JP2023511963A

JP2023511963A - 多重特異性抗体、それを含む組成物、およびベクター、ならびにそれらの使用

Info

Publication number: JP2023511963A
Application number: JP2022545037A
Authority: JP
Inventors: サンフンチャ
Original assignee: エイプリルバイオカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-01-24
Filing date: 2021-01-23
Publication date: 2023-03-23
Also published as: IL294917A; EP4093764A1; ECSP22065625A; EP4093764A4; WO2021149015A1; AU2021211241A1; MX2022009150A; CL2022001993A1; CR20220415A; KR20210095781A; US20230073034A1; KR20220154097A; US20210230285A1; JOP20220171A1; CN116113642A; DOP2022000150A; US20230220093A1; CO2022011885A2; CA3165029A1; US11773176B2

Abstract

本開示は、増加したインビボ持続可能性を有する多重特異性抗体を提供し、該多重特異性抗体は、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合断片FabのN末端およびC末端の一方または両方に連結された1つまたは複数の生物活性エフェクター部分を含む。TIFF2023511963000159.tif51170

Description

関連出願の相互参照
本願は、2020年1月24日出願の韓国特許出願第10-2020-0009565号、および2020年5月19日出願の米国特許出願第16/878,255号の優先権を主張するものであり、それぞれの開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる。

配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。該ASCII複製は、2662-0001WO01_Sequence Listing_ST25.txtとして2021年1月19日に作成され、サイズは68 KBである。

分野
本開示は、抗原結合断片および生物活性エフェクター部分を含む、融合構築物に関する。より具体的には、本開示は、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合断片のN末端およびC末端の一方または両方に連結された2つ以上の生物活性エフェクター部分を含む、多重特異性抗体に関する。

背景
CD40-CD40L相互作用は、抗原特異性抗体免疫応答の発生に本質的に作用し、自己抗体は様々な自己免疫疾患の発病を伴う。これらの疾患を有効に治療するために、CD40-CD40L相互作用を阻害および／または抑制することができる様々なCD40L特異性またはCD40特異性抗体が研究されている。例えば全身性エリテマトーデス（SLE）および特発性血小板減少性紫斑病（ITP）を含め、様々な自己免疫疾患の治療のために、例えば抗CD40Lモノクローナル抗体、hu5c8 IgG1（BG-9588、ルプリズマブ、Antova（商標）、Biogen、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、およびIDEC-131（E6040、IDEC Pharmaceuticals、カリフォルニア州サンディエゴ）が研究されたが、そのような抗体のさらなる開発は、血栓塞栓症などの副作用の発生により中断している。このため血栓塞栓の副作用の問題に取り組むアプローチが、多くの研究グループによりFc工学を通じて試みられており、例えば、PEG化抗CD40L Fab、CDP7657（ダピロリズマブペゴル、Biogen）、およびCD40Lに連結するよう設計されたTN3-HSA融合タンパク質VIB4920（VIELABIO、メリーランド州ゲイザースバーグ）を含め、いくつかの報告が寄せられている。これと関係して、他の研究グループは、CD40LではなくCD40を標的とする治療剤として、弱化したFc機能をもつBI655064抗体（Boehringer Ingelheim、独国）、ヒトIgG4型のブレセルマブ（bleselumab）抗体（Kyowa Kirin Pharmaceutical Development、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）等を開発している。

概要
本開示は、長期のインビボ保持時間を有する多重特異性抗体を提供する。本開示は、該多重特異性抗体を含む薬学的組成物も提供する。本開示は、該多重特異性抗体を生産する方法も提供する。

例えば、本明細書では、CD40-CD40Lシグナルを抑制しながら、抗CD40L抗体のFcベースの血栓塞栓の副作用を除去する、新規な自己免疫疾患治療剤が開示される。これを達成するために、CD40Lに結合するルプリズマブ抗体hu5c8の可変領域遺伝子V_HおよびV_Lからなる一本鎖可変断片（scFv）を、SL335 FabのN末端に連結することにより、Fc領域なしで血清持続可能性を維持することができる、（抗CD40L scFv）₂-（抗HSA Fab）-（抗TNF-α Fv）で表される組換え二重特異性抗体が開発された。さらに、本明細書では、TNF-αに結合するセルトリズマブペゴル抗体の可変領域遺伝子を含むFvまたはdsFvを、二重特異性抗体のSL335 FabのC末端に、ペプチドリンカーを用いて連結することにより、（抗CD40L scFv）₂-（抗HSA Fab）-（抗TNF-α Fv）で表される多重特異性抗体、ならびに生産された抗体タンパク質の、特定された機能および特徴が、開示される。

本明細書では、構造式

を含む多重特異性抗体であって、
式中、抗原結合断片（Fab）は、血清アルブミンFabであり;
R¹およびR²は、FabのN末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれがFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
R³およびR⁴は、FabのC末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれがFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
mは、0、または1以上の整数であり;
nは、0、または1以上の整数である、
多重特異性抗体が提供される。いくつかの態様では、R¹およびR²は、同じまたは異なる一本鎖可変断片（scFv）である。いくつかの態様では、R³およびR⁴は、同じまたは異なるFv断片またはジスルフィド安定化Fv（dsFv）断片である。

いくつかの態様では、R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、1つまたは複数のリンカーによりFabに連結され得る。各リンカーは、1～20のアミノ酸を含み得る。各リンカーは、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。各リンカーは、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの態様では、Fabは、
（a）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（b）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（c）アミノ酸配列NYGIH（SEQ ID NO:65）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（d）アミノ酸配列SYAMS（SEQ ID NO:68）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（e）アミノ酸配列AYWIA（SEQ ID NO:71）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列LYSGSYSP（SEQ ID NO:73）を含む重鎖CDR3;または
（f）アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、Fabは、
（g）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASRLES（SEQ ID NO:78）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QQSDSVPVT（SEQ ID NO:79）を含む軽鎖CDR3;
（h）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列AASSLQS（SEQ ID NO:81）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（i）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列DASNRAT（SEQ ID NO:84）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（j）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QQYGSSPRT（SEQ ID NO:88）を含む軽鎖CDR3;
（k）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QKYSSYPLT（SEQ ID NO:90）を含む軽鎖CDR3;または
（l）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、Fabは、
アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3、ならびに
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含む。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ含む。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン（V_H-C_H1ドメイン）、およびSEQ ID NO:46のアミノ酸配列を含む軽鎖ドメイン（V_L-C_Lドメイン）を含む。

いくつかの態様では、R¹およびR²はそれぞれ、抗CD40L hu5c8 scFvである。R¹およびR²はそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvであり得る。R¹およびR²はそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48のアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvであり得る。

いくつかの態様では、R³およびR⁴はそれぞれ、抗TNF-α Fv、抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、抗IL-23 Fv、抗IL-23 dsFv、抗IFNAR1、および／または抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分である。R³およびR⁴はそれぞれ、SEQ ID NO:49と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:50と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:52と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-α ジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:54と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:56と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:58と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1、ならびに／またはSEQ ID NO:59と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:60と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分であり得る。R³およびR⁴はそれぞれ、SEQ ID NO:49の重鎖およびSEQ ID NO:50の軽鎖を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51の重鎖およびSEQ ID NO:52の軽鎖を含む抗TNF-α ジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53の重鎖およびSEQ ID NO:54の軽鎖を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55の重鎖およびSEQ ID NO:56の軽鎖を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57の重鎖およびSEQ ID NO:58の軽鎖を含む抗IFNAR1、ならびに／またはSEQ ID NO:59の重鎖およびSEQ ID NO:60の軽鎖を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分であり得る。

本明細書では、本明細書に開示される多重特異性抗体および賦形剤を含む組成物が開示される。本明細書では、本明細書に開示される多重特異性抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物も開示される。

本明細書では、その必要のある対象において自己免疫疾患を治療する方法も開示され、該方法は、本明細書に開示される薬学的組成物を該対象に投与する段階を含む。

本明細書ではさらに、
（a）プロモーター、
（b）血清アルブミンに結合する抗原結合断片（Fab）をコードする、第1の核酸分子、および
（c）生物活性エフェクター部分およびリンカーをコードする、第2の核酸分子
を含む、発現ベクターがさらに開示され、
該プロモーター、該第1の核酸配列、および該第2の核酸分子は、機能的に連結されている。該第2の核酸分子は、2つ以上の生物活性エフェクター部分およびリンカーをコードし得る。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、
（a）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（b）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（c）アミノ酸配列NYGIH（SEQ ID NO:65）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（d）アミノ酸配列SYAMS（SEQ ID NO:68）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（e）アミノ酸配列AYWIA（SEQ ID NO:71）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列LYSGSYSP（SEQ ID NO:73）を含む重鎖CDR3;または
（f）アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列ETVMAGKALDY（SEQ ID NO:76）を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、
（g）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASRLES（SEQ ID NO:78）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QQSDSVPVT（SEQ ID NO:79）を含む軽鎖CDR3;
（h）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列AASSLQS（SEQ ID NO:81）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（i）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列DASNRAT（SEQ ID NO:84）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（j）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QQYGSSPRT（SEQ ID NO:88）を含む軽鎖CDR3;
（k）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QKYSSYPLT（SEQ ID NO:90）を含む軽鎖CDR3;または
（l）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、
アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3、ならびに
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含むFabをコードする核酸配列を含む。

他の態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ含むFabをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン（V_H-C_H1ドメイン）、およびSEQ ID NO:46のアミノ酸配列を含む軽鎖ドメイン（V_L-C_Lドメイン）を含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、生物活性エフェクター部分は、抗TNF-α Fv、抗TNF-α dsFv、抗IL-23 Fv、抗IL-23 dsFv、抗IFNAR1 Fv、および／または抗IFNAR1 dsFvである。第2の核酸分子は、SEQ ID NO:49～60のうちの1つまたは複数のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。

本開示は、動物細胞などの、発現ベクター含む宿主細胞、例えばCHO細胞株を提供する。

本開示の特定の態様の上述した、および他の局面、特徴、および利点は、添付の図面と併せて、以下の記載からより明白になろう。

図1Aおよび図1Bは、APB-A1のベクターマップおよびアミノ酸配列を示す。図1Aの説明を参照のこと。図2Aおよび図2Bは、APB-A1のHPLC分析およびSDS-PAGEの結果を示す。図2Aの説明を参照のこと。図3は、APB-A1の質量分析の結果を示す。図4Aおよび図4Bは、APB-A1のPI値を示す。図4Aの説明を参照のこと。図5は、APB-A1の電荷量の変化を示す。図6は、rhCD40L-APB-A1-HSAの同時結合を示す。図7は、フローサイトメトリー分析の結果を示す。図8A～8Dは、APB-A1のインビトロ分析の結果を示す。図8Aの説明を参照のこと。図8Aの説明を参照のこと。図8Aの説明を参照のこと。図9A～9Dは、様々なICが血小板凝集に及ぼす効果を示す。図9Aの説明を参照のこと。図9Aの説明を参照のこと。図9Aの説明を参照のこと。図10は、様々なICがセロトニンレベルに及ぼす効果を示す。図11は、カニクイザルを用いて測定されたAPB-A1濃度のPK値を示す。図12Aおよび図12Bは、カニクイザルを用いた薬物動態分析の結果を示す。図12Aの説明を参照のこと。図13A～13Cは、SAFAベースの二重特異性抗体および哺乳動物発現ベクターを示す。図13Aの説明を参照のこと。図13Aの説明を参照のこと。図14は、APB-B1重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。図15A～15Dは、CaptureSelect IgG-C_H1アフィニティークロマトグラフィーにより精製された二重特異性抗体構築物を示す。図15Aの説明を参照のこと。図15Aの説明を参照のこと。図15Aの説明を参照のこと。図16Aおよび図16Bは、2工程のクロマトグラフィーにより精製されたAPB-B1構築物を示す。図16Aの説明を参照のこと。図17は、様々なpHおよびバッファー条件での熱安定性シフトアッセイを示す。図18A～18Cは、ELISAにより決定された、親抗体と比較しての、APB-B1構築物の3つの異なる抗原との結合特異性の決定結果を示す。図18Aの説明を参照のこと。図18Aの説明を参照のこと。図19は、バイオレイヤー干渉法により分析された、APB-B1aの、3つの異なる抗原との同時結合の結果を示す。図20は、フローサイトメトリーにより特定された、SAFAベースの構築物の、D1.1細胞の細胞膜との結合を示す。図21は、L929マウス細胞において特定された、SAFAベースの二重特異性抗体による、TNF-α媒介細胞傷害性の阻害を示す。図22A～22Cは、HEK-blue（商標）レポーター細胞において特定された、CD40L-CD40相互作用およびTNFα-TNFαR相互作用の一方または両方を阻害するAPB-B1の能力の決定を示す。図22Aの説明を参照のこと。図22Aの説明を参照のこと。サルPKデータ。血漿中APB-A1濃度をPK ELISAを用いて測定した。データは、実施した実験の平均を示す。図24Aおよび図24B：免疫表現型検査（分裂B細胞）。末梢血の免疫表現型検査で、対照群と比較して減少した分裂B細胞が、30、10、および／または3 mg/kg群に1日目（図24A）および11日目（図24B）に見られた。血清中抗KLH IgGの力価。抗KLH抗体の測定で、対照群と比較して減少したIgG抗体力価が、10および30 mg/kg群に8～29日目に見られた（* P<0.05、** P<0.01: 対照との有意差あり）。腋窩リンパ節のKi67陽性細胞（免疫組織化学検査）。病理組織学および免疫組織化学の検査で、29日目に、腋窩リンパ節の胚中心の抗Ki67陽性細胞の減少が、10および／または30 mg/kg群で観測された。 PD試験の血清中APB-A1濃度。PKでは、3～30 mg/kg群で、第1および第2の投与で、CmaxおよびAUC0-tの値がほぼ用量比例的に増加した。

詳細な説明
次に諸態様を詳しく参照していくが、それらの例は添付の図面に例示されており、図面全体を通して類似の符号は類似の要素を指している。この点において、諸態様は種々の形態を有し得、本明細書に示される記載には制限されないと解釈すべきである。したがって、以下に記載の諸態様は、図面を参照しながら本明細書の諸局面を説明するためだけに記載されている。本明細書で使用する場合、「および／または」という用語は、関連の列挙項目の1つまたは複数のいずれか、およびそのあらゆる組み合わせを含む。「（～の）少なくとも1つ」などの表現は、要素のリストに係る場合、リストの要素の全体を修飾し、リストの個々の要素を修飾するのではない。

本明細書では、構造式

を含む多重特異性抗体であって、
式中、抗原結合断片（Fab）は、血清アルブミンFabであり;
R¹およびR²は、FabのN末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれがFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
R³およびR⁴は、FabのC末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれがFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
mは、0、または1以上の整数であり;
nは、0、または1以上の整数である、
多重特異性抗体が提供される。

そのような抗体をコードする、相補的DNA（cDNA）などの単離核酸（ポリヌクレオチド）も提供される。さらに、そのような抗体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む、ベクター（例えば発現ベクター）および細胞（例えば宿主細胞）が提供される。そのような抗体を作る方法も提供される。他の局面では、本明細書では、多重特異的活性を誘導し、増加させ、または強化する、かつ自己免疫疾患などの特定の病態を治療するための方法および使用が提供される。関連の組成物（例えば薬学的組成物）、キット、および検出方法も提供される。

術語
本明細書で使用する場合、「約」および「およそ」という用語は、数値または数の範囲を修飾するのに用いられる場合、その値または範囲の上5%～10%およびその下5%～10%の偏差が、記載の値または範囲の所期の意味内であることを示す。

本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、技術用語であって、本明細書では交換可能に用いられ得、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を指す。

抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、組換え生産された抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、表面改変（resurfaced）抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、2つの重鎖と2つの軽鎖分子とを含むテトラマー抗体、抗体軽鎖モノマー、抗体重鎖モノマー、抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー、抗体軽鎖・抗体重鎖ペア、細胞内抗体、ヘテロ複合抗体、シングルドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体または一本鎖Fv（scFv）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Fab断片、F（ab’）₂断片、ジスルフィド連結Fv（sdFv）、抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば抗抗Id抗体など）、二重特異性抗体、および多重特異性抗体を挙げることができる。

本明細書で使用する場合、「多重特異性抗体」という用語は、技術用語であって、2つ以上の生物活性エフェクター部分または抗原結合部位を有する分子を指すのに用いられ得、各抗原結合部位が特異的に抗原に結合する。本明細書に開示される多重特異性抗体は、それに連結された2、3、4、5、6、7、8、またはそれ以上の生物活性エフェクター部分を有し得る。

抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY）、任意のクラス（例えば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、もしくはIgA₂）、または任意のサブクラス（例えば、IgG_2aもしくはIgG_2b）であり得る。特定の態様では、本明細書に記載される抗体は、IgG抗体、またはそのクラス（例えば、ヒトIgG₁、IgG₂、もしくはIgG₄）もしくはサブクラスである。いくつかの態様では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。他の態様では、抗体はヒトモノクローナル抗体であり、それは例えば免疫グロブリンである。

本明細書で使用する場合、「バイオエフェクター部分」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」という用語、および類似の用語は、多重特異性抗体分子の部分であって、抗体分子上で抗原に対するその特異性を付与するアミノ酸残基（例えば、相補性決定領域（CDR））を含む、部分を指す。抗原結合領域は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）およびヒトなどの任意の動物種に由来し得る。

本明細書で使用する場合、「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、交換可能に用いられ、当技術分野では一般的である。可変領域は、典型的には、抗体の一部分、一般には軽鎖または重鎖の一部分、典型的には成熟重鎖のアミノ末端の約110～120アミノ酸および成熟軽鎖の約90～115アミノ酸を指し、その配列は抗体同士で大きく異なり、特定の抗体の特定の抗原に対する結合および特異性に用いられる。配列の多様性は、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる領域に集中しており、一方で可変ドメインにおいてより高度に保存されている領域はフレームワーク領域（FR）と呼ばれる。特定のメカニズムまたはセオリーに縛られるものではないが、軽鎖および重鎖のCDRは、抗体の抗原との相互作用および特異性を主に担っていると考えられる。特定の態様では、可変領域はヒト可変領域である。特定の態様では、可変領域は、げっ歯類またはマウスのCDR、およびヒトフレームワーク領域（FR）を含む。特定の態様では、可変領域は霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。特定の態様では、可変領域は、げっ歯類またはマウスのCDR、および霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（FR）を含む。

「VL」および「VLドメイン」と言う用語は、抗体の軽鎖可変領域を指すのに交換可能に用いられる。

「VH」および「VHドメイン」と言う用語は、抗体の重鎖可変領域を指すのに交換可能に用いられる。

「Kabatナンバリング」という用語、および類似の用語は、当技術分野では認識されており、抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸残基、または抗体の抗原結合部分のナンバリングのシステムを指す。特定の局面では、抗体のCDRは、Kabatナンバリングシステムにしたがい決定され得る（例えば、Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391およびKabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）。Kabatナンバリングシステムを用いると、抗体重鎖分子内のCDRは、典型的には、アミノ酸位置31～35、ただし場合によっては35に続く1つまたは2つの追加のアミノ酸（Kabatナンバリングスキームでは35Aおよび35Bとされる）が含まれ得（CDR1）、アミノ酸位置50～65（CDR2）、およびアミノ酸位置95～102（CDR3）にある。Kabatナンバリングシステムを用いると、抗体軽鎖分子内のCDRは、典型的には、アミノ酸位置24～34（CDR1）、アミノ酸位置50～56（CDR2）、およびアミノ酸位置89～97（CDR3）にある。いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体のCDRは、Kabatナンバリングスキームにしたがい決定された。

本明細書で使用する場合、「定常領域」または「定常ドメイン」という用語は交換可能であり、その意味は当技術分野では広く知られている。定常領域は、抗体の一部分、例えば軽鎖および／または重鎖のカルボキシル末端部分であり、抗体の抗原との結合に直接関連しないが、Fc受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示し得る。免疫グロブリン分子の定常領域は一般に、免疫グロブリン可変ドメインに対し相対的に、より保存されたアミノ酸配列を有する。

本明細書で使用する場合、「重鎖」という用語は、抗体に関して用いられる場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の別個のタイプ、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）を指し得、それらはそれぞれ、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMクラスの抗体を、IgGのサブクラス、例えば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、およびIgG₄も含め、生じる。

本明細書で使用する場合、「軽鎖」という用語は、抗体に関して用いられる場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の別個のタイプ、例えばカッパ（κ）またはラムダ（λ）を指し得る。軽鎖アミノ酸配列は、当技術分野では周知である。特定の態様では、軽鎖はヒト軽鎖である。

「結合親和性」は一般に、分子（例えば抗体）の１つの結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との非共有結合の相互作用の強さの総和を指す。特に断らないかぎり、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数（K_D）で表すことができる。親和性は、限定ではないが、平衡解離定数（K_D）および平衡会合定数（K_A）を含め、当技術分野では公知のいくつかの方法で測定および／または表現され得る。K_Dは、k_off/k_onの商から計算されるが、K_Aは、k_on/k_offの商から計算される。k_onは、例えば抗体の抗原との結合率定数を指し、k_offは、例えば抗体の抗原との解離を指す。k_onおよびk_offは、BIAcore^{（登録商標）}またはKinExAなどの当業者には公知の技法により決定され得る。

本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で特定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。特定の態様では、抗体のCDR内またはフレームワーク領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられ得る。

本明細書で使用する場合、「エピトープ」は当技術分野における用語であり、抗体が特異的に結合できる、抗原の局在領域を指す。エピトープは、例えば1つのポリペプチドの隣接するアミノ酸（線形または隣接エピトープ）であり得、またはエピトープは、例えば1つのポリペプチドまたは複数のポリペプチドの2つ以上の非隣接領域が集まったものであり得る（立体構造、非線形、非連続、または非隣接エピトープ）。特定の態様では、抗体が結合するエピトープは、例えば、NMR分光法、X線回折結晶解析試験、ELISAアッセイ、水素／重水素交換と質量分析との組み合わせ（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングアッセイ、および／または変異原性マッピング（例えば、部位特異的変異原性マッピング）により決定され得る。X線結晶解析の場合、当技術分野で公知の任意の方法を用いて結晶化が達成され得る（例えばGiege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303）。抗体:抗原結晶は、周知のX線回折技法を用いて調査することができ、また、X-PLOR（Yale University, 1992、販売はMolecular Simulations, Inc.;例えばMeth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194を参照）、およびBUSTER（Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323）などのコンピューターソフトウェアを用いて改良することができる。変異原性マッピングの調査は、当業者には公知の任意の方法を用いて達成することができる。アラニンスキャニング変異原性の技法を含め、変異原性の技法の記載については、例えばChampe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394およびCunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085を参照されたい。いくつかの態様では、抗体のエピトープは、アラニンスキャニング変異原性の調査により決定される。

本明細書で使用する場合、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、および「特異的に認識する」という用語は、抗体のコンテキストでは類同語であり、抗原（例えば、エピトープ、免疫複合体、または抗原結合部位の結合パートナー）に結合する分子を指し、そのような結合は当業者には理解される。例えば、ある抗原に特異的に結合する分子は、他のペプチドまたはポリペプチドには、例えば免疫アッセイ、BIAcore^{（登録商標）}、KinExA 3000機器（Sapidyne Instruments、アイダホ州ボイシ）、または当技術分野では公知の他のアッセイにより決定した場合、一般に、より低い親和性で結合し得る。いくつかの態様では、ある抗原に免疫特異的に結合する分子は、該分子が別の抗原に結合する場合のK_Aよりも少なくとも2ログ、2.5ログ、3ログ、4ログ、またはそれより大きいK_Aで結合する。

他の態様では、ある抗原に免疫特異的に結合する分子は、類似の結合条件下で他のタンパク質と交差反応しない。いくつかの態様では、ある抗原に免疫特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。いくつかの態様では、本明細書では、特定の抗原と、別の無関連抗原と結合するよりも高い親和性で結合する多重特異性抗体が提供される。特定の態様では、本明細書では、例えば放射免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴、または結合平衡除外アッセイにより測定した場合、特定の抗原（たとえばヒト血清アルブミン）と、別の無関連抗原と結合するよりも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上高い親和性で結合する多重特異性抗体が提供される。いくつかの態様では、例えば放射免疫アッセイにより測定した場合、本明細書に記載される多重特異性抗体の、無関連のタンパク質との結合の程度は、該抗体の、特定の抗原との結合の10%、15%、または20%よりも小さい。

いくつかの態様では、本明細書では、あるヒト抗原に、該抗原の別の種と結合するよりも高い親和性で結合する多重特異性抗体が提供される。特定の態様では、本明細書では、例えば放射免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴、または結合平衡除外アッセイにより測定した場合、ヒト抗原と、別の種と結合するよりも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、またはそれ以上高い親和性で結合する多重特異性抗体が提供される。いくつかの態様では、例えば放射免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴、または結合平衡除外アッセイにより測定した場合、あるヒト抗原に結合する、本明細書に記載される多重特異性抗体は、該抗体の該ヒト抗原タンパク質との結合の10%、15%、または20%未満で、該抗原タンパク質の別の種と結合する。

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、任意のタイプの細胞、例えば、初代細胞、培養細胞、または細胞株由来の細胞であり得る。諸態様では、「宿主細胞」という用語は、核酸分子を用いて遺伝子導入された細胞、またはそのような細胞の子孫または潜在的子孫を指す。そのような細胞の子孫は、例えば、後の世代に生じ得る変異もしくは環境的影響により、または宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みにより、核酸分子を用いて遺伝子導入された親細胞と同一ではあり得ない。

本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、対象への治療（therapy）投与のコンテキストでは、所望の予防または治療効果を実現する治療の量を指す。

本明細書で使用する場合、「対象」および「患者」という用語は、交換可能に用いられる。対象は、動物であり得る。いくつかの態様では、対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、その他）または霊長類（例えば、サルもしくはヒト）などの哺乳動物、あるいは人間である。いくつかの態様では、対象はカニクイザルである。特定の態様では、そのような用語は、非ヒト動物（例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ネコ、またはイヌなどの非ヒト動物）を指す。いくつかの態様では、そのような用語は、ペットまたは家畜動物を指す。特定の態様では、そのような用語は、人間を指す。

多重特異性抗体
本明細書では、構造式

を含む多重特異性抗体であって、
式中、抗原結合断片（Fab）は、血清アルブミンFabであり;
R¹およびR²は、FabのN末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれがFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
R³およびR⁴は、FabのC末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれがFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
mは、0、または1、2、3、もしくはそれ以上の整数であり;
nは、0、または1、2、3、もしくはそれ以上の整数である、
多重特異性抗体が開示される。

いくつかの態様では、R¹およびR²は、同じもしくは異なる一本鎖可変断片（scFv）であるか、または同じもしくは異なるFv断片もしくはジスルフィド安定化Fv（dsFv）断片である。いくつかの態様では、R³およびR⁴は、同じまたは異なるscFvもしくはFv断片またはdsFv断片である。

いくつかの態様では、R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、1つまたは複数のリンカーによりFabに連結され得る。各リンカーは、限定ではないが、1～20の、またはその間の任意の長さもしくは範囲の、例えば2、3、4、その他のアミノ酸を含み得る。各リンカーは、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。各リンカーは、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含み得る。

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、Fabは、
（g）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列AASSLQS（SEQ ID NO:81）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QQSYSTPPYT（SEQ ID NO:82）を含む軽鎖CDR3;
（i）アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（j）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QQYGSSPRT（SEQ ID NO:88）を含む軽鎖CDR3;
（k）アミノ酸配列RASQSVSSSSLA（SEQ ID NO:89）を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QKYSSYPLT（SEQ ID NO:90）を含む軽鎖CDR3;または
（l）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QQYYSFLAKT（SEQ ID NO:93）を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変ドメインを含む。

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3、ならびに
アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QQYYSFLAKT（SEQ ID NO:93）を含む軽鎖CDR3、または上記開示の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の任意の組み合わせ
を含む。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ、あるいは本明細書に開示される重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの任意の組み合わせを含む。例えば、Fabは、SEQ ID NO:99と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:105と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み得る。

いくつかの態様では、Fabは、SEQ ID NO:45と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン（V_H-C_H1ドメイン）、およびSEQ ID NO:46と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ドメイン（V_L-C_Lドメイン）を含む。

いくつかの態様では、R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、抗CD40L hu5c8 scFvなどの生物活性エフェクター部分であり得る。例えば、R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvであり得る。R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48のアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvであり得る。

いくつかの態様では、R¹およびR²はそれぞれ、抗CD40L hu5c8 scFvなどの生物活性エフェクター部分であり得る。例えば、R¹およびR²はそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvであり得る。R¹およびR²はそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48のアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvであり得る。

いくつかの態様では、R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、例えば、抗TNF-α Fv、抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、抗IL-23 Fv、抗IL-23 dsFv、抗IFNAR1、および／または抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分である。

いくつかの態様では、R³およびR⁴はそれぞれ、例えば、抗TNF-α Fv、抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、抗IL-23 Fv、抗IL-23 dsFv、抗IFNAR1、および／または抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分である。

いくつかの態様では、R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、SEQ ID NO:49と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:50と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:52と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:54と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:56と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:58と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1、ならびに／あるいはSEQ ID NO:59と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:60と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分であり得る。R¹、R²、R³、およびR⁴はそれぞれ、SEQ ID NO:49の重鎖およびSEQ ID NO:50の軽鎖を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51の重鎖およびSEQ ID NO:52の軽鎖を含む抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53の重鎖およびSEQ ID NO:54の軽鎖を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55の重鎖およびSEQ ID NO:56の軽鎖を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57の重鎖およびSEQ ID NO:58の軽鎖を含む抗IFNAR1、ならびに／またはSEQ ID NO:59の重鎖およびSEQ ID NO:60の軽鎖を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分であり得る。

いくつかの態様では、R³およびR⁴はそれぞれ、SEQ ID NO:49と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:50と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:52と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:54と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:56と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:58と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1、ならびに／あるいはSEQ ID NO:59と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:60と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分であり得る。R³はR⁴それぞれ、SEQ ID NO:49の重鎖およびSEQ ID NO:50の軽鎖を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51の重鎖およびSEQ ID NO:52の軽鎖を含む抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53の重鎖およびSEQ ID NO:54の軽鎖を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55の重鎖およびSEQ ID NO:56の軽鎖を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57の重鎖およびSEQ ID NO:58の軽鎖を含む抗IFNAR1、ならびに／またはSEQ ID NO:59の重鎖およびSEQ ID NO:60の軽鎖を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分であり得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示される多重特異性抗体は、抗HSA Fab（SL335）、それぞれ抗CD40L IgG（ルプリズマブ）であるR¹およびR²、ならびにそれぞれ抗TNF-α IgG（アダリムマブ）であるR³およびR⁴、ならびに／または抗TNF-α Fab'（セルトリズマブ）を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される多重特異性抗体は、抗HSA Fab（SL335）、それぞれ抗CD40L scFv（hu5c8）であるR¹およびR²、ならびにそれぞれ0である、R³mおよびR⁴nのmおよびnを含む。

特定の局面では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、そのVLドメインのみ、またはそのVHドメインのみ、またはその3つのVL CDRのみ、またはその3つのVH CDRのみにより、記載され得る。例えば、Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915（全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたく、そこには、ヒト軽鎖または重鎖ライブラリーから相補的（complementing）軽鎖または重鎖をそれぞれ特定することによる、マウス抗αvβ3抗体のヒト化が記載されており、その結果、もとの抗体の親和性と同じかまたはそれよりも高い親和性を有するヒト化抗体バリアントが生じる。Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628（全体が参照により本明細書に組み入れられる）も参照されたく、そこには、特定のVLドメイン（またはVHドメイン）を用いること、および相補的可変ドメインについてライブラリーをスクリーニングすることにより、特定の抗原に結合する抗体を生産する方法が記載されている。そのスクリーンは、特定のVHドメインの14の新パートナー、および特定のVLドメインの13の新パートナーを生じ、それらは強力なバインダーであることがELISAにより決定された。Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577（全体が参照により本明細書に組み入れられる）も参照されたく、そこには、特定のVHドメインを用いること、および相補的VLドメインについてライブラリー（例えば、ヒトVLライブラリー）をスクリーニングすることにより、特定の抗原に結合する抗体を生産する方法が記載されており、選択されたVLドメインは、追加の相補的（例えばヒト）VHドメインの選択のガイドに用いることができる。

特定の局面では、抗体のCDRは、免疫グロブリン構造ループの場所を参照するChothiaナンバリングスキームにしたがい決定され得る（例えばChothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82;および米国特許第7,709,226号を参照）。典型的には、Kabatナンバリング法を用いると、Chothia CDR-H1ループは重鎖アミノ酸26～32、33、または34に存在し、Chothia CDR-H2ループは重鎖アミノ酸52～56に存在し、Chothia CDR-H3ループは重鎖アミノ酸95～102に存在し、そしてChothia CDR-L1ループは軽鎖アミノ酸24～34に存在し、Chothia CDR-L2ループは軽鎖アミノ酸50～56に存在し、Chothia CDR-L3ループは軽鎖アミノ酸89～97に存在する。Chothia CDR-H1ループの端部は、Kabatナンバリング法を用いると、ループの長さによってH32～H34の違いがある（それはKabatナンバリングスキームではH35AおよびH35Bに挿入があるためであり、35Aも35Bも存在しなければ、ループは32で終わり、35Aだけが存在するならば、ループは33で終わり、35Aも35Bも存在するならば、ループは34で終わる）。

特定の局面では、本明細書では、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する、かつChothia VL CDRのVLを含む多重特異性抗体が提供される。特定の局面では、本明細書では、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する、かつChothia VH CDRのVHを含む抗体が提供される。特定の局面では、本明細書では、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する、かつChothia VL CDRのVLを含み、かつChothia VH CDRのVHを含む抗体が提供される。特定の態様では、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する抗体が、1つまたは複数のCDRを含み、ここでChothia CDRもKabat CDRも、同じアミノ酸配列を有する。特定の態様では、本明細書では、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する、かつKabat CDRとChothia CDRとの組み合わせを含む抗体が提供される。

特定の局面では、抗体のCDRは、Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136およびLefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212に記載されるIMGTナンバリングシステムにしたがい決定され得る。IMGTナンバリングスキームでは、VH-CDR1は位置26～35にあり、VH-CDR2は位置51～57にあり、VH-CDR3は位置93～102にあり、VL-CDR1は位置27～32にあり、VL-CDR2は位置50～52にあり、VL-CDR3は位置89～97にある。

特定の局面では、抗体のCDRは、MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745にしたがい決定され得る。例えばAntibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)のMartin A. “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”も参照されたい。

特定の局面では、抗体のCDRは、AbMナンバリングスキームにしたがい決定され得、それはKabat CDRとChothia構造ループとの折衷であるAbM超可変領域を参照するものであり、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア（Oxford Molecular Group, Inc.）はこれを用いている。

いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体のVH領域上のCDR（例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3）および／またはVL領域上のCDR（例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3）の1つまたは複数の位置は、抗原との免疫特異的結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、1、2、3、4、5、または6アミノ酸位置だけ異なり得る。例えば、本明細書に記載される抗体のCDRを画定する位置は、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、CDRのN末端および／またはC末端の境界を、本明細書に記載される多重特異性抗体のCDR位置に対し相対的に1、2、3、4、5、または6アミノ酸だけずらすことにより、異なり得る。他の態様では、本明細書に記載される抗体のVH領域上のCDR（例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3）および／またはVL領域上のCDR（例えば、CDR1、CDR2、もしくはCDR3）の1つまたは複数の長さは、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸だけ異なり得る（例えば、より短い、またはより長い）。

いくつかの態様では、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3は、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、本明細書に記載されるCDRの1つまたは複数よりも1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸だけ短い場合がある。他の態様では、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3は、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、本明細書に記載されるCDRの1つまたは複数よりも1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸だけ長い場合がある。他の態様では、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のアミノ末端は、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、本明細書に記載されるCDRの1つまたは複数と比べて、1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸だけ伸長されている場合がある。他の態様では、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のカルボキシ末端は、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、本明細書に記載されるCDRの1つまたは複数と比べて、1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸だけ伸長されている場合がある。他の態様では、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のアミノ末端は、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、本明細書に記載されるCDRの1つまたは複数と比べて、1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸だけ短縮されている場合がある。いくつかの態様では、本明細書に記載されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、および／またはVH CDR3のカルボキシ末端は、抗原との免疫特異性結合が維持される（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される）かぎり、本明細書に記載されるCDRの1つまたは複数と比べて、1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸だけ短縮されている場合がある。抗原との免疫特異性結合が維持されているかどうかを確認するために、当技術分野では公知の任意の方法、例えば、本明細書の「実施例」のセクションに記載される結合アッセイおよび条件を用いることができる。

2つの配列（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することもできる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの具体的な非現定例は、Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268のアルゴリズムを、Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877のように改変したものである。そのようなアルゴリズムは、Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。本明細書に記載される核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、例えばスコア=100、語長=12のNBLASTヌクレオチドプログラムパラメーターのセットを用いてBLASTヌクレオチド検索が実施され得る。本明細書に記載されるタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、例えばスコア50、語長=3のXBLASTプログラムパラメーターのセットを用いてBLASTタンパク質検索が実施され得る。比較の目的でギャップありアライメントを得るには、Gapped BLASTをAltschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402に記載されるように利用することができる。あるいは、PSI BLASTにより、分子間の遠隔関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを用いることができる（例えば、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.govの米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）を参照）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の具体的な非現定例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部のALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている。ALIGNプログラムを利用してアミノ酸配列を比較する場合、PAM120重み残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ＝12、およびギャップペナルティ＝4を用いることができる。

2つの配列間の同一性パーセントは、上記の技法と同様の技法を用いて、ギャップを許容して、または許容せずに決定され得る。同一性パーセントの計算においては、典型的には、厳密なマッチのみがカウントされる。

多重特異性抗体を、検出可能標識または物質と融合または結合させる（例えば、共有結合的、または非共有結合的に連結する）ことができる。検出可能標識または物質の例としては、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼ;放射性同位体、例えばヨウ素（¹²⁵I、¹²¹I）、炭素（¹⁴C）、硫黄（³⁵S）、トリチウム（³H）、インジウム（¹²¹In）、およびテクネチウム（⁹⁹Tc）;発光標識、例えばルミノール;ならびに蛍光標識、例えば蛍光およびローダミン、ならびにビオチンが挙げられる。そのような標識化抗体は、抗原タンパク質を検出するのに用いることができる。

例として、自己免疫疾患または同種移植片拒否反応の主要経路であるCD40-CD40L相互作用を抑制するために、CD40またはCD40Lを標的とするモノクローナル抗体が開発されているが、そのさらなる開発は、IgG1抗体のFcによって誘導される血栓塞栓症などの副作用の発生により、休止している。副作用を除去する、または減じるために、Fabを抗CD40L scFvと組み合わせることにより生産される、組換え抗体（抗hu5c8 scFv）₂-SL335（APB-A1と名付けられた）が開発された。SL335は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合することによりインビボの持続可能性が増大する、抗原結合断片（Fab）である。米国特許第9,879,077号（全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。

APB-A1の結合能力およびそれが血栓塞栓症を抑制する効力を特定するために、結合能力および細胞ベースの抑制効力が評価された。APB-A1のHSAおよびrhCD40Lに対する結合親和性は、バイレイヤー干渉法により特定され、その結果は、APB-A1のHSAおよびrhCD40Lに対する解離定数（KD）は各対照群に比べて減少する傾向があったことを示した。細胞ベースの抑制効力の評価では、HSAを加えた場合、hu5c8 IgG1の抑制効力には有意差がなかったが、APB-A1のrhCD40L抗原およびD1.1細胞に対する結合抑制効力のレベルは、それぞれ約1.6倍および3倍増加した。このことは、SL335とHSAとの結合によるサイズの変化が、陽性対照群と同じような効力レベルをもたらすことを示唆している。つまり、hu5c8 IgG1よりも低い親和性でも、HSAの存在下で抑制効力は増加した。

IgG1のFc領域の除去によって血栓塞栓症の副作用が解決するか否かを調べるために、APB-A1の血小板凝集率およびセロトニン分泌レベルの測定および分析がなされた。血小板凝集は、APB-A1とrhCD40Lとで形成される免疫複合体（IC）からは、400 ng/mlという高濃度でも観測されなかったが、hu5c8 IgG1とrhCD40LとのICに対する凝集応答は、60 ng/mlという比較的低濃度で開始し、それは透過率および血小板凝集率により特定された。セロトニン放出レベルを血小板密顆粒で分析すると、APB-A1 ICのセロトニン放出レベルはhu5c8 IgG1 ICのセロトニン放出レベルよりも統計学的に有意に低かったことが特定された。この結果は、本開示の抗CD40L抗体が、血栓塞栓症関連の障害をインビボでも有効に解決できることを示唆している。

APB-A1の半減期を評価するために、薬物動態分析が実施された。APB-A1が、カニクイザルの2試験群に各5 mg/kg（第1群）または各20 mg/kg（第2群）の用量で1回の静脈内注射により投与された。結果として、2つの群が等しい腎臓クリアランス速度を有すると想定すると、第2群のインビボ半減期は9.59±0.79日と特定され、それは第1群のインビボ半減期6.94±4.6日よりも1.38倍高い。

さらに別の例では、破傷風トキソイド（TT）を注射すると生じる抗TT IgG抗体に対する免疫応答を評価するために、薬力学分析が実施された。試験動物としてカニクイザルが用いられ、APB-A1が、カニクイザルの2試験群に各5 mg/kg（第1群）または各20 mg/kg（第2群）の用量で1回の静脈内注射により投与された。結果として、APB-A1が高濃度（20 mg/kg）で静脈内投与された場合、IgG抗体免疫応答に対する抑制効力は、陽性対照群としてDXTが投与された場合よりもはるかに高く、またこの抑制効力は最大30～40日間維持された。さらに、CD40-CD40L相互作用はメモリーB細胞によっても作動するが、TTブースティング（20日目）により、27日目にAPB-A1で大きな抑制有効性が特定された。したがって、本開示のAPB-A1が、hu5c8 IgG1に比べ、血栓塞栓症関連障害を著しく改善したことが確認された。

さらに他の態様では、それぞれAPB-B1aおよびAPB-B1bと名付けられた新しい二重特異性抗体が、抗CD154（CD40リガンド;CD40L）一本鎖可変断片（scFv）（V_H-[ペプチドリンカー]-V_L）と腫瘍壊死因子アルファ（抗TNF-α）可変断片（Fv）またはジスルフィド安定化Fv（dsFv）とを連結することにより生産された。バイオレイヤー干渉法（BLI）を用いた実験で、APB-B1が、3つの標的、つまり組換えヒトCD40L、組換えヒトTNF-α、およびヒト血清アルブミン（HSA）タンパク質に同時に結合する能力、ならびに抗CD40L IgGまたは抗TNF-αFab'親抗体と同様の抗原結合親和性レベルを有したことが確認された。

それに関する他の態様では、賦形剤なし緩衝状態で測定した融解温度（Tm）は、抗TNF-α Fvにおける鎖間ジスルフィド結合の有無にかかわらず62℃であり、鎖間ジスルフィド結合は構造安定性に寄与しなかったことが確認された。

それに関するさらに他の態様では、インビトロの細胞ベースのアッセイは、APB-B1のCD40L阻害能力が親抗体抗CD40L IgG1の該能力と同様であったこと、およびTNF-α阻害能力が親抗体抗TNF-α Fab'に比べてやや低かったことを示した。それにもかかわらず、APB-B1は、CD40LおよびTNF-αの両者に対する阻害活性、ならびに親抗体、抗CD40L IgG1および抗TNF-α Fab'それぞれよりも高い阻害活性を実証した。

抗体の生産
本明細書に開示される多重特異性抗体は、当技術分野では公知の任意の抗体合成法により、例えば化学合成により、および組換え発現の技法により、生産され得る。本明細書に記載される方法は、特に断らないかぎり、分子生物学、微生物学、遺伝子分析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当技術分野の技術範囲の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、例えば、本明細書に引用される参照文献に記載されており、該文献に十分に説明されている。例えば、Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987および年次更新); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987および年次更新) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。

いくつかの態様では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、例えば合成による作製、DNA配列の遺伝子操作を伴う任意の手段により、調製され、発現させられ、作られ、または単離された抗体（例えば、組換え抗体）である。特定の態様では、そのような抗体は、動物または哺乳動物（例えば、ヒト）のインビボの抗体生殖系列レパートリーには本来存在しない配列（例えば、DNA配列またはアミノ酸配列）を含む。

いくつかの局面では、本明細書では、本明細書に記載される細胞または宿主細胞を培養することを含む、本明細書に開示される多重特異性抗体を作る方法が提供される。いくつかの局面では、本明細書では、本明細書に記載される細胞または宿主細胞（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞）を用いて抗体を発現（例えば、組換え発現）させることを含む、多重特異性抗体を作る方法が提供される。いくつかの態様では、細胞は単離細胞である。いくつかの態様では、外因性ポリヌクレオチドが細胞に導入されている。いくつかの態様では、方法は、細胞または宿主細胞から得られた抗体を精製する工程をさらに含む。

ポリクローナル抗体を生産する方法は、当技術分野では公知である（例えばShort Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., eds., John Wiley and Sons, New Yorkの第11章を参照）。

多重特異性抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、およびファージディスプレイの技術、またはそれらの組み合わせの使用を含め、当技術分野では公知の多様な技法を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野では公知であって、例えばHarlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)のHammerling GJ et al.に教示されるハイブリドーマ技法を用いて生産され得る。「モノクローナル抗体」と言う用語は、本明細書で使用する場合、ハイブリドーマ技術により生産された抗体に限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書に記載される抗体を外因的に発現する宿主細胞から組み換えで生産され得る。

「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、単一細胞（例えば、組換え抗体を生産するハイブリドーマまたは宿主細胞）により生産される抗体であり、該抗体は、抗原（例えば、ヒト血清アルブミン）に免疫特異的に結合し、それは例えば、ELISA、または当技術分野もしくは本明細書に提供される実施例で公知の他の抗原結合もしくは競合結合アッセイにより決定される。特定の態様では、モノクローナル抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。特定の態様では、モノクローナル抗体は、一価抗体または多価（例えば、二価）抗体である。特定の態様では、モノクローナル抗体は、Fab断片またはF(ab’)₂断片であり得る。本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、例えば、Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495に記載されるようなハイブリドーマ方法により作ることができ、または例えば、例えば本明細書に記載される技法を用いてファージライブラリーから単離され得る。クローン細胞株の調製、およびそれによって発現させるモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当技術分野では周知である（例えばShort Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al.の第11章、前記）。

ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を生産し選別する方法は、当技術分野ではルーチンであり、周知である。例えば、ハイブリドーマ法では、マウス、または他の適切な宿主動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、もしくはマカクザルを免疫化して、免疫化に用いられた抗原（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する抗体を生産する、または生産する能力のある、リンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いでリンパ球をポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。それに加えて、RIMMS（反復複数部位免疫化）技法を用いて動物を免疫化することができる（Kilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16:381-9、全体が参照により組み入れられる）。

いくつかの態様では、マウス（または他の動物、例えばラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、またはイヌ）が抗原（例えば、ヒト血清アルブミン）で免疫化され得、免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中に検出されると、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次いで脾細胞を、任意の好適な骨髄腫細胞、例えばAmerican Type Culture Collection（ATCC^{（登録商標）}）（バージニア州マナッサス）から入手可能な細胞株SP20の細胞と、周知の技法により融合させて、ハイブリドーマを形成する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。特定の態様では、免疫化マウスのリンパ節を採取し、NS0骨髄腫細胞と融合させる。

こうして調製されたハイブリドーマ細胞を、無融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1つまたは複数の物質を含有し得る好適な培養培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）が欠けている場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むことになり（HAT培地）、これらの物質がHGPRT欠損細胞の増殖を阻止する。

特定の態様は、効率よく融合し、選択された抗体生産細胞による安定した高レベルの抗体生産をサポートし、かつHAT培地などの培地に感受性である、骨髄腫細胞を使用する。これらの骨髄腫細胞株には、マウス骨髄腫細胞株、例えばNS0細胞株、または米国カリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerから入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍に由来する細胞株、ならびに米国メリーランド州ロックビルのAmerican Type Culture Collectionから入手可能なSP-2もしくはX63-Ag8.653細胞がある。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記述されている（Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。

ハイブリドーマ細胞が増殖中の培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は、当技術分野では公知の方法、例えば免疫沈降法により、またはインビトロの結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ（RIA）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により決定される。

ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を生産すると特定された後、そのクローンが限界希釈手順によりサブクローニングされ得、標準的な方法で増殖され得る（Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、前記）。そのための好適な培養培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI 1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物体内で腹水腫瘍としてインビボ増殖させることができる。

サブクローンが分泌するモノクローナル抗体は、好適には、培養培地、腹水、または血清から、例えば、タンパク質A-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により分離される。

本明細書に記載される抗体は、当業者には公知の任意の技法により生成され得る。例えば、本明細書に記載されるFabおよびF(ab’)₂断片は、（Fab断片を生じる）パパインまたは（F(ab’)₂断片を生じる）ペプシンなどの酵素を用いての免疫グロブリン分子のタンパク質切断により、生産され得る。Fab断片は、テトラマー抗体分子の2本の同一アームの1本に対応し、重鎖のVHおよびCH1ドメインと対になっている完全な軽鎖を含んでいる。F(ab’)₂断片は、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された、テトラマー抗体分子の2本の抗原結合アームを含んでいる。

さらに、本明細書に記載される抗体はまた、当技術分野では公知の様々なファージディスプレイ法を用いて生成され得る。ファージディスプレイ法では、タンパク質は、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に呈示される。具体的には、VHドメインをコードするDNA配列およびVLドメインをコードするDNA配列を、動物のcDNAライブラリー（例えば、ヒトまたはマウスの罹患組織のcDNAライブラリー）から増幅する。VHドメインをコードするDNAとVLドメインをコードするDNAとは、PCRで、scFvリンカーにより、互いに組み換えられ、そしてファージミドベクターにクローニングされる。ベクターを大腸菌（E. coli）中に電気穿孔し、該大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法に用いられるファージは、典型的には、fdおよびM13を含め、糸状ファージであり、VHおよびVLドメインは、通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのどちらかと組換え融合させられる。特定の抗原に結合する抗体を発現するファージは、抗原、例えば、標識抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて、選択または特定され得る。本明細書に記載される抗体を作るのに使用され得るファージディスプレイ法の例としては、Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT/GB91/001134; WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401、およびWO97/13844; ならびに米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、同第5,733,743号、および同第5,969,108号に開示されているものが挙げられる。

上記の参照文献にも記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離することができ、そしてヒト抗体を含め抗体を生成するのに用いることができ、そして例えば下記のような哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含め、任意の所望の宿主内で発現させることができる。WO92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34;およびBetter M et al., (1988) Science 240: 1041-1043に開示される方法などの当技術分野では公知の方法を用いる、Fab、Fab’、およびF(ab’)₂断片などの抗体を組換え生産する技法を用いることもできる。

いくつかの局面では、抗体を生成するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するフランキング配列を含むPCRプライマーを用いて、鋳型からVHまたはVL配列、例えばscFvクローンを増幅することができる。当業者には公知のクローニング技法を利用して、PCR増幅されたVHドメインをVH定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、また、PCR増幅されたVLドメインをVL定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。VHおよびVLドメインを、必要な定常領域を発現する1つのベクターにクローニングすることもできる。そして、当業者には公知の技法を用いて、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターを細胞株に同時導入して、抗体、例えば、IgGを発現する安定または一過性細胞株を生成する。

キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合した、マウスまたはラットモノクローナル抗体の可変領域を含み得る。キメラ抗体を生産する方法は、当技術分野では公知である。例えば、Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; ならびに米国特許第5,807,715号、同第4,816,567号、同第4,816,397号、および同第6,331,415号を参照されたい。

ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域、および非ヒト免疫グロブリン（例えば、マウス免疫グロブリン）のアミノ酸配列を実質的に有するCDRを含む。特定の態様では、ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の、少なくとも一部分も含む。抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域も含み得る。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含め、免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにIgG₁、IgG₂、IgG₃、およびIgG₄を含め、任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体は、限定ではないが、CDR移植（EP 239400; WO91/09967; ならびに米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、および同第5,585,089号）、被覆（veneering）または表面改変（EP 592106およびEP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM et al., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; およびRoguska MA et al., (1994) PNAS 91: 969-973）、鎖シャッフル（米国特許第5,565,332号）、ならびに例えば米国特許第6,407,213号、同第5,766,886号、WO93/17105; Tan P et al., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C et al., (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V et al., (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M et al., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA et al., (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al., (1995) Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR et al., (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10およびPedersen JT et al., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73に開示される技法を含め、当技術分野では公知の様々な技法を用いて生産され得る。US 2005/0042664 A1（2005年2月24日）（全体が参照により本明細書に組み入れられる）も参照されたい。

シングルドメイン抗体、例えば、軽鎖のない抗体が、当技術分野では周知の方法により生産され得る。Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; 米国特許第6,005,079号; ならびにWO94/04678、WO94/25591、およびWO01/44301を参照されたい。

さらに、抗原に免疫特異的に結合する抗体を利用して、当業者には周知の技法を用いて抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成することができる。（例えばGreenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; およびNissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438を参照）。

特定の態様では、本明細書に記載される抗体と同じ関心対象の抗原（例えば、ヒト血清アルブミン）のエピトープに結合する、本明細書に記載される多重特異性抗体は、ヒト抗体である。特定の態様では、本明細書に記載される抗体のいずれか1つが血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に結合するのを競合的に（例えば、用量依存式に）ブロックする、本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野では公知の任意の方法を用いて生産され得る。例えば、機能的外因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することはできる、トランスジェニックマウスを用いることができる。具体的には、ヒト重・軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または相同組換えにより、マウス胚幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒト重・軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚幹細胞に導入することができる。マウス重・軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、ヒト免疫グロブリン座位の相同組換えによる導入とは別に、または同時に、非機能性とされ得る。具体的には、J_H領域のホモ接合型欠失により、内因性抗体生産が防げられる。改変胚幹細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを生産する。次いでキメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合型子孫を生産する。トランスジェニックマウスを、選択抗原、例えば、抗原全部または一部を用いて、通常のやり方で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫化されたトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリントランスジーンはB細胞分化時に再編し、その後クラス転換および体細胞変異を経る。したがって、そのような技法を用いれば、治療上有用なIgG、IgA、IgM、およびIgE抗体を生産することが可能になる。ヒト抗体を生産するこの技術の概要については、Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するこの技術、ならびにそのような抗体を生産するためのプロトコルの詳細な解説については、例えば、WO98/24893、WO96/34096、およびWO96/33735; ならびに米国特許第5,413,923号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,569,825号、同第5,661,016号、同第5,545,806号、同第5,814,318号、および同第5,939,598号を参照されたい。ヒト抗体を生産する能力のあるマウスの例としては、Xenomouse^（商標）（Abgenix, Inc.; 米国特許第6,075,181号、および同第6,150,184号）、HuAb-Mouse^（商標）（Mederex, Inc./Gen Pharm; 米国特許第5,545,806号、および同第5,569,825号）、Trans Chromo Mouse^（商標）（Kirin）、およびKM Mouse^（商標）（Medarex/Kirin）が挙げられる。

抗原に特異的に結合するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法を含め、当技術分野では公知の様々な方法により作ることができる。米国特許第4,444,887号、同第4,716,111号、および同第5,885,793号; ならびにWO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735、およびWO91/10741も参照されたい。

いくつかの態様では、ヒト抗体は、マウス-ヒトハイブリドーマを用いて生産され得る。例えば、エプスタイン・バーウイルス（EBV）で形質転換したヒト末梢血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス-ヒトハイブリドーマを生産することができ、これらのマウス-ヒトハイブリドーマを選別にかけて、標的抗原に免疫特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを決定する。そのような方法は公知であって、当技術分野で記述されており、例えばShinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31を参照されたい。

ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞
特定の局面では、本明細書では、抗原に免疫特異的に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片（例えば、可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにベクター、例えば、宿主細胞（例えば、大腸菌および哺乳動物細胞）において組換え発現するそのようなポリヌクレオチドを含むベクターが、提供される。本明細書では、本明細書に提供されるいずれかの抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞において、該ポリヌクレオチドを効率よく発現させるための発現ベクターが、提供される。

本明細書で使用する場合、「単離」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、該核酸分子の天然ソース（例えばマウスまたはヒト）に存在する他の核酸分子から分離されている、ポリヌクレオチドまたは核酸分子である。さらに、cDNA分子などの「単離」核酸分子は、組換え技法により生産される場合は他の細胞物質、もしくは培養培地を実質的に含まない場合があり、または化学合成される場合は化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない場合がある。例えば、「実質的に～を含まない」という言葉は、他の材料、例えば、細胞物質、培養培地、他の核酸分子、化学物質前駆体、および／または他の化学物質を約15%、10%、5%、2%、1%、0.5%、または0.1%未満（特に約10%未満）しか有しない、ポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体をコードする核酸分子が、単離または精製される。

特定の局面では、本明細書では、抗原ポリペプチド（例えば、ヒト血清アルブミン）に免疫特異的に結合し、かつ本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む抗体のほか、そのような抗体と、抗原ポリペプチドとの結合を（例えば用量依存式に）競う抗体、またはそのような抗体が結合するのと同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

特定の局面では、本明細書では、本明細書に記載される抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体のVL FRおよびCDRを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体のVH FRおよびCDRを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み得る。

特定の態様では、本明細書では、例えば本明細書に記載されるヒト血清アルブミンに対する抗体のVL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む、3つのVH鎖CDRと、例えば本明細書に記載されるヒト血清アルブミンに対する抗体のVH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含む、3つのVH鎖CDRとを含むFabを含む多重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

特定の態様では、本明細書では、多重特異性抗体、またはVLドメインを含むその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

特定の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:46）を含む軽鎖可変領域を含む、本明細書に提供される多重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、該抗体は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に免疫特異的に結合する。

特定の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:45）を含む重鎖可変領域を含む、本明細書に提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、該抗体は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に免疫特異的に結合する。

特定の局面では、本明細書では、軽鎖と重鎖、例えば別々の軽鎖と重鎖とを含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。軽鎖については、いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、カッパ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ラムダ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖を含む、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に免疫特異的に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで該抗体は軽鎖を含み、VLドメインのアミノ酸配列はSEQ ID NO:46に示されるアミノ酸配列を含み得、軽鎖の定常領域はヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば、ヒト定常領域配列は、米国特許第5,693,780号に記載される配列であり得る。

本明細書では、例えばコドン／RNA最適化、異種シグナル配列との置き換え、およびmRNA不安定性要素の除去により最適化されている、多重特異性抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドも提供される。コドン変更の導入および／またはmRNAにおける阻害領域の除去により、組換え発現させる多重特異性抗体またはその断片（例えば、軽鎖、重鎖、VHドメイン、またはVLドメイン）をコードする最適化された核酸を生成する方法は、例えば、米国特許第5,965,726号;同第6,174,666号;同第6,291,664号;同第6,414,132号;および同第6,794,498号に記載される最適化の方法を、それにしたがい用いて実行され得る。例えば、RNA内の潜在的スプライス部位および不安定性要素（例えば、A/TまたはA/Uが豊富な要素）を、核酸配列にコードされるアミノ酸は変えることなく変異させて、組換え発現のためRNAの安定性を増加させることができる。これらの改変は、遺伝コードの縮重を利用し、例えば、同一アミノ酸の代替コドンを用いる。いくつかの態様では、1つまたは複数のコドンを変えて、保存的変異、例えばもとのアミノ酸と同様の化学構造および特性ならびに／または機能をもつ同様のアミノ酸をコードすることが望ましい場合がある。

特定の態様では、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその断片（例えば、VLドメインまたはVHドメイン）をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその断片（例えば、VLドメインまたはVHドメイン）をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば相補的）ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る。特定の態様では、本明細書に記載される多重特異性抗体または断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの態様では、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー、中間、またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は、例えばUS 2005/0048549（例えば段落72～73）（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されており、これを参照されたい。

当技術分野では公知の任意の方法により、ポリヌクレオチドを得ることができ、かつ該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列、およびこれらの抗体の改変バージョンは、当技術分野では周知の方法を用いて決定され得、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることがわかっているヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸が生成するようにアセンブルする。そのような抗体をコードするポリヌクレオチドは、（例えば、Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-246に記載されるようにして）化学合成オリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ、簡単に説明すると、抗体をコードする配列の一部分を含むオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、そして連結させたオリゴヌクレオチドのPCR増幅を伴う。

あるいは、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、好適なソース（例えば、ハイブリドーマ）に由来する核酸から、当技術分野では周知の方法（例えば、PCRおよび他の分子クローニング法）を用いて生成され得る。例えば、既知の配列の3’および5’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを用いてのPCR増幅が、関心対象の抗体を生産するハイブリドーマ細胞から得られたゲノムDNAを用いて、実施され得る。そのようなPCR増幅法を用いて、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする配列を含む核酸を得ることができる。そのようなPCR増幅法を用いて、抗体の可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得ることができる。その後、増幅させた核酸を、宿主細胞で発現させるために、かつさらなるクローニングのために、例えばキメラおよびヒト化抗体を生成するために、ベクターにクローニングすることができる。

特定の抗体またはその断片をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、抗体分子またはその断片の配列はわかっている場合、免疫グロブリンまたは断片をコードする核酸を化学合成するか、または好適なソース（例えば、抗体cDNAライブラリー、または抗体を発現する任意の組織または細胞、例えば本明細書に記載される抗体を発現する選択されたハイブリドーマ細胞から作られたcDNAライブラリー、もしくはそれから単離されたpoly A+ RNAなどの核酸）から、該配列の3’および5’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを用いてのPCR増幅により、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、例えば抗体をコードするcDNAクローンをcDNAライブラリーから特定するクローニングにより、得ることができる。次いで、PCRで生成された増幅核酸を、方法当技術分野では周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

本明細書に記載される多重特異性抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて（例えば、該多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離し配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞が、そのようなDNAのソースとなり得る。DNAを単離してから、発現ベクター内に配置することができ、次いで該ベクターを、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（例えば、CHO GS System（商標）（Lonza）のCHO細胞）、または免疫グロブリンタンパク質を別途生産しない骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子導入して、組換え宿主細胞における多重特異性抗体の合成を得る。

抗体を生成するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するフランキング配列を含むPCRプライマーを用いて、scFvクローンのVHまたはVL配列を増幅することができる。当業者には公知のクローニング技法を利用して、PCR増幅したVHドメインを、重鎖定常領域、例えばヒトガンマ4定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、PCR増幅したVLドメインを、軽鎖定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。特定の態様では、VHまたはVLドメインを発現するベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。VHおよびVLドメインを、必要な定常領域を発現する1つのベクターにクローニングすることもできる。そして、当業者には公知の技法を用いて、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターを細胞株に同時導入して、全長抗体、例えば、IgGを発現する安定または一過性細胞株を生成する。

DNAは、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列をマウス配列の代わりに置き換えることにより、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を共有結合的に接合することにより、改変することもできる。

高ストリンジェンシー条件、中間またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドも提供される。特定の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー、中間またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に提供されるVHドメインおよび／またはVLドメインをコードするポリヌクレオチドに、ハイブリダイズする。

ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で記述されており、当業者には公知である。例えば、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、約45℃の6x 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中、フィルターに結合したDNAとハイブリダイズし、その後約50～65℃の0.2xSSC/0.1% SDS中、1回または複数回洗浄することを伴い得、高ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、約45℃の6xSSC中、フィルターに結合した核酸とハイブリダイズし、その後約68℃の0.1xSSC/0.2% SDS中、1回または複数回洗浄することを伴い得る。他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーションは当業者には公知であり、例えば、Ausubel FM et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New Yorkの6.3.1-6.3.6ページおよび2.10.3ページに記載されており、これを参照されたい。

本明細書では、
（a）プロモーター、
（b）血清アルブミンに結合する抗原結合断片（Fab）をコードする、第1の核酸分子、および
（c）生物活性エフェクター部分およびリンカーをコードする、第2の核酸分子
を含む、発現ベクターがさらに開示され、
該プロモーター、該第1の核酸配列、および該第2の核酸分子は、機能的に連結されている。該第2の核酸分子は、2、3、4、5、6、またはそれ以上の生物活性エフェクター部分およびリンカーをコードし得る。

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列AGWLRQYGMDV（SEQ ID NO:70）を含む重鎖CDR3;
（e）アミノ酸配列AYWIA（SEQ ID NO:71）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。

を含む軽鎖CDR3;
（i）アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（j）アミノ酸配列

例えば、第1の核酸分子は、上記（a）を含む重鎖可変ドメインおよび上記（g）を含む軽鎖可変ドメイン;上記（b）を含む重鎖可変ドメインおよび上記（h）を含む軽鎖可変ドメイン;上記（c）を含む重鎖可変ドメインおよび上記（i）を含む軽鎖可変ドメイン;上記（d）を含む重鎖可変ドメインおよび上記（j）を含む軽鎖可変ドメイン;上記（e）を含む重鎖可変ドメインおよび上記（k）を含む軽鎖可変ドメイン;上記（f）を含む重鎖可変ドメインおよび上記（l）を含む軽鎖可変ドメイン;または上記重鎖可変ドメインと上記軽鎖可変ドメインとの任意の組み合わせ、を含むFabをコードする核酸配列を含み得る。いくつかの態様では、第1の核酸分子は、
アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3、ならびに
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含むFab（SL335）をコードする核酸配列を含む。

他の態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ含むFabをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、第1の核酸分子は、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン（V_H-C_H1ドメイン）、およびSEQ ID NO:46のアミノ酸配列を含む軽鎖ドメイン（V_L-C_Lドメイン）を含むFab（SL335）をコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、生物活性エフェクター部分は、抗TNF-α Fv、抗TNF-α dsFv、抗IL-23 Fv、抗IL-23 dsFv、抗IFNAR1 Fv、および／または抗IFNAR1 dsFvである。例えば、第2の核酸分子は、SEQ ID NO:49～60の1つまたは複数と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様では、第2の核酸分子は、SEQ ID NO:6～15、39、および40の1つまたは複数と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。

特定の局面では、本明細書では、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する本明細書に記載される多重特異性抗体を（例えば組換え）発現する細胞（例えば、宿主細胞）、および関連ポリヌクレオチド、および発現ベクターが提供される。本明細書では、哺乳動物細胞などの宿主細胞において組換え発現する多重特異性抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。本明細書では、本明細書に記載される多重特異性抗体（例えば、ヒトまたはヒト化抗体）を組換え発現させるそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。本明細書では、本明細書に記載される抗体を生産する方法も提供され、該方法は、そのような抗体を宿主細胞において発現させることを含む。

特異的に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片（例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖または軽鎖）の組換え発現には、該抗体または断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が含まれる。本明細書に記載される抗体またはその断片（例えば、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該抗体分子を生産するためのベクターを、当技術分野では周知の技法を用いる組換えDNA技術により生産することができる。したがって、抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当業者には周知の方法を用いて、抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）コード配列および適切な転写・翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換えDNA技法、合成技法、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。プロモーターに機能的に連結された、本明細書に記載される抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメイン、もしくはその断片、または重鎖CDRもしくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターも提供される。そのようなベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、WO86/05807およびWO89/01036;ならびに米国特許第5,122,464号を参照）、該抗体の可変ドメインをそのようなベクターにクローニングして、重鎖全部、軽鎖全部、または重鎖および軽鎖両者全部を発現させることができる。

発現ベクターを従来の技法により細胞（例えば、宿主細胞）に導入することができ、そうして得られた細胞従来の技法により培養して本明細書に記載される抗体を生産することができる。

様々な宿主-発現ベクター系を利用して、記載の抗体分子を発現させることができる。そのような宿主-発現系は、ビヒクルとなり、それによって関心対象のコード配列が生産され得、そして精製され得るが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または遺伝子導入された場合、本明細書に記載される抗体分子をインサイチューで発現できる細胞にもなる。これらとしては、限定ではないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌および枯草菌（B. subtilis））などの微生物;抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス・ピキア（Saccharomyces Pichia））;抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系;抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV）に感染させた、もしくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えば、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）などの緑藻）;または哺乳動物細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、COS（例えば、COS1もしくはCOS）、CHO、BHK、MDCK、HEK293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa、およびNIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、およびBMT10細胞）が挙げられる。いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体（例えば、抗体pab1949またはpab2044のいずれか一方のCDRを含む抗体）を発現する細胞は、CHO細胞、例えばCHO GS System（商標）（Lonza）のCHO細胞である。いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体を発現する細胞は、ヒト細胞、例えばヒト細胞株である。いくつかの態様では、哺乳動物発現ベクターは、pOptiVEC（商標）またはpcDNA3.3である。いくつかの態様では、特に組換え全抗体分子を発現するために、大腸菌などの細菌細胞、または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）が、組換え抗体分子の発現に用いられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞などの哺乳動物細胞をヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せれば、有効な抗体発現系になる（Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-105;およびCockett MI et al., (1990) Biotechnology 8: 662-667）。特定の態様では、本明細書に記載される抗体は、CHO細胞またはNS0細胞により生産される。いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導プロモーター、または組織特異的プロモーターにより制御される。

細菌系では、いくつかの発現ベクターが、発現する抗体分子について意図される使用によっては、有利に選択され得る。例えば、抗体分子の薬学的組成物を作るために、そのような抗体を大量に生産する場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとしては、限定ではないが、大腸菌発現ベクターpUR278（Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794）（ここで抗体コード配列は、lac Zコード領域とフレームをそろえて個別にベクター内に連結され得、その結果融合タンパク質が生産される）;pINベクター（Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509）等が挙げられる。例えば、pGEXベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオン5-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合後、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、容易に融解細胞から精製され得る。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出されることができるように、トロンビンまたはファクターXaプロテアーゼ切断部位を含むよう設計される。

昆虫系では、例えばアウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現させることができる。このウイルスはヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞内で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングすること、そしてAcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。

哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、関心対象の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列に連結され得る。次いでこのキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボの組み換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域ElまたはE3）に挿入すると、感染した宿主において生存可能であり、かつ抗体分子を発現することができる組換えウイルスが生じる（例えば、Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81: 3655-3659参照）。挿入した抗体コード配列の高効率の翻訳のため、特定の開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全インサートが確実に翻訳されるように、所望のコード配列の読みフレームとそろっていなくてはならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然でも合成でも、様々な起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、その他を含めることにより増大し得る（例えば、Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol 153: 516-544参照）。

それに加えて、挿入配列の発現を調節する、または所望のように遺伝子産物を修飾しプロセスする、宿主細胞株を選ぶことができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、該タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞が、タンパク質産物および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾に関し、特徴的かつ特異なメカニズムを有する。発現する外来タンパク質が確実に正しく修飾されプロセシングされるように、適切な細胞株または宿主系が選ばれ得る。これを達成するために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定ではないがCHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、およびT47D、NS0（免疫グロブリン鎖を外因的にいっさい生産しないマウス骨髄腫細胞株）、CRL7O3O、COS（例えば、COS1またはCOS）、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10、およびHsS78Bst細胞が挙げられる。特定の態様では、本明細書に記載される多重特異性抗体（例えば、CDRを含む抗体）は、CHO細胞などの哺乳動物細胞において生産される。

いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体は、フコース含量が少ないか、またはフコースを含有しない。そのような抗体は、当業者には公知の技法を用いて生産され得る。例えば、抗体は、フコシル化する能力が不足しているか、または欠けている細胞において発現し得る。特定の例では、α1,6-フコシルトランスフェラーゼの両アレルのノックアウトを有する細胞株を用いて、フコース含量が少ない抗体が生産され得る。Potelligent^{（登録商標）}システム（Lonza）は、そのような系の一例であり、フコース含量が少ない抗体の生産に用いられ得る。

組換えタンパク質を長期にわたり高収率で生産するために、安定発現細胞が生成され得る。例えば、多重特異性抗体を安定的に発現する細胞株が作り出され得る。特定の態様では、本明細書に提供される細胞が、軽鎖／軽鎖可変ドメインおよび重鎖／重鎖可変ドメインを安定的に発現し、これらが会合して本明細書に記載される抗体（例えば、CDRを含む抗体）を形成する。

特定の局面では、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞が、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、その他）により制御されるDNA、および選択マーカーで、形質転換され得る。外来DNA／ポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞を1～2日間濃縮培地で増殖させてから選択培地に変えてもよい。組換えプラスミド内の選択マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、かつ細胞がその染色体にプラスミドを安定して組み込むこと、そしてフォーカスを形成するまで成長することを可能にし、それがクローニングされ得、増殖して細胞株になり得る。この方法は、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその断片を発現する細胞株を作り出すのに、有利に用いられ得る。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する組成物の選別および評価に、特に有用であり得る。

いくつかの選択系を用いることができ、限定ではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler M et al., (1977) Cell 11(1): 223-232）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-823）遺伝子を含み、それぞれtk-細胞、hgprt-細胞、またはaprt-細胞において用いることができる。また、次の遺伝子については、代謝拮抗薬の抵抗性を選択の基礎として用いることができる：メトトレキサートに対する抵抗性を与える、dhfr（Wigler M et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-3570; O’Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-1531）;ミコフェノール酸に対する抵抗性を与える、gpt（Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-2076);アミノグリコシドG-418に対する抵抗性を与える、neo（Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932;およびMorgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-215);およびハイグロマイシンに対する抵抗性を与える、hygro（Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-156）。当技術分野では一般に公知の組換えDNA技術の方法が、所望の組換えクローンの選択に日常的に適用され得、そのような方法は、例えば、Ausubel FM et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);ならびにDracopoli NC et al., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)の第12および13章; Colbere-Garapin F et al., (1981) J Mol Biol 150: 1-14に記載されており、これらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（概説は、Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)を参照）。抗体を発現するベクター系中マーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルが増加すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加することになる。増幅した領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の生産も増加することになる（Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66）。

宿主細胞は、本明細書に記載される2つ以上の発現ベクターを同時導入され得、第1のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードしており、第2のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードしている。2つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。宿主細胞は、量が異なる2つ以上の発現ベクターを用いて同時導入され得る。例えば、宿主細胞は、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、または1:50のいずれか1つの比の第1の発現ベクターおよび第2の発現ベクターを用いて遺伝子導入され得る。

あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両者をコードしかつ発現することができる、1つのベクターを用いることができる。そのような状況では、過剰な毒性遊離重鎖を回避するために、軽鎖を重鎖の前に配置すべきである（Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565;およびKohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199）。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含み得る。発現ベクターは、モノシストロニックまたはマルチシストロニックであり得る。マルチシストロニック核酸構築物は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくはそれ以上の、または2～5、5～10、もしくは10～20の範囲の遺伝子／ヌクレオチド配列をコードし得る。例えば、バイシストロニック核酸構築物は、プロモーター、第1の遺伝子（例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖）、および第2の遺伝子（例えば、本明細書に記載される抗体の軽鎖）を、記載した順に含み得る。そのような発現ベクターでは、両遺伝子の転写はプロモーターに駆動され得るが、第1の遺伝子のmRNAの翻訳は、キャップ依存性スキャニングメカニズムにより得、第2の遺伝子のmRNAの翻訳は、キャップ非依存性メカニズム、例えばIRESにより得る。

ベクターは、血清アルブミンに結合する抗原結合断片（Fab）をコードする第1の核酸分子、生物活性エフェクター部分をコードする第2の核酸分子、およびリンカーを含み得る。

本明細書に記載される抗体分子は、組換え発現により生産されると、免疫グロブリン分子を精製する当技術分野では公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインA以下の特定の抗原についてはアフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心処理、示差溶解度（differential solubility）、または任意の他の標準的なタンパク質精製技法で精製され得る。さらに、精製を容易にするために、本明細書に記載される抗体を、本明細書に記載される、またはそれ以外の当技術分野では公知の異種ポリペプチド配列に融合させてもよい。

特定の態様では、本明細書に記載される抗体が単離される、または精製される。一般に、単離抗体とは、その単離抗体とは異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体である。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体の調製物は、細胞物質および／または化学物質前駆体を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、抗体の調製物を含み、ここで抗体は、それが単離される、または組換え生産される細胞の細胞構成要素から、分離されている。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体は、異種タンパク質（本明細書では「汚染タンパク質」とも呼ばれる）および／または抗体のバリアント、例えば翻訳後修飾の形態が異なる抗体を、（乾燥重量で）約30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、または0.1%未満しか有しない、抗体の調製物を含む。抗体または断片が組換え生産される場合、一般には、培養培地も実質的に含まず、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の体積の約20%未満、10%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、または0.1%未満しかない。抗体または断片が化学合成により生産される場合、一般には、化学物質前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、タンパク質の合成に関わる化学物質前駆体またはその他の化学物質から分離されている。したがって、抗体または断片のそのような調製物は、化学物質前駆体または関心対象の抗体もしくは断片ではない化合物を、（乾燥重量で）約30%未満、20%未満、10%未満、または5%未満しか有しない。いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体は、単離されている、または精製されている。

組成物
本明細書では、生理的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA）中、所望の純度を有する本明細書に記載される多重特異性抗体を含む、組成物が提供される。また、本明細書では、本明細書に記載される多重特異性抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物が開示される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度では、レシピエントに対し非毒性である。

本開示の薬学的組成物は、対象に投与された後、活性成分の速効性、徐放性、または遅延性の放出を提供し得、当業者には周知の方法を用いて製剤され得る。製剤は、錠剤、丸薬、粉末、サシェ、エリクシール、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟もしくは硬ゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末等の形態であり得る。好適な担体、賦形剤、および希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアゴム、アルギナート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油である。さらに、製剤は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料（favoring agent）、乳化剤、保存料等を追加で含み得る。

本明細書に記載される薬学的組成物は、多重特異性抗体の活性を強化し、誘導し、または活性化すること、および自己免疫病態または疾患などの疾患または病態を治療することに、有用であり得る。

インビボ投与に用いられる組成物は、無菌であり得る。このことは、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。

使用および方法
本明細書では、その必要のある対象において自己免疫疾患または病態を治療する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される多重特異性抗体または薬学的組成物を該対象に投与する段階を含む。治療され得る自己免疫疾患または病態としては、限定ではないが視神経脊髄炎スペクトラム障害、関節リウマチ、多発性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、ANCA関連血管炎、潰瘍性大腸炎、およびクローン病が挙げられる。

いくつかの局面では、本明細書では、対象において1つまたは複数の免疫機能または応答を調節する方法が提示され、該方法は、その必要のある対象に、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその組成物を投与する段階を含む。本明細書では、対象において1つまたは複数の免疫機能または応答を活性化する、強化する、または誘導する方法が開示され、該方法は、その必要のある対象に、多重特異性抗体またはその組成物を投与する段階を含む。いくつかの態様では、本明細書では、1つまたは複数の免疫機能または応答を活性化または強化することが望ましい、疾患を予防する、かつ／または治療する方法が提示され、該方法は、その必要のある対象に、本明細書に記載される多重特異性抗体またはその組成物を投与する段階を含む。特定の態様では、本明細書では、自己免疫疾患または病態を治療する方法が提示され、該方法は、その必要のある対象に、多重特異性抗体またはその組成物を投与する段階を含む。

本明細書では、対象における、自己免疫疾患もしくは病態の治療、1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の調節、1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の活性化、強化、もしくは誘導、または1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の活性化もしくは強化が望ましい疾患の予防および／もしくは治療のための、本明細書に開示される多重特異性抗体または組成物の使用も開示される。本明細書では、対象において、自己免疫疾患もしくは病態の治療、1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の調節、1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の活性化、強化、もしくは誘導、または1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の活性化もしくは強化が望ましい疾患の予防および／もしくは治療に使用される、本明細書に開示される多重特異性抗体または組成物も開示される。本明細書では、対象における、自己免疫疾患もしくは病態の治療、1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の調節、1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の活性化、強化、もしくは誘導、または1つもしくは複数の免疫機能もしくは応答の活性化もしくは強化が望ましい疾患の予防および／もしくは治療のための、医薬の製造のための、本明細書に開示される多重特異性抗体または組成物の使用も開示される。

いくつかの態様では、当技術分野では周知のアッセイ、例えばELISPOT、ELISA、および細胞増殖アッセイを用いると、本明細書に記載される多重特異性抗体は、対象における1つまたは複数の免疫機能または応答を、本明細書に記載される多重特異性抗体を投与されていない対象の免疫機能に対し相対的に、少なくとも99%、少なくとも98%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、もしくは少なくとも10%だけ、または10%～25%、25%～50%、50%～75%、もしくは75%～95%の範囲だけ、活性化する、または強化する、または誘導する。

投与経路および投与量
本開示の薬学的組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内、および筋内の投与経路を含め様々な投与経路を通して対象に投与され得る。

病態の治療および／または予防に有効な抗体または組成物の量は、疾患の性質によりけりであって、標準的な臨床技法により決定され得る。

本開示では、実際に投与される多重特異性抗体の量は、治療される疾患、選択される投与経路、患者の年齢、性別、および体重、ならびに疾患の重篤度、ならびに活性成分としての生理活性ポリペプチドのタイプを含め、様々な関連ファクターに鑑み決定される。本開示の多重特異性抗体は、極めて優れた血中の持続可能性を有するので、本開示の融合タンパク質を含むペプチド調製物の投与の回数および頻度は、著しく少なくなり得る。

組成物中に用いられる正確な用量も、投与経路および疾患の重篤度に左右され、医師の判断および各対象の状況にしたがい決定されるべきである。例えば、有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理状態（年齢、体重、および健康状態を含む）、患者がヒトなのか動物なのか、投与される他の医薬、またはその治療が予防用なのか治療用なのかによっても、様々であり得る。通常は患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含め非ヒト哺乳動物も治療され得る。治療の投与量は、安全性および効能を最適化するよう、最適に滴定される。

いくつかの態様では、本明細書に開示される多重特異性抗体の投与量は、0.1 mg/kg～100 mg/kg（対象の体重）、0.1 mg/kg～80 mg/kg（対象の体重）、0.1 mg/kg～60 mg/kg（対象の体重）、0.1 mg/kg～50 mg/kg（対象の体重）、0.1 mg/kg～40 mg/kg（対象の体重）、0.1 mg/kg～30 mg/kg（対象の体重）、0.1 mg/kg～20 mg/kg（対象の体重）、0.1 mg/kg～10 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～100 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～80 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～60 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～50 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～40 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～30 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～20 mg/kg（対象の体重）、1 mg/kg～10 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～100 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～80 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～60 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～50 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～40 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～30 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～20 mg/kg（対象の体重）、5 mg/kg～10 mg/kg（対象の体重）、または本明細書に含まれる任意の投与量もしくは範囲の投与量、例えば0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10 mg/kg（対象の体重）である。

特定の態様では、最適な投与量の範囲を特定する補助として、インビトロのアッセイを用いる。有効用量は、インビトロのまたは動物モデルの試験系に由来する用量応答曲線から推定され得る。

一般に、ヒト抗体はヒト体内で、他種由来の抗体よりも長い半減期を有し、それは外来ポリペプチドに対する免疫応答のせいである。したがって、ヒト抗体のより低い投与量およびより低い投与頻度が、しばしば可能である。

キット
本明細書では、本明細書に記載される1つまたは複数の抗体またはそれらの結合体を含むキットが提供される。いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に提供される1つまたは複数の抗体などの、本明細書に記載される薬学的組成物の1つまたは複数の成分を充填した、1つまたは複数の容器を含む、薬学的パックまたはキットが提供される。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載される薬学的組成物、および任意の予防剤または治療剤、例えば本明細書に記載されるものを含む。そのような容器には、製薬または生物由来製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された書式の注意書きが付属されてもよく、注意書きは、ヒトへの投与に関する製造、使用、または販売が該機関により承認されたことを反映するものである。本明細書では、上記の方法に使用され得るキットも提供される。いくつかの態様では、キットは、1つまたは複数の容器に入った本明細書に記載される抗体、例えば精製抗体を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されるキットは、対照として用いられ得る、実質的に単離された抗原（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む。他の態様では、本明細書に記載されるキットは、血清アルブミン抗原とは反応しない対照抗体をさらに含む。他の態様では、本明細書に記載されるキットは、抗体の血清アルブミン抗原との結合を検出するための1つまたは複数の要素を含む（例えば、抗体を、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物、もしくは発光性化合物などの検出可能な基質と結合させる場合があり、または第1の抗体を認識する第2の抗体を検出可能な基質と結合させる場合がある）。特定の態様では、本明細書に提供されるキットは、組換え生産された、または化学合成された血清アルブミン抗原を含み得る。キット内に準備される血清アルブミン抗原は、固体支持体に付着させることもできる。いくつかの態様では、上記のキットの検出手段は、血清アルブミン抗原を付着させた固体支持体を含む。そのようなキットは、付着させていない、レポーターで標識した抗ヒト抗体または抗マウス／ラット抗体も含み得る。抗体の血清アルブミン抗原との結合は、該レポーター標識化抗体との結合により検出され得る。

ここからは、いくつかの態様および添付の図面を参照しながら本開示を記載していく。以下の態様および図面は、例示目的でのみ提供され、添付の請求項に定められる本開示を限定する目的はない。

実施例1.材料および方法
1.遺伝子のクローニング
1-1. APB-A1（（抗CD40L scFv）₂-抗HSA Fab構造）のクローニング
標準的な遺伝子組換え法を用いて遺伝子クローニングを実施した。哺乳動物細胞に好適なコドン最適化により、hu5c8 scFv（SEQ ID NO:5）を合成した（Cosmo Genetech、韓国）。Macrogen（韓国ソウル）から市販されているプライマーを用いてクローニングを行い、最初のクローニングを、pcDNA3.3およびpOptiVECベクター（Thermo Fisher Scientific）に対して、フレキシブルリンカーによって合成hu5c8 scFvをSL335重鎖および軽鎖それぞれのN末端に連結することによりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を通して実施した。その後、ExpiCHO-S（商標）細胞株（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）でのタンパク質発現により、クローニングを特定した。次に、GSヌルCHO K1細胞株（Horizon Discovery、英国ケンブリッジ）から生産細胞株を確立するために、動物細胞発現ベクター、つまり重鎖についてはpd2535nt（Horizon Discovery）を、軽鎖についてはpd2539（Horizon Discovery）を用いて、クローニングを実施した。PCRは、全25サイクルを、95℃で30秒、61℃で30秒、および72℃で1分実施し、最後に5分間伸長させ、その後温度を4℃まで下げるという条件で、実施した。表1は、pcDNA3.3ベクターおよびpOptiVECベクターに挿入されたAPB-A1重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子をそれぞれpd2535ntベクターおよびpd2539ベクターにクローニングすることにより組換えベクターを生産するためのプライマーセットを示す。さらに、pGL3c（1b）（Satorius）プラスミドベクターを追加のベクターとして用いた。

（表１）

詳細には、PCRを上記のようにして実施し、約1600塩基対（bp）の長さのAPB-A1重鎖および軽鎖のPCR産物を得た。PCR産物の重鎖の両端およびpd2535ntベクターをBbsI（Thermo Fisher Scientific）で処理し、PCR産物の軽鎖の5'末端およびpd2539ベクターをBsrGI（Thermo Fisher Scientific）で処理し、PCR産物の軽鎖の3'末端およびpd2539ベクターを制限酵素BbsIで、それからT4 DNAリガーゼ（Takara、日本国）で処理した。その後、生産されたプラスミドで、大腸菌株DH5-アルファ（RBC、カナダ国）を、ヒートショックを加えることにより形質転換してから、midiprepキット（Macherey Nagel（商標）、独国）をメーカーのプロトコルに従い用いることにより精製し、ヌクレアーゼを含まない水を用いて溶出した。APB-A1の重鎖および軽鎖はそれぞれSEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42のアミノ酸配列を有することができ、ここでそれらのアミノ酸配列のN末端から104番目のアミノ酸はグリシン（G）またはグルタミン（Q）に対応している。

1-2. APB-B1（（抗CD40L scFv）₂-（抗HSA Fab）-（抗TNF-α Fv））のクローニング
（1）ヒト血清アルブミンに結合するFab遺伝子SL335、CD40Lに結合するルプリズマブscFv遺伝子、および生物活性エフェクター遺伝子を合成した。生物活性エフェクターは、抗TNF-α Fv（重鎖SEQ ID NO:6および軽鎖SEQ ID NO:7を有するセルトリズマブ）もしくは抗TNF-α dsFv（重鎖SEQ ID NO:8および軽鎖SEQ ID NO:9を有するセルトリズマブ）、抗IL-23 Fv（重鎖SEQ ID NO:10および軽鎖SEQ ID NO:11を有するウステキヌマブ）もしくは抗IL-23 dsFv（重鎖SEQ ID NO:12および軽鎖SEQ ID NO:13を有するウステキヌマブ）、または抗IFNAR1 Fv（重鎖SEQ ID NO:14および軽鎖SEQ ID NO:15を有するアニフロルマブ）もしくは抗IFNAR1 dsFv（重鎖SEQ ID NO:39および軽鎖SEQ ID NO:40を有するアニフロルマブ）であり得る。表2、3、および4は、APB-B1（Macrogen、韓国）を生産するためのPCRプライマーセットを提供する。

（表２）

（表３）

（表４）

scFv、Fab、dsFv、およびFv遺伝子それぞれを増幅するために、T100（商標）サーマルサイクラー機器（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で、Taq DNAポリメラーゼ（Takara、日本国）を用いて、30サイクルのPCRを実施し、各サイクルを、94℃で1分、60℃で1分、および72℃で1分という条件で実施した。次に、それぞれの連鎖反応産物を（scFv）₂-Fab-Fvまたは（scFv）₂-Fab-dsFvフォーマットとしてアセンブルするために、アセンブリーPCRを、94℃で1分、60℃で1分、および72℃で1分30秒というサイクリング条件で、実施した。PCRにより得られた重鎖アセンブル産物およびpD2535NTベクター（Horizon Discovery、英国）をBbsI制限酵素（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）で処理し、軽鎖アセンブル産物およびpd2539ベクター（Horizon Discovery）をBbs IおよびBsr GI制限酵素（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ）で処理した。それぞれの制限酵素で処理した連鎖反応アセンブル産物と、プラスミドベクターとを、T4 DNAリガーゼ（Takara）を用いて互いにアセンブルし、アセンブル産物を可溶性コンピテント細胞に入れてCaCl₂で処理した後、ヒートショックを加えて形質転換した。次に、この形質転換クローンを、カナマイシン抗生物質を含有する培養培地を用いて選別した。

さらに、組換えヒトCD40L（rhCD40L-his）を生産するために、上記と同様にしてクローニングアッセイを実施した。Cosmo Genetechにより合成された組換えヒトCD40L遺伝子（SEQ ID NO:38）を用い、制限酵素Xba I（Takara）およびNot I（Takara）を用いてpcDNA3.3（商標）（登録商標）ベクター（Thermo Fisher Scientific）にクローニングした。

（2）タンパク質は、CHO細胞を用いて一過性発現により生産された。SAFAベースの二重特異性抗体、および組換えヒトCD40Lタンパク質試料を生産するために、ExpiCHO細胞（Thermo Fisher Scientific）を、振とうインキュベーターで、37℃、140 rpm、5% CO₂、湿度80%という条件で、ExpiCHO発現培地（Thermo Fisher Scientific）を用いて、インキュベートした。一過性発現細胞を生産するために、細胞を濃度6.0×10⁶細胞/mlという条件で125 ml培養フラスコに播種し、該播種細胞に、配列が特定された3遺伝子（セルトリズマブ、ウステキヌマブ、およびアニフロルマブ）の重鎖および軽鎖が挿入されたプラスミドベクターpD2535NTおよびpD2539、ならびに組換えヒトCD40L遺伝子が挿入されたベクターpcDNA3.3-TOP（登録商標）を、ExpiFectamine CHO遺伝子導入キット（Thermo Fisher Scientific）を用いて遺伝子導入した。振とうインキュベーターで16時間インキュベートされた細胞を、ExpiCHOフィードおよびエンハンサーで処理した後、同条件で3日間インキュベーターでインキュベートした。インキュベーション3日目、ExpiCHOフィードを追加で与え、32℃、140 rpm、5% CO₂、湿度80%以上という条件でインキュベートした。インキュベーション9日目、培養培地を収集してから、4000 rpm、15分、4℃という条件で遠心処理し、そうすることによって細胞を培養培地から単離した。単離後の培養培地を0.2 μmフィルターシートで濾過し、そうすることによって不純物を除去した。

2.細胞株の生産
2-1. APB-A1の場合のGSヌルCHO K1細胞株
グルタミン合成（GS）-ヌルCHO K1細胞株（Horizon Discovery）を用いた。4mM L-グルタミン（Gibco、Thermo Fisher Scientific）を補充したCDfortiCHO（Thermo Fisher Scientific）培地を用い、該培養培地を、125 rpmの振とうインキュベーターで、湿度80%、5% CO₂、37℃という条件でインキュベートした。遺伝子導入は、Freestyle（商標）Max試薬（Invitrogen、Thermo Fisher Scientific）を、Horizon Discovery提供の標準的なプロトコルを改変した手順で用いて実施した。遺伝子導入は、全部で37.6 μgのプラスミドベクターを用い、軽鎖と重鎖とを1:1～1:3（pd2539:pd2535nt）の比で同時導入することにより、実施した。遺伝子導入の2日後、インキュベートされた細胞を取り出し、50 ml 円錐管（Nunc、デンマーク国）に移して遠心処理してから、L-グルタミンを含有しないCDfortiCHO培養培地に溶解した後、COUNTESS II自動細胞カウンター（Invitrogen、Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞濃度および生存率を特定した。50 μM メチオニンスルホキシミン（MSX）（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）を加え、部分選択を行った。それからさらに2日後、MSXを加えた細胞に10 μg/ml ピューロマイシン（Gibco）を加えてから、48時間インキュベートした。次に、インキュベートされた細胞を、沈殿細胞濃度が0.5×10⁶細胞/mlとならないように、L-グルタミンを含有しない培養培地に溶解し、それからMSXおよびピューロマイシンを足し合わせて全選択を行った。その後、2.0×10⁶細胞/mlを超えないように細胞濃度を維持し、細胞生存率が90%以上に達するまでインキュベーションを実施し、そうすることによって細胞株を生産した。

2-2. APB-B1の場合のGSヌルCHO-K1細胞株
4 mM L-グルタミンを補充したCD FortiCHO（Thermo Fisher Scientific）培養培地に播種したHD-BIOP3 GS-ヌルCHO-K1細胞（Horizon Discovery）を、濃度3.0×10⁵細胞/mlという条件で調製し、種培養を、振とうインキュベーターで、37℃、5% CO₂、湿度80%以上という条件で、1日かけて実施した。遺伝子導入のために、細胞を濃度4.8×10⁵細胞/mlで播種し、さらに1日インキュベートし、最終的に濃度1.0×10⁶細胞/mlとして調製した。播種細胞に、配列が特定されたセルトリズマブ関連SAFAベースの二重特異性抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を含むプラスミドベクター（pD2535NTおよびpD2539）を、OptiPRO SFM培養培地およびFreestyle max試薬（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて遺伝子導入してから、37℃、5% CO₂、湿度80%以上という条件で2日間インキュベートした。インキュベートされた細胞を、L-グルタミンを含有しないCD FortiCHO培養培地にすべて移してから、50 μmのメチオニンスルホキシミン（MSX）（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）および10 μg/ml ピューロマイシン（Thermo Fisher Scientific）で、2日の間隔で処理し、そうすることによってベクターを含有しない細胞を除去した。次いで、遠心処理器を用いて既存の培養培地を除去してから、7～10日の間隔でMSXおよびピューロマイシンを両方含有するCD FortiCHO培養培地で置き換え、21日間インキュベーションを実施して、細胞数を5.0×10⁵細胞/mlに維持した。21日後、細胞生存率が70%以上になると、細胞数を3.0×10⁵細胞/mlに維持するように培養を実施し、細胞生存率が90%以上になると継代培養生産を開始して継代培養0（ゼロ）ストックを得、ストック3が生産されるまで持続した。

3.タンパク質の単離、精製、および分析
3-1. APB-A1タンパク質
（1）ELISA
本開示により調製された組換えhCD40L抗原、rhCD40L（AprilBio、韓国チュンチョン）を、96-ウェルMaxiSorp ELISAプレート（Nunc）に、濃度100 ng/ウェルで、一晩、4℃で、炭酸コーティングバッファー（pH 9.6）を用いてコーティングした。プレートを、ブロッキングバッファー（Starting Block（商標）（PBS）（Thermo Fisher Scientific））で、室温で3時間かけて処理することにより、ブロックした。洗浄バッファー（リン酸緩衝食塩水 + 0.1% ツイーン20;0.1% PBST）で洗った後、GSヌルCHOK1細胞から生産された抗CD40L scFv）₂-抗HSA Fabという構造を有する、APB-A1と呼ばれる組換え抗体の上清を、希釈バッファー（0.1% PBST + 0.3% BSA;0.3% PBA）で連続希釈し、室温で1時間反応させた。西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ-抗ヒトFd抗体（Southern Biotechnology、アラバマ州バーミンガム）を二次抗体として用い、テトラメチルベンジジン（TMB）基質（BD science、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を用いて発光させた。吸光度は、ELISAリーダー（BMG Labtech、独国）を用いて、450 nmで測定された。PK ELISAを、rhCD40L抗原をPBS（Roman Industries、日本国）中濃度1 μg/mlに希釈してから、体積100 μlを、一晩、4℃でELISAプレートにコーティングして、実施した。翌日、各ウェルにブロッキングバッファー（PBS中0.3% BSA、300 μl）を加えて、25℃で3時間ブロッキングを実施し、体積100 μlの標準試料およびQC試料を各ウェルに移して、25℃で1.5時間反応させた。洗浄バッファー（300 μl/ウェル）で3回洗った後、抗ヒト軽鎖ヤギIgG-ビオチン（サル吸収（monkey absorbed）;Immuno-Biological Laboratories、日本国）を各ウェルに濃度100 μl/ウェルで加え、25℃で1時間反応させた。その後、4回洗った後、Pierce高感受性ストレプトアビジン-HRP（Thermo Fisher Scientific）を同じ体積・時間条件で反応させてから洗った。次に、体積100 μlの1-step ultra TMB-ELISA基質液（Thermo Fisher Scientific）を各ウェルに移し、室温で5分間反応させた。続いて、1 mol/L 硫酸（Wako Pure Chemical、日本国;100 μl/ウェル）を停止液として加えた後、マイクロプレートミキサーを用いて600 rpmで10秒間混合し、吸光度を450～650 nmで測定した。

（2）タンパク質精製
生産されたAPB-A1を発現するGSヌルCHO K1細胞株を、WAVEバイオリアクター（GE Healthcare）を用いて、CDfortiCHO培養培地で11日間インキュベートし、得られた上清および細胞ペレットを、4℃、4000 rpmで20分遠心処理し、培養上清を0.2 μmフィルターで濾過した。APB-A1タンパク質は、3工程のクロマトグラフィープロセスにより精製した。まず、CaptureSelect IgG-C_H1アフィニティーマトリックス樹脂（Life Technologies）用いてアフィニティークロマトグラフィー工程を実施した。5カラム体積（CV）のPBSでマトリックスを洗った後、流量20 ml/minで試料結合を実施した。標的タンパク質以外のタンパク質を除去するために、4 CVの高塩洗浄バッファー（PBS、500 mM NaCl、pH 7.4）および2 CVの低塩洗浄バッファー（25 mM リン酸ナトリウム、pH 7.6）を、流量25 ml/minで用いて、洗浄工程を実施した。溶出バッファー（20 mM クエン酸 pH 3.0、150 mM 塩化ナトリウム）を流量20 ml/minでマトリックスに通し、UVピーク50 mAU以上を有するタンパク質液を収集してから、250 ml容器に移し、1時間冷蔵保存した。収集したタンパク質液に1 M トリス-HCl（pH 8.0）液を加えることにより中和し、0.2 μmフィルターを用いて不純物を除去し、そうすることによってAPB-A1を溶出した。次に、陽イオン交換精製を、25 mMのリン酸ナトリウム（pH 7.6）溶液で平衡化したCapto（商標） SP ImpRes樹脂を用いて実施した。滅菌蒸留水で4x 希釈したアフィニティークロマトグラフィー溶出試料をカラムに結合させ、流量を5 ml/minに設定し、溶出バッファー（25 mM リン酸ナトリウム、pH 7.6、1 M 塩化ナトリウム）を用いて30%～50%～100%の溶出工程を実施した。各工程の溶出物を収集し、0.2 μmフィルターを用いてそこから不純物を除去した。続いて、POROSベースの陰イオン交換50 HQ樹脂を用いて陰イオン交換精製を実施した。まず、洗浄バッファー（2 M 塩化ナトリウム）を流量3 ml/minで樹脂カラムに通して洗い、5 CVの20 mM リン酸ナトリウム（pH 6.5）溶液を樹脂カラムに通して平衡化した。不純物を樹脂に結合させるために、20 mMのリン酸ナトリウム pH 6.5 バッファーで試料を透析し、pH レベルおよび塩濃度を調節した。試料を流量5 ml/minで樹脂カラムに通してタンパク質液を収集した後、0.2 μmフィルターを用いて不純物を除去し、得られたタンパク質を定量化し、分析した。

（3）タンパク質分析 - SDS-PAGE
精製されたAPB-A1タンパク質をSDS-PAGEで分析した。分析に用いた試料バッファー液は、LDS非還元試料バッファー（4x;Thermo Fisher Scientific）、および該非還元試料バッファーに5% メルカプトエタノールを加えて調製した還元試料バッファー（4x）であり、それぞれの試料バッファー液を試料と混合し、水浴させ、5分間煮沸してから、非還元煮沸条件および還元条件で分析した。さらに、非還元試料バッファー（4x）と試料とを1:4の比で混合し、熱処理を省いた非煮沸条件で分析を実施した。タンパク質試料を4～15%の勾配ゲル（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に濃度1 μg/ウェルでロードしてから、150 Vで50分かけて電気泳動させ、そうすることによってSDS-PAGE分析を実施した。電気泳動後に分離したゲルをEz-Gel染色液（DoGenBio、韓国）で1時間かけて染色してから、水で脱色した。

（4）タンパク質分析 - 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
精製されたタンパク質のサイズおよび純度を評価するために、SE-HPLC（分子ふるい高速液体クロマトグラフィー）をprominence HPLC（Shimadzu、日本国）およびTSK gel Ultra SW aggregateカラム（Tosoh Bioscience、日本国）を用いて実施した。試料を100 mM Na₂HPO₄、100 mM Na₂SO₄、および0.05%（w/v）NaN₃（pH 6.7）で希釈し、希釈試料50 μgを自動サンプルインジェクターで15℃で注入してから、移動相（200 mM リン酸、pH 6.7、0.05%（w/v）NaN₃（流量:0.5 ml/min）を用いて溶出した。UV吸光度を波長280 nmで測定した。

（5）タンパク質分析 - 質量分析
還元及び非還元APB-A1の分子量をLC-ESI MS分光測定を用いて測定してから、Dionex UHPLC（Thermo Fisher Scientific）およびQ-TOF 5600+ MS/MSシステム（AB SCIEX、米国カリフォルニア州）と組み合わせて分析した。Acquity UPLC（登録商標）BEH1 30 C4の1.7 μmカラムを用い、移動相[アセトニトリル（ACN; J.T. Baker）]を流量300 μl/minでカラムに通して、APB-A1の重鎖（H）および軽鎖（L）の質量を測定した。

（6）タンパク質分析 - 等電点電気泳動（IEF）
（4）精製されたタンパク質の等電点を評価するために、単離されたタンパク質のpl値を、等電点電気泳動ゲル（pH 3～10）を用いて測定した。試料1 μg、3 μg、および 5 μgを密度1 mg/mlでゲルにロードした後、等電点電気泳動を100 Vで1時間、200 Vで1時間、そして500 Vで2時間実施し、12% トリクロロ酢酸（TCA）染色およびクーマシー・ブリリアント・ブルー（CBB）染色を実施した後、ImageMaster（商標） 2D Platinum（GE healthcare、ver 5.0）により分析した。

（7）タンパク質分析 - チャージバリアント分析
APB-A1のチャージバリアントを分析するために、Protein-Pak HiRes CMを用いてイオン交換クロマトグラフィーを実施した。20 μgのタンパク質試料を自動サンプルインジェクターで30℃で注入してから、0～40%の勾配の移動相[25 mM 2-(Nモルホリノ)エタンスルホニック（MES）、500 nM NaCl、pH 6.5]を用いて30分かけて溶出した。流量は0.3 ml/minであり、UV吸光度を波長280 nmで測定した。

3-2. APB-B1タンパク質
（1）単離および精製
CHO細胞培養培地中に存在する二重特異性抗体タンパク質試料を精製するために、アフィニティークロマトグラフィー（AC）を、CaptureSelect IgG-C_H1アフィニティーマトリックス樹脂（Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド）およびAKTA pure 150 L機器（GE Healthcare、イリノイ州シカゴ）を以下のように用いて実施した。リン酸緩衝食塩水（PBS）（pH 7.4）バッファーを樹脂充填カラムに通して平衡化させ、一過性発現細胞から発現されたタンパク質を含有する培養培地を単離してから、流量1.5 ml/minで樹脂カラムに通した。その後、500 mM NaClを含有するPBS pH 7.4 バッファーをカラムに通して、樹脂に非特異的に結合した材料を洗った。各材料の平衡化および洗浄の工程は、10カラム体積（CV）で実施した。SAFAベースの二重特異性抗体を樹脂から溶出するために、150 mM NaClを含有する20 mM クエン酸 pH 3.0 バッファーを用いた。溶出されたバッファーを1 M トリス-HCl（pH 8.0）で処理して中和して中性のpHレベルとし、精製されたタンパク質の濃度をマイクロプレート分光光度計（BMG LABTECH、独国）を用いて、波長A280 nmで測定した。二重特異性抗体タンパク質試料を精製するために、アフィニティークロマトグラフィーの後、陰イオン交換クロマトグラフィー（AEX）を、QセファロースHP樹脂（GE Healthcare）を用いて、以下のように実施した。平衡化後、NaClが加えられていない約10 CVの20 mM クエン酸 pH 6.0 バッファーをQセファロースHP樹脂に通し、当初アフィニティークロマトグラフィーで精製されたタンパク質をこの樹脂に通してから、樹脂に結合しなかったタンパク質を回収した。回収されたタンパク質の濃度を、マイクロプレート分光光度計を用いて、波長A280 nmで測定した。ダイマーサイズの（scFv）₂-Fab-dsFv、つまりジスルフィド結合を含むSAFAベースの二重特異性抗体に対応するタンパク質、およびモノマーサイズ（インタクト体）に対応するタンパク質を単離するために、CMセファロースFF樹脂（GE Healthcare）をカラムに充填することにより陽イオン交換クロマトグラフィー（CEX）を実施した。精製前に、アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたタンパク質をNaClが加えられていない20 mM クエン酸 pH 6.0 結合バッファーで透析することにより、事前処理工程を実施した。約10 CVの結合バッファーを樹脂充填カラムに流量1.0 ml/minで通して平衡化してから、事前処理されたタンパク質を同じ流量で与え、樹脂と反応させた。次に、5 CVの結合バッファーを同じ流量でカラムに通し、3 CVの100 mM NaClを加えた結合バッファーをさらに与え、そうすることによって非特異的に結合した材料を洗って除去した。次に、120 mMのNaClを加えた結合バッファーを加えることにより、モノマー体として存在する二重特異性抗体タンパク質を樹脂から溶出した。精製されたタンパク質の濃度をA280 nmで測定した。組換えヒトCD40Lタンパク質試料を精製するために、Profinity（商標）IMAC（Bio-Rad）、Hitrap Q HP, 5 ml（GE Healthcare）、Hitrap SP HP, 5 ml（GE Healthcare）樹脂、およびAKTA pure 150 L機器を、3工程クロマトグラフィーの実施に用いた。まず、20 mMのリン酸ナトリウム pH 7.2 バッファーを3つの樹脂の平衡化および洗浄に用いた。タンパク質試料を溶出するために、500 mM イミダゾールを含有する20 mMのリン酸ナトリウム pH 7.2 バッファー（Sigma）をアフィニティークロマトグラフィーに用いた。タンパク質試料を、1 M NaClを含有する15 mMのリン酸ナトリウム pH 7.4 バッファーを用いて、陰イオンクロマトグラフィーおよび陽イオンクロマトグラフィーで精製した。精製されたタンパク質の濃度を、マイクロプレート分光光度計を用いてA280 nmで測定した。

（2）SDS-PAGE分析
まず、精製された二重特異性抗体タンパク質試料を、非還元4x SDS試料バッファー（Thermo Fisher Scientific）、および2-メルカプトエタノール含有還元試料バッファーで希釈した。非還元条件の場合、熱処理に左右されるタンパク質のタイプおよびサイズを比較するために、100℃で5分間加熱した試料および非加熱試料を調製し、またサイズの比較のために、タンパク質サイズマーカー（SMOBio、台湾）と（scFv）₂-Fabタンパク質試料とを一緒に処理した。調製されたタンパク質試料を、4～15%の15ウェルMiniprotein TGX precastゲル（Bio-Rad）に密度2 μg/ウェルでロードし、電気泳動を、トリス-グリシンSDS泳動用バッファー中、150 Vで1時間かけて実施した。電気泳動が完了すると、SDS-PAGEゲルをEZ-Gel染色液（DoGenBio、韓国）で1時間かけて染色し、蒸留水中で1日かけて脱色した。

（3）タンパク質融解温度の分析
二重特異性抗体タンパク質試料の熱安定性を評価するために、タンパク質融解温度を、疎水性色素（5000x、SYPRO Orange）、およびリアルタイムPCR機器としてLight Cycler 480 II（Roche、スイス国）を用いて分析した。タンパク質試料を、リン酸ナトリウム pH 7.0 バッファー中、濃度300 μg/mlに希釈してから、ultraAmp PCRプレート（Sorenson Bioscience、ユタ州ソルトレークシティー）に、5x 試薬およびSYPRO Orange色素を、各ウェルの終濃度が5.4 μg/ウェルに達するまで配置した。次に、励起フィルターおよび蛍光フィルターをそれぞれ465 nmおよび580 nmに設定し、20℃～85℃の範囲内で1℃/minの速度で上昇する温度による、タンパク質の変性を評価した。

（4）分子ふるい高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）
精製された二重特異性抗体の純度を、TSKgel UltraSW Aggregate 7.8 x 300 mmカラム（Tosoh Bioscience、日本国）、およびHPLC機器として1260 infinity II LCシステム（Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて分析した。試料を分析する前に、カラムおよびHPLC機器を、100 mMの20 mM クエン酸（pH 5.5）バッファーで平衡化した。分析すべき試料を20 mM クエン酸 pH 5.5 バッファーに希釈し、そして試料を最大25 μgの密度でカラムにロードした。SE-HPLC分析を、流量0.7 ml/min、最大圧力限界120 barという条件で、30分かけて実施し、吸光度をA280 nmで測定した。

（5）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
精製された二重特異性抗体試料の、ヒト血清アルブミン（Sigma-Aldrich）、組換えヒトCD40Lタンパク質、および組換えヒトTNF-αタンパク質（BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ）に対する結合反応を評価するために、ELISAを実施した。ヒト血清アルブミン、CD40Lタンパク質、およびTNF-αタンパク質を、炭酸ナトリウム pH 9.6 バッファー中、濃度1 μg/mlに希釈してから、各100 μlを96ウェルマキシソーププレート（Nunc、デンマーク国）の各ウェルに播種した後、4℃で1日かけてコーティングさせた。コーティングされなかったタンパク質およびバッファーを完全に除去し、次いで、3% 仔ウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma-Aldrich）および0.1% ツイーン-20を含有する各300 μlのPBS pH 7.4 バッファーを各ウェルに加えることにより、ブロッキングを実施した。2時間かけてブロッキングした後、0.1% ツイーン-20 PBSを含有するバッファー（PBS-T）（pH 7.4）各300 μlを加え、そのバッファーを全部で3回除去する、添加バッファーを完全除去するプロセスを繰り返し実施することにより、洗浄を実施した。洗浄後に残っていた水を除去した後、それぞれの抗体を、0.3% 仔ウシ血清アルブミンおよび0.1% ツイーン-20を含有するPBS pH 7.4 バッファー（0.3% PBA）中、濃度100 nMから1.0×10^-4 nMまで系列希釈して10倍低下させ、各100 μlの希釈抗体試料を各ウェルに加えて、室温で2時間反応させた。上記と同様にして洗浄した後、HRP結合ヤギ抗ヒトFd抗体（Southern Biotechnology、アラバマ州バーミンガム）を0.3% PBAバッファーに1:4000で希釈し、各100 μlの希釈抗体試料を各ウェルに加えてから、室温で1時間反応させた。洗浄後に反応する抗体の抗原特異性結合を評価するために、TMB基質（BD Bioscience、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を加えて反応させ、吸光度をマイクロプレート分光光度計を用いてA450 nmで測定した。

（6）バイオレイヤー干渉法（BLI）アッセイ
二重特異性抗体および個々の一特異性抗体の、ヒト血清アルブミン、CD40L、およびTNF-αに対する抗原親和性を、Octet Red機器（Forte Bio、カリフォルニア州フレモント）を用いて、バイオレイヤー干渉法（BLI）により評価した。まず、TNF-αタンパク質（30 μg/ml）、CD40Lタンパク質（10 μg/ml）、およびヒト血清アルブミン（20 μg/ml）を、pH 5.0の酢酸ナトリウムバッファーを用いて、アミン反応性第2世代（amine reactive second generation）（AR2G）バイオセンサー（Forte Bio）に固定化し、固定化されなかった材料を1 M エタノールアミン（pH 8.5）で除去してから、系列希釈濃度の二重特異性抗体を反応させた後、それぞれの抗原との結合定数および解離定数を測定した。さらに、二重特異性抗体の3抗原に対する同時結合能力を評価するために、CD40Lタンパク質（10 μg/ml）を、pH 5.0の酢酸ナトリウムバッファーを用いてAR2Gバイオセンサーに固定化し、二重特異性抗体（3.2 μg/ml）、ヒト血清アルブミン（13.2 μg/ml）、ヒト血清アルブミン（13.2 μg/ml）、そしてTNF-α（2 μg/ml）の順に、結合能力を測定した。評価結果を、DataAnalysis8ソフトウェアを用いて分析した。

（7）フローサイトメトリー分析
二重特異性抗体と細胞膜CD40Lとの結合を特定するために、FACSVerse機器（BD Biosciences、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を用いてフローサイトメトリー分析を実施した。細胞膜CD40Lを細胞表面に発現するD1.1細胞（CRL-10915、ATCC、バージニア州マナッサス）を、10% ウシ胎仔血清（Thermo Fisher Scientific）含有RPMI1640（Thermo Fisher Scientific）中インキュベートして、3.0×10⁵細胞／試験管を調製し、0.3% PBAバッファーで2回洗った。SAFAベースの二重特異性抗体および対照抗体を、洗浄された細胞と4℃で30分間、それぞれ反応させ、2回洗ってから、それに1:1000希釈の蛍光イソチオシアネート（FITC）結合ヤギ抗ヒトカッパ抗体（LifeSpan BioSciences, Inc.、ワシントン州シアトル）を加えた後、4℃で30分間反応させた。次に、洗浄工程を2回繰り返し、細胞膜CD40Lに対する抗体の結合反応を、FACSVerse機器を用いて評価した。

実施例2: APB-A1
1-1: バイオレイヤー干渉法を用いる結合アッセイ
ヒト血清アルブミン（HSA）（Sigma-Aldrich）とSL335との、およびrhCD40L抗原とAPB-A1とのリアルタイム結合アッセイを、Octet REDシステムを備えるバイオレイヤー干渉法を用いて実施した。HSA結合親和性を評価するために、20 μg/mlのHSAおよび10 μg/mlのrhCD40LをAR2Gバイオセンサー（pH 5.0）に固定化し、非結合分子を、キネティクスバッファー（1 M エタノールアミン、pH 8.5）を用いて、バイオセンサー表面から除去した。HSAおよびrhCD40Lに対するAPB-A1結合の親和性を特定するために、10 nM～0.3125 nMの濃度範囲で実験を行った。二重特異性結合を特定するために、rhCD40L抗原をAR2Gバイオセンサーに固定化し、まずは所定濃度のAPB-A1と反応させ、それからHSAに結合させる。結合および解離のキネティクスは、Octet QKソフトウェアを用いて得られた。結合速度定数は、観測された結合曲線が1:1結合モデルにフィットするように計算された。

1-2: APB-A1タンパク質とCD40L発現細胞との結合または不結合の決定
APB-A1タンパク質がCD40L細胞を発現するD1.1細胞に結合するのを確認するために、江原大学校薬学部でフローサイトメトリーが実施された。D1.1細胞を遠心処理して上清を除去してから、MACSバッファー（0.5% BSA、2 mM EDTAを含む1x PBS、0.22 μm濾過）中、濃度1.0×10⁶細胞/mlで再懸濁させた。各濃度の100 μlの細胞（1.0 10⁵細胞／試験）を1.5 ml試験管に播種した後、4℃、500x gという条件で遠心処理を5分間実施し、そうすることによって上清を除去した。APB-A1、hu5c8 IgG1、およびSL335を、各1 μg/mlという量から開始して、5つの時点で10分の1（1/10）ずつ連続希釈していき、各100 μlの最初の希釈抗体を、ピペットを用いて1.5 ml試験管の細胞ペレットに移した後、4℃で30分間インキュベートした。それぞれの試験管に各500 μlのMACSバッファーを加えてから、4℃、500x g、5分間という条件で遠心処理をすることにより洗った。上清を除去した後、各50 μlのMACSバッファー中1:1000希釈ヤギ-抗ヒトカッパ-FITC試料（Lifespan Biosciences、シアトル州ワシントン）を加えることにより細胞ペレットを溶解させた後、4℃で30分間インキュベートし、洗浄工程をもう1回繰り返した。上清を除去した後、200 μlの0.4% パラホルムアルデヒド（PBS中PFA）バッファーを加えることにより細胞ペレットを溶解させた後、4℃で貯蔵して固定化し、細胞をBD FACSverse機器で分析した。

1-3:インビトロのCD40-CD40L阻害の分析
CD40-CD40L相互作用をAPB-A1が阻害する効力を分析するために、HEKBlue（商標）CD40Lレポーター細胞（InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）を用い、そしてmCD40LおよびrhCD40Lを発現するD1.1細胞をCD40Lドナーとして用いた。0.2% 仔ウシ血清アルブミン含有ダルベッコPBSバッファー（Corning）に、20 M HSAを加えた、または加えていないバッファーを用い、APB-A1、hu5c8 IgG1、およびSL335を、濃度200 nMから開始して3分の1（1/3）ずつ希釈した。各20 μlの希釈試料を96ウェル細胞培養プレート（Corning）に播種した後、同体積の1×10⁴細胞／ウェルのD1.1細胞を加え、インキュベーターで、37℃、5% CO₂という条件で3時間インキュベートした。次に、HEKBlue（商標）CD40L細胞を、5×10⁴細胞／ウェルの密度で加えてから、インキュベーターで、同じ条件で21時間インキュベートした。24時間後、マルチピペットを用いて、上清各40 μlを、該プレートから他の96ウェルEIA/RIAプレート（Corning）に移した。各160 μlのQUANTI-Blue（商標）溶液（InvivoGen）を各ウェルに加え、各ウェルにホイルを巻いて光を遮断し、37℃、CO₂インキュベーターに1時間置いた後、吸光度を分光光度計を用いて655 nmで測定した。各70 μlの300 ng/ml rhCD40L抗原を、3試料を200 nMから開始して3分の1（1/3）ずつ同濃度に希釈して得られた70 μlの希釈試料の入った試験管に加え、そしてCO₂インキュベーターで37℃で30分間反応させた。次に、HEKBlue（商標）CD40L細胞を終濃度3.125×10⁵細胞/mlになるまで希釈した後、560 μlの希釈細胞を、rhCD40L抗原と混合された試料の入った試験管に加えてから反転させ、それから96ウェル細胞培養プレートに細胞を濃度200 μl/ウェルで蒔いた。D1.1細胞の場合と同じようにして21時間インキュベーションを実施し、得られた細胞を基質と反応させ、そうすることによって吸光度を評価した。

1-4:血小板凝集アッセイ
正常かつ健康なボランティアの事前同意を得たうえでヒト多血小板血漿（PRP）が採取され、韓国赤十字血液センター（KRBC）（大韓民国）から提供された。クエン酸デキストロース液（0.8% クエン酸、2.2% クエン酸ナトリウム、2.45% グルコース）中、抗凝固化されたPRPを、120x gで10分間遠心処理して赤血球を除去し、さらに360x gで15分間遠心処理してプレートペレット（plate pellets）を得た。血小板を少血小板血漿（PPP）に終濃度5.0×10⁸/mlで溶解させ、全手順を室温（23±2℃）で実施した。血小板凝集を評価するために、Chrono-log凝集測定器（CHRONO-LOG（登録商標）、ペンシルベニア州ヘイバータウン）を用いて、透過光血小板凝集検査を実施した。免疫複合体（IC）、つまりrhCD40L + hu5c8 IgG1（30 μg/ml + 60 ng/ml）、rhCD40L + APB-A1（30 μg/ml + 40 ng/ml）、またはrhCD40L、hu5c8 IgG1、およびAPB-A1それぞれを37℃の5～10 mM CaCl₂中に2分間入れた後、PRPを最適以下のADP濃度（CHRONO-LOG（登録商標））で、連続撹拌条件で5分間刺激した。凝集反応が完了すると、血小板混合物を遠心処理し、セロトニンEIAキット（Labor DiagnostikaNord、独国）をメーカーの指示通りに用いて上清からセロトニンの放出を測定した。

1-5:薬物動態（PK）分析および薬力学的（PD）分析
（1）PK分析
APB-A1の血清半減期を評価するために、カニクイザルモデル[Shin Nippon Biomedical Laboratories（SNBL、日本国）]で薬物動態分析を実施した。APB-A1タンパク質を、各群の3匹のカニクイザル（雄）それぞれに、1回の静脈内注射で用量5 mg/kg（第1群）または20 mg/kg（第2群）を投与した。投与後、血液試料が全17時点から収集された:1時点は投与前であり、16時点は、投与後0.25時間、1時間、2時間、6時間、および24時間、ならびに4日、7日、10日、13日、16日、19日、22日、25日、28日、34日、および40日であった。各カニクイザルの血小板に存在するAPB-A1の濃度をELISAにより測定した。

（2）PD分析
APB-A1が抗破傷風トキソイド（TT）抗体応答を抑制する有効性が分析された（Southern Research、アラバマ州バーミンガム）。ビヒクル（陰性対照群: 20 mmol/L リン酸ナトリウム、pH 6.5）、デキサメタゾン（DXT）（陽性対照群）、およびAPB-A1（5 mg/kgおよび20 mg/kg）の全4つの試料群を、カニクイザル（雌; n=3/群）に静脈内投与した。まず、抗TT抗体応答を誘発するために、1日目にTT（5 Lf）を1回目筋内投与し、20日目にブーストのため2回目筋内投与した。各1 mg/kgの用量のDXTを全4回、つまり1回目のTT注射の2日前、1回目のTT注射後1日目、5日目、および8日目に注射し、APB-A1を1回目のTT注射時（1日目）に1回注射した。分析すべき血液試料を、注射前、10日目、12日目、14日目、16日目、20日目、27日目、30日目、および40日目に収集し、抗TT IgG抗体値をELISAにより測定した。2回目の抗体応答の分析のため、様々なB細胞免疫表現型を免疫表現型検査により。血液試料を、TT注射の約2時間後、TT注射後20日目、27日目、30日目、および40日目の全5回収集し、収集された血液試料をK2-EDTAの入った試験管に貯蔵して、非注射部分からの血液凝固を防止した。免疫表現型検査を、CD45、CD20、CD27、Ki67、およびIgDなどのマーカーの抗体パネルを用いて実施し、CD45+/20+、CD45+/20+/Ki67+、CD45+/20-/27hi/IgD-、およびCD45+20+/27+IgD-/Ki67+を含め4細胞群の所定部分を免疫表現型検査に用いた。

実施例3: APB-B1
1-1:マウスL929細胞を用いてのTNF-α媒介細胞傷害性の阻害効果の試験
二重特異性抗体および親抗体（セルトリズマブFab'）の、可溶性TNF-αタンパク質阻害能力を比較するために、TNF受容体を細胞表面に発現するL929マウス細胞、および組換え可溶性TNF-αタンパク質を用いた。L929細胞（Korean Cell Line Bank）を、10% ウシ胎仔血清含有RPMI1640培養培地と一緒に、37℃、5% CO₂、湿度80%以上という条件でインキュベーターでインキュベートした。L929細胞を濃度5.0×10⁴細胞／ウェルという条件で96ウェル細胞培養プレート（Corning Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク市）に蒔いてから、同じ条件でインキュベーターで24時間インキュベートした。24時間のインキュベーション後、既存培養培地を除去し、10% ウシ胎仔血清含有RPMI1640培養培地に希釈した濃度1 μg/mlのアクチノマイシンD（Sigma-Aldrich）を各ウェルに与えてから、37℃、5% CO₂、湿度80%以上という条件でインキュベーターで30分間インキュベートした。次に、様々な濃度にしたがい系列希釈された抗体を各ウェルに与えてから、濃度10 ng/mlの組換え可溶性TNF-αタンパク質を与え、そして37℃、5% CO₂、湿度80%以上という条件でインキュベーターで24時間かけて反応させた。24時間の反応後、それぞれの反応物の入ったウェルに、10 μlのCCK-8（Dojindo、日本国）を、マルチチャンネルピペットを用いて移すことにより与えた。2時間の反応後、ピペットを用いて上清を別のプレートに移し、吸光度を波長A450 nmで測定した。

1-2: CD40L HEK-blue（商標）レポーター細胞を用いてのCD40LおよびTNF-αの阻害
二重特異性抗体および親抗体（ルプリズマブIgG1およびセルトリズマブFab'）の、細胞膜CD40Lおよび可溶性TNF-αタンパク質の一方または両方に対する同時阻害能力を分析した。これを達成するために、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）を発現するCD40L HEK-Blue（商標）レポーター細胞（InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）を用い、CD40LおよびTNF-α、細胞膜CD40Lを細胞表面に発現するD1.1細胞、ならびに組換え可溶性TNF-αタンパク質と反応させることにより、分析を実施した。CD40L HEK-Blue（商標）細胞を、10% ウシ胎仔血清および抗生物質（ノルモシン（Normocin）、ブラストサイジン、およびゼオシン）を含有するDMEM（Thermo Fisher Scientific）培養培地と一緒に、37℃、5% CO₂、湿度80%以上という条件でインキュベーターでインキュベートした。D1.1細胞を、同じ条件で、10% ウシ胎仔血清含有RPMI1640培養培地を用いて、インキュベーターでインキュベートした。次に、D1.1細胞を濃度5.0×10⁴ 細胞／ウェルという条件で96ウェル細胞培養プレートに蒔き、あるいは組換え可溶性TNF-αタンパク質を濃度10 ng/mlで96ウェル細胞培養プレートに蒔いた。2種類の試料に対する同時結合反応を評価するために、D1.1細胞および組換え可溶性TNF-αタンパク質を一緒に96ウェル細胞培養プレートに蒔いた。細胞および組換えタンパク質の一方または両方を蒔いた96ウェル細胞培養プレートに、系列希釈試料（ヒト血清アルブミンで事前処理済）を与えてから、37℃、5% CO₂、湿度80%以上という条件でインキュベーターで3時間かけて反応させた。3時間の反応後、プレートの全ウェルに、CD40L HEK-Blue（商標）細胞を濃度5×10⁴細胞／ウェルで与えてから、同じ条件でインキュベーターで21時間かけて反応させた。次に、37℃の水中で30分間反応させた各160 μlのQUANTI-Blue試薬（SEAP検出試薬、InvivoGen）を新しい96ウェル細胞培養プレートの全ウェルに播種し、QUANTI-Blue試薬の入った各ウェルにインキュベーターで21時間反応させた反応液40 μlを入れてから、反応させた。37℃のインキュベーターで1時間反応させた後、吸光度を波長655 nmで測定した。

実施例4. 結果
1. APB-A1の実験結果
（1）APB-A1の発現および生産
APB-A1を生産するために、hu5c8 scFv（V_L + V_H）-フレキシブルリンカー（SEQ ID NO:3 -

;リンカー1）-SL335 Fd（V_H + C_H1）（APB-A1重鎖と命名）遺伝子と、hu5c8 scFv（V_L + V_H）-フレキシブルリンカー（SEQ ID NO:4-

;リンカー2）-SL335カッパ（V_L + CL）（APB-A1 L軽鎖と命名）遺伝子とを、リンキングPCRにより連結した。それぞれpcDNA3.3およびpOptiVECベクターにクローニングした後、これらの遺伝子は一過性発現のためにExpiCHO-S（商標）細胞株に遺伝子導入され、101.7 kDa-APBA1（APB-A1 H鎖; 50.7 kDa-483アミノ酸およびAPB-A1 L鎖; 50.9 kDa-478アミノ酸）を正常発現するかどうかをウエスタンブロッティングにより特定した。次に、CHO細胞における安定発現のために、APB-A1 HおよびAPB-A1 L遺伝子をそれぞれpd2535ntおよびpd2539ベクターにクローニングして、組換えベクターを生産し（図1A）、アミノ酸配列決定により、異常のないことを確認した（図1B）。図1Aは、pd2535ntおよびpd2539ベクターに挿入されるAPB-A1重鎖および軽鎖を示す。図1Bは、APB-A1 H（全483アミノ酸）およびAPB-A1 L（全478アミノ酸）のアミノ酸配列を示し、それらはリンカー1およびリンカー2によりhu5c8 scFvが連結されたSL335 HおよびSL335 Lである。組換えベクターは、使用前にGSヌルCHO K1細胞に遺伝子導入され、そしてMSXおよびピューロマイシンを用いて選別され、そうすることによって安定CHO細胞株が構築された。インビトロおよびインビボの効果の評価に用いるAPB-A1タンパク質を生産するために、安定CHO細胞株をバイオリアクターで培養し、上清を得て、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーを含む全3工程により精製を実施した。第1工程としてのアフィニティークロマトグラフィーにより、APB-A1タンパク質が95%以上の収率で得られ、不純物およびエンドトキシンを除去する第2および第3工程の陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、APB-A1試料が収率82%で得られた。次に、タンパク質の純度を評価するために、SE-HPLCをネイティブ条件で実施し、全3回の反復実験の結果により、完璧なAPB-A1試料が95%以上の純度を有したことが確認され、図2Aはその反復実験の一つを示している。精製プロセスによって得られた試料の純度および分子量を特定するために、得られた試料を、SDS-PAGEにより、還元、非還元（煮沸）、および非還元（非煮沸）条件で分析した（図2B）。したがって、図2Aは、HPLCにより特定されたAPB-A1の特徴の分析結果を示し、図2Bは、SDS-PAGEにより特定されたAPB-A1の特徴の分析結果を示す。精製GSヌルCHO K1細胞培養培地の上清から精製されたAPB-A1の特徴を、4～15%勾配ゲルで、還元（R）、非還元（煮沸）（NR（B））、および非還元（非煮沸）（NR（NB））条件で、（A）HPLCおよび（B）SDS-PAGEにより特定した。図2AのHPLC分析では、タンパク質試料をSE-HPLCによりネガティブ条件（DTTなし）で分析した。純度は95%以上であった。図2Bに示すSDS-PAGEゲルでは、タンパク質バンドをEz-gel染色液により可視化した。上述したように、APB-A1 H（50.7 kDa）およびAPB-A1 Lポリペプチド（50.9 kDa）の理論分子量は、それぞれ50.7 kDaおよび50.9 kDaであった。還元（R）条件では、分子量サイズ50 kDaのあたりに2つのタンパク質バンドが特定されたが、APB-A1 Hポリペプチドの分子量とAPB-A1 Lポリペプチドの分子量とは互いによく似ているので、2つのバンドを正確に区別することは極めて難しかった（図2BのレーンR）。非還元（煮沸）条件では、2つのバンドが還元条件の場合よりもわずかに小さいサイズの位置に特定され[図2BのレーンNR（B）]、2つのバンドのうちAPB-A1 HバンドがAPB-A1 Lバンドよりわずかに高い位置に位置することが、ウエスタンブロッティングによって確認された（データ表示せず）。非還元（非煮沸）条件では、特定されたAPB-A1が、その理論分子量サイズよりも小さい分子量サイズを有することが確認された（101.6 kDa）[図2BのレーンNR（NB）]。

（2）APB-A1の分子特徴
APB-A1タンパク質の質量を正確に測定するために、還元条件および非還元条件でQ-TOF分析を実施した。測定されたAPB-A1の重鎖（H）および軽鎖（L）の質量は、50.77 kDaおよび50.98 kDaであった（図3）。図3では、精製されたAPB-A1タンパク質の特徴を質量分析機器（ProteomeTech、韓国）を用いて特定した。質量分析では、タンパク質試料を還元条件および非還元条件で分析した。APB-A1重鎖および軽鎖の理論分子量は、50,777 Daおよび50,994 Daであり、それらは本例の質量分析により測定された値と実質的に同じであった。グリコシル化予想ソフトウェアを用いて確認するとAPB-A1がN連結グリコシル化部位を有しなかったこと、およびQ-TOF分析ではAPB-A1のHおよびLのピークのほかは特にピークが観測されなかったことを考慮すると、APB-A1はN連結グリコシル化を含まないであろうと予測された。pI分析ソフトウェアを用いて得られた分析結果から確認すると、APB-A1は理論pI値8.65を有し、pH 3～10の等電点電気泳動、およびキャピラリー等電点電気泳動（cIEF）の実測値は、それぞれ9.16および9.2であった（図4Aおよび図4B）。図4Aおよび図4Bでは、精製APB-A1タンパク質のpl分析が、ProteomeTechにより実施された。図4Aに示される等電点電気泳動（IEF）ゲルによりpH 3～10で特定されたpI値、および図4Bに示されるキャピラリー等電点電気泳動（cIEF）により特定されたpI値は、それぞれ9.16および9.2であった。APB-A1のチャージバリアントを正確に分析するために、超高パフォーマンス液体クロマトグラフィー（UPLC）を用いてチャージバリアント実験を反復的に行い、UPLCアッセイの結果、試料の76.3%がコンスタントな電荷を有するメインピークを有すること、4.6%が酸性ピークを有し、19.1%が塩基性ピークを有することを示す、ピークプロファイルが得られた（図5）。

（3）APB-A1のインビトロの機能特徴
APB-A1のHSAおよびrhCD40L抗原に対する結合親和性を評価するために、Octet Red機器を用いてバイオレイヤー干渉法を実施した。評価結果から、APB-A1のHSAおよびrhCD40L抗原に対する解離定数KDが、それぞれ748 pMおよび127 pMであることが確認された。したがって、APB-A1-HSAの平衡解離定数（K_D）はSL335-HSAのK_Dより約2.6倍大きいこと（それぞれ748 pMと286 pM）、そしてAPB-A1-rhCD40Lの解離定数はhu5c8 IgG1-rhCD40LのK_Dより約2.6倍大きいこと（それぞれ127 pMと49.6 pM）が確認された。

APB-A1のHSAおよびrhCD40L抗原に対する結合親和性を確認するために、再びOctet Red機器を用いてバイオレイヤー干渉法を実施した。評価結果から、APB-A1のHSAおよびrhCD40L抗原に対する平衡解離定数（K_D）は、それぞれ628 pMおよび186 pMであることが確認された。2つの結果の平均を表5に提供する。

（表５）

それに加えて、APB-A1がHSAおよびrhCD40L抗原に同時結合することを特定するために、rhCD40L抗原をAR2Gバイオセンサーに固定化しておいて、それとAPB-A1およびHSAを順に反応させるようにして、バイオレイヤー干渉法を実施した。結果として、APB-A1がHSAおよびrhCD40L抗原に同時結合する能力があることが確認された（図6）。細胞ベースのインビトロ評価のために、mCD40Lを発現するD1.1細胞を用い、予備実験として、対照群としてのAPBA1およびhu5c8 IgG1が、D1.1細胞が発現したmCD40Lに結合するかどうかを、フローサイトメトリー分析により特定した。分析結果によると、陰性対照群としてのSL335はD1.1細胞のmCD40Lに結合しなかったが、APB-A1およびhu5c8 IgG1は結合したことが確認された（図7）。図7では、APB-A1（a）およびhu5c8 IgG1（b）を、mCD40Lを発現するD1.1細胞に結合させ、D1.1細胞に結合しないSL335（c）を陰性対照群として用いた。次に、APB-A1がCD40-CD40L相互作用を抑制する効力を特定するために、HEKBlue（商標）CD40Lレポーター細胞を、D1.1細胞またはrhCD40L抗原と、HSAありまたはなしで組み合わせてから、APB-A1、hu5c8 IgG1、およびSL335（0.01～22.2 nMの範囲の濃度）をそれに加えることにより反応させた後、レポーター細胞のアルカリホスファターゼ（AP）応答を測定した（図8A～8D）。図8A～8Dでは、APB-A1およびhu5c8 IgG1がCD40L-CD40相互作用をHSAの非存在下で阻害する能力は0.9907 nMおよび0.289 nM（図8B）であり、HSAの存在下では1.031 nMおよび0.4729 nMであった（図8A）。APB-A1およびhu5c8 IgG1がHSAの非存在下で可溶性CD40LとCD40との相互作用を阻害する能力のIC₅₀値は、1.031 nMおよび0.4729 nM（図8D）であり、HSAの存在下では0.6371 nMおよび0.501 nMであった（図8C）。レポーター細胞とD1.1細胞との組み合わせを用いた実験では、APB-A1は低い抑制効力を実証し、HSAの非存在下ではhu5c8 IgG1より約3倍低いが、HSAの存在下では、APB-A1とhu5c8 IgG1とは実質的に同じ抑制有効性を実証した（図8Aおよび図8B）。同様に、レポーター細胞とrhCD40L抗原との組み合わせを用いた実験では、APB-A1の抑制効力は、HSAの非存在下ではhu5c8 IgG1より約2.1倍低かったが、HSAの存在下では、APB-A1とhu5c8 IgG1とは実質的に同じ抑制有効性を実証した（図8Cおよび図8D）。なお、陰性対照として用いられたSL335は、どの条件でも抑制有効性が実証されなかった（図8A～8D）。D1.1細胞を用いる場合、図8Aおよび図8Bに示す結果から得られたCD40L-CD40相互作用阻害能力を示すIC₅₀値はそれぞれ、HSAの非存在下では0.9907 nM、HSAの存在下では0.2988 nMであった。陽性対照としてのhu5c8 IgG1のIC₅₀値は、約0.2～0.3 nMと特定され、HSAの存在または不存在はhu5c8 IgG1のIC₅₀値に影響しなかったことが示唆された（図8Aおよび図8B）。rhCD40L抗原を用いた場合、IC₅₀値は、HSAの非存在下では1.031 nM、HSAの存在下では0.6371 nMであり、hu5c8 IgG1のIC₅₀値は約0.47～0.5 nMと特定され、それは上記の実験の結果と実質的に同じであった（図8Cおよび図8D）。

（4）APB-A1が血小板凝集に及ぼす効果の分析
従来の抗CD40L IgG抗体の典型的な副作用として知られる血小板凝集が、APB-A1によってもたらされたかどうかを判定した。これを達成するために、rhCD40L hu5c8 IgG1 ICおよびrhCD40L + APB-A1 ICを生産してから、ADPで刺激した血小板と反応させ、そうすることによって、血小板凝集の発生について、透過率の測定により決定した。結果は、rhCD40L hu5c8 IgG1 ICだけが、血小板凝集を強度に刺激したことを示した（図9A～9D）。図9A～9Dでは、PRPを、hCD40L（30 μg/ml）と、異なる濃度のhu5c8 IgG1（6 ng/ml、60 ng/ml、および600 ng/ml）または異なる濃度のAPB-A1（4 ng/ml、40 ng/ml、および400 ng/ml）と一緒に、5～10 mM CaCl₂の存在下、37℃で2分間、事前に培養した。次に、最適濃度に満たない濃度のADPで、連続撹拌しながら血小板をさらに刺激した。試料hu5c8 IgG1 + rhCD40L ICの場合、血小板凝集が生じた（図9Aおよび図9B）が、試料rhCD40L + APB-A1の場合は血小板凝集率が低かった（図9Cおよび図9D）。データは、少なくとも6つの異なるドナーを用いた実験の標準偏差（SD）を示している。図9A～9Dに示す結果を定量分析するために、血小板凝集%を計算し、この計算結果によると、試料rhCD40L + hu5c8 IgG1 ICは、濃度60 ng/mlおよび600 ng/mlで約80%以上の応答を実証したが、試料rhCD40L + APB-A1は、濃度400 ng/mlで約10%未満の血小板凝集を実証した（図9D）。それに加えて、血小板が活性化されたときの放出セロトニンの濃度を測定し、その評価結果は、rhCD40L + APB-A1および他の試料群による活性化ではセロトニン放出レベルは増加しなかったが、rhCD40L + hu5c8 IgG1 ICによる活性化では、セロトニン放出レベルが約300 pg/mlまで増加したことを示した（図10）。図10では、放出されたセロトニンの量が、組換えrhCD40L + hu5c8 IgG1の場合は増加したが、他の群では有意差が観測されなかった。データは、4以上の独立実験の平均値±標準偏差（SD）を示す（***p<0.001、IC（組換えhCD40L + hu5c8 IgG1）対照との比較）。

（5）APB-A1の薬物動態調査
APB-A1のインビボの半減期を評価するために、カニクイザルモデル（n=3/群）を用いて薬物動態アッセイを実施した。APB-A1を、5 mg/kgおよび20 mg/kgの2つの投与量で、1回の静脈内注射により投与した。材料および方法のセクションに記載したのと同じ時点で血液試料を収集した後、血漿中のAPB-A1の濃度をPK ELISAを用いて測定した（図11）。図11では、精製されたAPB-A1抗体を雄のカニクイザル（n=3）に様々な濃度（5 mg/kgおよび20 mg/kg）で注射した。実験はSNBLにより実施された。それぞれの時点の試料のAPB-A1濃度をELISAにより測定し、データは実施した実験の平均を示している。半減期は、ELISAの結果に基づき、Phoenix WinNonlinソフトウェア（ver 6.4; Certara LP、米国ニュージャージー州プリンストン）を用いて計算され、5 mg/kg APB-A1および20 mg/kg APB-A1の半減期はそれぞれ約7日および9.6日と特定された。したがって、APB-A1の半減期は、用量20 mg/kgで、用量5 mg/kgよりも約1.4倍長くなった、と理解された。Cmax値は、用量5 mg/kgおよび20 mg/kgでそれぞれ143 μg/mlおよび509 μg/mlであり、直腸クリアランス（CL）速度は4.44 ml/日/kgおよび4.72 ml/日/kgと、用量に関わらず同レベルであった（表6）。

（表６）

（6）APB-A1薬力学アッセイ
APB-A1のインビボの効力を評価するために、カニクイザル（n=3/群）を用いて薬力学調査を実施した。まず、動物にTTを2回筋内注射して、初回およびメモリー抗TT抗体免疫応答を誘導し、そして各動物にビヒクル（陰性対照、1回の単用量注射）、陽性対照（DXT; 1 mg/kg、4用量注射）、およびAPBA1（5 mg/kgまたは20 mg/kg、1回の単用量注射）を静脈内投与し、血清中に産生される抗TT IgG抗体の濃度をELISAにより測定した。結果として、単用量TT注射で誘導した初回抗TT IgG免疫応答は統計学的に有意ではなかったが、ビヒクル対照は通常の初回抗TT IgG免疫応答を誘導し、一方、DXT注射群およびAPB-A1注射群では初回抗TT IgG免疫応答は観測されなかった（図12A）。図12Aおよび図12Bでは、メモリー抗体応答の阻害を分析するために、雌のカニクイザル（n=3）に、ビヒクル、DXT、およびAPB-A1（5 mg/kgおよび20 mg/kg）とともに破傷風トキソイド（TT）を注射した。これらの実験はSNBLにより実施された。（A）抗TT抗体レベルをELISAにより測定した。（B）メモリーB細胞のパーセンテージは、5 mg/kg APB-A1群でも20 mg/kg APB-A1群でも有意に低下した（ビヒクル対照に対しt検定により、* p<0.03）。初回TT注射の20日後、メモリー抗TT IgG免疫応答を誘導するために2回目のTT注射を実施し、それから血清中に産生された抗TT IgG抗体の濃度を測定した。結果として、2回目のTT注射後、ビヒクル対照群およびDXT群に通常の抗TT IgG免疫応答が現れ、APB-A1注射群は、2回目の抗TT IgG免疫応答を用量依存式に阻害する統計学的に有意な効果を27日目に実証した。当初のCD40-CD40L応答から、APB-A1が抑制効力を有したことが確認され、それぞれの群の集団パーセンテージを免疫表現型検査により比較した。メモリーB細胞（CD45+20+/27+IgD-/Ki67+）およびB細胞の分裂集団（CD45+/20+/Ki67+）は、2回目のTT注射後27日目まで、統計学的に有意なAPB-A1の抑制効力を実証した（図12B）。形質細胞（CD45+20-/27hi/IgD-）および全B細胞（CD45+/20+）のアッセイでは、群間に差がないことが確認され、ビヒクル対照の全般的な阻害効果は、30日目および40日目に漸減した（データ表示せず）。

2. APB-B1の実験結果
（1）SAFAベースの二重特異性抗体の生産
SAFAベースの二重特異性抗体を生産するために、重鎖のC_H1（ヒンジ領域、EPKSC-）と軽鎖のCL（NRGEC-）との間の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインをセリン（Ser）で置換し、得られたSL335 Fabの変異体、2つの鎖間ジスルフィド結合が除去されているEPKSS-およびNRGES-を用いた。ヒトCD40Lに結合するscFv抗体断片[ルプリズマブ（またはhu5c8）に由来するV_H遺伝子配列およびV_L遺伝子配列を有する]を、SL335 Fabの重鎖および軽鎖のN末端に、(GGGGS)3または

ペプチドリンカーを用いて融合し、そして、TNF-αに結合するFv抗体断片（セルトリズマブペゴルに由来するV_H遺伝子配列およびV_L遺伝子配列を有する）、IL-23に結合するFv抗体断片（ウステキヌマブに由来するV_H遺伝子配列およびV_L遺伝子配列を有する）、およびINFAR1に結合する抗体断片（アニフロルマブに由来するV_H遺伝子配列およびV_L遺伝子配列を有する）を、SL335 FabのC末端に、ペプチドリンカーを用いてそれぞれ融合した。Fv融合の場合、C末端の重鎖V_H断片とC末端の軽鎖V_L断片とを融合した。FvのV_H断片とV_L断片との間に形成された人工的な鎖間ジスルフィド結合の存在または不存在による抗体機能を比較するために、ジスルフィド結合なしの（scFv）₂-Fab-FvフォーマットをV_HのG44C（G542C、図14）およびV_LのQ100C（Q593C、図13A）で置換し、そうすることによってそれぞれジスルフィド結合を有する（scFv）₂-Fab-dsFvフォーマットを形成した。図13Aおよび図13Bでは、抗CD40L scFv、抗HSA Fab、および抗TNF-α Fv（ジスルフィド結合あり、またはなし）を有する、APB-B1a（a）、（scFv）₂-Fab-Fv構築物と、APB-B1b（b）、（scFv）₂-Fab-dsFv構築物とが、（GGGGS）3（SEQ ID NO:3）および

ペプチドリンカーにより連結されている。（scFv）₂-Fab-dsFvは、抗TNF-α dsFv断片の可変軽鎖（V_L）と可変重鎖（V_H）との間に鎖間ジスルフィド結合（ss）を含むが、（scFv）₂-Fab-Fvは、鎖間ジスルフィド結合を含まない。図13Cは、DNAクローニング後の組換えpD2539および組換えpD2535NTを示す図である。ここで、セルトリズマブに由来するFvおよびdsFvと融合させた二重特異性抗体は、それぞれAPB-B1aおよびAPB-B1bと命名された（図13Aおよび図13B）。

図14では、APB-B1bの重鎖と軽鎖との間の鎖間ジスルフィド結合として、重鎖のG542C残基と、軽鎖のQ593C残基とが、ボールド体で示されている。ペプチドリンカーの残基[(GGGGS)3および

]に下線が引かれている。こうして生産されたSAFAベースの二重特異性抗体タンパク質は、最大128 kDaの理論サイズを有し、CHO細胞発現系を利用するために、APB-B1aまたはAPB-B1bを構築する2つのポリペプチドコード遺伝子（N'-抗CD40L scFv-SL335 H鎖-抗TNF-α V_H-C'およびN'-抗CD40L scFv-SL335 L鎖-抗TNF-α V_L-C'）を、哺乳動物発現ベクターであるpD2535NTベクターおよびpD2539ベクターにそれぞれクローニングし、そうすることによって、組換えpD2535NTベクターおよび組換えpD2539ベクターを生産した（図13C）。ウステキヌマブ遺伝子およびアニフロルマブ遺伝子に由来するSAFAベースの二重特異性抗体を上記と同様にしてクローニングし、そうすることによって組換えpD2535NTベクターおよび組換えpD2539ベクターを生産した（データ表示せず）。

SAFAベースの二重特異性抗体タンパク質を生産するために、生産された組換えpD2535NTベクターおよび組換えpD2539ベクター、ExpiCHO細胞およびHD-BIOP3 GSヌルCHO-K1細胞を、一過性発現および安定プールの生産に用いた。組換えCHO細胞をフラスコで7～9日間培養してから遠心処理し、そうすることによって細胞生存率90%の培養培地を得た。一過性発現の発現量という点では、セルトリズマブ、ウステキヌマブ、およびアニフロルマブ遺伝子に由来する3つのSAFAベースの二重特異性抗体のすべてで、ジスルフィド結合なしの（scFv）₂-Fab-Fv構築物の発現量は、ジスルフィド結合ありの（scFv）₂-Fab-dsFv構築物よりも、1.5～3倍高かった。安定プールで生産したAPB-B1a断片をフラスコで7日間培養し、約150 mg/Lを得た。

（2）SAFAベースの二重特異性抗体の生産
アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたSAFAベースの二重特異性抗体のサイズおよびパターンを比較するために、図15に示す還元条件および非還元条件でSDS-PAGE分析を実施した。還元条件では、60～75 kDaの位置にタンパク質バンドが観測され、それは（scFv）₂-Fab-Fv断片および（scFv）₂-Fab-dsFv断片の重鎖および軽鎖であるscFv-Fab H鎖-Fv V_Hおよび（scFv-Fab L鎖-Fv V_L）それぞれの理論サイズ、つまり64 kDaと一致し（図15A）、（scFv）₂-Fabの重鎖および軽鎖のバンドは45～60 kDaの位置に特定された（図15A）。なお、非還元（煮沸）条件では、重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合の形成されていない（scFv）₂-Fab-Fvの重鎖および軽鎖に対応する2つのタンパク質バンドが、還元条件の場合のように、60～75 kDaの位置に観察され、重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合の形成されている（scFv）₂-Fab-dsFvの場合は、1つのタンパク質バンドが100～140 kDaの位置に観察され、それは理論サイズ128 kDaの範囲内であった（図15B）。非還元（非煮沸）条件では、（scFv）₂-Fab-Fvの場合、約130 kDaのサイズの位置に1つのバンドが観測され、それは重鎖および軽鎖のサイズの和に対応し、また、非還元（煮沸）条件の場合のように、別々に位置する重鎖および軽鎖の2つのタンパク質バンドも、60～75 kDaの範囲の位置に、予想外に観測された（図15C）。図15A、図15B、および図15Cは、還元、非還元、および非還元（非煮沸）条件でそれぞれ実施されたSDS-PAGE分析の結果を示す。（1）（scFv）₂-Fab、（2）セルトリズマブ関連BsAb（APB-B1）、（3）ウステキヌマブ関連BsAb、（4）アニフロルマブ関連BsAbを含む4つのSAFAベースの試料を、最高2 μgの様々な量で、各ウェルにロードした。図15Dは、精製された（scFv）₂-Fab-Fv（最高25 μg）構築物の分子ふるいHPLC分析を示す。（scFv）₂-Fab-dsFvのダイマーを矢印で示す。（scFv）₂-Fab-dsFv構築物の場合、別々に位置する重鎖および軽鎖のバンドは可視化されなかったが、100～140 kDaの範囲の位置に2つのバンドが観測され、また、1つのタンパク質バンドが、245 kDと同じかまたはもっと高い位置に特定され、おそらく（scFv）₂-Fab-dsFvダイマーの位置に対応すると思われた。非還元（非煮沸）条件のSDS-PAGE結果を特定するために、それぞれネイティブ条件の（scFv）₂-Fab-Fvタンパク質および（scFv）₂-Fab-dsFvタンパク質の結果をSE-HPLCで分析し、その分析結果は、SDS-PAGE（矢印で示す）にあるように、（scFv）₂-Fab-dsFvタンパク質が少量の（scFv）₂-Fab-dsFvダイマーを含んでいたことを示した。（scFv）₂-Fab-Fvの場合、モノマー位置にだけピークが1つ現れ、SDS-PAGEでは別々に位置するとして特定された重鎖および軽鎖に対応するピークは観測されなかった（図15D）。したがって、SDS-PAGE実験の非還元（非煮沸）条件で（scFv）₂-Fab-Fvタンパク質試料により示された、別々に位置したポリペプチドの重鎖および軽鎖は、重鎖と軽鎖との間に存在した非共有結合の部分切断によって2つのバンドとして観測されたと考えられ、それはSDS-PAGE実験に存在したSDSまたは実験中にタンパク質に伝わった熱によるものである。

（3）SAFAベースの二重特異性抗体タンパク質の精製
アフィニティークロマトグラフィーにより単離されるAPB-B1aタンパク質およびAPB-B1bタンパク質の精製前に、SDS-PAGEおよびSE-HPLCを用いてタンパク質試料を分析した（図15A～15D）。APB-B1bのダイマー位置（最高245 kDa）に特定されたタンパク質を除去するために（図15Cおよび図15D）、CMセファロースFF樹脂を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。アフィニティークロマトグラフィーでのみ高純度で特定されたAPB-B1aタンパク質試料に、QセファロースHPを用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。それぞれの精製工程は、AKTA pure 150 Lシステムを用いて実施され、最終的な精製産物はSE-HPLCにより決定された。アフィニティークロマトグラフィー後に生じたダイマー位置の未除去APB-B1bタンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに除去し（図16B）、保持時間の一時点でAPB-B1aのものと似たピークが特定された（図16A）。図16Aおよび16Bでは、SAFAベースの構築物がTSKgel UltraSW aggregationカラム（20 mM クエン酸 pH 5.5 バッファー中）でネイティブ条件で、280 nmで分析された。APB-B1a（a）が、CaptureSelect IgG-C_H1アフィニティークロマトグラフィーおよびQセファロースHP陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製された。APB-B1b（b）が、CaptureSelect IgG-C_H1アフィニティークロマトグラフィーおよびCMセファロースFF陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製された。

（4）タンパク質安定性のためのジスルフィド結合の存在および最適pHバッファーによるタンパク質安定性の比較
（scFv）₂-Fab-Fvタンパク質および（scFv）₂-Fab-dsFvタンパク質の、Fvの鎖間ジスルフィド結合の存在または不存在による安定性を比較するために、セルトリズマブ、ウステキヌマブ、およびアニフロルマブ遺伝子に由来する3つの種のSAFAベースの二重特異性抗体を、リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）中、20℃から90℃まで徐々に熱処理していき、リアルタイムPCRプロセスを用いて、疎水性アミノ酸に結合させたSYPRO Orange色素を用いてタンパク質変性温度を測定した。結果は、タンパク質変性温度は3種類のSAFAベースの二重特異性抗体のFvクローンにより異なることを示したが、（scFv）₂-Fab-Fvおよび（scFv）₂-Fab-dsFvはジスルフィド結合の存在に関わらず同じ温度で変性することが確認された（表7a）。APB-B1タンパク質の貯蔵安定性に役立つ最適なバッファーを検出するために、タンパク質変性温度を、3.0～11.0のpH条件で、上記のように20℃から徐々に上昇する90℃までの範囲の融解温度でタンパク質を熱処理することにより、測定した（表7bおよび図17）。図17では、精製されたAPB-B1aタンパク質およびAPB-B1bタンパク質を様々なバッファー中4℃で1日インキュベートしたものを各1 mg/ml採取し、ライトサイクラー480 II（RT-PCR）およびSYPRO Orange色素を用いて分析した。結果として、様々なpH条件で、Fv中のジスルフィド結合の存在または不存在に関わらず、どのタンパク質も等しい変性温度を実証した。それに加えて、タンパク質の変性は、低pHレベル（3.0～4.0）および高pHレベル（9.0～11.0）条件で、比較的低温から始まった。しかし、pHレベル3.0または11.0などの極端な酸性または塩基性条件では、タンパク質の変性は温度4℃から始まった。熱に対し最高の安定性を有する構造体として存在したAPB-B1タンパク質試料のpHレベルは、5.0～7.0であり、該APB-B1タンパク質は、クエン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、およびリン酸ナトリウムバッファーのすべてにおいて、pH 6.0条件で、最高の熱安定性を示した（Tm = 61℃）（表7b）。

（表７ａ）

（表７ｂ）

（5）SAFAベースの二重特異性抗体の抗原特異性および親和性の決定
精製されたAPB-B1aおよびAPB-B1b二重特異性抗体が、3つの異なる抗原、つまりHSA、CD40L、およびTNF-αに結合する結合親和性を、ELISAおよびBLIにより決定した（図18A～18C、および表8）。図18A～18Cでは、3つの標的タンパク質、つまりヒト血清アルブミン（図18A）、CD40L（図18B）、およびTNF-α（図18C）を、96ウェルマキシソーププレートに密度1 μg/mlでコーティングした。APB-B1a、APB-B1b、および親抗体を、各標的にpH 7.4で結合させた。HRP結合ヤギ抗ヒトFd抗体を二次抗体として用いた。データを、ELISAリーダーを用いて450 nmで分析した。*親抗体: 抗HSA Fab（SL335）、抗CD40L IgG（ルプリズマブ）、抗TNF-α IgG（アダリムマブ）、および抗TNF-α Fab（セルトリズマブ）。ELISAの結果は、APB-B1aまたはAPB-B1bがヒト血清アルブミンに結合する強さは、対照として用いたSL335 Fabと比べて、約2～3倍低かったことを示し（図18A）、BLIを用いた親和性の評価では、APBB1a、APB-B1b、およびSL335 Fabのヒト血清アルブミンに対する平衡解離定数（KD）を測定し、結果はそれぞれ765 pM、809 pM、および286 pMであった（表8）。APB-B1a抗体およびAPB-B1b抗体のCD40L結合能力の評価では、これらの2つの二重特異性抗体は、親抗体としての抗ヒトCD40L IgG1（ルプリズマブ）よりも約1.5倍低い結合能力を実証し（図18B）、APB-B1a、APB-B1b、および親抗体の結合親和性を測定した結果、KD値はそれぞれ192 pM、167 pM、および49 pMであった（表8）。ELISAにより測定した場合、APB-B1aおよびAPB-B1bのTNF-α抗原親和性は、親抗体α Fab'のTNF-α抗原親和性よりも約1.5～2倍低く（図18C）、BLIにより測定した場合、APB-B1a、APB-B1b、および親抗体の結合親和性は、それぞれKD値164 pM、446 pM、および157 pMという結果となり（表8）、それらは上記のELISAおよびBLIによる評価結果と似たパターンである。

それに加えて、APB-B1aが抗原の3つの種に同時結合する能力を特定するために、BLIを実施した（表8）。AR2Gバイオセンサーにおいて500 nM CD40Lを反応させて該センサーに固定化し、25 nM APB-B1aを反応させて固定化したCD40Lと会合させた。次に、ヒト血清アルブミンを、APB-1aと、APB-1aがAPB-B1aのアルブミン結合部位を飽和させるよりも最大10倍高い濃度で反応させ、また、同濃度のヒト血清アルブミンを50 nM TNF-αと反応させた。結果を図19に示す。図19では、組換えヒトCD40Lを、pH 5.0、10 μg/ml 酢酸ナトリウムバッファー中、AR2Gバイオセンサーに固定化した。APB-B1aを濃度3.2 μg/mlでロードした（会合1）。HSAを濃度13.2 μg/mlでロードし（会合2）、HSAおよびTNF-αを濃度13.2 μg/mlおよび2 μg/mlでロードした（会合3）。各会合工程を900秒間実施した。Octet DataAnalysis8ソフトウェアを用いてデータを分析した。

（表８）

表8では、精製されたAPB-B1aおよびAPB-B1bの結合親和性を、Octet RED機器を用いて分析した。それぞれの抗原、HSA、CD40L、およびTNF-αを、pH 5.0 酢酸ナトリウムバッファー中、濃度20 μg/ml、10 μg/ml、および30 μg/mlで、アミン反応性第2世代（AR2G）バイオセンサーに固定化した。精製された抗体を、pH 7.4の1× キネティックバッファー中連続処理して2倍希釈した。Octet Data Analysis8ソフトウェアを用いてデータを分析した。*親抗体: 抗HSA Fab（SL335）、抗CD40L IgG1（ルプリズマブ）、および抗TNF-α Fab'（セルトリズマブ）。

（6）SAFAベースの二重特異性抗体の、細胞膜CD40Lタンパク質との結合
精製されたSAFAベースの二重特異性抗体の抗CD40L scFvが、可溶性CD40Lのみならず、細胞表面に発現した細胞膜CD40Lにも特異的に結合するかどうかを、FACSVerseにより特定した。結果として、SAFAベースの二重特異性抗体は、親抗体としての抗ヒトCD40L IgG1と同様に細胞膜CD40Lに結合する能力があったことが確認された（図20）。図20では、D1.1細胞が濃度3.0×10⁵細胞／反応で調製され、SL335ベースの構築物、SL335 Fab（陰性対照群）、および抗CD40L IgG（陽性対照群）を検出するのに、FITC結合ヤギ抗ヒトカッパ抗体を二次抗体として用いた。細胞数カウントにより示される結合シグナルを、FASCVerseフローサイトメーターを用いて測定した。

（7）SAFAベースの二重特異性抗体の細胞ベースの阻害能力の評価
APB-B1aおよびAPB-B1bに、TNF-αの生物学的機能を阻害する能力があるかどうかを特定するために、インビトロの阻害能力を、細胞膜TNF受容体を発現し、かつアクチノマイシンDの存在下でTNF-α依存的に細胞傷害性を示すL929マウス細胞を用いて評価した（図21）。図21では、TNF-α試料の濃度を、連続希釈により20 nMから0.24 nMまで3倍減じてから、アクチノマイシンDの存在下でTNF受容体およびTNF-α（10 ng/ml）を細胞膜に発現するL929マウス細胞と反応させた。抗TNF-α-Fab'（セルトリズマブ）を陽性対照群として用いた。細胞生存率を、細胞数カウンティングキット-8を用いて測定した。阻害能力は、可溶性TNF-α（10 ng/ml）、ならびに系列希釈抗体、つまりSL335 Fab、APB-B1a、APB-B1b、および親抗体としての抗TNFa Fab'を加えることにより、評価した。結果として、ヒト血清アルブミン（HSA）の存在下で、親抗体の半最大阻害濃度（IC₅₀）値は0.6259 nMであり、APB-B1aおよびAPB-B1bのIC₅₀値はそれぞれ5.3 nMおよび12.7 nMであり、それらは親抗体よりも8～20倍低い。しかし、SL335は阻害能力を実証しなかった（図21）。したがって、APB-B1aおよびAPB-B1bは、TNFα-TNFR相互作用を阻害する能力を維持したことが確認された。APB-B1aおよびAPB-B1bが、ヒト血清アルブミンの存在下で、細胞表面に発現した細胞膜CD40L、および可溶性TNF-αに同時結合し、したがってCD40L-CD40およびTNF α-TNFRの相互作用経路を同時阻害する能力があるかどうかを判定するために、同時阻害能力を、細胞膜CD40および細胞膜TNF受容体の両者を発現するHEK-blue（商標）CD40Lレポーター細胞を用いて観測した。図22A～22Cでは、CD40LまたはTNF-αに対する抗体構築物を濃度50 nMから0.0122 nMへと4倍連続希釈した。抗CD40L IgG1および抗TNF-αの両者をそれぞれの標的分子の対照群として用いた。HEK-blue（商標）レポーター細胞とCD40LまたはTNF-αとの反応により発現する分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）を、QUANTIBlue試薬を用いて測定し、シグナルをA655 nmで測定した。APB-B1aおよびAPB-B1の阻害能力を、（a）CD40Lを発現するD1.1細胞とCD40を発現するHEK-blue（商標）細胞との相互作用（図22A）、および（b）TNF受容体を発現するHEK-blue（商標）細胞と可溶性TNF-αとの相互作用（図22B）、ならびに（c）D1.1細胞とHEK-blue（商標）細胞との相互作用、およびHEK-blue（商標）細胞と可溶性TNF-αとの相互作用の両方（図22C）を含む、様々な相互作用に対するHEK-blue（商標）レポーター細胞の応答を測定することにより特定した。APB-B1aおよびAPB-B1bの細胞膜CD40Lに対するIC₅₀値は0.15～0.18 nM、親抗体（ルプリズマブ、IgG1）のIC₅₀値は0.30 nMであったことが特定され（図22A）、可溶性TNF-α（10 ng/ml）に対するAPB-B1aおよびAPB-B1bの阻害能力は、3.05 nMおよび4.13 nMであって、親抗体（セルトリズマブ、Fab'）、すなわち0.56 nmよりも6～8倍低く、L929マウス細胞を用いた実験（図22B）と同様である。細胞膜CD40Lおよび可溶性TNF-α抗原の両者を同時阻害するアッセイでは、APB-B1aおよびAPB-B1bのIC₅₀値は、1.98 nMおよび3.79 nMであり、それは、抗原がAPB-B1aおよびAPB-B1bによって完全に（100%）阻害されたことを意味する。しかし、親抗体である抗TNF-α Fab'はTNF-α抗原しか阻害できず、それは、全応答の約60%の阻害しか得られなかったことを意味する。CD40L IgG1の場合、CD40L IgG1はCD40Lを阻害できたが、抗CD40L IgG1は、非阻害TNF-αに対するレポーター細胞のSEAP活性が極端に高いせいで、応答を全く阻害することができず、それはSL335 Fab（陰性対照）の場合と同様である。なお、2つの親抗体、抗TNF-α Fab'および抗CD40L IgG1を同時に与えた場合（併用治療）、標的の2つの種は、二重特異性抗体の場合のように、この2つの親抗体によって完全に（100%）阻害され、測定されたIC₅₀値は0.47 nMであり、それはAPB-B1よりも3～8倍高かった。したがって、この2つの抗体は、CD40Lに対する阻害能力レベルは似ているものの、該2つの抗体同士のTNF-αに対する阻害能力の差により、併用治療の場合よりも低い阻害能力を有したと考えられる（図22C）。

実施例5. 追加の薬物動態および薬力学的分析
（1）PK分析
APB-A1の血清半減期をさらに評価するために、再度カニクイザルモデル（SNBL、日本国）で、薬物動態分析を実施した。APB-A1タンパク質を、各群の3匹のカニクイザル（雄）それぞれに、1回の静脈内注射で用量10 mg/kg（第1群）または30 mg/kg（第2群）を投与した。投与後、血液試料が全14時点から収集された: 1時点は投与前であり、続く13時点は、投与後0.25時間、1時間、6時間、12時間、および24時間、ならびに4日、8日、13日、19日、26日、33日、40日、および47日であった。各カニクイザルの血清に存在するAPB-A1の濃度がELISAにより測定された（SNBL、日本国）。

（2）PD分析
APB-A1の有効性により抑制される抗キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）抗体応答が分析された（SNBL、日本国）。ビヒクル（陰性対照群: 20 mmol/L L-ヒスチジン、HCl pH 5.8、5% スクロース）、ならびにAPB-A1（3 mg/kg、10 mg/kg、および30 mg/kg）の全4つの試料群を、カニクイザル（雄; n=5/群）に毎週1回（全部で2回）静脈内投与した。まず、抗KLH抗体応答を誘導するために、1回目のKLH（2 mg/kg）皮下注射をマイナス28日目に投与し、ブースティングのために2回目の皮下注射を1日目（試験物質および対照物質の投与終了のおよそ1時間後）に投与した。APB-A1を、2回目のKLH注射（1日目）の時、および1週間後（8日目）の全2回注射した。血液試料を、1回目のKLH注射の前（マイナス28日目）、マイナス21日目、マイナス14日目、マイナス7日目、1日目（試験物質および対照物質の投与のおよそ30分前）、4日目、8日目（試験物質および対照物質の投与のおよそ30分前）、11日目、15日目、22日目、および29日目に収集し、抗KLH IgG抗体力価および抗KLH IgM抗体力価をELISAにより測定した。末梢血の免疫表現型検査の分析のため、血液試料を、1回目のKLH注射の前（マイナス28日目）、1日目（試験物質および対照物質の投与のおよそ30分前）、4日目、11日目、22日目、および29日目の全6回収集した。免疫表現型検査を、CD45、CD20、CD27、CD38、CD3、CD4、CD8、およびKi-67などのマーカーの抗体パネルを用いて実施した。PK分析のために、血液試料を1日目、4日目、8日目、11日目、15日目、22日目、および29日目に収集した（全7時点）。各カニクイザルの血清に存在するAPB-A1の濃度をELISAにより測定した。免疫組織化学検査用の器官を剖検の翌日に切除し、肉眼所見の2日後に自動包埋システムで加工した。連続薄切標本として3切片が調製された。第1切片をヘマトキシリン・エオシン（HE）で染色し、第2および第3切片を免疫組織化学（IHC）検査に用いた。IHCでは、薄切標本を、免疫酵素法を用いて、次の抗体: マウス抗CD20抗体（L26、Leica Biosystems、独国）およびマウス抗Ki67抗体（MIB-1、Dako Denmark A/S、デンマーク国）を用いて染色した。統計学的分析では、バーレット検定により、等分散性についてデータを分析した。等分散であれば、ダネットの検定により対照群と各試験物質群との多重比較を実施した。バーレット検定による分散が不均一であれば、ダネット型の検定（ミラーの検定）により、対照群と各試験物質群との多重比較を実施した。

（3）2週反復用量毒性学試験
1週間あけて2回、静脈内（スローボーラス）注射によりカニクイザルに投与した場合の、自己免疫疾患の治療のためのAPB-A1の潜在的毒性を決定するために。この試験では、次のパラメーターおよびエンドポイントを評価した:臨床観測、体重、臨床病理パラメーター（血液学、凝固、臨床化学、および検尿）、バイオ分析および肉眼的剖検所見、ならびに臓器重量。

（4）結果
（1）APB-A1の追加のPK試験
APB-A1のインビボの半減期を評価するために、カニクイザルモデル（雄、n=3/群）を用いて薬物動態アッセイを実施した。APB-A1を10 mg/kgおよび30 mg/kgの2つの投与量で、1回の静脈内注射により投与した。材料および方法のセクションに記載したのと同じ時点で血液試料を収集した後、血漿中のAPB-A1の濃度をPK ELISAを用いて測定した（図23）。データは実施した実験の平均を示している。半減期は、ELISAの結果に基づき、Phoenix WinNonlinソフトウェア（ver 6.4; Certara LP、米国ニュージャージー州プリンストン）を用いて計算され、10 mg/kg APB-A1および30 mg/kg APB-A1の半減期は、それぞれ約9.33±1.54日および10.1±1.8日と特定された。Cmax値は、用量10 mg/kgおよび30 mg/kgでそれぞれ約347 μg/mlおよび1230 μg/mlであり、クリアランス（CL）速度は3.48 ml/日/kgおよび3.44 ml/日/kgであり、用量に関わらず同レベルであった（表9）。

（表９）追加のサルPKデータ

（2）APB-A1の追加のPD試験
どの群の動物も、死体で発見されたり、瀕死により安楽死させたりすることはなかった。試験物質関連の変化は、どの群でも、臨床徴候、体重、または肉眼所見において見られなかった。末梢血の免疫表現型検査では、30、10、および／または3 mg/kg群で、対照群と比較して、分裂B細胞の減少が見られた（図24Aおよび図24B）。抗KLH抗体の測定では、8～29日目に、10および30 mg/kg群で、対照群と比較して、IgG抗体力価の減少が見られたが（* P<0.05、** P<0.01:対照との有意差あり）（図25）、IgM抗体力価に試験物質関連の変化は見られなかった（データ表示せず）。病理組織学および免疫組織化学の検査では、29日目に、腋窩および顎下リンパ節の胚中心の細胞型（cellularity）、抗CD20陽性細胞、および抗Ki67陽性細胞の減少が、10および／または30 mg/kg群に観測された（図26および表10）。PKでは、Cmax値およびAUC0-t値は、3～30 mg/kg群で、1回目および2回目の投与でほぼ用量比例的に増加した（図27および表11）。

（表１０）病理組織学および免疫組織化学の検査

－:異常な変化なし、±:ごく小、＋:小、2＋:中、3＋:大

（表１１）PD試験のPK結果

2週反復用量毒性学試験
APB-A1を受けた雄にも雌にも、早死や、体重、血液学、凝固、臨床化学、または検尿における臨床観測または変化はなく、これといった肉眼的所見もなかった。1週間あけて2回の静脈内（スローボーラス）注射によるAPB-A1の投与は、最大100 mg/kg/用量という用量レベルで、カニクイザル体内でよく耐容された。

本開示では、既存の二重特異性抗体技法に基づき、増加したインビボ持続可能性を有する新フォーマットの多重特異性抗体構築物を成功裡に生産できることが立証され、それは本発明者らによって開発された。特に、CD40L、TNF-α、または他の生理活性エフェクターに結合する能力のある多重特異性抗体を、様々な自己免疫疾患の治療剤として、便利に適用することができる。

上記の特定の態様の記載は、本発明の全体的な特性を十分に明らかにするので、他者は、当技術分野の技術範囲の知識を適用すれば、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、それえを容易に改良でき、かつ／または様々な用途に応用できよう。したがって、そのような応用および改良は、本明細書に示される教示および手引きに基づき、開示される諸態様の等価物の意味内かつ範囲内とされる。本明細書における専門語または用語は、限定ではなく説明を目的とすることを理解されたく、したがって本明細書の専門語または用語は、当業者には、本明細書の教示および手引きに鑑み解釈されるものである。

本発明の範囲（breadth）および範囲（scope）は、上記の例示的な態様のいずれにも限定されるべきではなく、添付の請求項およびそれらの等価物のみにしたがい定められるべきである。

本明細書に記載される様々な局面、態様、および選択肢はすべて、ありとあらゆるバリエーションとして組み合わせることができる。

本明細書で言及したすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの刊行物、特許、または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられる、と具体的かつ個別に示されているも同然に、参照により本明細書に組み入れられる。

産業上の利用可能性
本開示の多重特異性抗体は、血栓塞栓症などの副作用を減じながらも、長期のインビボ保持時間を有する、自己免疫疾患治療剤の開発に用いられ得る。

Claims

構造式

を含む、多重特異性抗体であって、
式中、抗原結合断片（Fab）は、血清アルブミンFabであり;
R¹およびR²は、FabのN末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
R³およびR⁴は、FabのC末端に連結された生物活性エフェクター部分であり、それぞれFabの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに連結されており;
mは、0、または1以上の整数であり;
nは、0、または1以上の整数である、
前記多重特異性抗体。
R¹およびR²が、同じまたは異なる一本鎖可変断片（scFv）である、請求項1記載の抗体。
R³およびR⁴が、同じまたは異なるFv断片またはジスルフィド安定化Fv（dsFv）断片である、請求項1または2記載の抗体。
R¹、R²、R³、およびR⁴がそれぞれ、1つまたは複数のリンカーによりFabに連結されている、請求項1～3のいずれか一項記載の抗体。
Fabが、
（a）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（b）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（c）アミノ酸配列NYGIH（SEQ ID NO:65）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（d）アミノ酸配列SYAMS（SEQ ID NO:68）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（e）アミノ酸配列AYWIA（SEQ ID NO:71）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列LYSGSYSP（SEQ ID NO:73）を含む重鎖CDR3;または
（f）アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項1～4のいずれか一項記載の抗体。
Fabが、
（g）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASRLES（SEQ ID NO:78）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QQSDSVPVT（SEQ ID NO:79）を含む軽鎖CDR3;
（h）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列AASSLQS（SEQ ID NO:81）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（i）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列DASNRAT（SEQ ID NO:84）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（j）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QQYGSSPRT（SEQ ID NO:88）を含む軽鎖CDR3;
（k）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QKYSSYPLT（SEQ ID NO:90）を含む軽鎖CDR3;または
（l）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項1～5のいずれか一項記載の抗体。
Fabが、
アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3、ならびに
アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含む、請求項1～6のいずれか一項記載の抗体。
Fabが、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項1～7のいずれか一項記載の抗体。
Fabが、SEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項1～8のいずれか一項記載の抗体。
Fabが、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ含む、請求項1～9のいずれか一項記載の抗体。
Fabが、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン（V_H-C_H1ドメイン）、およびSEQ ID NO:46のアミノ酸配列を含む軽鎖ドメイン（V_L-C_Lドメイン）を含む、請求項1～10のいずれか一項記載の抗体。
各リンカーが、1～20のアミノ酸を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の抗体。
各リンカーが、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～12のいずれか一項記載の抗体。
各リンカーが、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項1～13のいずれか一項記載の抗体。
R¹およびR²がそれぞれ、抗CD40L hu5c8 scFvである、請求項1～14のいずれか一項記載の抗体。
R¹およびR²がそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvである、請求項1～15のいずれか一項記載の抗体。
R¹およびR²がそれぞれ、SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48のアミノ酸配列を含む抗CD40L hu5c8 scFvである、請求項1～16のいずれか一項記載の抗体。
R³およびR⁴がそれぞれ、抗TNF-α Fv、抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、抗IL-23 Fv、抗IL-23 dsFv、抗IFNAR1、および抗IFNAR1 dsFvからなる群より選択される1つまたは複数の生物活性エフェクター部分である、請求項1～17のいずれか一項記載の抗体。
R³およびR⁴がそれぞれ、SEQ ID NO:49と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:50と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:52と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗TNF-αジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:54と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:56と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:58と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1、ならびに／またはSEQ ID NO:59と80%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:60と80%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分である、請求項1～18のいずれか一項記載の抗体。
R³およびR⁴がそれぞれ、SEQ ID NO:49の重鎖およびSEQ ID NO:50の軽鎖を含む抗TNF-α Fv、SEQ ID NO:51の重鎖およびSEQ ID NO:52の軽鎖を含む抗TNF-α ジスルフィド安定化Fv（dsFv）、SEQ ID NO:53の重鎖およびSEQ ID NO:54の軽鎖を含む抗IL-23 Fv、SEQ ID NO:55の重鎖およびSEQ ID NO:56の軽鎖を含む抗IL-23 dsFv、SEQ ID NO:57の重鎖およびSEQ ID NO:58の軽鎖を含む抗IFNAR1、ならびに／またはSEQ ID NO:59の重鎖およびSEQ ID NO:60の軽鎖を含む抗IFNAR1 dsFvを含む、1つまたは複数の生物活性エフェクター部分である、請求項1～19のいずれか一項記載の抗体。
請求項1～20のいずれか一項記載の多重特異性抗体、および賦形剤を含む、組成物。
請求項1～20のいずれか一項記載の多重特異性抗体、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
その必要のある対象において自己免疫疾患を治療する方法であって、請求項22記載の薬学的組成物を前記対象に投与する段階を含む、方法。
（a）プロモーター、
（b）血清アルブミンに結合する抗原結合断片（Fab）をコードする、第1の核酸分子、および
（c）生物活性エフェクター部分およびリンカーをコードする、第2の核酸分子
を含む、発現ベクターであって、
前記プロモーター、前記第1の核酸配列、および前記第2の核酸分子が、機能的に連結されている、ベクター。
第2の核酸分子が、2つ以上の生物活性エフェクター部分およびリンカーをコードする、請求項24記載のベクター。
第1の核酸分子が、
（a）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（b）アミノ酸配列SYGIS（SEQ ID NO:61）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（c）アミノ酸配列NYGIH（SEQ ID NO:65）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3;
（d）アミノ酸配列SYAMS（SEQ ID NO:68）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列AGWLRQYGMDV（SEQ ID NO:70）を含む重鎖CDR3;
（e）アミノ酸配列AYWIA（SEQ ID NO:71）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列LYSGSYSP（SEQ ID NO:73）を含む重鎖CDR3;または
（f）アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む、請求項24または25記載のベクター。
第1の核酸分子が、
（g）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASRLES（SEQ ID NO:78）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QQSDSVPVT（SEQ ID NO:79）を含む軽鎖CDR3;
（h）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列AASSLQS（SEQ ID NO:81）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（i）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列DASNRAT（SEQ ID NO:84）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3;
（j）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QQYGSSPRT（SEQ ID NO:88）を含む軽鎖CDR3;
（k）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASSRAT（SEQ ID NO:87）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列QKYSSYPLT（SEQ ID NO:90）を含む軽鎖CDR3;または
（l）アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、
アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、および
アミノ酸配列

を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む、請求項24～26のいずれか一項記載のベクター。
第1の核酸分子が、
アミノ酸配列AYSMN（SEQ ID NO:74）を含む重鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列

を含む重鎖CDR2、およびアミノ酸配列

を含む重鎖CDR3、ならびに
アミノ酸配列

を含む軽鎖相補性決定ドメイン1（CDR1）、アミノ酸配列GASTGAT（SEQ ID NO:92）を含む軽鎖CDR2、およびアミノ酸配列QQYYSFLAKT（SEQ ID NO:93）を含む軽鎖CDR3
を含むFabをコードする核酸配列を含む、請求項24～27のいずれか一項記載のベクター。
第1の核酸分子が、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む、請求項24～28のいずれか一項記載のベクター。
第1の核酸分子が、SEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むFabをコードする核酸配列を含む、請求項24～29のいずれか一項記載のベクター。
第1の核酸分子が、SEQ ID NO:94、95、96、97、98、または99と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:100、101、102、103、104、または105と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ含むFabをコードする核酸配列を含む、請求項24～30のいずれか一項記載のベクター。
第1の核酸分子が、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン（V_H-C_H1ドメイン）、およびSEQ ID NO:46のアミノ酸配列を含む軽鎖ドメイン（V_L-C_Lドメイン）を含むFabをコードする核酸配列を含む、請求項24～31のいずれか一項記載のベクター。
生物活性エフェクター部分が、抗TNF-α Fv、抗TNF-α dsFv、抗IL-23 Fv、抗IL-23 dsFv、抗IFNAR1 Fv、および／または抗IFNAR1 dsFvである、請求項24～32のいずれか一項記載のベクター。
第2の核酸分子が、SEQ ID NO:49～60のうちの1つまたは複数のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項23～33のいずれか一項記載のベクター。