JP2023543461A

JP2023543461A - インターロイキン－１８結合タンパク質と血清アルブミンに対する抗原結合断片とを含む組換え融合タンパク質ならびにその組成物および使用

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Publication number: JP2023543461A
Application number: JP2023519427A
Authority: JP
Inventors: サンフンチャ
Original assignee: エイプリルバイオカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2023-10-16
Also published as: EP4222162A4; KR20220044057A; KR20230093271A; CN117015553A; US20230357340A1; BR112023005795A2; AU2021352174A1; CA3193862A1; WO2022070112A1; EP4222162A1

Abstract

インターロイキン-18結合タンパク質と血清アルブミンに対する抗原結合断片とを含む組換え融合タンパク質、ならびにその使用を提供する。この組換え融合タンパク質は、体内での半減期の増加による改善された投与サイクルを有する。さらに、組換え融合タンパク質は、低い免疫原性を有し、生体内で副作用を引き起こさず、したがって、様々な癌および免疫疾患および状態の処置に有効に用いることができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年9月29日に出願された、KR Appl. No. 10-2020-0127395に対する優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

電子的に提出された配列表への参照
本出願と共に提出されたASCIIテキストファイル(名称：2662-0005WO01_Sequence_Listing_ST25.txt；サイズ：46 KB；および作成日：2021年9月29日)で電子的に提出された配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

技術分野
本開示は、インターロイキン-18結合タンパク質と血清アルブミンへ結合する抗原結合断片とを含む組換えタンパク質、この組換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、細胞、組成物、およびその使用に関する。

背景
自己免疫疾患は、身体の免疫系の異常に起因する自己免疫によって引き起こされ、免疫系を体内の正常な化学物質および一部の細胞に対して誤って反応させる。ヒト免疫系は基本的に、人体に侵入した微生物および癌細胞を外来抗原として認識し、通常は攻撃および除去するが、自己寛容のために自身の細胞を攻撃しない。しかし、免疫系の自己寛容が破壊されると、自己反応性T細胞が自身の細胞(または自己抗原)に応答して活性化され、自己抗体が産生される間、人体は自身の細胞を継続的に破壊し、炎症および免疫反応を引き起こす。

インターロイキン-18(IL-18)は、インターロイキン-1ファミリーに属する炎症性サイトカインであり、インターフェロン-γ誘導因子としても公知である。特に、免疫疾患を有する患者の血液中では、IL-18の濃度が上昇し、IL-18のアンタゴニストであるインターロイキン-18結合タンパク質の濃度はIL-18の濃度よりも低い。このため、血中のインターロイキン-18の濃度を下げる必要がある。少数の患者を対象に実施された臨床試験は、インターロイキン-1、インターロイキン-1β、インターロイキン-6、TNFなどのような炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤が療法に適用された場合、それらは自己免疫疾患において臨床効果を示すことを報告した。生物学的薬剤は、特に自己免疫疾患において、抗薬物抗体(ADA)を引き起こす可能性があるため、新しい生物学的構造体は、既存の生物学的薬剤に対してADAを有する患者に代替の選択肢を提供することができる。高レベルのIL-18は、多発性骨髄腫(MM)患者の予後不良にも関連している(Nakamura, K. et al., Cancer Cell. 2018 Apr 9;33(4):634-648.e5（非特許文献１）)。したがって、副作用を最小限にしながら投与量および投与頻度を減らすことによって、患者についての投与の簡便性および効率を高めることができる抗炎症薬および癌治療薬を開発する必要性がある。

Nakamura, K. et al., Cancer Cell. 2018 Apr 9;33(4):634-648.e5

インターロイキン-18結合タンパク質と血清アルブミンに対する抗原結合断片とを含む、組換え融合タンパク質を本明細書に開示する。

免疫疾患を予防または処置するための薬学的組成物であって、活性成分として組換え融合タンパク質を含む薬学的組成物もまた本明細書に開示する。

癌を予防または処置するための薬学的組成物であって、活性成分として組換え融合タンパク質を含む薬学的組成物もまた本明細書に開示する。

インターロイキン-18結合タンパク質(IL-18BP)と血清アルブミンに対する抗原結合断片(Fab)とを含む、組換え融合タンパク質を本明細書に開示する。

融合タンパク質は、IL-18BPをFabへ連結するリンカーをさらに含むことができる。いくつかの態様において、リンカーは、IL-18BPを、Fabの、重鎖定常ドメインのC末端、重鎖可変ドメインのN末端、軽鎖定常ドメインのC末端、および／または軽鎖可変ドメインのN末端へ連結する。いくつかの態様において、リンカーは、IL-18BPを重鎖定常ドメインのC末端へ連結する。いくつかの態様において、リンカーは1～50個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは、SEQ ID NO:16および70～84のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、本明細書に開示される融合タンパク質において、Fabの重鎖および軽鎖は非共有結合によって結合されている。

Fabは、
(1)SYGIS (SEQ ID NO:22)のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン1(CDR1)、

のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン2(CDR2)、および

のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン3(CDR3)；
(2)SYGIS (SEQ ID NO:22)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；
(3)NYGIH (SEQ ID NO:26)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；
(4)SYAMS (SEQ ID NO:29)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；
(5)AYWIA (SEQ ID NO:32)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
LYSGSYSP (SEQ ID NO:34)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；または
(6) AYSMN (SEQ ID NO:35)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含む重鎖と；
(7)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASRLES (SEQ ID NO:39)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
QQSDSVPVT (SEQ ID NO:40)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(8)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
AASSLQS (SEQ ID NO:42)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(9)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
DASNRAT (SEQ ID NO:45)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(10)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASSRAT (SEQ ID NO:48)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
QQYGSSPRT (SEQ ID NO:49)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(11)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASSRAT (SEQ ID NO:48)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
QKYSSYPLT (SEQ ID NO:51)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；または
(12)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASTGAT (SEQ ID NO:53)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変ドメインを含む軽鎖と
を含むことができる。

いくつかの態様において、本明細書に開示される融合タンパク質において、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、およびSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含み、かつ、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO:53のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。

いくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、重鎖定常ドメインは、SEQ ID NO:68と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、軽鎖定常ドメインは、SEQ ID NO:69と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

IL-18結合タンパク質は、SEQ ID NO:7と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、IL-18結合タンパク質は、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、Fabの重鎖は、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む。

本明細書に開示される組換え融合タンパク質のいずれかをコードする核酸分子もまた本明細書に開示する。

本明細書に開示される核酸分子のいずれかを含む発現ベクターを本明細書にさらに開示する。

本明細書に開示される発現ベクターのいずれかで形質転換された細胞を本明細書に開示する。

本明細書に開示される組換え融合タンパク質のいずれかを含む組成物を本明細書に開示する。本明細書に開示される組成物のいずれかおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物もまた本明細書に開示する。本明細書に開示される組成物のいずれかと使用説明書を含むラベルとを含むキットもまた開示する。

その必要のある対象において免疫疾患を処置する方法であって、有効量の請求項23記載の薬学的組成物を対象へ投与する工程を含む方法を本明細書に開示する。いくつかの態様において、免疫疾患は炎症性疾患または自己免疫疾患である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎、乾癬、皮膚炎、アレルギー、関節炎、鼻炎、中耳炎、咽頭痛、扁桃炎、膀胱炎、腎炎、骨盤内炎症、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、浮腫、遅延型アレルギー(IV型アレルギー)、移植拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、虚血性再灌流障害、血管再狭窄、糸球体腎炎、または胃腸管アレルギーである。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、成人発症スチル病、全身性若年性特発性関節炎、マクロファージ活性化症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、全身性血管炎、混合性結合組織疾患、クローン病、橋本病、グレーブス病、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、過敏性腸症候群、重症筋無力症、嗜眠症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、または乾癬である。

その必要のある対象において癌を処置する方法であって、有効量の請求項23記載の薬学的組成物を対象へ投与する工程を含む方法を本明細書に開示する。いくつかの態様において、癌は、多発性骨髄腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、腎臓癌、線維肉腫、黒色腫、または血液癌である。

図1A～1B．組換え融合タンパク質の調製用の重鎖(図1A)および軽鎖(図1B)発現ベクター。 APB-R3タンパク質の図式的構造。還元(R)、非還元かつ煮沸(NR(B))、および非還元かつ非煮沸(NR(NB))条件下での1μg/ウェルおよび2μg/ウェルの量でのAPB-R3タンパク質のサイズを分析するSDS-PAGE結果。 APB-R3タンパク質の純度を分析するSEC-HPLC結果。 APB-R3タンパク質の等電点を分析する結果。 APB-R3タンパク質によるKG-1細胞株中のIL-18阻害を示すグラフ。 APB-R3タンパク質によるマウスCD4+ T細胞中のIL-18阻害を示すグラフ。ラットへのAPB-R3タンパク質の皮下投与後の血液中のタンパク質濃度を示すグラフ。ラットへのAPB-R3タンパク質の静脈内投与後の血液中のタンパク質濃度を示すグラフ。マクロファージ活性化症候群(MAS)疾患モデルにおけるマウスの体重を示すグラフ。図11A～11B．マクロファージ活性化症候群(MAS)疾患モデルにおけるマウスの脾臓重量/体重および肝臓重量/体重を示すグラフ。図11Aの説明を参照のこと。図12A～12B．マクロファージ活性化症候群(MAS)疾患モデルにおけるマウスの血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のレベルを示すグラフ。図12Aの説明を参照のこと。図13A～13B．マクロファージ活性化症候群(MAS)疾患モデルにおけるマウスの血清IFN-γおよびCXCL9のレベルを示すグラフ。図13Aの説明を参照のこと。マクロファージ活性化症候群(MAS)疾患モデルにおけるマウスの脾臓単球/マクロファージの細胞集団を示すグラフ。

詳細な説明
抗体およびその断片
インターロイキン-18結合タンパク質(IL-18BP)と血清アルブミンに対する抗原結合断片(Fab)とを含む、組換え融合タンパク質を本明細書に開示する。融合タンパク質は、IL-18BPをFabへ連結するリンカーをさらに含むことができる。

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(9)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(10)

いくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、およびSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含み、かつ、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO:53のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。

本明細書に開示される組換えタンパク質のいくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、およびSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含み、かつ、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO:53のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。

いくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、Fabは、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:61、62、63、64、65、または66または67と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ、あるいは本明細書に開示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの任意の組み合わせで含む。例えば、Fabは、SEQ ID NO:60と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:67と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み得る。

いくつかの態様において、重鎖定常ドメインは、SEQ ID NO:68と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、軽鎖定常ドメインは、SEQ ID NO:69と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、組換え融合タンパク質は、SEQ ID NO:19と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。いくつかの態様において、Fabは、SEQ ID NO:10 (V_H-C_H1ドメイン)と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ドメインを含む。いくつかの態様において、Fabは、SEQ ID NO:13 (V_L-Cκドメイン)と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ドメインを含む。

いくつかの態様において、組換え融合タンパク質は、SEQ ID NO:19と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖；およびSEQ ID NO:13と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。組換えタンパク質は、IL-18BPの固有の生物学的活性を維持しながら大幅に改善された薬物動態特性を有することができる。

いくつかの態様において、Fabは、SEQ ID NO:10 (V_H-C_H1ドメイン)と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン、およびSEQ ID NO:13 (V_L Cκドメイン)と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ドメインを含む。

本明細書に開示されるように、組換え融合タンパク質は、インターロイキン-18結合タンパク質と、血清アルブミンに対する抗原結合断片とを含む。いくつかの態様において、組換え融合タンパク質は、395個のアミノ酸を含む重鎖および215個のアミノ酸を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、グリコシル化は、血清アルブミンに対する抗原結合断片中に存在せず、1、2、3、または4個のN-グリコシル化および1個のO グリコシル化部位がIL-18結合タンパク質中に存在する。したがって、いくつかの態様において、組換え融合タンパク質はグリコシル化を含み得る。

本明細書において使用される場合、用語「インターロイキン-18結合タンパク質(IL-18BP)」は、拮抗作用を示すためにIL-18へ結合してIL-18およびIL-18受容体の結合を阻害するタンパク質を指す。健康な人では、IL-18結合タンパク質の血中濃度はIL-18の濃度の20倍にもなることが公知である。ヒトにおける、IL-18結合タンパク質の4つのアイソフォーム：a、b、c、およびd、が存在する。4つのアイソフォームのうち、a型およびc型IL-18結合タンパク質は、高い生物学的活性、すなわちIL-18に結合する高い能力を有することが公知であり、ヒトIL-18とマウスIL-18との間で交差反応を示す。アイソフォームaは、399 pMのヒトIL-18への結合能力を有し、高レベルの結合能を示す。IL-18BPは、変異していない天然タンパク質またはアイソフォームであり得、これは公共のデータベースまたは刊行物から得ることができ、例えば、Kim S.-H. et al., PNAS 97:1190-1195 (2000)を参照のこと。いくつかの態様において、IL-18BPは、SEQ ID NO:7と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。IL-18結合タンパク質は、SEQ ID NO:7と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、IL-18結合タンパク質は、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、IL-18結合タンパク質をコードする核酸分子は、SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を含む。

本明細書において使用される場合、用語「リンカー」は、組換え融合タンパク質がIL-18結合タンパク質と抗血清アルブミンFab抗体断片とを連結して調製されるときに、これらのタンパク質の構造柔軟性を高めて各結合タンパク質の活性を増強することができるようにタンパク質間に挿入されるペプチドを指す。免疫反応を最小限に抑えることができる限り、リンカーの種類やアミノ酸の数に制限はない。例えば、リンカーは、1個のアミノ酸～20個のアミノ酸、1個のアミノ酸～15個のアミノ酸、1個のアミノ酸～10個のアミノ酸、または1個のアミノ酸～8個のアミノ酸を含むことができる。いくつかの態様において、リンカーは、血清アルブミンに対する抗原結合断片の重鎖領域のC末端でIL-18結合タンパク質を連結することができる。例えば、リンカーは、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むことができる。SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むリンカーをコードする核酸は、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18によって表され得る。

いくつかの態様において、リンカーは、IL-18BPを、Fabの、重鎖定常ドメインのC末端、重鎖可変ドメインのN末端、軽鎖定常ドメインのC末端、および／または軽鎖可変ドメインのN末端へ連結する。いくつかの態様において、リンカーは、IL-18BPを重鎖定常ドメインのC末端へ連結する。いくつかの態様において、リンカーは1～50個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは、SEQ ID NO:16および70～84のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。

さらに、リンカーは、必要に応じて、使用のために適宜改変することができる。例えば、リンカーは、1～50個または1～20個の任意または非任意のアミノ酸から構成されるポリペプチドであり得る。ペプチドリンカーは、Gly、Asn、およびSer残基を含むことができ、ThrおよびAlaなどの中性アミノ酸を含むこともできる。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。コピー数「n」を調整することは、機能性部分間の適切な分離を達成するために、または必要な部分間相互作用を維持するために、リンカーの最適化を可能にする。他のリンカー、例えば、柔軟性を維持するためのTおよびAなどの追加のアミノ酸残基、ならびに溶解性を改善するための極性アミノ酸残基を含有する、GおよびSリンカーが当技術分野において公知である。したがって、リンカーは、G、S、および／またはT、A残基を含有する可動性リンカーであり得る。リンカーは、(GpSs)_nまたは(SpGs)_nの一般式を有することができ、式中、独立して、pは1～10の整数であり、sは0または0～10の整数であり、p + sは20以下の整数であり、nは1～20の整数である。より具体的には、リンカーの例は、

を含み得、ここで、nは1～20、または1～10の整数であり得る。

本明細書において使用される場合、用語「血清アルブミン」は、細胞の基本物質を構成するタンパク質の一つであり、体液を血管内にとどまらせることによって血管と組織との間の浸透圧を維持する上で重要な役割を果たす。加えて、用語「血清アルブミンに対する抗原結合断片」は、血清アルブミンのエピトープへ特異的に結合する抗血清アルブミン抗体または該抗体分子の抗原結合断片を指すことができる。

抗体の抗原結合断片または抗体断片は、抗原結合機能を保持する断片を指し、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fvなどを含む。抗体断片のFabは、軽鎖および重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、ならびに1つの抗原結合部位を有する重鎖の定常領域(CH)を含む構造を有する。Fab'は、重鎖CHドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を含むヒンジ領域を有する点でFabとは異なる。F(ab')2抗体は、Fab'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成する場合に生成される。重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有する最小抗体断片を有するFv断片を生成するための組換え技術は、PCT国際公開公報番号WO88/10649、WO88/106630、WO88/07085、WO88/07086、およびWO88/09344号に記載されている。二本鎖Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は非共有結合を介して連結されている。一本鎖Fv(scFv)において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、一般に、C末端で直接または共有結合によってペプチドリンカーを介して連結されている。したがって、一本鎖Fv(scFv)は、二本鎖Fvと同様に、二量体のような構造を有することができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ(例えば、抗体全体をパパインで切断するとFabを得ることができ、抗体全体をペプシンで切断するとF(ab')2断片を得ることができる)、それはまた組換え遺伝子技術によって作製することもできる。

いくつかの態様において、血清アルブミンに対する抗原結合断片は、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む重鎖領域；およびSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含み得る。いくつかの態様において、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む重鎖領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO:11または12のヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの態様において、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む軽鎖領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO:14または15のヌクレオチド配列を有し得る。

本明細書において使用される場合、用語「組換え融合タンパク質」または「融合タンパク質」は、2つ以上のタンパク質が人為的に連結されているタンパク質を指す。いくつかの態様において、組換え融合タンパク質は、IL-18結合タンパク質と、血清アルブミンに対する抗原結合断片、即ち、抗血清アルブミンFab抗体断片とが互いへ連結されているタンパク質を指す。このような組換え融合タンパク質は、各パートナーを決定した後に、化学合成法または遺伝子組換え法によりこれを発現および精製することによって得ることができる。いくつかの態様において、組換え融合タンパク質は、細胞発現系において、IL-18結合タンパク質をコードする遺伝子配列と抗血清アルブミンの抗原結合断片をコードする遺伝子配列とが連結されている融合遺伝子(発現ベクター)を発現させることによって得ることができる。組換え融合タンパク質において、IL-18結合タンパク質および抗血清アルブミンFab抗体断片は、直接またはリンカーを介して、互いへ連結されている。いくつかの態様において、組換え融合タンパク質は、IL-18結合タンパク質と、リンカーと、血清アルブミンに対する抗原結合断片の重鎖領域とを含む重鎖；および血清アルブミンに対する抗原結合断片の軽鎖領域を含む軽鎖を、非共有結合を介して含むことができる。例えば、組換え融合タンパク質は、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含むペプチド、およびSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むペプチドを含むことができる。

本明細書において使用される場合、用語「抗体」（単数または複数）は、当技術分野の用語であり、本明細書において互換的に使用することができ、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を指す。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、ヒト抗体、表面再構成（resurfaced）抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、2つの重鎖および2つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖モノマー、抗体重鎖モノマー、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖-抗体重鎖対、イントラボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、シングルドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体または一本鎖Fv(scFv)、ラクダ化抗体、アフィボディ、Fab断片、F(ab’)₂断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗-Id)抗体(例えば、抗-抗-Id抗体を含む)、二重特異性抗体、および多重特異性抗体を含むことができる。

抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、またはIgY)、任意のクラス(例えば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、またはIgA₂)、または任意のサブクラス(例えば、IgG_2aまたはIgG_2b)のものであり得る。

本明細書において使用される場合、用語「バイオエフェクター部分」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」、および類似の用語は、抗原に対するその特異性を組換えタンパク質に与えるアミノ酸残基を含む組換えタンパク質の部分(例えば、相補性決定領域(CDR))を指す。抗原結合領域は、ネコ、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、またはハムスター)およびヒトなどの任意の動物種に由来し得る。

本明細書において使用される場合、用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、互換的に使用され、当技術分野において一般的である。可変領域は、典型的には、抗体の一部、一般に、軽鎖または重鎖の一部、典型的には、成熟重鎖におけるアミノ末端約110～120アミノ酸および成熟軽鎖における約90～115アミノ酸を指し、これらは抗体間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合および特異性に使用される。配列の変動性は相補性決定領域(CDR)と呼ばれる領域に集中し、一方、可変ドメイン内のより高度に保存された領域はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。特定のメカニズムまたは理論に束縛されることを望まないが、軽鎖および重鎖のCDRは、抗体と抗原との相互作用および特異性を主に担うと考えられている。ある態様において、可変領域はヒト可変領域である。ある態様において、可変領域は、齧歯動物またはマウスCDRおよびヒトフレームワーク領域(FR)を含む。特定の態様において、可変領域は、霊長動物(例えば、非ヒト霊長動物)可変領域である。ある態様において、可変領域は、齧歯動物またはマウスCDRおよび霊長動物(例えば、非ヒト霊長動物)フレームワーク領域(FR)を含む。

用語「VL」および「VLドメイン」は、抗体の軽鎖可変領域を指すために互換的に使用される。用語「VH」および「VHドメイン」は、抗体の重鎖可変領域を指すために互換的に使用される。

本明細書において使用される場合、用語「重鎖(HCまたはCH)」は、完全長重鎖およびその断片の両方を指し、完全長重鎖は、抗原についての特異性を付与するのに十分な可変領域(VR)配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVH、ならびに3つの定常領域ドメインCH1、CH2、およびCH3を含む。本明細書において使用される場合、用語「軽鎖(LCまたはCL)」は、完全長軽鎖およびその断片の両方を指し、完全長軽鎖は、抗原についての特異性を付与するのに十分なVR配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVL、および定常領域ドメインCLを含む。

重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、IgG1抗体定常ドメインから誘導することができ、そのいずれか1つまたは複数において、軽鎖と重鎖ドメインとの間のジスルフィド結合に用いられるアミノ酸であるシステインは、保存または欠失またはシステイン以外のアミノ酸残基で置換することができる。例えば、重鎖定常ドメインは、SEQ ID NO:68と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、軽鎖定常ドメインは、SEQ ID NO:69と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ドメイン内のシステインの欠失または置換は、上述の組換えタンパク質を産生するプロセス中、形質転換細胞における組換えタンパク質の発現レベルの向上に寄与し得る。いくつかの態様において、軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合に位置する(i)重鎖定常ドメイン中の1つもしくは複数のシステインおよび／または(ii)軽鎖定常ドメイン中の1つもしくは複数のシステインは、保存され、欠失され、かつ／またはシステイン以外のアミノ酸残基で置換される。

用語「Kabatナンバリング」および同様の用語は、当技術分野において認識されており、抗体の重鎖および軽鎖可変領域またはその抗原結合部分中のアミノ酸残基をナンバリングするシステムを指す。ある局面において、抗体のCDRは、Kabatナンバリングシステムに従って決定することができる(例えば、Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391およびKabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと)。Kabatナンバリングシステムを使用して、抗体重鎖分子内のCDRは、典型的には、アミノ酸位置31～35（任意で、35に続いて、1つまたは2つの追加のアミノ酸(Kabatナンバリングスキームでは35Aおよび35Bと呼ばれる)を含み得る）(CDR1)、アミノ酸位置50～65(CDR2)、およびアミノ酸位置95～102(CDR3)に存在する。Kabatナンバリングシステムを使用して、抗体軽鎖分子内のCDRは、典型的には、アミノ酸位置24～34(CDR1)、アミノ酸位置50～56(CDR2)、およびアミノ酸位置89～97(CDR3)に存在する。いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体のCDRは、Kabatナンバリングスキームに従って決定されている。

本明細書において使用される場合、用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、互換的であり、当技術分野において一般的なその意味を有する。定常領域は、抗体部分、例えば、軽鎖および／または重鎖のカルボキシル末端部分であり、これは、抗原への抗体の結合には直接関与しないが、Fc受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示すことができる。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般に、免疫グロブリン可変ドメインと比べてより保存されたアミノ酸配列を有する。

本明細書において使用される場合、抗体に関して使用される場合の用語「重鎖」は、任意の別個のタイプ、例えば、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、およびミュー(μ)を指すことができ、これらは、それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMクラスの抗体を生じさせ、IgGのサブクラス、例えば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、およびIgG₄を含む。

本明細書において使用される場合、抗体に関して使用される場合の用語「軽鎖」は、任意の別個のタイプ、例えば、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(Cκ)またはラムダ(Cλ)を指すことができる。軽鎖アミノ酸配列は当技術分野において周知である。具体的な態様において、軽鎖はヒト軽鎖である。

「結合親和性」は、一般に、分子(例えば、抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の指示がない限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体および抗原)間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般に解離定数(K_D)によって表すことができる。親和性は、平衡解離定数(K_D)、および平衡会合定数(K_A)を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の多数の方法で測定および／または表現することができる。K_Dはk_off/k_onの商から計算されるのに対し、K_Aはk_on/k_offの商から計算される。k_onは、例えば、抗原に対する抗体の会合速度定数を指し、k_offは、例えば、抗原に対する抗体の解離を指す。k_onおよびk_offは、BIAcore（登録商標）またはKinExAなどの当業者に公知の技術によって決定することができる。

いくつかの態様において、本明細書に開示される組換え融合タンパク質の結合親和性は、ヒトIL-18BPaのそれよりも少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍高い、またはその中の任意の範囲で高い、例えば、2倍～10倍高い、結合親和性を有する。

本明細書において、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。ある態様において、抗体のCDR(複数可)内またはフレームワーク領域(複数可)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することができる。

本明細書において使用される場合、「エピトープ」は、当技術分野における用語であり、抗体が特異的に結合し得る抗原の局在領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続アミノ酸(線形または連続エピトープ)であることができ、またはエピトープは、例えば、ポリペプチド（単数または複数）の2つ以上の非連続領域(立体構造、非線形、不連続、または非連続エピトープ)から一緒になることができる。ある態様において、抗体が結合するエピトープは、例えば、NMR分光法、X線回折結晶構造解析研究、ELISAアッセイ、質量分析と組み合わせた水素/重水素交換(例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析)、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングアッセイ、および／または突然変異誘発マッピング(例えば、部位特異的突然変異誘発マッピング)によって決定することができる。X線結晶構造解析の場合、結晶化は、当技術分野における公知の方法のいずれかを用いて達成することができる(例えば、Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189:1-23; Chayen NE (1997) Structure 5:1269-1274; McPherson, A. (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303)。抗体:抗原結晶は、周知のX線回折技術を用いて研究することができ、X-PLOR(Yale University, 1992、Molecular Simulations, Inc.によって分布; 例えば、Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194を参照のこと)、およびBUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (Pt 1):37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A:361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10):1316-1323)などのコンピューターソフトウェアを用いてリファインすることができる。突然変異誘発マッピング研究は、当業者に公知の任意の方法を用いて達成することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発技術を含む突然変異誘発技術の説明については、例えば、Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270:1388-1394およびCunningham BC & Wells JA (1989) Science 244:1081-1085を参照のこと。いくつかの態様において、抗体のエピトープは、アラニンスキャニング突然変異誘発研究を用いて決定される。

本明細書において使用される場合、用語「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、および「特異的に認識する」は、抗体の文脈における類似の用語であり、そのような結合は当業者によって理解されるように、抗原(例えば、エピトープ、免疫複合体、または抗原結合部位の結合パートナー)へ結合する分子を指す。例えば、抗原へ特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、BIAcore（登録商標）、KinExA 3000機器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)、または当技術分野において公知の他のアッセイによって決定されるように、一般により低い親和性で、他のペプチドまたはポリペプチドへ結合することができる。いくつかの態様において、抗原へ免疫特異的に結合する分子は、分子が別の抗原へ結合する場合のK_Aよりも少なくとも2ログ、2.5ログ、3ログ、4ログ大きいまたはそれ以上のK_Aで抗原へ結合する。

いくつかの態様において、抗原へ免疫特異的に結合する分子は、類似の結合条件下で他のタンパク質と交差反応しない。いくつかの態様において、抗原へ免疫特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。いくつかの態様において、別の無関係の抗原に対してよりも高い親和性で指定の抗原へ結合する組換えタンパク質を本明細書に提供する。ある態様において、例えば、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、または結合平衡除外法によって測定される場合、別の無関係の抗原に対してよりも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%高いまたはそれ以上の親和性で指定の抗原(例えば、ヒト血清アルブミン)へ結合する組換えタンパク質を本明細書に提供する。いくつかの態様において、無関係のタンパク質への本明細書に記載される組換えタンパク質の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイによって測定される場合、指定の抗原への抗体の結合の10%、15%、または20%未満である。

いくつかの態様において、ネコ、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、またはハムスター)およびヒトなどの様々な種の抗原へ結合する組換えタンパク質を本明細書に提供する。いくつかの態様において、別の種の抗原に対してよりも高い親和性でヒト抗原へ結合する組換えタンパク質を本明細書に提供する。ある態様において、例えば、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、または結合平衡除外法によって測定される場合、別の種に対してよりも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%高いまたはそれ以上の親和性でヒト抗原へ結合する組換えタンパク質を本明細書に提供する。いくつかの態様において、ヒト抗原へ結合する本明細書に記載される組換えタンパク質は、例えば、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、または結合平衡除外法によって測定される場合、ヒト抗原タンパク質への抗体の結合の10%、15%、または20%未満で別の種の抗原タンパク質へ結合するであろう。

本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」は、任意のタイプの細胞、例えば、初代細胞、培養中の細胞、または細胞株由来の細胞であり得る。態様において、用語「宿主細胞」は、核酸分子でトランスフェクトされた細胞およびそのような細胞の子孫または潜在的子孫を指す。そのような細胞の子孫は、例えば、後世において起こり得る突然変異もしくは環境の影響、または宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組込みに起因して、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一であることができない。

ある局面において、本明細書に記載される組換えタンパク質は、そのVLドメイン単独、またはそのVHドメイン単独、またはその3つのVL CDR単独、またはその3つのVH CDR単独によって記載することができる。例えば、Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられ、ヒト軽鎖または重鎖ライブラリーからそれぞれ補完する軽鎖または重鎖を同定し、元の抗体の親和性と比べて同等のまたは高い親和性を有するヒト化抗体変異体をもたらすことによる、マウス抗-αvβ3抗体のヒト化を記載している。Clackson T et al., (1991) Nature 352:624-628も参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられ、特異的VLドメイン(またはVHドメイン)を用い、補完的可変ドメインについてライブラリーをスクリーニングすることによって、特異的抗原に結合する抗体を作製する方法を記載している。スクリーンは、ELISAによって決定されたように、強力なバインダーであった、特異的VHドメインについての14個の新しいパートナーおよび特異的VLドメインについての13個の新しいパートナーを生じさせた。Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45:572-577も参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられ、特異的VHドメインを用い、補完的VLドメインについてライブラリー(例えば、ヒトVLライブラリー)をスクリーニングすることによって、特異的抗原に結合する抗体を作製する方法を記載しており；選択されたVLドメインは、次に、追加の補完的(例えば、ヒト)VHドメインの選択を導くために使用することができた。

ある局面において、抗体のCDRは、免疫グロブリン構造ループの場所を指すChothiaナンバリングスキームに従って決定することができる(例えば、Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; および米国特許第7,709,226号を参照のこと)。典型的には、Kabatナンバリング慣例を使用する場合、Chothia CDR-H1ループは重鎖アミノ酸26～32、33、または34に存在し、Chothia CDR-H2ループは重鎖アミノ酸52～56に存在し、Chothia CDR-H3ループは重鎖アミノ酸95～102に存在し、一方、Chothia CDR-L1ループは軽鎖アミノ酸24～34に存在し、Chothia CDR-L2ループは軽鎖アミノ酸50～56に存在し、Chothia CDR-L3ループは軽鎖アミノ酸89～97に存在する。Kabatナンバリング慣例を使用して番号付けされた場合のChothia CDR-H1ループの終了は、ループの長さに応じてH32～H34の間で変動する(これは、Kabatナンバリングスキームが挿入をH35AおよびH35Bに配置するためであり；35Aも35Bも存在しない場合、ループは32で終了し；35Aのみが存在する場合、ループは33で終了し；35Aおよび35Bの両方が存在する場合、ループは34で終了する)。

ある局面において、血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)へ特異的に結合し、VLのChothia VL CDRを含む、組換えタンパク質を本明細書に提供する。ある局面において、血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)へ特異的に結合し、VHのChothia VH CDRを含む、抗体を本明細書に提供する。ある局面において、血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)へ特異的に結合し、VLのChothia VL CDRを含み、VHのChothia VH CDRを含む、抗体を本明細書に提供する。ある態様において、血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)へ特異的に結合する抗体は、1つまたは複数のCDRを含み、ここで、ChothiaおよびKabat CDRは、同じアミノ酸配列を有する。ある態様において、血清アルブミンへ特異的に結合し、Kabat CDRおよびChothia CDRの組み合わせを含む抗体を本明細書に提供する。

ある局面において、抗体のCDRは、Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136およびLefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212に記載されているようなIMGTナンバリングシステムに従って決定することができる。IMGTナンバリングスキームによれば、VH-CDR1は26～35位にあり、VH-CDR2は51～57位にあり、VH-CDR3は93～102位にあり、VL-CDR1は27～32位にあり、VL-CDR2は50～52位にあり、VL-CDR3は89～97位にある。

ある局面において、抗体のCDRは、MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745に従って決定することができる。例えば、Martin A. “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,” in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)も参照のこと。

ある局面において、抗体のCDRは、AbMナンバリングスキームに従って決定することができ、これは、Kabat CDRとChothia構造ループとの間の妥協を表し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア(Oxford Molecular Group, Inc.)によって使用される、AbM超可変領域を指す。

いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体のVH(例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3)および／またはVL(例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3)領域に沿った1つまたは複数のCDRの位置は、抗原への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、1、2、3、4、5、または6個のアミノ酸位置だけ変動し得る。例えば、本明細書に記載される抗体のCDRを定義する位置は、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、本明細書に記載される抗体のCDR位置に対して、1、2、3、4、5、または6個のアミノ酸だけ、CDRのN末端および／またはC末端境界をシフトさせることによって変動し得る。他の態様において、本明細書に記載される抗体のVH(例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3)および／またはVL(例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3)領域に沿った1つまたは複数のCDRの長さは、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のアミノ酸だけ変動し得る(例えば、より短くまたはより長くなり得る)。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3は、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つまたは複数よりも、1、2、3、4、5アミノ酸またはそれ以上の短くなり得る。他の態様において、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3は、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つまたは複数よりも1、2、3、4、5アミノ酸またはそれ以上長くなり得る。他の態様において、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のアミノ末端は、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つまたは複数と比較して1、2、3、4、5個またはそれ以上のアミノ酸だけ伸長され得る。他の態様において、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のカルボキシ末端は、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つまたは複数と比較して1、2、3、4、5個またはそれ以上のアミノ酸だけ伸長され得る。他の態様において、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のアミノ末端は、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つまたは複数と比較して1、2、3、4、5個またはそれ以上のアミノ酸だけ短縮され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のカルボキシ末端は、抗原（複数可）への免疫特異的結合が維持される(例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つまたは複数と比較して1、2、3、4、5個またはそれ以上のアミノ酸だけ短縮され得る。当技術分野において公知の任意の方法、例えば、本明細書の「実施例」セクションに記載される結合アッセイおよび条件を使用して、抗原(複数可)への免疫特異的結合が維持されるか否かを確かめることができる。

2つの配列(例えば、アミノ酸配列または核酸配列)間のパーセント同一性の決定はまた、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの具体的で非限定的な例は、Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877におけるように改変された、Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア=100、ワード長=12を用いて実行して、本明細書に記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムパラメータセット、例えば、スコア50、ワード長=3を用いて実行して、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402に記載されているように利用することができる。あるいは、PSI BLASTを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行することができる(同文献)。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(例えば、XBLASTおよびNBLAST)を使用することができる(例えば、ワールドワイドウェブ、ncbi.nlm.nih.gov上のNational Center for Biotechnology Information (NCBI)を参照のこと)。配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの別の具体的で非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用することができる。

2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するかまたは許容せずに、上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性の計算において、典型的には、完全一致のみがカウントされる。

本明細書に開示される組換えタンパク質は、検出可能な標識または物質へ融合またはコンジュゲート(例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に連結)することができる。検出可能な標識または物質の例としては、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素(¹²⁵I、¹²¹I)、炭素(¹⁴C)、硫黄(³⁵S)、トリチウム(³H)、インジウム(¹²¹In)、およびテクネチウム(⁹⁹Tc)などの放射性同位元素；ルミノールなどの発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。このような標識抗体は、抗原タンパク質を検出するために用いることができる。

抗体産生
一つの例示的な態様に従って、組換えタンパク質(APB-R3)を調製し、組換えタンパク質(APB-R3)は、ヒト血清アルブミンへ結合する抗原結合断片（ここで、抗原結合断片は、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインで結合されている）；および重鎖定常ドメインへ連結されたIL-18BPを含む。組換えタンパク質は、それぞれの因子によって保有される生物学的活性を維持したまま、高収率で得られたことが確認された。

さらに他の局面は、組換えタンパク質を調製する方法であって、(a)細胞を培養する工程；および(b)培養細胞から組換えタンパク質を回収する工程を含む方法を提供する。細胞は様々な培地中で培養することができる。培養培地としては市販の培地を制限なく用いることができる。当業者に公知のすべての他の必須のサプリメントも適切な濃度で含めることができる。培養条件、例えば、温度、pHなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。組換えタンパク質の回収は、不純物を例えば遠心分離または限外濾過により除去し、得られたものを例えばアフィニティークロマトグラフィーにより精製することなどによって行うことができる。他の追加の精製技術、例えば、陰イオン交換または陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどを使用することができる。

本明細書に開示される組換えタンパク質は、抗体の合成のための当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、化学合成によって、または組換え発現技術によって、製造することができる。本明細書に記載される方法は、別段の指示がない限り、当技術分野の技能内で、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、例えば、本明細書において引用される参考文献に記載されており、文献において完全に説明されている。例えば、Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987および年次更新); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987および年次更新) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。

いくつかの態様において、本明細書に記載される組換えタンパク質は、例えばDNA配列の合成または遺伝子工学を介する作製を伴う任意の手段によって、調製、発現、作製、または単離された抗体(例えば、組換え抗体)である。ある態様において、そのような抗体は、インビボで動物または哺乳動物(例えば、ヒト)の抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在しない配列(例えば、DNA配列またはアミノ酸配列)を含む。

いくつかの局面において、本明細書に記載されるような細胞または宿主細胞を培養する工程を含む本明細書に開示される組換えタンパク質を作製する方法を本明細書に提供する。いくつかの局面において、本明細書に記載される細胞または宿主細胞(例えば、本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞)を用いて抗体を発現させる(例えば、組換え的に発現させる)工程を含む組換えタンパク質を作製する方法を本明細書に提供する。いくつかの態様において、細胞は単離された細胞である。いくつかの態様において、外因性ポリヌクレオチドが細胞内に導入されている。いくつかの態様において、方法は、細胞または宿主細胞から得られた抗体を精製する工程をさらに含む。

抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において公知の多種多様な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知であり、例えば、Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)において教示されるものを含む、ハイブリドーマ技術を用いて産生することができる。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書に記載される抗体を外因的に発現する宿主細胞から組換え的に産生され得る。

「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用される場合、単一細胞(例えば、組換え抗体を産生するハイブリドーマまたは宿主細胞)によって産生される抗体であり、ここで、抗体は、例えば、ELISAまたは当技術分野において公知の他の抗原結合もしくは競合的結合アッセイによって、または本明細書に提供される実施例において決定されるように、抗原(例えば、ヒト血清アルブミン)へ免疫特異的に結合する。特定の態様において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。ある態様において、モノクローナル抗体は、一価抗体または多価(例えば、二価)抗体である。ある態様において、モノクローナル抗体は、Fab断片またはF(ab’)₂断片であり得る。本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、例えば、Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495に記載されるようなハイブリドーマ法によって作製することができ、または、例えば本明細書に記載されるような技術を用いて、例えば、ファージライブラリーから単離することができる。クローン細胞株およびそれによって発現されるモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当技術分野において周知である(例えば、Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al.（上記）中の第11章を参照のこと)。

ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生しおよびスクリーニングするための方法は、当技術分野において日常的かつ周知である。例えば、ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマカクザルを免疫化して、免疫化に用いられた抗原(例えば、ヒト血清アルブミン)へ特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。さらに、RIMMS(反復免疫化複数部位)技術を使用して動物を免疫化することができる(Kilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16:381-9、参照によりその全体が組み入れられる)。

本明細書に記載される抗体は、当業者に公知の任意の技術によって作製することができる。例えば、本明細書に記載されるFabおよびF(ab’)₂断片は、パパイン(Fab断片を生成するため)またはペプシン(F(ab’)₂断片を生成するため)などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって生成することができる。Fab断片は、四量体抗体分子の2つの同一のアームのうちの1つに対応し、重鎖のVHおよびCH1ドメインと対になった完全な軽鎖を含む。F(ab’)₂断片は、ヒンジ領域中のジスルフィド結合によって連結された四量体抗体分子の2つの抗原結合アームを含む。

さらに、本明細書に記載される抗体は、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面にタンパク質が提示される。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列が、cDNAライブラリー(例えば、罹患組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)から増幅される。VHおよびVLドメインをコードするDNAをPCRによりscFvリンカーとともに再結合し、ファージミドベクターにクローニングする。ベクターを大腸菌（E. coli）中にエレクトロポレーションし、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、fdおよびM13を含む繊維状ファージであり、VHおよびVLドメインは、通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかに組換え的に融合される。特定の抗原へ結合する抗体を発現するファージを、抗原を用いて、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズへ結合もしくは捕捉された抗原を使用して、選択または同定することができる。本明細書に記載される抗体を作製するために用いることができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT/GB91/001134; WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401、およびWO97/13844;ならびに米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、同第5,733,743号、および同第5,969,108号に開示されているものが挙げられる。

上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、ヒト抗体を含む抗体を作製するために使用し、例えば、以下に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。Fab、Fab’およびF(ab’)₂断片などの抗体を組換え的に産生する技術もまた、WO92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; およびBetter M et al., (1988) Science 240: 1041-1043に開示されるものなどの当技術分野において公知の方法を用いて採用することができる。

いくつかの局面において、抗体を作製するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するための隣接配列を含むPCRプライマーを使用して、鋳型、例えばscFvクローンからVHまたはVL配列を増幅することができる。当業者に公知のクローニング技術を利用して、PCR増幅されたVHドメインを、VH定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、PCR増幅されたVLドメインを、VL定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。VHドメインおよびVLドメインは、必要な定常領域を発現する1つのベクターにクローニングすることもできる。次いで、当業者に公知の技術を用いて、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時トランスフェクトし、抗体、例えばIgGを発現する安定または一過性の細胞株を生成する。

キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合したヒトモノクローナル抗体の可変領域を含むことができる。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202;ならびに米国特許第5,807,715号、同第4,816,567号、同第4,816,397号、および同第6,331,415号を参照のこと。

ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞
本明細書に開示される組換えタンパク質をコードする核酸分子を本明細書に開示する。

本明細書に開示される核酸分子を含む発現ベクターを本明細書に開示する。

本明細書に開示される発現ベクターで形質転換された細胞を本明細書に開示する。

核酸、発現ベクター、および形質転換細胞は、上述の組換えタンパク質または組換えタンパク質をコードする核酸をそのまま含むか、またはこれらを用いるため、これらに共通する説明は省略する。

例えば、いくつかの局面において、組換えタンパク質は、組換えタンパク質をコードする核酸を単離することによって作製することができる。核酸を単離し、複製可能なベクターに挿入して、追加のクローニング(DNA増幅)または追加の発現を実行する。これに基づいて、他の局面は、核酸を含むベクターに関する。

本明細書において使用される場合、用語「核酸」または「核酸分子」は、DNA(gDNAおよびcDNA)およびRNA分子を包括的に含み、核酸の基本単位としてのヌクレオチドは、天然ヌクレオチドだけでなく、修飾された糖または塩基部分を有する類似体も含む。

核酸は、ヌクレオチド配列に対して実質的同一性を示すヌクレオチド配列を含むと解釈される。実質的同一性とは、本開示のヌクレオチド配列と別の任意選択の配列とが可能な限り互いに対応するように整列され、整列された配列が当技術分野において一般的に使用されるアルゴリズムを用いて解析される場合、少なくとも80%の相同性、より具体的には少なくとも90%の相同性、最も具体的には少なくとも95%の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。

組換えタンパク質をコードするDNAは、一般的なプロセスを用いることによって(例えば、組換えタンパク質をコードするDNAへ特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離または合成される。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素は、一般に、以下のうちの1つまたは複数を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。

本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞において標的遺伝子を発現させる手段として、プラスミドベクター；コスミドベクター；ウイルスベクター、例えば、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む。ベクターにおいて、組換えタンパク質をコードする核酸は、プロモーターに機能的に連結されている。

「機能的に連結された」とは、核酸発現制御配列(例えば、プロモーター、シグナル配列、転写調節因子結合部位のアレイ)と別の核酸配列との間の機能的連結を指し、それによって、制御配列は、別の核酸配列の転写および／または翻訳を指示する。

原核細胞を宿主として使用する場合、転写を指示することができる強力なプロモーター(例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、lppプロモーター、pLλプロモーター、pRλプロモーター、rac5プロモーター、ampプロモーター、recAプロモーター、SP6プロモーター、trpプロモーターおよびT7プロモーターなど)、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳終結配列が一般に含まれる。例えば、真核細胞を宿主として使用する場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、およびヒト筋クレアチンプロモーター)、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、HSVのtkプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、HIVのLTRプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス(EBV)のプロモーター、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーター)を用いることができ、転写終結配列としてはポリアデニル化配列を一般に用いることができる。場合によっては、ベクターを別の配列と融合させて、そこから発現された組換えタンパク質の精製を容易にすることができる。融合される配列としては、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(Pharmacia, USA)、マルトース結合タンパク質(NEB, USA)、FLAG(IBI, USA)、6X His(ヘキサヒスチジン; Quiagen, USA)などが挙げられる。ベクターは、選択マーカーとして、当技術分野において通常使用される抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、およびテトラサイクリンに対して耐性の遺伝子を含む。

さらに他の局面において、本開示は、上述のベクターで形質転換された細胞を提供する。本開示の組換えタンパク質を産生するために使用される細胞は、原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞であり得るが、これらに限定されない。原核宿主細胞、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）などのバチルス属株、ストレプトマイセス属、シュードモナス属(例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）)、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）ならびにブドウ球菌属(例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Staphylococcus carnosus）)を用いることができる。しかしながら、動物細胞が最も関心を有しており、有用な宿主細胞株の例には、COS-7、BHK、CHO (GS null CHO-K1)、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、またはHT1080が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される場合、用語「形質転換」は、元の細胞のものとは異なる種類の外来遺伝子を有し、細胞間を貫通し、元の細胞内のDNAと結合するDNA鎖断片またはプラスミドによって細胞の遺伝的形質を変化させる分子生物学的手法を意味する。形質転換は、宿主細胞への組換えタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターの挿入を意味する。

抗原へ免疫特異的に結合する、本明細書に記載される組換えタンパク質(例えば、可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにベクター、例えば、宿主細胞(例えば、大腸菌および哺乳動物細胞)における組換え発現のためのそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを本明細書に提供する。本明細書に提供される抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞におけるそれらの効率的な発現のための発現ベクターを本明細書に提供する。

本明細書において使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然源中(例えば、マウスまたはヒト中)に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、cDNA分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって産生される場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないことができ、または化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことができる。例えば、「実質的に含まない」という文言は、約15%、10%、5%、2%、1%、0.5%、または0.1%未満(特に約10%未満)の他の物質、例えば、細胞物質、培養培地、他の核酸分子、化学的前駆体および／または他の化学物質を有する、ポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体をコードする核酸分子(複数可)は、単離または精製される。

抗原ポリペプチド(例えば、ヒト血清アルブミン)へ免疫特異的に結合し、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに、抗原ポリペプチドへの結合に関してそのような抗体と競合し(例えば、用量依存的に)、またはそのような抗体のものと同じエピトープへ結合する抗体を本明細書に提供する。

本明細書に記載される抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを本明細書に提供する。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体のVL FRおよびCDRを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体のVH FRおよびCDRを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

3つのVH鎖CDR（例えば、本明細書に記載されるヒト血清アルブミンに対する抗体のVL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む）ならびに3つのVH鎖CDR（例えば、本明細書に記載されるヒト血清アルブミンに対する抗体のVH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含む）を含むFabを含む組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを本明細書に提供する。

VLドメインを含む組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを本明細書に提供する。

ある態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67)を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に提供される組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体は、血清アルブミンへ免疫特異的に結合する。

ある態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60)を含む重鎖可変領域を含む本明細書に提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体は、血清アルブミンへ免疫特異的に結合する。

具体的な局面において、軽鎖および重鎖（例えば、別個の軽鎖および重鎖）を含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを本明細書に提供する。軽鎖に関して、いくつかの態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、κ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、λ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに他の態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ヒトκ軽鎖またはヒトλ軽鎖を含む本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、血清アルブミンへ免疫特異的に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体は軽鎖を含み、かつここで、VLドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67に記載のアミノ酸配列を含み得、かつここで、軽鎖の定常領域はκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。

例えば、コドン／RNA最適化、異種シグナル配列による置換、およびmRNA不安定性要素の排除によって最適化される抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドもまた本明細書に提供する。コドン変化を導入することおよび／またはmRNA中の阻害領域を排除することによって、組換え発現のための抗体またはその断片(例えば、軽鎖、重鎖、VHドメイン、またはVLドメイン)をコードする最適化核酸を作製するための方法は、それに応じて、例えば、米国特許第5,965,726号；同第6,174,666号；同第6,291,664号；同第6,414,132号；および同第6,794,498号に記載される最適化方法を適応させることによって行うことができる。例えば、RNA内の潜在的なスプライス部位および不安定性要素(例えば、A/TまたはA/Uリッチ要素)は、組換え発現のためのRNAの安定性を高めるために、核酸配列によってコードされるアミノ酸を変化させることなく変異させることができる。この変更は、例えば、同一のアミノ酸に対しする代替コドンを用いて、遺伝暗号の縮重を利用する。いくつかの態様において、保存的変異、例えば、元のアミノ酸と類似の化学構造ならびに特性および／または機能を有する類似のアミノ酸をコードするように1つまたは複数のコドンを変更することが望ましい場合がある。

ある態様において、本明細書に記載される抗体またはその断片(例えば、VLドメインまたはVHドメイン)をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される抗体またはその断片(例えば、VLドメインまたはVHドメイン)をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス(例えば、相補的)ポリヌクレオチドへハイブリダイズし得る。具体的な態様において、本明細書に記載される抗体または断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドへ高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードする最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドへ、高ストリンジェンシー、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は記載されており、例えばUS 2005/0048549(例えば段落72～73)を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる。

ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の方法によって、得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書に記載される抗体およびこれらの抗体の改変バージョンをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸を生成するような方法で組み立てる。抗体をコードするこのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができ(例えば、Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-246に記載される通り)、これは、簡潔には、抗体をコードする配列の部分を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびに次いでPCRによるライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅を伴う。

あるいは、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法(例えば、PCRおよび他の分子クローニング法)を用いて、好適な供給源(例えば、ハイブリドーマ)由来の核酸から生成することができる。例えば、既知の配列の3'末端および5'末端へハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるPCR増幅は、関心対象の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られたゲノムDNAを用いて行うことができる。このようなPCR増幅法は、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする配列を含む核酸を得るために使用することができる。このようなPCR増幅法は、抗体の可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得るために使用することができる。増幅された核酸は、宿主細胞における発現のためにおよびさらなるクローニングのために、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体を生成するために、ベクターにクローニングすることができる。

特定の抗体またはその断片をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、抗体分子またはその断片の配列が既知である場合、免疫グロブリンまたは断片をコードする核酸を化学合成することができ、あるいは、配列の3'および5'末端へハイブリダイズすることができる合成プライマーを用いたPCR増幅によって、または、例えば、抗体をコードするcDNAライブラリー由来のcDNAクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングによって、好適な供給源(例えば、抗体cDNAライブラリー、または、本明細書に記載される抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から生成されたcDNAライブラリー、またはそれから単離された核酸、例えばポリA+ RNA)から取得することができる。次いで、PCRによって生成された増幅核酸は、当技術分野において周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

本明細書に記載される組換えタンパク質をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、組換えタンパク質の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に単離および配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの供給源として役立ち得る。一旦単離されると、DNAを発現ベクター中へ入れることができ、これは、次いで、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、CHO GS System（商標）(Lonza)からのCHO細胞)、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞中へトランスフェクトして、組換え宿主細胞における組換えタンパク質の合成を得る。

抗体を作製するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するための隣接配列を含むPCRプライマーを使用して、scFvクローン中のVHまたはVL配列を増幅することができる。当業者に公知のクローニング技術を利用して、PCR増幅されたVHドメインを、重鎖定常領域、例えばヒトガンマ4定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、PCR増幅されたVLドメインを、軽鎖定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。ある態様において、VHまたはVLドメインを発現するためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。VHドメインおよびVLドメインは、必要な定常領域を発現する1つのベクターにクローニングすることもできる。次いで、当業者に公知の技術を用いて、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時トランスフェクトし、完全長抗体、例えばIgGを発現する安定または一過性の細胞株を生成する。

DNAはまた、例えば、マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列を用いることによって、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列へ共有結合することによって、改変することもできる。

本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドへ高ストリンジェンシー、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた提供する。具体的な態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に提供されるVHドメインおよび／またはVLドメインをコードするポリヌクレオチドへ、高ストリンジェンシー、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。

ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において記載されており、当業者に公知である。例えば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、約45℃での6x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中におけるフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、それに続く約50～65℃での0.2xSSC/0.1% SDS中における1回または複数回の洗浄を伴い得；非常にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、約45℃での6xSSC中におけるフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーション、それに続く約68℃での0.1xSSC/0.2% SDS中における1回または複数回の洗浄を伴い得る。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者に公知であり、記載されており、例えば、Ausubel FM et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, p 6.3.1-6.3.6および2.10.3を参照のこと。

他の局面は、IL-18結合タンパク質をコードする遺伝子と血清アルブミンに対する抗原結合断片とをコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。さらに他の局面は、ベクターで形質転換された細胞を提供する。

SEQ ID NO:10と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖領域をコードする核酸分子を本明細書に開示する。SEQ ID NO:11または12と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む軽鎖領域をコードする核酸分子を本明細書に開示する。

SEQ ID NO:13と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖領域をコードする核酸分子を本明細書に開示する。SEQ ID NO:14または15と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む軽鎖領域をコードする核酸分子を本明細書に開示する。

いくつかの態様において、各々がSEQ ID NO:10の軽鎖領域およびSEQ ID NO:19の重鎖領域をコードする、核酸を本明細書に開示する。いくつかの態様において、SEQ ID NO:10の軽鎖領域をコードする核酸は、SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:12によって表され得、SEQ ID NO:19の重鎖領域をコードする核酸は、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21によって表され得る。

(a)プロモーター、
(b)血清アルブミンへ結合する軽鎖をコードする第1核酸分子、および
(c)重鎖および生物活性エフェクター部分（例えばIL-18BP）およびリンカーをコードする第2核酸分子
を含む発現ベクターであって、
前記プロモーター、第1核酸配列、および第2核酸分子が、機能的に連結されている、前記発現ベクターを本明細書にさらに開示する。第2核酸分子は、1、2、3、4、5、6、またはそれ以上の生物活性エフェクター部分およびリンカーをコードすることができる。

以下を含む発現ベクターもまた本明細書に開示する：
(a)プロモーター、および
(b)本明細書に開示されるような重鎖可変ドメインおよび本明細書に開示されるような重鎖定常ドメインをコードする核酸分子。

以下を含む発現ベクターもまた本明細書に開示する：
(a)プロモーター、および
(b)本明細書に開示されるようなIL18BP、本明細書に開示されるような重鎖可変ドメイン、および本明細書に開示されるような重鎖定常ドメインをコードする核酸分子。

以下を含む発現ベクターもまた本明細書に開示する：
(a)プロモーター、および
(b)本明細書に開示されるような軽鎖可変ドメインおよび本明細書に開示されるような軽鎖定常ドメインをコードする核酸分子。

以下を含む発現ベクターもまた本明細書に開示する：
(a)プロモーター、および
(b)本明細書に開示されるようなIL-18BP、本明細書に開示されるような軽鎖可変ドメイン、および本明細書に開示されるような軽鎖定常ドメインをコードする核酸分子。
1、2、3、またはそれ以上の発現ベクターまたは核酸分子を発現させて、所望の組換えタンパク質を産生することができる。

いくつかの態様において、第1核酸分子またはベクターは、重鎖を含む抗原結合断片を含む組換えタンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、重鎖は重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインを含み、ここで、重鎖可変ドメインは以下を含む：
(1)SYGIS (SEQ ID NO:22)のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン1(CDR1)、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3。

第2核酸分子またはベクターが本明細書に開示され、この第2核酸分子またはベクターは、軽鎖を含む抗原結合断片を含む組換えタンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、軽鎖は軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、ここで、軽鎖可変ドメインは以下を含む：
(7)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(9)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(10)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。

例えば、IL-18BPをコードする核酸分子を、上述の第1または第2核酸分子またはベクターへ連結することができる。

他の態様において、第1核酸分子は、以下を含むFabをコードする核酸配列を含むことができる：上記(1)を含む重鎖可変ドメインおよび上記(7)を含む軽鎖可変ドメイン；上記(2)を含む重鎖可変ドメインおよび上記(8)を含む軽鎖可変ドメイン；上記(3)を含む重鎖可変ドメインおよび上記(9)を含む軽鎖可変ドメイン；上記(4)を含む重鎖可変ドメインおよび上記(10)を含む軽鎖可変ドメイン；上記(5)を含む重鎖可変ドメインおよび上記(11)を含む軽鎖可変ドメイン；上記(6)を含む重鎖可変ドメインおよび上記(12)を含む軽鎖可変ドメイン；または上述の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのありとあらゆる組み合わせ。いくつかの態様において、第1核酸分子は、以下を含むFab(SL335)をコードする核酸配列を含む：重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、およびSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含み、かつ、軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO:53のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。第1または第2核酸分子は、IL-18BPをコードすることができる。

他の態様において、第1核酸分子またはベクターは、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、第2核酸分子またはベクターは、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。IL-18BPをコードする核酸分子を、第1または第2核酸分子またはベクターへ連結することができる。

いくつかの態様において、第1核酸分子またはベクターは、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:61、62、63、64、65、または66または67と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様において、第1核酸分子は、SEQ ID NO:10 (V_H-C_H1ドメイン)と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ドメインと、SEQ ID NO:13 (V_L-Cκドメイン)と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ドメインとを含むFab(SL335)をコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様において、生物活性エフェクター部分はIL-18BPである。いくつかの態様において、核酸分子は、SEQ ID NO:7と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むIL-18-BPタンパク質をコードする。いくつかの態様において、IL-18結合タンパク質をコードする核酸分子は、SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。例えば、第1核酸分子は、SEQ ID NO:7のうちの1つまたは複数と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば、SEQ ID NO:8または9を含み得る。

特異的に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片(例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖または軽鎖)の組換え発現は、抗体または断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を伴う。本明細書に記載される抗体またはその断片(例えば、重鎖または軽鎖可変ドメイン)をコードするポリヌクレオチドが一旦得られると、抗体分子の産生用のベクターを、当技術分野において周知の技術を用いた組換えDNA技術によって作製することができる。したがって、抗体または抗体断片(例えば、軽鎖または重鎖)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法を、本明細書に記載する。当業者に周知である方法を用いて、抗体または抗体断片(例えば、軽鎖または重鎖)コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。また、プロモーターへ機能的に連結された、本明細書に記載される抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体もしくはその断片の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、または重鎖もしくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターも提供する。このようなベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ(例えば、WO86/05807およびWO89/01036；ならびに米国特許第No. 5,122,464号を参照のこと)、抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖および軽鎖全体の両方の発現のためにそのようなベクターにクローニングされ得る。

発現ベクターを従来の技術によって細胞(例えば、宿主細胞)へ移すことができ、次いで、得られた細胞を、本明細書に記載される抗体を産生するために、従来の技術によって培養することができる。

記載される抗体分子を発現するために、種々の宿主-発現ベクター系を利用することができる。このような宿主発現系は、関心対象のコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本明細書に記載される抗体分子をその場で発現し得る細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌および枯草菌（B. subtilis）)などの微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセスピキア（Saccharomyces Pichia）)；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV)に感染したかまたは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系(例えば、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）などの緑藻)；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系(例えば、COS (例えば、COS1もしくはCOS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa、およびNIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20およびBMT10細胞)が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体(例えば、抗体pab1949またはpab2044のいずれか1つのCDRを含む抗体)を発現するための細胞は、CHO細胞、例えば、CHO GS System（商標）(Lonza)からのCHO細胞である。いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体を発現するための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。いくつかの態様において、哺乳動物発現ベクターは、pOptiVEC（商標）またはpcDNA3.3である。いくつかの態様において、特に組換え抗体分子全体の発現のために、大腸菌などの細菌細胞、または真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター（major intermediate early gene promoter）エレメントなどのベクターと併用するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳動物細胞は、抗体についての有効な発現系である(Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-105; およびCockett MI et al., (1990) Biotechnology 8: 662-667)。ある態様において、本明細書に記載される抗体は、CHO細胞またはNS0細胞によって産生される。いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節される。

細菌系において、多数の発現ベクターを、発現される抗体分子について意図される用途に応じて有利に選択することができる。例えば、抗体分子の薬学的組成物の作製のために、大量のこのような抗体が産生される場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌発現ベクターpUR278(Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794)、ここで、抗体コード配列は、融合タンパク質が産生されるようにlac Zコード領域とインフレームでベクター中へ個々にライゲーションされ得る；pINベクター(Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509)などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、pGEXベクターもまた、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用することができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合とそれに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローン化された標的遺伝子産物をGST部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。

哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、関心対象の抗体コード配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三連リーダー配列へライゲーションされ得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域ElまたはE3)への挿入は、感染宿主において生存可能であり抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう(例えば、Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81: 3655-3659を参照のこと)。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、自然および合成の両方の様々な起源のものとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって増強され得る(例えば、Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol 153:516-544を参照のこと)。

加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にすることができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0(いかなる免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3O、COS(例えば、COS1またはCOS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10およびHsS78Bst細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、本明細書に記載される組換えタンパク質(例えば、CDRを含む抗体)は、CHO細胞などの哺乳動物細胞において産生される。

いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体は、低減したフコース含量を有するか、またはフコース含量を有さない。このような抗体は、当業者に公知の技術を用いて作製することができる。例えば、抗体は、フコシル化する能力を欠損または欠失する細胞において発現され得る。具体例において、α1,6-フコシルトランスフェラーゼの両方の対立遺伝子のノックアウトを有する細胞株を使用して、低減したフコース含量を抗体を産生することができる。Potelligent（登録商標）システム(Lonza)は、低減したフコース含量を有する抗体を産生するために使用できるそのようなシステムの一例である。

組換えタンパク質の長期、高収率生産のために、安定発現細胞を作製することができる。例えば、本明細書に開示される組換えタンパク質を安定に発現する細胞株を操作することができる。具体的な態様において、本明細書に提供される細胞は、本明細書に記載される抗体(例えば、CDRを含む抗体)を形成するように会合する軽鎖／軽鎖可変ドメインおよび重鎖／重鎖可変ドメインを安定に発現する。

ある局面において、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択マーカーで形質転換することができる。外来DNA／ポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞を栄養強化培地中で1～2日間増殖させ、次いで選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、それらの染色体の中にプラスミドを安定して統合し、成長して、次にクローニングされ、細胞株へと増殖することができるフォーカスを形成するのを可能にする。この方法は、本明細書に記載される抗体またはその断片を発現する細胞株を操作するために有利に使用することができる。このような操作された細胞株は、抗体分子と直接的にまたは間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。

単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler M et al., (1977) Cell 11(1): 223-232)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-823)遺伝子を含むが、これらに限定されない、多数の選択系が、使用され得、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞において用いられ得る。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子についての選択の基礎として使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与する、dhfr(Wigler M et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-3570; O’Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-1531)；ミコフェノール酸に対する耐性を付与する、gpt(Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-2076)；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する、neo(Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; およびMorgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-215)；および、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する、hygro(Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-156)。

抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大させることができる(概説については、Bebbington CR & Hentschel CCG. The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)を参照のこと)。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅領域は抗体遺伝子と関連するため、抗体の産生も増加するであろう(Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66)。

宿主細胞は、本明細書に記載される2つ以上の発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第1ベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第2ベクターで同時トランスフェクトすることができる。2つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含むことができる。宿主細胞は、異なる量の2つ以上の発現ベクターで同時トランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞は、第1発現ベクターおよび第2発現ベクターの以下の比率のいずれか1つでトランスフェクトすることができる：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、または1:50。

あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつ発現させることができる単一のベクターを使用することができる。このような状況において、過剰な毒性遊離重鎖を回避するために、軽鎖は重鎖の前に配置されるべきである(Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; およびKohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199)。重鎖および軽鎖についてのコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含むことができる。発現ベクターは、モノシストロン性またはマルチシストロン性であり得る。マルチシストロン性核酸構築物は、2、3、4、5、6、7、8、9、10個もしくはそれ以上の、または2～5、5～10もしくは10～20個の範囲内の遺伝子／ヌクレオチド配列をコードすることができる。例えば、2シストロン性核酸構築物は、以下の順序でプロモーター、第1遺伝子(例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖)、および第2遺伝子(例えば、本明細書に記載される抗体の軽鎖)を含むことができる。このような発現ベクターにおいて、両方の遺伝子の転写はプロモーターによって駆動され得、一方、第1遺伝子由来のmRNAの翻訳はキャップ依存性スキャニング機構によるものであり得、第2遺伝子由来のmRNAの翻訳は、キャップ非依存性機構、例えばIRESによるものであり得る。

本明細書に記載の抗体分子が組換え発現によって一旦産生されると、それは、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインA後の特異的抗原に対する親和性によって、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製することができる。さらに、本明細書に記載される抗体は、精製を容易にするための本明細書に記載されるかまたはそうでなければ当技術分野において公知の異種ポリペプチド配列へ融合することができる。

具体的な態様において、本明細書に記載される抗体は単離または精製される。一般に、単離された抗体は、単離された抗体とは異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないものである。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体の調製物は、細胞物質および／または化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という文言は、抗体が単離されるかまたは組換え的に産生される細胞の細胞成分から抗体が分離されている抗体の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体は、約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、または0.1%(乾燥重量)未満の異種タンパク質(本明細書において「夾雑タンパク質」とも呼ぶ)および／または抗体の変異体、例えば、抗体の異なる翻訳後修飾形態を有する抗体の調製物を含む。抗体または断片が組換え的に産生される場合、それはまた、一般に、培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約20%、10%、2%、1%、0.5%、または0.1%未満を表す。抗体または断片が化学合成によって生成される場合、それは、一般に、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それは、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、抗体または断片のそのような調製物は、約30%、20%、10%、または5%(乾燥重量)未満の関心対象の抗体または断片以外の化学的前駆体または化合物を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体は、単離または精製される。

組成物
さらに他の局面は、癌または免疫疾患もしくは状態を処置するための、組成物、例えば薬学的組成物であって、活性成分として組換えタンパク質を含む薬学的組成物；癌または免疫疾患もしくは状態を処置する方法であって、組成物を対象へ投与する工程を含む方法；および、癌または免疫疾患もしくは状態を予防または処置するための組換えタンパク質の医学的使用を提供する。

例えば、薬学的組成物は、(a)薬学的有効量の組換えタンパク質；および(b)薬学的に許容される担体を含み得る。

いくつかの態様において、薬学的組成物の生体内半減期は、ヒトIL-18BPのそれと比較した場合、2～20倍増加を示し得る。生体内半減期は、ヒトIL-18BPのそれと比較した場合、例えば、約2.5倍～約3.5倍、約3.5倍～約6倍増加、約4倍～約6倍増加、約4.5倍～約6倍増加、約5倍～約6倍増加、約5.5倍～約6倍増加、約3倍～約5.5倍増加、約3.5倍～約5.5倍増加、約4倍～約5.5倍増加、約4.5倍～約5.5倍増加、約5倍～約5.5倍増加、約3倍～約5倍増加、約3.5倍～約5倍増加、約4倍～約5倍増加、約4.5倍～約5倍増加、約3倍～約4.5倍増加、約3.5倍～約4.5倍増加、約4倍～約4.5倍増加、またはそれから誘導される任意の倍率もしくは倍率範囲を示し得る。いくつかの態様において、加えて、ヒトIL-18BPの生体内半減期は、ヒトIL-18BPの皮下注射後に評価することができる。

いくつかの態様において、薬学的組成物は、血液中の白血球レベルを低下させることができる。白血球は、例えば、好中球、単球、好塩基球、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様において、低下した白血球レベルは、投与後20日目まで、投与後15日目まで、投与後12日目まで、投与後10日目まで、投与後8日目まで、投与後7日目まで、またはそれから誘導される任意の範囲まで、持続および維持され得る。

薬学的組成物は、本開示が関係する当業者によって容易に実施され得る方法に従って、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位剤形または複数回投与容器中に調製することができる。この場合、製剤は、油性媒体もしくは水性媒体中の液剤、懸濁剤、もしくは乳剤の形態、または抽出物、坐剤、散剤、顆粒剤、錠剤、もしくはカプセル剤の形態とすることができ、製剤は分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤中に所望の純度を有する本明細書に記載される組換えタンパク質を含む組成物を本明細書に提供する(Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA)。また、本明細書に記載される組換えタンパク質および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物もまた本明細書に開示する。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒である。

いくつかの局面に従う免疫疾患または癌を予防または処置するための薬学的組成物は、一般的な方法に従って、経口調製物、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エアゾール剤など、外用調製物、坐剤、または滅菌注射用調製物の形態で製剤化した後に使用することができ、また、製剤化のために、薬学的組成物は、薬学的組成物の調製において一般的に用いられる適切な担体、賦形剤、または希釈剤を含むことができる。

担体、賦形剤、または希釈剤としては、様々な化合物または混合物、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などを挙げることができる。

製剤化する場合、一般的に使用される希釈剤または賦形剤、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などを用いて、それを調製することができる。

経口投与用の固形製剤は、組換え融合タンパク質を少なくとも1つの賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどと混合することにより調製することができる。単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤も使用することができる。

経口投与用の液体製剤としては、懸濁剤、内服用液剤、乳剤、シロップ剤が挙げられ得る。一般的に使用される単純な希釈剤である水および流動パラフィンに加えて、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味料、香料、保存剤などを含めることができる。

非経口投与用の製剤としては、滅菌水溶液、非水性溶媒、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥調製物、および坐剤が挙げられる。非水性溶媒および懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルなどを含み得る。坐剤基剤として、ウイテップゾール、マクロゴール、ツイーン61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセリンゼラチンなどを使用することができる。

使用および方法
その必要のある対象において癌または免疫疾患もしくは状態を処置する方法であって、本明細書に開示される薬学的組成物を対象へ投与する工程を含む方法もまた本明細書に開示する。対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばペットおよび家畜であり得る。用語「対象」は、処置を必要とする対象または患者を指す。

本明細書において使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、本明細書に開示される組成物を投与することによって疾患または状態の症状が改善し、排除され、または良好に改変された作用の全てを意味する。

その必要のある対象において癌または免疫疾患もしくは状態の処置のための本明細書に開示される組成物の使用もまた本明細書に開示する。その必要のある対象における癌または免疫疾患もしくは状態の処置における使用のための本明細書に開示される組成物もまた本明細書に開示する。その必要のある対象における癌または免疫疾患もしくは状態の処置用の医薬の製造のための本明細書に開示される組成物使用もまた本明細書に開示する。

いくつかの態様において、組成物は、対象の血液中の白血球を減少させる。いくつかの態様において、白血球は、好中球、単球、好塩基球、またはそれらの組み合わせである。

いくつかの態様において、本明細書に開示される組換えタンパク質の消失半減期(T1/2)は、IL-18BPのそれよりも、少なくとも約2倍長く、少なくとも2.5倍、少なくとも約3倍長く、少なくとも3.5倍、少なくとも約4倍長く、少なくとも約5倍長く、少なくとも約7倍長く、少なくとも約10倍長く、またはそれから誘導される任意の倍率もしくは倍率範囲で長い。いくつかの態様において、組換えタンパク質は、約8時間～約20時間、約10時間～約18時間、約12時間～約15時間、またはそれから誘導される任意の半減期もしくは範囲の消失半減期(T1/2)を有する。いくつかの態様において、組換えタンパク質のTmaxは、IL-18BPのTmaxよりも、少なくとも約10%～約200%高く、約50%～100%高く、約50%～75%高く、またはそれから誘導される任意の%もしくは%範囲で大きい。いくつかの態様において、対象1kg当たり約360 ugの組換えタンパク質の用量は、約8時間～約20時間、約10時間～約15時間、約12時間～約14時間のTmax、またはそれから誘導される任意のTmaxもしくはTmax範囲を提供する。いくつかの態様において、組換えタンパク質のCmaxは、IL-18BPのCmaxよりも、少なくとも約10%高く、少なくとも約20%高く、少なくとも約30%高く、またはそれから誘導される任意の%もしくは%範囲である。いくつかの態様において、対象1kg当たり約360 ugの組換えタンパク質の用量は、約700 ng/ml～約1000 ng/ml、約750 ng/ml～約900 ng/ml、約800 ng/ml～約850 ng/mlのCmax、またはそれから誘導される任意の用量もしくは用量範囲を提供する。いくつかの態様において、組換えタンパク質のAUClastは、IL-18BPのAUClastよりも、少なくとも約2倍大きく、少なくとも3倍大きく、少なくとも4倍大きく、少なくとも5倍大きく、またはそれから誘導される任意の倍率もしくは倍率範囲である。いくつかの態様において、対象1kg当たり約360 ugの組換えタンパク質の用量は、約8000 hr*ng/ml～約25000 hr*ng/ml、約16000 hr*ng/ml～約22000 hr*ng/ml、約18000 hr*ng/ml～約20000 hr*mg/mlのAUClast、またはそれから誘導される任意の濃度もしくは濃度範囲を提供する。

いくつかの態様において、本明細書に提示されるのは、対象における1つまたは複数の免疫機能または応答を調節するための方法であって、その必要のある対象へ、本明細書に記載される抗体、またはその組成物を投与する工程を含む方法である。対象における1つまたは複数の免疫機能または応答を活性化、増強または誘導するための方法であって、その必要のある対象へ抗体またはその組成物を投与する工程を含む方法が本明細書に開示される。いくつかの態様において、1つまたは複数の免疫機能または応答を活性化または増強することが望ましい疾患を予防および／または処置するための方法であって、その必要のある対象へ本明細書に記載される抗体またはその組成物を投与する工程を含む方法を本明細書に提示する。ある態様において、自己免疫疾患または状態を処置する方法であって、その必要のある対象へ抗体またはその組成物を投与する工程を含む方法を本明細書に提示する。

いくつかの態様において、当技術分野において周知のアッセイ、例えば、ELISPOT、ELISA、および細胞増殖アッセイを用いると、本明細書に開示される融合タンパク質は、本明細書に記載される組換えタンパク質を投与されていない対象における免疫機能と比べて、少なくとも99%、少なくとも98%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、もしくは少なくとも10%、または10%～25%、25%～50%、50%～75%、もしくは75%～95%の範囲で、対象における1つまたは複数の免疫機能または応答を活性化、増強、または誘導する。

本明細書に記載される薬学的組成物は、本明細書に開示される組換えタンパク質の活性を増強、誘導、または活性化し、疾患または状態を処置するのに有用であり得る。

インビボ投与に使用される組成物は無菌であり得る。これは、例えば滅菌濾過膜を通る濾過によって容易に達成される。

さらに他の局面は、免疫疾患を予防または処置するための薬学的組成物であって、活性成分として組換え融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。さらに他の局面は、免疫疾患を予防または処置する方法であって、組換え融合タンパク質を個体へ投与する工程を含む方法を提供する。組換え融合タンパク質の具体的な詳細は上述の通りである。

免疫疾患は炎症性疾患または自己免疫疾患であり得る。炎症性疾患は、例えば、成人発症スチル病、全身性若年性特発性関節炎、マクロファージ活性化症候群、血球貪食性リンパ組織球症、アトピー性皮膚炎、乾癬、皮膚炎、アレルギー、関節炎、鼻炎、中耳炎、咽頭痛、扁桃炎、膀胱炎、腎炎、骨盤内炎症、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、浮腫、遅延型アレルギー(IV型アレルギー)、移植拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、虚血性再灌流障害、血管再狭窄、糸球体腎炎、胃腸管アレルギーなどであり得る。さらに、免疫疾患は、例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、全身性血管炎、混合性結合組織疾患、クローン病、橋本病、グレーブス病、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、過敏性腸症候群、重症筋無力症、嗜眠症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、乾癬などであり得る。

いくつかの態様において、薬学的組成物は、成人発症スチル病を予防または処置するための薬学的組成物であって、活性成分として組換え融合タンパク質を含む薬学的組成物であり得る。成人発症スチル病は、全身性若年性特発性関節炎と同様の症状を有する多因子性全身性自己炎症性疾患であり、成人に発生する炎症性疾患であるが、疾患の正確な発症機序は不明のままである。成人発症スチル病は、血中のインターロイキン-18の濃度が上昇し、生体内でのアンタゴニストであるIL-18結合タンパク質の濃度が下方制御されることを特徴とする。一方、組換えIL-18BP薬をそれぞれ80 mg/頭および160 mg/頭の用量で受容した成人発症スチル病患者の50%超が薬物に反応したと報告された。加えて、臨床試験は、薬物がヒトにおいて約30時間～約40時間の半減期を有し、週3回投与される場合に有効であることを報告した。したがって、薬物は皮下注射用の製剤として患者へ頻繁に投与される必要があるという点で問題がある。一つの例示的な態様において、組換え融合タンパク質は、組換えIL-18BPと比較した場合、ラットにおいて約3.5倍延長された半減期を示し、小用量が投与される場合でさえ同一かつ類似の活性を有することが確認された。したがって、組換え融合タンパク質は、成人発症スチル病の処置に有効に用いることができる。

さらに他の局面は、癌を予防または処置するための薬学的組成物であって、活性成分として組換え融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。さらに他の局面は、癌を予防または処置する方法であって、組換え融合タンパク質を個体へ投与する工程を含む方法を提供する。組換え融合タンパク質の具体的な詳細は上述の通りである。

癌は、例えば、多発性骨髄腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、腎臓癌、線維肉腫、黒色腫、血液癌などであり得る。

投与経路および投与量
本開示の薬学的組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内、および筋肉内投与経路を含む様々な投与経路を通じて対象へ投与することができる。

状態の処置および／または予防に有効であろう本明細書に開示される組換えタンパク質または組成物の量は、疾患の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。

本開示において、実際に投与される本明細書に開示される組換えタンパク質の量は、処置される疾患、選択される投与経路、患者の年齢、性別および体重、ならびに疾患の重症度、ならびに活性成分としての生物活性ポリペプチドの種類を含む、種々の関連要因に照らして決定される。本開示の組換えタンパク質は血液中で優れた持続可能性を有するため、本開示の組換えタンパク質を含むペプチド調製物の投与回数および頻度を顕著に減らすことができる。

薬学的組成物は薬学的有効量で投与される。本明細書において使用される場合、対象への療法の投与の文脈における「薬学的有効量」または「有効量」は、所望の予防または治療効果を達成する療法の量を指す。有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物活性、薬物感受性、投与時間、投与経路および排泄率、処置期間、および同時投与される薬物、ならびに医療分野において周知の他の要因を含む要因に応じて決定することができる。薬学的組成物は、単一の治療剤としてまたは他の治療薬と併用して投与することができ、既存の治療薬と同時に、別々に、または連続して、1回でまたは少数の分割用量で、投与することができる。全ての要因を考慮して、いかなる副作用もなく最大の効果を得るのに十分な最小量で組成物を投与することが重要であり、この量は当業者によって容易に決定することができる。本明細書において使用される場合、用語「薬学的有効量」は、癌または免疫疾患もしくは状態を処置するために十分な量を指す。

いくつかの局面に従う免疫疾患または癌を予防または処置するための薬学的組成物の適切な投与量は、患者の状態、体重、疾患重症度、薬物製剤、投与経路および期間に依存して変動するが、当業者によって適切に選択することができる。しかしながら、望ましい効果のために、薬学的組成物は、0.0001 mg/kg～2,000 mg/kg、具体的には0.001 mg/kg～2,000 mg/kgの日用量で投与され得る。投与は、1日1回、またはいくつかの分割用量で行うことができる。

組成物において採用される正確な用量はまた、投与経路、および疾患の重篤度に依存し、医師の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。例えば、有効用量はまた、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態(年齢、体重および健康状態を含む)、投与される他の薬剤、または処置が予防的であるか治療的であるかに依存して変動し得る。通常、患者はヒトであるが、ペット、例えばイヌおよびネコなどの非ヒトであってもよい。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために最適に用量設定される。

ある態様において、インビトロアッセイは、最適な投与量範囲の同定を助けるために採用される。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿することができる。

いくつかの態様において、組換え融合タンパク質は、0.001 mg/kg～2,000 mg/kgの用量で投与され得る。例えば、組換え融合タンパク質は、0.001 mg/kg～0.01 mg/kg、0.1 mg/kg～1 mg/kg、1.5 mg/kg～2 mg/kg、4 mg/kg～10 mg/kg、15 mg/kg～20 mg/kg、30 mg/kg～40 mg/kg、60 mg/kg～80 mg/kg、100 mg/kg～200 mg/kg、またはそれから誘導される任意の用量もしくは用量範囲の用量で投与され得る。

いくつかの局面に従う免疫疾患を予防または処置するための薬学的組成物は、様々な経路を介して、哺乳動物、例えば、ラット、マウス、家畜、ヒトなどへ投与することができる。例えば、経口、直腸もしくは静脈内、筋肉内、皮下、もしくは硬膜内投与、または脳室内注入による、全ての投与様式が企図され得る。

薬学的組成物は、経口または非経口投与することができる。具体的には、薬学的組成物は非経口投与することができ、この場合、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、および直腸投与によって投与することができる。いくつかの態様において、それは皮下注射の形態で投与することができる。経口投与すると、タンパク質またはペプチドは消化され、したがって、活性成分をコーティングするかまたはそれを胃での分解から保護することによって経口組成物を製剤化することが必要とされる。加えて、薬学的組成物は、活性物質を標的細胞へ送達することができる任意のデバイスによって投与することができる。

さらに他の局面は、免疫疾患を予防または改善するための健康機能食品組成物であって、活性成分として組換え融合タンパク質を含む健康機能食品組成物を提供する。さらに他の局面は、癌を予防または改善するための健康機能食品組成物であって、活性成分として組換え融合タンパク質を含む健康機能食品組成物を提供する。組換え融合タンパク質、免疫疾患、および癌の具体的な詳細は上述の通りである。

免疫疾患もしくは状態または癌を予防または改善するための健康機能食品組成物に関して、組換え融合タンパク質を健康機能食品についての添加物として使用し、一般的な方法に従って適切に使用することができる場合、組換え融合タンパク質をそのまま添加してもよく、または他の食品もしくは食品成分と共に使用してもよい。活性成分の混合量は、予防、健康、処置などの各使用目的に応じて適切に決定することができる。

健康機能食品の製剤は、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、およびカプセル剤の形態、ならびに一般的な食品または飲料の形態であり得る。

食品の種類は特に限定されず、前記物質を添加することができる食品としては、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー、スナック、菓子類、ピザ、ラーメン、他の麺類、ガム、アイスクリームを含む乳製品、各種スープ、飲料、茶、飲み物、アルコール飲料、ビタミン複合体などを挙げることができ、常識内の全ての食品が含まれ得る。

一般に、食品または飲料の調製において、組換え融合タンパク質は、原料100重量部に対して15重量部以下、具体的には10重量部以下の量で添加することができる。しかし、保健衛生の目的のためまたは健康管理の目的のための長期摂取の場合は、上記範囲を下回るように量を調整することができる。さらに、本開示は、天然物由来のフラクションが使用されるため、安全性の点で問題はない。したがって、量は前記範囲を上回ることができる。

健康機能食品のうち、飲料は、一般的な飲料中のように、様々な香味剤または天然炭水化物を追加成分として含むことができる。上述の天然炭水化物は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールを含むことができる。甘味料としては、タウマチンおよびステビアエキスなどの天然甘味料、サッカリンおよびアスパルテームなどの合成甘味料などを使用することができる。天然炭水化物の割合は、本開示に従う飲料100 mL当たり約0.01 g～0.04 g、具体的には約0.02 g～0.03 gであり得る。

加えて、いくつかの局面に従う免疫疾患または癌を予防または改善するための健康機能食品組成物は、様々な栄養素、ビタミン、電解質、香味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、pH調整剤、安定剤、保存剤、グリセリン、アルコール、ならびに炭酸飲料に用いられる炭酸化剤を含むことができる。加えて、本開示の免疫疾患または癌を改善するための組成物は、天然果汁、果汁飲料、および野菜飲料を調製するための果肉を含むことができる。これらの成分は、単独でまたは混合物で使用することができる。これらの添加物の割合は限定されないが、一般に、健康機能食品組成物100重量部に対して0.01重量部～0.1重量部の範囲より選択される。

上述のように、組換え融合タンパク質は、例えば、ヒト組換えIL-18BPと比較した場合、ラットにおいて約3.5倍延長された半減期を示すことができ、SL335へ融合されていないIL-18BPの生物学的活性と同様のレベルで生物学的活性を示す。したがって、組換え融合タンパク質は、より少ない投与頻度でも同様の有効性を示すことができるため、患者には、より好都合な間隔で薬物を投与することができる。

キット
本明細書に記載される1つまたは複数の組換えタンパク質またはそのコンジュゲートを含むキットを本明細書に提供する。本明細書に開示される組成物と、その使用説明書を含むラベルとを含むキットを本明細書に開示する。いくつかの態様において、1つまたは複数の本明細書に提供される組換えタンパク質などの、本明細書に記載される薬学的組成物の成分のうちの1つまたは複数が充填された1つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを本明細書に提供する。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載される薬学的組成物と、本明細書に記載されるものなどの任意の予防剤または治療剤とを含有する。そのような容器(複数可)に任意で結び付けられるのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であり得、その通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。また、上記の方法において使用することができるキットも本明細書に提供する。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載される組換えタンパク質、例えば、精製された組換えタンパク質を、1つまたは複数の容器中に含む。いくつかの態様において、本明細書に記載されるキットは、対照として使用することができる実質的に単離された抗原(複数可)(例えば、ヒト血清アルブミン)を含有する。他の態様において、本明細書に記載されるキットは、血清アルブミン抗原と反応しない対照抗体をさらに含む。他の態様において、本明細書に記載されるキットは、血清アルブミン抗原への組換えタンパク質の結合を検出するための1つまたは複数の要素を含む(例えば、組換えタンパク質は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物などの検出可能な基質へコンジュゲートすることができ、または第1抗体を認識する第2抗体を検出可能な基質へコンジュゲートすることができる)。具体的な態様において、本明細書に提供されるキットは、組換え的に産生された、または化学的に合成された血清アルブミン抗原を含むことができる。キット中に提供された血清アルブミン抗原はまた、固体支持体へ結合させることもできる。いくつかの態様において、上述のキットの検出手段は、血清アルブミン抗原が結合されている固体支持体を含む。このようなキットはまた、非結合レポーター標識抗ヒト抗体または抗マウス/ラット抗体を含むことができる。血清アルブミンへの抗体の結合において、抗原は、前記レポーター標識抗体の結合によって検出することができる。

開示の有利な効果
いくつかの局面に従う組換え融合タンパク質は、IL-18結合タンパク質と抗血清アルブミン抗体とを融合することによって調製され、この組換え融合タンパク質は、体内での半減期の増加に起因して比較的長い投与サイクルを有するという利点がある。さらに、この組換え融合タンパク質は低い免疫原性を有し、生体内で副作用を引き起こさないため、成人発症スチル病を含む様々な免疫疾患の処置に有効に用いることができる。

本明細書以下において、本開示のよりよい理解のために例示的な態様を提供する。しかしながら、以下の例示的な態様は、本開示をより容易に理解するためにのみ提供され、しかし、本開示の内容は以下の例示的な態様によって限定されない。

実施例1．インターロイキン-18結合タンパク質と血清アルブミンに対する抗原結合断片とを含む組換え融合タンパク質の調製
1-1．インターロイキン-18結合タンパク質を発現するベクターおよび血清アルブミンに対する抗原結合断片を発現するベクターの調製
インターロイキンIL-18結合タンパク質(IL-18BP)と血清アルブミンへ結合する抗体断片とを含む組換え融合タンパク質を調製した。実験に必要なヒトインターロイキン-18結合タンパク質(hIL-18BP)遺伝子は、Cosmogenetech co, Ltd. (South Korea)によって合成された。ヒト血清アルブミンへ結合するFab抗体断片(SL335)をヒトナイーブ抗体ライブラリーより選択し、重鎖および軽鎖遺伝子はATUM (Newark, California)によって合成された。

hIL-18BPがペプチドリンカー(GSAPAPGS; SEQ ID NO:16)を介してSL335重鎖のC末端へ連結された組換え遺伝子(SL335H-リンカー-hIL18BP)を調製した。詳細には、SL335H-リンカー-hIL18BP遺伝子を、95℃1分間、60℃1分間、および72℃1分間の30サイクルの条件下で、下記表1のSEQ ID NO:1～4によって表されるプライマーを用いて増幅した。その後、増幅された組換え遺伝子および発現ベクターとして使用するpD2535NTを、それぞれ、BbsI (Takara, Japan)制限酵素で処理してBbsI部位を消化し、次いでT4 DNAリガーゼで処理し、各ベクターに挿入した。一方、SL335軽鎖遺伝子をpD2359ベクターに挿入した。

図1Aおよび1Bは、ある局面に従う組換え融合タンパク質の調製用の重鎖(図1A)および軽鎖(図1B)発現ベクターを示す。図1に示されるように、重鎖において、ヒト組換えIL-18BPが、ペプチドリンカーを介してSL335HのC末端へ連結された。

1-2．一過性発現細胞の調製
ExpiCHO-S（商標）細胞(Thermo Fisher scientific)を、発現培地(ExpiCHO発現培地、Thermo Fisher Scientific)を含有する125 ml培養フラスコ中に懸濁し、次いで、37℃、140 rpm、5% CO₂、および80%湿度の条件下にて振盪インキュベーター内で培養した。その後、一過性発現細胞を調製するために、培養細胞を6.0 × 10⁶細胞/mlの密度で分注し、実施例1-1で調製した重鎖および軽鎖遺伝子がそれぞれ挿入されたプラスミドベクター(pD2535NT、pD2539)を、分注した細胞中へトランスフェクトした。次いで、細胞を上記と同じ条件下にて振盪インキュベーター内で16時間培養し、直ちにExpiCHOフィードおよびエンハンサーで処理した。培養3日目に、細胞をさらにExpiCHOフィードで処理し、32℃に設定されたインキュベーター温度で8日間培養した。培養が完了した後、採取した培養培地を4,000 rpmおよび4℃で15分間遠心分離し、細胞と培養培地とを分離した。次いで、培養培地を0.2μm濾紙に通し、不純物を除去した。

1-3．安定細胞株の調製
安定細胞株を、HD-BIOP3 GS null CHO-K1細胞(Horizon Discovery)を用いて調製した。詳細には、4 mMのL-グルタミンを含有するCD FortiCHO (Thermo Fisher Scientific)培地中に3.0 × 10⁵細胞/mlの密度で細胞を分注し、続いて、37℃、5%CO₂、および湿度80%以上の条件下にて振盪インキュベーター内で1日間種培養した。トランスフェクションのために、細胞を1.0 × 10⁶細胞/mlの密度で分取し、実施例1-1で調製した各プラスミドベクター(pD2535NT、pD2539)を、OptiPRO SFM培地およびFreestyle max試薬(Invitrogen, Carlsbad, California)を用いて、分注した細胞中へトランスフェクトし、次いで、37℃、5%CO₂、および湿度80%以上の条件下にて2日間培養した。その後、安定したプール選択を行うために、培地を遠心分離によりL-グルタミンを含まないCD FortiCHO培地に交換し、50μMのメチオニンスルホキシミン(MSX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)および10μg/mlのピューロマイシン(Thermo Fisher Scientific)の処理を2日毎に行い、ベクターでトランスフェクトされていない細胞を除去した。その後、遠心分離機を用いて7～10日毎にMSXとピューロマイシンの両方を含有するCD FortiCHO培地によって培地を交換し、細胞数を毎回5.0 × 10⁵細胞/mlに維持し、21日間培養した。その後、生存率が90%以上で回収された時点で、ストックを1.0 × 10⁷細胞/mlで調製した。

1-4．APB-R3タンパク質の単離および精製
実施例1-3の培養培地中に存在するタンパク質サンプルを、アフィニティークロマトグラフィー(AC)、陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)、および陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)を順次行うことによって精製した。詳細には、アフィニティークロマトグラフィーを流速8ml/分で行い、陽イオン交換クロマトグラフィーを流速2ml/分で行った。次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製されたタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーに通し、樹脂へ結合していないタンパク質を回収した。上記の方法によって精製されたタンパク質をAPB-R3と命名した。

図2は、ある局面に従うAPB-R3タンパク質の構造を示す。図2に示されるように、APB-R3は、血清アルブミンへ特異的に結合するヒトFab断片であるSL335とIL-18BPとがペプチドリンカーを介して連結され、かつ、重鎖(SL335H-ペプチドリンカー-IL-18BP)と軽鎖(SL335L)とが非共有結合的に連結された構造を有することが確認された。また、SL335はヒトV_H-C_H1 (SL335H)およびVL-Cκ(SL335L)からなることも確認された。一方、ヒトナイーブ抗体ライブラリーより選択された配列であるSL335は、配列が元のヒト抗体配列と非常に類似しているため、非常に低い免疫原性を有すると予想される。

比較例1．組換えヒトインターロイキン-18結合タンパク質の調製
Hisタグ(HHHHHHHH; SEQ ID NO:85)がhIL-18BPのC末端へ連結された、組換え遺伝子を調製した。詳細には、表1のSEQ ID NO:5および6によって表されるプライマーを用いて、実施例1-1と同じ条件下にてhIL18BP-his8を増幅した。次いで、生成物を実施例1-1と同じ方法で発現ベクター中に挿入し、次いで、組換えヒトIL-18結合タンパク質を、実施例1-2～1-4の方法によって調製した。次いで、HiTrap IMAC HP (GE Healthcare)およびAKTA pure 150 L装置を用いてタンパク質を精製した。

実験実施例1．APB-R3タンパク質の分子的特徴
1-1．サイズの調査
実施例1および比較例1で調製したタンパク質のサイズを調べるために、SDS-PAGEを行った。詳細には、タンパク質サンプルを、非還元性4×SDSサンプルバッファー(Thermo Fisher Scientific)および2-メルカプトエタノールを使用して、還元および非還元条件下で調製した。非還元条件について、100℃で5分間加熱されたサンプル、または加熱されなかったサンプルを調製して、加熱によるタンパク質の形状およびサイズを比較した。タンパク質サイズマーカー(SMOBio, Taiwan)を調製して、それぞれの条件下でのタンパク質のサイズを比較した。調製されたタンパク質サンプルを、1ウェルあたり1μgまたは2μgの量でMini-protein TGXプレキャストゲル, 4-15%, 15ウェル(Bio-Rad)中へロードし、続いてトリス-グリシンSDSランニングバッファー中にて150 Vで1時間電気泳動した。電気泳動が完了した後、SDS-PAGEゲルをEZ-Gel染色液(DoGenBio, South Korea)と反応させて1時間染色を行い、続いて蒸留水中で1日間脱染を行った。

図3は、還元(R)、非還元かつ煮沸(NR(B))、および非還元かつ非煮沸(NR(NB))条件下での1μg/ウェルおよび2μg/ウェルの量でのAPB-R3タンパク質のサイズを分析するSDS-PAGE結果を示す。図3に示されるように、還元条件および5分間の非還元かつ煮沸条件下でのSL335H-IL18BP重鎖タンパク質は、追加のN結合型およびO結合型糖鎖に起因して、理論サイズ41.905 kDaよりも高い約60 kDaでタンパク質バンドを示し、SL335L軽鎖は理論サイズ(23.311 kDa)と同様の20 kDa～25 kDaでタンパク質バンドを示した。対照的に、非還元かつ非煮沸条件下では、重鎖と軽鎖が結合されたAPB-R3のインタクト型に対応するタンパク質バンドが75 kDa～100 kDaにて高純度で観察され、未結合の重鎖および軽鎖にそれぞれ対応するタンパク質バンドが弱く検出された。

1-2．純度の調査
実施例1-4で精製されたAPB-R3タンパク質の純度を測定するために、SE-HPLCを行った。先ず、TSKgel UltraSW Aggregate 7.8×300 mm (Tosoh Bioscience, Japan)カラムおよび1260 infinity II LC system (Agilent Technologies, Santa Clara, California) HPLC装置を、pH 5.5バッファーで20 mMクエン酸を用いて平衡化した。分析サンプルを、pH 5.5バッファーで20 mMクエン酸を用いて希釈することによって調製し、約25μgのサンプルをカラム上へロードした。SE-HPLC分析を流速0.7 ml/分および最大圧力限界120 barで30分間行い、純度をA280 nm波長で測定した。

図4は、ある局面に従うAPB-R3タンパク質の純度を分析するSEC-HPLC結果を示す。図4に示されるように、APB-R3タンパク質は98%以上の純度を有することが確認された。

1-3．等電点の調査
実施例1-4で精製されたAPB-R3タンパク質の等電点(pI)を測定するために、等電点電気泳動分析(IEF)を行った。詳細には、pH3-10 IEFゲル(Komaゲル)を用い、3μg、5μg、および10μgのサンプルをロードし、条件は100Vで1時間、200Vで1時間、および500Vで1時間であった。タンパク質を12%トリクロロ酢酸(TCA)を用いて固定し、クーマシーブリリアントブルー(CBB)で染色した。その後、タンパク質のpIを、ImageMaster（商標）2D Platinum (GE Healthcare, ver.5.0)を用いて分析した。

図5は、ある局面に従うAPB-R3タンパク質の等電点を分析する結果を示す。図5に示されるように、バンドが4.40～6.00のpIで観察された。

1-4．分子量の調査
実施例1のAPB-R3タンパク質の分子量を測定するために、インタクト質量分析を行った。詳細には、Dionex UHPLC (Thermo Fisher Scientific)およびQ-TOF 5600+ MS/MSシステム(AB SCIEX, CA, USA)を用いて還元条件(20 mM DTT, 37℃)下でインタクト質量分析を行った。分子量を、アセトニトリルの移動相(ACN; J.T. Baker)中、Acquity UPLC（登録商標）BEH130 C4, 1.7μmカラムを用いて流速0.3 ml/分で測定し、結果を以下の表2に示す。

表2に示されるように、APB-R3タンパク質の軽鎖(SL335L)および重鎖(SL335H-IL18BP)の分子量は、それぞれ、23.306 kDaおよび46.611 kDaであることが確認された。

実験実施例2．APB-R3タンパク質の生物学的活性の評価
2-1．IL-18阻害度の調査(1)
実施例1-4で精製されたAPB-R3タンパク質の生物学的機能を評価するために、IL-18に応答してIFN-γを発現するヒトKG-1細胞株(ATCC, CCL-246)を用いて、タンパク質のIL-18阻害度を調べた。先ず、実施例1のタンパク質サンプルを、0.3%ウシ血清アルブミン(BSA)が補われたPBSバッファーでサンプルを希釈することによって調製した。その後、各サンプルを組換えヒトIL-18タンパク質(R&D Systems)で処理し、37℃インキュベーター内で1時間反応させた。その後、1.3 x 10⁶細胞/mlのKG-1細胞を、組換えTNF-α(BioLegend, San Diego, California)を含有するIMDM培地中で調製し、タンパク質混合物中へ分注し、ここで反応を完了させた。細胞およびタンパク質の混合物を37℃および5% CO₂条件下にてインキュベーター内で23時間反応させ、次いで、遠心分離機を用いて上清と細胞とを分離した。分離された上清を分析して、組換えIL-18によりKG-1細胞から分泌されたIFN-γの量を測定した。上清中に分泌されたIFN-γの濃度をELISA MAX（商標）Deluxe SetヒトIFN-γ(BioLegend)を用いて分析し、製品に規定されている標準実験方法に従って行った。比較例1およびSL335タンパク質を同じ方法で分析した。

図6は、ある局面に従うAPB-R3タンパク質によるKG-1細胞株中のIL-18阻害を示すグラフを示す。図6に示されるように、KG-1細胞はIL-18濃度依存的にIFN-γを産生および発現し、APB-R3タンパク質は、IL-18BP-Hisタンパク質と同様に、濃度依存的にIFN-γ産生を阻害した。加えて、APB-R3のIC₅₀は0.0419 nMであり、IL-18BP-HisのIC₅₀は0.0240 nMであり、SL335へ融合されたヒトIL-18BPがそのインタクトな生物学的特性を維持したことを示している。

2-2．IL-18阻害度の調査(2)
実施例1-4で精製されたAPB-R3タンパク質の生物学的機能を評価するために、C57BL/6マウス(Orient Bio)から単離されたナイーブCD4+ T細胞を用いてAPB-R3のIL-18阻害度を調べた。先ず、PBSバッファーを用いて5μg/mlの濃度で希釈された抗CD3(Biolegend, クローン145-2C11)を96ウェル培養プレート(Corning, 3596)の各ウェルに50μlの量で分注し、次いで、4℃で16時間コーティングした。プレートを200μl/ウェルのPBSで2回洗浄し、その後、細胞を添加した。単離されたナイーブCD4+ T細胞をサンプルで処理する前に、以下の前処理を行った。組換えマウスIL-18タンパク質(R&D Systems)および組換えマウスIL-12タンパク質(PeproTech)を、10%ウシ胎仔血清(FBS)(Gemini bio)、50μM 2-メルカプトエタノール(Gibco)、10 mM HEPES (Gibco)、および5μg/mlゲンタマイシン(Gibco)を含有するRPMI1640 (Gibco)培地で希釈することによって、10 ng/mlの濃度で調製し、次いで、段階希釈されたAPB-R3タンパク質サンプルと混合し、37℃インキュベーター内で1時間反応させた。次いで、反応させたサンプルを1.0 x 10⁵細胞/mlのCD4+ T細胞で処理し、37℃および5% CO₂条件下においてインキュベーター内で48時間反応させた。組換えマウスIL-18によってCD4⁺ T細胞から分泌されたIFN-γの量を測定するために、分離された上清をELISA MAX（商標）Deluxe SetマウスIFN-γ(BioLegend)を用いて分析し、製品に規定されている標準実験方法に従って行った。比較例1、組換えマウスIL-18BP (R&D System)、およびSL335タンパク質を同じ方法で分析した。

図7は、ある局面に従うAPB-R3タンパク質によるマウスCD4+ T細胞中のIL-18阻害を示すグラフを示す。図7に示されるように、マウスCD4+ T細胞は、IL-18濃度依存的にINF-γを産生および発現し、APB-R3タンパク質は、ヒトIL-18BP-Hisタンパク質と同様に、濃度依存的にIFN-γ産生を阻害した。対照的に、マウスIL-18BPは濃度依存的にIFN-γ産生を阻害するが、その阻害活性はAPB-R3のそれよりも低かったことが確認された。

実験実施例3．APB-R3タンパク質の薬物動態評価
実施例1で調製されたAPB-R3タンパク質の吸収、分布、インビボ変化、および排泄を、薬物動態を通して調べた。詳細には、Koatech (South Korea)からの20匹の健康な雄性ラットを飼育した後、実施例1のタンパク質の単回皮下投与を5匹のマウスについてそれぞれ6 mg/kgの用量で行い、続いて2 mg/kgの用量で単回静脈内投与を行った。比較例1のタンパク質の単回皮下投与もまた、それぞれ3 mg/kgの用量で行い(5匹)、続いて1 mg/kgの用量で静脈内投与を行った(5匹)。その後、0.5 mlの全血を所定の採血スケジュールに従って頸静脈から採取し[単回皮下投与：0、0.33、1、1.5、3、5、7、12、24、48、72、120、および168時間(計13点)、単回静脈内投与：0、0.083、0.25、0.5、1.25、3、5、10、24、48、および72時間(計11点)]、血漿を遠心分離により分離し、低温冷凍庫(-70℃)に保存した。その後、血漿中のタンパク質濃度を定量的に分析するためにELISAを行った。実験期間中、死亡した動物は観察されず、試験物質の投与に関連する異常な症状は観察されなかった。

図8は、ラットへのAPB-R3タンパク質の皮下投与後の血液中のタンパク質濃度を示すグラフを示す。図8に示されるように、実施例1および比較例1のタンパク質は、それぞれ、ラットへの皮下投与後24時間および12時間で最大血中濃度(C_max)に達し、次いで減少した。詳細には、実施例1は23817.148 ng/mLを示し、比較例1は2533.5136 ng/mLを示し、約9.4倍の差を示した。加えて、実施例1は、1595699.12 h・ng/mLのインビボ曝露(AUC last)値を示し、これは、69900.47 h・ng/mLの値を示した比較例1よりも約22.8倍高かった。加えて、消失半減期(T_1/2)に関して、実施例1は約34.92時間を示し、比較例1は約9.69時間を示し、実施例1の半減期が約3.6倍長かったことを示している。

図9は、ラットへのAPB-R3タンパク質の静脈内投与後の血液中のタンパク質濃度を示すグラフを示す。図9に示されるように、ラットへの実施例1および比較例1の静脈内投与後0.083時間で測定した場合、最大血中濃度はそれぞれ109049.3 ng/mLおよび41969.6564 ng/mLであり、実施例1は約2.6倍高い濃度を示したことを示している。また、実施例1の消失半減期は21.81時間であり、比較例1の消失半減期は6.51時間であったことが観察され、実施例1の半減期は約3.4倍長かったことを示している。

換言すれば、組換え融合タンパク質は、投与方法にかかわらず、体内で増加した消失半減期を示すことができ、したがって、患者には、より好都合な間隔で薬物を投与することができる。加えて、既存のIL-18BPタンパク質と比較した場合、組換え融合タンパク質は少用量でも同じまたは同様の活性を有し、したがって、治療剤の選択を広げることが可能である。

実験実施例4．CpG誘発マクロファージ活性化症候群モデルマウスにおけるインビボ有効性試験
4-1．材料および方法
実験に用いたマウスは全て、Kangwon National UniversityのAnimal Laboratoryセンターで飼育された。IL18bp KO(ノックアウト)マウスは、Macrogen (South Korea)によってC57BL/6 (Orient Bio)でのCRISPR/Cas9技術を使用することによって確立され、8週齢以上のマウスが実験に使用された。

150 ugのAPB-R3、90 ugの抗血清アルブミンFab抗体(SL335)、250 ugの抗マウスIL-1β抗体(BioXcell, BE0246)、250 ugの抗マウスIL-6R抗体(BioXcell, BE0047)、250 ugのアイソタイプ抗体コントロール(BioXcell, BP0085)およびビヒクル(PBS)の各々を、9日間毎日腹腔内投与した。CpG ODN 1826は、Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, Lowa)によって合成され、PBS中に溶解された。0日目、2日目、4日目、6日目、8日目での各抗体投与の2時間後、50 ugの溶解CpG ODN 1826を各マウスに腹腔内投与した。実験中、全てのマウスを天秤で毎日計量した。

10日目に、マウスの眼静脈における、毛細管(Superior, HSU-2901000)によってヘパリン処理された血液試料を、室温で1時間インキュベートした後、4℃で8000 rpmまで遠心分離した。上層の血清を分離し、-80℃の低温冷凍庫に保存した。マウスIFN-γ ELISAキット(Biolegend, 430804)、マウスCXCL9/MIGAキット(R&D, DY492-05)、およびマウスフェリチンELISAキット(Abcam, ab157713)を用い、製造業者の推奨プロトコルに従って実験を行った。アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)が、IFCC(国際臨床化学連合)標準法に従って、Beckman AU480 (Brea, California)を用いてDK Korea (South Korea)によって測定された。

全てのマウスを10日目に犠牲にし、各脾臓および肝臓を、重量の測定、BD FACSVerse（商標）(BD Biosciences)でのフローサイトメトリーによる細胞表現型決定、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色による組織学のために取り出した。

4-2．結果
マクロファージ活性化症候群(MAS)を、C57BL/6マウスにおいて、TLR9アゴニストであるCpGよって誘発した。すべてのIL18bpノックアウト(KO)マウスにおいて有意な体重減少が観察されたが、野生型(WT)マウスでは観察されなかった。体重は、APB-R3投与KO群および無処置群において同様に回復したが、競合抗体(抗IL-6Rおよび抗IL-1β)で処置された群では体重が回復しなかった(図10)。

肝臓および脾臓重量を、MASの肝腫大および脾腫大を考慮した実験の終了時にそれぞれ測定した。CpG+APB-R3投与KO群およびCpG投与WT群との間で肝臓重量/体重の有意差はなかった(図11B)。他方で、CpG+APB-R3投与KO群では、CpG+抗IL-6R抗体およびCpG+抗IL-1β抗体投与KO群(競合抗体)の両方と比較して、脾臓重量/体重が低かった(図11A)。

血清ASTおよびALTのレベルを、Beckman AU480を用いて実験の終了時に測定した。CpG+APB-R3投与KO群におけるASTおよびALTのレベルは、無処置WT、無処置KOおよびCpG投与WT群と同様であったが、CpG+抗IL-6R抗体およびCpG+抗IL-1β抗体投与KO群の両方のそれよりも統計的に低かった(p<0.05)(図12Aおよび12B)。さらに、血清IFN-γおよびCXCL9のレベルは、他のCpG投与群と比較して、CpG+APB-R3投与KO群においてダウンレギュレートされた(図13Aおよび13B)。

脾臓単球/マクロファージの細胞集団を、FACSVerseを用いたフローサイトメトリーによって測定した。細胞集団はCpG投与群ではアップレギュレートされたが、APB-R3投与群ではわずかに低く、これはCpG投与WT群のそれと同様である(図14)。

取り出された肝臓および脾臓を、実験の終了時にH&Eで染色した。脾臓構造の破壊はすべてのCpG投与群で観察されたが、比較的保存されたリンパ濾胞領域がAPB-R3投与群において観察された。炎症により誘導された免疫細胞のいくらかの浸潤が、全てのCpG投与群で同定されたが、APB-R3投与群では競合抗体投与群の両方と比較して相対的に低い浸潤が観察された(データを示さず)。

実験実施例5．結合親和性
7-1．材料および方法
BiaCore（商標）T200 (GE Healthcare)、Sensor Chip CM5 (Cytiva)、およびHBS-EP+ (Cytiva)をランニングバッファーとして使用することによって、組換えヒトIL-18(Prospec)およびヒト血清アルブミン(Sigma)に対するAPB-R3の結合親和性、平衡解離定数(K_D)を測定するために、表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイがWide River Institute of Immunology (Seoul National University, Seoul, KR)によって実施された。APB-R3をpH 4.5でアミンカップリングキット(GE Healthcare)を用いて固定化し、ヒトIL-18の分析対象物を62.5 nM、31.3 nM、15.6 nM、7.8 nM、3.9 nM、および1.95 nMで希釈して調製し、ヒト血清アルブミンの分析対象物を1,250 nM、625 nM、313 nM、156 nM、78 nM、39 nM、および19.5 nMで希釈して調製した。APB-R3とヒトIL-18またはヒト血清アルブミンとの間の動態を、1:1結合フィッティングによって分析した。

7-2．結果
ヒトIL-18に対するヒトIL-18BPアイソフォームa(IL-18BPa)の結合親和性(K_D)は、BIAcoreアフィニティーアッセイによって決定されたように、399 pMであることが知られていた(Kim, S.-H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.97:1190-1195 (2000))。本研究では、抗血清アルブミンFab+ヒトIL-18BPa融合タンパク質であるAPB-R3のヒトIL-18およびヒト血清アルブミンへの結合親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイ(BiaCore（商標）T200)によって決定し、組換えヒトIL-18に対するAPB-R3の結合親和性(K_D)値は6.09 x 10^-11M (60.9 pM)であり、これは、Kim S.-H. et al. (2000)に記載されているヒトIL-18BPaのそれよりもおよそ6倍高い(60.9 pM対399 pM)。ヒト血清アルブミンに対するAPB-R3のK_D値は1.68 x 10^-8M (16.8 nM)であった(表3)。

実験実施例6．APB-R3のインビトロ免疫原性アッセイ
材料および方法
APB-R3のインビトロ免疫原性リスクを、T細胞増殖の分析のためのLonzaのインビトロPBMC増殖アッセイプラットフォーム(Epibase（登録商標）インビトロ増殖アッセイ)を用いて、52人の健康なドナーヒト標的集団において評価した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を陽性対照として使用した。

結果
有意なCD4+ T細胞応答が、KLH陽性対照によってドナーの98%(51/52)において誘導され、また、試験集団全体に対するブランクと有意に異なっていた。有意なCD4+ T細胞応答は、APB-R3によってドナーの10%(5/52)のみにおいて誘導され、試験集団全体に対するブランクと有意差はなかった。結果は、APB-R3が免疫原性のリスクが比較的低いと考えられ得ることを示唆している(表4)。

*p値は、所定の抗原についてのSIの頻度分布が1の平均SI値を有する分布を表すという単一サンプルt検定仮説に関連する。

本開示の上記の説明は、例示のためだけのものであり、本開示は、技術的精神またはその本質的な特徴を変更することなく、異なる特定の形態で容易に改変され得ることが当業者によって理解されるだろう。したがって、上記の例示的な態様は限定的ではなく、しあかしすべての局面において説明的であることが理解されるべきである。

本明細書に記載される様々な局面、態様、および選択肢の全ては、ありとあらゆる変形で組み合わせることができる。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられるように具体的にかつ個々に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

Claims

インターロイキン-18結合タンパク質(IL-18BP)と血清アルブミンに対する抗原結合断片(Fab)とを含む、組換え融合タンパク質。
IL-18BPをFabへ連結するリンカーをさらに含む、請求項1記載のタンパク質。
前記リンカーが、IL-18BPを、Fabの、重鎖定常ドメインのC末端、重鎖可変ドメインのN末端、軽鎖定常ドメインのC末端、および／または軽鎖可変ドメインのN末端へ連結する、請求項2記載のタンパク質。
前記リンカーが、IL-18BPを重鎖定常ドメインのC末端へ連結する、請求項3記載のタンパク質。
前記リンカーが1～50個のアミノ酸を含む、請求項2～4のいずれか一項記載のタンパク質。
前記リンカーが、SEQ ID NO:16および70～84のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項5記載のタンパク質。
Fabの重鎖および軽鎖が非共有結合によって結合されている、請求項1～6のいずれか一項記載のタンパク質。
Fabが、
(1)SYGIS (SEQ ID NO:22)のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン1(CDR1)、

のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン2(CDR2)、および

のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン3(CDR3)；
(2)SYGIS (SEQ ID NO:22)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；
(3)NYGIH (SEQ ID NO:26)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；
(4)SYAMS (SEQ ID NO:29)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；
(5)AYWIA (SEQ ID NO:32)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
LYSGSYSP (SEQ ID NO:34)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3；または
(6) AYSMN (SEQ ID NO:35)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含む重鎖と；
(7)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASRLES (SEQ ID NO:39)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
QQSDSVPVT (SEQ ID NO:40)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(8)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
AASSLQS (SEQ ID NO:42)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(9)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
DASNRAT (SEQ ID NO:45)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(10)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASSRAT (SEQ ID NO:48)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
QQYGSSPRT (SEQ ID NO:49)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；
(11)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASSRAT (SEQ ID NO:48)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
QKYSSYPLT (SEQ ID NO:51)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3；または
(12)

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
GASTGAT (SEQ ID NO:53)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および

のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変ドメインを含む軽鎖と
を含む、請求項1～7のいずれか一項記載のタンパク質。
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、およびSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含み、かつ
軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO:53のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、
請求項1～8のいずれか一項記載のタンパク質。
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～9のいずれか一項記載のタンパク質。
軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～10のいずれか一項記載のタンパク質。
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:55、56、57、58、59、または60のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、または67のアミノ酸配列を含む、請求項1～11のいずれか一項記載のタンパク質。
重鎖定常ドメインが、SEQ ID NO:68と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～12のいずれか一項記載のタンパク質。
軽鎖定常ドメインが、SEQ ID NO:69と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～13のいずれか一項記載のタンパク質。
IL-18結合タンパク質が、SEQ ID NO:7と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～14のいずれか一項記載のタンパク質。
IL-18結合タンパク質が、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、請求項1～15のいずれか一項記載のタンパク質。
前記Fabの重鎖が、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、請求項1～16のいずれか一項記載のタンパク質。
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、請求項1～17のいずれか一項記載のタンパク質。
請求項1～18のいずれか一項記載の組換え融合タンパク質をコードする、核酸分子。
請求項19記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
請求項20記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
請求項1～18のいずれか一項記載の組換え融合タンパク質を含む、組成物。
請求項22記載の組成物と薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
請求項22または23記載の組成物と、使用説明書を含むラベルとを含む、キット。
その必要のある対象において免疫疾患を処置する方法であって、有効量の請求項23記載の薬学的組成物を該対象へ投与する工程を含む、方法。
免疫疾患が炎症性疾患または自己免疫疾患である、請求項25記載の方法。
炎症性疾患が、アトピー性皮膚炎、乾癬、皮膚炎、アレルギー、関節炎、鼻炎、中耳炎、咽頭痛、扁桃炎、膀胱炎、腎炎、骨盤内炎症、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、浮腫、遅延型アレルギー(IV型アレルギー)、移植拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、虚血性再灌流障害、血管再狭窄、糸球体腎炎、または胃腸管アレルギーである、請求項26記載の方法。
自己免疫疾患が、成人発症スチル病、全身性若年性特発性関節炎、マクロファージ活性化症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、全身性血管炎、混合性結合組織疾患、クローン病、橋本病、グレーブス病、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、過敏性腸症候群、重症筋無力症、嗜眠症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、または乾癬である、請求項26記載の方法。
その必要のある対象において癌を処置する方法であって、有効量の請求項23記載の薬学的組成物を該対象へ投与する工程を含む、方法。
癌が、多発性骨髄腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、腎臓癌、線維肉腫、黒色腫、または血液癌である、請求項29記載の方法。