WO2024039238A1 - 단일쇄 가변 단편의 변이 단백질 - Google Patents

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WO2024039238A1
WO2024039238A1 PCT/KR2023/012335 KR2023012335W WO2024039238A1 WO 2024039238 A1 WO2024039238 A1 WO 2024039238A1 KR 2023012335 W KR2023012335 W KR 2023012335W WO 2024039238 A1 WO2024039238 A1 WO 2024039238A1
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WO
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chain variable
variable fragment
less
cancer
linker
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PCT/KR2023/012335
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권인찬
권나현
이재훈
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주식회사 프로앱텍
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Definitions

  • the present invention relates to a mutant protein of single chain variable fragment (scFv) and can be used in the medical field.
  • scFv single chain variable fragment
  • scFvs single-chain variable fragments
  • the scFv is a structure in which one heavy chain and one light chain variable domain (V H and V L ) immunoglobulin (Igs) are connected by a polypeptide linker.
  • V H and V L immunoglobulin
  • scFvs have the advantage of not inducing unwanted crystallized fragment (Fc)-mediated immune responses and better tumor penetration and distribution than full-length antibodies
  • scFvs are generally small in size (approximately 25 kDa) and lack an Fc region, resulting in a low half-life.
  • the downside is that it is very short.
  • the purpose of the present invention is to provide a mutant protein of a single-chain variable fragment with a novel structure.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a mutant protein of a single-chain variable fragment.
  • a single-chain variable fragment mutant protein in which an albumin-binding moiety is fused to a single-chain variable fragment (scFv) in which the heavy chain variable region (V H ) and light chain variable region (V L ) of an antibody are linked by a linker.
  • the albumin binding moiety is a single chain variable fragment mutation located in the direction opposite to the direction in which the complementarity determining region (CDR) of the heavy chain variable region (V H ) and the light chain variable region (V L ) are located. protein.
  • the bioactive substances include cytokines, insulin, insulin-like growth factor (IGF)-1, IGF-2, epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor (TGF), human growth hormone, and vascular endothelium.
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF-2 insulin-like growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • human growth hormone human growth hormone
  • VEGF vascular endothelium
  • a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer comprising the single-chain variable fragment mutant protein of any one of items 1 to 13 above.
  • the single chain variable fragment mutant protein of the present invention exhibits excellent binding ability to antigen because the albumin binding site does not interfere with the complementarity determining region (CDR) of the heavy and light chain variable regions.
  • CDR complementarity determining region
  • the single-chain variable fragment mutant protein of the present invention has an extended half-life by binding to albumin present in the body.
  • the single-chain variable fragment mutant protein of the present invention can maintain excellent binding ability to both antibodies and albumin by appropriately adjusting the length of the linker and albumin-binding moiety.
  • the single-chain variable fragment mutant protein of the present invention can efficiently deliver biologically active substances such as cytokines to the target by binding them to the C-terminus.
  • the single-chain variable fragment mutant protein of the present invention has excellent cell penetration ability.
  • the single-chain variable fragment mutant protein of the present invention can be easily produced using a microbial production system.
  • the single-chain variable fragment mutant protein of the present invention can fuse an albumin-binding moiety while minimizing structural changes in the known single-chain variable fragment (scFv), and can therefore be appropriately used for improving antibodies and fragments thereof.
  • FIGS 1 to 14 sequentially show 4D5scFv, examples and comparative examples of the present application, and structures implemented with AlphaFol2.
  • Figure 15 shows the results of computational evaluation of structure prediction of 4D5scFv and D5-ABD variants.
  • Figure 16 Aligns 4D5scFv and 4D5-ABD variants and visualized by PyMOL.
  • Figure 17 shows the complex conformational structure of two 4D5-ABD variants and HER2 (PDB ID: 1N8Z) visualized by PyMOL.
  • Figure 18 shows SDS-PAGE analysis results for expression and purification of 4D5scFv and 4D5-ABD variants.
  • (a) Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel of cell lysate samples achieved during expression (MW: molecular weight standard; BI: cell lysate sample before induction; AI: cell lysate sample after induction).
  • (b) Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel of the purified sample.
  • Figure 19 shows the results of SDS-PAGE analysis of 4D5scFv and two 4D5-ABD variants under reducing conditions (left) and non-reducing conditions (right) (MW: molecular weight standard).
  • Figure 20 shows the results of MALDI-TOF analysis for purified 4D5scFv and 4D5-ABD variants.
  • Figure 21 shows the size exclusion chromatogram results of 4D5scFv, 4D5-ABD variant and standard protein (4D5scFv: 27kDa; 4D5scFv dimer: 54kDa; 4D5-S-ABD: 32kDa; 4D5-L-ABD: 33kDa; ovalbumin (OA) ): 43 kDa; conalbumin (CA): 75 kDa; aldolase (Ald): 158kDa.
  • Figure 22 shows the results of anti-HER2 ELISA of 4D5scFv and 4D5-ABD variants in the presence/absence of HSA.
  • Figure 23 shows anti-HSA ELISA results of 4D5scFv and 4D5-ABD variants.
  • Figure 24 shows the pharmacokinetic profiles of 4D5scFv and 4D5-ABD variants.
  • the type of antibody can be appropriately selected depending on the purpose of using the mutant protein of the present invention and is not limited to a specific one.
  • it may be an antibody against a disease antigen, and the disease may be cancer or an autoimmune disease.
  • Antibodies may be anticancer drugs or immunosuppressive drugs, specifically Trastuzumab, Naxitamab, Cetuximab, Telisotuzumab, Tisotumab, and Pinatuzumab ( Pinatuzumab, Rifastuzumab, Indusatumab, Vandortuzumab, Sofituzumab, Vorsetuzumab, Trastuzumab, Milvetuzumab ( Mirvetuximab, Coltuximab, Naratuximab, Indatuximab, Anetumab, Lorvotuzumab, Cantuzumab, Laprituximab , Bivatuzumab, Vadastuximab, Rovalpituzumab, Inotuzumab, Sacituzumab, Labetuzumab, Milatuzumab, It may be selected from the group consisting of Lupartumab, Aprutumab
  • the single-chain variable fragment is not limited to having a specific amino acid length as long as it can fuse the albumin binding moiety for the purposes of the present invention.
  • a single chain variable fragment may have, for example, an amino acid length of at least 100 aa, at least 110 aa, at least 120 aa, at least 130 aa, at least 140 aa, at least 150 aa, at least 160 aa, at least 170 aa, at least 180 aa, and at least 190 aa.
  • AA or higher 200 AA or higher, 210 AA or higher, 220 AA or higher, 230 AA or higher, 240 AA or higher, 250 AA or higher, 260 AA or higher, 270 AA or higher, 280 AA or higher, 290 AA or higher, 300 AA or higher, 310 AA or higher, 320 AA or higher, 330 AA or higher, 340 AA or higher, 350 AA or higher, 360 AA or higher, 370 AA or higher, 380 AA or higher, 390 AA or higher, 400 AA or higher, 410 AA or higher, 420 AA or higher, 430 AA or higher, 440 AA or higher , may be 450 aa or more, 460 aa or more, 470 aa or more, 480 aa or more, 490 aa or more, or 500 aa or more.
  • a single-chain variable fragment may, for example, have an amino acid length of 500 aa or less, 490 aa or less, 480 aa or less, 470 aa or less, 460 aa or less, 450 aa or less, 440 aa or less, 430 aa or less, 420 aa or less, 410 aa or less.
  • the single-chain variable fragment may have a length of, for example, 150 to 350 aa, 160 to 340 aa, 170 to 330 aa, 180 to 320 aa, 190 to 310 aa, or 200 to 300 aa.
  • the heavy chain variable region (V H ) and light chain variable region (V L ) are not limited to having a specific amino acid length.
  • the heavy chain variable region (V H ) and the light chain variable region (V L ) each have, for example, an amino acid length of at least 50 aa, at least 55 aa, at least 60 aa, at least 65 aa, at least 70 aa, at least 75 aa, and at least 80 aa.
  • aa or greater 85 aa or greater, 90 aa or greater, 95 aa or greater, 100 aa or greater, 105 aa or greater, 110 aa or greater, 115 aa or greater, 120 aa or greater, 125 aa or greater, 130 aa or greater, 135 aa or greater, 140 aa or greater, 145 AA or higher, 150 AA or higher, 155 AA or higher, 160 AA or higher, 165 AA or higher, 170 AA or higher, 175 AA or higher, 180 AA or higher, 185 AA or higher, 190 AA or higher, 195 AA or higher, 200 AA or higher, 205 AA or higher , 210 aa or more, 215 aa or more, 220 aa or more, 225 aa or more, 230 aa or more, 235 aa or more, 240 aa or more, 245 aa or more, or 250 aa or more.
  • the heavy chain variable region (V H ) and the light chain variable region (V L ) each have, for example, an amino acid length of 250 aa or less, 245 aa or less, 240 aa or less, 235 aa or less, 230 aa or less, 225 aa or less, 220 aa or less.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region may have a length of, for example, 70 to 150 aa, 80 to 140 aa, 90 to 130 aa, or 100 to 120 aa, respectively.
  • the linker is a peptide linker that connects the heavy chain variable region and the light chain variable region and controls the distance and orientation to maintain structural stability and bind to the antigen in the correct direction.
  • the linker has an amino acid length of 3 aa or more, 4 aa or more, 5 aa or more, 6 aa or more, 7 aa or more, 8 aa or more, 9 aa or more, 10 aa or more, 11 aa or more, 12 aa or more, or 13 aa.
  • the linker must have an amino acid length of 100 aa or less, 95 aa or less, 90 aa or less, 85 aa or less, 80 aa or less, 75 aa or less, 70 aa or less, 65 aa or less, 60 aa or less, 55 aa or less, and 50 aa. It may be 55 aa or less, 50 aa or less, 45 aa or less, 40 aa or less, 35 aa or less, 30 aa or less, 25 aa or less, 20 aa or less, 15 aa or less, or 10 aa or less.
  • the linker may have a length of 6 to 50 aa, 6 to 40 aa, 6 to 30 aa, or 6 to 20 aa.
  • the linker is not limited to a specific sequence as long as it can maintain the flexibility and structural stability of the scFv.
  • n is any natural number and may be 1 to 10, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10. The order and repetition of these combinations are not limited and two or more types may be combined.
  • the linker may have the sequence of SEQ ID NOs: 10 to 12.
  • the N-terminus of the single-chain variable fragment may further include a start restriction sequence (eg, MG).
  • MG start restriction sequence
  • the C-terminus of the single-chain variable fragment may further include a His-Tag sequence (eg, HHHHHH) for isolation and purification of the single-chain variable fragment mutant protein.
  • a His-Tag sequence eg, HHHHHH
  • the single-chain variable fragment may have the sequence of SEQ ID NO: 4 (4D5scFv), SEQ ID NO: 5 (OKTscFv), or SEQ ID NO: 6 (3F8scFv).
  • albumin binding moiety refers to a portion that interacts with albumin protein, such as antibodies, antibody analogs, protein domains, protein motifs, peptides, compounds, aptamers, and oligomers. It may be nucleotides, sugars, etc.
  • the albumin binding moiety may, for example, have an amino acid length of at least 5 aa, at least 6 aa, at least 7 aa, at least 8 aa, at least 9 aa, at least 10 aa, at least 11 aa, at least 12 aa, at least 13 aa, at least 14 aa.
  • the albumin binding moiety may, for example, have an amino acid length of no more than 200 aa, no more than 195 aa, no more than 190 aa, no more than 185 aa, no more than 180 aa, no more than 175 aa, no more than 170 aa, no more than 165 aa, no more than 160 aa, no more than 155 aa.
  • the albumin binding moiety may have a length of, for example, 10 to 150 aa, 30 to 100 aa, or 30 to 50 aa.
  • the albumin binding moiety may have the sequence of SEQ ID NO: 1 (ABD), SEQ ID NO: 2 (VNAR), or SEQ ID NO: 3 (ABP).
  • the albumin binding moiety is selected in the single chain variable fragment where it does not significantly interfere with the structure and antigen binding function.
  • the albumin binding moiety may be fused within a linker or to the N-terminus or C-terminus of a single chain variable fragment.
  • ABM-V H -linker-V L (i) ABM-V H -linker-V L , (ii) V H -linker-V L -ABM, (iii) V H -ABM-linker-V L , (iv ) V H -linker1-ABM-linker2-V L and (v) V H -linker-ABM-V L , etc.
  • a linker may be added to connect the albumin binding moiety.
  • it may be in the form of (vi) ABM-linker1-V H -linker2-V L, (vii) V H -linker1-V L -linker2-ABM.
  • amino acid sequences and lengths of linker1 and linker2 may be different from each other.
  • Linker1 and linker2 may have amino acid lengths of 3 aa or more, 5 aa or more, 7 aa or more, 9 aa or more, and 10 aa or more, respectively.
  • the upper limit may be 15 aa or less, 20 aa or less, 25 aa or less, 30 aa, or 50 aa or less, but is not limited thereto.
  • albumin binding moiety When the albumin binding moiety is bound within the linker, at least 2 aa, at least 3 aa, at least 4 aa, at least 5 aa, at least 6 aa, and at least 7 aa from the C-terminus of the heavy chain variable region and the N-terminus of the light chain variable region, respectively. , it is preferred to be fused at positions separated by at least 8 aa, at least 9 aa, or at least 10 aa.
  • it may be a fusion between the 4th to 8th amino acids of a linker with a length of 10 to 15 aa and the adjacent amino acids.
  • it may be a fusion between the 7th to 14th amino acids of a linker having a length of 16 to 20 aa and an adjacent amino acid thereof.
  • it may be fused between the 5th to 8th amino acids of the linker of SEQ ID NO: 10 or 11 and its adjacent amino acids, or between the 11th to 16th amino acids of the linker of SEQ ID NO: 12 and its adjacent amino acids.
  • it may be a fusion between the 6th and 7th amino acids of the linker of SEQ ID NO: 10 or 11, or between the 13th and 14th amino acids of the linker of SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto.
  • albumin binding moiety is not fused at least 3 aa apart from the C-terminus of the heavy chain variable region and the N-terminus of the light chain variable region, interference with the adjacent complementarity determining region (CDR) may occur and the binding affinity to the antibody may decrease. .
  • the albumin binding moiety When the albumin binding moiety is fused within a linker or to the C-terminus of a single chain variable fragment, the albumin binding moiety is positioned in an orientation opposite to that of the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy and light chain variable regions. I do it.
  • the opposite direction means, for example, that if the complementarity determining region (CDR) is located at the bottom of the single-chain variable fragment variant protein, the albumin binding moiety is located at the top.
  • the opposite direction means, for example, that if the complementarity determining region (CDR) is located on the left side of the single chain variable fragment variant protein, the albumin binding moiety is located on the right side.
  • the albumin may be human serum albumin (HSA).
  • HSA human serum albumin
  • the mutant protein of the present invention can bind to serum albumin when administered in vivo through the albumin binding moiety, thereby delaying metabolism and degradation of the mutant protein and increasing permeability to cancer cells.
  • the albumin binding moiety When the albumin binding moiety is fused to the linker of the single-chain variable fragment, a bioactive substance can be additionally bound to the N-terminus or C-terminus of the single-chain variable fragment. Additionally, when the albumin binding moiety is fused to a position other than the C-terminus of the single-chain variable fragment, a bioactive substance can be bound to the C-terminus of the single-chain variable fragment.
  • the single-chain variable fragment mutant protein of the present invention functions as a carrier that delivers bioactive substances to the target.
  • Bioactive substances refer to all substances that can exhibit a certain activity when administered into the body.
  • Bioactive substances include, for example, cytokines, insulin, insulin-like growth factor (IGF)-1, IGF-2, epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor (TGF), human growth hormone, and vascular endothelial growth factor (VEGF). It may be any one selected from the group consisting of
  • Cytokines may be, for example, interleukins (IL-1 to IL-17), tumor necrosis factor (TNF), interferon (IFN), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), etc.
  • IL-1 to IL-17 tumor necrosis factor
  • IFN interferon
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • the albumin binding moiety may be fused to the center of the linker amino acid sequence of the single chain variable fragment. Alternatively, it may be a fusion between an amino acid located 1 to 5 aa or 1 to 10 aa away from the center and an amino acid adjacent thereto.
  • the albumin binding moiety may be, for example, an albumin protein domain, affibody, or peptide. It is small in size compared to an antibody (IgG) and is fused to scFv to form a single polypeptide chain. This may mean that it does not contain disulfide bonds in its structure.
  • the albumin binding moiety may be part of a specific protein or may be an artificially designed domain.
  • it could be a small triple-helix protein domain found in various surface proteins expressed by Gram-positive bacteria.
  • it may be derived from or modified from streptococcal protein G or protein PAB of Finegoldia magna to further increase albumin binding affinity.
  • VNAR V domain of cartilage oligomeric matrix protein, chondrocyte-derived
  • it may be modified from it to further increase albumin binding affinity.
  • the albumin binding moiety may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 3.
  • the mutant protein of the present invention may be produced in a microorganism that expresses the sequence encoding the protein.
  • Microorganisms known in the art may be used without limitation.
  • it may be Escherichia coli , but is not limited thereto.
  • mutant protein of the present invention When producing a mutant protein using a microbial system, expression is easy only if the protein does not contain PTM (post-translational modification) and has no or few disulfide bonds.
  • Antibody forms such as lgG contain many PTMs and disulfide bonds, and when using compounds, additional binding and purification processes are required.
  • the mutant protein of the present invention is in the form of a single fused polypeptide, and can be easily expressed in microbial systems due to its lack of PTM and few disulfide bonds.
  • the linker sequence of the scFv described above may be partially replaced with or further include a site that can be recognized by a restriction enzyme for insertion of the albumin binding moiety during gene cloning during the manufacturing process.
  • a restriction enzyme for insertion of the albumin binding moiety for example, one part of the linker sequence located on both sides of the albumin binding moiety may be replaced with a TS sequence, which is the recognition site for a restriction enzyme (Spe I), or may further include this.
  • the residues of the TS sequence have the advantage of being similar to the residues of the G and S sequences of the linker.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the above proteins. All of the above-described information regarding proteins directly applies to proteins as active ingredients in the pharmaceutical composition of the present application.
  • Cancer includes, for example, brain cancer, head and neck cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, leukemia, lung cancer, liver cancer, ovarian cancer, pancreas cancer, prostate cancer, rectal cancer, kidney cancer, stomach cancer, testicular cancer, and uterine cancer.
  • vascular tumor squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, small cell carcinoma, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma, laryngeal cancer, parotid cancer, biliary tract cancer, thyroid cancer, actinic keratosis, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, adenocystic carcinoma, adenoma , adenosquamous carcinoma, anal canal cancer, anal cancer, anorectal cancer, astrocytoma, greater vaginal estuarine adenocarcinoma, basal cell carcinoma, biliary carcinoma, bone cancer, bone marrow cancer, bronchial carcinoma, bronchial carcinoma, carcinoid, cholangiocarcinoma, chronic lymphocytic leukemia , chronic myeloid leukemia, clear cell carcinoma, connective tissue cancer, cystadenoma, digestive system cancer, duoden
  • Cancer skin cancer, small cell carcinoma, small intestine cancer, smooth muscle cancer, soft tissue cancer, somatostatin-secreting tumor, spine cancer, squamous cell carcinoma, striae muscle cancer, submesothelial carcinoma, T cell leukemia, tongue cancer, ureteral cancer, urethral cancer, It may be selected from the group consisting of cervical cancer, uterine body cancer, vaginal cancer, VIPoma, vulvar cancer, well-differentiated carcinoma, and Wilm's tumor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not significantly irritate living organisms and does not inhibit the biological activity and properties of the administered ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers in the present invention include saline solution, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these ingredients may be used in combination. If necessary, other common additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents can be added to formulate an injection suitable for injection into tissues or organs.
  • a target organ-specific antibody or other ligand may be used in combination with the carrier so that it can act specifically on the target organ.
  • composition of the present invention may further include fillers, excipients, disintegrants, binders, or lubricants. Additionally, the compositions of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained, or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the pharmaceutical composition may be in an injectable formulation and may be administered intravenously, but is not limited thereto.
  • the term “effective amount” refers to the amount necessary to delay or completely promote the onset or progression of a specific disease to be treated.
  • the composition can be administered in a pharmaceutically effective amount. It is obvious to those skilled in the art that the appropriate total daily usage amount of the pharmaceutical composition can be determined by the treating physician within the scope of sound medical judgment.
  • a specific pharmaceutically effective amount for a particular patient refers to the type and degree of response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used as the case may be, the patient's age, weight, general health, and gender. It is desirable to apply it differently depending on various factors including diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, drugs used together or simultaneously with the specific composition, and similar factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition may, if necessary, be accompanied by instructions associated with the packaging in a form directed by a government agency responsible for the manufacture, use and sale of drugs, and the instructions are in the form of the composition or in the form of a human or It indicates approval by a private interest organization for administration to animals, and may be, for example, a label approved by the U.S. Food and Drug Administration for prescription of a drug.
  • the present invention provides a method of treating cancer comprising administering the above protein. All of the above-mentioned information regarding proteins directly applies to proteins as active ingredients in the cancer treatment method described herein.
  • the method of the present invention includes administering the protein to a subject suffering from cancer.
  • the individual with cancer may be an animal with cancer, specifically a mammal with cancer, or more specifically a human with cancer.
  • Proteins can be administered in therapeutically effective amounts.
  • the term "administration" means introducing the composition of the present invention into a patient by any appropriate method, and the route of administration of the composition of the present invention is administration through various routes such as oral or parenteral as long as it can reach the target tissue. It can be. It may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, topically, intranasally, intrapulmonaryly, or rectally, but is not limited thereto.
  • Examples 1-9 and Comparative Examples 1-4 were designed by varying the type of scFv and albumin binding domain and the location of the albumin binding domain, and the structural model was confirmed.
  • the amino acid sequence of the scFv protein consists of N-terminal V H and C-terminal V L regions connected by a linker.
  • the 'MG' sequence was inserted at the N-terminus as a restriction site for the NcoI enzyme, and a hexahistidine tag (His-tag) sequence was inserted at the C-terminus as a protein purification tag.
  • a SpeI restriction site encoding the amino acid residue “TS” was used for insertion of the albumin binding domain.
  • Figures 1 to 14 show the structures calculated using AlphaFold2 of 4D5 scFv (SEQ ID NO: 4, Figure 1), Examples 1-9, and Comparative Examples 1-4.
  • the three bright sections within each heavy and light chain variable region represent CDRs.
  • Figure 1 is the structure of the original 4D5scFv without the ABD, implemented by AlphaFold2 using the ColabFold web server.
  • Examples 1 to 5 maintained a significant portion of the original structure of 4D5Ab, thereby maintaining anti-HER2 binding affinity.
  • 4D5-S-ABD and 4D5-L-ABD were analyzed by pTM score and pLDDT.
  • the structure was computationally predicted using AlphaFold2 and analyzed by pTM score and pLDDT ( Figure 15, Table 3).
  • the model structure of the 4D5-ABD variant was then aligned with the model structures of 4D5scFv and ABD ( Figure 16, Table 4).
  • the TM scores for all alignments were very high, above 0.94 points. That is, in the constructed 4D5-ABD variant, much of the structure of 4D5scFv and ABD is maintained, meaning that the function will also be maintained.
  • the predicted model structure showed that the position of the inserted ABD was away from the CDR of 4D5scFv, as expected. This fact can also be seen in the visualization of the 4D5-ABD and HER2 complex ( Figure 17), where the ABD is clearly separated from the HER2 binding site. Therefore, it can be predicted that the antigen binding affinity of 4D5scFv will not be significantly hindered by the presence of ABD or albumin binding to ABD. In conclusion, the high structural consistency and positional independence of each component maintains much of the functionality of 4D5scFv and ABD.
  • Examples 1 to 5 were produced as proteins through cytoplasmic expression in bacterial hosts. Specifically, the gene encoding the above amino acid sequence was optimized using ExpOptimizer (NovoPro Bioscience, Shanghai, China), synthesized and subcloned at Macrogen (Seoul, Korea), and inserted into the NcoI/KpnI restriction sites in the pBAD vector to create the pBAD_4D5scFv plasmid. created.
  • 4D5scFv and the plasmids of Examples 1 to 5 were transformed into E. coli TOP10 host cells.
  • Transformed cells were cultured in standard 2xYT medium containing 100 ⁇ g/mL ampicillin for 16 h at 37°C with shaking at 200 rpm. Cells were inoculated into the same fresh medium and cultured until the optical density at 600 nm (OD600) was 0.5 to 0.6. Protein expression was induced by L-(+)-arabinose at a final concentration of 0.2% (w/v). After lowering the temperature to 23°C, the culture was incubated for 24 hours. The grown cells were harvested by centrifugation at 8000 rpm and 4°C, and the cell pellet was stored at -80°C.
  • BI and AI samples for each strain were collected, centrifuged at 13,000 rpm for 1 min, then resuspended in PBS containing 2 M urea (pH 7.4) and subjected to SDS-PAGE analysis. .
  • the above His-tagged examples were purified by metal affinity chromatography using Ni-NTA.
  • the cell pellet was lysed with 1 mg/mL lysozyme and 5 mg/mL DNase in lysis buffer (10mM imidazole, 50mM NaH 2 PO 4 , 300mM NaCl, pH 8.0) and incubated on ice for at least 5 min.
  • the solution was sonicated for a total of 15 min at 1 s pulse, 2 s rest, 28% amplifier (500 W, 20 kHz), and the process was repeated after 5 min rest.
  • the mixture was then centrifuged at 10,000 ⁇ g for 20 min at 4°C, and the supernatant was incubated with Ni-NTA agarose resin for 30 min at 4°C.
  • Figure 18a shows the results of SDS-PAGE analysis of cell lysates collected during expression. Bands were detected in lanes loaded with AI samples with molecular masses of 27, 32, and 33 kDa, respectively, corresponding to the molecular masses of 4D5scFv, 4D5-S-ABD, and 4D5-L-ABD. Purification was performed using the interaction between Ni-NTA in agarose resin and the His-tag affinity tag at the C-terminus of each protein. As a result of SDS-PAGE analysis of the purified protein, a band at the same location as the expression gel was detected (FIG. 18b).
  • MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight
  • the purified samples were characterized by fast protein liquid chromatography (SEC) (Size Exclusion Chromatography).
  • SEC fast protein liquid chromatography
  • An equimolar amount (5 ⁇ M) of sample prepared in PBS (pH 7.4) was injected onto a Superdex 75 Increase 10/300 GL column (Cytiva, Uppsala, Sweden) and eluted at a flow rate of 0.2 mL/min.
  • Ovalbumin, conalbumin, and aldolase from the Gel Filtration Calibration Kit HMW (Cytiva, Uppsala, Sweden) were used as standard proteins. Analysis was performed using an NGC Quest 10 chromatography system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  • 4D5scFv was stable in a mixture of monomers and dimers, and disulfide bonds were not formed according to non-reducing SDS-PAGE.
  • the 4D5-ABD variant did not form a dimer and existed only as a monomer, which may be due to steric hindrance created by the fusion of ABD.
  • the anti-HER2 targeting efficiency of the purified 4D5scFv variant was analyzed through anti-HER2 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) in the presence or absence of HSA. Specifically, recombinant HER2 antigen (500 pg/ ⁇ L, 100 ⁇ L/well) was incubated overnight at 4°C in coating buffer (PBS, pH 7.4) and coated on an immune plate. Plates were washed three times with shaking in PBST (0.05% Tween 20) at 200 ⁇ L/well. Afterwards, the plate was blocked by incubating at room temperature at 200 ⁇ L/well in blocking buffer (5% skim milk in PBST) and washed four times.
  • coating buffer PBS, pH 7.4
  • the anti-HSA efficiency of the purified 4D5-ABD variant was also investigated by ELISA.
  • HSA 500 pg/ ⁇ L
  • Purified proteins were prepared to 20 nM in blocking buffer and serially diluted three-fold. Other conditions and procedures were performed as described above.
  • 4D5-L-ABD and 4D5-S-ABD were found to have the strongest binding force.
  • the binding affinity of ABD appears to be less affected by linker length than that of antibodies due to the small decrease in binding affinity, but the trend was the same as that of antibody binding affinity.
  • GIST Animal Experiment Ethics Committee of the Gwangju Institute of Science and Technology
  • Serum was separated from blood by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 10 min at 4°C and stored at ⁇ 20°C until further use. Serum protein concentrations at each time point were measured by ELISA as described above. Concentrations were calculated by interpolating a standard calibration curve.
  • both ABD fusion variants showed an approximately 70-fold increase in AUC values, which were calculated to be 42, 2887, and 3008 for 4D5scFv, 4D5-S-ABD, and 4D5-L-ABD, respectively. Considering that the detection limit has not been reached for the 4D5-ABD variant, the actual AUC increase is expected to be much higher.

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Abstract

본 발명은 항체의 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 링커로 연결된 단일쇄 가변 단편(scFv)에 알부민 결합 모이어티가 융합된, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질을 제공한다.

Description

단일쇄 가변 단편의 변이 단백질
본 발명은 단일쇄 가변 단편(scFv)의 변이 단백질에 관한 것으로 의료 분야에서 활용될 수 있다.
치료용 항체 시장은 1986년에 승인된 이후 급속히 성장해오고 있다. 기존 단클론 항체가 비용이 많이 들고 힘든 포유류 발현 시스템을 필요로 하고 조직 침투 문제를 겪는 문제로 인해, 이의 대안으로 다양한 항체 단편 형식이 연구되고 있다.
이러한 항체 유도체 중에서 scFvs(single-chain variable fragments)는 1988년에 여러 scFv 기반 치료제가 FDA의 승인을 받아 임상 가능성을 입증받았다. scFv는 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL) 면역글로불린(Igs)은 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는 구조이다. scFv는 원치 않는 결정화 단편(Fc) 매개 면역 반응을 일으키지 않고, 전장 항체보다 종양 침투 및 분포가 더 좋은 이점이 있지만, scFv의 혈청은 일반적으로 크기가 작고(약 25kDa) Fc 영역이 없기 때문에 반감기가 매우 짧은 단점이 있다.
이에 그 유용성에도 불구하고 임상적 적용이 혈액암이나 황반변성과 같은 일부 경우에 국한되고 있는 실정으로, 이를 개선할 수 있는 새로운 scFv 기반 치료제 개발이 필요하다.
본 발명은 신규 구조의 단일쇄 가변 단편의 변이 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 단일쇄 가변 단편의 변이 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 항체의 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 링커로 연결된 단일쇄 가변 단편(scFv)에 알부민 결합 모이어티가 융합된, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
2. 위 1에 있어서, 알부민 결합 모이어티는 링커 내에, 또는 단일쇄 가변 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합되어 있는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
3. 위 1에 있어서, 알부민 결합 모이어티는 링커 내에 융합되고, 단일쇄 가변 단편의 C-말단에 생리활성물질이 융합되어 있는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
4. 위 1에 있어서, 알부민 결합 모이어티는 중쇄 가변 영역(VH)의 C-말단과 경쇄 가변 영역(VL)의 N-말단으로부터 각각 3 aa 이상 이격된 위치에 융합되는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
5. 위 1에 있어서, 알부민 결합 모이어티는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 상보성 결정 영역(CDR)이 위치하는 방향과 반대 방향에 위치하는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
6. 위 1에 있어서, 알부민 결합 모이어티는 10 내지 150 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
7. 위 1에 있어서, 링커는 6 내지 50 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
8. 위 1에 있어서, 단일쇄 가변 단편은 150 내지 350 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
9. 위 1에 있어서, 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)은 각각 70 내지 150 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
10. 위 1에 있어서, 알부민 결합 모이어티는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
11. 위 1에 있어서, 단일쇄 가변 단편은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
12. 위 1에 있어서, 링커는 (GS)n, (GGS)n 또는 (GGGGS)n의 아미노산 서열을 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
13. 위 3에 있어서, 생리활성물질은 사이토카인, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자(IGF)-1, IGF-2, 상피 성장인자(EGF), 변환성장인자(TGF), 인간 성장 호르몬 및 혈관 내피 성장인자(VEGF)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
14. 위 1 내지 13 중 어느 하나의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 알부민 결합 위치가 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)과 간섭이 일어나지 않아서 항원에 대한 우수한 결합력을 나타낸다.
본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 체내에 존재하는 알부민과 결합함으로써 연장된 반감기를 갖는다.
본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 링커 및 알부민 결합 모이어티의 길이를 적절히 조절함으로써 항체 및 알부민 모두에 대한 우수한 결합력을 유지할 수 있다.
본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 사이토카인 등의 생리활성물질을 C-말단에 결합시켜 타겟에 효율적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 세포 침투능이 우수하다.
본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 미생물 생산 시스템으로 쉽게 제조가 가능하다.
본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 공지된 단일쇄 가변 단편(scFv)의 구조 변화를 최소화하면서 알부민 결합 모이어티를 융합할 수 있어서 항체 및 그 단편의 개량에 적절히 활용될 수 있다.
도 1 내지 14는 순서대로 4D5scFv, 본원 실시예 및 비교예 및 이를 AlphaFol2로 구현한 구조를 나타낸 것이다.
도 15는 4D5scFv 및 D5-ABD 변이체의 구조 예측에 대한 전산 평가 결과이다. (a)는 AlphaFold2에 의해 예측되고 PyMOL에 의해 시각화된 모델 구조. (b) AlphaFold2에 의해 보고된 구조 예측을 위한 위치당 pLDDT.
도 16은 4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체를 정렬하고 PyMOL에 의해 시각화한 것이다.
도 17은 PyMOL에 의해 시각화된 2개의 4D5-ABD 변이체와 HER2(PDB ID:1N8Z)의 복합 형태 구조를 나타낸 것이다.
도 18은 4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체의 발현 및 정제에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이다. (a) 발현 동안 달성된 세포 용해물 샘플의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔(MW: 분자량 표준; BI: 유도 전 세포 용해물 샘플; AI: 유도 후 세포 용해물 샘플). (b) 정제된 샘플의 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔.
도 19는 환원 조건(왼쪽) 및 비환원 조건(오른쪽)에서 4D5scFv 및 2개의 4D5-ABD 변이체의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다(MW: 분자량 표준).
도 20은 정제된 4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체에 대한 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 4D5scFv, 4D5-ABD 변이체 및 표준 단백질의 크기 배제 크로마토그램 결과를 나타낸 것이다(4D5scFv: 27kDa; 4D5scFv 이합체: 54kDa; 4D5-S-ABD: 32kDa; 4D5-L-ABD: 33kDa; ovalbumin (OA): 43 kDa; conalbumin (CA): 75 kDa; aldolase (Ald) : 158kDa.
도 22는 HSA 유/무 조건에서 4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체의 항-HER2 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체의 항-HSA ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체의 약동학 프로파일을 나타낸 것이다.
항체의 종류는 본 발명의 변이 단백질 사용 목적에 따라 적절히 선택될 수 있는 것으로 특정의 것으로 제한되지 않는다.
예컨대 질환 항원에 대한 항체일 수 있고, 질환은 암이나 자가면역 질환일 수 있다.
항체는 항암제 또는 면역억제제인 것일 수 있고, 구체적으로 트라스투주맙(Trastuzumab), 낙시타맙(Naxitamab), 세툭시맙(Cetuximab), 텔리소투주맙(Telisotuzumab), 티소투맙(Tisotumab), 피나투주맙(Pinatuzumab), 리파스투주맙(Lifastuzumab), 인두사투맙(Indusatumab), 밴돌투주맙(Vandortuzumab), 소피투주맙(Sofituzumab), 볼세투주맙(Vorsetuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 밀베투시맙(Mirvetuximab), 콜툭시맙(Coltuximab), 나라투시맙(Naratuximab), 인다투시맙(Indatuximab), 아네투맙(Anetumab), 롤보투주맙(Lorvotuzumab), 칸투주맙(Cantuzumab), 라프리투시맙(Laprituximab), 비바투주맙(Bivatuzumab), 바다스투시맙(Vadastuximab), 로발피투주맙(Rovalpituzumab), 이노투주맙(Inotuzumab), 사시투주맙(Sacituzumab), 라베투주맙(Labetuzumab), 밀라투주맙(Milatuzumab), 루팔투맙(Lupartumab), 아프루투맙(Aprutumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), OKT3(Anti-CD3 monoclonal antibody) 으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단일쇄 가변 단편은 본 발명의 목적에 따라 알부민 결합 모이어티를 융합할 수 있는 것이면 특정 아미노산 길이를 갖는 것으로 한정되지 않는다.
단일쇄 가변 단편은 예컨대 그 아미노산의 길이가 100 aa 이상, 110 aa 이상, 120 aa 이상, 130 aa 이상, 140 aa 이상, 150 aa 이상, 160 aa 이상, 170 aa 이상, 180 aa 이상, 190 aa 이상, 200 aa 이상, 210 aa 이상, 220 aa 이상, 230 aa 이상, 240 aa 이상, 250 aa 이상, 260 aa 이상, 270 aa 이상, 280 aa 이상, 290 aa 이상, 300 aa 이상, 310 aa 이상, 320 aa 이상, 330 aa 이상, 340 aa 이상, 350 aa 이상, 360 aa 이상, 370 aa 이상, 380 aa 이상, 390 aa 이상, 400 aa 이상, 410 aa 이상, 420 aa 이상, 430 aa 이상, 440 aa 이상, 450 aa 이상, 460 aa 이상, 470 aa 이상, 480 aa 이상, 490 aa 이상 또는 500 aa 이상일 수 있다.
단일쇄 가변 단편은 예컨대 그 아미노산의 길이가 500 aa 이하, 490 aa 이하, 480 aa 이하, 470 aa 이하, 460 aa 이하, 450 aa 이하, 440 aa 이하, 430 aa 이하, 420 aa 이하, 410 aa 이하, 400 aa 이하, 390 aa 이하, 380 aa 이하, 370 aa 이하, 360 aa 이하, 350 aa 이하, 340 aa 이하, 330 aa 이하, 320 aa 이하, 310 aa 이하, 300 aa 이하, 290 aa 이하, 280 aa 이하, 270 aa 이하, 260 aa 이하, 250 aa 이하, 240 aa 이하, 230 aa 이하, 220 aa 이하, 210 aa 이하, 200 aa 이하, 190 aa 이하, 180 aa 이하, 170 aa 이하, 160 aa 이하, 150 aa 이하, 140 aa 이하, 130 aa 이하, 120 aa 이하, 110 aa 이하 또는 100 aa 이하일 수 있다.
단일쇄 가변 단편은 예컨대 150 내지 350 aa, 160 내지 340 aa, 170 내지 330 aa, 180 내지 320 aa, 190 내지 310 aa 또는 200 내지 300 aa의 길이를 갖는 것일 수 있다.
중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 특정 아미노산 길이를 갖는 것으로 한정되지 않는다.
중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 각각 예컨대 그 아미노산의 길이가 50 aa 이상, 55 aa 이상, 60 aa 이상, 65 aa 이상, 70 aa 이상, 75 aa 이상, 80 aa 이상, 85 aa 이상, 90 aa 이상, 95 aa 이상, 100 aa 이상, 105 aa 이상, 110 aa 이상, 115 aa 이상, 120 aa 이상, 125 aa 이상, 130 aa 이상, 135 aa 이상, 140 aa 이상, 145 aa 이상, 150 aa 이상, 155 aa 이상, 160 aa 이상, 165 aa 이상, 170 aa 이상, 175 aa 이상, 180 aa 이상, 185 aa 이상, 190 aa 이상, 195 aa 이상, 200 aa 이상, 205 aa 이상, 210 aa 이상, 215 aa 이상, 220 aa 이상, 225 aa 이상, 230 aa 이상, 235 aa 이상, 240 aa 이상, 245 aa 이상 또는 250 aa 이상일 수 있다.
중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 각각 예컨대 그 아미노산의 길이가 250 aa 이하, 245 aa 이하, 240 aa 이하, 235 aa 이하, 230 aa 이하, 225 aa 이하, 220 aa 이하, 215 aa 이하, 210 aa 이하, 205 aa 이하, 200 aa 이하, 195 aa 이하, 190 aa 이하, 185 aa 이하, 180 aa 이하, 175 aa 이하, 170 aa 이하, 165 aa 이하, 160 aa 이하, 155 aa 이하, 150 aa 이하, 145 aa 이하, 140 aa 이하, 135 aa 이하, 130 aa 이하, 125 aa 이하, 120 aa 이하, 115 aa 이하, 110 aa 이하, 105 aa 이하, 100 aa 이하, 95 aa 이하, 90 aa 이하, 85 aa 이하, 80 aa 이하, 75 aa 이하, 70 aa 이하, 65 aa 이하, 60 aa 이하, 55 aa 이하 또는 50 aa 이하일 수 있다.
중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 예컨대 각각 70 내지 150 aa, 80 내지 140 aa, 90 내지 130 aa 또는 100 내지 120 aa의 길이를 갖는 것일 수 있다.
링커는 펩타이드 링커이며, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 연결하고 거리 및 배향을 조절함으로써 구조의 안정성을 유지하고 올바른 방향으로 항원에 결합하도록 한다.
예컨대 링커는 그 아미노산의 길이가 3 aa 이상, 4 aa 이상, 5 aa 이상, 6 aa 이상, 7 aa 이상, 8 aa 이상, 9 aa 이상, 10 aa 이상, 11 aa 이상, 12 aa 이상, 13 aa 이상, 14 aa 이상, 15 aa 이상, 16 aa 이상, 17 aa 이상, 18 aa 이상, 19 aa 이상, 20 aa 이상, 21 aa 이상, 22 aa 이상, 23 aa 이상, 24 aa 이상, 25 aa 이상, 26 aa 이상, 27 aa 이상, 28 aa 이상, 29 aa 이상 또는 30 aa 이상일 수 있다.
또한 링커는 그 아미노산의 길이가 100 aa 이하, 95 aa 이하, 90 aa 이하, 85 aa 이하, 80 aa 이하, 75 aa 이하, 70 aa 이하, 65 aa 이하, 60 aa 이하, 55 aa 이하, 50 aa 이하, 55 aa 이하, 50 aa 이하, 45 aa 이하, 40 aa 이하, 35 aa 이하, 30 aa 이하, 25 aa 이하, 20 aa 이하, 15 aa 이하 또는 10 aa 이하일 수 있다.
예컨대 링커는 6 내지 50 aa, 6 내지 40 aa, 6 내지 30 aa 또는 6 내지 20 aa의 길이를 갖는 것일 수 있다.
링커는 scFv의 유연성과 구조적 안정성을 유지할 수 있는 것이면 특정 서열로 된 것으로 한정되지 않는다.
예컨대 (GS(서열번호 7))n, (GGS(서열번호 8))n, (GGGGS(서열번호 9))n 또는 이들의 결합으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 n은 임의의 자연수이고, 1 내지 10, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 이들 결합의 순서와 반복은 제한되지 않으며 두 종류 이상이 결합되는 것일 수 있다.
링커는 서열번호 10 내지 12의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 단일쇄 가변 단편은 N-말단은 시작 제한 서열(start restriction sequence)(예컨대, MG)을 더 포함할 수 있다.
상기 단일쇄 가변 단편의 C-말단은 단일쇄 가변 단편 변이 단백질의 분리 및 정제를 위해 히스태그(His-Tag) 서열(예컨대, HHHHHH)을 더 포함할 수 있다.
예컨대 상기 단일쇄 가변 단편은 서열번호 4(4D5scFv), 서열번호 5(OKTscFv) 또는 서열번호 6(3F8scFv)의 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 알부민 결합 모이어티(Albumin binding moiety, ABM)는 알부민 단백질과 상호작용을 가지는 부분을 의미하며, 에컨대 이는 항체, 항체 유사체, 단백질 도메인, 단백질 모티프, 펩타이드, 화합물, 앱타머, 올리고뉴클레오타이드, 당류 등일 수 있다.
알부민 결합 모이어티는 예컨대 그 아미노산의 길이가 5 aa 이상, 6 aa 이상, 7 aa 이상, 8 aa 이상, 9 aa 이상, 10 aa 이상, 11 aa 이상, 12 aa 이상, 13 aa 이상, 14 aa 이상, 15 aa 이상, 16 aa 이상, 17 aa 이상, 18 aa 이상, 19 aa 이상, 20 aa 이상, 21 aa 이상, 22 aa 이상, 23 aa 이상, 24 aa 이상, 25 aa 이상, 26 aa 이상, 27 aa 이상, 28 aa 이상, 29 aa 이상 또는 30 aa 이상, 31 aa 이상, 32 aa 이상, 33 aa 이상, 34 aa 이상, 35 aa 이상, 36 aa 이상, 37 aa 이상, 38 aa 이상, 39 aa 이상, 40 aa 이상, 41 aa 이상, 42 aa 이상, 43 aa 이상, 44 aa 이상, 45 aa 이상, 46 aa 이상, 47 aa 이상, 48 aa 이상, 49 aa 이상 또는 50 aa 이상일 수 있다.
알부민 결합 모이어티는 예컨대 그 아미노산의 길이가 200 aa 이하, 195 aa 이하, 190 aa 이하, 185 aa 이하, 180 aa 이하, 175 aa 이하, 170 aa 이하, 165 aa 이하, 160 aa 이하, 155 aa 이하, 150 aa 이하, 145 aa 이하, 140 aa 이하, 135 aa 이하, 130 aa 이하, 125 aa 이하, 120 aa 이하, 115 aa 이하, 110 aa 이하, 105 aa 이하, 100 aa 이하, 95 aa 이하, 90 aa 이하, 85 aa 이하, 80 aa 이하, 75 aa 이하, 70 aa 이하, 65 aa 이하, 60 aa 이하, 55 aa 이하 또는 50 aa 이하일 수 있다.
알부민 결합 모이어티는 예컨대 10 내지 150 aa, 30 내지 100 aa, 30 내지 50 aa의 길이를 갖는 것일 수 있다.
예컨대 상기 알부민 결합 모이어티는 서열번호 1(ABD), 서열번호 2(VNAR) 또는 서열번호 3(ABP)의 서열을 갖는 것일 수 있다.
알부민 결합 모이어티는 단일쇄 가변 단편에서 구조 및 항원 결합 기능을 크게 저해하지 않는 곳으로 선택된다. 알부민 결합 모이어티는 링커 내에, 또는 단일쇄 가변 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
알부민 결합 모이어티의 결합 위치에 따라 (i) ABM-VH-linker-VL, (ii) VH-linker-VL-ABM, (iii) VH-ABM-linker-VL, (iv) VH-linker1-ABM-linker2-VL 및 (v) VH-linker-ABM-VL 등으로 도식화할 수 있다.
알부민 결합 모이어티가 (i), (ii)와 같이 N-말단 또는 C-말단에 융합되는 경우, 알부민 결합 모이어티를 연결하기 위한 링커가 추가될 수 있다. 예컨대 (vi) ABM-linker1-VH-linker2-VL, (vii) VH-linker1-VL-linker2-ABM 형태일 수 있다.
linker1 및 linker2의 아미노산 서열 및 길이는 서로 상이할 수 있다.
linker1 및 linker2는 그 아미노산 길이가 각각 3 aa 이상, 5 aa 이상, 7 aa 이상, 9 aa , 10 aa이상일 수 있다. 그 상한은 15 aa 이하, 20 aa 이하, 25 aa 이하, 30 aa, 50 aa 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
알부민 결합 모이어티가 링커 내에 결합되는 경우 중쇄 가변 영역의 C-말단과 경쇄 가변 영역의 N-말단으로부터 각각 2 aa 이상, 3 aa 이상, 4 aa 이상, 5 aa 이상, 6 aa 이상, 7 aa 이상, 8 aa 이상, 9 aa 이상 또는 10 aa 이상 이격된 위치에 융합되는 것이 바람직하다.
예컨대 10 내지 15 aa 길이를 갖는 링커의 4 내지 8 번째 아미노산과 이의 인접한 아미노산 사이에 융합되는 것일 수 있다. 또는 16 내지 20 aa 길이를 갖는 링커의 7 내지 14 번째 아미노산과 이의 인접한 아미노산 사이에 융합되는 것일 수 있다.
구체적으로는 서열번호 10 또는 11의 링커의 5 내지 8번째 아미노산과 이의 인접한 아미노산 사이에 융합되거나, 서열번호 12의 링커의 11 내지 16번째 아미노산과 이의 인접한 아미노산 사이에 융합되는 것일 수 있다.
또는 서열번호 10 또는 11의 링커의 6번째와 7번째 아미노산 사이, 또는 서열번호 12의 링커의 13번째와 14번째 아미노산 사이에 융합되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
알부민 결합 모이어티가 중쇄 가변 영역의 C-말단과 경쇄 가변 영역의 N-말단으로부터 적어도 3 aa 이격되어 융합되지 않는 경우 인접한 상보성 결정 영역(CDR)과의 간섭이 일어나 항체에 대한 결합력이 떨어질 수 있다.
알부민 결합 모이어티가 링커 내에, 또는 단일쇄 가변 단편의 C-말단에 융합되는 경우에는 알부민 결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)이 위치하는 방향과 반대 방향에 위치하게 된다. 여기서 반대 방향이라는 것은 예컨대 상보성 결정 영역(CDR)이 단일쇄 가변 단편 변이 단백질의 아래쪽에 위치하면 알부민 결합 모이어티는 위쪽에 위치한다는 것이다. 또한 반대 방향이라는 것은 예컨대 상보성 결정 영역(CDR)이 단일쇄 가변 단편 변이 단백질의 좌측에 위치하면 알부민 결합 모이어티는 우측에 위치한다는 것이다.
알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)일 수 있다.
본 발명 변이 단백질은 상기 알부민 결합 모이어티를 통해 생체 내 투여시 혈청 알부민과 결합하여 변이 단백질의 대사 및 분해를 지연시키고, 암세포에 대한 투과성을 높일 수 있다.
알부민 결합 모이어티가 단일쇄 가변 단편의 링커 내에 융합되면 단일쇄 가변 단편의 N-말단 또는 C-말단에 생리활성물질을 추가 결합할 수 있다. 또한 알부민 결합 모이어티가 단일쇄 가변 단편의 C-말단이외의 위치에 융합되는 경우 단일쇄 가변 단편의 C-말단에는 생리활성물질을 결합시킬 수 있다. 이 경우 본 발명의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질은 생리활성물질을 타겟에 전달하는 전달체로 기능한다.
생리활성물질은 체내에 투여되었을 때 소정의 활성을 나타낼 수 있는 모든 물질을 의미한다. 생리활성물질은 예컨대 사이토카인, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자(IGF)-1, IGF-2, 상피 성장인자(EGF), 변환성장인자(TGF), 인간 성장 호르몬 및 혈관 내피 성장인자(VEGF)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
사이토카인은 예컨대, 인터루킨(IL-1 내지 IL-17), 종양 괴사 인자(TNF), 인터페론(IFN), 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO) 등일 수 있다.
알부민 결합 모이어티는 단일쇄 가변 단편의 링커 아미노산 서열의 중앙에 융합되는 것일 수 있다. 또는 중앙으로부터 1 내지 5 aa 또는 1 내지 10 aa 떨어진 아미노산과 이와 인접한 아미노산 사이에 융합되는 것일 수 있다.
알부민 결합 모이어티는 예컨대 알부민 단백질 도메인, 어피바디 또는 펩타이드일 수 있다. 이는 항체(IgG)와 비교하여 작은 크기이며 scFv에 융합되어 단일한 폴리펩타이드 체인을 구성한다. 이는 구조에 이황화 결합을 포함하지 않는 것일 수 있다.
알부민 결합 모이어티는 특정 단백질의 일부분일 수도 있고, 인공적으로 설계된 도메인일 수 있다.
예컨대 이는 그람 양성 박테리아에 의해 발현되는 다양한 표면 단백질에서 발견되는 작은 3중 나선 단백질 도메인일 수 있다. 구체적으로는 streptococcal protein G 또는 Finegoldia magna의 protein PAB에서 유래하거나 이로부터 알부민 결합 친화도를 더욱 높이도록 변형된 것일 수 있다.
예컨대 이는 바다상어의 카르틸라지 올리고머 매트릭스 단백질에서 유래한 VNAR(V domain of cartilage oligomeric matrix protein, chondrocyte-derived)이거나 이로부터 알부민 결합 친화도를 더욱 높이도록 변형된 것일 수 있다.
구체적으로 알부민 결합 모이어티는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 변이 단백질은 해당 단백질을 코딩하는 서열을 발현하는 미생물 내에서 제조되는 것일 수 있다.
미생물은 당 분야에 공지된 미생물이 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들면 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
미생물 시스템으로 변이 단백질을 제조하는 경우에는 단백질이 PTM(post-translational modification)을 포함하지 않고 이황화 결합이 없거나 적어야 발현이 용이하다. lgG 등 항체 형태에는 PTM와 이황화 결합을 다수 포함하며, 화합물을 이용하는 경우에는 추가적인 결합과 정제과정이 필요하다. 본 발명의 변이 단백질은 융합된 하나의 폴리펩타이드 형태이며, PTM이 없고 이황화 결합이 적은 특징으로 미생물 시스템 발현을 용이하게 할 수 있다.
전술한 scFv의 링커 서열은, 제조 과정에 있어 유전자 클로닝에서 알부민 결합 모이어티의 삽입을 위해, 제한효소가 인식할 수 있는 부위로 일부분이 대체되거나 이들을 더 포함할 수 있다. 예컨대 알부민 결합 모이어티의 양측에 위치한 링커 서열에서 제한효소(Spe I)의 인식부위인 TS 서열로 일분이 대체되거나 이를 더 포함할 수 있다. TS 서열의 잔기는 상기 링커의 G, S 서열의 잔기와 유사한 이점이 있다.
본 발명은 이상의 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이상의 단백질에 관하여 설명된 사항은 모두 본원의 약학 조성물의 유효성분으로서의 단백질에 그대로 적용된다.
암은 예컨대 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암, 자궁암, 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종, 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 안와암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 림프종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, T 세포 백혈병, 설암, 요관암, 요도암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 질암, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 및 윌름 종양으로 이루진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리 식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 또는 활택제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 주사 제형일 수 있으며, 정맥내 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나, 전적으로 증진시키는데 필요한 양을 의미한다.
본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 약학적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적인 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 지시서가 수반될 수 있으며, 상기 지시서는 조성물의 형태 또는 인간이나 동물 투여에 관하여 사익 기관의 승인을 나타내고 있고, 예를 들어, 약물의 처방에 대하여 미국 식품의약국에서 승인된 표지일 수 있다.
본 발명은 이상의 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 이상의 단백질에 관하여 설명된 사항은 모두 본원의 암의 치료 방법의 유효성분으로서의 단백질에 그대로 적용된다.
본 발명의 방법은 암에 걸린 개체에 상기 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
암에 걸린 개체는 암에 걸린 동물, 구체적으로 암에 걸린 포유류일 수 있고, 보다 구체적으로는 암에 걸린 인간일 수 있다.
단백질은 치료상 유효량으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 상세하게 설명한다.
실시예
scFv 및 알부민 결합 도메인의 종류 및 알부민 결합 도메인 위치를 달리하여 실시예 1-9 및 비교예 1-4을 설계하고 구조 모델을 확인하였다. scFv 단백질의 아미노산 서열은 링커에 의해 연결된 N-말단 VH 및 C-말단 VL 영역으로 구성된다. N-말단에 NcoI 효소의 제한 부위로 'MG' 서열이 삽입되었고, C-말단에는 단백질 정제 태그로 헥사히스티딘 태그(His-tag) 서열이 삽입되었다. 알부민 결합 도메인의 삽입을 위해 아미노산 잔기 "TS"를 암호화하는 SpeI 제한 부위를 사용했다.
[표 1]
Figure PCTKR2023012335-appb-img-000001
도 1 내지 14에서 4D5 scFv(서열번호 4, 도 1), 실시예 1-9 및 비교예 1-4의 AlphaFold2를 사용하여 계산된 구조를 나타내었다. 도면에서 각 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내 밝은 3개 구간은 CDR을 나타낸다. 실시예 모두 단백질 구조가 링커 내부에 융합되어 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 구조를 해치지 않고 정상적으로 폴딩되는 것을 확인할 수 있었다. 도 1은 ABD가 없는 본래 4D5scFv의 구조이며, ColabFold 웹 서버를 사용하여 AlphaFold2에 의해 구현되었다. 이와 비교하여 실시예 1 내지 5가 4D5Ab의 원래 구조를 상당 부분 유지하여 항 HER2 결합 친화력이 유지될 것임을 확인할 수 있었다.
추가적으로 4D5-S-ABD 및 4D5-L-ABD에 대해서는 pTM 점수와 pLDDT로 분석했다. 이러한 익숙하지 않은 형태의 4D5-ABD 변형의 구조적 무결성을 확인하기 위해 AlphaFold2를 사용하여 구조를 계산적으로 예측하고 pTM 점수 및 pLDDT로 분석했다(도 15, 표 3). 그 후 4D5-ABD 변이체의 모델 구조를 4D5scFv 및 ABD의 모델 구조와 정렬하였다(도 16, 표 4). 모든 정렬에 대한 TM 점수는 0.94점 이상으로 매우 높았다. 즉, 구성된 4D5-ABD 변이체에서 4D5scFv 및 ABD의 구조가 많이 유지되어 기능도 유지될 것임을 의미한다. 또한 예측된 모델 구조는 삽입된 ABD의 위치가 예상대로 4D5scFv의 CDR에서 떨어져 있음을 보여주었다. 이 사실은 4D5-ABD 및 HER2 복합체(도 17)의 시각화에서도 볼 수 있으며, 여기서 ABD는 HER2 결합 부위에서 명확하게 분리된다. 따라서, 4D5scFv의 항원 결합 친화도는 ABD의 존재 또는 ABD에 대한 알부민 결합에 의해 크게 방해받지 않을 것이라고 예측할 수 있다. 결론적으로 각 구성 요소의 높은 구조적 일관성과 위치 독립성은 4D5scFv와 ABD의 기능을 상당 부분 유지하게 된다.
[표 2]
Figure PCTKR2023012335-appb-img-000002
[표 3]
Figure PCTKR2023012335-appb-img-000003
실험예
1. 단백질의 발현 및 정제
1.1. 플라스미드
상기 설계로 구축된 변이 단백질 중 실시예 1 내지 5에 대하여 박테리아 숙주에서 세포질 발현을 통해 단백질로 생산하였다. 구체적으로 상기 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 ExpOptimizer(NovoPro Bioscience, 중국 상하이)를 사용하여 최적화 하였으며, 마크로젠(서울, 대한민국)에서 합성 및 서브클론하여 pBAD 벡터 내 NcoI/KpnI 제한 부위에 삽입하여 pBAD_4D5scFv 플라스미드를 생성했다.
4D5scFv 및 실시예 1 내지 5의 플라스미드를 대장균 TOP10 숙주 세포로 형질 전환했다. 형질 전환된 세포는 암피실린 100μg/mL을 함유한 표준 2xYT 배지에서 37°C에서 16시간 동안 배양하면서 200rpm으로 흔들었다. 세포를 동일한 신선한 배지에 접종하고 600nm(OD600)에서 광학 밀도가 0.5 ~ 0.6이 될 때까지 배양했다. 단백질 발현은 최종 농도 0.2%(w/v)의 L-(+)-아라비노스에 의해 유도되었다. 온도를 23°C로 낮춘 후 배양액을 24시간 동안 배양하고, 성장한 세포를 8000rpm, 4°C에서 원심분리하여 수확한 후 세포 펠릿을 -80°C에서 보관했다. 각 변종에 대한 유도 전(BI) 및 유도 후(AI) 샘플을 수집하고 13,000rpm에서 1분간 원심분리한 다음, 2M 요소가 포함된 PBS(pH 7.4)에 다시 현탁하여 SDS-PAGE 분석을 수행했다.
His 태그가 부착된 상기 실시예들을 Ni-NTA를 사용한 금속 친화성 크로마토그래피로 정제했다. 세포 펠릿을 용해 완충액(10mM 이미다졸, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH 8.0)에 1mg/mL 리소자임 및 5mg/mL DNase로 용해하고 최소 5분 동안 얼음 위에서 배양했다. 용액을 1초 펄스, 2초 휴식, 28% 앰프(500W, 20kHz)로 총 15분 동안 초음파 처리하고 5분 휴식 후 이 과정을 반복했다. 이후 혼합물을 4°C에서 20분간 10,000×g으로 원심분리하고 상층액을 4°C에서 30분간 Ni-NTA 아가로스 수지와 함께 배양했다. 배양된 수지를 필터가 있는 폴리프로필렌 컬럼에 로드한 후 세척 버퍼(20mM 이미다졸, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH 8.0)로 세척하고 용출 버퍼(250mM 이미다졸, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH 8.0)로 용출했다. 제조업체의 프로토콜에 따라 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 버퍼를 PBS(pH 7.4)로 교환했다. 정제된 단백질을 4°C에서 보관하고 SDS-PAGE로 분석했다.
1.2. SDS-PAGE 분석
재부유된 BI 및 AI 샘플과 정제된 단백질을 포함하여 준비된 단백질을 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 사용하여 분석했다. 모든 샘플은 환원을 위해 100mM 디티오트레이톨(DTT)이 포함된 2× 샘플 로딩 염료(0.2% 브로모페놀 블루, 4% SDS, 20% 글리세롤, 100mM Tris-HCl, pH 6.8)와 혼합되었다. 환원되지 않는 샘플을 준비하기 위해 DTT는 제외되었다. 샘플을 100°C에서 10분간 끓인 후 12% SDS-PAGE 젤에 넣었다. 전기영동 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(0.25% 쿠마시 블루, 50% 에탄올, 10% 아세트산)로 염색하고 데스티네이트(50% 에탄올, 10% 아세트산)했다. 겔은 ChemiDoc XRS+ 시스템(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 헤라클레스)을 사용하여 이미지화 및 시각화했다.
도 18a에 발현 중에 수집한 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내었다. 각각 27, 32, 33kDa의 분자량을 가진 AI 샘플이 로드된 레인에서 밴드가 검출되었으며, 이는 4D5scFv, 4D5-S-ABD 및 4D5-L-ABD의 분자량에 해당한다. 정제는 아가로스 수지의 Ni-NTA와 각 단백질의 C-말단에 있는 His-tag 친화성 태그 간의 상호작용을 이용하여 수행했다. 정제된 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과, 발현 겔과 동일한 위치의 밴드가 검출되었다(도 18b).
또한 실시예 1 및 2를 통해 확인한 결과 변이 단백질 환원 및 비환원 조건 모두에서 단량체 단백질 밴드만 나타났는데(도 19), 이는 실질적인 분자 간 이황화 결합이 형성되지 않았음을 의미한다.
1.3. MALDI-TOF 분석
MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) 분석을 수행했다. 정제된 샘플을 PBS(pH 7.4)에서 Zeba Spin Desalting Column (7K MWCO)을 사용하여 탈염하고 0.1% TFA 용액으로 준비했다. 샘플을 TA30(30% 아세토니트릴, 0.1% TFA) 용액에 포화시킨 SA 매트릭스와 1:1(v/v)의 비율로 혼합했다. 에탄올 용액에 포화시킨 SA 매트릭스를 강철 타겟 플레이트에 사전 증착한 다음, 샘플 혼합 용액을 층 위에 증착하여 Autoflex speed(미국 매사추세츠주 빌레리카, 브루커)를 사용하여 분자량 분석을 수행했다. 보정 표준품으로 Protein Standard II를 사용했다. 이 세 가지 단백질은 MALDI-TOF 분석을 통해 추가로 확인되었다(도 20).
도 20에서, 온전한 4D5scFv, 4D5-S-ABD, 4D5-L-ABD의 질량 스펙트럼에서 26,645, 32,013, 32,816 m/z에서 피크가 검출되었다. 1% 미만의 편차로, 이는 각각 26,801, 32,155, 32,759 m/z인 4D5scFv 변이체의 예상 값과 잘 일치했다. 정제된 4D5scFv, 4D5-L-ABD 및 4D5-S-ABD의 생산 수율은 각각 22.0 ± 0.5, 18.8 ± 1.3 및 21.5 ± 0.8 mg/L였다. 전반적으로 이러한 결과는 4D5scFv 변종 샘플이 성공적으로 발현 및 정제되었음을 보여준다.
1.4. SEC 분석
추가적으로 실시예 1 및 2에 대해서 정제된 샘플은 고속 단백질 액체 크로마토그래피 SEC(Size Exclusion Chromatography)로 특성화했다. PBS(pH 7.4)에서 준비된 등몰량(5 μM)의 샘플을 Superdex 75 Increase 10/300 GL 컬럼(Cytiva, 스웨덴 웁살라)에 주입하고 0.2mL/min의 유속으로 용출시켰다. 표준 단백질로는 Gel Filtration Calibration Kit HMW(Cytiva, 스웨덴 웁살라)의 오발부민, 코날부민 및 알돌라제를 사용했다. 분석은 NGC Quest 10 크로마토그래피 시스템(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 헤라클레스)을 사용하여 수행했다.
도 21의 SEC 분석 결과를 보면, 4D5scFv는 단량체와 이량체의 혼합물에서 안정적이며, 비환원 SDS-PAGE에 따라 이황화 결합이 형성되지 않는 것으로 나타났다. 반대로 4D5-ABD 변이체는 이합체를 형성하지 않고 단량체로만 존재했는데, 이는 ABD의 융합으로 인해 생성된 입체 장애 때문일 수 있다.
2. 결합 친화성 분석
(1) HER2에 대한 결합 친화성 분석
HSA의 유무에 따라 항 HER2 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 통해 정제된 4D5scFv 변이체의 항 HER2 표적 효율을 분석했다. 구체적인 방법으로, 코팅 완충액(PBS, pH 7.4)에 재조합 HER2 항원(500 pg/μL, 100 μL/웰)을 4°C에서 하룻밤 배양하여 면역 플레이트에 코팅했다. 플레이트는 200μL/웰에서 PBST(0.05% Tween 20)로 흔들어 세 번 세척했다. 이후 차단 완충액(5% 탈지유를 PBST에 넣어 200 μL/웰에서 실온에서 배양하여 플레이트를 차단한 후 4회 세척했다. 정제된 단백질을 실온에서 1:2 몰 비율로 HSA를 첨가하거나 첨가하지 않은 PBS(pH 7.4)에서 배양했다. 배양된 단백질을 차단 완충액에서 준비하여 50 nM 스톡을 만들고, 이를 연속적으로 3배 희석했다. 준비된 샘플(100 μL/웰, n = 2)을 플레이트에 로드하고 실온에서 배양한 후 결합되지 않은 단백질을 4회 세척했다. 플레이트는 차단 완충액에 1:1500으로 희석한 토끼 항-His-태그 항체 100μL/웰로 배양되었다. 배양 후 웰을 4회 세척했다. 마지막으로, 차단 완충액에 1:3000으로 희석한 100 μL/웰의 HRP-결합 항-토끼 IgG 항체와 함께 배양했다. 웰을 4회 세척했다. 100 μL/웰의 TMB를 첨가하여 검출을 수행한 후, 반응은 2 M HCl로 켄칭했다. 결합된 단백질은 450nm에서 흡광도를 측정하여 정량화했다.
도 22 및 하기 표 4에서 실험 결과를 나타내었다. 모든 단백질은 유사한 농도 의존적 곡선을 보였으며, 이는 ABD 삽입이 4D5scFv의 구조에 상당한 왜곡을 일으키지 않았으며, 결과적으로 4D5-ABD 변이체의 항 HER2 결합 친화력을 유지함을 시사한다.
구체적으로 Albumin이 ABD에 붙었을 때와 안 붙었을 때의 결합력을 비교하기 위해 항체와 HSA를 미리 incubation한 실험군(HSA+)과 하지 않은 실험군(HSA -)을 비교하였다. ABD가 없는 4D5scFv의 HER2 결합은 크게 변하지 않아, 4D5scFv의 항 HER2 결합 친화력이 HSA의 존재에 의해 방해받거나 차단되지 않음을 알 수 있다. 4D5-ABD 변이체에 HSA가 결합하면 항 HER2 결합 친화도가 약간 감소할 수 있는데, 이는 부피가 큰 HSA가 4D5scFv와 결합할 때 HER2에 대한 입체 장애가 약하기 때문인 것으로 보인다. HSA가 있을 때와 없을 때 모두 ABD를 링커 중간에 위치 시킨 4D5-L-ABD와 4D5-S-ABD가 상대적으로 강한 결합력을 보였으며, 그 중에서도 링커 길이가 가장 긴 4D5-L-ABD가 가장 강한 결합력을 보였다. AlphaFold2로 예측한 구조를 토대로, ABD가 CDR 근처에 위치하여 낮은 binding affinity를 가질 것으로 예상되었던 LinkC와 TermN이, 예상 외로 ABD가 CDR과 떨어져 있는 LinkN 변이체보다 높은 binding affinity를 가지는 것으로 나타났다. 이는 LinkC와 TermC의 경우 ABD C-term에 최소한의 linker residue가 삽입된 데 반해, LinkN은 N-term에 추가적인 linker residue가 없기 때문으로 추측된다. 이는 각 변이체를 만들기 위한 cloning 과정에서 발생한 차이이다. 이는 ABD와 항체 사이에 linker가 적거나 없을 경우 입체 장애가 발생하며, 결합력을 위해서는 항체와 ABD 사이에 최소한의 linker가 필요하다는 것을 의미한다. 따라서 링커 영역 중간에 ABD를 삽입하여 항체와 ABD가 가장 입체 장애의 영향을 덜 받은 4D5-S-ABD와 4D5-L-ABD가 가장 높은 결합력을 가지는 것으로 보인다.
[표 4]
Figure PCTKR2023012335-appb-img-000004
(2) HSA 결합 친화력 분석
ELISA를 통해 정제된 4D5-ABD 변이체의 항 HSA 효율도 조사했다. 구체적인 방법으로, 코팅 완충액에 있는 HSA(500 pg/μL)를 플레이트에 코팅했다. 정제된 단백질을 차단 완충액에서 20 nM으로 제조하고 연속적으로 3배 희석했다. 이 외 다른 조건과 절차는 위에서 설명한 대로 수행되었다.
HSA가 존재할 때 4D5scFv 변이체의 결합 친화력도 조사하기 위해, 모든 변이체를 1:2 몰 비율로 HSA로 사전 배양한 후 ELISA를 실시했다. 도 23 및 하기 표 5에서 항-HSA 결합 친화력 결과를 나타냈다.
4D5-L-ABD와 4D5-S-ABD가 가장 강한 결합력을 가지는 것으로 나타났다. ABD의 결합력은 그 감소세가 적어 항체의 경우보다 링커 길이에 의한 영향을 덜 받는 것으로 보이나, 경향은 항체 결합력과 동일하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2023012335-appb-img-000005
2.9. 약동학 분석
약동학 분석을 위해 마우스를 사용해 4D5scFv 변이체의 혈청 반감기를 조사했다. 실험은 광주과학기술원(GIST)의 동물실험윤리위원회의 가이드라인에 따라 수행되었다. 구체적으로, 200 μL PBS(pH 7.4)에서 정제된 4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체(100 μg/mL)를 9주령 암컷 BALB/c 마우스(n = 4)의 꼬리 정맥에 주사했다. 후안와 채혈을 통해 주사 후 3분, 1, 2, 4, 8, 24, 48시간에 혈액 샘플(<100 μL)을 채취했다. 혈청은 4°C에서 10분간 10,000 × g으로 원심분리하여 혈액에서 분리한 후 추후 사용할 때까지 -20°C에서 보관했다. 각 시점의 혈청 단백질 농도는 위에서 설명한 대로 ELISA로 측정했다. 농도는 표준 보정 곡선을 보간하여 계산되었다.
4D5scFv 및 4D5-ABD 변이체의 혈청 반감기를 BALB/c 마우스에 정맥 주사한 후 측정했다(n = 4). 혈청에 남아있는 단백질을 정량하기 위해 ELISA를 수행했다(도 23). 4D5scFv는 혈청 반감기가 18분으로 혈액에서 빠르게 제거되었다. 반면, 4D5-S-ABD 및 4D5-L-ABD는 34시간의 현저하게 연장된 반감기를 보였으며, 이는 4D5scFv에 비해 114배 증가한 수치이다. 또한 두 ABD 융합 변이체 모두 AUC 값이 약 70배 증가했으며, 4D5scFv, 4D5-S-ABD 및 4D5-L-ABD의 경우 각각 42, 2887 및 3008로 계산되었다. 4D5-ABD 변종의 경우 검출 한계에 도달하지 않았다는 점을 고려하면 실제 AUC 증가는 훨씬 더 높을 것으로 예상된다.
[표 6]
Figure PCTKR2023012335-appb-img-000006
상기 1 0-2 h; 2 0-48 h.
4D5-ABD 변이체에서 반감기가 크게 증가한 것은 알부민과 결합한 4D5-ABD 분자가 FcRn 매개 재활용을 거쳤기 때문이라고 추론할 수 있다. 이 결과는 또한 내부에 삽입된 ABD가 혈청 알부민에 대한 결합 친화력을 유지한다는 것을 보여주며, 이는 구조 계산 및 ELISA 결과와 일치하는 것이다. 그리고 4D5-ABD 변이체 간에는 차이가 관찰되지 않았으며, 이 또한 ELISA 결과와 일치한다. 또한 이는 4D5-S-ABD 변이체의 15개 아미노산 잔기의 링커 길이가 알부민에 결합하기 위해 ABD 모이어티를 자유롭게 이동시키기에 충분하다는 것을 시사한다.

Claims (14)

  1. 항체의 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 링커로 연결된 단일쇄 가변 단편(scFv)에 알부민 결합 모이어티가 융합된, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 알부민 결합 모이어티는 상기 링커 내에, 또는 상기 단일쇄 가변 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합되어 있는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 알부민 결합 모이어티는 상기 링커 내에 융합되고, 상기 단일쇄 가변 단편의 C-말단에 생리활성물질이 융합되어 있는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 알부민 결합 모이어티는 상기 중쇄 가변 영역(VH)의 C-말단과 상기 경쇄 가변 영역(VL)의 N-말단으로부터 각각 3 aa 이상 이격된 위치에 융합되는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 알부민 결합 모이어티는 상기 중쇄 가변 영역(VH) 및 상기 경쇄 가변 영역(VL)의 상보성 결정 영역(CDR)이 위치하는 방향과 반대 방향에 위치하는, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 알부민 결합 모이어티는 10 내지 150 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 6 내지 50 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 단일쇄 가변 단편은 150 내지 350 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)은 각각 70 내지 150 aa의 길이를 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 알부민 결합 모이어티는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 단일쇄 가변 단편은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 (GS)n, (GGS)n 또는 (GGGGS)n의 아미노산 서열을 갖는 것인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  13. 청구항 3에 있어서, 생리활성물질은 사이토카인, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자(IGF)-1, IGF-2, 상피 성장인자(EGF), 변환성장인자(TGF), 인간 성장 호르몬 및 혈관 내피 성장인자(VEGF)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 단일쇄 가변 단편 변이 단백질.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 단일쇄 가변 단편 변이 단백질을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018151868A2 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Sonnet Bio Therapeutics Albumin binding domain fusion proteins
US20210060171A1 (en) * 2018-01-26 2021-03-04 Duke University Albumin binding peptide-drug (aibiped) conjugates and methods of making and using same
KR20210095781A (ko) * 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018151868A2 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Sonnet Bio Therapeutics Albumin binding domain fusion proteins
US20210060171A1 (en) * 2018-01-26 2021-03-04 Duke University Albumin binding peptide-drug (aibiped) conjugates and methods of making and using same
KR20210095781A (ko) * 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein 30 August 2014 (2014-08-30), ANONYMOUS : "anti-HER2 single chain antibody variable region, partial [synthetic construct]", XP093140363, retrieved from NCBI Database accession no. AIL24996.1 *
KWON NA HYUN, LEE JAE HUN, KWON INCHAN: "Computation-Aided Design of Albumin Affibody-Inserted Antibody Fragment for the Prolonged Serum Half-Life", PHARMACEUTICS, MDPI AG, CH, vol. 14, no. 9, 24 August 2022 (2022-08-24), CH , pages 1769, XP093140362, ISSN: 1999-4923, DOI: 10.3390/pharmaceutics14091769 *

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