KR20240055222A - 인터루킨-2 변이 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
인터루킨-2 변이 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 재조합 융합 단백질, 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 재조합 융합 단백질은 체내에서 반감기가 증가하여 투여 주기가 비교적 길다는 장점이 있고, 조절 T 세포에 대한 선택적 활성으로 염증성 장질환, 전신 홍반성 루푸스등을 포함한 다양한 면역 질환 및 염증성 신경질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
Description
인터루킨-2 변이 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이의 용도에 관한 것이다.
자가면역질환은 인체의 면역계가 이상을 일으켜 자가 면역으로 나타나는 질병으로 정상적인 화학 물질과 신체의 일부 세포들에 대해 면역계가 잘못된 반응을 일으키는 것이다. 인간의 면역계는 기본적으로 인체에 침입한 미생물 및 암세포 등에 대하여 외부 항원으로 인식하고, 이를 공격하여 제거하는 강력한 힘을 지녔지만 자기 관용(self-tolerance)로 인해 자기 세포에 대해서는 공격하지 않는다. 그러나, 면역계의 자기 관용이 파괴될 경우, 인체는 자기 세포(또는 자가 항원)에 반응하는 자가반응 T 세포가 활성화되고 자가항체(autoantibody)가 생성되면서 끊임없이 자기 세포를 파괴하며 염증 및 면역 반응을 일으키게 된다.
자가면역질환의 발생 원인에 대하여 명확히 밝혀지지는 않았지만, 유전적 요인과 후천적, 환경적 요인으로 크게 구분하며, 최근의 연구에 의하면 자가면역질환은 조절 T 세포 (Regulatory T cell, Treg)의 수가 감소되어 있어 이러한 조절 T 세포를 증가시켜주는 것이 중요한 치료전략으로 여겨진다.
조절 T 세포(Regulatory T cell; Treg)는 여러 면역 세포의 활성을 억제하는 CD4+CD25+ T 세포의 한 부류이다. 조절 T 세포는 면역계 항상성에 있어서 중심적이며, 자기 항원에 대한 관용을 유지하고 외래 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 데 있어서 주된 역할을 한다. 전신 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장질환 (IBD) 및 이식 편대 숙주 질환 (GVHD)을 비롯한 다수의 자가면역 질환 및 염증성 질환에서 Treg 세포수 또는 Treg 기능에 결함이 있는 것으로 확인 되었다. 따라서, Treg 세포의 수 및 기능을 활성화시키는 치료법의 개발이 큰 관심의 대상이다.
조절 T 세포의 활성화에는 인터루킨 2(IL-2)가 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는데, 조절 T 세포에는 인터루킨 2의 수용체인 IL-2RA(CD25), IL-2RB(CD122) 및 IL-2RG(CD132)로 이루어진, IL-2Rαβγ를 높은 항상적 수준으로 발현하고 있다. ILTOO사의 경우 저용량의 IL-2를 이용하여 1형 당뇨병, 루푸스 등의 자가면역 질환 임상 시험을 진행 중이며, 이는 Treg 세포만을 표적으로 하기 위한 전략인데, 그 이유는 Treg 세포는 IL-2Rαβγ의 발현으로 인해 다수의 다른 면역 세포 유형보다 더 적은 농도의 IL-2에 반응하기 때문이다 (Klatzmann D, 2015, Nat Rev Immunol. 15:283-94). 하지만 이와 같은 저용량의 IL-2 투여도 안전성, 내약성, 그리고 환자 편의도 측면에서 개선의 필요성이 있어 독성이 없는 새로운 기전의 치료제 개발이 요구되고 있다.
인터루킨-2(interleukin-2, IL-2)은 CD4+ 헬퍼 T 세포에 의해 생산되며 조절 T 세포(Regulatory T 세포)를 비롯한 모든 T 세포 및 NK 세포의 증식과 활성화를 유도하는 사이토카인이다. 상기의 면역세포는 IL-2 수용체(IL-2R)를 세포 표면에 발현하는데 조절 T 세포의 경우는 IL-2Rαβγ 삼량체(Trimer)를 발현하고 있고 CD4+ effector T 세포, CD8+ effector T 세포 및 NK 세포 등은 IL-2Rβγ 이량체(Dimer) 형태의 IL-2 수용체를 발현하고 있다.
따라서, IL-2Rβγ 이량체 보다는 IL-2Rαβγ 삼량체에 선별적으로 결합하는 IL-2 돌연변이(IL-2 mutein)을 개발할 경우 CD8+ T 세포와 NK 세포보다는 조절 T 세포를 선별적으로 활성화시킬 수 있으며 결과적으로 비정상적으로 과열된 자가면역질환 환자의 면역체계를 안정화시킬 수 있다.
본 발명은 인터루킨-2 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 인터루킨-2 변이 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 366개의 아미노산을 포함하는 중쇄; 215개의 아미노산을 포함하는 경쇄로 이루어져 있다. 또한, 상기 재조합 융합 단백질은 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편에는 글라이코실화(glycosylaytion)가 존재하지 않고, IL-2 단백질에 1개의 N- O-글라이코실화가 부위가 존재한다. 따라서, 일 양상에 따른 재조합 융합 단백질은 글라이코실화는 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "인터루킨-2 변이 단백질(Interleukin-2, IL-2)"은 IL-2 돌연변이(IL-2 mutein)로 IL-2 수용체 (IL-2R) 중 CD8+ effector T 세포 및 NK 세포 등에 발현되어 있는 IL-2Rβγ 이량체 형태의 수용체 보다는 조절 T 세포에 발현되어 있는 IL-2Rαβγ 삼량체에 선별적으로 결합한다. 일 구체예에 있어서, 상기 IL-2 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "혈청 알부민"은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 혈관 내에서 체액이 머물게 하여 혈관과 조직 사이의 삼투압 유지에 중요한 역할을 한다. 또한, 용어 "혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편"은 혈청 알부민의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-혈청 알부민 항체 또는 항체 분자의 항원 결합 단편을 의미할 수 있다. 항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 영역; 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "재조합 융합 단백질"은 2종 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질로서, 일 구체예에 있어서, IL-2 단백질과 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편 즉, 항-혈청 알부민 Fab 항체 절편이 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 이러한 재조합 융합 단백질은 각각의 파트너가 결정된 후 화학적으로 합성하거나 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 IL-2 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 항-혈청 알부민의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자 서열을 연결한 융합 유전자(발현 벡터)를 세포 발현 시스템에서 발현시켜 수득할 수 있다. 이러한 재조합 융합 단백질은 IL-2 단백질과 항-혈청 알부민 Fab 항체 절편이 직접 연결되거나 링커와 같은 연결자를 통해 연결되 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 IL-2 단백질, 링커 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 중쇄 영역을 포함하는 중쇄; 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 경쇄 영역을 포함하는 경쇄가 비공유결합에 의해 결합된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "링커"란 IL-2 단백질과 항-혈청 알부민 Fab 항체 절편을 연결하여 재조합 융합 단백질을 만드는 경우에 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시켜 결합시킨 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩타이드를 말한다. 링커는 면역반응을 최소화할 수 있는 것이라면 그 종류나 아미노산 수의 제한이 없다. 예를 들어, 상기 링커는 아미노산 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개 또는 1 내지 8개를 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 링커는 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 중쇄 영역의 C 말단과 IL-2 단백질을 연결하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 서열번호 11의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 상기 재조합 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 재조합 융합 단백질의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 면역 질환은 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease) 또는 전신홍반성루푸스(Systemic Lupus Erythematosus) 또는 근위축성 측삭경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis) 또는 파킨슨병 (Parkinson's Disease) 질환인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것일 수 있다. 염증성 장질환은 심각한 만성 염증반응에 의해 복통, 설사, 출혈을 일으키는 대표적인 자가면역질환이며 크론병(Chron's disease)과 궤양성대장염(Ulcerative colitis)으로 분류된다. 크론병은 소화기관 전체에 걸쳐 무작위적인 염증이 발생하는 반면 궤양성대장염은 대장에 국한되어 염증이 발생한다. 아직 명확한 발병 기전이 알려져 있지 않고 뚜렷한 치료방법이 없이 악화와 호전을 반복하는 것으로 알려져 있다. 여러 자가면역질환의 동물모델에서 조절 T 세포를 증가시켜 질병 억제 효과가 있음이 확인되었으나 현재 조절 T 세포를 체내에서 증가시키는 치료제는 승인받은 바가 없다. 따라서, 일 양상에 따른 재조합 융합 단백질은 염증성 장질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
다른 양상은 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 전신홍반성루푸스, 근위축성 측삭경화증 또는 파킨슨의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에 따른 면역 질환 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 재조합 융합 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 면역 질환 또는 치료용 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다.
일 양상에 따른 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
다른 양상은 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 재조합 융합 단백질, 면역 질환, 암의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 양상에 따른 면역 질환 또는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질을 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 재조합 융합 단백질은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 일 양상에 따른 면역 질환 또는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 수면 개선용 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 상기 건강기능식품 조성물의 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기한 바와 같이, 일 양상에 따른 재조합 융합 단백질은 재조합 인간 IL-2과 비교하여 SL335에 융합된 형태로 연장된 반감기가 예상되는 바, 적은 투여 횟수로 유사한 효능을 나타낼 수 있으므로 환자에게 보다 편리한 약물 투여 간격을 제공할 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 융합 단백질은 IL-2 변이 단백질과 항-혈청 알부민 항체를 융합한 것으로, 체내에서 반감기가 증가하여 투여 주기가 비교적 길다는 장점이 있다. 또한, 면역원성이 낮아 생체 내에서 부작용을 일으키지 않으므로 염증성 장질환 또는 전신홍반성루푸스를 포함한 다양한 면역 질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 재조합 융합 단백질를 제조하기 위한 중쇄(A) 및 경쇄(B) 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 2는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 일 양상에 따른 SAFA-IL2m, Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 크기를 1 ㎍/웰 reducing(R), 열을 가한 non-reducing(NR(B)), 열을 가하지 않은 non-reducing(NR(NB)) 조건에서 SDS-PAGE를 수행하여 분석한 결과이다.
도 4는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m, Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 순도를 SE-HPLC를 수행하여 분석한 결과이다.
도 5는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질의 인간 혈청 알부민, 원숭이 혈청 알부민, 생쥐 혈청 알부민에 대한 결합력 분석 결과이다.
도 6은 IL-2 수용체 의존 세포주에서 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질에 의한 활성 정도를 측정한 그래프이다.
도 7은 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질의 CD25, CD122에 대한 결합력 분석 결과이다.
도 8은 마우스의 비장에서 세포를 분리하여 SAFA-IL2m 단백질 용량 반응을 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 포스포-STAT5 신호전달을 측정한 그래프이다.
도 9는 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 SAFA-IL2m 단백질의 용량 반응을 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 포스포-STAT5 신호전달을 측정한 그래프이다.
도 10은 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 SAFA-IL2m 단백질의 용량 반응을 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 Ki67 증식 마커를 측정한 그래프이다.
도 11은 단회 피하 주사 후 SAFA-IL2m 단백질 및 양성 대조군이 처리된 마우스에서 비장, 서혜 림프절 및 장간막 림프절에서 세포를 분리한 후, 조절 T 세포 대 CD4+ Tconv 세포 수의 비율, 조절 T 세포 대 CD8+ T 세포 수의 비율, 조절 T 세포 대 NK 세포 수의 비율을 확인한 그래프이다.
도 12는 일 양상에 따라 면역 접종 한 마모셋 원숭이에서 SAFA-IL2m의 면역 반응을 확인한 그래프이다.
도 13은 Dextran sulfate sodium (DSS)로 유도된 염증성 장질환 마우스 모델에서 SAFA-IL2m 단백질 및 양성 대조군 투여 후 질병 활성도 (disease activity index, DAI) 점수, 장 길이 변화, 사이토카인 수준을 확인한 그래프이다.
도 2는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 일 양상에 따른 SAFA-IL2m, Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 크기를 1 ㎍/웰 reducing(R), 열을 가한 non-reducing(NR(B)), 열을 가하지 않은 non-reducing(NR(NB)) 조건에서 SDS-PAGE를 수행하여 분석한 결과이다.
도 4는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m, Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 순도를 SE-HPLC를 수행하여 분석한 결과이다.
도 5는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질의 인간 혈청 알부민, 원숭이 혈청 알부민, 생쥐 혈청 알부민에 대한 결합력 분석 결과이다.
도 6은 IL-2 수용체 의존 세포주에서 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질에 의한 활성 정도를 측정한 그래프이다.
도 7은 일 양상에 따른 SAFA-IL2m 단백질의 CD25, CD122에 대한 결합력 분석 결과이다.
도 8은 마우스의 비장에서 세포를 분리하여 SAFA-IL2m 단백질 용량 반응을 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 포스포-STAT5 신호전달을 측정한 그래프이다.
도 9는 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 SAFA-IL2m 단백질의 용량 반응을 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 포스포-STAT5 신호전달을 측정한 그래프이다.
도 10은 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 SAFA-IL2m 단백질의 용량 반응을 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 Ki67 증식 마커를 측정한 그래프이다.
도 11은 단회 피하 주사 후 SAFA-IL2m 단백질 및 양성 대조군이 처리된 마우스에서 비장, 서혜 림프절 및 장간막 림프절에서 세포를 분리한 후, 조절 T 세포 대 CD4+ Tconv 세포 수의 비율, 조절 T 세포 대 CD8+ T 세포 수의 비율, 조절 T 세포 대 NK 세포 수의 비율을 확인한 그래프이다.
도 12는 일 양상에 따라 면역 접종 한 마모셋 원숭이에서 SAFA-IL2m의 면역 반응을 확인한 그래프이다.
도 13은 Dextran sulfate sodium (DSS)로 유도된 염증성 장질환 마우스 모델에서 SAFA-IL2m 단백질 및 양성 대조군 투여 후 질병 활성도 (disease activity index, DAI) 점수, 장 길이 변화, 사이토카인 수준을 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인터루킨-2 변이 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 재조합 융합 단백질의 제조
1-1. 인터루킨-2 변이 단백질 발현 벡터 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 발현 벡터의 제조
인터루킨-2 (Interleukin-2, IL2) 변이체와 혈청 알부민에 결합하는 항체 절편을 포함하는 재조합 융합 단백질 발현 벡터를 제조하였다. 인터루킨-2 변이체1 C125A(IL2 m1, 서열번호 3)와 혈청알부민에 결합하는 Fab 항체 절편(SL335) 중쇄 유전자 (서열번호 1)가 펩타이드 링커 (서열번호 11)로 연결된 SL335H-Linker-IL2m2 유전자 (서열번호 5)와 인터루킨-2 N88R, V91D, M104S, C125A 변이체 (IL2m2, 서열번호 4)와 혈청알부민에 결합하는 Fab 항체 절편(SL335) 중쇄 유전자 (서열번호 1)가 펩타이드 링커 (서열번호 11)로 연결된 SL335L-Linker-IL2m2 유전자는 ㈜코스모진텍(South Korea)에서 유전자 코돈 최적화 진행 후 합성하였다(서열번호 6).
유전자 합성 제작된 SL335H-Linker-IL2m1, SL335L-Linker-IL2m2 유전자 발현을 위해 발현 벡터 pD2535NT(ATUM,USA)와 SL335H-Linker-IL2m1, SL335L-Linker-IL2m2 유전자에 BbsⅠ (Takara, Japan) 제한효소를 처리하여 BbsⅠ 부위를 절단하였고, T4 DNA ligase (Takara, Japan)를 처리하여 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작 하였다.
혈청알부민에 결합하는 Fab 항체 절편(SL335) 경쇄 유전자는 ATUM사 (USA)에서 유전자 코돈 최적화 진행 후 유전자 합성 및 발현 벡터 pD2359(ATUM, USA)에 삽입된 형태로 제작하였다.
도 1는 일 양상에 따른 재조합 융합 단백질를 제조하기 위한 중쇄(A) 및 경쇄(B) 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 2은 일 양상에 따른 제작할 APB-R4 (SAFA-IL2m2) 단백질의 구조를 나타낸 것이다
1-2. 일시적 발현 세포의 제조
ExpiCHO-S™ 세포(ThermoFhisher scientific)를 발현 배지(ExpiCHO expression media, Thermo Fisher Scientific)가 들어있는 125 ㎖ 배양 플라스크에 풀어준 뒤, 37℃, 140 rpm, 5% CO2, 습도 80% 조건으로 배양하였다. 이후, 일시적 발현 세포의 제작을 위해 배양된 세포를 6.0×106 cells/㎖으로 분주하였고 상기 실시예 1-1에서 제조한 유전자가 각각 삽입된 플라스미드 벡터(pD2535NT, pD2539)를 분주된 세포에 형질 주입하였고, 37℃, 140 rpm, 5% CO2, 습도 80% 조건 배양 16시간 후 ExpiCHO 피드(feed)와 인핸서(enhancer)를 처리하고 상기 동일한 조건으로 배양 하였다. 배양 6일째 D-Glucose를 추가 처리하였고 37℃, 140 rpm, 5% CO2, 습도 80% 조건으로 8일간 배양하였다. 배양이 종료된 후, 수확한 배양액을 4,000 rpm, 15분, 4℃ 조건의 원심분리기를 이용하여 세포와 배양액을 분리하였고 분리한 배양액을 0.2 ㎛ 여과지에 통과시켜 불순물을 제거하였다.
1-3. 안정화 세포주 제조
HD-BIOP3 GS null CHO-K1 세포(Horizon Discovery)를 사용하여 안정화 세포주를 제조하였다. 구체적으로, 4 mM의 L-glutamine이 포함된 CD FortiCHO (Thermo Fisher Scientific) 배지에 세포를 3.0 × 105 cells/㎖로 분주하여 37℃, 5% CO2, 80% 이상의 습도 조건의 쉐이킹 인큐베이터에서 1일 동안 종 배양(seed culture)하였다. 형질 주입을 위하여 세포를 1.0 × 106 cells/㎖로 분주하였고 상기 실시예 1-1에서 제조한 SAFA-IL2m1, SAFA-IL2m2 플라스미드 벡터(pD2535NT, pD2539)를 OptiPRO SFM 배지와 Freestyle max reagent (Invitrogen, Carlsbad, California)을 이용하여 분주된 세포에 형질 주입시킨 후 37℃, 5% CO2, 80% 이상의 습도 조건에서 2일 동안 배양하였다. 이후 stable pool 선별을 진행하기 위해 원심분리를 이용하여 L-glutamine이 포함되지 않은 CD FortiCHO 배지로 교체하였고 50 μM의 Methionine Sulfoximine (MSX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)과 10 ㎍/㎖의 puromycin (Thermo Fisher Scientific)을 이틀 간격으로 처리하여 벡터가 주입되지 않은 세포들을 제거하였다. 이후 원심분리기를 이용하여 MSX와 puromycin이 모두 포함된 CD FortiCHO 배지로 7~10일 간격으로 교체해주었으며 매 회 세포 수를 5.0Х105 cells/㎖로 유지하며 21일 동안 배양하였다. 이후 viability가 90% 이상으로 회복하여 1.0 Х 107 cells/㎖로 스탁을 제작하였다.
1-4. SAFA-IL2 변이 단백질의 분리 및 정제
상기 실시예 1-3의 SAFA-IL2m1, SAFA-IL2m2 안정화 세포주 배양액에 존재하는 단백질 시료를 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography; AC), 멀티모달 음이온 교환 크로마토그래피(Multimodal Anion exchange chromatography; MAEX) 및 양이온 교환 크로마토그래피(Cation exchange chromatography; CEX)를 차례대로 수행하여 정제하였다.
구체적으로 1-3의 SAFA-IL2m1, SAFA-IL2m2 (APB-R4) 단백질은 친화성 크로마토그래피는 CaptureSelect CH1-XL resin(Thermo fisher science, USA)를 1x PBS(pH 7.4)로 평형화 시킨 후 배양액을 유체 속도 136 cm/hr 속도로 결합시켜 25 mM Sodium citrate pH 5.0 버퍼로 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질 용액은 멀티모달 음이온 교환 크로마토그래피 Capto adhere ImpRes resin (Cytiva,USA)를 이용하여 pH 6.0 조건에서 FT mode 방식으로 불순물을 제거하고, 분리된 단백질 용액은 마지막으로 양이온 교환 크로마토그래피 Capto SP ImpRes resin(Cytiva, USA)을 이용하여, 20 mM L-Histidine buffer pH 7.0으로 레진을 평형화 시킨 resin에 단백질을 결합시키고 20 mM L-Histidine buffer pH 7.0, 1M NaCl을 이용하여 최종 단백질을 분리 정제 하였다. 상기 방법으로 정제된 단백질을 SAFA-IL2m1, SAFA-IL2m2 (APB-R4)로 명명하였다.
[비교예]
비교예 1. 재조합 인간 인터루킨-2 변이 단백질의 제조
1-1. 인터루킨-2 변이체 단백질 Efavaleukin-alfa analogue 발현 벡터의 제조
인터루킨-2 변이체 비교물질 Efavaleukin-alfa (AMGEN, AMG-592) analogue 단백질을 발현하는 발현 벡터를 제작하였다. Efavaleukin-alfa analogue는 약물 정보 사이트 (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, D11612) 공개 서열정보를 이용하여 ㈜코스모진텍(South Korea)에서 유전자 코돈 최적화 진행 후 합성하였다.
유전자 합성 제작된 Efavaleukin-alfa analogue 유전자 발현을 위해 발현 벡터 pD2535NT(ATUM,USA)와 Efavaleukin-alfa analogue 유전자에 BbsⅠ (Takara, Japan) 제한효소를 처리하여 BbsⅠ 부위를 절단하였고, T4 DNA ligase (Takara, Japan)를 처리하여 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작 하였다.
1-2. 일시적 발현 세포의 제조
ExpiCHO-S™ 세포(ThermoFhisher scientific)를 발현 배지(ExpiCHO expression media, Thermo Fisher Scientific)가 들어있는 125 ㎖ 배양 플라스크에 풀어준 뒤, 37℃, 140 rpm, 5% CO2, 습도 80% 조건으로 배양하였다. 이후, 일시적 발현 세포의 제작을 위해 배양된 세포를 6.0×106 cells/㎖으로 분주하였고 상기 비교예 1-1에서 제조한 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터(pD2535NT)를 분주된 세포에 형질 주입하였고, 37℃, 140 rpm, 5% CO2, 습도 80% 조건 배양 16시간 후 ExpiCHO 피드(feed)와 인핸서(enhancer)를 처리하고 상기 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 6일째 D-Glucose를 추가 처리하였고 37℃, 140 rpm, 5% CO2, 습도 80% 조건으로 8일간 배양하였다. 배양이 종료된 후, 수확한 배양액을 4,000 rpm, 15분, 4℃ 조건의 원심분리기를 이용하여 세포와 배양액을 분리하였고 분리한 배양액을 0.2 ㎛ 여과지에 통과시켜 불순물을 제거하였다.
1-3. 안정화 세포주 제조
HD-BIOP3 GS null CHO-K1 세포(Horizon Discovery)를 사용하여 안정화 세포주를 제조하였다. 구체적으로, 4 mM의 L-glutamine이 포함된 CD FortiCHO (Thermo Fisher Scientific) 배지에 세포를 3.0 × 105 cells/㎖로 분주하여 37℃, 5% CO2, 80% 이상의 습도 조건의 쉐이킹 인큐베이터에서 1일 동안 종 배양(seed culture)하였다. 형질 주입을 위하여 세포를 1.0 × 106 cells/㎖로 분주하였고 상기 비교예 1-1에서 제조한 Efavaleukin-alfa analogue 플라스미드 벡터(pD2535NT)를 OptiPRO SFM 배지와 Freestyle max reagent (Invitrogen, Carlsbad, California)을 이용하여 분주된 세포에 형질 주입시킨 후 37℃, 5% CO2, 80% 이상의 습도 조건에서 2일 동안 배양하였다. 이후 stable pool 선별을 진행하기 위해 원심분리를 이용하여 L-glutamine이 포함되지 않은 CD FortiCHO 배지로 교체하였고 50 μM의 Methionine Sulfoximine (MSX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)과 10 ㎍/㎖의 puromycin (Thermo Fisher Scientific)을 이틀 간격으로 처리하여 벡터가 주입되지 않은 세포들을 제거하였다. 이후 원심분리기를 이용하여 MSX와 puromycin이 모두 포함된 CD FortiCHO 배지로 7~10일 간격으로 교체해주었으며 매 회 세포 수를 5.0Х105 cells/㎖로 유지하며 21일 동안 배양하였다. 이후 viability가 90% 이상으로 회복하여 1.0 Х 107 cells/㎖로 스탁을 제작하였다.
1-4. Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 분리 및 정제
비교예 1-3의 Efavaleukin-alfa analogue 단백질은 친화성 크로마토그래피는 CaptureSelect CH1-XL resin(Thermo fisher science, USA)를 1x PBS(pH 7.4)로 평형화 시킨 후 배양액을 유체 속도 240 cm/hr 속도로 결합시켜 50 mM Sodium citrate pH 3.0 버퍼로 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질 용액은 음이온 교환 크로마토그래피 POROS™ XQ resin (Thermo fisher science, USA) 를 이용하여 pH 5.5 조건에서 FT mode 방식으로 불순물을 제거하고, 분리된 단백질 용액은 마지막으로 양이온 교환 크로마토그래피 CM Sepharose FF resin(Cytiva, USA)을 이용하여, 25 mM Sodium citrate pH 5.0으로 레진을 평형화 시킨 resin에 단백질을 결합시키고 5 mM Sodium citrate pH 5.0, 1M NaCl을 이용하여 최종 단백질을 분리 정제 하였다.
[실험예]
실험예 1. SAFA-IL2m 단백질의 분자적 특징
1-1. 크기 확인
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 단백질의 크기를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 구체적으로, 단백질 시료는 non-reducing 4×SDS 샘플 버퍼(Thermo Fisher Scientific)와 2-mercaptoethanol를 사용하여 reducing 조건과 non-reducing 조건의 샘플을 준비하였으며 non-reducing 조건의 경우에는 열에 의한 단백질의 형태와 크기를 비교하기 위해 100℃에서 5분간 가열한 샘플과 가열하지 않은 샘플을 함께 준비하였다. 각각의 조건에서 단백질들의 크기를 비교하기 위해 protein size marker (SMOBio, Taiwan)를 준비하였다. 준비된 단백질 시료를 Mini-protein TGX precast gel, 4-15%, 15-well (Bio-Rad)에 well당 1 ㎍ 또는 2 ㎍이 포함되게 로딩하였고, 이후 tris-glycine SDS running 버퍼에서 150 V 전압으로 1시간 동안 전기 영동을 진행하였다. 전기 영동이 완료된 후에 SDS-PAGE gel을 EZ-Gel staining solution (DoGenBio, South Korea)에 반응시켜 1시간 동안 염색하였고 이후 증류수에서 하루 동안 탈색시켰다.
도 3-A는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m1, SAFA-IL2m2 단백질의 크기를 1 ㎍/웰 reducing(R), 열을 가한 non-reducing(NR(B)), 열을 가하지 않은 non-reducing(NR(NB)) 조건에서 SDS-PAGE를 수행하여 분석한 결과이다.
도 3-B는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m2, Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 크기를 1 ㎍/웰 reducing(R), 열을 가한 non-reducing(NR(B)), 열을 가하지 않은 non-reducing(NR(NB)) 조건에서 SDS-PAGE를 수행하여 분석한 결과이다.
그 결과, 도3-A에 나타낸 바와 같이, SAFA-IL2m1, SAFA-IL2m2 단백질의 reducing 조건과 5분간의 열을 가한 non-reducing 조건에서 SL335H-IL2m1 SL335H-IL2m2의 중쇄 단백질은 이론적 크기인 39.6 kDa과 유사한 40 kDa에서 단백질 밴드가 관찰되었고, SL335L 경쇄는 이론적 크기(23.3 kDa)와 유사한 26.3 kDa 위치에서 단백질 밴드가 관찰되었다. 열을 가한 non-reducing 조건에서 IL2 단백질에 존재하는 O-결합 글라이칸에 의한 단백질 크기 변화는 확인되지 않았다. 한편, 열은 가하지 않은 non-reducing 조건에서는 중쇄와 경쇄가 결합된 온전한 형태의 APB-R4에 해당하는 단백질 밴드가 이론적인 크기인 62.975 kDa보다 작은 56.7kDa 위치에서 높은 순도로 관찰되었으며, 결합되지 않은 각각의 중쇄와 경쇄에 해당하는 단백질 밴드가 매우 약하게 검출되었다.
Efavaleukin-alfa analogue의 경우에는 도3-B에 나타낸 바와 같이 reducing 조건과 5분간의 열을 가한 non-reducing 조건에서 Efavaleukin-alfa analogue 단백질은 이론적 크기인 41.1 kDa과 유사한 43.3 kDa에서 단백질 밴드가 관찰되었고, 열은 가하지 않은 non-reducing 조건에서는 중쇄와 경쇄가 결합된 온전한 형태의 Efavaleukin-alfa analogue에 해당하는 단백질 밴드가 이론적 크기인 82.196kDa보다 낮은 69.8 kDa 위치에서 높은 순도로 관찰되었으며, 결합되지 않은 Efavaleukin-alfa analogue monomer에 해당하는 단백질 밴드가 매우 약하게 검출되었다.
1-2. 순도 확인
상기 실시예 1-4와 비교예 1-4에서 정제된 SAFA-IL2m2 (APB-R4)와 Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 순도를 측정하기 위하여 SE-HPLC를 수행하였다. 먼저, TSKgel G3000SWXL 7.8Х300 ㎜ (Tosoh Bioscience, Japan) 컬럼과 Alliance HPLC system (Waters, Milford, MA) HPLC 장비를 100 mM KCl이 포함된 300 mM Potassium phosphate pH 7.0 버퍼로 평형화 시켰다. 분석 샘플은 300 mM Potassium phosphate pH 7.0, 100 mM KCl 버퍼로 희석하여 준비하였고, 50 ㎍의 샘플을 컬럼에 로딩 하였다. SE-HPLC 분석은 0.5 ㎖/min의 유속, 최대 압력 제한 1000 psi 조건에서 40분간 진행하였고 A280 ㎚ 파장에서 순도를 측정하였다.
도 4는 일 양상에 따른 SAFA-IL2m2 , Efavaleukin-alfa analogue 단백질의 순도를 SE-HPLC를 수행하여 분석한 결과이다. SAFA-IL2m2, Efavaleukin-alfa analogue 단백질 모두 99%이상의 순도가 확인 되었다.
실험예 2. SAFA-IL2m 단백질의 생물학적 활성 평가
2-1. SAFA-IL2m 단백질의 인간혈청알부민, 원숭이혈청알부민, 쥐혈청알부민 결합력 분석
상기 실시예 1-4에서 정제된 SAFA-IL2m2 단백질의 생물학적 기능을 평가하기 위하여, ELISA 방법을 이용하여 인간혈청알부민, 원숭이혈청알부민, 생쥐혈청알부민과의 결합력을 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 SAFA-IL2m2 는 혈청알부민에 대한 SAFA의 교차 반응성 능력을 방해하지 않는 것을 확인한 결과이다.
2-2. 세포 수준에서 IL-2 수용체 결합 정도 확인
상기 실시예 1-4에서 정제된 SAFA-IL2m2 단백질의 생물학적 기능을 평가하기 위하여, IL-2 수용체 알파, 베타, 감마를 모두 발현하는 HEK-Blue IL-2 리포터 세포주와 IL-2 수용체 베타, 감마를 발현하는 HEK-Blue IL-2 리포터 세포주를 사용하여 상기 단백질의 IL-2 수용체 의존적인 활성을 확인하였다. 먼저 상기 실시예 1의 단백질 시료를 0.2% 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)이 혼합된 PBS 버퍼에 희석하여 준비하였다. 이후, 세포를 2.777 x 105 cells/㎖를 준비한 뒤 희석된 단백질 시료를 분주하였다. 혼합된 세포와 단백질은 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 21시간 동안 반응시켰으며, 반응 후 단백질이 혼합된 세포의 상층액과 QUANTI-Blue 용액을 혼합한 후 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시킨 후 655 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6-A에 나타낸 바와 같이 IL-2 수용체 알파, 베타, 감마를 모두 발현하는 세포주에서 Efavaleukin-alfa analogue 대비 SAFA-IL2m2 의 활성이 낮은 결과 와 도 6-B에 나타낸 바와 같이 IL-2 수용체 베타, 감마를 발현하는 세포주에서 SAFA-IL2m2 가 활성을 나타내지 않는 결과를 통해 IL-2 변이체를 입증하였다.
2-3. SAFA-IL2m2
단백질의 IL-2 수용체 결합 정도 확인
도 7은 SAFA-IL2m2 단백질의 IL-2 수용체 알파와 베타에 대한 결합력을 분석하고자 ELISA 분석 방법을 이용하여 확인하였다.
그 결과, IL-2 알파 수용체에 대해 변이가 적은 SAFA-IL2m2 는 IL-2 야생형과 Efavaleukin-alfa analogue와 비교하였을 때 결합력이 감소되었으며, IL-2 베타 수용체에 대해 변이가 큰 SAFA-IL2m2 는 IL-2 야생형과 Efavaleukin-alfa analogue와 비교하였을 때 결합을 하지 않는 것을 확인하였다.
2-4. 조절 T 세포의 특이적 활성 검증
상기 실시예 1-4에서 정제된 SAFA-IL2m2 단백질은 중간 친화성을 가진 인터루킨-2 베타, 감마 복합체를 통해 인터루킨-2 신호전달 능력을 완전히 감소시키고 고 친화성을 가진 인터루킨-2 알파, 베타, 감마 복합체를 통한 인터루킨 -2 신호전달 능력을 감소시키는 특이성을 부여하는 것을 목표로 하였다. 이에 SAFA-IL2m2 단백질이 조절 T 세포 및 CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 STAT5 (signal transducer and activation of transcription 5) 인산화를 차별적으로 유도하는 능력에 대해 조사하였다. STAT5는 인터루킨-2가 인터루킨-2 수용체에 결합할 때 다운 스트림 신호전달 캐스케이드에 관여하는 것으로 알려져 있다.
간략하게, C57BL/6 마우스 (㈜오리엔트바이오)의 비장에서 분리한 세포를 이용하여 SAFA-IL2m2 를 농도별로 15분동안 처리하고, 고정 및 투과화하고, 세척하고, 항-CD45-BV510, 항-CD3-BV605, 항-CD4-PerCP/cy5.5, 항-CD8-BV786, 항-CD25-PE, 항-FOXP3-AF700, 항-NK1.1-AF488 및 항-PSTAT5-AF647 항체의 혼합물로 염색한 후, 유동 세포측정 분석은 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에 대해 각각 CD4+CD25+Foxp3+, CDF4+CD25+Foxp3-, CD3+CD8+, CD4-CD8- 그룹으로 게이팅 되었다. 데이터는 게이팅된 모집단에서 pSTAT5 양성 세포의 백분율로 표시되며 도 8에 예시된다. SAFA-IL2m2 단백질은 조절 T 세포에서만 특이적으로 STAT5의 인산화가 농도별로 증가됨을 입증되었다.
도 9는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 도 8과 같은 T 세포 집단에서 STAT5의 인산화를 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다.
간략하게, 3 x 106 인간 말초 혈액 단핵 세포를 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 2시간 반응시킨 후 100 ng/mL 항-CD3 항체를 처리한 후 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 2틀 반응시킨다. 이후, 인간 말초 혈액 세포를 2 x 106 조건으로 준비한 후 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 5일간 반응시킨다. 그 다음 0.5 x 106 인간 말초 혈액 단백 세포를 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 15분 동안 시험 화합물의 연속 희석액으로 처리하였다. 세포를 고정 및 투과화하고, 세척하고, 항-CD45-PE/Cy7, 항-CD3-BV605, 항-CD4-FITC, 항-CD8-PE, 항-CD25-BV421, 항-FOXP3-AF700, 항-CD49b-CD510 및 항-pSTAT5-AF547 항체의 혼합물로 염색한 후, 유동 세포측정 분석은 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에 대해 각각 CD4+CD25+Foxp3+, CDF4+CD25+Foxp3-, CD3+CD8+, CD4-CD8- 그룹으로 게이팅 되었다. 데이터는 게이팅된 모집단에서 pSTAT5 양성 세포의 백분율로 표시되며 도 7에 예시된다. 대조 물질인 Efavaleukin-alfa analogue는 조절 T 세포뿐만 아니라 CD4+ Tcomv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서도 STAT5의 인산화를 발현시키지만, SAFA-IL2m2 단백질은 조절 T 세포에서만 STAT5를 인산화 시키는 것을 입증하였다.
도 10은 인간 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 도 8과 같은 T 세포 집단에서 Ki67 증식 마커에 대한 변화를 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다.
간략하게, 3 x 106 인간 말초 혈액 단핵 세포를 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 2시간 반응시킨 후 100 ng/mL 항-CD3 항체를 처리한 후 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 2틀 반응시킨다. 이후, 인간 말초 혈액 세포를 2 x 106 조건으로 준비한 후 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 5일간 반응시킨다. 그 다음 0.5 x 106 인간 말초 혈액 단백 세포를 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 2틀 동안 시험 화합물의 연속 희석액으로 처리하였다. 세포를 고정 및 투과화하고, 세척하고, 항-CD45-PE/Cy7, 항-CD3-BV510, 항-CD4-FITC, 항-CD8-PerCP/Cy5.5, 항-CD25-APC, 항-FOXP3-eFluor450, 항-CD49b-BV510 및 항-ki67-PE 항체의 혼합물로 염색한 후, 유동 세포측정 분석은 조절 T 세포, CD4+ Tconv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에 대해 각각 CD4+CD25+Foxp3+, CDF4+CD25+Foxp3-, CD3+CD8+, CD4-CD8- 그룹으로 게이팅 되었다. 데이터는 게이팅된 모집단에서 Ki67 양성 세포의 백분율로 표시되며 도 10에 예시된다. 대조 물질인 Efavaleukin-alfa analogue는 조절 T 세포뿐만 아니라 CD4+ Tcomv 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포의 증식 및 확장을 자극 하지만, SAFA-IL2m2 단백질은 조절 T 세포만 강력하게 증식 및 확장하는 것을 관찰하였다.
도 11은 C57BL/6 마우스에서 단회 투여 시 비장, 서혜 림프절 및 장간막 림프절에서 세포를 분리하여 조절 T 세포 증식 변화를 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 각 조직에서 분리한 세포에서 조절 T 세포 대 CD4+ Tconv 세포 수의 비율, 조절 T 세포 대 CD8+ T 세포 수의 비율 그리고 조절 T 세포 대 NK 세포 수의 비율이 SAFA-IL2m2 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인 할 수 있다. 또한, Efavaleukin-alfa analogue 보다 SAFA-IL2m2 의 조절 T 세포 형성이 우수함을 확인할 수 있다.
2-5. SAFA-IL2m2 의 약효 검증
도 12는 영장류의 한 종류인 마모셋 원숭이를 이용하여 KLH (Keyhole limpet hemocyanin)를 면역 접종한 후, SAFA-IL2m2 를 투여하여 면역반응을 검증하였다. 면역 반응은 항-KLH IgG, 항-KLH-IgM ELISA 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, KLH만 투여된 그룹에서는 KLH 면역반응에 의하여 항-KLH-IgG와 항-KLH-IgM이 증가되었으며, SAFA-IL2m2 가 투여된 그룹에서는 변화가 없는 것을 확인 할 수 있다.
도 13은 DSS로 유도된 염증성 장질환 마우스 모델에서 SAFA-IL2m2 의 유효성을 검증하였다.
간략하게, 도 13-A에 나타낸 바와 같이, 대조물질 (Humira, Efavaleukin-alfa analogue) 및 SAFA-IL2m2 투여 시작 후 장 증상 발생 및 체중 변화를 기반으로 Disease activity index (DAI)를 정략적으로 평가하였다. 평가 결과, SAFA-IL2m2를 농도별로 투여하였을 때, 음성 대조군 (Vehicle)과 비교하였을 때 통계적으로 유희하게 감소됨을 확인하였으며, 양성 대조군 (Humira, Efavaleukin-alfa analogue)과 비교하였을 때에도 질병 활성도 점수가 낮은 경향을 확인하였다.
도 13-B에 나타낸 바와 같이, 실험 종료 후 마우스 대장조직을 적출하여 길이를 측정한 결과이다. 음성대조군에서는 정상군에 비해 대장 길이가 감소되었으며, SAFA-IL2m2 투여군에서는 농도별로 대장 길이가 유지되는 것으로 보아 대장 정체 길이가 치료에 의해 감소가 적었기 때문으로 해석된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (14)
- 인터루킨-2 변이 단백질 (Interleukin-2 mutein, IL-2m) 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편(Fab)을 포함하는 재조합 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 인터루킨-2 변이 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 2에 있어서, 인터루킨-2 변이 단백질은 서열번호 4에 대해 98% 초과의 서열 상동성을 갖는 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 인터루킨-2 변이 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 인터루킨-2 변이 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편은 링커에 의하여 연결된 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 5에 있어서, 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 중쇄 C 말단 영역과 인터루킨-2 변이 단백질이 링커에 의하여 연결된 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 5에 있어서, 상기 링커는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질은 인터루킨-2 변이 단백질, 링커 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 중쇄 영역을 포함하는 중쇄; 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 경쇄 영역을 포함하는 경쇄가 비공유결합에 의해 결합된 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 8에 있어서, 상기 인터루킨-2 변이 단백질, 링커 및 혈청 알부민에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 영역을 포함하는 중쇄는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 융합 단백질.
- 인터루킨-2 변이 단백질을 코딩하는 유전자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 청구항 1의 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 또는, 염증성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 면역 질환은 염증성 장질환 또는 자가면역 질환, 염증성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 면역 질환은 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematodes, SLE), 천식, 부종, 지연성 알레르기(IV형 알레르기), 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 사구체신염, 및 위장관 알레르기로 구성된 군에서 선택되는 것인 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. 염증성 신경 질환은 근위축성 측삭경화증 및 파킨슨병으로 구성된 군에서 선택되는 것인 염증성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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