KR20220011931A

KR20220011931A - IgE Fc 수용체를 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 개 알레르기성 질환 치료 용도

Info

Publication number: KR20220011931A
Application number: KR1020200090789A
Authority: KR
Inventors: 남수연; 장명호; 조영규; 오영민
Original assignee: (주)지아이이노베이션
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2022-02-03
Also published as: WO2022019652A1

Abstract

본원 발명은 반려견의 알레르기성 질환을 치료하기 위한 신규한 융합단백질에 관한 것으로, 구체적으로 인간 또는 개의 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD)을 포함하며, 개의 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합단백질 이량체를 제공한다. 본원 발명에 따른 융합단백질 이량체는 개의 IgE에 매우 강하게 결합하며, 개의 혈액 내 free IgE를 효과적으로 억제시킨다. 또한, 본원 발명에 따른 융합단백질 이량체는 IgE 만을 단일표적으로 하고, Fc gamma receptor에는 결합하지 않음으로 ADCC 및 CDC 기능이 결여되어 IgG1과 비만세포의 Fc gamma 수용체 III와의 결합에 의해 유발될 수 있는 아나필락시스 발생 등의 심각한 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질 이량체는 반려견의 알레르기성 질환에 대한 치료 또는 예방 용도의 의약품에 적용될 수 있다.

Description

IgE Fc 수용체를 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 개 알레르기성 질환 치료 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING IGE FC RECEPTOR AND USE FOR TREATING CANINE ALLERGIC DISEASES COMPRISING THE SAME}

본원 발명은 IgE Fc 수용체 및 개의 면역글로불린 Fc 영역을 포함한 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

개 아토피성 피부염(CAD)은 유전 요인과 환경 요인 간 상호작용에 의해 유발되는 염증성 및 소양성 알레르기 피부 질환이다. 전체 개의 약 10%에서 발병하며 개과 동물, 특히 반려견에서 벼룩 알레르기 다음으로 가장 널리 알려진 알레르기성 피부 질환이다. 알레르기 증상은 습진성 피부로서 발현되고, 아토피성 피부염을 가지는 반려견과 같은 개과 동물은 종종 소양증, 중증 가려움증, 탈모, 피부 표피박리, 잦은 발 핥기 등의 증상을 나타낸다. 뿐만 아니라, 피부 감염 및 과도한 피지 분비를 비롯한 여러가지 문제가 흔히 발생한다.

한편, 대부분의 알레르기 질환은 면역글로불린 E(IgE)의 과잉 면역반응에 의해 유발된다. IgE는 정상 상태에서는 혈청 중에 아주 낮은 농도로 존재하는 항체이다. IgE는 일반적으로 무해한 항원에 의해서 생성되기도 하며, 특별한 자극 없이도 IgE가 증가되는 경우가 있는데 이러한 경우에 알레르기 질환이 야기될 수 있다. 비정상적으로 증가된 IgE가 비만 세포(Mast cell)와 호염기성 과립구(basophils) 등의 표면에 발현되는 고친화성 IgE Fc 수용체(FcεRI)에 결합할 수 있다. 이러한 결합에 의해 비만 세포나 호염기성 과립구는 히스타민, 류코트리엔, 프로스타글란딘, 브라디키닌 및 혈소판-활성화 인자 등 화학 매개자를 방출하고, 그로 인해 알레르기 증상이 발생하게 된다. 특히, 알레르기 질환은 IgE 및 FcεRI 사이의 결합으로 증상이 악화될 수 있다.

현재 알레르기 질환을 치료하기 위하여 알레르겐 회피, 항알레르기 약물 투여, 체내 IgE 합성 조절, 항 IgE 항체 개발 등 여러가지 방법이 제안되었다. 그러나, 현재까지 알려진 치료 방법은 알레르기의 근본 원인을 치료할 수 없고, 약제의 효능이 불충분하거나, 심각한 부작용이 발생하는 등 많은 단점을 가지고 있다. 따라서, 반려견에 부작용 없이 알레르기 질환을 효율적으로 치료할 수 있는 치료제 개발에 대한 필요성이 증가하고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 안전하고 효과적인 반려견의 알레르기 질환 치료제를 개발하기 위해 연구하였다. 그 결과, 개의 면역글로불린 Fc 영역을 포함하고, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 단량체(FcεRIα-ECD) 두 개를 포함하는 융합단백질 이량체가 개의 IgE와의 결합능이 우수함을 발견하였다. 뿐만 아니라, 상기 융합단백질 이량체가 개의 혈액 내에서 free IgE를 효과적으로 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면은, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD)을 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 융합단백질 이량체로서, 상기 단량체는 개 유래의 면역글로불린 IgG4 유래의 Fc 영역을 포함하며 상기 Fc 영역과 FcεRIα-ECD는 힌지를 통해 결합된 것을 특징으로 하는 융합단백질 이량체를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 개 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 개에 투여하는 단계를 포함하는 개 알레르기성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본원 발명에 따른 융합단백질 이량체는 개의 IgE에 매우 강하게 결합하며, 개의 혈액 내 free IgE를 효과적으로 억제시킨다. 또한, 본원 발명에 따른 융합단백질 이량체는 IgE 만을 단일표적으로 하고, Fc gamma receptor에는 결합하지 않음으로 ADCC(antibody dependent Cellular Cytotoxicity) 및 CDC(Complement dependent Cytotoxicity) 기능이 결여되어 IgG1과 비만세포의 Fc gamma 수용체 III와의 결합에 의해 유발될 수 있는 아나필락시스 발생 등의 심각한 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서, 종래의 항 IgE 항체를 포함하는 치료제를 대체할 수 있는 새로운 약학적 조성물로 활용될 수 있다.

도 1은 human FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cA1)의 구조를 도식화한 것이다.
도 2는 human FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cA1)를 생산한 후에 이를 SDS-PAGE로 확인한 그림이다.
도 3은 human FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cA1)를 생산한 후에 이를 웨스턴 블랏으로 확인한 그림이다.
도 4는 human FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cA1)를 생산한 후에 이를 SEC-HPLC로 분석한 그림이다.
도 5는 Canine FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cB1)의 구조를 도식화한 것이다.
도 6은 Canine FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cB1)를 생산한 후에 이를 SDS-PAGE로 확인한 그림이다.
도 7은 Canine FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cB1)를 생산한 후에 이를 웨스턴 블랏으로 확인한 그림이다.
도 8은 Canine FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cB1)를 생산한 후에 이를 SEC-HPLC로 분석한 그림이다.
도 9는 대한민국 특허출원 제10-2019-0002029호에서 개시한 human FcεRIα- ECD 및 인간 유래의 변형된 Fc 영역을 포함한 융합단백질 이량체(GI-301)와 Canine IgE와의 결합력을 확인한 것이다.
도 10은 human FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cA1)와 Canine IgE와의 결합력을 확인한 것이다.
도 11은 Canine FcεRIα-ECD 및 Canine IgG4 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체(GI-301cB1)와 Canine IgE와의 결합력을 확인한 것이다.
도 12는 GI-301, GI-301cA1 및 GI-301cB1에 의한 개의 혈장 내 Free IgE 억제 정도를 확인한 결과이다.

본 발명의 일 측면은, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD)을 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 융합단백질 이량체를 제공한다. 이때, 상기 단량체는 개 유래의 면역글로불린 IgG4 유래의 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 Fc 영역과 FcεRIα-ECD는 힌지를 포함한 링커를 통해 결합된다.

본 명세서에서 사용한 용어, "IgE"는 면역글로불린 E로 알려진 항체 단백질을 의미한다. IgE는 비만세포나 혈중의 호염기구 등에 친화성을 가진다. 또한, IgE 항체와 그것에 대응하는 항원(알레르겐)이 반응하면 염증반응을 일으킨다. 또한, IgE는 비만세포 또는 호염기구가 갑자기 분비되어 나타나는 아나필락시스(anaphylaxis)를 일으키는 항체로 알려져 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "IgE Fc 수용체"란 Fcε수용체라고도 불리며, IgE의 Fc 부분과 결합한다. 상기 수용체는 2 종류가 존재한다. IgE Fc에 대해 고친화성인 수용체는 Fcε수용체I(FcεRI)이라고 하고, IgE Fc에 대해 저친화성인 수용체는 Fcε수용체II(FcεRII)라고 한다. FcεRI은 비만세포, 호염기구에서 발현된다. FcεRI에 결합한 IgE 항체가 다가 항원에 의해 가교되면, 비만세포 또는 호염기구에서 탈과립이 생겨 히스타민을 비롯한 여러 가지 화학 전달 물질을 방출한다. 이러한 방출에 의해 즉시형 알레르기 반응이 나타난다.

상기 FcεRI는 하나의 α사슬과 한 개의 β 사슬 및 2황화 결합한 2개의 γ사슬로 구성된 막단백질이다. 이 중 IgE가 결합하는 부분은 α사슬(FcεRIα)로서, FcεRIα는 60 kDa 정도의 크기를 가지며, 세포막 안에 존재하는 소수성 도메인과 세포막 외부에 존재하는 친수성 도메인으로 구성된다. 특히, α사슬의 세포외 도메인에 IgE가 결합하게 된다.

본 발명의 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD)을 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 융합단백질 이량체에서 상기 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛은 인간 또는 개에서 유래된 것일 수 있다. 인간 유래의 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 개 유래의 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인은 개의 IgE와 결합을 할 수 있는 한, 인간 또는 개의 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인의 단편 또는 변이체를 사용할 수 있다.

상기 변이체는 FcεRI의 α사슬의 기능을 변형시키지 않는 한, 야생형 FcεRIα-ECD(Extracellular domain)에서 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다. 또한, 서열번호 2의 human FcεRIα-ECD는 서열번호 7의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 서열번호 3의 canine FcεRIα-ECD는 서열번호 8의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용한 용어, "IgG4 유래의 Fc 영역"은 IgG 항체의 Fc 영역을 의미한다. 이때, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 구체적으로, 개의 IgG4 Fc 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 Fc 영역과 FcεRIα-ECD를 연결하는 힌지를 포함한 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

구체적인 단량체 서열은 다음 표 1 내지 표 4에 나타냈다.

구분	GI-301cA1 아미노산 서열	서열번호
mIgG signal	MEWSWVFLFFLSVTTGVHS	1
hFcεRIα ECD	VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLQ	2
NL028 hinge linker	GS GGGGS GGGGS GGGG SA ESKYGPPCPPCP	4
Canine IgG4Fc(Caninized F01)	APEAAGGPSVFIFPPKPKDQLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVLHEALHNHYTQESLSHSPGK	5

구분	GI-301cB1 아미노산 서열	서열번호
mIgG signal	MEWSWVFLFFLSVTTGVHS	1
FcεRIα ECD(Canine)	KPTVSMNPPWNTILKDDSVTLTCTGNNSLEVDSAVWLHNNTTLQETTSRLDINKAQIQDSGEYRCRENRSILSDPVYLTVFTEWLILQASANVVMEGESFLIRCHSWKNLRLTKVTYYKDGIPIRYWYENFNISISNVTTKNSGNYSCSGQIQQKGYTSKVLNIIVKKEPTKQNKYSGLQ	3
NL028 hinge linker	GS GGGGS GGGGS GGGG SA ESKYGPPCPPCP	4
Canine IgG4Fc(Caninized F01)	APEAAGGPSVFIFPPKPKDQLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVLHEALHNHYTQESLSHSPGK	5

구분	GI-301cA1 핵산 서열	서열번호
mIgG signal	ATGGAATGGTCCTGGGTGTTCCTGTTCTTCCTGTCCGTGACCACCGGCGTGCACTCT	6
hFcεRIα ECD	GTGCCTCAGAAACCCAAAGTGTCTCTGAACCCTCCTTGGAACCGGATCTTCAAGGGCGAGAACGTGACCCTGACCTGCAACGGCAACAACTTCTTCGAGGTGTCCTCCACCAAGTGGTTCCACAACGGCTCCCTGTCCGAGGAAACAAACTCCAGCCTGAACATCGTGAACGCCAAGTTCGAGGACTCCGGCGAGTACAAGTGCCAGCACCAGCAAGTGAACGAGTCCGAGCCTGTGTACCTGGAAGTGTTCTCCGACTGGCTGCTGCTCCAGGCTTCTGCCGAGGTTGTGATGGAAGGCCAGCCTCTGTTCCTGAGATGTCACGGCTGGCGGAACTGGGACGTGTACAAAGTGATCTACTACAAGGACGGCGAGGCCCTGAAGTATTGGTACGAGAACCACAACATCTCCATCACCAACGCCACCGTGGAAGATTCCGGCACCTACTACTGCACCGGCAAAGTGTGGCAGCTGGACTACGAGAGCGAGCCTCTGAACATCACCGTGATCAAGGCCCCTAGAGAGAAGTACTGGCTGCAA	7
NL028 hinge linker	GGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGATCTGCTGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCT	9
Canine IgG4Fc(Caninized F01)	GCTCCAGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCTAAGGACCAGCTGCTGATCGCTCGGACCCCTGAAGTGACATGCGTGGTGGTGGATCTGGACCCTGAAGATCCCGAGGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGGACGGCAAGCAGATGCAGACCGCTAAGACCCAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACGGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGCCTATCGGCCACCAGGATTGGCTGAAGGGCAAGCAGTTCACCTGTAAAGTGAACAACAAGGCTCTGCCCTCTCCAATCGAGCGGACCATCTCTAAGGCTAGAGGCCAGGCTCACCAGCCTAGCGTGTACGTTTTGCCTCCTAGCCGCGAGGAACTGTCCAAGAACACCGTGTCTCTGACCTGCCTGATCAAGGACTTCTTCCCTCCTGACATCGACGTGGAATGGCAGTCCAACGGCCAGCAAGAGCCCGAGTCCAAGTACAGAACCACACCTCCACAGCTGGACGAGGACGGCTCCTACTTCCTGTACTCCAAGCTGTCCGTGGACAAGTCTCGGTGGCAGAGAGGCGACACCTTCATCTGTGCTGTGCTGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAAGAGTCCCTGTCTCACTCCCCTGGCAAG	10

구분	GI-301cB1 핵산 서열	서열번호
mIgG signal	ATGGAATGGTCCTGGGTGTTCCTGTTCTTCCTGTCCGTGACCACCGGCGTGCACTCT	6
FcεRIα ECD(Canine)	AAGCCTACCGTGTCTATGAACCCTCCTTGGAACACCATCCTGAAGGACGACAGCGTGACCCTGACCTGCACCGGCAACAATTCCCTGGAAGTGGACTCTGCCGTGTGGCTGCACAACAACACCACACTGCAAGAGACAACCTCTCGGCTGGACATCAACAAGGCCCAGATCCAGGACTCTGGCGAGTACCGGTGCAGAGAGAACCGGTCCATCCTGAGCGATCCCGTGTACCTGACCGTGTTCACCGAGTGGCTGATCCTCCAGGCCTCTGCCAACGTTGTGATGGAAGGCGAGTCCTTCCTGATCCGGTGCCACTCCTGGAAGAACCTGCGGCTGACCAAAGTGACCTACTACAAGGACGGCATCCCCATCCGGTATTGGTACGAGAACTTCAACATCTCCATCTCCAACGTCACCACCAAGAACTCCGGCAACTACTCCTGCTCCGGACAGATCCAGCAGAAGGGCTACACCTCCAAGGTGCTGAACATCATCGTGAAGAAAGAGCCCACCAAGCAGAACAAGTACTCCGGCCTGCAA	8
NL028 hinge linker	GGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGATCTGCTGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCT	9
Canine IgG4Fc(Caninized F01)	GCTCCAGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCTAAGGACCAGCTGCTGATCGCTCGGACCCCTGAAGTGACATGCGTGGTGGTGGATCTGGACCCTGAAGATCCCGAGGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGGACGGCAAGCAGATGCAGACCGCTAAGACCCAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACGGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGCCTATCGGCCACCAGGATTGGCTGAAGGGCAAGCAGTTCACCTGTAAAGTGAACAACAAGGCTCTGCCCTCTCCAATCGAGCGGACCATCTCTAAGGCTAGAGGCCAGGCTCACCAGCCTAGCGTGTACGTTTTGCCTCCTAGCCGCGAGGAACTGTCCAAGAACACCGTGTCTCTGACCTGCCTGATCAAGGACTTCTTCCCTCCTGACATCGACGTGGAATGGCAGTCCAACGGCCAGCAAGAGCCCGAGTCCAAGTACAGAACCACACCTCCACAGCTGGACGAGGACGGCTCCTACTTCCTGTACTCCAAGCTGTCCGTGGACAAGTCTCGGTGGCAGAGAGGCGACACCTTCATCTGTGCTGTGCTGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAAGAGTCCCTGTCTCACTCCCCTGGCAAG	10

본 발명의 또 다른 측면은, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD) 및 개 유래의 면역글로불린 IgG4 유래의 Fc 영역을 포함하는 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 본원 발명의 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드이다. 본원 발명에서 유용한 신호서열은 항체 경쇄 신호서열, 예를 들면 항체 14.18(Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202), 항체 중쇄 신호서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호서열(Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683) 및 당업계에 알려진 다른 신호서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다. 일 실시예로 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 신호서열이 이용되었다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터를 제공한다.

본원 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주세포에 도입되어 숙주세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.

본원 발명에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.

본원 발명의 또 다른 측면으로, 상기 발현 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다. 본원 발명에서 사용된 용어 "숙주세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵세포 및 진핵세포를 나타낸다. 본원 발명에서 사용된 용어, "형질주입된", "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.

본원 발명의 또 다른 측면으로, 상술한 융합단백질 이량체를 포함하는 개 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 명세서에서, "알레르기성 질환"은 비만세포의 탈과립 등 비만세포의 활성화가 매개된 알레르기 반응으로 인하여 초래되는 병리적 증상을 의미하며, 이러한 알레르기 질환에는 식품 알레르기, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천식(asthma), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 알레르기성 피부염(allergic dermatitis), 알레르기성 접촉성 피부염(allergic contact dermatitis), 과민성(anaphylaxis), 두드러기, 소양증, 곤충 알레르기, 만성 특발성 두드러기(Chronic idiopathic urticarial) 및 약품 알레르기 등이 포함된다. 특히, 상기 알레르기 질환은 IgE 매개성일 수 있다.

본원 발명의 개 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에서 상기 융합단백질 이량체는 항알레르기 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항알레르기 효과를 유도할 수 있는 상기 융합단백질 이량체의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

이때, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학적 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 본원 발명의 약학적 조성물은 상기 융합단백질 이량체 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 상기 융합단백질 이량체의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본원 발명의 약학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화할 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

본원 발명의 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.

본원 발명의 또 다른 측면으로, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 알레르기성 증상의 개선 또는 완화용 사료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 융합단백질 이량체는 장내로 효율적인 전달을 위해 적절한 전달 수단과 결합될 수 있다. 또한, 본원 발명의 사료 조성물은 어떠한 형태의 사료로도 제조될 수 있다.

상기 사료 조성물에는 알레르기 증상의 개선 또는 완화 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 사료와 같이 여러 가지 생약 추출물, 사료에 허용가능한 사료보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 사료보조첨가제는 각 제형의 사료 조성물을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.

본원 발명의 또 다른 측면으로, 상기 융합단백질 이량체를 개에 투여하는 단계를 포함하는 개 알레르기성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 인간 FcεRIα-ECD와 변형된 개 Fc 영역을 포함하는 융합단백질의 제조: hFcεRIα ECD-cFc(GI-301cA1)

인간 FcεRIα-ECD(FcεRIα ECD; Extracellular domain) 및 변형된 개 Fc 영역을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1) 인간 FcεRI의 α사슬의 세포외 도메인(서열번호 2), 힌지 링커(서열번호 4) 및 변형된 개 Fc 영역(서열번호 5)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다.

그 후, 상기 발현 벡터를 ExpiCHO-S(ThermoFisher) 세포에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃ 125 RPM, CO₂ 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하였다. 상기 배양된 배양액을 Protein-A affinity column을 이용하여 정제한 후, 정제된 단백질을 SDS-PAGE, Western blot 및 크기-배제(Size-Exclusion) HPLC(SE-HPLC)를 수행하여 단백질의 순도를 확인하였다. 표 5에 나타난 바와 같이, SE-HPLC 방법으로 정제된 단백질의 순도는 80% 이상인 것을 확인하였다.

hFcεRIα ECD-cFc 융합단백질의 100 mL 단기생산성은 BSA를 기준으로 Bradford assay를 통하여 확인한 결과, 5.67 mg로 나타났다.

Expression Vector	Media	Culture Scale	Productivity (Bradford with BSA)	Purity (SEC-HPLC)
pcDNA3.4	ExpiCHO^TM Expression Medium	100 mL	5.67 mg	84.78%

또한, SDS-PAGE 및 Western blot 분석결과, 환원 조건 및 비환원 조건에서 각각 약 66 kDa, 116 kDa 근처 크기의 단백질이 검출되는 것으로 확인되었으며(도 2, Lane 1 내지 2), 이를 통해 cFc와 결합된 hFcεRIα ECD가 이량체를 형성하고 있음을 알 수 있었다.

제조예 2. 개 FcεRIα-ECD와 변형된 개 Fc 영역을 포함하는 융합단백질의 제조: cFcεRIα ECD-cFc(GI-301cB1)

개 FcεRIα-ECD 및 변형된 개 Fc 영역을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여 시그널 펩타이드(서열번호 1), 개 FcεRI의 α사슬의 세포외 도메인(서열번호 3), 힌지 링커(서열번호 4) 및 변형된 개 Fc 영역(서열번호 5)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다.

그 후, 상기 발현 벡터를 ExpiCHO-S(ThermoFisher) 세포에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃ 125 RPM, CO₂ 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하였다. 상기 배양된 배양액을 Protein-A affinity column을 이용하여 정제한 후, 정제된 단백질을 SDS-PAGE, Western blot 및 크기-배제(Size-Exclusion) HPLC(SE-HPLC)를 수행하여 단백질의 순도를 확인하였다. 표 6에 나타난 바와 같이, SE-HPLC 방법으로 정제된 단백질의 순도는 95% 이상인 것을 확인하였다.

cFcεRIα ECD-cFc 융합단백질의 100 mL 단기생산성은 BSA를 기준으로 Bradford assay를 통하여 확인한 결과, 10.35 mg로 나타났다.

Expression Vector	Media	Culture Scale	Productivity (Bradford with BSA)	Purity (SEC-HPLC)
pcDNA3.4	ExpiCHO^TM Expression Medium	100 mL	10.35 mg	95.09%

또한, SDS-PAGE 및 Western blot 분석결과, 환원 조건 및 비환원 조건에서 각각 약 66 kDa, 116 kDa 근처 크기의 단백질이 검출되는 것으로 확인되었으며(도 6, Lane 1 내지 2), 이를 통해 cFc와 결합된 cFcεRIα ECD가 이량체를 형성하고 있음을 알 수 있었다.

실험예 1. hFcεRIα ECD-cFc 및 cFcεRIα ECD-cFc의 개 IgE 결합능 확인

제조예 1 및 제조예 2의 방법을 통해 정제된 단백질에 대하여 개 IgE(Bethyl Laboratories) 결합능을 측정하였다. 개 IgE 결합능은 Octet RED 384 (ForteBio, octet 384 Red)을 통하여 실험을 진행하였다. AR2G(Amine Reactive 2^nd generation) biosensors를 10분간 1X kinetic buffer에 침지시켜 사용하였다. hFcεRIα ECD-hFc, hFcεRIα ECD-cFc 및 cFcεRIα ECD-cFc 단백질을 10 mM acetate pH 5.0 buffer를 이용하여 10 μg/mL로 만들어 biosensor에 코팅하고, 개 IgE를 1.6 nM 내지 100 nM로 희석시켜 각각의 농도에서 결합능을 확인하였다. hFcεRIα ECD-hFc, hFcεRIα ECD-cFc 및 cFcεRIα ECD-cFc와 개 IgE의 결합력은 도 9, 도 10, 도 11 및 표 7에 나타냈다.

구분	K _on (1/Ms)	K _dis (1/S)	Binding affinity
hFcεRIα ECD-hFc(GI-301)	2.10E+05	1.49E-04	0.7 nM
hFcεRIα ECD-cFc(GI-301cA1)	2.29E+05	1.65E-04	0.7 nM
cFcεRIα ECD-cFc(GI-301cB1)	6.82E+04	7.12E-04	10.5 nM

실험예 2. Caninized GI-301 free IgE 억제능 확인

hFcεRIα ECD-hFc, hFcεRIα ECD-cFc 및 cFcεRIα ECD-cFc의 free IgE 억제능을 측정하기 위하여 6.1-24.7 μg/mL free IgE가 포함된 개 혈청을 다양한 농도(0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 μg/mL)의 시험물질과 반응시키고 ELISA를 통해 free IgE의 양을 측정하였다.

1X PBS에 GI-301을 1 μg/mL의 농도로 immunoplate(Nunc)에 well당 100 μL 첨가하고 4℃ 조건에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 immunoplate는 1X PBST를 이용하여 well당 300 μL씩 5번 세척하고 Blocking solution인 I-Block를 well당 200 μL 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. Blocking 도중 standard 와 분석용 샘플을 준비하였다. Standard는 개 IgE 단백질을 200-3.13 ng/mL의 농도로 1% BSA/PBS에 희석하였다.

분석용 샘플은 free IgE를 포함하고 있는 개 혈청에 다양한 농도의 시험물질을 첨가하여 37℃ 조건에서 1시간 동안 반응시켜 준비하였다. Blocking이 끝난 plate를 1X PBST를 이용하여 well당 300 μL씩 5번 세척하고 준비된 standard와 분석용 샘플을 well당 100 μL 첨가 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 1X PBST를 이용하여 well당 300 μL씩 5번 세척하고 1:10,000으로 희석된 goat anti-canine IgE secondary antibody-HRP를 well당 100 μL씩 첨가하고 상온에서 1시간 반응시켰다.

반응이 끝난 plate는 1X PBST를 이용하여 well당 300 μL씩 5번 세척하고 TMB solution을 well당 100 μL씩 넣고 반응시켰다. Microplate reader를 이용하여 650 nm 파장에서 흡광도값이 0.8 내지 1.0 범위에서 측정되면 stop solution을 well 당 100 μL씩 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응이 종결된 plate는 5분 이내에 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 수치를 분석하였다.

실험 결과는 도 12에 나타냈다. 도 12에 표시한 바와 같이, 인간 FcεRIα ECD를 포함하는 융합단백질인 hFcεRIα ECD-hFc 및 hFcεRIα ECD-cFc가 free IgE 억제에 있어서 cFcεRIα ECD-cFc 보다 우수한 효능을 갖는 것으로 나타났다.

<110> GI Innovation, Inc. <120> FUSION PROTEIN COMPRISING IGE FC RECEPTOR AND USE FOR TREATING CANINE ALLERGIC DISEASES COMPRISING THE SAME <130> SPD20-091GII <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIgG signal <400> 1 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 2 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human FceR1a ECD <400> 2 Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile 1 5 10 15 Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe 20 25 30 Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu 35 40 45 Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val 85 90 95 Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn 100 105 110 Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys 115 120 125 Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu 130 135 140 Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys 165 170 175 Tyr Trp Leu Gln 180 <210> 3 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> canine FceR1a ECD <400> 3 Lys Pro Thr Val Ser Met Asn Pro Pro Trp Asn Thr Ile Leu Lys Asp 1 5 10 15 Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asn Asn Ser Leu Glu Val Asp 20 25 30 Ser Ala Val Trp Leu His Asn Asn Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Ser 35 40 45 Arg Leu Asp Ile Asn Lys Ala Gln Ile Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg 50 55 60 Cys Arg Glu Asn Arg Ser Ile Leu Ser Asp Pro Val Tyr Leu Thr Val 65 70 75 80 Phe Thr Glu Trp Leu Ile Leu Gln Ala Ser Ala Asn Val Val Met Glu 85 90 95 Gly Glu Ser Phe Leu Ile Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Leu Arg Leu 100 105 110 Thr Lys Val Thr Tyr Tyr Lys Asp Gly Ile Pro Ile Arg Tyr Trp Tyr 115 120 125 Glu Asn Phe Asn Ile Ser Ile Ser Asn Val Thr Thr Lys Asn Ser Gly 130 135 140 Asn Tyr Ser Cys Ser Gly Gln Ile Gln Gln Lys Gly Tyr Thr Ser Lys 145 150 155 160 Val Leu Asn Ile Ile Val Lys Lys Glu Pro Thr Lys Gln Asn Lys Tyr 165 170 175 Ser Gly Leu Gln 180 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 4 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 5 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine IgG4Fc <400> 5 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Gln Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe 35 40 45 Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln 100 105 110 Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu 115 120 125 Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro 130 135 140 Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu 145 150 155 160 Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr 165 170 175 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly 180 185 190 Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 195 200 205 Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 6 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIgG signal <400> 6 atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtccgtga ccaccggcgt gcactct 57 <210> 7 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human FceR1a ECD <400> 7 gtgcctcaga aacccaaagt gtctctgaac cctccttgga accggatctt caagggcgag 60 aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgtcctccac caagtggttc 120 cacaacggct ccctgtccga ggaaacaaac tccagcctga acatcgtgaa cgccaagttc 180 gaggactccg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaagtga acgagtccga gcctgtgtac 240 ctggaagtgt tctccgactg gctgctgctc caggcttctg ccgaggttgt gatggaaggc 300 cagcctctgt tcctgagatg tcacggctgg cggaactggg acgtgtacaa agtgatctac 360 tacaaggacg gcgaggccct gaagtattgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac 420 gccaccgtgg aagattccgg cacctactac tgcaccggca aagtgtggca gctggactac 480 gagagcgagc ctctgaacat caccgtgatc aaggccccta gagagaagta ctggctgcaa 540 540 <210> 8 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> canine FceR1a ECD <400> 8 aagcctaccg tgtctatgaa ccctccttgg aacaccatcc tgaaggacga cagcgtgacc 60 ctgacctgca ccggcaacaa ttccctggaa gtggactctg ccgtgtggct gcacaacaac 120 accacactgc aagagacaac ctctcggctg gacatcaaca aggcccagat ccaggactct 180 ggcgagtacc ggtgcagaga gaaccggtcc atcctgagcg atcccgtgta cctgaccgtg 240 ttcaccgagt ggctgatcct ccaggcctct gccaacgttg tgatggaagg cgagtccttc 300 ctgatccggt gccactcctg gaagaacctg cggctgacca aagtgaccta ctacaaggac 360 ggcatcccca tccggtattg gtacgagaac ttcaacatct ccatctccaa cgtcaccacc 420 aagaactccg gcaactactc ctgctccgga cagatccagc agaagggcta cacctccaag 480 gtgctgaaca tcatcgtgaa gaaagagccc accaagcaga acaagtactc cggcctgcaa 540 540 <210> 9 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 9 ggatctggcg gaggtggaag cggaggcgga ggttctggtg gcggaggatc tgctgagtct 60 aagtacggcc ctccttgtcc tccatgtcct 90 <210> 10 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine IgG4Fc <400> 10 gctccagaag ctgctggcgg cccttccgtg ttcatcttcc cacctaagcc taaggaccag 60 ctgctgatcg ctcggacccc tgaagtgaca tgcgtggtgg tggatctgga ccctgaagat 120 cccgaggtgc agatcagttg gttcgtggac ggcaagcaga tgcagaccgc taagacccag 180 cctagagagg aacagttcaa cggcacctac agagtggtgt ccgtgctgcc tatcggccac 240 caggattggc tgaagggcaa gcagttcacc tgtaaagtga acaacaaggc tctgccctct 300 ccaatcgagc ggaccatctc taaggctaga ggccaggctc accagcctag cgtgtacgtt 360 ttgcctccta gccgcgagga actgtccaag aacaccgtgt ctctgacctg cctgatcaag 420 gacttcttcc ctcctgacat cgacgtggaa tggcagtcca acggccagca agagcccgag 480 tccaagtaca gaaccacacc tccacagctg gacgaggacg gctcctactt cctgtactcc 540 aagctgtccg tggacaagtc tcggtggcag agaggcgaca ccttcatctg tgctgtgctg 600 cacgaggccc tgcacaacca ctacacccaa gagtccctgt ctcactcccc tggcaag 657

Claims

IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD)을 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 융합단백질 이량체로서,
상기 단량체는 개 유래의 면역글로불린 IgG4 유래의 Fc 영역을 포함하며,
상기 Fc 영역과 FcεRIα-ECD는 힌지를 통해 결합된 것인, 융합단백질 이량체.
제1항에 있어서,
상기 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛은 인간 또는 개에서 유래된 것인, 융합단백질 이량체.
제2항에 있어서,
상기 인간 유래의 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인, 융합단백질 이량체.
제2항에 있어서,
상기 개 유래의 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것인, 융합단백질 이량체.
제1항에 있어서,
상기 개 유래의 면역글로불린 IgG4 유래의 Fc 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것인, 융합단백질 이량체.
제1항에 있어서,
상기 힌지는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것인, 융합단백질 이량체.
IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD) 및 개 유래의 면역글로불린 IgG4 유래의 Fc 영역을 포함하는 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항의 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터.
제8항의 발현 벡터가 도입된 숙주세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 이량체를 포함하는 개 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 알레르기성 질환은 식품 알레르기, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천식(asthma), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 알레르기성 피부염(allergic dermatitis), 만성 특발성 두드러기(Chronic idiopathic urticarial) 및 알레르기성 접촉성 피부염(allergic contact dermatitis)으로 구성된 군에서 선택된 하나인 것인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 이량체를 포함하는 알레르기성 증상의 개선 또는 완화용 사료조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 이량체를 개에 투여하는 단계를 포함하는 개 알레르기성 질환의 치료 또는 예방 방법.