NO175602B - Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptidInfo
- Publication number
- NO175602B NO175602B NO862313A NO862313A NO175602B NO 175602 B NO175602 B NO 175602B NO 862313 A NO862313 A NO 862313A NO 862313 A NO862313 A NO 862313A NO 175602 B NO175602 B NO 175602B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hybrid
- interferon
- ifn
- lyifn
- dna
- Prior art date
Links
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims abstract description 195
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims abstract description 193
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 10
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims abstract description 65
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 107
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 61
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 abstract description 8
- 101710106107 Interferon alpha-D Proteins 0.000 abstract 1
- 108010047126 interferon-alpha 8 Proteins 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 103
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 77
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 42
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 32
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 28
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 28
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 19
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 12
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 12
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 101000959791 Canis lupus familiaris Interferon alpha-3 Proteins 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 5
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- 108010067304 (2'-5')oligo-isoadenylate synthetase Proteins 0.000 description 3
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150103227 IFN gene Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102000007445 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Human genes 0.000 description 2
- 108010086241 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 101710133801 Interferon a3 Proteins 0.000 description 2
- 101710131622 Interferon alpha-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- -1 Polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- AWNXKZVIZARMME-UHFFFAOYSA-N 1-[[5-[2-[(2-chloropyridin-4-yl)amino]pyrimidin-4-yl]-4-(cyclopropylmethyl)pyrimidin-2-yl]amino]-2-methylpropan-2-ol Chemical compound N=1C(NCC(C)(O)C)=NC=C(C=2N=C(NC=3C=C(Cl)N=CC=3)N=CC=2)C=1CC1CC1 AWNXKZVIZARMME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010029692 Bisphosphoglycerate mutase Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000011765 DBA/2 mouse Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001134680 Drosophila melanogaster POU domain protein 2, isoform A Proteins 0.000 description 1
- 101001134679 Drosophila melanogaster POU domain protein 2, isoform B Proteins 0.000 description 1
- 101001134678 Drosophila virilis POU domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000710185 Mengo virus Species 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000011025 Phosphoglycerate Mutase Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- OAHKWDDSKCRNFE-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl chloride Chemical compound ClS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 OAHKWDDSKCRNFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/249—Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid med en aminosyresekvens sammensatt av to til fire undersekvenser, tilsvarende i aminosyreidentitet og tall til undersekvenser av human-lymfoblastoid-interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3.
Interferonene ("IFN") er en familie av polypeptider som sekreteres fra en stor varietet av eukaryotiske celler når de utsettes for forskjellige mitogener og viruser. Interferonene er klassifisert ved de kjemiske og biologiske karakteristika og i tre grupper: IFN-a, IFN-P og IFN-7. IFN-a og —p<->genene eksprimeres overveiende i celler behandlet med viruser, virale bestanddeler og dobbeltstrenget RNA. IFN-7 synteti-seres på den annen side som svar på mitogener.
Human IFN-a er kodet for av en genfamilie omfattende minst 15 ikke-alleliske gener. Human IFN-e og human IFN-t kodes av enkle gener. Det primære overføringsprodukt av IFN-a omfatter 189 aminosyrer (unntatt IFN-a2: 188 aminosyrer) hvorfra signalpeptider av 23 aminosyrer fjernes ved postoverførings-modifikasjon. Human IFN-e og humant IFN-"r består av 187 og 186 aminosyrer hvorfra 21 eller 20 aminosyrer som utgjør signalpeptidet fjernes. Aminosyresekvenshomologien blant IFN-a undertyper er 80-855É, mens homologien mellom IFN-e og IFN-a er ca. 30-4056. IFN-^y viser bare enkle aminosyre-homologier med IFN-a, svarende til 12% identiske residuer.
IFN viser antiviral, immunomodulatorisk, så vel som cyto-toksisk aktivitet. Det er påvist at IFN-a-undertyper (for eksempel IFN-a2, IFN-a^) viser forskjellige målcellespesifi-siteter. Den antivirale aktivitet av IFN-a2 og IFN—a^ er omtrent den samme på bovine (MDBK)-celler, men IFN-a2 er syv ganger mere effektiv enn IFN—a^ på humane (WISH)-celler, og 30 ganger mindre effektiv enn IFN—a^ i å beskytte muse-(L 929)-celler. [M. Streuli et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 78, 2848 (1981)]. På standen om at medlemmer av den multigene IFN-a-familie varierer i utstrekning og spesifisitet av deres antivirale aktivitet er blitt bekreftede resultater oppnådd fra noen IFN-a-"hybrider" (se EP 32134, US-PS 4 414 150). Disse "hybrider" er konstruert ved å kløve to gener som koder for interferon-a-undertyper med restrik-sjonsenzymet PvuII (eller i to tilfeller, med Bglll) og kryss-ligering de resulterende fragmenter slik at DNA-sekvensen som koder for en aminoterminal del av et IFN-gen ble sammensmeltet til DNA-sekvensen som koder for den karboksyterminale del av det andre IFN-gen. Enskjønt, disse hybridinterferoner utøver endringer i målcellespesifisitet sammenlignet med hovedinterferonene, ble det ikke vist at det var noen svekking eller begrensing av noen av de tre interferonaktiviteter. Slike begrensninger eller restrik-sjoner kan være ønskelig eksempelvis ved klinisk anvendelse, hvor det er ønskelig å fokusere interferonterapi på et spesielt problem som en viral infeksjon, uten mulighet i at kompliserende faktorer fremkommer fra andre aktiviteter av det administrerte interferon.
Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er således å tilveiebringe nye hybridinterferoner som viser mere spesifikke biologiske aktiviteter på grunn av den selektive eller predominante aktivering av kun noen av de interferon-induserte, biokjemiske reaksjonsmønstre, og/eller der noen av de uønskede bivirkninger hos naturlige interferoner, bivirkninger som begrenser deres bruk, for eksempel influ-ensalignende symptomer som feber, hodepine eller tretthet, gastrointestinale forstyrrelser, reduksjon av blodtrykket eller hårtapet, utelukkes eller reduseres.
Hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen er utledet av human lymfoblastoid-interferin LyIFN-a-2 med sekvensen og human lymfoblastoid-interferon eller LyIFN-a-3 med sekvensen:
Disse interferoner så vel som fremgangsmåten for fremstilling derav er blitt omtalt i EP-søknad 76 489. LyIFN-a—2 er beslektet med (men ikke identisk med) human leukocytt-interferon LelF-ocB (se US-PS 4 414 150) og har en spesifikk aktivitet på primære kalvenyreceller og et humant embryonisk "foreskin"-celler (HEF, hver infusert med vesikulært stomatitis virus) på 1,85'10<8> IU/mg og 2,45'10<8> IU/mg. LyIFN-a-3 er beslektet med (men ikke identisk med) humant leukocytt-interferon LeIF-aD (se US-PS 4 414 150) og har en spesifikk aktivitet på kalveceller og HEF-celler (som ovenfor) på 1,32*10<8> IU/mg og 3,7*10<6> IU/mg. Videre har LyIFN-a-3 en høyere termostabilitet og lavere anti-proliferativ aktivitet enn LyIFN-a-2.
Det er en spesiell hensikt med oppfinnelsen å tilveiebringe LyIFN-a-2/a-3 hybridpolypeptider som kombinerer den høye antivlrale titer og/eller den høye antiproliferative aktivitet på humane celler av LylFN—a—2 og den høye termostabilitet av LylFN—a—3.
I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid med en aminosyresekvens sammensatt av to til fire undersekvenser tilsvarende i aminosyreidentitet og tall til undersekvenser av human-lymfoblastoid-interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, idet hybridinterferon-polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av polypeptider med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 150 av LyIFN-a-2 "B1B2B3" og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-3 "D4", et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 92 av LyIFN-a-2 "B1B2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-cx-3 "D3'\ og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-2 "B4", og et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 60 av LyIFN-cx-2 " B^", aminosyrer 61 til 92 av LyIFN-a-3 "D2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-a-2 "B3" eller av LyIFN-a-3 "D3", og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-2 "B4" eller av LyIFN-a-3 "D4", og denne fremgangsmåte karakte-riseres ved a) fremstilling av en DNA omfattende det strukturelle genet som koder for hybridinterferonet og inkorporering av det
oppnådde DNA i en egnet ekspresjonsvektor,
b) overføring av det oppnådde hybridvektoren som bærer hybrid-IFN-strukturgenet i en mottagervert, c) utvelging av transformerte verter fra ikke-transformerte verter ved dyrking under slike betingelser at bare
transformerte verter overlever,
d) dyrking av de overførte verter under betingelser som muliggjør eksprimering av det hybrid-IFN-strukturelle
gene, og
e) isolering av det eksprimerte hybrid IFN.
I en foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen en
fremgangsmåte der hybridinterferon-peptidet er valgt fra gruppen bestående av hybridinterferon-polypeptid "B1B2B3D4" med formel
hybridinterferon-polypeptider "B1B2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptider "B1D2B3D4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3D4" med formel og hybridinterferon-polypeptid "B1D2B3B4" med formel
De mest foretrukne hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er "B1D2D3D4" (V) og "B1B2D3B4" (II).
Et hybridinterferon kan som nevnt ovenfor fremstilles ifølge oppfinnelsen ved rekombinant DNA-teknikk omfattende trinnene, for eksempel med: a) fremstilling av et DNA omfattende strukturelle gener som koder for nevnte hybridinterferon ved in vitro rekombinasjon av setene svarende til aminosyrene 60, 92 og 150, eller av interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3 eller ved kjemisk DNA-syntese og interkorporering av oppnådde DNA til en egnet ekspresjonsvektor, b) overføring av den oppnådde hybridvektor som har det hybride IFN-strukturelle gen i en mottagervert, c) utvelging av transformerte verter fra ikke-transformerte verter ved dyrking under slike betingelser at bare den
overførte verten overlever,
d) dyrking av de overførte verter under betingelser som muliggjør eksprimering av det hybrid-IFN-strukturelle gen, og
e) isolering av de uttrykte hybrid IFN.
Fremgangsmåtene som anvendes vil forstås lettere fra den
detaljerte beskrivelse nedenfor og tegningene der:
Figur 1 sammenligner amlnosyresekvensene av modne LylFN—a—2 og LylFN—a—3. Bare de aminosyrer av LylFN—a—3 som er forskjellige fra tilsvarende aminosyrer av LyIFN-a-2 er omtalt. Aminosyresekvensen av LylFN—a—3 er forøvrig identisk til den fra LylFN—a—2. Figur 2 viser nukleotidsekvensene av kodeområdene og deler av 3'-ekstracistroniske regioner av LylFN—a—2 og LyIFN-a-3, ATG-overføring initieringskodoner, avslutningstriplettene og egnede restriksjonsseter er understreket. Kodingstriplettene er nummerert. Figur 3 viser restriksjonskart av HindIII-PstI-små segmenter av plasmider pBR(AP )/LyIFN-a-2 og pBR(AP)/LyIFN-cx-3. Den hvite stav (LylFN—a—3) og sorte stav (LylFN—cx—2) avgrenser kodingsregionene av de modne IFN. Ved bunnen er det vist oppdeling av den primære struktur av IFN-polypeptid (166 aminosyrer) i fire seksjoner. Figur 4 og Figur 5 viser radioaktiviteten bundet til bærer-kulen i funksjon av kvantiteten av IFN—a—2 i prøve-oppløsningen målt i sandwich RIA.
1. Fremstilling av hvbridvektorer inneholdende hybride IFN-strukturelle gener
cDNA av human interferon-a undertyper a—2 og a—3 er kloning i E. coli. Således omfatter plasmid pBR(AP )/LyIFN-cx-2 og pBR(AP)/LyIFN-a-3 Hindlll-Pstl (eller EcoRI-Pstl) DNA-innskudd inneholdende kodingsregioner av LylFN—a—2 og
LylFN—a—3 under kontroll av p<->laktamase-promotere (se EP-PS 76 489). Restriksjonsområdet for nevnte innskudd er vist på figur 3. Man ser lett at genene deler noen felles restriksjonsseter (plassert i posisjonene 60, 92 og 150 i IFN-aminosyresekvensene) som fordelaktig kan benyttes for å konstruere nye gener som koder for hybridinterferoner som har fordelaktige biologiske og/eller fysikalske egenskaper.
Således kan rekombinanter (single eller multiple utskift-ninger) mellom LylFN—a—2— og LylFN—a—3-gener utvikles ved in vitro rekombinasjon ved PvuII-setet (posisjon 92) og/eller ved Sau3A-posisjonene (posisjonene 60 og 150). Da den primære struktur av interferonene således kan oppdeles i fire seksjoner (første seksjon av aminosyre 1 til 60, annen seksjon aminosyre 61 til 92, tredje seksjon av aminosyrene 93 til 150 og fjerde seksjon av aminosyrene 151 til 166, se figur 3), kan hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen designeres ved fire bokstaver, hver bokstav indikerer den tilstedeværende seksjon. Således er for eksempel hybridinterferon (I) sammensatt av seksjonene 1 til 3 av interferon LylFN—a—2 ("B", LylFN—a—2 er relatert til IFN-a-, supra) og seksjon 4 av LylFN—a—3 ("D", LylFN—a—3 er relatert til IFN—a—D, supra) er betegnet i IFN "B1B2B3D4".
For å lette fremstilling av det ønskede hybridinterferon må DNA-innskuddene inneholdende de LyIFN-a-2- eller LyIFN-a-3-kodende områder modifiseres på en slik måte at restriksjons-setene Hindlll (eller EcoRI), PvuII og Pstl er unike for dem. Det er klart fra figur 3 at det er et ytterligere PvuII-sete i det 3'-ekstracistroniske området av genet som koder for LylFN—a—2. Seter kan lett fjernes, for eksempel ved delvis deling av en hybridvektor inneholdende den LyIFN-a-2-kodende region med PvuII, ligering av den resulterende lineære DNA til en linker inneholdende en DNA-sekvens som gjenkjennes av restriksjonsendonukleasen, Pstl, spalting med Pstl, religering av det digererte med lav DNA-konsentrasjon, utvelging med henblikk på plasmider (for eksempel ved restriksjonsanalyse) som har den ønskede modifikasjon, det vil si et forkortet 3'-ekstracistronisk område der PvuII-seter er eliminert. Analogt blir vektorer som er benyttet for å klone IFN-gener med fordel modifisert slik at restrik-sjonssetene Hindlll, PvuII og Pstl er felles for dem.
Ved hjelp av oppfinnelsens fremgangsmåte oppnår man fremstilling av hybridvektorer som omfatter en DNA-sekvens som koder for en hvilken som helst av hybridinterferonene med formel I-VI, og er operativt bundet til en ekspresjons-kontrollsekvens.
Vektoren velges avhengig av vertscellene som er utsett for transformasjon. Eksempler på egnede verter er mikroorganismer som er fri for eller fattige i restriksjonsenzymer eller modifikasjonsenzymer som gjær, for eksempel Saccharomyces cerevisiae, og stammer av bakterier, spesielt stammer av Escherichia coli, for eksempel E. coli X1776, E. coli EB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 eller E. coli K12 stamme 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearo-thermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre, og videre celler av høyere organismer, spesielt etablerte human- eller dyrecellelinjer. De ovenfor nevnte stammer av E. coli, for eksempel E. coli HB101 og E. coli JA221, og videre Saccharomyces cerevisiae, er foretrukket som vertsmikroorganismer.
Prinsipielt er alle vektorer som replikerer og eksprlmerer hybrid-IFN-gener ifølge oppfinnelsen i den valgte vert, egnet. Eksempler på vektorer som er egnet for beskrivelse av hybridinterferongener i en E. coli-stamme, er bakteriofager, for eksempel derivater av "y-bakteriof ager eller plasmider, særlig plasmid ColEl og dets derivater som pMB9, pSF2124, pBR317 eller pBR322. De foretrukne vektorer stammer fra plasmid pBR322. Egnede vektorer inneholder en komplett replikon for et markørgen som muliggjør å velge og å identifisere vertene som er transformert med ekspresjons-plasmidene på basis av et fenotypisk trekk. Egnede markør-gener gir til verten, for eksempel motstandsevne mot tungmetaller, antibiotika og lignende. Videre inneholder foretrukne vektorer foruten replikon- og markørgenregionene, erkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser, slik at hybrid-IFN-genet og hvis hensiktsmessig erkjennelseskontroll-sekvensen kan innføres ved disse seter. Den foretrukne vektor, plasmid pBR322, inneholder et Intakt replikon, markørgener som gir motstandsevne mot tetracyklin og ampicillin (tet<**> og amp<**>) og et antall av unike erkjennelses-seter for restriksjonsendonukleaser, for eksempel Pstl (spalter i amp**-gene t, tet^-genet forbli intakt), BamHI, Hindlll og Sali (alle spalter i tet<R->genet, amp<R->genet forblir intakt), Nrul og EcoRI.
Mange ekprimeringskontrollsekvenser kan benyttes for regulering av geneksprimering. Spesielt benyttes eksprimeringskontrollsekvenser av høyeksprimerte gener av verten som skal transformeres. I tilfelle av pBR322 som hybridvektor og E. coli som vertsmikroorganismer, for eksempel eksprimeringskontrollsekvenser (som blant annet inneholder promoteren og ribosomal-bindesetet) av laktoseoperon, tryptofanoperon, arabinoseoperon og lignende, er e-laktamase-genet, den tilsvarende sekvens av fag y N-genet, eller fag fd-coat proteingenet og andre.
Mens plasmidet pBR322 allerede inneholder promoteren av p—laktamasegenet (p<->lac-genet), må de andre eksprimeringskontrollsekvenser innføres i plasmidet.
Vektorer som er egnet for replikering og eksprimering i gjær, inneholder en gjærreplikasjonsstart og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridvektorer som inneholder en gjærreplikasjonsstart, for eksempel kromosomal autonom repliker-ende segment (ars), holdt tilbake ekstrakromosomalt inne i gjærcellen efter transformering, og replikeres autonomt. Videre kan hybridvektorer som inneholder sekvenser som er homologt til gjær 2^-plasmid DNA brukes. Slike hybridvektorer vil bli integrert ved rekombinering inn i 2>i-plasmider som allerede eksisterende inne i cellen, eller replikere autonomt. 2p-sekvenser er spesielt egnet for plasmider i en høy transformeringssekvens, og muliggjør høye kopitall. Foretrukne gjærvektorer er plasmid pJDB207.
Egnede markørgener for gjær er spesielt de som gir verten antibiotisk motstandsevne eller i tilfelle auksotropisk gjærmutanter, gener som komplementerer vertlesjoner. Tilsvarende gener gir for eksempel motstandsevne mot antibiotikumet cykloheksimid eller tilveiebringer protrofi i en auksotropisk gjærmutant, for eksempel URA3, LEU2, HIS3 eller spesielt TRPl-genet. Gjærhybridvektorene inneholder videre fortrinnsvis en replikasjonsstart og et markørgen for en materiell vert, spesielt E. coli, således at konstruksjonen og kloning av hybridvektorene og deres mellomprodukter kan finne sted i en bakteriell vert.
Eksprimeringskontrollsekvenser som er egnet for eksprimering i gjær er for eksempel de av høyeksprimerte gjærgener. Således kan promoterene av TRPl-genet, ADHI eller ADHII-genet, syrefosfatase (PH03 eller PH05)-genet, isocytokromgen eller en promoter involvert med en glykolytisk vei, som promoteren av enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (GAPDE), 3-fosfoglycerase-kinase (PKG), heksokinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, fosfoglycerat-mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinasegener, benyttes. Foretrukne vektorer ifølge oppfinnelsen inneholder promotere med transkripsjonen kontroll, for eksempel promotere av PH05-, ADHII- og GAPDH-gener, som kan "skrues" på eller av, alt efter vekstbetingelsene. For eksempel kan PH05-promotere undertrykkes eller frempresses ved kun å øke eller redusere konsentrasjonen av uorganisk fosfat i mediet. Promotere for bruk i mammaeceller er for eksempel virale promotere, HTLV, SV40, vaccinia promotere og lignende.
Promoteren er operativt bundet til koderegionen for derved å sikre effektiv eksprimering av hybridinterferonet. I en utførelse ifølge oppfinnelsen er promoteren direkte bundet til koderegionen for hybrid IFN med translasjonsstartsignal (ATG) innskutt ved forbindelsen. Et foretrukket område for å forbinde promoteren til hybrid IFN-koderegionen er mellom hoved mRNA-start og ATG for genet som naturlig er forbundet til promoteren.
Ifølge en annen utførelsesform av oppfinnelsen, spesielt hvis gjær benyttes som vertsmikroorganisme, blir en signalsekvens innarbeidet i konstruksjonen. Egnede signalsekvenser er de som naturlig er bundet til den benyttede promoter. For eksempel kan PH05-signalsekvensen, videre signalsekvensen for gjærinvertase eller a—faktorgenet benyttes. De kombinasjoner er foretrukket som muliggjør en nøyaktig spalting mellom signalsekvensen og den modne hybrid-IFN-aminosyresekvens. Tilleggssekvenser som pro- eller spacer-sekvenser som eventuelt kan være spesielle prosess-signaler, kan også inkluderes i konstruksjonen for å muliggjøre nøyaktige prosesser av forløpermolekyler. Alternativt kan sammenbundne proteiner dannes med interne prosess-signaler, noe som muliggjør god modning in vivo eller in vitro.
Videre omfatter hybridvektorene ifølge oppfinnelsen også 3'-flankesekvensen av et gen som inneholder de riktige signaler for transkripsjonsterminering og polyadenylering. Egnede 3'-flankesekvenser er for eksempel de for genet som naturlig er bundet til den anvendte promoter. Der gjær benyttes som vertsmikroorganisme og PH05-promoteren benyttes som eksprime-ringskontrollsekvens, er 3'-flankesekvensen fortrinnsvis den for PH05-genet.
I en foretrukket utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse hybridvektorer som er i stand til replikering og fenotypisk selektering i en vertsstamme omfattende en promoter og en DNA-sekvens som koder det hvilket som helst av de nye hybridinterferoner, idet DNA-sekvensen er plassert sammen med transkripsjonsstart og termineringssignaler så vel som translasjonsstart og stoppsignaler i nevnte hybridvektorer under kontroll av nevnte promoter, således at den i en transformert vert er eksprimert til å produsere et hybridinterferon ifølge oppfinnelsen.
Hybridvektorene ifølge oppfinnelsen kan produseres ved in-vitro-ligering av egnede segmenter av LylFN—a—2- og LylFN—a—3-kodende regioner, og innføring av det resulterende hybrid-IFN-genet i en egnet vektor, eller ved ligering av et spesielt IFN-DNA-segment til et lineært vektor-DNA som allerede inneholder gjenværende seksjoner på en slik måte at det dannes gener som koder for det ønskede hybridinterferon. Det er foretrukket at DNA-segmentet som donerer amino-terminale sluttsekvenser allerede er bundet sammen til eksprimeringskontrollsekvensen.
Egnede segmenter av de LyIFN-a-2- og LyIFN-a-3-kodende regionene er spesielt tatt fra de foretrukne startvektorer ifølge oppfinnelsen, det vil si pBR322 avledede plasmider pAM2 og pAM21. Plasmidet pAM2 inneholder et Hindlll-Pstl-innskudd med den LylFN—a—3-kodende region under kontroll av 3-laktamase-promoteren. Vektordelen av plasmidet pAM2 er motstandsdyktig mot PvuII. Plasmidet pAM21 inneholder et Hindlll-Pstl-innskudd med den LylFN—a—2-kodende region med et enestående PvuII-sete ved posisjon 92 og er under kontroll av p-laktamase-promoteren. Vektordelen av plasmidet p21 er likeledes resistent overfor PvuII.
Spesielt fremstilles genet som koder for hybridinterferon-"B1B2B3D4" ved å ligere det store Pstl-PvuII-fragment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM21, og det lille Sau3A-PstI-fragment av plasmid pAM2. Denne konstruksjon resulterer I et plasmid (pJC344) inneholdende den hybridinterferonen "B1B2D3B4"-kodende region under kontroll av p-laktamase-promotere. På tilsvarende måte fremstilles gener som koder for hybridinterferon, "B1B2D3B4" med ligering av det store PvuII-Pstl-fragment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM2 og det lille Sau3A-Psti-fragment av plasmid pAM21. Denne konstruksjon resulterer i en plasmid (pJC342) inneholdende den hybrIdinterferon-"BiB2D3B4"~kodende region under kontroll av e-laktamase-promoteren. Gener som koder for hybridinterferon-"B1D2D3D4" kan fremstilles ved å ligere det lille Hindlll-Sau3A-segment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM2 og det store PvuII-HindiII-fragment av plasmid pAM2. Denne konstruksjon resulterer I et plasmid (pAM94) inneholdende den hybridinterferon-"BiD2D3D4"-kodende region under kontroll av p<->laktamase-promoteren. Analogt fremstilles genet som koder for hybridinterferon-"BiD2B3B4" ved ligering av det lille HindiII-Sau3A-fragment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM2 og det store PvuII-HindiII-fragment av plasmid pAM21. Denne konstruksjon resulterer i plasmid (pAM90) inneholdende den hybridinterferon-"BiD2B3B4"-kodende region under kontroll av p-laktamase-promoteren. Plasmider inneholdende den hybride interferon "B1D2B3D4"-kodende region (for eksempel plasmid pDM2) kan fremstilles på lignende måte. Disse plasmider er egnet for replikering og eksprimering av hybrid-IFN-gener i E. coli. Hvis ønsket, kan DNA-innskuddet som koder for et hvilket som helst av de nevnte hybridinterferonene skjæres ut fra det tilsvarende plasmid og innføre i en annen vektor-DNA. På denne måte kan det oppnås plasmider inneholdende den hybridinterferon-kodende region under kontroll av en promoter som er forskjellig fra 3-laktamase-promoteren og/eller tillater genet å gli eksprimert i en vert forskjellig fra E. coli.
Fremstillingen av DNA omfattende det strukturelle genet for et hvilket som helst av de nevnte hybridinterferoner kan også utføres ved hjelp av kjemisk syntese. Egnede metoder for syntese av DNA er blitt gitt i summarisk form av S.A. Narang ["Tetrahedron", 39, 3 (1983)]. De kjente synteseteknikker muliggjør fremstilling av polynukleotider opp mot 20-baser i lengde i godt utbytte med høy renhet og i løpet av relativt kort tid. Egnede beskyttede nukleotider er forbundet med hverandre ved fosfodiestermetoden [K.L. Agarwal et al., "Angew. Chem.", 84. 489 (1972)], eller mer effektivt fosfotriestermetoden [C.B. Reese, "Tetrahedron", 34. 3143
(1972)] eller fosfitt-triestermetoden [R.L. Letsinger et al., "J. Am. Chem. Soc", 98, 3655 (1976)]. Forenkling av syntesen av oligonukleotider og polynukleotider er gjort mulig ved fastfasemetoden, der nukleotidkjedene er bundet til en egnet polymer. Itakura et al., ["J. Am. Chem. Soc", 103. 706
(1981)] benyttes trinukleotider forbundet ved fosfotriestermetoden i fastfasesyntesen, i stedet for individuelle nukleotider, og disse kan således kondenseres hurtig og med godt utbytte for for eksempel å gi et polynukleotid med 31 baser. Det aktuelle dobbeltstrengede DNA kan bygges opp enzymatisk fra kjemisk fremstilte kortsegmenter. For disse benytter Khorana et al. ["J. Biol. Chem.", 251, 565 (1976)] overlappende polynukleotidsekvenser fra begge DNA-strenger som holdes sammen i riktig arrangement ved baseparring, og som derefter forbindes kjemisk av enzymet DNA-llgase. En annen mulighet er inkubering i hvert tilfelle av en nukleo-tidsekvens fra de to DNA-strenger med et kort overlappings-segment i nærvær av de fire nødvendige deoksynukleosid-trifosfater med et DNA-polymerase, for eksempel DNA-polymerase I, et Klenow-fragment av polymerase I eller T4-DNA-polymerase, eller med AMV (avian myeloblastosis virus), revers transkriptase. De to polynukleotidsekvenser er derved holdt sammen på riktig måte ved baseparring, og er supplementert med de nødvendige nukleotider av enzymet for å gi en komplett dobbeltstrenget DNA [S.A. Narang et al., "Anal. Biochem.", 121, 356 (1982)]. Itakura et al. ["J. Biol. Chem.", 257. 9226 (1982)] omtaler hvordan, på basis av dette prinsippet, et segment på 132 basepar av det humane leukocytt interferon c<2-gen kan bygges inn i nærvær av DNA-polymerase I (Klenow-fragment) fra 4 kjemisk syntetiserte fragmenter med lengde 39 til 42 baser, det oppnås en 4056 innsparing i kjemisk syntese sammenlignet med metoden som benytter bare ligase. En egnet fremgangsmåte for fremstilling av DNA ifølge oppfinnelsen er omtalt for eksempel i EP-søknad 146 785.
Det kjemisk syntetiserte DNA som omfatter det strukturelle gen for ethvert av hybridinterferonene Ifølge oppfinnelsen kan innføres inn i en vektor-DNA inneholdende en ekspri-meringskontrollsekvens på en måte at eksprlmeringskontroll-sekvensene regulerer genets eksprimering.
2. Transformering av vertsceller.
Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en transformert vert som omfatter transformering av en vert ved en eksprimeringsvektor inneholdende en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst av hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen, og er regulert av en eksprimerings-kontrollsekvens.
Eksempler på egnede verter er de ovenfor nevnte mikroorganismer som stammer av Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis og Escherichia coli. Transformeringen med eksprime-ringsplasmidene ifølge oppfinnelsen utføres for eksempel som angitt i litteraturen, således for S. cerevisiae [A. Hinnen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 75, 1929 (1978)], B. subtilis [Anagnostopoulos et al., "J. Bacterio.", 81, 741
(1961)] og E. coli [M. Mendel et al., "J. Mol. Biol.", 53> 159 (1970)].
Følgelig omfatter transformeringsprosedyren for E. coli-celler Ca^<+->forbehandling av cellen for å muliggjøre DNA-opptak, og inkubering med hybridvektoren. Cellene overfører til et selektivt vekstmedium som muliggjør separering av de transformerte celler fra opphavscellene. Celler som Ikke Inneholder vektoren vil ikke overleve i et slikt medium. Transformeringen av gjær omfatter for eksempel trinnene (1) enzymatisk fjerning av gjærcelleveggen ved hjelp av glukosidaser, (2) behandling av de oppnådde sferoplaster med vektoren i nærvær av polyetylenglykol og Ca<2+->ioner, og (3) regenerering av cellevegger ved å innleire sferoplastene
i agar.
Fortrinnsvis fremstilles regenereringsagaren på en måte som muliggjør regenerering og selektering av de transformerte celler samtidig.
3. Dyrking av de transformerte vertsceller og Isolering av
det uttrykte hvbridinterferon.
Ved fremgangsmåten for fremstilling av hybridinterferonene med formel I-VI der vertscellene er transformert med en hybridvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst av de nevnte hybridinterferoner, dyrkes og hybridinterferonet isoleres.
De transformerte vertsceller dyrkes på i og for seg kjent måte i et væskemedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter.
Forskjellige karbonkilder kan benyttes for dyrking av de transformerte verter ifølge oppfinnelsen. Eksempler på foretrukne kilder for karbon er assimilerbare karbohydrater som glukose, maltose, mannitol eller laktose, eller et acetat som kan benyttes enten per se eller i en egnet blanding. Eksempler på egnede kilder for nitrogen er aminosyrer som casaminosyrer, peptider og proteiner, og deres nedbrytnings-produkter som trypton, pepton eller kjøttbuljonger, og videre gjærekstrakter, maltekstrakter og også ammoniumsalter, for eksempel ammoniumklorid, sulfat eller nitrat, som kan benyttes enten per se eller i egnet blanding. Uorganiske salter som også kan benyttes er for eksempel sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium.
Mediet inneholder videre for eksempel vekstfremmende stoffer som sporelementer, for eksempel jern, sink, mangan og lignende, og fortrinnsvis stoffer som utøver seleksjonstrykk og hindrer vekst av celler som har mistet sitt eksprimeringsplasmid. Således settes for eksempel ampicillin til mediet hvis eksprimeringsplasmidet inneholder en amp^-gen. Slik tilsetning av antibiotiske stoffer har også den effekt at fourensende antibiotisk følsomme mikroorganismer ødelegges. Hvis en gjærstamme som er auksotropisk når det gjelder for eksempel en vesentlig aminosyre, benyttes som vertsmikroorganisme, Inneholder plasmidet fortrinnsvis med en gen som koder for et enzym som komplementerer vertseffekten. Dyrkingen av gjærstammen utføres i et minimal medium som er fattig på nevnte aminosyre.
Dyrkingen gjennomføres ved i og for seg kjente fremgangs-måter. Dyrkingsbetingelser som temperatur, pH-verdi av mediet og fermenteringstid velges slik at det oppnås en maksimum-titer av hybridinterf eron. Således dyrkes en E. coli eller gjærstamme fortrinnsvis under aerobe betingelser, ved submerged kultur ved rysting eller omrøring ved en temperatur på 20 til 40°C, fortrinnsvis ca. 30°C og en pH-verdi på 4 til 8, fortrinnsvis ved ca. pH 7, i 4 til 30 timer, fortrinnsvis inntil det er oppnådd maksimalt utbytte av hybridinterferonet.
Det er overraskende funnet at de maksimale titere av hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen, for eksempel av hybridinterferonene "B1D2D3B4" > "B1D2B3D4", "B1D2D3<D>4<H> og "B^D2B3B4", kan oppnås i råekstrakter av for eksempel transformert gjær som er dyrket under standardbetingelser som klart er høyere enn de for interferon-a-2 og hybridinterferonene "B1B2D3D4" og "DiD2B3B4" som er nær beslektet med hybridinterferonene "BD" og "DB", omtalt i US-PS 4 414 150. Når celledensiteten har nådd en tilstrekkelig verdi, avbrytes dyrkingen og hybridinterferonene frigjøres av vertscellene. For dette formål ødelegges cellene, for eksempel ved behandling med en detergent som SDS eller triton, eller lyseres med lysozym eller et tilsvarende virkende enzym. Hvis gjær benyttes som vertsmikroorganisme, kan celleveggen fjernes ved enzymatisk fermentering med en glukosidase. Alternativt eller i tillegg kan det benyttes mekaniske krefter som skjærkrefter (for eksempel X-press, French-press, Dyno-mill) eller rysting, eller aluminiumoksyd, eller alternerende frysing, for eksempel i flytende nitrogen, og tining, for eksempel ved 30 til 40°C, så vel som ultralyd, for å bryte ned cellene. Den resulterende blanding som inneholder proteiner, nukleinsyre og andre cellebestanddeler, er anriket på proteiner inkludert hybridinterferon på i og for seg kjent måte, efter sentrifugering. Således fjernes for eksempel det meste av ikke-proteinbestanddelene ved poly-etylen-iminbehandling og proteinene inkludert hybridinterferon, felles ut, for eksempel ved metning av oppløsningen med ammoniumsulfat eller med andre salter. Bakterielle proteiner kan også felles ut ved surgjøring med eddiksyre (for eksempel 0, 1%, pH 4-5). Ytterligere rensing omfatter for eksempel ultraf11trering, diafiltrering, elektroforese, kromatografiske prosesser som ionebyttekromatografi, størrelsesutelukkelseskromatografi, HPLC, omvendt fase HPLC og lignende, separering av bestanddelene i blandingene efter molekylstørrelse ved hjelp av en egnet Sephadex-kolonne, dialyse, affinitetskromatografi, for eksempel antistoff-, spesielt monoklonalt antistoff-, affinitetskromatografi, samt andre kjente prosesser, spesielt de som er kjent i teknikkens stand.
Overraskende har hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen høyere termostabiliteter enn interferon LyIFN-a-2 og hybridinterferon "B1B2D3D4". Således er den temperatur ved hvilken 5056 av den antivirale aktivitet er tapt (temperatur-økning av IFN-oppløsninger ved l°C/min. ) 62,8,,C i tilfelle LylFN—a—2 og 63°C 1 tilfelle' hybridinterferon "B1B2D3D4"> mens de tilsvarende verdier for, for eksempel hybridinterferonene "B1D2D3D4", "B1D2B3B4", "B1D2B3D4'<1> og "B1D2D3B4" er 65'C, 64,7°C, 65,3°C og 64,2°C.
Biologiske egenskaper for hybridinterferonene og farmasøy-tiske formuleringer.
Hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen har interessante biologiske egenskaper som kvalifiserer dem som verdifulle farmasøytika.
Hybridinterferonene som fremstilles Ifølge oppfinnelsen utmerker seg ved en meget potent antiviral aktivitet på mammaeceller, som bovin- og spesielt humane celler. Således er antiviral-titerene, bestemt som reduksjon av cytopatisk effekt ifølge S. Rubinstein et al., ["J. Virol.", 37, 755
(1981)] med vesikulaere stomatitis virus (VSV) som utfordrende virus på bovin-(MDBK)- og humane-(WISH)-celler som følger: Som det vises, er den antivirale virkning av hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen ikke bundet til humane celler, men er uvariabel interspesifikk. Følgelig er de antivirale aktiviteter for hybridinterferonene "B1D2D3D4", "B1D2B3B4", "B1B2D3B4", "B1D2D3D4" og "B1B2B3D4" på humane celler sammenlignbare i størrelsesorden med de av hovedinterferonene a-2 og hybridinterferonen "B1B2D3D4" som er nær beslektet med hybridinterferonet "BD" som er omtalt i US-PS 4 414 150, men er tydelig overlegen den til opphavsinterferon a-3 (med faktor 10-30) og den til referansehybridinterferon "D1D2B3B4"
(med faktoren 230-600).
Bortsett fra den generelle antivirale aktivitet på humane celler, gir hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen grunn til en mer spesifikk respons på målceller. Således induseres forskjellige intracellulære enzymer ved interferon virkning. Blant disse enzymer er (2'-5')-oligoisoadenylat-syntetase ("2—5 A-syntetase") som genererer (2<*>5') bundne oligonukleotider, og disse på sin side aktiverer en latent endoribonu-klease som spalter viral mRNA. Det er overraskende funnet at hybridinterferonen ifølge oppfinnelsen som "B1D2D3D4", "B1D2B3<B>4", "B1B2B3D4" og "BJB2D3B4" er spesielt aktive induserere av 2-5 A-syntetaseaktivitet i humane celler. Således gir ved IO<3> enheter/ml, hybridinterferoner "B1D2D3D4", "B1D2B3B4"> " B1B2* 3V/ l" og "B1B2D3D4" henholdsvis 17,5 ganger, 11,4 ganger, 8,5 ganger og 9,6 ganger økning i 2-5 A-syntetaseaktivitet i Daudi-celler, sammenlignet med en 5,6-, 3,9-, 4,0- eller 4,3-ganger økning på virkningen av henholdsvis hovedinterferon a—2 og a—3 og referansehybrid-interferonene "B1B2D3D4" og "D1D2B3B4".
Videre viser interferonene ifølge oppfinnelsen antiproliferative virkninger. Den antiproliferative virkning kan benyttes som følger: interferon-holdige oppløsninger inkuberes med 5*IO<4> Daudi-celler pr. ml i 2 ml RPMI-medium inneholdende 10% føtalt kalveserum. Cellemultiplikeringen bestemmes efter 3 dagers inkubering ved å telle levedyktige celler i et hemocytometer idet det anvendes tryptanblått-eksklusjonsprøven. Således er den konsentrasjon av hybridinterf eron "B1D2B3B4", "B1B2B3D4", "B1B2D3B4" og "B1D2B3D4" og "B1D2D3B4" som er nødvendige for å indusere en 50% inhibering av Daudi-cellemultiplikeringen henholdsvis ca. 4, 4, 1,3, 1,3, 4 og 4 enheter/ml, altså omtrent ekvivalent med hovedinterferon a-2 og referansehybridinterferon "B1B2D3D4"
(ca. 1,3 enheter/ml) og overlegen i forhold hovedinterferon a—3 (ca. 20 enheter/ml) og referansehybridinterferon "D1D2B3B4" (ca. 400 enheter/ml).
Den antiproliferative aktivitet mot human kreft kan også vises in vivo. Således er forskjellige typer kreft av human opprinnelse, som kreft i bryst, lunge, ovarie og melanoma blitt frembragt i nakne mus. Små fragmenter av de frembragte tumorer isoleres og implanteres ved trochar under venal-kapselen av (Balb/c x DBA/2)F^ (CDFj) mus. IFN administreres lntramuskulært i to daglige doser på fra 5* IO5 til 5*IO<7 >IU/kg/Injeksjon ved dag 1 til 5 (dag av administrering: dag 0). Ved dag 6 avlives dyrene, den endelige tumorstørrelse måles og sammenlignes til begynnende tumorstørrelse (før IFN-behandllng), og til tumorstørrelsen i ubehandlede kontroll-mus. Ved behandling med hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen, for eksempel "B1D2D3D4" og "B1B2D3B4", iakttas en betraktelig og tydelig hindring av tumorvekst, og delvis regresjon av tumoren. Overraskende er den antiproliferative aktivitet av hybridinterferonene overlegen til denne av opphavsinterferonene a—2 og a-3, så vel som til den av hybridinterferon-"B1B2D3D4" og -,,D1D2B3B4" .
Den antivirale og antiproliferative egenskap av hybridinterferon som fremstilles ifølge oppfinnelsen gjør disse polypeptider anvendelige for å behandle virale infeksjoner som influensa og andre luftveisvirusinfeksjoner, herpesvirus-infeksjoner, rabies og heptatitisinfeksjoner, og neoplastiske sykdommer, som melanoma, renalkreft, og hårcelleleukemi, i det humane og dyriske legeme, eventuelt i kombinasjon med andre antivirale eller antitumorstoffer, fortrinnsvis i form av farmasøytiske preparater som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av det aktive stoff, eventuelt sammen med eller i blanding med uorganiske eller organiske, faste eller flytende farmasøytisk godtagbare bærere som er egnet for parenteral administrering.
Parenterale formuleringer er spesielt injiserbare væsker som kan anvendes på mange måter som intravenøst, lntramuskulært, lntraperitonealt, lntranasalt, Intradermalt eller subkutant. Slike væsker er fortrinnsvis isotonisk vandige oppløsninger eller suspensjoner som kan fremstilles før bruk, for eksempel fra lyofiliserte preparater som inneholder det aktive stoff alene eller sammen med farmasøytisk godtagbare bærere. De farmasøytiske preparater kan steriliseres og/eller inneholde tilsetninger, for eksempel konserveringsmidler, stabili-seringsmidler, fuktestoffer og/eller emulgatorer, oppløs-ningsformidlere, salter for regulering av det osmotiske trykk og/eller buffere. De farmasøytiske preparater som hvis ønsket kan inneholde ytterligere farmasøytiske verdifulle stoffer, fremstilles på i og for seg kjent måte, eksempelvis ved hjelp av vanlig oppløsning i lyofiliseringsprosesser og inneholder fra 0,1* til 100*, spesielt fra 1* til 50*, og i tilfelle av lyofilisater, opp til 100* av det aktive stoff. Det er verdt å merke seg at hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, for eksempel "B1D2D3D4", kan lyofiliseres og gjenoppløses uten aktivitetstap. I motsetning til dette gir lyofiliserte preparater av parenterale interferoner a-2 og a—2 uklare oppløsninger med en merkbar nedgang av aktiviteten. Sistnevnte interferon kan derfor bare lagres i bufrede oppløsninger.
Farmasøytiske blandinger fremstilles ved at en farmakologisk aktiv forbindelse, fremstilt ifølge oppfinnelsen, blandes med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Den aktuelle administrering og dosering velges av legen avhengig av pasientens tilstand, sykdommen og sykdomsstyrken. For eksempel behandles virale infeksjoner vanligvis ved en eller to daglige doser over få dager til få uker, mens behandling av neoplasmer typisk involverer daglige eller multidaglige doser over uker eller måneder. Samme daglige dosisnivå, det vil sl ca. IO<6> til IO<7> enheter som benyttes i vanlig interferonterapi kan anvendes.
Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.
Forkortelser benyttet i eksemplene:
DTT 1,4-ditiotreitol
TNE oppløsning inneholdende 50 mM Tris*HCl, pE 7,5,
100 mM NaCl, 2 mM EDTA.
Tris tris-(hydroksymetyl)-aminometan
EDTA etylendiamintetraeddiksyre
TE oppløsning inneholdende 100 mM Tris, 50 pm EDTA, N-medium inneholder Bacto-trypton (20 g Difco), gjær-ekstrakt (1 g Difco), glukose (lg), NaCl (8 g),
CaCl2'2E20 (249 mg) pr. 1 oppløsning
TBE oppløsning inneholdende 89 mM tris, 89 mM
borsyre, 2 mm EDTA,
BSA bovinserumalbumin,
HAT hypoxantin/aminopterin/tymldin,
lg immunoglobulin,
IU internasjonale enheter (for interferonaktivi-teten)
MAb monoklonalt antistoff,
PBS fosfatbufret saltoppløsning,
SDS-PAGE natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel, elektroforese.
Del I: Konstruksjon og kloning av interferon cx—2/cx—3-hvbrider 1 Escherichia coli
Alle hybridinterferon-proteinkodende sekvenser som er omtalt nedenfor er blitt operativt bundet til p-laktamase-promoter, klonet inn i et pBR322-derivert eksprimeringsplasmid og transformert i E. coli HB101.
Eksempel 1: Konstruksjon av PvuII-resistente vektorer som har DNA-sekvenser av lymfoblastoidet IFN—a—2 og
-a-3.
pBR322 kuttes ved PvuII (Biolabs) og det lineære DNA ligeres til en (<32>P)-BclI-linker [d(ATGTGTGATCACACAT) syntetisert ved fastfase fosfotriestermetoden, se H. Rink et al., "Nucleic Acids Research", 12, 6369 (1984)] som følger: Det kuttede plasmid DNA (1 jjg, ca. 0,7 pmol ender) ligeres til <32>P-merket Bcll-linker DNA (ca. 30 pmol ender) i 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 20 mM Tris'HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2. 10 mM DTT, 0,5 mM rATP og 40 U/pl T4 DNA-ligase (Biolabs). Efter Inkubering i 2-3 timer ved 15°C, ekstraheres
den vandige fase med et ekvivalent volum av fenol:kloroform og DNA felles ut ved tilsetning av 1/9 volum 10x TNE, 2,5 volumer etanol og holdes over natten ved -20°C. DNA-pelleten ble suspendert i 50 pl TE, pH 8,0, og sentrifugert gjennom en 5-23* sukrosegradient (50 mM Tris-HCl, pH 8,1/1 mM EDTA) i en Kontron TST 60-rotor i 4 timer ved 58 000 o/min. ved 15°C. Gradienten fraksjoneres fra toppen til bunnen, og radioaktiviteten i hver fraksjon bestemmes ved Cerenkov-telling. Fraksjoner av interesse merkes, og DNA felles ut med TNE og etanol. DNA-pelleten resuspenderes i restriksjonsbuffer, og digereres mot BC1I og felles ut igjen efter ekstrahering av den vandige fase med fenol:kloroform. Denne lineære DNA resirkuleres derefter med en konsentrasjon på 5 pg/ml under betingelsene identiske for de beskrevet for linker-ligering.
Den ligerte DNA kuttes med enzymene Hindlll, PvuII (for å eliminere gjenværende intakt pBR322) og Pstl og Hindlll-Pstl store fragment (3600 bp + linker) inneholdende replikerings-opprinnelsen og amp<R->genet, isoleres ved sukrosegradientsentrifugering.
Hindlll-Pstl innskudd fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 (1160 bp) og fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 (1020 bp) (EP-søknad 76 489) oppnådd ved sukrosegradientsentrlfugering er hver ligert inn i det ovenfor fremstilte DNA, noe som resulterte i plasmider pAM4 og pAM2, inneholdende LyIFN-a-2- og LyIFN-cx-3-kodende regioner under kontroll av p<->laktamase-promotere.
Ligert DNA benyttes direkte for transformering av kompetent E. coli som følger: DNA-ligeringsblandingen (eller fraksjoner av den) overføres i 150 pl 15 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaClg, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA og 50 pl CaCl2-behandlede mottager E. coli HB101 tilsettes. Blandingen holdes ved 0°C i 10 minutter og overføres derefter til 42°C i 2 minutter, og efter avkjøling til romtemperatur tilsettes 1 ml N-medium. Inkuberingen fortsettes ved 37 "C i 1 time (shakerplattform, 250 opm) hvorefter 600 pl bringes på McConkey-agar (Difco) inneholdende tetracyklin (10 pg/ml). Petri-skålene inkuberes ved 37°C i 16-18 timer slik at bakterielle kolonier kan observeres.
Plasmid-DNA oppnås fra transformantene ved følgende prosedyre: 10 ml N-medium inneholdende tetracyklin (10 pg/ml) inokuleres med en transformantkoloni hver, og kulturene rystes ved 37°C (rysteplattform, 150-300 opm) inntil de har nådd en optisk densitet på 0,9-1,1 (650 nm). Cellene høstes og resuspenderes i et ekvivalent volum av N-medium inneholdende tetracyklin (10 pg/ml) og kloramfenikol (80 pg/ml). Inkuberingen fortsettes ved 37°C i ytterligere 18 timer for å forsterke antallet av plasmidkopier pr. celle. Bakteriene høstes og bakterlepelletene resuspenderes i 50 mM Tris*HCl, pH 8 (10 ml/g fuktig cellevekt), og lysozym (Sigma) tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 2 mg/ml. Efter 10 minutter ved 0°C justeres oppløsningen til 50 mM EDTA, efter 10 minutter ved 0°C tilsettes Triton x 100 ved en sluttkonsentrasjon på 0,8*, og utfellingen holdes ved 0°C i 1 time, efterfulgt av sentrifugering i Sorvall SS-34-rotor i 30 minutter ved 18 000 opm. Efter ekstrahering av det klare overstående med fenol efterfulgt av to ekstraheringer med kloroform, tilsettes RNase A (Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 25 pg/ml, og oppløsningen inkuberes ved 37°C i 1 time. For fjerning av DNA tilsettes NaCl (IM sluttkonsentrasjon) og polyetylenglykol 6000 (7,5* sluttkonsentrasjon) og utfellingen holdes ved -10°C i 2 timer, efterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 10 000 opm og 0°C i en Sorvall SS-34-roter. Pelleten resuspenderes i 200 pl TNE og ekstraheres igjen med fenol:kloroform (1:1) før gjenutfelling (ved tilsetning av 500 pl etanol 5 minutter ved —80°C, 10 minutter Eppendorf-sentrifuge), DNA-pelleten resuspenderes I 20-40 pm av TE. Typiske utbytter som fremkommer fra denne prosedyre er ca. 20 pg plasmid-DNA.
Det fremstilte plasmid DNAs (pAM4 og pAM2) utsettes for restriksjonsenzymanalyse. Strukturen av pAM4 og pAM3 bekreftes.
Eksempel 2: Eliminering av 3'-ekstracistronisk PvuII-sete
fra pAM4.
Til forskjell fra pAM2-(cx-3) inneholder pAM4-(a-2) ennu to PvuII-seter (se figur 3). For å muliggjøre konstruksjonen av hybrid-IFN-gener med PvuII-seter innen IFN-kodende region, elimineres det annet PvuII-setet Innen den ekstracistroniske region.
Denne modifikasjon av plasmid-pAM4 er vesentlig en utelatelse av den 3'-ekstracistroniske IFN—a—2-cDNA-sekvens mellom Pstl og det 3'-ekstracistroniske PvuII-setet (se figur 3). pAM4 fermenteres delvis med PvuII (5 pg pAM4 i 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 enhet/jjg PvuII (Biolabs) tilsettes, fermentering i 5 minutter ved 37°C, stopp ved fenolekstrahering og ligering til (<32>P)-Pstl-linker ("Collaborative Res."-prosedyre som omtalt i eksempel 1). DNA-blandingen transformeres i E. coil HB101 som ovenfor, og plasmidene av 16 kolonier beskyttes ved restriksjonsenzymanalyse Idet det anvendes Pstl, PvuII og Hlndlll i nærvær av en utelatelse som har den korrekte størrelse (246 bp). Av de 16 undersøkte koloniene er tre umodifisert pAM4, en er en multimer, fem har en stor utelatelse (620 bp), syv har den ønskede lille utelatelse (246 bp). En klon med et forkortet IFN-a-2-innskudd (Hindlll-Pstl lite fragment nu 907 bp) velges og betegnes pAM21.
Eksempel 3: Konstruksjon av Pvu-hybrider med kryssoverseter
med aminosyre 92.
Plasmider pAM2-(a-3) og pAM21-(a-2) kuttes begge med Hlndlll og PvuII, noe som resulterer i utskjæring av DNA-fragmenter (521 bp) inneholdende g<->laktamase-promotersekvensene og den N-terminale halvdel av IFN-gener (som koder for aminosyre 1 til 92). De store og små fragmenter (ca. 4 Kb og 521 bp) separeres ved sukrosegradientsentrifugering, og de store fragmenter def osforyleres ved behandling av 1 pg DNA-fragmenter i 50 pl 50 mM Tris, pH 8 med 1 enhet av kalvetarm alkalisk fosfatase pr. 10 pmol 5<*->ender i 30 minutter ved 37"C. Hybrid-IFN "B1B2D3D4"- og -"D1D2B3B4"-gener konstrueres ved ligering av de egnede store og små DNA-fragmenter som omtalt ovenfor [stort HindiII-PvuII-fragment (~4 Kb) fra pAM2, ligert til lite Hindi 11-PvuII-f ragment (521 bp) fra pAM21 resulterte 1 typen "B1B2D3D4 "-IFN, og så videre). Ligeringen utføres i 10 pl volum inneholdende 20 mM Tris'HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl, 10 mM DTT, 0,5 mM r ATP, 40 enheter/pl, T4-DNA-ligase (Biolabs) og omtrent 500 ng av store DNA-f ragmenter og 20-40 ng av små DNA-f ragmenter. Efter 5 timer ved 15"C benyttes 5 pl av 1igeringsblandlngene til å transformere E. coli HB101 som ovenfor, noe som gir ca. 1000 transformerte kolonier hver. Tre kolonier ble tatt opp, deres plasmid-DNA isolert, og analysert med enzymene Hlndlll, PvuII, EcoRl, Tagl og Pstl. To kolonier som huser plasmid-DNA av den ønskede struktur [pAM27 ("B1B2D3D4") og pAM33 ("D1D2B3B4")], velges ut.
Eksempel 4: Konstruksjon av hybrid-IFN-gener krysset over
ved aminosyre 150.
Plasmidet pAM2-(cx—3) og pAM21-(a—2) fermenteres hver med PvuII og Pstl. DNA-fragmentet separeres ved sukrosegradientsentrifugering i PvuII-Pstl store fragmenter (ca. 4 Kb som koder de N-terminale 92 aminosyrer av IFN—a—2 og —cx—3) og PvuII-Pstl små fragmenter (lengde 386 og 495 bp koder C-termini av IFN-cx-2 og -cx-3). I et andre trinn <32>P-merkes de rensede PvuII-Pstl små fragmenter fra pAM2 og pAM21 som følger: DNA-fragmentene (~ 1 pg) oppløses i 50 pl 50 mM Tris'HCl, pH 8,0 og defosforyleres ved behandling med 1 U/10 pmol 5'-ender alkalisk fosfatase i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inakti-veres ved inkubering i 1 time ved 65° C, og DNA renses ved adsorpsjon og eluering fra DEAE-cellulose og felles ut i etanol. Dette DNA fosforyleres i et 20 pl reaksjonsvolum
inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 9,5/10 mM MgCl2/(5 mM DTT, 30-40 pl lyofilisert -y-(<32>P)-ATP (Amersham, 6000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) og 0,5 U/pl T4-kinase (P.L. Biochem.). Efter 20 minutter ved 37°C stoppes reaksjonen ved tilsetning av EDTA til 10 mM. Et overskudd (~ 4 pg) av tilsvarende ubehandlet DNA-fragment tilsettes derefter, og oppløsningen ekstraheres med fenol og kloroform. DNA separeres fra gjenværende -Y-(<32>P)-ATP ved kromatografi gjennom Sephadex G-50 i TNE. De utelukkede toppfraksjoner, registrert ved Cerenkov-telling, samles og precipiteres med etanol.
De <32>P-merkede PvuII-Pstl små fragmenter fermenteres fullstendig med Sau3A, og det kuttede DNA felles ut ved elektroforese i en 6* polyakrylamidgel idet det anvendes TBE som løpende buffer. 4 DNA-fragmenter tilsvarende PvuII-Sau3A (172 bp hver, koder aminosyrene 93 til 150 av IFN-oc-2 og -cx-3) og til Sau3A-PstI (214 bp og 323 bp, koder aminosyrer 151 til 166 av IFN-a-2 og -a-3) isoleres fra gelen.
Ved religering av 3 egnede fragmenter (se tabell 2) utvikles det 4 hybrid-IFN-typer som er krysset over ved aminosyre 150. De tilsvarende plasmider rekonstrueres i en serie trinn: i en første ligeringsreaksjon, ligeres ekvimolare menger av PvuII-Sau3A og Sau3A-PstI-DNA-fragmenter i 10 pl ligeringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM r ATP og 40 enheter/pl T4-DNA-ligase i 3-6 timer ved 15°C noe som resulterer i concatemer DNA). Efter fermentering med PvuII-Pstl og ekstrahering med fenol:kloroform (1:1), tilsettes et overskudd av det passende PvuII-Pstl store fragment (defosforylert: typisk 1 pg av DNA I 50 pl, 50 mM Tris-HCl ved pH 8 (ca. 0,6 pmol 5'-ender) som behandlet med 0,06 enheter av kalvetarmalkalifosfatase i 30 minutter ved 37°C) og DNA ligeres igjen. E. coli HB101 transformeres og 4 kloner med DNA av ønsket struktur som bestemt ved restriksjonsanalyse (PvuII, Sau3A, Taql og EcoRI) plukkes ut. Klonene betegnes E. coli HB101 pJC334, pJC37, pJC342 og pJC344 (se tabell 2).
Tabell 2
Opprinnelse av DNA-fragmenter som er benyttet for konstruksjon av hybrid-IFN krysset over ved aminosyre 150. I parentes er IFN-typen og seksjonen alFN som er kodet på fragmentene, angitt.
Eksempel 5; Konstruksjon av hybrid-IFN-gener krysset over
ved aminosyre 60.
Konstruksjonen av disse hybrid-IFN-gener utføres ved i det vesentlige samme prosedyre som omtalt 1 eksempel 4.
Plasmider pAM2-(a-3) og pAM21-(a-2) kuttes med Hlndlll og PvuII, og fragmentene separeres med sukrosegradientsentrifugering. De Hindll-PvuII små fragmenter (521 bp, inneholdende p-lac-promoterregion og som kodende for de N-terminale 92 aminosyrer av IFN-a—2 og —a—3) <32>P-merkes og fermenteres delvis med Sau3A (0,5 enheter av enzym pr. pg av DNA, 5 minutter ved 37°C, reaksjonsstopp ved fenolekstrahering). Den resulterende blanding av fragmenter gjenoppløses ved elektroforese i 6* polyakrylamidgel, og 4 fragmenter (to 424 bp Hindi 11-Sau3A-f ragmenter og to 97 bp Sau3A-PvuII-fragmenter) ekstraheres fra gelen. Religering av 3 egnede fragmenter av den trinnvise fremgangsmåte som angitt i eksempel 5 (se tabell 3), og transformering i E. coil HB101 resulterer i transformanter bare 2 av de ventede 4 konstruk-sjoner: pAM65 ("D1B2D3D4") og pAM90 ("B1D2B3<B>4").
Tabell 3
Opprinnelse av DNA-fragmenter som benyttes for konstruksjon av to hybrid-IFN-gener som er krysset over ved aminosyre 61. I parentes indikeres IFN-typen og seksjonen av cxIFN som er kodet på fragmentene.
For konstruksjon av de andre to hybrid-IFN-gener som er krysset over ved aminosyre 61, blir plasmidene pAM65 og pAM90 kuttet ved Hlndlll og PvuII, og de små Hindlll-PvuII DNA-fragmenter (521 bp) isolert efter elektroforese i agarose-gelen. Ligering av det Hindlll-PvuII lille fragment av pAM90 med det Hindlll-PvuII store fragment av pAM2 resulterer i pAM94 ("B1D2D3D4") og ligering av det lille Hindlll-PvuII-fragment av pAM65 med det HindiII-PvuII store fragment av pAM21 gir plasmid pAM76 ("D1B2B3B4"). Strukturen av de 4 ovennevnte plasmid-DNA bekreftes av restriksjonsenzymanalyse.
De respektive kloner betegnes som E. coli HB101 pAM65, pAM90, pAM94 og pAM76.
Del II: Konstruksjon og kloning av interferon- ot- 2/ a- 3-hvbrider i Saccharom<y>ces cerevisiae
Alle hybridinterferon-proteinkodende sekvenser som omtales nedenfor er bundet til PH05-promoteren og PH05-transkrip-sjonstermineringssignalene, klonet inn i gjæren 2 p vektor pJDB207, og transformert inn i gjær S. cerevisiae GRF18.
Eksempel 6: Konstruksjon av eksprimeringsplasmid p31RT(A72). Plasmid pJDB207/IF2( 5± )a72 (EP-søknad 100 561 ) fermenteres med Hlndlll og EcoRI og et 470 bp fragment omfattende en karboksyl terminal ende av interf eron-oc-2 og PH05-transkrip-sjonstermineringssignaler isoleres med agarosegel, elektroforese og elektroeluering [R. Yang et al., "Methods Enzym", 68. 176 (1979)] idet det benyttes Micro-Collodion-poser (Sartorius, Gottingen, Tyskland). Plasmid p31R (se EP 100 561) fermenteres med Hlndlll og EcoRI og 4,1 kb vektordelen isoleres idet det benyttes samme teknikk. Efter ligering av 200 ng av vektor og innskyt ing av DNA idet det benyttes E. coli T4-DNA-ligase, og transformering av E. coli HB101 til ampicillin-resistens, isoleres et plasmid kalt p31RT(A72) inneholdende PH05-promoteren, den C-terminale ende av interferon—a—2 og PH05-transkripsjonstermineringssignaler, og dets struktur bekreftes ved restriksjonsanalyse.
Eksempel 7: Konstruksjon av plasmider pJDB207 PH05/IFN
AM 104, AM114 og AM119.
PH05-eksprimeringsplasmid p31RT(A72) (se eksempel 6) fermenteres med EcoRI og Xhol og de frigjorte 3'-ender fylles med dCTP, dGTP, dATP og dTTP idet det brukes et Klenow-fragment av DNA-polymerase I av E. coli. De stumpe ender blir derefter defosforylert med bakteriell alkalisk fosfatase. Plasmider pJC334, pAM90 og pJC337 (eksempel 4 og 5) fermenteres med Taql (pJC334 og pAM90) eller ved Taql og EcoRI (pJC337) og de 3'-frigjorte ender fylles med de tilsvarende deoksynukleotider som beskrevet ovenfor. DNA-fragmenter på omtrent 560 basepar isoleres ved agarosegelelektroforese og elektroeluering idet det benyttes Micro-Collodion-poser som ovenfor. Ligering av 200 ng preparert vektordel av plasmid p31RT(A72) og 200 ng eluerte DNA-fragmenter idet det benyttes T4-DNA-ligase og transformering av E. coli HB101 til ampicillinmotstandsdyktighet, gir plasmider p31R/IFN AM104 (inneholdende den hybridinterferon "D1D2D3B4"-kodende sekvens), p31R IFN AM 119 (inneholdende den hybridinterferon "B1D2B3B4"-kodende sekvens) og p31R IFN AMI14 (inneholdende den hybridinterferon "D1D2B3D4"-kodende sekvens). Ved å kutte disse plasmider med BamHI og Hlndlll isoleres et DNA-fragment på omtrent 1300 bp med konfigurasjonen PH05-promoter - IFN-proteinkodende sekvens - PH05-transkriberende terminerings-signal ved agarosegelelektroforese og elektroeluering. Dette fragment er klonet mellom Hlndlll- og BamHI-setene i plasmid pJDB207. Plasmidene er transformert inn i gjærstammen GRF18 til Leu<+> (se EP 100 561, se også eksempel 14). De resulterende kloner gis betegnelsen som S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM104, GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM114 og GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM119.
Eksempel 8: Konstruksjon av plasmid pJDB207 PH05/IFN ÅM129.
Plasmid pAM94 (eksempel 5) kuttes fullstendig med Taql og delvis (i nærvær av 10 ng/ml etidiumbromid) med EcoRI. Et DNA-fragment på ca. 580 bp isoleres ved agarosegelelektroforese og elektroeluering og ligeres til EcoRI- og Xhol-kutt, gel renses og vektordel av plasmid p31RT(A72) (se eksempel 6). Efter transformering av E. coli HB101 til ampicillin-resistens isoleres plasmidet p31R PH05/IFN AM129. Dette plasmid som Inneholder den interferon "B1D2D3D4"-kodende region fermenteres med Hlndlll og BamHI, og 1300 bp DNA-fragmentet ligeres inn i pJDB207 som omtalt 1 eksempel 7. Plasmidet tranformeres inn i gjærstammen GRF 18 som ovenfor. Den oppnådde klon gis betegnelsen S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM129.
Eksempel 9: Konstruksjon av plasmider pJDB207 PH05/IFN
AM106, AM110 og AM112.
Plasmid pJDB207 PH05 IFN/AM104, AM114 og AM129 (se eksempel 7 og 8) fermenteres med BamHI og PvuII og 6,8 Kb vektordelene inneholdende de respektive C-terminale ender av de interferon-kodende regioner isoleres ved agarosegelelektroforese og elektroeluering. Likeledes fermenteres pJDB207T/(oc-2 )A72 (EP-søknad 100 561 ) med BamHI og PvuII og det isoleres et DNA-fragment på 800 bp. Ligering av de tilsvarende fragmenter og transformering av E. coli HB101 gir plasmider pJDB207 PH05/IFN AM106 (inneholdende den hybridinterferon "B1B2B3D4"-kodende region) AM112 (inneholdende den hybridinterferon "B1B2D3B4"-kodende region) og AM110 (inneholdende den hybridinterferon "B1B2D3D4"-kodende region). Gjærstammen GRF18 transformeres som vanlig. De resulterende kloner gis betegnelsen som S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN AM106, pJDB207 PH05/IFN AM112 og pJDB207 PH05/IFN AM110.
Eksempel 10: Konstruksjon av plasmider pJDB207 PH05/IFN DM1
og DM2.
Plasmid pJDB207 PH05/IFN AM119 (eksempel 7) fermenteres med Hindll og Bglll og 7,5 Kb vektordelen inneholdende den N-terminale ende av den interferon-kodende region isoleres med agarosegelelektroforese og elektroeluering. På samme måte fermenteres plasmidene pJDB207 PH05/IFN AM114 og pJDB207/IFN AM104 (se eksempel 7) med de samme enzymer og DNA-fragmentet på ca. 600 bp inneholdende den C-terminale ende av den interferon-kodende region isoleres. De tilsvarende fragmenter ligeres med T4-DNA-ligase. Efter transformering av E. coli HB101 oppnås plasmider pJDB207 PH05/IFN DM1 inneholdende den hybridinterferon "B1D2B3D4"-kodende region, og pJDB207 PH05/IFN DM2 inneholdende den hybridinterferon "B1D2D3B4"-kodende region. Gjærstammen GRF18 transformeres som angitt ovenfor. De resulterende kloner gis betegnelsen som S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM1 og S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM2.
Eksempel 11: Konstruksjon av plasmid pJDB207 PH05/IFN ER143. Plasmid pJDB207R/IF(a-2)a72 (EP-søknad 100 561) fermenteres med BamHI og PvuII og det isoleres et DNA-fragment av 6,8 kb. Likeledes fermenteres plasmid pJDB207R/IFN-(cx-3) (EP 100 561 ) med samme enzymer, og det isoleres et DNA-fragment på 800 bp. Ligering av de to DNA-fragmenter og transformering av E. coli HB101 til ampicillinresistens gir plasmid pJDB207 PH05/IFN HR143 inneholdende den hybridinterferon "D;lD2b3b4"-kodende region. Gjærstamme GRF18 transformeres som ovenfor. De resulterende kloner gis betegnelsen S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN HR143.
Eksempel 12: Transformering av Saccharomyces cerevisiae GRF18
og indusering av interferonproduksjon.
Plasmid pJDB207 PH05/IFN AM129 ("B1D2D3D4") Innføres i Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (a, his, 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can^) analogt det som tidligere er beskrevet. [Hinnen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei USA", 75, 1929 (1978)]. 1 pg av plasmid DNA settes til 100 pl av en sferoplastsuspensjon og blandingen behandles med en polyetylenglykol. Sferoplastene blandes med 10 ml regenereasjons-agar, bringes på gjær-minimalmediumplater uten leucin. Efter inkubering i 3 dager ved 30 "C ble det oppnådd ca. 1000 transformerte celler.
En enkel gjærkoloni fra gjærtransf ormas jonsplatene (kalt Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM129) bringes inn i 10 ml gjær-minimalmedium i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe og dyrkes ved 30°C ved 200 opm i 24 timer til en densitet på ca. 2-3'IO<7> celler/ml. Cellene vaskes en gang med 20 ml av lav-Pi-minimalmedium (som "Difco gjær-minimalmedium uten aminosyre" supplementert med 20 g/l glukose, men fremstilt fra komponentene ifølge reseptoren av Difco (Difco Manual, Difco Lab., Detroit, USA) bortsett fra et 0,03 g/l KH2P04 pluss 1 g/l KC1 benyttes i stedet for 1 g/l KH2P04). 3 ml av de resuspenderte celler ble benyttet for å inokulere 300 ml lav-Pi-minimalmedium og 300 ml normal-minimalmedium i 1000 ml Erlenmeyer-kolber. Inkuberingen gjennomføres ved 30°C og 360 opm. Induksjon av PH05-promoteren efterfølges av måling av begynnende sur fosfataseaktivitet i hele celler som beskrevet [Toh-e et al., "J. Bact.", 113, 727 (1973)]. Cellene dyrkes til ca. 1-2*10<7> celler/ml (26-30 timer inkubering).
Eksempel 13: Fremstilling av gjærcelleekstrakter og bestemmelse av interferontiteren.
Celler fra 300 ml dyrkingsmedium (se eksempel 12) med en densitet på l-2*10<7>/ml samles ved sentrifugering i en Sorvall GSA-rotor i 5 minutter ved 8000 opm ved 4°C. Cellene vaskes en gang med 100 ml H20, suspenderes 1 6 ml iskald lyseringsblanding (0.1M kaliumfosfatbuffer, pH 7,4, 1* (v/v), Triton X-100,0,0001M PMSF (Merck)) og overføres til et 30 ml corex-rør. Suspensjonen sentrifugeres igjen 5 minutter i en Sorvall SS-34-rotor ved 8000 opm ved 4°C og resuspenderes i 3 ml lyseringsblanding ved 0°C. 4 g av glassperler (0,4 mm i diameter) settes til cellene og suspensjonen rystes i en Vortex-mixer (Scientific Instr. Inc., USA) ved full hastighet i 30 sekunder, avkjøles derefter i 1 minutt i et isbad. Denne rysteprosedyren gjentas 5 til 10 ganger inntil mer enn 90* av cellene er brutt ned (kontroll under lysmikroskop). Celle-rester og glassperler fjernes fra oppløsningen ved sentrifugering i 10 minutter ved 8000 opm ved 4°C i en Sorvall HB-4-rotor. Supernatanten overføres til et Eppendorf-rør, fryses i flytende nitrogen og lagres ved —60°C. Interferonaktivitet bestemmes ifølge S. Rubinstein et al. ["J. Virol.", 37, 755
(1981)] til 7-IO<9> enheter/ml celleekstrakt.
Analogt det som er beskrevet i eksempel 12 og 13 transformeres S. cerevisiae-stammer GRF18 med plasmider pJDB207 PH05/IFN AM119 ("B1D2B3B4"), AM106 ("B1B2B3D4"). AM112 ("B1B2D3B4"), DM1 ("B1D2B3D4"), DM2 ("B1D2D3B4"), AM110 ("B1B2D3D4") og HR143 ("D1D2B3B4"). De resulterende stammer dyrkes. Cellene høstes og interferontiterene bestemmes som ovenfor. IFN-titerene er som følger: S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM119: 5'IO<9> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM106: 7'IO<7> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM112: 2'10<8> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM1: 3'IO<9> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM2: 5' IO9 enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM110: 3'10<8> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN HR143: 1'10<9> enheter/ml
Under de samme betingelser gir S. cerevisiae stammer GRF18/pJDB207R/IF-(a-2) og /IF-(a-3) (EP 100 561) tltere på henholdsvis 1*10<8> og 3'IO<9> enheter/ml.
Eksempel 14: Produksjon av hybridinterferon "B1D2D3D4" med
transformerte gjærceller i en 30 liters skala. Gjærstammen GRF18 som bærer plasmidet pJDB207 PH05/IFN AM129 som koder for gener for hybridinterferon "B1D2D3D4" nedstrøms fra den sure fosfatasepromoter PH05 strykes på overflaten av en agarkultur av YNB-medium. Platene inkuberes ved 30°C inntil det observeres konfluent vekst. Et sterilt øye benyttes til å overføre en del av overflatekulturen til en rystekolbe Inneholdende pre-kulturmedium IFN/21 Inneholdende:
Kolben på 500 ml har en enkel ledeplate og inneholder 100 ml medium. Mediet fremstilles idet det benyttes deionisert vann og har en pH-verdi på omtrent 6,0. Glukosen steriliseres separat. Efter inokulering inkuberes den første prekultur i 24 timer ved 30°C og en ryster med 5 cm slag ved en hastighet på 250 opm. Den første prekulturkolbe tilveiebringer inokulum for den andre prekulturkolbe. Disse kolber får et inokulum på 1* v/v. Medium og inkubasjonsbetingelser er identisk med de for den første prekultur. Et tilstrekkelig antall kolber fra det andre prekulturtrinn kombineres for å tilveiebringe 1% v/v Inokulum for en 30 liters fermenter (3 kolber/fermenter). Produksjonsfermenteren har et operasjonsvolum på 30 liter Inneholdende 4 ledeskjermer og en enkel seks-bladet plate-turblnagitator med en diameter på 115 mm. Agiteringsgraden er 600 opm, luft kobles ved 1 vol/vol/min. og overtrykket opprettholdes ved 0,3 bar. Fermenteringstemperaturen er 30°C. Fermenteren steriliseres ved medium IFN/23 inneholdende Glukose steriliseres separat og tilsettes for å gi et sluttvolum på 30 liter.
Efter inokulering kontrolleres fermenterings-pH-verdien slik at den ikke faller under 6,0 ved tilsetning av natrium-hydroksyd. Fermenteringen har en varighet på ca. 18 timer eller inntil det maksimale utbytte av interferon er nådd.
Den optiske densitet som er et hensiktsmessig mål på veksten av gjæren, når en verdi mellom 6-7 OD-enheter. Glukosen konsumeres for en stor del, men ikke fullstendig, og det er en induksjon av sur fosfatase-aktivitet ledsaget av produksjon av interferon.
Interferontiteren kan måles i råekstrakter fremstilt ved mekanisk cellediskripsjon i laboratoriet og er 7* IO9 enheter/liter celleekstrakter. Protelninnholdet av rå-ekstraktet er omtrent 1 mg/ml.
Ved slutten av fermenteringen kan dyrkingsbuljongen hvis nødvendig, avkjøles til 10°C før høsting og utvinning av hybridinterferon.
30 1 dyrkingsvæske av pH 6,0 avkjøles til 10° C og cellene separeres med en "Sharples"-sentrifuge. Det klare supernatant inneholder ingen IFN-aktivitet. Den oppnådde cellemasse justeres med buffer X (2 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5M NaCl, 20 jjM fenylmetylsulfonylklorid) til 1400 ml og har en pH-verdi på 8,0. Efter avkjøling til 5-10°C, føres suspensjonen gjennom en "Dyno"-mølle (type KDL Pilot, 0,6 1) utstyrt med polyuretanagitatorplater og 500 ml glassperler av 0,5-0,75 mm diameter og har en agiteringshastlghet på 3000 opm og en matehastighet på 10 l/h, hvorved cellene sprenges. Suspensjonen har en pH-verdi på 8. Suspensjonen inneholdende brutte celler klares ved sentrifugering. Sentrifugeringen gjennomføres i en Sorvall 6SA-rotor ved 12000 opm og ved 4°C i 20 minutter.
Stammen S. cerevisiae GRF18 med plasmidene henholdsvis pJDB207 PH05/IFN AM119, AM106, AM112, DM1 og DM2 kan kultureres og den klare oppløsning inneholdende det tilsvarende hybridinterferon, kan fremstilles på analog måte.
Eksempel 15: Fremstilling av ekstrakter av E. coli stamme
HB101/pAM94 og bestemmelse av IFN-aktivitet.
E. coli stammen HB101/pAM94 dyrkes til en optisk densitet på 8 ved 650 nm i 1 1 av M9-medium inneholdende 0,4* casamino-syre og 2* glukose. Celler sedimenteres og resuspenderes i buffer (16 g celler i 160 ml buffer), inneholdende 0,1M Tris-HCl, pH 8,0, 0,5M NaCl, 5 mM EDTA og 100 pm PMSF. Lysozym tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml. Oppløsningen holdes derefter på is i 30 minutter. Cellene i denne suspensjon åpnes idet det anvendes en Sorvall Omnimix ved en innstilling på tre ganger i 60 sekunder. Suspensjonen inneholder brutte celler som klares ved sentrifugering i en Sorvall 6SA-rotor ved 12000 opm ved 4°C i 20 minutter. Supernatanten analyseres for IFN-aktivitet idet man arbeider i henhold til S. Rubinstein et al. (supra).
Det ble funnet en IFN-aktivitet av 5'IO<7> enheter/ml celleekstrakt.
På analog måte dyrkes E. coli stammene HB101/pAM90, pJC344 og pJC342 og interferontitrene bestemmes som ovenfor til 5*10<8>, 5*IO<7> og 5*IO<6> enheter/ml celleekstrakt.
Eksempel 16: Fremstilling av hybridomceller.
a) Immunogenkilde:
En prøve av halvrenset naturlig human leukocytt IFN (IFNoc),
oppnådd fra dr. K. Cantall (Helsinki), med en spesifikk aktivitet på 13"10^ IU/mg protein, benyttes for immunise-ringen.
b) Immunlseringsprotokoll:
7 hunn-Balb/c-mus (dyrefarm Sisseln, Sveits) 10-14 minutter
gamle immuniseres ved injeksjon i fire fotblader av 4*10^ IU av IFNcx (eksempel 16a) emulgert i komplett Freunds-adjuvans (Difco). En ytterligere injeksjon av 4 "IO5 IU av IFNcx i komplett Freunds adjuvans gis ved dag 30 og en forsterknings-injeksjon (i.p.) av 6* IO5 IU av IFNcx i PBS ved dag 60. Tre dager senere tas milten for fusjon.
c) Cellefusjon:
Alle fusjonseksperimenter utføres ifølge fremgangsmåten av G.
Kohler og C. Miltstein ["Nature", 256, 495 (1975)] idet man benyttet den ikke-sekreterende Sp 2/0-Agl4 myelomalinje [M. Shulman, CD. Wilde og G. Kbhler, "Nature", 276, 269 (1978)]. 10<8> miltceller blandes med IO<7> myelomaceller i nærvær av 1 ml 50* polyetylenglykol (PEG 1500, Serva). Efter vasking resuspenderes cellene i 48 ml standard Dulbeccos minimum-essensialmedium (Gibco nr. 0422501). 3*10^ normal-museperi-toneal eksudataceller pr. fusjon settes til som mateceller. Cellene fordeles i 48 x 1 ml "costar well" og mates 3 ganger uken ved standard HAT-seleksjonsmedium efter 3 til 6 uker. Når hybridomcellenes vekst blir synlig, prøves supernatantene ved en kombinert imunoutfellingsbioanalyse (eksempel 19). Av totalt 221 hybridomer bindes 10 hybridomer å produsere anti-IFN—antistoffer. Hybridomcellene klones med begrenset fortynning i mikrotiterplater i det minste en gang. Hybridom 144 BS velges for ytterligere studier fordi det spesielt er stabilt, og skiller ut store mengder immunoglobulin. Eksempel 17: Isolering og rensing av monoklonalt antistoff. 8-10 uker gamle Balb/c-mus (dyrefarm Sisseln, Sveits) forbehandles intraperitonealt med 0,3 ml pristan (Aldrich). 2-3 uker senere inokuleres 2-5*10^ klonene hybridomceller og 0,2 ml pristan intraperitonealt. Efter 8-10 dager samles ascitesfluidet, sentrifugeres ved 800 x g og lagres ved -20'C.
Opptint ascites-fluidum sentrifugeres ved 50 000 x g i 60 minutter. Et fett lag som flyter på overflaten fjernes forsiktig og protelnkonsentrasjonen justeres til en konsentrasjon på 10-12 mg/ml. Råimmunoglobulin felles ut ved dråpevls tilsetning av 0,9 volumekvivalenter mettet ammoniumsulfat ved 0°C, derefter oppløses det hele i 20 mM Tris-HCl/ 50 mM NaCl (pH 7,9) og dialyseres med samme buffer. En immunoglobulinfraksjon oppnås ved DEAE-D52-cellulose-(Whatman)-kromatografi ved anvendelse av et buffergradient-system på 20 mM Tris*HC1/25-400 mM NaCl, pH 7,9. Immuno-globulinet felles igjen ut med ammoniumsulfat og oppløses i PBS ved en konsentrasjon på 10 mg/ml.
Natriumdodecylsulfat-polyakrylamld-gelelektroforese (SDS-PAGE) viser en renhetsgrad på mer enn 95* for de monoklonale antistoffer 144 BS.
Eksempel 18: Bestemmelse av klasse og underklasse av
monoklonale antistoffer.
Klasse og underklasse for de monoklonale antistoffer som er dannet av klonede hybridomceller bestemmes ved den kjente agargel-immunodiffusjonsteknikk Ifølge Ouchterlony, som benytter klasse- og underklassespesifikke kanin-antistoffer (Bionetics). Resultatene bekreftes ved en enzym-immunoanalyse (ELISA) på følgende måte: Mikrotiterplater belegges med 1 pg pr. brønn av et kanin-immunoglobulinpreparat av et klasse-eller underklassespesifikt serum (Bionetics) i 50 pl av PBS. Fri bindingskapasitet på platen mettes med en buffer av 1* bovinserumalbumin i PBS inneholdende 0,2* ?a?3 (w/v), pH 7,4. 100 pl prøver inneholdende monoklonale antistoffer inkuberes i brønnene ved 37 "C i 1 time. Platene vaskes med PBS, inkuberes derefter ved 37° C i 1 time med et fosfatase-konjugert kanin-immunoglobulinpreparat av samme spesifisitet som benyttes for belegging av platene. Det fikserte enzym utvikles ved inkubering (37°C, 20 minutter) med en oppløsning av enzymsubstrat p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml i dietanolaminbuffer 10* inneholdende 0,5 mM MgCl2 og 0,02* (w/v) NaN3, pH 9,8) og måling av den optiske densitet ved 405 nm. Det monoklonale antistoff 144 BS hører til klassen IgG^K (kappa).
Eksempel 19: Kombinert immunoutfellingsbioanalyse.
50 pl av rå naturlig human leukocytt IFN eller rekombinant IFNoc-polypeptider (eksempel 20a) (IO<4> IU/ml) blandes med ekvivalenter mengder av prøveoppløsningen, det vil si dyrkingssupernatanten av hybridomer eller PBS-oppløsninger av rensede monoklonale antistoffer, og inkuberes i 37°C i 2 timer i mikrorør (Eppendorf 3810). Derefter tilsettes 50 pl av på forhånd titrert kanin-antimus lg antistoff (Nordic) og blandingen inkuberes ved 37°C i 1 timer og derefter ved 4°C i 16 timer hvorved fri og IFN-bundne monoklonale antistoffer danner immunkomplekser. Rørene sentrifugeres ved 12 000 opm ved 4°C i 5 minutter. Den immune utfelling vaskes en gang med 1 ml kald bufret saltoppløsning (pH 7,5), oppløses derefter i 200 pl av bufret saltoppløsning av pH 2,2. IFN-aktiviteten som derved frigjøres bestemmes i en standard bioanalyse ifølge J.A. Armstrong, "Appl. Microbiol.", 21, 723 (1971), Inhibering av den cytopatiske effekt av Mengo-virus (400 plaque-formede enheter pr. brønn), bestemmes ved å benytte Hep2-celler (3*10<4> celler pr. brønn) i mikrotiterplater.
Eksempel 20: Bestemmelse av interferonspesifisitet.
a) Kilde av rekombinant IFN- polvpeptlder:
LylFN—a-1—, LYIFN-a—2— og LyIFN-a-3-polypeptider som er
relatert til henholdsvis IFNaF, IFNaB og IFNaD omtales i EP-
søknad 76 489. IFN-A og IFNaJ oppnås fra dr. J. Davies (Biogen, Geneve) og professor C. Weissmann (Universitetet i Ztlrich, Sveits), IFNocC fra Weissmann Institute of Science, Department of Virology, Rehovot, Israel. b) Kilde for monoklonale antistoffer med IFN som benyttes for
sammenli<g>nin<g>: Monoklonale antistoffer 1K2 og 2K2 fremstilles som omtalt i GB-PS 2 108 510. MAb, NK2 og YOK oppnås fra Celltech (Berkshire), YI-1 og YI-2 fra Inter-Yeda (Israel), S-l, S-2, S-3 og S-4 fra dr. C. Favre, UNICET, Dardilly (Frankrike) og MAb 1/24 fra M. Aguet, Universitetet i Ztlrich, Sveits.
c) Bestemmelse av reaktlvltet av de forskjellige monoklonale antistoffer til IFNcx-undertyper utføres ved den kombinerte
immunoutfellingsbioanalyse ifølge eksempel 19, og tandem-radiolmmunoanalyse omtalt av D.S. Secher "Nature", 290, 501
(1981). Resultatene er oppført i tabell 4.
De monoklonale antistoffer 144 BS, 1K2 og 2K2 reagerer ikke med human IFNP (Rentschler, Laupheim, Tyskland) eller human IFN-y (Bio Science, Emmenbrtlcke, Sveits).
Resultatene av tabell 4 viser at monoklonalt antistoff 144 BS utøver et unikt blndingsmønster. Det bemerkelsesverdige er fremfor alt den lave binding til IFNaA og den effektive binding til IFN-a-2-, IFN-a-3- og IFN-a-l-polypeptider.
Videre muliggjør resultatene i tabell 4 den epitope analyse som skjematisk er angitt i tabell 5.
Fra analysen av tabell 5, fremgår det faktum at den epitope kombinasjon av hver IFNcx-undertype er unik. Videre muliggjør analysen forutsiing av egnede par av monoklonale antistoffer for bestemmelse av spesifikke undertyper av IFNcx med eksklusjon av andre undertyper 1 en tandem-immunoanalyse. For eksempel vil en kombinasjon av monoklonale antistoffer 144 BS med en hvilken som helst av MAb NK2, S-3, IY-1 eller 1/24 være nyttig for bestemmelse av IFNcxB uten interferens av IFNcxD, og kombinasjonen av MAb 144 BS med MAb YOK for bestemmelse av IFNcxD i nærvær av IFNcxD i nærvær av IFNcxB.
Eksempel 21: Fremstilling av en immunoadsorbent kolonne.
1 ml avsatt "Affi-gel" 10 (Bio-Rad) kobles til 17 mg av monoklonalt antistoff 144 BS ifølge fremstillerens instruksjon: "Affi-gel" vaskes på et sintret glassfilter først med kaldt destillert vann og derefter med en 0,1 molar NaHC03~ oppløsning, pH 8,0 (koblingsbuffer). En suspensjon av 50* gel i koblingsbuffer overføres til et plastrør, blandes med et likt volum av renset monoklonal antistoffoppløsning og roteres i 4 timer ved romtemperatur. Efter kobling vaskes gelen med koblIngsbuffer, og for å blokkere ikke-reagerte seter, behandles den med 0,1 ml i IM etanolamin-HCl (pH 8,0) i 1 til 2 timer ved romtemperatur. Gelen vaskes med PBS i nærvær av 10 mM NaN3 og holdes der ved 4°C.
Eksempel 22: Rensing av rekombinant IFNa ved immunoaffi-nitetskromatografi.
En suspensjon av brutte E. coli-celler som produserer rekombinant IFNa, for eksempel E. coil HB101/pAM94 (se eksempel 15) klares ved sentrifugering i en Sorvall 6SA-rotor ved 12 000 opm ved 4°C i 20 minutter. Polyetylenimin ("Polyimin P" Fluka, pH 8,0) settes til supernatanten til en sluttkombinasjon på 0,25* (w/v). Oppløsningen omrøres 1 time og sentrifugeres. Pelleten kasseres, og supernatanten bringes til 65* metning med ammoniumsulfat. Denne blanding omrøres i 1 time og sentrifugeres. Supernatanten kasseres, og pelleten suspenderes i 1/10 volum (15-20 ml) PBS (pH 7,2). Oppløs-ningen dialyseres over natten mot PBS inneholdende 0,02* Na<N>3.
Den dialyserte oppløsning blandes med 1 ml av immunoaffinitetsgelen fra eksempel 21. Denne blanding rystes godt i 1 time, pakkes derefter i en kolonne og vaskes suksessivt med 5 kolonnevolum PBS, 5 kolonnevolum av PBS inneholdende 0,5M NaCl og 0,2* "Triton X 100" og 5 kolonnevolum av PBS. Alternativt pakkes immunoaffinitetsgelen først i kolonnen og den dialyserte oppløsning tilsettes på toppen, og vaskes så som beskrevet. Rekombinanthybrid IFNa ("B1D2D3D4") elueres ved sur buffer, pH 2,5, inneholdende 0,1M sitronsyre og 0,3M NaCl. De aktive IFN-fraksjoner nøytraliseres med IM Tris, dialyseres mot PBS og konsentreres til ca. 0,1 mg/ml protein idet det benyttes ultrafiltrering flatsjiktmembraner XM10 (Amicon Corp.).
Den maksimale kapasitet av immunoadsorbentkolonnen av det i eksempel 21 Inneholdende 17 ml av monoklonalt antistoff 144 BS ved ca. 1,2 mg av hver av IFN-a-2-, IFN-a-3-polypeptider, ved minst 0,8 mg av IFN-a-l-type polypeptid, 1,15 mg hybridinterferon "B1B2D3B4", 1,25 mg hybridinterferon "B1D2B3B4", 1,25 mg hybridinterferon "B1D2D3D4", 0,44 mg hybridinterferon "BiD2B3B4"»<l>»6 mg hybridinterferon "B1D2D3B4", 1,6 mg hybridinterferon "B1B2D3D4" og 1,15 mg hybridinterferon "B1B2D3D4" °g 1,25 mg hybridinterferon "D1D2B3B4". Immunoabsorbentgelen kan benyttes for opp til 50 separeringer uten vesentlig tap av kapasitet. Rekombinant IFN-a-2-, IFN-a-3-, IFN-a-l-type polypeptider og hybridinterferoner som renses ved denne metode er homogene på SDS-PAGE.
Eksempel 23: Immunodotanalyse.
Immunodotanalyse utføres ifølge R. Hawkes et al., "Anal. Biochem.", 11, 143 (1982). Prøver inneholdende naturlige eller rekombinante interferoner avsettes på nitrocelluloseark ved forskjellige konsentrasjoner. Prikkene lufttørkes og den gjenblivende bindingskapasitet av nitrocellulosen blokkeres ved inkubasjon i en Tris-buffer (0.15M NaCl, 0,01M Tris-HCl, pH 7,6) inneholdende 10* hesteserum. Nitrocellulosestrimlene inkuberes derefter med en oppløsning av monoklonale antistoffer 144 BS (23 pg/ml), og tilsvarende preparerte strimler med enten en oppløsning av monoklonalt antistoff 2K2 (30 pg/ml) for sammenligning, en oppløsning av et normalt museimmunoglobulin (1:100 fortynning) som negativ kontroll, eller en oppløsning av et polyklonalt antihumant interferon oc-museserum (Enzo, 1:1000 fortynning) som en positiv kontroll. Efter vasking behandles alle strimler med kanin-antimuseimmunoglobulin merket med peroksydase (Nordic, 1:400 fortynning), og det bundne andre antistoff fremkalles med et peroksydasesubstrat, 4-klor-l-naftol.
De monoklonale antistoff-flekker IFNaD-typen polypeptider (som IFN—a—3) i konsentrasjon ned til 0,4 ng pr. flekk og IFNaB-type polypeptid (som IFN—a-2) ved 10 ng pr. flekk, mens MAb 2K2 kun erkjenner IFNaD-type polypeptider (4 ng pr. flekk).
Eksempel 24: Perle-radioimmuno-tandem-analyse.
a) Radiomerking av monoklonalt antistoff 144 BS med 1^-J:
0,1 mg monoklonalt antistoff 144 BS joderes med <125>j_
natrium;] odid (1 mC) og kloramid T ifølge standardmetode av F.C. Greenwood et al., "Biochem. J.", 89» 114 (1963). Reaksjonsproduktet renses med en ionebyttekolonne "Bio-Rad" AG 1x8 og aktiviteten standardisert til 4*10^ cpm/ml ved fortynning med PBS.
Joderingen av det monoklonale antistoff 2K2 utføres på samme måte. Monoklonalt antistoff YOK og NK2 er kommersielt tilgjengelig i radiomerket form fra Celltech.
b) Kobling av monoklonalt antistoff 144 BS til makroperler: Polystyrenperler (diameter 6,3 mm, Spherotech AG, Ztlrich)
inkuberes ved 4°C i 16 timer ved bevegelse i en oppløsning av 1 mg/ml MAb 144 BS i en koblingsbuffer for PBS inneholdende 5 mM EDTA og 0,1* NaN3 (pH 8) i et forhold av 20 perler på 10 ml oppløsning. De dekkede perler overføres derefter i en blokkeringsbuffer av PBS inneholdende 10* hesteserum og 0,1 NaN3 og holdes deri ved 4°C inntil bruk, i det minste i 24 timer.
Kobling av andre MAb utføres på samme måte.
c) Analyseprosedvre:
Plastrør (Falcon, 5 ml) belegges med 0,5 ml blokkeringsbuffer
av PBS inneholdende 10* hesteserum og 0,1* NaN3 over natten. Bufferen fjernes ved aspirasjon og 0,2 ml av en IFN-holdig prøve eller standardoppløsning i blokkeringsbuffer settes direkte til bunnen av rørene. En MAb-koblet og blokkert perle fra eksempel 24b) tørkes kort på en ren klut og overføres forsiktig uten ytterligere skum inneholdende IFN-oppløsning. Perlen inkuberes 4 til 6 timer ved romtemperatur med svak rysting. IFN-oppløsningen fjernes ved aspirasjon og hver perle vaskes med 3 x 2 ml blokkeringsbuffer. Perlen inkuberes derefter med 0,2 ml av <125>J-merket annet antistoff (eksempel
24a) tilsvarende til 80*10<3> cpm i 16 timer ved 4°C, vaskes tre ganger med PBS og føres over i et nytt rør for telling. Tabell 6 viser resultatene for standardoppløsninger av IFN-a—3- og IFN-a-2-polypeptider oppnådd ved forskjellige kombinasjoner av fast fase (perler koblet) første antistoff og l25J-merket annet antistoff.
Polyklonalt: Perle-koblet polyklonalt saueanti-IFNa-antistoff oppnådd fra Celltech.
Beste resultat oppnås ved kombinasjon av MAb 144 BS med MAb YOK for påvisning av IFN-a-3 og med kombinasjon av MAb 144 BS med MAb NK2 for påvisning av IFN-a-2.
Figur 4 viser resultatet av kvantitative titrerings-eksperimenter med kombinasjon av MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb NK2 i radiomerket form. Analysen gir lineære resultater fra 1 til 5000 IU/ml (2 pg/ml til 10 ng/ml) av IFN-aB-type polypeptider. Forskjeller i titrerings-kurver av IFN—a—2 og "standard B"-type polypeptider (fra Celltech) skyldes variasjoner i analysemålinger av de to IFN-preparater.
Tilsvarende resultater oppnås i kvantitative eksperimenter for måling av IFNaD-type polypeptider med kombinasjonen av MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb YOK i radiomerket form. Analysen er pålitelig ned til 1 IU/ml (2 pg/ml) av IFNaD-type polypeptider. Kombinasjonen av MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb NK2 kan også benyttes for bestemmelse av IFNaF-type polypeptider.
d) Forkortelse av analvseprosedvre ( simultananalvse):
Idet det benyttes den generelle prosedyre som beskrevet i
eksempel 24c) inkuberes den MAb-koblede perlen 1 3 timer ved romtemperatur med prøveoppløsningen (0,1 ml) og den radio-merkede andre antistoff (0,1 ml) sammen, idet det unngås vaskinger mellom inkuberingene.
Figur 5 viser at den forkortede samtidige analyse kan benyttes pålitelig for hurtig påvisning av IFN-B-type polypeptider (som IFN-a-2) prøver inneholdende 150 IU/ml eller mer, men er betraktelig mindre følsom enn analysen Ifølge eksempel 24c).
bg = bakgrunn
e ) Prøvesett for perle- radlolmmuno- tandem- analyse:
Prøvesett for analysen omtalt i eksempel 24c) Inneholder:
100 plastrør Falcon 5 ml
100 polystyrenperler, 6,3 mm belagt med monoklonalt antistoff 144 BS i PBS inneholdende 10* hesteserum og 0,1* NaN3, 20 ml av <125>J-merket monoklonalt antistoff YOK med en spesifikk aktivitet 4"IO<5> cpm/ml, 20 ml av <125>J-merket monoklonalt antistoff NK2 med en spesifikk aktivitet 4*10<5> cpm/ml,
2 ml standardoppløsning IFN—a—1 inneholdende IO<4> IU/ml,
2 ml standardoppløsning IFN-a-2 inneholdende IO<4> IU/ml,
2 ml standardoppløsning IFN-a-3 inneholdende IO<4> IU/ml,
1000 ml PBS Inneholdende 10* hesteserum og 0,1* NaN3, kalibreringskurve.
Eksempel 25; Enzym-lmmunoanalyse (ELISA)
a) Merking av monoklonalt antistoff 144 BS med alkalisk fosfatase: 1,4 ml MAb BS i 1,4 ml PBS kobles 2 timer med en oppløsning inneholdende 5 ml alkalisk fosfatase (Sigma P6774, type VII-T) ifølge standardmetode av Voller et al., "Bull.", World Health Organ. 53, 55 (1976) idet det benyttes glutaraldehyd (0,2* v/v). Konjugatet overføres i 5 ml av Tris-buffer, 0,05M, pH 8,0, inneholdende 1 mmol av MgCl2, 1* BSA og 0,02* NaN3. Oppløsningen holdes ved 4°C.
b) Analyseprosedyre:
Polypropylen-mikrotiterplater (Dynatech Labs. Inc.) dekkes over en periode på 2 timer ved 37° C og over natten ved 4°C med 150 pl av en oppløsning av det monoklonale antistoff NK2 (Celltech, 10 pg/ml) i en buffer, pH 8,6 (karbonatbufret 0,9* saltoppløsning inneholdende 0,02* natriumazid). Platene vaskes fem ganger med PBS og protein-reaktive seter som ennå er til stede mettes ved inkubering i 1 time ved 37°C med 250 pl av en buffer, pH 7,4 (0,2* gelatin og 0,2* NaN3 i PBS). Plater belagt på denne måte kan holdes ved 4°C 1 denne buffer i få dager. 50 pl av en fortynningsserie av prøveoppløsningen eller en standardoppløsning inneholdende IFNcx-under type r, 50 pl av buffer pH 7,4 og 50 pl av en oppløsning av det fosfat-merkede antistoff 144 BS (eksempel 25a) som er blitt fortynnet 1:100 med en buffer, pH 7,4, blandes og inkuberes i brønnen på mikrotiterplatene i 2 timer ved 37°C og 30 minutter ved 4°C. Platene vaskes fem ganger med PBS, Inkuberes derefter 30 minutter ved 37°C med 150 pl av en oppløsning av p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml i 10* dietanolaminbuffer, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8). Ved å måle den optiske densitet ved 405 nm, bestemmes mengden av frigjort nitrofenol som er proporsjonal med mengden av den bundne enzymfosfatase og således proporsjonal med mengden av IFNcx-undertype i prøveoppløsningen.
Denne analyse kan benyttes til å bestemme mengden av IFNcxB-type som (IFN-a-2) eller IFN-F-type-polypeptlder. For bestemmelsen av IFN-D-type (slik som IFN-a-3)-polypeptider, dekkes mikrotiterplaten med monoklonale antistoffer YOK (Celltech) i stedet for NK2.
Tilsvarende resultater oppnås når mikrotiterplater dekkes med MAb 144 BS, og henholdsvis f osf atasekoblet MAbs NK2 og YOK brukes som annet antistoff. c) Prøvesett for ELISA: Et prøvesett for analyse omtalt 1 eksempel 25b) Inneholder:
polypropylenmikrotiterplater,
20 ml av monoklonalt antistoff NK2 (10 pg/ml) i karbonatbufret saltoppløsning (0,9* NaCl, 0,42* NaHC03, 0,0072* Na2C03, 0,02* NaN3), 1 ml av alkalifosfatase-koblet MAb 144 BS (eksempel 10.1, 0,3 mg antistoff pr. ml) i Tris-buffer (0,05M, 1 mM MgCl2, 1* BSA, 0,2* NaN3, pH 8,0),
2 ml standardoppløsning IFN-a-1 Inneholdende IO<4> IU/ml,
2 ml standardoppløsning IFN-a-2 inneholdende IO<4> IU/ml,
2 ml standardoppløsning IFN-a-3 inneholdende IO<4> IU/ml, 300 ml PBS,
300 ml buffer, pH 7,4 (0,2* gelatin og 0,2* NaN3 i PBS),
50 ml av p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml) i dietanolaminbuffer (10*, 0,5 mM MgCl2, 0,02* NaN3, justert til pH 8,9
med HC1),
kalibreringskurve
farveintensitetsskala.
Eksempel 26: Rensing av hybridinterferonene ved anvendelse av
utfelling og kromatografiske metoder.
1 liter lnterferon "BiD2D3D4"-holdige oppløsninger klares ved sentrifugering (se eksemplene 13-15) og surgjøres ved bruk av 2M HC1 inntil oppløsningen når pH 2,2. Oppløsningen omrøres i 1 time ved 4°C og utfelt protein separeres ved sentrifugering (GSA-rotor Sorvall ved 12 000 opm ved 4°C i 20 minutter). Pelleten kasseres og supernatanten bringes til 30* metning med fast ammoniumsulfat. Denne oppløsning omrøres i 1 time ved 4°C og sentrifugeres. Supernatanten inneholdende interferonet dialyseres derefter mot 0,1M NH2HCO3 ved pH 8,2. Det finnes en interferonaktivltet på ca. 10<8> IU/ml.
En kolonne inneholdende 50 ml chelaterende Sepharose 6B (Pharmacia) ladet med Cu<2+->ioner ifølge fremstillerens instruksjon ekvilibreres idet det benyttes 250 ml 0.05M natriumacetat, pH 7,0, og 0,5M NaCl. 200 ml dialysert oppløsning (se ovenfor) påføres ved 4°C på kolonnen. Kolonnen vaskes med 150 ml ekvilibrert buffer. Eluering av bundet interferon utføres idet det benyttes en lineær gradient av
250 ml 0,5M natriumacetat, pH 7,0 og 0,5M NaCl,
250 ml 0,05M natriumacetat, pH 2,8, og 0,5M NaCl og efterfulgt av en vasking med 150 ml av 0,05M natriumacetat, pH 2,8, og 0,5M NaCl.
De aktive interferonfraksjoner samles og dialyseres mot 0,05M Tris-HCl-buffer, pH 8,0. Interferonaktivltet i den dialyserte oppløsning er omtrent 10<8> IU/ml. Maksimumkapasitet av kolonnen er a 75 mg interferon-"B^D2D3D4".
En kolonne inneholdende 50 ml Q-Sepharoseanionbytter (Pharmacia) ekvilibreres under anvendelse av 250 ml 0,05M Tris-HCl-buffer, pH 8,0. 100 ml av den ovenfor dialyserte interferon-holdige oppløsning påføres på en kolonne ved romtemperatur. Kolonnen vaskes derefter med 50 ml ekvilibrert buffer. Bundet interferon elueres idet det benyttes en lineær gradient på 0 til 0,7M NaCl i 200 ml 0,05 Tris-HCl, pH 8,0.
De rene interferon elueres ved ca. 0,3M NaCl, De aktive fraksjoner viser et enkeltbånd ved en tilsynelatende molekylvekt på 19 000 når det analyseres på SDS-polyakrylamidgel. Maksimumkapasiteten av ionebyttekolonnen er ca. 50 mg av hybridinterferon-"BiD2D3D4".
På analog måte kan det renses hybridinterferonene "B1D2B3B4", "B1D2B3D4", "B1D2D3B4", "B1B2B3D4" og " B^^ Bi".
Eksempel 27: Lyofilisering av hybridinterferon "B1D2D3D4".
Interferon "BJD2D3D4" som er renset enten via immunoaffi-nitetskromatografi under anvendelse av monoklonalt antistoff 144 BS eller via vanlig kromatografisk teknikk (se eksempel 26), dialyseres mot 0,5M NH2HCO3 og lyofiliseres derefter. Små volum av vann tilsettes to ganger til den lyofiliserte prøve for fullstendig å fjerne NH4CO3. Oppløsningen blir derefter lyofllisert igjen.
Rekonstituering av interferon-"BiD2D3D4"_0PPløsning utføres som følger: 0,5M NH4HCO3, pH 8,2 settes til den lyofiliserte prøve for å oppnå en interferonkonsentrasjon på ca. 0,1 mg/ml. Den gjenoppløste interferon har en spesifikk antiviral aktivitet på 2*10<8> IU/mg, noe som er identisk med den tilsvarende verdi før lyofilisering.
Eksempel 28: Fysikokjemisk karakteristikk av hybridinterferoner .
Hybridinterferoner ifølge oppfinnelsen og utgangs-interferonene utsettes for polyakrylamid SDS-gelelektroforese Ifølge metoden som er beskrevet av Laemmli ["Nature", 227, 680 (1970)]. De tilsynelatende molekylvekter for hybridinterferonene, gitt i kilo-Dalton (kD), er oppstilt i tabell 7. Tabell 7 Inneholder også de isoelektriske punkter (pl) av hybridinterferonene slik de er bestemt ved å benytte LKB-polyakrylamidgeler inneholdende "Ampholine". Aminosyresekvensen for hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen bestemmes for å benytte en 470 A proteinsekvenser fra Applied Biosystems eller å benytte en 890 C Beckman-sekvens. I begge tilfeller foretrekkes automatisert Edman-degradering. Strukturen som finnes er i full overensstemmelse med det som var ventet. Den N-terminale aminosyre er cystein.
Eksempel 29: Effekt av hybridinterferoner på nivå av (2'-5')~
oligoisoadenylat-syntetaseaktivitet i Daudi-celler .
Daudi-celler såes ved 2*IO<9> celler/ml i RPMI-1640-medium med 10* føtalt kalveserum inneholdende den angitte konsentrasjon (se tabell 8) av hybridinterferoner "B1B2B3D4", "BiD2B3B4", "B1D2D3D4" OG "B1B2D3B4". Efter 24 timers behandling sentrifugeres 5'10^ celler pr. prøve (9000 opm) og resuspenderes i 500 1 av kald lyseringsbuf f er (20 mM 4-(2-hydroksy-etyl)-l-piperazinetansulfonsyre-buffer, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 120 mM KC1, 7 mM ditiotreitol, 10* glycerol, 0,5* Nonidet P 40) og inkuberes 2 minutter på is. Prøvene sentrifugeres derefter ved 9000 opm i 8 minutter og ved 4°C og supernatanten fjernes og analyseres for (2'-5' )-oligoisoadenylat-syntetaseaktivltet som følger: Supernatanten blandes med 50 1 av poly(ri)•(rC)-agarose (P-L Biochemicals) 1 15 minutter ved 30'C og det lkke-adsorberte materiale fjernes ved sentrifugering. Det poly(ri)•(rC)-adsorberte materialet inkuberes med 2,5 mM (o<32>P) ATP 400 Cl/mmol (Amersham Int.) i 20 timer ved 30°C, idet det behandles med bakteriell alkalifosfatase (Sigma) og elueres så fra en kolonne av surt aluminiumoksyd (Sigma) (300 pl) med 3,0 ml av IM glycin-HCl-buffer, pH 2,0 som beskrevet [Merlln et al., "Analyt. Biochem.", 110. 190 (1981 )]. Resultatene i tabell 8 er uttrykt som antall ganger økning I (2'-5')-oligoisoadenylat-syntetase-aktivitet i interferon-behandlede celler i forhold til nivået av celleaktiviteten i ubehandlede kontrollceller (gjennomsnittlig aktivitet 51,6 8,7 pmol/timer/10<5->celle).
Eksempel 30: Farmasøytisk preparat (parenteral admini
strering ). 2 mg av hybridinterferon-"B1D2D3D4" med en spesifikk aktivitet på 1,3*10<8> enheter/mg på human Wish-celler oppløses i 30 ml av 5N human serumalbumin. Den resulterende oppløsning føres gjennom et bakteriologisk filter og den filtrerte oppløsning oppdeles under aseptiske betingelser i 100 ampuller som hver inneholder 2,6*IO<6> enheter rent hybridinterferon. Ampullene som er egnet for parenteral administrering lagres fortrinnsvis kaldt, for eksempel ved -20°C.
På samme måte kan det fremstilles ampuller inneholdende 5, 2'IO6 eller 1,04'IO<7> enheter ved å benytte 4 eller 8 mg hybridinterferon.
På analog måte kan det fremstilles ampuller inneholdende hybridinterferon "B1D2B3B4", "B1B2D3B4"» "B1D2B3<D>4", •'B1D2D3B4" eller "B1B2B3D4" (spesifikk aktivitet 1,28-10<8>, 2*10<8>, 7,V10<7>, 3,8'10<7> og 8-10<7>).
Claims (4)
- Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid med en aminosyresekvens sammensatt av to til fire undersekvenser tilsvarende i aminosyreidentitet og tall til undersekvenser av human-lymfoblastoid-interferoner LyIFN-oc-2 og LyIFN-a-3, Idet hybridinterferon-polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av polypeptider med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 150 av LyIFN-a-2 "BiB2B3" og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-3 "D4", et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 92 av LyIFN-a-2 "B1B2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-a-3 "D3", og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-oc-2 "B4", og et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 60 av LyIFN-a-2 " B^, aminosyrer 61 til 92 av LyIFN-a-3 "D2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-a-2 "B3" eller av LyIFN-a-3 "D3" , og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-2 "B4" eller av LyIFN-a-3 "D4", karakterisert veda) fremstilling av en DNA omfattende det strukturelle genet som koder for hybridinterferonet og inkorporering av det oppnådde DNA i en egnet ekspresjonsvektor, b) overføring av det oppnådde hybridvektoren som bærer hybrid-IFN-strukturgenet i en mottagervert, c) utvelging av transformerte verter fra ikke-transformerte verter ved dyrking under slike betingelser at bare transformerte verter overlever, d) dyrking av de overførte verter under betingelser som muliggjør eksprimering av det hybrid-IFN-strukturelle genet, og e) isolering av det eksprimerte hybrid IFN.
- 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hybridinterferon-polypeptid er valgt fra gruppen bestående av hybridinterferon-polypeptid "B1B2B3D4" med formel hybridinterferon-polypeptider "B1B2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptider "B1D2B3D4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3D4" med formel og hybridinterferon-polypeptid "B1D2B3B4" med formel
- 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av hybridinterferon "B1B2B3D4">karakterisert ved at hybridvektoren inneholder DNA-sekvens som koder for hybridinterferon .
- 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av hybridinterferon "B1B2D3B4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder en DNA-sekvens som koder for hybridinterferon. 5-Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av hybridinterferon "B^D2B3D4<M>, karakterisert ved at hybridvektoren inneholder et DNA-sekvens som koder for hybridinterferon. 6.Fremgangsmåte ifølge krav 1 til fremstilling av hybridinterferon "BiD2D3B4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder et DNA-sekvens som koder for hybridinterferon. 7.Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av hybridinterferon "B1D2D3D4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder en DNA-sekvens som koder for hybridinterferoner. 8.Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av hybridinterferon "B1D2B3B4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder en DNA-sekvens som koder for hybridinterferoner.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB858514725A GB8514725D0 (en) | 1985-06-11 | 1985-06-11 | Hybrid polypeptide |
GB858514722A GB8514722D0 (en) | 1985-06-11 | 1985-06-11 | Hybrid interferon |
GB858514726A GB8514726D0 (en) | 1985-06-11 | 1985-06-11 | Hybrid polypeptides |
GB858514723A GB8514723D0 (en) | 1985-06-11 | 1985-06-11 | Hybrid alpha-interferon |
GB858514724A GB8514724D0 (en) | 1985-06-11 | 1985-06-11 | Hybrid alpha-interferon |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO862313D0 NO862313D0 (no) | 1986-06-10 |
NO862313L NO862313L (no) | 1986-12-12 |
NO175602B true NO175602B (no) | 1994-07-25 |
NO175602C NO175602C (no) | 1994-11-02 |
Family
ID=27516593
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO862313A NO175602C (no) | 1985-06-11 | 1986-06-10 | Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US4885166A (no) |
EP (1) | EP0205404B1 (no) |
JP (2) | JPH0655759B2 (no) |
KR (1) | KR920002267B1 (no) |
AT (1) | ATE78262T1 (no) |
AU (1) | AU598196B2 (no) |
CA (1) | CA1285507C (no) |
CY (1) | CY1842A (no) |
DE (1) | DE3685996T2 (no) |
DK (1) | DK168794B1 (no) |
FI (1) | FI90983C (no) |
GR (1) | GR861497B (no) |
HK (1) | HK99895A (no) |
HU (1) | HU203255B (no) |
IE (1) | IE57865B1 (no) |
IL (1) | IL79085A (no) |
NO (1) | NO175602C (no) |
NZ (1) | NZ216485A (no) |
PT (1) | PT82736B (no) |
SG (1) | SG25195G (no) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5359035A (en) * | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
DE3607835A1 (de) * | 1986-03-10 | 1987-09-24 | Boehringer Ingelheim Int | Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung |
GB8803365D0 (en) * | 1988-02-13 | 1988-03-16 | Ciba Geigy Ag | Antiviral combination |
EP0331635A3 (en) * | 1988-02-29 | 1990-02-28 | The Board of Regents of the University of Texas System | Preparations for treating bladder cancer |
US5273889A (en) * | 1990-08-22 | 1993-12-28 | University Of Saskatchewan | Gamma-iterferon-leukotoxin gene fusions and uses thereof |
US5594107A (en) * | 1990-08-22 | 1997-01-14 | University Of Saskatchewan | Chimeric protein comprising an RTX-family cytotoxin and interferon-2 or interferon |
ATE167896T1 (de) * | 1990-08-29 | 1998-07-15 | Genetics Inst | Aus mehreren domänen bestehende hämatopoese- stimulatoren |
US5372808A (en) † | 1990-10-17 | 1994-12-13 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect |
DE69222013T2 (de) * | 1991-12-16 | 1998-01-29 | Ciba Geigy Ag | Endoplasmatisches Retikulum-ständige rekombinante dibasische Endoprotease und deren Verwendungen |
US5676942A (en) * | 1992-02-10 | 1997-10-14 | Interferon Sciences, Inc. | Composition containing human alpha interferon species proteins and method for use thereof |
ATE175998T1 (de) * | 1992-03-10 | 1999-02-15 | Jolla Cancer Res Found | Rekombinierte alkalische phosphatase aus kälberdarm |
TW218846B (no) * | 1992-04-07 | 1994-01-11 | Ciba Geigy | |
JPH078215A (ja) * | 1993-04-30 | 1995-01-13 | Kawasaki Steel Corp | ドコサヘキサエン酸含有海洋性微細藻類食品素材およびその製造方法 |
TW249202B (no) * | 1993-08-13 | 1995-06-11 | Ciba Gerigy Corp | |
US5981227A (en) | 1995-02-09 | 1999-11-09 | Movartis Ag | Process for the production of proteins |
TW442492B (en) * | 1995-07-26 | 2001-06-23 | Novartis Ag | Process for the enrichment of interferon |
US6685933B1 (en) | 1998-07-28 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Interferon α hybrids |
EE05201B1 (et) | 1998-10-16 | 2009-08-17 | Biogen Idec Ma Inc. | Glkoslitud interferoon-beeta, selle kasutamine ja seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon, meetod interferoon-beeta-1a aktiivsuse pikendamiseks ja leiutisekohase valgu valmistamiseks |
US6514729B1 (en) * | 1999-05-12 | 2003-02-04 | Xencor, Inc. | Recombinant interferon-beta muteins |
CA2427194A1 (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-10 | Biomedicines, Inc. | Method for short-term and long-term drug dosimetry |
US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
FR2821625B1 (fr) * | 2001-03-01 | 2003-05-16 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques |
FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
AU2002365436B8 (en) * | 2001-11-09 | 2008-04-03 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Method for treating diseases with omega interferon |
US20040175359A1 (en) * | 2002-11-12 | 2004-09-09 | Desjarlais John Rudolph | Novel proteins with antiviral, antineoplastic, and/or immunomodulatory activity |
KR20050086498A (ko) * | 2002-11-18 | 2005-08-30 | 맥시겐, 인크. | 인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체 |
US7314613B2 (en) * | 2002-11-18 | 2008-01-01 | Maxygen, Inc. | Interferon-alpha polypeptides and conjugates |
US7731947B2 (en) | 2003-11-17 | 2010-06-08 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle |
TW200611910A (en) * | 2004-05-19 | 2006-04-16 | Maxygen Inc | Interferon-alpha polypeptides and conjugates |
EP1771197A2 (en) * | 2004-06-30 | 2007-04-11 | Egen Corporation | Pegylated interferon alpha-1b |
WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
BRPI0609809A2 (pt) | 2005-05-18 | 2011-10-11 | Maxygen Inc | polipeptìdeo isolado ou recombinante, conjugado, composição, polinucleotìdeo isolado ou recombinante, célula hospedeira, vetor, métodos para preparar o polipeptìdeo, para preparar um conjugado, para inibir replicação de um vìrus em células infectadas com o vìrus para reduzir o numero de cópias de um vìrus em células infectadas com o vìrus, para reduzir o nìvel de rna de hcv no soro de um paciente infectado com hcv, para reduzir o nìvel de dna de hbv em soro de um paciente infectado com hbv e para reduzir o nìvel de rna de hiv em soro de um paciente infectado com hiv, e, uso do polipeptìdeo ou do conjugado |
MX2008014870A (es) | 2006-05-30 | 2009-02-12 | Intarcia Therapeutics Inc | Modulador de flujo para sistema de suministro osmotico con canal interno de dos piezas. |
EP2634250B1 (en) | 2006-07-14 | 2017-04-05 | Patheon Holdings I B.V. | Improved process for the culturing of cells |
ES2422864T3 (es) | 2006-08-09 | 2013-09-16 | Intarcia Therapeutics, Inc | Sistemas de liberación osmótica y unidades de pistón |
US20100143372A1 (en) | 2006-12-06 | 2010-06-10 | Medimmune, Llc | Interferon alpha-induced pharmacodynamic markers |
AU2008244523B2 (en) | 2007-04-23 | 2012-02-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof |
MX2009011870A (es) * | 2007-05-02 | 2009-11-12 | Ambrx Inc | Polipeptidos de interferon beta modificados y usos de los mismos. |
CA2686861A1 (en) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | Medimmune, Llc | Interferon alpha-induced pharmacodynamic markers |
US7625555B2 (en) | 2007-06-18 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human interferon-like proteins |
ES2557352T3 (es) | 2007-11-05 | 2016-01-25 | Medimmune, Llc | Métodos de tratamiento de la esclerodermia |
EP2848702A1 (en) | 2008-02-08 | 2015-03-18 | MedImmune, LLC | Disease markers and uses thereof |
US8343140B2 (en) | 2008-02-13 | 2013-01-01 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents |
AU2010289383B2 (en) | 2009-09-03 | 2015-04-16 | Medimmune, Llc | Type 1 interferon diagnostic |
EP3735944A1 (en) | 2009-09-28 | 2020-11-11 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Rapid establishment and/or termination of substantial steady-state drug delivery |
US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
SI2686002T1 (en) | 2011-03-15 | 2018-06-29 | Biogen Ma Inc. | A method for reducing influenza-like symptoms associated with intramuscular delivery of interferon by the rapid titration-enhancing regimen |
US8729236B2 (en) * | 2011-05-23 | 2014-05-20 | Hal S. Padgett | Selection and characterization of novel plant-derived recombinant human interferons with broad spectrum activity |
US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
EP4278996A3 (en) | 2015-06-03 | 2024-01-24 | i2o Therapeutics, Inc. | Implant placement systems |
AU2017268161B2 (en) | 2016-05-16 | 2020-03-12 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof |
USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
CA3049034A1 (en) | 2017-01-03 | 2018-07-12 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Methods comprising continuous administration of a glp-1 receptor agonist and co-adminstration of a drug |
EA202192176A1 (ru) | 2019-02-15 | 2022-01-13 | Астразенека Аб | Нарушения, опосредованные интерфероном i типа |
KR102570958B1 (ko) * | 2023-06-14 | 2023-08-25 | (주) 신성하이스킬 | 화재방지 4축 파쇄장치 |
KR102594862B1 (ko) * | 2023-06-14 | 2023-10-27 | (주) 신성하이스킬 | 화재방지 파쇄 시스템 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CY1346A (en) * | 1980-01-08 | 1987-01-16 | Biogen Nv | Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
ES8302778A1 (es) * | 1980-11-10 | 1983-02-01 | Genentech Inc | Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral. |
US4456748A (en) * | 1981-02-23 | 1984-06-26 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
US4414150A (en) * | 1980-11-10 | 1983-11-08 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
GB2108510B (en) * | 1981-10-03 | 1984-12-12 | Ciba Geigy Ag | Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof |
IT1167610B (it) * | 1982-01-19 | 1987-05-13 | Cetus Corp | Interfreron ibrido multiclasse, composizione farmaceutica che lo contiene e procedimento di produzione |
GB8315980D0 (en) * | 1983-06-10 | 1983-07-13 | Biogen Nv | Producing hybrid dna sequences |
GB8317880D0 (en) * | 1983-07-01 | 1983-08-03 | Searle & Co | Structure and synthesis of interferons |
EP0146903A3 (en) * | 1983-12-19 | 1987-07-22 | Schering Corporation | Production of a vector encoding a novel hybrid interferon species |
GB8412564D0 (en) * | 1984-05-17 | 1984-06-20 | Searle & Co | Structure and properties |
EP0173935A1 (en) * | 1984-08-31 | 1986-03-12 | University Patents, Inc. | Hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons |
US4716217A (en) * | 1984-08-31 | 1987-12-29 | University Patents, Inc. | Hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons |
-
1986
- 1986-06-05 AT AT86810243T patent/ATE78262T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-06-05 EP EP86810243A patent/EP0205404B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-05 DE DE8686810243T patent/DE3685996T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-05 US US06/871,059 patent/US4885166A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-09 CA CA000511107A patent/CA1285507C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-09 GR GR861497A patent/GR861497B/el unknown
- 1986-06-09 PT PT82736A patent/PT82736B/pt unknown
- 1986-06-09 FI FI862461A patent/FI90983C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-06-10 HU HU862457A patent/HU203255B/hu unknown
- 1986-06-10 IE IE1542/86A patent/IE57865B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-06-10 IL IL79085A patent/IL79085A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-06-10 JP JP61132895A patent/JPH0655759B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-10 DK DK272986A patent/DK168794B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-06-10 AU AU58499/86A patent/AU598196B2/en not_active Expired
- 1986-06-10 NZ NZ216485A patent/NZ216485A/en unknown
- 1986-06-10 NO NO862313A patent/NO175602C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-06-10 KR KR1019860004580A patent/KR920002267B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-07-18 US US07/381,444 patent/US5071761A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-14 JP JP4276015A patent/JPH0736757B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-16 SG SG25195A patent/SG25195G/en unknown
- 1995-06-22 HK HK99895A patent/HK99895A/xx not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-03-08 CY CY184296A patent/CY1842A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO175602B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid | |
US7635466B1 (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human fibroblast interferon-like polypeptides | |
DK170714B1 (da) | Rekombinant DNA-vektor, fremgangsmåde til fremstilling deraf, værter transformeret dermed, fremgangsmåde til fremstilling af transformeret vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et lymfoblastoidtalfa-interferon | |
JP2561255B2 (ja) | 組換コロニ−刺激因子▲下−▼1 | |
US5231176A (en) | Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons | |
JP2567385B2 (ja) | 神経突起促進因子及びその製造方法 | |
US5702920A (en) | DNAS encoding human macrophage migration inhibition factor related peptides | |
CA1339776C (en) | Equine-gamma-interferon | |
WO1996035789A1 (en) | Human interferon tau compositions and methods of use | |
WO2000042186A1 (fr) | Nouvel interferon alpha | |
JP2567195B2 (ja) | 新規なヒトi型インターフェロン | |
AU648214B2 (en) | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. | |
US5739290A (en) | Monoclonal antibody against an interferon-induced human protein in pure form | |
US7052867B2 (en) | Expression and secretion vector for human interferon alpha and process for producing human interferon alpha by employing same | |
EP0242329B1 (en) | Monoclonal antibodies against interferon-induced human protein in pure form, and test kits containing these antibodies | |
EP0174143A1 (en) | Novel, distinct family of human leukocyte interferons, compositions containing them, methods for their production, and DNA and transfected hosts therefor | |
US5198350A (en) | Interferon-induced human protein in pure form, monoclonal antibodies thereto and test kits containing these antibodies | |
Zoon et al. | Comparative structures of mammalian interferons | |
US5656596A (en) | Method of treating lesions in a nervous system | |
Reddy et al. | Isolation and characterization of complementary DNA to proliferating cell nucleolar antigen P40 | |
US6407209B1 (en) | Interferon-induced human protein in pure form, monoclonal antibodies thereto and test kits containing these antibodies | |
CA2228618A1 (en) | Novel feline cytokine protein | |
NZ227372A (en) | Murine monoclonal antibodies to human ifnalpha | |
HU196461B (en) | Process for producing and cleaning immune interferon and pharmaceutical compositions comprising it | |
KR100250574B1 (ko) | 역상 고압 액체 크로마토그래피를 이용한 변이형 알파 인터페론의 분석방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |