FI90983B - Menetelmä yhdistelmäinterferonipolypeptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

90983

Menetelmä yhdistelmäinterferonipolypeptidien valmistamiseksi

Keksintö koskee uusia yhdistelmäinterferoneja ja niiden mikrobiologista tuottamista yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Niitä voidaan käyttää virus- ja kasvainsairauksien hoidossa.

Interferonit ("IFN:t") ovat joukko polypeptidejä, joita erilaiset eukaryoottiset solut erittävät jouduttuaan alttiiksi erilaisten mitogeenien ja virusten vaikutukselle. Interferonit on kemiallisten ja biologisten ominaisuuksiensa perusteella luokiteltu kolmeen ryhmään, jotka ovat IFN-a, IFN-β ja IFN-γ. IFN-a- ja -β-geenit ilmentyvät pääasiassa sellaisissa soluissa, jotka on käsitelty viruksilla, virusten rakenneosilla tai kaksisäikeisellä RNAilla. IFN-γ sitä vastoin ilmentyy vasteena mitogeeneille.

Ihmisen IFN-a:aa koodittaa geeniperhe, joka koostuu vähintään 15 ei-alleelisesta geenistä. Ihmisen IFN-β ja IFN-γ ovat kumpikin yhden geenin koodittamia. IFN-a:n primäärinen luentatuote koostuu 189 aminohaposta (paitsi IFN-a2: 188 aminohappoa), josta 23 aminohaposta koostuva signaalipep-tidi poistetaan luennanjälkeisessä muuntotoimenpiteessä. Ihmisen IFN-β ja ihmisen IFN-γ koostuvat 187 ja 186 aminohaposta, joista poistetaan 21 tai 20 aminohaposta muodostuva signaalipeptidi. IFN*a:n alatyyppien aminohapposek-venssihomologia on 80 - 85 %, kun taas homologia IFN-β:n ja IFN-a:n välillä on noin 30 - 40 %. IFN-γ osoittaa homolo-giaa IFN-a:n kanssa vain yksittäisten aminohappojen kohdalla niin, että identtisiä tähteitä on vain 12 %.

Interferoneilla on virustenvastaisia, immunomodulato-risia sekä sytotoksisia ominaisuuksia. On osoitettu, että IFN-a-alatyypit (esim. IFN-a2, IFN-α^) kohdistavat vaikutuksensa spesifisesti eri kohdesoluihin. IFN-a2:n ja IFN-a^:n virustenvastainen vaikutus on suunnilleen sauna naudan (MDBK)-soluissa, mutta IFN-a2 on seitsemän kertaa tehokkaampi kuin IFN-a1 ihmisen (WISH)-soluissa ja 30 kertaa tehottomampi kuin IFN-α^ hiiren (L 929)-solujen suojaamisessa (M.Streuli et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 2848 (1981)). Havainnot siitä, että IFN-a-monigeeniper- 2 heen jäsenten virustenvastaisen aktiivisuuden laajuus ja spesifisyys vaihtelee, on osoitettu eräille IFN-a-"yhdis-telmille" saaduilla tuloksilla (ks. eurooppalainen patenttijulkaisu no. 32134 ja USA:n patenttijulkaisu no. 4 414 150). Nämä "yhdistelmät" on rakennettu katkaisemalla interferonien alatyyppejä koodittavat kaksi geeniä restriktioentsyy-millä PvuII (tai kahdessa tapauksessa BglII:lla) ja vaihtamalla näin saadut jaksot keskenään niin, että toisen IFN-geenin aminoterminaalista päätä koodittava DNA-sekvenssi liitettiin toisen IFN-geenin karboksiterminaalista päätä koodittavaan DNA-sekvenssiin. Vaikka nämä yhdistelmäin-terferonit osoittavat muutoksia kohdesoluspesifisyydessä kantainterferoneihin verrattuna, ei missään näissä kolmessa interferoniaktiivisuudessa voitu havaita heikkenemistä tai rajoittuneisuutta. Tällainen heikkeneminen tai rajoittuneisuus saattaa olla toivottavaa esimerkiksi kliinisissä sovellutuksissa, joissa halutaan kohdistaa interferonihoito tiettyyn ongelmaan, kuten virusinfektioon, tarvitsematta ottaa huomioon komplikaatioita, jotka johtuvat käytetyn interferonin muista aktiivisuuksista.

Näin ollen esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota uusia yhdistelmäinterferoneja, jotka osoittavat spesifisempää biologista aktiivisuutta johtuen vain joidenkin interferonin indusoimien biokemiallisten tapahtumien selektiivisestä tai vallitsevasta aktivoitumisesta ja/tai, joista on poistettu tai vähennetty eräitä luontaisten interferonien ei-toivottuja, niiden käyttöä rajoittavia sivuvaikutuksia, kuten influenssaa muistuttavat oireet (esim. kuume, päänsärky ja väsymys), gastrointes-tinaaliset häiriöt, verenpaineen lasku ja hiustenlähtö.

Keksinnönmukaiset yhdistelmäinterferonit on johdettu ihmisen lymfoblastoidi-interferonista LyIFN-a-2, jonka sekvenssi on seuraava

CYS ASP LEU PRO GLN THR HI S SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE

SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE

TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN

ti 3 90983

GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER

LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

ja ihmisen lymfoblastoidi-interferonista LyIFN-a-3, jonka sekvenssi on seuraava

CYS ASP LEU PRO GLU THR HIS SER LEU ASP ASN ARG ARG THR LEU MET LEU

LEU ALA GLN MET SER ARG ILE SER PRO SER SER CYS LEU MET ASP ARG HIS

ASP PHE GLY PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP GLY ASN GLN PHE GLN LYS ALA

PRO ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU LEU ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN

GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA

VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER

LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

Nämä interferonit ja niiden valmistusmenetelmät on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no.

76 489. LyIFN-a-2 on sukua (mutta se ei ole identtinen) ihmisen leukosyytti-interferonille LeIF-αΒ (ks. USA:n patenttijulkaisua no. 4 414 150) ja sen spesifinen ak tiivisuus primäärisiin vasikanmunuaissoluihin ja ihmisen sikiön esinahan soluihin (HEF, jotka kumpikin on infektoi-

O

tu vesicular stomatitis-viruksella) on 1,85x10 kj/mg g ja 2,45x10 ky/mg vastaavasti. LyIFN-a-3 on sukua (mutta ei identtinen) ihmisen leukosyytti-interferonin LelF-aD kanssa (ks. USA:n patenttijulkaisu no. 4 414 150) ja sen

Q

spesifinen aktiivisuus vasikan soluille on 1,32x10 ky/mg ja HEF-soluille (kuten edellä) on 3,7x106 ky/mg. Lisäksi LyIFN-a-3s 11a on suurempi lämmönkestävyys ja pienempi lisääntymistä estävä vaikutus kuin LyIFN-a-2:11a.

Tämän keksinnön erityiskohteena on tarjota LyIFN-a-2/ a-3-yhdistelmäpolypeptidejä, joissa yhdistyy LyIFN-a-2:n ihmisen soluihin kohdistama korkea virustenvastainen tiit- 4 teri ja/tai korkeampi lisääntymistä estävä aktiivisuus sekä LyIFN-a-3:n korkea lämmönkestävyys.

Erityisesti keksintö koskee yhdistelmäinterferoni-polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi koostuu kahdesta -neljästä alasekvenssistä, jotka vastaavat aminohappojensa identiteetin ja lukumäärän suhteen ihmisen lymfoblastoidi-interferonien LyIFN-a-2 ja LyIFN-a-3 alasekvenssejä, ja mainittu yhdistelmäinterferonipolypeptidi on polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LyIFN-a-2:n aminohapoista 1 - 150 ja LyIFN-a-3:n aminohapoista 151 - 166, polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LyIFN-a-2:n aminohapoista 1 - 92, LyIFN-a-3:n aminohapoista 93 - 150 ja LyIFN-a-2:n aminohapoista 151 - 166, polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LyIFN-a-2:n aminohapoista 1-60, LyIFN-a-3:n aminohapoista 61 - 92 ja LyIFN-a-2:n aminohapoista 93 - 166, tai polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LyIFN-a-2:n aminohapoista 1 - 60, LyIFN-a-3:n aminohapoista 61 - 92 ja LyIFN-a-3:n aminohapoista 93 - 166.

Tarkemmin sanottuna keksintö koskee yhdistelmäinter-feronia "B1B2B3D4", jonka kaava on (i)

CYS ASP LEO PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEO ILE LEO

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEO LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLO PHE PRO GLN GLO GLO PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEO HIS GLO MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEO PHE

SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEO ASP GLO THR LEO LEO ASP GLO PHE

TYR ILE GLO LEO ASP GLN GLN LEO ASN ASP LEO GLO SER CYS VAL MET GLN

GLO VAL GLY VAL ILE GLO SER PRO LEO MET TYR GLO ASP SER ILE LEO ALA

VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEO TYR LEO THR GLU LYS LYS TYR

SER SER CYS ALA TRP GLO VAL VAL ARG ALA GLO ILE MET ARG SER LEO SER

LEO SER THR ASN LEO GLN GLO ARG LEO ARG ARG LYS GLO

(I), kaavan (II) mukaista yhdistelmäinterferonia "B^B2D3B4"

CYS ASP LEO PRO GLN THR HIS SER LEO GLY ASN ARG ARG ALA LEO ILE LEO

LEO ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEO LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLO PHE PRO GLN GLO GLO PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEO HIS GLO MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEO PHE

SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEO ASP GLO THR LEO LEO ASP GLO PHE

li 5 90983

TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER

LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

(II) , kaavan (III) mukaista yhdistelmäinterferonia "B.jD2B3D4"

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN

GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA

VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER

LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

(III) , kaavan (IV) mukaista yhdistelmäinterferonia "Β^θ2θ3Β4"

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN

GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA

VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER

LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

(IV), kaavan (V) mukaista yhdistelmäinterferonia "B^D2D3D4" 6

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN

GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA

VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER

LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

(V) .

ja kaavan (VI) mukaista yhdistelmäinterferonia "B^D2B2B^"

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN

GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA

VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER

LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

(VI) .

Etusijalle asetettavat keksinnönmukaiset yhdistelmä-interferonit ovat "B^D2D2D^" (V) ja "B^B2D2B^" (II).

Keksinnönmukainen yhdistelmäninterferoni voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-menetelmällä, joka koostuu esimerkiksi seuraavista vaiheista: a) Valmistetaan DNA, joka kattaa mainittua yhdistelmä-interferonia koodittavan rakennegeenin, suorittamalla yhdisteleminen in vitro interferonien LyIFN-a-2 ja LyIFN-ot-3 vastaavien aminohappojen no. 60, 92 ja 150 kohdalta tai syntetisoimalla DNA kemiallisesti ja sijoittamalla saatu DNA sopivaan ilmentämisvektoriin.

7 90983 b) Siirretään saatu yhdistelmävektori, joka kantaa yhdis-telmä-IFN:n rakennegeeniä, vastaanottajaisäntään.

c) Valitaan transformoituneet isännät transformoitumatto-mien isäntien joukosta tavallisesti viljelemällä sellaisissa olosuhteissa, joissa vain transformoituneet isännät säilyvät hengissä.

d) Viljellään transformoituneita isäntiä olosuhteissa, jotka sallivat yhdistelmä-IFN:n rakennegeenin ilmentymisen.

e) Eristetään ilmentynyt yhdistelmä-IFN.

Käytetyt menetelmät selviävät yksityiskohtaisemmin seuraavasta yksityiskohtaisemmasta kuvauksesta ja liitteenä olevista piirroksista, joista

Kuvassa 1 verrataan keskenään kypsän LyIFN-a-2:n ja LylFN-a-3:n aminohapposekvenssiä. Kuvaan on merkitty vain ne LyIFN-a-3:n aminohapot, jotka eroavat vastaavista LyIFN-a-2:n aminohapoista. LyIFN-a-3:n aminohapposekvenssi on muuten identtinen LyIFN-a-2:n aminohapposekvenssin kanssa.

Kuva 2 esittää LyIFN-a-2:n ja LyIFN-a-3:n koodittavien alueiden nukleotidisekvenssejä ja osia rakennegeenin ulkopuolisista 3'-alueista. ATG-luennanaloituskodoni, terminaatio-tripletit ja edulliset restriktiokohdat on alleviivattu. Koodittavat tripletit on numeroitu.

Kuva 3 esittää plasmidien pBR(AP)/LyIFN-a-2 ja pBR(AP)/ LyIFN-a-3 pienten Hindlll-PstI-jaksojen restriktiokartto-ja. Valkoinen alue (LyIFN-a-3) ja musta alue (LyIFN-a-2) rajaavat kypsää IFN:ää koodittavat alueet. Alla on esitetty IFN-polypeptidin primäärirakenteen (166 aminohappoa) jako neljään osaan.

Kuvat 4 ja 5 esittävät kantajahelmeen sitoutunutta radioaktiivisuutta koeliuoksen sisältämän IFN-a-2-määrän funktiona voileipä-RIA-menetelmällä mitattuna.

1. Yhdistelmä-IFN:n rakennegeenin sisältävien yhdistelmä-vektorien rakentaminen

Ihmisen a-interferonin alatyyppien a-2 ja a-3 cDNA:t on kloonattu E. coliin. Näin ollen plasmidi pBR(AP)/LylFN-α-2 ja pBR(AP)/LylFN-or3 sisältävät Hindlll-PstI- (tai EcoRI- 8

PstI-) DNA-liitännäisen, jotka sisältävät vastaavasti LyIFN-a-2:ta ja LyIFN-a-3:a koodittavan alueen g-laktamaa-sin promoottorin ohjauksessa (ks. eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 76 489). Mainittujen liitännäisten rest-riktiokartat on esitetty kuvassa 3. Voidaan helposti havaita, että geeneillä on joitakin yhteisiä restriktiokoh-tia (sijaitsevat kohdissa 60, 92 150 IFN:n aminohapposekvenssissä) , joita voidaan käyttää hyväksi rakennettaessa uusia yhdistelmäinterferoneja, joilla on edullisia biologisia ja/tai fysikaalisia ominaisuuksia.

Näin ollen yhdistelmiä (joissa on tapahtunut yksi tai useampia vaihtoja) LyIFN* a-2-geenin ja LyIFN-a-3-geenin välille voidaan saada aikaan suorittamalla in vitro-yhdiste-ly PvuII-kohdasta (kohta 92) ja/tai Sau3A-kohdista (kohdat 60 ja 150). Koska interferonien primäärirakenne voidaan näin jakaa 4 osaan (ensimmäinen osa kattaa aminohapot 1-60, toinen aminohapot 61 - 92, kolmas aminohapot 93 - 150 ja neljäs aminohapot 151 - 166, ks. kuva 3), voidaan tämän keksinnön mukaisia yhdistelmäinterferoneja kuvata neljällä kirjaimella, joista kukin edustaa läsnä olevaa osaa. Näin ollen esimerkiksi yhdistelmäinterferonista (I), joka koostuu interferonin LyIFN-a-2osista 1-3 ("B"LyIFN-a-2 on sukua IFN-aB:lle, supra) ja interferonin LyIFN-a-3 osasta 4 ("D", LyIFN-a-3 on sukua IFN-aD:lle, supra), käytetään merkintää IFN "B.B-B-D.".

12 3 4

Jotta voitaisiin helpottaa halutun yhdistelmäinterfe-ronin tuotantoa, pitää DNA-liitännäiset, jotka sisältävät vastaavasti LyIFN-a-2:ta tai LyIFN-a-3:a koodittavan alueen, muuntaa yhteenliittämistarkoituksia varten siten, että ne tulevat sisältämään vain yhden ainoan Hindlll-(tai EcoRI-), PvuII- ja Pstl-kohdan. Kuvasta 3 ilmenee, että LyIFN-a-2:aa koodittavalla alueella on rakennegeenin ulkopuolisella 3'-alueella lisä-PvuII-kohta. Tämä kohta voidaan helposti poistaa esimerkiksi katkaisemalla LyIFN-a-2:ta koodittavan alueen sisältävä yhdistelmävektori osittain PvuII:11a, liittämällä näin saatu linearisoitunut DNA kytkijään, joka sisältää restriktioendonukleaasin PstI tunnistaman DNA-sekvenssin, katkaisemalla Pstlrllä, liittämällä hajoamistuotteet yhteen pienessä DNA-pitoisuudessa ja li 9 90983 valitsemalla plasmidit (esim. restriktioanalyysillä), joissa on haluttu muunnos eli lyhentynyt rakennegeenin ulkopuolinen 3'-alue, josta PvuII-kohta on poistunut. Vastaavasti on IFN-geenien kloonauksessa käytetyt vektorit edullista muuntaa siten, että niissä on yksi ainoa Hindlll-, PvuII-ja Pstl-kohta.

Keksintö koskee yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät minkä tahansa kaavan I - VI mukaista yhdistelmäinterferonia koodittavan DNA-sekvenssin toiminnallisesti liittyneenä ilmentymisenohjaussekvenssiin, sekä menetelmiä näiden yhdistelmävektorien valmistamiseksi.

Vektori valitaan sen mukaan, mitä isäntäsoluja halutaan käyttää. Esimerkkejä sopiviksi isänniksi ovat sellaiset mikro-organismit, joilta puuttuvat, tai joissa on vain vähän restriktioentsyymejä tai muuntoentsyymejä, kuten hiivat, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae, ja Escherichia coli-kannat, esimerkiksi E. coli X1776, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 tai E. coli Kl2-kanta 294. Edellä luetelluista kannoista asetetaan isäntäorganismeina etusijalle E. coli-kannat, esimerkiksi E. coli HB101 ja E. coli JA221, ja lisäksi Saccharomyces cerevisiae.

Periaatteessa ovat sopivia kaikki vektorit, jotka replikoituvat ja ilmentävät keksinnönmukaisia yhdistelmä-IPN-geenejä valitussa isännässä. Esimerkkejä vektoreista, jotka ovat sopivia yhdistelmäinterferonigeenien ilmentämiseen E. coli-kannoissa, ovat bakteriofaagit, esimerkiksi λ-bakteriofaagin johdannaiset, tai plasmidit, kuten erityisesti plasmidi ColE1 ja sen johdannaiset, esimerkiksi pMB9, pSF2124, pBR317 ja pBR322. Tässä keksinnössä etusijalle asetettavat vektorit on johdettu plasmidista pBR322. Sopivat vektorit sisältävät täydellisen replikonin ja merk-kigeenin, joka antaa mahdollisuuden valita ja tunnistaa fenotyyppisen ominaisuuden perusteella ne isännät, jotka ovat transformoituneet ilmentämisplasmideilla. Sopivat 10 merkkigeenit antavat isännälle esimerkiksi vastustuskyvyn raskasmetelleille, antibiooteille tms. Keksinnös sä etusijalle asetettavat vektorit sisältävät lisäksi replikonin ja merkkigeenialueiden ulkopuolella restriktio-endonukleaasien tunnistuskohtia niin, että yhdistelmä-IFN-geeni ja tarvittaessa ilmentymisenohjaussekvenssi voidaan sijoittaa näihin kohtiin. Etusijalle asetettava vektori eli plasmidi pBR322 sisältää ehjän replikonin, merkki- geenit, jotka antavat vastustuskyvyn tetrasykliinin ja am-

R R

pisilliinin suhteen (tet ja amp ) ja joukon ainoita rest- £ riktiokohtia endonukleaaseille, kuten PstI (katkaisee amp - g geenin, mutta tet -geeni säilyy ehjänä), BamHI, Hindlll ja

R R

Sali (kaikki katkaisevat tet ,geenin, mutta amp -geeni säilyy ehjänä), NruI ja EcoRI.

Geenin ilmentymisen säätelyssä voidaan käyttää useita ilmentymisenohjaussekvenssejä. Voidaan käyttää erityisesti transformoitavassa isännässä voimakkaasti ilmentyvien geenien ilmentymisenohjaussekvenssejä. Jos yhdis- telmävektorina käytetään plasmidia pBR322 ja isäntänä E. colia, voidaan valita laktoosioperonin, tryptofaaniopero-nin, arabinoosioperonin tms. tai 6-laktamaasigeenin il-mentymisenohjaussekvenssit (jotka sisältävät mm. promoottorin ja ribosomin sitoutumiskohdan)ja faagi λΝ-geenin tai faagin fd-pintaproteiinigeenin tms. vastaavat sekvenssit. Plasmidi pBR322 sisältää jo β-laktamaasigeenin (β-lac-geeni) promoottorin, mutta muut ilmentymisenohjaus-sekvenssit pitää liittää siihen.

Vektorit, jotka soveltuvat replikoitumiseen ja ilmentämiseen hiivassa, sisältävät replikoitumisen aloituskohdan ja valintamerkkigeenin hiivalle. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät hiivan replikoitumisen aloituskohdan, esimerkiksi kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan alueen (ars), pysyvät yllä hiivasolussa kromosomin ulkopuolella transformoitumisen jälkeen ja replikoituvat autonomisesti. Lisäksi voidaan käyttää yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät hiivan 2y-plasmidi-DNA:lie homologisia sekvenssejä. Tällaiset yhdistelmävektorit yhtyvät rekombinaation tuloksena solussa ennestään oleviin 2y-plasmideihin tai rep- 90983 11 likoituvat autonomisesti. 2y-sekvenssit ovat erityisen sopivia plasmideille, joilla on suuri transformointifrek-venssi, ja jotka antavat suuria kopiomääriä. Tässä keksinnössä käytettäväksi sopiva edullinen hiivavektori on plasmidi pJDB207.

Sopivia hiivojen merkkigeenejä ovat erityisesti ne, jotka antavat isännälle vastustuskyvyn antibiootin suhteen, ja auksotrooppisten hiivamuntanttien kohdalla sellaiset geenit,jotka täydentävät isännän vajavuuksia. Tällaiset geenit antavat esimerkiksi vastustuskyvyn sykloheksimidin suhteen tai antavat protrofian auksotrofiselle hiivamu-tantille, kuten esimerkiksi URA3-, LEU2-, HIS3- tai erityisesti TRP1-geenit. Hiivan yhdistelmävektorit sisältävät mielellään vielä replikoitumisenaloitusgeenin ja merkkigeenin bakteeri-isäntää varten, erityisesti E. colia varten, jotta yhdistelmävektorien ja niiden välituotteiden rakentaminen ja kloonaus voi tapahtua bakteeri-isännässä.

Hiivassa tapahtuvaan ilmentämiseen soveltuvia ilmen-tymisenohjaussekvenssejä ovat esimerkiksi voimakkaasti ilmentyvien hiivageenien ilmentymisenohjaussekvenssit. Niinpä voidaan käyttää TRP1-geenin, ADHI- tai ADHII-geenin, happofosfataasigeenin (PH03 tai PH05) tai isosytokromigee-nin promoottoria tai glykolyyttisessä ketjussa mukana olevia promoottoreja, kuten enolaasi-, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi- (GAPDH), 3-fosfoglyseraattikinaa-si- (PGK), heksokinaasi-, puryvaattidekarboksylaasi-, fosfofruktokinaasi-, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi-, 3-fosfoglyseraattimutaasi-, puryvaattikinaasi-, trioosi-fosfaatti-isomeraasi-, fosfoglukoosi-isomeraasi- tai glukokinaasigeenin promoottoria. Keksinnössä käytettävät edulliset vektorit sisältävät promoottorin, jossa on transkriptionohjaus, esim. PH05-, ADHII- tai GAPDH-geenin promoottorin, joka voidaan kytkeä päälle ja pois päältä kasvuolosuhteiden vaihtelun mukaan. Esimerkiksi PH05-promoottori voidaan kytkeä pois päältä ja kytkeä päälle vain nostamalla tai laskemalla kasvuväliaineen epäorgaanisen fosfaatin pitoisuutta.

Nisäkässoluissa käytettäviksi sopivia promoottoreja ovat esimerkiksi viruspromoottorit, kuten HTLV-, SV40- ja 12 vaccinia-promoottori.

Promoottori liitetään toiminnallisesti koodittavaan alueeseen, jotta saadaan varmistetuksi yhdistelmäninterfe-ronin tehokas ilmentyminen. Eräässä tmän keksinnön toteutustavassa promoottori liitetään suoraan kypsää yhdistelmä-interferonia koodittavaan alueeseen niin, että luennanaloi-tussignaali (ATG) sijoitetaan liitoskohtaan. Edullinen alue promoottorin liittämiseksi yhdistelmäinterferonia koodittavaan alueeseen on suur-mRNA:n aloituskohdan ja mainittuun promoottoriin luontaisesti liittyneen geenin ATG:n välissä.

Toisessa tämän keksinnön toteutustavassa, erityisesti, jos hiivaa käytetään isäntämikro-organismina, rakenteeseen sisällytetään signaalisekvenssi. Sopivia signaali-sekvenssejä ovat käytettyyn promoottoriin luontaisesti liittyvät. Voidaan käyttää PH05-signaalisekvenssiä tai hii-vainvertaasin tai a-tekijän signaalisekvenssiä. Sellaiset yhdistelmät asetetaan etusijalle, jotka mahdollistavat tarkan katkeamisen signaalisekvenssin ja kypsän IFN:n aminohapposekvenssin välistä. Lisäsekvenssejä, kuten pro-tai välikesekvenssejä, jotka sisältävät tai eivät sisällä spesifisiä prosessointisignaaleja, voidaan myös sisällyttää rakenteisin prekursorimolekyylien tarkan prosessoinnin helpottamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa yhteenliitettyjä proteiineja, jotka sisältävät sisäisiä prosessointisignaaleja, jotka mahdollistavat oikean kypsymisen in vivo tai in vitro.

Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit sisältävät myös geenin 3'-oheissekvenssin, jossa on oikeat transkriptionlo-petus- ja polyadenylointisignaalit. Sopivat 3'-oheis-sekvenssit kuuluvat esim. sellaiselle geenille, joka luontaisesti liittyy käytetyyn promoottoriin. Jos isäntäor-ganismina käytetään hiivaa ja ilmentymisenohjaussekvenssi-nä käytetään PH05-promoottoria, on 3’-oheissekvenssi mielellään PH05:lle kuuluva.

Tämän keksinnön edullinen toteutustapa koskee yhdiste lmävektore itä, jotka replikoituvat ja voidaan valita feno-tyypin perusteella isäntäkannassa, ja jotka sisältävät promoottorin ja mitä tahansa tässä kyseessä olevaa uutta 90983 13 interferonia koodittavan DNA-sekvenssin, ja mainittu DNA-sekvenssi sijaitsee yhdessä transkriptionaloitus- ja trans-kriptionlopetussignaalin sekä luennanaloitus- ja lopetus-signaalin kanssa mainituissa yhdistelmävektoreissa mainitun promoottorin ohjauksessa niin, että DNA-sekvenssi ilmentyy transformoituneessa isännässä tuottaen keksinnön-mukaista yhdistelmäinterferonia.

Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit voidaan tuottaa in vitro siten, että LyIFN-a-2:ta ja LyIFN-a-3:a koodittavat tarvittavat jaksot liitetään yhteen ja saatu yhdistelmä-IFN-geeni sijoitetaan sopivaan vektoriin tai liitetään tietty IFN-DNA-jakso sellaiseen linearisoituun vektori-DNA:han, joka jo ennestään sisältää muut jaksot, niin, että muodostuu haluttua yhdistelmäinterferonia koodattava geeni. On edullista, jos aminoterminaalisen pään antava DNA-jakso on jo liitetty ilmentymisenohjaus-sekvenssiin.

Tarvittavat LyIFN-a-2:ta ja LyIFN-a-3:a koodittavat jaksot on hyvä ottaa edullisista keksinnönmukaisista lähtövektoreista eli plasmidista pBR322 johdetuista plas-mideista pAM2 ja pAM21. Plasmidi pAM2 sisältää Hindlll-Pstl-liitännäisen, jossa on LyIFN-a-3:a koodittava alue 6-laktamaasipromoottorin ohjauksessa. Plasmidin pAM2 vek-toriosa on vastustuskykyinen PvuIIrlle. Plasmidi pAM21 sisältää Hindlll-Pstl-liitännäisen, jossa LyIFN-a-2:ta koodittava alue sisältää ainoan PvuII-kohdan asemassa 92, ja alue on β-laktamaasipromoottorin ohajuksessa. Plasmidin p21 vektoriosa on samoin vastustuskykyinen PvuIIrlle.

Erityisesti yhdistelmäinterferonia koo dittava geeni valmistetaan liittämällä yhteen plasmidin pAM21 suuri Pstl-PvuII-jakso, plasmidin pAM21 pieni Sau3A-PvuII-jakso ja plasmidin pAM2 pieni Sau3A-PstI-jakso.

Tästä rakentamisesta on seurauksena plasmidi (pJC344), joka sisältää yhdistelmäinterferonia "BiB^^D^' koodittavan alueen β-laktamaasipromoottorin ohjauksessa. Vastaavalla tavalla rakennetaan yhdistelmäinterferonia "B^B^D^B^" koodittava geeni liittämällä yhteen plasmidin pAM21 suuri PvuII-PstI-jakso, plasmidin pAM2 pieni Sau3A-PvuII-jakso ja plasmidin pAM21 pieni Sau3A-PstI-jakso. Näin 14 saadaan plasmidi (pJC342), joka sisältää yhdistelmäinter-feronia "B.jB2D.jB4" koodittavan alueen β-laktamaasipro-moottorin ohjauksessa. Yhdistelmäinterferonia "B1D2D3D4" koodittava geeni voidaan valmistaa liittämällä yhteen plas-midin pAM21 pieni HindIII-Sau3A-jakso, plasmidin pAM2 pieni Sau3A-PvuII-jakso ja plasmidin pAM2 suuri PvuII-Hindlll-jakso. Näin saadaan plasmidi (pAM94), joka sisältää yhdistelmäinterferonia "B.D-D-D." koodittavan alueen (3-lak- 12 3 4 tamaasipromoottorin ohjauksessa. Vastaavasti yhdistelmä-interferonia "B^D2B2B4" koodittava geeni valmistetaan liittämällä yhteen plasmidin pAM21 pieni HindIII-Sau3A-jakso, plasmidin pAM2 pieni Sau3A-PvuII-jakso ja plasmidin pAM21 suuri PvuII-Hindlll-jakso. Näin saadaan plasmidi (pAM90) , joka sisältää yhdistelmäinterferonia "B.jD2B.jB4m koodittavan alueen β-laktamaasipromoottorin ohjauksessa. Plasmidit jotka sisältävät yhdistelmäinterferonia "B^D2B2D4" koodittavan alueen (esim. plasmidi pDMl) ja yhdistelmäinterferonia "B^D2D2B4" koodittavan alueen (esim. plasmidi pDM2), voidaan valmistaa samalla tavalla. Nämä plasmidit soveltuvat yhdisteimä-IFN-geenien replikointiin ja ilmentämiseen E. colissa. Haluttaessa voidaan mitä tahansa mainittua yhdistelmäinterferonia koodittava DNA-liitännäinen leikata irti vastaavasta plasmidista ja tuoda eri vektori-DNA:han. Tällä tavalla voidaan saada aikaan plasmideja, jotka sisältävät yhdistelmäinterferonia koodittavan alueen muun kuin β-laktamaasipromoottorin ohjauksessa ja/tai antavat mahdollisuuden ilmentää geeniä muussa isännässä kuin E. colissa.

Sellaisen DNA:n valmistus, joka sisältää minkä tahansa mainitun yhdistelmäinterferonin geenin, voidaan myös suorittaa kemiallisella synteesillä. Sopivista synteesi-menetelmistä on esitetty yhteenveto julkaisussa S.A. Na-rang. Tetrahedron 3i), 3(1983). Ennestään tunnetut synteesimenetelmät mahdollistavat noin 20 emäksen pituisten po-lynukleotidien valmistuksen hyvällä saannolla, hyvin puhtaina ja suhteellisen lyhyessä ajassa. Sopivalla tavalla suojatut nukleotidit liitetään toisiinsa fosfodiesteri- 15 90983 menetelmällä (K.L. Agarwal et ai., Angew.Chem. 84, 489 (1972)) tai vielä tehokkaammalla fosfotriesterimenetel-mällä (C.B. Reese, Tetrahedron 34^, 3143 (1972)) tai fos-fiittitriesterimenetelmällä (R.L. Letsinger et ai., J.

Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976)). Oligonukleotidien ja polynukleotidien synteesit voidaan suorittaa yksinkertaisemmin kiinteäfaasimenetelmällä, jossa nukleotidiketjut sidotaan sopivaan polymeeriin. Itakura et ai. (A. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)) käyttävät fosfotriesterimenetel-mällä liitettyjä trinukleotideja kiinteäfaasisynteesissä yksittäisten nukleotidien tilalla, jolloin trinukleoti-dit voidaan kondensoida lyhyessä ajassa hyvillä saannoilla esimerkiksi 31 emäksen muodostamiksi polynukleotideik-si. Varsinainen kaksisäikeinen DNA voidaan rakentaa entsymaattisesti näistä kemiallisesti valmistetuista lyhyistä jaksoista. Tätä varten Khorana et ai. (J.Biol.

Chem. 251, 565 (1976)) käyttävät päällekkäin meneviä polynukleotidisekvenssejä kummastakin DNA-säikeestä, jotka pysyvät yhdessä emäspariutumisen avulla, ja yhteen-littäminen suoritetaan DNA-ligaasientsyymillä. Toinen mahdollisuus on kussakin tapauksessa inkuboida kahta polynukleo-tidisekvenssiä, joissa on lyhyet päällekäin menevät jaksot, neljän tarvittavan deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa DNA-polymeraasin, kuten DNA-polymeraasi I:n, poly-meraasi I:n Klenow-jakson tai T^ DNA-polymeraasin, kanssa tai AMV- (linnun myeloblastosis-virus) käänteiskopioija-entsyymin kanssa. Kyseiset kaksi polynukleotidisekvenssiä pysyvät tällöin yhdessä oikeassa ryhmitelmässä emäspariutumisen avulla ja täydentyvät tarvittavilla nukleotideilla enstyymin vaikutuksesta niin, että lopputuoloksena on täydellinen kaksisäikeinen DNA (S.A. Narang et ai., Anal. Biochem. 121, 356 (1982)). Itakura et ai. (J. Biol. Chem.

257, 9226 (1982)) selostavat, kuinka tällä periaatteella voidaan valmistaa ihmisen lekukosyytti-interferoni-o^-geenista 132 emäsparin pituinen segmentti DNA-polymeraasi I:n (Klenow-jakso) läsnäollessa neljästä kemiallisesti syntetisoidusta, 39 - 42 emäsparin pituisesta jaksosta saavuttamalla kemiallisessa synteesiajassa 40 % säästö 16 verrattuna menetelmään, jossa käytetään vain ligaasia. Sopiva menetelmä keksinnönmukaisten DNA-jaksojen valmistamiseksi on selostettu esimerkiksi eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 146 785, joka sisällytetään tähän viitteeksi.

Kemiallisesti syntetisoitu DNA, joka sisältää mitä tahansa tämän keksinnön mukaista yhdistelmäinterferonia koodittavan rakennegeenin, voidaan sijoittaa vektori-DNA: hän, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin niin, että ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee mainitun geenin ilmentymistä.

2. Isäntäsolujen transformointi

Keksintö koskee myös menetelmää transformoituneen isännän valmistamiseksi siten, että transformoidaan isäntä ilmentämisvektorilla, joka sisältää mitä tahansa kek-sinnönmukaista yhdistelmäinterferonia koodittavan DNA-sek-venssin, joka sekvenssi on ilmentymisenohjaussekvenssin säätelyn alaisena.

Esimerkkejä sopivista isännistä ovat edellämainitut mikro-organismit, kuten Saccharomyces cerevisiae-ja Escherichia coli-kannat. Transformointi kek- sinnönmukaisilla ilmentämisplasmideilla voidaan suorittaa esimerkiksi kirjallisuudessa kuvatulla tavalla: S. cere- visiae (A. Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)), ja E. coli (M. Mandel et ai., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)).

Näin ollen E. coli-solujen transformointi sisältää 2+ solujen esikäsittelyn Ca -ioneilla DNA:n sisäänoton mahdollistamiseksi ja inkuboinnin yhdistelmävektorin kanssa. Solut siirretään selektiiviseen kasvualustaan, joka mahdollistaa transformoituneiden solujen erottamisen kantasoluista. Solut, jotka eivät sisällä vektoria, eivät pysy hengissä tällaisessa alustassa. Hiivojen transformointi sisältää esimerkiksi (1) hiivan soluseinän entsy-maattisen poiston glukosidaaseilla, (2) saatujen sfero-plastien käsittelyn vektorilla polyetyleeniglykolin ja 17 90983

Ca^+-ionien läsnäollessa ja (3) solunseinän regeneroinnin peittämällä sferoplastit agariin. Regenerointiagar valmistetaan mielellään siten, että regenerointi ja transformoitujen solujen valinta voidaan suorittaa samanaikaisesti .

Keksintö koskee myös edelläkuvatulla tavalla saatuja transformoituneita isäntiä.

3. Transformoituneiden isäntäsolujen viljely ja ilmentyneen yhdistelmäinterferonin eristäminen

Keksintö koskee myös menetelmää kaavojen I - VI mukaisten yhdistelmäinterferonien valmistamiseksi siten, että mitä tahansa mainituista yhdistelmäinterferoneista koodattavan DNA-sekvenssin sisältävällä yhdistelmävektorilla transformoituneita isäntäsoluja viljellään ja yhdistelmä-interferoni eristetään.

Transformoituneita isäntäsoluja viljellään alalla tunnetuilla menetelmillä nestemäisessä kasvualustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja.

Keksinnönmukaisesti trasnformoituneiden isäntien viljelyssä voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Edullisia hiililähteitä ovat esimerkiksi assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi tai asetaatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauutteet, ja edelleen hiivauutteet, mallasuute sekä ammoniumsuolat, kuten ammoniumkloridi, -ammoniumsulfaatti tai -ammoniumnitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai seoksina. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan myös käyttää, ovat esim. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit.

Kasvualusta sisältää lisäksi esimerkiksi kasvua edistäviä aineita, kuten hivenaineita, esimerkiksi rautaa, sinkkiä, mangaania tms., ja mielellään aineita, jotka aiheuttavat valintapaineen ja estävät niiden solujen kasvun, jotka ovat menettäneet ilmentämisplasmidin.

18

Niinpä kasvualustaan lisätään esimerkiksi ampisilliiniä, £ jos ilmentämisplasmidi sisältää amp -geenin. Tällaisella antibiottiaineiden lisäämisellä on myös se vaikutus, että antibiootille herkät, kontaminoivat mikro-organismit tuhoutuvat. Jos isäntäorganismina käytetään hiivakantaa, joka on auksotrofinen esimerkiksi välttämättömän aminohapon suhteen, sisältää plasmidi mielellään sellaista entsyymiä koodittavan geenin, joka täydentää isännän puutteen. Hiivakannan kasvatus tapahtuu minimialustassa, josta puuttuu mainittu aminohappo.

Kasvatus suoritetaan alalla tunnetuilla menetelmillä. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, kasvualustan pH ja fermentointiaika, valitaan niin, että yhdistelmäinterfe-ronitiitterille saavutetaan maksimaalinen arvo. Näin ollen E. colia tai hiivaa kasvatetaan mielellään aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisvilejlmänä ravistellen tai sekoittaen noin 20 - 40°C lämpötilassa, mielellään noin 30°C:ssa, pH-arvossa 4-8, mielellään noin pH 7:ssä, noin 4-30 tuntia mielellään siihen asti, kunnes maksimaalinen yh-distelmäinterferonisaanto saavutetaan.

Yllättäen on havaittu, että keksinnönmukaisten interferonien, kuten esimerkiksi yhdistelmäinterferonien ',B1D2D3B4"/ "B1D2B3D4", "B1D2D3D4" ja "B1D2B3B4", maksimaaliset tiitterit, jotka ovat saavutettavissa esimerkiksi tavanomaisilla menetelmillä viljeltyjen transformoituneiden hiivojen epäpuhtaille uutteille, ovat selvästi -korkeampia kuin interferoni-a-2:lie ja yhdistelmäinterfero-neille "B^B2D3D4" ja "D^D2B3B4", jotka ovat läheistä sukua USA:n patenttijulkaisussa no. 4 414 150 kuvatuille yhdistelmäinterferoneille "BD" ja "DB", saavutettavissa olevat tiitterit.

Kun solutiheys on saavuttanut riittävän arvon, viljely keskeytetään ja yhdistelmäinterferoni vapautetaan isäntäsoluista. Tätä tarkoitusta varten solut rikotaan esim. käsittelemällä pinta-aktiivisella aineella, kuten SDSrllä tai tritonilla, tai lysoidaan lysotsyymillä tai vastaavalla tavalla toimivalla entsyymillä. Jos isäntä- li 19 90983 mikro-organismina käytetään hiivaa, soluseinä voidaan poistaa suorittamalla entsymaattinen hajotus glukosidaa-silla. Vaihtoehtoisesti tai lisäksi voidaan solujen rikkomiseen käyttää mekaanisia voimia, kuten leikkausvoimaa (esim. X-puristin, ranskalainen puristin, Dyno-mylly) tai ravistelua lasihelmien tai alumiinioksidin kanssa tai vuorottelevaa jäädytystä, esim. nestetypessä, ja sulatusta, esimerkiksi 30 - 40°C:een, sekä ultraääntä. Saatu seos, joka sisältää proteiineja, nukleiinihappoja ja muita solun aineosia, rikastetaan proteiinien suhteen, yhdis-telmäinterferoni mukaanlukien, sinänsä tunnetulla tavalla sentrifugoinnin jälkeen. Niinpä esimerkiksi suurin osa ei-proteiiniaineosista poistetaan polyetyleeniamiinikäsit-telyllä ja proteiinit, yhdistelmäinterferoni mukaanlukien, saostetaan esimerkiksi kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai muilla suoloilla. Bakteeriproteiinit voidaan myös saostaa tekemällä seos happamaksi etikkahapolla (esimerkiksi 0,1 %:sella, pH 4-5). Muita puhdistusvaihei-ta ovat mm. ultrasuodatus, diasuodatus, geelielektrofo-reesi, karomatografiset menetelmät, kuten ioninvaihtokranato-grafia, ekskluusiokrcmatografia, HPLC, käänteisfaasi-HPLC tms., seoksen aineosien erottaminen molekyylikoon perusteella sopivassa Sephadex-pylväässä, dialyysi, affiniteetti-kromatografia, esim. vasta-aineilla, esityisesti mono-klonaalisilla vasta-aineilla, ja muut ennestään tunnetut menetelmät, erityisesti alalla tunnetut menetelmät.

Yllättäen keksinnönmukaisilla yhdistelmäinterfero-neilla on parempi lämmönkestävyys kuin interferonilla LyIFN-ot-2 ja yhdistelmäinterferonilla "Β^Β2θ2θ^”. Niinpä lämpötila, jossa 50 % LyIFN-a-2:n virustenvastaisesta aktiivisuudesta menetetään, on 62,8°C (IFN-liuosten lämpötilaa nostetaan 1°C/min), ja yhdistelmäinterferonilla "B.B0D_D." 63°C, kun taas vastaavat arvot esimerkiksi yh-distelmäinterferoneille"B^D2D2D^", "B.DjB^B^", ja "B^D2D2B^m ovat 65°C, 64,7 C, 65,3 C ja 64,2°C vastaavasti .

Keksintö koskee myös kaavojen I-VI mukaisia yhdis- 20 telmäinterferoneja, jos ne on valmistettu keksinnönmu-kaisella menetelmällä.

Keksintö koskee myös keksinnönmukaisella menetelmällä saatavissa olevia yhdistelmäinterferoneja.

Keksintö koskee esityisesti yhdistelmävektoreita, transformoituneita isäntäsoluja, yhdistelmäinterferonipo-lypeptidejä ja näiden valmistusmenetelmiä, kuten esimerkeissä on selostettu.

Yhdistelmäinterferonien biologiset ominaisuudet ja farmaseuttiset formulaatiot

Keksinnönmukaisilla yhdistelmäinterferoneilla on mielenkiintoisia biologisia ominaisuuksia, joiden ansiosta niitä voidaan käyttää lääkeaineina.

Keksinnönmukaislle yhdistelmäinterferoneille on ominaista hyvin voimakas virustenvastainen aktiivisuus nisä-kässoluissa, kuten naudan ja erityisesti ihmisen soluissa. Näin ollen virustenvastaiset tiitterit, jotka määritettiin solusairausvaikutusten vähenemisenä S. Rubinsteinin menetelmällä (J. Virol. yj_, 755 (1981)) käyttämällä ärsykevi-ruksena vesicular stomatitis virusta (VSV) naudan (MDBK) ja ihmisen (WISH) soluissa, olivat seuraavat:

Taulukko 1: Yhdistelmäinterferonien virustenvastaiset tiitterit, kun ärsykeviruksena käytettiin VSV:tä interferoni ominaisaktiivisuus/mg proteiinia _ nauta_ ihminen "BiDzDaD^·' 1,25-10* 1,3-10* "BiDiBaBi/1 1,25-10* 1,3-10* ”BiB2D3B.," 9,5-107 >2-10* "B,D2B3Di," 1,9-10* 7,7-107 "BiD2D3B*" 7,2-107 3,8-107 "BiB2B3Di,m 1,05-10· 8-107 "DiD2B3B·," (DB) 8,5-107 3,3-105 "BiB2D3D<," (BD) 1,15-101 2,33-10* β-2 ("B") 1,05-10· 2,13-10* o-3 ("D”) 5,5-107 6,7-106 21 90983 Näin ollen keksinnönmukaisten yhdistelmäinterfero-nien virustenvastainen vaikutus ei rajoitu ihmissolui-hin, vaan se on poikkeuksetta lajienvälinen. Näin ollen yhdistelmäinterferonien "B.jD2B3B4", "B.B0D.,B." , B.D-B-D." ja "B.B,,B-.D " virustenvastainen aktiivisuus ihmissoluissa on verrattavissa kantainterfe-ronin a-2 ja yhdistelmäinterferonin "B.jB2D3D4" aktiivisuuteen, joka viimeksimainittu interferoni on läheistä sukua yhdistelmäinterferonille "BD", jota on selostettu USA:n patenttijulkaisussa no. 4 414 150, mutta aktiivisuudet ovat selvästi suurempia kuin kantainterferonilla a-3 (10- - 30-kertaa) ja vertailuyhdistelmäinterferonilla "D1D2B3B4" (230-- 600-kertaa).

Paitsi yleistä ihmisen soluihin kohdistuvaa virus-tenvastaista vaikutusta, saavat keksinnönmukaiset yhdis-telmäinterferonit aikaan spesifisemmän vasteen kohdesoluis-sa. Niinpä interferonin vaikutus indusoi erilaisia solunsisäisiä entsyymejä. Näiden entsyymien joukossa on (2'-5') oligoisoadenylaattisyntetaasi ("2-5 A synte-taasi"), joka tuottaa (2'5')-kytkettyjä oligonukleotide-ja, ja nämä vuorostaan aktivoivat latentin endoribonukle-aasin, joka pilkkoo virus-mRNA:ta. On yllättäen havaittu, että keksinnönmukaiset yhdistelmäinterferonit, kuten "B1D2D3D4", "B1D2B3B4", ,iB1B2B3D4" ja "B^D^", ovat erittäin aktiivisia ihmisen solujen 2-5 A-syntetaasin aktivoijia. Niinpä 10^ yksikköä/ml yhdistelmäinterfero-nia "B1D2D3D4", "B^B^", "B^B^" tai "B1B2D3B4" antaa 17,5-kertaisen, 11,4-kertaisen, 8,5-kertaisen ja 9,6-kertaisen lisäyksen 2-5 A-syntetaasiaktiivisuuteen vastaavasti Daudi-soluissa verrattuna 5,6-, 3,9-, 4,0-ja 4,3-kertaiseen lisäykseen kantainterferonien a-2 ja a-3 ja vertailuyhdistelmäinterferonien "B^B2D3D4" ja "D^D2B3B4" vaikutuksesta vastaavasti.

Lisäksi keksinnönmukaisilla yhdistelmäinterfero-neilla on solujen lisääntymistä estävä vaikutus. Solujen lisääntymistä estävä vaikutus voidaan määrittää seuraavasti: Interferonipitoisia liuoksia inkuboidaan 2 ml: ssa RPMI-alustaa, joka sisältää 10 % vasikan sikiön 4 22 seerumia sekä millilitraa kohti 5x10 Daudi-solua. Solujen lisääntyminen määritetään 3 vuorokauden inkuboinnin jälkeen laskemalla elävät solut hemosytometrissä käyttämällä tryptofaanisini-ekskluusiokoetta. Tällöin yhdis-telmäinterferonien , "B^B^", "B.jBjDjB^', "B1D2B3D4" ja "B.jDjDjB^j" pitoisuudet, jotka saavat aikaan 50 % inhiboitumisen Daudi-solujen lisääntymisessä, ovat noin 4, 4, 1,3, 1,3, 4 ja 4 yksikköä/ml vastaavasti ja näin ollen suunnilleen samat kuin tarvittavat kantainterferonin a-2 ja yhdistelmäinterferonin "B1B2D3D4" pitoisuudet (noin 1,3 yksikköä/ml) ja päreämmät kuin tarvittavat kantainterferonin a-3 (noin 20 yksikköä/ml) ja vertailuinterferonin "D^D2B3B4" (noin 400 yksikköä/ml) pitoisuudet.

Solujen lisääntymiseen kohdistuva aktiivisuus ihmisen syöpälaaduissa voidaan myös osoittaa in vivo. Erilaisia ihmisalkuperää olevia syöpälaatuja, kuten rintasyöpää, paksusuolisyöpää ja keuhkosyöpää, munasarja-syöpää ja melanoomaa on kasvatettu paljaissa hiirissä. Kasvatetuista kasvaimista otetaan pienet fragmentit ja siirrostetaan ne troakaarilla hiirten (Balb/c x DBA/2) (CDF.J) venaalisen kapselin alle. Interferonia annetaan lihaksensisäisesti kaksi kertaa vuorokaudessa annok-5 7 sinä 5x10 -5x10 IU/kg/ruiske vuorokausina 1-5 (käsittelyvuorokausi: vuorokausi 0). Vuorokautena 6 eläimet surmataan, lopulliset kasvainkoot mitataan ja niitä verrataan alkuperäisiin kasvainten kokoihin (ennen interferonikäsittelyä) ja käsittelemättömien verrok-kihiirten kasvainten kokoihin. Kun suoritettiin, hoito keksinnönmukaisilla yhdistelmäinterferoneilla, esimerkiksi "B.D-D-.D " tai "B.B_D0B.", havaittiin huomattava ja merkitsevä kasvainten kasvun estyminen ja osaksi kasvainten taantuminen. Yllättäen keksinnönmukais-ten yhdistelmäinterferonien lisääntymistä estävä vaikutus on suurempi kuin kantainterferoneilla a-2 ja a-3 sekä yhdistelmäinterferoneilla "B^B2D3D4" ja "D^D2B3B4". Keksinnönmukaisten yhdistelmäinterferonien virus- t; 23 90983 tenvastaiset ja lisääntymistä estävät ominaisuudet tekevät näistä polypeptideistä hyödyllisiä ihmisten ja eläinten virusinfektioiden, kuten influenssan ja muiden hengitystiesairauksien, herpes-virusinfektioiden ja rabies- ja hepatiitti-infektioiden, hoidossa sekä kasvainsairauk-sien, kuten melanooman ja munuaissyövän ja karvasoluleuke-mian, hoidossa, jolloin näitä interferoneja voidaan haluttaessa käyttää muiden virustenvastaisten tai kasvain-tenvastaisten aineiden kanssa mielellään farmaseuttisina valmisteina, jotka sisältävät terapeuttisesti tehokkaan määrän vaikuttavaa ainetta sekä mahdollisesti epäorgaanisia tai orgaanisia, kiinteitä tai nestemäisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantaja-aineita, jotka ovat sopivia mielellään parenteraalisesti annettaviksi.

Parenteraaliset formulaatiot ovat varsinkin injektoitavia nesteitä, jotka voidaan antaa eri tavoin, kuten intravenoosisesti, intramuskulaarisesti, intraperitone-aalisesti, intranasaalisesti, intradermaalisesti tai subkutaanisti. Tällaiset nesteet ovat mielellään isotonisia vesiliuoksia tai -suspensioita, jotka voidaan valmistaa ennen käyttöä esimerkiksi lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisältävät vaikuttavaa ainetta yksin tai yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa. Farmaseuttiset valmisteet voidaan steriloida ja/tai ne voivat sisältää lisäaineita, kuten säilöntäaineita, stabilointiaineita, kostutusaineita ja/tai emulgointiaineita, liuotusaineita, suoloja osmoottisen paineen säätöön ja/tai puskureita. Nämä farmaseuttiset valmisteet, jotka voivat haluttaessa sisältää myös muita farmakologisesti arvokkaita aineita, valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, kuten tavanomaisilla lyofi-lisointimenetelmillä, ja ne sisältävät vaikuttavaa ainetta noin 0,1 - 100 %, erityisesti noin 1 - 50 %, ja lyofilisaattien ollessa kyseessä korkeintaan 100 %. On huomionarvoista, että keksinnönmukaiset yhdistelmäinter-feronit, kuten , voidaan lyofilisoida ja liuot taa uudestaan ilman aktiivisuudenmenetystä. Sitävastoin 24 lyofilisoidut kantainterferonit α-2 ja α-3 antavat sameita liuoksia, joissa niiden aktiivisuus on alentunut huomattavasti. Näin ollen viimeksimainittuja interferoneja voidaan varastoida vain puskuriliuoksissa.

Keksintö koskee myös menetelmää farmaseuttisen valmisteen valmistamiseksi siten, että keksinnönmukainen farmakologisesti aktiivinen yhdiste sekoitetaan farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen.

Kulloinkin kyseeseen tulevan antotavan ja annostuksen valitsee hoitava lääkäri ottaen huomioon kyseisen potilaan, sairauden ja sairausasteen. Esimerkiksi virusinfektioita hoidetaan lääkkeellä tavallisesti kerran tai kahdesti vuorokaudessa muutaman vuorokauden ajan, kun taas kasvainten hoito vaatiin lääkkeen antamista kerran tai useammin vuorokaudessa viikkojen tai kuukausien ajan.

Voidaan käyttää samoja vuorokausiannoksia eli noin ΙΟ** - 7 10 yksikköä kuin tavanomaisessa interferonihoidossa.

Yhdistelmäinterferonien monoklonaalinen vasta-aine

Keksinnön tarkoituksena on tarjota uusi IFNasn monoklonaalinen vasta-aine, jolla on suuri affiniteetti useiden IFNa:n alatyyppien suhteen, yhdistelmä-IFNa:t mukaanlukien, ja pieni affiniteetti muiden IFNa:n alatyyppien suhteen, sekä tätä monoklonaalista vasta-ainetta erittäviä hybridoomasoluja.

Uudelle monoklonaaliselle vasta-aineelle on ominaista se, että sillä on korkea affiniteetti IFNa/B-, D- ja F-tyypin ja näille sukua olevien alatyyppien suhteen (ks. Goeddel et ai., Nature 290, 20 (1981)) sekä näitä alatyyppejä edustavien yhdistelmien suhteen, erityisesti keksinnönmukaisten yhdistelmäinterferonien suhteen, mutta pieni affiniteetti esimerkiksi IFNa/A-alatyy-pin suhteen.

Tälle monoklonaaliselle vasta-aineelle on annettu nimeksi 144 BS. Tätä monoklonaalista vasta-ainetta erittää hybridoomalolulinja, jolle on annettu nimeksi 144 BS 22-6-19. Keksintö koskee myön tämän vasta-aineen johdannaisia, esimerkiksi vasta-aineen osia, radioaktii- 25 90983 visesti leimattuja monoklonaalisia vasta-aineita ja kon-jugaatteja, jotka sisältävät monoklonaalisen vasta-aineen ja entsyymin, tms.

Keksinnönmukaisen monoklonaalisen vasta-aineen osia ovat esimerkiksi Fab-, Fab'- tai F(ab')2”Pala/ jotka ovat säilyttäneet spesifisyytensä antigeenisen determinantin suhteen eli ovat säilyttäneet alkuperäisen monoklonaalisen vasta-aineen luonteenomaisen sitoutumisen ihmisen IFNaraan ja IFNa-yhdistelmäalatyyppeihin.

Radioaktiivisesti leimatut monoklonaaliset vasta- 123 aineet sisältävät esimerkiksi radioaktiivista jodia ( I, 125I, hiiltä (1^C), rikkiä (2^S), tritiumia (½) tms. Etusijalle asetetaan radioaktiivisella jodilla leimatut monoklonaaliset vasta-aineet.

Keksinnönmukaisia vasta-ainekonjugaatteja ovat esimerkiksi sellaiset, joissa monoklonaalinen vasta-aine tai sen osa on liitetty entsyymiin, kuten piparjuuriper-oksidaasiin, emäsfosfataasiin, B-D-galaktosidaasiin, glu-koosioksidaasiin, glukoamylaasiin, karboanhydraasiin, asetyylikoliiniesteraasiin, lysotsyymiin, malaattidehyd-rogenaasiin tai glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasiin, tai avidiiniin tai biotiiniin. Tällaisissa konjugaateissa vasta-aine on liittyneenä entsyymiin suoraan tai välike-tai kytkijäryhmän avulla. Etusijalle asetetaan sellaiset monoklonaalisen vasta-aineen konjugaatit, joissa entsyymi on piparjuuriperoksidaasi tai emäsfosfataasi.

Keksinnönmukaiselle monoklonaaliselle vasta-aineelle on ominaista se, että se kykenee sitoutumaan pepti-deihin, jotka edustavat ihmisen IFNa:n erilaisia alatyyppejä. Sitomiskyky määritetään esimerkiksi ns. yhdistetyllä immunosaostusbiomäärityksellä, jota on selostettu julkaisussa S.S. Alkan et ai., "Protides of the biological fluids", toim. H. Peeters, Pergamon Press, Voi.

30, ss. 495 - 498 (1983). Tässä määrityksessä IFNasaa sisältävää liuosta inkuboidaan tutkittavan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, sitoutumaton ja sitoutunut monoklonaalinen vasta-aine saostetaan lisäämällä poly-klonaalista seerumia, joka sitoo kaikki tutkittavat 26 vasta-aineetj immuunisakka erotetaan ja liuotetaan uudestaan happoliuokseen ja tällöin vapautunut IFNa määritetään klassisella biomäärityksellä, joka perustuu IFNarn virustenvastaiseen aktiivisuuteen.

On yllättävää, että keksinnönmukainen monoklonaali-nen vasta-aine sitoutuu voimakkaasti IFNcx-alatyyppeihin B, D ja F ja näistä johdettuihin yhdistelmiin ja myös IFNa-alatyyppeihin C ja J, mutta osoittavat pientä affiniteettia IFNa-alatyyppiin A, joka alatyyppi taas sitoutuu kaikkiin einestään tunnettuihin, useampia kuin kolme IFNa-alatyyppiä tunnistaviin monoklonaalisiin vasta-aineisiin eli vasta-aineisiin, joilla on laaja alatyyppien-tunnistuskyky, kuten monoklonaaliseen vasta-aineeseen NK2 (D. Secher et ai., Nature 285, 446 (1980)), monoklonaaliseen vasta-aineeseen EBI-1, 2 ja 3, joita on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa EP 119 476, tai monoklonaaliseen vasta-aineeseen LO-22 , jota on selostettu patenttihakemusjulkaisussa W084/03106.

Verrattuna monoklonaaliseen vasta-aineeseen YOK, jota on selostettu patenttihakemusjulkaisussa W084/03105, ja joka on spesifinen IFNa-alatyypille D, osoittaa keksinnönmukainen monoklonaalinen vasta-aine yllättäen laajaa spesifisyyttä erityisesti IFNa-alatyyppejä B ja F kohtaan, joita vasta-aine YOK ei sido.

Keksinnönmukaisen monoklonaalisen vasta-aineen, jolle on annettu nimi 144 BS, on havaittu kuuluvan immu-noglobuliiniluokkaan IgG1<(Kappa), kun määritys suoritetaan ennestään tunnetuilla menetelmillä, esim. immunodif-fuusiolla (Ouchterlonyn analyysillä) käyttämällä luokka-spesifisiä toisia vasta-aineita.

Keksinnönmukainen monoklonaalinen vasta-aine ja sen johdannaiset valmistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä siten, että hybridoomasolulinjaa 144 BS 22-6-19 a) viljellään in vitro ja monoklonaalinen vasta-aine eristetään viljelmän emäliuoksesta, tai b) kasvatetaan in vivo sopivassa nisäkkäässä ja monoklonaalinen vasta-aine otetaan talteen mainitun nisäkkään kehon nesteistä, ja haluttaessa 27 90983 e) saatu monoklonaalinen vasta-aine muunnetaan johdan-naisekseen.

Sopivia kasvualustoja kohdan a) mukaiselle in vitro-viljelylle ovat standardikasvualustat kuten Dulbeccon Modified Eagle Medium tai RPMI 1640 Medium, joita mahdollisesti on täydennetty nisäkkään seerumilla, esim. vasikan sikiön seerumilla. Monoklonaalinen vasta-aine eristetään seostamalla viljelmän emäliuoksen sisältämä proteiini ammoniumsulfaatilla tai vastaavalla, jonka jälkeen immunoglobuliini puhdistetaan tavallisilla kromatografisilla menetelmillä, kuten geelisuodatuksella, ioninvaihtokromatografiällä, DEAE-selluloosakromatogra-fiällä tai immunoaffiniteettikromatografiällä.

Suuria määriä haluttua monoklonaalista vasta-ainetta voidaan saada kasvattamalla hybridoomasolulinjaa menetelmän b) mukaisesti. Solukloonit injektoidaan geeneiltään yhteensopiviin nisäkkäisiin, jolloin alkaa kasvaa vasta-aineita tuottavia kasvaimia. 1-3 viikon kuluttua haluttu monoklonaalinen vasta-aine otetaan talteen mainitun nisäkkään kehon nesteistä. Esimerkiksi Balb/c-hii-ristä johdettu hybridoomasolulinja injektoidaan vatsa-ontelonsisäisesti Balb/c-hiiriin, jotka on mahdollisesti esikäsitelty hiilivedyllä, kuten pristaanilla, ja 1 -2 viikon kuluttua näiden hiirten askitesneste kerätään talteen. Monoklonaalinen vasta-aine eristetään kehon nesteistä sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esim. saos-tamalla proteiini ammoniumsulfaatilla tms. ja puhdistamalla immunoglobuliini sen jälkeen tavallisilla kromatografisilla menetelmillä, kuten geelisuodatuksella, ioninvaihtokromatograf iällä, DEAE-selluloosakromatografi-alla tai immunoaffiniteettikromatografiällä.

Monoklonaalisen vasta-aineen osat, esim. Fab-, Fab'-tai F(ab')2-pala, jotka ovat säilyttäneet spesifisyytensä IFNa-alatyyppien antigeenisiin determinantteihin, voidaan saada menetelmällä a) tai b) valmistetusta mono-klonaalisesta vasta-aineesta sinänsä tunnetulla tavalla, esim. pilkkomalla entsyymeillä, kuten pepsiinillä tai pa-paiinilla, ja/tai katkaisemalla disulfidisidokset kemial- 28 lisella pelkistyksellä.

Radioaktiivisella jodilla leimatut monoklonaaliset vasta-aineet valmistetaan sinänsä tunnetuilla jodausme-netelmillä, esim. leimaamalla monoklonaalinen vasta-aine radioaktiivisella natrium- tai kaliumjodidilla ja kemiallisella hapettimella, kuten natriumhypokloriitilla, kloramiini T:llä tms., tai entsymaattisella hapettimella, kuten laktoperoksidaasilla, glukoosioksidaasilla ja glukoosilla. Keksinnönmukaiset radioaktiivisesti leimatut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan myös valmistaa lisäämällä radioaktiivisesti leimattuja ravinteita kasvualustaan kohdan a) mukaisessa in vitro-viljelyssä. Tällaiset leimatut ravinteet sisältävät esim. radioaktiivista hiiltä (^4C), tritiumia (½) , rikkiä (^S) tms., ja ovat esim.

L-(^ 4C)-leusiinia, L- (½) -leusiinia tai L-(^S) -metio-niinia.

Keksinnönmukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden konjugaatit valmistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi saattamalla menetelmän a) tai b) mukaisesti valmistettu monoklonaalinen vasta-aine tai sen pala, joka on saatu aikaan edelläkuvatulla tavalla, reagoimaan entsyymin kanssa kytkentäaineen, kuten glutaarialdehydin, perjodaatin, Ν,Ν'-ο-fenyleenidimaleimidin, N-(m-maleimido-bentsoyylioksi)-sukkinimidin, N-(3-(2'-pyridyyliditio)-propionoksi)sukkinimidi, N-etyyli-N'-(3-dimetyyliamino-propyyli)karbodi-imidi tms. Avidiinikonjugaatit valmistetaan vastaavalla tavalla. Biotiinikonjugaatit valmistetaan esimerkiksi saattamalla monoklonaalinen vasta-aine reagoimaan biotiinin aktivoidun esterin, kuten biotiini-N-hydroksisukkinimidiesterin, kanssa.

Keksintö koskee lisäksi hybridoomasolulinjaa, jolle on annettu nimi 144 BS 22-6-19, ja joka on talletettu 14. maaliskuuta, 1985 "Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes", Institut Pasteur-kokoelmiin Pariisiin numerolla 1-424. Tämä hybridoomasolulinja on hybridi, joka koostuu hiiren myeloomasolulinjasta Sp2/0-Ag14 ja ihmisen luontaisella IFNa:lla immunisoidun Balb/c-hiiren pernan B-lymfosyytistä. Se on pysyvä solulinja, 29 90983 joka erittää 144 BS-nimistä monoklonaalista vasta-ainetta. Solulinjaa säilytetään viljelmänä tai nestetyppeen syväjäädytettynä ja se uudelleenaktivoidaan sulattamalla.

Keksintö koskee myös menetelmää mainitun monoklonaalista vasta-ainetta 144 BS tuottavan solulinjan valmistamiseksi siten, että Balb/c-hiiret immunisoidaan ihmisen luontaisella IFNaslla, vasta-ainetta tuottavat hiiren pernasolut fuusioidaan myeloomasolulinjan Sp2/0-Ag14 solujen kanssa, fuusiossa saadut hybridisolut kloonataan ja haluttua vasta-ainetta erittävä soluklooni valitaan.

Hiirten immunisointi suoritetaan esimerkiksi injektoimalla ihmisen luontaista IFNa:aa 2-4 kertaa parente-raalisesti, kuten vatsaontelonsisäisesti ja/tai subkutaa-nisti, 10-40 vuorokauden välein määrinä noin 10^ ky -

g J

noin 10 ky. Injektiot voivat sisältää lymfosyytti-tuotantoa stimuloivaa adjuvanttia, kuten täydellistä tai epätäydellistä Freundin adjuvanttia.

Vasta-ainetta tuottavat pernasolut, jotka otetaan 2-5 vuorokauden kuluttua lopullisesta tehosteinjektiosta lukien, fuusioidaan myeloomasolulinjanSp2/0-Ag14 solujen kanssa fuusiopromoottorin läsnäollessa. Sopivia fuusiopromoottoreja ovat esimerkiksi Sendai-virus ja muut paramyxo-virukset, mahdollisesti UV-aktivoidussa muodossa, kalsiumionit, pinta-aktiiviset lipidit, kuten lysolesitii-ni, tai polyetyleeniglykoli. Mielellään myeloomasolut fuusioidaan immunisoiduilta hiiriltä otetun 3- - 20-ker-taisen pernasoluylimäärän kanssa liuoksessa, joka sisältää noin 30 - noin 60 % polyetyleeniglykolia, jonka molekyy-lipaino on välillä 1000 - 4000.

Fuusioinnin jälkeen solut suspendoidaan uudestaan ja niitä viljellään selektiivisessä HAT-alustassa. Tällöin vain hybridoomasolut pysyvät elossa, koska ne kykenevät kasvamaan ja monistumaan in vitro myeloomasoluilta perimänsä kyvyn perusteella. Myeloomasoluilta puuttuvat kuitenkin HAT-alustassa säilymiselle välttämättömät HGPRT-tai TK-geenit, jotka fuusioituneet solut ovat perineet vasta-aineita tuottavilta, immunisoitujen hiirten perna- 30 soluilta.

Sopivia kasvualustoja hybridoomasolujen kasvattamiselle ovat tavalliset kasvualustat, kuten Dulbeccon muunnettu Eagle-alusta, minimaaliset välttämättömät ravinteet sisältävä alusta, RPMI 1640-alusta tms, joita mahdollisesti on täydennetty seerumilla, esim. vasikan sikiön seerumilla (10 - 15 %). Solujen kasvun alkuvaiheessa on edullista lisätä syöjäsoluja, esim. hiiren normaaleja peritoneaalisia tulehdusnestesoluja, pernasoluja, luuydinmakrofageja tms. Kasvualustaan lisätään selektiivistä HAT-alustaa tasaisin välein, jotta saadaan estetyksi normaalien myeloomasolujen liiallinen kasvu hybridoomasolujen kasvuun verrattuna.

Hybridoomasoluviljelmien emäliuokset seulotaan halutun monoklonaalisen vasta-aineen suhteen käyttämällä mielellään yhdistettyä immunosaostus-biomääritystä tai radio-immunologista määritystä. Positiiviset hybridoomasolut kloonataan, esim. rajoittavalla laimennuksella, mielellään kahdesti tai useammin. Kloonatut solulinjat voidaan jäädyttää tavalliseen tapaan.

Keksinnönmukaista monoklonaalista vasta-ainetta ja/tai sen johdannaisia voidaan käyttää haluttaessa määrittää kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti ja/tai puhdistaa luonnonlähteistä peräisin olevia tai yhdiste ltoärD^A-tekniikalla valmistettuja ihmisen IFNa-alatyyp-pejä ja ihmisen yhdistelmä-DNA-laatuja, erityisesti tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja.

Monoklonaalista vasta-ainetta tai sen johdannaista, kuten entsyymikonjugaattia tai sen radioaktiivista johdannaista, voidaan käyttää missä tahansa ennestään tunnetussa immunomäärityksessä, joka perustuu antigeenideterminantin, esim. IFNa-aktiivisuuden omaavan polypeptidin, ja monoklonaalisen vasta-aineen väliselle sitoutumiselle. Esimerkkejä tällaisista määrityksistä ovat radioimmunologiset määritykset, entsyymi-immunomääritykset, immuno-fluoresenssi, lateksiagglutinaatio ja hemagglutinaatio. Tällaiset immunomääritykset ovat hyödyllisiä esim. seurattaessa IF!'a:n tuotantoa tai puhdistusta luonnonlähteistä 31 90983 tai geenitekniikalla valmistetuista mikro-organismeista, yhdistelmä-IFNa-proteiinit mukaanlukien. Näitä menetelmiä voidaan myös käyttää IFNarn ja yhdistelmä-IFNa:n kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen määrittämiseen biologisista nesteistä, esim. IFNa-hoidossa olevilta potilailta tai tällaisen hoidon tarpeessa olevilta.

Keksinnönmukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää sellaisenaan tai radioaktiivisesti leimatun johdannaisensa muodossa radioimmunologisessa määrityksessä (RIA). Voidaan käyttää mitä tahansa ennestään tunnettua RIA-menetelmän muunnosta, kuten RIA:ta homogeenisessa faasissa, kiinteäfaasi-RIA:ta eli heterogeenista RIA:ta, yksinkertaista tai kaksois-RIA:ta (voileipä) , joissa on suora tai epäsuora (kompetitiivinen) IFNa:n määritys. Etusijalle asetetaan voileipä-RIA, jossa sopiva kantaja-aine, kuten mikrotitrauslevyn tai koeputken muovipinta, joka voi olla esimerkiksi poly-styreeniä, polypropeenia tai polyvinyylikloridia, lasi-tai muovihelmet, suodatinpaperi tai dekstraani, sellu-loosa-asetaatti tai nitroselluloosa tms., päällystetään IFNa-alatyypille spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella pelkkää adsorptiota käyttäen tai sen jälkeen, kun kantaja-aine on aktivoitu esim. glutaarialdehydillä tai syanogeenibromidilla, ja inkuboidaan koeliuoksen 125 ja I:llä radioaktiivisesti leimatun monoklonaalisen vasta-aineen liuoksen kanssa, jolloin liuennut mono-klonaalinen vasta-aine tunnistaa IFNa-alatyypin muun epitoopin kuin kantaja-aineeseen sidottu monoklonaalinen vasta-aine, ja IFNa-määrä tai yhdistelmä-IFNa-määrä määritetään mittaamalla kantaja-aineeseen sitoutunut radioaktiivisuus. Tällaisessa etusijalle asetettavassa radioimmunologisessa määrityksessä joko kantaja-aineeseen sitoutunut vasta-aine tai radioaktiivisesti leimattu vasta-aine on keksinnönmukainen monoklonaalinen vasta-aine tai sen johdannainen ja toinen vasta-aine on IFNa:n monoklonaalinen vasta-aine, joka ei kuulu tämän keksinnön kattamaan alaan, tai polyklonaalinen vasta-aine, mahdollisesti radioaktiivisesti leimatun 32 johdannaisen muodossa.

Erityisen edullinen on sellainen edelläkuvattu radioimmunologinen voileipämenetelmä, jossa keksinnönmukainen monoklonaalinen vasta-aine on sidottu helmiin, esimerkiksi polystyreenihelmiin, ja jossa näitä päällystettyjä helmiä inkuboidaan ensin tutkittavassa standardiliuok-sessa, joka sisältää IFNa:aa tai yhdistelmä-IFNa:aa, ja lopuksi suoritetaan kehitys radioaktiivisesti leimatulla monoklonaalisella vasta-aineella, joka tunnistaa IFNa:n eri epitoopin.

Kuvat 4 ja 5 esittävät kantajahelmiin sitoutunutta radioaktiivisuutta koeliuoksen sisältämän IFNa/B-ala-tyyppiin kuuluvan IFN-a-2-polypeptidimäärän funktiona, kun mittaus suoritetaan voileipä-RIA-menetelmällä, jota on selostettu yksityiskohtaisesti esimerkeissä. RIA-menetelmän herkkyys tekee mahdolliseksi määrittää nopeasti, luotettavasti ja kvantitatiivisesti 150 - 5000 ky/ml IFN-a-2-alatyyppiä ja jopa 1 ky/ml IFN-a-2-alatyyp-piä, jos valitaan aikaanvievempi menetelmäsovellutus. Samanlaisia tuloksia voidaan saada voileipä-RIA-menetel-mällä muihin IFNa-alatyyppeihin kuuluville polypepti-deille, kuten IFNa/D-alatyypille tai IFNa/F-alatyypille, ja erityisesti keksinnönmukaisille yhdistelmäinterfero-neille.

Keksinnönmukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää sellaisenaan tai entsyymiin konjugoitu-na johdannaisenaan entsyymi-immunomäärityksessä. Tällaisissa immunomäärityksissä käytetään entsyymillä leimattua keksinnönmukaista monoklonaalista vasta-ainetta, sinänsä tunnettuja enstyymillä leimattuja vasta-aineita, jotka tunnistavat ja sitoutuvat keksinnönmukaisen anti-IFNa-vasta-aineen epitooppeihin tai muita anti-IFNa-vasta-aineita.

Etusijalle asetetaan ELISA-menetelmä (enzyme-linked immunoadsorbent assay), jossa edellä RIA-menetelmän yhteydessä kuvattu kantaja-aine päällystetään keksinnön-mukaisella monoklonaalisella vasta-aineella, inkuboidaan IFNasaa sisältävän koeliuoksen kanssa ja sen jälkeen IFNa:n ii 33 90983 vastaisen polyklonaalisen seerumin kanssa, esimerkiksi lampaan seerumin kanssa, ja lopuksi polyklonaalisesta seerumista sitoutuneet vasta-aineet kehitetään nämä tunnistavilla, entsyymillä leimatuilla vasta-aineilla ja sitoutunut IFNa-määrä määritetään entsyymisubstraattireak-tiolla. Tällainen entsyymillä leimattu vasta-aine voi olla esimerkiksi fosfataasilla leimattu, vuohessa tuotettu lampaanvastainen immunoglobuliini.

Edullinen on myös sellainen ELISA-menetelmä, jossa IFNa-alatyypille spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella päällystettyä kantaja-ainetta inkuboidaan IFNocaa sisältävän koeliuoksen ja entsyymiin konjugoi-tua monoklonaalista vasta-ainetta sisältävän liuoksen kanssa, joka liuennut monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa IFNa-alatyypin muun epitoopin kuin kantaja-aineeseen sitoutunut monoklonaalinen vasta-aine. Sen entsyymi-substraattireaktion seurauksena, joka tästä aiheutuu, voidaan esimerkiksi havaita silmällä tai optisella mittauslaitteella värimuutos, ja saatu sitoutuneen entsyymin määrä on verrannollinen koeliuoksen sisältämään IFNa-alatyypin tai yhdistelmä-IFNa-alatyypin määrään.

Erittäin edullinen entsyymi-immunomääritys on ns. immunotäpläanalyysi (immunodot analysis), jossa IFNa:aa tai yhdistelmä-IFNa:aa sisältävää koeliuosta tai standar-diliuosta sijoitetaan täpliksi mikrohuokoiselle kantaja-aineelle, jolla on suuri luontainen affiniteetti poly-peptideille, esim. nitroselluloosalle, ja kantaja-ainetta, jossa on yksi tai useampia mainittua IFNa:aa sisältävien näytteiden täplää, inkuboidaan keksinnönmukaista monoklonaalista vasta-ainetta sisältävässä liuoksessa ja sen jälkeen liuoksessa, joka sisältää entsyymillä leimattua toista vasta-ainetta, joka tunnistaa ja sitoutuu kek-sinnönmukaiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen, ja lopuksi enstyymin substraattia sisältävässä liuoksessa niin, että saadaan havaittavissa oleva signaali, esim. väriaine. Tällainen entsyymillä leimattu toinen vasta-ai- 34 ne voi olla esimerkiksi kanissa aikaansaatu hiirenvastai-nen immunoglobuliini, joka on liitetty piparjuuriperok-sidaasiin, joka puolestaan voidaan kehittää sopivilla substraateilla» kuten 4-kloori-1-naftolilla tms.

Tässä kuvattu monoklonaalisen vasta-aineen ja sen johdannaisten keksinnönmukainen käyttö IFNcx-alatyyppien ja yhdistelmä-IFNa:n kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen määrittämiseen kattaa myös muut sinänsä tunnetut immuno-määritykset, kuten immunofluoresenssikokeet, joissa käytetään vasta-aineen tai antigeenin ja fluoresoivan aineen muodostamia konjugaatteja, lateksiagglutinaation, jossa käytetään vasta-aineella tai antigeenillä päällystettyjä lateksihiukkasia, tai hemagglutinaation, jossa käytetään vasta-aineella tai antigeenillä päällystettyjä punaisia verisoluja, tms.

Keksintö koskee myös testipakkauksia IFNa-alatyyp-pien ja keksinnönmukaisten yhdistelmä-IFNa-laatujen määrittämiseksi, jotka pakkaukset sisältävät monoklonaa-lista vasta-ainetta 144 BS ja/tai sen johdannaista ja mahdollisesti muita monoklonaalisia tai polyklonaali-sia ihmisen iFNoun vasta-aineita ja/tai adjunkteja.

Radioimmunologisiin määrityksiin tarkoitetut keksin-nönmukaiset testipakkaukset sisältävät esimerkiksi sopivaa kantaja-ainetta, joka voi olla päällystetty tai päällystämätön IFNa:n monoklonaalisella vasta-aineella, IFNa:n monoklonaalista tai polyklonaalista vasta-ainetta ja/tai sen radioaktiivisesti leimattua johdannaista mahdollisesti kylmäkuivattuna tai väkevänä liuoksena niin, että vähintään yksi monoklonaalisista vasta-aineista, joka on päällysteenä kantaja-aineessa,liuoksen muodossa tai radioaktiivisesti leimatussa muodossa, on keksinnönmukainen monoklonaalinen vasta-aine, ihmisen IFNasn standardiliuok-sia, puskuriliuoksia ja mahdollisesti polypeptidejä ja pinta-aktiivisia aineita, jotka estävät epäspesifisen adsorption ja aggregaatinmuodostuksen, pipettejä, reak-tioastioita, kalibrointikäyriä tms.

Entsyymi-immunomäärityksiin tarkoitetut keksinnön-mukaiset testipakkaukset sisältävät esimerkiksi sopi- li 90983 35 vaa kantaja -ainetta, IFNa:n monoklonaalista ja/tai po-lyklonaalista vasta-ainetta ja IFNa:n tai IFNa:n tunnistavan ensimmäisen vasta-aineen enstyymillä leimattua monoklonaalista tai polyklonaalista vasta-ainetta mahdollisesti kylmäkuivattuina tai väkevinä liuoksina niin, että joko IFNa:n mo-noklonaalinen vasta-aine tai enstyymillä leimattu IFNa:n vasta-aine on keksinnönmukainen monoklonaalinen vasta-aine tai sen johdannainen, entsyymin substraatteja kiinteässä tai liuosmuodossa, ihmisen IFNcxrn standardiliuok-sia, puskuriliuoksia ja mahdollisesti polypeptidejä ja pinta-aktiivisia aineita, pipettejä, reaktioastioita, kalibrointikäyriä, väriskaalataulukoita tms.

Luonnonlähteistä peräisin olevat IFNcct tai IFNa:n alatyypit tai IFNa:lle sukua olevat polypeptidit, kuten keksinnönmukaiset yhdistelmäinterferonit voidaan puhdistaa immunoaffiniteettikromatografiällä käyttämällä apuna tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta. Mo-noklonaalisen vasta-aine tai sen pala kiinnitetään sopivaan orgaaniseen tai epäorgaaniseen kantaja-aineeseen, kuten silloitettuun agaroosiin, dekstraaniin tai polyak-ryyliamidiin, jotka ovat sopivasti funktionalisoidussa muodossa, mahdollisesti aktivoinnin jälkeen, käyttämällä tavallisia alalla tunnettuja menetelmiä. Esimerkiksi aktivoituja esterifunktioita sisältävä kantaja-aine suspendoidaan vesipitoiseen puskuriliuokseen,mukaan sekoitetaan monoklonaalista vasta-ainetta tai sen osaa sisältävää liuosta, suodatetaan, suspendoidaan uudestaan ja pestään ylimääräinen monoklonaalinen vasta-aine pois ja käsitellään irrelevantteja proteiineja sisältävällä liuoksella kantaja-aineen sisältämien vapaiden reaktiivisten kohtien tukkimiseksi. Tätä vasta-aineella päällystettyä kantaja-ainetta käytetään sitomaan selektiivisesti ihmisen IFNa-alatyyppejä, esim. IFNa/B, IFNa/D ja IFNa/F, ja niille sukua olevia polypeptidejä, kuten keksinnönmukaisia yhdistelmäinterferoneja, jotka voivat olla glykosyloituneessa tai glykosyloitumattomassa muodossa. Tätä tarkoitusta varten kantaja-aine suspendoidaan sopivaan vesiliuokseen, esimerkiksi suolaliuok- 36 seen, kuten NaCl-liuokseen, tai puskuriliuokseen, kuten fosfaatilla puskuroituun NaCl-liuokseen, NaHCO^-liuok-seen tai 3-(N-morfolino)propaanisulfonihappoliuokseen, ja saatetaan kosketukseen IFNa:aa sisältävän liuoksen kanssa. Kantaja-ainesuspensio voidaan esimerkiksi kaataa kromatografiapylvääseen ja sen jälkeen pumpata IFNa:aa sisältävä liuos kantaja-aineen läpi haluttaessa paineen avulla. Sitoutumattomat proteiinit ja muut epäpuhtaudet pestään pois vesiliuoksilla, esimerkiksi puskuri-liuoksilla, joiden pH on noin 5-9, ja/tai suolaliuoksilla, esimerkiksi NaCl-liuoksella. Kantaja-aineeseen sitoutunut IFNa eluoidaan sopivilla vesiliuoksilla, esimerkiksi puskuriliuoksilla, joiden pH on noin 2-5, kuten glysiinipuskurilla tai sitruunahapolla, tai pH-gra-dienteilla, joiden koostumus vaihtelee, tai suolaliuoksilla, esimerkiksi väkevällä NH4SCN-liuoksella. IFNatn sisältävä eluaatti neutraloidaan haluttaessa ja puhdistettu IFNa eristetään siitä tunnetuilla menetelmillä.

Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraa-villa esimerkeillä.

Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä: DTT 1,4-ditiotreitoli TNE Liuos, joka sisältää 50 mM Tris.HCl pH 7,5,

100 mM NaCl, 2 mM EDTA

Tris tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo TE Liuos, joka sisältää 10 mM Tris, 50 yM EDTA.

N-alusta Sisältää Bacto-Tryptonia (10 g, Difco), hiiva-uutetta (1 g, Difco), glukoosia (1 g), NaCl (8 g), CaCl2.2H20 (249 mg) per litra liuosta.

TBE Liuos, joka sisältää 89 mM Tris, 89 mM boori- happoa, 2 mM EDTA.

BSA naudan seerumialbumiini HAT hypoksantiini/aminopteriini/tymidiini

Ig immunoglobuliini ky kansainvälinen yksikkö (interferoniaktiivisuuden) MAb monoklonaalinen vasta-aine 37 90983 PBS fosfaatilla puskuroitu suolaliuos SDS-PAGE natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigee-lielektroforeesi

OsaI: a-2/ot-3-interferoniyhdistelmien rakentaminen ja kloonaus Eschericia coliln

Kaikki jäljempänä kuvatut yhdistelmäinterferonipro-teiineja koodittavat sekvenssit on liitetty toiminnallisesti β-laktamaasipromoottoriin, kloonattu plasmidista pBR322 johdettuun ilmentämisplasmidiin ja transformoitu E. coli HB101-kantaan.

Esimerkki 1: PvuIIrlle vastustuskykyisten vektorien ra kentaminen, jotka sisältävät lymfoblastoidi-interferonien a-2 ja a-3 DNA-sekvenssejä pBR322 leikataan PvuIIrlla (Biolabs) ja lineaariseen DNA:hän liitetään (32P)-BclI-kytkijä (d(ATGTGTGATCACACAT), joka on sytetisoitu kiinteäfaasi-fosfotriesterimenetelmäll.s, ks.

H. Rink et ai., Nucleic Acids Research 1_2, 6369 (1984)) seuraavalla tavalla:

Katkaistu plasmidi-DNA (1 ug, noin 0,7 pmol päitä) liitetään 32P:llä leimattuun BclI-kytkijään (noin 40 pmol päitä) 50 yl:ssa reaktioliuosta, joka sisältää 20 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP ja 40 yksikköä/yl T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Inkuboi-daan 2-3 tuntia 15°C:ssa, vesifaasi.uutetaan tilavuudellaan fenoli/kloroformia ja DNA saostetaan lisäämällä 1/9 tilavuutta 10x TNE-liuosta, 2,5 tilavuutta etanolia ja pitämällä -20°C:ssa yön yli. DNA-pelletti uudelleensuspendoidaan 50 ui:aan TE-liuosta, pH 8,0, ja sentrifugoidaan 15°C:ssa 4 tunnissa nopeudella 58000 1/min 5 - 23 % sakkaroosi-gradientin läpi (50 mM Tris-HCl pH 8,0/1mM EDTA) Kontron TST 60-roottorissa. Gradientti fraktioidaan ylhäältä alas ja kunkin jakeen radioaktiivisuutta seurataan Cerenkov-laskennalla. Halutut jakeet yhdistetään ja DNA saostetaan TNEillä ja etanolilla. DNA-pelletti uudelleensuspendoidaan restriktiopuskuriin ja pilkotaan Bcll:llä 38 ja saostetaan uudestaan sen jälkeen, kun on uutettu fenoli/kloroformilla. Tämä lineaarinen DNA saatetaan uudestaan renkaan muotoon pitoisuudessa 5 yg/ml samanlaisissa olosuhteissa, kun edellä oli kytkijän liittämisessä.

Yhteenliitetty DNA leikataan entsyymeillä Hindlll, PvuII (ehjän pBR322-jäännöksen poistamiseksi) ja PstI ja suuri Hindlll-PstI-jakso (3600 emäsparia + kytkijä), joka sisältää replikoitumisen aloituskohdan ja amp -geenin, eristetään sakkaroosigradienttisentrifugoinnilla.

CG—pBR(AP)/LyIFN-a-2:n; (1160 ep) ja CG-pBR(AP)/

LyIFN-a-3:n (1020 ep) (eurooppalainen patenttihakemus-julkaisu no. 76 489) Hindlll-Pstl-liitännäiset, jotka on saatu gradienttisentrifugoinnilla, liitetään kukin edellä valmistettuun DNA:hän, ja näin saadaan plasmidit midit pAM4 ja pAM2, joissa on LyIFN-a-2-alue ja LyIFN-a-3-alue vastaavasti β-laktamaasipromoottorin ohjauksessa.

Näin saadulla yhteenliitetyllä DNA:11a transformoidaan transformointikelpoinen E. coli seuraavalla tavalla: DNA:n yhteenliittämisseos (tai sen jakeet) siir retään 150 yl:aan liuosta, jossa on 15 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl ja C p mM EDTA, ja lisätään 50 μΐ CaCl2:lla käsiteltyjä vastaanottaja-E. coli HB 101-soluja. Saatua seosta pidetään 0°C:ssa 20 minuuttia ja siirretään sen jälkeen 2 minuutiksi 42 °C:een, jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja lisätään 1 ml N-alustaa. Inkubointia jatketaan 1 tunti 37°C: ssa (ravistelualusta, 250 1/min), jonka jälkeen 600 yl kasvatetaan levyllä McConkey-agarissa (Difco), joka sisältää tetrasykliiniä (10 yg/ml). Petrimaljoja inku-boidaan 37°C:ssa 16 - 18 tuntia, jonka kuluessa ilmestyy bakteeripesäkkeitä.

Plasmidi-DNA saadaan transformanteista seuraavalla tavalla. 10 ml:aan N-alustaa, joka sisältää tetrasykliiniä (10 yg/ml), siirrostetaan yksi transformantti-pesäke ja viljelmää sekoitetaan 37°C:ssa (ravistelualusta, 150 - 300 1/min), kunnes optinen tiheys on 0,9 - 1,1 (650 nm). Solut otetaan talteen ja uudelleensuspendoi-daan samaan tilavuuteen N-alustaa, joka sisältää tet- 39 90983 rasykliiniä (10 yg/ml) ja kloramfenikolia (80 yg/ml). Inkuboidaan vielä 18 tuntia 37°C:ssa, jotta saadaan lisätyksi plasmidikopioiden lukumäärää solua kohti.

Bakteerit otetaan talteen ja bakteeripelletti uudelleen-suspendoidaan liuokseen, jossa on 50 mM Tris-HCl pH 8 (10 ml per solugramma märkäpainoa), ja lisätään lysotsyymiä (Sigma) lopulliseen pitoisuuteen 2 mg/ml. Kun on inku-boitu 10 minuuttia 0°C:ssa, liuoksen pitoisuudeksi säädetään 50 mM EDTA, ja kun on inkuboitu 10 minuuttia 0 °C:ssaf lisätään Triton X 100 lopulliseen pitoisuuteen 0,8 % ja saatua seosta pidetään 1 tunti 0°C:ssa, jonka jälkeen sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 18 000 1/min Sorvali SS-34-roottorilla. Kirkas emäliuos uutetaan ensin fenolilla ja sen jälkeen kahdesti kloro-roformilla ja liuokseen lisätään RNaasia (Sigma) lopulliseen pitoisuuteen 25 yg/ml ja saatua liuosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. RNA:n poistamiseksi lisätään natriumkloridia (lopullinen pitoisuus 1 M) ja polyetyleeniglykolia 6000 (lopullinen pitoisuus 7,5 %) ja saatua seosta pidetään 2 tuntia -10°C:ssa, jonka jälkeen sentrifugoidaan 10 minuuttia 0°C:ssa nopeudella 10 000 1/min Sorvali SS-34-roottorissa. Pelletti uudelleensuspendoidaan 200 yltään TNE-liuosta ja uutetaan uudestaan fenoli/kloroformilla (1:1), jonka jälkeen seostetaan uudestaan (lisäämällä 500 yl etanolia, 5 min -80°C:ssa, 10 min Eppendorf-sentrifugissa). DNA-pelletti uudelleensuspendoidaan 20 - 40 yltään TE-liosta. Tällä menetelmällä saadaan tavallisesti noin 20 yg plasmidi-DNA:ta.

Näin saaduille plasmidi-DNA-laaduille (pAM4 ja pAM2) suoritetaan restriktioentsyymianalyysi. Näin saadaan varmistetuksi pAM4:n ja pAM2:n rakenne.

Esimerkki 2: Rakennegeenin ulkopuolella 3'-alueella sijaitsevan PvuII-kohdan poistaminen plasmidista pAM4

Toisin kuin plasmidi pAM2(a-3), sisältää plasmi-di pAM4(a-2) edelleen kaksi PvuII-kohtaa (ks. kuva 3).

40

Jotta voitaisiin liittää yhdistelmä-IFN-aeene-iä IFM^aa koo-dittavalla alueella olevaan PvuII-kohtaan, pitää rakenne-geenin ulkopuolella oleva toinen PvuII-kohta poistaa.

Tämä plasmidin pAM4 muunto on oleellisesti IFN ot-2 cDNA-sekvenssin rakennegeenin ulkopuoliseen 3'-alueeseen kohdistuva deleetio Pstl-kohdan ja rakennegeenin ulkopuolisen 3'-PvuII-kohdan välissä (ks. kuva 3). Plas-midi pAM4 pilkotaan osittain PvuII:11a (5 yg pAM4:ää liuoksessa, jossa on 50 mM NaCl, 6 mM MgC^» 6 mM 2-merkapto-etanolia, 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 yksikkö PvuIIrta (Biolabs) per ua 5 minuuttia, 37°C:ssa, pysäytetään fenoliuutolla) ja lii-32 tetään ( P)-Pstl-kytkijään (Collaborative Research, menettely sama kuin esimerkissä 1). Saadulla DNA-seoksella transformoidaan E. coli HB 101 samoin kuin edellä ja 16 pesäkkeen plasmidit seulotaan restriktioentsyymianalyy-sillä oikeankokoisen deleetion (246 emäaparia) läsnäolon siiiteen käyttämällä restriktioentsyymejä PstI, PvuII ja Hindlll. Tutkittujen 16 pesäkkeen joukossa on 3 muuttumatonta plasmidia pAM4, yksi on multimeeri, viidessä on suuri deleetio (620 emäsparia) ja seitsemässä on haluttu pieni deleetio (246 emäsparia). Valitaan yksi klooni, jossa on lyhennetty IFN α-2-liitännäinen (pieni Hindlll-Fstl-jakso on nyt 907 emäsparia), ja sille annetaan nimeksi pAM21.

Esimerkki 3: Sellaisten Pvu-yhdistelmien rakentaminen, joissa on tekijäinvaihto aminohapossa 92

Plasmidit pAM2 (a-3) ja pAM21 (a-2) leikataan kumpikin restriktioentsyymeillä Hindlll ja PvuII, jolloin poistuu DNA-jaksot (521 emäaparia), jotka sisältävät β-laktamaasipromoottorisekvenssin ja IFN-geenin N-pään puoleisen osan (koodittaa aminohappoja 1 - 92). Suuret ja pienet jaksot (noin 4 ke ja 521 e, vastaavasti) erotetaan sakkaroosigradienttisentrifugoinnilla ja suuret jaksot defosforyloidaan käsittelemällä 1 yg kutakin DNA-jaksoa 50 yltssa 50 mM Tris pH 8 1 yksiköllä vasikan emäsfosfataasia per 10 pmol 5'-päitä 30 minuuttia 37°C: 90983 41 ssa. Yhdistelmä-IFN-geenit " ja ^0.^21^1^" ra kennetaan liittämällä tarvittavat edelläkuvatut suuret ja pienet DNA-jaksot yhteen (kun plasmidista pAM2 saatu suuri Hindlll-PvuII-jakso (n. 4 ke) liitetään plasmidista pAM21 saatuun pieneen Hindlll-PvuII-jaksoon (521 e), saadaan tyyppiä B1B2D2D^-IFN edustava geeni, jne.). Yhteenliittämiset suoritetaan 10 yl:n tilavuuksissa, joissa on 20 rnM Tris.HCl pH 7,8, 10 mM MgC^/ 10 mM DTT, 0,5 mM rATP, 40 yksikköä/ yl T4 DNA-ligaasia (Biolabs) ja noin 500 ng suurta DNA-jaksoa ja 20 - 40 ng pientä DNA-jaksoa. Kun on inkuboitu 5 tuntia 15°C:ssa, 5 ylslla yhteenliittämisseosta transformoidaan E. coli HB 101 edelläkuvatulla tavalla, jolloin kussakin transfor-moinnissa saadaan noin 1000 transformoitunutta pesäkettä. Kustakin trasnformoinnista poimitaan 3 pesäkettä, niiden plasmidi-DNA eristetään ja analysoidaan enstyy-meillä Hindlll, PvuII, EcoRI, Taql ja Pstl. Valitaan kaksi plasmidi-DNA:ta kantavaa pesäkettä, joissa on haluttu rakenne (pAM 27 ( B^D^") ja pAM 33 ("D^B^")) .

Esimerkki 4: Sellaisten yhdistelmä-XFN-geenien ra kentaminen, joissa on tekijäinvaihto aminohapossa 150

Plasmidit pftM2 (a-3) ja pftM21 (a-2) pilkotaan kukin

PvuII:11a ja Pstl:llä. DNA-jaksot erotellaan sakkaroosi- gradienttisentrifugoinnilla suuriin PvuII-Pstl-fragment- teihin (noin 4 ke, koodattavat IFN a-2:n ja a-3:n N- pään 92 aminohappoa) ja pieniin PvuII-PstI-jaksoihin (pituudeltaan vastaavasti 386 ja 495 e, koodittavat IFN a-2:n ja a-3:n C-päätä). Toisessa vaiheessa kukin puhdistettu pAM2:n ja pAM21:n pieni PvuII-Pstl-jakso 32 leimataan P:llä seuraavasti:

Kukin DNA-jakso (n. 1 yg) liuotetaan 50 yl:aan 50 mM

Tris-HCl pH 8,0 ja defosforyloidaan käsittelemällä 1 yksiköllä emäsfosfataasia·.per 10 pmol 5'-päitä 30 minuuttia 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan inkuboimalla 1 tunti 65°C:ssa ja DNA puhdistetaan adsorboimalla ja eluoimalla DEAE-selluloosasta ja saostetaan etanolilla.

DNA fosforyloidaan 20 yl;n reaktiotilavuudessa, jossa 42 on 50 mM Tris-HCl pH 9,5/10 mM MgCl9/{5 mM DTT, 30 - 40 32 ^ μΐ lyofilisoitua γ-( P)-ATP:tä (Amersham, 6000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) ja 0,5 yksikköä T4 kinaasia per yl (P.L. Biochemicals) . Inkuboidaan 20 minuuttia 37°C:ssa, jonka jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä EDTA:ta pitoisuuteen 10 mM. Sitten lisätään ylimäärin (n. 4 yg) vastaavaa käsittelemätöntä DNA-jaksoa ja liuos uutetaan fenolilla ja kloroformilla. DNA erotetaan jäljellejää-32 neestä γ-( P)-ATP:stä kromatografiällä Sephadex G-50-pylväässä TNErllä. Cerenkov-laskennalla havaitut poistuvat jaefiuiput yhdistetään ja saostetaan etanolilla.

32

Kukin P:llä leimattu pieni PvuII-PstI-jakso pilkotaan täydellisesti Sau3A:lla ja pilkottu DNA erotetaan elektroforeesilla 6 % polyakryyliamidigeelissä käyttämällä TBE:tä ajopuskurina. Geelistä eristetään 4 DNA-jaksoa, jotka vastaavat PvuII-Sau3A-aluetta (kukin 172 emäsparia koodittaen IFN a-2:n ja a-3:n aminohappoja 93 -150) ja Sau3A-PstI-alue (214 e ja 323 e vastaavasti koodittaen IFN a-2:n ja a-3:n aminohappoja 151 - 166).

Liittämällä yhteen 3 tarvittavaa jaksoa(ks. taulukko 2) , saadaan 4 yhdistelmä-IFN-tyyppiä, joissa on teki jäinvaihto aminohapossa 150. Vastaavat plasmidit rekonstruoidaan seuraavasti: Ensimmäisessä liittämisreak- tiossa ekvimolaariset määrät PvuII-Sau3A- ja Sau3A-PstI-jaksoa liitetään yhteen 10 yl:ssa liittämispuskuria, joka sisältää 20 mM Tris.HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP ja 40 yksikköä/ yl T4 DNA-ligaasia, inku-boimalla 3-6 tuntia 15°C:ssa (näin syntyy yhteenlii-tetty DNA). Sen jälkeen suoritetaan pilkkominen PvuII-PstI :llä, uutetaan fenoli/kloroformilla (1:1) ja ylimäärä tarvittavaa suurta PvuII-PstI-jaksoa (defosforyloitu: tavallisesti 1 yg DNA:ta käsitellään 50 yl:n tilavuudessa liuosta, jossa on 50 mM Tris-HCl pH 8 (noin 0,6 pmol 5'-päitä), 0,06 yksiköllä vasikan suolen emäsfosfa- taasia 30 minuuttia 37°C:ssa) lisätään ja DNA liitetään uudestaan yhteen. E. coli HB 101 transformoidaan ja poimitaan 4 kloonia, joilla on haluttu restriktio- li 43 90983 analyysillä (PvuII, Sau3A, Taql ja EcoRI) todettu rakenne. Klooneille annetaan nimet E. coli HB 101 pJC334, pJC37, pJC342 ja pJC344 (ks. taulukko 2).

Taulukko 2: Niiden DNA-jaksojen alkuperä, joita käytet tiin rakennettaessa yhdistelmäinterferoneja, joissa on tekijäinvaihto aminohapon 150 kohdalla. Sulkeisiin on merkitty IFN-tyyppi ja jaksojen koodittama aIFN:n alue.

Tuloksena ^ ^ ^ ^ . , saatu Kloonin Yhteenlrrtetyt DNA-3aksot (pxtuus) yhdis- ja

telinä- plas- PvuII-PstI PvuII-Sau3A Sau3A-PstI

IFN- midin (n. 4ke) (170 e) (210 e, a-2) tyyppi nimi (320 e, a-3) "DiDzDjB.," pJC334 AM2(o-3j_92) Αο2(α-393 15()) Am21(a-2151_166> "0x028301,·· pJC337 AM2(o-31_92> Am21(a-293_150) Am2(e-3151_166> "BiBzDsBi," pJC342 AM21 (0-2^^) Am2(e-393_150) Am21(e-2151166) "BxBzBsD^' PJC344 AM21(o-2j_92) Am21(a-293150) Am2(e-3151166)

Esimerkki 5: Sellaisten yhdistelmä-IFN-geenien rakenta minen, joissa on tekijäinvaihto aminohapon 61 kohdalla Näiden yhdistelmä-IFN-geenien rakentaminen suoritetaan oleellisesti ottaen samalla tavalla kuin esimerkissä 4 on selostettu.

Kumpikin plasmidi pAM2 (a-3) ja pAM21 (a-2) leikataan Hindlllrlla ja PvuIIs 11a ja jaksot erotellaan sakka-roosigradienttisentrifugoinnilla. Pienet Hindin-PvuII-jaksot (521 e, sisältävät β-lac-promoottorialueen ja IFN

a-2:n ja a-3:n N-pään 92 aminohappoa koodittavan alueen) 32 leimataan P:llä ja pilkotaan osittain Sau2A:lla (0,5 yksikköä entsyymiä per yg DNA:ta, 5 minuuttia 37°C:ssa, reaktio pysäytetään fenoliuutolla). Saadut jaksoseokset erotellaan osiinsa suorittamalla elektroforeesi 6 % poly- 44 akryyliamidigeeleissä ja geeleistä uutetaan 4 jaksoa (kaksi 424 emäsparin HindIII-Sau3A-jaksoa ja kaksi 97 emäsparin Sau3A-PvuII-jaksoa). Tarvittavat 3 jaksoa liitetään yhteen vaiheittain samoin kuin esimerkissä 4 on kuvattu (ks. taulukko 3), ja E. coli HB 101:n transformointi johtaa transformantteihin, joissa on vain kahta odotetuista neljästä rakenteesta eli saadaan pAM65 ("0^Β2Ρ304") ja pAM90 (”B1D2B3B4").

Taulukko 3: Niiden DNA-jaksojen alkuperä, joita käytet tiin rakennettaessa yhdistelmäinterferoneja, joissa on tekijäinvaihto aminohapon 61 kohdalla. Sulkeisiin on merkitty IFN-tyyppi ja jaksojen koodittama aIFN:n alue.

Tulok sena saatu Kloonin DNA-jaksotyyppi (pituus) yhdis- ja telmä- plas-

IFN- midin HindIII-Sau3A Sau3A-PvuII Hindlll-PvuII

tyyppi nimi (424 e) (97 e) (n. 4ke)

DiB2D3D% pAM65 An2(e-31_61> Am21(o-26292) AM2(a-393_166> B1D2B3BH pAM90 Am21(e-21_61) Am2(a-362_92) AM21(a-293_166>

Jotta saataisiin rakennetuiksi muut kaksi yhdiste lmä-IFN-geeniä, joissa on tekijäinvaihto aminohapon 61 kohdalla, kukin plasmidi pAM65 ja pAM90 katkaistaan HindIII:lla ja PvuIIrlla ja pienet HindIII-PvuII-DNA-jaksot (521 e) eristetään elektroforeesin jälkeen, joka suoritetaan agaroosigeeleissä. Kun plasmidin pAM90 pieni Hindlll-PvuII-jakso liitetään plasmidin pAM2 suureen Hindlll-PvuII-jaksoon, saadaan plasmidi pAM94 (B^D2D3D4), ja kun plasmidin pAM65 pieni Hindlll-PvuII-jakso liitetään plasmidin pAM21 suureen HindiII-PvuII-jaksoon, saadaan plasmidi pAM76 (ϋ,^Β^^. Edellä mainittujen 4 plasmidi DNA:n rakenne varmistetaan restriktioentsyymianalyy-sillä.

90983 45

Vastaavat kloonit ovat nimeltään E. coli HB101 pAM65, pAM90, pAM94 ja pAM76.

Osa II: Interferoni-a-2/a-3-yhdistelmien rakentaminen ja kloonaus Saccharomyces cerevisiae-hiivaan

Kaikki jäljempänä kuvatut yhdistelmäinterferonipro-teiinia koodittavat sekvenssit on liitetty PH05-promoottoriin ja PH05:n transkriptionlopetussignaaleihin, kloonattu hiivan 2y-vektoriin pJDB207 ja transformoitu hii-vakantaan S. cerevisiae GRF18.

Esimerkki 6: Ilmentämisplasmidin p31RT (Δ72) rakenta minen

Plasmidi pJDB207/IF2(5^)A72 (eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 100,561) pilkotaan HindIII:lla ja EcoRI: llä ja 470 e:n jakso, joka sisältää ot-2:n karboksyyli-pään ja PH05:n transkription lopetussignaalit, eristetään agaroosigeelielektroforeesilla ja elektroeluutiolla (R. Yang et ai., Methods Enzym. 6j), 176 (1979)) käyttämällä Micro-Collodion-pusseja (Sartorius, Göttingen, Länsi-Saksa).

Plasmidi p31R (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu 100,561) pilkotaan Hindlllrlla ja EcoRItllä ja 4,1 ke:n vektoriosa eristetään edellämainitulla tekniikalla. Kun on liitetty yhteen 200 ng vektoria ja liitännäis-DNA:ta käyttämällä E. colin T4 DNA-ligaasia ja E. coli HB101 transformoitu ampisilliinille vastustuskykyiseksi, eristetään plasmidi, jolle annetaan nimeksi p31RT(A72), ja joka sisältää PH05:n promoottorin, α-2-interferonin C-pään ja PH05:n transkription lopetussignaalit, ja saadun plas-midin rakenne varmistetaan restriktioanalyysillä.

Esimerkki 7: Plasmidien pJD207 PH05/IFN AM104, AM114 ja AM119 rakentaminen PH05:n ilmentämisplasmidi p31RT(A72) (ks. esimerkki 6) pilkotaan EcoRI:llä ja XhoI:llä ja sisempänä olevat 3'-päät täytetään dCTP:llä, dGTPsllä, dATP:llä ja dTTP: llä käyttämällä E. colin DNA polymeraasi I:n Klenow-jaksoa.

46

Saadut tylpät päät defosforyloidaan käyttämällä bakteeriperäistä emäsfosfataasia. Plasmidit pJC334, pAM90 ja pJC337 (esimerkit 4 ja 5) pilkotaan Taqlsllä (pJC334 ja pAM90) tai Taqlrllä ja EcoRIsllä (pJC337) ja sisempänä olevat 3'-päät täytetään vastaavilla deoksinukleotideilla edelläkuvatulla tavalla. Noin 560 e:n DNA-jaksot eristetään geelielektroforeesilla ja elektroeluutiolla käyttämällä Micro-Collodion-pusseja kuten edellä. Kun liitetään yhteen 200 ng valmistettua plasmidin p3lRT(A72) vek-toriosaa ja 200 ng eluoituja DNA-jaksoja käyttämällä T4 DNA-ligaasia ja transformoidaan E. coli HB101 ampi-silliinille vastustuskykyiseksi, saadaan plasmidit p31R/IFN AM104 (sisältää yhdistelmäinterferonia "D^D2D2B^" koodittavan sekvenssin), p31R IFNAM119 (sisältää yhdistelmäinterferonia "B^D2B2B^" koodittavan sekvenssin) ja p31R IFN AM114 (sisältää yhdistelmäinterferonia "D1D2B3D4" koodittavan sekvenssin) vastaavasti. Kun nämä plasmidit leikataan BamHIrllä ja Hindlllrlla, saadaan agaroosigeeli-elektroforeesilla ja elektroeluutiolla eristetyiksi DNA-jaksot (noin 1300 e), joissa on PH05-promoottori, IFN-proteiinia koodittava sekvenssi ja PH05:n transkription lopettamissignaali. Tämä jakso kloonataan plasmidin pJDB207 Hindlll- ja BamHI-kohdan väliin. Näillä plas-mideilla transformoidaan hiivakanta GRF18 ominaisuuksiltaan Leu+:ksi (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu 100, 561, ks. myös esimerkki 14). Näin saaduista klooneista käytetään nimityksiä S. cerevisiae GRF 18/pJDB207 PH05/IFN AM104, GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM114 ja GRF18/ pJDB207 PH05/IFN AM119.

Esimerkki 8: Plasmidin pJDB207 PH05/IFN AM129 rakentami nen

Plasmidi pAM94 (esimerkki 5) katkaistaan täysin Taql:llä ja osittain (etidiumbromidin 10 ng/ml läsnäollessa) EcoRI:llä. Noin 580 e:n DNA-jakso eristetään agaroosigeelielektroforeesilla ja elektroeluutiolla ja liitetään EcoRI:llä ja Xholrllä leikattuun, geelissä 47 90983 puhdistettuun plasmidin p31RT(Ä72) vektoriosaan (ks. esimerkki 6). E. coli HB101 transformoidaan ampisil-liinille vastustuskykyiseksi ja plasmidi p31R PH05/IFN AM129 eristetään. Tämä plasmidi, joka sisältää interferonia koodittavan alueen, pilkotaan Hindlll: 11a ja BamHIillä ja 1300 e:n DNA-jakso liitetään plasmidiin pJDB207 esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Tällä plasmidilla transformoidaan hiivakanta GRF 18 samoin kuin edellä. Näin saadulle kloonille on annettu nimeksi S. ce-revisiae GRF18/pJDB 207 PH05/IFN AM 129.

Esimerkki 9: Plasmidien pJDB207 PH05/IFN AM 106, AM110 ja AM112 rakentaminen

Plasrnidit PJDB207 PH05 IFN/AM 104, AM114 ja AM129 {ks. esimerkit 7 ja 8) pilkotaan BamHI:llä ja PvuII:lla ja 6,8 ke:n vektoriosat, jotka sisältävät interferonia koodittavan alueen C-pään vastaavasti, eristetään aga-roosigeelielektroforeesilla ja elektroeluutiolla. Samoin plasmidi pJDB207R/(α-2)Λ72 (eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 100,561) pilkotaan BamHI:llä ja PvuII: 11a ja 800 e:n DNA-jakso eristetään. Kun vastaavat jaksot liitetään yhteen jaE. coli HB101 transformoidaan, saadaan plasrnidit pJDB207 PH05/IFN AM106 (sisältää yhdistel-mäinterferonia "BiBjB^D^" koodittavan alueen), AM112 (sisältää yhdistelmäinterferonia "B^BjD^B^" koodittavan alueen) ja AM110 (sisältää yhdistelmäinterferonia "B.B^D-D." koodittavan alueen). Hiivakanta GRF18 trans-formoidaan tavalliseen tapaan. Näin saadut kloonit ovat nimeltään S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN AM106, pJDB207 PH05/IFN AM112 ja pJDB207 PH05/ IFN AM110.

Esimerkki 10: Plasmidien pJDB207 PH05/IFN DM 1 ja DM 2 rakentaminen

Plasmidi pJDB207 PH05/IFN AM119 (esimerkki 7) katkaistaan HindIII:lla ja Bglllrlla ja 7,5 ke:n vektoriosa, joka sisältää interferonia koodittavan alueen N-pään, eristetään agaroosigeelielektroforeesilla ja elektroeluu- 48 tiolla. Samoin kukin plasmideista pJDB207 PH05/IFN AM114 ja pJDB207 PH05/IFN AM104 (ks. esimerkki 7) pilkotaan samoilla entsyymeillä ja noin 600 e:n DNA-jaksot, jotka sisältävät interferonia koodittavan alueen C-pään, eristetään. Tarvittavat jaksot liitetään yhteen T4 DNA-ligaasin avulla. Kun E. coli HB101 transformoidaan, saadaan plasmidit pJDB207 PH05/IFN DM1, joka sisältää yh-distelmäinterferonia "B.jD2B3D4" koodittavan alueen, ja plasmidi pJDB207 PH05/IFN DM2, joka sisältää yhdistelmä-interferonia "B.D0D0B.” koodittavan alueen. Hiivakanta GRF18 transformoidaan edelläkuvatulla tavalla. Näin saadut kloonit ovat nimeltään S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM1 ja s. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM2.

Esimerkki 11: Plasmidin pJDB207 PH05/IFN HRi43 raken taminen

Plasmidi pJDB207R/IF (α-2)Λ72 (eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 100,561) pilkotaan BamHIrllä ja PvuIIslla ja 6,8 ke:n DNA-jakso eristetään. Samoin plasmidi pJDB207R/IF (a-3) (eurooppalainen hakemusjul-kaisu no. 100,561) pilkotaan samoilla entsyymeillä ja 800 e:n DNA-jakso eristetään. Kun kyseiset kaksi DNA-jaksoa liitetään yhteen ja E. coli HB101 transformoidaan ampisilliinille vastustuskykyiseksi, saadaan plasmidi pJDB207 PH05/IFN HRi43, joka sisältää yhdistelmä-interferonia "D.D_B-,B . " koodittavan alueen. Hiivakanta GRF18 transformoidaan edelläkuvatulla tavalla. Näin saadut kloonit ovat nimeltään S. cerevisiae GRF18 pJDB 207 PH05/IFN HRi43.

Esimerkki 12: Saccharomyces cerevisiae GRF18:n transfor- mointi ja interferonituotannon indusointi

Plasmidi pJDB207 PH05/IFN AM129 ("B^D^") tuodaan Saccharomyces cerevisiae-kantaan GRF18 (a, his 3-11, £ his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can ) samoin kuin on selostettu julkaisussa Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 75, 1929 (1978). 1 pg plasmidi-DNA:ta lisätään 100 49 90983 pl:aan sferoplastisuspensiota ja saatu seos käsitellään polyetyleeniglykolilla. Sferoplastit sekoitetaan regene-rointiagarin (10 ml) kanssa ja niitä kasvatetaan minimi-alustaa sisältävillä maljoilla ilman leusiinia. Kun in-kuboidaan 3 vuorokautta 30°C:ssa, saadaan noin 1000 transformoitunutta solua.

Yksi ainut hiivapesäke poimitaan hiivantra-nsfor-mointimaljoista (nimeltään Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207 PH05/IFN AMI 29) ja sijoitetaan 10 ml:aan hiivan minimialustaa 100 ml:n Erlenmeyer-kolviin ja kasvatetaan 30°C:ssa 24 tuntia nopeudella 200 1/min ravis- 7 telien tiheyteen noin 2 - 3 x 10 solua/ml. Solut pestään kerran 20 ml:11a "low-P^"-minimialustaa ("Difco yeast minimal medium without amino acids", johon on lisätty 20 g/1 glukoosia, mutta muuten valmistettu Difcon ohjeen mukaisista aineosista (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA) paitsi, että 1 g/1:n KH2P04 tilalla on käytetty 0,03 g/1 KH2P04 plus 1 g/1 KCl). Kolmella millilitralla uudelleensuspendoituja soluja siirrostetaan 300 ml "low-P.^ "-alustaa ja 300 ml normaalia minimialustaa vastaavasti 1000 ml:n Erlenmeyer-kolveissa. Inkuboidaan 30°C:ssa nopeudella 160 1/min. PH05-promoottorin indusoitumista seurataan mittaamalla happofosfataasiaktiivisuuden ilmestyminen kokonaisiin soluihin (Toh-e et ai., J.

Bacteriol. 113, 727 (1973)). Soluja kasvatetaan pitoisuuteen noin 1 - 2 x 107 solua/ml (26 - 30 tunnin inku-bointi).

Esimerkki 13: Hiivasolu-uutteiden valmistus ja inter- feronitiitterin määritys

300 ml:sta kasvualustaa (ks. esimerkki 12), jossa solutiheys on 1 - 2 x 10 /ml, kerätään solut talteen sentrifugoimalla Sorvali GSA-roottorissa 5 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 8000 1/min. Solut pestään kerran 100 ml:11a vettä, uudelleensuspendoidaan 6 ml:aan jääkylmää lysointiseosta (0,1 M kaliumfosfaattipuskuri pH 7,4, 1% (tilavuusosina) Triton X-100, 0,0001 M PMSF

50 (Merck)) ja siirretään 30 ml:n corex-putkeen. Suspensio sentrifugoidaan uudelleen Sorvali SS-34-roottorissa (5 minuuttia, 4°C, 8000 1/min) ja suspendoidaan uudestaan 3 ml:aan lysointiseosta 0°C:ssa. Solususpensioon lisätään 4 g lasihelmiä (halkaisija 0,4 mm) ja saatua suspensiota ravistellaan Vortex Mixer-sekoittimessa (Scientific Instuments Inc., USA) täydellä nopeudella 30 sekuntia ja sen jälkeen jäähdytetään 1 minuutti jäähauteella. Tämä ravistelu toistetaan 5-10 kertaa, kunnes yli 90 % soluista on särkynyt (tarkistetaan valo-mikroskoopin alla). Liuoksesta poistetaan solujätteet ja lasihelmet sentrifugoimalla 10 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 8000 1/min Sorvali HB-4-roottorissa. Emäliuos siirretään Eppendorf-putkiin, jäädytetään nestetypessä ja säilytetään -60°C:ssa. S. Rubinstein et ai:n menetelmällä (J. Virol. 2T_, 755 (1981)) määritetty interfe- 9 roniaktiivisuus on 7 x 10 yksikköä/ml solu-uutetta.

S. cerevisiae-kanta GRF18 transformoidaan esimerkkien 12 ja 13 mukaisesti plasmideilla pJDB207 PH05/ IFN AM119 (,,B1D2B3B4··) , AM106 ( "B^B^") , AM11 2 ("B1B2D3B4") , DM1 ("B^B^") , DM2 ( "B^D^") , AM110 ("B^B2D3D4") ja HRi43 ("D.jD2B3B4"). Saatuja kantoja viljellään. Solut otetaan talteen ja interferoni-tiitterit määritetään edelläkuvatulla tavalla. IFN-tiitterit ovat seuraavat: S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM119: 5·109 yksikköä/ml S. cerevisiae GRFl8/pJDB207 PH05/IFN AM106: 7·107 yksikköä/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM112: 2·10® yksikköä/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM1 : 3·109 yksikköä/ml S. cerevisiae GRFl8/pJDB207 PH05/IFK DM2 : 5*109 yksikköä/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM110: 3*10® yksikköä/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN HR143: 1-109 yksikköä/ml

Samoissa olosuhteissa antavat S. cerevisiae-kannat GRF18/pJDB207R/IF( ot-2) ja /IF ( ct-3) (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100,561) tiittereiksi 8 9 1 x 10 ja 3 x 10 yksikköä/ml vastaavasti.

li 51 90983

Esimerkki 14: Yhdistelmäinterferonin "B.jD2D2D4" tuotta minen transformoituneilla hiivasoluilla 30 litran mittakaavassa

Hiivakantaa GRF 18, joka kantaa plasmidia pJDB207 PH05/IFN AM129, jossa on happofosfataasin promoottorin PH05 alavirrassa yhdistelmäinterferonia koo- dittava geeni, viirutetaan YNB-alustaa sisältävälle aga-rille. Maljaa inkuboidaan 30°C:ssa, kunnes havaitaan yhtenäinen kasvu. Steriilillä kierukalla siirretään osa pintaviljelmää ravistelupulloon, joka sisältää esivil-jelyalustaa IFN/21, jonka koostumus on seuraava:

Hiivauute (Difco) 10,0 g L-asparagiini.H2O 6,6 g kh2po4 1,0 g

MgS04.7H20 1,9 g L-histidiini 0,02 g D-glukoosi (monohydraatti) 33,0 g per 1 deionoitua vettä 500 ml:n kolvissa on yksi ohjauslevy ja se sisältää 100 ml alustaa. Kasvualusta valmistetaan deionoidusta vedestä ja sen pH on noin 6,0. Glukoosi steriloidaan erikseen. Siirrostuksen jälkeen ensimmäistä esiviljelmää inkuboidaan 24 tuntia 30°C:ssa orbitaaliravistelulaittees-sa, jossa on 5 cm:n heitto, nopeudella 250 kierrosta/min. Ensimmäisestä esiviljelykolvista saadaan ymppi toisiin esiviljelykolveihin. Näihin kolveihin tuodaan ymppiä 1 tilavuus-%. Kasvualusta ja inkubointiolosuhteet ovat samat kuin ensimmäisessä esiviljelmässä. Riittävä määrä toisen esiviljelyn kolveja yhdistetään, jotta saadaan riittävä määrä ymppiä (1 tilavuus—%) 30 litran fermento-riin (3 kolvia per fermentori). Tuotantofermentorin toi-mintatilavuus on 30 litraa, se sisältää 4 ohjauslevyä ja yhden kuusilapaisen levyturbiinisekoittimen, jonka halkaisija on 115 mm. Sekoitusnopeus on 600 kierr/min, ilmaa suihkutetaan nopeudella 1 tilav./tilav./min ja pidetään yllä 0,3 bar:n ylipainetta. Fermentointilämpötila on 30°C. Fermentori steriloidaan sen sisältäessä alustaa IFN/23, jonka koostumus on seuraava: 52

Hiivauute (Difco) 2,0 g L-asparagiini.H20 6,6 g

MgS04.7H20 1,0 g L-histidiini 0,02 g D-glukoosi (monohydraatti) 33,0 g per 1 deionoitua vettä Glukoosi steriloidaan erikseen ja lisätään niin, että lopulliseksi tilavuudeksi tulee 30 1.

Siirrostuksen jälkeen fermentaation pH:ta säädetään natriumhydroksidia lisäämällä niin, ettei se laske arvon 6,0 alapuolelle. Fermentointi kestää noin 18 tuntia tai sitä jatketaan, kunnes saavutetaan maksimaalinen interfe-ronisaanto.

Optinen tiheys, joka on hyvä hiivasolujen kasvun mitta, saavuttaa 6-7 optisen tiheysyksikön välillä olevan arvon. Glukoosi kuluu suurelta osin, mutta ei täysin, ja happofosfataasiaktiivisuus indusoituu yhdessä interfero-nituotannon kanssa.

Interferonitiitteri voidaan mitata raakauutteista, jotka saadaan rikkomalla solut mekaanisesti laboratorios- g sa, ja tiitteri on 7.10 yksikköä/litra solu-uutetta. Raa-kauutteen proteiinipitoisuus on noin 1 mg/ml.

Fermentoinnin lopussa voidaan viljelmä tarvittaessa jäähdyttää 10°C:een ennen solujen ja yhdistelmäinterfe-ronin talteenotttoa.

30 1 viljelmää, jonka pH on 6,0, jäähdytetään 10°C: n een ja solut erotetaan Sharpies -sentrifugilla. Kirkas emäliuos ei sisällä lainkaan IFN-aktiivisuutta. Saadun

solumassan tilavuudeksi säädetään puskurilla X (2 mH

Tris pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 20 μΜ fenyylimetyy- lisulfonyylifluoridia) 1400 ml, jolloin pH on 8,0. Sus-

o R

pensio jäähdytetään 5-10 C:een ja lasketaan DYNO -myllyn (tyyppi KDL Pilot, 0,6 1) läpi, joka on varustettu polyuretaanisekoituskiekoilla ja 500 ml:11a lasi-helmiä (halkaisija 0,5 - 0,75 mm), sekoitusnopeudella 3000 1/min ja syöttönopeudella 10 1/h, jolloin solut särkyvät. Suspension pH on 8. Särkyneet solut sisältävä suspensio kirkastetaan sentrifugoimalla. Sentrifu- li 53 90983 gointi suoritetaan Sorvali 6SA-roottorissa nopeudella 12000 1/min 4°C:ssa 20 minuutissa.

S. cerevisiae GRF18-kantoja, joissa on plasmidi PJDP207 PH05/IFN AM119/ AM106, AM112, DM1 tai DM2 voidaan viljellä ja vastaavaa yhdistelmäinterferonia sisältävä kirkastettu liuos voidaan tuottaa vastaavalla tavalla.

Esimerkki 15: E. coli HB101/pAM94-kannan uutteiden val mistus ja IFN-aktiivisuuden määrittäminen E. coli-kantaa HB101/pAM94 kasvatetaan optiseen tiheyteen 8 (650 nm) l:ssa M9-alustaa, joka sisältää 0,4 % kasaminohap-poja ja 2 % glukoosia. Solut sedimentoidaan ja uudelleen-suspendoidaan puskuriin (16 g soluja 160 ml:ssa puskuria), joka sisältää 0,1 M Tris.HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA ja 100 yM PMSF. Lisätään lysotsyymiä niin, että lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 1 mg/ml. Sitten liuosta pidetään jään päällä 30 minuuttia. Tämän suspension solut avataan käyttämällä Sorvali Omnimix-laitetta asetuksella 3 x 60 sekuntia. Särkyneet solut sisältävä suspensio kirkastetaan sentrifugoimalla Sorvali 6SA-roottorissa nopeudella 12 000 1/min 4°C:ssa 20 minuuttia. Emäliuoksen IFN-aktiivisuus määritetään käyttämällä S. Rubinstein et ai:n menetelmää (supra).

7 IFN-aktiivisuudeksi saadaan 5.10 yksikköä/ml solu-uutetta.

Vastaavalla tavalla kasvatetaan E. coli-kantoja HBl01/pAM90, pJC344 ja pJC342, joiden interferonitiitte-reiksi saadaan edellämainitulla menetelmällä mittaamalla 5.10®, 5.10^ ja 5.106 yksikköä/ml solu-uutetta.

Esimerkki 16: Hybridoomasolujen valmistus a) Immunogeenilähde: Immunisoinneissa käytetään osittain puhdistettua luontaista ihmisen leukosyytti-interferonia (IFNa), joka oli saatu Tri K. Cantellilta (Helsinki), ja jonka ominaisaktiivisuus oli 13 x 10® kansainvälistä yksikköä per mg proteiinia.

b) Immunisointiohjelma: Seitsemän naaraspuolis- 54 ta Balb/c-hiirtä (Sisselnin eläinfarmi, Sveitsi), joiden ikä on 10 - 14 viikkoa, immunisoidaan injektoimalla neljään 5 käpälään 4 x 10 kansainvälistä yksikköä IFNa:aa (esimerkki 16a) emulgoituna täydelliseen Freundin adjuvant-tiin (Difco). Vuorokautena 30 annetaan vielä injektiona 4 x 10^ kansainvälistä yksikköä IFNotsaa epätäydellisessä Freundin adjuvantissa ja vuorokautena 60 annetaan 5 tehosteruiskeena (i.p.) 6 x 10 kansainvälistä yksikköä IFNasaa PBS:ssä. Kolme vuorokautta myöhemmin otetaan pernat fuusiota varten.

c) Solufuusio: Kaikki fuusiointikokeet suoritetaan G. Köhlerin ja C. Milsteinin menetelmällä (Nature 256, 495 (1975)) käyttämällä erittämätöntä Sp 2/0-Ag14- myeloomasolulinjaa (M. Shulman, C.D. Wilde and G. Köhler, 8 7

Nature 276, 269 (1978)). 10 pernasolua ja 10 myelooma- solua sekoitetaan keskenään polyetyleeniglykolin (1 ml, 50 %) läsnäollessa (PEG 1500, Serva). Pesun jälkeen solut uudelleensuspendoidaan 48 ml saan tavallista Dulheccon minimaaliset välttämättömät ravinteet sisältävää alustaa (Gibco No. 0422501). 3 x 10^ normaalia hiiren peritoneaalista tulehdusnestesolua per fuusio lisätään syöjäsoluiksi. Solut jaetaan costar-kolojen (48 x 1 ml) kesken ja niille syötetään 3-6 viikon ajan 3 kertaa viikossa tavallista HAT-valinta-alustaa. Kun hybridoomasolujen kasvu tulee näkyväksi, emäliuokset seulotaan käyttämällä yhdistettyä immunosaostus-biomää-ritystä (esimerkki 19). Kaikkiaan 221 hybridoomasta havaitaan 10 hybridooman tuottavan anti-IFNa-vasta-aineita. Hybridoomasolut kloonataan rajoittavalla laimennusmene-telmällä mikrotitrauslevyillä vähintään kerran. Hybridoomasolut 144 BS valitaan jatkotutkimuksiin, koska ne ovat erityisen stabiileja ja erittävät suuria määriä immuno-globuliinia.

Esimerkki 17: Monoklonaalisen vasta-aineen eristäminen ja puhdistaminen 8-10 viikon ikäiset Balb/c-hiiret (Sisselnin I; 55 90983 eläinfarmilta, Sveitsi) käsitellään vatsaontelonsisäisesti 0,3 ml:lla pristaania (Aldrich). 2-3 viikkoa myöhemmin annetaan vatsaontelonsisäisesti 2 - 5 x 10^ kloonattua hybridoomasolua ja 0,2 ml pristaania. 8-10 vuorokauden kuluttua kerätään askitesneste, sentrifugoidaan nopeudella 800 x g ja varastoidaan -20°C:ssa.

Sulatettua askitesnestettä sentrifugoidaan 60 minuuttia nopeudella 50000 x g. Pinnalla kelluva rasvakerros poistetaan varovasti ja proteiinipitoisuudeksi säädetään 10-12 mg/ml. Raakaimmunoglobuliini saostetaan lisäämällä tipoittain 0,9 tilavuusekvivalenttia kyllästettyä ammoniumsulfaattia 0°C:ssa ja sen jälkeen sakka liuotetaan liuokseen, jossa on 20 mM Tris.HCl/50mM NaCl (pH 7,9), ja dialysoidaan samaa puskuria vasten. Immunoglobuliinijae saadaan DEAE-D52-selluloosalla (Whatman) kromatografises-ti käyttämällä puskurigradienttisysteemiä, jossa on 20 mM Tris.HCl/25 - 400 mM NaCl, pH 7,9. Immunoglobuliini saostetaaan uudestaan ammoniumsulfaatilla ja liuotetaan PBS:ään pitoisuuteen 10 mg/ml.

Suorittamalla natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyli-amidigeelielektroforeesi (SDS-TAGE) todetaan, että mono-klonaalisten vasta-aineiden 144 BS puhtausaste on yli 95 %.

Esimerkki 18: Monoklonaalisten vasta-aineiden luokan ja alaluokan määrittäminen

Hybridoomasolujen tuottamien monoklonaalisten vasta-aineiden luokan ja alaluokan määritys suoritetaan ennestään tunnetulla Ouchterlonyn agargeeli-immunodiffuusio-tekniikalla käyttämällä luokka- ja alaluokkaspesifisiä kanin vasta-aineita (Bionetics). Saadut tulokset vahvistetaan entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA) seuraavalla tavalla: Mikrotitrauslevyt päällystetään käyttämällä koloa kohti 1 yg luokka- tai alaluokkaspesifisestä seerumista saatua kanin immunoglobuliinivalmistetta (Bionetics) 50 yl:ssa PBS-liuosta.

Levyn vapaa sitomiskapasiteetti täytetään käyttämällä puskuria, jossa on 1 % naudan seerumialbumiinia PBS:ssä, jossa on 0,2 % (paino/tilavuus) NaN3, pH 7,4. 100 yl:n 56 näytteitä, jotka sisältävät monoklonaalisia vasta-aineita, inkuboidaan koloissa 1 tunti 37°C:ssa. Levyt pestään PBS-liuoksella, inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa fosfataasiin konjugoidun kanin immunoglobuliinivalmisteen kanssa, jolla on sama spesifisyys kuin levyjen päällystyksessä käytetyllä valmisteella. Kiinnittynyt entsyymi kehitetään inkuboimalla (37°C:ssa, 30 minuuttia) liuoksen kanssa, joka sisältää enstyymin substraattina toimivaa p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml dietanoliamiinipusku-rissa (10 %), joka sisältää 0,5 mM MgCl2 ja 0,02 % (paino/tilavuus) NaN^, pH 9,8) ja mittaamalla optinen tiheys 405 nm:ssä. Monoklonaaliset vasta-aineet 144 BS kuuluvat luokkaan IgG^ic (Kappa).

Esimerkki 19: Yhdistetty immunosaostus-biomääritys 50 yl epäpuhdasta luontaista ihmisen leukosyytti-interferonia tai yhdistelmä-IFN «-polypeptidejä (esimerkki 20a) 4 (10 ky/ml) sekoitetaan yhtä suuriin määriin koeliuosta, kuten esimerkiksi hybridoomasoluviljelmän emäliuosta tai puhdistetun monoklonaalisen vasta-aineen PBS-liuota, ja inkuboidaan 37°C:ssa 2 tuntia mikroputkissa (Eppendorf 3810). Sitten lisätään 50 yl aiemmin titrattua kanin antihiiri-Ig-vasta-ainetta (Nordic) ja saatua seosta inkuboidaan ensin 1 tunti 37°C:ssa ja sen jälkeen 16 tuntia 4°C:ssa, jolloin vapaat ja interferoniin sitoutuneet monoklonaaliset vasta-aineet muodostavat immuunikomplekseja. Putkia sentrifugoidaan 5 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 12000 1/min. Immuunisakka pestään kerran 1 ml:11a kylmää, puskuroitua suolaliuosta (pH 7,2) ja sen jälkeen liuotetaan 200 yl:aan puskuroitua suolaliuosta, jonka pH on 2,2. Näin vapautunut IFN-aktiivisuus määritetään tavanomaisella biomäärityksellä (J.A. Armstrong, Appi. Microbiol. 21, 723 (1971)). Mengo-viruksen (400 plakinmuodostusyksikköä per kolo) sytopaattinen vaikutus todetaan käyttämällä 4

Hep 2-soluja (3 x 10 solua per kolo) mikrotitrauslevyillä. Esimerkki 20: Interferonin spesifisyyden määrittäminen 57 90983 a) Yhdistelmä-IFNa-polypeptidien lähde: Polypep- tidejä LyIFN-a-1,LyIFN-a-2ja LyIFN-a- 3,jotka ovat sukua vastaavasti polypeptideille IFNaF, IFNaB ja IFNaD, selostetaan eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no.

76 489. IFNctA ja IFNaJ on saatu Tri J. Daviesiltä (Biogen, Geneve) ja Prof. C. Weissmanninlta (Zörichin yliopisto, Sveitsi) ja IFNaC Weizmann Institute Of Sciencen virusopin laitokselta ( Rehovot, Israel).

b) Vertailussa käytettyjen IFN :n monoklonaalisten vasta-aineiden lähteet: Monoklonaaliset vasta-aineet 1K2 ja 2K2 valmistetaan brittiläisessä patenttijulkaisussa no. 2 108 510 kuvatulla tavalla. MAb NK2 ja YOK on saatu Celltechiltä (Berkshire), IY-1 ja IY-2 Inter-Yedalta (Israel), S-1, S-2, S-3 ja S-4 Tri. C. Favrelta (UNICET, Dardilly, Ranska) ja MAb 1/24 M. Aguetilta (Zvirichin yliopisto, Sveitsi).

c) Erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus IFNa-alatyyppien suhteen suoritetaan yhdistetyllä immunosaostus-biomäärityksellä (esimerkki 19) ja radioimmunologisella tandem-määrityksellä (D.S. Secher, Nature 290, 501 (1981)). Saaduista tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 4.

Monoklonaaliset vasta-aineet 144 BS, 1K2 ja 2K2 eivät reagoi ihmisen IFN8:n (Rentschler, Laupheim, Länsi-Saksa) tai ihmisen IFNY:n (Bio Science, Emmenbriicke, Sveitsi) kanssa.

58

Taulukko 4: Yhdistelmä-IFNa-alatyyppien immunosaostus monoklonaalisilla vasta-aineilla

Monoklo- IFN a -alatyypit naaliset ——------

vasta- A o-2 C a-3 a-1 J

aineet 144 BS ♦ ++++ +++ ++++ +++ +♦ 1K2 +++ - +++ + +++ 2K2 ++++ - +++ +++♦ ++ +++ NK2 ++++ ++++ - ++ ++++ YOK + - ++++ - +++ S-l ++♦ 4 4444 44 4 S-2 ++4 - - - S-3 444 ++++ - ++ ++++ S-4 ++++ - + 4444 IY-1 ++ +++ - ++ IY-2 4444 - 4 444 1/24 ++++ 4444 - ++ +++

Merkit: ++++ 100 % sitoutumista +++ 75 % sitoutumista ++ 50 % M + 25 % + 10 % " - 0 % tyhjä sitoutumista ei määritetty (likiarvoja)

Taulukosta 4 ilmenee, että monoklonaalisella vasta-aineella 144 BS on ainutlaatuinen sitoutumiskaavio. Huomattavaa on ennen kaikkea vähäinen sitoutuminen IFNaA:han ja tehokas sitoutuminen IFN-»2-, IFN-a-3- ja IFN-a-1-po-lypeptidiin. .

Lisäksi taulukon 4 tulokset mahdollistavat taulukossa 5 kaaviollisesti esitetyn epitooppianalyysin.

59 90983

Taulukko 5: IFNoralatyyppien epitooppianalyysi ----— -------h

Monoklonaalisen vasta-aineen tunnistama epitooppi

Yhdistelmä---—---— IFNa- 144 BS 1K2 NK2.S-3 YOK S-l S-2 S-4, alatyyppi 2K2 IY-1,1/24 IY-2

A x-XX-XX-x-X-X-XX

o-2 XX-XX-x- o-3 XX-XX-XX-XX- o-l X-x-X-X-x

J X-—X-XX-XX-x-x-XX

Taulukossa 5 esitetystä analyysistä ilmenee, että kunkin IFNa-alatyypin epitooppiyhdistelmä on ainutlaatuinen. Lisäksi analyysi mahdollistaa sopivien monoklonaa-listen vasta-aineiden parien ennustamisen haluttaessa määrittää IFNa:n spesifiset alatyypit sulkemalla muut alatyypit pois tandem-immunomäärityksellä. Esimerkiksi monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS yhdistelmä minkä tahansa monoklonaalisen vasta-aineen NK-2, S-3, IY-1 tai 1/24 kanssa on hyödyllinen haluttaessa ilmaista IFNaB ilman IFNaDsn aiheuttamaa häirintää. Samoin monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS ja monoklonaalisen vasta-aineen YOK yhdistelmä on hyödyllinen IFNaDsn ilmaisemiseksi IFNaB:n läsnäollessa.

Esimerkki 21: Immunoadsorbenttipylvään rakentaminen 1 ml laskeutunutta Affi-GelR 10:tä (Bio-Rad) liitetään 17 mg:aan monoklonaalista vasta-ainetta 144 BS vai-mistäjän ohjeita noudattaen: Affi-Gel 10 pestään sint- ratussa lasisuodattimessa ensin kylmällä tislatulla vedellä ja sen jälkeen 0,1 M NaHCO^-liuoksella pH 8,0 (kytke-mispuskuri). Suspensio, jossa on 50 % geeliä kytkemis-puskurissa, siirretään muoviputkeen, mukaan sekoitetaan yhtä suuri tilavuus monoklonaalisen vasta-aineen liuosta 60 ja pyöritetään 4 tuntia huoneenlämpötilassa. Kytkennän jälkeen geeli pestään kytkentäpuskurilla, ja jotta saadaan tukituiksi reagoimattomat kohdat, käsitellään 0,1 ml:11a 1 M etanoliamiini-HCl (pH 8,0) 1 - 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Geeli pestään PBS-liuoksella 10 mM NaN^:n läsnäollessa ja pidetään tässä liuoksessa 4°C:ssa.

Esimerkki 22: Yhdistelmä-IFNa:n puhdistaminen immunoaf- finiteettikromatografiällä

Suspensio, joka sisältää yhdistelmä-IFNa:aa tuottavan E. colin rikottuja soluja, esim. E. coli HB 101/pAM94 (ks. esimerkki 15), kirkastetaan sentrifugoimalla Sorvali 6SA-roottorissa 4°C:ssa 20 minuuttia nopeudella 12 000 1/min. Emäliuokseen lisätään polyetyleeniamiinia (Poly-£ min P , Fluka, pH 8,0) niin, että lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 0,25 % (paino/tilavuus). Liuosta sekoitetaan 1 tunti ja sen jälkeen se sentrifugoidaan. Pelletti heitetään pois ja emäliuos kyllästetään 65 %:sesti kiinteällä ammoniumsulfaatilla. Tätä seosta sekoitetaan 1 tunti ja sen jälkeen sentrifugoidaan. Emäliuos heitetään pois ja pelletti suspendoidaan 1/10 tilavuuteen (15 - 20 ml) PBS-liuosta (pH 7,2). Liuosta dialysoidaan yön yli PBS-liuosta vasten, joka sisältää 0,02 % NaN^·

Dialysoituun liuokseen sekoitetaan 1 ml esimerkin 21 mukaista immunoaffiniteettigeeliä. Saatua seosta sekoitetaan varovasti 1 tunti ja sen jälkeen se pakataan pylvääseen ja pestään peräkkäisesti 5 pylvästilavuudel-la PBS-liuosta, 5 pylvästilavuudella PBS-liuosta, jossa on 0,5 M NaCl ja 0,2 % Triton X-100R, ja 5 pylvästilavuudella PBS-liuosta. Vaihtoehtoisesti immunoaffiniteetti-geeli pakataan ensin pylvääseen ja dialysoitu liuos kaadetaan pylvään yläosaan ja pestään sen jälkeen edelläkuvatulla tavalla. Yhdistelmä-IFNa (”B^020^0^") eluoidaan happopuskurilla pH 2,5, joka sisältää 0,1 M sitruunahappoa ja 0,3 M NaCl. Aktiiviset IFN-jakeet neutraloidaan 1 M Tris-liuoksella, dialysoidaan PBS-liosta vasten ja il 61 90983 väkevöidään pitoisuuteen 0,1 mg proteiinia per ml käyttämällä ultrasuodatusta laakakerroskalvoilla XM10 (Amicon Corp.).

Esimerkin 21 mukaisen immunoadsorbenttipylvään, joka sisältää 17 mg monoklonaalista vasta-ainetta 144 BS, maksi-mikapasiteetti on noin 1,2 mg IFN-a-2- tai IFN-a-3-poly-peptidiä, vähintään 0,8 mg IFN-a-1-tyypi polypeptidiä, 1,15 mg yhdistelmäinterferonia "B1B2D3B4", 1,25 mg yhdis-telmäinterferonia "B^D2B3B4", 1,25 mg yhdistelmäinterferonia "B^D2D3D4", 0,44 mg yhdistelmäinterferonia "B.jB2B3D4", 1,6 mg yhdistelmäinterferonia "B.jD2B3D4" , 1,6 mg yhdis-telmäinterferonia ”B^D2D3B4", 1,15 mg yhdistelmäinterferonia "B,|B2D3D4" ja 1,25 mg yhdistelmäinterferonia "D^D2B3B4". Immunoadsorbenttigeeliä voidaan käyttää jopa 50 erotukseen ilman oleellista kapasiteetinmenetystä. Tällä menetelmällä puhdistetut IFN-a-2-, IFN-a-3- ja IFN-a-1-tyypin polypeptidit ja yhdistelmäinterferonit ovat homogeenisiä SDS-PAGE-analyysissä.

Esimerkki 23: Immunotäplä analyysi

Immunotäpläanalyysi suoritetaan R. Hawkes et ai:n menetelmällä (Anal. Biochem 119, 142 (1982)). Näytteet, jotka sisältävät luontaista tai yhdistelmäinterferonia, täplitetään nitroselluloosalevyille eri pitoisuuksina. Täplät kuivataan ilmassa ja nitroselluloosan jäljellä oleva sitomiskapasiteetti tukitaan inkuboimalla Tris-puskurissa (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,6), joka sisältää 10 % hevosen seerumia. Nitroselluloosakaistoja inkuboidaan sen jälkeen monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS-liuoksen (23 yg/ml) kanssa ja samalla tavalla valmistettuja kaistoja joko monoklonaalisen vasta-aineen 2K2 liuoksen (30 yg/ ml) kanssa vertailutarkoituksessa, negatiivisena verrokkina käytetyn normaalin hiiren immunoglobuliiniliuoksen (1:100 laimennus) kanssa tai positiivisena verrokkina käytetyn hiiren seerumin kanssa, joka sisältää polyklonaalista ihmisen a-interferonin vasta-ainetta (Enzo, 1:1000 laimennus) . Pesun jälkeen kaikki kaistat käsitellään kanin antihiiri-immunoglobuliinilla, joka on leimattu peraksidaasilla 62 ja sitoutunut toinen vasta-aine kehitetään peroksidaasin substraatilla, joka on 4-kloori-1-naftoli.

Monoklonaalinen vasta-aine värjää IFNaD-tyypin polypeptidit (kuten IFN-a-3) pienimpään pitoisuuteen 0,4 ng per täplä ja IFNαΒ-tyypin polypeptidit (kuten IFN-a- 2) pitoisuuteen 10 ng per täplä, kun taas monoklonaalinen vasta-aine 2K2 tunnistaa vain IFNaD-tyypin polypeptidit (4 ng per täplä).

Esimerkki 24: Radioimmunologinen tandem-määritys helmiä käyttäen a) Monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS radioaktii- 125 vinen leimaaminen I:llä: 0,1 mg monoklonaalista vas- 125 ta-ainetta 144 BS jodataan I-natriumjodidilla (1 mC) ja kloramiini T:llä standardimenetelmää noudattaen (F.C.

Greenwood et ai., Biochem. J. 8j), 114 (1963)). Reaktioin tuote puhdistetaan ioninvaihtopylväässä Bio-Rad AG 1x8 ja aktiivisuus standardisoidaan määrään 4 x 10D cpm/ml laimentamalla PBS:llä.

Monoklonaalisen vasta-aineen 2K2 jodaus suoritetaan samalla tavalla. Monoklonaaliset vasta-aineet YOK ja NK2 ovat kaupallisesti saatavissa radioaktiivisesti leimatussa muodossa Celltechiltä.

b) Monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS kytkeminen makrohelmiin: Polystyreenihelmiä (halkaisija 6,3 mm,

Spherotech AG, Zurich) inkuboidaan 16 tuntia 4°C:ssa keinuttamalla varovasti liuoksessa, jossa on 1 mg/ml monoklonaalista vasta-ainetta 144 BS PBS-^kytkentäpuskiirissa, joka sisältää 5 mM EDTA ja 0,1 % NaN^ (pH 8), niin, että 10 ml liuosta sisältää 20 helmeä. Päällystetyt helmet siirretään sen jälkeen PBS-tukkimispuskuriin, joka sisältää 10 % hevosen seerumia ja 0,1 % NaN^, ja pidetään siinä 4°C:ssa käyttöön asti tai ainakin 24 tuntia.

Muiden monoklonaalisten vasta-aineiden kytkeminen suoritetaan vastaavalla tavalla.

c) Mittausmenetelmä: Muoviputket (Falcon, 5 ml) päällystetään 0,5 ml:11a PBS-tukkimispuskuria, joka si-

II

63 90983 sältää 10 % hevosen seerumia ja 0,1 % NaN^, inkuboimalla yön yli. Puskuri poistetaan imulla ja putken pohjaan lisätään suoraan 0,2 ml interferonipitoista liuosta tai standardiliuosta, joka on tehty tukkiinispuskuriin. Esimerkissä 24b valmistettu monoklonaalisiin vasta-aineisiin kytketty ja tukittu helmi kuivataan nopeasti puhtaalla pyyhepaperilla ja siirretään varovasti vaahtoamista aiheuttamatta interferoniliuoksen sisältävään putkeen. Helmeä inkuboidaan 4-6 tuntia huoneenlämpötilassa varovasti kallistellen. IFN-liuos poistetaan imulla ja kukin helmi pestään kolmeen kertaan 2 ml:11a tukkimispuskuria. Helmeä inkuboidaan sen jälkeen 0,2 125 mlrssa I:llä leimattua toista vasta-ainetta (esimerkki 24a) määrän vastatessa 80 x 101 cpm 16 tuntia 4°C:ssa, pestään kolme kertaa PBS-liuoksella ja siirretään uuteen putkeen laskentaa varten.

Taulukossa 6 on esitetty tulokset IFN-a-3- ja IFN-a- 2-polypeptidien standardiliuoksilie, jotka tulokset on saatu käyttämällä erilaisia kiinteään faasiin (helmeen 125 kytketty) kytketyn ensimmäisen vasta-aineen ja I:llä leimatun toisen vasta-aineen yhdistelmiä.

Taulukko 6: Sopivan monoklonaalisen vasta-aineyhdistelmän valinta IFNa-2- ja IFNqt-3-polypeptidimääritystä varten

Radioaktiivi- Löydetty cpm per 10 ky/ml

Kiinteän faasin sesti leimattu _ vasta-aine toinen vasta-aine τ_„ Λ - T_„ - lFh-o-3 IFN-a-2 144 BS 2K2 113 105 144 BS 144 BS 103 58 144 BS YOK 16,793 313 144 BS NK2 78 3,733 2K2 144 BS 52 2 polyklonaa- 144 BS 1,572 546 linen _____________

Polyklonaalinen: Helmiin kytketty, polyklonaalinen lampaan anti-IFNa-vasta-aine, joka on saatu Celltechiltä.

64

Parhaat tulokset saadaan monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS ja monoklonaalisen vasta-aineen YOK yhdistelmällä IFN-a-3:n havaitsemisessa ja monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS ja monoklonaalisen vasta-aineen NK2 yhdistelmällä IFN-a-2:n havaitsemisessa.

Kuvassa 4 on esitetty kvantitatiivisten titrausko-keiden tulokset käyttämällä yhdistelmää, jossa on mono-klonaalinen vasta-aine 144 BS kytkettynä kiinteään faasiin ja monoklonaalinen vasta-aine NK2 radioaktiivisessa muodossa. Mittaus antaa lineaarisia tuloksia IFNaB-tyypin poly-peptidimäärille 1 - 5000 ky/ml (2 pg/ml - 10 ng/ml). IFN-α-2-tyypin ja "standardi B"-tyypin polypeptidien (Celltech-iltä) titrauskäyrien väliset erot johtuvat kyseisten kahden IFN-valmisteen biomääritysmittausten eroista.

Vastaavanlaisia tuloksia saadaan IFNaD-tyypin polypeptidien kvantitatiivisissa määrityksissä käyttämällä yhdistelmää, jossa on monoklonaalinen vasta-aine 144 BS kytkettynä kiinteään faasiin ja monoklonaalinen vasta-aine YOK radioaktiivisesti leimatussa muodossa. Määrityksellä havaitaan luotettavasti vähintään 1 ky/ml (2 pg/ ml) IFNaD-tyypin polypeptidiä. Yhdistelmää, jossa monoklonaalinen vasta-aine 144 BS on kytkettynä kiinteään faasiin sekä monoklonaalinen vasta-aine NK2, voidaan käyttää myös IFNaF-tyypin polypeptidien määrittämiseen.

d) Lyhennetty määritysmenetelmä (samanaikäinen määritys): Käyttämällä esimerkissä 24c) kuvattua yleis- menetelmää inkuboidaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen kytkettyä helmeä 3 tuntia huoneenlämpötilassa koeliuok-sen (0,1 ml) ja radioaktiivisesti leimatun toisen vasta-aineen (0,1 ml) kanssa niin, että välistä jätetään pois pesu.

Kuvasta 5 ilmenee, että lyhennettyä samanaikaismää-ritystä voidaan käyttää luotettavasti IFNaB-tyypin poly-peptidin (kuten IFN-a-2) nopeaan seulontaan näytteistä, jotka sisältävät 150 ky/ml tai enemmän, mutta määritys on huomattavasti vähemmän herkkä kuin esimerkin 24 c) mukainen menetelmä, bg = tausta 65 90983 e) Koepakkaus radioimmunologiselle tandem-määritykselle, jossa käytetään helmiä

Koepakkaus esimerkissä 24c) kuvattua määritysmenetelmää varten sisältää: 100 muoviputkea Falcon 5 ml 100 polystyreenihelmeä (6,3 mm), jotka on päällystetty monoklonaalisella vasta-aineella 144 BS, ja joita säilytetään PBS-liuoksessa, joka sisältää 10 % hevosen seerumia ja 0,1 % NaN-.

125 J

20 ml l:llä leimattua monoklonaalista vasta-ainetta YOK, jonka ominaisaktiivisuus on 4 x 10^ cpm/ml.

125 20 ml Iillä leimattua monoklonaalista vasta-ainetta 5 NK2, jonka ominaisaktiivisuus on 4 x 10 cpm/ml 4 2 ml IFN-a-1-standardiliuosta, jonka pitoisuus on 10 ky/ml 4 2 ml IFN-a-2-standardiliuosta, jonka pitoisuus on 10 ky/ml 4 2 ml IFN-a-3-standardiliuosta, jonka pitoisuus on 10 ky/ml 1000 ml PBS-liuosta, joka sisältää 10 % hevosen seerumia ja 0,1 % NaN3 kalibrointikäyrä

Esimerkki 25: Entsyymi-immunomääritys (ELISA) a) Monoklonaalisen vasta-aineen 144 BS leimaaminen emäs-fosfataasilla: 1,4 mg monoklonaalista vasta-ainetta 144 BS 1,4 ml:ssa PBS-liuosta liitetään yhteen 2 tuntia 5 mg emäsfosfataasia sisältävän liuoksen kanssa (SIGMA P6774, tyyppi VII-T) käyttämällä standardimenetelmää (Voller et ai., Bull. World Health Organ. 53, 55 (1976)) ja glutaarialdehydiä (0,2 paino-%). Konjugaatti siirretään 5 mliaan Tris-puskuria (0,05M, pH 8,0), joka sisältää 1 mmol MgC^/ 1 % BSA ja 0,2 % NaN^. Liuosta pidetään pimeässä 4°C:ssa.

b) Määritysmenetelmä: Polypropyleenimikrotitraus- levyjä (Dynatech Labs. Inc.) päällystetään 2 tuntia 37°C: ssa ja yön yli 4°C:ssa 150 ulilla monoklonaalisen vasta- 66 aineen NK2 (Celltech, 10 yg/ml) puskuriin pH 8,6(karbo-naattipuskuroitu 0,9 % suolaliuos, joka sisältää 0,02 % . natriumatsidia) tehtyä liuosta. Levyt pestään viisi kertaa PBS-liuoksella ja proteiiniaktiiviset kohdat, joita vielä on läsnä, kyllästetään inkuboimalla 1 tunti 37 °C:ssa 250 yl:n kanssa puskuria pH 7,4 (0,2 % liivatetta ja 0,2 % NaN3 PBS-liuoksessa). Tällä tavalla päällystettyjä levyjä pidetään 4°C:ssa tässä puskurissa muutaman päivän ajan.

Seoksia, joissa on 50 yl koe liuoksen tai standardi-liuoksen sarjalaimennosta, joka sisältää IFNa-alatyyppiä, 50 jjl puskuria pH 7,4 ja 50 jjl fosfataasilla leimatun vasta-aineen 144 BS liuosta (esimerkki 25a), joka on laimennettu suhteessa 1:100 puskurilla pH 7,4, inkuboidaan mikrotitrauslevyjen koloissa 2 tuntia 37°C:ssa ja sen jälkeen 30 minuuttia 4°C:ssa. Levyt pestään 5 kertaa PBS-liuoksella, sen jälkeen inkuboidaan 30 minuuttia 37°C: ssa 150 yl:n kanssa p-nitrofenyylifosfaattiliuosta (1 mg/ml 10 %:sessa dietanoliamiinipuskurissa, joka sisältää 0,5 mM MgC^, pH 9,8). Suorittamalla optisen tiheyden mittaus 405 nm':ssä, saadaan selville vapautuneen p-nitrofenolin määrä, joka on verrannollinen sitoutuneeseen fosfataasientsyymimäärään ja näin ollen myös verrannollinen koeliuoksen sisältämään IFNa-alatyypin määrään.

Tällä menetelmällä voidaan mitata IFNaB-tyypin (kuten IFN-a-2) tai IFNaF-tyypin polypeptidimäärät. IFNaD-tyypin polypeptidien määrittämiseksi (kuten IFN-a-3) mikrotitrauslevy päällystetään monoklonaalisella vasta-aineella YOK (Celltech) NK2:n sijasta.

Vastaavanlaisia tuloksia saadaan, kun mikrotitraus-levyt päällystetään monoklonaalisella vasta-aineella 144 BS ja toisena vasta-aineena käytetään NK2:ta tai YOK:ta.

c) Koepakkaus ELISA-menetelmää varten: Esimer kissä 25b) kuvattua menetelmää varten tarkoitettu koepakkaus sisältää: li 67 90983 polypropeenimikrotitrauslevyjä, 20 ml monoklonaalista vasta-ainetta NK2 (10 yg/ml) karbonaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (0,9 %

NaCl, 0,42 % NaHCC>3, 0,0072 % Na2C03, 0,02 % NaN3) 1 ml emäsfosfataasiin kytkettyä monoklonaalista vasta- ainetta 144 BS (esimerkki 10.1, 0,3 mg vasta-ainetta per ml) Tris-puskurissa (0,05 M, 1 mM MgCl2, 1 % BSA, 0,02 % NaN3, pH 8,0) 2 ml IFN-a-1-standardiliuosta, jonka pitoisuus on 10^ ky/ml 4 2 ml IFN-a-2-standardiliuosta, jonka pitoisuus on 10 ky/ml 4

2 ml IFN-a-3-standardiliuosta, jonka pitoisuus on 10 ky/ml 300 ml PBS

300 ml puskuria pH 7,4 (0,2 % liivatetta ja 0,2 % NaN3 PBS-liuoksessa) 50 ml p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml) dietanoliamii-nipuskurissa (10%, 0,5 mM MgCl2» 0,02 % NaN3, pH säädetty suolahapolla arvoon 8,9) kalibrointikäyrä väri-intensiteettikäyrä

Esimerkki 26: Yhdistelmäinterferonien puhdistus käyttä mällä saostusta ja kromatografisia menetelmiä 1 litra interferonia "B^D^^D^" sisältävää liuosta, joka on kirkastettu sentrifugoimalla (ks. esimerkit 13-15), tehdään happamaksi lisäämällä 2 M suolahappoa, kunnes pH saavuttaa arvon 2,2. Saatua liuosta sekoitetaan 1 tunti 4°C:ssa ja saostunut proteiini erotetaan sentrifugoimalla (GSA-roottori, Sorvali, 12000 1/min, 20 min, 4°C). Pelletti heitetään pois ja emäliuokseen lisätään kiinteätä ammoniumsulfaattia 30 % kyllästymispisteeseen asti. Tätä liuosta sekoitetaan 1 tunti 4°C:ssa ja sen jälkeen sentrifugoidaan. Emäliuos, joka sisältää interferonin» dialysoidaan 0,1 M NH^HCC^-liuosta (pH 8,2) vasten. Interferoniaktiivisuudeksi saadaan noin 108 ky/ml. Pylväs, joka sisältää 50 ml kelatoituvaa Sepharose 68 6B:tä (Pharmacia), joka on ladattu Cu^+-ioneilla valmistajan ohjeiden mukaan, tasapainotetaan käyttämällä 250 ml liuosta, jossa on 0,05 M natriumasetaattia pH 7,0 ja 0,5 M NaCl. Pylvääseen sijoitetaan 200 ml dialysoitua liuosta (ks. edellä) 4°C:ssa. Pylväs pestään 150 ml:11a tasapainotuspuskuria. Sitoutuneen interferonin eluointi suoritetaan lineaarisella gradientilla 250 ml liuosta, jossa on 0,05 M natriumasetaattia pH 7,0 ja 0,5 M NaCl 250 ml liuosta, jossa on 0,05 M natriumasetaattia pH 2,8 ja 0,5 M NaCl, jonka jälkeen seuraa pesu 150 ml:11a liuosta, jossa on 0,05 M natriumasetaattia pH 2,8 ja 0,5 M NaCl.

Aktiiviset interferonijakeet yhdistetään ja dialy-soidaan 0,05 M Tris.HCl-puskuria pH 8,0 vasten. Dialy-

O

soidun liuoksen interferoniaktiivisuus on noin 10 ky/ml. Pylvään maksimaalinen kapasiteetti on noin 75 mg interferonia "B.D-D^D.".

12 3 4

Pylväs, joka sisältää 50 ml Q-Sepharose-anioninvaih-dinta (Pharmacia), tasapainotetaan käyttämällä 250 ml Tris. HCl-puskuria pH 8,0. Pylvääseen sijoitetaan 100 ml edel-lädialysoitua interferonipitoista liuosta huoneenlämpö-tilassa. Sen jälkeen pylväs pestään 50 ml:11a tasapainotuspuskuria. Sitoutunut interferoni eluoidaan käyttämällä lineaarista gradienttia 0 - 0,7 M NaCl 200 ml:ssa liuosta, jossa on 0,05 M Tris.HCl pH 8,0.

Puhdas interferoni eluoituu kohdassa noin 0,3 M NaCl. Aktiiviset jakeet osoittavat yhtä vyöhykettä, jonka näennäinen molekyylipaino on 19 000, kun analysoidaan SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Anioninvaihtopylvään maksimaalinen kapasiteetti on noin 50 mg yhdistelmäinterferonia ,,B1D2D3D4"·

Yhdistelmäinterferonit "B^D2B3B^", , "B1D2D3B4", "Β,^Β^^' ja voidaan puhdistaa vastaavalla tavalla.

Esimerkki 27: Yhdistelmäinterferonin lyofi- lisointi li 69 90983

Interferoni ", joka on puhdistettu joko immunoaffiniteettikromatografialla käyttämällä monoklo-naalista vasta-ainetta 144 Bs tai tavanomaisilla kromatografisilla menetelmillä (ks. esimerkki 26), dialysoidaan 0,5 M NH^HCO^:a vasten ja sen jälkeen lyofilisoidaan. Lyo-filisoituun näytteeseen lisätään kahdesti pieni määrä vettä NH^HCO^in poistamiseksi täydellisesti. Sen jälkeen liuos lyofilisoidaan uudestaan.

Interferoni "B.D^D0D."-liuoksen rekonstruointi suo-ritetaan seuraavalla tavalla: Lyofilisoituun näytteeseen lisätään 0,5 M NH^HCO^-liuosta pH 8,2 niin, että.inter-feronipitoisuudeksi tulee noin 0,1 mg/ml. Uudelleenliuo-tetun interferonin virustenvastainen ominaisaktiivisuus o on 2 x 10 ky/mg, joka aktiivisuus on sama kuin vastaava arvo ennen lyofilisointia.

Esimerkki 28: Yhdistelmäinterferonien fysikokemialliset ominaisuudet

Keksinnönmukaisille yhdistelmäinterferoneille ja kantainterferoneille suoritetaan polyakryyliamidi-SDS-geelielektroforeesi Laemmlin menetelmällä (Nature 227, 680 (1970)). Yhdistelmäinterferonien näennäiset mole-kyylipainot kilodaltoneina (kD) on esitetty taulukossa 7. Taulukko 7 sisältää myös yhdistelmäinterferonien iso-elektriset pisteet (pl), jotka on määritetty käyttämällä t>

Ampholinea sisältäviä LKB-polyakryyliamidigeelejä.

70

Taulukko 7: Yhdistelmäinterferonien näennäiset mole-kyylipainot ja isoelektriset pisteet IFN Näenn. molekyylipaino pl o-2 27,000 5,2 o-3 20,000 5,2

BiB2D3D(, 27,000 5-6 (diffuusi) D3D2B3B* 20,000 5,0 B1B2B3D., 27,000 5,2 B1B2D3B1, 26,000 5-6 (diffuusi)

BiDzD3D., 19,000 5,6

BiD2B3Dk 20,000 5,6 B,D2D3Bi, 20,000 5,5 B1D2B3B1, 20,000 5,6

Keksinnönmukaisten yhdistelmäinterferonien aminohapposekvenssit on määritetty käyttämällä 470 A-pro-teiinisekvenaattoria (Applied Biosystems) tai 890 C Beck-man-sekvenaattoria. Kummassakin tapauksessa on suoritettu automaattinen Edman-hajotus. Havaitut rakenteet vastaavat täysin odotettuja. N-pään aminohappo on kysteiini.

Esimerkki 29: Yhdistelmäinterferonien vaikutus (2*-5') oligoisoadenylaattisyntetaasiaktiivisuustasoon Daudi-soluissa

Viljelmään, jossa on 2 x 10^ solua/ml RPMI 1640-kasvualustaa, tuodaan 10 % vasikan sikiön seerumia, joka sisältää yhdistelmäinterferonia "B^B2B2D^", ^^028^0^, "B.D-D-jD." ja "B,B,,D,B " taulukossa 8 ilmoitetut määrät.

24 tunnin käsittelyn jälkeen näytettä kohti sentrifugoi-daan pohjaan (9000 kierr/min) 5 x 10^ solua ja suspen-doidaan uudestaan 500 yl:aan kylmää lyysipuskuria (20 mM

4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo-puskuri pH 7,5, 5 mM MgC^, 120 mM KCl, 7 mM ditiotreito-lia,10 % glyserolia ja 0,5 % Nonidet P 40) ja inkuboi-daan 2 minuuttia jään päällä. Sen jälkeen näytteitä sentrifugoidaan (9000 kierr/min, 8 min, 4°C) ja emäliuokset 71 90983 otetaan talteen ja niistä määritetään (2'-5')-oligoisoade- nylaattisyntetaasiaktiivisuus seuraavalla tavalla:

Emäliuosta sekoitetaan 50 yl:n kanssa poly(rl).(rC)- agaroosia (P-L Biochemicals) 15 minuuttia 30°C:ssa ja adsorboitumaton materiaali poistetaan sentrifugoimalla.

Poly(rl).(rC)-adsorboitunutta materiaalia inkuboidaan 20 tuntia 30°C:ssa liuoksen kanssa, jossa on 2,5 mM 32 (α P) ATPrtä, 400 Ci/mmol (Amersham International), käsitellään bakteeriperäisellä emäsfosfataasilla (Sigma) ja eluoidaan sen jälkeen happamasta alumiinioksidipylvääs-tä (Sigma) (300 μΐ) käyttämällä 3,0 ml 1 M glysiini.HCl-puskuria pH 2,0, kuten on selostettu julkaisussa Meriin et ai., Analyt. Biochem. 110, 190 (1981). Taulukossa 8 esitetyt tulokset ovat interferonilla käsitellyistä soluista löytyneitä (2'-5')-oligoisoadenylaattisyntetaasiaktiivi-suuden kasvun kerrannaisia verrattuina käsittelemättömistä verrokkisoluista löytyneeseen entsyymiaktiivisuuteen (keskimääräinen aktiivisuus 51,6 - 8,7 pmol/h/10^ solua).

Taulukko 8: (2 * —5 *) (A)-syntetaasiaktiivisuuden kasvu kertaisena (pmol sisältynyttä ATP:tä/h/105 solua) IFN-pitoisuus (yksikköä/ml) 1 10 100 1000 IFN o-2 <"B") 3.6 4.0 5,7 5,6 o-3 ("D") 2.2 3,2 3,2 3,9 "B^DsD.," 3,4 3,2 4,6 4,0 "DjDzBjB*," 2,6 2,1 4,8 4,3 "BjBzBaD,," 9,4 8,4 10,0 8,5 mB1D2B3B„” 5,6 5,7 7,8 11,4 "BiDaDaD^" 5,8 8,9 12,1 17,5 "B1B2D3B1," 5,6 7,0 9,1 9,6 72

Esimerkki 30: Farmaseuttinen valmiste ( parenteraalinen antotapa) 2 mg yhdistelmäinterferonia ^^020^0^, jonka omi-naisaktiivisuus on 1,3 x 10® yksikköä/mg ihmisen WISH-soluissa, liuotetaan 30 ml:aan 5N ihmisen seerumialbumiinia. Saatu liuos lasketaan bakteriologisen suotimen läpi ja suodatettu liuos jaetaan aseptisissa olosuhteissa 100 lääkepullon välille niin, että jokaiseen tulee 2,6 x 10® yksikköä puhdasta yhdsitelmäinterferonia. Lääkepulloja, jotka soveltuvat parehteraalieeen antoon, on parasta säilyttää kylmässä, esimerkiksi -20°C:ssa.

Samalla tavalla voidaan valmistaa lääkepulloja, 6 7 jotka sisältävät 5,2 x 10 tai 1,04 x 10 yksikköä, käyttämällä 4 tai 8 mg yhdistelmäinterferonia vastaavasti.

Vastaavalla tavalla voidaan valmistaa lääkepullot, jotka sisältävät yhdistelmäinterferonia ", "B1 B2°3B4" ' "B1D2B3D4" ' ”B1D2D3V tai (ominaisaktiivisuudet vastaavasti 1,28 x 10 , 2 x 10®, 7,7 x 107, 3,8 x 107 ja 8 x 107).

li

Claims (5)

90983

1. Menetelmä yhdistelmäinterferonipolypeptidin valmistamiseksi, jonka aminohapposekvenssi koostuu kahdesta -neljästä alasekvenssistä, jotka vastaavat aminohappojensa identiteetin ja lukumäärän suhteen ihmisen lymfoblastoi-di-interferonien LyIFN-e-2 ja LyIFN-a-3 alasekvenssejä, ja mainittu yhdistelmäinterferonipolypeptidi on polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LylFN-a-2:n aminohapoista 1 - 150 ja LyIFN-a-3:n aminohapoista 151 - 166, polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LyIFN-a-2:n aminohapoista 1-92, LyIFN-a-3:n aminohapoista 93 -150 ja LyIFN-cr-2:n aminohapoista 151 - 166, polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LyIFN-a-2:n aminohapoista 1-60, LyIFN-a-3:n aminohapoista 61 -92 ja LyIFN-a-2:n aminohapoista 93 - 166, tai polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi koostuu LylFN-a-2:n aminohapoista 1 - 60, ja LyIFN-e-3:n aminohapoista 61 - 166, tunnettu siitä, että £. coli- tai hiivasoluja, jotka on transformoitu yhdistelmävektorilla, joka sisältää mainittua yhdistelmäinterferonipolypeptidiä kooditta-van DNA-sekvenssin, viljellään ja mainittu yhdistelmäin-terferoni eristetään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmäinterferonipolypeptidi on yhdistelmä inter f eron ipolypeptidi MB1B2B3D4M, jonka kaava on CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU HET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmäinterferonipolypeptidi on yhdistelmä inter f eronipolypeptidi "B^DjB*", jonka kaava on CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmäinterferonipolypeptidi on yhdistelmä inter f eronipolypeptidi mB1D2DjD4", jonka kaava on CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmäinterferonipolypeptidi on yhdistelmäinterf eronipolypeptidi nBiD2B3B4", jonka kaava on li 90983 CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN HET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU.