NO175602B - Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid med en aminosyresekvens sammensatt av to til fire undersekvenser, tilsvarende i aminosyreidentitet og tall til undersekvenser av human-lymfoblastoid-interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3.

Interferonene ("IFN") er en familie av polypeptider som sekreteres fra en stor varietet av eukaryotiske celler når de utsettes for forskjellige mitogener og viruser. Interferonene er klassifisert ved de kjemiske og biologiske karakteristika og i tre grupper: IFN-a, IFN-P og IFN-7. IFN-a og —p<->genene eksprimeres overveiende i celler behandlet med viruser, virale bestanddeler og dobbeltstrenget RNA. IFN-7 synteti-seres på den annen side som svar på mitogener.

Human IFN-a er kodet for av en genfamilie omfattende minst 15 ikke-alleliske gener. Human IFN-e og human IFN-t kodes av enkle gener. Det primære overføringsprodukt av IFN-a omfatter 189 aminosyrer (unntatt IFN-a2: 188 aminosyrer) hvorfra signalpeptider av 23 aminosyrer fjernes ved postoverførings-modifikasjon. Human IFN-e og humant IFN-"r består av 187 og 186 aminosyrer hvorfra 21 eller 20 aminosyrer som utgjør signalpeptidet fjernes. Aminosyresekvenshomologien blant IFN-a undertyper er 80-855É, mens homologien mellom IFN-e og IFN-a er ca. 30-4056. IFN-^y viser bare enkle aminosyre-homologier med IFN-a, svarende til 12% identiske residuer.

IFN viser antiviral, immunomodulatorisk, så vel som cyto-toksisk aktivitet. Det er påvist at IFN-a-undertyper (for eksempel IFN-a2, IFN-a^) viser forskjellige målcellespesifi-siteter. Den antivirale aktivitet av IFN-a2 og IFN—a^ er omtrent den samme på bovine (MDBK)-celler, men IFN-a2 er syv ganger mere effektiv enn IFN—a^ på humane (WISH)-celler, og 30 ganger mindre effektiv enn IFN—a^ i å beskytte muse-(L 929)-celler. [M. Streuli et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 78, 2848 (1981)]. På standen om at medlemmer av den multigene IFN-a-familie varierer i utstrekning og spesifisitet av deres antivirale aktivitet er blitt bekreftede resultater oppnådd fra noen IFN-a-"hybrider" (se EP 32134, US-PS 4 414 150). Disse "hybrider" er konstruert ved å kløve to gener som koder for interferon-a-undertyper med restrik-sjonsenzymet PvuII (eller i to tilfeller, med Bglll) og kryss-ligering de resulterende fragmenter slik at DNA-sekvensen som koder for en aminoterminal del av et IFN-gen ble sammensmeltet til DNA-sekvensen som koder for den karboksyterminale del av det andre IFN-gen. Enskjønt, disse hybridinterferoner utøver endringer i målcellespesifisitet sammenlignet med hovedinterferonene, ble det ikke vist at det var noen svekking eller begrensing av noen av de tre interferonaktiviteter. Slike begrensninger eller restrik-sjoner kan være ønskelig eksempelvis ved klinisk anvendelse, hvor det er ønskelig å fokusere interferonterapi på et spesielt problem som en viral infeksjon, uten mulighet i at kompliserende faktorer fremkommer fra andre aktiviteter av det administrerte interferon.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er således å tilveiebringe nye hybridinterferoner som viser mere spesifikke biologiske aktiviteter på grunn av den selektive eller predominante aktivering av kun noen av de interferon-induserte, biokjemiske reaksjonsmønstre, og/eller der noen av de uønskede bivirkninger hos naturlige interferoner, bivirkninger som begrenser deres bruk, for eksempel influ-ensalignende symptomer som feber, hodepine eller tretthet, gastrointestinale forstyrrelser, reduksjon av blodtrykket eller hårtapet, utelukkes eller reduseres.

Hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen er utledet av human lymfoblastoid-interferin LyIFN-a-2 med sekvensen og human lymfoblastoid-interferon eller LyIFN-a-3 med sekvensen:

Disse interferoner så vel som fremgangsmåten for fremstilling derav er blitt omtalt i EP-søknad 76 489. LyIFN-a—2 er beslektet med (men ikke identisk med) human leukocytt-interferon LelF-ocB (se US-PS 4 414 150) og har en spesifikk aktivitet på primære kalvenyreceller og et humant embryonisk "foreskin"-celler (HEF, hver infusert med vesikulært stomatitis virus) på 1,85'10<8> IU/mg og 2,45'10<8> IU/mg. LyIFN-a-3 er beslektet med (men ikke identisk med) humant leukocytt-interferon LeIF-aD (se US-PS 4 414 150) og har en spesifikk aktivitet på kalveceller og HEF-celler (som ovenfor) på 1,32*10<8> IU/mg og 3,7*10<6> IU/mg. Videre har LyIFN-a-3 en høyere termostabilitet og lavere anti-proliferativ aktivitet enn LyIFN-a-2.

Det er en spesiell hensikt med oppfinnelsen å tilveiebringe LyIFN-a-2/a-3 hybridpolypeptider som kombinerer den høye antivlrale titer og/eller den høye antiproliferative aktivitet på humane celler av LylFN—a—2 og den høye termostabilitet av LylFN—a—3.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid med en aminosyresekvens sammensatt av to til fire undersekvenser tilsvarende i aminosyreidentitet og tall til undersekvenser av human-lymfoblastoid-interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, idet hybridinterferon-polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av polypeptider med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 150 av LyIFN-a-2 "B1B2B3" og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-3 "D4", et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 92 av LyIFN-a-2 "B1B2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-cx-3 "D3'\ og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-2 "B4", og et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 60 av LyIFN-cx-2 " B^", aminosyrer 61 til 92 av LyIFN-a-3 "D2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-a-2 "B3" eller av LyIFN-a-3 "D3", og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-2 "B4" eller av LyIFN-a-3 "D4", og denne fremgangsmåte karakte-riseres ved a) fremstilling av en DNA omfattende det strukturelle genet som koder for hybridinterferonet og inkorporering av det

oppnådde DNA i en egnet ekspresjonsvektor,

b) overføring av det oppnådde hybridvektoren som bærer hybrid-IFN-strukturgenet i en mottagervert, c) utvelging av transformerte verter fra ikke-transformerte verter ved dyrking under slike betingelser at bare

transformerte verter overlever,

d) dyrking av de overførte verter under betingelser som muliggjør eksprimering av det hybrid-IFN-strukturelle

gene, og

e) isolering av det eksprimerte hybrid IFN.

I en foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen en

fremgangsmåte der hybridinterferon-peptidet er valgt fra gruppen bestående av hybridinterferon-polypeptid "B1B2B3D4" med formel

hybridinterferon-polypeptider "B1B2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptider "B1D2B3D4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3D4" med formel og hybridinterferon-polypeptid "B1D2B3B4" med formel

De mest foretrukne hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er "B1D2D3D4" (V) og "B1B2D3B4" (II).

Et hybridinterferon kan som nevnt ovenfor fremstilles ifølge oppfinnelsen ved rekombinant DNA-teknikk omfattende trinnene, for eksempel med: a) fremstilling av et DNA omfattende strukturelle gener som koder for nevnte hybridinterferon ved in vitro rekombinasjon av setene svarende til aminosyrene 60, 92 og 150, eller av interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3 eller ved kjemisk DNA-syntese og interkorporering av oppnådde DNA til en egnet ekspresjonsvektor, b) overføring av den oppnådde hybridvektor som har det hybride IFN-strukturelle gen i en mottagervert, c) utvelging av transformerte verter fra ikke-transformerte verter ved dyrking under slike betingelser at bare den

overførte verten overlever,

d) dyrking av de overførte verter under betingelser som muliggjør eksprimering av det hybrid-IFN-strukturelle gen, og

e) isolering av de uttrykte hybrid IFN.

Fremgangsmåtene som anvendes vil forstås lettere fra den

detaljerte beskrivelse nedenfor og tegningene der:

Figur 1 sammenligner amlnosyresekvensene av modne LylFN—a—2 og LylFN—a—3. Bare de aminosyrer av LylFN—a—3 som er forskjellige fra tilsvarende aminosyrer av LyIFN-a-2 er omtalt. Aminosyresekvensen av LylFN—a—3 er forøvrig identisk til den fra LylFN—a—2. Figur 2 viser nukleotidsekvensene av kodeområdene og deler av 3'-ekstracistroniske regioner av LylFN—a—2 og LyIFN-a-3, ATG-overføring initieringskodoner, avslutningstriplettene og egnede restriksjonsseter er understreket. Kodingstriplettene er nummerert. Figur 3 viser restriksjonskart av HindIII-PstI-små segmenter av plasmider pBR(AP )/LyIFN-a-2 og pBR(AP)/LyIFN-cx-3. Den hvite stav (LylFN—a—3) og sorte stav (LylFN—cx—2) avgrenser kodingsregionene av de modne IFN. Ved bunnen er det vist oppdeling av den primære struktur av IFN-polypeptid (166 aminosyrer) i fire seksjoner. Figur 4 og Figur 5 viser radioaktiviteten bundet til bærer-kulen i funksjon av kvantiteten av IFN—a—2 i prøve-oppløsningen målt i sandwich RIA.

1. Fremstilling av hvbridvektorer inneholdende hybride IFN-strukturelle gener

cDNA av human interferon-a undertyper a—2 og a—3 er kloning i E. coli. Således omfatter plasmid pBR(AP )/LyIFN-cx-2 og pBR(AP)/LyIFN-a-3 Hindlll-Pstl (eller EcoRI-Pstl) DNA-innskudd inneholdende kodingsregioner av LylFN—a—2 og

LylFN—a—3 under kontroll av p<->laktamase-promotere (se EP-PS 76 489). Restriksjonsområdet for nevnte innskudd er vist på figur 3. Man ser lett at genene deler noen felles restriksjonsseter (plassert i posisjonene 60, 92 og 150 i IFN-aminosyresekvensene) som fordelaktig kan benyttes for å konstruere nye gener som koder for hybridinterferoner som har fordelaktige biologiske og/eller fysikalske egenskaper.

Således kan rekombinanter (single eller multiple utskift-ninger) mellom LylFN—a—2— og LylFN—a—3-gener utvikles ved in vitro rekombinasjon ved PvuII-setet (posisjon 92) og/eller ved Sau3A-posisjonene (posisjonene 60 og 150). Da den primære struktur av interferonene således kan oppdeles i fire seksjoner (første seksjon av aminosyre 1 til 60, annen seksjon aminosyre 61 til 92, tredje seksjon av aminosyrene 93 til 150 og fjerde seksjon av aminosyrene 151 til 166, se figur 3), kan hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen designeres ved fire bokstaver, hver bokstav indikerer den tilstedeværende seksjon. Således er for eksempel hybridinterferon (I) sammensatt av seksjonene 1 til 3 av interferon LylFN—a—2 ("B", LylFN—a—2 er relatert til IFN-a-, supra) og seksjon 4 av LylFN—a—3 ("D", LylFN—a—3 er relatert til IFN—a—D, supra) er betegnet i IFN "B1B2B3D4".

For å lette fremstilling av det ønskede hybridinterferon må DNA-innskuddene inneholdende de LyIFN-a-2- eller LyIFN-a-3-kodende områder modifiseres på en slik måte at restriksjons-setene Hindlll (eller EcoRI), PvuII og Pstl er unike for dem. Det er klart fra figur 3 at det er et ytterligere PvuII-sete i det 3'-ekstracistroniske området av genet som koder for LylFN—a—2. Seter kan lett fjernes, for eksempel ved delvis deling av en hybridvektor inneholdende den LyIFN-a-2-kodende region med PvuII, ligering av den resulterende lineære DNA til en linker inneholdende en DNA-sekvens som gjenkjennes av restriksjonsendonukleasen, Pstl, spalting med Pstl, religering av det digererte med lav DNA-konsentrasjon, utvelging med henblikk på plasmider (for eksempel ved restriksjonsanalyse) som har den ønskede modifikasjon, det vil si et forkortet 3'-ekstracistronisk område der PvuII-seter er eliminert. Analogt blir vektorer som er benyttet for å klone IFN-gener med fordel modifisert slik at restrik-sjonssetene Hindlll, PvuII og Pstl er felles for dem.

Ved hjelp av oppfinnelsens fremgangsmåte oppnår man fremstilling av hybridvektorer som omfatter en DNA-sekvens som koder for en hvilken som helst av hybridinterferonene med formel I-VI, og er operativt bundet til en ekspresjons-kontrollsekvens.

Vektoren velges avhengig av vertscellene som er utsett for transformasjon. Eksempler på egnede verter er mikroorganismer som er fri for eller fattige i restriksjonsenzymer eller modifikasjonsenzymer som gjær, for eksempel Saccharomyces cerevisiae, og stammer av bakterier, spesielt stammer av Escherichia coli, for eksempel E. coli X1776, E. coli EB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 eller E. coli K12 stamme 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearo-thermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre, og videre celler av høyere organismer, spesielt etablerte human- eller dyrecellelinjer. De ovenfor nevnte stammer av E. coli, for eksempel E. coli HB101 og E. coli JA221, og videre Saccharomyces cerevisiae, er foretrukket som vertsmikroorganismer.

Prinsipielt er alle vektorer som replikerer og eksprlmerer hybrid-IFN-gener ifølge oppfinnelsen i den valgte vert, egnet. Eksempler på vektorer som er egnet for beskrivelse av hybridinterferongener i en E. coli-stamme, er bakteriofager, for eksempel derivater av "y-bakteriof ager eller plasmider, særlig plasmid ColEl og dets derivater som pMB9, pSF2124, pBR317 eller pBR322. De foretrukne vektorer stammer fra plasmid pBR322. Egnede vektorer inneholder en komplett replikon for et markørgen som muliggjør å velge og å identifisere vertene som er transformert med ekspresjons-plasmidene på basis av et fenotypisk trekk. Egnede markør-gener gir til verten, for eksempel motstandsevne mot tungmetaller, antibiotika og lignende. Videre inneholder foretrukne vektorer foruten replikon- og markørgenregionene, erkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser, slik at hybrid-IFN-genet og hvis hensiktsmessig erkjennelseskontroll-sekvensen kan innføres ved disse seter. Den foretrukne vektor, plasmid pBR322, inneholder et Intakt replikon, markørgener som gir motstandsevne mot tetracyklin og ampicillin (tet<**> og amp<**>) og et antall av unike erkjennelses-seter for restriksjonsendonukleaser, for eksempel Pstl (spalter i amp**-gene t, tet^-genet forbli intakt), BamHI, Hindlll og Sali (alle spalter i tet<R->genet, amp<R->genet forblir intakt), Nrul og EcoRI.

Mange ekprimeringskontrollsekvenser kan benyttes for regulering av geneksprimering. Spesielt benyttes eksprimeringskontrollsekvenser av høyeksprimerte gener av verten som skal transformeres. I tilfelle av pBR322 som hybridvektor og E. coli som vertsmikroorganismer, for eksempel eksprimeringskontrollsekvenser (som blant annet inneholder promoteren og ribosomal-bindesetet) av laktoseoperon, tryptofanoperon, arabinoseoperon og lignende, er e-laktamase-genet, den tilsvarende sekvens av fag y N-genet, eller fag fd-coat proteingenet og andre.

Mens plasmidet pBR322 allerede inneholder promoteren av p—laktamasegenet (p<->lac-genet), må de andre eksprimeringskontrollsekvenser innføres i plasmidet.

Vektorer som er egnet for replikering og eksprimering i gjær, inneholder en gjærreplikasjonsstart og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridvektorer som inneholder en gjærreplikasjonsstart, for eksempel kromosomal autonom repliker-ende segment (ars), holdt tilbake ekstrakromosomalt inne i gjærcellen efter transformering, og replikeres autonomt. Videre kan hybridvektorer som inneholder sekvenser som er homologt til gjær 2^-plasmid DNA brukes. Slike hybridvektorer vil bli integrert ved rekombinering inn i 2>i-plasmider som allerede eksisterende inne i cellen, eller replikere autonomt. 2p-sekvenser er spesielt egnet for plasmider i en høy transformeringssekvens, og muliggjør høye kopitall. Foretrukne gjærvektorer er plasmid pJDB207.

Egnede markørgener for gjær er spesielt de som gir verten antibiotisk motstandsevne eller i tilfelle auksotropisk gjærmutanter, gener som komplementerer vertlesjoner. Tilsvarende gener gir for eksempel motstandsevne mot antibiotikumet cykloheksimid eller tilveiebringer protrofi i en auksotropisk gjærmutant, for eksempel URA3, LEU2, HIS3 eller spesielt TRPl-genet. Gjærhybridvektorene inneholder videre fortrinnsvis en replikasjonsstart og et markørgen for en materiell vert, spesielt E. coli, således at konstruksjonen og kloning av hybridvektorene og deres mellomprodukter kan finne sted i en bakteriell vert.

Eksprimeringskontrollsekvenser som er egnet for eksprimering i gjær er for eksempel de av høyeksprimerte gjærgener. Således kan promoterene av TRPl-genet, ADHI eller ADHII-genet, syrefosfatase (PH03 eller PH05)-genet, isocytokromgen eller en promoter involvert med en glykolytisk vei, som promoteren av enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (GAPDE), 3-fosfoglycerase-kinase (PKG), heksokinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, fosfoglycerat-mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinasegener, benyttes. Foretrukne vektorer ifølge oppfinnelsen inneholder promotere med transkripsjonen kontroll, for eksempel promotere av PH05-, ADHII- og GAPDH-gener, som kan "skrues" på eller av, alt efter vekstbetingelsene. For eksempel kan PH05-promotere undertrykkes eller frempresses ved kun å øke eller redusere konsentrasjonen av uorganisk fosfat i mediet. Promotere for bruk i mammaeceller er for eksempel virale promotere, HTLV, SV40, vaccinia promotere og lignende.

Promoteren er operativt bundet til koderegionen for derved å sikre effektiv eksprimering av hybridinterferonet. I en utførelse ifølge oppfinnelsen er promoteren direkte bundet til koderegionen for hybrid IFN med translasjonsstartsignal (ATG) innskutt ved forbindelsen. Et foretrukket område for å forbinde promoteren til hybrid IFN-koderegionen er mellom hoved mRNA-start og ATG for genet som naturlig er forbundet til promoteren.

Ifølge en annen utførelsesform av oppfinnelsen, spesielt hvis gjær benyttes som vertsmikroorganisme, blir en signalsekvens innarbeidet i konstruksjonen. Egnede signalsekvenser er de som naturlig er bundet til den benyttede promoter. For eksempel kan PH05-signalsekvensen, videre signalsekvensen for gjærinvertase eller a—faktorgenet benyttes. De kombinasjoner er foretrukket som muliggjør en nøyaktig spalting mellom signalsekvensen og den modne hybrid-IFN-aminosyresekvens. Tilleggssekvenser som pro- eller spacer-sekvenser som eventuelt kan være spesielle prosess-signaler, kan også inkluderes i konstruksjonen for å muliggjøre nøyaktige prosesser av forløpermolekyler. Alternativt kan sammenbundne proteiner dannes med interne prosess-signaler, noe som muliggjør god modning in vivo eller in vitro.

Videre omfatter hybridvektorene ifølge oppfinnelsen også 3'-flankesekvensen av et gen som inneholder de riktige signaler for transkripsjonsterminering og polyadenylering. Egnede 3'-flankesekvenser er for eksempel de for genet som naturlig er bundet til den anvendte promoter. Der gjær benyttes som vertsmikroorganisme og PH05-promoteren benyttes som eksprime-ringskontrollsekvens, er 3'-flankesekvensen fortrinnsvis den for PH05-genet.

I en foretrukket utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse hybridvektorer som er i stand til replikering og fenotypisk selektering i en vertsstamme omfattende en promoter og en DNA-sekvens som koder det hvilket som helst av de nye hybridinterferoner, idet DNA-sekvensen er plassert sammen med transkripsjonsstart og termineringssignaler så vel som translasjonsstart og stoppsignaler i nevnte hybridvektorer under kontroll av nevnte promoter, således at den i en transformert vert er eksprimert til å produsere et hybridinterferon ifølge oppfinnelsen.

Hybridvektorene ifølge oppfinnelsen kan produseres ved in-vitro-ligering av egnede segmenter av LylFN—a—2- og LylFN—a—3-kodende regioner, og innføring av det resulterende hybrid-IFN-genet i en egnet vektor, eller ved ligering av et spesielt IFN-DNA-segment til et lineært vektor-DNA som allerede inneholder gjenværende seksjoner på en slik måte at det dannes gener som koder for det ønskede hybridinterferon. Det er foretrukket at DNA-segmentet som donerer amino-terminale sluttsekvenser allerede er bundet sammen til eksprimeringskontrollsekvensen.

Egnede segmenter av de LyIFN-a-2- og LyIFN-a-3-kodende regionene er spesielt tatt fra de foretrukne startvektorer ifølge oppfinnelsen, det vil si pBR322 avledede plasmider pAM2 og pAM21. Plasmidet pAM2 inneholder et Hindlll-Pstl-innskudd med den LylFN—a—3-kodende region under kontroll av 3-laktamase-promoteren. Vektordelen av plasmidet pAM2 er motstandsdyktig mot PvuII. Plasmidet pAM21 inneholder et Hindlll-Pstl-innskudd med den LylFN—a—2-kodende region med et enestående PvuII-sete ved posisjon 92 og er under kontroll av p-laktamase-promoteren. Vektordelen av plasmidet p21 er likeledes resistent overfor PvuII.

Spesielt fremstilles genet som koder for hybridinterferon-"B1B2B3D4" ved å ligere det store Pstl-PvuII-fragment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM21, og det lille Sau3A-PstI-fragment av plasmid pAM2. Denne konstruksjon resulterer I et plasmid (pJC344) inneholdende den hybridinterferonen "B1B2D3B4"-kodende region under kontroll av p-laktamase-promotere. På tilsvarende måte fremstilles gener som koder for hybridinterferon, "B1B2D3B4" med ligering av det store PvuII-Pstl-fragment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM2 og det lille Sau3A-Psti-fragment av plasmid pAM21. Denne konstruksjon resulterer i en plasmid (pJC342) inneholdende den hybrIdinterferon-"BiB2D3B4"~kodende region under kontroll av e-laktamase-promoteren. Gener som koder for hybridinterferon-"B1D2D3D4" kan fremstilles ved å ligere det lille Hindlll-Sau3A-segment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM2 og det store PvuII-HindiII-fragment av plasmid pAM2. Denne konstruksjon resulterer I et plasmid (pAM94) inneholdende den hybridinterferon-"BiD2D3D4"-kodende region under kontroll av p<->laktamase-promoteren. Analogt fremstilles genet som koder for hybridinterferon-"BiD2B3B4" ved ligering av det lille HindiII-Sau3A-fragment av plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment av plasmid pAM2 og det store PvuII-HindiII-fragment av plasmid pAM21. Denne konstruksjon resulterer i plasmid (pAM90) inneholdende den hybridinterferon-"BiD2B3B4"-kodende region under kontroll av p-laktamase-promoteren. Plasmider inneholdende den hybride interferon "B1D2B3D4"-kodende region (for eksempel plasmid pDM2) kan fremstilles på lignende måte. Disse plasmider er egnet for replikering og eksprimering av hybrid-IFN-gener i E. coli. Hvis ønsket, kan DNA-innskuddet som koder for et hvilket som helst av de nevnte hybridinterferonene skjæres ut fra det tilsvarende plasmid og innføre i en annen vektor-DNA. På denne måte kan det oppnås plasmider inneholdende den hybridinterferon-kodende region under kontroll av en promoter som er forskjellig fra 3-laktamase-promoteren og/eller tillater genet å gli eksprimert i en vert forskjellig fra E. coli.

Fremstillingen av DNA omfattende det strukturelle genet for et hvilket som helst av de nevnte hybridinterferoner kan også utføres ved hjelp av kjemisk syntese. Egnede metoder for syntese av DNA er blitt gitt i summarisk form av S.A. Narang ["Tetrahedron", 39, 3 (1983)]. De kjente synteseteknikker muliggjør fremstilling av polynukleotider opp mot 20-baser i lengde i godt utbytte med høy renhet og i løpet av relativt kort tid. Egnede beskyttede nukleotider er forbundet med hverandre ved fosfodiestermetoden [K.L. Agarwal et al., "Angew. Chem.", 84. 489 (1972)], eller mer effektivt fosfotriestermetoden [C.B. Reese, "Tetrahedron", 34. 3143

(1972)] eller fosfitt-triestermetoden [R.L. Letsinger et al., "J. Am. Chem. Soc", 98, 3655 (1976)]. Forenkling av syntesen av oligonukleotider og polynukleotider er gjort mulig ved fastfasemetoden, der nukleotidkjedene er bundet til en egnet polymer. Itakura et al., ["J. Am. Chem. Soc", 103. 706

(1981)] benyttes trinukleotider forbundet ved fosfotriestermetoden i fastfasesyntesen, i stedet for individuelle nukleotider, og disse kan således kondenseres hurtig og med godt utbytte for for eksempel å gi et polynukleotid med 31 baser. Det aktuelle dobbeltstrengede DNA kan bygges opp enzymatisk fra kjemisk fremstilte kortsegmenter. For disse benytter Khorana et al. ["J. Biol. Chem.", 251, 565 (1976)] overlappende polynukleotidsekvenser fra begge DNA-strenger som holdes sammen i riktig arrangement ved baseparring, og som derefter forbindes kjemisk av enzymet DNA-llgase. En annen mulighet er inkubering i hvert tilfelle av en nukleo-tidsekvens fra de to DNA-strenger med et kort overlappings-segment i nærvær av de fire nødvendige deoksynukleosid-trifosfater med et DNA-polymerase, for eksempel DNA-polymerase I, et Klenow-fragment av polymerase I eller T4-DNA-polymerase, eller med AMV (avian myeloblastosis virus), revers transkriptase. De to polynukleotidsekvenser er derved holdt sammen på riktig måte ved baseparring, og er supplementert med de nødvendige nukleotider av enzymet for å gi en komplett dobbeltstrenget DNA [S.A. Narang et al., "Anal. Biochem.", 121, 356 (1982)]. Itakura et al. ["J. Biol. Chem.", 257. 9226 (1982)] omtaler hvordan, på basis av dette prinsippet, et segment på 132 basepar av det humane leukocytt interferon c<2-gen kan bygges inn i nærvær av DNA-polymerase I (Klenow-fragment) fra 4 kjemisk syntetiserte fragmenter med lengde 39 til 42 baser, det oppnås en 4056 innsparing i kjemisk syntese sammenlignet med metoden som benytter bare ligase. En egnet fremgangsmåte for fremstilling av DNA ifølge oppfinnelsen er omtalt for eksempel i EP-søknad 146 785.

Det kjemisk syntetiserte DNA som omfatter det strukturelle gen for ethvert av hybridinterferonene Ifølge oppfinnelsen kan innføres inn i en vektor-DNA inneholdende en ekspri-meringskontrollsekvens på en måte at eksprlmeringskontroll-sekvensene regulerer genets eksprimering.

2. Transformering av vertsceller.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en transformert vert som omfatter transformering av en vert ved en eksprimeringsvektor inneholdende en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst av hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen, og er regulert av en eksprimerings-kontrollsekvens.

Eksempler på egnede verter er de ovenfor nevnte mikroorganismer som stammer av Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis og Escherichia coli. Transformeringen med eksprime-ringsplasmidene ifølge oppfinnelsen utføres for eksempel som angitt i litteraturen, således for S. cerevisiae [A. Hinnen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 75, 1929 (1978)], B. subtilis [Anagnostopoulos et al., "J. Bacterio.", 81, 741

(1961)] og E. coli [M. Mendel et al., "J. Mol. Biol.", 53> 159 (1970)].

Følgelig omfatter transformeringsprosedyren for E. coli-celler Ca^<+->forbehandling av cellen for å muliggjøre DNA-opptak, og inkubering med hybridvektoren. Cellene overfører til et selektivt vekstmedium som muliggjør separering av de transformerte celler fra opphavscellene. Celler som Ikke Inneholder vektoren vil ikke overleve i et slikt medium. Transformeringen av gjær omfatter for eksempel trinnene (1) enzymatisk fjerning av gjærcelleveggen ved hjelp av glukosidaser, (2) behandling av de oppnådde sferoplaster med vektoren i nærvær av polyetylenglykol og Ca<2+->ioner, og (3) regenerering av cellevegger ved å innleire sferoplastene

i agar.

Fortrinnsvis fremstilles regenereringsagaren på en måte som muliggjør regenerering og selektering av de transformerte celler samtidig.

3. Dyrking av de transformerte vertsceller og Isolering av

det uttrykte hvbridinterferon.

Ved fremgangsmåten for fremstilling av hybridinterferonene med formel I-VI der vertscellene er transformert med en hybridvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst av de nevnte hybridinterferoner, dyrkes og hybridinterferonet isoleres.

De transformerte vertsceller dyrkes på i og for seg kjent måte i et væskemedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter.

Forskjellige karbonkilder kan benyttes for dyrking av de transformerte verter ifølge oppfinnelsen. Eksempler på foretrukne kilder for karbon er assimilerbare karbohydrater som glukose, maltose, mannitol eller laktose, eller et acetat som kan benyttes enten per se eller i en egnet blanding. Eksempler på egnede kilder for nitrogen er aminosyrer som casaminosyrer, peptider og proteiner, og deres nedbrytnings-produkter som trypton, pepton eller kjøttbuljonger, og videre gjærekstrakter, maltekstrakter og også ammoniumsalter, for eksempel ammoniumklorid, sulfat eller nitrat, som kan benyttes enten per se eller i egnet blanding. Uorganiske salter som også kan benyttes er for eksempel sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium.

Mediet inneholder videre for eksempel vekstfremmende stoffer som sporelementer, for eksempel jern, sink, mangan og lignende, og fortrinnsvis stoffer som utøver seleksjonstrykk og hindrer vekst av celler som har mistet sitt eksprimeringsplasmid. Således settes for eksempel ampicillin til mediet hvis eksprimeringsplasmidet inneholder en amp^-gen. Slik tilsetning av antibiotiske stoffer har også den effekt at fourensende antibiotisk følsomme mikroorganismer ødelegges. Hvis en gjærstamme som er auksotropisk når det gjelder for eksempel en vesentlig aminosyre, benyttes som vertsmikroorganisme, Inneholder plasmidet fortrinnsvis med en gen som koder for et enzym som komplementerer vertseffekten. Dyrkingen av gjærstammen utføres i et minimal medium som er fattig på nevnte aminosyre.

Dyrkingen gjennomføres ved i og for seg kjente fremgangs-måter. Dyrkingsbetingelser som temperatur, pH-verdi av mediet og fermenteringstid velges slik at det oppnås en maksimum-titer av hybridinterf eron. Således dyrkes en E. coli eller gjærstamme fortrinnsvis under aerobe betingelser, ved submerged kultur ved rysting eller omrøring ved en temperatur på 20 til 40°C, fortrinnsvis ca. 30°C og en pH-verdi på 4 til 8, fortrinnsvis ved ca. pH 7, i 4 til 30 timer, fortrinnsvis inntil det er oppnådd maksimalt utbytte av hybridinterferonet.

Det er overraskende funnet at de maksimale titere av hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen, for eksempel av hybridinterferonene "B1D2D3B4" > "B1D2B3D4", "B1D2D3<D>4<H> og "B^D2B3B4", kan oppnås i råekstrakter av for eksempel transformert gjær som er dyrket under standardbetingelser som klart er høyere enn de for interferon-a-2 og hybridinterferonene "B1B2D3D4" og "DiD2B3B4" som er nær beslektet med hybridinterferonene "BD" og "DB", omtalt i US-PS 4 414 150. Når celledensiteten har nådd en tilstrekkelig verdi, avbrytes dyrkingen og hybridinterferonene frigjøres av vertscellene. For dette formål ødelegges cellene, for eksempel ved behandling med en detergent som SDS eller triton, eller lyseres med lysozym eller et tilsvarende virkende enzym. Hvis gjær benyttes som vertsmikroorganisme, kan celleveggen fjernes ved enzymatisk fermentering med en glukosidase. Alternativt eller i tillegg kan det benyttes mekaniske krefter som skjærkrefter (for eksempel X-press, French-press, Dyno-mill) eller rysting, eller aluminiumoksyd, eller alternerende frysing, for eksempel i flytende nitrogen, og tining, for eksempel ved 30 til 40°C, så vel som ultralyd, for å bryte ned cellene. Den resulterende blanding som inneholder proteiner, nukleinsyre og andre cellebestanddeler, er anriket på proteiner inkludert hybridinterferon på i og for seg kjent måte, efter sentrifugering. Således fjernes for eksempel det meste av ikke-proteinbestanddelene ved poly-etylen-iminbehandling og proteinene inkludert hybridinterferon, felles ut, for eksempel ved metning av oppløsningen med ammoniumsulfat eller med andre salter. Bakterielle proteiner kan også felles ut ved surgjøring med eddiksyre (for eksempel 0, 1%, pH 4-5). Ytterligere rensing omfatter for eksempel ultraf11trering, diafiltrering, elektroforese, kromatografiske prosesser som ionebyttekromatografi, størrelsesutelukkelseskromatografi, HPLC, omvendt fase HPLC og lignende, separering av bestanddelene i blandingene efter molekylstørrelse ved hjelp av en egnet Sephadex-kolonne, dialyse, affinitetskromatografi, for eksempel antistoff-, spesielt monoklonalt antistoff-, affinitetskromatografi, samt andre kjente prosesser, spesielt de som er kjent i teknikkens stand.

Overraskende har hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen høyere termostabiliteter enn interferon LyIFN-a-2 og hybridinterferon "B1B2D3D4". Således er den temperatur ved hvilken 5056 av den antivirale aktivitet er tapt (temperatur-økning av IFN-oppløsninger ved l°C/min. ) 62,8,,C i tilfelle LylFN—a—2 og 63°C 1 tilfelle' hybridinterferon "B1B2D3D4"> mens de tilsvarende verdier for, for eksempel hybridinterferonene "B1D2D3D4", "B1D2B3B4", "B1D2B3D4'<1> og "B1D2D3B4" er 65'C, 64,7°C, 65,3°C og 64,2°C.

Biologiske egenskaper for hybridinterferonene og farmasøy-tiske formuleringer.

Hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen har interessante biologiske egenskaper som kvalifiserer dem som verdifulle farmasøytika.

Hybridinterferonene som fremstilles Ifølge oppfinnelsen utmerker seg ved en meget potent antiviral aktivitet på mammaeceller, som bovin- og spesielt humane celler. Således er antiviral-titerene, bestemt som reduksjon av cytopatisk effekt ifølge S. Rubinstein et al., ["J. Virol.", 37, 755

(1981)] med vesikulaere stomatitis virus (VSV) som utfordrende virus på bovin-(MDBK)- og humane-(WISH)-celler som følger: Som det vises, er den antivirale virkning av hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen ikke bundet til humane celler, men er uvariabel interspesifikk. Følgelig er de antivirale aktiviteter for hybridinterferonene "B1D2D3D4", "B1D2B3B4", "B1B2D3B4", "B1D2D3D4" og "B1B2B3D4" på humane celler sammenlignbare i størrelsesorden med de av hovedinterferonene a-2 og hybridinterferonen "B1B2D3D4" som er nær beslektet med hybridinterferonet "BD" som er omtalt i US-PS 4 414 150, men er tydelig overlegen den til opphavsinterferon a-3 (med faktor 10-30) og den til referansehybridinterferon "D1D2B3B4"

(med faktoren 230-600).

Bortsett fra den generelle antivirale aktivitet på humane celler, gir hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen grunn til en mer spesifikk respons på målceller. Således induseres forskjellige intracellulære enzymer ved interferon virkning. Blant disse enzymer er (2'-5')-oligoisoadenylat-syntetase ("2—5 A-syntetase") som genererer (2<*>5') bundne oligonukleotider, og disse på sin side aktiverer en latent endoribonu-klease som spalter viral mRNA. Det er overraskende funnet at hybridinterferonen ifølge oppfinnelsen som "B1D2D3D4", "B1D2B3<B>4", "B1B2B3D4" og "BJB2D3B4" er spesielt aktive induserere av 2-5 A-syntetaseaktivitet i humane celler. Således gir ved IO<3> enheter/ml, hybridinterferoner "B1D2D3D4", "B1D2B3B4"> " B1B2* 3V/ l" og "B1B2D3D4" henholdsvis 17,5 ganger, 11,4 ganger, 8,5 ganger og 9,6 ganger økning i 2-5 A-syntetaseaktivitet i Daudi-celler, sammenlignet med en 5,6-, 3,9-, 4,0- eller 4,3-ganger økning på virkningen av henholdsvis hovedinterferon a—2 og a—3 og referansehybrid-interferonene "B1B2D3D4" og "D1D2B3B4".

Videre viser interferonene ifølge oppfinnelsen antiproliferative virkninger. Den antiproliferative virkning kan benyttes som følger: interferon-holdige oppløsninger inkuberes med 5*IO<4> Daudi-celler pr. ml i 2 ml RPMI-medium inneholdende 10% føtalt kalveserum. Cellemultiplikeringen bestemmes efter 3 dagers inkubering ved å telle levedyktige celler i et hemocytometer idet det anvendes tryptanblått-eksklusjonsprøven. Således er den konsentrasjon av hybridinterf eron "B1D2B3B4", "B1B2B3D4", "B1B2D3B4" og "B1D2B3D4" og "B1D2D3B4" som er nødvendige for å indusere en 50% inhibering av Daudi-cellemultiplikeringen henholdsvis ca. 4, 4, 1,3, 1,3, 4 og 4 enheter/ml, altså omtrent ekvivalent med hovedinterferon a-2 og referansehybridinterferon "B1B2D3D4"

(ca. 1,3 enheter/ml) og overlegen i forhold hovedinterferon a—3 (ca. 20 enheter/ml) og referansehybridinterferon "D1D2B3B4" (ca. 400 enheter/ml).

Den antiproliferative aktivitet mot human kreft kan også vises in vivo. Således er forskjellige typer kreft av human opprinnelse, som kreft i bryst, lunge, ovarie og melanoma blitt frembragt i nakne mus. Små fragmenter av de frembragte tumorer isoleres og implanteres ved trochar under venal-kapselen av (Balb/c x DBA/2)F^ (CDFj) mus. IFN administreres lntramuskulært i to daglige doser på fra 5* IO5 til 5*IO<7 >IU/kg/Injeksjon ved dag 1 til 5 (dag av administrering: dag 0). Ved dag 6 avlives dyrene, den endelige tumorstørrelse måles og sammenlignes til begynnende tumorstørrelse (før IFN-behandllng), og til tumorstørrelsen i ubehandlede kontroll-mus. Ved behandling med hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen, for eksempel "B1D2D3D4" og "B1B2D3B4", iakttas en betraktelig og tydelig hindring av tumorvekst, og delvis regresjon av tumoren. Overraskende er den antiproliferative aktivitet av hybridinterferonene overlegen til denne av opphavsinterferonene a—2 og a-3, så vel som til den av hybridinterferon-"B1B2D3D4" og -,,D1D2B3B4" .

Den antivirale og antiproliferative egenskap av hybridinterferon som fremstilles ifølge oppfinnelsen gjør disse polypeptider anvendelige for å behandle virale infeksjoner som influensa og andre luftveisvirusinfeksjoner, herpesvirus-infeksjoner, rabies og heptatitisinfeksjoner, og neoplastiske sykdommer, som melanoma, renalkreft, og hårcelleleukemi, i det humane og dyriske legeme, eventuelt i kombinasjon med andre antivirale eller antitumorstoffer, fortrinnsvis i form av farmasøytiske preparater som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av det aktive stoff, eventuelt sammen med eller i blanding med uorganiske eller organiske, faste eller flytende farmasøytisk godtagbare bærere som er egnet for parenteral administrering.

Parenterale formuleringer er spesielt injiserbare væsker som kan anvendes på mange måter som intravenøst, lntramuskulært, lntraperitonealt, lntranasalt, Intradermalt eller subkutant. Slike væsker er fortrinnsvis isotonisk vandige oppløsninger eller suspensjoner som kan fremstilles før bruk, for eksempel fra lyofiliserte preparater som inneholder det aktive stoff alene eller sammen med farmasøytisk godtagbare bærere. De farmasøytiske preparater kan steriliseres og/eller inneholde tilsetninger, for eksempel konserveringsmidler, stabili-seringsmidler, fuktestoffer og/eller emulgatorer, oppløs-ningsformidlere, salter for regulering av det osmotiske trykk og/eller buffere. De farmasøytiske preparater som hvis ønsket kan inneholde ytterligere farmasøytiske verdifulle stoffer, fremstilles på i og for seg kjent måte, eksempelvis ved hjelp av vanlig oppløsning i lyofiliseringsprosesser og inneholder fra 0,1* til 100*, spesielt fra 1* til 50*, og i tilfelle av lyofilisater, opp til 100* av det aktive stoff. Det er verdt å merke seg at hybridinterferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, for eksempel "B1D2D3D4", kan lyofiliseres og gjenoppløses uten aktivitetstap. I motsetning til dette gir lyofiliserte preparater av parenterale interferoner a-2 og a—2 uklare oppløsninger med en merkbar nedgang av aktiviteten. Sistnevnte interferon kan derfor bare lagres i bufrede oppløsninger.

Farmasøytiske blandinger fremstilles ved at en farmakologisk aktiv forbindelse, fremstilt ifølge oppfinnelsen, blandes med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Den aktuelle administrering og dosering velges av legen avhengig av pasientens tilstand, sykdommen og sykdomsstyrken. For eksempel behandles virale infeksjoner vanligvis ved en eller to daglige doser over få dager til få uker, mens behandling av neoplasmer typisk involverer daglige eller multidaglige doser over uker eller måneder. Samme daglige dosisnivå, det vil sl ca. IO<6> til IO<7> enheter som benyttes i vanlig interferonterapi kan anvendes.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Forkortelser benyttet i eksemplene:

DTT 1,4-ditiotreitol

TNE oppløsning inneholdende 50 mM Tris*HCl, pE 7,5,

100 mM NaCl, 2 mM EDTA.

Tris tris-(hydroksymetyl)-aminometan

EDTA etylendiamintetraeddiksyre

TE oppløsning inneholdende 100 mM Tris, 50 pm EDTA, N-medium inneholder Bacto-trypton (20 g Difco), gjær-ekstrakt (1 g Difco), glukose (lg), NaCl (8 g),

CaCl2'2E20 (249 mg) pr. 1 oppløsning

TBE oppløsning inneholdende 89 mM tris, 89 mM

borsyre, 2 mm EDTA,

BSA bovinserumalbumin,

HAT hypoxantin/aminopterin/tymldin,

lg immunoglobulin,

IU internasjonale enheter (for interferonaktivi-teten)

MAb monoklonalt antistoff,

PBS fosfatbufret saltoppløsning,

SDS-PAGE natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel, elektroforese.

Del I: Konstruksjon og kloning av interferon cx—2/cx—3-hvbrider 1 Escherichia coli

Alle hybridinterferon-proteinkodende sekvenser som er omtalt nedenfor er blitt operativt bundet til p-laktamase-promoter, klonet inn i et pBR322-derivert eksprimeringsplasmid og transformert i E. coli HB101.

Eksempel 1: Konstruksjon av PvuII-resistente vektorer som har DNA-sekvenser av lymfoblastoidet IFN—a—2 og

-a-3.

pBR322 kuttes ved PvuII (Biolabs) og det lineære DNA ligeres til en (<32>P)-BclI-linker [d(ATGTGTGATCACACAT) syntetisert ved fastfase fosfotriestermetoden, se H. Rink et al., "Nucleic Acids Research", 12, 6369 (1984)] som følger: Det kuttede plasmid DNA (1 jjg, ca. 0,7 pmol ender) ligeres til <32>P-merket Bcll-linker DNA (ca. 30 pmol ender) i 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 20 mM Tris'HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2. 10 mM DTT, 0,5 mM rATP og 40 U/pl T4 DNA-ligase (Biolabs). Efter Inkubering i 2-3 timer ved 15°C, ekstraheres

den vandige fase med et ekvivalent volum av fenol:kloroform og DNA felles ut ved tilsetning av 1/9 volum 10x TNE, 2,5 volumer etanol og holdes over natten ved -20°C. DNA-pelleten ble suspendert i 50 pl TE, pH 8,0, og sentrifugert gjennom en 5-23* sukrosegradient (50 mM Tris-HCl, pH 8,1/1 mM EDTA) i en Kontron TST 60-rotor i 4 timer ved 58 000 o/min. ved 15°C. Gradienten fraksjoneres fra toppen til bunnen, og radioaktiviteten i hver fraksjon bestemmes ved Cerenkov-telling. Fraksjoner av interesse merkes, og DNA felles ut med TNE og etanol. DNA-pelleten resuspenderes i restriksjonsbuffer, og digereres mot BC1I og felles ut igjen efter ekstrahering av den vandige fase med fenol:kloroform. Denne lineære DNA resirkuleres derefter med en konsentrasjon på 5 pg/ml under betingelsene identiske for de beskrevet for linker-ligering.

Den ligerte DNA kuttes med enzymene Hindlll, PvuII (for å eliminere gjenværende intakt pBR322) og Pstl og Hindlll-Pstl store fragment (3600 bp + linker) inneholdende replikerings-opprinnelsen og amp<R->genet, isoleres ved sukrosegradientsentrifugering.

Hindlll-Pstl innskudd fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 (1160 bp) og fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 (1020 bp) (EP-søknad 76 489) oppnådd ved sukrosegradientsentrlfugering er hver ligert inn i det ovenfor fremstilte DNA, noe som resulterte i plasmider pAM4 og pAM2, inneholdende LyIFN-a-2- og LyIFN-cx-3-kodende regioner under kontroll av p<->laktamase-promotere.

Ligert DNA benyttes direkte for transformering av kompetent E. coli som følger: DNA-ligeringsblandingen (eller fraksjoner av den) overføres i 150 pl 15 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaClg, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA og 50 pl CaCl2-behandlede mottager E. coli HB101 tilsettes. Blandingen holdes ved 0°C i 10 minutter og overføres derefter til 42°C i 2 minutter, og efter avkjøling til romtemperatur tilsettes 1 ml N-medium. Inkuberingen fortsettes ved 37 "C i 1 time (shakerplattform, 250 opm) hvorefter 600 pl bringes på McConkey-agar (Difco) inneholdende tetracyklin (10 pg/ml). Petri-skålene inkuberes ved 37°C i 16-18 timer slik at bakterielle kolonier kan observeres.

Plasmid-DNA oppnås fra transformantene ved følgende prosedyre: 10 ml N-medium inneholdende tetracyklin (10 pg/ml) inokuleres med en transformantkoloni hver, og kulturene rystes ved 37°C (rysteplattform, 150-300 opm) inntil de har nådd en optisk densitet på 0,9-1,1 (650 nm). Cellene høstes og resuspenderes i et ekvivalent volum av N-medium inneholdende tetracyklin (10 pg/ml) og kloramfenikol (80 pg/ml). Inkuberingen fortsettes ved 37°C i ytterligere 18 timer for å forsterke antallet av plasmidkopier pr. celle. Bakteriene høstes og bakterlepelletene resuspenderes i 50 mM Tris*HCl, pH 8 (10 ml/g fuktig cellevekt), og lysozym (Sigma) tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 2 mg/ml. Efter 10 minutter ved 0°C justeres oppløsningen til 50 mM EDTA, efter 10 minutter ved 0°C tilsettes Triton x 100 ved en sluttkonsentrasjon på 0,8*, og utfellingen holdes ved 0°C i 1 time, efterfulgt av sentrifugering i Sorvall SS-34-rotor i 30 minutter ved 18 000 opm. Efter ekstrahering av det klare overstående med fenol efterfulgt av to ekstraheringer med kloroform, tilsettes RNase A (Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 25 pg/ml, og oppløsningen inkuberes ved 37°C i 1 time. For fjerning av DNA tilsettes NaCl (IM sluttkonsentrasjon) og polyetylenglykol 6000 (7,5* sluttkonsentrasjon) og utfellingen holdes ved -10°C i 2 timer, efterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 10 000 opm og 0°C i en Sorvall SS-34-roter. Pelleten resuspenderes i 200 pl TNE og ekstraheres igjen med fenol:kloroform (1:1) før gjenutfelling (ved tilsetning av 500 pl etanol 5 minutter ved —80°C, 10 minutter Eppendorf-sentrifuge), DNA-pelleten resuspenderes I 20-40 pm av TE. Typiske utbytter som fremkommer fra denne prosedyre er ca. 20 pg plasmid-DNA.

Det fremstilte plasmid DNAs (pAM4 og pAM2) utsettes for restriksjonsenzymanalyse. Strukturen av pAM4 og pAM3 bekreftes.

Eksempel 2: Eliminering av 3'-ekstracistronisk PvuII-sete

fra pAM4.

Til forskjell fra pAM2-(cx-3) inneholder pAM4-(a-2) ennu to PvuII-seter (se figur 3). For å muliggjøre konstruksjonen av hybrid-IFN-gener med PvuII-seter innen IFN-kodende region, elimineres det annet PvuII-setet Innen den ekstracistroniske region.

Denne modifikasjon av plasmid-pAM4 er vesentlig en utelatelse av den 3'-ekstracistroniske IFN—a—2-cDNA-sekvens mellom Pstl og det 3'-ekstracistroniske PvuII-setet (se figur 3). pAM4 fermenteres delvis med PvuII (5 pg pAM4 i 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 enhet/jjg PvuII (Biolabs) tilsettes, fermentering i 5 minutter ved 37°C, stopp ved fenolekstrahering og ligering til (<32>P)-Pstl-linker ("Collaborative Res."-prosedyre som omtalt i eksempel 1). DNA-blandingen transformeres i E. coil HB101 som ovenfor, og plasmidene av 16 kolonier beskyttes ved restriksjonsenzymanalyse Idet det anvendes Pstl, PvuII og Hlndlll i nærvær av en utelatelse som har den korrekte størrelse (246 bp). Av de 16 undersøkte koloniene er tre umodifisert pAM4, en er en multimer, fem har en stor utelatelse (620 bp), syv har den ønskede lille utelatelse (246 bp). En klon med et forkortet IFN-a-2-innskudd (Hindlll-Pstl lite fragment nu 907 bp) velges og betegnes pAM21.

Eksempel 3: Konstruksjon av Pvu-hybrider med kryssoverseter

med aminosyre 92.

Plasmider pAM2-(a-3) og pAM21-(a-2) kuttes begge med Hlndlll og PvuII, noe som resulterer i utskjæring av DNA-fragmenter (521 bp) inneholdende g<->laktamase-promotersekvensene og den N-terminale halvdel av IFN-gener (som koder for aminosyre 1 til 92). De store og små fragmenter (ca. 4 Kb og 521 bp) separeres ved sukrosegradientsentrifugering, og de store fragmenter def osforyleres ved behandling av 1 pg DNA-fragmenter i 50 pl 50 mM Tris, pH 8 med 1 enhet av kalvetarm alkalisk fosfatase pr. 10 pmol 5<*->ender i 30 minutter ved 37"C. Hybrid-IFN "B1B2D3D4"- og -"D1D2B3B4"-gener konstrueres ved ligering av de egnede store og små DNA-fragmenter som omtalt ovenfor [stort HindiII-PvuII-fragment (~4 Kb) fra pAM2, ligert til lite Hindi 11-PvuII-f ragment (521 bp) fra pAM21 resulterte 1 typen "B1B2D3D4 "-IFN, og så videre). Ligeringen utføres i 10 pl volum inneholdende 20 mM Tris'HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl, 10 mM DTT, 0,5 mM r ATP, 40 enheter/pl, T4-DNA-ligase (Biolabs) og omtrent 500 ng av store DNA-f ragmenter og 20-40 ng av små DNA-f ragmenter. Efter 5 timer ved 15"C benyttes 5 pl av 1igeringsblandlngene til å transformere E. coli HB101 som ovenfor, noe som gir ca. 1000 transformerte kolonier hver. Tre kolonier ble tatt opp, deres plasmid-DNA isolert, og analysert med enzymene Hlndlll, PvuII, EcoRl, Tagl og Pstl. To kolonier som huser plasmid-DNA av den ønskede struktur [pAM27 ("B1B2D3D4") og pAM33 ("D1D2B3B4")], velges ut.

Eksempel 4: Konstruksjon av hybrid-IFN-gener krysset over

ved aminosyre 150.

Plasmidet pAM2-(cx—3) og pAM21-(a—2) fermenteres hver med PvuII og Pstl. DNA-fragmentet separeres ved sukrosegradientsentrifugering i PvuII-Pstl store fragmenter (ca. 4 Kb som koder de N-terminale 92 aminosyrer av IFN—a—2 og —cx—3) og PvuII-Pstl små fragmenter (lengde 386 og 495 bp koder C-termini av IFN-cx-2 og -cx-3). I et andre trinn <32>P-merkes de rensede PvuII-Pstl små fragmenter fra pAM2 og pAM21 som følger: DNA-fragmentene (~ 1 pg) oppløses i 50 pl 50 mM Tris'HCl, pH 8,0 og defosforyleres ved behandling med 1 U/10 pmol 5'-ender alkalisk fosfatase i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inakti-veres ved inkubering i 1 time ved 65° C, og DNA renses ved adsorpsjon og eluering fra DEAE-cellulose og felles ut i etanol. Dette DNA fosforyleres i et 20 pl reaksjonsvolum inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 9,5/10 mM MgCl2/(5 mM DTT, 30-40 pl lyofilisert -y-(<32>P)-ATP (Amersham, 6000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) og 0,5 U/pl T4-kinase (P.L. Biochem.). Efter 20 minutter ved 37°C stoppes reaksjonen ved tilsetning av EDTA til 10 mM. Et overskudd (~ 4 pg) av tilsvarende ubehandlet DNA-fragment tilsettes derefter, og oppløsningen ekstraheres med fenol og kloroform. DNA separeres fra gjenværende -Y-(<32>P)-ATP ved kromatografi gjennom Sephadex G-50 i TNE. De utelukkede toppfraksjoner, registrert ved Cerenkov-telling, samles og precipiteres med etanol. De <32>P-merkede PvuII-Pstl små fragmenter fermenteres fullstendig med Sau3A, og det kuttede DNA felles ut ved elektroforese i en 6* polyakrylamidgel idet det anvendes TBE som løpende buffer. 4 DNA-fragmenter tilsvarende PvuII-Sau3A (172 bp hver, koder aminosyrene 93 til 150 av IFN-oc-2 og -cx-3) og til Sau3A-PstI (214 bp og 323 bp, koder aminosyrer 151 til 166 av IFN-a-2 og -a-3) isoleres fra gelen.

Ved religering av 3 egnede fragmenter (se tabell 2) utvikles det 4 hybrid-IFN-typer som er krysset over ved aminosyre 150. De tilsvarende plasmider rekonstrueres i en serie trinn: i en første ligeringsreaksjon, ligeres ekvimolare menger av PvuII-Sau3A og Sau3A-PstI-DNA-fragmenter i 10 pl ligeringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM r ATP og 40 enheter/pl T4-DNA-ligase i 3-6 timer ved 15°C noe som resulterer i concatemer DNA). Efter fermentering med PvuII-Pstl og ekstrahering med fenol:kloroform (1:1), tilsettes et overskudd av det passende PvuII-Pstl store fragment (defosforylert: typisk 1 pg av DNA I 50 pl, 50 mM Tris-HCl ved pH 8 (ca. 0,6 pmol 5'-ender) som behandlet med 0,06 enheter av kalvetarmalkalifosfatase i 30 minutter ved 37°C) og DNA ligeres igjen. E. coli HB101 transformeres og 4 kloner med DNA av ønsket struktur som bestemt ved restriksjonsanalyse (PvuII, Sau3A, Taql og EcoRI) plukkes ut. Klonene betegnes E. coli HB101 pJC334, pJC37, pJC342 og pJC344 (se tabell 2).

Tabell 2

Opprinnelse av DNA-fragmenter som er benyttet for konstruksjon av hybrid-IFN krysset over ved aminosyre 150. I parentes er IFN-typen og seksjonen alFN som er kodet på fragmentene, angitt.

Eksempel 5; Konstruksjon av hybrid-IFN-gener krysset over

ved aminosyre 60.

Konstruksjonen av disse hybrid-IFN-gener utføres ved i det vesentlige samme prosedyre som omtalt 1 eksempel 4.

Plasmider pAM2-(a-3) og pAM21-(a-2) kuttes med Hlndlll og PvuII, og fragmentene separeres med sukrosegradientsentrifugering. De Hindll-PvuII små fragmenter (521 bp, inneholdende p-lac-promoterregion og som kodende for de N-terminale 92 aminosyrer av IFN-a—2 og —a—3) <32>P-merkes og fermenteres delvis med Sau3A (0,5 enheter av enzym pr. pg av DNA, 5 minutter ved 37°C, reaksjonsstopp ved fenolekstrahering). Den resulterende blanding av fragmenter gjenoppløses ved elektroforese i 6* polyakrylamidgel, og 4 fragmenter (to 424 bp Hindi 11-Sau3A-f ragmenter og to 97 bp Sau3A-PvuII-fragmenter) ekstraheres fra gelen. Religering av 3 egnede fragmenter av den trinnvise fremgangsmåte som angitt i eksempel 5 (se tabell 3), og transformering i E. coil HB101 resulterer i transformanter bare 2 av de ventede 4 konstruk-sjoner: pAM65 ("D1B2D3D4") og pAM90 ("B1D2B3<B>4").

Tabell 3

Opprinnelse av DNA-fragmenter som benyttes for konstruksjon av to hybrid-IFN-gener som er krysset over ved aminosyre 61. I parentes indikeres IFN-typen og seksjonen av cxIFN som er kodet på fragmentene.

For konstruksjon av de andre to hybrid-IFN-gener som er krysset over ved aminosyre 61, blir plasmidene pAM65 og pAM90 kuttet ved Hlndlll og PvuII, og de små Hindlll-PvuII DNA-fragmenter (521 bp) isolert efter elektroforese i agarose-gelen. Ligering av det Hindlll-PvuII lille fragment av pAM90 med det Hindlll-PvuII store fragment av pAM2 resulterer i pAM94 ("B1D2D3D4") og ligering av det lille Hindlll-PvuII-fragment av pAM65 med det HindiII-PvuII store fragment av pAM21 gir plasmid pAM76 ("D1B2B3B4"). Strukturen av de 4 ovennevnte plasmid-DNA bekreftes av restriksjonsenzymanalyse.

De respektive kloner betegnes som E. coli HB101 pAM65, pAM90, pAM94 og pAM76.

Del II: Konstruksjon og kloning av interferon- ot- 2/ a- 3-hvbrider i Saccharom<y>ces cerevisiae

Alle hybridinterferon-proteinkodende sekvenser som omtales nedenfor er bundet til PH05-promoteren og PH05-transkrip-sjonstermineringssignalene, klonet inn i gjæren 2 p vektor pJDB207, og transformert inn i gjær S. cerevisiae GRF18.

Eksempel 6: Konstruksjon av eksprimeringsplasmid p31RT(A72). Plasmid pJDB207/IF2( 5± )a72 (EP-søknad 100 561 ) fermenteres med Hlndlll og EcoRI og et 470 bp fragment omfattende en karboksyl terminal ende av interf eron-oc-2 og PH05-transkrip-sjonstermineringssignaler isoleres med agarosegel, elektroforese og elektroeluering [R. Yang et al., "Methods Enzym", 68. 176 (1979)] idet det benyttes Micro-Collodion-poser (Sartorius, Gottingen, Tyskland). Plasmid p31R (se EP 100 561) fermenteres med Hlndlll og EcoRI og 4,1 kb vektordelen isoleres idet det benyttes samme teknikk. Efter ligering av 200 ng av vektor og innskyt ing av DNA idet det benyttes E. coli T4-DNA-ligase, og transformering av E. coli HB101 til ampicillin-resistens, isoleres et plasmid kalt p31RT(A72) inneholdende PH05-promoteren, den C-terminale ende av interferon—a—2 og PH05-transkripsjonstermineringssignaler, og dets struktur bekreftes ved restriksjonsanalyse.

Eksempel 7: Konstruksjon av plasmider pJDB207 PH05/IFN

AM 104, AM114 og AM119.

PH05-eksprimeringsplasmid p31RT(A72) (se eksempel 6) fermenteres med EcoRI og Xhol og de frigjorte 3'-ender fylles med dCTP, dGTP, dATP og dTTP idet det brukes et Klenow-fragment av DNA-polymerase I av E. coli. De stumpe ender blir derefter defosforylert med bakteriell alkalisk fosfatase. Plasmider pJC334, pAM90 og pJC337 (eksempel 4 og 5) fermenteres med Taql (pJC334 og pAM90) eller ved Taql og EcoRI (pJC337) og de 3'-frigjorte ender fylles med de tilsvarende deoksynukleotider som beskrevet ovenfor. DNA-fragmenter på omtrent 560 basepar isoleres ved agarosegelelektroforese og elektroeluering idet det benyttes Micro-Collodion-poser som ovenfor. Ligering av 200 ng preparert vektordel av plasmid p31RT(A72) og 200 ng eluerte DNA-fragmenter idet det benyttes T4-DNA-ligase og transformering av E. coli HB101 til ampicillinmotstandsdyktighet, gir plasmider p31R/IFN AM104 (inneholdende den hybridinterferon "D1D2D3B4"-kodende sekvens), p31R IFN AM 119 (inneholdende den hybridinterferon "B1D2B3B4"-kodende sekvens) og p31R IFN AMI14 (inneholdende den hybridinterferon "D1D2B3D4"-kodende sekvens). Ved å kutte disse plasmider med BamHI og Hlndlll isoleres et DNA-fragment på omtrent 1300 bp med konfigurasjonen PH05-promoter - IFN-proteinkodende sekvens - PH05-transkriberende terminerings-signal ved agarosegelelektroforese og elektroeluering. Dette fragment er klonet mellom Hlndlll- og BamHI-setene i plasmid pJDB207. Plasmidene er transformert inn i gjærstammen GRF18 til Leu<+> (se EP 100 561, se også eksempel 14). De resulterende kloner gis betegnelsen som S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM104, GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM114 og GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM119.

Eksempel 8: Konstruksjon av plasmid pJDB207 PH05/IFN ÅM129.

Plasmid pAM94 (eksempel 5) kuttes fullstendig med Taql og delvis (i nærvær av 10 ng/ml etidiumbromid) med EcoRI. Et DNA-fragment på ca. 580 bp isoleres ved agarosegelelektroforese og elektroeluering og ligeres til EcoRI- og Xhol-kutt, gel renses og vektordel av plasmid p31RT(A72) (se eksempel 6). Efter transformering av E. coli HB101 til ampicillin-resistens isoleres plasmidet p31R PH05/IFN AM129. Dette plasmid som Inneholder den interferon "B1D2D3D4"-kodende region fermenteres med Hlndlll og BamHI, og 1300 bp DNA-fragmentet ligeres inn i pJDB207 som omtalt 1 eksempel 7. Plasmidet tranformeres inn i gjærstammen GRF 18 som ovenfor. Den oppnådde klon gis betegnelsen S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM129.

Eksempel 9: Konstruksjon av plasmider pJDB207 PH05/IFN

AM106, AM110 og AM112.

Plasmid pJDB207 PH05 IFN/AM104, AM114 og AM129 (se eksempel 7 og 8) fermenteres med BamHI og PvuII og 6,8 Kb vektordelene inneholdende de respektive C-terminale ender av de interferon-kodende regioner isoleres ved agarosegelelektroforese og elektroeluering. Likeledes fermenteres pJDB207T/(oc-2 )A72 (EP-søknad 100 561 ) med BamHI og PvuII og det isoleres et DNA-fragment på 800 bp. Ligering av de tilsvarende fragmenter og transformering av E. coli HB101 gir plasmider pJDB207 PH05/IFN AM106 (inneholdende den hybridinterferon "B1B2B3D4"-kodende region) AM112 (inneholdende den hybridinterferon "B1B2D3B4"-kodende region) og AM110 (inneholdende den hybridinterferon "B1B2D3D4"-kodende region). Gjærstammen GRF18 transformeres som vanlig. De resulterende kloner gis betegnelsen som S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN AM106, pJDB207 PH05/IFN AM112 og pJDB207 PH05/IFN AM110.

Eksempel 10: Konstruksjon av plasmider pJDB207 PH05/IFN DM1

og DM2.

Plasmid pJDB207 PH05/IFN AM119 (eksempel 7) fermenteres med Hindll og Bglll og 7,5 Kb vektordelen inneholdende den N-terminale ende av den interferon-kodende region isoleres med agarosegelelektroforese og elektroeluering. På samme måte fermenteres plasmidene pJDB207 PH05/IFN AM114 og pJDB207/IFN AM104 (se eksempel 7) med de samme enzymer og DNA-fragmentet på ca. 600 bp inneholdende den C-terminale ende av den interferon-kodende region isoleres. De tilsvarende fragmenter ligeres med T4-DNA-ligase. Efter transformering av E. coli HB101 oppnås plasmider pJDB207 PH05/IFN DM1 inneholdende den hybridinterferon "B1D2B3D4"-kodende region, og pJDB207 PH05/IFN DM2 inneholdende den hybridinterferon "B1D2D3B4"-kodende region. Gjærstammen GRF18 transformeres som angitt ovenfor. De resulterende kloner gis betegnelsen som S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM1 og S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM2.

Eksempel 11: Konstruksjon av plasmid pJDB207 PH05/IFN ER143. Plasmid pJDB207R/IF(a-2)a72 (EP-søknad 100 561) fermenteres med BamHI og PvuII og det isoleres et DNA-fragment av 6,8 kb. Likeledes fermenteres plasmid pJDB207R/IFN-(cx-3) (EP 100 561 ) med samme enzymer, og det isoleres et DNA-fragment på 800 bp. Ligering av de to DNA-fragmenter og transformering av E. coli HB101 til ampicillinresistens gir plasmid pJDB207 PH05/IFN HR143 inneholdende den hybridinterferon "D;lD2b3b4"-kodende region. Gjærstamme GRF18 transformeres som ovenfor. De resulterende kloner gis betegnelsen S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN HR143.

Eksempel 12: Transformering av Saccharomyces cerevisiae GRF18

og indusering av interferonproduksjon.

Plasmid pJDB207 PH05/IFN AM129 ("B1D2D3D4") Innføres i Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (a, his, 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can^) analogt det som tidligere er beskrevet. [Hinnen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei USA", 75, 1929 (1978)]. 1 pg av plasmid DNA settes til 100 pl av en sferoplastsuspensjon og blandingen behandles med en polyetylenglykol. Sferoplastene blandes med 10 ml regenereasjons-agar, bringes på gjær-minimalmediumplater uten leucin. Efter inkubering i 3 dager ved 30 "C ble det oppnådd ca. 1000 transformerte celler.

En enkel gjærkoloni fra gjærtransf ormas jonsplatene (kalt Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM129) bringes inn i 10 ml gjær-minimalmedium i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe og dyrkes ved 30°C ved 200 opm i 24 timer til en densitet på ca. 2-3'IO<7> celler/ml. Cellene vaskes en gang med 20 ml av lav-Pi-minimalmedium (som "Difco gjær-minimalmedium uten aminosyre" supplementert med 20 g/l glukose, men fremstilt fra komponentene ifølge reseptoren av Difco (Difco Manual, Difco Lab., Detroit, USA) bortsett fra et 0,03 g/l KH2P04 pluss 1 g/l KC1 benyttes i stedet for 1 g/l KH2P04). 3 ml av de resuspenderte celler ble benyttet for å inokulere 300 ml lav-Pi-minimalmedium og 300 ml normal-minimalmedium i 1000 ml Erlenmeyer-kolber. Inkuberingen gjennomføres ved 30°C og 360 opm. Induksjon av PH05-promoteren efterfølges av måling av begynnende sur fosfataseaktivitet i hele celler som beskrevet [Toh-e et al., "J. Bact.", 113, 727 (1973)]. Cellene dyrkes til ca. 1-2*10<7> celler/ml (26-30 timer inkubering).

Eksempel 13: Fremstilling av gjærcelleekstrakter og bestemmelse av interferontiteren.

Celler fra 300 ml dyrkingsmedium (se eksempel 12) med en densitet på l-2*10<7>/ml samles ved sentrifugering i en Sorvall GSA-rotor i 5 minutter ved 8000 opm ved 4°C. Cellene vaskes en gang med 100 ml H20, suspenderes 1 6 ml iskald lyseringsblanding (0.1M kaliumfosfatbuffer, pH 7,4, 1* (v/v), Triton X-100,0,0001M PMSF (Merck)) og overføres til et 30 ml corex-rør. Suspensjonen sentrifugeres igjen 5 minutter i en Sorvall SS-34-rotor ved 8000 opm ved 4°C og resuspenderes i 3 ml lyseringsblanding ved 0°C. 4 g av glassperler (0,4 mm i diameter) settes til cellene og suspensjonen rystes i en Vortex-mixer (Scientific Instr. Inc., USA) ved full hastighet i 30 sekunder, avkjøles derefter i 1 minutt i et isbad. Denne rysteprosedyren gjentas 5 til 10 ganger inntil mer enn 90* av cellene er brutt ned (kontroll under lysmikroskop). Celle-rester og glassperler fjernes fra oppløsningen ved sentrifugering i 10 minutter ved 8000 opm ved 4°C i en Sorvall HB-4-rotor. Supernatanten overføres til et Eppendorf-rør, fryses i flytende nitrogen og lagres ved —60°C. Interferonaktivitet bestemmes ifølge S. Rubinstein et al. ["J. Virol.", 37, 755

(1981)] til 7-IO<9> enheter/ml celleekstrakt.

Analogt det som er beskrevet i eksempel 12 og 13 transformeres S. cerevisiae-stammer GRF18 med plasmider pJDB207 PH05/IFN AM119 ("B1D2B3B4"), AM106 ("B1B2B3D4"). AM112 ("B1B2D3B4"), DM1 ("B1D2B3D4"), DM2 ("B1D2D3B4"), AM110 ("B1B2D3D4") og HR143 ("D1D2B3B4"). De resulterende stammer dyrkes. Cellene høstes og interferontiterene bestemmes som ovenfor. IFN-titerene er som følger: S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM119: 5'IO<9> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM106: 7'IO<7> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM112: 2'10<8> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM1: 3'IO<9> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM2: 5' IO9 enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM110: 3'10<8> enheter/ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN HR143: 1'10<9> enheter/ml

Under de samme betingelser gir S. cerevisiae stammer GRF18/pJDB207R/IF-(a-2) og /IF-(a-3) (EP 100 561) tltere på henholdsvis 1*10<8> og 3'IO<9> enheter/ml.

Eksempel 14: Produksjon av hybridinterferon "B1D2D3D4" med

transformerte gjærceller i en 30 liters skala. Gjærstammen GRF18 som bærer plasmidet pJDB207 PH05/IFN AM129 som koder for gener for hybridinterferon "B1D2D3D4" nedstrøms fra den sure fosfatasepromoter PH05 strykes på overflaten av en agarkultur av YNB-medium. Platene inkuberes ved 30°C inntil det observeres konfluent vekst. Et sterilt øye benyttes til å overføre en del av overflatekulturen til en rystekolbe Inneholdende pre-kulturmedium IFN/21 Inneholdende:

Kolben på 500 ml har en enkel ledeplate og inneholder 100 ml medium. Mediet fremstilles idet det benyttes deionisert vann og har en pH-verdi på omtrent 6,0. Glukosen steriliseres separat. Efter inokulering inkuberes den første prekultur i 24 timer ved 30°C og en ryster med 5 cm slag ved en hastighet på 250 opm. Den første prekulturkolbe tilveiebringer inokulum for den andre prekulturkolbe. Disse kolber får et inokulum på 1* v/v. Medium og inkubasjonsbetingelser er identisk med de for den første prekultur. Et tilstrekkelig antall kolber fra det andre prekulturtrinn kombineres for å tilveiebringe 1% v/v Inokulum for en 30 liters fermenter (3 kolber/fermenter). Produksjonsfermenteren har et operasjonsvolum på 30 liter Inneholdende 4 ledeskjermer og en enkel seks-bladet plate-turblnagitator med en diameter på 115 mm. Agiteringsgraden er 600 opm, luft kobles ved 1 vol/vol/min. og overtrykket opprettholdes ved 0,3 bar. Fermenteringstemperaturen er 30°C. Fermenteren steriliseres ved medium IFN/23 inneholdende Glukose steriliseres separat og tilsettes for å gi et sluttvolum på 30 liter.

Efter inokulering kontrolleres fermenterings-pH-verdien slik at den ikke faller under 6,0 ved tilsetning av natrium-hydroksyd. Fermenteringen har en varighet på ca. 18 timer eller inntil det maksimale utbytte av interferon er nådd.

Den optiske densitet som er et hensiktsmessig mål på veksten av gjæren, når en verdi mellom 6-7 OD-enheter. Glukosen konsumeres for en stor del, men ikke fullstendig, og det er en induksjon av sur fosfatase-aktivitet ledsaget av produksjon av interferon.

Interferontiteren kan måles i råekstrakter fremstilt ved mekanisk cellediskripsjon i laboratoriet og er 7* IO9 enheter/liter celleekstrakter. Protelninnholdet av rå-ekstraktet er omtrent 1 mg/ml.

Ved slutten av fermenteringen kan dyrkingsbuljongen hvis nødvendig, avkjøles til 10°C før høsting og utvinning av hybridinterferon.

30 1 dyrkingsvæske av pH 6,0 avkjøles til 10° C og cellene separeres med en "Sharples"-sentrifuge. Det klare supernatant inneholder ingen IFN-aktivitet. Den oppnådde cellemasse justeres med buffer X (2 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5M NaCl, 20 jjM fenylmetylsulfonylklorid) til 1400 ml og har en pH-verdi på 8,0. Efter avkjøling til 5-10°C, føres suspensjonen gjennom en "Dyno"-mølle (type KDL Pilot, 0,6 1) utstyrt med polyuretanagitatorplater og 500 ml glassperler av 0,5-0,75 mm diameter og har en agiteringshastlghet på 3000 opm og en matehastighet på 10 l/h, hvorved cellene sprenges. Suspensjonen har en pH-verdi på 8. Suspensjonen inneholdende brutte celler klares ved sentrifugering. Sentrifugeringen gjennomføres i en Sorvall 6SA-rotor ved 12000 opm og ved 4°C i 20 minutter.

Stammen S. cerevisiae GRF18 med plasmidene henholdsvis pJDB207 PH05/IFN AM119, AM106, AM112, DM1 og DM2 kan kultureres og den klare oppløsning inneholdende det tilsvarende hybridinterferon, kan fremstilles på analog måte.

Eksempel 15: Fremstilling av ekstrakter av E. coli stamme

HB101/pAM94 og bestemmelse av IFN-aktivitet.

E. coli stammen HB101/pAM94 dyrkes til en optisk densitet på 8 ved 650 nm i 1 1 av M9-medium inneholdende 0,4* casamino-syre og 2* glukose. Celler sedimenteres og resuspenderes i buffer (16 g celler i 160 ml buffer), inneholdende 0,1M Tris-HCl, pH 8,0, 0,5M NaCl, 5 mM EDTA og 100 pm PMSF. Lysozym tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml. Oppløsningen holdes derefter på is i 30 minutter. Cellene i denne suspensjon åpnes idet det anvendes en Sorvall Omnimix ved en innstilling på tre ganger i 60 sekunder. Suspensjonen inneholder brutte celler som klares ved sentrifugering i en Sorvall 6SA-rotor ved 12000 opm ved 4°C i 20 minutter. Supernatanten analyseres for IFN-aktivitet idet man arbeider i henhold til S. Rubinstein et al. (supra).

Det ble funnet en IFN-aktivitet av 5'IO<7> enheter/ml celleekstrakt.

På analog måte dyrkes E. coli stammene HB101/pAM90, pJC344 og pJC342 og interferontitrene bestemmes som ovenfor til 5*10<8>, 5*IO<7> og 5*IO<6> enheter/ml celleekstrakt.

Eksempel 16: Fremstilling av hybridomceller.

a) Immunogenkilde:

En prøve av halvrenset naturlig human leukocytt IFN (IFNoc),

oppnådd fra dr. K. Cantall (Helsinki), med en spesifikk aktivitet på 13"10^ IU/mg protein, benyttes for immunise-ringen.

b) Immunlseringsprotokoll:

7 hunn-Balb/c-mus (dyrefarm Sisseln, Sveits) 10-14 minutter

gamle immuniseres ved injeksjon i fire fotblader av 4*10^ IU av IFNcx (eksempel 16a) emulgert i komplett Freunds-adjuvans (Difco). En ytterligere injeksjon av 4 "IO5 IU av IFNcx i komplett Freunds adjuvans gis ved dag 30 og en forsterknings-injeksjon (i.p.) av 6* IO5 IU av IFNcx i PBS ved dag 60. Tre dager senere tas milten for fusjon.

c) Cellefusjon:

Alle fusjonseksperimenter utføres ifølge fremgangsmåten av G.

Kohler og C. Miltstein ["Nature", 256, 495 (1975)] idet man benyttet den ikke-sekreterende Sp 2/0-Agl4 myelomalinje [M. Shulman, CD. Wilde og G. Kbhler, "Nature", 276, 269 (1978)]. 10<8> miltceller blandes med IO<7> myelomaceller i nærvær av 1 ml 50* polyetylenglykol (PEG 1500, Serva). Efter vasking resuspenderes cellene i 48 ml standard Dulbeccos minimum-essensialmedium (Gibco nr. 0422501). 3*10^ normal-museperi-toneal eksudataceller pr. fusjon settes til som mateceller. Cellene fordeles i 48 x 1 ml "costar well" og mates 3 ganger uken ved standard HAT-seleksjonsmedium efter 3 til 6 uker. Når hybridomcellenes vekst blir synlig, prøves supernatantene ved en kombinert imunoutfellingsbioanalyse (eksempel 19). Av totalt 221 hybridomer bindes 10 hybridomer å produsere anti-IFN—antistoffer. Hybridomcellene klones med begrenset fortynning i mikrotiterplater i det minste en gang. Hybridom 144 BS velges for ytterligere studier fordi det spesielt er stabilt, og skiller ut store mengder immunoglobulin. Eksempel 17: Isolering og rensing av monoklonalt antistoff. 8-10 uker gamle Balb/c-mus (dyrefarm Sisseln, Sveits) forbehandles intraperitonealt med 0,3 ml pristan (Aldrich). 2-3 uker senere inokuleres 2-5*10^ klonene hybridomceller og 0,2 ml pristan intraperitonealt. Efter 8-10 dager samles ascitesfluidet, sentrifugeres ved 800 x g og lagres ved -20'C. Opptint ascites-fluidum sentrifugeres ved 50 000 x g i 60 minutter. Et fett lag som flyter på overflaten fjernes forsiktig og protelnkonsentrasjonen justeres til en konsentrasjon på 10-12 mg/ml. Råimmunoglobulin felles ut ved dråpevls tilsetning av 0,9 volumekvivalenter mettet ammoniumsulfat ved 0°C, derefter oppløses det hele i 20 mM Tris-HCl/ 50 mM NaCl (pH 7,9) og dialyseres med samme buffer. En immunoglobulinfraksjon oppnås ved DEAE-D52-cellulose-(Whatman)-kromatografi ved anvendelse av et buffergradient-system på 20 mM Tris*HC1/25-400 mM NaCl, pH 7,9. Immuno-globulinet felles igjen ut med ammoniumsulfat og oppløses i PBS ved en konsentrasjon på 10 mg/ml.

Natriumdodecylsulfat-polyakrylamld-gelelektroforese (SDS-PAGE) viser en renhetsgrad på mer enn 95* for de monoklonale antistoffer 144 BS.

Eksempel 18: Bestemmelse av klasse og underklasse av

monoklonale antistoffer.

Klasse og underklasse for de monoklonale antistoffer som er dannet av klonede hybridomceller bestemmes ved den kjente agargel-immunodiffusjonsteknikk Ifølge Ouchterlony, som benytter klasse- og underklassespesifikke kanin-antistoffer (Bionetics). Resultatene bekreftes ved en enzym-immunoanalyse (ELISA) på følgende måte: Mikrotiterplater belegges med 1 pg pr. brønn av et kanin-immunoglobulinpreparat av et klasse-eller underklassespesifikt serum (Bionetics) i 50 pl av PBS. Fri bindingskapasitet på platen mettes med en buffer av 1* bovinserumalbumin i PBS inneholdende 0,2* ?a?3 (w/v), pH 7,4. 100 pl prøver inneholdende monoklonale antistoffer inkuberes i brønnene ved 37 "C i 1 time. Platene vaskes med PBS, inkuberes derefter ved 37° C i 1 time med et fosfatase-konjugert kanin-immunoglobulinpreparat av samme spesifisitet som benyttes for belegging av platene. Det fikserte enzym utvikles ved inkubering (37°C, 20 minutter) med en oppløsning av enzymsubstrat p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml i dietanolaminbuffer 10* inneholdende 0,5 mM MgCl2 og 0,02* (w/v) NaN3, pH 9,8) og måling av den optiske densitet ved 405 nm. Det monoklonale antistoff 144 BS hører til klassen IgG^K (kappa).

Eksempel 19: Kombinert immunoutfellingsbioanalyse.

50 pl av rå naturlig human leukocytt IFN eller rekombinant IFNoc-polypeptider (eksempel 20a) (IO<4> IU/ml) blandes med ekvivalenter mengder av prøveoppløsningen, det vil si dyrkingssupernatanten av hybridomer eller PBS-oppløsninger av rensede monoklonale antistoffer, og inkuberes i 37°C i 2 timer i mikrorør (Eppendorf 3810). Derefter tilsettes 50 pl av på forhånd titrert kanin-antimus lg antistoff (Nordic) og blandingen inkuberes ved 37°C i 1 timer og derefter ved 4°C i 16 timer hvorved fri og IFN-bundne monoklonale antistoffer danner immunkomplekser. Rørene sentrifugeres ved 12 000 opm ved 4°C i 5 minutter. Den immune utfelling vaskes en gang med 1 ml kald bufret saltoppløsning (pH 7,5), oppløses derefter i 200 pl av bufret saltoppløsning av pH 2,2. IFN-aktiviteten som derved frigjøres bestemmes i en standard bioanalyse ifølge J.A. Armstrong, "Appl. Microbiol.", 21, 723 (1971), Inhibering av den cytopatiske effekt av Mengo-virus (400 plaque-formede enheter pr. brønn), bestemmes ved å benytte Hep2-celler (3*10<4> celler pr. brønn) i mikrotiterplater.

Eksempel 20: Bestemmelse av interferonspesifisitet.

a) Kilde av rekombinant IFN- polvpeptlder:

LylFN—a-1—, LYIFN-a—2— og LyIFN-a-3-polypeptider som er

relatert til henholdsvis IFNaF, IFNaB og IFNaD omtales i EP-

søknad 76 489. IFN-A og IFNaJ oppnås fra dr. J. Davies (Biogen, Geneve) og professor C. Weissmann (Universitetet i Ztlrich, Sveits), IFNocC fra Weissmann Institute of Science, Department of Virology, Rehovot, Israel. b) Kilde for monoklonale antistoffer med IFN som benyttes for sammenli<g>nin<g>: Monoklonale antistoffer 1K2 og 2K2 fremstilles som omtalt i GB-PS 2 108 510. MAb, NK2 og YOK oppnås fra Celltech (Berkshire), YI-1 og YI-2 fra Inter-Yeda (Israel), S-l, S-2, S-3 og S-4 fra dr. C. Favre, UNICET, Dardilly (Frankrike) og MAb 1/24 fra M. Aguet, Universitetet i Ztlrich, Sveits.

c) Bestemmelse av reaktlvltet av de forskjellige monoklonale antistoffer til IFNcx-undertyper utføres ved den kombinerte

immunoutfellingsbioanalyse ifølge eksempel 19, og tandem-radiolmmunoanalyse omtalt av D.S. Secher "Nature", 290, 501

(1981). Resultatene er oppført i tabell 4.

De monoklonale antistoffer 144 BS, 1K2 og 2K2 reagerer ikke med human IFNP (Rentschler, Laupheim, Tyskland) eller human IFN-y (Bio Science, Emmenbrtlcke, Sveits).

Resultatene av tabell 4 viser at monoklonalt antistoff 144 BS utøver et unikt blndingsmønster. Det bemerkelsesverdige er fremfor alt den lave binding til IFNaA og den effektive binding til IFN-a-2-, IFN-a-3- og IFN-a-l-polypeptider.

Videre muliggjør resultatene i tabell 4 den epitope analyse som skjematisk er angitt i tabell 5.

Fra analysen av tabell 5, fremgår det faktum at den epitope kombinasjon av hver IFNcx-undertype er unik. Videre muliggjør analysen forutsiing av egnede par av monoklonale antistoffer for bestemmelse av spesifikke undertyper av IFNcx med eksklusjon av andre undertyper 1 en tandem-immunoanalyse. For eksempel vil en kombinasjon av monoklonale antistoffer 144 BS med en hvilken som helst av MAb NK2, S-3, IY-1 eller 1/24 være nyttig for bestemmelse av IFNcxB uten interferens av IFNcxD, og kombinasjonen av MAb 144 BS med MAb YOK for bestemmelse av IFNcxD i nærvær av IFNcxD i nærvær av IFNcxB.

Eksempel 21: Fremstilling av en immunoadsorbent kolonne.

1 ml avsatt "Affi-gel" 10 (Bio-Rad) kobles til 17 mg av monoklonalt antistoff 144 BS ifølge fremstillerens instruksjon: "Affi-gel" vaskes på et sintret glassfilter først med kaldt destillert vann og derefter med en 0,1 molar NaHC03~ oppløsning, pH 8,0 (koblingsbuffer). En suspensjon av 50* gel i koblingsbuffer overføres til et plastrør, blandes med et likt volum av renset monoklonal antistoffoppløsning og roteres i 4 timer ved romtemperatur. Efter kobling vaskes gelen med koblIngsbuffer, og for å blokkere ikke-reagerte seter, behandles den med 0,1 ml i IM etanolamin-HCl (pH 8,0) i 1 til 2 timer ved romtemperatur. Gelen vaskes med PBS i nærvær av 10 mM NaN3 og holdes der ved 4°C.

Eksempel 22: Rensing av rekombinant IFNa ved immunoaffi-nitetskromatografi.

En suspensjon av brutte E. coli-celler som produserer rekombinant IFNa, for eksempel E. coil HB101/pAM94 (se eksempel 15) klares ved sentrifugering i en Sorvall 6SA-rotor ved 12 000 opm ved 4°C i 20 minutter. Polyetylenimin ("Polyimin P" Fluka, pH 8,0) settes til supernatanten til en sluttkombinasjon på 0,25* (w/v). Oppløsningen omrøres 1 time og sentrifugeres. Pelleten kasseres, og supernatanten bringes til 65* metning med ammoniumsulfat. Denne blanding omrøres i 1 time og sentrifugeres. Supernatanten kasseres, og pelleten suspenderes i 1/10 volum (15-20 ml) PBS (pH 7,2). Oppløs-ningen dialyseres over natten mot PBS inneholdende 0,02* Na<N>3.

Den dialyserte oppløsning blandes med 1 ml av immunoaffinitetsgelen fra eksempel 21. Denne blanding rystes godt i 1 time, pakkes derefter i en kolonne og vaskes suksessivt med 5 kolonnevolum PBS, 5 kolonnevolum av PBS inneholdende 0,5M NaCl og 0,2* "Triton X 100" og 5 kolonnevolum av PBS. Alternativt pakkes immunoaffinitetsgelen først i kolonnen og den dialyserte oppløsning tilsettes på toppen, og vaskes så som beskrevet. Rekombinanthybrid IFNa ("B1D2D3D4") elueres ved sur buffer, pH 2,5, inneholdende 0,1M sitronsyre og 0,3M NaCl. De aktive IFN-fraksjoner nøytraliseres med IM Tris, dialyseres mot PBS og konsentreres til ca. 0,1 mg/ml protein idet det benyttes ultrafiltrering flatsjiktmembraner XM10 (Amicon Corp.).

Den maksimale kapasitet av immunoadsorbentkolonnen av det i eksempel 21 Inneholdende 17 ml av monoklonalt antistoff 144 BS ved ca. 1,2 mg av hver av IFN-a-2-, IFN-a-3-polypeptider, ved minst 0,8 mg av IFN-a-l-type polypeptid, 1,15 mg hybridinterferon "B1B2D3B4", 1,25 mg hybridinterferon "B1D2B3B4", 1,25 mg hybridinterferon "B1D2D3D4", 0,44 mg hybridinterferon "BiD2B3B4"»<l>»6 mg hybridinterferon "B1D2D3B4", 1,6 mg hybridinterferon "B1B2D3D4" og 1,15 mg hybridinterferon "B1B2D3D4" °g 1,25 mg hybridinterferon "D1D2B3B4". Immunoabsorbentgelen kan benyttes for opp til 50 separeringer uten vesentlig tap av kapasitet. Rekombinant IFN-a-2-, IFN-a-3-, IFN-a-l-type polypeptider og hybridinterferoner som renses ved denne metode er homogene på SDS-PAGE.

Eksempel 23: Immunodotanalyse.

Immunodotanalyse utføres ifølge R. Hawkes et al., "Anal. Biochem.", 11, 143 (1982). Prøver inneholdende naturlige eller rekombinante interferoner avsettes på nitrocelluloseark ved forskjellige konsentrasjoner. Prikkene lufttørkes og den gjenblivende bindingskapasitet av nitrocellulosen blokkeres ved inkubasjon i en Tris-buffer (0.15M NaCl, 0,01M Tris-HCl, pH 7,6) inneholdende 10* hesteserum. Nitrocellulosestrimlene inkuberes derefter med en oppløsning av monoklonale antistoffer 144 BS (23 pg/ml), og tilsvarende preparerte strimler med enten en oppløsning av monoklonalt antistoff 2K2 (30 pg/ml) for sammenligning, en oppløsning av et normalt museimmunoglobulin (1:100 fortynning) som negativ kontroll, eller en oppløsning av et polyklonalt antihumant interferon oc-museserum (Enzo, 1:1000 fortynning) som en positiv kontroll. Efter vasking behandles alle strimler med kanin-antimuseimmunoglobulin merket med peroksydase (Nordic, 1:400 fortynning), og det bundne andre antistoff fremkalles med et peroksydasesubstrat, 4-klor-l-naftol.

De monoklonale antistoff-flekker IFNaD-typen polypeptider (som IFN—a—3) i konsentrasjon ned til 0,4 ng pr. flekk og IFNaB-type polypeptid (som IFN—a-2) ved 10 ng pr. flekk, mens MAb 2K2 kun erkjenner IFNaD-type polypeptider (4 ng pr. flekk).

Eksempel 24: Perle-radioimmuno-tandem-analyse.

a) Radiomerking av monoklonalt antistoff 144 BS med 1^-J:

0,1 mg monoklonalt antistoff 144 BS joderes med <125>j_

natrium;] odid (1 mC) og kloramid T ifølge standardmetode av F.C. Greenwood et al., "Biochem. J.", 89» 114 (1963). Reaksjonsproduktet renses med en ionebyttekolonne "Bio-Rad" AG 1x8 og aktiviteten standardisert til 4*10^ cpm/ml ved fortynning med PBS.

Joderingen av det monoklonale antistoff 2K2 utføres på samme måte. Monoklonalt antistoff YOK og NK2 er kommersielt tilgjengelig i radiomerket form fra Celltech.

b) Kobling av monoklonalt antistoff 144 BS til makroperler: Polystyrenperler (diameter 6,3 mm, Spherotech AG, Ztlrich)

inkuberes ved 4°C i 16 timer ved bevegelse i en oppløsning av 1 mg/ml MAb 144 BS i en koblingsbuffer for PBS inneholdende 5 mM EDTA og 0,1* NaN3 (pH 8) i et forhold av 20 perler på 10 ml oppløsning. De dekkede perler overføres derefter i en blokkeringsbuffer av PBS inneholdende 10* hesteserum og 0,1 NaN3 og holdes deri ved 4°C inntil bruk, i det minste i 24 timer.

Kobling av andre MAb utføres på samme måte.

c) Analyseprosedvre:

Plastrør (Falcon, 5 ml) belegges med 0,5 ml blokkeringsbuffer

av PBS inneholdende 10* hesteserum og 0,1* NaN3 over natten. Bufferen fjernes ved aspirasjon og 0,2 ml av en IFN-holdig prøve eller standardoppløsning i blokkeringsbuffer settes direkte til bunnen av rørene. En MAb-koblet og blokkert perle fra eksempel 24b) tørkes kort på en ren klut og overføres forsiktig uten ytterligere skum inneholdende IFN-oppløsning. Perlen inkuberes 4 til 6 timer ved romtemperatur med svak rysting. IFN-oppløsningen fjernes ved aspirasjon og hver perle vaskes med 3 x 2 ml blokkeringsbuffer. Perlen inkuberes derefter med 0,2 ml av <125>J-merket annet antistoff (eksempel

24a) tilsvarende til 80*10<3> cpm i 16 timer ved 4°C, vaskes tre ganger med PBS og føres over i et nytt rør for telling. Tabell 6 viser resultatene for standardoppløsninger av IFN-a—3- og IFN-a-2-polypeptider oppnådd ved forskjellige kombinasjoner av fast fase (perler koblet) første antistoff og l25J-merket annet antistoff.

Polyklonalt: Perle-koblet polyklonalt saueanti-IFNa-antistoff oppnådd fra Celltech.

Beste resultat oppnås ved kombinasjon av MAb 144 BS med MAb YOK for påvisning av IFN-a-3 og med kombinasjon av MAb 144 BS med MAb NK2 for påvisning av IFN-a-2.

Figur 4 viser resultatet av kvantitative titrerings-eksperimenter med kombinasjon av MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb NK2 i radiomerket form. Analysen gir lineære resultater fra 1 til 5000 IU/ml (2 pg/ml til 10 ng/ml) av IFN-aB-type polypeptider. Forskjeller i titrerings-kurver av IFN—a—2 og "standard B"-type polypeptider (fra Celltech) skyldes variasjoner i analysemålinger av de to IFN-preparater.

Tilsvarende resultater oppnås i kvantitative eksperimenter for måling av IFNaD-type polypeptider med kombinasjonen av MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb YOK i radiomerket form. Analysen er pålitelig ned til 1 IU/ml (2 pg/ml) av IFNaD-type polypeptider. Kombinasjonen av MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb NK2 kan også benyttes for bestemmelse av IFNaF-type polypeptider.

d) Forkortelse av analvseprosedvre ( simultananalvse):

Idet det benyttes den generelle prosedyre som beskrevet i

eksempel 24c) inkuberes den MAb-koblede perlen 1 3 timer ved romtemperatur med prøveoppløsningen (0,1 ml) og den radio-merkede andre antistoff (0,1 ml) sammen, idet det unngås vaskinger mellom inkuberingene.

Figur 5 viser at den forkortede samtidige analyse kan benyttes pålitelig for hurtig påvisning av IFN-B-type polypeptider (som IFN-a-2) prøver inneholdende 150 IU/ml eller mer, men er betraktelig mindre følsom enn analysen Ifølge eksempel 24c).

bg = bakgrunn

e ) Prøvesett for perle- radlolmmuno- tandem- analyse:

Prøvesett for analysen omtalt i eksempel 24c) Inneholder:

100 plastrør Falcon 5 ml

100 polystyrenperler, 6,3 mm belagt med monoklonalt antistoff 144 BS i PBS inneholdende 10* hesteserum og 0,1* NaN3, 20 ml av <125>J-merket monoklonalt antistoff YOK med en spesifikk aktivitet 4"IO<5> cpm/ml, 20 ml av <125>J-merket monoklonalt antistoff NK2 med en spesifikk aktivitet 4*10<5> cpm/ml,

2 ml standardoppløsning IFN—a—1 inneholdende IO<4> IU/ml,

2 ml standardoppløsning IFN-a-2 inneholdende IO<4> IU/ml,

2 ml standardoppløsning IFN-a-3 inneholdende IO<4> IU/ml,

1000 ml PBS Inneholdende 10* hesteserum og 0,1* NaN3, kalibreringskurve.

Eksempel 25; Enzym-lmmunoanalyse (ELISA)

a) Merking av monoklonalt antistoff 144 BS med alkalisk fosfatase: 1,4 ml MAb BS i 1,4 ml PBS kobles 2 timer med en oppløsning inneholdende 5 ml alkalisk fosfatase (Sigma P6774, type VII-T) ifølge standardmetode av Voller et al., "Bull.", World Health Organ. 53, 55 (1976) idet det benyttes glutaraldehyd (0,2* v/v). Konjugatet overføres i 5 ml av Tris-buffer, 0,05M, pH 8,0, inneholdende 1 mmol av MgCl2, 1* BSA og 0,02* NaN3. Oppløsningen holdes ved 4°C.

b) Analyseprosedyre:

Polypropylen-mikrotiterplater (Dynatech Labs. Inc.) dekkes over en periode på 2 timer ved 37° C og over natten ved 4°C med 150 pl av en oppløsning av det monoklonale antistoff NK2 (Celltech, 10 pg/ml) i en buffer, pH 8,6 (karbonatbufret 0,9* saltoppløsning inneholdende 0,02* natriumazid). Platene vaskes fem ganger med PBS og protein-reaktive seter som ennå er til stede mettes ved inkubering i 1 time ved 37°C med 250 pl av en buffer, pH 7,4 (0,2* gelatin og 0,2* NaN3 i PBS). Plater belagt på denne måte kan holdes ved 4°C 1 denne buffer i få dager. 50 pl av en fortynningsserie av prøveoppløsningen eller en standardoppløsning inneholdende IFNcx-under type r, 50 pl av buffer pH 7,4 og 50 pl av en oppløsning av det fosfat-merkede antistoff 144 BS (eksempel 25a) som er blitt fortynnet 1:100 med en buffer, pH 7,4, blandes og inkuberes i brønnen på mikrotiterplatene i 2 timer ved 37°C og 30 minutter ved 4°C. Platene vaskes fem ganger med PBS, Inkuberes derefter 30 minutter ved 37°C med 150 pl av en oppløsning av p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml i 10* dietanolaminbuffer, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8). Ved å måle den optiske densitet ved 405 nm, bestemmes mengden av frigjort nitrofenol som er proporsjonal med mengden av den bundne enzymfosfatase og således proporsjonal med mengden av IFNcx-undertype i prøveoppløsningen.

Denne analyse kan benyttes til å bestemme mengden av IFNcxB-type som (IFN-a-2) eller IFN-F-type-polypeptlder. For bestemmelsen av IFN-D-type (slik som IFN-a-3)-polypeptider, dekkes mikrotiterplaten med monoklonale antistoffer YOK (Celltech) i stedet for NK2.

Tilsvarende resultater oppnås når mikrotiterplater dekkes med MAb 144 BS, og henholdsvis f osf atasekoblet MAbs NK2 og YOK brukes som annet antistoff. c) Prøvesett for ELISA: Et prøvesett for analyse omtalt 1 eksempel 25b) Inneholder:

polypropylenmikrotiterplater,

20 ml av monoklonalt antistoff NK2 (10 pg/ml) i karbonatbufret saltoppløsning (0,9* NaCl, 0,42* NaHC03, 0,0072* Na2C03, 0,02* NaN3), 1 ml av alkalifosfatase-koblet MAb 144 BS (eksempel 10.1, 0,3 mg antistoff pr. ml) i Tris-buffer (0,05M, 1 mM MgCl2, 1* BSA, 0,2* NaN3, pH 8,0),

2 ml standardoppløsning IFN-a-1 Inneholdende IO<4> IU/ml,

2 ml standardoppløsning IFN-a-2 inneholdende IO<4> IU/ml,

2 ml standardoppløsning IFN-a-3 inneholdende IO<4> IU/ml, 300 ml PBS,

300 ml buffer, pH 7,4 (0,2* gelatin og 0,2* NaN3 i PBS),

50 ml av p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml) i dietanolaminbuffer (10*, 0,5 mM MgCl2, 0,02* NaN3, justert til pH 8,9

med HC1),

kalibreringskurve

farveintensitetsskala.

Eksempel 26: Rensing av hybridinterferonene ved anvendelse av

utfelling og kromatografiske metoder.

1 liter lnterferon "BiD2D3D4"-holdige oppløsninger klares ved sentrifugering (se eksemplene 13-15) og surgjøres ved bruk av 2M HC1 inntil oppløsningen når pH 2,2. Oppløsningen omrøres i 1 time ved 4°C og utfelt protein separeres ved sentrifugering (GSA-rotor Sorvall ved 12 000 opm ved 4°C i 20 minutter). Pelleten kasseres og supernatanten bringes til 30* metning med fast ammoniumsulfat. Denne oppløsning omrøres i 1 time ved 4°C og sentrifugeres. Supernatanten inneholdende interferonet dialyseres derefter mot 0,1M NH2HCO3 ved pH 8,2. Det finnes en interferonaktivltet på ca. 10<8> IU/ml.

En kolonne inneholdende 50 ml chelaterende Sepharose 6B (Pharmacia) ladet med Cu<2+->ioner ifølge fremstillerens instruksjon ekvilibreres idet det benyttes 250 ml 0.05M natriumacetat, pH 7,0, og 0,5M NaCl. 200 ml dialysert oppløsning (se ovenfor) påføres ved 4°C på kolonnen. Kolonnen vaskes med 150 ml ekvilibrert buffer. Eluering av bundet interferon utføres idet det benyttes en lineær gradient av

250 ml 0,5M natriumacetat, pH 7,0 og 0,5M NaCl,

250 ml 0,05M natriumacetat, pH 2,8, og 0,5M NaCl og efterfulgt av en vasking med 150 ml av 0,05M natriumacetat, pH 2,8, og 0,5M NaCl.

De aktive interferonfraksjoner samles og dialyseres mot 0,05M Tris-HCl-buffer, pH 8,0. Interferonaktivltet i den dialyserte oppløsning er omtrent 10<8> IU/ml. Maksimumkapasitet av kolonnen er a 75 mg interferon-"B^D2D3D4".

En kolonne inneholdende 50 ml Q-Sepharoseanionbytter (Pharmacia) ekvilibreres under anvendelse av 250 ml 0,05M Tris-HCl-buffer, pH 8,0. 100 ml av den ovenfor dialyserte interferon-holdige oppløsning påføres på en kolonne ved romtemperatur. Kolonnen vaskes derefter med 50 ml ekvilibrert buffer. Bundet interferon elueres idet det benyttes en lineær gradient på 0 til 0,7M NaCl i 200 ml 0,05 Tris-HCl, pH 8,0.

De rene interferon elueres ved ca. 0,3M NaCl, De aktive fraksjoner viser et enkeltbånd ved en tilsynelatende molekylvekt på 19 000 når det analyseres på SDS-polyakrylamidgel. Maksimumkapasiteten av ionebyttekolonnen er ca. 50 mg av hybridinterferon-"BiD2D3D4".

På analog måte kan det renses hybridinterferonene "B1D2B3B4", "B1D2B3D4", "B1D2D3B4", "B1B2B3D4" og " B^^ Bi".

Eksempel 27: Lyofilisering av hybridinterferon "B1D2D3D4".

Interferon "BJD2D3D4" som er renset enten via immunoaffi-nitetskromatografi under anvendelse av monoklonalt antistoff 144 BS eller via vanlig kromatografisk teknikk (se eksempel 26), dialyseres mot 0,5M NH2HCO3 og lyofiliseres derefter. Små volum av vann tilsettes to ganger til den lyofiliserte prøve for fullstendig å fjerne NH4CO3. Oppløsningen blir derefter lyofllisert igjen.

Rekonstituering av interferon-"BiD2D3D4"_0PPløsning utføres som følger: 0,5M NH4HCO3, pH 8,2 settes til den lyofiliserte prøve for å oppnå en interferonkonsentrasjon på ca. 0,1 mg/ml. Den gjenoppløste interferon har en spesifikk antiviral aktivitet på 2*10<8> IU/mg, noe som er identisk med den tilsvarende verdi før lyofilisering.

Eksempel 28: Fysikokjemisk karakteristikk av hybridinterferoner .

Hybridinterferoner ifølge oppfinnelsen og utgangs-interferonene utsettes for polyakrylamid SDS-gelelektroforese Ifølge metoden som er beskrevet av Laemmli ["Nature", 227, 680 (1970)]. De tilsynelatende molekylvekter for hybridinterferonene, gitt i kilo-Dalton (kD), er oppstilt i tabell 7. Tabell 7 Inneholder også de isoelektriske punkter (pl) av hybridinterferonene slik de er bestemt ved å benytte LKB-polyakrylamidgeler inneholdende "Ampholine". Aminosyresekvensen for hybridinterferonene ifølge oppfinnelsen bestemmes for å benytte en 470 A proteinsekvenser fra Applied Biosystems eller å benytte en 890 C Beckman-sekvens. I begge tilfeller foretrekkes automatisert Edman-degradering. Strukturen som finnes er i full overensstemmelse med det som var ventet. Den N-terminale aminosyre er cystein.

Eksempel 29: Effekt av hybridinterferoner på nivå av (2'-5')~

oligoisoadenylat-syntetaseaktivitet i Daudi-celler .

Daudi-celler såes ved 2*IO<9> celler/ml i RPMI-1640-medium med 10* føtalt kalveserum inneholdende den angitte konsentrasjon (se tabell 8) av hybridinterferoner "B1B2B3D4", "BiD2B3B4", "B1D2D3D4" OG "B1B2D3B4". Efter 24 timers behandling sentrifugeres 5'10^ celler pr. prøve (9000 opm) og resuspenderes i 500 1 av kald lyseringsbuf f er (20 mM 4-(2-hydroksy-etyl)-l-piperazinetansulfonsyre-buffer, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 120 mM KC1, 7 mM ditiotreitol, 10* glycerol, 0,5* Nonidet P 40) og inkuberes 2 minutter på is. Prøvene sentrifugeres derefter ved 9000 opm i 8 minutter og ved 4°C og supernatanten fjernes og analyseres for (2'-5' )-oligoisoadenylat-syntetaseaktivltet som følger: Supernatanten blandes med 50 1 av poly(ri)•(rC)-agarose (P-L Biochemicals) 1 15 minutter ved 30'C og det lkke-adsorberte materiale fjernes ved sentrifugering. Det poly(ri)•(rC)-adsorberte materialet inkuberes med 2,5 mM (o<32>P) ATP 400 Cl/mmol (Amersham Int.) i 20 timer ved 30°C, idet det behandles med bakteriell alkalifosfatase (Sigma) og elueres så fra en kolonne av surt aluminiumoksyd (Sigma) (300 pl) med 3,0 ml av IM glycin-HCl-buffer, pH 2,0 som beskrevet [Merlln et al., "Analyt. Biochem.", 110. 190 (1981 )]. Resultatene i tabell 8 er uttrykt som antall ganger økning I (2'-5')-oligoisoadenylat-syntetase-aktivitet i interferon-behandlede celler i forhold til nivået av celleaktiviteten i ubehandlede kontrollceller (gjennomsnittlig aktivitet 51,6 8,7 pmol/timer/10<5->celle). Eksempel 30: Farmasøytisk preparat (parenteral admini strering ). 2 mg av hybridinterferon-"B1D2D3D4" med en spesifikk aktivitet på 1,3*10<8> enheter/mg på human Wish-celler oppløses i 30 ml av 5N human serumalbumin. Den resulterende oppløsning føres gjennom et bakteriologisk filter og den filtrerte oppløsning oppdeles under aseptiske betingelser i 100 ampuller som hver inneholder 2,6*IO<6> enheter rent hybridinterferon. Ampullene som er egnet for parenteral administrering lagres fortrinnsvis kaldt, for eksempel ved -20°C.

På samme måte kan det fremstilles ampuller inneholdende 5, 2'IO6 eller 1,04'IO<7> enheter ved å benytte 4 eller 8 mg hybridinterferon.

På analog måte kan det fremstilles ampuller inneholdende hybridinterferon "B1D2B3B4", "B1B2D3B4"» "B1D2B3<D>4", •'B1D2D3B4" eller "B1B2B3D4" (spesifikk aktivitet 1,28-10<8>, 2*10<8>, 7,V10<7>, 3,8'10<7> og 8-10<7>).

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridinterferon-polypeptid med en aminosyresekvens sammensatt av to til fire undersekvenser tilsvarende i aminosyreidentitet og tall til undersekvenser av human-lymfoblastoid-interferoner LyIFN-oc-2 og LyIFN-a-3, Idet hybridinterferon-polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av polypeptider med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 150 av LyIFN-a-2 "BiB2B3" og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-3 "D4", et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 92 av LyIFN-a-2 "B1B2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-a-3 "D3", og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-oc-2 "B4", og et polypeptid med en aminosyresekvens bestående av aminosyrer 1 til 60 av LyIFN-a-2 " B^, aminosyrer 61 til 92 av LyIFN-a-3 "D2", aminosyrer 93 til 150 av LyIFN-a-2 "B3" eller av LyIFN-a-3 "D3" , og aminosyrer 151 til 166 av LyIFN-a-2 "B4" eller av LyIFN-a-3 "D4", karakterisert veda) fremstilling av en DNA omfattende det strukturelle genet som koder for hybridinterferonet og inkorporering av det oppnådde DNA i en egnet ekspresjonsvektor, b) overføring av det oppnådde hybridvektoren som bærer hybrid-IFN-strukturgenet i en mottagervert, c) utvelging av transformerte verter fra ikke-transformerte verter ved dyrking under slike betingelser at bare transformerte verter overlever, d) dyrking av de overførte verter under betingelser som muliggjør eksprimering av det hybrid-IFN-strukturelle genet, og e) isolering av det eksprimerte hybrid IFN.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hybridinterferon-polypeptid er valgt fra gruppen bestående av hybridinterferon-polypeptid "B1B2B3D4" med formel hybridinterferon-polypeptider "B1B2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptider "B1D2B3D4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3B4" med formel hybridinterferon-polypeptid "B1D2D3D4" med formel og hybridinterferon-polypeptid "B1D2B3B4" med formel
3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av hybridinterferon "B1B2B3D4">karakterisert ved at hybridvektoren inneholder DNA-sekvens som koder for hybridinterferon .
4. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av hybridinterferon "B1B2D3B4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder en DNA-sekvens som koder for hybridinterferon. 5-

   Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av hybridinterferon "B^D2B3D4<M>, karakterisert ved at hybridvektoren inneholder et DNA-sekvens som koder for hybridinterferon. 6.

   Fremgangsmåte ifølge krav 1 til fremstilling av hybridinterferon "BiD2D3B4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder et DNA-sekvens som koder for hybridinterferon. 7.

   Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av hybridinterferon "B1D2D3D4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder en DNA-sekvens som koder for hybridinterferoner. 8.

   Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av hybridinterferon "B1D2B3B4", karakterisert ved at hybridvektoren inneholder en DNA-sekvens som koder for hybridinterferoner.