 내지 102, VL-CDR1은 위치 27 내지 32, VL-CDR2 위치 50 내지 52에 있고 VL-CDR3이 위치 89 내지 97에 있다.
특정 측면에서, 상기 항체의 CDRs은 하기 문헌(MacCallum RM et al., (1996) J.Mol.Biol. 262: 732-745.)에 따라 결정될 수 있고 예컨대, Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)을 참조할 수 있다.
특정 측면에서, 항체의 CDR은 Kabat CDR 간의 절충을 나타내는 AbM 초가변 영역을 나타내는 AbM 넘버링 방식에 따라 결정될 수 있다. 또한 Chothia 구조적 루프이며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 항체의 VH(예컨대, CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 및/또는 VL(예컨대, CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 영역을 따른 하나 이상의 CDR의 위치는 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 위치에 의해 다양할 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 예컨대, 본 발명에 기재된 항체의 CDR을 정의하는 위치는 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 본 문서에 기재된 다중특이적 항체의 CDR 위치에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산에 의해, CDR의 N-말단 및/또는 C-말단 경계를 이동시킴으로써 변할 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 다른 실시양태에서, 본 발명에 기재된 항체의 VH(예컨대, CDR1, CDR2 또는 CDR3) 및/또는 VL(예컨대, CDR1, CDR2 또는 CDR3) 영역을 따른 하나 이상의 CDR의 길이는 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 아미노산에 의해, 다양할 수 있다(예컨대, 더 짧거나 더 길다)(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%).
일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3은 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 본 발명에 기재된 CDR 중 하나 이상보다 짧은 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산일 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 다른 실시예에서, 본 발명에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3은 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 본 발명에 기재된 CDR 중 하나 이상보다 긴 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 아미노산일 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 다른 실시예에서, 본 발명에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 및/또는 VH CDR3의 아미노 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한, 본 문서에 기재된 CDR 중 하나 이상과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산에 의해 연장될 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 다른 실시예에서, 본 발명에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 및/또는 VH CDR3의 카르복시 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한, 본 발명에 기재된 CDR 중 하나 이상과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산에 의해 연장될 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 다른 실시예에서, 본 문서에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 및/또는 VH CDR3의 아미노 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한, 본 발명에 기재된 CDR 중 하나 이상과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산에 의해 단축될 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3의 카르복시 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한, 본 발명에 기재된 CDR 중 하나 이상과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산에 의해 단축될 수 있다(예컨대, 실질적으로 유지됨, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%). 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 본원의 "실시예" 섹션에 기재된 결합 검정 및 조건과 같이 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는지 여부를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
2개의 서열(예컨대, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 간의 퍼센트 동일성의 결정은 또한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 시퀀스의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 특정 비제한적 예는 Karlin S & Altschul SF(1993) PNAS 90: 5873-5877에서와 같이 수정된 Karlin S & Altschul SF(1990) PNAS 87: 2264-2268의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul SF et al., (1990) J.Mol.Biol 215: 403의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 예컨대 점수 = 100, 단어 길이 = 12에 대해 설정된 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 매개변수로 수행되어 본 문서에 기재된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램 매개변수 세트로 수행될 수 있으며, 예컨대 50점, 단어 길이 = 3으로 설정되어 본 문서에 기술된 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적으로 간격이 있는 정렬을 얻기 위해 Altschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402에 설명된 대로 Gapped BLAST를 사용할 수 있다. 또는 PSI BLAST를 사용하여 분자(Id) 간의 먼 관계를 감지하는 반복 검색을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI Blast 프로그램을 사용할 때 각 프로그램의 기본 매개변수(예: XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다(예: NCBI(National Center for Biotechnology Information) 참조).
서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 특정 비제한적 예는 하기 문헌(Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 시퀀스 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM 120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용할 수 있다.
상기 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않고 상기 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성을 계산할 때 일반적으로 정확히 일치하는 항목만 계산된다.
다중특이적 항체는 검출가능한 표지 또는 물질에 융합 또는 결합(예컨대, 공유 또는 비공유 연결)될 수 있다. 검출가능한 표지 또는 물질의 예는 글루코스 옥시다제와 같은 효소 표지; 요오드(1251, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(121In) 및 테크네튬(99Tc)과 같은 방사성 동위원소; 루미놀과 같은 발광 표지, 및 플루오레세인 및 로다민 및 비오틴과 같은 형광 표지를 포함한다. 이러한 표지된 항체를 사용하여 항원 단백질을 검출할 수 있다.
예컨대, 자가면역 질환 또는 동종이식 거부반응의 주요 경로인 CD40-CD40L 상호작용을 억제하기 위해, CD40 또는 CD40L을 표적으로 하는 단일클론항체를 개발하였으나 예컨대, IgG1 항체의 Fc에 의해 유도된 혈전색전증과 같은 부작용 발생으로 추가 개발이 중단되었다. 부작용을 제거하거나 감소시키기 위해 Fab와 항-CD40L scFv를 조합하여 생산된 재조합 항체(anti-hu5c8 scFv)2-SL335(APB-A1로 명명)가 개발되었다. SL335는 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하여 생체 내 지속성을 증가시킨 항원 결합 단편(Fab)이다. 이와 관련하여 하기 문헌(미국 특허 제9,879,077호) 전체가 참고로 본 명세서에 통합된다.
APB-A1의 결합능 및 혈전색전증 억제 효능을 확인하기 위해 결합능 및 세포 -기반 억제 효능을 평가하였다. APB-Al의 HSA 및 rhCD40L에 대한 결합 친화도를 이중층 간섭법으로 확인하였고, 그 결과 HSA 및 rhCD40L에 대한 APB-Al의 해리상수(KD)가 각 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다. 세포 기반 억제 효능 평가에서, HSA를 첨가했을 때, hu5c8 IgG1의 억제 효능에는 유의한 차이가 없었지만, rhCD40L 항원 및 Dl.1 세포에 대한 APB-A1의 결합 억제 효능 수준은 약 1.6배 및 3배 증가하였다. 상기 결과는 SL335와 HSA의 결합으로 인한 크기 변화가 양성대조군과 유사한 역가 수준으로 이어짐을 시사한다. 즉, hu5c8 IgG1보다 낮은 친화도에서도 HSA 존재하에서 억제력이 증가하였다.
IgG1의 Fc 영역 제거에 따른 혈전색전증 부작용이 해소되는지 여부를 알아보기 위해 APB-A1의 혈소판 응집 속도 및 세로토닌 분비 수준을 측정하여 분석하였다. 400ng/mf의 고농도에서도 APB-A1과 rhCD40L에 의해 형성된 면역 복합체(IC)에서 혈소판 응집이 관찰되지 않았지만, hu5c8 IgG1 및 rhCD40L의 IC에 대한 응집 반응은 60 ng/mf의 비교적 낮은 농도에서 시작되었고, 투과율과 혈소판 응집 속도에 의해 확인되었다. 조밀한 혈소판 과립에서 세로토닌 방출 수준을 분석한 결과, APB-A1 IC의 세로토닌 방출 수준이 hu5c8 IgG1 IC보다 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 확인되었다. 상기 결과는 본 발명의 항-CD40L 항체가 생체 내에서도 혈전색전증 관련 장애를 효과적으로 해결할 수 있음을 시사한다.
APB-A1의 반감기를 평가하기 위해 약동학적 분석을 수행하였다. APB-A1은 단일 정맥 주사를 통해 각각의 5 mg/kg(그룹 1) 또는 각각 20 mg/kg(그룹 2)의 용량으로 게잡이 원숭이의 2개의 시험 그룹에 투여되었다. 그 결과, 상기 두 그룹이 동일한 신장 제거율을 갖는다는 가정 하에 그룹 2의 생체 내 반감기는 그룹 1보다 1.38배 높은 9.59±0.79일임을 확인하였고, 이는 그룹 1보다 1.38배 높은 6.94±4.6일이다.
또 다른 예에서, 파상풍 톡소이드(TT)를 주사할 때 생성되는 항-TT IgG 항체에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 약력학 분석을 수행하였다. 실험동물은 게잡이 원숭이를 사용하였고, APB-A1은 5 mg/kg(그룹 1) 또는 20 mg/kg(그룹 2)의 2개의 테스트 그룹에 단일 정맥 주사를 통해 투여하였다. 그 결과, APB-A1을 고농도(20 mg/kg)로 정맥주사했을 때, IgG 항체 면역반응에 대한 억제력은 양성대조군인 DXT를 투여했을 때보다 훨씬 높았으며, 상기 억제력은 최대 30~40일 동안 유지되었다. 또한, CD40-CD40L 상호작용은 또한 기억 B 세포에 의해 작동되며, TT 부스팅과 함께 27일째(20일째)에 APB-A1에서 상당한 억제 효능이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 APB-A1은 hu5c8 IgG1에 비해 혈전색전증 관련 장애를 현저히 개선함을 확인하였다.
또 다른 실시양태에서, 각각 APB-Bla 및 APB-B1b로 지칭되는 신규 이중특이적 항체는 각각 종양 괴사 인자-알파(항-TNF-α) 가변 단편(Fv) 또는 이황화 안정화 Fv(dsFv) 및 항-CD154(CD40 리간드; CD40L) 단일 사슬 가변 단편(scFv)(VH-[펩티드 링커]-VL)을 연결하여 생성되었다. BLI(bio-layer interferometry)를 이용한 실험에서 APB-B 1은 3개의 표적, 즉 재조합 인간 CD40L, 재조합 인간 TNF-α 및 인간 혈청 알부민(HSA) 단백질에 동시에 결합하는 능력 및 항-CD40L IgG 또는 항-TNF-α Fab' 모 항체와 유사한 수준의 항원-결합 친화도를 가짐을 확인하였다.
이와 관련된 다른 구현예에서, 항-TNF-α Fv에서 사슬간 이황화 결합의 유무에 관계없이, 부형제가 없는 완충 상태에서 측정된 용융 온도(Tm)는 62℃이고, 사슬간 이황화 결합이 구조적 안정성에 기여하지 않음을 확인하였다.
이와 관련된 또 다른 실시양태에서, 시험관내 세포-기반 검정은 APB-B1의 CD40L 억제 능력이 모 항체 항-CD40L IgG1의 능력과 유사함을 나타내었고, TNF-α 억제 능력은 모 항체 항-TNF-α Fab'와 비교하여 약간 감소되었다. 그럼에도 불구하고, APB-B 1은 CD40L 및 TNF-α 모두에 대한 억제 활성 및 각각의 모 항체인 항-CD40L IgG1 및 항-TNF-α Fab'보다 더 높은 억제 활성을 나타내었다.
항체 생산
본 문서에 개시된 다중특이적 항체는 항체 합성을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술에 의해 생성될 수 있다. 본 문서에 기술된 방법은 달리 지시되지 않는 한 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 혼성화, 및 관련 기술 분야의 관련 분야에서 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 하기에 인용된 참고 문헌(예컨대, Maniatis T el al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987 및 annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 및 annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.)에 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체는 예컨대 합성, DNA 서열의 유전 공학을 통한 생성을 포함하는 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 (예컨대, 재조합 항체)이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 생체내 동물 또는 포유동물(예컨대, 인간)의 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열(예컨대, DNA 서열 또는 아미노산 서열)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명에 기재된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 본 문서에 기재된 다중특이적 항체의 제조 방법이 본 문서에 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명에 기재된 세포 또는 숙주 세포(예컨대, 본 발명에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여 항체를 발현(예컨대, 재조합 발현)하는 것을 포함하는 다중특이적 항체의 제조 방법이 본 문서에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 단리된 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 상기 세포 내로 도입되었다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 수득된 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
다클론 항체를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있고 하기 문헌(예컨대, 11장: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al, eds., John Wiley and Sons, New York )을 참조할 수 있다.
다중특이적 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는 당업계에 공지된 매우 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 당업계에 공지되어 있고 하기 문헌(Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)을 참고할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되지 않는다. 예컨대, 모노클로날 항체는 본 문서에 기재된 항체를 외인성으로 발현하는 숙주 세포로부터 재조합적으로 생성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "단일클론 항체"는 단일 세포(예컨대, 재조합 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생산된 항체이며, 상기 항체는 예컨대, ELISA 또는 당업계에 공지된 또는 본 문서에 제공된 실시예에 공지된 다른 항원-결합 또는 경쟁적 결합 검정에 의해 결정된 바와 같이 항원(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 면역특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 1가 항체 또는 다가(예컨대, 2가) 항체이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 본 문서에 기재된 모노클로날 항체는 하기 문헌 (Kohler G & Milstein C, (1975) Nature, 256:495)에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 예컨대 본 문서에 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현되는 모노클로날 항체의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 하기 문헌(예컨대, 문헌(Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., supra)을 참조할 수 있다.
하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체를 생산하고 스크리닝하는 방법은 일상적이며 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 하이브리도마 방법에서 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 양, 염소, 토끼, 래트, 햄스터 또는 짧은꼬리 원숭이는 면역화에 사용되는 항원(예: 인간 혈청 알부민)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 그런 다음 림프구는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding JW(Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 추가로, RIMMS(반복적 면역화 다중 부위) 기술을 사용하여 동물을 면역화할 수 있다(Kilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16:381-9, 상기 문헌 전체가 본 발명에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 마우스(또는 랫트, 원숭이, 당나귀, 돼지, 양, 햄스터 또는 개와 같은 다른 동물)는 항원(예컨대, 인간 혈청 알부민)으로 면역화될 수 있고, 일단 면역 반응이 검출되면, 예컨대, 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되고, 마우스 비장이 수확되고 비장세포가 분리된다. 그 다음 상기 비장세포는 잘 알려진 기술에 의해 임의의 적합한 골수종 세포, 예컨대 American Type Culture Collection(ATCC®)(Manassas, VA)에서 입수가능한 세포주 SP20의 세포에 융합되어 하이브리도마를 형성한다. 하이브리도마는 제한된 희석에 의해 선택되고 복제된다. 특정 실시양태에서, 면역화된 마우스의 림프절을 수확하고 NSO 골수종 세포와 융합시킨다.
상기 제조된 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있는 적합한 배양 배지에서 파종되고 성장된다. 예컨대, 상기 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 HGPRT 결핍 세포의 성장을 막는 물질인 일반적으로 하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
특정 실시양태는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지원하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포를 사용한다. 상기 골수종 세포주 중에는 미국 캘리포니아주 샌디에고에 있는 Salk Institute Cell Distribution Center에서 입수할 수 있는 NSO 세포주 또는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래된 것과 같은 뮤린 골수종 세포주 및 미국 메릴랜드주 록빌 소재의 American Type Culture Collection에서 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8.653 세포가 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 하기 문헌에 기술되어 있다(Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63). (Marcel , Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대한 단일클론 항체의 생산에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 면역침전 또는 방사성면역검정(RIA) 또는 효소결합 면역흡수 검정(ELISA)과 같은 시험관내 결합 검정에 의해 결정된다.
원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 상기 클론은 희석 절차를 제한하여 서브클로닝될 수 있고 표준 방법에 의해 성장시켰다(Goding JW(Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, supra). 상기 목적에 적합한 배양 배지는 예컨대 D-MEM 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양을 생체내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 예컨대 단백질 A-세파로스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
본 발명에 기재된 항체는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 기술된 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성)과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자의 단백질 분해 절단에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 사량체 항체 분자의 두 개의 동일한 암 중 하나에 해당하고 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이루는 완전한 경쇄를 포함한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화 결합으로 연결된 4량체 항체 분자의 두 항원 결합 암을 포함한다.
추가로, 본 문서에 기재된 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 단백질은 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에 디스플레이된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예: 영향을 받은 조직의 인간 또는 마우스 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되고 파지미드 벡터로 클로닝된다. 상기 벡터는 E. coli에서 전기천공되고 상기 E. coli는 헬퍼 파지로 감염된다. 상기 방법에 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 사상성 파지이고, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합적으로 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항체를 발현하는 파지는, 예컨대, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 항원으로 선택되거나 확인될 수 있다. 본 발명에 기술된 항체를 제조하는 데 사용할 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 하기 문헌 참고할 수 있다(Brinkman U et al., (1995) J. Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J. Immunol Methods, 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic L et al, (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT/GB91/001134; WO90/02809, WO91/10737, W092/01047, W092/18619, W093/11236, W095/15982, W095/20401, 및 W097/13844; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호, 및 제5,969,108호).
상기 참고문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터 항체 코딩 영역을 분리하여 인간 항체를 비롯한 항체를 생성하는 데 사용할 수 있으며, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현되며, 예컨대 하기에 기재된 바와 같다. Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편과 같은 항체를 재조합적으로 생산하는 기술은 또한 당업계에 공지된 방법을 하기 문헌을 참조하여 사용할 수 있다(W092/22324; Mullinax RL et al, (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al, (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; 및 Better M et al, (1988) Science 240: 1041-1043).
일부 측면에서, 항체를 생성하기 위해 VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PCR 프라이머, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하기 위한 플랭킹 서열은 주형, 예컨대 scFv 클론으로부터 VH 또는 VL 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인은 VH 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 VL 불변 영역, 예컨대 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. VH 및 VL 도메인은 또한 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터로 클로닝될 수 있다. 이어서, 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 항체, 예컨대, IgG를 발현하는 안정하거나 일시적인 세포주를 생성하기 위해 세포주 내로 공동 형질전환된다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래된 분자이다. 예컨대, 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역에 융합된 마우스 또는 래트 단일클론 항체의 가변 영역을 포함할 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 하기 문헌을 참조할 수 있다(예컨대, Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al, (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; 및 미국 특허 제5,807,715호, 제4,816,567호, 제4,816,397호 및 제6,331,415호).
인간화 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 프레임워크 영역 및 비인간 면역글로불린(예컨대, 뮤린 면역글로불린)의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 CDR을 포함하는 예정된 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함한다. 상기 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 면역글로불린의 임의의 부류 및 IgG, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 아이소타입으로부터 선택될 수 있다. 인간화 항체는 당업계에 알려진 하기문헌의 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있으나 이에 한정되지 않는다(CDR-그라프팅(EP 239400, WO91/09967, 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 축성 또는 재표면화(EP 592EA519 및 992106), Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498, Studnicka GM et al, (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814 및 Roguska MA et al, (1994) PNAS 91: 969-973, 사슬 셔플링(U.S. Pat. No. 5,565,332), 및 예컨대 U.S. Pat. 미국 특허 제6,407,213호 제5,766,886호, WO93/17105; Tan Petal, (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C et al, (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V et al, (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M etal, (1997) J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84; Roguska M et al, (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al, (1995) Cancer Res. 55(23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR et al, (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 및 Pedersen JT et al, (1994) J. Mol. Biol. 235(3): 959-73. 또한 미국 특허공개 US2005/0042664A1(2005년 2월 24일)).
단일 도메인 항체, 예컨대 경쇄가 결여된 항체는 당업계에 잘 알려진 방법으로 하기 문헌을 참조하여 생산될 수 있다(Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al, (2000) Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J. Biotechnol. 74(4): 277-302; 미국 특허 제6,005,079호; 및 WO94/04678, W094/25591 및 WO01/44301).
추가로, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체는 차례로 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 항원을 "모방하는" 항-이디오타입 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444 및 NissinoffA (1991) J. Immunol. 147(8): 2429-2438 참조).
특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체와 동일한 관심 항원(예컨대, 인간 혈청 알부민)의 에피토프에 결합하는 본 문서에 기재된 다중특이적 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 기재된 항체 중 임의의 하나가 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단하는 (예컨대, 용량 의존적 방식으로) 본 발명에 기재된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예컨대, 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 마우스가 사용될 수 있다. 특히, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 기능하지 않게 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 상기 변형된 배아 줄기 세포를 확장하고 배반포에 미세 주입하여 키메라 마우스를 생성한다. 그런 다음 상기 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형 접합 자손을 생성한다. 상기 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예컨대 항원의 전부 또는 일부로 정상적인 방식으로 면역화된다. 상기 항원에 대한 단일클론 항체는 기존의 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 형질전환 마우스로부터 얻을 수 있다. 형질전환 마우스에 의해 숨겨져 있는 인간 면역글로불린 형질전환 유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 본 기술의 개요는 하기 문헌을 참조할 수 있다(Lonberg N & Huszar D, (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93). 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 본 발명의 기술과 그러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 대한 자세한 논의를 위해 하기 문헌을 참조할 수 있다(예컨대, WO98/24893, WO96/34096 및 W096/33735 참조; 및 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호 및 제5,939,598호). 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스의 예로는 Xenomouse™(Abgenix, Inc.; 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,184호), HuAb-Mouse™(Mederex, Inc./Gen Pharm; 미국 특허 제5,545,506호 및 제5,569,825호), Trans Chromo Mouse™(Kirin) 및 KM Mouse™(Medarex/Kirin)를 포함한다.
항원에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여 상기 기재된 파지 디스플레이 방법을 비롯한 당업계에 공지된 하기 문헌을 참조하여 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다(미국 특허 제4,444,887호, 제4,716,111호 및 제5,885,793호; 및 WO98/46645, WO98/50433, W098/24893, W098/16654, WO96/34096, W096/33735, 및 W091/10741).
일부 실시양태에서, 인간 항체는 마우스-인간 하이브리도마를 사용하여 생성될 수 있다. 예컨대, Epstein-Barr 바이러스(EBV)로 형질전환된 인간 말초혈액 림프구는 마우스 골수종 세포와 융합되어 인간 모노클로날 항체를 분비하는 마우스-인간 하이브리도마를 생성할 수 있다. 상기 마우스-인간 하이브리도마는 표적 항원에 면역특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 분비하는 것을 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은 하기 문헌에 공지되어 있고 당업계에 기재되어 있다(예컨대, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology, 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31).
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 세포
특정 측면에서, 항원에 면역특이적으로 결합하는 본 문서에 기재된 항체 또는 그의 단편 (예컨대, 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 예컨대 숙주 세포(예컨대, 대장균 및 포유동물 세포)에서 재조합 발현을 위한 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 본 문서에 제공된 항체 중 임의의 것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 그의 효율적인 발현을 위한 발현 벡터가 제공된다.
본 발명에 사용된 "단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원(예컨대, 마우스 또는 인간)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예컨대, "실질적으로 없는"이라는 용어는 기타 재료, 예컨대, 세포 물질, 배양 배지, 기타 핵산 분자, 화학적 전구체 및/또는 기타 화학물질의 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만(특히 약 10% 미만)을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자의 제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 항체를 코딩하는 핵산 분자(들)는 단리되거나 정제된다.
특정 측면에서, 항원 폴리펩티드(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 면역특이적으로 결합하고 본 문서에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 제공된다. 뿐만 아니라 항원 폴리펩타이드에 대한 결합에 대해 이러한 항체와 경쟁하는(예컨대, 용량 의존적 방식으로), 또는 이러한 항체의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명에 기재된 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 문서에 기재된 항체의 VL FR 및 CDR을 포함하는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 기재된 항체의 VH FR 및 CDR을 포함하는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 하기를 포함하는 다중특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다: 예컨대 본 문서에 기재된 인간 혈청 알부민에 대한 항체의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 3개의 VH 사슬 CDRs을 포함하는 Fab 및 예컨대, 본 문서에 기재된 인간 혈청 알부민에 대한 항체의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 3개의 VH 사슬 CDRs.
특정 실시양태에서, VL 도메인을 포함하는 다중특이적 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 문서에 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본 문서에 기재된 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 46)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 문서에 제공된 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 면역특이적으로 결합하는 다중특이적 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본 문서에 기재된 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 45)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 본 문서에 제공된 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 면역특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 경쇄 및 중쇄, 예컨대 별도의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 문서에 제공된다. 경쇄와 관련하여, 일부 실시양태에서, 본 문서에 제공된 폴리뉴클레오티드는 카파 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 문서에 제공된 폴리뉴클레오티드는 람다 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 문서에 제공된 폴리뉴클레오티드는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄를 포함하는 본 문서에 기재된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 제공된 폴리뉴클레오티드는 혈청 알부민(예: 인간 혈청 알부민)에 면역특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 항체는 경쇄를 포함하고, 상기 VL 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 46에 제시된 아미노산 서열 및 상기 경쇄의 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 예컨대, 인간 불변 영역 서열은 미국 특허 제5,693,780호에 기술된 것일 수 있다.
또한, 예컨대 코돈/RNA 최적화, 이종 신호 서열로의 대체, 및 mRNA 불안정 요소의 제거에 의해 최적화된 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 문서에 제공된다. mRNA에서 코돈 변화를 도입하고/하거나 억제 영역을 제거함으로써 재조합 발현을 위한 다중특이적 항체 또는 이의 단편(예컨대, 경쇄, 중쇄, VH 도메인, 또는 VL 도메인)을 암호화하는 최적화된 핵산을 생성하는 방법이 하기 문헌에 설명된 최적화 방법을 적용하여 수행될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,965,726호; 제6,174,666; 제6,291,664; 제6,414,132; 및 제6,794,498호). 예컨대, RNA 내의 잠재적 스플라이스 부위 및 불안정 요소(예: A/T 또는 A/U 풍부 요소)는 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산을 변경하지 않고 돌연변이되어 재조합 발현을 위한 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 변경은 예컨대 동일한 아미노산에 대한 대체 코돈을 사용하여 유전 암호의 축퇴성(degeneracy)을 활용한다. 일부 실시양태에서, 보존적 돌연변이, 예컨대 유사한 화학 구조 및 특성을 갖는 유사한 아미노산 및/또는 원래 아미노산과 기능을 암호화하도록 하나 이상의 코돈을 변경하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 단편(예컨대, VL 도메인 또는 VH 도메인)을 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스(예컨대, 상보적) 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다(예컨대, VL 도메인 또는 VH 도메인). 특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 단편을 코딩하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건 하에 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화되지 않은 뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 높은 엄격성, 중간 또는 더 낮은 엄격성 혼성화 조건 하에 혼성화한다. 혼성화 조건에 관한 정보는 예컨대 본 문서에 참고로 포함된 미국 특허공개 US2005/0048549A1(예컨대, 단락 72-73)를 참조할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 얻어질 수 있고, 상기 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 문서에 기재된 항체 및 이들 항체의 변형된 버전을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 즉, 특정 아미노산을 암호화하는 것으로 알려진 뉴클레오티드 코돈은 항체를 암호화하는 핵산을 생성하는 방식으로 조립된다. 상기 항체를 코딩하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다(예컨대, Kutmeier G et al, (1994), BioTechniques 17: 242-246에 기재된 바와 같음), 간단히 말해서, 항체를 코딩하는 서열의 일부를 포함하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 및 이어서 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
대안적으로, 본 문서에 기재된 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 널리 공지된 방법(예컨대, PCR 및 기타 분자 클로닝 방법)을 사용하여 적합한 공급원(예컨대, 하이브리도마)으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예컨대, 알려진 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭은 관심 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 얻은 게놈 DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법을 사용하여 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 얻을 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법을 사용하여 항체의 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 얻을 수 있다. 상기 증폭된 핵산은 숙주 세포에서의 발현 및 추가 클로닝, 예컨대 키메라 및 인간화 항체 생성을 위해 벡터로 클로닝될 수 있다.
특정 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 클론을 사용할 수 없지만 항체 분자 또는 이의 단편의 서열이 알려진 경우 면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의한 적합한 공급원(예컨대, 항체 cDNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리, 또는 폴리 A+ RNA와 같은 핵산, 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 본 문서에 기재된 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 단리됨)으로부터 또는 예컨대, 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 클로닝함으로써, 화학적으로 합성하거나 얻을 수 있다. PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당업계에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
본 문서에 기재된 다중특이적 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열결정될 수 있다(예컨대, 다중특이적 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 소스로 작용할 수 있다. 일단 분리되면, 상기 DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 이는 그 다음 재조합 숙주 세포에서 다중특이적 항체의 합성을 얻기 위해 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(예: CHO GS System™(Lonza)의 CHO 세포), 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질전환된다.
항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하기 위한 측면 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 클론에서 VH 또는 VL 서열을 증폭할 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인은 중쇄 불변 영역, 예컨대 인간 감마 4 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있다. 상기 PCR 증폭된 VL 도메인은 경쇄 불변 영역, 예컨대 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정 실시양태에서, VH 또는 VL 도메인을 발현하기 위한 벡터는 EF-1a 프로모터, 분비 신호, 가변 도메인에 대한 클로닝 부위, 불변 도메인, 및 네오마이신과 같은 선택 마커를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터로 클로닝될 수 있다. 이어서, 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 전장 항체, 예컨대, IgG를 발현하는 안정하거나 일시적인 세포주를 생성하기 위해 세포주 내로 공동-형질전환된다.
상기 DNA는 또한 예컨대 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써, 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비면역글로불린 폴리펩타이드 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합함으로써 변형될 수 있다.
또한, 본 문서에 기재된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 높은 엄격성, 중간 또는 보다 낮은 엄격성 혼성화 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본 문서에 제공된 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 높은 엄격성, 중간 또는 더 낮은 엄격성 혼성화 조건 하에 혼성화한다.
혼성화 조건은 당업계에 기재되어 있고 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 엄격한 조건 하의 혼성화는 약 45C에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중 필터 결합 DNA에 대한 혼성화에 이어 약 50-65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS로 1회 이상 세척하는 것을 포함할 수 있다. 매우 엄격한 조건하의 혼성화는 약 45℃에서 6xSSC에서 필터 결합 핵산에 혼성화한 후 약 68℃에서 0.1xSSC/0.2% SDS로 한 번 이상 세척하는 것을 포함할 수 있다. 다른 엄격한 혼성화 조건 하에서의 혼성화는 당업자에게 공지되어 있으며, 하기 문헌을 참조할 수 있다(예컨대, Ausubel FM et al, eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York at pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3.)
하기를 포함하는 발현 벡터가 본 발명에 추가로 개시된다:
(a) 프로모터,
(b) 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편(Fab)을 암호화하는 제1 핵산 분자, 및
(c) 생물활성 반응기 모이어티 및 링커를 암호화하는 제2 핵산 분자,
상기 프로모터, 상기 제1 핵산 분자 및 상기 제2 핵산 분자는 작동가능하게 연결된다. 상기 제2 핵산 분자는 2, 3, 4, 5, 6, 및 그 이상의 생물활성 반응기 모이어티 및 링커를 암호화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 (a) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), WINT YSGTKYAQKF QG(서열번호 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(b) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), RINTYNGNTGYAQRLQG(서열번호 64)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(c) NYGIH(서열번호 65)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISYDGSNKYYADSVKG(서열번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 DVHYYGSGSYYNAFDI(서열번호 67)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(d) SYAMS(서열번호 68)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), VISHDGGFQYYADSVKG(서열번호 69)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 AGWLRQ Y GMD V의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(서열번호: 70);
(e) AYWIA(서열번호 71)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), MIWPPDADARYSPSFQG(서열번호 72)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LYSGSYSP(서열번호 73)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는 (f) AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 (g) RASQSISRYLN(서열번호 77)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASRLES(서열번호 78)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSDSVPVT(서열번호 79)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(h) RASQSISSYLN(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), AASSLQS(서열번호 81)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSYSTPPYT(서열번호 82)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(i) RASQSIFNYVA(서열번호 83)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), DASNRAT(서열번호 84)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQRSKWPPTWT(서열번호 85)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(j) RASETVSSRQLA(서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호: 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYGSSPRT(서열번호 88)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(k) RASQSVSSSSLA(서열번호 89)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호: 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QKYSSYPLT(서열번호 90)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
(l) RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다:
예컨대, 상기 제1 핵산 분자는 상기 (a)를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 상기 (g)를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 상기 (b)를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 상기 (h)를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 상기 (c)를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 상기 (i)를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 상기 (d)를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 상기 (j)를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 상기 (e)를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 상기 (k)를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 상기 (f)를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 상기 (1)을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 경쇄 가변 도메인의 임의의 조합을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄CDR3(서열번호 93)를 포함하는 Fab(SL335)를 암호화하는 핵산서열을 포함한다
다른 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 분자는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 도메인(VH-CHI 도메인) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 도메인(VL-CL 도메인)을 포함하는 Fab(SL335)를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 생물활성 반응기 모이어티는 항-TNF-α Fv, 항-TNF-α dsFv, 항-IL-23 Fv, 항-IL-23 dsFv, 항-IFNAR1 Fv, 및/또는 항-IFNAR1 dsFv이다. 예컨대, 상기 제2 핵산 분자는 서열번호 49 내지 60중 하나 이상에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 핵산 분자는 서열번호 6 내지 15, 39, 및 40 중 하나 이상에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 본 문서에 기재된 혈청 알부민(예: 인간 혈청 알부민) 및 관련 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체를 발현하는(예컨대, 재조합적으로) 세포(예컨대, 숙주 세포)가 제공된다. 포유동물 세포와 같은 숙주 세포에서 재조합 발현을 위한 단편 또는 다중특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예컨대, 발현 벡터)가 본 문서에서 제공된다. 또한 본 발명에 기재된 다중특이적 항체(예컨대, 인간 또는 인간화 항체)를 재조합적으로 발현하기 위한 상기벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한 숙주 세포에서 이러한 항체를 발현시키는 것을 포함하는, 본 문서에 기재된 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명에서 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편들의 재조합적 발현은 항체 또는 그의 단편(예컨대, 본 문서에 기재된 항체의 중쇄 또는 경쇄)들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터의 컨스트럭트를 포함한다. 본 문서에 기재된 항체 또는 그의 단편 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 상기 벡터는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 항체 또는 항체 단편(예컨대, 경쇄 또는 중쇄)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법이 본 문서에 기재되어 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 항체 또는 항체 단편(예컨대, 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는 예컨대 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 또한, 본 문서에 기재된 항체 분자, 프로모터에 작동가능하게 연결된 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체 또는 그의 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는 예컨대 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예컨대, W086/05807 및 W089/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조) 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 모두의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 세포(예컨대, 숙주 세포)로 전달될 수 있고, 상기 생성된 세포는 이어서 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 문서에 기재된 항체를 생성할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 기재된 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내며, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 제자리에서 본 문서에 기재된 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 여기에는 하기 미생물이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예: E. coli 및 B. subtilis); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예: Saccharomyces Pichia); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV)로 감염된 식물 세포 시스템(예: Chlamydomonas reinhardtii와 같은 녹조류); 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환됨; 또는 포유동물 세포의 게놈(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예: COS(예: COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NSO, PER.C6, VERO, CRL7030, HsS78Bst, HeLa 및 NIH3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1 , L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMTIO 세포). 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체(예컨대, 항체 pab1949 또는 pab2044 중 어느 하나의 CDR을 포함하는 항체)를 발현하기 위한 세포는 CHO 세포, 예컨대 CHO GS System™(Lonza)의 CHO 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체를 발현하기 위한 세포는 인간 세포, 예컨대 인간 세포주이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 pOptiVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 일부 실시양태에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 대장균 또는 진핵 세포(예컨대, 포유동물 세포)와 같은 박테리아 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포는 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking MK & Hofstetter H(1986) Gene 45: 101-105 및 Cockett MI et al, (1990) Biotechnology, 8: 662-667). 특정 실시양태에서, 본 발명에 기재된 항체는 CHO 세포 또는 NSO 세포에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 발현되는 항체 분자에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예컨대, 그러한 항체를 대량으로 생산해야 하는 경우, 항체 분자의 약제학적 조성물을 생성하기 위해 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터에는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794), 여기서 항체 코딩 서열은 lac Z 코딩 영역과 프레임 내에서 벡터 내로 개별적으로 결찰될 수 있으므로 융합 단백질이 생성되고; pIN 벡터(Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J.Biol.Chem. 24: 5503-5509); 등등. 예컨대, pGEX 벡터는 또한 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 흡착 및 결합한 후 유리 글루타티온의 존재하에 용출함으로써 용해된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. 상기 pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되었다.
곤충 시스템에서, 예컨대, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV)는 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 상기 바이러스는 Spodoptera frugiperda 세포에서 자란다. 상기 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예컨대, 폴리헤드린 유전자)으로 개별적으로 클로닝될 수 있고 AcNPV 프로모터(예컨대, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심 있는 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예컨대 후기 프로모터 및 삼자 리더 서열에 결찰될 수 있다. 상기 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예: 영역 E1 또는 E3)에 삽입하면 생존 가능하고 감염된 숙주에서 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성된다(예: Logan J & Shenk T(1984) PNAS 81: 3655-3659). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호도 필요할 수 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. 또한, 상기 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 위상이 같아야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두에서 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함함으로써 향상될 수 있다(예컨대, Bitter G et al, (1987) Methods Enzymol, 153: 516-544 참조).
또한, 상기 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 제품의 이러한 변형(예: 글리코실화) 및 가공(예: 절단)은 단백질 기능에 중요할 수 있다. 다른 숙주 세포는 번역 후 처리 및 단백질 및 유전자 산물의 변형을 위한 특징적이고 특정한 메커니즘을 가지고 있다. 발현된 상기 외래 단백질의 정확한 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해 1차 전사체의 적절한 처리, 글리코실화 및 유전자 산물의 인산화를 위한 세포 기계를 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포에는 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, NSO(내인적으로 면역글로불린 사슬을 생성하지 않는 쥐 골수종 세포주), CRL7030, COS(예: COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, Rl.l, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포. 특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 예컨대, CDR를 포함하는 항체는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포에서 생산된다.
일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체는 푸코스 함량이 감소되거나 푸코스 함량이 없다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 푸코실화 능력이 결핍되거나 결핍된 세포에서 발현될 수 있다. 특정 예에서, al,6-푸코실트랜스퍼라제의 두 대립유전자가 모두 녹아웃된 세포주는 푸코스 함량이 감소된 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. Potelligent® 시스템(Lonza)은 푸코스 함량이 감소된 항체를 생산하는 데 사용할 수 있는 시스템의 한 예입니다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해 안정한 발현 세포를 생성할 수 있다. 예컨대, 다중특이적 항체를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 문서에 제공된 세포는 결합하여 본 문서에 기재된 항체(예컨대, CDR을 포함하는 항체)를 형성하는 경쇄/경쇄 가변 도메인 및 중쇄/중쇄 가변 도메인을 안정적으로 발현한다. 특정 측면에서, 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오타이드를 도입한 후 조작된 세포를 농축 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 다음 선택 배지로 전환할 수 있다. 재조합 플라스미드의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체에 안정적으로 통합하고 성장하여 초점을 형성하며 차례로 복제되고 세포주로 확장될 수 있다. 상기 방법은 유리하게는 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 단편을 발현하는 세포주를 조작하는데 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
하기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler M et al, (1977) Cell 11(1): 223-232), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-203) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy I et al, (1980) Cell 22(3):817-823) 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있다. 또한, 하기 유전자에 대한 선택의 기초로 대사물질 내성을 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler M et al, (1980) PNAS 77(6): 3567-3570; O'Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-1531); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-2076); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Wu GY & Wu CH(1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P(1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596); Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; 및 Morgan RA & Anderson WF(1993) Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; Nabel GJ & Feigner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-215); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로(Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-156). 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법을 일상적으로 적용하여 원하는 재조합 클론을 선택할 수 있으며 이러한 방법이 하기 문헌에 설명되어 있다(예컨대, Ausubel FM et al, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli NC et al, (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY(1994); Colbere-Garapin F et al, (1981) J Mol Biol 150: 1-14, 이는 그 전체가 본 문서에 참고로 포함된다).
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(리뷰는 Bebbington CR & Hentschel CCG 참조, DNA 클로닝, Vol. 3(Academic Press, New York, 1987) 에서 포유동물 세포에서 클로닝된 유전자의 발현을 위한 유전자 증폭 기반 벡터의 사용). 항체를 발현하는 상기 벡터 시스템의 마커가 증폭될 수 있는 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 상기 증폭된 영역이 항체 유전자와 연관되기 때문에 상기 항체의 생산도 증가할 것이다(Crouse GF et al, (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).
상기 숙주 세포는 본 문서에 기재된 2개 이상의 중쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터로 공동-형질전환될 수 있다. 상기 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 상기 숙주 세포는 상이한 양의 2개 이상의 발현 벡터로 공동-형질전환될 수 있다. 예컨대, 숙주 세포는 제1 발현 벡터 및 제2 발현 벡터의 하기 비율 중 임의의 하나로 형질전환될 수 있다: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1: 20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 또는 1:50.
대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서 상기 경쇄는 독성이 없는 중쇄의 과잉을 피하기 위해 상기 중쇄 앞에 위치해야 한다(Proudfoot NJ (1986) Nature, 322: 562-565; 및 Kohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). 상기 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 상기 발현 벡터는 모노시스트론(monocistronic) 또는 다중 시스트론(multi cistronic)일 수 있다. 멀티 시스트론 핵산 컨스럭트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상, 또는 2 내지 5, 5 내지 10 또는 10 내지 20개의 유전자/뉴클레오티드 서열 범위를 암호화할 수 있다. 예컨대, 바이시스트론 핵산 컨스트럭트는 제1 유전자(예컨대, 본 문서에 기재된 항체의 중쇄), 및 제2 유전자 및 (예컨대, 본 문서에 기재된 항체의 경쇄) 순서로 프로모터를 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서 상기 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 구동될 수 있는 반면 상기 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡-의존적 스캐닝 메커니즘에 의한 것일 수 있고 상기 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡-독립적 메커니즘, 예컨대 IRES에 의한 것일 수 있다.
상기벡터는 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편(Fab)을 암호화하는 제1 핵산 분자를 포함할 수 있고, 생물활성 반응기 모이어티 및 링커를 코딩하는 제2 핵산 분자를 포함한다. 본 문서에 기재된 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생성되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도 또는 단백질 정제를 위한 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 본 문서에 기재된 항체는 본 문서에 기재된 이종 폴리펩티드 서열에 융합되거나 정제를 용이하게 하기 위해 당업계에 달리 공지될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체는 단리되거나 정제된다. 일반적으로, 단리된 항체는 단리된 항체와 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 것이다. 예컨대, 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체의 제제에는 세포 물질 및/또는 화학적 전구체가 실질적으로 없다. 상기 "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 용어는 항체가 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 항체가 분리된 항체 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1%(건조 중량 기준) 미만의 이종 단백질(본 문서에서 "오염 단백질"이라고도 함) 및/또는 항체의 변이체, 예컨대 항체의 상이한 번역 후 변형된 형태을 갖는 항체 제제를 포함한다. 상기 항체 또는 단편이 재조합으로 생산되는 경우, 또한 일반적으로 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 상기 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만을 나타낸다. 상기 항체 또는 단편이 화학적 합성에 의해 생성되는 경우, 일반적으로 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 즉, 상기 단백질 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 상기 항체 또는 단편의 이러한 제제는 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(건조 중량 기준) 미만의 관심 항체 또는 단편 이외의 화학적 전구체 또는 화합물을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 항체는 단리되거나 정제된다.
조성물
생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제에서 원하는 정도의 순도를 갖는 본 발명에 기재된 다중특이적 항체를 포함하는 조성물이 본 문서에 제공된다(Remington’s Pharmaceutical Sciences, (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). 또한, 본 발명에 기재된 다중특이적 항체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본 발명에 개시된다. 본 발명에 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 환자에게 무독성이다.
본 발명의 약학적 조성물은 대상체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있고, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
상기 제형은 정제, 환제, 분말, 향낭, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사 용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 검, 알기네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일일 수 있다. 또한, 상기 제형은 충전제, 응집방지제, 윤활제, 습윤제, 호감제, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 문서에 기재된 약제학적 조성물은 다중특이적 항체의 활성을 향상, 유도 또는 활성화하고 자가면역 상태 또는 질병과 같은 질병 또는 상태를 치료하는 데 유용할 수 있다. 생체내 투여에 사용되는 상기 조성물은 멸균될 수 있다. 이는 예컨대 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
용도 및 방법
본 문서에 개시된 다중특이적 항체 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 치료될 수 있는 자가면역 질환 또는 상태는 시신경척수염 스펙트럼 장애, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, ANCA 관련 혈관염, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 측면에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 조절하는 방법이 본 문서에 제공된다. 본 발명은 다중특이적 항체 또는 그의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화, 향상 또는 유도하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체 또는 그의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화 또는 증진시키는 것이 바람직한 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법이 본 문서에 제공된다. 특정 실시양태에서, 다중특이적 항체 또는 그의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본 문서에 제공된다.
또한 자가면역 질환 또는 병태의 치료를 위한 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 조절하는 것; 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화, 강화 또는 유도하는 것; 또는 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화 또는 향상시키는 것이 바람직한 질병의 예방 및/또는 치료를 포함하는 본 문서에 개시된 다중특이적 항체 또는 조성물의 용도가 제공된다. 또한 자가면역 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위해하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 조절하는 것; 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화, 강화 또는 유도하는 것; 또는 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화 또는 향상시키는 것이 바람직한 질병의 예방 및/또는 치료를 포함하는 본 문서에 개시된 다중특이적 항체 또는 조성물이 제공된다. 또한 자가면역 질환 또는 상태의 치료를 위한 의약 제조하기 위한 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 조절하는 것; 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화, 강화 또는 유도하는 것; 또는 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화 또는 향상시키는 것이 바람직한 질병의 예방 및/또는 치료를 포함하는 본 문서에 개시된 다중특이적 항체 또는 조성물의 용도가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 다중특이적 항체는당업계에 잘 알려진 분석법, 예컨대 ELISPOT, ELISA 및 세포 증식 분석법을 사용하여 대상에게 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50% , 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는 적어도 10%, 또는 본 문서에 기재된 다중특이적 항체가 투여되지 않은 대상체의 면역 기능에 대해 10% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 또는 75% 내지 95% 범위에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화 또는 향상시키거나 유도한다.
투여 및 투여 경로
본 개시내용의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥내 및 근육내 투여 경로를 비롯한 다양한 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 상태의 치료 및/또는 예방에 효과적일 항체 또는 조성물의 양은 질병의 성질에 의존할 것이고 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 본 개시내용에서, 실제로 투여되는 상기 다중특이적 항체의 양은 치료할 질병, 선택된 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질병의 중증도, 및 활성 성분으로서의 생물활성 폴리펩타이드의 유형을 포함하는 다양한 관련 인자에 비추어 결정된다. 본 발명의 다중특이적 항체는 혈액 내에서 매우 우수한 지속성을 가지므로, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 펩타이드 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저히 감소시킬 수 있다. 조성물에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 질병의 중증도 등을 고려하여 의사의 판단과 각 피험자의 상황에 따라 결정하여야 한다. 예컨대, 유효 용량은 대상 부위, 환자의 생리적 상태(나이, 체중 및 건강 포함), 환자가 사람인지 동물인지, 투여된 다른 약물, 또는 치료가 예방적 또는 치료적인지 여부투여 수단에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 상기 환자는 인간이지만 트랜스제닉 포유류를 포함한 비인간 포유류도 치료할 수 있다. 치료 용량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 최적으로 적정된다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 개시된 다중특이적 항체의 투여량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg의 대상체 체중, 0.1 mg/kg 내지 80 mg/kg의 대상체 체중, 0.1 mg/kg 내지 60 mg/kg의 대상체 체중, 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg의 대상체 체중, 0.1 mg/kg 내지 40 mg/kg의 대상체 체중, 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg의 대상체 체중, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 대상체 체중, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 대상체 체중, 1 mg/kg 내지 100 mg/kg의 대상체 체중, 1 mg/kg 내지 80 mg/kg의 대상체 체중, 1 mg/kg 내지 60 mg/kg의 대상체 체중, 1 mg/kg 내지 50 mg/kg의 대상체의 체중, 1 mg/kg 내지 40 mg/kg의 대상체의 체중, 1 mg/kg 내지 30 mg/kg의 대상체 체중, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 대상체 체중, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 100 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 80 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 60 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 50 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 40 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 30 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 20 mg/kg의 대상체 체중, 5 mg/kg 내지 10 mg/kg의 대상체 체중, 또는 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg 대상체의 체중과 같은 본 문서에 포함된 임의의 투여량 또는 투여량 범위를 포함한다.
특정 실시양태에서, 시험관내 검정은 최적의 투여량 범위를 확인하는 데 도움이 되도록 사용된다. 유효 선량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 도출된 선량 반응 곡선에서 추정할 수 있다.
일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종의 항체보다 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서 인간 항체의 투여량을 낮추고 투여 빈도를 낮추는 것이 종종 가능하다.
키트
본 문서에 기재된 하나 이상의 항체 또는 그의 접합체를 포함하는 키트가 본 문서에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 제공된 하나 이상의 항체와 같은 본 문서에 기재된 약학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트가 본 문서에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 본 문서에 기재된 제약 조성물 및 본 문서에 기재된 것과 같은 임의의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 이러한 용기(들)와 선택적으로 관련된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 통지일 수 있으며, 상기 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다. 또한, 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트가 본 문서에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 문서에 기재된 항체, 예컨대 정제된 항체를 하나 이상의 용기에 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 문서에 기재된 키트는 대조군으로서 사용될 수 있는 실질적으로 단리된 항원(들) (예컨대, 인간 혈청 알부민)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 문서에 기재된 키트는 혈청 알부민 항원과 반응하지 않는 대조군 항체를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 문서에 기재된 키트는 혈청 알부민 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 요소를 포함한다(예컨대, 상기 항체는 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물과 같은 검출 가능한 기질에 접합될 수 있거나, 제1 항체를 인식하는 제2 항체는 검출 가능한 기질에 결합될 수 있다). 특정 실시양태에서, 본 문서에 제공된 키트는 재조합적으로 생성되거나 화학적으로 합성된 혈청 알부민 항원을 포함할 수 있다. 상기 키트에 제공된 혈청 알부민 항원은 또한 고체 지지체에 부착될 수 있습니다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 키트의 검출 수단은 혈청 알부민 항원이 부착된 고체 지지체를 포함한다. 이러한 키트는 또한 비부착 리포터-표지된 항-인간 항체 또는 항-마우스/래트 항체를 포함할 수 있다. 혈청 알부민 항원에 대한 항체의 결합은 상기 리포터 표지 항체의 결합에 의해 검출할 수 있다.
이하, 여러 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 설명한다. 하기 실시예 및 도면은 단지 예시 목적으로 제공되며 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 개시내용을 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
1. 유전자 클로닝
1-1. APB-A1((항-CD40L scFv)2-항-HSA Fab 구조) 클로닝
표준 유전자 재조합 방법을 사용하여 유전자 클로닝을 수행하였다. hu5c8 scFv(서열번호 5)는 포유동물 세포(Cosmo Genetech, Korea)에 적합한 코돈 최적화를 통해 합성되었다. 클로닝은 Macrogen(Seoul, Korea)에서 시판 중인 프라이머를 사용하였으며, PCR(polymerase chain reaction)을 통해 pcDNA3.3 및 pOptiVEC vector(Thermo Fisher Scientific)에 대한 초기 클로닝을 합성된 hu5c8 scFv를 유연한 링커를 통해 각각 SL335 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 연결함으로써 수행하였다. 이후 ExpiCHO-S™ 세포주에서 단백질 발현으로 클로닝을 확인하였다(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). 다음으로, GS null CHO K1 세포주(Horizon Discovery, Cambridge, UK)로부터 생산 세포주를 확립하기 위해 동물 세포 발현 벡터를 이용하여 클로닝을 수행하였고, 즉, 중쇄의 경우 pd2535nt(Horizon Discovery)이고 경쇄의 경우 pd2539(Horizon Discovery)이다. PCR은 95℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 1분간 총 25회의 사이클을 수행하는 조건으로 수행되었으며, 마지막으로 연장을 위해 5분 동안, 이어서 온도를 4℃로 낮추었다. 하기 표 1은 pcDNA3.3 및 pOptiVEC 벡터에 삽입된 APB-A1 중쇄 및 경쇄 유전자를 각각 pd2535nt 및 pd2539 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 생산하기 위한 프라이머 세트를 나타낸다. 또한, pGL3c(lb)(Satorius) 플라스미드 벡터를 추가 벡터로 사용하였다.
프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
APB-A1 중쇄 서열번호 16 (포워드) 5'-gatcaactctagagccaccatggagtggtcctgggtc-3'
서열번호 17 (리버스)
5'-aggaagacgcttttagaggcggccgctcaggaggacttgggctccaccttcttatc-3'
APB-A1 경쇄 서열번호 18 (포워드) 5'-gatcaactctagagccaccatggagacccacagccag-3'
서열번호 19 (리버스)
5'-aggaagacgcttttagaggcggccgctcaggactccccccggttaaagctcttggtcac-3'
구체적으로, 상기와 같은 방법으로 PCR을 수행하여 약 1,600 염기쌍(bp) 길이의 APB-A1 중쇄 및 경쇄의 PCR 산물을 수득하였다. 상기 PCR 산물 및 pd2535nt 벡터의 중쇄 말단을 Bbsl(Thermo Fisher Scientific)로 처리하고; 및 상기 PCR 생성물의 경쇄의 5' 말단 및 pd2539 벡터를 BsrGI(Thermo Fisher Scientific)로 처리하였으며, 상기 PCR 산물의 경쇄 3' 말단과 pd2539 벡터에 제한효소 Bbsl을 처리한 후 T4 DNA ligase(Takara, Japan)를 처리하였다. 이어서 E. coli 균주 DH5-alpha(RBC, Canada)에 열충격을 가하여 생성된 플라스미드를 형질전환시킨 후 제조사의 프로토콜에 따라 midiprep kit(Macherey Nagel™, Germany)를 이용하여 정제하였고 뉴클레아제가 없는 물로 용출하였다. 상기 APB-A1의 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 41 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖도록 하였고, 상기 아미노산 서열의 N-말단으로부터 104번째 아미노산은 글리신(G) 또는 글루타민(Q)에 상응한다.
1-2. APB-B1 ((항-CD40L scFv)2-(항-HSA Fab)-(항-TNF-α Fv)) 클로닝
(1) 인간 혈청 알부민에 결합하는 SL335의 Fab 유전자, CD40L에 결합하는 루플리주맙의 scFv 유전자 및 생물활성 반응기 유전자를 합성하였다. 상기 생물활성 반응기는 항-TNF-α Fv(서열번호 6의 중쇄 및 서열번호 7의 경쇄를 갖는 세르톨리주맙) 또는 항-TNF-α dsFv(서열번호 8의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는 세르톨리주맙), 항-IL-23 Fv(서열번호: 10의 중쇄 및 서열번호: 11의 경쇄를 갖는 우스테키누맙) 또는 항-IL-23 dsFv(서열번호 12의 중쇄 및 서열번호 13의 경쇄를 갖는 우스테키누맙), 또는 항-IFNAR1 Fv(서열번호 14의 중쇄 및 서열번호 15의 경쇄를 갖는 아니프롤루맙) 또는 항-IFNAR1 dsFv(서열번호 39의 중쇄 및 서열번호 40의 경쇄를 갖는 아니프롤루맙)일 수 있다. 하기 표 2, 3 및 4는 APB-B 1(마크로젠, 한국)을 생산하기 위한 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
컨스트럭트 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
(항-CD40L scFv)2
+항-HSA Fab
+항-TNF-α Fv		 서열번호 20 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagtggtcctgggt-3'
서열번호 21 (리버스)5'-ggaggacttgggctccaccttcttatcgac-3'
서열번호 22 (포워드)5'-gtcgataagaaggtggagcccaagtcctcc-3'
서열번호 23 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
서열번호 24 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagacccacagccag-3'
서열번호 25 (리버스)5'-ggactccccccggttaaagctcttggtcac-3'
서열번호 26 (포워드)5'-gtgaccaagagctttaaccggggggagtcc-3'
서열번호 27 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
(항-CD40L scFv)2
+항-HSA Fab
+항-TNF-α dsFv		 서열번호 20 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagtggtcctgggt-3'
서열번호 28 (리버스)5'-tttaccgggggcctgccgaacccagttcat-3'
서열번호 29 (포워드)5'-gcccccggtaaatgtctggaatggatgggg-3'
서열번호 30 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
서열번호 24 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagacccacagccag-3'
서열번호 31 (리버스) 5'-ttcatgcggccgcgaagacgcttttagatcaccgcttaatctcaacttttgttccacatccaaatgtcag-3'
컨스트럭트 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
(항-CD40L scFv)2
+항-HSA Fab
+항-IL-23 Fv		 서열번호 20 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagtggtcctgggt-3'
서열번호 21 (리버스)5'-ggaggacttgggctccaccttcttatcgac-3'
서열번호 22 (포워드)5'-gtcgataagaaggtggagcccaagtcctcc-3'
서열번호 23 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
서열번호 24 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagacccacagccag-3'
서열번호 25 (리버스)5'-ggactccccccggttaaagctcttggtcac-3'
서열번호 26 (포워드)5'-gtgaccaagagctttaaccggggggagtcc-3'
서열번호 27 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
(항-CD40L scFv)2
+항-HSA Fab
+항-IL-23 dsFv		 서열번호 20 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagtggtcctgggt-3'
서열번호 32 (리버스)5'-ttttccgggcatctgccgtacccacccaag-3'
서열번호 33 (포워드)5'-atgcccggaaaatgtctcgattggatagggataatg-3'
서열번호 30 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
서열번호 24 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagacccacagccag-3'
서열번호 34 (리버스) 5'-ttcatgcggccgcgaagacgcttttagatcaccgctttatctccaattttgttccacacccgaatgtata-3'
컨스트럭트 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
(anti-CD40L scFv)2
+anti-HSA Fab
+anti-IFNAR1 Fv		 서열번호 20 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagtggtcctgggt-3'
서열번호 21 (리버스)5'-ggaggacttgggctccaccttcttatcgac-3'
서열번호 22 (포워드)5'-gtcgataagaaggtggagcccaagtcctcc-3'
서열번호 23 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
서열번호 24 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagacccacagccag-3'
서열번호 25 (리버스)5'-ggactccccccggttaaagctcttggtcac-3'
서열번호 26 (포워드)5'-gtgaccaagagctttaaccggggggagtcc-3'
서열번호 27 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
(anti-CD40L scFv)2
+anti-HSA Fab
+anti- IFNAR1
DsFv		 서열번호 20 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagtggtcctgggt-3'
서열번호 35 (리버스)5'-ttttccgggcatctgccgtacccacccaag-3'
서열번호 36 (포워드)5'-atgcccggaaaatgtctcgattggatagggataatg-3'
서열번호 30 (리버스)5'-atcggcggccgcgaagacgcttttagatca-3'
서열번호 24 (포워드)5'-gatcaactctagagccaccatggagacccacagccag-3'
서열번호 37 (리버스) 5'-Tacatgcggccgcgaagacgcttttagatcaacgtttaatctcaagtcgagtcccacacccgaaagtaat-3'
상기 각각의 scFv, Fab, dsFv 및 Fv 유전자의 증폭을 위해 Taq DNA 중합효소(Takara, Japan)를 사용하여 T100™ Thermal cycler instrument(Bio-Rad, Hercules, California)로 각 사이클의 조건은 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 30사이클 동안 PCR을 수행했다. 다음으로, 각각의 연쇄 반응 산물을 (scFv)2-Fab-Fv 또는 (scFv)2-Fab-dsFv 형식으로 조립하기 위해 조립 PCR을 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 사이클링 조건으로 수행하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 중쇄 조립 산물과 pD2535NT 벡터(Horizon Discovery, United Kingdom)를 Bbs I 제한 효소(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts)로 처리하고; 경쇄 조립 생성물 및 pd2539 벡터(Horizon Discovery)를 Bbs I 및 Bsr GI 제한 효소(New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts)로 처리하였다. T4 DNA ligase(Takara)를 이용하여 상기 각각의 제한효소 처리된 연쇄반응 조립 산물과 플라스미드 벡터를 서로 조립하고, 상기 조립된 산물을 CaCh로 처리된 가용성 컴피턴트 세포에 넣고 열충격을 가하여 형질전환시켰다. 다음으로, 카나마이신 항생제가 포함된 배지를 이용하여 상기 형질전환된 클론을 스크리닝하였다.
또한, 재조합 인간 CD40L(rhCD40L-his)을 생산하기 위해 상기와 동일한 방법으로 클로닝 분석을 수행하였다. Cosmo Genetech에서 합성한 재조합 인간 CD40L 유전자(서열번호 38)를 사용하고 제한효소 Xba I(Takara) 및 Not I(Takara)를 사용하여 pcDNA3.3TM® 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 클로닝했다.
(2)CHO 세포를 이용한 일시적 발현에 의해 단백질을 생산하였다. SAFA-기반 이중특이적 항체 및 재조합 인간 CD40L 단백질 시료의 생산을 위해, ExpiCHO 세포(Thermo Fisher Scientific)를 ExpiCHO 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)와 함께 37℃, 140 rpm, 5% CO2 및 80% 습도의 조건의 진탕 배양기에서 배양했다. 일시적 발현 세포의 생산을 위해 125 m 배양 플라스크에 6.0 × 106 세포/㎖ 농도의 조건으로 세포를 파종하였고, 3개의 염기서열이 확인된 유전자(certolizumab, ustekinumab 및 pD2539)를 갖는 플라스미드 벡터 pD2535NT 및 pD2539 아니프롤루맙) 중쇄 및 경쇄가 이에 삽입되고, ExpiFectamine CHO 형질감염 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 접종된 세포에 재조합 인간 CD40L 유전자 삽입 벡터 pcDNA3.3-TOP®를 형질전환시켰다. 진탕 인큐베이터에서 16시간 동안 배양한 세포에 ExpiCHO 피드와 인핸서를 처리한 후 동일한 조건의 인큐베이터에서 3일간 배양하였다. 배양 3일째에 ExpiCHO 사료를 32℃, 140rpm, 5% CO2, 80% 이상의 습도 조건에서 추가 처리하여 배양하였다. 배양 3일째에 ExpiCHO 사료를 32℃, 140rpm, 5% CO2, 80% 이상의 습도 조건에서 추가 처리하여 배양하였다. 배양 9일째에 배양액을 회수하여 4,000 rpm, 15분, 4℃의 조건에서 원심분리하여 배양액에서 상기 세포를 분리하였다. 상기 분리된 배양액을 0.2 pm-필터시트로 여과하여 불순물을 제거하였다.
2. 세포주의 생산
2-1. APB-A1용 GS Null CHO K1 세포주
글루타민 합성(GS)-null CHO K1 세포주(Horizon Discovery)를 사용했다. 4mM L-글루타민이 첨가된 CDfortiCHO(Thermo Fisher Scientific) 배지(Gibco, Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 상기 배양 배지를 80% 습도, 5% CO2 및 37℃의 조건하에서 125 rpm으로 진탕 배양기에서 배양하였다. Horizon Discovery에서 제공한 표준 프로토콜에서 수정된 절차에 따라 Freestyle™Max 시약(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 형질전환을 수행했다. 총 37.6 ㎍의 플라스미드 벡터를 사용하여 경쇄 및 중쇄를 1:1 내지 1:3(pd2539:pd2535nt)의 비율로 공동-형질전환시켜 형질전환을 수행하였다. 형질전환 2일 후 상기 배양된 세포를 꺼내어 50 ㎖ conical tube(Nunc, Denmark)에 옮겨 원심분리한 후, L-글루타민이 포함되지 않은 CDfortiCHO 배양액에 녹이고, COUNTESS II 자동 세포 계수기(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포 농도 및 생존력을 확인했다. 50 mM 메티오닌 설폭시민(MSX)(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)을 첨가하고 부분 선택을 하였다. 그 후 2일 후 MSX가 첨가된 세포에 10 μg/㎖ 퓨로마이신(Gibco)을 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 다음으로, 상기 배양된 세포를 L-글루타민이 포함되지 않은 배양액에 용해시켜 침전 세포 농도가 0.5 × 106 세포/㎖가 되도록 하고, MSX와 퓨로마이신을 함께 첨가하여 전체 선별하였다. 그 후, 상기 세포 농도를 2.0 × 106 세포/㎖를 넘지 않도록 유지하고, 세포 생존율이 90% 이상이 될 때까지 배양하여 세포주를 생산하였다
2-2. APB-B1용 GS Null CHO-K1 세포주
4 mM L-글루타민이 첨가된 CD FortiCHO(Thermo Fisher Scientific) 배양 배지에 접종된 HD-BIOP3 GS-null CHO-K1 세포(Horizon Discovery)를 농도 3.0 × 105 세포/㎖의 조건으로 제조하였고, 파종 배양은 37℃, 5% CO2, 습도 80% 이상의 조건에서 1일 동안 진탕 배양기에서 수행하였다. 형질전환을 위해 세포를 4.8 × 105 세포/㎖의 농도로 파종하고 1일 동안 추가 배양한 후 최종적으로 1.0 × 106 세포/㎖의 농도로 준비하였다. 서열-식별된 세르톨리주맙 관련 SAFA-기반 이중특이적 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터(pD2535NT 및 pD2539)를 OptiPRO SFM 배양 배지 및 Freestyle max 시약(Invitrogen, Carlsbad, California)을 사용하여 파종된 세포에 형질감염시켰다. 그런 다음 37℃, 5% CO2, 습도 80% 이상의 조건에서 2일 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 모두 L-글루타민이 포함되지 않은 CD FortiCHO 배양 배지로 옮기고 50 μm의 메티오닌 설폭시민(MSX)(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)으로 처리하였으며 10 μg/㎖ 퓨로마이신(Thermo Fisher Scientific)을 2일 간격으로 첨가하여 벡터가 포함되지 않은 세포를 제거하였다. 이후 원심분리기를 이용하여 기존 배양액을 제거한 후 7~10일 간격으로 MSX와 퓨로마이신이 모두 포함된 CD FortiCHO 배양액으로 교체하고, 세포수가 5.0 × 105 세포/㎖가 되도록 21일간 배양하였다. 21일 후 세포 생존율이 70% 이상이 되면 세포수가 3.0 × 105 세포/㎖가 되도록 배양하였고, 계대 배양 생산은 세포 생존율이 90% 이상일 때 시작되어 계대 배양 0(제로) 스톡을 산출하고 스톡 3이 생성될 때까지 계속되었다.
3. 단백질의 분리, 정제 및 분석
3-1. APB-A1 단백질
(1) ELISA
96-well MaxiSorp ELISA plate(Nunc)에 본 발명에 따라 제조된 hCD40L 재조합 항원인 rhCD40L(AprilBio, Chuncheon, South Korea)을 탄산염 코팅 완충액(pH 9.6) 사용하여 4℃에서 밤새 100 ng/well 농도로 코팅하였다. 블로킹 버퍼(Starting Block™(PBS)(Thermo Fisher Scientific))로 실온에서 3시간 처리하여 상기 플레이트를 블로킹하고, 세척 버퍼(phosphate buffered saline + 0.1% tween 20; 0.1% PBST)로 세척한 후, APB-A1로 명명된 GS null CHOK1 세포로부터 생산된 항-CD40L scFv)2-항-HSA Fab의 구조를 갖는 재조합 항체의 상등액을 희석 완충액(0.1% PBST + 0.3% BSA; 0.3% PBA)으로 연속적으로 희석하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 결합된 염소-항-인간 Fd 항체(Southern Biotechnology, Birmingham, Alabama)를 2차 항체로 사용하였고, 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(BD science, Franklin Lakes, New Jersey)을 발광에 사용하였다. 흡광도는 ELISA 리더(BMG Labtech, Germany)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. PK ELISA는 rhCD40L 항원을 PBS(Roman Industries, Japan)에 1 μg/㎖ 농도로 희석한 후 ELISA 플레이트에 100 ㎕의 부피로 4℃에서 밤새 코팅하도록 수행하였다. 다음날, 블로킹 완충액(0.3% BSA in PBS, 300 bL)을 각 웰에 첨가하여 25℃에서 3시간 동안 블로킹을 수행하고 표준물질 및 QC 시료을 100 bL의 부피로 각 웰에 옮기고 25℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액(300 ㎕/well)으로 3회 세척한 후 항-인간 경쇄 염소 IgG-비오틴(monkey absorbed; Immuno-Biological Laboratories, Japan)을 각 웰에 100 ㎕/well 농도로 파종하였고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 4회 세척 후 동일한 부피 및 시간 조건에서 Pierce high sensitivity streptavidin-HRP(Thermo Fisher Scientific)를 반응시킨 후 세척하였다. 다음으로, 1-step ultra TMB-ELISA 기질 용액(Thermo Fisher Scientific)을 100 ㎕의 부피로 각 웰에 옮기고 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 정지용액으로 1 mol/L 황산(Wako Pure Chemical, Japan; 100 ㎕/well)을 첨가하고, 마이크로플레이트 믹서를 이용하여 600 rpm으로 10초간 혼합하고, 450 내지 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2) 단백질 정제
생성된 APB-A1을 발현하는 상기 GS null CHO K1 세포주를 WAVE 생물반응기(GE Healthcare)를 사용하여 CDfortiCHO 배양 배지에서 11일 동안 배양하였고, 생성된 상등액 및 세포 펠렛을 4℃에서 4,000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 배양 상등액을 0.2 필터로 여과하였다. APB-A1 단백질은 3단계 크로마토그래피 과정을 통해 정제하였다. 먼저, CaptureSelect IgG-CHI IgG-CHI affinity matrix resin(Life Technologies)를 사용하여 친화성 크로마토그래피 단계를 수행했다. 5 컬럼 부피(CVs)의 PBS로 매트릭스를 세척한 후, 20 ㎖/min의 유속으로 시료 결합을 수행하였다. 목적 단백질 이외의 단백질을 제거하기 위해 4 CV의 고염 세척 완충액(PBS, 500 mM NaCl, pH 7.4) 및 2 CV의 저염 세척 완충액(25 mM 인산나트륨, pH 7.6)을 25 ㎖/min의 유속으로 사용하여 세척 단계를 수행하였다. 용출 완충액(20 mM 시트르산 pH 3.0, 150 mM 염화나트륨)을 20 ㎖/min의 유속으로 매트릭스에 통과시키고, UV 50 mAU 이상의 피크를 갖는 단백질 용액을 수집한 후 1시간 동안 냉장 보관을 위해 250 ml 용기에 옮겼다. 상기 회수한 단백질 용액에 1M tris-HCl(pH 8.0) 용액을 첨가하여 중화한 후, 0.2 필터를 이용하여 불순물을 제거 후 APB-Al을 용출하였다. 다음으로, 25 mM의 인산나트륨(pH 7.6) 용액으로 평형화된 CaptoTM SP ImpRes 수지를 사용하여 양이온 교환 정제를 수행하였다. 멸균된 증류수로 4배 희석한 어피니티 크로마토그래피 용출 시료을 5 ㎖/min으로 설정된 유속으로 컬럼에 결합하고, 30%-50%-100% 용출 단계는 용출 완충액(25 mM 인산나트륨, pH 7.6, 1M 염화나트륨)을 사용하여 수행했다. 각 단계의 용출액을 채취 후 0.2 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다. 이어서, POROS 기반 음이온 교환 50 HQ 수지를 사용하여 음이온 교환 정제를 수행하였다. 먼저 세척 완충액(2M 염화나트륨)을 3 ㎖/min의 유속으로 통과시켜 수지 컬럼을 세척하고, 5 CVs의 20 mM 인산나트륨(pH 6.5) 용액을 평형을 위해 수지 컬럼에 통과시켰다. 불순물을 수지에 결합시키기 위해 시료을 20 mM의 인산나트륨 pH 6.5 완충액으로 투석하고 pH 수준 및 염 농도를 조정하였다. 상기 시료을 5 ㎖/min의 유속으로 수지 컬럼에 통과시켜 단백질 용액을 수집한 후, 0.2 필터를 이용하여 불순물을 제거하고, 상기 수득한 단백질을 정량화하여 분석하였다.
(3) 단백질 분석 - SDS-PAGE
상기 정제된 APB-A1 단백질은 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 분석에 사용한 시료 완충액은 LDS 비환원성 시료 완충액(4x; Thermo Fisher Scientific)과 비환원성 시료 완충액에 5% 머캅토에탄올을 첨가하여 제조한 환원성 시료 완충액(4x), 각각의 상기 시료 완충액을 시료와 혼합하여 수조에 넣고 5분간 끓인 후, 비환원 비등 및 환원 조건에서 분석하였다. 또한, 비환원성 시료 완충액(4x)과 상기 시료을 1:4의 비율로 혼합하여, 열처리를 생략하고 끓이지 않은 조건에서 분석을 수행하였다. 단백질 시료를 4~15% gradient gel(Bio-Rad, Hercules, California)에 1 ㎍/well 농도로 파종한 후, 150V에서 50분간 전기영동하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 전기영동 후 상기 분리된 겔을 Ez-Gel 염색용액(DoGenBio, South Korea)으로 1시간 동안 염색한 후 물로 탈색하였다.
(4) 단백질 분석 - 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
상기 정제된 단백질의 크기와 순도를 평가하기 위해 prominence HPLC(Shimadzu, Japan)와 TSK gel Ultra SW 응집체 컬럼(Tosoh Bioscience, Japan)을 이용하여 SE-HPLC(size exclusion high-performance liquid chromatography)를 수행하였다. 상기 시료을 100 mM NaiHPCE, 100 mM NaiSCE 및 0.05%(w/v) NaN3(pH 6.7)로 희석하고, 상기 희석된 시료 50 ㎍을 15℃에서 자동 시료 주입기로 주입하였으며 이동상(200 mM 포스페이트, pH 6.7, 0.05%(w/v) NaN3(유속: 0.5 ㎖/min))을 사용하여 용출했다. UV 흡광도는 280 nm의 파장에서 측정하였다.
(5) 단백질 분석 - 질량 분석
환원 및 비환원 APB-Al의 분자량은 LC-ESI MS 분광법을 사용하여 측정한 다음 Dionex UHPLC(Thermo Fisher Scientific) 및 Q-TOF 5600+ MS/MS 시스템(AB SCIEX, CA, USA)과 함께 분석했다. Acquity UPLC® BEH1 30 C4, 1.7 ㎛ 컬럼을 사용하였고, 이동상[acetonitrile(ACN; J.T. Baker)]을 300 ㎕/min의 유속으로 APB-Al의 중쇄(H) 및 경쇄(L) 질량을 측정하기 위하여 컬럼에 통과시켰다.
(6) 단백질 분석 - 등전점 집속(IEF)
(4) 정제된 단백질의 등전점을 평가하기 위해 상기 분리된 단백질의 pI 값을 등전 포커싱 겔(pH 3 ~ 10)을 사용하여 측정하였다. 1 mg/㎖의 밀도로 겔에 시료 1㎕, 3 ㎕, 5 ㎕을 로딩한 후 100 V에서 1시간, 200 V에서 1시간, 500 V에서 2시간 동안 등전점 집속을 수행하였고 12% trichloroacetic acid(TCA) 염색 및 coomassie bright blue(CBB) 염색을 실시한 후 ImageMaster™ 2D Platinum(GE Healthcare, ver 5.0)으로 분석하였다.
(7) 단백질 분석 - 전하 변이체 분석
APB-Al의 전하 변이체를 분석하기 위해 Protein-Pak HiRes CM을 사용하여 이온 변화 크로마토그래피를 수행했다. 20 ㎍의 단백질 시료을 30℃에서 자동 시료 주입기에 의해 주입하고, 그런 다음 30분 동안 0에서 40%의 구배로 이동상[25 mM 2-(Nmorpholino) ethanesulfonic (MES), 500 nM NaCl, pH 6.5]을 사용하여 용출하였다. 유속은 0.3 ㎖/min이었고, UV 흡광도는 280 nm의 파장에서 측정하였다.
3-2. APB-B1 단백질
(1) 분리 및 정제
CHO 세포 배양 배지에 존재하는 이중특이적 항체 단백질 시료의 정제를 위해, CaptureSelect IgG-CHI affinity matrix resin(Life Technologies, Carlsbad, California) 및 AKTA 순수 150L 기기(GE Healthcare, Chicago, Illinois)를 사용하여 친화성 크로마토그래피(AC)를 수행하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4) 완충액을 수지 충전 컬럼에 통과시켜 평형화하고, 일시적 발현 세포에서 발현된 단백질을 포함하는 배양 배지를 분리한 후 1.5 ㎖/min의 유속으로 상기 수지 컬럼을 통과시켰다. 그 후, 500 mM NaCl을 포함하는 PBS pH 7.4 완충액을 컬럼에 통과시켜 수지에 비특이적으로 결합하는 물질을 세척하였다. 각 재료에 대한 평형 및 세척 단계는 10 컬럼 부피(CV)로 수행되었다. 상기 수지로부터 SAFA-기반 이중특이적 항체를 용출하기 위해, 150 mM NaCl을 포함하는 20 mM 시트르산, pH 3.0 완충액을 사용하였다. 상기 용출된 완충액을 1M Tris-HCl(pH 8.0)로 처리하여 중성 pH 수준이 되도록 중화시키고 상기 정제된 단백질의 농도를 A280 nm의 파장에서 마이크로플레이트 분광광도계(BMG LABTECH, Germany)를 사용하여 측정하였다. 이중특이적 항체 단백질 시료의 정제를 위해 친화성 크로마토그래피 후 Q 세파로스 HP 레진(GE Healthcare)을 사용하여 하기와 같은 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 수행하였다. 20 mM 구연산염을 약 10 CVs 평형화시킨 후, NaCl이 첨가되지 않은 pH 6.0 완충액을 Q 세파로스 HP 레진에 통과시키고, 어피니티 크로마토그래피를 통해 1차 정제한 상기 단백질을 수지에 통과시킨 후 상기 수지에 결합하지 않은 단백질을 회수하였다. 상기 회수된 단백질의 농도는 A280 nm의 파장에서 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 측정하였다. (scFv)2-Fab-dsFv의 이량체 크기에 해당하는 단백질, 즉 이황화 결합을 포함하는 SAFA-기반 이중특이적 항체와 단량체 크기에 해당하는 단백질(intact form)을 분리하기 위해, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)는 CM 세파로스 FF 수지(GE Healthcare)를 컬럼에 패킹하여 수행하였다. 정제에 앞서, 친화성 크로마토그래피로 정제된 상기 단백질을 NaCl이 첨가되지 않은 20mM 시트르산, pH 6.0 결합 완충액으로 투석하여 전처리 단계를 수행하였다. 약 10 CVs의 결합 완충액을 1.0 ㎖/min의 유속으로 수지가 채워진 컬럼에 통과시켜 평형화시킨 후, 전처리된 단백질을 동일한 유속으로 처리하여 상기 수지와 반응시켰다. 다음으로, 5 CVs의 결합 완충액을 동일한 유속으로 컬럼에 통과시키고, 100 mM NaCl이 첨가된 결합 완충액 3 CV를 추가 처리하여 비특이적 결합 물질을 세척 및 제거하였다. 다음으로, NaCl이 첨가된 결합 완충액 120 mM을 첨가하여 단량체 형태로 존재하는 이중특이적 항체 단백질을 상기 수지로부터 용출시켰다. 상기 정제된 단백질의 농도는 A280 nm에서 측정하였다. 재조합 인간 CD40L 단백질 시료의 정제를 위해 Profmity™ IMAC(Bio-Rad), Hitrap Q HP, 5 ㎖(GE Healthcare), Hitrap SP HP, 5 ㎖ (GE Healthcare) 수지 및 AKTA 순수 150L 기기를 3-단계 크로마토그래피를 수행하는 데 사용했다. 먼저, 20 mM의 인산나트륨 pH 7.2 완충액을 사용하여 3개의 수지를 평형화하고 세척하였다. 단백질 시료의 용출을 위해, 500 mM 이미다졸(Sigma)을 포함하는 인산나트륨 pH 7.2 완충액 20mM을 친화성 크로마토그래피에 사용하였다. 상기 단백질 시료을 음이온 크로마토그래피 및 양이온 크로마토그래피에서 1 M NaCl을 포함하는 15 mM 인산나트륨, pH 7.4 완충액을 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 단백질의 농도는 A280 nm에서 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 측정하였다.
(2) SDS-PAGE 분석
먼저, 상기 정제된 이중특이적 항체 단백질 시료을 비환원성 4 x SDS 시료 완충액(Thermo Fisher Scientific) 및 2-메르캅토에탄올을 포함하는 환원성 시료 완충액으로 희석하였다. 비환원 조건의 경우 열처리에 따른 단백질의 종류와 크기를 비교하기 위하여 100℃에서 5분간 가열한 시료와 가열하지 않은 시료를 준비하였으며, 크기 비교를 위해 단백질 크기 마커(SMObio, Taiwan)와 (scFv)2-Fab 단백질 시료를 함께 처리하였다. 상기 준비된 단백질 시료을 4-15% 15-웰 Miniprotein TGX 프리캐스트 겔(Bio-Rad)에 2 ㎍/well의 밀도로 로딩하고, 전기영동은 1시간 동안 150V에서 트리스-글리신 SDS 실행 완충액에서 수행되었다. 상기 전기영동 종료 후 SDS-PAGE 젤을 EZ-Gel 염색용액(DoGenBio, Korea)으로 1시간 동안 염색하고, 증류수에서 하루 동안 탈색시켰다.
(3) 단백질의 녹는점 분석
이중특이적 항체 단백질 시료의 열적 안정성을 평가하기 위해 단백질 용융 온도를 소수성 염료(5,000 x, SYPRO Orange) 및 Light Cycler 480 II(Roche, Switzerland)를 실시간 PCR 기기로 사용하여 분석했다. 상기 단백질 시료을 300 mglmi 농도의 인산나트륨 pH 7.0 완충액에 희석하고, 각 웰의 최종 농도가 5.4 ㎍/well에 도달할 때까지 5x 시약 및 SYPRO Orange 염료와 함께 ultraAmp PCR 플레이트(Sorenson Bioscience, Salt Lake City, Utah)에 방치하였다. 다음으로, 여기 필터 및 방출 필터를 각각 465 nm 및 580 nm로 설정하고, 20℃ ~ 85℃ 범위 내에서 1℃/min의 속도로 증가하는 온도에 따라 단백질의 변성을 평가하였다.
(4) 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)
상기 정제된 이중특이적 항체의 순도는 컬럼 T SKgel UltraSW Aggregate 7.8 x 300 mm(Tosoh Bioscience, Japan) 및 1260 infinity II LC 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, California)을 aHPLC 기기로 사용하여 분석하였다. 시료 분석 전에 상기 컬럼과 HPLC 기기를 100 mM의 20 mM 시트르산(pH 5.5) 완충액으로 평형화했다. 상기 분석할 시료을 20 mM 시트르산 pH 5.5 완충액으로 희석하고, 상기 시료을 최대 25/ig의 밀도로 컬럼에 로딩하였다. SE-HPLC 분석은 유속 0.7 ㎖/min, 최대 압력 한계 120 bar의 조건에서 30분간 수행하였으며, 흡광도는 A280 nm에서 측정하였다.
(5) 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)
인간 혈청 알부민(Sigma-Aldrich), 재조합 인간 CD40L 단백질 및 재조합 인간 TNF-α 단백질(BioLegend, San Diego, California)에 대한 정제된 이중특이적 항체 시료의 결합 반응을 평가하기 위해 ELISA를 수행하였다. 인간 혈청 알부민, CD40L 및 TNF-α 단백질을 탄산나트륨 pH 9.6 완충액에 1 μg/㎖ 농도로 희석하고, 각 100 ㎕를 96-well maxi sorp plate(Nunc, Denmark)의 각 웰에 파종한 다음 4℃에서 하루 동안 코팅했다. 코팅되지 않은 단백질과 버퍼를 완전히 제거한 후 3% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma-Aldrich) 및 0.1% 트윈-20을 포함하는 PBS pH 7.4 완충액의 각 300i를 각 웰에 첨가함으로써 블로킹을 진행하였다. 2시간 동안 블로킹한 후, 0.1% tween-20 PBS(pH 7.4)가 포함된 버퍼(PBS-T)를 300 ㎕씩 첨가하고, 상기 첨가된 버퍼를 완전히 제거하는 과정을 반복하여 세척을 수행하였고 총 3번 버퍼를 제거하였다. 세척 후 남은 물을 제거한 후, 각각의 항체를 0.3% 소 혈청 알부민 및 0.1% 트윈-20을 포함하는 PBS pH 7.4 완충액(0.3% PBA)에서 100 nM에서 1.0 x 104 nM으로 감소하는 농도로 10배 연속 희석하였고 상기 희석된 항체 시료을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기와 동일한 방법으로 세척한 후, HRP-결합 염소 항-인간 Fd 항체(Southern Biotechnology, Birmingham, Alabama)를 0.3% PBA 완충액으로 1:4,000으로 희석하고 상기 희석된 항체 시료을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 반응하는 상기 항체의 항원 특이적 결합을 평가하기 위해 TMB 기질(BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey)을 첨가하여 반응시켰고 A450 nm에서 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
(6) 생물층 간섭계(BLI) 분석
인간 혈청 알부민에 대한 이중 특이적 항체 및 개별 단일 특이적 항체의 항원 친화성, CD40L 및 TNF-α는 Octet Red 기기(Forte Bio, Fremont, California)를 사용하여 생물층 간섭계(BLI)에 의해 평가되었다. 먼저, TNF-a 단백질(30 μg/㎖), CD40L 단백질(10 μg/㎖) 및 인간 혈청 알부민(20 μg/㎖)을 pH 5.0 아세트산나트륨 완충액을 사용하여 아민 반응성 2세대(AR2G) 바이오센서(Forte Bio)에 고정화하였다. 고정되지 않은 물질은 1M 에탄올아민(pH 8.5)으로 제거하고, 이중특이적 항체를 순차적으로 희석된 농도로 반응시킨 후, 각각의 항원에 대한 결합 및 해리 상수를 측정하였다. 또한, 상기 3개의 항원에 대한 이중특이적 항체의 동시 결합 능력을 평가하기 위해, CD40L 단백질(10 μg/㎖)을 pH 5.0 아세트산나트륨 완충액을 사용하여 AR2G 바이오센서에 고정화하고, 이중특이적 항체(3.2 μg/㎖), 인간 혈청 알부민(13.2 μg/㎖), 인간 혈청 알부민(13.2 μg/㎖), 및 TNF-α(2 μg/㎖) 순으로 결합능을 측정하였다. 상기 평가 결과는 DataAnalysis8 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
(7) 유세포 분석
이중특이적 항체와 세포막 CD40L의 결합을 확인하기 위해 FACSVerse 기기(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 유세포 분석을 수행했다. 세포 표면에 세포막 CD40L을 발현하는 Dl.1 세포(CRL-10915, ATCC, Manassas, Virginia)를 10% 우태아혈청(Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 RPMI1640(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하여 3.0 × 105 세포/튜브를 제조했고 0.3% PBA 완충액으로 2회 세척하였다. 상기 세척된 세포에 SAFA 기반 이중특이적 항체와 대조군 항체를 각각 4℃에서 30분간 반응시킨 후 2회 세척하고, 1:1,000으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate)-결합 염소 항-인간 카파 항체(LifeSpan BioSciences, Inc., Seattle, Washington)를 첨가한 후 4℃에서 30분간 반응시켰다. 다음으로, 세척 단계를 2회 반복하고, FACSVerse 기기를 사용하여 세포막 CD40L에 대한 상기 항체의 결합 반응을 평가하였다.
실시예 2: APB-A1
1-1: 생물층 간섭계를 이용한 결합 분석
인간 혈청 알부민(HSA)(Sigma-Aldrich)과 SL335 사이 및 rhCD40L 항원과 APB-A1 사이의 실시간 결합 분석을 Octet RED 시스템이 장착된 생물층 간섭계를 사용하여 수행하였다. HSA 결합 친화도를 평가하기 위해 20 μg/㎖의 HSA 및 10 μg/㎖의 rhCD40L을 AR2G 바이오센서(pH 5.0)에 고정화했고 역학 완충액(1M 에탄올 아민, pH 8.5)을 사용하여 바이오센서 표면에서 비-결합 분자를 제거하였다. HSA 및 rhCD40L에 대한 APB-A1 결합의 친화성을 확인하기 위해 실험을 10 nM에서 0.3125 nM 범위의 농도에서 수행하였다. 이중특이적 결합을 확인하기 위해 상기 rhCD40L 항원을 AR2G 바이오센서에 고정시키고 APB-A1을 결정된 농도로 1차 반응시켜 HSA에 결합시켰다. 결합 및 해리 역학은 Octet QK 소프트웨어를 사용하여 얻었다.상기 관찰된 결합 곡선이 1:1 결합 모델에 적합하도록 결합 속도 상수를 계산하였다.
1-2: APB-A1 단백질 및 CD40L 발현 세포의 결합 또는 비결합 결정
APB-A1 단백질이 CD40L 세포를 발현하는 Dl.1 세포에 결합함을 확인하기 위해 강원대학교 약학대학에서 유세포분석을 수행하였다. Dl.1 세포를 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 MACS 완충액(0.5% BSA, 1 x PBS 중 2 mM EDTA, 0.22 μm 여과)에 1.0 × 106 세포/㎖ 농도로 재현탁시켰다. 1.5 mL 튜브에 100 mL(1.0×105 cells/test)의 농도로 세포를 파종한 후, 4℃, 500xg 조건에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. APB-A1, hu5c8 IgG1 및 SL335를 각각 1 μg/㎖의 양에서 시작하여 5개의 시점에서 1/10로 연속 희석하고, 첫 번째 희석된 항체의 각 100 ㎕를 피펫을 사용하여 1.5 ㎖ 튜브의 세포 펠렛에 옮기고, 이어서 4℃에서 30분 동안 배양하였다. MACS 완충액을 각각의 튜브에 500 μl씩 첨가한 후, 4℃, 500xg 및 5분의 조건하에서 원심분리하여 세척하였다. 상등액을 제거한 후, 상기 MACS 완충액(Lifespan Biosciences, Washington, Seattle)에 1:1000으로 희석한 염소-항-인간 카파-FITC 시료을 각각 50 ㎕씩 첨가하여 세포 펠렛을 용해시킨 후, 4℃에서 30분 동안 배양하였고 세척 단계를 다시 한 번 반복하였다. 상등액을 제거한 후, 상기 세포 펠릿을 200 bL의 0.4% 파라포름알데히드(PFA 중 PFA) 완충액을 첨가하여 용해시키고, 고정화를 위해 4℃에서 보관하고 상기 세포를 BD FACS verse instrument로 분석했다.
1-3: 시험관내 CD40-CD40L 억제 분석
APB-A1의 CD40-CD40L 상호작용 억제 효능을 분석하기 위해 HEKBlue™ CD40L 리포터 세포(InvivoGen, San Diego, California)를 사용하였고, mCD40L 및 rhCD40L을 발현하는 Dl.1 세포를 CD40L 도너로 사용하였다. 0.2% 소혈청 알부민을 포함하는 Dulbecco's PBS 완충액(Coming)에 20M HSA가 첨가되거나 첨가되지 않은 완충액을 사용하였고, APB-A1, hu5c8 IgG1 및 SL335는 200 nM의 농도에서 시작하여 1/3로 희석되었다. 상기 희석된 시료을 96-웰 세포 배양 플레이트(Coming)에 각각 20 μl씩 파종한 후, 상기 D1.1 세포를 동일한 부피의 1 × 104 세포/웰로 첨가하였으며, 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 다음으로, HEKBlue™CD40L 세포를 웰당 5 × 104 세포의 밀도로 첨가한 후, 동일한 조건의 배양기에서 21시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 상등액을 멀티 피펫을 사용하여 플레이트에서 다른 96-웰 EIA/RIA 플레이트(Coming)로 각각 40 ㎕씩 옮겼다. 각 well에 QUANTI-Blue™ solution(InvivoGen)을 160 ㎕씩 첨가하고, 빛을 차단하기 위해 호일로 싸서, 37℃ CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 방치한 후 분광광도계를 이용하여 655 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 70 ㎕의 300 ng/㎖ rhCD40L 항원을 200 nM에서 시작하여 동일한 농도에서 3개의 시료을 1/3로 희석하여 얻은 희석된 시료 70 ㎕를 포함하는 튜브에 첨가하고, CO2 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 다음으로, HEKBlue™CD40L 세포를 최종 농도가 3.125 x 105 cells/㎖가 될 때까지 희석한 후, 560 ㎕의 희석된 세포를 rhCD40L 항원이 혼합된 시료이 담긴 튜브에 첨가하고, 반전시킨 후, 상기 세포를 200 ㎕/well의 농도로 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 21시간 동안 Dl.1 세포에서와 동일한 방식으로 배양을 수행하였고, 상기 생성된 세포를 기질과 반응시켜 흡광도를 평가하였다.
1-4: 혈소판 응집 분석
인간 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 사전 동의 후 정상적인 건강한 자원자로부터 얻었고 대한적십자혈액센터(KRBC)(대한민국)로 부터 제공되었다. 산-구연산 덱스트로스 용액(0.8% 구연산, 2.2% 구연산나트륨, 2.45% 포도당)에 항응고된 PRP를 120xg에서 10분간 원심분리하여 적혈구를 제거하고, 360xg에서 15분 동안 원심분리하여 플레이트 펠릿을 얻었다. 혈소판은 5.0 × 108/㎖의 최종 농도로 혈소판 불량 혈장(PPP)에 용해되었고 모든 절차는 실온(23 ± 2℃)에서 수행되었다. 혈소판 응집을 평가하기 위해, Chrono-log 응집측정기(CHRONO-LOG®, Havertown, Pennsylvania)를 사용하여 광투과 혈소판응집검사를 수행했다. 상기 PRP는 면역 복합체(IC)를 배치한 후 5분 동안 비최적 농도의 ADP(CHRONO-LOG®)에서 5 내지 10 mM CaCh에서 rhCD40L + hu5c8 IgG1(30 ng/ml + 60ng/㎖), rhCD40L + APB-A1(30 μg/㎖ + 40 ng/㎖), 또는 각각의 rhCD40L, hu5c8 IgG1 및 APB-A1 37℃에서 2분 동안 연속 교반 조건 하에서 자극되었다. 응집 반응이 완료된 후, 상기 혈소판 혼합물을 원심분리하고 세로토닌 EIA 키트(Labor DiagnostikaNord, Germany)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 상등액으로부터 세로토닌의 방출을 측정했다.
1-5: 약동학(PK) 분석 및 약력학(PD) 분석
(1) 약동학 분석
APB-A1의 혈청 반감기를 평가하기 위해 게잡이 원숭이 모델[Shin Nippon Biomedical Laboratories (SNBL, Japan)]에서 약동학 분석을 수행했다. APB-A1 단백질은 단일 정맥 주사를 통해 5 mg/kg(그룹 1) 또는 20 mg/kg(그룹 2)의 용량으로 각 그룹의 3마리의 게잡이 원숭이(수컷) 각각에 투여되었다. 투여 후, 하기 총 17개의 시점에서 혈액 시료을 수집하였다: 투여 전 1점; 및 16점; 투여 후 0.25, 1, 2, 6 및 24시간 및 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 34 및 40일. 각 게잡이 원숭이의 혈소판에 존재하는 상기 APB-A1의 농도를 ELISA로 측정하였다.
(2) PD 분석
APB-A1의 효능을 억제하는 항-파상풍-톡소이드(TT) 항체 반응을 분석하였다(Southern Research, Birmingham, Alabama). 비히클 시료의 총 4개 그룹(음성 대조군: 20 mmol/L 인산나트륨, pH 6.5) 덱사메타손(DXT)(양성 대조군), 및 APB-A1(5 mg/kg 및 20 mg/kg)을 게잡이 원숭이(암컷; n=3/그룹)의 정맥내 투여하였다. 첫째, 항-TT 항체 반응의 유도를 위해 TT(5 Lf)를 1일째에 근육내 투여하고 20일째에 부스팅을 위해 2차적으로 근육내 투여하였다. DXT는 첫 번째 TT 주사 2일 전과 첫 번째 TT 주사 후 1, 5, 8일에 각각 1 mg/kg씩 총 4회 주사하였으며, APB-A1은 첫 번째 TT 주입 시(1일차) 1회 주입되었다. 주사 전, 10, 12, 14, 16, 20, 27, 30, 및 40일에 분석하고자 하는 혈액 시료을 채취하고, ELISA로 항-TT IgG 항체 값을 측정하였다. 2차 항체 반응 분석을 위해, 면역표현형을 통한 다양한 B 세포 면역표현형을 조사하였다. 상기 혈액 시료은 TT 주사 약 2시간 후에 총 5회 채취하였으며, TT 주사 후 20일, 27일, 30일, 40일째에, 상기 수집된 혈액 시료은 주입되지 않은 부분에서 혈액 응고를 방지하기 위해 튜브를 포함하는 K2-EDTA에 보관되었다. 면역표현형검사는 CD45, CD20, CD27, Ki67 및 IgD와 같은 마커에 대한 항체 패널 및 CD45 +/20+, CD45+/20+/Ki67+, CD45+/20-/27hi/IgD- 및 CD45+20+/27+IgD-/Ki67+를 포함하는 4개 세포군의 미리 결정된 부분을사용하여 시행하였다
실시예 3: APB-B1
1-1: 마우스 L929 세포를 이용한 TNF-α 매개 세포독성 억제 효과 시험
이중특이적 항체와 모항체(세르톨리주맙 Fab')의 가용성 TNF-α 단백질 억제능을 비교하기 위해, 세포 표면에 TNF 수용체를 발현하는 L929 마우스 세포 및 재조합 가용성 TNF-α 단백질을 사용하였다. L929 세포(한국 세포주 은행)는 10% 우태아혈청을 포함하는 RPMI1640 배양 배지와 함께 37℃, 5% CO2 및 80% 이상의 습도 조건에서 배양되었다. L929 세포를 5.0 x 104 cells/well 농도의 조건으로 96-well cell culture plate(Corning Inc., New York City, New York)에 도말하였고 상기와 동일한 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후 기존 배양액을 제거하고 1 μg/㎖ 농도의 10% 우태아혈청을 포함하는 RPMI1640 배양액으로 희석한 악티노마이신 D(Sigma-Aldrich)를 각 웰에 처리하고, 37℃, 5% CO2, 습도 80% 이상의 조건하의 배양기에서 30분간 반응시켰다. 다음으로 농도에 따라 순차적으로 희석된 항체를 각 웰에 처리하고, 재조합 가용성 TNF-α 단백질을 10 ng/㎖ 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2 및 80% 이상의 습도 조건의 배양기에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 24시간 후, CCK-8(Dojindo, Japan) 10 ㎕를 각 반응물이 들어있는 웰에 멀티채널 피펫으로 옮겨 처리하였다. 반응 2시간 후 상등액을 피펫을 이용하여 다른 플레이트로 옮기고 A450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
1-2: CD40L HEK-blue™ Reporter Cells를 사용한 CD40L 및 TNF-α의 억제
세포막 CD40L 및 가용성 TNF-α 단백질 중 하나 또는 둘 모두에 대한 이중특이적 항체 및 모 항체(루플리주맙 IgG1 및 세르톨리주맙 Fab')의 동시 억제 능력을 분석하였다. 이를 위해 SEAP(secreted 태아 알칼리성 인산분해효소)를 발현하는 CD40L HEK-Blue™ 리포터 세포(InvivoGen, San Diego, California) 및 재조합 가용성 TNF-α 단백질을 이용하여 CD40L 및 TNF-α, 세포 표면에 세포막 CD40L을 발현하는 Dl.1 세포, 및 재조합 가용성 TNF-α 단백질과 반응함으로써 분석을 수행하였다. 상기 CD40L HEK-Blue™ 세포를 10% 우태아혈청과 항생제(Normocin, Blasticidin 및 Zeocin)를 포함하는 DMEM(Thermo Fisher Scientific) 배양 배지와 함께 37℃, 5% CO2 및 80% 이상의 습도 조건에서 배양했다. 상기 Dl.1 세포를 10% 우태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배양 배지를 사용하여 동일한 조건하에 있는 배양기에서 배양하였다. 다음으로, 상기 Dl.1 세포를 5.0 × 104 세포/웰 농도의 조건하에 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하거나 재조합 가용성 TNF-α 단백질을 10 ng/㎖의 농도로 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 두 종류의 시료에 대한 동시 결합 반응을 평가하기 위해 Dl.1 세포와 재조합 가용성 TNF-α 단백질을 96웰 세포 배양 플레이트에 함께 플레이팅했다. 상기 연속 희석된 시료(인간 혈청 알부민으로 전처리됨)을 세포 및 재조합 단백질 중 하나 또는 둘 모두가 플레이팅된 96-웰 세포 배양 플레이트에 처리하고, 37℃, 5% CO2, 습도 80% 이상의 조건하의 배양기에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 반응 후 상기 플레이트의 모든 웰에 CD40L HEK-Blue™ 세포를 5 x 104 cells/well의 농도로 처리한 후 동일한 조건의 배양기에서 21시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 37℃의 물에서 30분간 반응시킨 QUANTI-Blue 시약(SEAP 검출 시약, InvivoGen)을 각각 160 ㎕씩 새로운 96웰 세포 배양 플레이트의 모든 웰에 파종하고, Quanti-Blue 시약이 들어있는 각 웰에 배양기에서 21시간 동안 반응시킨 반응액을 40 ㎕ 씩 넣어 반응시켰다. 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시킨 후, 655 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 4. 결과
1. APB-Al에 대한 실험 결과
(1) APB-A1의 발현 및 생산
APB-Al을 생산하기 위해, hu5c8 scFv(VL + VHp가요성 링커, 서열번호 3-GGGGS GGGGS GGGGS; 링커 1)-SL335 Fd(VH + CHI)(APB-A1 중쇄로 지칭됨) 유전자, 및 hu5c8 scFv(VL + VH)- 가요성 링커(서열번호 4-GSTSGSGKPGSGEGSTKG; 링커 2)-SL335 카파(VL + CL)(APB-A1 L 경쇄로 지칭됨) 유전자는 연결 PCR에 의해 연결되었다. pcDNA3.3 및 pOptiVEC 벡터에 각각 클로닝한 후, 유전자를 일시적 발현을 위해 ExpiCHO-S™ 세포주에 형질전환시키고, 101.7 kDa-APBAl을 정상적으로 발현하는지 여부를 웨스턴 블랏으로 확인하였다(APB-A1 H 사슬; 50.7 kDa-483 아미노산 및 APB-A1 L 사슬; 50.9 kDa-478 아미노산). 다음으로 안정적인 표현을 위해 상기 CHO 세포, 상기 APB-A1 H 및 APB-A1 L 유전자를 각각 pd2535nt 및 pd2539 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 생성하고(도 1a), 아미노산 서열분석을 통해 이상이 없음을 확인하였다(도 1b). 도 1a는 pd2535nt 및 pd2539 벡터에 삽입된 APB-A1 중쇄 및 경쇄를 나타낸다. 도 1b는 APB-A1H(총 483개 아미노산) 및 APB-A1L(총 478개 아미노산)의 아미노산 서열을 나타내고, 이는 링커 1 및 링커 2에 의해 연결된 hu5c8 scFv를 갖는 SL335 H 및 SL335 L이다. 상기 재조합 벡터를 사용 전에 GS null CHO K1 세포에 형질전환시키고 MSX와 퓨로마이신을 이용하여 스크리닝하여 안정적인 CHO 세포주를 확립하였다. 시험관 내 및 생체 내 효과 평가에 사용되는 APB-A1 단백질 생산을 위해 안정한 CHO 세포주를 생물반응기에서 배양하고 상등액을 획득하고, 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피의 총 3단계를 통해 정제를 수행하였다. 상기 APB-A1 단백질은 첫 번째 단계로 어피니티 크로마토그래피를 통해 95% 이상의 수율로 획득하였으며, 상기 APB-A1 시료은 불순물 및 내독소 제거를 위한 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계의 두 번째 및 세 번째 단계를 사용하여 82%의 수율로 수득되었다. 다음으로, 상기 단백질의 순도를 평가하기 위해 천연 조건에서 SE-HPLC를 수행하였으며, 총 3회 반복 실험한 결과 완전한 APB-Al 시료의 순도가 95% 이상임을 확인하였고, 도 2a는 반복된 실험 중 하나를 나타낸다. 정제과정을 통해 얻은 상기 시료의 순도와 분자량을 확인하기 위하여 환원, 비환원(가열) 및 비환원(비가열) 조건(도 2b)에서 SDS-PAGE로 상기 시료을 분석하였다. 이와 같이, 도 2a는 HPLC로 확인된 APB-A1 특성 분석 결과이고 도 2b는 SDS-PAGE로 확인된 APB-A1 특성 분석 결과이다. 정제된 GS null CHO K1 세포 배양액의 상층액에서 정제한 APB-A1의 특성을 도 2a의 HPCL 분석에서 (A) HPLC 및 (B) SDS-PAGE에 의한 환원성(R), 비환원성(가열)(NR(B)) 및 비환원성(비가열)(NR(NB)) 조건하에서 4~15% 구배젤에서 확인하였다. 순도는 95% 이상이었다. 도 2b에 나타낸 SDS-PAGE 겔에서 단백질 밴드는 Ez-겔 염색 용액에 의해 가시화되었다. 전술한 바와 같이, APB-A1H(50.7kDa) 및 APB-A1L 폴리펩타이드(50.9kDa)의 이론 분자량은 각각 50.7kDa 및 50.9kDa이었다. 환원(R) 조건에서 분자량 크기가 약 50kDa인 두 개의 단백질 밴드가 확인되었으나 APB-A1 H 및 L 폴리펩타이드의 분자량이 서로 매우 유사하기 때문에(도 2b의 레인 R) 상기 두 밴드를 정확하게 구별하는 것은 상당히 어려웠다. 비환원(가열) 조건에서는 환원 조건보다 약간 작은 크기[도 2b의 레인 NR(B)]의 위치에서 두 개의 밴드가 확인되었으며, 웨스턴 블롯팅을 통해 상기 두 밴드의 APB-A1 H 밴드가 APB-A1 L 밴드보다 약간 높게 위치했음을 확인했다(데이터는 표시되지 않음). 비환원(비가열) 조건에서, 확인된 APB-Al의 분자량 크기는 이론적인 분자량 크기(101.6 kDa)[도 2b의 레인 NR(NB)]보다 작은 것으로 확인되었다.
(2) APB-Al의 분자 특성
APB-A1 단백질의 질량을 정확하게 측정하기 위해 환원 및 비환원 조건에서 Q-TOF 분석을 수행하였다. APB-A1의 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 측정된 질량은 50.77 kDa 및 50.98 kDa였다(도 3). 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 정제된 APB-Al 단백질의 특성은 질량분석기(ProteomeTech, South Korea)를 이용하여 확인하였다. 질량 분석에서 상기 단백질 시료은 환원 및 비환원 조건에서 분석되었다. 상기 APB-A1 중쇄 및 경쇄의 이론 분자량은 50,777 Da 및 50,994 Da였으며, 이는 본 실시예의 질량 분석 분석에 의해 측정된 값과 실질적으로 동일하다. APB-A1에 N-결합 글리코실화 부위가 없는 것을 고려하면, 글리코실화 예측 소프트웨어를 이용하여 확인한 바와 같이, APB-A1 H 및 L 피크 이외의 피크는 실제로 Q-TOF 분석을 통해 관찰되지 않았으며, APB-A1은 N-연결된 글리코실화를 포함하지 않을 것으로 예측되었다. pi 분석 소프트웨어를 이용하여 얻은 분석 결과에서 확인된 바와 같이, APB-Al의 이론적인 pi 값은 8.65이고 pH 3-10에서 등전점 집속(IEF) 및 모세관 등전점 집속(cIEF)의 실제 측정값은 각각 9.16 및 9.2였다(도 4a 및 4b). 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이, 상기 정제된 APB-A1 단백질에 대한 pI 분석은 ProteomeTech에 의해 수행되었다. 도 4a에 도시된 pH 3-10에서 등전점 집속(IEF) 겔에 의해 확인된 pI 값 및 도 4b에 도시된 모세관 등전점 집속(cIEF)은 각각 9.16과 9.2였다. APB-Al의 전하 변이체를 정확하게 분석하기 위해 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)를 이용하여 전하 변이체 실험을 반복적으로 수행하였고, UPLC 분석은 시료의 76.3%가 일정한 전하를 갖는 주요 피크를 갖고, 4.6%가 산 피크를 갖고, 19.1%가 염기성 피크를 가짐을 나타내는 피크 프로파일을 생성하였다(도 5).
(3) APB-A1의 시험관내 기능적 특성
HSA 및 rhCD40L 항원에 대한 APB-A1의 결합 친화도를 평가하기 위해, Octet Red 기기를 사용하는 생물층 간섭계를 수행하였다. 따라서, 상기 APB-Al-HSA 평형 해리 상수(KD)가 SL335-HSA KO(각각 748 pM 대 286 pM)보다 약 2.6배 큰 것을 확인하였고, APB-A1-rhCD40L 해리 상수는 hu5c8 IgG1-rhCD40L KO보다 약 2.6배 더 높게 나타났다(각각 127 pM 대 49.6 pM). HSA 및 rhCD40L 항원에 대한 APB-A1의 결합 친화성을 확인하기 위해 Octet Red 기기를 사용한 생물층 간섭 측정을 다시 수행하였다. 평가 결과, 상기 HSA 및 rhCD40L 항원에 대한 APB-A1의 평형 해리 상수(Ku)는 각각 628 pM 및 186 pM인 것으로 확인되었다. 상기 두 결과의 평균은 하기 표 5에 나와 있다.
바인더 리간드 KD(M) Kon(1/Ms) Kdis(1/s)
HSA APB-A1 6.88E-10 8.04E+05 5.60E-04
hCD40L 1.57E-10 7.44E+05 1.15E-04
또한, APB-A1이 HSA 및 rhCD40L 항원에 동시에 결합함을 확인하기 위해, AR2G 바이오센서에 rhCD40L 항원을 고정하고 APB-A1과 HSA가 순차적으로 반응하도록 생물층 간섭계(bio-layer interferometry)를 수행하였다. 그 결과, APB-A1이 HSA 및 rhCD40L 항원에 동시에 결합할 수 있음을 확인하였다(도 6). 세포 기반 시험관 내 평가를 위해 mCD40L을 발현하는 Dl.l 세포를 사용하였고, 예비 실험으로, 대조군인 APBA1 및 hu5c8 IgG1이 D1.1 세포에 의해 발현되는 mCD40L에 결합하는지 여부를 유세포 분석에 의해 확인하였다. 분석 결과, 음성대조군인 SL335는 D1.1 세포의 mCD40L에 결합하지 않은 반면, APB-A1과 hu5c8 IgG1은 결합하는 것을 확인하였다(도 7). 도 7에 나타낸 바와 같이, mCD40L을 발현하는 상기 D1.1 세포에 APB-A1(a) 및 hu5c8 IgG1(b)을 결합시키고, 상기 D1.1 세포에 결합하지 않는 SL335(c)를 음성 대조군으로 사용하였다. 다음으로, CD40-CD40L 상호작용을 억제하기 위한 APB-A1의 효능을 확인하기 위해, HEKBlue™ CD40L 리포터 세포를 상기 Dl.l 세포 또는 HSA가 있거나 없는 rhCD40L 항원과 결합한 다음 여기에 APB-A1, hu5c8 IgG1 및 SL335(0.01 내지 22.2 nM 범위의 농도)를 첨가하여 반응시켰다. 이어서 상기 리포터 세포의 알칼리성 포스파타제(AP) 반응을 측정하였다(도 8a 내지 8d). 도 8a 내지 8d에서 HSA의 부재 하에 CD40L-CD40 상호작용을 억제하는 APB-A1 및 hu5c8 IgG1의 용량은 0.9907 nM 및 0.289 nM(도 8d) 및 HSA 존재 하에 1.031 nM 및 0.4729 nM이었다(도 8c). HSA의 부재 하에 가용성 CD40L과 CD40 사이의 상호작용에 대한 APB-A1 및 hu5c8 IgGl의 억제 능력에 대한 IC50 값은 1.031 nM 및 0.4729 nM(도 8d)이고 HSA의 존재 하에 0.6371 nM 및 0.501 nM(도 8c)이다. 리포터 세포와 D1.1 세포의 조합을 사용한 실험에서, APB-A1은 HSA 부재하에서 hu5c8 IgG1보다 약 3배 더 낮은 낮은 억제 효능을 나타내었고, APB-A1 및 hu5c8 IgG1은 HSA의 존재 하에 실질적으로 동일한 억제 효능을 나타내었다(도 8a 및 8b). 유사하게, 리포터 세포와 rhCD40L 항원의 조합을 사용한 실험에서, APB-A1의 억제 효능은 HSA의 부재 하에 hu5c8 IgG1의 억제 효능보다 약 2.1배 낮았지만, APB-A1 및 hu5c8 IgG1은 HSA의 존재 하에 억제 효능이 실질적으로 동일한 것으로 입증되었다(도 8c 및 8d). 한편, 음성 대조군으로 사용된 SL335는 어떠한 조건에서도 억제 효능을 나타내지 않았다(도 8a-8d). Dl.1 세포를 사용하는 경우, 상기 CD40L-CD40 상호작용 억제능을 나타내는 IC50 값은 도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이 각각 HSA 부재 시 0.9907 nM, HSA 존재 시 0.2988 nM이었다. 양성 대조군인 hu5c8 IgG1의 IC50 값은 약 0.2 내지 0.3 nM으로 확인되었으며, 이는 HSA의 존재 또는 부재가 hu5c8 IgG1의 IC50 값에 영향을 미치지 않았음을 의미한다(도 8a 및 8b). rhCD40L 항원을 사용했을 때 IC50 값은 위에서 언급한 실험과 실질적으로 동일한 결과인 HSA가 없을 때 1.031 nM, HSA가 있을 때 0.6371 nM이었고, hu5c8 IgG1의 IC50 값은 약 0.47 내지 0.5 nM인 것으로 확인되었다(도 8c 및 8d).
(4) 혈소판 응집에 대한 APB-A1 효과의 분석
기존 항-CD40L IgG 항체의 대표적인 부작용으로 알려진 상기 혈소판 응집이 APB-A1에 의한 것인지 여부를 확인했다. 이를 위해 rhCD40L hu5c8 IgG1 IC 및 rhCD40L + APB-A1 IC를 생성한 후 ADP에 의해 자극된 상기 혈소판과 반응시키고, 투과율을 측정하여 혈소판 응집의 발생 여부를 판단하였다. 상기 결과는 상기 rhCD40L hu5c8 IgG1 IC만이 혈소판 응집을 강력하게 자극함을 보여주었다(도 9a 내지 9d). 도 9a 내지 9d에서, PRP는 2분 동안 37℃에서 5 내지 10mM CaCh의 존재하에 hCD40L(30 μg/㎖) 및 상이한 농도(6 ng/㎖, 60 ng/㎖ 및 600 ng/㎖)의 hu5c8 IgG1 또는 상이한 농도(4 ng/㎖, 40 ng/㎖ 및 400 ng/㎖)의 APB-A1과 함께 사전 배양되었다. 다음으로, 지속적으로 교반하면서 최적 농도 미만의 농도에서 ADP에 의해 상기 혈소판을 추가로 자극하였다. 상기 시료 hu5c8 IgG1 + rhCD40L IC의 경우, 혈소판 응집이 발생하였으나(도 9a 및 9b), 상기 시료 rhCD40L + APB-A1의 경우 혈소판 응집 속도가 낮았다(도 9c 및 9d). 상기 데이터는 최소 6명의 다른 기증자를 사용한 실험의 표준편차(SD)를 나타낸다. 도 9a 내지 도 9d에 나타낸 결과를 정량적으로 분석하기 위해, 혈소판 응집률(%)을 계산하였고, 상기 계산 결과는 시료 rhCD40L + hu5c8 IgG1 IC가 60 ng/㎖ 및 600 ng/㎖의 농도에서 약 80% 이상의 반응을 나타내는 반면, 상기 시료 rhCD40L + APB-A1은 400 ng/㎖의 농도에서 약 10% 미만의 혈소판 응집을 나타내었다(도 9d). 또한 상기 혈소판이 활성화되었을 때 분비되는 세로토닌의 농도를 측정한 결과, rhCD40L + APB-Al 및 기타 시료의 그룹에 의한 활성화에 따라 세로토닌 방출량 증가는 없었으나 세로토닌 방출 수준은 rhCD40L + hu5c8 IgG1 IC에 의한 활성화로 약 300 pg/㎖로 증가되었다(도 10). 도 10에 나타낸 바와 같이, 재조합 rhCD40L + hu5c8 IgG1의 경우 상기 세로토닌의 방출량이 증가하였으나, 다른 그룹에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 상기 데이터는 4개 이상의 독립적인 실험의 평균값 ± 표준편차(SD)를 나타낸다(*** p < 0.001 IC(재조합 hCD40L + hu5c8 IgG1) 대조군과 비교).
(5) APB-A1에 대한 약동학 연구
APB-A1의 생체내 반감기를 평가하기 위해, 게잡이 원숭이 모델(n=3/그룹)을 사용하여 약동학적 검정을 수행하였다. APB-A1은 단일 정맥 주사를 통해 5 mg/kg 및 20 mg/kg의 두 가지 용량으로 투여되었다. 재료 및 방법 섹션과 동일한 시점에서 혈액 시료을 수집한 후, PK ELISA를 사용하여 혈장 내 APB-A1 농도를 측정하였다(도 11). 도 11에 도시된 바와 같이, 정제된 APB-A1 항체를 다양한 농도(5 mg/kg 및 20 mg/kg)로 수컷 게잡이 원숭이(n=3)에 주사하였다. 상기 실험은 SNBL에 의해 수행되었다. 각 지점에서 시료의 APB-Al 농도는 ELISA로 측정하였으며, 상기 데이터는 수행된 실험의 평균을 나타낸다. 반감기는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(ver 6.4; Certara LP, Princeton, NJ, USA)를 사용하여 ELISA 결과를 기반으로 한 데이터를 사용하여 계산되었고 5 mg/kg APB-A1 및 20 mg/kg APB-A1의 반감기는 각각 약 7일 및 9.6일인 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 APB-A1 반감기는 20 mg/kg의 투여량에서 증가하여 5 mg/kg의 투여량에 비해 약 1.4배 더 긴 것으로 이해되었다. Cmax 값은 각각 5 mg/kg 및 20 mg/kg의 용량에서 143 ㎍/㎖ 및 509 ㎍/㎖였으며, 신장 제거율(CL)은 4.44 ㎖/day/kg 및 4.72 ㎖/day/kg으로 용량에 관계없이 유사한 수준이었다(하기 표 6 참조).
종 그룹 단일 투여량
(mg/kg)		 T1/2
(day)		 Cmax
(㎍/㎖)		 AUCinf
(㎍·day/㎖)		 CL
(㎖/day/kg)		 Vdss
(mg/kg)
게잡이 원숭이 1 5 6.94±4.6 143±18 1130±80 4.44±0.32 54.1±9.7
2 20 6.59±0.79 509±23 4290±580 4.72±0.6 64.1±6.0
(6) APB-A1 약력학 검정
APB-A1의 생체내 효능을 평가하기 위해, 게잡이 원숭이(n=3/그룹)를 사용하여 약력학 연구를 수행하였다. 먼저, TT를 동물에게 2회 근육주사하여 1차 및 기억 항-TT 항체 면역반응을 유도하고, 비히클(음성 대조군, 단일 용량 주사 1회), 양성 대조군(DXT; 1 mg/kg, 4회 용량 주사) 및 APBA1(5 mg/kg 또는 20 mg/kg, 단일 용량 주사 1회) 각 동물에게 정맥 내 투여하였고 혈청에서 생성된 항-TT IgG 항체의 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 상기 단일 용량의 TT 주사에 의해 유도된 상기 1차 항-TT IgG 면역 반응은 통계적으로 유의하지 않았지만, 상기 비히클 대조군은 정상적인 1차 항-TT IgG 면역 반응을 유도한 반면 상기 1차 항-TT IgG 면역 반응은 DXT 및 APB-Al 주입 그룹에서는 관찰되지 않았다(도 12a). 도 12a 및 12b에 나타낸 바와 같이, 기억 항체 반응의 억제를 분석하기 위해 파상풍 톡소이드(TT)를 암컷 게잡이 원숭이(n=3)에 비히클, DXT 및 APB-A1(5 mg/kg 및 20 mg/kg)과 함께 주사하였다. 상기 실험은 SNBL에 의해 수행되었다. (A) 항-TT 항체 수준은 ELISA로 측정하였다. (B) 기억 B 세포 백분율은 5 mg/kg APB-Al 및 20 mg/kg APB-Al의 두 그룹에서 유의하게 감소했다(* p < 0.03 대 t-검정에 의한 비히클 대조군). 상기 1차 TT 주사 후 20일 후에 기억 항-TT IgG 면역반응을 유도하기 위해 2차 TT 주사를 시행한 후 혈청에서 생성되는 항-TT IgG 항체의 농도를 측정하였다. 그 결과, 2차 TT 주사 후 비히클 대조군 및 DXT 그룹에서 정상적인 항-TT IgG 면역 반응이 나타났고, APB-A1 주입 그룹은 용량 의존적 방식으로 27일째에 제2 항-TT IgG 면역 반응을 억제하는 데 통계적으로 유의한 효과를 입증했다. 초기 CD40-CD40L 반응에서 APB-Al이 억제력을 가지고 있음이 확인되었으며, 각 그룹의 집단 비율은 면역 표현형을 통해 비교되었다. 기억 B 세포(CD45+20+/27+IgD-/Ki67+) 및 B 세포의 분열 집단(CD45+/20+/Ki67+)은 제2 TT 주사 후 27일까지 APB-A1 up의 통계적으로 유의한 억제 효능을 입증했다(도 12b). 형질세포(CD45+20-/27hi/IgD-)와 총 B세포(CD45+/20+)의 분석에서 군간 차이가 없음을 확인하였고, 비히클 대조군에 대한 전반적인 억제 효과는 30일 및 40일에 점차적으로 감소하였다(데이터는 나타내지 않음).
2. APB-B1에 대한 실험 결과
(1) SAFA-기반 이중특이적 항체의 생산
SAFA-기반 이중특이적 항체 생산을 위해, 중쇄의 CHI(hinge region, EPKSC-)와 경쇄의 CL(NRGEC-) 사이에 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인을 세린(Ser)으로 치환하고, 2개의 사슬간 이황화 결합이 제거된 SL335 Fab, EPKSS- 및 NRGES-의 돌연변이 형태를 사용하였다. 인간 CD40L에 결합하는 scFv 항체 단편[루플리주맙(또는 hu5c8)으로부터 유래된 VH 및 VL 유전자 서열 포함]은 (GGGGS)3 또는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 펩티드 링커를 사용하여 SL335 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 융합되었고, TNF-α에 결합하는 Fv 항체 단편(세르톨리주맙 페골 유래 VH 및 VL 유전자 서열 포함), IL-23에 결합하는 Fv 항체 단편(우스테키누맙 유래 VH 및 VL 유전자 서열 포함), 및 INFAR1에 결합하는 항체 단편(아니프롤루맙에서 유래된 VH 및 VL 유전자 서열을 가짐)을 펩티드 링커를 사용하여 SL335 Fab의 C-말단에 각각 융합시켰다. Fv 융합의 경우, C-말단 중쇄 VH 단편과 C-말단 경쇄 VL 단편이 융합되었다. Fv의 VH 단편과 VL 단편 사이에 형성된 인공 사슬간 이황화 결합의 유무에 따른 항체 기능을 비교하기 위해, 이황화 결합이 없는 (scFv)2-Fab-Fv 형식은 VH의 G44C(G542C, 도 14) 및 VL의 Q100C(Q593C, 도 13a)로 치환되었고, 각각 이황화 결합을 갖는 (scFv)2-Fab-dsFv 형식을 생성한다. 도 13a 및 13b, 항-CD40L scFv, 항-HSA Fab 및 항-TNF-α Fv를 갖는(이황화 결합이 있거나 없음) APB-Bla(a), (scFv)2-Fab-Fv 컨스트럭트 및 APB-Blb(b), (scFv)2-Fab-dsFv 컨스트럭트는 (GGGGS)3(서열번호 3) 및 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 펩티드 링커에 의해 연결된다. (scFv)2-Fab-dsFv는 항-TNF-α dsFv 단편의 가변 경쇄(VL)와 가변 중쇄(VH) 사이에 사슬간 이황화 결합(ss)을 포함하는 반면, (scFv)2-Fab-Fv는 사슬간 이황화 결합을 포함하지 않는다. 도 13c는 DNA 클로닝 후 재조합 pD2539 및 재조합 pD2535NT를 나타내는 도면이다. 여기서, 세르톨리주맙 유래 Fv 및 dsFv와 융합된 이중특이적 항체를 각각 APB-Bla 및 APB-Blb로 명명하였다(도 13a 및 13b). 도 14, APB-Blb의 중쇄 및 경쇄 사이의 사슬간 이황화 결합에 대해, 상기 중쇄의 G542C 잔기 및 상기 경쇄의 Q593C 잔기는 굵게 표시된다. 상기 펩티드 링커[(GGGGS)3 및 GSTSGSGKPGSGEGSTKG]의 잔기는 밑줄이 그어져 있다. 상기 생산된 SAFA-기반 이중특이적 항체 단백질은 이론상 최대 128 kDa의 크기를 가지며, CHO 세포 발현 시스템을 활용하기 위해 APB-Bla 또는 APB-Blb를 구성하는 2개의 폴리펩타이드 코딩 유전자(N'-항-CD40L scFv-SL335 H 사슬-항-TNF-a VH-C 및 N'-항-CD40L scFv-SL335 L 사슬-항-TNF-α VL-C)를 각각 포유동물 발현 벡터인 pD2535NT 및 pD2539 벡터에 클로닝하여 재조합 pD2535NT 및 재조합 pD2539 벡터를 생산한다(도 13c). 우스테키누맙 및 아니프롤루맙 유전자 유래의 SAFA-기반 이중특이적 항체를 상기와 동일한 방법으로 클로닝하여, 재조합 pD2535NT 및 재조합 pD2539 벡터를 생성하였다(데이터 미도시). SAFA-기반 이중특이적 항체 단백질을 생산하기 위해, 상기 생산된 재조합 pD2535NT 및 재조합 pD2539 벡터, ExpiCHO 세포 및 HD-BIOP3 GS null CHO-K1 세포를 일시적 발현 및 안정적인 풀 생산에 사용했다. 상기 재조합 CHO 세포를 플라스크에서 7~9일 동안 배양한 후 원심분리하여 세포 생존율이 90%인 배양액을 수득하였다. 일시적인 발현에서의 발현량을 고려하여 이황화 결합이 없는 (scFv)2-Fab-Fv 컨스트럭트의 발현량은 세르톨리주맙, 우스테키누맙 및 아니프롤루맙 유전자에서 유래된 3개 SAFA-기반 이중특이적 항체 모두에서 이황화 결합을 갖는(scFv)2-Fab-dsFv 컨스트럭트의 발현량보다 1.5~3배 높았다. 안정한 풀로 생성된 APB-Bla 단편을 플라스크에서 7일 동안 배양하여 약 150 mg/L를 수득하였다.
(2) SAFA 기반 이중특이적 항체의 생산
친화성 크로마토그래피를 통해 정제된 SAFA-기반 이중특이적 항체의 크기 및 패턴 비교를 위해, SDS-PAGE 분석은 도 15에 나타낸 바와 같이 환원 및 비환원 조건에서 수행하였다. 환원 조건에서 60~75kDa 위치에서 단백질 밴드가 관찰되었으며, 이는 각각의 (scFv)2-Fab-Fv 및 (scFv)2-Fab-dsFv 단편의 중쇄 및 경쇄 scFv-Fab H 사슬-Fv VH 및 (scFv-Fab L 사슬-Fv VL)의 이론적인 크기와 일치한다, 즉, 64kDa(도 15a), (scFv)2-Fab의 중쇄 및 경쇄 밴드가 45 내지 60 kDa 위치에서 확인되었다(도 15a). 한편, 비환원(끓인) 조건에서, (scFv)2-Fab-Fv의 중쇄와 경쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성되지 않은 중쇄 및 경쇄에 해당하는 2개의 단백질 밴드가 60 내지 75kDa 위치에서 관찰되었다, 환원 조건의 경우와 같이; 중쇄와 경쇄 사이에 이황화 결합이 형성된 (scFv)2-Fab-dsFv의 경우, 100 내지 140 kDa의 위치에서 단일 단백질 밴드가 관찰되었으며 이론적인 크기 128 kDa의 범위에 속하였다(도 15b). 비환원(비가열) 조건에서 (scFv)2-Fab-Fv의 경우 약 130kDa 크기의 위치에서 밴드가 관찰되었으며, 이는 중쇄 및 경쇄 크기의 합에 해당하며, 비환원(가열) 조건의 경우와 같이 60~75 kDa 범위의 위치에서 불연속적으로 위치하는 중쇄 및 경쇄에 대한 두 개의 단백질 밴드도 예기치 않게 관찰되었다(도 15c). 도 15a, 15b 및 15c는 각각 상기 환원, 비환원 및 비환원(비가열) 조건에서 수행된 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. (1) (scFv)2-Fab, (2) 세르톨리주맙 관련 BsAb(APB-B1), (3) 우스테키누맙 관련 BsAb, (4) 아니프롤루맙 관련 BsAb를 포함하는 4개의 SAFA-기반 시료는 최대 2 mg의 다양한 양으로 각 웰에 로딩되었다. (scFv)2-Fab-dsFv 컨스트럭트의 경우, 중쇄 및 경쇄에 대해 개별적으로 위치된 밴드는 가시화되지 않은 반면, 100 내지 140 kDa 범위의 위치에서 2개의 밴드가 관찰되었으며, (scFv)2-Fab-dsFv 이량체의 위치에 해당하는 것으로 추정되는 245 kDa 이상 위치에서 단백질 밴드가 확인되었다. 비환원(비등) 조건에 대한 SDS-PAGE 결과를 확인하려면, 천연 조건하에 있는 (scFv)2-Fab-Fv 및 (scFv)2-Fab-dsFv 단백질을 SE-HPLC로 분석하였고, 상기 분석 결과는 (scFv)2-Fab-dsFv 단백질이 SDS-PAGE에서와 같이 소량의 (scFv)2-Fab-dsFv 이량체를 포함함을 보여주었다(화살표 표시). (scFv)2-Fab-Fv의 경우, 단량체 위치에만 피크가 나타났고, SDS-PAGE에 의해 이산적으로 위치하는 것으로 확인된 상기 중쇄 및 경쇄에 해당하는 피크는 관찰되지 않았다(도 15d). 따라서, 비환원(비등) 조건 하에 SDS-PAGE 실험에서 (SCFV)2-Fab-Fv 단백질 시료에 의해 지시된 바와 같이, 상기 폴리펩타이드의 중쇄 및 경쇄가 불연속적으로 위치하며, SDS-PAGE 실험에 존재하는 SDS나 실험 중 단백질에 열이 전달되어 발생하는 상기 중쇄와 경쇄 사이에 존재하는 비공유 결합의 부분적 절단으로 인해 두 개의 밴드로 관찰된 것으로 판단된다.
(3) SAFA-기반 이중특이적 항체 단백질의 정제
친화성 크로마토그래피를 통해 분리된 APB-B1a 및 APB-Blb 단백질을 정제하기 전에 SDS-PAGE 및 SE-HPLC를 이용하여 단백질 시료를 분석하였다(도 15a 내지 15d). APB-Blb의 이량체 위치(최대 245kDa)에서 확인된 단백질을 제거하기 위해(도 15c 및 15d), CM 세파로스 FF 수지를 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 고순도의 친화성 크로마토그래피로만 동정된 APB-Bla 단백질 시료에 대해 Q sepharose HP를 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 각각의 정제 단계는 AKTA 퓨어 150L 시스템을 이용하여 수행하였고, 최종 정제 생성물은 SE-HPLC로 결정하였다. 친화성 크로마토그래피 후 생성된 이량체 위치의 제거되지 않은 APB-B1b 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 추가로 제거되었으며(도 16b), APB-Bla와 유사한 머무름 시간 시점에서 피크가 확인되었다(도 16a). 도 16a 및 16b에 도시된 바와 같이, SAFA-기반 구축물은 280 nm에서 천연 조건 하에서 TSKgel UltraSW 응집 컬럼(20 mM 시트르산, pH 5.5 완충액)에서 분석되었다. APB-Blb(b)는 CaptureSelect IgG-CHI 친화도 및 CM 세파로스 FF 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
(4) 단백질 안정성을 위한 이황화 결합 및 최적 pH 완충액의 존재 여부에 따른 단백질 안정성 비교
Fv의 사슬간 이황화 결합의 유무에 따른 (scFv)2-Fab-Fv 및 (scFv)2-Fab-dsFv 단백질의 안정성 비교를 위해, 3종의 SAFA 기반 이중특이적 항체 유래 세르톨리주맙, 우스테키누맙, 아니프롤루맙 유전자로 부터 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 20℃에서 90℃로 점진적으로 열처리하고, 단백질 변성 온도는 소수성 아미노산에 결합된 SYPRO Orange 염료를 사용하는 실시간 PCR 공정으로 측정되었다. 그 결과, 상기 3종의 SAFA-기반 이중특이적 항체의 Fv 클론에 따라 단백질 변성 온도가 달라지는 것으로 나타났으나 (scFv)2-Fab-Fv와 (scFv)2-Fab-dsFv는 이황화 결합의 유무에 관계없이 동일한 온도에서 변성됨을 확인하였다(하기 표 7 참조). PB-B1 단백질의 저장 안정성에 기여하는 최적의 버퍼를 검출하기 위해, 단백질 변성 온도는 상기와 동일한 방법으로 단백질을 3.0 내지 11.0 pH 조건에서 20℃ 내지 90℃ 범위에서 점진적으로 증가하는 융점으로 열처리하여 측정하였다(표 7 및 도 17). 도 17에 도시된 바와 같이, 4℃에서 하루 동안 배양된 다양한 완충액에 넣은 정제된 APB-Bla 및 APB-Blb 단백질 각각을 1 mg/㎖ 취하여 라이트 사이클러 480 II(RT-PCR) 및 SYPRO 오렌지 염료를 사용하여 분석하였다. 그 결과 다양한 pH 조건에서 상기 단백질은 Fv에서 이황화 결합의 유무에 관계없이 동일한 변성 온도를 나타냈다. 또한, 상기 단백질의 변성은 낮은 pH(3.0~4.0) 및 높은 pH(9.0~11.0) 조건에서 비교적 낮은 온도에서 시작되었다. 그러나 pH 3.0 또는 11.0과 같은 극산성 또는 염기성 조건에서 단백질의 변성은 4℃의 온도에서 시작되었다. 열에 대한 안정성이 가장 높은 구조로 존재하는 상기 APB-B1 단백질 시료의 pH 수준은 5.0~7.0이었고, 상기 APB-B1 단백질은 pH 6.0 조건(Tm = 61℃)에서 모든 시트르산, 히스티딘 및 인산나트륨 완충액에서 가장 높은 열 안정성을 나타냈다(하기 표 7 참조).
버퍼 (pH) 클론 컨스트럭트 온도 (°C)
인산나트륨
(pH 7.0)		 세르톨리주맙 (scFv)2-Fab-dsFv 60.3
(scFv)2-Fab-Fv 60.5
우스테키누맙 (scFv)2-Fab-dsFv 59.9
(scFv)2-Fab-Fv 59.2
아니프롤루맙 (scFv)2-Fab-dsFv 54.8
(scFv)2-Fab-Fv 54.8
Tm (°C)
버퍼 pH APB-B1a APB-B1b
구연산 3.0 41.82 41.81
4.0 51.83 51.77
5.0 61.23 61.06
6.0 61.54 61.36
아세트산 나트륨 4.0 57.06 57.18
5.0 61.15 61.14
히스티딘 5.0 59.69 59.71
6.0 61.16 61.19
7.0 60.04 60.51
인산나트륨 6.0 61.84 61.56
7.0 60.42 60.20
8.0 58.02 58.13
탄산나트륨 9.0 51.01 51.24
11.0 4.00 4.00
(5) SAFA 기반 이중특이적 항체의 항원 특이성 및 친화도 결정
3개의 상이한 항원, 즉 HSA, CD40L 및 TNF-α에 결합하는 정제된 APB-Bla 및 APB-Blb 이중특이적 항체의 결합 친화도를 ELISA 및 BLI에 의해 결정하였다(도 18a 내지 18c 및 표 8). 도 18a 내지 18c, 3개의 표적 단백질, 즉, 인간 혈청 알부민(도 18a), CD40L(도 18b) 및 TNF-α(도 18c)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트에 1 μg/㎖의 밀도로 코팅하였다. APB-Bla, APB-Blb 및 모 항체를 pH 7.4에서 표적에 결합하도록 하였다. HRP-접합된 염소 항-인간 Fd 항체를 2차 항체로 사용하였다. 450 nm에서 ELISA 판독기를 사용하여 데이터를 분석했다.*모 항체: 항-HSA Fab(SL335), 항-CD40L IgG(루플리주맙), 항-TNF-α IgG(아달리무맙), 및 항-TNF-α Fab(세르톨리주맙). ELISA 결과, 인간 혈청 알부민에 대한 APB-Bla 또는 APB-Blb의 결합 강도가 대조군으로 사용된 SL335 Fab에 비해 약 2 내지 3배 감소됨을 나타내었고(도 18a), BLI를 사용한 친화도의 평가에서, 인간 혈청 알부민에 대한 APBB1a, APB-Blb 및 SL335 Fab의 평형 해리 상수(KD)를 측정하여 각각 765pM, 809pM 및 286pM을 생성했다(표 8). APB-Bla 및 APB-Blb 항체의 CD40L-결합 능력의 평가에서, 이들 2개의 이중특이적 항체는 모 항체로서의 항-인간 CD40L IgG1(루플리주맙)보다 약 1.5배 더 낮은 결합 능력을 나타내었고(도 18b), APB-Bla, APB-B1b 및 모 항체의 결합 친화도를 측정하여 각각 192 pM, 167 pM 및 49 pM의 KD 값을 얻었다(표 8). ELISA에 의해 측정된 APB-Bla 및 APB-Blb의 TNF-α 항원 친화도는 모 항체 α Fab'의 TNF-α 항원 친화도보다 1.5 내지 2배 낮았고(도 18c), BLI에 의해 측정된 APB-Bla, APB-Blb 및 모 항체의 결합 친화도는 각각 164pM, 446pM 및 157pM의 KD 값을 초래하였다(하기 표 8 참조), 이는 상기 설명한 ELISA 및 BLI에 의해 평가된 패턴과 유사한 패턴이다. 또한, APB-Bla가 3종의 항원에 동시에 결합하는 능력을 확인하기 위해 BLI를 수행하였다(표 8). AR2G 바이오센서에서 500 nM CD40L을 반응시켜 센서에 고정시키고, 25 nM APB-Bla를 반응시켜 고정화된 CD40L과 결합시켰다. 다음으로, 인간 혈청 알부민은 APB-B1a의 알부민 결합 부위가 포화되도록 APB-1a보다 최대 10배 더 높은 농도에서 APB-1a와 반응하도록 하고, 동일한 농도의 인간 혈청 알부민을 50 nM TNF-α와 반응시켰다. 도 19에 도시된 바와 같이, 재조합 인간 CD40L을 pH 5.0, 10 ㎍/㎖ 아세트산나트륨 완충액에서 AR2G 바이오센서 상에 고정화시켰다. APB-Bla는 3.2 ㎍/㎖ 의 농도로 로딩되었다(Association 1). HSA는 13.2 ㎍/㎖의 농도로 로딩되었고(Association 2), HSA와 TNF-a는 13.2 ㎍/㎖ 및 2 ㎍/㎖의 농도로 로딩되었다(Association 3). 각 연결 단계는 900초 동안 수행되었다. Octet DataAnalysis8 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
APB-B1a APB-B1b 모항체 *
K D (M) K on (1/Ms) K dis (1/s) K D (M) K on (1/Ms) K dis (1/s) K D (M) K on (1/Ms) K dis (1/s)
HSA 7.65E
-10		 5.49E
+05		 4.20E
-04		 8.09E
-10		 5.01E
+05		 4.05E
-04		 2.86E
-10		 1.01E
+06		 2.88E
-04
CD40L 1.92E
-10		 5.90E
+05		 1.13E
-04		 1.67E
-10		 5.55E
+05		 9.27E
-05		 4.96E
-11		 3.26E
+05		 1.62E
-05
TNF-α 1.64E
-10		 2.30E
+05		 3.82E
-05		 4.46E
-10		 2.46E
+05		 1.09E
-04		 1.57E
-10		 4.95E
+05		 7.75E
-05
상기 표 8에서는 Octet RED 기기를 이용하여 정제된 APB-Bla와 APB-Blb의 결합력을 분석하였다. 각각의 항원인 HSA, CD40L 및 TNF-a는 pH 5.0 아세트산나트륨 완충액에서 20 μg/㎖, 10 μg/㎖ 및 30 μg/㎖의 농도에서 아민 반응성 2세대(AR2G) 바이오센서에 고정되었다. 상기 정제된 항체를 2배 희석을 위해 pH 7.4에서 1 × 동역학 완충액에서 연속적으로 처리하였다. Octet Data Analysis8 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다. *모 항체: 항-HSA Fab(SL335), 항-CD40L IgG1(루플리주맙), 및 항-TNF-α Fab'(세르톨리주맙).
(6) 세포막 CD40L 단백질에 대한 SAFA 기반 이중특이적 항체의 결합
정제된 SAFA 기반 이중특이적 항체의 항-CD40L scFv가 세포 표면에 발현된 세포막 CD40L 및 가용성 CD40L에 특이적으로 결합하는지 여부를 FACSVerse에 의해 확인하였다. 그 결과, SAFA-기반 이중특이적 항체가 모항체로서의 항인간 CD40L IgG1과 유사하게 세포막 CD40L에 결합할 수 있음을 확인하였다(도 20). 도 20, Dl.1 세포는 3.0 × 105 세포/반응의 농도로 제조되었으며, FITC가 결합된 염소 항-인간 카파 항체는 SL335 기반 컨스트럭트, SL335 Fab(음성 대조군) 및 항-CD40L IgG(양성 대조군)를 검출하기 위한 이차 항체로 사용되었다. 세포 수에 의해 표시되는 결합 신호는 FASCVerse 유세포 분석기를 사용하여 측정되었다.
(7) SAFA 기반 이중특이적 항체의 세포 기반 억제 능력 평가
APB-Bla 및 APB-Blb가 TNF-α의 생물학적 기능을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 세포막 TNF 수용체를 발현하고 악티노마이신 D의 존재 하에 TNF-α 의존적 방식으로 세포 세포독성을 나타내는 L929 마우스 세포를 사용하여 시험관내 억제 능력을 평가하였다(도 21). 도 21에 나타낸 바와 같이, TNF-α 시료을 20 nM에서 0.24 nM으로 감소하는 농도에서 3배 연속 희석하였다. 그런 다음 액티노마이신 D의 존재 하에 세포막 상에서 TNF 수용체 및 TNF-α(10 ng/ml)를 발현하는 L929 마우스 세포와 반응하도록 하였다. 항-TNF-α-Fab'(세르톨리주맙)을 양성 대조군으로 사용하였다. 세포 계수 키트-8을 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 억제능은 가용성 TNF-α(10 ng/ml) 및 연속 희석된 항체, 즉 SL335 Fab, APB-Bla, APB-Blb 및 항-TNFaFab'를 모 항체로 첨가하여 평가하였다. 그 결과, 인간 혈청 알부민(FISA) 존재하에서 모항체의 반치 최대 억제 농도(IC50) 값은 0.6259 nM이었고, APB-Bla 및 APB-Blb의 IC50 값은 각각 모 항체보다 8~20배 낮은 5.3 nM 및 12.7 nM이었다. 그러나, SL335는 억제능을 나타내지 않았다(도 21). 따라서, APB-Bla 및 APB-Blb는 TNFa-TNFR 상호작용을 억제하는 능력을 유지함을 확인하였다. APB-Bla 및 APB-Blb가 인간 혈청 알부민의 존재 하에 CD40L-CD40 및 TNF α-TNFR 상호작용 경로를 동시에 억제하고 세포 표면에 발현되는 세포막 CD40L 및 가용성 TNF-α에 동시에 결합할 수 있는지 확인하기 위해 동시 억제 능력은 세포막 CD40과 세포막 TNF 수용체를 모두 발현하는 HEK-blue™ CD40L 리포터 세포를 사용하여 관찰되었다. 도 22a 내지 22c에서, CD40L 또는 TNF-α에 대한 항체 컨스트럭트는 50 nM 내지 0.0122 nM의 농도에서 연속적으로 4배 희석되었다. 항-CD40L IgG1 및 항-TNF-α는 모두 각각의 표적 분자에 대한 대조군으로 사용되었다. HEK-blue™ 리포터 세포와 CD40L 또는 TNF-a의 반응에 의해 발현되는 SEAP(secreted 태아 알칼리성 인산분해효소)를 QUANTI-Blue 시약을 사용하여 측정하였고, 신호는 A655 nm에서 측정하였다. (a) CD40L을 발현하는 D 1.1 세포와 CD40을 발현하는 HEK-blue™ 세포 사이의 상호작용(도 22a) 및 (b) TNF 수용체를 발현하는 HEK-blue™ 세포와 가용성 TNF-a 사이의 상호작용(도 22b), (c) 및 Dl.1 세포와 HEK-blue™ 세포 간의 상호작용 및 HEK-blue™ 세포와 가용성 TNF-a 간의 상호작용(도 22c)을 포함하는 다양한 상호작용에 대한 HEK-blue™ 리포터 세포 반응을 측정하여 APB-Bla 및 APB-B1의 억제능을 확인했다. 세포막 CD40L에 대한 APB-Bla 및 APB-Blb의 IC50 값은 0.15 내지 0.18 nM이고, 모 항체(ruplizumab, IgG1)의 IC50 값은 0.30 nM인 것으로 확인되었으며(도 22a), 가용성 TNF-α(10 ng/ml)에 대한 APB-Bla 및 APB-B1b의 억제 능은 3.05 nM 및 4.13 nM이었으며, 이는 모 항체(세르톨리주맙, Fab')보다 6 내지 8배 낮고, 즉, L929 마우스 세포를 사용한 실험과 유사한 0.56 nm이다(도 22b). 세포막 CD40L 및 가용성 TNF-α 항원을 동시에 억제하기 위한 검정에서, APB-Bla 및 APB-Blb의 IC50 값은 1.98 nM 및 3.79 nM이었고, 이는 상기 두 항원 모두 APB-Bla 및 APB-Blb에 의해 완전히(100%) 억제되었음을 의미한다. 그러나, 상기 모항체 항-TNF-α Fab'는 TNF-α 항원만을 억제할 수 있으며, 이는 전체 반응의 약 60% 억제만이 달성되었음을 의미한다. CD40L IgG1의 경우, 상기 CD40L IgG1이 CD40L을 억제할 수 있지만, 상기 항-CD40L IgG1은 억제되지 않은 TNF-α에 대한 리포터 세포의 극도로 높은 SEAP 활성으로 인해 어떠한 반응도 억제할 수 없었으며, 이는 SL335 Fab(음성 대조군)의 경우와 유사하다. 한편, 2개의 모 항체인 항-TNF-α Fab' 및 항-CD40L IgG1을 동시에 처리한 경우(병용 처리), 상기 2종의 표적은 이중특이적 항체의 경우와 같이 2개의 모 항체에 의해 완전히(100%) 억제되었고, 측정된 IC50 값은 0.47 nM으로 APB-B1보다 3 내지 8배 더 높았다. 결과적으로, CD40L에 대한 유사한 억제 능력 수준에도 불구하고, 이는 두 항체 간의 TNF-a 저해능의 차이로 인해 병합치료의 경우보다 저해능이 낮은 것으로 판단된다(도 22c).
실시예 5. 추가적인 약동학 및 약력학 분석
(1) PK 분석
APB-A1의 혈청 반감기를 추가로 평가하기 위해 게잡이 원숭이 모델(SNBL, 일본)에 대해 약동학적 분석을 다시 수행하였다. APB-A1 단백질은 10 mg/kg(그룹 1) 또는 30 mg/kg(그룹 2)의 용량으로 각 그룹의 3마리의 게잡이 원숭이(수컷) 각각에 단일 정맥 주사를 통해 투여되었다. 투여 후, 하기 총 14개의 시점에서 혈액 시료을 수집하였다: 투여 전 시점 1; 및 다음 13개 시점; 투여 후 0.25, 1, 6, 12 및 24시간 및 4, 8, 13, 19, 26, 33, 40 및 47일. 각 게잡이 원숭이의 혈청에 존재하는 APB-A1의 농도는 ELISA(SNBL, Japan)로 측정하였다.
(2) PD 분석
APB-A1의 효능에 의해 억제되는 항-Keyhole limpet hemocyanin(KLH) 항체 반응을 분석하였다(SNBL, 일본). 비히클(음성 대조군: 20 mmol/L L-히스티딘, HCl pH 5.8, 5% 자당) 및 APB-A1(3 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg) 시료의 총 4개 그룹)를 게잡이 원숭이(수컷, n=5/그룹)에 매주 1회(총 2회 투여) 정맥내 투여하였다. 먼저, 항-KLH 항체 반응을 유도하기 위해, 부스팅을 위해 KLH(2 mg/kg)의 첫 번째 피하 주사를 -28일에 투여하고 두 번째 피하 주사를 1일(시험물질 및 대조물질의 투여 종료 후 약 1시간)에 투여했다. APB-A1은 2차 KLH 주입 시(1일차)와 일주일 후(8일차) 총 2회 주입하였다. 상기 혈액 시료은 첫 번째 KLH 주사 전(-28일), -21, -14, -7, 1일(시험물질 및 대조물질 투여 약 30분 전), 4, 8(시험물질 및 대조물질 투여 약 30분 전) , 11, 15, 22 및 29,에 수집되었고 항-KLH IgG 및 항-KLH IgM 항체 역가를 ELISA로 측정하였다. 말초 혈액의 면역 표현형 분석을 위해, 혈액 시료은 첫 번째 KLH 주사 전(-28일째) 및 1일째(시험물질 및 대조물질 투여 약 30분 전), 4, 11, 22 및 29일에 총 6회 수집되었다. 면역표현형은 CD45, CD20, CD27, CD38, CD3, CD4, CD8 및 Ki-67과 같은 마커에 대한 항체 패널을 사용하여 수행되었다. PK 분석을 위해 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 22일, 29일에 혈액 시료을 수집했다(총 7점). 각 게잡이 원숭이의 혈청에 존재하는 APB-A1의 농도를 ELISA로 측정하였다. 면역조직화학적으로 검사하고자 하는 장기는 부검 다음 날 다듬어지고 총 병리학 2일 후에 자동화된 포매 시스템에서 처리되었다. 3개의 섹션이 연속 슬라이스 표본으로 준비되었다. 첫 번째 섹션은 헤마톡실린-에오신(HE)으로 염색되었고 두 번째 및 세 번째 섹션은 면역조직화학(IHC) 분석에 사용되었다. IHC의 경우, 하기 항체를 사용한 면역효소 방법을 사용하여 상기 슬라이스 표본을 염색했다: 마우스 항-CD20 항체(L26, Leica Biosystems, Germany) 및 마우스 항-Ki67 항체(MIB-1, Dako Denmark A/S, Denmark). 통계적 분석을 위해 Bartlett's test로 분산의 동질성에 대한 데이터를 분석하였다. 분산이 동질적일 때 대조군과 각 실험군 간의 다중비교를 위해 Dunnett's test를 수행하였다. 대조군과 각 실험군 간의 다중 비교를 위해 Bartlett's test로 분산이 이질적일 때 Dunnett-type test(Miller's test)를 수행하였다.
(3) 2주 반복 투여 독성 연구
게잡이 원숭이에게 1주일 간격으로 2회에 걸쳐 정맥내(느린 볼루스) 주사를 통해 투여하여 자가면역 질환의 치료를 위한 APB-A1의 잠재적 독성을 결정하였다. 본 발명에서 하기 매개변수와 엔드포인트를 평가했다: 임상 관찰, 체중, 임상 병리학 매개변수(혈액학, 응고, 임상 화학 및 소변 검사), 생체 분석 및 총 부검 결과, 장기 무게.
(4) 결과
(1) APB-A1에 대한 추가 PK 연구
APB-A1의 생체내 반감기를 평가하기 위해, 게잡이 원숭이 모델(수컷, n=3/그룹)을 사용하여 약동학적 검정을 수행하였다. APB-A1은 단일 정맥 주사를 통해 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 두 가지 용량으로 투여되었다. 재료 및 방법 섹션과 동일한 시점에서 혈액 시료을 수집한 후, PK ELISA를 사용하여 혈장 내 상기 APB-A1 농도를 측정하였다(도 23). 상기 데이터는 상기 수행된 실험의 평균을 나타낸다. 반감기는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(ver 6.4; Certara LP, Princeton, NJ, USA)를 사용하여 ELISA 결과를 기반으로 한 데이터를 사용하여 계산되었으며, 10 mg/kg APB-Al 및 30 mg/kg APB-Al의 반감기는 각각 약 9.33 ± 1.54 및 10.1 ± 1.8일인 것으로 확인되었다. Cmax 값은 각각 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 용량에서 약 347 μg/㎖ 및 1230 μg/㎖이었고 제거율(CL)은 용량에 관계없이 유사한 수준인 3.48 ㎖/day/kg 및 3.44 ㎖/day/kg이었다(하기 표 9 참조).
종 그룹 단일 투여량
(mg/kg)		 T1/2
(day)		 Cmax
(㎍/㎖)		 AUCinf
(㎍·day/㎖)		 CL
(㎖/day/kg)		 Vdss
(mg/kg)
게잡이 원숭이 1 10 9.33±1.54 347±24 2890±240 3.48±0.29 46.1±4.7
2 30 10.1±1.8 1230±70 8780±880 3.44±0.36 43.6±3.5
(2) APB-A1에 대한 추가 PD 연구
어떤 그룹에서도 빈사 상태로 인해 죽은 동물이나 안락사된 동물이 발견되지 않았다. 어떤 그룹에서도 임상 징후, 체중 또는 육안 병리학에서 시험 항목 관련 변화가 관찰되지 않았다. 말초혈액의 면역표현형 분석에서, 대조군에 비해 30, 10, 및/또는 3 mg/kg 그룹에서 감소된 분열 B 세포가 관찰되었다(도 24a 및 24b). 항-KLH 항체 측정에서 대조군과(* P < 0.05, ** P < 0.01: 대조군과 유의하게 다름)(도 25) 비교하여 10 및 30 mg/kg 그룹에서 8일부터 29일까지 IgG 항체 역가 감소가 관찰되었으나 IgM 항체 역가에서는 시험 항목 관련 변화가 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 조직병리 및 면역조직화학 검사에서 29일째 겨드랑이 및 턱밑 림프절의 배중심부의 세포질 감소, 항-CD20 양성 세포 및 항-Ki67 양성 세포가 10 및/또는 30 mg/kg 그룹에서 관찰되었다(도 26 및 표 10, 조직병리 및 면역조직화학 검사). PK에서, 상기 Cmax 및 AUCO-t 값은 1차 및 2차 투여에서 3 내지 30 mg/kg 그룹 사이에서 거의 용량-비례적으로 증가하였다(도 27 및 표 11 참조, PD 연구에서 PK 결과).
Figure pct00004
Figure pct00005
2주 반복 투여 독성 연구
조기 사망, 체중, 혈액학, 응고, 임상 화학 또는 소변 검사에서 임상 관찰 또는 변화가 없었으며 APB-A1을 투여받은 수컷 및 암컷에서 관찰된 어떠한 총체적 소견도 없었다. 1주 간격으로 2회 정맥내(느린 볼루스) 주사에 의한 APB-A1의 투여는 최대 100 mg/kg/의 용량 수준에서 게잡이 원숭이에서 잘 용인되었다. 본 발명에서는 본 발명자들에 의해 개발된 생체 내 지속가능성이 증가된 이중특이적 항체의 기존 기술을 기반으로 새로운 형태의 다중특이성 항체 컨스트럭트를 성공적으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 특히, CD40L, TNF-α 또는 기타 생물활성 반응기에 결합할 수 있는 다중특이적 항체는 다양한 자가면역질환 치료제로 유용하게 적용될 수 있다. 특정 실시예에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 드러낼 것이며, 다른 사람들은 본 기술 분야의 지식을 적용함으로써 다양한 응용 분야에 대해 쉽게 수정 및/또는 적응할 수 있도록 본 발명의 일반적인 특성을 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 이러한 적응 및 수정은 본 발명에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 실시예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본 명세서의 어구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이며 본 명세서의 용어 또는 어구가 교시 및 지침에 비추어 숙련된 기술자에 의해 해석되어야 한다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 폭 및 범위는 전술한 예시적인 실시예 중 어느 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 하기의 청구범위 및 그 균등물에 따라서만 정의되어야 한다. 본 명세서에 기재된 모든 다양한 양태, 실시예 및 옵션은 임의의 모든 변형으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 여기에 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 참조로 여기에 포함된다.
본 발명의 다중특이적 항체는 혈전색전증과 같은 부작용을 감소시키면서 생체내 체류시간을 연장한 자가면역질환 치료제 개발에 이용될 수 있다.

Claims (34)

  1. 하기 구조식을 포함하는 다중특이적 항체:
    Figure pct00006

    상기 항원 결합 단편(Fab)은 혈청 알부민 Fab이고;
    상기 R1 및 R2는 상기 Fab의 N-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이며,
    각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되고;
    상기 R3 및 R4는 상기 Fab의 C-말단에 연결된 생물활성 반응기 모이어티이고,
    각각은 상기 Fab의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 각각 연결되며; 상기 m은 0 또는 1 이상의 정수이고; 상기 n은 0 또는 1 이상의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1 및 R2가 동일하거나 상이한 단일쇄 가변 단편(scFv)인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 R3 및 R4가 동일하거나 상이한 Fv 단편 또는 이황화-안정화 Fv(dsFv) 단편인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 R1, R2, R3 및 R4가 하나 이상의 링커에 의해 Fab에 연결된 것인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab가 (a) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), WINTYSGTKYAQKFQG(서열번호 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (b) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), RINTYNGNTGYAQRLQG(서열번호 64)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (c) NYGIH(서열번호 65)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISYDGSNKYYADSVKG(서열 번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 DVHYYGSGSYYNAFDI(서열번호 67)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) SYAMS(서열번호 68)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), VISHDGGFQYYADSVKG(서열번호 69)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 AGWLRQYGMDV(서열번호 70)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (e) AYWIA(서열번호 71)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), MIWPPDADARYSPSFQG(서열번호 72)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LYSGSYSP(서열번호 73)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는 (f) AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab가 (g) RASQSISRYLN(서열번호 77)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASRLES(서열번호 78)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSDSVPVT(서열번호 79)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (h) RASQSISSYLN(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), AASSLQS(서열번호 81)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSYSTPPYT(서열번호 82)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (i) RASQSIFNYVA(서열번호 83)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), DASNRAT(서열번호 84)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQRSKWPPTWT(서열번호 85)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (j) RASETVSSRQLA(서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYGSSPRT(서열번호 88)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (k) RASQSVSSSSLA(서열번호 89)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QKYSSYPLT(서열번호 90)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는 (l) RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체:
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab가 AYSMN(서열 번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab가 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab가 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab가 서열번호94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호: 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105 각각에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab가 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 도메인(VH-CHI 도메인) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 도메인(VL-CL 도메인)을 포함하는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 링커가 1 내지 20개의 아미노산을 포함하는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 링커가 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대해 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 링커가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2 각각이 항-CD40L hu5c8 scFv인 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 R1 및 R2가 서열번호 47 또는 서열번호 48에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv인 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 R1 및 R2가 서열번호 47 또는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40L hu5c8 scFv인 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 R3 및 R4가 항-TNF-α Fv, 항-TNF-α 이황화-안정화 Fv(dsFv), 항-IL-23 Fv, 항-IL-23 dsFv, 항-IFNAR1, 및 항-IFNAR1 dsFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티인 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 R3 및 R4가 서열번호 49에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 50에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α Fv, 서열번호 51에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 52에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 54에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 56에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 58에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl, 및/또는 서열번호 59에 대해 80% 상동성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 60에 대해 80% 상동성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IFNARl dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티를 포함하는 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각각의 R3 및 R4가 서열번호 49의 중쇄 및 SEQ ID NO:50의 경쇄를 포함하는 항-TNF-α Fv, 서열번호 51의 중쇄 및 SEQ ID NO:52의 경쇄를 포함하는 항-TNF-α 이황화 안정화 Fv(dsFv), 서열번호 53의 중쇄 및 SEQ ID NO:54의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 Fv, 서열번호 55의 중쇄 및 SEQ ID NO:56의 경쇄를 포함하는 항-IL-23 dsFv, 서열번호 57의 중쇄 및 SEQ ID NO:58의 경쇄를 포함하는 항-IFNAR1, 및/또는 서열번호 59의 중쇄 및 서열 60의 경쇄를 포함하는 항-IFNAR1 dsFv를 포함하는 하나 이상의 생물활성 반응기 모이어티인 항체
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 다중특이적 항체 및 부형제를 포함하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 다중특이적 항체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 상기 제22항의 약학적 조성물을 자가면역질환의 치료가 필요한 대상체에서 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법.
  24. 하기를 포함하는 발현 벡터:
    (a) 프로모터,
    (b) 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편(Fab)을 암호화하는 제1 핵산 분자, 및
    (c) 생물활성 반응기 모이어티 및 링커를 암호화하는 제2 핵산 분자,
    상기 프로모터, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 작동가능하게 연결된다.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 제2 핵산 분자가 2개 이상의 생물활성 반응기 모이어티 및 링커를 암호화하는 벡터.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자가 (a) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), WINTYSGTKYAQKFQG(서열번호 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (b) SYGIS(서열번호 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), RINTYNGNTGYAQRLQG(서열번호 64)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LGHCQRGICSDALDT(서열번호 63)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (c) NYGIH(서열번호 65)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISYDGSNKYYADSVKG(서열번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 DVHYYGSGSYYNAFDI(서열번호 67)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) SYAMS(서열번호 68)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), VISHDGGFQYYADSVKG(서열번호 69)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 AGWLRQ Y GMD V의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(서열 번호: 70);
    (e) AYWIA(서열번호 71)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), MIWPPDADARYSPSFQG(서열번호 72)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 LYSGSYSP(서열번호 73)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 또는 (f) AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자가 (g) RASQSISRYLN(서열번호 77)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASRLES(서열번호 78)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSDSVPVT(서열번호 79)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (h) RASQSISSYLN(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), AASSLQS(서열번호 81)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSYSTPPYT(서열번호 82)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (i) RASQSIFNYVA(서열번호 83)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), DASNRAT(서열번호 84)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQRSKWPPTWT(서열번호 85)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (j) RASETVSSRQLA(서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호: 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYGSSPRT(서열번호 88)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (k) RASQSVSSSSLA(서열번호 89)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASSRAT(서열번호: 87)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QKYSSYPLT(서열번호 90)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는 (l) RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 벡터.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자가 AYSMN(서열번호 74)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), SISSSGRYIHYADSVKG(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ETVMAGKALDY(서열번호 76)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVGSNLA(서열번호 91)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 도메인 1(CDR1), GASTGAT(서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYYSFLAKT(서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터:
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자가 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자가 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자가 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자가 서열번호 45(VH-CH1 도메인)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 도메인 및 서열번호 46(VL-CL 도메인)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 도메인을 포함하는 Fab를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물활성 반응기 모이어티는 항-TNF-αFv, 항-TNF-α dsFv, 항-IL-23 Fv, 항-IL-23 dsFv, 항-IFNAR1 Fv, 및/또는 항-IFNAR1 dsFv인 벡터.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 핵산 분자가 서열번호 49 내지 60 중 하나 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
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